1) No início da década de 80 o avanço no conhecimento da estrutura de proteínas apontava para a necessidade de organização e classificação do que se sabia até então. Assim, em um trabalho pioneiro, Jane S. Richardson publica, em 1981, uma das primeiras tentativas de compôr um “atlas” da estrutura de proteínas, intitulado "The Anatomy & Taxonomy of Protein Structure” e publicado ma revista Advances in Protein Chemistry, pp. 167-339, volume 34. Este trabalho se tornou uma referência clássica em estrutura de proteínas, e é facilmente encontrado para download em uma versão atualizada. Observe abaixo a Figura 11 do artigo, com sua legenda, e responda as questões abaixo.

a) Em uma hélice α, as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos apontam para fora ou para dentro da hélice? E, em função disso, é possível que um lado da hélice seja hidrofóbico e outro hidrofílico permitindo, por exemplo, que uma hélice fique paralela ao plano de uma membrana plasmática, ao mesmo tempo inserida parcialmente na membrana e exporta ao solvente?

b) A energia que estabiliza uma hélice α, permitindo sua formação, deriva de interações por ligações de hidrogênio entre aminoácidos de voltas consecutivas da hélice (linhas tracejadas da imagem). Paralelamente, é comum encontrar em estruturas 3D de proteínas pequenos fragmentos preditos por programas como hélices, com 2 ou 3 resíduos. Mas essas ligações de hidrogênio só se formam ao final de uma volta e início da segunda (e no caso da hélice α podemos considerar que cada volta tem em torno de 4 resíduos). Neste sentido, esses fragmentos de 2 ou 3 resíduos constituem-se de fato em hélices? Porquê?

2) Leia o texto abaixo, extraído do artigo onde originalmente foi descrito o programa BLAST: Altschul et al., Basic

Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410. A partir do texto, responda as questões abaixo:

a) Como se prediz a predição de função de um gene recém sequenciado?

b) Uma predição de função por similaridade é absoluta ou pode ser modificada com o passar do tempo? Porquê?

3) O paradigma de que a forma molecular determina a função protéica é bastante difundido, empregado inclusive para explicar processos patológicos - e, juntamente a este, de que a interação entre moléculas pode mudar suas formas, estabelecendo novas formas que assumem novas funções, ou seja, o alosterismo. Em outras palavras, a forma de um receptor que desencadeia a cascata de segundos mensageiros somente seria estabelecida (ou induzida) na presença de seu agonista endógeno. Os primeiros modelos para estes processos datam do final do século XIX, como na representação chave-fechadura, em que o modulador endógeno seria a chave e o receptor biológico a fechadura. A participação da flexibilidade molecular nesse entendimento é mais recente, desenvolvida em estudos enzimáticos na década

de 1960. Algumas dessas questões são discutidas no artigo indicado abaixo, publicado em 2015 na revista Current Opinion in Structural Biology 2015, 30:17–24, e, trabalho intitulado: Allostery without a conformational change? Revisiting the paradigm. O resumo do artigo indica:a) Segundo o texto, quais motivos podem explicar o processo alostérico na ausência de diferenças estruturais?

b) Neste sentido, a obtenção de informação experimental sobre uma determinada proteína é necessariamente conclusiva sobre a existência ou ausência de alosterismo? Porquê?

4) Considerando as imagens e legenda obtidas do artigo intitulado Molecular mechanism of mRNA repression in trans by a ProQ-dependent small RNA, publicado no periódico The EMBO Journal (Smimov et al., 2017. DOI: 10.15252/embj.201696127), responda as seguintes questões:

RaiZ is a processed enterobacterial sRNA. A. Multiple alignment of raiA loci from enterobacteria. Highly conserved positions are shown in red; invariant ones are marked with asterisks. C. RNase E inactivation compromises the raiA mRNA processing and RaiZ production. Unlike the WT allele, the thermosensitive rne-3071 variant gives rise to an RNase E protein which is only active at temperatures below 37°C, as can be assessed by the characteristic accumulation of a 5S rRNA precursor, 9S RNA, upon a shift to a non-permissive temperature of 44°C.a) Com base na interpretação da figura C, proponha um mecanismo pelo qual os

pequenos RNAs (sRNAs) RaiZ e RaiZ-S são gerados a partir do mRNA de raiA considerando a importância de RNAse E no processo.

b) Considerando o alinhamento múltiplo apresentado na figura A, comente sobre o sítio de reconhecimento da RNAse E na sequência do mRNA de raiA

5) A figura abaixo, extraída do manuscrito intitulado The MEKK1 SWIM domain is a novel substrate receptor for c-Jun ubiquitylation, publicado no periódico Biochemical Journal (Rieger et al., 2012. DOI: 10.1042/BJ20120406), descreve experimentos para

avaliar a interação entre duas proteínas associadas a uma via de sinalização celular relacionada ao fator de transcrição c-Jun. Conforme análise da figura e de sua legenda é possível afirmar que Jun-c interage fisicamente com o domínio SWIM, presente na proteína MEKK1? Qual o domínio presente em Jun responsável por esta interação? Justifique com base na interpretação das Figuras A e B.

A graphical representation of the FLAG-tagged full-length c-Jun and Jun truncation mutant proteins used in the pull-down experiments. δ, delta domain; D, DBD – DNA binding domain; LZ, leucine zipper domain. (B) GST–SWIM domain fusion protein pull-down of full-length c-Jun and truncated c-Jun mutants. Results are representative of at least three independent experiments. IB, immunoblot.

6) A figura abaixo foi extraída do artigo intitulado Genome-wide CRISPR screen identifies HNRNPL as a prostate cancer dependency regulating RNA splicing, publicado no periódico PNAS (Fei et al., 2017. DOI: 10.1073/pnas.1617467114). O artigo busca identificar fatores envolvidos no processamento de RNA essenciais para o estabelecimento do câncer de próstata. A partir da interpretação da figura e respectiva legenda apresentada, responda às seguintes questões:

HNRNPL directly regulates alternative splicing in prostate cancer. (A) Pie chart showing different classes of HNRNPL-dependent alternative splicing events. (B) HNRNPL binding is significantly associated with HNRNPL-dependent alternative splicing. Fraction of genes with HNRNPL binding from differential splicing genes was compared with that from all genes. (D) RT-qPCR confirmation of HNRNPL-dependent alternative splicing of AR (androgen receptor). Both two alternatively spliced isoforms and pre-mRNA of AR were examined using corresponding PCR primers by RT-qPCR analysis upon HNRNPL knockdown. Data were shown as mean ± SEM, n = 3, *P < 0.05.

a) Qual é a influência do silenciamento de HNRNPL na obtenção das isoformas a e b obtidas por splicing alternativo do pre-mRNA de AR? Comente sobre a abordagem utilizada para realização desta análise.

b) Cite e comente a evidência a qual confirma que HNRNPL regula a expressão das isoformas do mRNA de AR por splicing alternativo e não por regulação direta da transcrição.

7) O Abstract e a figura abaixo foram copiados do artigo Nuclear Localization of Flavonoid Enzymes in Arabidopsis (Saslowsky et al, 2005, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 280: 23735–23740):

Flavonoids represent one of the oldest, largest, andmost diverse families of plant secondary metabolites.These compounds serve a wide range of functions inplants, from pigmentation and UV protection to the regulationof hormone transport. Flavonoids also have interestingpharmacological activities in animals that areincreasingly being characterized in terms of effects onspecific proteins or other macromolecules. Although flavonoidsare found in many different locations both insideand outside the cell, biosynthesis has long beenbelieved to take place exclusively in the cytoplasm. Recentreports from a number of different plant specieshave documented the presence of flavonoids in nuclei,raising the possibility of novel mechanisms of action forthese compounds. Here we present evidence that notonly flavonoids, but also at least two of the biosyntheticenzymes, are located in the nucleus in several cell typesin Arabidopsis. This is the first indication that differentialtargeting of the biosynthetic machinery may be usedto regulate the deposition of plant secondary productsat diverse sites of action within the cell.

a) As enzimas CHS (Chalcona Sintase) e CHI (Chalcona Isomerase) são necessárias para a síntese de flavonoides. Qual informação pode ser obtida a respeito destas duas enzimas com base na Figura acima? Explique. b) Por que os autores também mostraram imunoblots relativos às proteínas Histona H1 e alfa-tubulina?

8) A figura abaixo foi copiada do artigo Pathways of plastid-to-nucleus signaling (Rodermel S, 2011, TRENDS in Plant Science 6: 471-478). A figura mostra as epatas necessárias para a síntese e montagem da enzima Rubisco, a primeira enzima do ciclo de Calvin (fotossíntese). Esta enzima é considerada a proteína mais abundante no planeta Terra.

a) Lembrando que a origem evolutiva dos cloroplastos em células eucarióticas foi semelhante à origem das mitocôndrias, como você explica que a subunidade pequena da Rubisco (RbcS) é sintetizada em ribosomos 80S e a subunidade grande (RbcL) é sintetizada em ribosomos 70S?

b) Quais as principais diferenças que você esperaria encontrar entre os genomas que codificam RbcS e RbcL?

9) A figura abaixo foi copiada do artigo Anion channels: master switches of stress responses (Roelfsema et al, 2012, TRENDS in Plant Science 17: 221-229).

a) A figura mostra a relação entre canais iônicos, transportadores e bombas na resposta ao hormônio ABA (ácido abscísico) em células de uma espécie vegetal. Considerando que os três estão localizados na membrana plasmática, qual característica estrutural deve estar presente em todos eles? Por quê?

b) Na Figura 1a, o transporte de potássio e de água deve ser considerado ativo ou passivo? Por quê?