variantes moleculares do vírus influenza

7/25/2019 Variantes Moleculares Do Vrus Influenza

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Miguel Augusto Golono

Variantes moleculares do vrus influenza

So Paulo2004


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So Paulo2004


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Dissertao apresentada aoInstituto de Biocincias daUniversidade de So Paulo, para aobteno de Ttulo de Mestre emCincias, na rea deBiologia/Gentica.

Orientador: Prof. Dr Willy Beak.

So Paulo

2004


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Golono, MiguelVariantes moleculares do vrusinfluenza

129 pginasDissertao (Mestrado) - Instituto de

Biocincias da Universidade de So Paulo.Departamento de Biologia/Gentica.

1. Influenza 2. Hemaglutinina 3.Drift

I. Universidade de So Paulo. Instituto deBiocincias. Departamento deBiologia/Gentica.

Comisso Julgadora:

________________________ _______________________Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

________________________ _______________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

______________________

Prof. Dr. Willy beakOrientador


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Dedico esta dissertaao aos meus pais:

Edson Domingos Golono e Vera Lcia da

Silva Golono

A minha esposa: Iris Melina Politi Soza

E as minhas filhas: Amarillyz e Izabella

Politi Golono


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"Arrebentaram a porta. Derrubaram a porta.

Chegaram ao lugar luminoso

onde a verdade esplendia os seus fogos.

Era dividida em duas metades

diferentes uma da outra.

Chegou-se a discutir qual a metade mais bela.

Nenhuma das duas era perfeitamente bela.

E era preciso optar. Cada um optou

conforme seu capricho, sua iluso, sua miopia."

Carlos Drummond de Andrade.


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Agradecimentos

Agradeo meu orientador Prof. Dr. Willy Beak pela confiana em mim

depositada e por seu esforo dedicado a esta dissertao.

Ao Prof. Dr. Edison Luiz Durigon do Laboratrio de Virologia do ICB -

USP, por abrir as portas de seu laboratrio assim como propiciado os meios

para a concluso desta dissertao.

Ao Mrio Gustavo Mayer por toda ajuda na metodologia e no

delineamento a este projeto.A Dra. Maria Luiza Beak, pelo incentivo e ajuda para o trmino deste

trabalho de mestrado.

A Danielle Bruna Leal de Oliveira, por ter dedicado seu tempo para

meu treinamento em seqenciamento e para as anlises de seqncias.

Ao Dr. Marcelo Genofre Vallada, pela seleo dos pacintes e coleta

das amostras no Instituto da Criana da FMUSP.Ao Alexandre Pereira pelo acompanhamento deste trabalho.

A Dra Viviane Botosso por todas as sugestes dadas para a concluso

deste trabalho.

A Dra Rita de Cassia Stocco dos Santos por todo apoio e ajuda

dispensada a mim.

A Leonardo Setsuo Kobashi pela ajuda na finalizao do trabalho.

Aos amigos do Laboratrio de Virologia, em especial para Jansen de

Arajo pelo apoio nos experimentos de concluso desta Dissertao.

A Nair Aparecida da Silva Pereira, pelo apoio prestado durante a

execuo deste trabalho e pelo incentivo dado em todos os momentos.


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A Antnio Carlos de Freitas tambm pelo apoio e incentivo.

Aos amigos e tambm alunos do laboratrio de gentica: Marcelo M.

Tavares, Luis G. B. Goes, Luciana S. Cabral, Gil R. H. Ribeiro, Rodrigo F.Ramalho, Guilherme Francisco, Juliana S. Capitanio, Adriana M. Orimoto e

Daniela C. C. Santos.

Em especial a Olga Brunner pelo convvio desde o incio, mesmo antes

de eu ser aluno do curso de mestrado.

Aos fncionrios e tambm amigos do laboratrio de Gentica do

Instituto Butantan; Zenaide L. Silva, Vera L. A. Rodrigues, Tnia R. Berulis,Ivone S. dos Santos, Laerte P. do Santos, Ronaldo Dias, Helir Serralvo.

Aos funcionrios da Ps-Graduao por toda ajuda dispensada.


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ndice

I - Introduo...................................................................................................01

II - Objetivos....................................................................................................18

III - Materiais e Mtodos

1.Amostras.............................................................................................19

2.Extrao de RNA................................................................................193. Obteno de cDNAs por transcrio reversa.....................................20

4. Reao em Cadeia pela Polimerase -Nested Multiplex PCR.........21

4.1. Oligonucleotdeos Iniciadores (primers)..............................21

4.2. Reaes.................................................................................23

4.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................25

5. Reaes de Semi-Nested PCR e Nested-PCR".............................255.1. Oligonucleotdeos iniciadores..............................................25

5.2. Reaes.................................................................................30

5.3. Anlise dos Produtos Amplificados......................................32

6. Determinao da seqncia de nucleotdeos......................................32

6.1. Purificao dos Produtos de PCR.........................................33

6.2. Reao de determinao de Seqncias de nucleotdeos......33

7. Edio e Anlise das Seqncias Obtidas..........................................35

8. Localizao das diferenas na estrutura da hemaglutinina................35

9. rvore genealgica............................................................................36


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IV - Resultados.................................................................................................37

1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.....................37

2. Obteno da regio codificadora completa de HA1..........................403. Nested e Semi-nested PCR................................................................40

4. Seqncias de aminocidos de HA1 das amostras estudadas:

anlise comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais...42

4.1. Tipo A Subtipo H1N1...........................................................42

4.2. Tipo A Subtipo H3N2...........................................................49

4.3. Tipo B...................................................................................594.4. Pesquisa das seqncias de nucleotdeos no "Genbank"......63

4.5. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H1N1.............64

4.6. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de A H3N2.............65

4.7. Pesquisa no "Genbank" das seqncias de vrus do tipo B..66

4.8. rvore Genealgica..............................................................66

V - Discusso...................................................................................................70

VI - Concluso.................................................................................................81

VII - Resumo....................................................................................................82

VIII - Abstract..................................................................................................83

IX - Apndice 1. Dados gerais dos pacientes..................................................84

X - Apndice 2. Distribuio das amostras.....................................................93

XI - Referncias Bibliogrficas........................................................................97

XII - Biografia................................................................................................119


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I - Introduo

A gripe uma doena respiratria aguda em seres humanos e

causada pelo vrus da influenza. Anualmente mais de 10% da populao

mundial, cerca de 600 milhes de pessoas so acometidas pelo vrus da

gripe (Gerdil, 2003). Somente nos Estados Unidos, a doena causa cerca

de 110.000 hospitalizaes com 36.000 mortes todos os anos (Thompson

e col., 2003). Idosos com idade igual ou superior a 65 anos constituem o

grupo de maior risco de morte por influenza. Cerca de 90% das mortes

causadas pela gripe ocorre nessa faixa etria (Simonsen, 1999). A doena

afeta tambm a classe economicamente ativa, o que causa queda deprodutividade e, conseqentemente prejuzos financeiros (Akazawa e

col., 2003).

A sintomatologia clssica da doena engloba febre, dores

musculares, tosse, dor de cabea, irritao na garganta e secrees nasais.

Os vrus se multiplicam no epitlio ciliado das vias respiratrias

superiores e inferiores, causando necrose celular e irritao. Os sintomas

podem variar de pessoa para pessoa, dependendo da idade do doente, deseu estado geral de sade e, do status imunolgico no que se refere a

infeces anteriores, podendo evoluir para complicaes como

pneumonia causada pela propagao viral no epitlio alveolar e/ou

pneumonia bacteriana (WHO Fact Sheet 211, 1999).

A famlia Ortomixoviridae composta de 4 gneros: Influenza

virus A, Influenza virus B, Influenza virus C e Thogotovirus (Pringle,

1996). Os vrus influenza tipo A e B causam um largo espectro de

doenas, incluindo doena respiratria do trato inferior, pneumonia e,

podendo no caso dos vrus influenza tipo A, causar encefalopatia e

encefalite. Por outro lado, infeces associadas ao vrus tipo C so

limitadas ao trato respiratrio superior (Murphy e Webster, 1990,


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Nicholson, 1998). Os thogotovirus so ortomixovirus transmitidos por

carrapatos.

Os vrus influenza do tipo A e B quando adaptados a condies

laboratoriais, assumem forma esfrica com dimetros de 80 a 120 nm. No

entanto, as cepas recm isoladas so pleiomrficas, podendo conter

partculas virais filamentosas (Lamb e Choppin, 1983, Roberts e

Compans, 1998). O genoma viral composto por segmentos de RNA de

fita simples e de polaridade negativa (complementar ao RNA

mensageiro). Cada um dos oito segmentos dos vrus influenza tipo A e B

e, os sete segmentos do vrus influenza tipo C esto associados

nucleoprotena NP (Mcgeoch e col., 1976, Desselberger e col., 1980,Klumpp e col., 1997) e esto associados a um complexo de polimerase

viral (Brown, 2000). Assim, forma-se um complexo ribonucleoprotico

composto por RNA viral (vRNA), NP e polimerase.

Englobando estas oito (ou sete) partculas, h uma matriz protica

constituda por protena M1, a qual envolvida por uma bicamada

lipdica derivada da clula hospedeira durante o processo de brotamento

(Kates e col., 1962, Lamb e Choppin, 1983, Braakman e Anken, 2000).Duas glicoprotenas de superfcie, codificadas pelo genoma viral,

projetam-se atravs da bicamada lipdica. Dessas, a glicoprotena

hemaglutinina (HA) a mais abundante e, apresenta-se na forma de

basto. J a neuraminidase (NA), presente em menores quantidades,

apresenta-se na forma de cogumelo. Ainda, uma terceira protena,

formadora de canais e denominada de M2, encontra-se inserida na

bicamada lipdica (Zebedee e Lamb, 1988, Park e col., 1998, Mould e

col., 2000).

Quanto capacidade codificadora dos genomas dos vrus

influenza, podemos dizer que os genomas dos vrus do tipo A e B

codificam pelo menos dez protenas, enquanto o genoma do tipo C


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codifica nove protenas (Neumann e col., 2000a) (tabela 1).

Tabela 1. Organizao do genoma do vrus da influenza.

*a - Os segmentos de RNA so numerados de acordo com seus tamanhos decrescentes.

*b - O tamanho dos RNAs mensageiros baseado em seqncias de cepas tipo A, no

entanto pode variar entre os tipos e subtipos, especialmente os segmentos 4, 6 e 8.

*c - As funes detalhadas das protenas que compem a polimerase dos vrusinfluenza tipo C, ainda no foram determinadas e so designadas de P1, P2 e P3.

*d Hemaglutinina esterase (HE) compreende as funes de HA e NA.

*e Recentemente, NS2 recebeu o nome de NEP (nuclear export protein). estrutural.

*f Ao vrus influenza tipo C possuem apenas 7 segmentos.

No vrus tipo A, os segmentos 1, 2 e 3 codificam as protenas

PB2, PB1 e PA respectivamente. No vrus tipo B os segmentos 1, 2 e 3

codificam respectivamente as protenas PB1 , PB2 e PA. Estas protenas

compem a polimerase viral, possuem atividade de transcriptase, e esto

intimamente associadas ao RNA genmico do vrus. A estrutura e funo

das polimerases do vrus tipo C ainda no foram totalmente

caracterizadas e, assim, so designadas por P1, P2 e P3 (Yamashita e col.,

Tamanho Polipeptdios Codificados

*a Segmento *b RNA viral *b RNAm Tipo A Tipo B Tipo C

1 2341 2320 PB2 PB1 *c P1

2 2341 2320 PB1 PB2 *c P2

3 2233 2210 PA PA *c P3

4 1778 1756 HA HA *d HE

5 1565 1539 NP NP NP

6 1413 1391 NA NA, NB M1, CM27 1027 1004, 314, 275 M1, M2 (M3) M1, BM2 NS1, NS2*e

8 890 868, 396 NS1, NS2*e NS1, NS2*e *f


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4

1989, Hay, 1998, Crescenzo-Chaigne e col., 1999). No entanto, admite-se

que essas ltimas possuam caractersticas estruturais e funcionais

semelhantes s correlatas dos vrus tipo A e B.

O segmento 4 codifica a hemaglutinina (HA). A HA a

glicoprotena de superfcie viral mais imunognica. O processamento ps-

traduo de seu precursor biossinttico (Ha0) envolve glicosilao, adio

de cidos graxos e clivagem proteoltica. A clivagem deste precursor

resulta em duas subunidades, HA1 e HA2, as quais permanecem unidas

por ligaes dissulfeto (Wiley e Skehel, 1987, Skehel e Wiley, 2002). A

subunidade HA1, correspondente extremidade N-terminal do precursor,

projeta-se para fora do envelope viral. J a subunidade HA2 permaneceancorada no interior do envelope viral. Tal processamento proteoltico

essencial para que os vrus tornem-se infectantes (Lamb, 1989, Skehel e

Wiley, 2002). A HA de importncia fundamental na interao da

partcula viral com a clula hospedeira. Esta glicoprotena, pela sua

regio HA1, liga-se ao receptor de cido silico existente na superfcie

celular (Zhirnov e col., 2002). Assim, a HA inicia o processo de infeco

mediando a fuso da partcula viral endocitada com a membranaendossmica, permitindo o acesso da partcula viral ao citoplasma celular

(Lamb, 1989, Skehel e Wiley, 2002). Contrastando com os vrus

influenza tipo A e B, o segmento 4 do vrus influenza tipo C codifica a

hemaglutinina esterase (HE), uma glicoprotena de superfcie que executa

de forma acoplada as funes de HA e NA. HE reconhece

especificamente apenas um tipo de cido silico modificado, o cido 9-

O-acetil-N-acetilneuramnico (Rogers e col., 1986, Skehel e Wiley,

2000), o que est relacionado com a menor patogenicidade dos vrus

influenza tipo C.

A nucleoprotena NP codificada pelo segmento 5. A NP

sintetizada em abundncia nas clulas infectadas e transportada para o


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ncleo celular. No ncleo, a NP liga-se ao RNA viral e o encapsida,

estabilizando-o e protegendo-o da ao de RNases. (Compans e

Duesberg, 1972; Jennings e col., 1983, Mena e col., 1999). A NP dos

vrus influenza tipo B no relacionada imunologicamente NP dos

vrus influenza tipo A, desempenhando, no entanto, a mesma funo. A

NP uma das protenas utilizadas na diferenciao dos tipos sorolgicos

A, B e C (Lamb, 1989).

A neuraminidase (NA) codificada pelo segmento 6. Na sua

forma madura, a NA um tetrmero com atividade cataltica de quebra de

cido silico em glicoconjugados (Colman, 1998). A NA tem a funo de

facilitar o acesso da partcula viral superfcie das clulas alvo, atravsda degradao de cido silico do muco extracelular, no estando

envolvida diretamente na fuso da partcula viral com a membrana celular

(Liu e col., 1995). Alm dessa funo, a atividade de NA destri os

receptores de HA na superfcie das clulas hospedeiras, facilitando a

disperso das partculas virais geradas no processo infectivo, impedindo-

as de serem imobilizadas na superfcie das clulas infectadas (Palese e

Compans, 1976, Yang e col, 1997). Essa glicoprotena est ancorada bicamada lipdica da clula hospedeira por uma seqncia de resduos

hidrofbicos. A neuraminidase concentra-se em aglomerados na

superfcie viral, contrastando com a distribuio uniforme de HA. No

vrus influenza tipo B, uma glicoprotena adicional codificada pelo

segmento 6. Essa glicoprotena foi denominada NB, sendo codificada por

uma fase de leitura distinta da fase de leitura de NA. NB, assim como

NA, uma protena de membrana, inserida no envelope viral (Betakova e

col., 1996; Brassard e col., 1996). Devido atividade formadora de canal

dessa glicoprotena, atribui-se a ela uma funo anloga da protena M2

(Odagiri e col., 1999, Fischer e col., 2000, Hatta e Kawaoka, 2003).

O segmento nmero 7 dos vrus influenza tipo A codifica as


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protenas M1, M2 e potencialmente um peptdeo M3. Estas protenas,

juntamente com a NP, so utilizadas para a tipagem sorolgica dos tipos

virais. M1 faz parte da matriz protica, a qual forma uma camada

eltrondensa logo abaixo do envelope viral e, a protena mais abundante

no vrion (Brown, 2000). J, M2 expressa em abundncia na superfcie

da clula hospedeira, no entanto, detectada em pequenas quantidades no

vrion (Hilleman, 2002). Ainda, um terceiro transcrito foi identificado

com o potencial de codificar um peptdeo constitudo de 9 resduos de

aminocidos (M3), no entanto, ainda no foi possvel a identificao

desse peptdeo em extratos celulares. O segmento 7 dos vrus tipo B

codifica uma protena M1 com semelhana estrutural e funcional protena M1 dos vrus influenza tipo A. Alm da protena M1, o

segmento 7 dos vrus tipo B codificam um segundo polipeptdio

denominado BM2 (Odagiri e col., 1999). BM2 uma protena de

membrana. Estudos recentes indicam que BM2 uma protena formadora

de canais inicos, e assim como M2, tem a funo de acidificar o interior

dos vrions quando esses se encontram nos endossomos celulares,

enfraquecendo as ligaes entre as protenas virais, tais como M1 e NP, efavorecendo o "desempacotamento" viral (Paterson e col., 2003, Mould e

col., 2003, Watanabe e col., 2003). O segmento 6 da influenza tipo C

codifica a protena de matriz M1 e uma protena integral de membrana

denominada CM2. Apesar da funo de CM2 no ser conhecida, sua

similaridade estrutural M2 dos vrus tipo A sugere uma funo anloga

(Hongo e col., 1997, Pekosz e Lamb, 1997, Pekosz e Lamb, 1998, Tada e

col., 1998).

Duas protenas no estruturais, NS1 e NS2, so codificadas pelo

segmento 8 (vrus tipo A e B) ou segmento 7 (vrus tipo C).

Recentemente, foi detectada a presena de NS2 em partculas virais, e

com isso NS2 foi elevada categoria de protena estrutural. Diferente da


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NS2, a NS1 no incorporada aos vrions e encontrada apenas em

clulas infectadas. Em sua forma madura, NS1 se apresenta como

homodmero, tanto para os vrus tipo A como para os vrus tipo B. No

entanto a ao de NS1 difere entre os dois tipos de vrus. A NS1

produzida pelos vrus influenza tipo A (NS1A) inibidora do

processamento ps-transcricional de RNAm celular, com isso NS1A

impede a sntese de protenas antivirais (Chen e Krug, 2000). Por outro

lado, NS1B que produzida pelos vrus tipo B, atua diretamente na

inibio da protena celular antiviral ISG15 (Chen e col., 1999, Krug e

col., 2003). Aparentemente, NS1 tambm possui a capacidade de

estimular a traduo dos RNAm virais em ambos os tipos virais (Wolff ecol., 1996, Egorov e col.,1998). A NS2 foi rebatizada de NEP ("nuclear

export protein") devido demonstrao de que NS2 (NEP) na realidade

uma protena estrutural. Alm da funo estrutural, NS2 ou NEP tem a

funo de mediar a exportao nuclear dos RNAs do vrion, atuando

como adaptadora entre os complexos ribonucleoproticos virais e a

maquinaria de exportao nuclear da clula (ONeill e col., 1998,

Neumann e Col., 2000, Paragas e col., 2001, Lommer e Lou, 2002).A influenza transmitida por aerossis. Quando as gotculas

contendo os vrus so inaladas, esses entram em contato com o epitlio do

trato respiratrio, sendo esse o tecido primrio alvo para os vrus

influenza (Lindsay e col.,1970, Nicholson, 1998). A glicoprotena de

superfcie NA uma enzima que age nos cidos silicos do muco

facilitando o acesso do vrus para que haja contato direto com a

membrana celular. As partculas virais, atravs da HA ativada, ligam-se a

receptores de cido silico presentes em glicoprotenas e glicolipdios da

superfcie celular. Aps essa ligao, o vrion endocitado pela clula. O

pH baixo da vescula endoctica induz mudanas conformacionais na HA

facilitando sua insero na membrana vesicular, iniciando a fuso das


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membranas viral e vesicular (Isin e col., 2002, Epand e Epand, 2003). Os

nucleocapsdeos virais migram para o ncleo da clula hospedeira e, as

protenas com atividade de polimerase iniciam a transcrio dos RNAs do

vrion (vRNAs) em RNAs mensageiros (mRNAs) (Yewdell e Garca-

Sastre, 2002).

A sntese de mRNA do vrus influenza iniciada por fragmentos

de RNAs celulares recm sintetizados pela RNA polimerase II da clula

hospedeira, os quais j possuem a modificao cap (m7GPPPNm) nas

suas extremidades 5. A partir desses iniciadores de transcrio, as

cadeias de mRNA so elongadas pela transcriptase viral at que esta

atinja uma regio terminadora composta por uma seqncia de 5 a 7nucleotdeos de uridina localizada aproximadamente a 16 nucleotdeos da

extremidade 5 do vRNA molde. Nesse ponto da sntese, adicionada

uma cauda de poliadenilato [poli (A)] extremidade 3 do mRNA (Krug,

1981, Chung e col., 1994, Pritlove e col., 1998, Fodor e col., 2000,

Fechter e col., 2003). Participam do processo de transcrio, compondo o

complexo da transcriptase viral, as protenas PB1, PB2 e PA. A

polimerase PB2 atua no reconhecimento e quebra das extremidades 5modificadas dos mRNAs celulares e, portanto inicia o processo de

transcrio (Ulmanem e col., 1981; Braam e col., 1983, Nakagawa e col.,

1995, Perales e Ortn, 1997, Brown e Bailly, 1999, Hiromoto e col.,

2000a). A polimerase PB1 responsvel pelo processo de elongao do

mRNA viral (Lazarev e col., 1999, Perez e Donis, 2001). A funo da

polimerase PA na transcrio primria ainda no conhecida, no entanto

este polipeptdio necessrio para a transcrio e replicao do vRNA

(Nakagawa e col., 1996, Sanz-Ezquerro e col., 1998, Fodor e col., 2003,

Huarte e col., 2003).

Os transcritos produzidos so utilizados na traduo das protenas

virais. No incio da infeco predominam as snteses de NP e NS1,


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protenas essas que migram para o ncleo. Acredita-se que o aumento da

concentrao de NP livre dispare a mudana da sntese de mRNA

(transcrio) para a sntese de cRNA e vRNA (replicao) (Skehel, 1972;

Hay e col., 1977; Smith e Hay, 1982; Shapiro e col., 1987, Arrese e

Portela, 1996, Mena e col., 1999, Medcalf e col., 1999).

A replicao feita atravs de um processo de transcrio

alternativo, que resulta na produo de cpias integrais de vRNAs. A

replicao iniciada pela sntese de um RNAs complementares (cRNA),

os quais diferem dos mRNAs pelas ausncias das modificaes 5 cap

metiladas e caudas de poli A 3 (Hay e col.,1977; Hay e col., 1982).

Assim, a primeira etapa na replicao dos vRNAs seria a mudana desntese de mRNA para sntese de cRNA. Os requisitos para esta mudana

so: (1) a mudana do processo de iniciao de transcrio, o qual era

dependente de iniciadores 5 "capped", para um processo de iniciao

que no requer iniciadores e; (2) antiterminao no stio de

poliadenilao, permitindo que a transcrio de cRNA gere uma cpia

completa do vRNA (Pritlove e col., 1998). Acredita-se que NP tenha

papel fundamental na mudana de sntese de mRNA para cRNA, comodescrito acima. Finalizando o processo de replicao, molculas de

cRNA atuam como molde para a sntese do vRNA genmico (Honda e

col., 2001).

Os vRNAs recm-sintetizados so encapsidados pela NP no

interior do ncleo e, funcionam como moldes para a transcrio de

mRNAs virais da infeco tardia (Biswas e col., 1998, Hoffmann e

Webster, 2000). Os principais produtos de traduo nesta etapa da

infeco so as protenas M1, HA e NA. HA e NA so processadas aps a

traduo no retculo endoplasmtico rugoso e, transportadas para a

superfcie celular apical via complexo de Golgi (Barman e col., 2001). A

entrada da protena M1 no ncleo celular parece estar associada com a


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migrao de nucleocapsdeos para fora do ncleo, culminando com a

montagem das partculas virais no citoplasma (Martin e Helenius, 1991,

Ali e col., 2000). Pouco se sabe a respeito do processo de montagem dos

vrus da influenza. Acredita-se que nucleocapsdeos envolvidos por uma

cpsula de protena M1 migrem para a face interna da membrana

plasmtica, para onde j foram transportadas as glicoprotenas HA, NA e

M2. Foi proposto que a interao de M1 com os domnios citoplasmticos

dessas 3 glicoprotenas sinalize o processo de brotamento (Elster e col.,

1994, Reinhardt e Wolff, 2000, Hilleman, 2002). A atividade de NA na

superfcie da clula infectada destri o receptor de HA, permitindo que as

partculas virais geradas sejam propagadas e, evitando a adsoro destaspartculas mesma clula (Palese e Compans, 1976, Mitnaul e col., 2000,

Wagner e col., 2000, Plakokefalos e col., 2001). O passo final na

maturao dos vrus a clivagem de HA0 em HA1 e HA2 por proteases

extracelulares do hospedeiro. As duas subunidades geradas, HA1 e HA2,

permanecem ligadas por uma nica ponte dissulfeto (Wiley e Skehel,

1987, Klenk e col., 2002, Zhirnov e col., 2002).

Os vrus influenza tipo A so classificados de acordo com aspropriedades de duas glicoprotenas presentes na superfcie viral, HA e

NA. At o presente momento foram descritos 15 subtipos de HA,

denominados de H1, H2, H3 e assim sucessivamente (Webster e col.,

1997). Estes, diferem entre si pela seqncia polipeptdica de HA1 em no

mnimo 30%, e no possuem sorologia cruzada. Cada subtipo pode ser

composto de variantes semelhantes entre si e, que possuem sorologia

parcialmente cruzada (Webster e col., 1992; Ellis e col., 1997). Dos 15

subtipos de HA descritos at hoje, 6 subtipos (H1, H2, H3, H5, H7 e H9)

foram encontrados em isolados da influenza humana, no entanto,

atualmente os subtipos H1 e H3 so aqueles que esto em circulao na

populao humana (Webster e col., 1997; Subbarao e col., 1998; Peiris e


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col., 1999; Fouchier e col., 2004). Outros subtipos de HA foram

encontrados em vrus da influenza de cavalos, porcos e mamferos

aquticos entre outros. Todos os subtipos de HA foram encontrados em

vrus influenza de aves.

Nove subtipos (N1 a N9) foram descritos para neuraminidase. A

influenza A humana e a influenza suna compartilham entre si os subtipos

N1 e N2 e, apesar de outros subtipos de NA terem sido encontrados em

sunos, somente N1 e N2 foram estabelecidos nessa populao. Outros

subtipos so encontrados em cavalos, mamferos aquticos alm de outros

mamferos. Nos vrus da influenza aviria foram encontrados todos os

subtipos de NA (Webster e col., 1997, Webby e Webster 2001). Osisolados de influenza tipo A so denominados pelos subtipos de HA e NA

que possuem, o local e o ano da coleta [por ex. A/Hong Kong/03/68

(H3N2)]. Os tipos B e C so denominados geralmente pelo local da coleta

e ano (por ex. B/Maryland/59).

As aves aquticas so os reservatrios naturais dos vrus tipo A.

Estudos ecolgicos levaram a hiptese de que todos os vrus da influenza

de mamferos so derivados dos reservatrios avirios (Webster e col.,1992). Mais recentemente, estudos filogenticos realizados a partir das

seqncias de nucleotdeos dos vrus tipo A de vrios hospedeiros, de

diferentes regies geogrficas, pertencentes a diferentes subtipos deram

suporte a essa teoria (Webster e col., 1992, Capua e Alexander, 2002).

A gripe usualmente ocorre em epidemias com rpida expanso

geogrfica, surgindo em focos e, podendo atingir propores mundiais,

quando so ento denominadas pandemias (Bridges e col., 2003).

Associado s epidemias, h um aumento na taxa de morbidade e

mortalidade. At o momento ocorreram cerca de 10 pandemias nos

ltimos 200 anos, dentre as quais, a pandemia de 1918-20, tambm

denominada gripe espanhola, cujo agente etiolgico foi um vrus tipo A


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subtipo H1N1. As estimativas iniciais calculavam que mais de 20 milhes

de pessoas foram a bito em conseqncia dessa infeco. No entanto,

devido falta de registros em muitos pases durante a gripe espanhola,

estima-se atualmente que o nmero de mortes foi da ordem de 40 ou 50

milhes de pessoas em todo o mundo (Kuszewski e Brydak, 2000, Potter,

2001). O subtipo H1N1 foi relacionado a cepas de influenza suna, o que

estabeleceu uma ligao entre influenza enzotica e influenza humana

(Reid e col, 2000).

A pandemia de 1957 (gripe asitica), causada pela influenza A

do subtipo H2N2, e a pandemia de 1968 (gripe de Hong - Kong)

causada pela influenza A do subtipo H3N2, mataram juntas mais de 1,5milhes de pessoas. Essas pandemias causaram danos estimados de 32

bilhes de dlares economia mundial, principalmente pela perda de

produtividade, despesas com medicamentos e internaes (WHO

Influenza Fact Sheet 211, 1999). Existem evidncias de que as pandemias

de 1957 e de 1968 estivessem associadas a vrus da influenza aviria.

J em 1976, um novo subtipo de vrus influenza advindo de

porcos causaram graves quadros clnicos em seres humanos (WHOInfluenza Fact Sheet 211, 1999) e, em 1977 a linhagem H1N1 reapareceu

(gripe Russa), infectando principalmente crianas e jovens, sendo as

pessoas com mais de 50 anos pouco afetadas. Esse subtipo, ainda hoje,

est em circulao causando gripe em seres humanos (Laver e Garman,

2002, Nguyen-Van-Tam e Hampson, 2003).

Em 1997-1998, 18 pessoas foram infectadas com o vrus avirio

tipo A subtipo H5N1, na cidade de Hong Kong, onde 6 pessoas foram a

bito. O vrus H5N1 no provocou uma epidemia ou pandemia devido a

sua incapacidade de se transmitir de uma pessoa a outra (Subbarao e

col.,1998, Hatta e Kawaoka, 2002, Shortridge e col., 2003, Cox e col.,

2003). Em maro de 1999 mais um subtipo relacionado influenza


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aviria infectou pessoas em Hong Kong. Identificado como sendo do

subtipo H9N2, causou apenas quadros brandos de gripe (Peiris e

col.,1999, Cox e Subbarao 2000). No incio de 2003, na Holanda, o

subtipo viral H7N7, que ainda no havia sido encontrado em infeco de

seres humanos, foi identificado em 89 pessoas e causou, na maioria dos

infectados, um quadro de conjuntivite. No entanto, duas pessoas

desenvolveram um quadro respiratrio com sintomatologia caracterstica

de gripe, e uma foi a bito devido a complicaes pulmonares (Fouchier e

col., 2004). Desde janeiro de 2004, a Tailndia e o Vietnam, esto

vivendo o ressurgimento do subtipo H5N1. At o dia 10 de maro j

haviam sido contabilizados 33 casos de infeco por H5N1 com 22mortes (www.who.int/csr/disease/influenza/en).

A proteo contra os vrus influenza correlaciona com os nveis

de anticorpos anti-HA e anti-NA. Uma das caractersticas marcantes do

vrus influenza sua extensa e contnua variao antignica,

principalmente no que se refere as glicoprotenas de superfcie viral (HA

e NA). Tal caracterstica assegura a esses vrus seu sucesso

epidemiolgico e, insere a influenza no hall de doenas emergentes oureemergentes.

Dois mecanismos principais so responsveis pela mudana

contnua na antigenicidade dos vrus da influenza, e so denominados

shift antignico e drift antignico (Zambon, 1999).

O drift antignico uma alterao antignica gerada por

mutaes puntuais e cumulativas nos genes de HA e NA. O drift

antignico ocorre como parte da evoluo contnua dos vrus da

influenza. Esse processo gera novas linhagens de vrus capazes de escapar

neutralizao por anticorpos gerados contra linhagens que circulavam

anteriormente (Bridges e col., 2003). Epidemias anuais ou bienais

ocorrem durante o perodo intra-pandmico pois um nmero suficiente de


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indivduos na populao suscetvel linhagem variante gerada (Lin e

col., 1999). A alterao de um nico resduo de aminocido em HA1

pode resultar em alterao estrutural, permitindo ao vrus mutante escapar

neutralizao pelos anticorpos gerados em processos infectivos

anteriores (Knossow e col., 1984, Nakajima e col., 2000). Cinco stios de

maior variabilidade no domnio globular da subunidade HA1 foram

identificados (Wiley e Skehel, 1987). Este stios, designados A, B, C, D e

E correspondem a regies expostas na superfcie de HA1, e prximas ao

stio de ligao ao receptor (Wiley e col., 1981). Variaes nesses

mesmos stios foram identificadas, quando variantes antignicos foram

gerados pelo crescimento de linhagens na presena de anticorposmonoclonais sabidamente neutralizantes (Wiley e Skehel, 1987, Bush e

col., 1999). Assim, os stios de maior variabilidade correspondem, pelo

menos em parte, s regies de ligao dos anticorpos neutralizantes, o que

poderia explicar o escape dos variantes gerados aos anticorpos produzidos

numa infeco anterior. Estudos correlatos tambm foram realizados com

NA (Webster e col., 1987, Ferguson e col., 2003).

O shift antignico pode ser definido como o aparecimento deum novo vrus influenza tipo A contendo um novo subtipo de HA ou HA

e NA, os quais so imunologicamente distintos dos vrus influenza

circulantes nas ltimas dcadas. O shift antignico ocorre quando

certos vrus de influenza animal, que normalmente infectam reservatrios

avirios ou sunos e, que no estejam relacionados aos vrus da influenza

que circulam no momento na populao humana, so transmitidos para o

homem. Evidncias sugerem que o aparecimento de linhagens

pandmicas podem ocorrer por dois mecanismos distintos. O primeiro

derivado da natureza segmentada do genoma dos vrus influenza e, refere-

se ao reagrupamento dos segmentos genmicos de vrus influenza

humana e vrus influenza animal, durante a co-infeco de uma mesma


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clula hospedeira (Cox e Subbarao, 2000). Como exemplos de shift

pode-se citar as pandemias de 1957 e 1968 (Nguyen-Van-Tam e

Hampson, 2003). A pandemia de 1957 foi gerada pela incorporao de

segmentos genmicos avirios que codificam para a HA, NA e PB1 em

vrus da influenza humana circulantes. Em 1968, os segmentos

genmicos de HA e PB1 originrios de aves foram introduzidos em vrus

da influenza humana circulantes. (Kawaoka e col., 1989; Laver e Webster

1973). O segundo mecanismo para o surgimento de linhagens pandmicas

a transmisso direta de uma linhagem animal para o homem (Cox e

Subbarao, 2000). Esse fenmeno foi observado no episdio ocorrido em

Hong-Kong, em 1997. Postula-se que, vrus da influenza aviria dosubtipo H5N1 foram transmitidos de aves migratrias para patos atravs

da contaminao da gua por fezes de aves infectadas. Dos patos os vrus

foram transmitidos para galinhas, as quais posteriormente so

comercializadas nos mercados de Hong-Kong. Durante a transmisso

entre diferentes espcies de aves os vrus agregaram a caracterstica de

serem altamente patognicos para galinhas, sendo, eventualmente,

transmitidos para humanos nos mercados de Hong-Kong (Lavanchy,1998, Matrosovich e col., 1999, Hiromoto e col., 2000b). Apesar do

subtipo H5N1 ser altamente patognico para galinhas e humanos, nada

causa em patos e gansos (Webster, 1998).

Muitas mortes e internaes causadas pelos vrus da influenza

podem ser evitadas pela vacinao anual, especialmente em pessoas

propensas a complicaes mdicas. Nesse grupo esto as pessoas com

idade acima dos 65 anos, pessoas com doenas crnicas do corao, do

pulmo ou rins, pessoas diabticas, imunodeprimidas e pessoas com

quadros clnicos de anemia severa (WHO Weekly Epidemiological

Record, 2000, Kemble e Greenberg, 2003).

As vacinas de vrus inativados constituem o principal mtodo de


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preveno da influenza (Palese e Garca-Sastre, 2002). O monitoramento

da antigenicidade dos vrus circulantes a cada ano necessrio para

identificao das linhagens variantes e, posterior escolha das linhagens a

serem utilizadas na composio da vacina (Rota e col., 1992, Gerdil,

2003). A eficcia da vacina em grande parte devida similaridade

antignica entre as linhagens circulantes e as da vacina (Kendal e Cox,

1985, Wood, 2002).

O monitoramento epidemiolgico da gripe uma atividade

mundial que conta atualmente com uma rede de 110 laboratrios, em 80

pases, coordenados pela Organizao Mundial da Sade (OMS). Um

comit da OMS encarrega-se de reunir os dados e recomendar acomposio da vacina para o ano seguinte (WHO Weekly

Epidemiological Record, 2000). A cada ano, a vacina deve conter os vrus

com tendncia a apresentar maior prevalncia. No entanto, a vacina

formulada para o hemisfrio norte nem sempre corresponde a linhagens

de vrus prevalentes em outras regies, fato esse observado em pelo

menos duas localidades do hemisfrio sul, frica do Sul (Besselaar e col.,

1996) e Argentina (Savy e col., 1999). Na frica do Sul, isolados (H3N2)de 1993 mostraram-se antigenicamente diferentes com relao cepa

vacinal A/Beijing/353/89 recomendada pela Organizao Mundial da

Sade. Os isolados possuem 8 resduos de aminocidos de diferena,

quando comparadas suas seqncias da subunidade de HA1 com a

seqncia de HA1 de A/Beijing/353/89 (Besselaar e col., 1996). Estes

resultados mostram a necessidade da intensificao do monitoramento no

hemisfrio sul, tendo em vista a formulao coerente de uma vacina mais

adequada.

A determinao da seqncia de nucleotdeos dos genes HA e NA

a metodologia mais precisa na associao de determinados resduos de

aminocidos a um drift antignico (Rota e col., 1990, Plotkin e col.,


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2002, Schweiger e col., 2002). A sensibilidade e especificidade da tcnica

de RT-PCR, e a determinao da seqncia de nucleotdeos dos produtos

amplificados aperfeioaram a anlise molecular das linhagens de vrus da

influenza circulantes, aprimorando a qualidade dos dados disponveis a

serem utilizados na formulao de vacinas (Smith, 2003).

Nosso trabalho est situado no mbito da monitorao de

variantes moleculares de vrus influenza tipo A, subtipos H3N2 e H1N1,

e tipo B em amostras coletadas na cidade de So Paulo, sendo relevante o

monitoramento desses variantes para a escolha das cepas vacinais.


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II Objetivos

1) Determinar a ocorrncia dos vrus influenza tipo A, subtipos H1N1 e

H3N2, e tipo B em amostras clnicas coletadas durante os anos de

2000 e 2001, atravs da tcnica de Nested Multiplex RT-PCR,

utilizando a regio varivel da hemaglutinina viral (HA1) como base

de investigao.

2) Obteno da seqncia codificadora da regio varivel completa da

hemaglutinina dos isolados de influenza, atravs da tcnica de Nested

Multiplex RT-PCR ou Semi-nested Multiplex RT-PCR.

3) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas da

regio HA1 da hemaglutinina do vrus influenza tipo A, H1N1 e

H3N2, e tipo B nos anos de 2000 e 2001.

4) Localizao das diferenas detectadas na estrutura da molcula de

hemaglutinina e, verificao da incluso ou no desses pontos emstios antignicos de alta variabilidade.

5) Analisar comparativamente as seqncias de aminocidos obtidas com

as das cepas vacinais utilizadas no hemisfrio sul por proposta da

OMS para os anos 2000 e 2001.

6) Analisar comparativamente as seqncias de nucleotdeos entre os

variantes isolados, assim como, compar-las a seqncias de

nucleotdeos presentes em bancos de dados. Elaborao de uma rvore

genealgica.


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tubo, prosseguiu-se com incubao por 3 minutos a temperatura

ambiente. A mistura foi centrifugada a 12.000 x g por 15 minutos a 4oC.

A fase aquosa foi transferida para outro tubo, e a precipitao do RNA foi

feita temperatura ambiente por 10 minutos aps a adio de 500L de

isopropanol (Merck). O precipitado foi coletado por centrifugao a

12.000 x g por 10 minutos a 4oC. O sobrenadante foi descartado, e o

precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 75% (Synth). O RNA seco foi

dissolvido em 20 L de gua livre de RNAses.

3. Obteno de cDNAs por transcrio reversa.

Inicialmente, para a reao de transcrio reversa, 10 L do RNA

extrado de cada alquota de 250L de amostra foram desnaturados a

65oC por 5 minutos na presena de 50 ng de iniciador randmico (50

ng/L, Invitrogen Life Technologies) e 1 L de 10 mM de cada dNTP

(dATP, dGTP, dTTP e dCTP). Aps a desnaturao, a mistura foi

transferida para banho de gelo e, foram adicionados tampo para

transcrio reversa, inibidor de RNase (RNAguard, Amershan Pharmacia

Biotec Inc) e DTT para concentraes finais de 1X (50mM Tris-HCl,

pH 8,3, 75 mM KCl, 3mM MgCl2), 1U/L e 10 mM respectivamente,

considerando-se um volume final de reao de 20 L. Seguiu-se

incubao a 25oC por 2 minutos e adio de 200 U de transcriptase

reversa Superscript II RNase H- (200 U/L, Invitrogen Life

Technologies). A incubao a 25oC foi prolongada por mais 10 minutos,

seguindo-se aumento de temperatura para 42oC pelo tempo restante da

reao, ou seja, 50 minutos. Finalmente, a enzima foi inativada por calor

a 70oC durante 15 minutos.

Para um lote de reaes um controle negativo foi realizado. Nesse

controle, o mesmo volume de gua substituiu o volume original de RNA.


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4. Reao em Cadeia pela Polimerase -Nested Multiplex PCR.

Para a deteco, tipagem e subtipagem dos cDNAs de vrus

influenza A H1, A H3 e B foi utilizada a tcnica de Nested Multiplex

PCR previamente estabelecida (Ellis e col., 1997; Ellis e col., 1995 e

Zhang e Evans, 1991), na qual duas rodadas de amplificao so

utilizadas.

4.1. Oligonucleotdeos Iniciadores.

Para cada uma das duas rodadas de amplificao, foram utilizados3 pares de iniciadores especficos para cada um dos segmentos de RNA

codificante da hemaglutinina dos tipos A H1, A H3 e B (tabela 2 e

figuras 1, 2 e 3). Assim, do total de 6 pares de iniciadores utilizados, 3

pares tem localizao externa e destinam-se primeira rodada de

amplificao, enquanto na segunda rodada de amplificao so utilizados

3 pares de iniciadores internos (tabela 2).


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Tabela 2. Iniciadores utilizados na reao de Nested Multiplex PCR.

Iniciadores*

Posio da

extremidade

5' do

iniciador**

Tamanho do

Produto (pb)Seqncia (53)

Primeira Amplificao

AH1 A 76 cagatgcagacacaatatgt

AH1 FII 1090 1.015 aaaccggcaatggctccaaa

AH3 A 174 cagattgaagtgactaatgc

AH3 DII 1056 883 gtttctctggtacattccgc

BHA A 154 gtgactggtgtgataccact

BHA DII 1053 900 tgttttcacccatattgggc

Segunda Amplificao

AH1 B 96 ataggctaccatgcgaacaa

AH1 EII 1039 944 cttagtcctgtaaccatcct

AH3 B 348 agcaaagctttcagcaactg

AH3 CII 938 591 gcttccatttggagtgatgc

BHA B 196 cattttgcaaatctcaaagg

BHA CII 962 767 tggaggcaatctgcttcacc

O nmero romano II presente no nome dos iniciadores indica que estes socomplementares ao cDNA obtido por transcrio reversa do RNA viral. Os demais

oligonucleotdeos so complementares ao RNA viral.

** Posio da extremidade 5 do iniciador ocupada no cDNA completo (iniciadores

complementares ao RNA viral) ou, a posio onde a extremidade 5 do iniciador se associa

com o cDNA (iniciadores complementares ao cDNA).


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4.2. Reaes.

A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,

utilizando-se de 2 L de cDNA ou do controle negativo de transcrio

reversa e nas seguintes condies: 20 mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl,

1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,1M de iniciador externo

(AH1 A, AH1 FII, AH3 A, AH3 DII, BHA A e BHA DII), 2,5 U de Taq

DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies de

ciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 3.

A segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 2 L do produto da

primeira amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR",excetuando-se a concentrao dos iniciadores, a qual foi alterada para 0,5

M de cada um dos iniciadores internos (AH1 B, AH1EII, AH3 B, AH3

CII, BHA B e BHA CII). As condies de ciclagem utilizadas nessa

segunda amplificao encontram-se na tabela 4. Todas as amplificaes

foram realizadas em termociclador "Perkin Elmer Cetus DNA Thermal

Cycler", utilizando-se leo mineral (Sigma) para se impedir evaporao

dos contedos.


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Tabela 3. Parmetros de ciclagem da primeira "PCR".

Programa de Ciclos da Primeira "PCR"

EtapasTemperatura

em oC

Tempo em

Minutos

Nmero de

Ciclos

Desnaturao

inicial95 2 1

Desnaturao 94 1

Associao 50 1Extenso 72 3

35

Manuteno 4 1

Tabela 4. Parmetros de ciclagem da segunda "PCR".

Programa de Ciclos da Segunda "PCR"

EtapasTemperatura

em oC

Tempo em

Minutos

Nmero de

Ciclos

Desnaturao

inicial95 2 1

Desnaturao 94 1Associao 60 1

Extenso 72 1

35

Manuteno 4 1


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4.3. Anlise dos Produtos Amplificados

A um volume de 15L de produto da segunda amplificao foram

adicionados de 3L de corante para amostra 6X (azul de bromofenol

0,25% e Ficoll tipo 400 15%), seguindo-se anlise por eletroforese

horizontal em gel de agarose 1.2% (Invitrogen Life Technologies), em

tampo 1X TAE (40 mM Tris-acetato pH 8,0, 1 mM EDTA). Os gis

foram corados com brometo de etdio na concentrao de 0,5g/mL

(Invitrogen Life Technologies). Aps a corrida, as bandas foram

visualizadas por iluminao com luz ultravioleta e o gel fotografado.

5. Reaes de Semi-Nested PCR e Nested-PCR.

Os mesmos cDNAs positivos para os vrus influenza analisados por

Nested Multiplex PCR foram utilizados para a amplificao de

segmentos dos cDNAs que codificam a poro externa completa da

molcula da Hemaglutinina (HA1). A tcnica de "Semi-Nested PCR", foi

utilizada para a amplificao de segmentos dos cDNAs dos vrus da

influenza tipo A subtipo H1N1 e tipo B. J para os vrus do tipo A

subtipo H3N2, foi utilizada a tcnica de "Nested PCR".

5.1. Oligonucleotdeos iniciadores.

As reaes de "Semi-Nested PCR" utilizaram um par de iniciadores

externos para a primeira amplificao, sendo os iniciadores H1F e H1R

utilizados para os vrus influenza A H1N1, e os iniciadores BF e BR

utilizados para vrus influenza B. Para a segunda amplificao foram

utilizados os mesmos iniciadores externos senso (H1F e BF), no entanto


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substituindo-se os iniciadores anti-senso utilizados na primeira reao por

iniciadores internos: H1R2 para vrus influenza A H1N1 e, BR2 para

vrus influenza B.

Para as reaes de "Nested PCR" de vrus influenza H3N2 foram

utilizados 2 pares de iniciadores, um par externo para a primeira

amplificao, H3F2 e H3R, e um par interno para a segunda

amplificao, H3F e H3R2.

A seqncia dos iniciadores H3F, H3R, H1F, H1R, BF e BR foram

descritas anteriormente (Xu e col., 1994; Xu e col., 1993; Rocha e col.,

1991) (tabela 5 e figuras 1, 2 e 3). Os demais iniciadores, H3F2 e H3R2

para o subtipo H3N2, H1R2 para o subtipo H1N1 e BR2 para o tipo B,foram desenhados utilizando-se os programas de computador para

anlise, Oligo Tech (verso 1.0, Oligos Etc Inc e Oligo Therapeutics inc)

e DNA Sequence Search Program (verso 2.1)(tabela 5 e figuras 1, 2 e 3).


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Tabela 5. Propriedades dos iniciadores do "Semi-Nested PCR e Nested PCR"

A letra R que compe o nome do iniciador indica que ele um iniciador reverso, enquanto letra F

indica que o iniciador senso.

Iniciador

Posio da

extremidade 5

do iniciador

Tamanho do Produto

(pb)Seqncia (53)

Primeiro "PCR" (iniciadores externos)

H3F2 12 gggataattctattaacca

H3R 1198 1187 atggctgcttgagtgctt

H1F 06 aagcaggggaaaataaaa

H1R 1210 1205 gtaatcccgttaatggcaBF 36 gaaggcaataattgtactac

BR 1140 1105 accagcaatagctccgaa

Segundo "PCR" (iniciadores internos)

H3F 36 actatcattgctttgagc

H3R2 1153 1118 catctatcattcctgtc

H1R2 1122 1117 catctatcattcctgtc

BR2 1075 1040 cattggcaagcttcaaag


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Fig. 1. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo A subtipo H1N1* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.

Stio de Clivagem*

HA1 HA2

H1A

H1R2 H1R

Direo de Sntese

H1F

Dire o de Sntese

H1B

H1FIIH1EII

HA2

Regio notraduzida

PeptdioSinal

cDNA

HA1

(6) (76) (96)

(1039) (1090) (1122) (1210)

5

53

3

PPrroodduuttooddeePPCCRRSSeemmii--NNeesstteedd 11220055ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRSSeemmii--NNeesstteedd 11111177paarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx11 11001155ppaarreessddee

PPrroodd..PPCCRRMMuullttiipplleexx22 994444ppbb


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Fig. 2. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo A subtipo H3N2* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.

Stio de Clivagem*

HA1 HA2

H3A

H3R H3R

Direo de Sntese

H3F2 H3F

Dire o de Sntese

H3B

H3DIIH3CII

HA2

Regio notraduzida

PeptdioSinal

cDNA

HA1

(12) (36) (174) (348)

(938) (1056) (1153) (1198)

5

53

3

PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd11 11118877ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd22 11111188ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx 888833ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodd..PPCCRRMMuullttiipplleexx22 559911ppbb


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Fig. 3. Esquematizao da localizao dos iniciadores especficos para ovrus da influenza tipo B.* Representao no cDNA do stio de clivagem da protena.

5.2. Reaes.

A primeira "PCR" foi realizada num volume total de 50 L,

utilizando-se de 2 L de cDNA positivo ou de controle negativo nos

experimentos de Nested Multiplex PCR e nas seguintes condies: 20

mM Tris-Cl pH 8,4, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP,

0,2M de iniciador externo (H1F, H1R, H3F2, H3R, BF e BR), 2,5 U de

Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies). As condies deciclagem utilizadas nessa primeira amplificao encontram-se na tabela 6

para os vrus da influenza tipo A e tabela 7 para os vrus tipo B. A

segunda "PCR" foi realizada partindo-se de 1 L do produto da primeira

amplificao e nas mesmas condies da primeira "PCR", excetuando-se

Stio de Clivagem*

HA1 HA2

BHA

BR2 BR

Direo de

BF

Dire o de Sntese

BHA

BHADIBHACII

HA2

Regio notraduzida

PeptdioSinal

cDNA

HA1

(36) (154) (196)

(962) (1053 (1075 (1140

5

53

3

PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd 11110055ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRNNeesstteedd 11004400ppaarreessddeebbaasseess

PPrroodduuttooddeePPCCRRMMuullttiipplleexx 990000ppaarreessddeebbaasseess

PPCCRRMMuullttiipplleexx22 776677ppbb


41/129

31

a temperatura de associao, a qual foi alterada para 55oC. As condies

utilizadas nessa segunda amplificao encontram-se nas tabelas 6 e 7.

Todas as amplificaes foram realizadas em termociclador "Perkin

Elmer Cetus DNA Thermal Cycler", utilizando-se leo mineral (Sigma)

para se impedir evaporao dos contedos.

Tabela 6 Para vrus da influenza tipo A.

EtapasTemperatura

em oC

Tempo em

Minutos

Nmero de

Ciclos

Desnaturaoinicial

95 2 1

Desnaturao 94 1

Associao 53 1

Extenso 72 1.5

40

Manuteno 4 1


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32

Tabela 7 Para vrus da influenza tipo B.

Programa de Ciclos do "Semi-Nested PCR"

EtapasTemperatura

em oC

Tempo em

Minutos

Nmero de

Ciclos

Desnaturao

inicial95 2 1

Desnaturao 94 1

Associao 55 1Extenso 72 1.5

40

Manuteno 4 1

5.3. Anlise dos Produtos Amplificados.

Os produtos da segunda reao foram analisados por eletroforese

em gis de agarose exatamente da mesma maneira que os produtos de

Nested Multiplex PCR.

6. Determinao da seqncia de nucleotdeos.

A determinao da seqncia de nucleotdeos foi feita diretamente

do produto de "PCR". Para isso, foi utilizado o seqenciador ABI 377(Applied Biosystems Inc) que emprega um gel de poliacrilamida com

capacidade de 96 canaletas.


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33

6.1. Purificao dos Produtos de "PCR".

A purificao dos produtos das reaes de "Nested PCR e Semi-

Nested PCR" foi feita em colunas, utilizando o sistema "QIAquick PCR

Purification Kit" (Qiagen) de acordo com as instrues do fabricante.

Alquotas do produto purificado foram submetidas eletroforese

em gel de agarose 1,2% e quantificadas com o auxlio de DNA de

bacterifago Lambda de massa conhecida (Invitrogen Life Technologies).

6.2. Reao de determinao de Seqncias de nucleotdeos.

Para a reao de determinao de seqncias de nucleotdeos foramutilizados 3.2 moles de cada iniciador, 2 l de BigDye terminator

cycle sequencing kit 3.0 (Applied Biosystems Inc), 6l de tampo Save

Money (200mM de Tris-HCl pH 9 e 5mM de MgCl2), 30 a 100 moles

de produto de "PCR" e, gua deionizada para completar o volume final de

20 l. Os iniciadores utilizados foram os mesmos empregados para a

obteno de produtos do Nested-PCR e Semi-Nested PCR (H1F,

H1R2, H3F, H3R2, BF e BR2 - tabela 5). Para cada amostra foram feitas

quatro reaes de seqnciamento, duas reaes utilizando iniciadores

senso e duas com iniciadores anti-senso. As reaes foram realizadas no

termociclador "Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400". As

condies de ciclagem so apresentadas na tabela 8.


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34

Tabela 8. Programa de ciclagem utilizado para as reaes de

determinao de seqncias de nucleotdeos.

Programa de Ciclos do Seqnciamento

EtapasTemperatura

em oCTempo

Nmero de

Ciclos

Desnaturao

inicial

95 2 minutos 1

Desnaturao 94 45 segundos

Associao 50 10 segundos

Extenso 72 4 minutos

25

Manuteno 4 1

Os produtos das reaes de determinao da seqncia de

nucleotdeos foram purificados em colunas do kit "DyeEx 2.0 Spin Kit"

(Qiagen) de acordo com as instrues do fabricante, seguindo-se secagem

a vcuo por 30 minutos. As amostras purificadas foram ressuspendidas

em 3 l de formamida e submetidas eletroforese em gel de

poliacrilamida, utilizando o seqenciador automtico ABI 377 (AppliedBiosystems Inc).


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35

7. Edio e Anlise das Seqncias Obtidas.

As quatro seqncias de nucleotdeos obtidas para cada amostra

positiva foram alinhadas e editadas manualmente no programa de

computador "Sequence Navigator" (verso 1.0.1 Applied Biosystems).

As seqncias editadas foram comparadas utilizando-se o programa de

computador ClustalX 1.83 (Thompson e col., 1997) e traduzidas para

aminocidos pelo programa "BioEdit Sequence Alignment Editor"

(verso 5.0.9) (Hall, 1999). Para a apresentao grfica dos alinhamentos

das seqncias de nucleotdeos obtidas, foi utilizado o programa de

computador "GeneDoc Multiple Sequence Alignment Editor & ShadingUtility" (verso 2.4.002) (Karl Nicholas, Copyright).

8. Localizao das diferenas na estrutura da hemaglutinina.

Aps mapeadas as diferenas encontradas, quando foram

comparadas as seqncias de aminocidos das amostras estudadas entre si

e entre as seqncias peptdicas das cepas vacinais, foi possvel localizarestas diferenas na estrutura tridimensional da hemaglutinina. Para isso

foi utilizado o programa de computador "Rasmol" (verso 2.7.2.1.1)

(Sayle e Milner-White 1995) para a edio da estrutura tridimensional do

monmero de HA obtida por difrao de raios X (Influenza Sequence

Data Base, www.flu.lanl.gov). O Modelo foi baseado na estrutura obtida

por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein Data Bank sob o

nmero de acesso 1HGI.


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36

9. rvore genealgica.

Para a construo da rvore genealgica foi utilizado o programa de

computador Meg Align 4.05 Expert Analysis Software (DNASTAR,

Inc). As seqncias de nucleotdeos utilizadas na rvore foram todas

alinhadas com o programa "BioEdit Sequence Alignment Editor" (verso

5.0.9) e editadas para ficarem no tamanho de 555 resduos de

nucleotdeos, que corresponde menor seqncia de nucleotdeos obtida

nas amostras analisadas.

Alm das seqncias de nucleotdeos por ns determinadas,

tambm foram utilizadas seqncias obtidas em bancos de dados de genesGenBank e Influenza Sequence Database (www.ncbi.nlm.nih.gov e,

www.flu.lanl.gov respectivamente). Essas ltimas foram escolhidas de

acordo com trs critrios. Primeiro, foram obtidas seqncias de

nucleotdeos que tiveram maior similaridade com as seqncias das

amostras que analisamos. Segundo, foram selecionadas seqncias de

nucleotdeos de vrus influenza isolados em diferentes anos e hospedeiros

distintos, assim como uma seqncia do tipo A subtipo H5N1 e duasseqncias do tipo C para que o programa de computador DNASTAR

tivesse base de comparao tendo como material de anlise seqncias

relacionadas, no entanto, heterogneas. Terceiro, foram utilizadas na

obteno da rvore genealgica as seqncias de nucleotdeos das cepas

vacinais dos anos 2000 e 2001, propostas pela Organizao Mundial de

Sade. Todas as seqncias utilizadas na rvore genealgica foram da

regio HA1 da hemaglutinina viral, com exceo para seqncias de

nucleotdeos dos vrus tipo C onde foram utilizadas seqncias correlatas

da sua glicoprotena de superfcie, hemaglutinina esterase (HE).


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37

IV Resultados

1. Deteco, tipagem e subtipagem das amostras clnicas.

A tcnica de Nested Multiplex PCR previamente estabelecida (Ellis e

col., 1997) foi utilizada na deteco, tipagem e subtipagem dos vrus influenza

nas amostras estudadas. Essa tcnica baseia-se na amplificao de fragmentos

de tamanho distintos atravs da utilizao de iniciadores especficos para os

tipos e subtipos virais A H1N1, A H3N2 e B. Aps a segunda amplificao,

eram esperados fragmentos de tamanhos 944 pares de base (pb), 591pb e 767

pb respectivamente para amostras portadoras dos tipos virais A H1N1, A

H3N2 e B (figura 4). Em todos experimentos de Nested Multiplex PCR um

controle negativo onde o volume de cDNA foi substitudo pelo mesmo

volume de gua, controle dos reagentes, sempre resultou na ausncia de

deteco de algum produto, indicando a ausncia de contaminao dereagentes.

No ano de 2000 foram coletadas 91 amostras e, sendo 57 amostras

coletadas em 2001. Das 91 amostras coletadas no ano de 2000, 18 se

mostraram positivas para vrus da influenza. Duas dessas 18 amostras (006 e

015) mostraram a peculiaridade de serem positivas para dois subtipos virais, A

H1N1 e A H3N2. Assim, no ano de 2000 foi possvel a deteco de 20

produtos de Nested Multiplex PCR independentes (figura 4 B e tabela 9).

Portanto, do total de 20 registros positivos, o que corresponde a

aproximadamente 22% do nmero total de amostras, 12 (60% dos registros

positivos) pertencem ao tipo A subtipo H3N2, 2 (10% dos registros positivos)

pertencem ao subtipoH1N1 e, 6 (30% dos registros positivos) pertencem ao

tipo B (tabela 09).


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38

J para as 57 amostras coletadas em 2001, 16 se mostraram positivas

para o vrus influenza, o que corresponde a 28% do nmero total de amostras,

sendo 1 amostra positiva para o subtipo H3N2 (6,25% dos registros positivos),

14 para o subtipo H1N1 (87,5% dos registros positivos) e 1 amostra para o

tipo B (6,25% dos registros positivos) (figura 4 A e tabela 9).

Figura 4 Deteco, tipagem e subtipagem do vrus influenza em amostras clnicas. A) Gel

de agarose 1,2% corado com brometo de etdio representativo de amostras clnicas

portadoras dos diferentes tipos e subtipos virais. Canaleta 1, produto de Nested Multiplex

PCR da amostra 114, mostrando padro caracterstico de presena do vrus A H1N1.

Canaleta 2, produto de Nested Multiplex PCR da amostra 125, mostrando padro

caracterstico de presena do vrus A H3N2. Canaleta 3, produto de Nested Multiplex

PCR da amostra 110, mostrando padro caracterstico de presena do vrus tipo B.

Canaleta PM, padro de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Invitrogen LifeTechnologies). B) Produtos de Nested multiplex PCR positivos para vrus do tipo A

subtipos H3N2 e H1N1 na mesma amostra clnica. Canaleta 1, produtos gerados a partir da

amostra 006. Canaleta 2, produtos gerados a partir da amostra 015. Canaleta PM, padro

de peso molecular 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs).

PM 1 2 3

1.500 pb

600 pb

100 pb

H1N1 944 bB (767 pb)

H3N2 591 b

100 pb

1.200 pb

500 pb

PM 1 2

A B

H1N1 944 b

H3N2 591 b


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39

Tabela 9 Distribuio da amostras positivas pelos anos de coleta*.

Quantidade de Amostras positivas

Tipo A Tipo B Co-infeco com H3N2Ano da

Coleta Subtipo

H1N1

Subtipo

H3N2H1N1 B

2000 2 12 6 2 0

2001 14 1 1 0 0

Total 16 13 7 2 0

*Ver tambm o apndice 2.


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40

2. Obteno da regio codificadora completa de HA1.

A tcnica de "Semi-Nested PCR", foi utilizada para a amplificao do

segmento gnico contendo a poro externa da molcula de hemaglutinina

(HA1) dos vrus da gripe tipo A subtipo H1N1 e tipo B. Para os vrus do tipo

A subtipo H3N2 foi utilizada a tcnica de "Nested PCR". Os iniciadores

utilizados nestas reaes em cadeia pela polimerase foram desenhados para

serem especficos para a regio de peptdeo sinal do segmento gnico 4 e para

a regio que codifica a poro HA2 da hemaglutinina. Dessa forma, foi

possvel a obteno de produtos contendo as regies HA1 completas.

Os fragmentos obtidos com a tcnica de "Semi-Nested PCR" para os

vrus tipo A subtipo H1N1 foram de 1117 pares de bases, onde se incluem os

978 pares de bases quem compem a regio codificadora da poro HA1 da

hemaglutinina. Para os vrus do tipo B, foram obtidos produtos de PCR com

1040 pares de bases, sendo a regio codificadora de HA1 composta por 1038nucleotdeos. Com a tcnica de "Nested PCR" obtivemos para o tipo A subtipo

H3N2 produtos com 1118 pares de bases, os quais contm a regio

codificadora da poro HA1 da hemaglutinina viral de 984 pares de base.

Do total de 34 amostras positivas que geraram 36 produtos amplificados

pela tcnica de "Nested Multiplex PCR", conseguimos obter 32 produtos que

correspondem s regies HA1 completas da hemaglutinina (Figura 5). No foi

possvel a amplificao de produtos de PCR contendo a regio completa de

HA1 de 4 amostras, sendo 3 do tipo A subtipo H3N2 (006, 011 e 013) e 1 do

tipo A subtipo H1N1 (006).

As amostras de influenza A subtipo H1N1, 123, 126, 133 e 140

mostraram bandas inespecficas (figura 5A, linhas 12, 13, 14 e 15

respectivamente). O mesmo ocorreu com as amostras 08, 10, 12, 15 e 125 do

tipo A subtipo H3N2 (figura 5B, linhas 2, 4, 5, 6 e 11 respectivamente).


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41

A

BC

PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 PM 01 02 03 04 05 06 07 08 PM

PM 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 PM

500 pb

1.200 pb

100 pb

100 pb

1.200 pb

500 pb

600 pb

1500 pb

100 pb

Figura 5. Obteno das regies codifcadoras completas de HA1. por Semi-Nested PCR e

Nested PCR A: Produtos de Semi-Nested PCR para cDNAs A H1N1 analisados em gel de agarose

1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 15 correspondem s amostras 15, 99, 101, 103, 104,

109, 112, 113, 114, 121, 122, 123, 126, 133 e 140 respectivamente. Padro de peso molecular (PM)

100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). B: Produtos de Nested PCR para cDNAs A H3N2

analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 11 correspondem s

amostras 03, 08, 09, 10, 12, 15, 18, 24, 49, controle negativo e 125 respectivamente. Marcador de peso

molecular (PM) 100bp DNA ladder (New England Biolabs INC). C: Produtos de Semi-Nested PCR

para cDNAs B analisados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etdio. Linhas de 01 a 08

correspondem s amostras 17, 53, 55, 64, 74, 79, controle negativo e 110 respectivamente. Marcador de

peso molecular (PM) 100bp DNA ladder (Invitrogen Life Technologies).


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42

4. Seqncias de aminocidos de HA1 das amostras estudadas: anlise

comparativa das amostras entre si e com as cepas vacinais.

As regies codificadoras completas de HA1 da hemaglutinina viral das

amostras positivas foram utilizadas para a obteno de suas seqncias de

nucleotdeos. As seqncias de nucleotdeos obtidas foram traduzidas em

peptdeos, as quais foram utilizadas em diferentes alinhamentos. As

seqncias de aminocidos das regies HA1 obtidas foram alinhadas entre si,

assim como, com a seqncia das cepas vacinais utilizadas nos anos de 2000 e

2001.

Essa estratgia nos permite avaliar variaes na seqncia de

aminocidos para cada tipo e subtipo viral ao longo de 2 anos consecutivos e,

compar-las com as cepas vacinais. Uma vez mapeadas as diferenas,

podemos localiz-las na estrutura tridimensional da hemaglutinina e, verificar

se essas pertencem a stios antignicos conhecidos por sua alta variabilidade.

4.1. Tipo A Subtipo H1N1

Foram obtidos 14 produtos de "Semi-Nested PCR" para as amostras do

tipo A subtipo H1N1. A seqncia de nucleotdeos para esses produtos de

978 pares de bases. Devido ausncia de produto contendo a regio HA1

completa para a amostra 006, utilizou-se o produto de 891 pares de bases

obtido em experimentos de "Nested Multiplex PCR" para a obteno de

informao de seqncia de nucleotdeos. Esse fragmento corresponde a

aproximadamente a 91% da regio HA1 da hemaglutinina. Para a amostra 123

no foi possvel obter seqncias.

A comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 de todas as

amostras do tipo A subtipo H1N1 entre si, assim como, com a seqncia da


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43

cepa vacinal utilizada nos anos 2000 e 2001 (A/New Caledonia/20/99)

mostrou vrias diferenas. Das 20 diferenas mapeadas, 19 so substituies

de aminocidos, enquanto uma configura-se como uma deleo (figura 06).

Entre as amostras positivas que foram coletadas no ano 2000 (amostras 006 e

015) foi encontrado um total de 15 aminocidos de diferena quando

comparadas com as seqncias da cepa vacinal, sendo 13 diferenas referentes

seqncia 006 e duas referentes a seqncias 015 (tabela 10). Entre as

amostras do ano 2001 foram encontradas apenas 6 diferenas em suas

composies peptdicas quando comparadas com a seqncia da cepa vacinal

A/New Caledonia/20/99 (figura 06 e tabela 10).

Todas as alteraes de aminocidos ocorridas entre as seqncias

peptdicas das amostras do subtipo H1N1 foram relacionadas com os cinco

stios de maior variabilidade na regio de HA1 da molcula de hemaglutinina

(figura 07 e tabela 10) (Yewdell e col., 1983, Caton e col., 1982, Drescher e

Aron, 1999).

10 20 30 40 50 60

Cepa DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGW

121H1 ............................................................

122H1 ............................................................

101H1 ............................................................

099H1 ............................................................

109H1 ............................................................

103H1 ...........................................I................

112H1 ............................................................

113H1 ............................................................

133H1 ............................................................

126H1 ............................................................

114H1 ............................................................

104H1 ............................................................

140H1 ............................................................

015H1............................................................

006H1-------------.............................R.............I...


54/129

44

70 80 90 100 110 120

Cepa ILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKE

121H1 ............................................................

122H1 ............................................................

101H1 ............................................................

099H1 ............................................................

109H1 ............................................................

103H1 ............................................................

112H1 ............................................................

113H1 ............................................................

133H1 ............................................................

126H1 ............................................................

114H1 ............................................................

104H1 ............................................................

140H1 ............................................................

015H1............................................................

006H1........S.F........A....S...................................

130 140 150 160 170 180

Cepa SSWPNHTVT-GVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVH

121H1 N........-...................................A..............

122H1 N........-...................................A..............

101H1 .........-...................................A..............

099H1 .........-...................................A..............

109H1 .........-...................................A..............

103H1 .........-...................................A..............

112H1 .........-...................................A..............

113H1 .........-...................................A..............

133H1 .........-...................................A..............

126H1 .........-...................................A..............114H1 .........-...................................A..............

104H1 .........-...................................A..............

140H1 .........-...................................A..............

015H1.........-................................M.................

006H1.........K..T...............................................

190 200 210 220 230 240

Cepa HPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTI

121H1 ............................................................

122H1 ............................................................

101H1 ............................................................

099H1 ............................................................

109H1 ............................................................

103H1 ............................................................

112H1 ............................................................

113H1 ............................................................

133H1 ............................................................

126H1 ............................................................114H1 ............................................................

104H1 ............................................................

140H1 ............................................................

015H1............................................................

006H1..S.......I..............................G..................


55/129

45

250 260 270 280 290 300

Cepa IFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTI

121H1 ...........R................................................

122H1 ...........R................................................

101H1 ...........R................................................

099H1 ...........R.............................................I..

109H1 ...........R................................................

103H1 ...........R................................................

112H1 ...........R................................................

113H1 ...........R................................................

133H1 ...........R................................................

126H1 ...........R................................................

114H1 ...........R................................................

104H1 ...........R................................................

140H1 ...........R................................................

015H1..........................................K.................

006H1..............................S.............................

310 320

Cepa GECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQS

121H1 .........T................

122H1 .........T................

101H1 .........T................

099H1 ..........................

109H1 ..........................

103H1 ..........................

112H1 ..........................

113H1 ..........................

133H1 ..........................126H1 ..........................

114H1 ..........................

104H1 ..........................

140H1 ..........................

015H1..........................

006H1.........T----------------

Figura 06 - Comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 obtidas de amostras do tipo A

subtipos H1N1 coletadas nos anos de 2000 e 2001 e a cepa vacinal A/New Caledonia/20/99.

Pontos (.) indicam similaridade entre as seqncias obtidas, somente os aminocidos diferentes

da seqncia da cepa vacinal esto representados. Traos (-) representam lacunas geradas por

ausncia de seqncia peptdica. A disposio grfica da figura foi obtida com o auxlio do

programa de computador "GeneDoc Multiple Sequence Alignment Editor & Shading Utility"

(verso 2.4.002) (Karl Nicholas, copyrigth). A ordem das seqncias foi determinada pela

similaridade entre as seqncias e arranjadas pelo programa de computador "ClustalX" (verso

1.83) (Thompson e col., 1997). Amostras coletadas no ano de 2000 esto em itlico e negrito, as

demais foram coletadas no ano de 2001. A seqncia peptdica da cepa vacinal A/New

Caledonia/20/99 (Cepa) foi obtida do "Genbank" sob nmero de acesso AJ344014.


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46

Tabela 10. Sumrio das alteraes nas seqncias de aminocidos das

amostras coletadas nos anos de 2000 e 2001 em relao cepa vacinal A/New

Caledonia/20/99.

Nmero da

Amostra

Posio dos

ResduosCepa Vacinal Alterao

Stio

Antignico

006 43 leucina arginina ---

103 44 leucina isoleucina ---

006 57 valina isoleucina Cb

006 69 leucina serina Cb

006 71 isoleucina fenilalanina Cb

006 80 valina alanina Cb

006 85 prolina serina ---

121 e 122 121 serina asparagina Ca1

006 130* Lacuna lisina Ca2

006 133 serina treonina Ca2

015 162 lisina metionina Sa

121, 122, 101,

099, 109, 103,

112, 113, 133,

126, 114 e

104 .

165 valina alanina Ca1


006 191 leucina isoleucina Sb

006 222 cido asprtico glicina---


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47

Nmero da

Amostra

Posio dos

ResduosCepa Vacinal Alterao

Stio

Antignico

121, 122, 101,

099, 109, 103,

112, 113, 133,

126, 114 e

104 .

251 triptofano arginina ---


015 282 glutamina lisina ---

99 297 valina isoleucina ---

006, 101, 121

e 122.309** alanina treonina ---

(---)Resduos de aminocidos que no se enquadram em nenhum stio antignico.

*A amostra 006 apresentou a insero de um aminocido na posio 130 da cadeiapeptdica.

** Para a amostra 006 esta alterao ocorreu no resduo 310 devido insero de um

aminocido na posio 130. Para as outras amostras esta diferena ocorreu no resduo 309.


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48

A B Legenda

A) Mutaes ocorridas nos stiosantignicos Ca2, Sa, Sb, Ca1 e Cb.

i) Ca2

ii) Sa

iii) Sb

iv) Ca1

iv) Cb

B) Mutaes ocorridas fora dos stiosantignicos descritos.

Resduo 130 Resduo 133

Resduo 162

Resduo 191


Resduo 57 Resduo 80

Resduo 69 Resduo 57

Resduo 43 Resduo 44Resduo 85 Resduo 183

Resduo 222 Resduo 251Resduo 271 Resduo 282


Figura 07. Estrutura do monmero de HA obtida por difrao de raios X (Influenza Sequence Data Base,

www.flu.lanl.gov). Modelo baseado na estrutura obtida por Sauter e cols., 1992 e depositada no Protein DataBank sob o nmero de acesso 1HGI. "Rasmol" (2.7.2.1.1), foi o programa utilizado na edio da figura (Sayle

e Milner-White 1995).


59/129

49

4.2. Tipo A Subtipo H3N2

Foram obtidos 13 produtos de "Nested Multiplex PCR" para as

amostras do tipo A subtipo H3N2. Dessas, 9 tiveram as seqncias de

nucleotdeos, da regio codificadora de HA1 completa, determinadas. Devido

no ter sido possvel a obteno de produto de "Nested PCR" para as amostras

006, 011 e 013, foram obtidas seqncias dos produtos de "Nested Multiplex

PCR" com tamanho de 555 pares de bases ou, quando traduzidas para

aminocidos um tamanho de 185 resduos, cerca de 56% da regio HA1 da

hemaglutinina. Para a amostra 018 no foi possvel obter seqncias

caractersticas de influenza A H3N2. Todas as seqncias obtidas foram

traduzidas para sua forma peptdica e comparadas com a seqncia de

aminocidos da cepa vacinal.

A comparao entre as seqncias peptdicas de HA1 dasamostras coletadas do subtipo H3N2 com a seqncia de aminocidos das

cepas vacinais mostrou a existncia de 52 alteraes (Figura 08). Entre as

amostras coletadas no ano de 2000 a diferena entre a cadeia peptdica das

amostras e a seqncia da cepa vacinal de 2000 (A/Sydney/5/97) foi de 42

resduos de aminocidos (tabela 11). A seqncia peptdica da cepa vacinal de

2000 foi obtida no Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) sob nmero de acesso

AJ311466. Para o ano de 2001 foi recomendada pela OMS a cepa vacinal

A/Panam/2007/99, sua seqncia peptdica foi obtida no banco de dados

Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov) sob nmero de acessoISDNCDA001. Quando comparamos a seqncia peptdica da cepa vacinal de

2001 com a seqncia da amostra 125, coletada no ano de 2001, encontrou-se

o total de 10 diferenas de aminocidos (tabela 12).


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50

Todas as alteraes de aminocidos ocorridas entre as seqncias

peptdicas das amostras dos subtipo H3N2 foram relacionadas com os cinco

stios de maior variabilidade na regio de HA1 da molcula de hemaglutinina

(Wiley e col., 1981, Underwood, 1982, Underwood 1984, Wiley e Skehel,

1987) (tabelas 11 e 12 e figura 09).

10 20 30 40 50 60

Cepa1 QKIPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILD

Cepa2 ..L.................S...................................Q...

003H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...

049H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...

125H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...

012H3 ..L.V...............P...........H.......................Q...

024H3 ..L.V...............P........M..H.......................Q...

008H3 ..L.................P.......................................

015H3 ..L.................P.......................................

010H3 ..L.................P.......................................

009H3 ..L.................P.......................................

006H3 ------------------------------------------------------------

011H3 ------------------------------------------------------------

013H3 ------------------------------------------------------------

70 80 90 100 110 120Cepa1 GENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEF

Cepa2 ............................................................

003H3 ...............................T............................

049H3 ...............................T............................

125H3 ...............................T...................I........

012H3 ...............................T............................

024H3 ...............................T............................

008H3 .K..........................................................

015H3 .K..........................................................

010H3 .K..........................................................

009H3 .K..........................................................

006H3 ------------------------------------........................

011H3 ------------------------------------........................

013H3 ------------------------------------........................

130 140 150 160 170 180

Cepa1 NNESFNWTGVAQNGTSYACKRSSIKSFFSRLNWLHQLKYKYPALNVTMPNNDKFDKLYIW

Cepa2 ................S....R.N...........................E........

003H3 ................S....R.I...........................E........

049H3 ................S....R.I...........................E........

125H3 ................S....R.I...........................E........

012H3 ................S....R.I...........................E........

024H3 ................S....R.I...........................E........

008H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........

015H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........

010H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........

009H3 I..D........S.E......G.V...........KSD.............G........


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51

006H3 I..D........S.E......G.V...........KS

variantes moleculares do vírus influenza

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