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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Programa de Pós-graduação em Patologia

Wanúzia Keyla Miranda

ESTUDO QUANTITATIVO DAS CÉLULAS DE LANGERHANS

NO CARCINOMA ESCAMOCELULAR IN SITU DO COLO

UTERINO – ANÁLISE MORFOMÉTRICA E IMUNO-

HISTOQUÍMICA

Recife 2006

Livros Grátis

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II

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Programa de Pós-graduação em Patologia





HISTOQUÍMICA

Orientadora

Profª. Drª. Maria do Carmo Abreu e Lima

Recife 2006

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia do Departamento de Patologia – CCS/UFPE como requisito para obtenção do grau de Mestre em Patologia Área de concentração: Patologia Geral

III





HISTOQUÍMICA

Orientadora

Profª. Drª. Maria do Carmo Abreu e Lima

Apresentada em: 12/04/2006

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Nicodemos Telles de Pontes Filho

Presidente

Profª. Drª. Sílvia Regina Arruda de Moraes

Membro

Prof. Dr. Artur Lício Rocha Bezerra

Membro

IV

Epígrafe

Não se contente em trilhar

um caminho estabelecido.

Ao contrário, vá para onde

não há caminho algum,

e deixe seu rastro.

Muriel Strode

V

Dedicatória

A Deus, dedico este trabalho científico, como

reconhecimento de Sua Soberania sobre mim e

como forma de agradecê-Lo por tudo e todos

que pôs propositalmente em meu caminho,

trançando com fios tênues a rede que deu

sustentação a esta pesquisa.

VI

Agradecimentos

Pensei!

Pensei muito a quem devo gratidão por este trabalho!

Decidi que não devo agradecer, mas convidar a todos

como autores, já que é autor todo aquele de contribui de

forma decisiva para a consecução da obra.

Dessa forma, gostaria que se reconhecessem como

autores:

Minha mãe, Maria Ivete Miranda, pelas aflições e pelas orações a cada

viagem para o Recife;

Meus filhos, Roberto Miranda Moreira Segundo e Renata Miranda Moreira,

pelas inúmeras contas de subtração de convívio, que tiveram que

aprender durante todo o tempo que durou a preparação desta

pesquisa.

Dr. Raimundo Sales Filho, que de imediato estimulou-me a prosseguir, ao ver

traçado o tema que abordei neste trabalho.

Roberto Miranda, o amigo que me apoiou, por tantas vezes em que precisei,

nas idas e vindas a Recife, sempre perto nos momentos exaustivos.

Drª Maria do Carmo Abreu e Lima, a grande mestra, que dedicou sua mão

direita para guiar-me num caminho, inicialmente muito escuro... Sou-lhe

grata, ainda, pela documentação fotográfica deste trabalho.

Dr. Adonis de Carvalho, autor de tantas obras e ajudador de tantas vidas, por

dar-me o que de mais precioso alguém pode receber de outrem – o

saber prazeroso e compartilhado.

Drª. Terezinha Tenório, pela presteza em me ouvir e me ajudar nos passos que

levaram ao meu objetivo.

Dr. Luciano Montenegro, que aceitou o desafio de compartilhar o saber da

imuno-histoquímica no estudo das células de Langerhans.

Drª. Alana Brandão, por ter viabilizado toda a parte prática deste trabalho e,

mais que isso, mostrou-me que o serviço público pode exercer seu

VII

papel último que é servir à coletividade, quando é chefiado por pessoa

com a visão de futuro e de bem-estar.

Drª. Laís Guimarães Vieira, pela luz da amizade que, sem limites de tempo,

transpôs o técnico e ensinou-me a mesclar fortaleza com doçura e

respeito.

Dr. Élson Soares, estatístico, que, nas horas mais inconvenientes, não exitou em

me receber e auxiliar na compreensão dos testes estatísticos.

Dr. Camilo Flamarion, meu cunhado, pela disposição em me ajudar quando

precisei de suas orientações.

Dr. Tarso S. Pereira, que, de modo extremamente prestativo, nos cedeu a

grade morfométrica de Weibel para a execução deste trabalho.

Drª. Vera Andrade de Melo, minha amiga e sócia, por manejar o volume de

trabalho de modo a me proporcionar mais tempo para a execução

dessa pesquisa.

Dr. Alisson Kenedy de Souza, pela atenção dedicada a cada chamado para

melhor entendimento das análises estatísticas.

VIII

RESUMO

Objetivo: Verificar a densidade de células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ do colo do útero em relação ao epitélio escamoso normal. Pacientes e Métodos: Por estudo prospectivo, observacional, tipo caso controle, foram selecionadas 36 espécimes de colo uterino, obtidos por biópsias ou por histerectomia, de mulheres com vida sexual ativa, não gestantes, na faixa etária de 20 a 40 anos, provenientes do Centro de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, no período de janeiro a dezembro de 2003, separadas em dois grupos equivalentes quanto à idade: grupo caso, correspondente a 18 lesões diagnosticadas como carcinoma escamocelular in situ, e grupo controle, formado por 18, com epitélio escamoso histologicamente normal. As preparações histológicas foram submetidas ao exame imuno-histoquímico com anticorpo anti-proteína S-100 (DAKO) e quantificação das células de Langerhans utlizando grade de Weibel, em 10 campos de 400X. Foi calculada a densidade de CL/mm2 considerando a área ocupada pelo epitélio escamoso, para cada campo examinado. Utilizou-se o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 13.0 e os testes t de Student e χ2, ao nível de significância de 0,05. Resultados: Houve diferença significante da densidade média de CL entre o grupo caso e o grupo controle (12,79 ± 5,48 células/mm2 e 2,44 ± 0,79 células/mm2 respectivamente; p < 0,001). Observou-se distribuição topográfica difusa no grupo caso e predominando nas camadas basal e para-basal, no grupo controle. Conclusão: Houve aumento significante da densidade de CL no carcinoma escamocelular in situ do colo uterino, com distribuição difusa por entre as células escamosas neoplásicas, consistente com a ativação da resposta imune celular.

Palavras-chave: Neoplasias do colo uterino. Imunologia, Células de Langerhans / análise morfométrica

IX

ABSTRACT

Objective: To compare the density of Langerhans cells in situ squamous cell carcinoma of uterus cervix with cervix histologically normal. Patients and Methods: According to a prospective, observational case-control study, 36 uterus cervix samples, obtained by biopsy or hysterectomy, of sexually active women, no pregnant, aging from 20 to 40 years old, attempted at Cancer Diagnostic Centre from Paraiba, Brazil, from January to December 2003, were analyzed. Samples were separated into two groups, equivalent by age: case group corresponding to 18 lesions diagnosed as in situ squamous cell carcinoma, and control group including 18 samples from histologically normal cervix. Samples were submitted to immuno histochemistry exam with the immuno marker S-100 (DAKO) and morphometric analysis on Weibel grade, in 10 high power fields. Langerhans cells density was calculated considering the area occupied by squamous epithelium, for each field examined. Data were organized with Statistical Package for Social Sciences (SPSS), version 13.0. Statistical tests were t Student and Chi squared, both at significance level of 0,05. Results: There was significant difference on mean density of Langerhans cells between case and control group (12.79 ± 5.48 cells/mm2 e 2.44 ± 0.79 cells/mm2, respectively; p < 0,001). Langerhans cells topographic distribution was diffuse on case group and predominantly basal and para-basal on control group. Conclusion: There was a significant increase of Langerhans cells in in situ squamous cell carcinoma, diffusely spread between the squamous neoplasic cells, consistent with cellular immune response activation.

Key-words: Uterus cervix neoplasia. Immunology, Langerhans cells/ morphometric analysis

X

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans segundo grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003 .................................................................................................................................... 58

Tabela 2 - Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso e controle, segundo faixas etárias – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003..................................................................... 65

Lista de Gráficos

Gráfico 1 – Distribuição das faixas etária por grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003................................................................................. 57

Gráfico 2 – Dispersão da densidade de células de Langerhans segundo idade de 18 casos (NIC 3) -– Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003....... 59

Gráfico 3 – Dispersão da densidade de células de Langerhans segundo idade de 18 controles (epitélio escamoso normal) -– Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003...................................................................................................... 59

Lista de Figuras

Figura 1 – Diagrama de seleção das amostras........................................................................... 38 Figura 2 – Desenho a mão livre da área do epitélio escamoso em 10 campos ópticos de 400X,

para contagem de células de Langerhans .......................................................................... 52

XI

Lista de Fotos

Foto 1 – Epitélio escamoso do colo uterino, histologicamente normal, marcado com anticorpo anti-proteína S-100 (100X).................................................................................................. 26

Foto 2 – Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 100X) ..................................................... 39 Foto 3 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 400X) ...................................................... 40 Foto 4 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 25 X)

............................................................................................................................................ 40 Foto 5 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE,

100X) .................................................................................................................................. 41 Foto 6 – Corte de linfonodo histologicamente normal, empregado como controle de qualidade de

imuno-marcação por anticorpo anti-proteína S-100 (à esquerda – 100X, à direita – 400X) 46 Foto 7 - Corte de linfonodo histologicamente normal, empregado como controle de qualidade de

imuno-marcação por anticorpo anti-proteína S-100 (400x) ................................................. 46 Foto 8 – Grade de Weibel, com 10 mm de lado.......................................................................... 49 Foto 9 - Lâmina com escala micrométrica (seta), medindo 1 mm, dividida em 100 partes (0,01

mm)..................................................................................................................................... 49 Foto 10 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC

3 (400x)............................................................................................................................... 60 Foto 11 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC

3 (1000x) ............................................................................................................................. 60 Foto 12 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC




3 (1000x) ............................................................................................................................. 62 Foto 16 – – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in

situ/NIC 3 (1000x) ............................................................................................................... 63 Foto 17 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio escamoso normal (1000X) 63 Foto 18 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio ecamoso normal (100X) .... 66 Foto 19 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC

3 (100x)............................................................................................................................... 66 Foto 20 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC

3, extensivo às criptas glandulares (100x) .......................................................................... 66

XII

Lista de Siglas e Abreviaturas

AIDS – Síndrome de imunodeficiência adquirida (Acquired immune

defficiency syndrome)

APC – Célula apresentadora de antígeno (Antigen Presenting Cell)

CDC – Centro de Controle de Doenças (Center for Disease Control &

Prevention)

CL – células de Langerhans

HPV – Papiloma Virus Humano

IARC – Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (International

Agency for Research on Câncer)

IgG – Imunoglobulina G

IL – Interleucina

LT – Linfócitos T

MHC – Moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (Major

histocompatibility Complex)

NIC 3 – neoplasia intraepitelial cervical grau 3 / carcinoma

escamocelular in situ

NK – linfótico NK (Natural Killer)

OCE – Orifício cervical externa

TNF – Fator de necrose tumoral (tumoral necrosis factor)

XIII

SUMÁRIO

RESUMO..............................................................................................................................VIII ABSTRACT ............................................................................................................................ IX Lista de Tabelas .................................................................................................................X Lista de Gráficos ...............................................................................................................X Lista de Figuras...................................................................................................................X Lista de Fotos .....................................................................................................................XI Lista de Siglas e Abreviaturas....................................................................................XII

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 15 2 OBJETIVOS........................................................................................................................ 17 2.1 Geral ............................................................................................................................... 17 2.2 Específicos ..................................................................................................................... 17

3 REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................... 18 3.1 Células de Langerhans ................................................................................................... 18 3.2 Células de Langerhans e Papilomavírus humano........................................................... 24 3.3 Células de Langerhans e câncer de colo uterino............................................................ 31

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................... 35 4.1 Tipo de estudo ................................................................................................................ 35 4.2 Local e População de estudo.......................................................................................... 35 4.3 Material e seleção das amostras .................................................................................... 36 4.4 Tamanho amostral .......................................................................................................... 41 4.5 Variáveis e conceitos...................................................................................................... 43 4.5.1 Variável independente............................................................................................. 43 4.5.2 Variáveis dependentes............................................................................................. 43

4.6 Métodos.......................................................................................................................... 44 4.6.1 Recortes dos blocos de parafina .............................................................................. 44 4.6.2 Exame imuno-histoquímico ...................................................................................... 45 4.6.3 Análise morfométrica................................................................................................ 48 4.6.3.1 Seleção dos campos para análise quantitativa:............................................... 50 4.6.3.2 Determinação da área ocupada pelo epitélio escamoso (mm2) em ambos os

grupos.............................................................................................................. 51 4.6.3.3 Determinação da densidade de células de Langerhans por mm2.................... 53 4.6.3.4 Fórmulas utilizadas para cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso e

para a densidade das células de Langerhans por mm2 ................................... 55 4.7 Processamento e análise dos dados .............................................................................. 56 4.8 Aspectos éticos............................................................................................................... 56

5 RESULTADOS.................................................................................................................... 57 5.1 Densidade de células de Langerhans............................................................................. 58 5.2 Densidade de células de Langerhans dos grupos segundo faixas etárias ..................... 64 5.3 Distribuição das células de Langerhans no epitélio escamoso segundo grupos ............ 65

6 DISCUSSÃO....................................................................................................................... 67 7 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 74

XIV

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................... 75 9 APÊNDICES ....................................................................................................................... 81 9.1 Apêndice 1 - Protocolo experimental .............................................................................. 81 9.2 Apêndice 2 – Aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba........................................................... 83

Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de Langerhans no carcinoma escamocelular

in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica

15

1 INTRODUÇÃO

O Papiloma vírus humano tem sido confirmado pela

International Agency for Research on Cancer (IARC) como agente

responsável pelas lesões intraepiteliais e câncer do colo uterino,

estando presente em 99,7% dos cânceres cervicais (PEREYRA;

PARELLADA, 2003). A resposta imune celular do hospedeiro é um fator

importante no controle dessas infecções (WIELAND; PFISTER, 1999).

O carcinoma cervical é um dos grandes problemas de

saúde pública com relatos de 500.000 novos casos anualmente. É

doença neoplásica mais comum entre mulheres nos países pouco

desenvolvidos (NICOL; FERNANDES; BONECINI-ALMEIDA, 2005). No Brasil,

para 2006, são estimados 19,270 casos novos, dos quais 4.414 ocorrendo

na Região Nordeste e 160 casos no estado da Paraíba (BRASIL, 2005). A

mortalidade por câncer de colo de útero, em 2003, igualou-se a 4.202

casos no Brasil, sendo 1.087 na Região Nordeste e 47, no estado da

Paraíba (BRASIL, 2005).



16

O Center for Disease Control & Prevention (CDC) passou a

considerar, a partir de 1993, o câncer de colo uterino como uma

manifestação maior da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, por

ser uma forma de expressão do déficit da imunidade celular, com

redução dos linfócitos T CD4 (JACYNTHO, 2001).

Dentre as células do sistema imune, as células de

Langerhans são apresentadoras de antígeno profissionais (APC),

iniciadoras do reconhecimento imune. Capturam e transportam

antígenos aos linfonodos, onde os apresentam aos linfócitos para que

sejam reconhecidos (MALE, 1988).

O número, a distribuição e a morfologia das células de

Langerhans estão alterados nas infecções por HPV e nas lesões pré-

neoplásicas da cérvice uterina (HUBERT et al., 2005).

O conhecimento do comportamento imunológico celular

do colo do útero frente às lesões intraepiteliais induzidas pelo HPV não

acompanhou os avanços de diagnóstico dessas lesões.

Entender que o preenchimento desta lacuna pode

propiciar novas estratégias para prevenção e tratamento dessas lesões

e para o seguimento das portadoras, possibilitando modificar um

quadro de incidência e de mortalidade por câncer de colo do útero,

serviu de estímulo para a escolha do tema.



17

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Verificar a densidade de células de Langerhans no

carcinoma escamocelular in situ do colo do útero em relação ao

epitélio escamoso normal.

2.2 Específicos

� Caracterizar as portadoras de carcinoma escamocelular in situ e

de epitélio escamoso normal da cérvix uterina quanto à idade.

� Comparar a densidade de células de Langerhans no carcinoma

escamocelular in situ da cérvix uterina em relação ao epitélio

escamoso normal.

� Comparar a distribuição topográfica de células de Langerhans no

carcinoma escamocelular in situ da cérvix uterina em relação ao

epitélio escamoso normal..



18

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Células de Langerhans

As células de Langerhans foram assim denominadas em

homenagem a Paul Langerhans que as descreveu em 1868 pensando

tratar-se de uma célula nervosa receptora (DARVISHIAN et al., 2002)

Hoje as células de Langerhans são consideradas células apresentadoras

de antígenos, derivadas de precursores monócitos-macrófagos da

medula óssea. Representam 4% a 5% das células da epiderme (PEREIRA,

1999).

A célula CD34, derivada da medula óssea, é a precursora

de dois tipos celulares dendríticos imaturos: as células de Langerhans, de

distribuição epitelial, e as células dendríticas intersticiais. A geração

destes dois tipos celulares é conseqüente à participação de citocinas

(CORONATO et al., 1998).

As células de Langerhans no epitélio diferem das células

dendríticas presentes no estroma pela expressão de altos níveis de



19

receptores para a proteína E-caderina, a qual viabiliza sua adesão e

distribuição por entre os queratinócitos (DINIZ-FREITAS et al., 2005).

As células imaturas podem ser identificadas pelos seus

dendritos (em média de 12), que aumentam a superfície

imunologicamente reativa, e marcadores de superfície envolvidos na

apresentação de antígenos, que as tornam capazes de capturá-los e

apresentá-los aos linfócitos T (UCHIMURA, 2002). Essas células compõem

a imunidade inata e adaptativa (KATOU et al., 2000). São denominadas

células apresentadoras de antígeno profissionais (Antigen presenting

cell - APC), dada sua habilidade de não só apresentar antígenos aos

linfócitos T, mas promover sinais co-estimuladores para a ativação

desses linfócitos, sem os quais estes não se tornam efetores da

imunidade, tanto celular como humoral (ABBAS; LICHTMAN; POBER,

2003).

Os precursores das células de Langerhans migram da derme

para a epiderme em resposta à proteína MIP-3α, secretada por

macrófagos, bem como ao fator de necrose tumoral (TGF α), liberado

por queratinócitos (NICOL; FERNANDES; BONECINI-ALMEIDA, 2005;

PARDO-GOVES et al., 2005).

As características morfológicas e ultra-estruturais das células

de Langerhans puderam ser visualizadas, respectivamente, ao

microscópico óptico e à microscopia eletrônica, após coloração com



20

iodeto de zinco – tetróxido de ósmio, usada originalmente para corar

fibras nervosas (DARVISHIAN et al., 2002). Podem também ser

identificadas por métodos imuno-histoquímicos, dirigidos para

receptores e antígenos de superfície da membrana citoplasmática

(FADARE et al., 2005), dentre os quais está o S-100, que integra um grupo

de proteínas de superfície, vinculadas ao cálcio e relacionadas à

progressão, diferenciação e citotoxicidade do ciclo celular. Apenas um

terço das células de Langerhans é S-100 positivo.

A proteína S-100 reage bem como imunomarcador de

superfície, na identificação das células de Langerhans nos tecidos,

ainda que estes estejam congelados ou fixados em parafina, não

sofrendo alterações diante da presença de infiltrado inflamatório

(FADARE et al., 2005).

As células de Langerhans medem de 15 µm a 20 µm, no

maior diâmetro; apresentam núcleo vesicular, lobulado ou indentado

longitudinalmente, ribossomos livres, retículo endoplasmático rugoso,

mitocôndrias, complexo de Golgi, lisossomos e grânulos de Birbeck

(DARVISHIAN et al., 2002). Não têm desmossomos que as interliguem a

outras células (DINIZ-FREITAS et al., 2005).

Os grânulos de Birbeck são morfologicamente semelhantes

a raquetes e provavelmente se originam de invaginações da

membrana celular. São característicos das células de Langerhans



21

(NYLANDER et al., 1992). Apesar da função desses grânulos não estar

ainda bem identificada, acredita-se que constituem um compartimento

de reciclagem, provavelmente envolvido no processamento de

antígenos, que antecede sua apresentação aos linfócitos (MIZUMOTO;

TAKASHIMA, 2004).

Conforme sua localização no epitélio, os processos

dendríticos citoplasmáticos das células de Langerhans, variam em

número e disposição. (EDWARDS; MORRIS, 1995). Na camada basal,

apresentam um a dois dendritos, que podem se estender aos vasos do

estroma subepitelial, denotando transferência de informações

antigênicas para as células endoteliais. Na camada suprabasal, seu

citoplasma é escasso e os dendritos citoplasmáticos são numerosos,

distribuídos de forma difusa e arboriforme (KATOU et al., 2000).

Em condições normais, o número de células de Langerhans

é mantido homeostaticamente no epitélio com uma vida média de

nove dias (HUBERT et al., 2005).

Embora descobertas em 1868, as funções das células de

Langerhans estiveram desconhecidas até 1970, quando foram

descobertos certos receptores de superfície, que definem o modo

distinto com que elas reagem aos vários antígenos (DARVISHIAN et al.,

2002).



22

Estão presentes em vários sítios do corpo: pele, timo,

linfonodos, endotélio e mucosas (oral, do tubo digestivo, do trato

respiratório, vaginal, retal e cervical), nos quais apresentam diferentes

formas e funções (NYLANDER et al., 1992).

Em órgãos não linfóides, periféricos, são imaturas, hábeis a

capturar e processar antígenos, o que as torna ativadas, resultando em

uma dramática mudança na superfície celular e nas características

funcionais e fenotípicas. Assim, um pequeno número de células ativadas

é suficiente para iniciar uma potente resposta imune (ABBAS; LICHTMAN;

POBER, 2003).

As células de Langerhans influenciam tanto o tipo quanto a

quantidade da resposta imune (CHAPEL, MISBOH; SNOWSOWN, 2003).

Iniciam tanto a imunidade inata como a adaptativa contra agentes

antigênicos, atuando como sentinelas do sistema imunológico (ABBAS;

LICHTMAN; POBER, 2003).

A captura dos antígenos pelas células de Langerhans se faz

por fagocitose ou pinocitose (antígenos solúveis), pois apresentam

receptores que as capacitam a se ligar aos micróbios (UCHIMURA et al.,

2004).

A ativação das células de Langerhans, por meio de

componentes da superfície bacteriana, de citocinas inflamatórias (tais



23

como: TNFα, interleucina Iβ - IL-Iβ) e de eventos mediados por receptores

(BAKRI et al., 2001), faz com que super-expressem moléculas de

histocompatibilidade das classes I e II e moléculas co-estimulatórias

(como CD80 e CD86) e aumentem a secreção de citocinas, com o

objetivo de facilitar a apresentação e a sensibilização de linfócitos T

CD4 nativos e CD8 (CHAPEL; MISBOH; SNOWDOWN, 2003). Ativadas,

adquirem dendritos mais pronunciados e iniciam a expressão de outros

marcadores de superfície como o CD83, o qual as identifica como

maduras. Procedem também à super-expressão de receptores para E-

caderina, assim como das moléculas de CD1A e de langerin, uma

proteína envolvida no tráfego de partículas capturadas dos grânulos de

Birbeck para os receptores MHC classe II (RODRIGUES-SASTRE et al.,

2004).

Perdem então sua adesividade ao epitélio e migram para

fora dos tecidos periféricos (FAUSCH et al., 2002). Durante a migração,

as células maduras tornam-se capazes de apresentar os antígenos aos

linfócitos T e estimulá-los (PARDO-GOVES et al., 2005). As células de

Langerhans migram de uma região para outra em curto espaço de

tempo, facilitando a passagem da informação antigênica aos linfócitos

da pele e aos linfonodos (MIZUMOTO; TAKASHIMA, 2004).

Para uma ativação dos linfócitos T, a união destes com as

células de Langerhans deve ser estável e duradoura, alcançando o



24

limiar de sinalização necessário aos linfócitos. Esta estabilidade é dada

por moléculas de adesão situadas nas células T, cujos ligantes estão

expressos nas células de Langerhans, sendo o mais importante a

molécula denominada ICAM-I, da família das integrinas (ABBAS;


Também no epitélio escamoso do colo uterino, as células

de Langerhans estão distribuídas normalmente por entre as camadas

basais e suprabasais, respondendo por sua vigilância imunológica

(MALE, 1988).

3.2 Células de Langerhans e Papilomavírus humano

Pouco se sabe sobre os fatores que controlam o número,

distribuição e atividade funcional das células de Langerhans na

infecção pelo papilomavírus humano, todavia a densidade, a

distribuição e a morfologia dessas células alteram-se nas infecções por

HPV e nas lesões pré-neoplásicas (HERTEL et al., 2003)

Para que se compreendam os processos fisiológicos que

ocorrem no epitélio do colo uterino na infecção por papilomavirus

humano, é necessário o conhecimento de alguns de seus aspectos

histológicos.



25

O colo uterino é revestido por epitélio escamoso, assim

denominado pelo modo com que estão dispostas as células que o

constituem. Histologicamente, divide-se em três zonas: zona basal,

germinativa, responsável pela renovação contínua do epitélio; zona

intermediária, também denominada estrato espinhoso, o qual constitui

a maior parte da sua espessura e zona superficial, formada pela

população de células mais maduras do epitélio com função de

proteger as camadas epiteliais abaixo e a vasculatura subepidérmica

contra traumas e infecções (FERENCZY WINCLE, 1987) (Foto 1).

A camada basal é formada por:

• células basais, com diâmetro médio de 10 µm, indiferenciadas,

têm núcleo arredondado, central, vesicular orientado

perpendicularmente em relação à lâmina basal e pequena

rima de citoplasma. Estas células ancoram o epitélio à

membrana basal por meio hemidesmossomos (DEMAY, 1996).

• células parabasais: assim denominadas devido a sua

topografia no epitélio, logo acima das células basais.

Apresentam–se mais largas (15 µm – 30 µm); o núcleo é

redondo, finamente granular. Ultraestruturalmente, possuem

pontes intercelulares e microvilos longos, fixados pelos

desmossomos (DEMAY, 1996).



26

As células de Langerhans estão presentes na zona basal do

colo uterino (CONNOR et al., 1999) (Foto 1).

Foto 1 – Epitélio escamoso do colo uterino, histol ogicamente normal, marcado com anticorpo anti-proteína S-100 (100X) Observar a distribuição das células de Langerhans nas zonas histológicas predominando nas camadas basal e para-basal

A principal função das células que compõem a zona basal

está na regeneração do epitélio. Assim, possuem, em grande número,

receptores de superfície para o fator de crescimento epidérmico, os

quais são observados em quantidade decrescente à medida que o

epitélio escamoso se diferencia em direção a camada intermediária e

superficial (DEMAY, 1996). Estas células possuem receptores hormonais

no núcleo e são as únicas que normalmente se dividem e também

Zona superficial

Zona intermediária

camada para-basal

camada basal

Célula de Langerhans

Zona basal

Zona superficial

Zona intermediária

camada para-basal

camada basal

Célula de Langerhans

Zona basal



27

participam da produção da membrana basal (GROSS; BARRASSO,

1999).

O epitélio escamoso estratificado não queratinizado bem

como o epitélio colunar mucossecretor da cérvice contrapõem-se aos

agentes biológicos patogênicos, constituindo-se assim na primeira linha

de defesa da imunidade inata (imunidade inespecífica que não requer

contato prévio com o patógeno) (ABAS; LICHTMAN; POBER, 2003).

Integram esta barreira epitelial, células especializadas em concentrar o

antígeno, promovendo a interação deste com o sistema imune:

neutrófilos, linfócitos intraepiteliais, monócitos, macrófagos e células de

Langerhans (WRIGHT; KURMAN; FERENCZY, 2001).

A infecção por HPV leva a um efeito imunossupressivo

resultando em neoplasias, como conseqüência de alterações no

desempenho das células apresentadoras de antígeno, que expressam

proteína S-100, dentre as quais estão as células de Langerhans

(CONNOR et al., 1999), envolvidas nos primeiros degraus da resposta

imune primária em um grande número de neoplasias malignas epiteliais

(COX, 2003; EDWARDS; MORRIS, 1995).

Em todas as células apresentadoras de antígeno, algumas

proteínas envolvidas na apresentação do antígeno são moduladas por

infecção viral produtiva (KIRNBAUER et al., 1992).



28

O vírus do papiloma humano adentra o epitélio escamoso,

através de micro-erosões, alcançando a camada basal, e Infectando a

célula escamosa, através da identificação com antígenos de superfície

(tropismo viral). Uma vez na célula, o genoma viral poderá ou não

integrar-se ao genoma do hospedeiro.(GROSS;BARRASSO, 1999)

A integração do genoma viral ao do hospedeiro se faz de

modo aleatório, o que permite que ocorra próxima a genes importantes

do hospedeiro, favorecendo a rápida transformação maligna celular.

Alterado o código genético, há modificações não só no fenótipo, mas

também nos antígenos de superfície (chamados antígenos tumorais), na

produção protéica celular, na produção de TNF α, GM-CSF, IL-I e

redução da E-caderina (MATTHEWS et al., 2003).

Como resposta inicial à infecção viral, as células de

Langerhans são mobilizadas e migram para os linfonodos locais,

reduzindo sua densidade no epitélio. Em aproximadamente cinco dias

após a infecção viral, a densidade destas células no local da infecção

volta ao normal. No entanto, se persistir a infecção, ocorre redução das

células de Langerhans mediada pelo vírus.

O mesmo fenômeno é observado na infecção pelo HIV,

contudo este vírus é capaz de infectar as células de Langerhans

exercendo influência direta no número e função destas na epiderme, o

que não é observado em relação ao HPV (VISCIDI; SHAH, 1992).



29

Infectando a célula escamosa, o vírus lança mão de

mecanismos para evadir-se da imunidade celular, dentre os quais, a

latência viral. Mesmo após o genoma viral estar presente na célula

escamosa, o vírus não exerce sobre ela qualquer efeito citopático

(alteração da produção protéica podendo provocar lise e morte

celular). Desta forma, a expressão pelo MHC-I dos antígenos virais na

superfície das células infectadas estará parcial ou totalmente

comprometida, do que decorre a persistência viral. A imunidade celular

não é capaz de erradicar o vírus de modo que a infecção permanece

em baixos níveis, levando a uma adaptação da vigilância imunológica

celular à presença dos peptídeos virais na superfície das células

infectadas.

Outro mecanismo de escape viral às defesas imunológicas

são as possíveis variações antigênicas no vírus capazes de camuflá-lo

das células imunes. Esse fato pode explicar a persistência viral no

hospedeiro sem a ocorrência de lesões epiteliais, como também a

recorrência das lesões virais por longo período (RIETHDORF et al., 1996).

Aventou-se ainda a hipótese que o HPV pudesse interagir

com as células de Langerhans intraepiteliais, as quais não iniciariam

uma resposta imune contra o vírus (KIRNBAUER et al., 1992). Este fato foi

comprovado experimentalmente introduzindo-se partículas semelhantes

às virais (VLP – virus like particles), utilizadas nas vacinas para o HPV-16 e



30

baseadas nas proteínas L1 e L2. Observou-se que as células dendríticas

existentes no estroma assim como as células de Langerhans

internalizaram tais partículas, no entanto estas não foram ativadas,

mostrando-se inábeis para iniciar uma resposta específica contra o HPV,

mediada por células T.

A inabilidade das células Langerhans em ativar os linfócitos

T sugere que permanecem imaturas ou inativadas, mesmo após o

contato com o vírus. Essa inabilidade parece explicar a capacidade de

as células de Langerhans reterem por longo tempo partículas virais,

comportando-se, portanto, como um reservatório e sítio de latência

viral, cuja reativação ocorre após a ação de citocinas pró-inflamatórias

ou estimulação alogênica (FAUSCH et al., 2002).

Não há evidência da competência do HPV em infectar ou

replicar nas células de Langerhans (HERTEL et al., 2003). Supõe-se que a

redução da densidade destas células, mediante a infecção viral, pode

ocorrer devido a um efeito indireto, mediado pelo vírus, relacionado à

redução da expressão de E-caderina nos queratinócitos infectados, de

modo a influenciar a permanência das células de Langerhans, entre as

células epiteliais escamosas, pelo fato de possuírem receptores para E-

caderina em sua superfície. Há relatos de que a redução de E-caderina

seria causada pela proteína E6 do HPV-16, que também parece inibir os

sinais para migração e maturação das células de Langerhans.



31

3.3 Células de Langerhans e câncer de colo uterino

As células de Langerhans envolvem-se na resposta imune

contra tumores quando ingerem os antígenos tumorais expressos nas

células que sofreram transformação maligna, apresentando-os aos

linfócitos T, através das moléculas de MHC classe II. Deste modo os

antígenos tumorais são reconhecidos pelos linfócitos T (CHAPEL; MISBOH;

SNOWDOWN, 2003).

Os linfócitos T ativados são capazes de matar células

tumorais, que expressam antígenos relevantes. Este tem sido um

mecanismo pelo qual os imunologistas tumorais têm aperfeiçoado

estratégias para estimular a imunidade anti-tumor, sendo a

imunoterapia um recurso bastante promissor por não comprometer

células normais de tecido como ocorre com a radioterapia e

quimioterapia aplicadas em câncer avançado (ABBAS; LICHTMAN;

POBER, 2003).

Recentemente, é de grande interesse o estudo de células

dendriticas, dentre estas as células de Langerhans (isolando precursores

do sangue e expandindo-os em cultura com fatores do crescimento)



32

para serem usadas como vacinas, após exposição a agentes tumorais

(ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).

Alguns relatos mostram que o desenvolvimento das lesões

intraepiteliais está associado com o aumento nas células de Langerhans

por incremento prévio das proteínas inflamatórias quimioatrativas

derivadas de macrófago. Mesmo assim, o crescimento tumoral ocorre,

denotanto uma falha do sistema imunológico.

O crescimento tumoral supera a reação imune do

hospedeiro, talvez pelos antígenos tumorais serem fracamente

imunogênicos, pois diferem pouco dos antígenos próprios (ABBAS;


Várias hipóteses têm sido propostas para explicar a

deficiência imune observada nas lesões pré-neoplásicas induzidas pelo

HPV no colo uterino, já que, nas mulheres com lesões intraepiteliais, a

habilidade de formar células de Langerhans, a partir de precursores de

medula óssea, se mantém inalterada (KADISH et al., 2002).

Os queratinócitos podem produzir citocinas

imunorregulatórias, que têm efeito sobre as células de Langerhans, ou

ainda podem sofrer transformação mediante infecção viral, reduzindo

sua produção de citocinas. Uma dessas citocinas é o fator estimulador

de crescimento de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), cuja



33

deficiência reduz o estímulo quimioatrativo para a migração contínua e

para maturação e diferenciação das células de Langerhans e das

dendríticas (HERTEL et al., 2003).

Outra hipótese para a redução da densidade epitelial das

células de Langerhans é a possibilidade da super-expressão nas lesões

intraepiteliais da IL-10, uma citocina imunossupressora. O decréscimo

das células de Langerhans, nessas lesões, sugere um distúrbio na

imunidade celular nas infecções pelo papilomavírus humano (KADISH et

al., 2002).

As neoplasias podem indicar também uma possível falha

nas células profissionais apresentadoras de antígenos em mediar ou

potencializar a resposta imune, do que deriva o crescimento tumoral

(CHAPEL; MISBOH; SNOWDOWN, 2003).

A diminuição ou ausência das células de Langerhans no

epitélio resulta em diminuição da responsividade a antígenos cutâneos,

com conseqüente vulnerabilidade daquele a infecções e neoplasias

(SOBHANI et al., 2000).

As células de Langerhans podem também não apresentar

antígenos por falha na ação das integrinas, responsáveis por estabilizar

a ligação dessas células aos linfócitos T por um período longo o

suficiente para que ocorra a ativação linfocitária, ou ainda por



34

interferências nas moléculas co-estimuladoras, sem as quais a ativação

das células T não se faz (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).

Um mecanismo redutor da imunidade celular é a indução

da tolerância, derivada da persistência da infecção produtiva viral em

baixos níveis, mediante apresentação dos antígenos virais por longo

tempo através dos queratinócitos.

Outro mecanismo da falha imunológica refere-se à

intrínseca relação entre a ação imune e os níveis hormonais. O período

do ciclo menstrual é critico em definir a resposta imune aos antígenos

inoculados, provavelmente pela imunossupressão provocada pela

ação da progesterona, cuja estrutura química em muito se assemelha a

dos glicocorticóides, os quais são imunossupressores (BLACK et al., 2000).

A presença de células dendríticas em tumores e áreas

peritumorais, bem como nos linfonodos regionais, tem demonstrado

correlação com melhor prognóstico (ZHANG, 1992).



35

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Tipo de estudo

O estudo foi prospectivo, observacional, tipo caso controle.

4.2 Local e População de estudo

Dois foram os locais de estudo. No Setor de Histopatologia

do Centro de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, localizado

na cidade de João Pessoa, foram obtidos blocos de parafina contendo

material de biópsias de colo do útero ou secções histológicas de colo

de útero obtidas de peças cirúrgicas de histerectomia, encaminhadas

para exame histopatológico, como parte da rotina do programa de

prevenção do colo do útero e tratamento de doenças uterinas,

respectivamente.

No Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de

Pernambuco, localizado na Cidade do Recife – Pernambuco, os blocos



36

de parafina contendo fragmentos teciduais do colo do útero foram

submetidos a recortes. Esses cortes histológicos foram, então,

processados como de rotina, em hematoxilina-eosina e também

submetidos a exame imuno-histoquímico com posterior análise

morfométrica.

4.3 Material e seleção das amostras

A partir do banco de dados correspondente a biópsias

cervicais realizadas no período de Janeiro a Dezembro de 2003, foram

selecionados, baseados no relatório histopatológico original, 68 casos

diagnosticados como carcinoma escamocelular intra-epitelial

(carcinoma escamocelular in situ/NIC 3) em mulheres com vida sexual

ativa, conforme dados presentes no prontuário do serviço.

Numa segunda etapa, considerando-se a alta relevância

da idade e do estado gestacional na resposta imune, decidimos

trabalhar apenas com a faixa etária de 20 a 40 anos e mulheres não

gestantes. Assim, foram excluídos nesta etapa 37 amostras, passando, o

material a constituir de 31 casos de neoplasia escamocelular in situ/NIC

3 (grupo caso).



37

Para formar o grupo controle (epitélio escamoso normal),

retiraram-se do banco de dados 31 amostras obtidas por biópsia

cervical ou histerectomia, representadas por fragmentos de colo uterino

com epitélio escamoso dentro dos limites normais e obedecendo aos

mesmos critérios de inclusão aplicados ao grupo caso (NIC 3), isto é,

oriundas de mulheres com vida sexual ativa, não gestantes, na faixa

etária entre 20 e 40 anos. Tomou-se o cuidado de manter a

equivalência entre as idades deste grupo e as contempladas no grupo

caso.

Numa terceira etapa, foram feitos recortes dos blocos de

parafina correspondentes ao material de ambos os grupos e as lâminas

obtidas foram revistas pela autora e professora orientadora. Incluíram-

se, no estudo, as amostras cujas preparações histológicas estavam em

boas condições para confirmação do diagnóstico e realização do

exame imuno-histoquímico: cortes inteiros, não fragmentados, ausência

de autólise, hemorragia e exsudato inflamatório significativo.

Esta ultima etapa resultou na exclusão de 26 amostras,

sendo 13 em cada grupo, permanecendo 18, representativas do grupo

caso (NIC 3), e 18, do grupo controle (epitélio escamoso normal).

O diagrama da seleção das amostras pode ser visto na

Figura 1.



38

Figura 1 – Diagrama de seleção das amostras

Banco de dados de relatórios histopatológicos do Centro de Diagnóstico de Câncer do estado da Paraíba – Janeiro-Dezembro 2003

Idade de 20 a 40 anosNão gestantes

Vida sexual ativa

68 casos (NIC 3)

31 casos (NIC 3)

carcinoma escamocelular in situ / NIC 3

Equivalência de idade

Amostras adequadas (NIC 3 e de epitélio escamoso normal) para diagnóstico histopatológico e exame imuno-histoquímico

18 casos(NIC 3)

18 controles(epitélio escamoso normal)

Incluídos13 casos(NIC 3)


Excluídas26 amostras

1ª etapa - Critérios de inclusão

AMOSTRA ANALISADA


Excluídas37 amostras31 controles

(epitélio escamoso normal)

Vida sexual ativa

Epitélio escamoso normal

Critérios de inclusão

Não gestantes

Idade de 20 a 40 anos

3ª etapa Critério de inclusão

Banco de dados de relatórios histopatológicos do Centro de Diagnóstico de Câncer do estado da Paraíba – Janeiro-Dezembro 2003

Idade de 20 a 40 anosNão gestantes

Vida sexual ativa

68 casos (NIC 3)

31 casos (NIC 3)

carcinoma escamocelular in situ / NIC 3

Equivalência de idade

Amostras adequadas (NIC 3 e de epitélio escamoso normal) para diagnóstico histopatológico e exame imuno-histoquímico

18 casos(NIC 3)


Incluídos13 casos(NIC 3)


Excluídas26 amostras


AMOSTRA ANALISADA


Excluídas37 amostras31 controles

(epitélio escamoso normal)

Vida sexual ativa

Epitélio escamoso normal

Critérios de inclusão

Não gestantes

Idade de 20 a 40 anos

3ª etapa Critério de inclusão



39

A revisão das preparações histológicas para confirmação

do diagnóstico de NIC 3 foi realizada segundo os critérios da OMS:

[...] maturação (incluindo queratinização superficial) pode

estar presente, mas confinada ao terço superior do epitélio. As

anormalidades nucleares são marcantes em toda espessura do

epitélio. As mitoses anormais são freqüentes (WELLS et al., 2003,

p. 270).

Nas Fotos 2, 3, 4 e 5, observam-se as preparações

histológicas com diagnóstico de NIC 3.

Foto 2 – Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 100X)

Notar o contraste entre a área de epitélio escamoso com NIC 3 (à esquerda), caracterizada por atipismo nuclear em toda a espessura do epitélio e o epitélio escamoso normal (à direita)



40

Foto 3 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (HE, 400X)

Notar a alta relação núcleo-citoplasma em toda a espessura do epitélio, bem como o aumento do número de mitoses (setas)

Foto 4 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 25 X)



41

Foto 5 - Carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, com extensão às criptas glandulares (HE, 100X)

À direita, observa-se a preservação do epitélio glandular endocervical, ainda não completamente substituído pela NIC 3.

4.4 Tamanho amostral

Para cálculo do tamanho amostral, admitiram-se:

� Proporção entre casos e controles (escolha da pesquisadora) = 1,00

(um caso para um controle);

� Menor Odds-Ratio que a pesquisadora aceitou no estudo = 22,91

(valor igual à estimativa do INCA de câncer do colo do útero, para

2005, em João Pessoa) (BRASIL, 2005);



42

� Percentual de controles em risco de câncer do colo do útero = 3,62

(incidência de câncer do colo do útero, em 2005, em João Pessoa)

(BRASIL, 2005);

� nível de significância = 0,05;

� poder de prova = 80%,

O tamanho amostral foi estimado em 40 fragmentos de colo

de útero, sendo 20 casos (obtidos por biópsia de mulheres com

diagnóstico de carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, confirmado por

exame histopatológico de acordo com os critérios da Organização

Mundial de Saúde) e 20 controles (obtidos por biópsia de mulheres,

histologicamente livres de neoplasias intraepiteliais cervicais).

Aplicados os critérios de inclusão e de exclusão, o tamanho

amostral analisado igualou-se a 36 espécimes, sendo 18 casos (grupo

caso) e 18 controles (grupo controle), equivalentes quanto à idade,

correspondendo a um poder de prova de 91,5%, ao nível de

significância de 0,05.



43

4.5 Variáveis e conceitos

4.5.1 Variável independente

A variável independente foi o diagnóstico histopatológico,

firmado pela observação microscópica dos corte corados pela

hematoxilina-eosina. Foi categorizado em: carcinoma escamocelular in

situ/NIC 3 e epitélio escamoso normal.

4.5.2 Variáveis dependentes

� Idade – conceituada como o número de anos de vida

constante no prontuário da mulher. Foi categorizada em

intervalos de classe: 20 – 25; 26 – 30; 31 – 35 e 36 – 40.

� Densidade de células de Langerhans – considerada

como o número de células de Langerhans existentes em

1 mm2 de epitélio escamoso de colo do útero. Foi

expressa pelos parâmetros estatísticos de valor mínimo,

máximo, média e desvio padrão.



44

� Distribuição topográfica das células de Langerhans – foi

considerada como a localização dessas células na

espessura do epitélio escamoso do colo do útero. Foi

categorizada como: em zona superficial; em zona

intermediária e em zona basal.

4.6 Métodos

Na presente dissertação, foram empregados: recortes dos

blocos de parafina para confecção de preparações histológicas de

rotina (HE), exame imuno-histoquímico e análise morfométrica.

4.6.1 Recortes dos blocos de parafina

Em cada bloco de parafina correspondente ao grupo caso

(NIC 3) e grupo controle (epitélio escamoso normal), foram efetuados

dois recortes histológicos em micrótomo manual, de 3 µm a 4 µm de

espessura.

Uma das duas secções teciduais de cada paciente foi

corada pela técnica da hematoxilina-eosina (HE), montada em



45

Bálsamo do Canadá contra lamínula e observada à microscopia óptica

de campo claro, para diagnóstico histológico, realizado pela

pesquisadora e pela professora orientadora.

A outra secção foi utilizada para o exame imuno-

histoquímico e análise quantitativa.

4.6.2 Exame imuno-histoquímico

Para a imunomarcação, foi utilizado o anticorpo

antiproteína S100 da DAKO®, adquirido com o apoio financeiro da

Secretaria de Saúde do estado da Paraíba – Núcleo de Prevenção do

Câncer.

Realizou-se controle de qualidade do imunomarcador

empregando secções histológicas de linfonodos histologicamente

normais, selecionados a partir dos arquivos do Departamento de

Patologia do Hospital de Câncer de Pernambuco (Fotos 6 e 7).



46

Foto 6 – Corte de linfonodo histologicamente norma l, empregado como controle de qualidade de imuno-marcação por anticorpo anti-prot eína S-100 (à esquerda – 100X, à direita – 400X) Observar imuno-marcação das células de Langerhans, caracterizadas pela coloração marrom, em contraste com a negatividade do tecido linfático. Notar a concentração de células de Langerhans na zona para-cortical, em torno do folículo linfático (setas).

Foto 7 - Corte de linfonodo histologicamente norma l, empregado como controle de qualidade de imuno-marcação por anticorpo anti-prot eína S-100 (400x) Observar imuno-marcação das células de Langerhans, caracterizadas pela coloração marrom, em contraste com a negatividade do tecido linfático. Notar o aspecto estrelado das células de Langerhans, dado pelas projeções dendríticas (seta).



47

A segunda secção de cada paciente da amostra

analisada foi submetida a desparafinação e clareamento em banho de

xilol e etanol, de acordo com o procedimento padrão em

histotecnologia (FREITAS NETO et al., 2003). As lâminas foram imersas em

banho de solução de citrato de sódio a 5% e colocadas em forno de

microondas por duas sessões de 10 minutos cada uma, para

recuperação antigênica das amostras. Foi utilizada uma solução de

metanol a 2% em peróxido de hidrogênio, para bloqueio da peroxidase

endógena.

O anticorpo anti-proteína S-100 foi diluído a 1:1000 em

tampão salina fosfato, em câmara úmida a 4° C, por 12 horas.

Para a visualização da imuno-marcação, foi empregado o

kit de revelação Liquid DAB - LSAB2-Plus, da marca DAKO®, e a 3’ 3 –

diaminobenzidina.4 HCl como cromógeno.

As preparações histológicas correspondentes a imuno-

marcação foram montadas com Bálsamo do Canadá, contra lamínula.

Foram revistas em conjunto pela autora e pela professora orientadora. A

célula de Langerhans foi identificada pela imuno-marcação para

proteína S100 expressa pela cor castanha do citoplasma e do núcleo e

pelo seu citoplasma peculiar com projeções dendríticas (Foto 7).



48

4.6.3 Análise morfométrica

A utilização da morfometria seguiu a metodologia de

pesquisa do Programa de Pós-graduação em Patologia pela

Universidade Federal de Pernambuco, iniciada há cerca de 20 anos

pelo Professor Adonis Carvalho.

A fundamentação teórica e prática para a utilização da

estereologia foi obtida nos textos de Weibel (1979), Baak e Oort (1983) e

Elias e Hyde (1983).

As contagens foram feitas pela autora, utilizando um

retículo quadriculado (grade de Weibel) adaptado à ocular do

microscópio. Dito retículo mede dez milímetros de cada lado e contém

400 intersecções que delimitam 400 quadrículos (Foto 8).

Visando evitar quantificações super-estimadas, optou-se por

considerar na contagem as células de Langerhans representadas pelo

corpo celular e respectivo núcleo, desprezando aquelas caracterizadas

apenas pelos prolongamentos citoplasmáticos (dendritos). Foi utilizado,

para a contagem das células de Langerhans, um microscópio óptico

binocular (Olympus CX). A calibração da magnificação de 400X do



49

microscópio foi feita pela utilização de uma lâmina contendo escala de

1 mm dividida em 100 partes iguais (escala micrométrica) (Foto 9).

Foto 8 – Grade de Weibel, com 10 mm de lado

Foto 9 - Lâmina com escala micrométrica (seta), me dindo 1 mm, dividida em 100 partes (0,01 mm)



50

A medida da grade de Weibel, no aumento de 400X, foi

aferida pela superposição da sua imagem à lâmina contendo a escala

micrométrica. Nesse aumento, a grade Weibel mede 0,25mm de cada

lado, com área total de 0,062mm2. Cada quadrículo delimitado pelas

intersecções corresponde a uma área de 0,000015mm2.

Os corpos celulares com imunomarcação para o anticorpo

anti-proteina S100, foram quantificados em dez campos de 400X para

cada amostra do grupo caso (NIC 3) e do grupo controle (epitélio

escamoso normal). Para padronização da avaliação, foram excluidos

da contagem os corpos celulares vistos na intersecção com o limite

superior e o lateral esquerdo da grade.

4.6.3.1 Seleção dos campos para análise quantitativa:

Inicialmente, tanto no grupo caso (NIC 3) como do grupo

controle (epitélio escamoso normal), os campos mais representativos

foram identificados, em menor aumento (100X), nas preparações

coradas pelo HE e marcados com caneta indelével. Através da

superposição das lâminas coradas em HE com as equivalentes,

submetidas a imuno-histoquímica (S100), a marcação da área

estudada foi localizada e repassada à preparação histológica



51

correspondente. Para a contagem, selecionaram-se as áreas de maior

celularidade das células de Langerhans, vizualizadas no pequeno

aumento (50X), nas preparações submetidas a imuno-histoquímica. Foi

elaborado um formulário para a pesquisa das células de Langerhans

(Apêndice 1) sob orientação da Professora orientadora.

4.6.3.2 Determinação da área ocupada pelo epitélio escamoso (mm2)

em ambos os grupos

Como o tamanho e o formato dos cortes histológicos

correspondentes ao epitélio escamoso examinado (e

conseqüentemente a sua área) variava em cada preparação

histológica e em cada campo examinado, o formulário incluiu, ainda,

um diagrama da grade de Weibel, sobre o qual a autora desenhou, à

mão livre, a área representada pelo epitélio escamoso para cada caso,

em cada um dos dez campos examinados, em ambos os grupos (Figura

2).

À maneira da contagem histológica das células de

Langerhans, foram excluídos da contagem os quadrículos ocupados

parcialmente pelo epitélio escamoso no limite superior da grade e no

limite lateral esquerdo, no desenho à mão livre.

Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-

histoquímica

52

Figura 2 – Desenho a mão livre da área do epitélio escamoso em 10 campos ópticos de 400X, para contag em de células de Langerhans

Miranda, W.K. Estudo quantitativo das células de langerhans no carcinoma escamocelular in

situ do colo uterino – análise morfométrica e imuno-histoquímica

53

Desse modo, foi calculada a área do epitélio escamoso, em

ambos os grupos e em cada um dos dez campos examinados, obtida

por meio da soma dos quadrículos correspondentes ao desenho do

epitélio escamoso.

O cálculo do número de células de Langerhans/mm2 levou

em consideração a área ocupada pelo epitélio escamoso examinado

em cada um dos dez campos contados para cada caso.

4.6.3.3 Determinação da densidade de células de Langerhans por mm2

A cada contagem, no formulário elaborado para esta

pesquisa (Apêndice 1), registraram-se o número de quadrículos da

grade morfométrica de Weibel ocupados pelo epitélio escamoso no

campo microscópico submetido a exame e o número de células de

Langerhans identificadas.

O início da contagem das células de Langerhans foi

realizado da seguinte forma:

Para o grupo caso (NIC 3):

a) a partir de um dos bordos do epitélio escamoso com NIC 3 ou

b) a partir da transição epitélio normal/NIC 3, iniciando a

contagem na área de NIC 3.



54

Para o grupo controle:

a) a partir de um dos bordos do epitélio escamoso normal ou

b) a partir da zona de transformação.

As abordagens “b” foram preferenciais, sempre que as

áreas em tela estavam presentes nos cortes histológicos selecionados. O

objetivo foi observar modificações na quantidade de células de

Langerhans em zona de transformação no grupo controle (epitélio

escamoso normal), onde costuma ser mais freqüente o

desenvolvimento das neoplasias intra-epiteliais cervicais. No grupo caso

(NIC 3), a abordagem visou detectar uma possível concentração das

células de Langerhans na área de NIC 3, mais próxima ao epitélio

malpighiano normal.

Para cada paciente, foram calculados média e desvio

padrão do número de células de Langerhans e do número de

quadrículos da grade morfométrica de Weibel ocupados pelo epitélio

escamoso, no campo microscópico submetido a exame.



55

4.6.3.4 Fórmulas utilizadas para cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso e para a densidade das células de Langerhans por mm2

quadrículo cada de área à entecorrespond constante, fator 400

0,062

examinados campos 10 nos escamoso epitélio

pelo ocupados Weibelde grade da squadrículo de número n

escamoso epitélio pelo ocupada área A

onde400

0,062n A

esc q

esc

esc qesc

→

→→

×=

Fórmula 1 – Cálculo da área ocupada pelo epitélio escamoso

escamoso epitélio pelo ocupada área A

examinados campos 10 nos Langerhans de células de número n

mm por Langerhans de células das densidade D

A

n D

esc

CL

2CL

esc

CLCL

→→→

=

onde

Fórmula 2 – Cálculo da densidade de células de Langerhans



56

4.7 Processamento e análise dos dados

Os dados foram organizados por meio do programa

Statistical Package for Social Sciences (SPSS), versão 13.0. Da estatística

descritiva empregaram-se média, desvio padrão, variância e

distribuição de freqüências absolutas e relativas.

Foram empregados o teste t de Student para diferenças de

médias de amostras pareadas e o teste de χ2 para teste de associação

de variáveis, ambos ao nível de significância de 0,05.

Os resultados foram apresentados em tabelas e gráficos

obedecidas as normas do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística.

4.8 Aspectos éticos

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa

do Hospital Universitário Lauro Wanderley, situado na cidade de João

Pessoa, Paraíba, sob número 600 (Apêndice 2).



57

5 RESULTADOS

Foram analisados os dados de 36 mulheres, divididas em

dois grupos: caso e controle. No grupo caso (NIC 3), a idade média

igualou-se a 32,17 ± 5,42 anos e variou entre 20 e 40 anos. No grupo

controle (epitélio escamoso normal), a média etária igualou-se a 33,94 ±

4,96 anos, com variação entre 23 e 40 anos. Os grupos caso (NIC 3) e

controle (epitélio escamoso normal) não diferiram significantemente

quanto à distribuição etária (F = 1,054 , p = 0,312) (Gráfico 1)

2 2

4

3

5

4

7

9

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

freqüência

20 - 25 26 - 30 31 - 35 36 - 40faixas etárias

casos (NIC 3) controles (epitélio escamoso normal)

Gráfico 1 – Distribuição das faixas etária por grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003



58

5.1 Densidade de células de Langerhans

Na Tabela 1, estão expressos limites mínimo e máximo,

média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans

segundo grupos caso (NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal).

Os intervalos de variação da densidade de células de

Langerhans foram 5,06 – 25,02 células/mm2 e 1,26 – 3,62 células/mm2,

nos grupos caso (NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal),

respectivamente (Tabela 1).

Houve diferença estatisticamente significante da densidade

média de células de Langerhans entre o grupo caso (NIC 3) e o controle

(epitélio escamoso normal) (F = 63,009, p < 0,001). A densidade média

de células de Langerhans igualou-se a 12,79 ± 5,48 células/mm2 e 2,44 ±

0,79 células/mm2 (Tabela 1).

Tabela 1 – Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans segundo grupo – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003

GRUPOS DENSIDADE DE CÉLULAS DE

LANGERHANS caso (NIC 3) controle (epitélio escamoso

normal) Mínimo 5,06 1,26 Máximo 25,02 3,62 Média 12,79 2,44 Desvio-padrão 5,48 0,79

F = 63,009, p < 0,0001



59

Nos Gráficos 2 e 3, está representada a dispersão da

densidade de células de Langerhans nos grupos caso (NIC 3) e controle

(epitélio escamoso normal), respectivamente.

idade dos casos

5040302010

dens

idad

e (c

élul

a/m

m2)

30

20

10

0

Gráfico 2 – Dispersão da densidade de células de L angerhans segundo idade de 18 casos (NIC 3) -– Centro Diagnóstico do Câncer do es tado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003

idade dos controles

50403020

dens

idad

e (c

élul

a/m

m2)

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

Gráfico 3 – Dispersão da densidade de células de L angerhans segundo idade de 18 controles (epitélio escamoso normal) -– Centro Diag nóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003



60

Comparando os grupos caso (NIC 3) (Fotos 10 a 16) e

controle (epitélio escamoso normal) (Foto 17), equivalentes em relação

à idade das pacientes, quanto à densidade de células de Langerhans,

identificou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos

(t=17,458, p < 0,001).

Foto 10 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (400x) Notar o atipismo celular das células escamosas caracterizado por núcleos aumentados, hiper cromáticos com variação de forma e tamanho, em toda a espessura do epitélio. As células de Langerhans encontram-se distribuídas em todos os níveis do epitélio.

Foto 11 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar as células de Langerhans em meio às células escamosas atípicas, bem como coilocitos (setas).



61

Foto 12 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta).

Foto 13 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta)



62

Foto 14 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar corpo celular com núcleo (seta)

Foto 15 – Imuno-marcação das células de Langerha ns no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar forma estrelada da célula de Langerhans (seta).



63

Foto 16 – – Imuno-marcação das células de Langerha ns no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (1000x) Notar acúmulo focal de células de Langerhans.

Foto 17 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio escamoso normal (1000X) Notar a escassez das células de Langerhans às quais estão localizadas nas camadas basal e para-basal.



64

5.2 Densidade de células de Langerhans dos grupos segundo faixas etárias

Na Tabela 2, estão expressos os limites de variação, média e

desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso

(NIC 3) e controle (epitélio escamoso normal) , segundo faixas etárias.

Não houve diferença estatisticamente significante da

densidade de células de Langerhans entre as faixas etárias do grupo

caso (NIC 3) e do grupo controle (epitélio escamoso normal) (F = 0,443 ,

p = 0,726 e F = 1,954, p = 0,167, respectivamente).

Constatou-se que, em todas as faixas etárias, a densidade

celular do grupo caso (NIC 3) foi maior que a do grupo controle (epitélio

escamoso normal). No grupo caso (NIC 3), a densidade celular variou

entre 7,19 células/mm2 e 25,02 células/mm2, enquanto que, no grupo

controle (epitélio escamoso normal), essa variação igualou-se a 1,26

células/mm2 a 3,62 células/mm2 (Tabela 2).

Comparando-se as faixas etárias quanto à variabilidade da

densidade celular de Langerhans identificou-se que, no grupo caso (NIC

3), foi maior nas faixas etárias maiores, enquanto que, no grupo controle



65

(epitélio escamoso normal), foi semelhante nas diversas faixas etárias

(Tabela 2).

Tabela 2 - Limites de variação, média e desvio-padrão da densidade de células de Langerhans dos grupos caso e controle, segundo faixas etárias – Centro Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba – Janeiro/Dezembro 2003

GRUPOS

Caso (NIC 3) CONTROLE (epitélio escamoso normal) FAIXAS ETÁRIAS (anos) Mínimo Máximo Média

Desvio-padrão

Mínimo Máximo Média Desvio-padrão

20 – 25 7,19 9,77 8,48 1,82 1,90 3,62 2,76 1,22

26 – 30 9,67 19,67 13,87 4,20 2,19 3,43 2,96 0,67

31 - 35 10,38 17,20 13,47 3,26 1,83 3,51 2,82 0,72

36 - 40 5,06 25,02 12,92 7,82 1,26 3,20 2,03 0,66

5.3 Distribuição das células de Langerhans no epitélio escamoso segundo grupos

No grupo controle (epitélio escamoso normal), as células de

Langerhans foram mais freqüentemente visualizadas nas camadas

profundas do epitélio, correspondentes às camadas basal e para-basal

(Foto 18) e, de modo mais evidente, na área da junção escamocolunar.

No grupo caso (NIC 3), as células de Langerhans se

distribuíram de modo disperso, em toda a espessura do epitélio. Não se

limitavam apenas às camadas profundas do epitélio, mas também

foram encontradas permeando as camadas intermediária e superficial,

tanto na NIC 3 em superfície (Foto 19), como na NIC 3 extensiva às

criptas glandulares (Foto 20).



66

Foto 18 – Imuno-marcação das células de Langerhans em epitélio ecamoso normal (100X)

Notar distribuição das células de Langerhans, nas camadas basal e para-basal.

Foto 19 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3 (100x)

Notar as células de Langerhans, dispersas em toda a espessura do epitélio

Foto 20 – Imuno-marcação das células de Langerhans no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, extensivo às criptas glandulares (100x)

Notar as células de Langerhans, dispersas em toda a espessura do epitélio.



67

6 DISCUSSÃO

Mulheres portadoras de carcinoma escamocelular in situ

apresentaram uma densidade de células de Langerhans

significantemente maior que mulheres com colo uterino normal,

sugerindo um incremento da imunidade celular no carcinoma

escamocelular in situ.

Os achados da presente pesquisa diferiram de estudos

prévios, nos quais foi identificada redução das células de Langerhans

em câncer cervical. Mathews et al. (2003) referiram uma produção

reduzida de E-caderina nas neoplasias intraepiteliais cervicais e no

câncer cervical, com conseqüente redução das células de Langerhans

no local da lesão. Hubert et al. (1999) relataram redução das células de

Langerhans em câncer cervical in situ como conseqüência da

diminuição da produção do fator de necrose tumoral alfa e do fator

estimulador de colônia GM-CSF pelos queratinócitos.

No entanto, o presente estudo pareceu corroborar os

achados de outras pesquisas. McArdle e Muller (1986) e Abdou et al.

(1999) referiram haver um aumento significante nas células de



68

Langerhans nas neoplasias intraepiteliais cervicais e no carcinoma

escamocelular in situ, sugerindo que este fato decorreria de uma

resposta imune direta contra neoantígenos associados com a

transformação maligna.

Outros pesquisadores relataram aumento dessas células em

carcinomas gástricos (LI, 1992) e de laringe (ZHANG, 1992), o que

consideraram ser um importante fator de defesa, atuando como critério

prognóstico, com menor número de metástases e maior sobrevida

desses pacientes.

A idade das pacientes dos grupos caso e controle variaram

entre 20 e 40 anos e 23 a 40 anos, respectivamente, sem diferença

significante.

As células de Langerhans integram o sistema imunológico

tecidual do colo do útero. A adoção na presente pesquisa da faixa

etária de 20 a 40 anos, para os grupos caso e controle, deveu-se a

pouca variação do status hormonal nessas idades, o qual se constitui no

principal fator de regulação da apresentação de antígenos no trato

genital inferior e, portanto, da imunidade celular (WIRA et al., 2005). Por

esse motivo, é importante ressaltar que os grupos caso e controle não

diferiram significantemente quanto à distribuição etária.



69

No presente estudo, constatou-se que o grupo controle

(epitélio escamoso normal) diferiu do grupo caso (NIC 3) quanto à

distribuição das células de Langerhans.

Histologicamente, o colo do útero normal caracterizou-se

por baixa densidade de células de Langerhans, situadas

predominantemente na camada profunda (basal e parabasal) do

epitélio (WEISS; SANDERS; WESTBROOK, 1993), assim como na zona de

transformação e na junção escamocolunar, compondo uma barreira

inata de defesa contra patógenos.

A junção escamocolunar tem como característica estar em

parte constituída por células indiferenciadas, chamadas células de

reserva, capazes de diferenciar-se para células colunares ou

escamosas, enquanto que a zona de transformação contém células

metaplásicas, com alto dinamismo genético para multiplicação,

maturação e diferenciação celular. Assim sendo, a localização das

células de Langerhans parece estar relacionada à maior

vulnerabilidade das células dessas camadas a agentes mutagênicos e

patógenos intracelulares (JABLONSKA, 1982).

A distribuição difusa das células de Langerhans constatada

no grupo caso (NIC 3), de portadoras de carcinoma escamocelular in

situ/NIC 3, pareceu uma resposta imunológica aos antígenos tumorais

presentes, os quais estariam também difusamente dispersos em todas as



70

camadas celulares, recrutando essas células de defesa (ABBAS;

LITCHMAN; POBER, 2003).

No grupo caso (NIC 3), a densidade de células de

Langerhans foi significantemente maior que a do grupo controle

(epitélio escamoso normal), em todas as faixas etárias. Essa

constatação contrariou relatos prévios de que a densidade de células

de Langerhans está diretamente relacionada à concentração de E-

caderina. Essa proteína é apontada como responsável pela adesão

intercelular e pela manutenção das células de Langerhans

intraepiteliais. Desta forma, a redução dos níveis de E-caderina

acarretaria conseqüente redução das células de Langerhans, o que

não se verificou na presente pesquisa.

Na literatura consultada, não se identificou qualquer

publicação que abordasse com precisão esse aspecto da imunologia

do colo do útero na carcinogênese. Todavia, com base nos estudos de

imunologia dos tumores em outros órgãos (DINIZ-FREITAS et al., 2005),

pode-se aventar hipótese para explicar os resultados obtidos.

As células alteradas pela carcinogênese expressam

antígenos tumorais em sua superfície. Este fato, aliado à alteração da

arquitetura epitelial, pela perda de coesão celular e alteração

comportamental das células que compõem o tumor, se constituiriam

em agentes agressores ao epitélio normal adjacente, que reagiria,



71

produzindo os níveis significantes de citocinas, como o fator de necrose

tumoral alfa, interleucina-1 e o MIP-3 alfa, os quais são quimiotáxicos

para as células de Langerhans, macrófagos e linfócitos T.

A comprovação do aumento significante da densidade de

células de Langerhans em carcinoma escamocelular in situ/NIC 3

convida a refletir sobre o porquê do processo cancerígeno evoluir para

estágios mais agressivos, uma vez que a imunidade celular local foi

incentivada.

Há algumas causas plausíveis. As células de Langerhans,

atraídas ao sítio da carcinogênese, estreitamente relacionadas à

infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV), englobariam partículas

virais, expressas como agentes tumorais na superfície celular, capazes

de promover alteração na expressão de moléculas co-estimuladoras

(B7-1 e B7-2), expressas pelas células de Langerhans e responsáveis pela

estimulação de linfócitos T, sem a qual a sensibilização destes não

ocorre. Estas partículas virais, uma vez englobadas pelas células de

Langerhans, poderiam também promover defeito na molécula de

adesão intercelular 1 (ICAM-1), expressa na superfície, o que não

ofereceria tempo suficiente para sinalização e sensibilização dos

linfócitos T após o encontro destes com as células apresentadoras de

antígenos (ABBAS; LITCHMAN; POBER, 2003).



72

Seria viável também supor que, na carcinogênese, ao

englobar partículas virais, as células de Langerhans sofreriam alteração

no processamento ou na apresentação de antígenos, através do MHC

II, em conseqüência ao efeito citopático viral nestas células as quais já

não completam a digestão desses antígenos por terem limitados

poderes enzimáticos (CHAPEL; MISBOH; SNOWDWN, 2003), podendo se

constituir em um reservatório, onde os vírus, assim, permaneceriam em

latência ou seriam reativados (HERTEL et al., 2003).

Outra hipótese provável seria a de que o processo de

carcinogênese levaria a produção de interleucina-10, designada como

fator inibidor de citocinas, portanto uma imunossupressora, promovendo

uma tolerância das células de defesa aos antígenos tumorais. Assim

sendo, o aumento da densidade de células de Langerhans não se faria

corresponder ao aumento da proteção imunológica do tecido à

carcinogênese.

A partir da literatura consultada, pode-se identificar que

pouco se sabe sobre a imunologia dos tumores cervicais. Novas

pesquisas devem ser realizadas para que se possa responder

adequadamente ao fato de que, apesar de todos os esforços

envidados, não se tem obtido sucesso em impedir a evolução das

neoplasias intraepiteliais cervicais ao câncer invasivo, reduzindo sua

incidência e sua prevalência.



73

Dentro dessa abordagem, o desenvolvimento de vacinas

profiláticas com capsídeos virais vazios (viral-like particles) é a linha de

pesquisa e realidade atual mais promissora que, se supõe, resultará em

grande impacto na redução da incidência do câncer de colo uterino

nas próximas décadas. Todavia as vacinas terapêuticas, que

objetivavam a regressão das lesões intra-epiteliais escamosas e indução

de depuração viral, não têm conseguido os mesmos resultados.

Talvez o melhor entendimento da resposta imune celular ao

HPV e às neoplasias intra-epiteliais cervicais possa impulsionar a

pesquisa para novas opções terapêuticas, visando a impedir a

progressão das neoplasias intra-epiteliais para o carcinoma invasor.



74

7 CONCLUSÃO

Por meio de imuno-histoquímica e análise morfométrica,

constatou-se que, no carcinoma escamocelular in situ/NIC 3, ocorre

aumento significante da densidade das células de Langerhans, as quais

se mostram distribuídas difusamente em todas as camadas do epitélio

cervical.



75

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1

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81

9 APÊNDICES

9.1 Apêndice 1 - Protocolo experimental

PESQUISA DE CÉLULAS DE LANGERHANS (CL) DADOS DE IDENTIFICAÇÃO: REGISTRO: IDADE: VIDA SEXUAL sim ( ) não ( ) Gestante sim ( ) não ( ) TIPO DE ESPÉCIME: Biópsia ( ) Histerectomia ( ) Exame histológico e conclusões: ( ) Epitélio escamoso normal ( ) Eversão com metaplasia escamosa ( ) Cervicite discreta ( ) NIC 3 em superfície ( ) NIC 3 em superfície e glândula ( ) NIC 3 em glândula ( ) Coilocitose ( ) Mitoses ( ) Mitoses atípicas Foto HE: ( ) Sim ( ) Não Exame imuno-histoquímico – S100: Campo mais representativo inclui: ( ) NIC 3 em superfície ( ) NIC 3 em superfície e glândula ( ) NIC 3 em glândula ( ) Área de transição normal/NIC 3 ( ) Epitélio escamoso normal ( ) Zona de transformação / epitélio escamoso normal

AP Nº _______



82

Foto S100: ( ) Sim ( ) Não Morfometria: Grade de Weibel Medida: 10 x 10 mm Limite da grade excluído: superior e lateral esquerdo

Número de campos avaliados: 10 campos serão escolhidos (os campos mais celulares identificados no aumento 50 x, seguindo-se a contagem ao longo do fragmento, no aumento de 400 x). Critério: Serão contadas apenas as células de Langerhans representadas pelo corpo celular. Os prolongamentos citoplasmáticos (dendritos) não serão incluídos na contagem. Início da contagem – campo escolhido ( ) Contagem a partir de um dos bordos ( ) Contagem a partir da transição normal/NIC 3 ( ) Contagem a partir da zona de transformação

Nº de campos

Nº de quadrículos ocupados pelo epitélio

escamoso

Área ocupada pelo epitélio escamoso

Nº de células de Langerhans

Nº células/mm²

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10

Média Desvio-padrão



83

9.2 Apêndice 2 – Aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Lauro Wanderley da Universidade Federal da Paraíba

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