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Geschäftsfüh

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chen Zentrum für Hygiene und Infektionsbioer Philipps-Universität Marburg

Institut für Virologie render Direktor: Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk

ungen zur Rolle des VP24 im ngszyklus des Marburgvirus

Inaugural-Dissertation ng des Doktorgrades der Humanbiologie

(Dr. rer. physiol.)

m Fachbereich Humanmedizin er Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Sandra Bamberg aus Koblenz

Marburg, August 2004

Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Januar 2001 bis Juli 2004

am Institut für Virologie des Medizinischen Zentrums für Hygiene und

Infektionsbiologie unter der Leitung von Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk durchgeführt.

Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs. Dekan: Herr Prof. Dr. Bernhard Maisch Referent: Herr Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk Koreferent: Herr Prof. Dr. Jacob

Inhaltsverzeichnis 1


1 Einleitung 7

1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren 7

1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion 10

1.3 Morphologie des Marburgvirus 12

1.4 Genomstruktur des Marburgvirus 13

1.5 Die viralen Proteine 13

1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus 17

1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und Retroviren 18

1.8 RNA Interferenz (RNAi) 19

1.9 Fragestellung 21

2 Material 22

2.1 Chemikalien 22

2.2 Verbrauchsmaterialien 24

2.3 Kits 25

2.4 Geräte 25

2.5 Puffer und Lösungen 27

2.5.1 Puffer 27

2.5.2 Lösungen 31

2.6 Wachstumsmedien 32

2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien 32

2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen 32

2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide 33

2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker 33

2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide 33

2.7.3 siRNA-Sequenzen 33

2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer) 34

2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide 35


2.8.1 Vektoren 35

2.8.2 Rekombinante Plasmide 35

2.9 Proteine 36

2.9.1 Enzyme 36

2.9.2 Antikörper 37

2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren 38

2.10 Radioaktiv markierte Substanzen 38

2.11 Zellen und Viren 38

2.11.1 Prokaryotische Zellen 38

2.11.2 Eukaryotische Zellen 38

2.11.3 Viren 38

3 Methoden 39

3.1 Molekularbiologische Methoden 39

3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA 39

3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten >100 bp 39

3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 39

3.1.1.3 Ethanolfällung 39

3.1.2 Analyse von DNA 40

3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung 40

3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele 40

3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele 40

3.1.2.2 Quantifizierung von DNA 40

3.1.2.3 Sequenzanalyse mit dem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer 41

3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA 42

3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen 42

3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA 43

3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-

Ketten-Reaktion (PCR)

44


3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren 45

3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA 46

3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA 47

3.1.4 Vervielfältigung von DNA 47

3.1.4.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (Miniprep) 47

3.1.4.2 Plasmidpräparation im großen Maßstab (Maxiprep) 47

3.1.5 Reinigung und Analyse von RNA 48

3.1.5.1 Reinigung von viraler RNA aus Zellkulturüberstand 48

3.1.5.2 Quantifizierung von RNA und siRNAs 48

3.1.6 Real-time RT-PCR Analyse mittels SYBR Green dye I 48

3.2 Zellbiologische Methoden 49

3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen 49

3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine PlusTM 50

3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen

Partitionierung

51

3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse

freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs)

51

3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit LipofectamineTM 2000 52

3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen 52

3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach siRNA-

Behandlung

53

3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem 54

3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen 54

3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung

mittels Triton X-100

54

3.3 Biochemische und immunologische Methoden 55

3.3.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen und deren

Visualisierung

55

3.3.1.1 SDS-PAGE 55


3.3.1.2 Coomassie-Färbung 56

3.3.1.3 Autoradiographie 56

3.3.1.4 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot) 56

3.3.1.5 Entfernung von gebundenen Antikörpern von bereits analysierten

PVDF-Membranen

58

3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse 58

3.3.3 In vitro Translation 59

3.3.4 Immunpräzipitation 60

3.3.5 Behandlung von VLPs mit Proteinase K 61

3.3.6 Untersuchungen zur Membranassoziation von Proteinen 62

3.3.6.1 Flotationsanalyse im nichtlinearen Saccharose-Gradienten 62

3.3.6.2 Charakterisierung der Membranassoziation 62

3.3.6.3 Triton X-114 Phasenpartitionierung 63

3.3.7 Bakterielle Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen 64

3.3.7.1 Klonierung und bakterielle Expression von GST-VP24 64

3.3.7.2 Kopplung des GST-VP24 an Glutathion-Sepharose 65

3.3.8 Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen 65

3.3.8.1 Präparation des GST-VP24-Fusionsproteins 65

3.3.8.2 Immunisierung 66

3.3.8.3 Aufbereitung der Seren und Antikörpernachweis 66

3.3.9 Affinitätsreinigung des VP24-Antikörpers 67

4 Ergebnisse 68

4.1 Immunfluoreszenzanalysen zur intrazellulären Lokalisation von

VP24

68

4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten 68

4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten 70

4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern 71

4.1.4 Immunfluoreszenzanalyse des VP24 72


4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24 73

4.2.1 Interaktion von VP24 mit zellulären Membranen 73

4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion 75

4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP 76

4.2.3 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24 77

4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs) 79

4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24 80

4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur

Virusinfektion

82

4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP 82

4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur

MARV-Infektion

83

4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs 84

4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln 85

4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den

Einbau von VP24

87

4.3.6 Einbau von NP in die VLPs 89

4.4 Interaktion des VP24 mit viralen Proteinen 90

4.4.1 Lokalisation des VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen 90

4.4.2 Interaktion von VP24 und NP in der Immunfluoreszenzanalyse 92

4.4.3 Interaktion von VP24 und VP40 94

4.4.3.1 Koimmunpräzipitation von VP24 und VP40 94

4.4.3.2 Kolokalisation von VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse 95

4.5 Abschalten der MARV VP24-Expression durch RNAi 97

4.5.1 Auswahl geeigneter siRNA-Sequenzen aus der Ziel-mRNA-Sequenz 97

4.5.2 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNAs 98

4.5.3 Abschalten der VP24-Expression in der Virusinfektion durch RNAi 100

4.5.4 Freisetzung reifer Viruspartikel von siRNA-behandelten Zellen 103


5 Diskussion 105

6 Zusammenfassung 113

7 Literaturverzeichnis 114

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 127

9 Abkürzungsverzeichnis 129

10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen 131

11 Curriculum Vitae 133

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 134

13 Danksagung 135

14 Ehrenwörtliche Erklärung 136

1 Einleitung 7

1 Einleitung

1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren

Das Marburgvirus (MARV) und das Ebolavirus (EBOV) bilden aufgrund ihrer

fadenförmigen Gestalt (lat.: filum = der Faden) sowie serologischer, biochemischer und

molekularbiologischer Eigenschaften die Familie der Filoviridae (Kiley et al., 1982).

Hierbei handelt es sich um hochpathogene Erreger, die sowohl bei menschlichen als

auch nichtmenschlichen Primaten schwere, oft tödliche Erkrankungen mit

hämorrhagischer Diathese verursachen.

Aufgrund ihres nichtsegmentierten, negativsträngigen RNA-Genoms (NNS-RNA) bilden

die Filoviren gemeinsam mit den Virusfamilien der Rhabodoviridae, Paramyxoviridae

und Bornaviridae die Ordnung der Mononegavirales (Abbildung 1). Sequenzvergleiche

der Genome der Mononegavirales zeigten, dass die Filoviridae den Paramyxoviridae

evolutiv am nächsten stehen (Mühlberger et al., 1992; Sanchez et al., 1992).

Erstmals wurde 1967 eine von Filoviren ausgelöste Epidemie beschrieben (Siegert,

1967), die zeitgleich in Marburg, Frankfurt a.M. und Belgrad auftrat. Bei den infizierten

Personen handelte es sich hauptsächlich um Laborarbeiter und Tierpfleger, die Kontakt

zu Blut oder Organen von grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops) hatten, welche

zuvor aus Uganda importiert worden waren. Das neu entdeckte Marburgvirus erhielt

den Namen der Stadt, in der es identifiziert wurde.

Abbildung 1: Taxonomie der Filoviren. In Anlehnung an van Regenmortel et al. (2000), ICTVdB Management (2003)

Mononegavirales

Paramyxoviridae Filoviridae BornaviridaeRhabdoviridae

Ordnung

Familie

Genus

Spezies

Marburgvirus (MARV)

Ebolavirus (EBOV)

MarburgvirusIvory Coast Ebolavirus (CIEBOV)

Reston Ebolavirus (REBOV)

Sudan Ebolavirus (SEBOV)

Zaire Ebolavirus

(ZEBOV)

1 Einleitung 8

Das Ebolavirus trat erstmals im Jahre 1976 während zweier annähernd zeitgleich

verlaufender, aber voneinander unabhängiger Epidemien in Zaire und Sudan in

Erscheinung. Mehrere hundert Menschen erkrankten an einem schweren hämorr-

hagischen Fieber. Das Virus wurde nach einem Fluss, der sich in der Nähe der Epi-

demiegebiete befindet, benannt (Johnson et al., 1977; Murphy et al., 1978). Morpho-

logisch war das neuentdeckte EBOV dem MARV sehr ähnlich, ließ sich jedoch sero-

logisch unterscheiden. (Bowen et al., 1977; Pattyn et al., 1977). Nach 1967 bzw. 1976

kam es gelegentlich zu kleineren Ausbrüchen durch MARV und EBOV (Tabelle 1).

Virus Genus Jahr Ort humane

Krankheitsfälle (Todesfälle)

Isolat

Marburg 1967 Deutschland /

Jugoslawien

32 (7) Rataycak / Popp

1975 Zimbabwe 3 (1) Ozolin

1980 Kenia 2 (1) Musoke

1987 Kenia 1 (1) Ravn

seit 1998 Republik Kongo >90 (>50) ?

Ebola Sudan 1976 Sudan 284 (141) Boniface

Zaire 1976 Zaire 318 (280) Mayinga

Zaire 1977 Zaire 1 (1) Bonduni

Sudan 1979 Sudan 34 (22) Maleo

Reston 1989 USA 4 (0) Philippines

Reston 1992 Philippinen 0 Philippines

Reston 1992 Italien 0 Siena

Zaire 1994 Gabun 49 (29) Gabon

Ivory Coast 1994 Elfenbeinküste 1 (0) Cote d’Ivoire

Zaire 1995 Zaire 315 (243) Kikwit



Reston 1996 USA 0 Pennsylvania

Sudan 2000-1 Uganda 425 (224) ?

Zaire 2001-2 Gabun/Kongo 122 (110) ?

Zaire 2003 Republik Kongo 143 (128) ?

Zaire 2003-4 Republik Kongo 35 (29) ?

Sudan 2004 Süd-Sudan 25 (6) ?

Tabelle 1: Ausbrüche von Filovirus-Infektionen. In Anlehnung an Feldmann et al., 1996b; WHO 1978a, 1978b, 1992, 1996, 1997, 1999,2000, 2001, 2002, 2003a, 2003b, 2004a, 2004b; CDC, 1996. DRC = DemokratischeRepublik Kongo.

1 Einleitung 9

1995 erfolgte ein weiterer größerer Ausbruch von hämorrhagischem Fieber in Kikwit

(Zaire), ausgelöst vom Subtyp Zaire des Ebolavirus, bei dem von 315 infizierten

Menschen 244 starben (CDC, 1995).

Ein neuer EBOV-Subtyp wurde 1989 in Reston (Virginia/USA) aus Cynomogolus-Affen

(Macaca fascicularis) isoliert, die von den Philippinen in die USA importiert worden

waren (Jahrling et al., 1990). Dieses als Reston Ebolavirus (REBOV) bezeichnete Virus

scheint nicht oder nur schwach humanpathogen zu sein. Es konnten bisher nur

symptomlose Infektionen beim Menschen nachgewiesen werden. Für Affen ist REBOV

jedoch hochpathogen.

Seit Ende 1998 traten gehäuft Fälle von MARV-Infektionen im östlichen Teil der

Demokratischen Republik Kongo (ehemaliges Zaire) um die Stadt Durba auf (Bertherat

et al., 1999; WHO, 1999). Die hier dokumentierten Fälle scheinen auf den Aufenthalt

der infizierten Personen in einer nahegelegenen Goldmine zurückzugehen. Im

Gegensatz zu den bisher beobachteten, sporadisch in verschiedenen Regionen

aufgetretenen MARV-Infektionen sind sie in Durba seit 1998 regelmäßig dokumentiert.

Der natürliche Wirt der Filoviren ist trotz intensiver Untersuchungen bis heute

unbekannt. Zwar spielen Affen bei der Verbreitung der Viren oft eine entscheidende

Rolle, doch können sie als das Reservoir der Viren nahezu ausgeschlossen werden,

da experimentell infizierte Affen ausnahmslos an der Infektion versterben (Fisher-Hoch

et al., 1992; Fisher-Hoch and McCormick, 1999; Ryabchikova et al., 1999; Simpson,

1977). Sie stellen wahrscheinlich nur einen Zwischenwirt in der Infektionskette von

Filovirusinfektionen dar. Als ein möglicher Wirt werden u.a. Fledermäuse betrachtet, da

diese nach einer Infektion das Virus mit dem Kot ausscheiden, jedoch keine Anzeichen

einer Erkrankung aufweisen (Swanepoel et al., 1996). Auch Arthropoden können nicht

ausgeschlossen werden, da gezeigt werden konnte, dass MARV in Mosquitos der

Spezies Aedes aegypti mehrere Wochen persistieren kann (Monath et al., 1999; Kunz

et al., 1968), jedoch scheint dieser Übertragungsweg aufgrund des seltenen Auftretens

von filoviralem hämorrhagischen Fieber als eher unwahrscheinlich.

Umfangreiche serologische Studien haben ergeben, dass Filoviren in Teilen

Zentralafrikas, dem sogenannten Ebola-Gürtel, häufiger vertreten sind als die seltenen

bekannt gewordenen Ausbrüche vermuten lassen. Bei bis zu 10 % der untersuchten

Personen konnten Antikörper gegen eines der bekannten Filoviren nachgewiesen

werden (Slenczka et al., 1984; Hughes et al., 1986). Dieses Ergebnis legt nahe, dass

Filovirusinfektionen unter Umständen klinisch inapparent verlaufen können und somit

unerkannt bleiben. Untersuchungen im Rahmen des EBOV-Ausbruchs in Gabun 1996

bestätigten, dass es asymptomatische Verläufe der EBOV-Erkrankung geben kann

(Baize et al., 1999; Leroy et al., 2000).

1 Einleitung 10

Serologische Studien auf anderen Kontinenten ergaben, dass auch hier eine gewisser

Prozentsatz der untersuchten Seren von Menschen, die keine Anamnese für

hämorrhagische Fieber hatten, Filovirus-spezifische Antikörper besaßen (Becker et al.,

1992). Mögliche Erklärungen für diese Ergebnisse wären, dass es sich hierbei um

unspezifische Kreuzreaktionen der Antikörper handelt, oder dass Filoviren mit

niedrigem pathogenen Potential in weiten Teilen der Welt kursieren.

Die Übertragung der Filoviren von Mensch zu Mensch erfolgt über kontaminierte

Körperflüssigkeiten wie Blut, Speichel und Sperma. Als Eintrittspforten in den Körper

dienen kleine Haut- und Schleimhautläsionen (Simpson et al., 1977). Daher gehören

zu den am meisten gefährdeten Personen während einer Epidemie v.a. das

Pflegepersonal und die nächsten Angehörigen der Erkrankten. Um eine Eindämmung

von Epidemien zu erreichen, ist der besondere Schutz dieser Personen beim Umgang

mit Erkrankten absolut erforderlich. Umstritten ist, inwieweit Filoviren über Aerosole

übertragen werden können. Eine aerogene Übertragung konnte bei MARV bisher nur

im Tierexperiment nachgewiesen werden, gilt aber unter natürlichen Bedingungen als

unwahrscheinlich (Pokhodiaev et al., 1991). Auch im Falle des EBOV ist eine aerogene

Übertragung prinzipiell möglich. Sie konnte z. B. während des EBOV Reston

Ausbruchs bei Affen nicht völlig ausgeschlossen werden, wurde beim Menschen

jedoch nicht nachgewiesen (Johnson et al., 1995; Jaax et al., 1995).

1.2 Klinik und Pathogenese der MARV-Infektion

MARV verursacht beim Menschen und bei nichtmenschlichen Primaten ein schweres

hämorrhagisches Fieber. Nach einer Inkubationszeit von fünf bis neun Tagen beginnt

die Krankheit plötzlich mit schwerem Krankheitsgefühl, hohem Fieber, Kopf- und

Gliederschmerzen sowie Erbrechen und wässriger, nichtblutiger Diarrhoe (Martini et

al., 1968b). Teilweise kommt es schon im Anfangsstadium zu neurologischen Begleit-

symptomen, wie Verwirrtheitszuständen und Bewusstseinstrübungen bis hin zur

Bewusstlosigkeit. In der ersten Krankheitswoche entwickelt sich ein charakteristisches

makulopapulöses Exanthem, das nach Abklingen in eine Hautschuppung übergeht.

Daneben werden Konjunktividen und Lymphknotenschwellungen beschrieben. Im

Verlauf der Krankheit tritt ein obligatorischer Thrombozytenabfall ein, welcher mit der

hämorrhagischen Diathese (Blutungen der Nasenschleimhaut, des Gaumens und des

gesamten Gastrointestinaltrakts) korreliert. Der Verlauf der Erkrankung wird vom

Ausmaß der Hämorrhagien bestimmt. Bei letal endenden Fällen tritt der Tod zwischen

dem achten und zehnten Krankheitstag aufgrund von hämorrhagischem Schock,

Verbrauchskoagulopathie und Multiorganversagen ein. Die Letalitätsrate betrug

während des Ausbruches 1967 in Marburg ca. 25 %, in Durba ca. 50%. Hierbei muss

1 Einleitung 11

berücksichtigt werden, dass die Letalitätsrate entscheidend von der medizinischen

Betreuung der erkrankten Personen und deren allgemeinen Gesundheitszustand

abhängt und daher in Entwicklungsländern, wo eine intensivmedizinische Betreuung

nicht möglich ist, höher liegt. Bei Überlebenden dauert die Krankheit 12 bis 22 Tage an

(Martini et al., 1968b; Stille and Böhme, 1971). Die Rekonvaleszenz dauert fünf

Wochen und länger und ist gekennzeichnet durch Erschöpfung, Gewichtsverlust und

Amnesie in Bezug auf die akute Krankheitsphase. MARV kann bis drei Monate nach

der Infektion in der Samenflüssigkeit nachgewiesen werden (Martini et al., 1968a).

Es wird angenommen, dass die Viren nach der Infektion zunächst in die lokalen

Lymphknoten transportiert werden und dass die primären Ziele der Virusinfektion

Zellen des monozytären phagozytischen Systems (MPS) sind (Feldmann et al., 1996a;

Ströher et al., 2001). Die Virusausbreitung durch infizierte Monozyten erfolgt über das

lymphatische System und das Blutgefäßsystem. Im Frühstadium sind vor allem die

Lymphknoten, Milz und Leber betroffen (Feldmann et al., 1996b; Peters et al., 1996).

Im Spätstadium der Infektion findet man histopathologisch in fast allen Organen

Nekrosen, besonders ausgeprägt treten sie in Leber, Niere und Lunge auf (Rippey et

al., 1984; Zaki and Peters, 1997). Eine erhöhte Durchlässigkeit der Endothelien scheint

für die Schock-Symptomatik und das Auftreten von Hämorrhagien im terminalen

Stadium der Infektion verantwortlich zu sein. Dabei ist interessant, dass infizierte

Makrophagen mit einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen reagieren (Ströher et al.,

2001), darunter der Tumor Nekrose Faktor α (TNFα), der als Auslöser der Schock-

Symptomatik gilt. Die Ausschüttung von TNFα erhöht vermutlich die Permeabilität der

Endothelien, ohne das eine direkte Infektion der Endothelzellen vorliegen muss

(Schnittler et al., 1993; Strieter et al., 1993; Feldmann et al., 1996a). Ablagerungen von

Fibrin und Fibrinspaltprodukten in den Nierentubuli weisen auf eine generelle Störung

der Blutgerinnung hin (Martini et al., 1971).

Eine kausale Therapie gegen MARV existiert bisher nicht. Die Behandlung beschränkt

sich, sofern möglich, auf eine intensivmedizinische symptomatische Therapie des

hämorrhagischen Schocks und der Verbrauchskoagulopathie. Der Einsatz von

Rekonvaleszentenserum scheint jedoch einen positiven Einfluss auf den

Krankheitsverlauf zu haben (Mupapa et al., 1999). Bei EBOV-Infektionen zeigen

Inhibitoren der S-Adenosylhomocystein-Hydrolase im Tierversuch einen guten

therapeutischen Effekt (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Huggins et al., 1999).

Ferner zeigte die Behandlung von EBOV-infizierten Makaken mit einem rekombinanten

Inhibitor des Gewebefaktors VIIa (rNAPc2) einen positiven Effekt auf den

Krankheitsverlauf der Tiere. Die Anzahl überlebender Tiere stieg von 0 auf 33 %

(Geisbert et al., 2003).

1 Einleitung 12

Die Prävention beschränkt sich vor allem auf Hygienemaßnahmen und Absonderung

infizierter Personen zur Unterbrechung der Infektionskette. Eine Impfung ist zur Zeit

nicht verfügbar und auch schwierig einsetzbar, da man aufgrund fehlender

Informationen über den eigentlichen Wirtsorganismus die gefährdete und damit zu

impfende Population nicht eingrenzen kann. Allerdings gibt es für das EBOV im

Tiermodell erste Erfolge mit DNA-Vaccinen bzw. rekombinanten Adenoviren (Baize et

al. 2001; Sullivan et al., 2000).

1.3 Morphologie des Marburgvirus

Marburgvirus-Partikel zeigen ein pleomorphes Erscheinungsbild. Sie sind fadenförmig,

manchmal verzweigt, zirkularisiert oder in Form eines U oder einer 6 gebogen

(Feldmann et al., 1993; 1999). Der Durchmesser der Partikel beträgt 80 nm, ihre Länge

ist variabel und liegt durchschnittlich bei 1µm, kann aber bis zu 14 µm betragen. In die

das Virion umgebende Hüllmembran sind Spikes von ungefähr 7 nm Länge

eingelagert. Abbildung 2 zeigt den schematischen Aufbau (A) sowie die

elektronenmikroskopische Aufnahme (B) eines MARV-Partikels.

MARV besteht aus sieben Strukturproteinen. Im Zentrum der Viruspartikel liegt das

Nukleokapsid, oder auch Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex, welches aus dem viralen

RNA-Genom (vRNA) und den Proteinen NP, VP35, VP30 und L besteht. Im

Oberflächenprotein GP

Ribonukleoproteinkomplex(vRNA, NP, VP35, VP30 und L)

MatrixVP40 und VP24

1 µm

80 nmA B

Abbildung 2: Struktur des Marburgvirus. A: Schematische Darstellung eines MARV-Partikels. B: ElektronenmikroskopischeAufnahme des MARV, Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure. Vergrößerung:50000fach. Zur Verfügung gestellt von Dr. Larissa Kolesnikova

1 Einleitung 13

Matrixraum zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran liegen die Proteine

VP40 und VP24 (Becker et al., 1998; Kiley et al., 1988). In die Hüllmembran, die von

Membranen der Wirtszelle abstammt, ist das einzige Oberflächenprotein GP in Form

von Homotrimeren eingelagert (Feldmann et al., 1991).

1.4 Genomstruktur des Marburgvirus

Das MBGV besitzt ein einzelsträngiges, nichtsegmentiertes RNA-Genom negativer

Polarität, dessen Länge 19,1 kb beträgt. Die genomische RNA per se ist nicht infektiös.

Sie enthält sieben offene Leserahmen, die für die viralen Strukturproteine kodieren

(Abbildung 3).

Am 3’- und 5’-Ende der RNA befinden sich nichttranskribierte Bereiche, der 3’-Leader

und der 5’-Trailer, deren Enden komplementär zueinander sind und möglicherweise

stabile Sekundärstrukturen bilden können (Peters, 1996). Leader und Trailer enthalten

Signale zur Initiation der Replikation und der Enkapsidierung des Genoms durch das

NP (Mühlberger et al., 1996; 1998). Die offenen Leserahmen der einzelnen Gene sind

von nichttranslatierten Sequenzen flankiert, die hochkonservierte Signale für

Transkriptionsstart und -stop enthalten (Mühlberger et al., 1996). Zwischen den

einzelnen Genen befinden sich intergenische Sequenzen, die nicht transkribiert

werden. Zwischen VP30 und VP24 überlappen die intergenischen Sequenzen

(Feldmann et al., 1992).

1.5 Die viralen Proteine

NP Das Nukleoprotein ist das Produkt des ersten Gens und umfasst 695

Aminosäuren bei einem Molekulargewicht von 94 kD. Es enkapsidiert die virale RNA

und spielt eine zentrale Rolle bei Replikation und Transkription (Becker et al., 1998;

Mühlberger et al., 1998; Kolesnikova et al., 2000; Mavrakis et al., 2003).

Abbildung 3: Genomstruktur des Marburgvirus. Ausgehend vom 3’ Leader werden auf der genomischen RNA die Proteine NP, VP35, VP40,GP, VP30, VP24 und L kodiert, gefolgt von dem 5’ Trailer. Zwischen den einzelnen Genebefinden sich nichttranskribierte intergenische Sequenzen, die zwischen VP30 und VP24überlappen.

TrailerLeader

LNP VP35 GP VP24VP40'3’ 5’VP30

1 Einleitung 14

Anhand von Hydrophobizitätsplots läßt sich NP in eine hydrophile Carboxy (C)-

terminale und eine hydrophobe Amino (N)-terminale Domäne einteilen. Der N-

Terminus zeigt Sequenzhomologien zu den Nukleoproteinen anderer NNS-RNA-Viren

(Sanchez et al., 1992), während der saure C-Terminus hochvariabel ist. Das NP zeigt

eine starke Phosphorylierung und liegt in virusinfizierten Zellen als phosphoryliertes (94

kD) und nicht-phosphoryliertes NP (92 kD) vor. Jedoch wird nur die phosphorylierte

Form des NP in Virionen eingebaut (Becker et al., 1994), was eine entscheidende

Rolle dieser posttranslationalen Modifikation im MARV-Vermehrungszyklus vermuten

lässt. Die Phosphorylierung findet in der C-terminalen Domäne an Serin- und

Threoninresten statt und umfasst sieben Regionen (I-VII) (Lötfering et al., 1999).

VP35 Das VP35 interagiert mit NP und L, wirkt als Kofaktor der RNA-abhängigen

RNA-Polymerase L und wird, trotz seiner vergleichsweise schwachen Phos-

phorylierung, als Analogon der P-Proteine der Rhabdo- und Paramyxoviridae

angesehen (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; 1999). VP35 (35 kD) wird, wie

das P-Protein der Rhabdo- und Paramyxoviridae, vom zweiten Gen des Genoms

kodiert und spielt eine essentielle Rolle bei der viralen Transkription und Replikation

(Mühlberger et al., 1998). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass VP35 des EBOV

ein Typ I Interferonantagonist ist und so die unspezifischen zellulären Abwehr-

mechanismen gegen eine Virusinfektion schwächt (Basler et al., 2000, 2003a).

VP40 VP40, das im Virion neben dem NP mengenmäßig am stärksten vertretene

Protein der Filoviren (Elliot et al., 1985) besteht aus 303 AS. Es läuft in der SDS-PAGE

als Doppelbande bei 37 und 39 kD, wobei es sich bei der größeren Form

wahrscheinlich um eine posttranslationale Modifizierung handelt, die jedoch bisher

nicht näher beschrieben ist. Bei VP40 handelt es sich um ein Analogon der M-Proteine

anderer Mononegavirales. Salz-Dissoziationsuntersuchungen zeigten, dass VP40

zwischen Nukleokapsid und Virushülle lokalisiert ist (Becker er al., 1998; Elliott et al.,

1985). Untersuchungen zur Membranassoziation des VP40 ergaben, dass es stark mit

Membranen interagiert und sich als peripheres Membranprotein verhält (Ruigrok et al.,

2000; Kolesnikova et al., 2002). VP40 assoziiert sehr schnell zu 80 % mit Membranen

und nur ein kleiner Teil assoziiert mit den Nukleokapsiden (Kolesnikova et al., 2002;

Geisbert et al., 1995). Durch Röntgen-Kristallographie konnte die Struktur des EBOV-

VP40 aufgeklärt werden. Dabei zeigte sich, dass der C-Terminus des VP40, der für

eine Membranbindung notwendig ist, hydrophobe Bereiche enthält, die wahrscheinlich

für die Interaktion mit der Lipidmembran verantwortlich sind (Dessen et al., 2000a;

2000b). MARV-VP40 ist in diesem Bereich stark homolog. Für das VP40 des MARV ist

1 Einleitung 15

gezeigt, dass es mit multivesikulären Membranstrukturen des späten endosomalen

Kompartiments, sog. „multivesicular bodies“ (MVB), interagiert (Kolesnikova et al.,

2002; 2004a). Außerdem ist es in der Lage, bei solitärer Expression, seine Freisetzung

als virusähnliche Partikel („virus-like partikles“, VLPs) zu vermitteln (Timmins et al.,

2001; Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b), wobei für EBOV gezeigt wurde,

dass ein prolinreiches Motiv PTAPPEY am N-Terminus des Proteins, eine sog. Late-

Domain, für diesen Vorgang essentiell ist (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al.,

2004). MARV-VP40 besitzt im N-Terminus ebenfalls das Motiv einer Late-Domain

(PPPY), deren Funktion jedoch bisher nicht näher untersucht ist.

GP GP ist als einziges Oberflächenprotein des MARV als Homotrimer in die

Virushülle inseriert (Feldmann et al., 1991). Es besteht aus 681 AS und wird in eine C-

terminal gelegene cytoplasmatische Domäne (11 AS), eine Transmembrandomäne

(29 AS) und eine N-terminale luminale Domäne (643 AS) gegliedert. Es wird als

klassisches Typ-I-Membranprotein in einem einzigen offenen Leserahmen kodiert (Will

et al., 1993), während für die Expression des Volle-Länge EBOV-GP ein RNA-Editing

benötigt wird (Sanchez et al., 1996; Volchkov et al., 1995). Der hydrophobe N-

Terminus dient als Signalpeptid und wird nach Synthese und Translokation ins

endoplasmatische Retikulum abgespalten (Will et al., 1993). GP wird stark N- und O-

glykosyliert, wobei die fast fehlende Sialylierung auffällt (Geyer et al., 1992).

Stattdessen besitzt GP endständig Galaktosereste. Weitere posttranslationale

Modifikationen sind Acylierung und Phosphorylierung (Funke et al., 1995; Sänger et al.,

2002). Im Trans-Golgi-Netzwerk wird GP von der Prohormonkonvertase Furin

gespalten (Volchkov et al., 2000a), was eventuell zu einer Aktivierung einer

Fusionsdomäne führt (Weissenhorn et al., 1998). Die beiden entstehenden Fragmente

bleiben über Disulfidbrücken miteinander verbunden. GP1 (luminale Domäne) stellt sich

im SDS-Gel bei 170 kD dar, GP2 (Membrananker und cytoplasmatischer Anteil) bei 45

kD. Untersuchungen zum vektoriellen Transport des GP in polarisierten Zellen

ergaben, dass GP während der Virusinfektion zum größten Teil an die apikale

Membran transportiert wird, während die Virusfreisetzung ausschließlich basolateral

stattfindet. Man nimmt an, dass für den vektoriellen Transport und die Virusfreisetzung

andere Faktoren als das GP eine Rolle spielen (Sänger et al., 2001).

VP30 VP30 besteht aus 281 AS (33 kD), ist stark phosphoryliert und Bestandteil des

Nukleokapsidkomplexes. (Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; Modrof et al.,

2002). Es stellt in der Ordnung der Mononegavirales eine Besonderheit dar, da es als

viertes Nukleokapsidprotein nur bei der Familie der Filoviridae vorkommt. Das bei den

1 Einleitung 16

Pneumovirinae ebenfalls als viertes Nukleokapsidprotein gefundene M2-Protein

(Huang et al. 1985; Collins et al., 1996; Garcia et al., 1993) stellt aufgrund der

unterschiedlichen Lokalisation seines Gens auf dem Virusgenom vermutlich kein

Analogon zum VP30 dar. Die Funktion des MARV-VP30 ist bislang unbekannt. In

einem artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystem (Mühlberger et. al., 1999)

konnte gezeigt werden, dass das EBOV-VP30 essentiell für die virale Transkription

jedoch nicht für die Replikation ist. MARV-VP30 war für keinen der beiden Vorgänge

notwendig. Allerdings ist es im artifiziellen EBOV-System möglich, EBOV-VP30

funktionell durch MARV-VP30 zu ersetzen (Mühlberger et al., 1999). VP30 ist

außerdem in der Lage mit NP zu interagieren (Becker et al., 1998).

VP24 VP24 (253 AS, 28 kD) ist wie das VP40 im Matrixraum der Virionen zwischen

dem Nukleokapsid und der Hüllmembran lokalisiert und wird als ein zweites

Matrixprotein angesehen (Becker et al., 1998; Elliott et al., 1985). VP24 stellt ebenso

wie das VP30 eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales dar, da kein

anderer Vertreter dieser Ordnung ein entsprechendes Protein besitzt. Die Funktion des

VP24 ist unbekannt. Bisher konnte eine Interaktion mit der zytoplasmatischen Domäne

des GP und mit negativ geladenen Membranen gezeigt werden (Sänger et al., 1998;

Bamberg, 2000). Für EBOV wurde postuliert, dass VP24 für die Bildung von

Nukleokapsiden notwendig ist (Huang et al., 2002). Außerdem ist EBOV-VP24 nach

solitärer Expression teilweise membran-assoziiert und scheint zur Bildung von

virusähnlichen Partikeln in der Lage zu sein, allerdings in wesentlich geringerem Maße

als VP40 (Han et al., 2003). Des Weiteren wird VP24 als Pathogenitätsfaktor in der

filoviralen Infektion diskutiert. EBOV erzeugt zunächst keine letalen Infektionen im

Meerschweinchen, während es nach mehreren Passagen zum Auftreten von

hochpathogenen Varianten kommt. Sequenzanalysen der an Meerschweinchen

adaptierten EBOV-Varianten ergaben, dass diese Mutationen im VP24-Gen besaßen,

die zu AS-Austauschen führten. Es wird angenommen, dass diese Mutationen sowohl

für die Adaptation als auch Veränderungen in der Virulenz verantwortlich sind

(Volchkov et al., 2000b). Außerdem wird vermutet, dass EBOV-VP24 die IFNβ-

vermittelte Induktion von ISRE-Reportergenen inhibieren kann und somit die

Siganlkaskade der Interferonantwort bei Virusinfektionen beeinflusst (Basler and

Palese, 2003). Für MARV sind ähnliche Mechanismen bisher jedoch nicht beschrieben.

L Das L-Protein umfasst 2331 AS (220 kD) und ist somit das größte Protein des

MARV. Es handelt sich bei diesem Protein um den katalytischen Teil der RNA-

abhängigen RNA-Polymerase. Es zeigt Homologien zu den L-Proteinen anderer

1 Einleitung 17

Mononegavirales, insbesondere der Paramyxoviren, und weist drei bei den

Mononegavirales konservierte Polymerase-Motive auf (Mühlberger et al., 1992;

Volchkov et al., 1999; Poch et al., 1990).

1.6 Der Replikationszyklus des Marburgvirus

Der Eintritt des Virus in die Zelle wird durch das einzige Oberflächenprotein GP

vermittelt, welches die zentrale Rolle bei der Erkennung von zellulären Rezeptoren

spielt. Bisher ist nur der Asialoglykoprotein-Rezeptor als möglicher Rezeptorkandidat

für die Infektion von Hepatozyten beschrieben (Becker et al., 1995). Der Folat-

rezeptor-α wurde als Kofaktor für den Eintritt von EBOV beschrieben (Chan et al.,

2001), wobei jedoch gezeigt werden konnte, dass er beim Eintritt in primäre Zelllinien

keine Rolle spielt (Simmons et al., 2003b; Sinn et al., 2003). Die C-Typ Lektine DC-

SIGN und DC-SIGNR, welche unter anderem auf Makrophagen und dentritischen

Zellen exprimiert werden, wurden ebenfalls als mögliche Kofaktoren der EBOV-

Infektion beschrieben (Simmons et al., 2003a; Lin et al., 2003). Die Aufnahme der

Viren erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Mar’iankova et al., 1993). Nach

Fusion der Virushülle mit der endosomalen Membran kommt es zur Freisetzung der

Nukleokapside in das Zytoplasma der Zelle, wo Transkription (Synthese

virusspezifischer mRNA) und Replikation (Vervielfältigung des Virusgenoms) der

viralen RNA stattfindet. Zunächst werden monocistronische, polyadenylierte, nicht-

enkapsidierte mRNAs der einzelnen Strukturproteine synthetisiert (Feldmann et al.,

1992; Sanchez et al., 1993; Mühlberger et al., 1996). Diese Transkripte enthalten

lange, nicht-translatierte Bereiche, die regulatorische Funktionen bei der

Proteinsynthese ausüben (Mühlberger et al., 1996; Weik et al., 2002). Die mRNAs

werden von der zellulären Translationsmaschinerie in Proteine übersetzt. Wie die

Transkription findet die Replikation nur an enkapsidierter RNA statt. Dabei wird die

genomische (-)-Strang RNA zunächst vollständig in antigenomische (+)-Strang RNA

umgeschrieben, welche dann als Matrize zur Synthese neuer, viraler Genome dient.

Sowohl Genom als auch Antigenom liegen in enkapsidierter Form vor. Welcher

molekulare Mechanismus für den Wechsel zwischen Transkription und Replikation

verantwortlich ist, ist bisher nicht bekannt. Die neusynthetisierten Nukleokapside

erscheinen etwa zehn bis zwölf Stunden nach Infektion in typischen

intrazytoplasmatischen Einschlusskörpern, welche vermutlich die Syntheseorte der

Nukleokapside darstellen (Kolesnikova et al., 2000). Reife Nukleokapsidkomplexe

wandern zur Zelloberfläche und nehmen über die Matrixproteine Kontakt zu den

Ausschleusungspunkten an der Plasmamembran auf, in die das GP eingelagert ist. Die

Freisetzung von MARV-Partikeln erfolgt etwa 22 Stunden nach Infektion.

1 Einleitung 18

1.7 Die Funktion der Matrixproteine bei Mononegavirales und Retroviren

Der Zusammenbau umhüllter Viren umfasst vier wesentliche Schritte (Lenard et al.,

1996):

1.) Enkapsidierung der genomischen RNA und Bildung der viralen

Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe (Nukleokapside).

2.) Reifung der RNP-Komplexe und Transport zu den Orten der

Viruszusammensetzung.

3.) Umhüllung der reifen RNP-Komplexe durch Zellmembranbereiche, in denen

virale Glykoproteine angereichert sind.

4.) Abschnürung und Freisetzung der reifen Viruspartikel von der Zelle.

Die Matrixproteine der Mononegavirales und die MA-Proteine der Retroviren zeigen

einige Gemeinsamkeiten. Sie sind mengenmäßig mit am häufigsten in den Virionen

vertreten und binden an Membranen. Diese Bindung kann jedoch unterschiedlich stark

ausgeprägt sein. So liegt zum Beispiel das M-Protein von VSV zu 90 % in löslicher

Form und zu 10 % in membrangebundener Form vor (Chong et al., 1993a), während

das VP40 des MARV zu 80 % Membranbindung aufweist (Kolesnikova et al., 2002).

Für den Zusammenbau der Virionen ist die Interaktion zwischen den

Oberflächenproteinen und den zytoplasmatischen viralen Komponenten von zentraler

Bedeutung. Bei den negativsträngigen RNA-Viren wird diese Interaktion durch die

Matrixproteine vermittelt. Viele Matrixproteine sind in der Lage, spezifisch mit den

viralen Oberflächenproteinen zu interagieren. Für das Rabies-Virus (Rhabdoviridae)

und das Sendai-Virus (Paramyxoviridae) wurde eine Interaktion der entsprechenden

Matrixproteine einerseits mit dem viralen Nukleokapsid und andererseits mit der

zytoplasmatischen Domäne der viralen Oberflächenproteine gezeigt (Sanderson et al.,

1993; Mebatsion et al., 1999).

Die solitäre Expression von Matrixproteinen führt, auch in Abwesenheit anderer viraler

Proteine, zur Abschnürung von sog. virusähnlichen Partikeln (VLPs), die strukturell

reifen Viruspartikeln ähneln (Gonzales et al., 1993; Justice et al., 1995; Coronel et al.,

1999; Timmins et al., 2001). Eine Koexpression mit viralen Glykoproteinen führt zu

einer gemeinsamen Freisetzung in Form der VLPs (Swenson et al., 2004; Schmitt et

al., 2002).

Die Matrixproteine der Filoviridae sowie der Rhabdo- und Retroviridae enthalten

sogenannte Late-Domain-Motive, von denen bekannt ist, dass sie eine wesentliche

Rolle bei der Abschnürung viraler Partikel spielen. Late-Domain-Motive zeichnen sich

durch hoch konservierte kurze Peptidsequenzen aus, die der Protein-Protein

1 Einleitung 19

Interaktion dienen. Bisher sind verschiedene Late-Domain-Motive bekannt: u.a. PTAP,

PPxY und Yxxθ (Freed, 2002; Pelchen-Matthews et al., 2004), wobei x für jede

beliebige AS und θ für große hydrophobe AS-Reste steht. Entdeckt wurden diese

Motive aufgrund der Beobachtung, dass C-terminale Deletionen beim HIV-1 gag-

Protein zu Virionen führen, welche sich nicht von der Plasmamembran ablösen

können, sondern durch einen schmalen Faden mit ihr verbunden bleiben (Gottlinger et

al., 1991). Die Funktion dieser Late-Domain-Motive scheint in der Interaktion mit

Wirtszellproteinen zu liegen. So konnte für das Motiv PTAPPEY des EBOV-VP40 eine

Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 und Tsg101 gezeigt werden, welche beide

in der Sortierung von Proteinen in den endosomalen Stoffwechselweg eine Rolle

spielen. Die Mutation oder Deletion dieser Late-Domain-Motive führt zu einer

drastischen Reduktion der Freisetzung von VLPs bzw. reifer Viruspartikel von

infizierten Zellen (Harty et al., 1999; Licata et al., 2003; Gottwein et al., 2003).

1.8 RNA Interferenz (RNAi)

Der Begriff der RNA Interferenz (RNAi) beschreibt den Gebrauch von doppelsträngiger

RNA, mir deren Hilfe sequenzspezifisch mRNAs abgebaut werden können und somit

die Expression des entsprechenden Gens unterdrückt werden kann. RNAi ist eines

mehrerer sogenannter „post-transcriptional gene silencing“ (PTGS) Phänomene, die

bisher in Pflanzen, Pilzen und tierischen Zellen beobachtet wurden (Elbashir et al.,

2001, Hammond et al., 2001, Tuschl, 2001, Cogoni and Macino, 2000).

Der RNAi-Mechanismus Durch das Einbringen von sogenannten „small interfering RNAs“ (siRNAs), kurzen,

doppelsträngigen Nukleotidfragmenten mit einer Länge von 21 bp, kann in

Säugerzellen die Expression von Proteinen durch spezifischen Abbau ihrer mRNA

verhindert werden (Elbashir et al., 2001). Die siRNAs weisen dabei 3’-Überhänge von

zwei Nukleotiden auf. Diese siRNAs werden im Folgenden von dem sogenannten

„RNA-induced silencing complex“, kurz RISC, erkannt und gebunden. Für die

Aktivierung von RISC ist zunächst eine ATP-abhängige Entwindung der siRNA

notwendig, der dann die Basenpaarung der gebundenen siRNA mit der homologen

mRNA-Zielsequenz folgt. Der aktivierte RISC-Komplex ist nun in der Lage die mRNA

zu spalten und somit die Expression des entsprechenden Proteins zu verhindern.

Anwendung der RNAi-Technologie In der kurzen Zeit nach ihrer Entdeckung haben sich in sehr vielen Bereichen der

biomedizinischen Grundlagenforschung Anwendungsmöglichkeiten für die RNAi-

1 Einleitung 20

Technologie ergeben. Es besteht die Möglichkeit durch Einführung der siRNAs in

Säugerzellen die Expression spezifischer Proteine posttranskriptionell abzuschalten,

ohne das Wirtsgenom zu beeinflussen (z.B. durch knock-out Mutanten). Besondere

Bedeutung gewinnt der RNAi-Mechanismus in der antiviralen Therapie. Hier konnte

bereits eine Replikationsinhibition verschiedener Viren durch siRNAs gezeigt werden

(Saksela, 2003). Bisher ist es jedoch beim Menschen noch nicht möglich siRNAs

therapeutisch zur Bekämpfung von viralen Infektionen einzusetzen, da sich die

Moleküle schnell im Körper abbauen, und nur schwer in Zellen einzubringen und auf

ein spezielles Zielgewebe auszurichten sind. Jedoch konnten Influenza-spezifische

siRNAs mithilfe von Polymeren in die Lungen infizierter Mäuse gebracht werden,

wodurch die Zahl der Grippeviren bei den Tieren um mehr als das Tausendfache

gesenkt werden konnte (Ge et al., 2004).

Abbildung 4: Der RNAi-Mechanismus. (Hannon, 2002) Die siRNAs werden von einer Multikomponenten-Nuklease, RISC (grün), erkannt. Es wirdvermutet, dass RISC zunächst von einer latenten Form, welche die doppelsträngige siRNAenthält, in eine aktive Form, RISC*, durch Entwinden der siRNAs überführt werden muss(ATP-abhängig). RISC* nutzt dann die entwundene siRNA, um an das entsprechendeSubstrat (mRNA) zu binden und dieses abzubauen.

Aktivierungdurch ATP

mRNA-Zielsequenz

RISC

RISC* m7G

siRNAs

1 Einleitung 21

1.9 Fragestellung Für das VP24 des MARV ist bisher keine Funktion bekannt. Durch Salz-

Dissoziationsstudien konnte gezeigt werden, dass es in den Viruspartikeln wie das

Matrixprotein VP40 zwischen dem RNP-Komplex und der Hüllmembran lokalisiert ist

(Becker et al., 1998; Elliot et al., 1985). Es wird daher als zweites Matrixprotein der

Filoviren angesehen, was eine Besonderheit in der Ordnung der Mononegavirales

darstellt, da hier üblicherweise nur ein Matrixprotein vorhanden ist. Die vorliegende

Arbeit beschäftigt sich mit der näheren Charakterisierung des MARV-VP24.

Hierbei stand zunächst die Fragestellung im Mittelpunkt, ob VP24 in der Lage ist, mit

zellulären Membranen zu interagieren und ob es die Bildung von virusähnlichen

Partikeln (VLPs) induziert. Es konnte bereits mithilfe von Liposomen und in vitro

translatiertem VP24 eine Tendenz zur Interaktion mit negativ geladenen Membranen

gezeigt werden (Bamberg, 2000), die jedoch in einem zellulären Hintergrund näher

untersucht werden sollte. Des Weiteren galt es, die intrazelluläre Lokalisation von

singulär exprimiertem VP24 sowie von VP24 im Hintergrund einer MARV-Infektion

durch Immunfluoreszenzanalysen aufzudecken. Ferner stand die Untersuchung von

möglichen Interaktionen mit anderen viralen Proteinen im Vordergrund.

Um die Funktion des VP24 in der Replikation und Morphogenese während der

Virusinfektion zu untersuchen, wurde der Einsatz der RNAi-Technologie gewählt.

Hierbei sollte die Proteinexpression von VP24 mithilfe der RNA Interferenz

abgeschaltet und die Auswirkungen der vermindertenn VP24-Expression auf andere

virale Proteine sowie die Ausschleusung reifer Partikel untersucht werden.

2 Material 22

2 Material

2.1 Chemikalien Aceton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Agarose, ultrarein BRL, Neu-Isenburg

Agarose, NA Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

Alconox Sigma-Aldrich, Deisenhofen

6-Amino-n-Capronsäure Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Ammoniumchlorid Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Ammoniumhydrogenkarbonat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Ammoniumpersulfat (APS) Biorad, Richmond (USA)

Ampicillin (Natriumsalz) Serva, Heidelberg

Bacto-Agar Difco Lab., Detroit (USA)

Borsäure Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Bovines Serumalbumin (BSA) Serva, Heidelberg

Bromphenolblau (BPB) Serva, Heidelberg

Calciumchlorid (CaCl2) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

CompleteTM (Proteasen-Inhibitor-Cocktail) Roche, Mannheim

Coomassie Brillant Blue R250 Serva, Heidelberg

DAPI (4’, 6-Diamidino-2-phenylindol) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Dextranblau Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Dinatriummethylendiamintetraacetat

(EDTA)

Roth, Karlsruhe

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Dithiothreitol (DTT) Biorad, Richmond (USA)

Essigsäure (HAc) Riedel-de-Haën, Seelze

Ethanol (abs.) EtOH Riedel-de-Haën, Seelze

Ethidiumbromid Roche, Mannheim

Ethylacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Fluoprep bioMérieux, Nürtingen

Formamid BRL, Neu-Isenburg

2 Material 23

Freundsches Adjuvants, komplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Freundsches Adjuvants, inkomplett Sigma-Aldrich, Deisenhofen

L-Glutamin 200 mM (100×) Gibco BRL, Karlsruhe

Glycerol BRL, Neu-Isenburg

Glycin Riedel-de-Haën, Seelze

Glycogen (20 µg / µl) Roche, Mannheim

Harnstoff (ultrarein) BRL, Neu-Isenburg

Hefeextrakt Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Isopropanol Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid

(IPTG)

Roth, Karlsruhe

Kaliumchlorid (KCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Lipofectin-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe

LipofectamineTM 2000 Invitrogen, Karlsruhe

LipofectamineTM Invitrogen, Karlsruhe

Magermilchpulver Töpfer, Dietmannsried

Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2 × 6H2O) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Magnesiumsulfat (MgSO4) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

β-Mercaptoethanol Serva, Heidelberg

Methanol (MeOH) Riedel-de-Haën, Seelze

Natriumacetat Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Natriumazid (NaN3) J.T. Baker B.V., Deventer (Holland)

Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe

Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Natriumhydroxid (NaOH) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Natrium-o-Vanadat (NaV) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

N(onidet)P40 Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

Paraformaldehyd (PFA) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml Gibco BRL, Karlsruhe

Pepton Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche, Mannheim

PlusTM-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe

2 Material 24

Polyacrylamid-Lösung (29:1) Biorad, Richmond (USA)

rotiphorese Gel 30 Roth, Karlsruhe

Saccharose Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Salzsäure (HCl) Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Stickstoff (99,996 %) Messer-Griesheim, Siegen

SuperSignal Ultra® West Dura Extended

Duration Substrate

Pierce, Rockford (USA)

SuperSignal® West Femto Maximum

Sensitivity Substrate

Pierce, Rockford (USA)

Tetracyclin Serva, Heidelberg

N, N, N´, N´, -

Tetramethylethylethylendiamin (TEMED)

Biorad, Richmond (USA)

Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Base) Roth, Karlsruhe

Triton X-100 Serva, Heidelberg

Triton X-114 Serva, Heidelberg

Tween 20 Serva, Heidelberg

Wasser, nukleasefrei Ambion, Austin (USA)

2.2 Verbrauchsmaterialien

9 cm Zellkulturschalen Greiner, Nürtingen

6 well-, 12 well-, 24 well-Zellkulturplatten Greiner, Nürtingen

75 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)

162 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)

Bio-Image Screen: Imaging plate 2040S Fuji, Kanagawa (Japan)

Blottingpapier GB 002 (Whatman 3MM) Whatman, New Jersey (USA)

Gefrierfolie Krups, Solingen

Gewebekulturröhrchen Greiner, Nürtingen

Immobilon™ P, PVDF-Membran Millipore, Eschborn

Kapillarspitzen 200 µl Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf

Nitrocelluloseacetatfolie (NTA) Schleicher & Schuell, Dassel

Objektträger Menzel GmbH, Braunschweig

Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Neenah (USA)

PCR-tubes, 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf

Petrischalen Greiner, Nürtingen

Pipetten 2 + 10 ml, Cellstar® bio-one Greiner, Nürtingen

Pipetten 5 ml, serological pipette Sarstedt, Nümbrecht

2 Material 25

Pipettenspitzen, oberflächenoptimiert Nerbe Plus, Winsen/Luhe

Polypropylen-Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Greiner, Solingen

Polaroidfilm 667 Professional Polaroid, Cambridge (USA)

Reaktionsgefäße 1,5 / 2 ml Eppendorf, Hamburg

Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Hellma, Müllheim

Röntgenfilme (BiomaxTM MR) Kodak, Rochester (USA)

Feather-Skalpell PfM AG, Köln

Ultraclear™-Zentrifugenröhrchen SW41 Beckmann, Palo Alto (USA)

Zellschaber, greiner bio-one Greiner, Nürtingen

2.3 Kits

ABI Prism™ Dye Terminator Cycle

Sequencing Ready Reaction Kit

Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA)

DIG Glycan Differentiation Kit Roche, Mannheim

E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I Peqlab, Erlangen

Gene Amp™ PCR Reagent Kit Perkin Elmer Cetus, Norwalk (USA)

HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden

QIAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen, Hilden

QIAfilter® Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden

QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden

QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden

QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis

Kit

Stratagene, Heidelberg

RNeasy®Mini Kit Qiagen, Hilden

SuperScriptTM One-Step RT-PCR with

Platinum Taq

Invitrogen, Karlsruhe

SYBR Green I Dye Invitrogen, Karlsruhe

TNT® T7 Quick Coupled

Transcription/Translation Kit

Promega GmbH, Mannheim

Z-Competent E.coli Transformation Kit™

and Buffer Set

Zymo Research, Orange (USA)

2.4 Geräte

ABI PRISMTM377 DNA Sequenzer Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA)

2 Material 26

Biofuge A Heraeus Sepatech GmbH, Osterode

Biofuge 13 Heraeus Sepatech GmbH, Osterode

Bio-Imager Analyser BAS-1000 Fuji, Kanagawa (Japan)

Branson Sonifier 450 Heinemann, Schwäbisch Gmünd

Brutschrank 6000 Heraeus Instruments, Hanau

DNA Thermal Cycler TC1 Perkin-Elmer Cetus, Norwalk (USA)

Elektronenmikroskop Zeiss 109 Zeiss, Jena

Eppendorf Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

Eppendorf Reference Pipetten

(0,1-2,5 µl; 0,5-10 µl; 10-100 µl; 100-1.000 µl)

Eppendorf, Hamburg

Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Eppendorf-Tischzentrifuge 5145 Eppendorf, Hamburg

Fastblot B34 Biometra, Göttingen

Feinwaage Sartorius, Göttingen

Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena

Geiger-Müller-Zähler Berthold, Wildbad

GelDoc 2000 Biorad, Richmond (USA)

Genequant II DNA / RNA Calculator Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

Horizontalschüttler HS 250 Basis IKA Labortechnik, Staufen

J2 21 Zentrifuge Beckmann, Palo Alto (USA)

Keutz®-Gel-Trocken-Rahmen von Keutz, Reiskirchen

Keutz®-Minigelkammer von Keutz, Reiskirchen

Kippschüttler von Keutz, Reiskirchen

Krups Vakupack plus Krups, Solingen

LightCycler Roche, Mannheim

MegaBACETM 1000 Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

Megafuge 1.0R Heraeus Instruments, Hanau

Metallblockthermostat TCS Lab Tech Barkey, Bielefeld

Microcomputer Electrophoresis, Power

supply Consort

von Kreutz, Reiskirchen

Mikrowellengerät Bosch

Minifuge RF Heraeus Sepatech GmbH, Osterode

Optimax 2010 Protec Medizintechnik GmbH,

Oberstenfeld

2 Material 27

pH-Meter CG 832 Schott Laborgeräte

pipetus® akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt

Polaroid MP4 Land Camera Polaroid, Cambridge (USA)

Primus Thermocycler MWG Biotech AG, Ebersberg

Protean II Gelkammer Biorad, Richmond (USA)

Rotavapor Büchi, Schweiz

Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau

Spot Kamera, Version 3.1.2 Diagnostic Instruments, Michigan (USA)

Überkopfrotierer Heidolph, Schwabach

UV-Durchflußphotometer Uvicord® SII Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH, Freiburg

UV-Schirm 302 nm Bachofer, Reutlingen

Vakuum-Geltrockner von Keutz, Reiskirchen

Vakuum-Zentrifuge (Speed-vac) von Keutz, Reiskirchen

Waage Sartorius, Göttingen

Wasserbad mwg lauda MT

2.5 Puffer und Lösungen

2.5.1 Puffer

Blockierungs-Puffer für

Immunfluoreszenzen

2 %

5 %

0,2 %

0,05 %

BSA

Glycerol

Tween 20

NaN3

in PBSdef.

Blockierungspuffer für Western

Blots

10 g

ad 100 ml

Magermilchpulver

PBSdef

6x DNA-Probenpuffer 0,25 %

40 %

10 %

Bromphenolblau

Saccharose

Glycerol

Glycin-Puffer, sauer 100 mM Glycin, pH 2,5

2 Material 28

Karbonatpuffer I

Karbonatpuffer II

Karbonatpuffer pH11

100 mM

100 mM

Na2CO3

NaHCO3

Mischung von I+II 20:1

KoIP-Puffer (∅ BSA)

(Koimmunpräzipitations-Puffer)

20 mM

100 mM

5 mM

1 %

Tris/HCl, pH 7,6

NaCl

EDTA

NP40

Lysispuffer für Flotationen 10 mM

250 mM

1 mM

1 mM

200 µM

Tris/HCl, pH 7,5

Saccharose

EDTA

PMSF

Natrium-o-Vanadat

PBSdef, pH 7.5

(Phosphatpuffer deficient)

8 g

0,2 g

1,15 g

0,2 g

ad 1 l

NaCl

KCl

Na2HPO4

KH2PO4

dH2O

10× Proteingellaufpuffer 10 g

30 g

250 g

ad 1 l

SDS

Tris-Base

Glycin

dH2O

4× Proteinprobenpuffer 10 ml

10 ml

15 ml

12,5 ml

1,25 ml

ad 50 ml

Glycin

ß-Mercaptoethanol

40 % SDS

3 M Tris-Base

gesättigte BPB-Lösung in dH2O

dH2O

4× Probenpuffer für Sequenzgele 500 µl

100 µl

50 mg / ml

deionisiertes Formamid

25 mM EDTA, pH 8,0

Dextranblau

2 Material 29

Saccharoselösungen für

Flotationen (90 %, 45 %, 10 %)

X %

10 mM

1 mM

Saccharose (w/v)

Tris/HCl, pH 7,5

EDTA, pH 8,0

20 %ige Saccharose für VLP-

Reinigung

20 %

10 mM

1 mM

Saccharose (w/v)

Tris/HCl, pH 7,5

EDTA, pH 8,0

SDS-PAGE -Sammelgelpuffer 2,52 ml

0,1 ml

0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

10 % SDS

SDS-PAGE- Trenngelpuffer 2,5 ml

0,1 ml

2,5 M Tris/HCl, pH 8,8

10 % SDS

Sequenzier-Probenpuffer 1 %

5 mM

80 %

Dextranblau

EDTA, pH 8,0

Formamid

siRNA-Lysispuffer 50 mM

150 mM

1 %

1×

Tris/HCl, pH 7.5

150 mM NaCl

NP40

CompleteTM

Stripping-Puffer 62,5 mM

2 %

1 mM

Tris/HCl, pH 6,8,

SDS

β-Mercaptoethanol

50× TAE, pH 8,0 242 g

57,1 g

100 ml

ad 1 l

Tris-Base

Essigsäure

0,5 M EDTA, pH 8,0

dH2O

10× TBE, pH 8,0 108 g

55 g

40 ml

ad 1 l

Tris-Base

Borsäure

0,5 M EDTA, pH 8,0

dH2O

2 Material 30

TBS

(Affinitätsreinigung von AK)

500 mM

20 mM

0,05 %

NaCl

Tris/HCl, pH 7,4

Tween 20 (v/v)

TBS-B 500 mM

20 mM

0.05 %

3 %

NaCl

Tris/HCl, pH 7,4

Tween 20 (v/v)

BSA (w/v)

TE-Puffer 10 ml

2 ml

ad 1 l

1 M Tris/HCl, pH 7,5

0,5 M EDTA, pH 8,0

dH2O

Tris/KCl-Puffer 10 mM

150 mM

0,1 %

3 %

Tris/HCl, pH 8,0

KCl

NP40

BSA

Tris/KCl-Waschpuffer Wie Tris/KCl-Puffer, jedoch ohne

BSA

Triton X-114-Lysispuffer 10 mM

150 mM

1 mM

200 µm

Tris/HCl, pH 7,5

NaCl

PMSF

Natrium-o-Vanadat

Triton X-114-Saccharose-Kissen 6 %

10 mM

150 mM

0,06 %

Saccharose (w/v)

Tris/HCl, pH 7,5

NaCl

Triton X-114 (v/v)

AK-Verdünnungspuffer Western

Blot

1 %

0,1 %

in

Magermilchpulver

Tween 20

PBSdef

Waschpuffer Western Blot 0,1 %

in

Tween 20

PBSdef

2 Material 31

Western Blot Anodenpuffer I 36,34 g

200 ml

ad 1 l

Tris-Base

Ethanol

dH2O

Western Blot Anodenpuffer II 3,04 g

200 ml

ad 1 l

Tris-Base

Ethanol

dH2O

Western Blot Kathodenpuffer 5,25 g

3,03 g

200 ml

ad 1 l

6-Amino-N-Capronsäure

Tris-Base

Ethanol

dH2O

2.5.2 Lösungen

Ampicillin-Stammlösung 100 mg

ad 1 ml

Ampicillin

dH2O

Coomassie®-Färbelösung Wie Fixierer/Entfärber für Proteingele, jedoch mit

0,05 % Coomassie® Brillant Blue R250

Fixierer/Entfärber für Proteingele 300 ml

100 ml

600 ml

Ethanol

Essigsäure

dH2O

100 mM IPTG 1,41 g

ad 50 ml

Isopropyl-β-D-

Thiogalactopyranosid

dH2O

100 mM Orthovanadat, pH 10 368 g

ad 20 ml

Natrium-o-Vanadat

dH2O

100 mM PMSF 360 mg

ad 21 ml

PMSF

Isopropanol

2 Material 32

Tetracyclin-Stammlösung 20 mg

ad 1 ml

Tetracyclin

Ethanol

2.6 Wachstumsmedien

2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien

2YT-Medium 5 g

10 g

16 g

ad 1 l

NaCl

Hefeextrakt

Pepton

dH20

LB-Agar (1,5 %) 3,75 g

ad 250 ml

Bacto-Agar

LB-Medium

LB-Medium 10 g

5 g

10 g

ad 1 l

NaCl

Hefeextrakt

Pepton

dH20

SOB-Medium 20 g

5 g

0,58 g

0,19 g

10 ml

10 ml

ad 1 l

Pepton

Hefeextract

NaCl

KCl

1 M MgCl2

1 M MgSO4

dH20

2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco BRL, Karlsruhe

DMEM(+++) 500 ml

50 ml

5 ml

5 ml

DMEM

FCS (Fetales Kälberserum)

L-Glutamin 200 mM (100x)

Penicillin/Streptomycin 5000 IU / ml

2 Material 33

DMEM(+ Q) 500 ml

5 ml

DMEM

L-Glutamin 200 mM (100x)

Fetales Kälberserum (FCS) Whittaker, Heidelberg

Opti-MEM I Gibco BRL, Karlsruhe

Trypsin/EDTA Gibco BRL, Karlsruhe

2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide

2.7.1 Nukleinsäuren als Größenmarker

DNA Größenmarker III (λ-DNA EcoRI, HindIII verdaut) Roche, Mannheim

MassRuler™ DNA-ladder High range MBI-Fermentas, St.Leon-Rot

2.7.2 Sonstige Nukleinsäuren und Nukleotide

dATP 2’-Desoxyadenosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dCTP 2’-Desoxycytidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dGTP 2’-Desoxyguanosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dTTP 2’-Desoxythymidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

rATP Adenosin 5’-Triphosphat 10 mM Roche, Mannheim

2.7.3 siRNA Sequenzen

VP24 Nr. 1 sense-Strang: 5’ -CCGUUUUUGGCCCUGAGGAdTdT- 3’

antisense-Strang: 5’ -UCCUCAGGGCCAAAAACGGdTdT- 3’

20 µM Dr. Michael Krause,

IMT, Marburg

VP24 Nr. 2 sense-Strang: 5’ -CCUUGCUGUGGUGAGACAGdTdT- 3’ antisense-Strang: 5’ -CUGUCUCACCACAGCAAGGdTdT- 3’

20 µM Dr. Michael Krause,

IMT, Marburg

VP35 sense-Strang: 5’ -UAGGCAGAUAUCAGACAUUdTdT- 3’

antisense-Strang: 5’ –AAUGUCUGAUAUCUGCCUdTdT- 3’

20 µM Qiagen, Hilden

VP30 sense-Strang: 5’ -UAGAGAUCAUGACCUUGAUdTdT- 3’

antisense-Strang: 5’ -AUCAAGGUCAUGAUCUCUAdTdT- 3’


2 Material 34

NP sense-Strang: 5’ -CAGUUCUCGAGUUCAUCUUdTdT- 3’

antisense-Strang: 5’ -AAGAUGAACUCGAGAACUGdTdT- 3’


X sense-Strang: 5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT- 3’

antisense-Strang: 5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT- 3’


2.7.4 DNA-Oligonukleotide (Primer)

MARV-spezifische Vorwärtsprimer

Nr. Name Sequenz

116 NPv 2515-Bam CAG GGA TCC CAT GAC TTG ATT CAA AGA ATA TAC

718 VP24Flag/mutF

CGA TGA CAA GTA ACT GCA GCT CG

958 VP40-PPxA+ GAA CCC CCC TCC TGC TGC TGA TCA CGG TGC

1086 MGP-SmaI f

CAG CCC GGG ATG AAG ACC ACA TGT TTC C

1089 MVP24-SmaI f

CAG CCC GGG ATG GCA GAA TTA TCA ACG CG

1091 MVP40-SmaII f

CAG CCC GGG ATG GCC AGT TCC AGC AAT TAC

1107 VP24-Flag-N+

CGG GAT CCA CCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG

ACA AGG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC

1108 VP24-HA-N+

CGG GAT CCA CCA TGG CTT ACC CTT ACC CTT ATG

ATG TGC CGG ATT ATG CCG CAG AAT TAT CAA CGC

GTT AC

1109 VP24-myc-N+

CGG GAT CCA CCA TGG AAC AAA AAC TCA TCT CAG

AAG AGG ATC TGG CAG AAT TAT CAA GCC GTT AC

MARV-spezifische Rückwärtsprimer

138 NP 43.1 Acc R CCT CAT ATC TGT TAT CAT CTA

435 VP24 - Flag

(Pst I)

CTG CAG TTA GTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC

CAT TAT AGC AAT TTT GCT GTT C

719 VP24Flag/mutR CGA GCT GCA GTT ACT TGT CAT CGT CG

959 VP40-PPxA- GCA CCG TGA TCA GCA GCA GGA GGG GGG TTC

1085 MGP-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT CCG ATA TAT TTA GTA AAG

1088 MVP24-NotI r GTC GCG GCC GCT TAT ATA GCA ATT TTG CTG

1092 MVP40-NotI r GTC GCG GCC GCT CAA ACG GCA CTG AGC G

1110 VP24-HA-C- CGG GAT CCT TAG GCA TAA TCC GGC ACA TCA TAA

2 Material 35

GGG TAT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG

1111 VP24-myc-C- CGG GAT CCT TAC AGA TCC TCT TCT GAG ATG AGT

TTT TGT TCT ATA GCA ATT TTG CTG TTC ATG

Vektorspezifische Primer

125 pTM1-F ATT GTA TGG GAT CTG ATC TGG

174 pTM1-R GCC AAC TCA GCT TCC TTT CGG

600 pGEX-F GCA GGG CTG GAC AGC CAC GTT TGG TGG TGG CG

601 pGEX-R CCG TCT CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG

1233 pCAGGS-forw CCT TCT TCT TTT TCC TAC AG

1234 pCAGGS-rev CCT TTA TTA GCC AGA AGT CAG

Die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen wurden unterstrichen.

Nukleotidaustausche wurden durch Fett-Druck hervorgehoben. Die Primer #125 bis

#435 wurden von Dr. M. Krause am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung

in Marburg synthetisiert. Die Primer #718 bis #1234 wurden von der Firma MWG

Biotech in München synthetisiert.

2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide

2.8.1 Vektoren

pTM1 B. Moss, NIH, Bethesda (USA)

pCAGGS-MCS-5 Institut für Virologie, Marburg

pGEX-6P1 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg

2.8.2 Rekombinante Plasmide

pTM1-MARV-VP24 Institut für Virologie, Marburg

pTM1-MARV-NP Institut für Virologie, Marburg

pTM1-MARV-GP Institut für Virologie, Marburg

pTM1-MARV-VP40 Institut für Virologie, Marburg

2 Material 36

kloniertes Plasmid

Matrizen-DNA Oligonukleotide Klonierungs-strategie

Zielvektor

pTM1-Flag-VP24 pTM1-VP24 #1107 / #174 PCR + RL pTM1

pTM1-HA-VP24 pTM1-VP24 #1108 / #174 PCR + RL pTM1

pTM1-myc-VP24 pTM1-VP24 #1109 / #174 PCR + RL pTM1

pTM1-VP24-Flag pTM1-VP24 #125 / #435

#718 / #719

PCR, IVM pTM1

pTM1-VP24-HA pTM1-VP24 #125 / #1110 PCR + RL pTM1

pTM1-VP24-myc pTM1-VP24 #125 / #1111 PCR + RL pTM1

pGEX-6P1-VP24 pTM1-VP24 RL: BamHI pGEX-

6P1

pCAGGS-VP24 pTM1-VP24 #1088 / #1089 PCR + RL pCAGGS

pCAGGS-HA-VP24 pTM1-VP24 RL: EcoRI, XhoI pCAGGS

pCAGGS-VP40 pTM1-VP24 #1091 / #1092 PCR + RL pCAGGS

pCAGGS-VP40-

PPPA

pTM1-VP24 #958 / #959

#1091 / #1092

IVM, PCR + RL pCAGGS

pCAGGS-GP pTM1-GP #1085 / #1086 PCR + RL pCAGGS

pCAGGS-NP pTM1-NP RL: EcoRI pCAGGS

2.9 Proteine

2.9.1 Enzyme

Alkalische Phosphatase,

Calf Intestinal Phosphatase (CIP) (10 U / µl)

New England Biolabs GmbH,

Frankfurt

Pfu-TurboTM DNA-Polymerase (2.5 U / µl) Stratagene, Heidelberg

Proteinase K, lyophilisiert Sigma-Aldrich, Deisenhofen

SAWADY PWO DNA-Polymerase (1U / µl) Peqlab Biotechnologie GmbH,

Erlangen

Restriktionsendonukleasen:

BamHI (20 U / µl), DpnI (20 U / µl),

EcoRI (20 U / µl), PstI (20 U / µl), SacI (20 U / µl),

SmaI (20 U / µl), StuI (20 U / µl), XhoI (20 U / µl)

New England Biolabs GmbH,

Frankfurt

RNase A Qiagen, Hilden

Tabelle 2: Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und Oligonukleotide. Die Bezeichnung der Oligonukleotide erfolgte mit der internen Labornummer (#n), deren genaue Bezeichnung und Sequenz unter 2.7.4 verzeichnet ist. PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion (3.1.3.3), RL: Restriktionsverdau (3.1.3.1) mit anschließender Ligation (3.1.3.4); IVM: in vitro Mutagenese (3.1.3.5).

2 Material 37

RNase-Inhibitor (RNasin) aus humaner Plazenta Roche, Mannheim

T4-DNA-Ligase (4 U / µl) New England Biolabs GmbH,

Frankfurt

2.9.2 Antikörper

α GST-MARV-VP24, Kaninchen (27.06.2002) Institut für Virologie, Marburg

α MARV-VP24, Kaninchen (17.08.94) Institut für Virologie, Marburg

α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) Institut für Virologie, Marburg

α MARV-GP, Kaninchen (glykosyliert, 3/95,

11.09.1996)

Institut für Virologie, Marburg

α MARV-GP, Kaninchen (nicht glykosyliert, 3/95,

11.09.1996)

Institut für Virologie, Marburg

α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal Institut für Virologie, Marburg

α MARV-VP40, Maus, monoklonal CDC, Atlanta (USA)

α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) Institut für Virologie, Marburg

α MARV-VP30 #249, Meerschweinchen Institut für Virologie, Marburg

α HA 11 16B12, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Heidelberg

α α-tubulin, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen

α FlagTM M2, Maus, monoklonal Sigma-Aldrich, Deisenhofen

α FlagTM, Kaninchen Sigma-Aldrich, Deisenhofen

α c-myc sc-789, Kaninchen Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Heidelberg

α Lamp-1, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Heidelberg

α Lamin A/C sc-7292, Maus, monoklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Heidelberg

Ziege α Maus, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg

Esel α Kaninchen, FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg

Ziege α Maus FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg

Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg

Ziege α Maus, POD DAKO-Diagnostika GmbH,

Hamburg

Ziege α Meerschweinchen, POD DAKO-Diagnostika GmbH,

Hamburg

Ziege α Kaninchen, POD Dianova, Hamburg

2 Material 38

2.9.3 Proteine, Peptide und Aminosäuren

Glutathion, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Protein A, gebunden an Sepharose CL-4B Sigma-Aldrich, Deisenhofen

RainbowTM Protein Molecular Weight Marker

14,3 - 220 kD

Amersham Pharmacia Biotech

Europe GmbH, Freiburg

2.10 Radioaktiv markierte Substanzen

[14C] RainbowTM Protein Molecular Weight Marker

14,3 - 200 kDa



[35S]-PromixTM Redivue, 14,3 mCi / ml

(Methionin 10 mCi / ml)



2.11 Zellen und Viren

2.11.1 Prokaryotische Zellen

E. coli Stamm BL-21 Amersham Pharmacia Biotech

Europe GmbH, Freiburg Genotyp: B F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm

E. coli Stamm XL1-Blue Stratagene, Heidelberg

Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘ proAB laclqZ∆M15 Tn10

(Tetr)]

2.11.2 Eukaryotische Zellen

HeLa-Zellen (humane epitheliale Zervixkarzinomzellen): ATCC Klon CCL-2

HEK 293-Zellen (humane, embryonale Nierenzellen)

Vero-Zellen (Nierenzellen der affrikanischen Meerkatze)

2.11.3 Viren

rekombinantes Vacciniavirus MVA-T7 Sutter et al., 1995 Marburg-Virus (MARV-Musoke) Institut für Virologie, Marburg

3 Methoden 39

3 Methoden

3.1 Molekularbiologische Methoden

3.1.1 Isolierung und Reinigung von DNA

DNA, die in molekularbiologische Experimente eingesetzt wird, darf keine

Verunreinigungen enthalten. Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, Detergenzien, Salze

oder Proteine greifen negativ in den Verlauf nachfolgender biochemischer Reaktionen

ein.

3.1.1.1 Reinigung von DNA-Fragmenten > 100 bp

Die DNA wurde mit dem QIAquick PCR Purification Kit über eine Säulenmatrix

gereinigt, wobei die Durchführung laut beiliegendem Protokoll erfolgte. Die gereinigte

DNA wurde in 30 - 50 µl dH2O von der Säulenmatrix eluiert. Diese Reinigung wurde

nach der Durchführung einer PCR (3.1.3.3) bzw. nach einem Restriktionsverdau

(3.1.3.1) durchgeführt.

3.1.1.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

Zur Extraktion von DNA aus präparativen Agarosegelen wurde das QIAquick Gel

Extraction Kit entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung verwendet. Die DNA

wurde über eine Säulenmatrix gereinigt und in 30 µl dH2O eluiert. Ein Zehntel des

Eluats wurde zur Kontrolle der Präparation auf einem analytischen Agarosegel

(3.1.2.1.2) aufgetrennt.

3.1.1.3 Ethanolfällung

Mittels Ethanolfällung kann DNA gereinigt und ankonzentriert werden.

Ansatz: x µl DNA-Lösung

1 µl Glykogen (20 µg / µl)

x/10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,2

ad 2,5fache des bisherigen Volumens 100 % Ethanol

Die Präzipitation erfolgte durch Vortexen bei Raumtemperatur (RT). Das Präzipitat

wurde 30 Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert. Das durch die Verwendung von

Glykogen gut sichtbare Pellet wurde mit 300 µl 70 % Ethanol gewaschen, weitere 15

Minuten bei 13.000 UpM abzentrifugiert und das DNA-Pellet bei RT getrocknet. Diese

Art der Reinigung wurde nach DNA-Sequenzierung (3.1.2.3) durchgeführt.

3 Methoden 40

3.1.2 Analyse von DNA

3.1.2.1 Elektrophoretische Auftrennung

DNA kann unter nativen Bedingungen entsprechend ihrer Molekülgröße in einer

Agarosegelmatrix elektrophoretisch aufgetrennt werden. Die Nukleinsäuren bewegen

sich aufgrund ihrer negativen Ladung in einem elektrischen Feld in Richtung der Anode

(⊕-Pol), wobei kleinere Fragmente schneller wandern als große. Präparative Gele

dienen der Reinigung, analytische der Größenbestimmung von Nukleinsäuren nach

enzymatischen Reaktionen.

3.1.2.1.1 Präparative DNA-Agarosegele

Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose NA in 1x TAE-Puffer gelöst

Laufpuffer: 1x TAE-Puffer, pH 8,0

Die Agarose wurde durch Erhitzen in TAE-Puffer gelöst und in einen Gelschlitten

gegossen. Die DNA-Proben wurden nach Erstarren des Gels mit 1/6 Volumen 6x DNA-

Probenpuffer versetzt und anschließend zusammen mit einem DNA-Längenstandard

aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte bei einer konstanten Stromstärke von 60 mA bei

maximaler Spannung. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel für 20

Minuten in einer wässrigen Ethidiumbromidlösung (1 µg / ml) gefärbt und die DNA

unter UV-Beleuchtung von 302 nm Wellenlänge sichtbar gemacht. Die gewünschten

DNA-Banden wurden auf dem UV-Schirm einzeln mit einem Skalpell ausgeschnitten

und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.

3.1.2.1.2 Analytische DNA-Agarosegele

Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose, ultrarein in 1x TBE-Puffer gelöst

Laufpuffer: 1x TBE-Puffer, pH 8,0

Aufbau- und Elektrophoresebedingungen entsprechen denen präparativer Agarosegele

(3.1.2.1.1). Nach Färbung der DNA wurde diese mithilfe des Geldokumenta-

tionssystems GelDoc 2000 visualisiert.

3.1.2.2 Quantifizierung von DNA

Zur Bestimmung der Konzentration von wässrigen DNA-Lösungen wurde deren

Absorptionsvermögen photometrisch mithilfe des GeneQuant II bei einer Wellenlänge

von 260 nm in einer Quarzküvette mit 1 cm Lichtweg analysiert. Eine Absorption von 1

entsprach dabei einer Konzentration von 50 µg / ml für doppelsträngige (ds) DNA.

Um Extinktionen im linearen Bereich (zwischen 0,1 und 0,8) zu erhalten, wurden die

Proben entsprechend in dH2O verdünnt.

3 Methoden 41

Der Quotient OD260/OD280 erlaubt eine Aussage über die Reinheit von

Nukleinsäurepräparationen. Reine Lösungen sind durch Quotienten zwischen 1,8 und

2,0 charakterisiert. Verunreinigungen durch Proteine ergeben einen Wert kleiner als

1,8, Kontaminationen durch Phenol oder RNA ergeben deutlich höhere Quotienten.

3.1.2.3 Sequenzanalyse mit dem ABI PrismTM 377 DNA Sequencer

Das Prinzip dieser Sequenzierung beruht auf der Kettenabbruchmethode nach Sanger

und Coulson (Sanger and Coulson, 1975). Bei der hier verwendeten Modifikation der

Methode wird die zu sequenzierende DNA durch PCR amplifiziert. Neben den

Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTP befinden sich

im Reaktionsgemisch geringe Konzentrationen der unterschiedlich fluoreszenz-

markierten Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs) ddATP, ddCTP, ddGTP und

ddTTP. Die Sequenzierung kann bei diesem System in einem Reaktionsgefäß

erfolgen. Während der Synthesereaktion kommt es durch den Einbau der ddNTPs zu

statistisch verteilten Abbrüchen der Komplementärstrangsynthese. Die Abbruch-

fragmente werden über ein Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Der untere Rand

des Gels wird durch einen Argon-Laser abgetastet. Seine Hauptemission liegt bei

Wellenlängen von 488 nm und 514,5 nm. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden durch den

Laser angeregt und senden spezifische Fluoreszenzstrahlung aus. Diese wird über

eine CCD-Kamera digitalisiert, auf den Computer übertragen und durch spezielle

Software analysiert.

Die Sequenzierung erfolgte mit dem ABI Prism™ 377 DNA Sequencer und dem ABI

Prism™ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin Elmer. Zur

Synthese der DNA wurde die im Kit enthaltene AmpliTaq DNA-Polymerase FS

eingesetzt. Diese Polymerase baut im Gegensatz zur Taq DNA-Polymerase verstärkt

Didesoxynukleotide ein.

Reaktionsansatz: 1 µl DNA (1 µg / µl)

1 µl Primer (5 µM)

4 µl Terminations-Mix

ad 20 µl dH2O

Programm: Zyklen Temperatur Zeit

Denaturierung 1 95 °C 30 sec


Annealing 50 °C 15 sec

Synthese 60 °C 4 min

Ende der Synthese 1 4 °C ∞

3 Methoden 42

Anschließend wurde die amplifizierte DNA durch Ethanolfällung (3.1.1.3) gereinigt, das

Pellet in 4 µl Sequenzier-Probenpuffer resuspendiert und drei Minuten bei 95 °C

denaturiert. Auf das Harnstoff-Polyacrylamidgel wurden 2 µl der Probe aufgetragen.

Sequenzgel: 5 % Polyacrylamidgel / 7 M Harnstoff

21,0 g Harnstoff

8,4 ml 30 % Polyacrylamid-Lösung (29:1)

6,0 ml 10× TBE

20,0 ml dH2O

Die Gellösung wurde 45 Minuten gerührt, bis der Harnstoff vollständig gelöst war.

Anschließend wurde sie über eine 0,2 µm Membran filtriert und fünf Minuten entgast.

Während dieser Zeit konnte die Gelapparatur aufgebaut werden, wobei darauf zu

achten war, dass die Glasscheiben vorher gründlich mit dem Detergenz Alconox, dH2O

und 90 % Isopropanol gereinigt wurden.

Die Polymerisation des Gels wurde durch Zugabe von APS und TEMED gestartet.

300 µl 10 % (w/v) APS

20 µl TEMED

Die Auftrennung der Proben erfolgte elektrophoretisch in TBE-Puffer (pH 8,0) bei 48 W

über einen Zeitraum von acht Stunden.

3.1.3 Klonierung und Mutagenese von DNA

3.1.3.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen sind Enzyme bakteriellen Ursprungs, welche die

Phosphordiesterbindungen beider Stränge eines DNA-Moleküls an spezifschen

Erkennungssequenzen hydrolytisch spalten. Man kann sie präparativ zum

Herausschneiden eines Inserts aus einem Vektor oder zur Analyse von DNA

verwenden, wobei zwei DNA-Moleküle, die sich in Anzahl oder Position der

Erkennungsstellen unterscheiden, nach einem analytischen Restriktionsverdau und

Gelelektrophorese im Gel verschiedene Bandenmuster erzeugen.

Beim Verdau mittels Restriktionsendonukleasen muss darauf geachtet werden, dass

die Reaktionsbedingungen dem jeweiligen Restriktionsenzym optimal angepasst

werden. Temperatur, Pufferzusammensetzung und Zusatz von BSA richten sich nach

den Angaben des Herstellers. Bei einem Doppelverdau durch zwei Restriktionsenzyme

kann dies gleichzeitig in einem Ansatz geschehen, sofern die Enzyme die gleichen

3 Methoden 43

Reaktionsbedingungen benötigen. Ansonsten muss die DNA nach dem ersten Verdau

mittels QIAquick™ PCR Purification Kit gereinigt werden (3.1.1.1), bevor sie mit dem

zweiten Enzym verdaut werden kann.

Der Restriktionsverdau wurde für einen möglichst vollständigen Verdau je nach Enzym

2 bis 16 Stunden inkubiert.

Ansatz für analytischen Verdau: 0,2 - 1 µg DNA

1 µl 10x Puffer nach Herstellerangaben

(1 µl 10 % BSA, falls notwendig)

1 - 5 U Restriktionsendonuklease A

(0,5 – 2,5 U bei Doppelverdau)

(0,5 – 2,5 U Restriktionsendonuklease

B bei Doppelverdau)

ad 10 µl

(ad 20 µl

dH2O

dH2O, wenn mit 2 Enzymen verdaut

wurde)

Anschließend wurde der Verdau mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2)

überprüft.

Ansatz für präparativen Verdau: 2 - 10 µg DNA

10 µl 10x Puffer

(10 µl 10 % BSA, falls notwendig)

10 - 30 U Restriktionsendonuklease A (5 - 15 U

bei Doppelverdau)

(5 - 15 U Restriktionsendonuklease B

bei Doppelverdau)

ad 100 µl dH2O

Wenn die DNA in weiteren Reaktionen verwendet werden soll, muss sie nach dem

Verdau entweder mithilfe des PCR-Purification-Kit (3.1.1.1) oder über ein präparatives

Gel (3.1.2.1.1) mit anschließender Gelextraktion (3.1.1.2) aufgereinigt werden.

3.1.3.2 Dephosphorylierung linearisierter DNA

Um die Religation linearisierter Vektoren zu verhindern, werden die 5’-

Phosphatgruppen der verdauten Plasmide durch die Behandlung mit alkalischer

Phosphatase (calf intestinal phosphatase, CIP) entfernt. Dazu wurde nach dem

Restriktionsverdau 1 µl CIP in den Ansatz gegeben und eine Stunde bei 37°C

inkubiert. Da die alkalische Phosphatase in den meisten Restriktionspuffern aktiv ist, ist

3 Methoden 44

eine vorherige Reinigung im Allgemeinen nicht notwenig. Die Inaktivierung der CIP

erfolgte durch Zugabe von 0,5 µl einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) für 10 min bei

72 °C. Die DNA wurde anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma

Qiagen (Hilden) gereinigt und in 30 µl dH2O aufgenommen (3.1.1.1).

3.1.3.3 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Mittels PCR können spezifische DNA-Abschnitte vermehrt werden. Für jede Reaktion

benötigt man zwei verschiedene Primer, die an jeweils einen DNA-Strang binden. Der

Vorwärts-Primer enthält die ersten 15 bis 25 Nukleotide der zu amplifizierenden

Sequenz, der Rückwärts-Primer die letzten 15 bis 25 Nukleotide des komplementären

Stranges. Je nach Klonierungsstrategie können Primer im 5’-Bereich zusätzliche

Sequenzen, z.B. Schnittstellen für Restriktionsenzyme, enthalten (Abbildung 5).

Im ersten Schritt des Reaktionszyklus (Denaturierung) wird die DNA-Matrize durch

Erhitzen in ihre Einzelstränge zerlegt. Im zweiten Schritt (Annealing) erniedrigt man die

Temperatur entsprechend der Basenzusammensetzung und Länge der Primer, damit

diese an die komplementären Sequenzabschnitte der einzelsträngigen DNA-Matrize

binden können. Anschließend erfolgt die Synthese des Doppelstranges ausgehend

vom 3’-Ende des jeweiligen Primers. Die dafür verwendete hitzestabile PWO DNA-

Polymerase ist durch eine hohe Lesegenauigkeit und Korrekturlesefunktion (3’-5’-

Exonukleaseaktivität) ausgezeichnet. Der Reaktionszyklus wird mehrfach wiederholt,

wobei die zu amplifizierende DNA im Reaktionsgemisch exponentiell angereichert wird.

Abbildung 5: Prinzip einer PCR. Der vergrößerte DNA-Abschnitt soll amplifiziert werden. Gleiche Linien stehen fürgleiche Sequenzen, gestrichelte und gepunktete Bereiche, sofern sie einandergegenüberliegen, sind komplementär. Die Synthese erfolgt in 5’-3’-Richtung.

dsDNA

Rückwärts-Primer

5’3’

5’ 3’

3’

5’

3’

5’

Vorwärts-Primer

3 Methoden 45

Reaktionsansatz: 10 ng DNA

30 µM Vorwärts-Primer

30 µM Rückwärts-Primer

je 1,5 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

10 µl 10× Puffer für PWO DNA-Polymerase (komplett)

ad 99,5 µl dH2O

0,5 µl PWO DNA-Polymerase


Denaturierung 1 95 °C 5 min

Denaturierung 35 95 °C 1 min

Annealing 50 – 60 °C 1 min

Synthese 72 °C 2 min + 5 sec pro

Zyklus

Nach Durchlaufen der Zyklen wurden 5 µl des Reaktionsansatzes auf einem

analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) überprüft. Anschließend wurde das entstandene

DNA-Fragment mittels eines präparativen Agarosegels (3.1.2.1.1) aufgetrennt und

durch Gelextraktion (3.1.1.2) gereinigt.

3.1.3.4 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren

Bei der Ligation von DNA-Fragmenten in einen zuvor mit geeigneten

Restriktionsendonukleasen geschnittenen Vektor katalysiert die DNA-Ligase die

Bildung von Phosphodiesterbrücken zwischen freien 5’-Phosphatgruppen eines DNA-

Stranges mit den freien 3’-OH-Gruppen eines zweiten Stranges.

Insertions- und Vektor-DNA wurden in einem Verhältnis von 7,5:1 eingestetzt.

Ansatz: 20 - 200 ng verdaute, gereinigte Insert-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1)

25 - 50 ng linearisierte, gereinigte Vektor-DNA (3.1.3.1, 3.1.1.1)

1 µl 10x Ligationspuffer mit rATP

0,5 µl T4-DNA-Ligase (4 U / µl)

ad 10 µl dH2O

Zur Abschätzung des Verhältnisses von religierten Plasmiden zu Plasmiden mit

Insertionen wurde eine Religationskontrolle mitgeführt, in der das zu klonierende Insert

durch dH2O ersetzt wurde. Als Ligationskontrolle diente ein phosphoryliertes

linearisiertes Plasmid, das nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten wurde.

3 Methoden 46

Der Ansatz wurde eine Stunde bei RT inkubiert und anschließend in Z-kompetente

XL1-blue Zellen transformiert (3.1.3.6).

3.1.3.5 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA

Mittels in vitro Mutagenese ist es möglich, Punktmutationen, Deletionen und

Insertionen in Plasmid-DNA einzubringen. Die Methode beruht auf einer Polymerase-

Ketten-Reaktion (PCR) mit speziell entworfenen, zueinander komplementären Primern,

welche die gewünschte Mutation enthalten.

Die Plasmid-DNA wurde mit den entsprechenden Primern durch rekombinante

PfuTurboTM-DNA-Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate die durch die Primer

eingeführten Mutationen enthalten. Anschließend wurde der PCR-Ansatz drei Stunden

bei 37 °C nach Zugabe von 1 µl DpnI inkubiert, ein Restriktionsenzym, welches

methylierte DNA vollständig in kleinste Fragmente verdaut. Dadurch wurde die

methylierte Ausgangs-DNA abgebaut, während die nicht methylierte, neu synthetisierte

DNA intakt blieb. 10 µl des Amplifikationsansatzes wurden direkt in XL1-Blue Zellen

transformiert (3.1.3.6). Zur Kontrolle wurden außerdem 5 µl des Reaktionsproduktes

mit einem analytischen Agarosegel (3.1.2.1.2) dargestellt.

Ansatz der PCR: 50 ng DNA

125 ng Vorwärts-Primer

125 ng Rückwärts-Primer

je 1 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

5 µl 10x Puffer für die PfuTurboTM-DNA-Polymerase

ad 49 µl dH2O

1 µl PfuTurboTM-DNA-Polymerase (2,5 U / µl)




Annealing 55 °C 1 min

Synthese 68 °C 2 min / kb Plasmidlänge

Ende der Synthese 1 4 °C ∞

3 Methoden 47

3.1.3.6 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA

Rekombinante Plasmide werden in vivo durch Replikation und Teilung transformierter

Bakterienzellen vermehrt. Um DNA in Bakterienzellen zu transformieren, ist es

notwendig, die Bakterien der Wahl kompetent, sie also aufnahmefähig für DNA zu

machen.

Mit dem Z-Competent E. coli Transformation KitTM and Buffer Set wurden E. coli-Zellen

laut beiliegendem Protokoll behandelt, aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

Vor einer Transformation wurden die Z-kompetenten E. coli-Zellen zügig in der Hand

aufgetaut. Nach der Zugabe von 100 µl Zellsuspension zur DNA-Lösung (z.B. 10 µl

Ligationsansatz) erfolgte eine Inkubation der Zellen für eine Stunde auf Eis. Schließlich

wurde der komplette Ansatz auf LB-Agarplatten mit Ampicillin (100 µg / ml) ausge-

strichen und über Nacht (ÜN) bei 37 °C inkubiert. Die transformierten Bakterien

verfügen durch die aufgenommenen Plasmide über ein Ampicillin-Resistenzgen und

können deshalb auf den ampicillinhaltigen Agarplatten wachsen.

3.1.4 Vervielfältigung von DNA

3.1.4.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab (Miniprep)

Mit Plasmidpräparationen kleinen Maßstabs können rekombinante Plasmide aus

Bakterien isoliert und anschließend charakterisiert werden. Dies geschah unter Ver-

wendung des QIAprep® Spin Miniprep Kits bzw. des E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I.

Die Funktionsweise der Kits beruht auf der Adsorption der DNA an eine in Säulen

verpackte Silicagel-Matrix, wobei Waschung und Elution der gebundenen DNA durch

Zentrifugation erfolgt. Eine einzelne Bakterienkolonie wurde in 4 ml 2YT-Medium mit

100 µg / ml Ampicillin resuspendiert und über Nacht bei 37 °C auf einem Schüttler

inkubiert. Von dieser Bakterien-Übernachtkultur (ÜNK) wurden 2 ml entsprechend den

beiliegenden Arbeitsprotokollen zur Präparation der DNA bearbeitet. Die DNA wurde in

50 µl dH2O eluiert. 5 µl des gewonnenen Eluats wurden zur Analyse mit geeigneten

Restriktionsendonukleasen verdaut (3.1.3.1) und auf einem analytischen Gel

(3.1.2.1.2) aufgetrennt.

3.1.4.2 Plasmidpräparation im großen Maßstab (Maxiprep)

Eine Plasmidpräparation großen Maßstabs erfolgte unter Verwendung des QIAfilter

Plasmid Maxi Kits bzw. des HiSpeed Plasmid Maxi Kits. Beide Anwendungen basieren

auf einer alkalischen Lyse von Bakterienzellen (Sambrook et al., 1989) mit

anschließender Adsorption der Plasmid-DNA an eine Anionenaustauscher-Matrix. Als

Ausgangsmaterial wurden 100 µl einer ÜNK (3.1.4.1) des gewünschten Bakterienklons

3 Methoden 48

in 100 ml LB-Medium mit 100 µg / ml Ampicillin überführt und 16 bis 20 Stunden bei 37

°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Präparation wurde anhand des mitgelieferten

Handbuches durchgeführt und die gereinigte DNA schließlich in 500 µl dH2O

aufgenommen. Mithilfe eines Photometers wurde die DNA-Konzentration bestimmt

(3.1.2.2) und einheitlich auf 1 µg / µl eingestellt.

3.1.5 Reinigung und Analyse von RNA

3.1.5.1 Reinigung von viraler RNA aus Zellkulturüberstand

Zur Aufreinigung viraler RNA aus Zellkulturüberstand wurde das QIAamp® Viral RNA

Mini Kit entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung verwendet. Die RNA wurde

über eine Säulenmatrix gereinigt, in 30 µl nukleasefreiem dH2O eluiert und die RNA-

Konzentration photometrisch bestimmt (3.1.5.2).

3.1.5.2 Quantifizierung von RNA und siRNAs

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration einer wässrigen Lösung wurde deren

Absorption bei einer Wellenlänge von λ=260 nm UV-photometrisch gemessen. Eine

Absorption von 1 entspricht dabei einer Konzentration von 40 µg RNA / ml.

Zur Quantifizierung von synthetischen siRNAs wurde die gelieferte Lösung 1:10 in

dH2O verdünnt und deren Absorption bei λ=260 nm UV-photometrisch mithilfe einer

Mikroküvette gemessen. Zur Berechnung der siRNA-Konzentration wurden folgende

Formeln verwendet:

OD260 ∗ Verdünnung ∗ 40 µg siRNA / ml pro OD-Einheit = siRNA-Konzentration µg / ml

Die molare Konzentration der siRNA in µM bestimmt man durch die Formel:

x µg / ml siRNA-Konzentration ÷ 14 µg siRNA / nmol siRNA = X µM siRNA

3.1.6 Real-time RT-PCR Analyse mittels SYBR Green dye I

Die Real-time RT-PCR mit der LightCycler-Technologie ist derzeit die exakteste

Methode zur quantitativen und gleichzeitig auch qualitativen Erfassung der

Genexpression in einem einzigen Reaktionsansatz. Bei diesem Verfahren wird die

Amplifikation mit der qualitativen Detektion unmittelbar kombiniert. Dies geschieht mit

einem Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green), der sich in die sogenannte "Minor Groove"

(„kleine Furche“) von doppelsträngiger DNA einlagert. Durch diese Bindung wird die

emittierte Fluoreszenz von SYBR Green um ein vielfaches verstärkt und man erhält ein

Signal, dessen Intensität direkt proportional zu der Zahl und Größe der vorhandenen

Doppelstränge ist. Im LightCycler wird diese emittierte Fluoreszenz nach jedem Zyklus

(Verdoppelung der Menge an doppelsträngiger DNA) gemessen. Nach einer

3 Methoden 49

bestimmten Zahl von Zyklen (abhängig von der Zahl der Ausgangskopien) wird die

Fluoreszenz schließlich messbar. Dieses Signal ist direkt proportional zur Menge an

gebildeter DNA und steigt exponentiell bis zum Erreichen eines Maximums an.

Der hier gewählte Versuchsansatz diente nicht der absoluten Messung der RNA-

Konzentration, sondern der vergleichenden Darstellung in verschiedenen Ansätzen.

Für die Real-time RT-PCR wurde das SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum

Taq Kit verwendet.

Ansatz der PCR: 5 µl virale RNA aus Zellkulturüberstand

10 µl 2x Reaktionspuffer

1 µl Vorwärts-Primer #116 (10 µM)

1 µl Rückwärts-Primer #138 (10 µM)

0,2 µl 100x SYBR-Green

0,8 µl SuperScript II / Taq-Enzym-Mix

ad 20 µl nukleasefreises dH2O


Reverse Transkription 1 45 °C 30 min

PCR


Annealing 60 °C 10 sec

Synthese 72 °C 20 sec

Die PCR sowie Quantifizierung und Digitalisierung wurden automatisch durch den

LightCycler (Roche) durchgeführt und die erhaltenen Daten wurden mithilfe der

LightCycler Software ausgewertet.

3.2 Zellbiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von HeLa-, HEK293- und Vero-Zellen

Diese permanenten Zelllinien wurden in 162 cm2 Zellkulturflaschen in Dulbecco’s

Modified Eagle‘s Medium (DMEM) in Gegenwart von 10 % FCS, L-Glutamin und

Penicillin/Streptomycin kultiviert. Bei 37 °C und unter 5 % CO2-Begasung bildeten die

Zellen nach 3 bis 4 Tagen einen geschlossenen Zellrasen. Die Zellen wurden unter

einer Sicherheitswerkbank passagiert. Dazu wurden DMEM(+++), PBSdef und

Trypsin/EDTA auf 37 °C erwärmt. Altes Medium wurde entfernt und der Zellrasen nach

zweimaligem Waschen mit PBSdef durch Zugabe von 2 ml Trypsin/EDTA abgelöst.

3 Methoden 50

Dieser Vorgang dauert bei den verschiedenen Zelllinien unterschiedlich lange.

Während sich HEK293-Zellen bereits nach wenigen Sekunden ablösen, dauert dies bei

Vero-Zellen mitunter bis zu 20 Minuten. Daher müssen die Zellen während dieser

Behandlung ständig mikroskopisch kontrolliert werden. Hatten sich alle Zellen gelöst,

wurde die Reaktion mit 8 ml Wachstumsmedium gestoppt, die Zellen durch Pipettieren

resuspendiert und in der gewünschten Menge in neue Zellkulturflaschen bzw. -platten

mit DMEM(+++) überführt.

3.2.2 Transfektion von HEK293-Zellen mit Lipofectamine PlusTM

Um DNA in Zellen einzubringen, wird deren negative Ladung durch Komplexbildung

mit kationischen Lipiden maskiert. In dieser Form können die DNA-Lipidkomplexe sich

an die Zellmembran anlagern und diese passieren. Die HEK293-Zellen wurden einen

Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte

von 50 bis 70 % aufwiesen. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend den

Empfehlungen des Herstellers angesetzt.

pro well einer 6 well-

Platte

pro well einer 12 well-

Platte

5 cm-Schale

Ansatz I 4 µl LipofectamineTM

100 µl DMEM(+Q)

2 µl LipofectamineTM

50 µl DMEM(+Q)

9,1 µl LipofectamineTM

230 µl DMEM(+Q)

Ansatz II 1 - 10 µg DNA

100 µl DMEM(+Q)

6 - 10 µl Plus-ReagentTM

0,5 - 5 µg DNA +

50 µl DMEM(+Q)

5 µl Plus-ReagentTM

2,3 µg DNA

230 µl DMEM(+Q)

13,7 µl Plus-ReagentTM

Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für 15 Minuten bei RT inkubiert,

miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 15

Minuten bei RT inkubiert. Währenddessen wurde das FCS-haltige Medium von den zu

transfizierenden Zellen abgenommen. Da sich HEK293-Zellen sehr leicht vom Boden

ablösen, wurden diese Zellen nicht mit DMEM(+Q) gewaschen. Anschließend wurden

auf ein well einer 6 well-Platte 800 µl, auf ein well einer 12-well-Platte 450 µl

DMEM(+Q) bzw 1,85 ml auf einer 5 cm-Schale vorgelegt. Nach Ablauf der

Inkubationszeit wurden die Gemische des Transfektionsansatzes zugesetzt. Nach

einer Inkubationszeit von drei Stunden bei 37 °C im Brutschrank wurde das

Transfektionsmedium vollständig abgenommen und durch 2 ml (6 well), 1 ml (12 well)

bzw. 5 ml (5 cm-Schale) DMEM(+++) ersetzt.

3 Methoden 51

3.2.3 Zellernte für Flotationsanalysen und Triton X-114 Phasen-partitionierung

HEK293-Zellen wurden für die Durchführung von Flotationsanalysen sowie Triton X-

114 Phasenpartitionierungen 24 Stunden nach Transfektion geerntet. Die Zellernte

erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt. Für die

Flotationsanalysen wurden pro Ansatz 3 wells einer 6 well-Platte bearbeitet, für die

Phasenpartitionierung eine 5 cm-Schale.

Da HEK293-Zellen nur schwach am Boden der Zellkulturschalen haften, wurden sie

zunächst mithilfe einer Pipette im Medium vom Boden abgespült, in ein 15 ml

Reaktionsröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 UpM und

4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge pelletiert. Anschließend erfolgte das Waschen der

Zellen jeweils einmal mit 5 ml PBSdef und 5 ml Lysispuffer für Flotationen bzw. Triton X-

114 Lysispuffer mithilfe von Zentrifugation. Das Zellpellet wurde mit 300 µl Lysispuffer

für Flotationen versetzt und die Zellen mittels 10fachem Passagieren durch eine 22G-

Kanüle aufgeschlossen und homogenisiert. Die Zellkerne konnten durch fünfminütige

Zentrifugation bei 830 x g pelletiert werden und der postnukleäre Überstand wurde im

Weiteren für die Flotationsanalysen (3.3.6.1) bzw. die Phasenpartitionierung (3.3.6.3)

eingesetzt.

3.2.4 Ernte und Aufreinigung von Zellkulturüberstand zur Analyse freigesetzter Proteine in Form von virusähnlichen Partikeln (VLPs)

VLPs wurden durch Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen

aufgereinigt. Pro Ansatz wurde eine 6 well-Platte mit den entsprechenden Plasmiden

wie unter 3.2.2 beschrieben, transfiziert und der Überstand sowie die Zellen 48

Stunden später geerntet.

Hierzu wurde das Medium von einer 6 well-Platte abgenommen, in ein 15 ml Reak-

tionsröhrchen überführt und, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen, bei 5000 UpM

und 4 °C in einer Heraeus-Zentrifuge zentrifugiert.

In UltraClearTM-Zentrifugenröhrchen für SW41-Rotoren wurden 2 ml 20 %ige

Saccharoselösung vorgelegt und vorsichtig mit dem zuvor zentrifugierten

Zellkulturüberstand überschichtet. Es folgte ein Ultrazentrifugations-Schritt für drei

Stunden bei 35.000 UpM und 4 °C in einem SW41 Rotor. Der Überstand wurde

dekantiert, die Röhrchen vorsichtig trocken gewischt, ohne den Boden zu berühren,

und das Pellet in 65 µl PBSdef resuspendiert. Anschließend wurde ein Proteinase K-

Verdau durchgeführt (3.3.5).

3 Methoden 52

Die Zellen wurden in PBSdef abgespült, in ein 15 ml Reaktionsröhrchen überführt und

durch Zentrifugation bei 1500 UpM und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 800 µl

PBSdef resuspendiert und mit 400 µl 4x Proteinprobenpuffer versetzt.

3.2.5 Transfektion von Vero-Zellen mit LipofectamineTM 2000

Das Funktionsprinzip des Transfektionsreagents LipofectamineTM 2000 ist ähnlich dem

von Lipofectamine PlusTM (3.2.2), jedoch hat sich gezeigt, dass sich dieses Reagenz

besser zur Transfektion von chemisch synthetisierten siRNAs in Vero-Zellen eignet.

Die Zellen wurden 1 Tag vor Transfektion so umgesetzt, dass sie zum

Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 % aufwiesen. Sollte eine Immun-

fluoreszenzanalyse durchgeführt werden, wurden die Zellen auf Deckgläschen

ausgesät. Die Transfektionsansätze wurden entsprechend der Empfehlungen des

Herstellers angesetzt.

pro well einer 6 well-Platte pro well einer 24 well-Platte

Ansatz I 10 µl LipofectaminTM 2000

250 µl Opti-MEM I

2 µl LipofectaminTM 2000

50 µl Opti-MEM I

Ansatz II x µg DNA

100 µl Opti-MEM I

x µg DNA

x ng siRNA

50 µl Opti-MEM I

Die Ansätze I und II wurden getrennt jeweils für fünf Minuten bei RT inkubiert,

miteinander vereinigt, durch Schütteln per Hand gründlich gemischt und für weitere 30

Minuten bei RT inkubiert. Die Zellen wurden unterdessen 2x mit DMEM(+Q)

gewaschen. In den Zellkulturschalen wurden 2 ml (6 well) bzw. 0,5 ml (24 well)

DMEM(+Q) vorgelegt und nach Ablauf der Inkubationszeit mit den entsprechenden

Transfektionsgemischen versetzt. Nach einer vierstündigen Inkubationszeit bei 37 °C

im Brutschrank wurde das Transfektionsmedium abgenommen und durch 2 ml (6 well)

bzw. 0,5 ml (24 well) DMEM(+++) ersetzt. Die Zellernte erfolgte bei Immunfluoreszenz-

analysenen 24 Stunden nach Transfektion (p.t.), bei siRNA-Untersuchungen 48

Stunden p.t..

3.2.6 Transfektion von siRNAs in MARV-infizierte Vero-Zellen

Die Vero-Zellen wurden einen Tag vor der ersten Transfektion in 6 well-Platten

umgesetzt, sodass sie zum Transfektionszeitpunkt eine Dichte von 50 bis 70 %

aufwiesen.

3 Methoden 53

ein well einer 6 well-Platte

Ansatz I 10 µl LipofectamineTM 2000

250 µl Opti-MEM I

Ansatz II 1543 ng siRNA (= 44 nM)

250 µl Opti-MEM I

Die Transfektionsbedingungen entsprachen denen, die unter 3.2.5. beschrieben

wurden. Vier Stunden nach der ersten Transfektion wurde das Medium nach

zweimaligem Waschen durch 2 ml DMEM(+Q) mit 2,5 % FCS ersetzt und für weitere

vier Stunden inkubiert. Acht Stunden nach der ersten Transfektion fand die Infektion

der Vero-Zellen mit Marburgvirus (Stamm Musoke) mit einer m.o.i von ungefähr 1 p.f.u.

im Sicherheitslabor des Instituts für Virologie in Marburg statt. Die Inkubationszeit der

Viren auf den Zellen betrug eine Stunde. Durch zweimaliges Waschen wurden nicht

gebundene Viruspartikel entfernt und im direkten Anschluss fand eine zweite siRNA-

Transfektion, wie zuvor beschrieben, statt. Vier Stunden nach dieser zweiten Trans-

fektion wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit DMEM(+++) für weitere 20

Stunden mit 2 ml DMEM(+++) bei 37 °C inkubiert. Die Ernte der Zellen und

Zellkulturüberstände fand 24 Stunden nach der Virusinfektion statt.

3.2.7 Ernte von Vero-Zellen sowie Zellkulturüberständen nach siRNA-Behandlung

Die Zellernte erfolgte auf Eis, Zentrifugen und Puffer wurden auf 4 °C gekühlt.

1,2 ml des Überstandes der MARV-infizierten Zellkulturplatten wurden abgenommen,

in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und Zellen sowie Zelltrümmer durch zwei-

minütige Zentrifugation bei 10.000 UpM entfernt. Der Überstand wurde für die

Isolierung viraler RNA mit AVL-Puffer (3.1.5.1) bzw. für Western Blot Analysen mit 4x

Proteinprobenpuffer versetzt.

Der Zellrasen wurden 1x mit PBSdef gewaschen und dann durch Zugabe von 500 µl

Trypsin / EDTA vom Boden der Zellkulturplatten abgelöst. Die Reaktion wurde durch

Zugabe von 700 µl DMEM(+++) gestoppt, die Zellen gründlich abgespült und in ein

1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Pelletierung der Zellen erfolgte durch eine fünf-

minütige Zentrifugation bei 1500 UpM in einer Eppendorf-Kühlzentrifuge. Nach dem

Waschen des Pellets mit 1 ml PBSdef wurden die Zellen in 100 bis 200 µl siRNA-

Lysispuffer resuspendiert, mit 4x Proteinprobenpuffer versetzt und für 10 Minuten bei

95 °C erhitzt. Die Proben wurden mittels Western Blot (3.3.1.4) analysiert.

3 Methoden 54

3.2.8 Das Vaccinia-Virus-Expressionssystem

Mit diesem System ist es möglich, Fremdgene in Zellen rekombinant zu exprimieren.

Die Zellen werden mit dem rekombinanten, modifizierten Vaccinia-Virus Ankara T7

(MVA-T7) infiziert (Sutter et al., 1995). Infizierte Zellen exprimieren dann die

viruskodierte DNA-abhängige-RNA-Polymerase des Phagen T7. Anschließend werden

die Zellen mit Plasmiden transfiziert, welche die zu exprimierenden Fremdgene unter

Kontrolle eines T7-Promotors enthalten. Durch die T7-RNA-Polymerase wird das

Fremdgen transkribiert und es kommt zu dessen Expression durch die zelluläre

Translationsmaschinerie.

3.2.8.1 Infektion und Transfektion von HeLa-Zellen

Zur Durchführung von Immunfluoreszenzanalysen wurden HeLa-Zellen auf runden

Deckgläsern (12 mm) in 6 well-Zellkulturplatten angezüchtet. Bei einer Konfluenz von

40 bis 60 % wurden die Zellen einmal mit vorgewärmtem DMEM(+Q) gewaschen. Die

Infektion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 500 µl pro well, wobei 100 µl MVA-T7

mit der entsprechenden Menge DMEM(+Q) versetzt wurde. Dies entspricht ungefähr

einer Infektionsdosis von drei infektiösen Einheiten / Zelle. Anschließend fand eine ein-

stündige Inkubation bei 37 °C im Brutschrank auf einem Kippschüttler statt.

Für die DNA-Transfektion wurde Lipofectin®-Reagent verwendet, welches mit der DNA

spontan Lipid-DNA-Komplexe bildet. Für die Transfektion wurden zwei Ansätze (I und

II) in Polystyrolröhrchen vorbereitet:

I: 5 µl Lipofectin® Reagent II: 1 – 2 µg DNA

1 ml DMEM(+Q) 1 ml DMEM(+Q)

Nach einer 20-minütigen Inkubation der Ansätze I und II bei RT wurden diese vereinigt,

durch Vortexen gemischt und nochmals für 15 Minuten bei RT inkubiert. Das

Transfektionsvolumen für ein well einer 6 well-Platte betrug somit 2 ml. Vor Zugabe

des Transfektionsansatzes wurden die infizierten HeLa-Zellen einmal mit DMEM(+Q)

gewaschen. Die Transfektion erfolgte für 8 bis 14 Stunden bei 37 °C in einem

Brutschrank. Im Anschluss wurden die exprimierten Fremdgene durch

Immunfluoreszenzanalysen sichtbar gemacht.

3.2.8.2 Fixierung von Zellen durch Paraformaldehyd und Permeabilisierung mittels Triton X-100

Die Zellen wurden zunächst zweimal mit PBSdef gewaschen und anschließend mit 3 %

Paraformaldehyd in PBSdef für 15 Minuten bei RT fixiert. Nach der Fixierung folgte

3 Methoden 55

zweimaliges Waschen mit PBSdef und eine Inkubation der Zellen mit 0,1 M Glycin für

10 Minuten bei RT. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBSdef erfolgte die

Permeabilisierung der Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBSdef für 10 Minuten bei RT.

Die Zellen wurden erneut gewaschen und für mindestens 10 Minuten mit

Blockierungspuffer überschichtet. Im Anschluss erfolgte die Immunfluoreszenzanalyse

(3.3.2).

3.3 Biochemische und immunologische Methoden

3.3.1 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen und deren Visualisierung

3.3.1.1 SDS-PAGE

Proteine werden unter reduzierenden Bedingungen durch diskontinuierliche SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt (Laemmli, 1970). Die Proteine

werden dabei mit SDS komplexiert und dadurch negativ geladen. Die negativen SDS-

Protein-Komplexe wandern in einem Polyacrylamid-Gel nach Anlegen einer Spannung

in Richtung Anode (⊕-Pol) und trennen sich entsprechend ihrer Molekülgröße auf, da

kleinere Proteine schneller wandern als große. Das Gel besteht aus einem 4-%igen

Sammelgel und, je nach Größe der Proteine, einem höherprozentigen Trenngel.

Sammelgel: Trenngel:

4 % 12 %

dH2O 3,4 ml 3,3 ml

30 % Polyacrylamid-Lösung

(rotiphorese® Gel 30)

830 µl 4,0 ml

PAGE-Sammelgelpuffer 680 µl -

PAGE-Trenngelpuffer - 2,6 ml

10 % APS 50 µl 100 µl

TEMED 5 µl 4 µl

Den aufzutrennenden Proteinen wurde eine entsprechende Menge an 4x

Proteinprobenpuffer zugegeben und die Proben für fünf Minuten bei 95 °C inkubiert. Es

folgte die Beladung des SDS-Gels. Als Größenmarker wurden auf jedes Gel 1 bis 2 µl

RainbowTM Protein Molecular Weight Marker in 15 µl 4x Proteinprobenpuffer

3 Methoden 56

aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte in einer von Keutz-Minigelkammer mit 1x

Proteingellaufpuffer bei 25 mM pro Gel bei maximaler Spannung.

3.3.1.2 Coomassie-Färbung

Die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine können mit Coomassie® Brillant Blue

R250 direkt angefärbt werden. Dazu wurde das Gel 20 Minuten bei RT in Coomassie®-

Färbelösung auf dem Schüttler inkubiert und anschließend in Fixierer/Entfärber-Lösung

bis zum gewünschten Grad entfärbt, sodass nur die Proteinbanden sichtbar blieben.

Das Gel konnte im Folgenden mithilfe des GelDoc 2000 analysiert und digitalisiert

werden und die Proteinmengen der jeweiligen Spuren konnten im Vergleich zu

mitgeführten Standards (unterschiedliche Mengen an BSA) mit dem Programm

TINA2.0 quantifiziert werden.

3.3.1.3 Autoradiographie

Radioaktiv markierte Proteine können nach ihrer Auftrennung mittels SDS-PAGE

mithilfe einer Bio-Imager-Platte sichtbar und quantifizierbar gemacht werden. Durch

radioaktive Strahlung werden Elektronen in der Platte angeregt. Beim Einlesen im Bio-

Imager Analyzer wird die Platte mit einem Helium-Neon-Laser abgetastet, wodurch die

bereits angeregten Elektronen zusätzlich angeregt werden und dann unter Emission

von Licht in ihren ursprünglichen Energiezustand zurückfallen. Die Daten werden

digitalisiert und am Computer mithilfe der Software TINA2.0 ausgewertet.

Nach der SDS-PAGE wurde das Gel 15 Minuten bei RT in Fixierer/Entfärber-Lösung

auf dem Schüttler inkubiert und anschließend unter Vakuum auf Whatmann-Papier

getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann auf eine Bio-Imager-Platte aufgelegt und

nach einer angemessenen Expositionszeit im Bio-Imager eingelesen und ausgewertet.

Die Expositionszeit variierte zwischen 30 Minuten und mehreren Tagen.

3.3.1.4 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot)

Der Western Blot ermöglicht den spezifischen Nachweis von Proteinen nach einer

SDS-PAGE (3.3.1.1) bis zu einer Nachweisgrenze von 1 pg. Dabei werden die

Proteine irreversibel auf eine PVDF-Membran übertragen und anschließend mithilfe

von Antikörpern nachgewiesen.

Zur Durchführung eines Semi-Dry-Blots (Khyse-Andersen et al., 1984) wurden je drei

Blatt Whatman-Papier (6 x 9 cm) mit Anodenpuffer I, Anodenpuffer II bzw.

Kathodenpuffer befeuchtet. Eine 6 x 9 cm große PVDF-Membran wurde zunächst in

Methanol gegeben, um sie benetzbar zu machen, dann wurde das Methanol durch

Einlegen in dH2O verdrängt und die Membran anschließend in Anodenpuffer II

3 Methoden 57

äquilibriert. Der Western Blot zeigte folgenden Aufbau in einer Fastblot-Apparatur

(Biometra):

Anode (⊕-Pol)

3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer I

3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer II

PVDF-Membran

SDS-PAGE-Gel

3x Whatman-Papier getränkt mit Kathodenpuffer

Kathode ( -Pol)

Durch Überrollen mit einer Pipette wurden Luftblasen entfernt, anschließend erfolgte

der Blot für 105 Minuten bei 0,8 mA / cm2. Zur Absättigung unspezifischer Bindungs-

stellen wurde die Membran in Blockierungspuffer mindestens eine Stunde bei RT oder

über Nacht bei 4 °C inkubiert. Daran schloss sich nach kurzem Waschen der Membran

in PBSdef / 0,1 % Tween 20 eine einstündige Inkubation mit dem spezifischen

Erstantikörper bei RT auf einem Schüttler an, gefolgt von drei Waschschritten à 10

Minuten in PBSdef / 0,1 % Tween 20. Im nächsten Schritt wurde die Membran für eine

Stunde mit einem POD-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert und anschließend 2 x 10

Minuten mit PBSdef / 0,1 % Tween 20 und 4 x 10 Minuten mit PBSdef auf dem Schüttler

bei RT gewaschen. Die Detektion des POD-gekoppelten Zweitantikörpers erfolgte

durch Chemiluminiszenz. Dazu wurde die Membran auf Folie gelegt, pro Blot 500 µl

SuperSignal, bei sehr schwachen Signalen 500 µl FemtoSignal, und 500 µl Luminol /

Enhancer-Lösung gemischt, auf der Membran verteilt und diese mit einer zweiten Folie

bedeckt. Nach fünf Minuten Inkubation bei RT wurden überschüssige Flüssigkeit und

Luftblasen entfernt und der Blot in der Folie eingeschweißt. In der Dunkelkammer

wurde die Membran für fünf Sekunden bis zu einer Stunde je nach Signalstärke auf

einem Röntgenfilm exponiert, anschließend fand die Entwicklung des Filmes mithilfe

des Optimax 2010 statt.

Folgende Antikörperverdünnungen wurden in dieser Arbeit für Western Blot Analysen

verwendet:

α MARV-VP24, Kaninchen, affinitätsgereinigt (3.3.9) 1:10

α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) 1: 2000

α MBGV-GP, Kaninchen (nicht glykosyliert, 3/95,

11.09.1996)

1:1000

-

3 Methoden 58

α MARV-VP40, Maus, monoklonal 1:2000

α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal 1:1000

α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) 1:5000

α MARV-VP30 #249, Meerschweinchen 1:100

α HA 11 16B12, Maus, monoklonal 1:10.000

α α-tubulin, Maus, monoklonal 1:1000

α Lamin A/C sc-7292, Maus, monoklonal 1:500

α Lamp1, Maus, monoklonal 1:100

Ziege α Maus, POD 1:40.000

Ziege α Kaninchen, POD 1:20.000

Ziege α Meerschweinchen, POD 1:20.000

3.3.1.5 Entfernung von gebundenen Antikörpern von bereits analysierten PVDF-Membranen

Sollen PVDF-Membranen ein zweites Mal mit einem anderen Antikörper inkubiert

werden, müssen die bereits zuvor gebundenen Antikörper der ersten Inkubation

entfernt werden, wodurch jedoch auch ein Teil des Proteins auf der Membran verloren

geht.

10 ml des Stripping-Puffers werden frisch mit 68,2 µl β-Mercaptoethanol versetzt und

die PVDF-Membran darin für 30 bis 45 Minuten bei 50 °C im Wasserbad geschwenkt.

Anschließend wurde die Membran 2x fünf Minuten im Waschpuffer für Western Blot

gewaschen. Nach Absättigung unspezifischer Bindungen mit Blockierungspuffer für

eine Stunde war die PVDF-Membran dann zur erneuten Färbung bereit.

3.3.2 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse

Mithilfe der Immunfluoreszenzanalyse kann die intrazelluläre Lokalisation von

Proteinen dargestellt werden. Diese Methode beruht auf zwei Antigen-Antikörper-

Reaktionen. Der Erstantikörper erkennt und bindet das Zielprotein. Der Zweitantikörper

ist gegen den Erstantikörper gerichtet und trägt zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff.

Dieser wird durch das UV-Licht des Fluoreszenzmikroskopes angeregt, wodurch die

Lokalisation des Proteins angezeigt wird.

Für Immunfluoreszenzanalysen wurden zum einen MARV-infizierte Vero-Zellen, zum

anderen HeLa-Zellen benutzt, welche die entsprechenden Proteine mithilfe des

Vaccinia-Virus-Expressionssystems exprimierten (3.2.8). Dazu wurden die Zellen auf

runden Deckgläsern (12 mm) in 6 well-Zellkulturschalen angezüchtet und mit MARV

(3.2.6) bzw. mit MVA-T7 infiziert und dem entsprechenden Plasmid transfiziert. 24

3 Methoden 59

Stunden nach MARV-Infektion bzw. 8 bis 12 Stunden nach der Transfektion wurden

die Zellen fixiert und permeabilisiert (3.2.8.2).

Inkubation mit Antikörpern

Nach einer Permeabilisierung der Zellen durch Triton X-100 erfolgte die Färbung mit

den entsprechenden Antikörpern, verdünnt in Blockierungspuffer.

Zur Inkubation wurden 25 µl des verdünnten Erstantikörpers tropfenförmig auf Parafilm

gegeben und das Deckglas mit der zellbewachsenen Seite nach unten daraufgelegt.

Die Inkubation fand in einer feuchten dunklen Kammer für 1 Stunde statt. Anschließend

wurden die Deckgläser 3x 5 Minuten mit PBSdef gewaschen und für 1 Stunde mit 25 µl

des verdünnten Zweitantikörpers wie oben beschrieben inkubiert. Nach erneutem

dreimaligen Waschen in PBSdef wurden die Deckgläser kurz in dH2O getaucht und mit

der zellbewachsenen Seite nach unten mittels Fluoprep auf einem Objektträger

eingedeckt. Nach einer Stunde Trocknen konnten die Zellen mithilfe des Fluoreszenz-

mikroskopes untersucht werden.

Folgende Antikörperverdünnungen wurden in dieser Arbeit verwendet:

α MARV-VP24, Kaninchen, affinitätsgereinigt 1:2

α HA 11 16B12, Maus, monoklonal 1:1000

α FlagTM M2, Maus, monoklonal 1:50

α c-myc sc-789, Kaninchen 1:100

Ziege α Maus, Rhodamin-gekoppelt 1:100

Esel α Kaninchen, FITC-gekoppelt 1:100

Ziege α Maus FITC-gekoppelt 1:100

Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt 1:100

DAPI 1:100

3.3.3 In vitro Translation

Unter Verwendung von Plasmid-DNA und des TNT® T7 Quick Coupled

Transcription/Translation Kit können Proteine im zellfreien System synthetisiert und

dabei mit [35S]-PromixTM Redivue markiert werden. Das im TNT® T7 Quick Master Mix

enthaltene Kaninchen-Retikulozytenlysat und die T7-RNA-Polymerase vermitteln

sowohl Transkription als auch die Translation von Genen, die unter Kontrolle eines

ein T7-Promotors stehen.

3 Methoden 60

Ansatz: 2 µg Plasmid-DNA mit T7-Promotor

40 µl TNT® T7 Quick Master Mix

2 µl [35S]-PromixTM Redivue (14,3 mCi / ml)

ad 50 µl nukleasefreies dH2O

Der Reaktionsansatz wurde auf Eis zusammen pipettiert und 90 Minuten bei 30 °C

inkubiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und

mittels Bio-Imager-Analyse (3.3.1.1, 3.3.1.3) visualisiert.

3.3.4 Immunpräzipitation

Mittels Immunpräzipitation und Koimmunpräzipitation werden Proteine durch die

Kopplung von Antigen-Antikörper-Komplexen an Protein-A-Sepharose gefällt.

Äquilibrierung von Protein-A-Sepharose:

250 mg Protein-A-Sepharose wurden mit 4 ml Präzipitationspuffer (z.B. KoIP-Puffer)

aufgenommen, gut gemischt und für eine Stunde bei RT inkubiert. Die gequollene

Sepharose wurde anschließend eine Minute bei 5000 UpM pelletiert und dreimal mit je

1 ml Präzipitationspuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde die

Protein-A-Sepharose in 1 Volumenteil entsprechendem Puffer aufgenommen und bei

4 °C gelagert.

Präadsorption

5 µl in vitro Translat wurden zunächst in 500 µl Präzipitationspuffer aufgenommen und

für 30 Minuten bei 4 °C und 13.000 UpM zentrifugiert. Um den Hintergrund an

unspezifischen Proteinen möglichst gering zu halten, wurden die Überstände in neue

1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt und mit 25 µl Protein-A-Sepharose versetzt. Die

Präinkubation erfolgte bei 4 °C für eine Stunde auf dem Überkopfrotierer (ÜKR). Nach

einer zweiminütigen Zentrifugation bei 10.000 UpM wurden die Überstände wiederum

in neue Reaktionsgefäße überführt.

Spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion

Die Überstände wurden bei 4 °C für eine Stunde mit dem / den spezifischen

Antikörper(n) auf dem ÜKR inkubiert.

Eingesetzte Antikörperverdünnungen für die Immunpräzipitation:

α FlagTM M2, Maus, monoklonal 1:500

α VP40, Maus, monoklonal 1:1000

3 Methoden 61

Präzipitation der Antigen-AK-Komplexe durch Kopplung an Protein-A-Sepharose

Die Ansätze wurden nach Zugabe von 25 µl Protein-A-Sepharose bei 4 °C für eine

Stunde auf dem ÜKR inkubiert. Die an Protein-A-Sepharose gebundenen

Immunkomplexe wurden für zwei Minuten bei 3000 UpM abzentrifugiert. Nach

Absaugen der Überstände wurde das Pellet noch zweimal mit 800 µl

Präzipitationspuffer gewaschen und nach der letzten Zentrifugation mit 25 µl 4x

Proteinprobenpuffer versetzt. Die Analyse der Immunpräzipitate erfolgte mittels SDS-

PAGE (3.3.1.1) und dem Bio-Imager (3.3.1.3).

3.3.5 Behandlung von VLPs mit Proteinase K

Um festzustellen, ob Proteine in membranumhüllter Form von Zellen in den

Zellkulturüberstand abgegeben werden, z.B. als virusähnliche Partikel (VLPs), kann

nach Aufreinigung dieser Proteine (3.2.4) ein Proteinase K-Verdau durchgeführt

werden. Proteinase K ist eine sehr reaktive, stabile Serinprotease der Subtilisin-Familie

und in einem breiten Spektrum von Versuchsbedingungen (verschiedene pH-Werte,

Salze, Detergentien und Temperaturen) aktiv. Proteinase K hat ein breites

Spezifitätsspektrum und spaltet Peptidbindungen C-terminal von aliphatischen,

aromatischen oder hydrophoben Aminosäuren. Liegen Proteine membranumhüllt vor,

sind sie für Proteinase K nicht zugänglich, während freie Proteine durch Proteinase K

verdaut werden können.

15 µg der lyophilisierten Proteinase K wurden auf einer Feinwaage eingewogen und in

1 ml PBSdef resuspendiert. Diese Lösung wurde nochmals 1:10 in PBSdef verdünnt,

sodass man eine Endkonzentration von 1,5 µg Proteinase K / ml erhielt. Diese wurde

dann für den Verdau eingesetzt.

Die unter 3.2.4 gereinigten VLPs wurden im Anschluss an die Zentrifugation in PBSdef

resuspendiert und einem Proteinase K-Verdau unterzogen. Dabei wurden 3 Ansätze

pipettiert:

Ansatz I Ansatz II Ansatz II

20 µl VLPs 20 µl VLPs 20 µl VLPs

4,6 µl PBSdef 2,2 µl PBSdef 2,2 µl PBSdef / 1 % Triton X-100

2,4 µl Proteinase K

(c = 1,5 µg/ml)

2,4 µl Proteinase K

(c = 1,5 µg/ml)

Ansatz I wurde nicht Proteinase K behandelt und erhielt somit alle pelletierten Proteine,

freie sowie membranumhüllte. Die Ansätze II und III wurden Proteinase K behandelt,

wobei in Ansatz II ausschließlich nicht umhüllte Proteine angreifbar waren, während in

3 Methoden 62

Ansatz III durch Zusatz von Triton X-100 membranumhüllte Proteine freigelegt wurden

und somit für Proteinase K zugänglich waren. Aufgrund der Vergleichbarkeit wurden

alle Ansätze für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Proteinase K wurde durch

anschließende Zugabe von 1 µl PMSF (100 mM) inaktiviert und die Proben mit 9 µl 4x

Proteinprobenpuffer versetzt. Die so behandelten VLPs wurden mittels Western Blot

(3.3.1.4) analysiert.

3.3.6 Untersuchungen zur Membranassoziation von Proteinen

3.3.6.1 Flotationsanalyse im nichtlinearen Saccharose-Gradienten

Die Flotationsanalyse ist eine Standardmethode, um membranassoziierte Proteine zu

charakterisieren (Bergmann et al., 1988; Chong und Rose, 1993; 1994). In dieser

Arbeit wurde ein nichtkontinuierlicher Saccharosegradient verwendet. HEK293-Zellen

wurden mit LipofectamineTM Plus transfiziert (3.2.2) und anschließend wie unter 3.2.3

beschrieben lysiert. 250 µl des so erhaltenen postnukleären Überstandes wurden mit

250 µl Lysispuffer für Flotationen versetzt und mit 1 ml 90-%iger Saccharoselösung

gemischt, sodass eine 60-%ige Probe entstand. Diese wurde in ein UltraClear-

Zentrifugenröhrchen für SW-60-Rotoren überführt und nacheinander mit 2,2 ml 45-

%iger und 500 µl 10-%iger Saccharoselösung überschichtet. Im Anschluss erfolgte

eine 18-stündige Zentrifugation bei 40.000 UpM und 4 °C. Nach der Zentrifugation

wurden von oben nach unten 9 Fraktionen à 300 µl und 2 Fraktionen à 750 µl

(Ladezone, entspricht der 60-%igen Probe) abgenommen. Die Fraktionen wurden mit

4x Proteinprobenpuffer versetzt und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert

(3.3.1.1, 3.3.1.4).

3.3.6.2 Charakterisierung der Membranassoziation

Der postnukleäre Überstand (PNÜ) wurde wie unter 3.2.3 beschrieben gewonnen und

mit verschiedenen Reagentien behandelt:

Behandlung PNÜ zugesetzte Puffer Inkubationszeit

unbehandelt 250 µl 250 µl Lysispuffer 1 Stunde Eis

hohe Salzkonzentrationen 250 µl 250 µl 4 M KCl 1 Stunde RT

Chelatbildner 250 µl 200 µl Lysispuffer

50 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0

1 Stunde RT

alkalischer pH 250 µl 200 µl Lysispuffer

50 µl Karbonatpuffer pH11

30 min Eis,

+ Puffer, 30 min Eis

3 Methoden 63

Die so behandelten Zelllysate wurden danach wie unter 3.3.6.1 beschrieben einer

Flotation unterzogen und analysiert.

3.3.6.3 Triton X-114 Phasenpartitionierung

Mithilfe einer Triton X-114 Phasenpartitionierung kann untersucht werden, ob ein

membranassoziiertes Protein das Verhalten eines peripheren oder integralen

Membranproteins zeigt (Bordier, 1981). Hierbei wird der postnukleäre Überstand

(3.2.3) mit dem nichtionischen Detergenz Triton X-114 behandelt. Dieses Detergenz

besitzt die Eigenschaft, bei 0 °C in einer Phase mit der wässrigen Umgebung vorzu-

liegen (klares Lysat), während es bei Erwärmung zu einer Separation des Triton X-114

von der wässrigen Umgebung kommt (Eintrübung des Lysats). Während dieses

Phasenübergangs transferiert das Detergenz alle integralen Membranproteine in die

sogenannte Detergentienphase, die von Triton X-114 gebildet wird, während alle

löslichen oder nur peripher an Membranen gebundene Proteine in der wässrigen

Phase verbleiben. Die Proteine des Zelllysats werden somit durch mehrfaches

Extrahieren mittels Triton X-114 in membranintegrierte und lösliche / peripher asso-

ziierte Proteine getrennt.

Für die Phasenpartitionierung wurden HEK293-Zellen in 5 cm-Schalen ausgesät, wie

unter 3.2.2 beschrieben transfiziert und die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion in

250 µl Triton X-114-Lysispuffer geerntet (3.2.3). Der postnukleäre Überstand wurde mit

1 % Triton X-114 versetzt und auf Eis inkubiert bis die Lösung vollständig klar war.

Durch anschließende Zentrifugation bei 14.000 x g und 4 °C für 15 Minuten wurde

unlösliches Material pelletiert. Der Überstand wurde in frische Reaktionsgefäße

überführt und der Phasenpartitionierung unterzogen.

In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß wurden 300 µl des Triton X-114-Saccharose-Kissens

vorgelegt und mit 200 µl des Lysats überschichtet. Durch Inkubation der Probe für drei

Minuten bei 30 °C kam es zur Eintrübung. Diese beruht auf der Trennung von

wässrigem Medium und Triton X-114 (Phasenseparation). Triton X-114 konnte

anschließend durch eine dreiminütige Zentrifugation bei 500 x g und RT pelletiert

werden. Die folgenden Zentrifugationsschritte dienten der vollständigen Trennung von

wässriger und Detergentienphase durch mehrmalige Extraktion.

Von oben wurden im Folgenden 200 µl der wässrigen Phase abgenommen, in einem

frischen 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 0,5 % Triton X-114 versetzt (Trübung bei RT), und

solange auf Eis inkubiert, bis die Lösung wieder klar wurde. Diese 200 µl wurden

erneut auf das zuvor verwendete Triton X-114-Saccharose-Kissen gegeben und wie

oben beschrieben behandelt. Wieder wurde von oben die wässrige Phase (200 µl)

abgenommen (Saccharose-Kissen zur Seite gestellt), mit 0,5 % Triton X-114 versetzt

3 Methoden 64

und auf Eis inkubiert. Anschließend fand eine erneute Zentrifugation, diesmal jedoch

über ein frisches Triton X-114-Saccharose-Kissen statt. Die oberen 200 µl wurden

wiederum abgenommen (Saccharose-Kissen wurde verworfen) und in einem frischen

1,5 ml Reaktionsgefäß mit 70 µl 4x Proteingelpuffer versetzt (wässrige Phase).

Zur Erlangung der Detergentienphase wurde das erste Triton X-114-Saccharose-

Kissen weiter bearbeitet. Dieses zeigte ein deutliches, öliges Pellet am Boden des

Gefäßes (ca. 20 µl). Der Überstand wurde komplett von diesem Pellet entfernt und

dieses dann in 180 µl Lysispuffer resuspendiert. Bis die Trübung verschwunden war

wurden die resultierenden 200 µl Probe erneut auf Eis inkubiert, auf ein frisches 300 µl

Triton X-114-Saccharose-Kissen geschichtet und weiterbehandelt wie oben be-

schrieben. Das resultierende ölige Pellet von ca. 20 µl wurde erneut durch Absaugen

vom Überstand befreit und in 180 µl Lysispuffer resuspendiert sowie mit 70 µl 4x

Proteinprobenpuffer versetzt (Detergentienphase). Die resultierende wässrige sowie

die Detergentienphase wurden mithilfe von Western Blot analysiert (3.3.1.4).

3.3.7 Bakterielle Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen

Mithilfe des Vektors pGEX-6P1, der das Gen für die Glutathion-S-Transferase (GST)

mit anschließender Polylinkerregion trägt, ist es möglich, Fusionsproteine zu

exprimieren, deren N-Terminus aus GST besteht an das sich eine beliebige Protein-

oder Peptidsequenz im C-terminalen Bereich anschließt. Diese Fusionsproteine

können in Bakterien in großem Maßstäben exprimiert und durch Affinitätsreinigung

über den GST-Anteil aufgereinigt werden.

3.3.7.1 Klonierung und bakterielle Expression von GST-VP24

Zur Klonierung eines GST-VP24-Fusionsproteins wurde die VP24-Sequenz mittels

Restriktionsverdau mit BamHI (3.1.3.1) aus dem Konstrukt pTM1-VP24 ausgeschnitten

und über BamHI in den ebenfalls durch Restriktionsverdau linearisierten Vektor pGEX-

6P1 kloniert. Die so hergestellten Plasmide wurden zunächst in E. coli BL21-Zellen

transformiert und auf Agarplatten ausgestrichen (3.1.3.6). Einzelkolonien wurden

mithilfe einer ÜNK vermehrt (3.1.4.1). Anschließend wurden 250 ml LB-Medium

(100 µg / ml Ampicillin) mit 2,5 ml dieser Kultur beimpft und der Ansatz für drei Stunden

bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde die Expression der Fusionsproteine

durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) induziert und der Ansatz für

zwei weitere Stunden bei 37 °C inkubiert. Im Folgenden wurde die

Bakteriensuspension 10 Minuten bei 4 °C mit 6.000 UpM zentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Sediment in 12,5 ml PBSdef, versetzt mit den Complete Protease

Inhibitoren (Roche), aufgenommen. Die Bakterienzellen wurden durch Beschallung mit

3 Methoden 65

einem Branson Stab-Sonifizierer aufgeschlossen. Hierzu wurde die

Bakteriesuspension in einem 50 ml Reaktionsgefäß auf Eis platziert und sechs Mal für

jeweils 20 Sekunden mit einer Pause von 20 Sekunden beschallt. Die

Bakterientrümmer wurden anschließend durch eine zehnminütige Zentrifugation bei

6.000 UpM in einer Heraeus-Zentrifuge sedimentiert. Der Überstand enthielt das

exprimierte Protein und wurde im Weiteren durch Kopplung an Glutathion-Sepharose

aufgereinigt.

3.3.7.2 Kopplung des GST-VP24 an Glutathion-Sepharose

Das in BL21-Zellen exprimierte Fusionsprotein kann aus der Menge der Proteine des

Zelllysats mithilfe von an Sepharose gekoppeltem Glutathion gereinigt werden,

welches durch den GST-Anteil des Fusionsproteins gebunden wird.

Zunächst wurde die Glutathion-Sepharose entsprechend den Anweisungen des

Herstellers aufbereitet, sodass eine 50-%ige Glutathion-Sepharose-Lösung in PBSdef

entstand. 250 µl dieser Lösung wurde dem unter 3.3.7.1 erhaltenen Bakterienlysat

zugegeben und dieser Ansatz eine Stunde bei 4 °C auf dem ÜKR inkubiert.

Anschließend wurde die mit dem GST-Fusionsprotein beladene Sepharose 3x mit je 10

ml PBSdef gewaschen, wobei die Sepharose jeweils bei 500 x g sedimentiert wurde.

Zur Darstellung des gereinigten GST-Fusionsproteins wurde das Sepharose-Pellet mit

125 µl 4x Proteinprobenpuffer versetzt und das GST-Fusionsprotein durch

fünfminütiges Aufkochen bei 95 °C von der Sepharose abgelöst. Diese wurde im

Folgenden bei 14.000 UpM sedimentiert, der Überstand in ein frisches 1,5 ml

Reaktionsgefäß überführt und mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert

(3.3.1.2). Das im Probenpuffer vorliegende Fusionsprotein wurde im Folgenden für die

Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen verwendet.

3.3.8 Immunisierung von Kaninchen und Meerschweinchen

3.3.8.1 Präparation des GST-VP24-Fusionsproteins

Bevor man das Fusionsprotein Tieren zur Produktion von Antikörpern spritzen kann,

muss es speziell aufbereitet werden, um das Versuchstier möglichst wenig mit

chemischen Substanzen zu belasten.

Das unter 3.3.7 erhaltene GST-VP24-Fusionsprotein wurde mithilfe eines präparativen

SDS-Gels aufgetrennt und anschließend auf Nitrozellulose geblottet (3.3.1.4).

Anschließend wurde das Fusionsprotein auf der Blotfolie durch Färbung mit

Ponceaurot (DIG Glycan Differentiation Kit) für fünf Minuten und Entfärbung in dH2O

sichtbar gemacht und mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die so erhaltenen Blotstreifen

3 Methoden 66

wurden für 30 Minuten auf einem Vakuum-Geltrockner vollständig getrocknet,

kleingeschnitten und in 2 ml Reaktionsgefäße überführt. Die Nitrozellulose mit

gebundenem Fusionsprotein wurde durch Zugabe von 500 µl DMSO und gründliches

vortexen gelöst.

3.3.8.2 Immunisierung

Die Immunisierung fand im direkten Anschluss an die Präparation des Antigens (GST-

VP24) statt. Für die erste Immunisierung (19.02.2002) wurde das in DMSO gelöste

Antigen nochmals 1:1 mit komplettem Freundschen Adjuvants versetzt, um eine

möglichst starke Immunreaktion bei den Tieren zu erreichen. Bei den

Folgeimmunisierungen wurde das in DMSO gelöste Antigen 1:1 mit inkomplettem

Freundschen Adjuvants versetzt, um eine erfolgte Immunantwort weiter zu boostern.

Es wurden ein Kaninchen sowie zwei Meerschweinchen nach folgendem Schema

immunisiert:

Datum Tier (Anzahl) Antigen GST-VP24 Blutentnahme AK-test

19.02.02 Kaninchen (1)

Meerschweinchen (2)

500 µl (DMSO + kompl. Adjuvans)

je 250 µl (DMSO + kompl. Adjuvans)

Ja, Präserum

Ja, Präserum

negativ

negativ


Meerschweinchen (2)

500 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)

je 250 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)

Nein

Nein

-

-


Meerschweinchen (2)

1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)


Ja

Nein

negativ

-


Meerschweinchen (2) 1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)


Ja

Ja

negativ

negativ


Meerschweinchen (2) 1000 µl (DMSO + inkompl. Adjuvans)


Ja

Nein

schwach

-

03.06.02 Kaninchen (1) - Ja positiv


Meerschweinchen (2) -

-

Ausbluten

Ausbluten

positiv

negativ

3.3.8.3 Aufbereitung der Seren und Antikörpernachweis

Um festzustellen, ob die Immunisierung erfolgreich war und die behandelten Tiere

Antikörper gegen das verabreichte Antigen produzierten, wurde zu verschiedenen

Zeitpunkten Blut entnommen. Dieses wurde für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert und der

geronnene Blutkuchen anschließend für 15 Minuten bei 6000 UpM in einer Heraeus-

3 Methoden 67

Zentrifuge sedimentiert. Das Serum wurde abgenommen, aliquotiert und bei – 20 °C

gelagert.

Die Reaktivität der Seren gegenüber VP24 wurde mittels Western Blot getestet. Dazu

wurde MARV-Antigen mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membran

geblottet. Der Blot wurde in ca. 0,5 cm breite Streifen geschnitten und diese mit

verschiedenen Verdünnungen des jeweiligen Serums inkubiert (3.3.1.4).

3.3.9 Affinitätsreinigung des VP24-Antikörpers

Um die unspezifische Bindung von Serumbestandteilen an andere Proteine und somit

den Hintergrund in Western Blot und Immunfluoreszenz zu verringern, wurde eine

Affinitätsreinigung durchgeführt. Hierbei wird aus dem Serum nur der gewünschte,

spezifische Antikörper aufgereinigt.

Zunächst wurde eine MARV-Präparation aus dem Sicherheitslabor mit MARV-Antigen

auf einem präparativen SDS-Gel aufgetrennt (3.3.1.1), auf eine PVDF-Membran

geblottet (3.3.1.4) und die einzelnen viralen Proteine mittels Ponceaurot sichtbar

gemacht. Die Bande des VP24 wurde ausgeschnitten und zur Fixierung der Proteine

bei RT vollständig getrocknet. Diese Blotstreifen konnten nach Bedarf direkt

weiterverwendet oder bei -20 °C gelagert werden.

Vor der Affinitätsreinigung wurden die Blotstreifen kurz in Methanol geschwenkt, um sie

für Wasser benetzbar zu machen und anschließend wurde unzureichend gebundenes

Protein durch fünfminütiges Waschen in saurem Glycin-Puffer entfernt. Nach

zweimaligem Waschen in TBS wurde die Membran durch eine einstündige Inkubation

in TBS-B bei RT blockiert, anschließend wiederum zweimal in TBS gewaschen und

kleingeschnitten in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. 2 ml Kaninchenserum wurden

mit 8 ml TBS verdünnt, zu dem zerschnittenen Blotstreifen gegeben und mit diesen für

drei Stunden bei RT auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurde die Serum-

verdünnung abgenommen und zu 4 °C gestellt und es folgte 2x fünfminütiges Waschen

der Blotstücke in TBS und 2x fünf Minuten in PBSdef. Zur Elution der gebundenen

Antikörper wurden die Blotstücke für 10 Minuten in 1 ml saurem Glycin-Puffer bei RT

inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der Glycin-Puffer abgenommen, in ein 1,5 ml

Reaktionsgefäß überführt und mit 1 M Tris/HCl, pH 8,0 auf einen pH-Wert von 7,0

neutralisiert. Der Elutionsschritt wurde ein zweites Mal wiederholt, die neutralisierten

Eluate vereinigt und mit BSA (Endkonzentration 1 mg / ml) sowie 5 mM NaN3 versetzt.

Anschließend konnte ein zweiter Aufreinigungsschritt mit der bei 4 °C gelagerten

Serum-TBS-Verdünnung durchgeführt werden. Der so gereinigte Antikörper wurde im

Folgenden für Western Blot und Immunfluoreszenzanalysen verwendet.

4 Ergebnisse 68

4 Ergebnisse

Ziel dieser Arbeit war es, das virale Protein VP24 des Marburgvirus zu charakterisieren

und dessen Rolle im viralen Vermehrungszyklus näher zu betrachten. Neben der

intrazellulären Lokalisation sowie Kolokalisation mit anderen Virusproteinen stand

außerdem die Untersuchung typischer Eigenschaften von Matrixproteinen im

Vordergrund. Mithilfe von RNA Interferenz sollte schließlich die Rolle von VP24 in der

Virusinfektion betrachtet werden.

4.1 Immunfluoreszenzanalyse zur intrazellulären Lokalisation von VP24

4.1.1 Klonierung Epitop-markierter VP24-Mutanten

Ein Antikörper zur immunologischen Detektion von VP24 in Western Blot- und

Immunfluoreszenzanalysen war zu Beginn dieser Arbeit nicht vorhanden. Durch die

Herstellung verschiedener Epitop-markierter Mutanten sollte VP24 mithilfe von

käuflichen Antikörpern detektiert werden.

VP24 wurde jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, einem HA- oder einem myc-

Epitop versehen (Abbildung 6).

VP24Flag

VP24HA

VP24myc

VP24 Flag

VP24 HA

VP24 myc

Sequenzen der Epitope:Flag-tag: N‘-DYKDDDK-C‘ HA-tag: N‘-YPYDVPDYA-C‘ myc-Tag: N‘-EQKLISEEDL-C‘

*

Flag-VP24

HA-VP24

myc-VP24

VP24-Flag

VP24-HA

VP24-myc

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten.VP24 wurde zur immunologischen Detektion jeweils N- bzw. C-terminal mit einem Flag-, HA-oder myc-Epitop versehen. Die *-markierte Mutante VP24-Flag existierte bereits (Bamberg,2000). Die Aminosäuresequenzen der verschiedenen Epitope sind im unteren Teil derAbbildung vermerkt.

4 Ergebnisse 69

Die Grundlage für die Klonierung war das bereits vorhandene Plasmid pTM1-VP24,

welches die Sequenz des VP24 unter Kontrolle eines T7-Promotors enthält (Bamberg,

2000). Die eingesetzten Primer wurden so synthetisiert, dass sie neben der VP24-

spezifischen Sequenz außerdem die kodierende Sequenz des einzufügenden Epitops

enthielten sowie eine BamHI-Schnittstelle für die Klonierung. Abbildung 7 zeigt den

schematischen Verlauf der Klonierung.

Die Sequenz der Plasmide wurde durch Sequenzierung (3.1.2.3) verifiziert.

Abbildung 7: Klonierung der Epitop-markierten MARV-VP24-Mutanten. Durch die PCR-Amplifikation wurde VP24 entweder N- oder C-terminal mit den kodierendenSequenzen des Flag-, HA- bzw. myc-Epitops versehen. Die PCR-Fragmente sowie derZielvektor pTM1 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Nach Behandlung derVektor-DNA mit alkalischer Phosphatase (CIP) wurden die aufbereiteten PCR-Fragmentemit diesem ligiert.

PCR

pTM1

BamHIBamHI

pTM1

BamHIBamHI

BamHITag-VP24Tag-VP24

BamHI

Tag-VP24

pTM1pTM1

pTM1-tag-VP24

Tag-VP24Tag-VP24Tag-VP24

Ligation

BamHIBamHI

Vorwärtsprimer#1107, 1108, 1109, 125

5' 3' Rückwärtsprimer#174, 1110, 1111VP24

3' 5'

pTM1-VP24

Konstrukte:pTM1-Flag-VP24pTM1-HA-VP24pTM1-myc-VP24pTM1-VP24-HApTM1-VP24-myc

Verdau mit BamHICIP-

Behandlung

Verdau mit BamHI

4 Ergebnisse 70

4.1.2 Immunfluoreszenzanalysen der Epitop-markierten VP24-Mutanten

Die unter 4.1.1 erstellten VP24-Mutanten sowie pTM1-VP24-Flag wurden im

Folgenden auf ihre intrazelluläre Verteilung hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden

subkonfluente HeLa-Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde

nach Infektion jeweils mit 1 µg der entsprechenden Plasmid-DNA (pTM1-Flag-VP24,

pTM1-HA-VP24, pTM1-myc-VP24, pTM1-VP24-Flag, pTM1-VP24-HA, pTM1-VP24-

myc) transfiziert (3.2.8.1). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert,

permeabilisiert und mit den entsprechenden Antikörpern gefärbt (3.2.8.2, 3.3.2). Die

Mutanten wurden mit monoklonalen AK gegen das Flag-Epitop, das HA-Epitop oder

mittels eines polyklonalen α myc Kaninchen-AK markiert. Durch Inkubation mit

Rhodamin-gekoppelten α Maus- bzw. α Kaninchen-AK wurden die Proteine im

Fluoreszenzmikroskop detektierbar. Während der Inkubation mit dem Zweitantikörper

wurde der Zellkern zusätzlich durch eine DAPI-Färbung markiert.

Die Immunfluoreszenzanalysen der exprimierten VP24-Mutanten sind in Abbildung 8

dargestellt.

Mock WT VP24-Mutanten

Flag- VP24 VP24-Flag

HA- VP24 VP24-HA

myc- VP24 VP24-myc

A

B

C

WT

WT

WT

Mock

Mock

Mock

α Flag

α HA

αmyc

1 2 3 4

4 Ergebnisse 71

Vergleicht man die intrazelluläre Verteilung der VP24-Mutanten, so fällt auf, dass die

verschiedenen Epitope die zelluläre Lokalisation des VP24 unterschiedlich

beeinflussen. So zeigte die Expression des Flag-markierten VP24 (Abbildung 8, A3

und A4) eine eher netzartige, zytoplasmatische Verteilung, während das HA-markierte

VP24 eher zu punktförmigen Aggregaten im zellkernnahen Bereich neigte und weniger

strukturiert im Zytoplasma zu finden war (B3 und B4). Die Verteilung des myc-

markierten VP24 (C3 und C4) ähnelte wiederum eher der der Flag-markierten-

Mutanten, wobei es hier bei VP24-myc ebenfalls zur Ausbildung kleinerer Aggregate

kam, ähnlich denen der HA-markierten Mutanten. Nicht nur der Einsatz verschiedener

Epitope beeinflusste die Verteilung des VP24, sondern auch die Lokalisation des

Epitops im Protein selbst, d.h. ob es N- oder C-terminal vorlag. Dieser Einfluss wurde

vor allem im Unterschied zwischen HA-VP24 und VP24-HA deutlich. HA-VP24 zeigte

eine wesentlich stärker aggregierte Verteilung, während VP24-HA sowohl Aggregate

als auch eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufwies. Unterschiede in der

Verteilung zeigten auch myc-VP24 und VP24-myc, wobei die C-terminale Markierung

kleine Aggregate aufwies, welche bei N-terminalem myc-Epitop nicht zu beobachten

waren. Durch die Verwendung von verschiedenen Epitopen am C- bzw. N-Terminus

des VP24 ist es daher schwierig auf die Verteilung des WT-VP24 zu schließen.

4.1.3 Herstellung und Aufreinigung von VP24-spezifischen Antikörpern

Um die intrazelluläre Verteilung von WT-VP24 sichtbar zu machen war ein spezifischer

AK gegen das VP24 notwendig. Durch Immunisierung eines Kaninchens (3.3.8) mit

einem bakteriell exprimierten Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und

VP24 (3.3.7) war es möglich, ein MARV-VP24-spezifisches Serum zu erhalten. Dieses

zeigte jedoch im Western Blot nur mäßige Ergebnisse aufgrund starker

Hintergrundfärbung (Abbildung 9 A) und in der Immunfluoreszenz keine bis schwache

VP24-spezifische Signale, ebenfalls mit hoher Hintergrundfärbung der Zellen. Daher

war es notwendig, den VP24-spezifischen Antikörper aufzureinigen. Hierzu wurde

MARV-VP24-Antigen aus Viruspartikeln mittels SDS-PAGE augetrennt und auf PVDF-

Membran geblottet. Durch Färbung mit Ponceaurot wurden die viralen Proteinbanden

Abbildung 8: Immunfluoreszenzanalyse der Epitop-markierten VP24-Mutanten. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und mit den Plasmiden pTM1-Flag-VP24, pTM1-HA-VP24, pTM1-myc-VP24, pTM1-VP24-Flag, pTM1-VP24-HA oder pTM1-VP24-myc transfiziert. 12 h nach Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mitAntikörpern gefärbt. A: Expression der Flag-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit demmonoklonalen α Flag-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. B: Expression der HA-markierten VP24-Mutanten, Färbung mit dem monoklonalen α HA-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Maus-AK. C: Expression der myc-markierten VP24-Mutanten, Färbung mitdem polyklonalen α myc-AK und Rhodamin-gekoppeltem α Kaninchen-AK.

4 Ergebnisse 72

sichtbar gemacht und nur die Bande des VP24 ausgeschnitten (3.3.1.4). Mithilfe der so

erhaltenen VP24-Blotstreifen konnten die VP24-Antikörper wie unter 3.3.9 beschrieben

aufgereinigt werden. Blotstreifen die das Fusionsprotein GST-VP24 trugen konnten

hierbei nicht verwendet werden, da die Möglichkeit bestand, neben den VP24-

spezifischen auch GST-Antikörper aufzureinigen, welche dann potentielle

Hintergrundfärbungen verursachen könnten.

Abbildung 9 zeigt die spezifische VP24-Färbung im Western Blot durch das

unbehandelte Kaninchenserum (A) im Vergleich zum affinitätsgereinigten VP24-AK (B).

Die Aufreinigung des VP24-AK zeigte eine deutliche Verminderung des Hintergrunds

im Western Blot und sollte im Folgenden auf die Funktionalität in der

Immunfluoreszenzanalyse hin untersucht werden.

4.1.4 Immunfluoreszenzanalyse des VP24

Um die intrazelluläre Verteilung von VP24 zu zeigen, wurden subkonfluente HeLa-

Zellen mit dem Vaccinia-Virus MVA-T7 infiziert und eine Stunde nach Infektion mit 1 µg

pTM1-VP24 transfiziert (3.2.8). Die Zellen wurden 12 Stunden nach der Infektion fixiert,

permeabilisiert (3.2.8.2) und mit dem affinitätsgereinigten VP24-Antikörper (3.3.9) in

einer Verdünnung von 1:2 angefärbt. Durch Inkubation mit einem Rhodamin-

Abbildung 9: Vergleich des VP24-spezifischen Kaninchenserum und desaffinitätsgereinigten VP24-AK. MARV-Antigen wurde mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membran geblottet und dieMembran in Streifen geschnitten. Die Blotstreifen wurden im folgenden mit verschiedenen AK-Verdünnungen des VP24-spezifischen Kaninchenserums sowie des affinitätsgereinigtenVP24-AK gefärbt. Als Zweitantikörper diente ein POD-gekoppelter α Kaninchen-AK. A:Färbung mit einer 1:100 (1) und 1:500 Verdünnung (2) des VP24-spezifischen Kaninchen-serum. B: Färbung mit einer 1:50 (3) und 1:100 Verdünnung (4) des affinitätsgereinigtenVP24-AK.

A BVP24-spezifischesKaninchen-Serum

1:100 1:500

gereinigter VP24-AK

1:50 1:100

1 2 3 4

VP24 VP24

4 Ergebnisse 73

gekoppelten α Kaninchen-AK wurde VP24 sichtbar gemacht und mithilfe des

Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-Kamera fotografiert.

Die intrazelluläre Verteilung von VP24 in Hela-Zellen ist in Abbildung 10 dargestellt.

VP24 zeigte eine punktförmige Aggregation in zellkernnahen Bereichen, jedoch nur

eine schwache Färbung des Zytoplasmas. Vergleicht man die Lokalisation von VP24

mit den unter 4.1.2 beschriebenen Epitop-markierten Mutanten, so fällt auf, dass die

Epitope einen deutlichen Einfluss auf die Lokalisation des VP24 haben und von der

Verteilung des WT-VP24 zum Teil stark abweichen. Lediglich die N-terminal mit HA-

markierte Mutante zeigte eine sehr ähnliche Verteilung in der Immunfluoreszenz und

wurde daher in weiteren Versuchen verwendet.

4.2 Untersuchungen zur Membranassoziation von VP24

Im Folgenden sollte untersucht werden, ob das VP24 mit intrazellulären Membranen

assoziiert vorliegt, und wenn ja, wie diese Interaktion beschaffen ist. Integrale

Membranproteine benötigen mindestens eine hydrophobe Transmembrandomäne in

der Polypeptidkette, mit der sie in der Membran verankert sind und können nur durch

die Behandlung mit Detergenzien aus der Membran isoliert werden. Periphere

Membranproteine lassen sich im Gegensatz dazu von der Membran dissoziieren, ohne

diese zu zerstören. Für das VP24 des MARV gibt es keine Hinweise auf eine

Transmembrandomäne.

4.2.1 Interaktion von VP24 mit zellulären Membranen

Die Flotationsanalyse ist eine Standardmethode, um membranassoziierte Proteine zu

charakterisieren (Bergmann and Fusco, 1988; Chong and Rose, 1993; 1994). Das

Prinzip der Flotationsanalyse beruht auf der Eigenschaft von Membranen, während

Abbildung 10: Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression des WT-VP24. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und dem Plasmid pTM1-VP24transfiziert. 12 h nach Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit demaffinitätsgereinigten α VP24-AK sowie einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AKgefärbt. 1 + 2 zeigen die Hintergrundkontrollen, 3 + 4 die spezifische VP24-Färbung.

α VP24α VP24 α VP24 α VP24α VP24 α VP24α VP24

Mock WT MARV-VP24

1 2 3 4

4 Ergebnisse 74

einer Gleichgewichtszentrifugation aufgrund ihrer Schwebedichte in einem

Stufengradienten (60 % - 45 % - 10 %) in die Interphase der hoch (45 %) und niedrig

(10 %) konzentrierten Gradienten-Medien zu flotieren. Lösliche Proteine verbleiben in

der 60-%igen Lösung.

Für diese Untersuchung wurden zunächst die kodierenden Sequenzen für das VP24

und das HA-VP24 durch Restriktionsverdau und Ligation (3.1.3.1, 3.1.3.4) aus dem

Vektor pTM1 in den Vektor pCAGGS übertragen. Die VP24-Sequenzen stehen im

pCAGGS-Vektor unter der Kontrolle des β-Chicken-Actin-Promotors, der eine

Expression dieser Proteine in Abwesenheit des Helfervirus MVA-T7 ermöglicht.

Für die Flotationsanalyse wurden HEK293-Zellen mit pCAGGS-VP24 bzw. pCAGGS-

HA-VP24 transfiziert (3.2.2) und 24 Stunden p.t. geerntet, lysiert und der postnukleäre

Überstand für die Flotationsanalyse eingesetzt (3.3.6.1). Der Gradient wurde nach der

Ultrazentrifugation fraktioniert und die einzelnen Fraktionen mithilfe von SDS-PAGE

und Western Blot analysiert (3.3.1.4).

Abbildung 11 zeigt die Membranassoziation von VP24 und HA-VP24. Als Kontrolle für

die Flotation der Membranen innerhalb des Gradienten wurde das integrale

Membranprotein Lamp-1 (lysosome-associated membrane protein 1) angefärbt

(Abbildung 11 A), welches, wie erwartet, gemeinsam mit den Membranen in die oberen

Fraktionen 2 und 3 flotierte. Das vorwiegend zytoplasmatisch lokalisierte Protein

Abbildung 11: Flotationsanalyse des WT-VP24 und HA-VP24. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-VP24 bzw. pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24h p.t.geerntet und einer Flotationsanalyse unterzogen. Darstellung der fraktionierten Gradientenvon oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Färbung mitα Lamp-1-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK, B: Färbung mit α Annexin II-AK und POD-gekoppeltem α Maus-AK, C: Färbung mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK und POD-gekoppletem α Kaninchen-AK, D: Färbung mit dem α HA-AK und POD-gekoppeltemα Maus-AK.

Lamp-1 110 kD

VP24 28 kD

29,8 kDHA-VP24

36 kDAnnexin II

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten

A

B

C

D

4 Ergebnisse 75

Annexin II diente als Kontrolle für ein lösliches Protein, welches nicht in der Lage ist zu

flotieren (Abbildung 11 B). Vergleicht man das Flotationsverhalten von VP24 und HA-

VP24, so sieht man, dass sich beide Proteine, wie auch in der Immunfluoreszenz,

ähnlich verhielten. Beide Proteine zeigten eine schwache Tendenz zur Interaktion mit

Membranen (Fraktionen 1 bis 4), der weitaus größere Anteil der Proteine lag jedoch in

löslicher Form vor (Fraktionen 9 bis 11). In diesem Verhalten unterscheidet sich VP24

deutlich von dem des Matrixproteins VP40, welches eine starke Membranassoziation

zeigt (Kolesnikova et al., 2002).

4.2.2 Charakterisierung der Membraninteraktion

Peripher assoziierte Membranproteine können durch verschiedene Behandlungen von

Membranen abgelöst werden. Ihr Verhalten lässt dabei einen Rückschluss auf die

Beschaffenheit der Membraninteraktion zu (Chong und Rose, 1993). Durch alkalischen

pH werden Membranvesikel in Membranblätter transformiert, wodurch lösliche Proteine

freigesetzt werden, die in den Vesikeln eingeschlossen waren (Fujiki et al., 1982).

Hohe Salzkonzentrationen schirmen Ladungen und schwache ionische

Wechselwirkungen ab, die periphere Proteine direkt oder indirekt über andere

Membranproteine an Membranen binden. Chelatbildner stören Membranassoziationen,

die durch divalente Kationen-Brücken vermittelt werden (Kretzschmar et al., 1996). Im

Folgenden sollte untersucht werden, wie die schwache Interaktion des VP24 mit

Membranen beschaffen ist. Da sich VP24 und HA-VP24 in der Flotationsanalyse gleich

verhielten, wurden die folgenden Experimente aufgrund der besseren Detektierbarkeit

mittels des monoklonalen HA-Antikörper mit HA-VP24 durchgeführt. Zur näheren

Charakterisierung der Membranassoziation wurde der postnukleäre Überstand von HA-

VP24-transfizierten HEK293-Zellen mit verschiedenen Lösungen (2 M KCl, 50 mM

EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11) behandelt (3.3.6.2) und einer Flotation unterzogen.

Zur Kontrolle wurde ein Ansatz nicht behandelt.

2 M KCl

50 mM EDTA

HA-VP24

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten

HA-VP24

HA-VP24 Karbonatpuffer pH11

HA-VP24 ∅A

B

C

D

4 Ergebnisse 76

Das unbehandelte HA-VP24 bindet, wie bereits unter 4.2.1 gezeigt, nur schwach an

Membranen und befindet sich vor allem als lösliches Protein im unteren Teil des

Gradienten (Abbildung 12 A). Durch die Behandlung mit 2 M KCl (B) und 50 mM EDTA

(C) lässt sich das VP24 nicht von der Membran ablösen, KCl scheint die Bindung eher

zu unterstützen. Die Inkubation mit Karbonatpuffer jedoch verringert den Anteil von

VP24 in den Membranfraktionen, was darauf hinweist, dass sich ein Teil des flotierten

VP24 eingeschlossen in Membranvesikeln befinden könnte und durch diese

Behandlung freigesetzt wird.

4.2.3 Membranassoziation von VP24 in Anwesenheit von VP40 oder GP

Wie unter 4.2.1 gezeigt, hat VP24 nur eine schwache Tendenz mit zellulären

Membranen zu interagieren, während das MARV-spezifische periphere

Membranprotein VP40 sowie das Oberfächenprotein GP als integrales

Membranprotein stark mit Membranen assoziiert vorliegen. Aufgrund der Lokalisation

des VP24 im Matrixraum der Virionen erschien eine Interaktion mit VP40 und GP

wahrscheinlich. Eine Interaktion von VP24 mit dem zytoplasmatischen Anteil des GP

konnte bereits in GST-Kosedimentationsexperimenten nachgewiesen werden

(Bamberg, 2000). Um zu untersuchen, ob VP24 durch die Anwesenheit von VP40 oder

GP an die Membranen rekrutiert werden kann, wurden diese Proteine jeweils in

HEK293-Zellen koexprimiert und wie zuvor beschrieben einer Flotationsanalyse

unterzogen.

Abbildung 12: Charakterisierung der Membranassoziation von HA-VP24. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-HA-VP24 transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜmit 2 M KCl, 50 mM EDTA bzw. Karbonatpuffer pH 11 behandelt. Anschließend wurde eineFlotationsanalyse durchgeführt. Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nachunten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. Die Färbung erfolgte miteinem HA-AK sowie einem POD-gekoppelten α Maus-AK. A: unbehandelter PNÜ. B:Behandlung mit 2 M KCl. C: Behandlung mit 50 mM EDTA. D: Behandlung mitKarbonatpuffer pH 11.

Lamp-1 110 kD1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11oben unten

VP40 33,8 kD

29,8 kDHA-VP24

A

4 Ergebnisse 77

Abbildung 13 A zeigt die Verteilung von VP24 und VP40 im Gradienten nach der

Zentrifugation. Als Kontrollprotein für die Membranfraktionen diente wiederum Lamp-1.

VP40 zeigte die erwartete starke Assoziation mit den zellulären Membranen, während

sich das Membranbindungsverhalten von VP24 auch in Anwesenheit von VP40 nicht

veränderte. Daraus lässt sich schließen, dass VP40 nicht in der Lage ist, VP24 in

diesem Flotationsassay an zelluläre Membranen zu rekrutieren.

Die Koexpression von GP und HA-VP24 (Abbildung 13 B) zeigte die erwartete

Flotation des GP als integrales Membranprotein in die oberen Fraktionen (1 bis 4),

während HA-VP24 im Vergleich zur singulären Expression auch hier keine größere

Membranaffinität zeigte. GP scheint daher ebenfalls in der Flotation keinen Einfluss auf

die Interaktion des VP24 mit Membranen zu haben.

4.2.4 Untersuchungen zur Membranintegration des VP24

Durch eine Triton X-114 Phasenpartitionierung lässt sich unterscheiden, ob ein

membranassoziiertes Protein als peripheres oder integrales Membranprotein vorliegt

(3.3.6.3), da dieses Detergenz die Eigenschaft besitzt, bei 0 °C in einer Phase mit der

wässrigen Umgebung vorzuliegen, während es bei Erwärmung zu einer Separation des

Triton X-114 von der wässrigen Umgebung kommt. Während dieses Phasenübergangs

transferiert das Detergenz alle integralen Membranproteine in die sogenannte

Detergentienphase, die von Triton X-114 gebildet wird, während alle löslichen oder nur

peripher an Membranen gebundene Proteine in der wässrigen Phase verbleiben.

Für VP40 konnte bereits gezeigt werden, dass es sich um ein peripheres

Membranprotein handelt, welches sich ausschließlich in der wässrigen Phase der

Abbildung 13: Membranassoziation von HA-VP24 bei Koexpression von VP40 bzw. GP.HEK293-Zellen wurden mit 1 µg pCAGGS-HA-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,5 µgpCAGGS-GP transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Flotationsanalyse unterzogen.Darstellung der fraktionierten Gradienten von oben nach unten (Fraktion 1 bis 11) durch SDS-PAGE und Western Blot. A: Flotation von VP40 und HA-VP24 nach Koexpression. B:Flotation von GP und HA-VP24 nach Koexpression.

B

GP1 160 kD

HA-VP24 29,8 kD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10oben unten

11

4 Ergebnisse 78

Partitionierung befindet (Kolesnikova et al., 2002). Das Verhalten von VP24 sollte hier

im Vergleich zu VP40 untersucht werden.

HEK293-Zellen wurden entweder mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder mit beiden

Plasmiden im Verhältnis 1:1 transfiziert und 24 Stunden p.t. geerntet (3.2.2). Der PNÜ

wurde anschließend einer Triton X-114 Phasenpartitionierung unterzogen, wie sie

unter 3.3.6.3 beschrieben ist. Abbildung 14 zeigt die Western Blot Analyse der

wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D).

In Abbildung 14 A sind als zelluläre Kontrollproteine das Lamp-1 sowie Annexin II

gezeigt. Lamp-1 zeigte als integrales Membranprotein, wie erwartet, die vollständige

Anwesenheit in der Detergentienphase, während Annexin II als vorwiegend lösliches

Protein ausschließlich in der wässrigen Phase zu finden war. Betrachtet man nun die

Verteilung von VP24, so zeigte sich, dass es zu gleichen Teilen in der wässrigen als

auch in der Detergentienphase vertreten war. Abbildung 14 B zeigt zur Kontrolle die

Partitionierung des VP40, welches sich, wie bereits beschrieben, ausschließlich in der

wässrigen Phase wiederfand. Auch die Koexpression des VP24 gemeinsam mit dem

VP40 (C) änderte nichts an der Verteilung beider Proteine in der

Phasenpartitionierung. VP24 zeigte somit das Verhalten eines partiell

membranintegrierten Proteins, während die Sequenz des VP24 jedoch weder eine

Signalsequenz für die Translokation in das ER noch eine potentielle

Transmembrandomäne aufweist.

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

Lamp-1

Annexin II

VP24

W D

Lamp-1

VP40

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

W D220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

VP40

Lamp-1

VP24

W D

A B C

1 2 1 2 1 2

Abbildung 14: Triton X-114 Phasenpartitionierung von VP24 und VP40. HEK293-Zellen wurden einzeln und in Kombination mit pCAGGS-VP24 und pCAGGS-VP40transfiziert, 24 h p.t. geerntet und der PNÜ einer Phasenpartitionierung unterzogen.Darstellung der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D) durch SDS-PAGE undWestern Blot. A: Partitionierung von singulär exprimiertem VP24. B: Partitionierung vonsingulär exprimiertem VP40. C: Partitionierung von VP24 und VP40 nach Koexpression.

4 Ergebnisse 79

Es stellte sich daher die Frage, ob diese potentiell membranintegrierte Form auch in

reifen MARV-Partikeln zu finden ist. Daher wurden aufgereinigte Marburgvirus-Partikel

im Sicherheitslabor ebenfalls einer Phasenpartitionierung (3.3.6.3) unterzogen und

mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

Die Phasenpartitionierung der MARV-Partikel (Abbildung 15) ergab, dass sich die

Virusproteine VP24 und VP40, welche mit reifen Partikeln ausgeschleust werden,

genauso verhielten wie die transient exprimierten Proteine. Offenbar werden beide

Formen des VP24, die lösliche sowie die tendenziell membranintegrierte bei der

Virusreifung eingebaut.

4.3 Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs)

Für eine Reihe von Viren konnte bisher gezeigt werden, dass eine transiente

Expression von einzelnen oder mehreren viralen Proteinen zur Bildung von

virusähnlichen Partikeln, sogenannten „virus-like particles“ (VLPs) führt. Sie imitieren

strukturell reife virale Partikel, enthalten jedoch kein genomisches Material (Noad and

Roy, 2003). Bei vielen NNS-RNA-Viren führt die singuläre Expression der

Matrixproteine zu der Freisetzung von VLPs (Paramyxoviren [Takimoto et al., 2001;

Coronel et al., 1999]; Rhabdoviren [Li et al., 1993; Justice et al., 1995]; Retroviren

[Garnier et al., 1996]). Sowohl für das VP40 des Ebolavirus, als auch für das

Marburgvirus konnte bereits gezeigt werden, dass VP40 in der Lage ist, seine eigene

Freisetzung in Form von VLPs zu vermitteln, welche die typische filamentöse Gestalt

der reifen Filoviren zeigen. Auch GP ist bei singulärer Expression in der Lage, VLPs zu

bilden, allerdings handelt es sich hierbei um ca. 100 nm große, sphärische Partikel, die

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

VP40

VP24

W D

Abbildung 15: Triton X-114 Phasenpartitionierung von MARV-Partikeln. Gereinigte MARV-Partikel wurden wie unter 3.3.6.3 beschrieben einer Phasenpartitionierungunterzogen. Darstellung der wässrigen (W) sowie der Detergentienphase (D) durch SDS-PAGE und Western Blot. Färbung der viralen Proteine VP24 und VP40.

4 Ergebnisse 80

das Oberfächenprotein GP tragen. Des Weiteren ist gezeigt, dass VP40 in der Lage ist

GP in die von VP40 gebildeten, filamentösen VLPs zu rekrutieren (Noda et al., 2002;

Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b).

4.3.1 Bildung von VLPs durch Einzelexpression von VP40, GP und VP24

Zunächst stellte sich die Frage, ob VP24 als potentielles zweites Matrixprotein der

Filoviren ebenfalls in der Lage ist, VLPs zu bilden, wie es für die Matrixproteine vieler

Vertreter der Mononegavirales gezeigt werden konnte. Für das EBOV-VP24 ist bereits

eine Freisetzung in membranumhüllter Form in den Zellkulturüberstand beschrieben

(Han et al., 2003). Um ein solches Verhalten für das MARV-VP24 zu untersuchen,

wurde WT-VP24 transient in HEK293-Zellen exprimiert und der Zellkulturüberstand 48

Stunden p.t. auf die Anwesenheit von VLPs hin untersucht. Hierzu wurde partikuläres

Material aus dem Überstand durch eine dreistündige Zentrifugation über ein

Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Um sicherzustellen, dass es sich bei den

pelletierten Proteinen wirklich um membranumhüllte VLPs handelte und nicht um

Membrandebris mit assoziierten Proteinen oder Proteinaggregate, wurde ein

Proteinase K-Verdau durchgeführt (3.3.5). Das resuspendierte Pellet wurde in drei

Ansätze geteilt, einer blieb unbehandelt (PBSdef), der zweite wurde mit Proteinase K

versetzt. Hier erwartet man den Abbau aller Proteine, die nicht durch eine Membran

geschützt vorliegen, und kann somit im Vergleich zum ersten Ansatz den Anteil an

pelletiertem Protein von membranumhülltem Protein unterscheiden. Als Kontrolle

wurde der dritte Ansatz neben Proteinase K zusätzlich mit dem Detergenz Triton X-100

versetzt, welches die Membranen zerstört und somit auch membranumhülltes Protein

der Protease zugänglich macht. Als Kontrollen für die Funktionalität der VLP-Reinigung

sowie des Proteinase K-Verdaus wurden VP40 bzw. GP parallel exprimiert. Die VLPs

wurden im Anschluss mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot analysiert (3.3.1.1,

3.3.1.4).

Abbildung 16 zeigt die Ergebnisse der Aufreinigung der VLPs von VP40, GP und

VP24.

Die Einzelexpression von VP40 (Spur 4) führte, wie erwartet, zur Freisetzung von

VP40 in den Zellkulturüberstand (Abbildung 16 A, Spur 1). Die Behandlung mit

Proteinase K und zusätzlich Triton X-100 (Spuren 2 und 3) machte deutlich, das diese

Freisetzung in Form von membranumhüllten Partikeln stattfand. Das VLP-Pellet wurde

außerdem von Dr. Larissa Kolesnikova elektronenmikroskopisch untersucht und es

konnten die typischen, filamentösen Partikel dargestellt werden (Abbildung nicht

gezeigt).

4 Ergebnisse 81

Die Einzelexpression von GP (Abbildung 16 B, Spur 4) führte ebenfalls zu seiner

Freisetzung (B, Spur 1), jedoch konnte hier durch den Proteinase K-Verdau nicht

eindeutig festgestellt werden, ob dies tatsächlich in Form von VLPs geschah, da der

größte Anteil des Proteins (GP1 sowie Teile des GP2) aus der Membran herausragt und

somit auch ohne Triton X-100-Behandlung für die Proteinase K zugänglich ist.

Lediglich ein kleiner Anteil des GP2 war nach Proteinase K-Verdau noch detektierbar

(B, Spur 2). Die Einzelexpression von VP24 (Abbildung 16 C, Spur 4) führte nicht zu

einer Freisetzung von VP24 (C, Spur 1-3) in den Zellkulturüberstand. Die Proben

wurden nach der Ultrazentrifugation ebenfalls einer elektronenmikroskopischen

Untersuchung unterzogen, doch auch hier konnten keine membranumhüllten

Strukturen festgestellt werden (Abbildungen nicht gezeigt). Somit scheint das VP24

des Marburgvirus nicht in der Lage zu sein, seine eigene Freisetzung in Form von

membranumhüllten, virusähnlichen Partikeln zu vermitteln.

Abbildung 16: Bildung von virusähnlichen Partikeln durch Einzelexpression vonVP40, GP und VP24. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 1 µg pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-GPtransfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. Der Überstand wurde überein Saccharose-Kissen zentrifugiert, die pelletierten VLPs anschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die Proben mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A:Aufreinigung und Proteinase K-Verdau des Zellkulturüberstandes von VP40-transfiziertenZellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet, Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K)und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase K sowie Triton X 100 (TX100). Spur 4 zeigt diezelluläre Expression. B: Darstellung der von GP erzeugten virusähnlichen Partikel. Spuren1-4 wie unter A beschrieben. C: Darstellung des Zellkulturüberstands von VP24-exprimierenden Zellen. Spuren 1-4 wie unter A beschrieben. * markiert ein bisherunbekanntes, zelluläres Protein.

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

T X100P.K -

-+ +- +

21 kD

Zelll

ysatÜberstand

VP24

1 2 3 4

C

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

21 kD

T X100

P.K -

-

+ +- + Ze

lllys

atÜberstand

VP40

1 2 3 4

A

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

21 kD

T X100P.K -

-+ +- + Ze

lllys

atÜberstand

GP1

GP2

1 2 3 4

B

GPER*

4 Ergebnisse 82

4.3.2 Koexpression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur Virusinfektion

Bevor im Folgenden die Freisetzung von VP24 durch VP40 oder GP bzw. der Einfluss

des VP24 auf deren Freisetzung untersucht werden konnte, sollte zunächst betrachtet

werden, ob VP24 die Expression von GP oder VP40 beeinflussen kann und in

welchem Verhältnis die kodierenden Plasmide für VP24, VP40 und GP zueinander

transfiziert werden müssen, um eine der Virusinfektion entsprechende

Proteinexpression zu erhalten.

4.3.2.1 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 und GP

Es wurde zunächst untersucht, ob die Koexpression von VP24 Einfluss auf die

Expression von VP40 bzw. GP nimmt. Ansteigende Mengen von pCAGGS-VP24

wurden mit 0,5 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP in HEK293-Zellen

kotransfiziert (3.2.2). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in PBSdef

geerntet, mit 4x-Proteinprobenpuffer versetzt und die synthetisierten Proteinmengen

mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht und miteinander verglichen

(3.3.1.4).

Die Koexpression von VP24 und GP (Abbildung 17 A) zeigte kaum Einfluss auf die

Bildung und Spaltung von GP. Lediglich eine leichte Erhöhung der GP-Menge konnte

ab einer eingesetzten DNA-Konzentration von 0,6 µg des Vektors pCAGGS-VP24

festgestellt werden, was für eine potentielle Stabilisierung des GP durch VP24

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

0

0,2

1,00,80,60,40,2pC-VP24 (µg)

0,20,20,20,20,2pC-GP (µg)

GP1

GP2

VP24

∗

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

220 kD

66 kD

46 kD

30 kD

97 kD

0

0,2

1,00,80,60,40,2pC-VP24 (µg)

0,20,20,20,20,2pC-GP (µg)

GP1

GP2

VP24

∗ 46 kD

30 kD

VP40

VP24

0

0,5

0,80,60,40,20,1pC-VP24 (µg)

0,50,50,50,50,5pC-VP40 (µg)

46 kD

30 kD

46 kD

30 kD

VP40

VP24

0

0,5

0,80,60,40,20,1pC-VP24 (µg)

0,50,50,50,50,5pC-VP40 (µg)

BA

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Abbildung 17: Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 bzw. GP. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,2 µg pCAGGS-GP oder 0,5 µg pCAGGS-VP40 sowiemit verschiedenen Mengen an pCAGGS-VP24 transfiziert. 24 h p.t. wurden die Zellengeerntet und die Proteine im Western Blot sichtbar gemacht. A: Koexpression von GP ohneVP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6). B: Koexpressionvon VP40 ohne VP24 (Spur 1) sowie mit ansteigenden Mengen an VP24 (Spuren 2 bis 6).* markiert ein bisher unbekanntes, zelluläres Protein.

4 Ergebnisse 83

sprechen könnte. Betrachtet man die Koexpression von VP24 und VP40 (Abbildung 17

B), so beobachtet man hier keinen Effekt des VP24 auf die in der Zelle vorliegende

VP40-Menge.

4.3.2.2 Expression von VP24, VP40 und GP in äquivalenten Mengen zur MARV-Infektion

Im Weiteren wurde ermittelt, welche Plasmidmengen eingesetzt werden müssen, um

bei der rekombinanten Expression der viralen Proteine ein Verhältnis zu erreichen, das

dem in MARV-infizierten Zellen entspricht. Ein der natürlichen Infektion

entsprechendes Bild bezüglich der Verhältnisse von VP40 und GP zeigte sich, wenn

sie im Verhältnis 1:0,2 transfiziert wurden (Berghöfer, 2003). VP24 ist in der

Virusinfektion mengenmäßig schwächer vertreten als das VP40, jedoch zeigt es ein

stärkeres Signal als GP. Aufgrund dieser Beobachtung wurden die drei viralen Proteine

im Verhältnis VP24:VP40:GP = 0,5:1:0,2 in HEK293-Zellen transfiziert und die

Proteinexpression 48 Stunden p.t. mit der Proteinexpression von MARV-infizierten

Vero-Zellen verglichen.

Abbildung 18 zeigt die Färbung von GP, VP40 und VP24 im Western Blot. Die Signale

der einzelnen Proteine machen deutlich, dass die Transfektion der drei Plasmide in

dem oben genannten Verhältnis eine Proteinexpression vermitteln, die der Expression

220 kD

97 kD

66 kD

45 kD

30 kD

GP1

VP40

VP24

MAR

V

GP +

VP4

0 +

VP24

Abbildung 18: Vergleich der Proteinmengen in MARV-infizierten Vero-Zellen undtransfizierten HEK293-Zellen. Vero-Zellen wurden 1 h mit MARV infiziert und 24 h p.i. geerntet. HEK293-Zellen wurden mit1 µg pCAGGS-VP40, 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert, dieZelllysate 48 h p.t. geerntet und mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

4 Ergebnisse 84

von GP, VP40 und VP24 in virusinfizierten Zellen entspricht. Die folgenden

Kotransfektionen zur Untersuchung der VLPs wurden deshalb immer in diesem

Verhältnis durchgeführt.

4.3.3 Rekrutierung von VP24 in von VP40 bzw. GP gebildete VLPs

Da VP24 nicht in der Lage ist, virusähnliche Strukturen auszubilden, stellte sich im

Weiteren die Frage, ob VP24 in die von VP40- bzw. GP-gebildeten Partikel rekrutiert

werden kann.

Um dies zu untersuchen, wurde VP24 jeweils entweder mit VP40 oder GP koexprimiert

und die resultierenden VLPs auf den Einbau von VP24 hin untersucht. 0,5 µg

pCAGGS-VP24 wurde zusammen mit 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. 0,2 µg pCAGGS-GP

in HEK293-Zellen kotransfiziert (3.2.2). 48 Stunden nach der Transfektion wurden die

Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die gebildeten VLPs durch

Zentrifugation des Überstandes über ein Saccharose-Kissen aufgereinigt (3.2.4). Im

Anschluss wurde, wie bereits unter 4.3.1 beschrieben, ein Proteinase K-Verdau

durchgeführt, um membranumhüllte Proteine von freien Proteinen zu unterscheiden.

Die Einzelexpression von VP24 zeigte, wie erwartet, keine Freisetzung des

exprimierten VP24 (Abbildung 19 A), während die Koexpression mit VP40 dazu führte,

dass VP24 im Zellkulturüberstand detektierbar wurde (B, Spur 1). Dieser freigesetzte

Anteil an VP24 war zudem resistent gegen Proteinase K-Verdau (B, Spur 2), ebenso

wie das VP40, und wurde erst durch Anwesenheit des Triton X-100 für die Protease

angreifbar (B, Spur 3), was darauf hindeutet, dass VP24 in die von VP40 gebildeten

VLPs eingebaut und so in den Zellkulturüberstand abgegeben wurde. Somit ist eine

Interaktion zwischen VP24 und VP40 sehr wahrscheinlich.

T X100P.K -

-+ +- + Ze

lllys

at

Überstand

A

1 2 3 4

T X100P.K -

-+ +- + Ze

lllys

at

Überstand

B

1 2 3 4

P.K --

+ +- + Ze

lllys

at

Überstand

T X100

C

1 2 3 4

VP24

VP40

GP1

GP2

VP24

VP40

GP1

GP2

VP24

VP40

GP1

GP2

4 Ergebnisse 85

Im Gegensatz zu VP40 führte die Koexpression von GP und VP24 (Abbildung 19 C,

Spur 4) nicht zur Freisetzung von VP24 in den Zellkulturüberstand, während GP hier

jedoch detektiert werden konnte (C, Spur 1). GP scheint somit im Gegensatz zu VP40

nicht in der Lage zu sein, VP24 in die von GP gebildeten virusähnlichen Partikel zu

rekrutieren und in den Überstand freizusetzen. Die durch Koexpression von VP24 und

VP40 entstandenen Partikel wurden außerdem elektronenmikroskopisch von

Dr. Larissa Kolesnikova untersucht. Es zeigte sich (Abbildung 19 D), dass auch hier die

für VP40 typischen filamentösen VLPs gefunden wurden. Aufgrund der Umhüllung

durch die Membran waren die eingeschlossenen Proteine nicht für eine

Antikörperfärbung zugänglich (weder VP40, noch VP24), jedoch war in Bereichen, in

denen die Membran beschädigt zu sein schien, eine Färbung sowohl von VP24 (12 nm

Goldpartikel, Pfeil) als auch von VP40 (6 nm Goldpartikel, Pfeilkopf) möglich.

4.3.4 Einfluss des VP24 auf die Bildung von virusähnlichen Partikeln

Im Folgenden stellte sich die Frage, ob VP24 die Freisetzung von VP40 und GP

beeinflussen kann. Um diese Frage zu beantworten, wurden die drei Proteine jeweils

Abbildung 19: Rekrutierung von VP24 in virusähnliche Partikel. HEK293-Zellen wurden mit jeweils 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40 oder0,2 µg pCAGGS-GP transfiziert und 48 h p.t. wurden Überstand und Zellen geerntet. DerÜberstand wurde über ein Saccharose-Kissen zentrifugiert und die pelletierten VLPsanschließend einem Proteinase K-Verdau unterzogen. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot analysiert. A: Aufreinigung und Proteinase K-Verdau desZellkulturüberstandes von VP24-transfizierten Zellen. Spur 1 zeigt das unbehandelte Pellet,Spur 2 die Behandlung mit Proteinase K (P.K) und Spur 3 die Behandlung mit Proteinase Ksowie Triton X-100 (TX100). Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. B: Koexpression vonVP24 und VP40. Die Spuren 1 bis 3 zeigen den Proteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt diezelluläre Expression. C: Koexpression von VP24 und GP. Die Spuren 1 bis 3 zeigen denProteinase K-Verdau, Spur 4 zeigt die zelluläre Expression. D: ElektronenmikroskopischeAufnahme von VLPs, enstanden durch Koexpression von VP24 und VP40, nachZentrifugation über ein Saccharose-Kissen. Gefärbt wurde mit α VP24- (Kaninchen) undα VP40- (Maus) Antikörpern. VP24 ist mit 12 nm Goldpartikeln (Pfeil) durch Verwendungeines Gold-markierten Esel α Kaninchen-Sekundärantikörpers markiert. VP40 ist durch 6 nmGoldpartikel (Pfeilkopf) durch Verwendung eines Gold-markierten Esel α Maus-Sekundärantikörpers markiert. 60000fach Vergrößerung. EM-Bild Dr. Larissa Kolesnikova.

D

4 Ergebnisse 86

einzeln (VP24, VP40, GP), in Zweierkombinationen (VP24 + VP40, VP24 + GP, VP40

+ GP) und zusammen in HEK293-Zellen exprimiert und die Freisetzung der

virusähnlichen Partikel miteinander verglichen. VP24, VP40 und GP wurden im

Verhältnis 0,5:1:0,2 transfiziert (s. 4.3.2.2). Um die transfizierten DNA-Mengen

vergleichbar zu halten wurde, wenn notwendig, mit Leervektor pCAGGS aufgefüllt. Der

Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden p.t. geerntet, ebenso die Zellen (3.2.4).

Abbildung 20 zeigt die Darstellung der zellulären Expression der einzelnen Proteine (A)

sowie deren Freisetzung in den Zellkulturüberstand (B) mittels Western Blot Analysen

(3.3.1.4).

Vergleicht man zunächst die Einzelexpression von VP40 (B, Spur2) mit der

Koexpression von VP40 und VP24 (B, Spur 4) so fällt zum einen auf, dass es, wie

bereits gezeigt, zur Freisetzung von VP24 in Anwesenheit von VP40 kam. Außerdem

zeigte sich, dass sich die Menge an freigesetztem VP40 in Anwesenheit von VP24

nicht veränderte. VP24 scheint somit keinen Einfluss auf die Freisetzung des VP40 zu

haben. Auch die Freisetzung von GP wurde durch die Anwesenheit des VP24 nicht

beeinflusst (Vergleich Spur 3 und 5).

Abbildung 20: Einfluss des VP24 auf die Bildung virusähnlicher Partikel. HEK293-Zellen wurden entweder einzeln mit pCAGGS-VP24, pCAGGS-VP40 bzw.pCAGGS-GP transfiziert, oder in Zweier- und Dreierkombination kotransfiziert. DasVerhältnis der eingesetzten DNA VP24:VP40:GP betrug dabei immer 0,5:1:0,2. 48 h p.t.wurden die Zellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet und die viralen Proteine mittelsSDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von VP24, VP40 und GP inHEK293-Zellen. B: Freisetzung der viralen Proteine VP24, VP40 und GP in den Überstand.

-+++-+--pC-GP

-++-+-+-pC- VP40

--+++--+pC-VP24

-+++-+--pC-GP

-++-+-+-pC- VP40

--+++--+pC-VP24

Zelllysat Überstand

GP1

GP2

VP40

VP24

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

4 Ergebnisse 87

Vergleicht man jeweils die Einzelexpression von VP40 und GP (B, Spuren 2 + 3) mit

der Koexpression beider Proteine (Spur 7), so fällt auf, dass die Freisetzung beider

Proteine in den Zellkulturüberstand gegenüber der Einzelexpression erhöht war. Beide

Proteine schienen sich gegenseitig in der Freisetzung zu unterstützen. Es konnte

gezeigt werden, dass das GP bei Koexpression mit VP40 nicht verstärkt als Vesikel

freigesetzt wurde, sondern in die filamentösen, von VP40 gebildeten Partikel rekrutiert

wurde (Kolesnikova et al., 2004b).

Exprimierte man zusätzlich zu VP40 und GP das zweite Matrixprotein VP24 (B, Spur

6), sah man, dass die Menge an freigesetztem VP24 im Vergleich zur Koexpression

von VP24 und VP40 erhöht war. Diese Erhöhung war wahrscheinlich durch die

vermehrte Freisetzung von VP40 bedingt, welche wiederum durch die Koexpression

mit GP zustande kam. Allerdings war die Menge an freigesetztem GP im Vergleich zur

Koexpression von VP40 und GP in Anwesenheit von VP24 leicht verringert. VP24

scheint somit einen Einfluss auf den Einbau des GP in die von VP40 gebildeten

virusähnlichen Partikel zu haben.

4.3.5 Einfluss des Late-Domain-Motivs PPPY des MARV-VP40 auf den Einbau von VP24

Viele umhüllte Viren, darunter Vertreter der Familien der Retroviridae, Rhabdoviridae,

Arenaviridae und der Filoviridae kodieren in den viralen Strukturproteinen für

sogenannte Late-Domain-Motive. Diese kurzen Peptidmotive sind für den letzten

Schritt der Virusfreisetzung notwendig, wenn die Hüllmembran des Virus sich von der

Plasmamembran abschnürt. Für das Ebolavirus konnte bereits gezeigt werden, dass

die sich überlappenden Late-Domain-Motive PTAPPEY (bestehend aus PTAP und

PPEY) des VP40 eine zentrale Rolle in der Freisetzung von virusähnlichen Partikeln

aus VP40-transfizierten Zellen spielen (Licata et al., 2003; Martin-Serrano et al., 2004).

Das VP40 des MARV besitzt im N-terminalen Bereich ebenfalls ein klassisches Late-

Domain-Motiv PPPY (EMBL Nucleotide Sequence Database, accession number

Z12132; Nukleotide 4612 – 4623). Die Funktionalität eines solchen Motivs kann bereits

durch die Mutation des Tyrosin-Restes (Y) stark beeinträchtigt werden, wie es bereits

bei anderen viralen Matrixproteinen gezeigt wurde (Strecker et al., 2003; Jayakar et al.,

2000). Ein nicht mehr funktionelles Late-Domain-Motiv resultierte hier in der

verminderten oder vollständig gehemmten Freisetzung von virusähnlichen Partikeln.

Für MARV ist die Rolle des PPPY-Motivs des VP40 bei der Abschnürung viraler

Partikel bzw. VLPs bisher unbekannt, ebenso dessen Einfluss auf die Freisetzung des

VP24 in die VLPs. Daher wurde durch in vitro Mutagenese (3.1.3.5) der Tyrosin-Rest

gegen ein Alanin ausgetauscht und die so entstandene VP40-PPPA-Mutante im

4 Ergebnisse 88

Vergleich zum WT-VP40 auf ihre Fähigkeit hin untersucht, VLPs zu bilden sowie VP24

in die VLPs zu rekrutieren.

pCAGGS-VP40 oder pCAGGS-VP40-PPPA wurden in HEK293-Zellen transfiziert

(3.2.2) und 48 Stunden p.t. wurde der Zellkulturüberstand geerntet, einem Proteinase

K-Verdau unterzogen und mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot auf die

Anwesenheit von VLPs überprüft (3.3.1.4). Zusätzlich wurden Zellen sowohl mit den

beiden VP40-Proteinen sowie dem VP24 im Verhältnis 1:0,5 kotransfiziert, um den

Einfluss des Late-Domain-Motivs auf die Ausschleusung von VP24 zu untersuchen.

Abbildung 21 zeigt, dass im Fall des MARV-VP40 eine Mutation des Late-Domain-

Motivs PPPY zu PPPA nicht zu einer verminderten Freisetzung des Proteins in den

Zellkulturüberstand führte (Abbildung 21, A + B) und dass die VP40-Mutante ebenso

wie das WT-Protein in membranumhüllter Form vorlag (A + B, Spuren 1 bis 3). Des

Weiteren lässt die Koexpression von VP24 erkennen, dass VP24 unabhängig von dem

PPPY-Motiv in die virusähnlichen Partikel rekrutiert wird (Abbildung 21, C + D).

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

+--+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

TX100

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

VP24VP24

VP40-PPPA

VP40-PPPA

VP40

VP40

A B

C D

1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

+--+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

TX100

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

+--TX100

+++P.K

Zelll

ysatÜberstand

VP24VP24

VP40-PPPA

VP40-PPPA

VP40

VP40

A B

C D

1 2 3 4 1 2 3 4

1 2 3 4 1 2 3 4

Abbildung 21: Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY des VP40 und sein Einfluss aufdie Freisetzung der VLPs sowie die Rekrutierung von VP24. HEK293-Zellen wurden entweder mit je 1 µg pCAGGS-VP40 bzw. pCAGGS-VP40-PPPAtransfiziert (A + B), oder zusätzlich mit 0,5 µg pCAGGS-VP24 (C + D). 48 h p.t. wurden dieZellen sowie der Zellkulturüberstand geerntet, und die VLPs mittels Zentrifugation über einSaccharose-Kissen aufgereinigt und einer Proteinase K-Behandlung unterzogen (3.3.5). Dieviralen Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A:Freisetzung und Expression von VP40. B: Freisetzung und Expression von VP40-PPPA. C:Freisetzung von VP24 durch VP40. D: Freisetzung von VP24 durch VP40-PPPA.

4 Ergebnisse 89

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Late-Domain-Motiv PPPY des MARV-

VP40 nicht ausschlaggebend für die Freisetzung von virusähnlichen Partikeln von der

Zelloberfläche sowie die Rekrutierung von VP24 ist, sondern dass VP40 andere

Sequenzen enthalten muss, welche für die Abschnürung und Freisetzung der Partikel

eine Rolle spielen.

4.3.6 Einbau von NP in die VLPs

Zur Bildung reifer, infektiöser Virionen muss das im Zytoplasma reifende Nukleokapsid

mit einer Hüllmembran umschlossen werden, in welche die viralen Oberflächenproteine

inseriert sind. Die Matrixproteine gelten hierbei als Mediatoren der Interaktion zwischen

den RNP-Komplexen und der Plasmamembran mit den eingelagerten Hüllproteinen.

Es ist bekannt, dass das Nukleoprotein NP des MARV auch in Abwesenheit anderer

viraler Proteine durch singuläre Expression in der Lage ist, nukleokapsidähnliche

Strukturen und sog. Einschlusskörper zu bilden, die in ihrer Ultrastruktur denen in der

Virusinfektion sehr ähneln (Kolesnikova et al., 2000). Durch die Koexpression von NP

zusammen mit VP40 und/oder VP24 sollte überprüft werden, ob NP in die von VP40

gebildeten virusähnlichen Partikel rekrutiert werden kann.

Dazu wurde 1 µg pCAGGS-NP entweder alleine oder in Kombination mit pCAGGS-

VP24 und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. Der Zellkulturüberstand wurde 48 Stunden

p.t. geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und mittels SDS-PAGE und

Western Blot analysiert. Abbildung 22 zeigt die Freisetzung von NP in den Überstand.

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

P.K --

+ +- +

Überstand

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

T X100P.K -

-+ +- +

Überstand

NP

VP40

VP24

A B C D

1 2 3 4

Zelll

ysat

Zelll

ysat

Zelll

ysat

Zelll

ysat

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

NP

VP40

VP24

NP

VP40

VP24

Abbildung 22: Einbau von NP in VLPs. HEK293-Zellen wurden mit pCAGGS-NP alleine oder in Kombination mit pCAGGS-VP24und/oder pCAGGS-VP40 transfiziert. 48 h p.t. wurden die Zellen sowie der Zellkultur-überstand geerntet, einem Proteinase K-Verdau unterzogen und die viralen Proteine mittelsSDS-PAGE und Western Blot sichtbar gemacht. A: Expression von NP. B: Expression vonNP und VP24. C: Expression von NP und VP40. D: Expression von NP, VP24 und VP40.

4 Ergebnisse 90

Die solitäre Expression von NP (Abbildung 22 A) führte nicht zu dessen Freisetzung in

den Überstand, ebenso wenig die Koexpression mit VP24 (22 B). Koexprimierte man

jedoch NP zusammen mit VP40, so war NP im Zellkulturüberstand detektierbar (22 C)

und dessen Freisetzung wurde durch die Anwesenheit von VP24 (22 D) noch einmal

signifikant verstärkt. Allerdings ließ sich durch den Proteinase K-Verdau zeigen, dass

die Freisetzung des NP nicht in einer membrangeschützten Form als VLP stattfand, da

NP auch in Abwesenheit eines Detergenz Proteinase K-sensitiv war (Spuren 1 + 2).

Untersuchungen der VLPs mithilfe des Elektronenmikroskopes ergaben, dass die

Expression von VP40 zur Bildung der erwarteten filamentösen VLPs führte, in welche

VP24 bei Koexpression eingebaut wurde. Das freigesetzte NP trat zwar in Assoziation

mit den VLPs auf, war jedoch außen und nicht, wie erwartet, innen an den VLPs zu

finden (Daten nicht gezeigt). Somit scheint die singuläre Expression von NP nicht

auszureichen, um Nukleokapsid-ähnliche Strukturen zu erzeugen, welche dann in die

von VP40 gebildeten VLPs eingebaut werden können.

4.4 Interaktion des VP24 mit viralen Proteinen

4.4.1 Lokalisation des VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen

Die Lokalisation von VP24 in MARV-infizierten Zellen ist bisher nicht beschrieben. Das

EBOV-VP24 liegt in infizierten Zellen perinukleär in größeren Aggregaten vor (Han et

al., 2003). Um die Verteilung des MARV-VP24 in der Virusinfektion zu untersuchen,

wurden Vero-Zellen 24 Stunden vor der Infektion auf Deckgläsern ausgesät und bei

einer Konfluenz von ca. 70 % mit einer m.o.i. von 1 mit Marburgvirus im

Sicherheitslabor infiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen

und mit DMEM(+Q, + 2 % FCS) versetzt. 24 Stunden p.i. wurden die Zellen mit 4 %

Paraformaldehyd in DMEM über Nacht fixiert, aus dem Sicherheitslabor ausgeschleust

und anschließend permeabilisiert (3.2.8.2). VP24 wurde mithilfe des

affinitätsgereinigten VP24-AK (3.3.2) in einer 1:2 Verdünnung markiert und

anschließend durch Inkubation mit einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK

sichtbar gemacht.

Abbildung 23 A zeigt die Verteilung von VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen. Hier fiel

auf, dass VP24 im Gegensatz zur transienten Einzelexpression des Proteins

(Abbildung 10) in großen Aggregaten in der perinukleären Region lokalisiert vorlag, die

in ihrer Form viralen Einschlusskörpern, den Reifungszentren der RNP-Komplexe,

ähneln. Außerdem zeigte VP24 eine granuläre Verteilung im Zytoplasma der Zelle,

jedoch keine Färbung der Plasmamembran. Zusätzlich wurde eine Kofärbung von

4 Ergebnisse 91

VP24 und dem Nukleoprotein NP, der Hauptkomponente der Einschlusskörper,

durchgeführt, um eine potentielle Kolokalisation zu ermitteln.

Abbildung 23 B zeigt deutlich, dass VP24 tatsächlich mit den Einschlusskörpern

kolokalisierte. Neben der Färbung der perinukleären Aggregate von NP und VP24 kann

man für beide Proteine außerdem eine eher körnige Struktur im Zytoplasma der Zellen

erkennen. In der Kofärbung von NP und VP24 fällt jedoch auf, das diese peripheren

Signale von VP24 und NP nicht kolokalisieren.

Ultrastrukturelle Untersuchungen der MARV-infizierten Zellen haben die Kolokalisation

mit den Einschlusskörpern bestätigt.

Abbildung 24 zeigt die elektronenmikroskopische Aufnahme eines Einschlusskörpers

im Zytoplasma MARV-infizierter Vero-Zellen. Die AK-Färbung mit dem

affinitätsgereinigten VP24-AK und 12 nm Goldpartikeln (Esel α Kaninchen-Sekundär-

Abbildung 23: Lokalisation des VP24 in Marburgvirus-infizierten Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit einer m.o.i. von 1 mit MARV infiziert und 24 h p.i. fixiert undpermeabilisiert. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK vom Kaninchenangefärbt und durch einen Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK detektiert, NP wurdedurch den monoklonalen α NP-AK 2B10 sowie einen FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt.A: Färbung von VP24 in MARV-infizierten Vero-Zellen. B: Kofärbung von VP24 und NP inMARV-infizierten Vero-Zellen. C: Färbung nicht-infizierter Vero-Zellen.

α VP24 α NP Überlagerung

A

B

MARVMARV MARV

Mock Mock

MARV MARVMock

α VP24

1 2 3

C

4 Ergebnisse 92

antikörper) markiert deutlich die Lokalisation des VP24 in den elektronendichten

Strukturen der Einschlusskörper (Pfeile).

4.4.2 Interaktion von VP24 und NP in der Immunfluoreszenzanalyse

Die Kolokalisation des VP24 in den viralen Einschlusskörpern während der

Virusinfektion lässt die Frage aufkommen mit welchem viralen Protein der RNP-

Komplexe das VP24 interagiert. NP als Hauptkomponente der Einschlusskörper ist

dabei ein wahrscheinlicher Kandidat. Um eine mögliche Interaktion von VP24 mit NP

zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen auf Deckgläsern ausgesät, mit MVA-T7 infiziert

und im Anschluss mit je 1 µg pTM1-VP24 und/oder 1 µg pTM1-NP transfiziert (3.2.8.1).

12 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und entweder

mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK, dem monoklonalen α NP-AK 2B10 oder mit

beiden Erstantikörpern inkubiert. Anschließend wurden VP24 und NP durch Inkubation

mit einem Rhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK bzw. einem FITC-gekoppelten α

Maus-AK sichtbar gemacht und mithilfe des Fluoreszenzmikroskopes und der Spot-

Kamera fotografiert (3.3.2).

Zunächst wurde die intrazelluläre Verteilung des VP24 und des NP durch

Einzelexpression der Proteine betrachtet. Abbildung 25 A1 zeigt die Lokalisation von

VP24, Abbildung 25 A2 das NP, das die typischen großen Aggregate im perinukleären

Abbildung 24: Lokalisation des VP24 in den Einschlusskörpern Marburgvirus-infizierter Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit einer m.o.i. von 1 mit MARV infiziert und 24 h p.i. für dieElektronenmikroskopie vorbereitet. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten α VP24-AKvom Kaninchen markiert und durch einen Gold-markierten Esel α Kaninchen-Sekundärantikörper (12 nm) detektiert. EM-Bild Dr. Larissa Kolesnikova, Vergrößerung60000fach.

4 Ergebnisse 93

Bereich erzeugte, welche den Einschlusskörpern in der viralen Infektion auch

strukturell stark ähneln (Kolesnikova et al., 2000).

Die Koexpression beider Proteine (B) führte zu einer Relokalisation des VP24 aus den

kleinen VP24-Aggregaten in die von NP gebildeten Einschlusskörper. Diese

Kolokalisation war vor allem in der Überlagerung beider Signale sichtbar. Diese

Ergebnisse machen deutlich, dass VP24 in der Lage ist, mit dem NP zu interagieren

und wahrscheinlich in der Virusinfektion aufgrund dieser Interaktion in die viralen

Einschlusskörper rekrutiert wird. Jedoch zeigt sich auch in der rekombinanten

Expression eine Kofärbung nur in den perinukleären Aggregaten, während keine

Kolokalisation in den peripheren NP-Signalen mit dem VP24 zu beobachten ist.

Abbildung 25: Immunfluoreszenzanalyse der Einzel- und Koexpression von VP24 undNP. Subkonfluente HeLa-Zellen wurden mit MVA-T7 infiziert und mit je 1 µg der Plasmide pTM1-VP24 und pTM1-NP einzeln oder kotransfiziert. 12 h p.i. wurden die Zellen fixiert,permeabilisiert und mit dem affinitätsgereinigten α VP24 AK bzw. dem monoklonalenα NP-AK sowie einem Rhodamin-gekoppeltem α Kaninchen-AK und einem FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt. A: Einzelexpression von VP24 (A1) und NP (A2).B: Koexpression von VP24 (B1) und NP (B2), sowie Überlagerung der beiden Signale (B3).C: MVA-T7 infizierte HeLa-Zellen ohne Transfektion.

α VP24 α NP

VP24 NP

NP + VP24 NP + VP24 NP + VP24

MVA-T7 MVA-T7

A

B

C

1 2 3

Überlagerung

4 Ergebnisse 94

4.4.3 Interaktion von VP24 und VP40

VP24 und VP40 gelten als die zwei Matrixproteine der Filoviren, da sie beide im

Matrixraum der Virionen lokalisiert sind, wobei VP40 das funktionelle Homolog der

Matrixproteine der Ordnung Mononegavirales darstellt. Aufgrund ihrer Lokalisation in

den reifen Viruspartikeln sowie der hier vorliegenden Ergebnisse, dass VP40 in der

Lage ist, VP24 in die virusähnlichen Partikel zu rekrutieren, ließ sich vermuten, dass

VP40 und VP24 in der Lage sind, direkt miteinander zu interagieren.

4.4.3.1 Koimmunpräzipitation von VP24 und VP40

Mithilfe der Koimmunpräzipitation (KoIP) sollte eine mögliche Protein-Protein-

Interaktion zwischen beiden Matrixproteinen untersucht werden. Ausgehend von den

Plasmiden pTM1-VP24-Flag und pTM1-VP40 wurden die Proteine VP24-Flag und

VP40 entweder einzeln oder gemeinsam mit dem TNT T7 Quick Coupled

Transcription/Translation System in vitro translatiert und metabolisch mit [35S]-PromixTM

Redivue markiert (3.3.3). Für diese Untersuchungen konnte weder das WT-VP24 noch

das HA-markierte VP24 eingesetzt werden, da sowohl der affinitätsgereinigte VP24-AK

als auch der monoklonale HA-Antikörper eine Kreuzreaktivität mit dem VP40 aufwiesen

und somit für eine Koimmunpräzipitation nicht geeignet waren (Daten nicht gezeigt).

Für die KoIP wurden zwei verschiedene Puffersysteme benutzt, zum einen der KoIP-

Puffer, zum anderen der Tris-KCl-Puffer, welcher vor allem bei der Kopräzipitation von

VP35-Multimeren im Vergleich zum KoIP-Puffer bessere Ergebnisse erzielte, da er in

seinen Bedingungen weniger stringent ist. (Möller, 2002).

Das in vitro Translat wurde nach einer Präinkubation mit Protein-A-Sepharose mit

einem gegen das Flag-Epitop und einem gegen das VP40 gerichteten AK inkubiert und

anschließend über die Kopplung der AK an Protein-A-Sepharose präzipitiert (3.3.4).

Die Koimmunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE (3.3.1.1) aufgetrennt, das Gel

getrocknet und mit dem Bio-Imager und dem Computerprogramm TINA2.0 (3.3.1.3)

ausgewertet.

Abbildung 26 A zeigt zunächst die Einzelexpression der beiden Proteine sowie die

jeweilige Präzipitation in KoIP-Puffer mit dem Flag- sowie dem VP40-AK. Das Flag-

markierte VP24 wurde durch den Flag-AK erkannt und spezifisch präzipitiert (Spur 2),

während VP40 nicht erkannt wurde (Spur 3). Umgekehrt wurde das VP40 spezifisch

durch den VP40-AK erkannt (Spur 6), während VP24-Flag unerkannt blieb (Spur 5).

Damit waren die Voraussetzungen für eine Koimmunpräzipitationsanalyse gegeben.

Findet eine Interaktion der beiden Proteine statt, so müsste das VP40 nach

spezifischer Fällung des VP24-Flag mit dem Flag-AK kosedimentieren und umgekehrt.

4 Ergebnisse 95

Abbildung 26 B zeigt die Kopräzipitation von VP24-Flag und VP40 in KoIP-Puffer

(Spuren 2 + 3) sowie in Tris-KCl-Puffer (Spuren 4 + 5). Als Hintergrundkontrolle diente

die Expression und Präzipitation des Leervektors pTM1 mit den entsprechenden AK in

KoIP-Puffer.

Die Spuren 2 und 4 in Abbildung 26 B zeigen, dass VP40 unter keiner der gewählten

Pufferbedingungen gemeinsam mit dem VP24-Flag kosedimentiert werden konnte.

Ebenso verhielt es sich bei der Präzipitation mit dem monoklonalen VP40-AK, die

ausschließlich zur Fällung des VP40, nicht aber des VP24-Flag führte (Spuren 3 und

5). Somit konnte eine potentielle Interaktion zwischen VP24 und VP40 nicht durch die

Koimmunpräzipitation aus radioaktiv-markiertem Retikulozytenlysat gezeigt werden.

4.4.3.2 Kolokalisation von VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse

Da eine Interaktion des VP24 mit VP40 durch Koimmunpräzipitation nicht

nachgewiesen werden konnte, wurde im Folgenden die Kolokalisation beider Proteine

mittels Immunfluoreszenzanalyse untersucht.

Zunächst wurde die intrazelluläre Verteilung des VP24 und des VP40 durch

Einzelexpression der Proteine betrachtet. VP40 zeigte dabei die Ausbildung von

größeren Clustern (Abbildung 27 B2) in der Zellperipherie, von denen bereits gezeigt

werden konnte, dass sie mit multivesikulären Strukturen des späten Endosoms, sog.

„multivesicular bodies“ (MVB), kolokalisieren. Außerdem zeigte VP40 eine Lokalisation

an der Plasmamenbran (Kolesnikova et al., 2002). VP24 wies die bereits

beschriebenen punktförmigen Aggregate im zellkernnahen Bereich auf (4.1.4).

Abbildung 26: Koimmunpräzipitationsanalyse des VP24-Flag mit dem VP40. VP24-Flag und VP40 wurden sowohl getrennt als auch zusammen in vitro translatiert undradioaktiv markiert. Anschließend wurde unter Verwendung des α Flag-AK und des α VP40-AK eine Immunpräzipitationsanalyse (A) und eine Koimmunpräzipitationsanalyse (B)durchgeführt. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mithilfe des Bio-Imagers ausgewertet.

A B

VP24-FlagαFlagivTl α40

VP40αFlagivTl α40

VP40

VP24-Flag30 kD

1 2 3 4 5 6

VP24-FlagαFlagivTl α40

VP40αFlagivTl α40

VP40

VP24-Flag30 kD

1 2 3 4 5 6

30 kD

VP24-FlagVP40

αFlagivTl α40pTM1αFlagivTl α40αFlag α40

VP40

VP24-Flag

1 2 3 4 5 6 7 8

30 kD

VP24-FlagVP40

αFlagivTl α40pTM1αFlagivTl α40αFlag α40

VP40

VP24-Flag

1 2 3 4 5 6 7 8

4 Ergebnisse 96

Bei der Koexpression von VP24 und VP40 (Abbildung 27 A) zeigte sich nur eine

schwache Kolokalisation beider Proteine. Diese konnte vor allem an der

Plasmamembran sowie in Zellausläufern beobachtet werden (Ausschnittsver-

größerungen I + II). VP24 kolokalisierte nicht mit VP40, das in den großen Clustern der

MVB lokalisiert vorlag (Ausschnitt III), während VP40 ebenfalls nicht mit den

punktförmigen VP24-Aggregaten im zellkernnahen Bereich kolokalisierte. Die

Kolokalisation von VP24 und VP40 scheint weit weniger stark ausgeprägt, als die

Interaktion des VP24 mit dem Nukleoprotein NP. Dies könnte darauf hindeuten, dass

das VP24 in der Morphogenese eher am Reifungsprozess der Nukleokapside beteiligt

ist als an der Bildung der Virushülle.

Abbildung 27: Immunfluoreszenzanalyse der Kolokalisation von VP24 und VP40. Subkonfluente Vero-Zellen wurden und mit 0,5 µg pCAGGS-VP24 und 1 µg pCAGGS-VP40einzeln oder kotransfiziert. 24 h p.t. wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit demaffinitätsgereinigten α VP24 AK bzw. dem monoklonalen α VP40-AK sowie einemRhodamin-gekoppelten α Kaninchen-AK und einem FITC-gekoppelten α Maus-AK gefärbt.A: Koexpression von VP24 und VP40, Ausschnittsvergrößerungen sind links (I), rechts (III)und unterhalb (II) einzeln gefärbt sowie in der Überlagerung gezeigt. B: Einzelexpressionvon VP24 und VP40, sowie Kofärbung der Mock-Zellen mit beiden Antikörpern in derÜberlagerung.

MockVP40VP24

A

B

I

II

III

4 Ergebnisse 97

4.5 Abschalten der MARV VP24-Expression durch RNAi

Die Rolle des VP24 im viralen Vermehrungszyklus ist bisher unbekannt. Zur

Untersuchung der Funktion in der Morphogenese von reifen Viruspartikeln sollte VP24

durch den Einsatz kurzer (21 bp), doppelsträngiger RNA-Fragmente, sog. siRNAs, in

der MARV-Infektion abgeschaltet werden. Dieser Mechanismus ist als RNA Interferenz

beschrieben (1.8). Er beruht auf der homologen Paarung der siRNA mit der Ziel-

mRNA-Sequenz und ist dabei absolut sequenzspezifisch. Es ist beschrieben, dass

bereits die Mutation einer Base in der siRNA-Sequenz ein posttranskriptionelles

Abschalten des gewünschten Proteins verhindern kann (Zeng et al., 2002; Doench et

al., 2003).

4.5.1 Auswahl geeigneter siRNA-Sequenzen aus der Ziel-mRNA-Sequenz

Die virale mRNA des VP24 stellte die Zielsequenz dar, aus welcher passende siRNA-

Sequenzen ausgesucht werden sollten. Das Design dieser dsRNA-Fragmente wurde

unter Berücksichtigung der Hinweise von Tuschl und Kollegen zur Generierung funktio-

neller siRNA-Sequenzen erstellt (http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html)

Folgende Vorgaben wurden berücksichtigt:

- die Sequenz sollte 50 bis 100 Nukleotide jenseits des Startkodons liegen, um

Interferenzen mit UTR-bindenden Proteinen oder den Translations-Initiations-

Komplexen und dem RISC-Komplex zu vermeiden

- die optimale Sequenz ist 23 Nukleotide lang und folgt dem Motiv AA(N19)TT, wobei

N jedes beliebige Nukleotid darstellt

- ebenfalls funktionell sind Sequenzen mit dem Motiv NA(N21), wobei die 3’-Enden

dieser siRNA-Sequenzen zu TT konvertriert werden sollten, um symmetrische 3’-

Überhänge zu erzeugen.

- der G/C-Gehalt der entsprechenden Sequenz sollte optimalerweise bei ca. 50 %,

aber auf jeden Fall zwischen 30 und 70 % liegen.

In der mRNA-Sequenz des VP24 befinden sich insgesamt 7 Sequenzabschnitte, die

dem Motiv AA(N17)TT entsprechen, jedoch nur eine dieser Sequenzen (EMBL

Nucleotide Sequence Database, accession number Z12132; Nukleotide 10465 -

10487) zeigt einen optimalen G/C-Gehalt von ca. 50 %. Diese Sequenz wurde zur

Synthese von siRNA VP24 Nr. 1 ausgewählt. Zur Synthese einer zweiten VP24-

spezifischen siRNA wurde auf das Sequenzmotiv NA(N21) ausgewichen und nach

Berücksichtigung der Tuschl-Regeln wurde die Sequenz der Nukleotide 10819 bis

10841 (EMBL Nucleotide Sequence Database, accession number Z12132) zur

Synthese der siRNA VP24 Nr. 2 ausgewählt (Abbildung 28). Bei der chemischen

Synthese der siRNA-Duplexe wurden für die 3’-Überhänge Thymidine (dT) statt Uridine

4 Ergebnisse 98

(U) verwendet, da Desoxynukleotide in den 3’-Überhängen die gleiche Effizienz zeigen

wie Ribonukleotide, jedoch preiswerter in der Synthese und wahrscheinlich

nukleaseresistenter sind. Als Kontroll-siRNA, die nicht in der Lage sein sollte die

mRNA-Sequenz des VP24 abzuschalten, wurde eine käufliche siRNA der Firma

Qiagen gewählt, die keinerlei Sequenzhomologien zu bisher beschriebenen

eukaryotischen Genen besitzt und daher keine bisher bekannte mRNA-Sequenz

erkennt.

4.5.2 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNAs

Zunächst wurden die VP24-spezifischen siRNAs dahingehend überprüft, ob sie in der

Lage sind, spezifisch die transiente Expression von VP24 herunterzufahren. Dazu

wurden Vero-Zellen in 24 well-Platten ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 70 %

mit 250 ng pCAGGS-VP24 singulär oder in Kombination mit ansteigenden

Konzentrationen (100 bis 1000 ng) der spezifischen und unspezifischen Kontroll-siRNA

transfiziert (3.2.5). Als Transfektionsreagenz diente LipofectamineTM 2000. 24 Stunden

p.t. wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und die Zellernte fand 48 Stunden p.t. wie

unter 3.2.7 beschrieben statt. Der Gesamtproteingehalt der Zelllysate wurde

vergleichend durch Auftrennung mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung (3.3.1.2)

dargestellt und nach Digitalisierung des Gelbildes mithilfe des Programms TINA2.0

Abbildung 28: Sequenzen der VP24-spezifischen siRNAs sowie der Kontroll-siRNA X.Die VP24-spezifischen Sequenzen wurden in Anlehnung an die Tuschl-Regeln entworfen(4.5.1). Die Kontroll-siRNA X der Firma Qiagen zeigt keine Sequenzspezifität für einbekanntes eukaryotisches Gen.

siRNA VP24 Nr. 1Zielsequenz (10465 - 10487): 5' AACCGTTTTTGGCCCTGAGGATT 3'

Sense siRNA: 5' CCGUUUUUGGCCCUGAGGAdTdT 3'

Antisense siRNA: 5' UCCUCAGGGCCAAAAACGGdTdT 3'

siRNA VP24 Nr. 2Zielsequenz (10819 – 10841): 5' AACCTTGCTGTGGTGAGACAGTC 3'

Sense siRNA: 5' CCUUGCUGUGGUGAGACAGdTdT 3'

Antisense siRNA: 5' CUGUCUCACCACAGCAAGGdTdT 3'

Kontroll-siRNA X:Zielsequenz: 5' AATTCTCCGAACGTGTCACGT 3'

Sense siRNA: 5' UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3'

Antisense siRNA: 5' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3'

4 Ergebnisse 99

ausgewertet und angeglichen. Anschließend wurden entsprechende Mengen der

Zelllysate mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteinexpression von VP24 im

Western Blot gezeigt.

Abbildung 29 zeigt die Proteinexpression des VP24 unter Einfluss verschiedener

Mengen an spezifischer und unspezifischer siRNA.

Bereits der Einsatz von 100 ng beider VP24-spezifischen siRNAs zeigte einen

deutlichen, wenn auch nicht vollständigen Rückgang der VP24-Expression (Abbildung

AMock VP24

100 ng siRNAVP24

1VP24

2 X

1 2 3 4 5

VP24

Tubulin

BMock VP24

250 ng siRNAVP24

1VP24

2 X

1 2 3 4 5

VP24

Tubulin

CMock VP24

500 ng siRNAVP24

1VP24

2 X

1 2 3 4 5

VP24

Tubulin

DMock VP24

750 ng siRNAVP24

1VP24

2 X

1 2 3 4 5

VP24

Tubulin

Mock VP24

1000 ng siRNAVP24

1VP24

2 X

1 2 3 4 5

E

VP24

Tubulin

Abbildung 29: Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNA-Transfektion.250 ng pCAGGS-VP24 wurden entweder allein oder gemeinsam mit verschiedenen Mengen(100 bis 1000 ng) an VP24-spezifischen bzw. Kontroll-siRNA in Vero-Zellen transfiziert. Die Zellernte fand 48 h p.t. statt und die Proteine VP24 und α-Tubulin wurden mittels SDS-PAGE und anschließendem Western Blot dargestellt. VP24 wurde mit dem affinitätsgereinigten VP24-AK sowie einem POD-gekoppelten α Kaninchen-AK, α-Tubulin mit einem mono-klonalen α α-Tubulin-AK sowie einem POD-gekoppelten α Maus-AK gefärbt. A-E zeigen die VP24-Expression (Spur 2) sowie den Einfluss ansteigender siRNA-Konzentrationen an VP24-spezifischen (Spuren 3 + 4) und unspezifischer siRNA (Spur 5).

4 Ergebnisse 100

29 A, Spuren 3 + 4). Die unspezifische Kontroll-siRNA (Spur 5) wies im Vergleich zur

unbehandelten Einzelexpression von VP24 (Spur 2) keinen Effekt auf. Außerdem

wurde zur Kontrolle das konstitutiv exprimierte, zytoplasmatische Protein α-Tubulin

angefärbt, um festzustellen, ob die Transfektion und siRNA-Behandlung einen Einfluss

auf die zelluläre Proteinexpression hatte. Wie die Proteinbanden des Tubulins zeigten,

hatte der Einsatz von 100 ng siRNA keinen Einfluss auf dessen Expression. Diese

Ergebnisse sprechen für eine spezifische Abschaltung der VP24-Expression durch

RNA Interferenz mit den VP24-spezifischen siRNAs. Der Einsatz von 250 ng siRNA

(29 B) hatte bereits einen nahezu vollständigen Rückgang der VP24-Expression zu

Folge (Spuren 3 + 4), der beim Einsatz von 500 ng kaum mehr verstärkt werden

konnte (29 C). Auch hier zeigten die Kontrollen der unspezifischen siRNA (Spur 5)

sowie der Tubulin-Expression, dass es sich um einen spezifischen Effekt handelte. Der

Einsatz von höheren Mengen siRNAs hatte ebenfalls die spezifische Abschaltung des

VP24 (29 C-E) zur Folge. Es konnte jedoch mit diesem Versuch gezeigt werden, dass

bereits eine Menge zwischen 250 und 500 ng siRNA ausreichend ist, um die VP24-

Expression effizient abzuschalten.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung einer weiteren Zelllinie (HeLa CCL2-

Zellen) unter gleichen Versuchsbedingungen beobachtet (Daten nicht gezeigt)

Außerdem wurden VP24-spezifische siRNA-Sequenzen in den pSUPER-Vektor

kloniert. Dieser Vektor enthält einen Polymerase II H1-RNA Promotor, der die

Synthese kleiner RNA-Transkripte ohne Poly-A Schwanz mit klar definierten Enden

ermöglicht, die wie bei siRNAs aus zwei Uridinen bestehen. Die VP24-spezifischen

Sequenzen wurden so in den pSUPER-Vektor kloniert, dass es nach der Transfektion

in eukaryotische Zellen zur Ausbildung von „hairpin“ siRNAs kommt, welche ebenfalls

RNA Interferenz vermitteln können (Brummelkamp et al., 2002). Die VP24-spezifischen

pSUPER-Konstrukte wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin getestet, VP24 in der

transienten Expression abzuschalten (Daten nicht gezeigt). Es zeigte sich jedoch, dass

die Transfektionseffizienz der Vektoren in Vero-Zellen wesentlich geringer war, als die

der siRNAs und daher kein so deutlicher RNAi-Effekt gezeigt werden konnte, wie mit

chemisch synthetisierten siRNAs. Daher wurden ausschließlich die chemisch

synthetisierten siRNAs für die Abschaltung des VP24 in der Virusinfektion benutzt.

4.5.3 Abschalten der VP24-Expression in der Virusinfektion durch RNAi

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die entworfenen siRNA-Sequenzen in der Lage

waren VP24 spezifisch abzuschalten, sollte der Versuchsansatz auf MARV-infizierte

Vero-Zellen übertragen werden.

4 Ergebnisse 101

Der Ansatz wurde in 6 well-Platten durchgeführt. Die Menge an siRNA wurde an diese

Versuchsbedingungen angepasst. Vorversuche ergaben, dass eine einmalige

Transfektion von 2570 ng siRNA (entsprach 500 ng auf einer 24 well-Platte) im

direkten Anschluss an die Virusinfektion sowie eine Zellernte 24 Stunden p.i. kaum

einen Effekt auf die VP24-Expression zeigte. Daher wurde das Transfektions- und

Infektionsschema in Anlehnung an die siRNA-Behandlung von RSV-infizierten Zellen

(Bitko and Barik, 2001) durchgeführt.

Vero-Zellen wurden einen Tag vor der ersten siRNA-Transfektion in 6 well-Platten

ausgesät und bei einer Konfluenz von ca. 70 % mit 1543 ng der entsprechenden

siRNA transfiziert (3.2.6). 8 Stunden nach dieser ersten Transfektion wurden die Zellen

im Sicherheitslabor mit MARV infiziert (m.o.i. = 1), im direkten Anschluss fand eine

zweite siRNA-Transfektion statt. Die Bedingungen und siRNA-Mengen entsprachen

denen der ersten Transfektion. 24 Stunden p.i. wurden die Zellen wie unter 3.2.7

beschrieben geerntet und anschließend aus dem Sicherheitslabor ausgeschleust.

Der Gesamtproteingehalt der Zelllysate wurde vergleichend durch Auftrennung mittels

SDS-PAGE und Coomassie-Färbung (3.3.1.2) dargestellt und nach Digitalisierung des

Gelbildes mithilfe des Programms TINA2.0 ausgewertet und angeglichen.

Anschließend wurden entsprechende Mengen der Zelllysate in der SDS-PAGE

aufgetrennt und die virale Proteinexpression mittels Western Blot analysiert.

In Abbildung 30 A ist zu sehen, dass die Anwendung der VP24 siRNAs (Spuren 3 und

4) zu einem spezifischen Rückgang der VP24-Expression in der Virusinfektion führte,

während dies bei Anwendung der Kontroll-siRNA X (Spur 5) nicht der Fall war. Zur

Kontrolle wurden die zellulären Proteine α-Tubulin und Lamin A/C im Western Blot

dargestellt, deren Expression durch die Anwesenheit der siRNAs nicht beeinträchtigt

wurde.

Nachdem die RNAi-Behandlung eine spezifische Abnahme der VP24 Expression

ermöglichte, stellte sich die Frage, ob die Abwesenheit von VP24 einen Einfluss auf die

Expression der anderen viralen Proteine hatte. In einem artifiziellen Minigenomsystem

konnte bereits gezeigt werden, dass für die Vorgänge der Transkription und Replikation

die Anwesenheit der Nukleokapsidproteine NP, VP35 und L notwendig und

ausreichend ist (Mühlberger et al., 1998) und dass VP24 an diesem Prozess nicht

beteiligt zu sein scheint. Daher wurde durch Western Blot Analysen die Expression der

anderen viralen Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30 untersucht (Abbildung 30 B).

Die RNA-abhängige RNA-Polymerase L konnte aufgrund von fehlenden Antikörpern

zur Detektion dieses Proteins im Western Blot nicht dargestellt werden.

4 Ergebnisse 102

Sowohl bei Einsatz der siRNA VP24 Nr. 1 als auch bei siRNA Nr. 2 (Spuren 3 + 4)

konnte kein Effekt auf die Proteinexpression der genannten viralen Proteine im

Vergleich zur unbehandelten MARV-Infektion (Spur 2) und der Transfektion mit der

unspezifischen Kontroll-siRNA (Spur 5) festgestellt werden. Dieses Ergebnis zeigte

zum einen, dass VP24 tatsächlich nicht an dem Prozess der Transkription und

Replikation während des viralen Vermehrungszyklus beteiligt zu sein scheint. Zum

anderen machten diese Ergebnisse auch deutlich, dass die virale genomische und

antigenomische RNA nicht für den siRNA-vermittelten Abbau von RNA empfänglich ist,

da der Abbau der genomischen RNA nicht nur eine Verminderung der VP24-

Expression, sondern auch eine Verminderung der Expression aller anderen viralen

Proteine zur Folge hätte. Es wird vermutet, dass die Enkapsidierung der viralen

Genome im direkten Anschluss an deren Synthese dafür verantwortlich ist, dass diese

RNA-Moleküle nicht für den siRNA-vermittelten Abbau empfänglich sind.

Abbildung 30: Abschalten der VP24-Expression in der MARV-Infektion durch RNAi. Subkonfluente Vero-Zellen wurden zunächst mit 1543 ng der VP24-spezifischen bzw.Kontroll-siRNAs transfiziert und 8 h p.t. mit MARV infiziert. Im direkten Anschluss fand einezweite siRNA-Transfektion statt. Die Ernte der Zellen erfolgte 24 h p.i. und die Zelllysatewurden mittels SDS-PAGE und Western Blot auf die virale Proteinexpression hin untersucht.A: Färbung des WB gegen VP24, Lamin A/C und α-Tubulin. B: Färbung der Zelllysategegen die viralen Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30.

XVP24 2

VP24 1

∅

siRNAMARV

Mock

1 2 3 4 5

ZelllysatB

NP

VP35

VP40

GP1

VP30

XVP24 2

VP24 1

∅

siRNAMARV

Mock

1 2 3 4 5

ZelllysatA

Lamin A/C

VP24

Tubulin

4 Ergebnisse 103

4.5.4 Freisetzung reifer Viruspartikel von siRNA-behandelten Zellen

Da VP24 als Strukturprotein mit den reifen Viruspartikeln freigesetzt wird, stellte sich

die Frage, ob seine Abwesenheit einen Einfluss auf die Freisetzung reifer Viruspartikel

hat. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden die Zellkulturüberstände der

siRNA-transfizierten, MARV-infizierten Vero-Zellen auf die Anwesenheit von reifen

Partikeln hin untersucht. Dies geschah zum einen mittels Western Blot Analyse durch

Nachweis des Nukleoproteins NP, zum anderen mittels Real-time RT-PCR Analyse

zum Nachweis freigesetzter viraler Genome.

Zunächst wurde ein Aliquot des Zellkulturüberstandes mit 4x Proteinprobenpuffer

versetzt und mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen

(3.3.1.4). Um die Menge an freigesetzten Viruspartikeln sichtbar zu machen, wurde die

Membran gegen das Nukleoprotein NP gefärbt, neben VP40 eine der

Hauptkomponenten der viralen Partikel, das jedoch nicht in der Lage ist, seine eigene

Freisetzung selbstständig zu vermitteln (Abbildung 22).

Der Western Blot ist in Abbildung 31 A dargestellt. Vergleicht man die Menge an

freigesetztem NP im Überstand, so fällt auf, dass die Behandlung der MARV-infizierten

Zellen mit der unspezifischen Kontroll-siRNA (Spur 5) nicht zu einer Verminderung der

Virusfreisetzung im Vergleich zur unbehandelten MARV-Infektion (Spur 2) führt. Im

Gegensatz dazu beobachtet man jedoch einen deutlichen Rückgang an freigesetzten

Viruspartikeln nach der Behandlung mit beiden VP24-spezifischen siRNAs (Spuren 3 +

4).

Die Freisetzung reifer Viruspartikel kann ferner durch den Nachweis der viralen

genomischen RNA im Überstand überprüft werden. Zu diesem Zweck wurde mithilfe

des Viral RNA Mini Kit der Firma Qiagen die virale RNA aus dem Zellkulturüberstand

gereinigt (3.1.5.1). Durch Verwendung von NP-spezifischen Primern wurde die Anzahl

der vorhandenen Genomkopien im Überstand der unbehandelten und siRNA-

behandelten Zellen durch Real-time RT-PCR bestimmt und miteinander verglichen

(3.1.6). Abbildung 31 B zeigt das Ergebnis der quantitativen PCR.

Vergleicht man die Menge an viralen Genomen im Überstand der unbehandelten

Zellen (rote Linie) mit jenem der Zellen die zusätzlich mit der unspezifischen Kontroll-

siRNA X transfiziert wurden (schwarze Linie), so zeigte sich, das hier kein signifikanter

Unterschied in der Freisetzung viraler Genome vorlag. Im Gegensatz dazu zeigte

sowohl die Behandlung mit siRNA VP24 Nr.1 als auch mit siRNA VP24 Nr. 2 eine

deutliche Verminderung der Menge an viralen Genomen im Überstand.

4 Ergebnisse 104

Die Ergebnisse der Western Blot Analyse als auch der Real-time RT-PCR zeigen

deutlich, dass die Abwesenheit von VP24 in der Virusinfektion durch Transfektion von

VP24-spezifischen siRNAs zu einer verminderten Freisetzung viraler Partikel führt.

Diese Beobachtungen unterstreichen die Vermutung, dass das VP24 eine zentrale

Rolle bei der Morphogenese und Ausschleusung von Nachkommenviren spielt.

Abbildung 31: Freisetzung reifer MARV-Partikel nach siRNA-Behandlung. Die Zellkulturüberstände der unter 4.5.3 transfizierten und infizierten Vero-Zellen wurdenzum einen für die Western Blot Analyse mit Probenpuffer versetzt (A), zum anderen wurdefür die Real-time RT-PCR die virale RNA extrahiert (B). A: Western Blot derZellkulturüberstände gefärbt mit dem monoklonalen α NP-AK 2B10. B: Real-time RT-PCR-Analyse der viralen RNA im Zellkulturüberstand mit NP-spezifischen Primern.

XVP24 2

VP24 1

∅

siRNAMARV

Mock

Überstand

1 2 3 4 5

NP

A

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49

MockMock MARV

siVP24 1 siVP24 2 siX

Fluo

resz

enz

(530

nm

)

ZyklusM

ock

Moc

k

MAR

VM

ARV

siVP

24 1

siVP

24 1

siVP

24 2

siVP

24 2

siX

siX

B

1 2 3 4 5

5 Diskussion 105

5 Diskussion

Die Morphogenese umhüllter Viren ist bisher noch nicht sehr gut verstanden. Umhüllte

Viren müssen zur Bildung infektiöser Virionen das im Zytoplasma reifende

Nukleokapsid mit einer Hüllmembran umschließen, welche mit den viralen

Oberflächenproteinen assoziiert ist. Da diese subviralen Komponenten innerhalb der

Zelle getrennt voneinander synthetisiert und assembliert werden, muss der Transport

von Nukleokapsiden und Oberflächenproteinen zur Ausschleusungsstelle zeitlich und

räumlich präzise organisiert sein. Die viralen Matrixproteine gelten hierbei als

Mediatoren dieser Prozesse. Die Filoviren besitzen im Gegensatz zu anderen

Vertretern der Ordnung Mononegavirales zwei Proteine im Matrixraum der Virionen,

wobei VP40 das Analogon der Matrixproteine repräsentiert, während die Funktion des

VP24 unbekannt ist. VP24 gilt als zweites Matrixprotein.

Ziel dieser Arbeit war es, VP24 bezüglich seiner Interaktion mit zellulären Membranen,

der Fähigkeit VLPs zu bilden und seiner Interaktion mit anderen viralen Proteinen zu

untersuchen. Außerdem sollte die Rolle von VP24 in der viralen Morphogenese

während der Virusinfektion durch Einsatz von siRNAs näher betrachtet werden.

Interaktion mit zellulären Membranen

Die Analysen zeigten, dass VP24 in der Lage ist mit zellulären Membranen zu

interagieren, dass jedoch der Hauptanteil des Proteins nicht membranassoziiert

vorliegt. Hier unterscheidet sich das VP24 deutlich von VP40, welches bereits kurz

nach seiner Synthese eine hohe Tendenz zur Interaktion mit Membranen aufweist

(Kolesnikova et al., 2002). Eine nähere Charakterisierung der Membraninteraktion

ergab, dass VP24 zum Teil als lösliches, in Membranvesikeln eingeschlossenes

Protein vorzuliegen scheint, da die Behandlung mit Karbonatpuffer die

Membranassoziation verringerte (Fujiki et al., 1982). Die Behandlung mit hohen

Salzkonzentrationen oder dem Chelatbildner EDTA führte jedoch nicht zu einer

Ablösung des Proteins von den Membranen, was für hydrophobe und nicht

elektrostatische Wechselwirkungen mit den Membranlipiden spricht. Die Koexpression

von VP24 mit VP40 oder GP hatte keinen Einfluss auf die Rekrutierung des VP24 an

die zellulären Membranen. In der Immunfluoreszenzanalyse des singulär exprimierten

WT-VP24 lässt sich nur eine schwache Interaktion mit der Plasmamembran erkennen.

Im Gegensatz dazu ergab die Triton X-114 Phasenpartitionierung von zellulär

exprimiertem VP24 eine 50:50 Verteilung in der wässrigen Phase (enthält lösliche und

peripher membranassoziierte Proteine) und der Detergentienphase (enthält integrale

Membranproteine), was auf eine Tendenz zur Membranintegration hindeutet. Dieses

5 Diskussion 106

Verhalten des VP24 wurde nicht nur in der transienten Expression des Proteins

beobachtet, sondern auch in den reifen Viruspartikeln. Betrachtet man die AS-Sequenz

des VP24, so finden sich weder Signalsequenzen für eine Translokation ins ER, noch

ausreichend lange hydrophobe Regionen, die als Transmembrandomäne fungieren

könnten (von Heijne, 1985; Tusnady et al., 1998). Auch sind keine bekannten

Signalsequenzen für die Anheftung eines GPI-Ankers oder Konsensussequenzen für

eine Acylierung vorhanden (Chatterjee and Mayor, 2001; Resh, 1999). Daher scheint

es unwahrscheinlich, dass Lipid-Modifikationen die Erklärung für das Verhalten in der

Phasenpartitionierung sind. Hydrophobizitätsanalysen der AS-Sequenz von VP24

(Kyte-Doolittle, Hopp-Woods) zeigten jedoch, dass VP24 ein stark hydrophobes Profil

besitzt. Eine mögliche Erklärung für das Verhalten des VP24 in der Triton X-114

Partitionsanalyse wäre, dass VP24 durch Multimerisierung in der Lage ist, Strukturen

auszubilden, welche dann in die Membranen eintauchen und diese starke Assoziation

vermitteln könnten. Für das VP24 des Ebolavirus wurde ein ähnliches Verhalten in der

Phasenpartitionierung beschrieben, und mithilfe von Gelfiltrationsanalysen konnte

gezeigt werden, dass EBOV-VP24 in der Lage zu sein scheint, Tetramere auszubilden

(Han et al., 2003). Ein ähnliches Verhalten in der Gelfiltration konnte auch in dieser

Arbeit für das MARV-VP24 beobachtet werden, jedoch waren Crosslinking-Analysen

bezüglich der Multimerisierung des VP24 bisher nicht erfolgreich (Daten nicht gezeigt).

Neben dem VP24 des EBOV zeigt auch das M1-Protein von Influenza A das Verhalten

eines partiell membranassoziierten und –integrierten Proteins (Zhang and Lamb,

1996). Das Verhalten von M1 in der Phasenpartitionierung konnte bisher nicht erklärt

werden, da es, ebenso wie das VP24, keine membrandurchspannende Domäne

enthält. Allerdings besitzt die AS-Sequenz des M1 einige hydrophobe Bereiche und es

liegt in der Flotationsanalyse stark membranassoziiert vor (ca. zu 70 %). Man nimmt

an, dass es zu einem Zusammenschluss der hydrophoben Domänen mehrerer M1-

Moleküle kommt, die dann eine besonders enge Interaktion mit Membranen vermitteln

(Zhang and Lamb, 1996).

Bildung von virusähnlichen Partikeln

Die Matrixproteine vieler NNS-RNA-Viren sind bei transienter Einzelexpression in der

Lage, ihre eigene Freisetzung von den Zellen in Form von virusähnlichen Partikeln zu

vermitteln. Diese Eigenschaft ist auch für das VP40 der Filoviren gezeigt (Noda et al.,

2002; Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al., 2004b). Bei diesem Prozess der

Abschnürung und Freisetzung viraler Partikel bzw. VLPs scheinen sogenannte Late-

Domain-Motive, kurze Peptidmotive, die die zelluläre Knospungsmaschinerie an den

Ort der Virusfreisetzung dirigieren, eine entscheidende Rolle zu spielen. Es stellte sich

5 Diskussion 107

die Frage, ob auch VP24, als zweites Matrixprotein der Filoviren, in der Lage ist, VLPs

zu bilden. Für das VP24 von EBOV konnte gezeigt werden, dass es in einer

membranumhüllten Form von transfizierten Zellen freigesetzt wird, jedoch in wesentlich

geringeren Mengen als das VP40 (Han et al., 2003). MARV-VP24 konnte jedoch bei

transienter Einzelexpression im Gegensatz zu EBOV-VP24 nicht in Form von VLPs im

Zellkulturüberstand nachgewiesen werden. Für EBOV-VP24 wurde postuliert, dass das

AS-Motiv YXXL, welches als Late-Domain-Motiv des Virus der infektiösen Anämie der

Pferde identifiziert wurde (Puffer et al., 1997; Li et al., 2002), die Freisetzung von VP24

vermitteln könnte. MARV-VP24 besitzt jedoch kein klassisches Late-Domain-Motiv,

was das unterschiedliche Verhalten in der Freisetzung erklären könnte. Die

Koexpression mit MARV-VP40 führt jedoch zur Freisetzung von VP24 in den von VP40

gebildeten VLPs, was darauf hindeutet, dass VP24 durch das VP40 in die viralen

Partikel rekrutiert wird. Dahingegen ist das Oberflächenprotein GP nicht in der Lage,

VP24 in die sphärischen, von GP gebildeten VLPs einzubauen, obwohl für MARV-

VP24 eine Tendenz zur Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des GP gezeigt

werden konnte (Bamberg, 2000).

Für die transiente Koexpression von VP40 und GP ist bekannt, dass beide Proteine

sich gegenseitig in ihrer Freisetzung verstärken und dass GP sehr effizient in die von

VP40 gebildeten VLPs eingebaut wird (Swenson et al., 2004; Kolesnikova et al.,

2004b). Daher wurde untersucht, ob auch VP24 in der Lage ist die Bildung der VP40-

VLPs zu beeinflussen. Die Koexpression von VP24 und VP40 führte zwar zum Einbau

des VP24 in die VLPs, jedoch blieb die Menge an freigesetztem VP40 im Vergleich zu

seiner Einzelexpression unverändert. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die

Koexpression von EBOV-VP24 und EBOV-VP40 beschrieben (Licata et al., 2004). Die

Freisetzung von GP wurde ebenfalls kaum von der Anwesenheit des VP24 beeinflusst.

Wurden alle drei Proteine gemeinsam exprimiert, so konnte man eine erhöhte

Freisetzung von VP24, im Vergleich zur Koexpression mit VP40, beobachten. Hier

kann man jedoch davon ausgehen, dass die erhöhte Menge darauf zurückzuführen ist,

dass die Anwesenheit von GP die Freisetzung von VP40 verstärkt und die vermehrte

Freisetzung von VP40 somit auch vermehrt VP24 in den Überstand transportiert.

Allerdings war ein Effekt von VP24 auf den Einbau des GP in die VLPs zu beobachten.

Die Menge an eingebautem GP war im Vergleich zur Koexpression ohne VP24 leicht

verringert. Wie dieser Effekt zustande kommt ist bisher unklar, jedoch war diese

Beobachtung mehrfach reproduzierbar. Dr. Larissa Kolesnikova konnte zeigen, dass

der zytoplasmatische Anteil des GP kaum eine Rolle bei der Rekrutierung durch VP40

in die VLPs spielt. Dafür scheinen andere Bereiche im GP, wie die Transmembran-

oder die Ektodomäne verantwortlich zu sein (persönliche Mitteilung). Für das VP24

5 Diskussion 108

konnte hingegen eine sequenzspezifische Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil

des GP gezeigt werden (Bamberg, 2000). In Abbildung 33 ist eine schematische

Vorstellung für die Bildung der filoviralen Hüllmembran gezeigt. Es ist bekannt, dass

Matrixproteine dazu neigen, in direkter Assoziation mit Membranen gitternetzartige

Strukturen auszubilden. GP wird durch Koexpression mit VP40 in einer bestimmten

Quantität in dieses Gitternetz eingebaut. Wird jedoch das zweite Matrixprotein VP24

koexprimiert, wäre eine Veränderung der von VP40 ausgebildeten Netzwerkstruktur

durch das VP24 denkbar. In die so gebildete virale Matrix würde GP anders eingebaut

als in jene, welche ausschließlich von VP40 gebildet wird. Außerdem wäre durch eine

direkte Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des GPs ein veränderter Einbau in

die VLPs zu erklären. Im Moment ist jedoch unklar, welche Bedeutung die verringerte

Einbaurate des GP in Gegenwart von VP24 hat.

Durch Koexpression sollte versucht werden, NP in die von VP40 gebildeten VLPs

einzubauen. Für das NP vom Marburgvirus ist gezeigt, dass die singuläre Expression

zur Ausbildung von nukleokapsidähnlichen Strukturen führt (Mavrakis et al., 2002), die

den Einschlusskörpern in der Virusinfektion ultrastrukturell stark ähneln (Kolesnikova et

al., 2000). Allerdings zeigen diese Strukturen keine so starke Kondensierung wie die

reifen RNP-Komplexe, was auf den Einfluss anderer viraler Proteine auf die strukturelle

Organisation der reifen Nukleokapside hindeutet. Der Einbau von singulär

exprimiertem NP in die virusähnlichen Partikel war nicht erfolgreich und es kam zu

einer nicht-membrangeschützten Freisetzung in den Überstand nach Koexpression von

VP40 bzw. VP40 und VP24. Wie NP hierbei freigesetzt wurde ist bisher unklar,

ultrastrukturelle Analysen zeigten eine Assoziation mit der Außenseite der VLPs (Daten

GP

VP40

GP

VP40VP24

GP

VP40

GP

VP40

GP

VP40VP24

GP

VP40VP24

Abbildung 32: Schematische Darstellung der filoviralen Hüllmembran. Dargestellt ist eine modellhafte Vorstellung der Bildung der filoviralen Hüllmembran in Ab-und Anwesenheit von VP24 sowie der Einbau des Oberflächenproteins GP in dieseOberflächenstrukturen.

5 Diskussion 109

nicht gezeigt). Es wird vermutet, dass es durch die Überexpression von VP40 und

VP24 und den späten Zeitpunkt der Zellernte (nach 48 Stunden) zu einer

unspezifischen Freisetzung von NP aus nicht mehr intakten Zellen kommt. Für den

Einbau in die VLPs scheinen somit die durch Einzelexpression entstehenden

Strukturen des NP nicht ausreichend zu sein. Für das Ebolavirus konnte gezeigt

werden, dass für die Ausbildung von Nukleokapsiden, die ultrastrukturell reifen RNP-

Komplexen ähneln, die Proteine NP, VP35 und VP24 notwendig und ausreichend sind

(Huang et al., 2002).

Während die Late-Domain-Motive des EBOV-VP40 sowie der Matrixproteine weiterer

Vertreter der Familien der Rhabdo- und Paramyxoviridae hinsichtlich ihrer Funktion bei

der Abschnürung viraler Partikel bzw. VLPs näher untersucht sind, ist über die Rolle

des PPPY-Motiv des MARV-VP40 sowie dessen Einfluss auf den Einbau von VP24 in

die VLPs bisher nichts bekannt. Für das M-Protein von VSV sowie für das Z-Protein

von Lassavirus (Jayakar et al., 2000; Strecker et al., 2003) konnte gezeigt werden,

dass bereits der Austausch des Tyrosin (Y) gegen Alanin (A) die Funktionalität des

PPPY-Motivs stark beeinträchtigt und nur noch eine schwache Knospungsaktivität zu

beobachten ist. Durch die Substitution des Tyrosin-Rests im PPPY-Motiv des MARV-

VP40 durch Alanin, sollte dieses Sequenzmotiv hinsichtlich seines Einflusses auf die

VP40-Freisetzung und VP24-Rekrutierung untersucht werden. Überaschenderweise

war die Effizienz in der Freisetzung von VP40 durch die Mutation des PPPY-Motivs

nicht beeinflusst. Diese AS-Sequenz scheint somit, im Vergleich zu anderen

Matrixproteinen, nicht entscheidend für die Virusfreisetzung zu sein. Auch spielte das

PPPY-Motiv keine Rolle bei der Rekrutierung von VP24 in die VLPs, da sich die Menge

an eingebautem VP24 auch bei Mutation dieses Motivs nicht änderte. Diese

Ergebnisse lassen vermuten, dass im Falle das MARV-VP40 andere AS-Sequenzen

innerhalb des Proteins für die Rekrutierung des VP24 in die VLPs sowie die Interaktion

mit zellulären Faktoren zur Vermittlung der Virusfreisetzung eine Rolle spielen, die

bisher jedoch noch nicht beschrieben sind. So besitzt z.B. das Influenza A M1-Protein

kein typisches Late-Domain-Motiv, ist jedoch auch bei singulärer, transienter

Expression in der Lage VLPs zu bilden und wird von den transfizierten Zellen

freigesetzt (Gómez-Puertas et al., 2000). Hier scheinen ebenfalls bisher nicht näher

beschriebene AS-Sequenzen für die Interaktion mit zellulären Proteinen und die

Virusfreisetzung verantwortlich zu sein.

5 Diskussion 110

Interaktion des MARV-VP24 mit NP und VP40

Betrachtet man die intrazelluläre Lokalisation des VP24 in der MARV-Infektion, so zeigt

sich in der Immunfluoreszenzanalyse sowie in der elektronenmikroskopischen

Untersuchung eine deutliche Kolokalisation mit den viralen Einschlusskörpern, den

Reifungszentren der Nukleokapside, deren Hauptkomponente das NP ist. Die

transiente Koexpression von VP24 und NP führte zu einer Relokalisation des VP24 in

die NP-Aggregate, was für ein direktes Wechselspiel beider Proteine spricht. Allerdings

wurde außerdem beobachtet, dass die Kolokalisation nur in den perinukleären

Aggregaten, nicht jedoch in der Zellperipherie stattfindet. Für EBOV ist eine Beteiligung

des VP24 an der Reifung viraler Nukloekapside gezeigt (Huang et al., 2002). Die hier

erhaltenen Ergebnisse für das Marburgvirus lassen eine ähnliche Funktion des MARV-

VP24 in der Reifung von Nukleokapsiden vermuten, jedoch ist es fraglich, ob und wie

VP24 in den Transport der reifen Nukleokapside involviert ist. Im Vergleich zu VP24

zeigt das Matrixprotein VP40 von MARV nur eine schwache Kolokalisation mit den

Einschlusskörpern der Virusinfektion sowie den NP-Aggregaten in der rekombinanten

Koexpression (Dr. Larissa Kolesnikova, persönliche Mitteilung). Dahingegen interagiert

VP40 stark mit zellulären Membranen und es wird sechs Mal mehr

membranassoziiertes VP40 transportiert als nukleokapsidassoziiertes (Kolesnikova et

al., 2002). Jedoch wurde VP40 in der Virusinfektion in Assoziation mit einzelnen, reifen

RNP-Komplexen, welche zur Plasmamembran transportiert wurden, detektiert und

könnte somit eine Rolle im Transport dieser Nukleokapside spielen. Die hier gezeigten

Daten sowie die publizierten Daten bezüglich des EBOV VP24 scheinen eher gegen

einen Kotransport von Nukleokapsiden und VP24 zu sprechen.

Betrachtet man VP24 und VP40 in der Immunfluoreszenzanalyse, so beobachtet man

eine schwache Kolokalisation der beiden Proteine, vor allem im Bereich der

Plasmamembran sowie in Plasmamembranausläufern. VP24 zeigt keinerlei

Kolokalisation mit den großen VP40-Clustern in den multivesikulären Strukturen des

späten Endosoms (MVBs) in der Zellperipherie oder in Kernnähe. Koimmun-

präzipitationsanalysen von MARV-VP24 und VP40 waren ebenfalls nicht erfolgreich,

jedoch ist VP40 in der Lage, VP24 spezifisch in VLPs zu rekrutieren. Es ist ungeklärt,

ob es sich bei dieser Rekrutierung um eine direkte Interaktion oder vielleicht um eine

indirekte Rekrutierung mittels bisher unbekannter, zellulärer Faktoren handelt. Auch für

das EBOV-VP24 konnte nur eine schwache Interaktion mit dem EBOV-VP40

nachgewiesen werden (Licata et al., 2004).

5 Diskussion 111

Abschalten der VP24-Expression durch RNA Interferenz

Durch Anwendung der siRNA Technologie ist es möglich, die Expression einzelner

Proteine gezielt durch den Abbau ihrer jeweiligen mRNA abzuschalten. Dieser Prozess

der RNA Interferenz ist unter anderem als Ansatz für eine antivirale Therapie

interessant. Bisher konnte eine Inhibition der Virusreplikation durch RNAi für eine

Reihe von Viren gezeigt werden, so z.B. für HIV-I (Novina et al., 2002), HCV (Kapadia

et al., 2003), Influenza A Virus (Ge et al., 2003), das Respiratorische Syncytialvirus

RSV (Bitko and Barik, 2001) oder auch das Hepatitis B Virus (Shlomai et al., 2003).

Jedoch ist es noch nicht möglich, siRNAs zur antiviralen Therapie einzusetzen.

Nichtsdestotrotz ist die RNA Interferenz ein interessantes Werkzeug für die virale

Grundlagenforschung.

Um die Rolle des VP24 in der Infektion näher zu untersuchen, wurden zwei

verschiedene VP24-spezifische siRNAs synthetisiert, welche beide in der Lage waren

VP24 spezifisch in der transienten Expression abzuschalten, während eine

unspezifische Kontroll-siRNA keinen Einfluss auf die VP24-Expression hatte. Der

Einsatz beider siRNA-Sequenzen war ebenfalls in der MARV-Infektion erfolgreich. Nun

war interessant, welche Folgen die Abwesenheit des VP24 auf die Virusreplikation und

Morphogenese hat. Für das Marburgvirus konnte bereits mithilfe eines artifiziellen

Minigenomsystems gezeigt werden, dass für die Transkription der viralen mRNA-

Spezies sowie die Replikation des viralen Genoms die Nukleokapsidproteine NP, VP35

und L notwendig und ausreichend sind (Mühlberger et al., 1998). In diesem System

konnte kein Einfluss von VP24 auf diese Prozesse gezeigt werden, genauso wenig wie

für das Nukleokapsidprotein VP30. Jedoch zeigte der Einsatz einer VP30-spezifischen

siRNA in der Infektion, dass das VP30 des MARV für die Vorgänge der Transkription

und Replikation durchaus eine Rolle spielt, diese jedoch mittels des artifiziellen

Minigenomsystems nicht gezeigt werden konnte (Fowler and Bamberg et al., in

submission).

Daher wurde durch Western Blot Analysen untersucht, ob die Abwesenheit des VP24

die Expression der anderen Virusproteine beeinflusst. Die Expression der viralen

Proteine NP, VP35, VP40, GP und VP30 in der unbehandelten Infektion wurde mit der

in den siRNA-behandelten Zellen verglichen. Dieser Vergleich ergab, dass das

Abschalten der VP24-Expression durch RNAi keinen Einfluss auf die Expression der

anderen viralen Proteine hat. Nur VP24 wurde spezifisch abgeschaltet. Dies wiederum

bedeutet zum einen, dass VP24, auch in der Virusinfektion, nicht an den Prozessen

der Transkription und Replikation beteiligt zu sein scheint, da ansonsten eine Abnahme

in der Expression der anderen Proteine erwartet werden würde. Zum anderen lässt

sich indirekt auf die Zugänglichkeit der viralen Genome und Antigenome durch den

5 Diskussion 112

RNAi-Mechanismus schließen. Während der Infektion entstehen in der Zelle sowohl

negativsträngige als auch positivsträngige virale RNA-Genome. Beide RNA-Moleküle

zeigen komplementäre Sequenzen zu den siRNAs. Daher könnte man erwarten, dass

auch diese genomischen RNA-Moleküle für den RNAi-Mechanismus zugänglich sind.

Die Expression der viralen Proteine macht jedoch deutlich, dass nur die VP24-

spezifische mRNA betroffen ist. Die genomischen RNAs wurden nicht als

Zielsequenzen von den siRNAs erkannt und nicht abgebaut. Gleiche Ergebnisse

bezüglich der viralen Genome wurden auch bei der siRNA-Behandlung von RSV-

infizierten Zellen (Bitko and Barik, 2001) sowie bei Influenza A-infizierten Zellen

beschrieben (Ge et al., 2003). Man nimmt an, dass die viralen Genome aufgrund der

kompletten Enkapsidierung durch die jeweiligen Nukleoproteine im direkten Anschluss

an deren Synthese nicht für den RNAi-Mechanismus zugänglich sind.

Betrachtet man im Weiteren die Freisetzung von reifen Virionen in den

Zellkulturüberstand, so fällt auf, dass die Behandlung mit den VP24-spezifischen

siRNAs im Vergleich zu den Kontrollen zu einer verminderten Freisetzung führte. Damit

konnte gezeigt werden, dass das VP24 des Marburgvirus eine wichtige Rolle in der

viralen Morphogenese spielt und dass dieses Protein für eine effiziente Freisetzung der

Tochtervirionen notwendig ist. Welche Mechanismen VP24 dabei genau vermittelt,

konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgeklärt werden. Aufgrund der hier

erhobenen Daten ist aber eine Funktion im Reifungsprozess sowie dem Einbau von

RNP-Komplexen denkbar. Allerdings konnte für EBOV gezeigt werden, dass VP24 für

die Produktion infektiöser VLPs, die ein GFP-exprimierendes EBOV-Minigenom tragen,

nicht benötigt wird (Watanabe et al., 2004). Jedoch handelt es sich hier um ein

artifizielles System, bei dem der Einfluss des VP24 auf die Partikelreifung eventuell

durch andere Faktoren beeinflusst oder überlagert sein könnte. Ein weiterer Hinweis,

dass VP24 essentiell ist für die Virusreifung ist, kommt aus Studien mit VP24-

defizienten Ebolaviren, die mithilfe von reverser Genetik erzeugt wurden (Volchkov et

al., 2001). Hier war es nach Deletion des VP24-Gens nicht möglich reife, infektiöse

Viruspartikel zu generieren (Viktor Volchkov, persönliche Mitteilung).

Die hier erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, dass das VP24 des Marburgvirus als

strukturelle Komponente der Virionen eine wichtige Rolle in der Morphogenese reifer

Partikel spielt. Aufgrund der hier gezeigten starken Assoziation mit dem Nukleoprotein

NP scheint dabei eine Beteiligung an der Reifung der RNP-Komplexe sowie deren

Transport wahrscheinlich.

6 Zusammenfassung 113

6 Zusammenfassung

Das Marburgvirus bildet zusammen mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae.

Hierbei handelt es sich um hochpathogene Erreger, die sowohl bei menschlichen als

auch nichtmenschlichen Primaten schwere, oft tödliche Erkrankungen mit

hämorrhagischer Diathese verursachen. Eine Besonderheit dieser Viren ist das

Vorhandensein von zwei Matrixproteinen, VP40 und VP24. VP40 stellt das Analogon

zu den Matrixproteinen anderer Mononegavirales dar. Die Funktion des zweiten

Matrixproteins VP24 ist bislang ungeklärt. Aus früheren Untersuchungen war eine

Interaktion mit dem zytoplasmatischen Anteil des Oberflächenproteins GP sowie eine

schwache Bindung an negativ geladene Membranen bekannt.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass VP24 eine schwache Tendenz zur

Interaktion mit zellulären Membranen aufwies, welche durch Koexpression von GP

oder VP40 nicht verstärkt werden konnte. Allerdings war eine Tendenz zur

Membranintegration von transient exprimiertem sowie viralem VP24 vorhanden, deren

Zustandekommen und Bedeutung jedoch bisher nicht geklärt ist. VP24 ist des

Weiteren nicht in der Lage, seine eigene Freisetzung in Form von virusähnlichen

Partikeln (VLPs) zu vermitteln, wird jedoch in die von VP40 gebildeten, filamentösen

VLPs rekrutiert. Außerdem scheint VP24 einen Einfluss auf die Inkorporation des

Oberflächenproteins GP in die von VP40 gebildeten VLPs zu haben.

VP24 zeigte eine deutliche Kolokalisation mit den Einschlusskörpern der Virusinfektion,

welche die Reifungszentren viraler Nukleokapside darstellen. Eine direkte Interaktion

von VP24 und NP wurde durch Immunfluoreszenzanalysen nachgewiesen. Im

Gegensatz dazu scheint die Interaktion von VP24 und VP40 nur schwach ausgeprägt

zu sein, wie Koimmunfluoreszenzanalysen sowie Koimmunpräzipitationstudien zeigten.

Mithilfe von RNA Interferenz war es möglich, VP24 sowohl in der transienten

Expression als auch in der viralen Infektion abzuschalten. Hier konnte gezeigt werden,

dass VP24 in der Infektion keine Rolle bei der viralen Transkription und Replikation

spielt, jedoch beim Zusammenbau reifer Virionen nötig ist, um diese von den Zellen

freizusetzen. Auch konnte indirekt gezeigt werden, dass der Mechanismus der RNA

Interferenz nicht in der Lage ist, die viralen RNA-Genome zu erkennen und abzubauen.

Die hier erhaltenen Ergebnisse lassen vermuten, dass das VP24 des Marburgvirus als

strukturelle Komponente der Virionen eine wichtige Rolle in der Morphogenese reifer

Partikel spielt. Aufgrund seiner starken Assoziation mit dem Nukleoprotein scheint

dabei die Beteiligung an der Reifung der Nukleokapside sowie deren Transport

wahrscheinlich.


7 Literaturverzeichnis

Baize, S., Leroy, E. M., Georges-Courbot, M. C., Capron, M., Lansoud-Soukate, J., Debre, P.,

Fisher-Hoch, S. P., McCormick, J. B., and Georges, A. J. (1999). Defective humoral

responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola

virus-infected patients. Nat Med 5(4), 423-6.

Baize, S., Marianneau, P., Georges-Courbot, M. C., and Deubel, V. (2001). Recent advances in

vaccines against viral haemorrhagic fevers. Curr Opin Infect Dis 14(5), 513-8.

Bamberg, S. (2000): Interaktion des Marburg-Virus VP24 mit dem Oberflächenprotein GP und

anionischen Membranstrukturen. Diplomarbeit. Philipps-Universität, Marburg

Basler, C. F., Wang, X., Mühlberger, E., Volchkov, V., Paragas, J., Klenk, H. D., Garcia-Sastre, A.,

and Palese, P. (2000). The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist.

Proc Natl Acad Sci U S A 97(22), 12289-94.

Basler, C. F., Mikulasova, A., Martinez-Sobrido, L., Paragas, J., Mühlberger, E., Bray, M., Klenk, H.

D., Palese, P., and Garcia-Sastre, A. (2003). The Ebola virus VP35 protein inhibits

activation of interferon regulatory factor 3. J Virol 77(14), 7945-56.

Basler, C. F., and Palese, P. (2003) Modulation of Innate Immunity by Filoviruses. In: Ebola and

Marburg Viruses: Molecular and Cellular Biology, Horizon Bioscience. 305-350

Becker, S., Feldmann, H., Will, C., and Slenczka, W. (1992). Evidence for occurrence of filovirus

antibodies in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur

worldwide? Med Microbiol Immunol 181(1), 43-55.

Becker, S., Huppertz, S., Klenk, H. D., and Feldmann, H. (1994). The nucleoprotein of Marburg

virus is phosphorylated. J Gen Virol 75 ( Pt 4), 809-18.

Becker, S., Spiess, M., and Klenk, H. D. (1995). The asialoglycoprotein receptor is a potential liver-

specific receptor for Marburg virus. J Gen Virol 76(Pt 2), 393-9.

Becker, S., Rinne, C., Hofsass, U., Klenk, H. D., and Mühlberger, E. (1998). Interactions of Marburg

virus nucleocapsid proteins. Virology 249(2), 406-17.

Berghöfer B, (2003): Verteilung, Transport und Freisetzung von Marburg-Virus VP40 und

Interaktion mit dem Oberflächenprotein GP. Diplomarbeit. Philipps-Universität, Marburg

Bergmann, J. E., and Fusco, P. J. (1988). The M protein of vesicular stomatitis virus associates

specifically with the basolateral membranes of polarized epithelial cells independently of the

G protein. J Cell Biol 107(5), 1707-15.

Bertherat, E., Talarmin, A., and Zeller, H. (1999). [Democratic Republic of the Congo: between civil

war and the Marburg virus. International Committee of Technical and Scientific

Coordination of the Durba Epidemic]. Med Trop (Mars) 59(2), 201-4.

Bitko, V., and Barik, S. (2001). Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific

double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild

type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol 1(1), 34.


Bordier, C. (1981). Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution. J Biol

Chem 256(4), 1604-7.

Bowen, E. T., Lloyd, G., Harris, W. J., Platt, G. S., Baskerville, A., and Vella, E. E. (1977). Viral

haemorrhagic fever in southern Sudan and northern Zaire. Preliminary studies on the

aetiological agent. Lancet 1(8011), 571-3.

Bray, M., Driscoll, J., and Huggins, J. W. (2000). Treatment of lethal Ebola virus infection in mice

with a single dose of an S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase inhibitor. Antiviral Res 45(2), 135-47.

Bray, M., Raymond, J. L., Geisbert, T., and Baker, R. O. (2002). 3-deazaneplanocin A induces

massively increased interferon-alpha production in Ebola virus-infected mice. Antiviral Res

55(1), 151-9.

Brummelkamp, T. R., Bernards, R., and Agami, R. (2002). A system for stable expression of short

interfering RNAs in mammalian cells. Science 296(5567), 550-3.

CDC (Centers for Disease Control) (1995) Update: Outbreak of Ebola Viral Hemorrhagic Fever -

Zaire, 1995. MMWR 44(25), 468-9, 475; 44(20), 399

CDC (Centers for Disease Control) (1996) Ebola Reston Virus Infection Among Quarantined

Nonhuman Primates - Texas, 1996. MMWR 45(15), 314-6

Chan, S. Y., Empig, C. J., Welte, F. J., Speck, R. F., Schmaljohn, A., Kreisberg, J. F., and

Goldsmith, M. A. (2001). Folate receptor-alpha is a cofactor for cellular entry by Marburg

and Ebola viruses. Cell 106(1), 117-26.

Chatterjee, S., and Mayor, S. (2001). The GPI-anchor and protein sorting. Cell Mol Life Sci 58(14), 1969-87.

Chong, L. D., and Rose, J. K. (1993). Membrane association of functional vesicular stomatitis virus

matrix protein in vivo. J Virol 67(1), 407-14.

Chong, L. D., and Rose, J. K. (1994). Interactions of normal and mutant vesicular stomatitis virus

matrix proteins with the plasma membrane and nucleocapsids. J Virol 68(1), 441-7.

Cogoni, C., and Macino, G. (2000). Post-transcriptional gene silencing across kingdoms. Curr Opin

Genet Dev 10(6), 638-43.

Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., and Grosfeld, H. (1996). Transcription elongation factor of

respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci

U S A 93(1), 81-5.

Coronel, E. C., Murti, K. G., Takimoto, T., and Portner, A. (1999). Human parainfluenza virus type 1

matrix and nucleoprotein genes transiently expressed in mammalian cells induce the

release of virus-like particles containing nucleocapsid-like structures. J Virol 73(8), 7035-8.

Coronel, E. C., Takimoto, T., Murti, K. G., Varich, N., and Portner, A. (2001). Nucleocapsid

incorporation into parainfluenza virus is regulated by specific interaction with matrix protein.

J Virol 75(3), 1117-23.


Dessen, A., Volchkov, V., Dolnik, O., Klenk, H. D., and Weissenhorn, W. (2000). Crystal structure of

the matrix protein VP40 from Ebola virus. Embo J 19(16), 4228-36.

Dessen, A., Forest, E., Volchkov, V., Dolnik, O., Klenk, H. D., and Weissenhorn, W. (2000).

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the matrix protein from Ebola virus. Acta

Crystallogr D Biol Crystallogr 56 ( Pt 6), 758-60.

Doench, J. G., Petersen, C. P., and Sharp, P. A. (2003). siRNAs can function as miRNAs. Genes

Dev 17(4), 438-42.

Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes

of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature

411(6836), 494-8.

Elliott, L. H., Kiley, M. P., and McCormick, J. B. (1985). Descriptive analysis of Ebola virus proteins.

Virology 147(1), 169-76.

Feldmann, H., Will, C., Schikore, M., Slenczka, W., and Klenk, H. D. (1991). Glycosylation and

oligomerization of the spike protein of Marburg virus. Virology 182(1), 353-6.

Feldmann, H., Mühlberger, E., Randolf, A., Will, C., Kiley, M. P., Sanchez, A., and Klenk, H. D.

(1992). Marburg virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of

the replication cycle. Virus Res 24(1), 1-19.

Feldmann, H., Klenk, H. D., and Sanchez, A. (1993). Molecular biology and evolution of filoviruses.

Arch Virol Suppl 7, 81-100.

Feldmann, H., and Klenk, H. D. (1996). Marburg and Ebola viruses. Adv Virus Res 47, 1-52.

Feldmann, H., Slenczka, W., and Klenk, H. D. (1996). Emerging and reemerging of filoviruses. Arch

Virol Suppl 11, 77-100.

Feldmann, H., and Kiley, M. P. (1999). Classification, structure, and replication of filoviruses. Curr

Top Microbiol Immunol 235, 1-21.

Fisher-Hoch, S. P., Perez-Oronoz, G. I., Jackson, E. L., Hermann, L. M., and Brown, B. G. (1992).

Filovirus clearance in non-human primates. Lancet 340(8817), 451-3.

Fisher-Hoch, S. P., and McCormick, J. B. (1999). Experimental filovirus infections. Curr Top

Microbiol Immunol 235, 117-43.

Fowler, T., Bamberg, S., Möller, P., Rudel, T., Klenk, H.-D., Meyer, T.F., Becker, S., and Rudel, T.

(2004). Inhibition of Marburgvirus Protein Expression and Viral Release by RNA

Interference. in submission

Funke, C., Becker, S., Dartsch, H., Klenk, H.-D., and Mühlberger, E. (1995). Acylation of the

Marburg Virus Glycoprotein. Virology 208(1), 289-97

Freed, E. O. (2002). Viral late domains. J Virol 76(10), 4679-87.

Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., and Lazarow, P. B. (1982). Isolation of intracellular

membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic

reticulum. J Cell Biol 93(1), 97-102.


Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., and Melero, J. A. (1993). Cytoplasmic inclusions of

respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells

that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology 195(1),

243-7.

Garnier, L., Wills, J. W., Verderame, M. F., and Sudol, M. (1996). WW domains and retrovirus

budding. Nature 381(6585), 744-5.

Garoff, H., Hewson, R., and Opstelten, D. J. (1998). Virus maturation by budding. Microbiol Mol Biol

Rev 62(4), 1171-90.

Ge, Q., McManus, M. T., Nguyen, T., Shen, C. H., Sharp, P. A., Eisen, H. N., and Chen, J. (2003).

RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation

and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 100(5), 2718-

23.

Ge, Q., Filip, L., Bai, A., Nguyen, T., Eisen, H. N., and Chen, J. (2004). Inhibition of influenza virus

production in virus-infected mice by RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A 101(23), 8676-81.

Geisbert, T. W., and Jahrling, P. B. (1995). Differentiation of filoviruses by electron microscopy.

Virus Res 39(2-3), 129-50.

Geisbert, T. W., Hensley, L. E., Jahrling, P. B., Larsen, T., Geisbert, J. B., Paragas, J., Young, H.

A., Fredeking, T. M., Rote, W. E., and Vlasuk, G. P. (2003). Treatment of Ebola virus

infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa/tissue factor: a study in rhesus monkeys.

Lancet 362(9400), 1953-8.

Geyer, H., Will, C., Feldmann, H., Klenk, H. D., and Geyer, R. (1992). Carbohydrate structure of

Marburg virus glycoprotein. Glycobiology 2(4), 299-312.

Gomez-Puertas, P., Albo, C., Perez-Pastrana, E., Vivo, A., and Portela, A. (2000). Influenza virus

matrix protein is the major driving force in virus budding. J Virol 74(24), 11538-47.

Gonzalez, S. A., Affranchino, J. L., Gelderblom, H. R., and Burny, A. (1993). Assembly of the matrix

protein of simian immunodeficiency virus into virus-like particles. Virology 194(2), 548-56.

Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., and Haseltine, W. A. (1991). Effect of mutations

affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proc Natl

Acad Sci U S A 88(8), 3195-9.

Gottwein, E., Bodem, J., Muller, B., Schmechel, A., Zentgraf, H., and Krausslich, H. G. (2003). The

Mason-Pfizer monkey virus PPPY and PSAP motifs both contribute to virus release. J Virol

77(17), 9474-85.

Hammond, S. M., Caudy, A. A., and Hannon, G. J. (2001). Post-transcriptional gene silencing by

double-stranded RNA. Nat Rev Genet 2(2), 110-9.

Han, Z., Boshra, H., Sunyer, J. O., Zwiers, S. H., Paragas, J., and Harty, R. N. (2003). Biochemical

and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein: implications for a role in

virus assembly and budding. J Virol 77(3), 1793-800.


Hannon, G. J. (2002). RNA interference. Nature 418(6894), 244-51.

Harty, R. N., Paragas, J., Sudol, M., and Palese, P. (1999). A proline-rich motif within the matrix

protein of vesicular stomatitis virus and rabies virus interacts with WW domains of cellular

proteins: implications for viral budding. J Virol 73(4), 2921-9.

Huang, Y. T., Collins, P. L., and Wertz, G. W. (1985). Characterization of the 10 proteins of human

respiratory syncytial virus: identification of a fourth envelope-associated protein. Virus Res

2(2), 157-73.

Huang, Y., Xu, L., Sun, Y., and Nabel, G. J. (2002). The assembly of Ebola virus nucleocapsid

requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of

nucleoprotein. Mol Cell 10(2), 307-16.

Huggins, J., Zhang, Z. X., and Bray, M. (1999). Antiviral drug therapy of filovirus infections: S-

adenosylhomocysteine hydrolase inhibitors inhibit Ebola virus in vitro and in a lethal mouse

model. J Infect Dis 179 Suppl 1, S240-7.

Hughes, J. H., Mann, D. R., and Hamparian, V. V. (1986). Viral isolation versus immune staining of

infected cell cultures for the laboratory diagnosis of herpes simplex virus infections. J Clin

Microbiol 24(3), 487-9.

ICTVdB - The Universal Virus Database, version 3 (Büchen-Osmond, C., ed.) (2003). 01.

Mononegavirales. ICTVdB Management, The Earth Institute, Biosphere 2 Center, Columbia

University, Oracle, USA

Jaax, N., Jahrling, P., Geisbert, T., Geisbert, J., Steele, K., McKee, K., Nagley, D., Johnson, E.,

Jaax, G., and Peters, C. (1995). Transmission of Ebola virus (Zaire strain) to uninfected

control monkeys in a biocontainment laboratory. Lancet 346(8991-8992), 1669-71.

Jahrling, P. B., Geisbert, T. W., Dalgard, D. W., Johnson, E. D., Ksiazek, T. G., Hall, W. C., and

Peters, C. J. (1990). Preliminary report: isolation of Ebola virus from monkeys imported to

USA. Lancet 335(8688), 502-5.

Jayakar, H. R., Murti, K. G., and Whitt, M. A. (2000). Mutations in the PPPY motif of vesicular

stomatitis virus matrix protein reduce virus budding by inhibiting a late step in virion release.

J Virol 74(21), 9818-27.

Johnson, K. M., Lange, J. V., Webb, P. A., and Murphy, F. A. (1977). Isolation and partial

characterisation of a new virus causing acute haemorrhagic fever in Zaire. Lancet 1(8011), 569-71.

Johnson, E., Jaax, N., White, J., and Jahrling, P. (1995). Lethal experimental infections of rhesus

monkeys by aerosolized Ebola virus. Int J Exp Pathol 76(4), 227-36.

Justice, P. A., Sun, W., Li, Y., Ye, Z., Grigera, P. R., and Wagner, R. R. (1995). Membrane

vesiculation function and exocytosis of wild-type and mutant matrix proteins of vesicular

stomatitis virus. J Virol 69(5), 3156-60.

Kapadia, S. B., Brideau-Andersen, A., and Chisari, F. V. (2003). Interference of hepatitis C virus

RNA replication by short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 100(4), 2014-8.


Kiley, M. P., Bowen, E. T., Eddy, G. A., Isaacson, M., Johnson, K. M., McCormick, J. B., Murphy, F.

A., Pattyn, S. R., Peters, D., Prozesky, O. W., Regnery, R. L., Simpson, D. I., Slenczka, W.,

Sureau, P., van der Groen, G., Webb, P. A., and Wulff, H. (1982). Filoviridae: a taxonomic

home for Marburg and Ebola viruses? Intervirology 18(1-2), 24-32.

Kiley, M. P., Cox, N. J., Elliott, L. H., Sanchez, A., DeFries, R., Buchmeier, M. J., Richman, D. D.,

and McCormick, J. B. (1988). Physicochemical properties of Marburg virus: evidence for

three distinct virus strains and their relationship to Ebola virus. J Gen Virol 69 ( Pt 8), 1957-

67.

Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., and Becker, S. (2000). Ultrastructural

organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus

inclusions. J Virol 74(8), 3899-904.

Kolesnikova, L., Bugany, H., Klenk, H. D., and Becker, S. (2002). VP40, the matrix protein of

Marburg virus, is associated with membranes of the late endosomal compartment. J Virol

76(4), 1825-38.

Kolesnikova, L., Bamberg, S., Berghöfer, B., and Becker, S. (2004). The matrix protein of Marburg

virus is transported to the plasma membrane along cellular membranes: exploiting the

retrograde late endosomal pathway. J Virol 78(5), 2382-93.

Kolesnikova, L., Berghöfer, B., Bamberg, S., and Becker, S. (2004). Multivesicular bodies as a

platform for the formation of Marburgvirus envelope. J Virol, accepted.

Kretzschmar, E., Bui, M., and Rose, J. K. (1996). Membrane association of influenza virus matrix

protein does not require specific hydrophobic domains or the viral glycoproteins. Virology

220(1), 37-45.

Kunz, C., Hofmann, H., and Aspock, H. (1968). [Propagation of "Marburg virus" (Vervet monkey

disease agent) in Aedes aegypti]. Zentralbl Bakteriol [Orig] 208(1), 347-9.

Kyhse-Andersen, J. (1984). Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank

for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys

Methods 10(3-4), 203-9.

Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 227(259), 680-5.

Lenard, J. (1996). Negative-strand virus M and retrovirus MA proteins: all in a family? Virology

216(2), 289-98.

Leroy, E. M., Baize, S., Volchkov, V. E., Fisher-Hoch, S. P., Georges-Courbot, M. C., Lansoud-

Soukate, J., Capron, M., Debre, P., McCormick, J. B., and Georges, A. J. (2000). Human

asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response. Lancet 355(9222), 2210-

5.

Li, Y., Luo, L., Schubert, M., Wagner, R. R., and Kang, C. Y. (1993). Viral liposomes released from

insect cells infected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular

stomatitis virus. J Virol 67(7), 4415-20.


Li, F., Chen, C., Puffer, B. A., and Montelaro, R. C. (2002). Functional replacement and positional

dependence of homologous and heterologous L domains in equine infectious anemia virus

replication. J Virol 76(4), 1569-77.

Licata, J. M., Simpson-Holley, M., Wright, N. T., Han, Z., Paragas, J., and Harty, R. N. (2003).

Overlapping motifs (PTAP and PPEY) within the Ebola virus VP40 protein function

independently as late budding domains: involvement of host proteins TSG101 and VPS-4. J

Virol 77(3), 1812-9.

Licata, J. M., Johnson, R. F., Han, Z., and Harty, R. N. (2004). Contribution of ebola virus

glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles. J Virol

78(14), 7344-51.

Lin, G., Simmons, G., Pohlmann, S., Baribaud, F., Ni, H., Leslie, G. J., Haggarty, B. S., Bates, P.,

Weissman, D., Hoxie, J. A., and Doms, R. W. (2003). Differential N-linked glycosylation of

human immunodeficiency virus and Ebola virus envelope glycoproteins modulates

interactions with DC-SIGN and DC-SIGNR. J Virol 77(2), 1337-46.

Lötfering, B., Mühlberger, E., Tamura, T., Klenk, H. D., and Becker, S. (1999). The nucleoprotein of

Marburg virus is target for multiple cellular kinases. Virology 255(1), 50-62.

Mar'iankova, R. F., Glushakova, S. E., Pyzhik, E. V., and Lukashevich, I. S. (1993). The penetration

of the Marburg virus into eukaryotic cells. Vopr Virusol 38(2), 74-6.

Martin-Serrano, J., Perez-Caballero, D., and Bieniasz, P. D. (2004). Context-dependent effects of L

domains and ubiquitination on viral budding. J Virol 78(11), 5554-63.

Martini, G. A., and Schmidt, H. A. (1968). [Spermatogenic transmission of the "Marburg virus".

(Causes of "Marburg simian disease")]. Klin Wochenschr 46(7), 398-400.

Martini, G. A., Knauff, H. G., Schmidt, H. A., Mayer, G., and Baltzer, G. (1968). [On the hitherto

unknown, in monkeys originating infectious disease: Marburg virus disease]. Dtsch Med

Wochenschr 93(12), 559-71.

Martini, G. A. (1971). Marburg Virus Disease, Clinical Syndrome. In: Marburg Virus Disease

(Martini, G. A., and Siegert, R., ed.), 1st ed. Springer, New York, USA, pp. 1-230

Mavrakis, M., Kolesnikova, L., Schoehn, G., Becker, S., and Ruigrok, R. W. (2002). Morphology of

Marburg virus NP-RNA. Virology 296(2), 300-7.

Mebatsion, T., Weiland, F., and Conzelmann, K. K. (1999). Matrix protein of rabies virus is

responsible for the assembly and budding of bullet-shaped particles and interacts with the

transmembrane spike glycoprotein G. J Virol 73(1), 242-50.

Modrof, J., Mühlberger, E., Klenk, H. D., and Becker, S. (2002). Phosphorylation of VP30 impairs

ebola virus transcription. J Biol Chem 277(36), 33099-104.

Monath, T. P. (1999). Ecology of Marburg and Ebola viruses: speculations and directions for future

research. J Infect Dis 179 Suppl 1, S127-38.

Möller, P. (2002): Charakterisierung von Interaktionsdomänen auf dem Marburg-Virus VP35.

Diplomarbeit. Philipps-Universität, Marburg


Mühlberger, E., Sanchez, A., Randolf, A., Will, C., Kiley, M. P., Klenk, H. D., and Feldmann, H.

(1992). The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: homologies

with paramyxoviruses and rhabdoviruses. Virology 187(2), 534-47.

Mühlberger, E., Trommer, S., Funke, C., Volchkov, V., Klenk, H. D., and Becker, S. (1996). Termini

of all mRNA species of Marburg virus: sequence and secondary structure. Virology 223(2), 376-80.

Mühlberger, E., Lötfering, B., Klenk, H. D., and Becker, S. (1998). Three of the four nucleocapsid

proteins of Marburg virus, NP, VP35, and L, are sufficient to mediate replication and

transcription of Marburg virus-specific monocistronic minigenomes. J Virol 72(11), 8756-64.

Mühlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., and Becker, S. (1999). Comparison of the

transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial

replication systems. J Virol 73(3), 2333-42.

Mupapa, K., Massamba, M., Kibadi, K., Kuvula, K., Bwaka, A., Kipasa, M., Colebunders, R., and

Muyembe-Tamfum, J. J. (1999). Treatment of Ebola hemorrhagic fever with blood

transfusions from convalescent patients. International Scientific and Technical Committee. J

Infect Dis 179 Suppl 1, S18-23.

Murphy, F. A., van der Groen, G., Whitfield, S. G., and Lange, J. V. (1978). Ebola and Marburg-

Virus morphology and taxonomy. In: Ebola virus hemorrhagic fever (Pattny, S. R., ed.) 1st

edn. Elsevier/North-Holland, Amsterdam, pp. 61-84

Noad, R., and Roy, P. (2003). Virus-like particles as immunogens. Trends Microbiol 11(9), 438-44.

Noda, T., Sagara, H., Suzuki, E., Takada, A., Kida, H., and Kawaoka, Y. (2002). Ebola virus VP40

drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP. J Virol 76(10), 4855-

65.

Novina, C. D., Murray, M. F., Dykxhoorn, D. M., Beresford, P. J., Riess, J., Lee, S. K., Collman, R.

G., Lieberman, J., Shankar, P., and Sharp, P. A. (2002). siRNA-directed inhibition of HIV-1

infection. Nat Med 8(7), 681-6.

Pattyn, S., van der Groen, G., Courteille, G., Jacob, W., and Piot, P. (1977). Isolation of Marburg-

like virus from a case of haemorrhagic fever in Zaire. Lancet 1(8011), 573-4.

Pelchen-Matthews, A., Raposo, G., and Marsh, M. (2004). Endosomes, exosomes and Trojan

viruses. Trends Microbiol 12(7), 310-6.

Peters, C. J. (1996). Emerging infections--Ebola and other filoviruses. West J Med 164(1), 36-8.

Peters, C. J., Sanchez, A., Rollin, P. E., Ksiazek, T. G., and Murphy, F. A. (1996). Filoviridae:

Marburg and Ebola Viruses. In: Fields Virology (Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P.

M., eds) 4th Ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, USA, pp. 1305-1340

Poch, O., Blumberg, B. M., Bougueleret, L., and Tordo, N. (1990). Sequence comparison of five

polymerases (L proteins) of unsegmented negative-strand RNA viruses: theoretical

assignment of functional domains. J Gen Virol 71 ( Pt 5), 1153-62.


Pokhodiaev, V. A., Gonchar, N. I., and Pshenichnov, V. A. (1991). An experimental study of the

contact transmission of the Marburg virus. Vopr Virusol 36(6), 506-8.

Puffer, B. A., Parent, L. J., Wills, J. W., and Montelaro, R. C. (1997). Equine infectious anemia virus

utilizes a YXXL motif within the late assembly domain of the Gag p9 protein. J Virol 71(9), 6541-6.

Resh, M. D. (1999). Fatty acylation of proteins: new insights into membrane targeting of

myristoylated and palmitoylated proteins. Biochim Biophys Acta 1451(1), 1-16.

Rippey, J. J., Schepers, N. J., and Gear, J. H. (1984). The pathology of Marburg virus disease. S

Afr Med J 66(2), 50-4.

Ruigrok, R. W., Schoehn, G., Dessen, A., Forest, E., Volchkov, V., Dolnik, O., Klenk, H. D., and

Weissenhorn, W. (2000). Structural characterization and membrane binding properties of

the matrix protein VP40 of Ebola virus. J Mol Biol 300(1), 103-12.

Ryabchikova, E. I., Kolesnikova, L. V., and Netesov, S. V. (1999). Animal pathology of filoviral

infections. Curr Top Microbiol Immunol 235, 145-73.

Saksela, K. (2003). Human viruses under attack by small inhibitory RNA. Trends Microbiol 11(8), 345-7.

Sanchez, A., Kiley, M. P., Klenk, H. D., and Feldmann, H. (1992). Sequence analysis of the

Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented

negative-strand RNA viruses. J Gen Virol 73 ( Pt 2), 347-57.

Sanchez, A., Kiley, M. P., Holloway, B. P., and Auperin, D. D. (1993). Sequence analysis of the

Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of

Marburg virus. Virus Res 29(3), 215-40.

Sanchez, A., Trappier, S. G., Mahy, B. W., Peters, C. J., and Nichol, S. T. (1996). The virion

glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed

through transcriptional editing. Proc Natl Acad Sci U S A 93(8), 3602-7.

Sanderson, C. M., McQueen, N. L., and Nayak, D. P. (1993). Sendai virus assembly: M protein

binds to viral glycoproteins in transit through the secretory pathway. J Virol 67(2), 651-63.

Sanger, F., and Coulson, A. R. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by

primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 94(3), 441-8.

Sänger, C., Mühlberger, E., Klenk, H.-D. und Becker, S. (1998). Untersuchungen zur Interaktion

des Marburg-Virus GP mit den Matrixproteinen VP24 und VP40. Poster. Jahrestagung der

Gesellschaft für Virologie, Regensburg

Sänger, C., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Kolesnikova, L., Klenk, H. D., and Becker, S. (2001).

Sorting of Marburg virus surface protein and virus release take place at opposite surfaces

of infected polarized epithelial cells. J Virol 75(3), 1274-83.

Sänger, C., Mühlberger, E., Lötfering, B., Klenk, H. D., and Becker, S. (2002). The Marburg virus

surface protein GP is phosphorylated at its ectodomain. Virology 295(1), 20-9.


Sambrook A., Fritsch E. F., and Maniatis A. K. (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.

Schmitt, A. P., Leser, G. P., Waning, D. L., and Lamb, R. A. (2002). Requirements for budding of

paramyxovirus simian virus 5 virus-like particles. J Virol 76(8), 3952-64.

Schnittler, H. J., Mahner, F., Drenckhahn, D., Klenk, H. D., and Feldmann, H. (1993). Replication of

Marburg virus in human endothelial cells. A possible mechanism for the development of

viral hemorrhagic disease. J Clin Invest 91(4), 1301-9.

Schnittler, H. J., and Feldmann, H. (1999). Molecular pathogenesis of filovirus infections: role of

macrophages and endothelial cells. Curr Top Microbiol Immunol 235, 175-204.

Shlomai, A., and Shaul, Y. (2003). Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA

interference. Hepatology 37(4), 764-70.

Siegert, R., Shu, H. L., Slenczka, W., Peters, D., and Muller, G. (1967). [On the etiology of an

unknown human infection originating from monkeys]. Dtsch Med Wochenschr 92(51), 2341-

3.

Simmons, G., Reeves, J. D., Grogan, C. C., Vandenberghe, L. H., Baribaud, F., Whitbeck, J. C.,

Burke, E., Buchmeier, M. J., Soilleux, E. J., Riley, J. L., Doms, R. W., Bates, P., and

Pohlmann, S. (2003). DC-SIGN and DC-SIGNR bind ebola glycoproteins and enhance

infection of macrophages and endothelial cells. Virology 305(1), 115-23.

Simmons, G., Rennekamp, A. J., Chai, N., Vandenberghe, L. H., Riley, J. L., and Bates, P. (2003).

Folate receptor alpha and caveolae are not required for Ebola virus glycoprotein-mediated

viral infection. J Virol 77(24), 13433-8.

Simpson, D. I. (1977). Marburg fever. Nurs Mirror 144(21), 13-5.

Sinn, P. L., Hickey, M. A., Staber, P. D., Dylla, D. E., Jeffers, S. A., Davidson, B. L., Sanders, D. A.,

and McCray, P. B., Jr. (2003). Lentivirus vectors pseudotyped with filoviral envelope

glycoproteins transduce airway epithelia from the apical surface independently of folate

receptor alpha. J Virol 77(10), 5902-10.

Slenczka, W., Rietschel, M., Hoffmann, C. und Sixl, W. (1984). Seroepidemiologische

Untersuchungen über das Vorkommen von Antikörpern gegen Marburg- und Ebola-Virus in

Afrika. Mitt. Oesterr. Ges. Tropenmed. Parasit. 6, 53-60

Stille, W., and Böhme, E. (1971). Clinical Course and Prognosis of Marburg Virus (“Green Monkey”)

Disease. In: Marburg Virus Disease (Martini, G. A., and Siegert, R., eds.). Springer Verlag,

New York, USA, pp. 10-18

Strecker, T., Eichler, R., Meulen, J., Weissenhorn, W., Dieter Klenk, H., Garten, W., and Lenz, O.

(2003). Lassa virus Z protein is a matrix protein and sufficient for the release of virus-like

particles [corrected]. J Virol 77(19), 10700-5.

Strieter, R. M., Kunkel, S. L., and Bone, R. C. (1993). Role of tumor necrosis factor-alpha in disease

states and inflammation. Crit Care Med 21(10 Suppl), S447-63.


Ströher, U., West, E., Bugany, H., Klenk, H. D., Schnittler, H. J., and Feldmann, H. (2001). Infection

and activation of monocytes by Marburg and Ebola viruses. J Virol 75(22), 11025-33.

Sullivan, N. J., Sanchez, A., Rollin, P. E., Yang, Z. Y., and Nabel, G. J. (2000). Development of a

preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. Nature 408(6812), 605-9.

Sutter, G., Ohlmann, M., and Erfle, V. (1995). Non-replicating vaccinia vector efficiently expresses

bacteriophage T7 RNA polymerase. FEBS Lett 371(1), 9-12.

Swanepoel, R., Leman, P. A., Burt, F. J., Zachariades, N. A., Braack, L. E., Ksiazek, T. G., Rollin,

P. E., Zaki, S. R., and Peters, C. J. (1996). Experimental inoculation of plants and animals

with Ebola virus. Emerg Infect Dis 2(4), 321-5.

Swenson, D. L., Warfield, K. L., Kuehl, K., Larsen, T., Hevey, M. C., Schmaljohn, A., Bavari, S., and

Aman, M. J. (2004). Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of

glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunol Med Microbiol 40(1), 27-31.

Takimoto, T., Murti, K. G., Bousse, T., Scroggs, R. A., and Portner, A. (2001). Role of matrix and

fusion proteins in budding of Sendai virus. J Virol 75(23), 11384-91.

Timmins, J., Scianimanico, S., Schoehn, G., and Weissenhorn, W. (2001). Vesicular release of

ebola virus matrix protein VP40. Virology 283(1), 1-6.

Timmins, J., Schoehn, G., Ricard-Blum, S., Scianimanico, S., Vernet, T., Ruigrok, R. W., and

Weissenhorn, W. (2003). Ebola virus matrix protein VP40 interaction with human cellular

factors Tsg101 and Nedd4. J Mol Biol 326(2), 493-502.

Tuschl, T. (2001). RNA interference and small interfering RNAs. Chembiochem 2(4), 239-45.

Tusnady, G. E., and Simon, I. (1998). Principles governing amino acid composition of integral

membrane proteins: application to topology prediction. J Mol Biol 283(2), 489-506.

van Regenmortel, M. H. V., Fauquet, C. M., Bishop, D. H. L., Carstens, E. B., Estes, M. K., Lemon,

S. M., Maniloff, J., Mayo, M. A., McGeoch, D. J., Pringle, C. R., and Wickner, R. B. (2000).

Virus Taxonomy, VIIth report of the ICTV. Academic Press, San Diego, USA

Volchkov, V. E., Becker, S., Volchkova, V. A., Ternovoj, V. A., Kotov, A. N., Netesov, S. V., and

Klenk, H. D. (1995). GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and

by T7 and vaccinia virus polymerases. Virology 214(2), 421-30.

Volchkov, V. E., Volchkova, V. A., Chepurnov, A. A., Blinov, V. M., Dolnik, O., Netesov, S. V., and

Feldmann, H. (1999). Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus. J

Gen Virol 80 ( Pt 2), 355-62.

Volchkov, V. E., Volchkova, V. A., Ströher, U., Becker, S., Dolnik, O., Cieplik, M., Garten, W., Klenk,

H. D., and Feldmann, H. (2000). Proteolytic processing of Marburg virus glycoprotein.

Virology 268(1), 1-6.

Volchkov, V. E., Chepurnov, A. A., Volchkova, V. A., Ternovoj, V. A., and Klenk, H. D. (2000).

Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus. Virology 277(1), 147-55.


Volchkov, V. E., Volchkova, V. A., Mühlberger, E., Kolesnikova, L. V., Weik, M., Dolnik, O., and

Klenk, H. D. (2001). Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA: RNA

editing of the GP gene and viral cytotoxicity. Science 291(5510), 1965-9.

von Heijne, G. (1985). Ribosome-SRP-signal sequence interactions. The relay helix hypothesis.

FEBS Lett 190(1), 1-5.

Watanabe, S., Watanabe, T., Noda, T., Takada, A., Feldmann, H., Jasenosky, L. D., and Kawaoka,

Y. (2004). Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola

virus generation by reverse genetics. J Virol 78(2), 999-1005.

Weik, M., Modrof, J., Klenk, H. D., Becker, S., and Mühlberger, E. (2002). Ebola virus VP30-

mediated transcription is regulated by RNA secondary structure formation. J Virol 76(17), 8532-9.

Weissenhorn, W., Carfi, A., Lee, K. H., Skehel, J. J., and Wiley, D. C. (1998). Crystal structure of

the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein

ectodomain. Mol Cell 2(5), 605-16.

WHO (1978a). Ebola Hemorrhagic Fever in Sudan, 1976. Bull WHO 56, 247-70

WHO (1978b). Ebola Hemorrhagic Fever in Zaire, 1976. Bull WHO 56, 271-93

WHO (1992). Viral Hemorrhagic Fever in Imported Monkeys. Wkly. Epidemiol. Rec. (WER) 67, 142-

43

WHO (1996). Outbreak of Haemorrhagic Fever in Gabon Officially Declared Over. Wkly. Epidemiol.

Rec. (WER) 71, 125-126

WHO (1997). Ebola Haemorrhagic Fever. A Summary of the Outbreak in Gabon. Wkly. Epidemiol.

Rec. (WER) 72, 7-8

WHO (1999). Marburg Fever, Democratic Republic of the Congo. Wkly. Epidemiol. Rec. (WER) 74,

145

WHO (2000). Outbreak News. Wkly. Epidemiol. Rec. (WER) 75(50), 409

WHO (2001). Outbreak of Ebola Haemorrhagic Fever, Uganda, August 2000 - January 2001. Wkly.

Epidemiol. Rec. (WER) 76, 41-6

WHO (2002). Ebola Haemorrhagic Fever in Gabon/ The Republic of the Congo - update 21.

http://www.who.int/csr/don/2002_03_22/en/

WHO (2003a). Outbreak(s) of Ebola Haemorrhagic Fever in the Republic of the Congo, January -

April 2003. Wkly. Epidemiol. Rec. (WER) 78 (No. 33), 285-9

WHO (2003b). Ebola Haemorrhagic Fever in the Republic of the Congo - Update 12.


WHO (2004a). Ebola Haemorrhagic Fever in the Republic of the Congo - update 6.


WHO (2004b). Ebola Haemorrhagic Fever in south Sudan - update 3.

http://www.who.int/csr/don/2004_06_01a/en/


Will, C., Mühlberger, E., Linder, D., Slenczka, W., Klenk, H. D., and Feldmann, H. (1993). Marburg

virus gene 4 encodes the virion membrane protein, a type I transmembrane glycoprotein. J

Virol 67(3), 1203-10.

Zaki, S. R., and Peters, C. J. (1997). Viral Hemorrhagic Fever. In Diagnostic Pathology of Infectious

Diseases (Connor, D. H., Chandler, F. W., Schwartz, D. A., Manz, H. J., Lack, E. E., eds.).

Appleton and Lange, Stamford, USA, pp. 347-364

Zeng, Y., Wagner, E. J., and Cullen, B. R. (2002). Both natural and designed micro RNAs can

inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells. Mol Cell 9(6), 1327-33.

Zhang, J., and Lamb, R. A. (1996). Characterization of the membrane association of the influenza

virus matrix protein in living cells. Virology 225(2), 255-66.

8 Abbildung- und Tabellenverzeichnis 127

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildungen:

Abbildung 1 Taxonomie der Filoviren. 7

Abbildung 2 Struktur des Marburgvirus. 12

Abbildung 3 Genomstruktur des Marburgvirus. 13

Abbildung 4 Der RNAi-Mechanismus. 20

Abbildung 5 Prinzip einer PCR. 44

Abbildung 6 Schematische Darstellung der Epitop-markierten MARV-

VP24-Mutanten.

68

Abbildung 7 Schema der Klonierung der Epitop-markierten MARV-VP24-

Mutanten.

69

Abbildung 8 Immunfluoreszenzanalyse der Epitop-markierten VP24-

Mutanten.

71

Abbildung 9 Vergleich des VP24-spezifischen Kaninchenserum und des

affinitätsgereinigten VP24-AK..

72

Abbildung 10 Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression des WT-

VP24.

73

Abbildung 11 Flotationsanalyse des WT-VP24 und HA-VP24. 74

Abbildung 12 Charakterisierung der Membranassoziation von HA-VP24. 76

Abbildung 13 Membranassoziation von HA-VP24 bei Koexpression von

VP40 bzw. GP.

77

Abbildung 14 Triton X-114 Phasenpartitionierung von VP24 und VP40. 78

Abbildung 15 Triton X-114 Phasenpartitionierung von MARV-Partikeln. 79

Abbildung 16 Bildung von virusähnlichen Partikeln durch Einzelexpression

von VP40, GP und VP24.

81

Abbildung 17 Einfluss des VP24 auf die Expression von VP40 bzw. GP. 82

Abbildung 18 Vergleich der Proteinmengen in MARV-infizierten Vero-Zellen

und transfizierten HEK293-Zellen.

83

Abbildung 19 Rekrutierung von VP24 in virusähnliche Partikel. 85

8 Abbildung- und Tabellenverzeichnis 128

Abbildung 20 Einfluss des VP24 auf die Bildung virusähnlicher Partikel. 86

Abbildung 21

Mutation des Late-Domain-Motivs PPPY des VP40 und sein

Einfluss auf die Freisetzung der VLPs sowie die Rekrutierung

von VP24.

88

Abbildung 22 Einbau von NP in VLPs. 89

Abbildung 23 Lokalisation des VP24 in Marburgvirus-infizierten Vero-Zellen. 91

Abbildung 24 Lokalisation des VP24 in den Einschlusskörpern

Marburgvirus-infizierter Vero-Zellen.

92

Abbildung 25 Immunfluoreszenzanalyse der Einzel- und Koexpression von

VP24 und NP.

93

Abbildung 26 Koimmunpräzipitationsanalyse des VP24-Flag mit dem VP40. 95

Abbildung 27 Immunfluoreszenzanalyse der Kolokalisation von VP24 und

VP40.

96

Abbildung 28 Sequenzen der VP24-spezifischen siRNAs sowie der Kontroll-

siRNA X.

98

Abbildung 29 Abschalten der transienten VP24-Expression durch siRNA-

Transfektion.

99

Abbildung 30 Abschalten der VP24-Expression in der MARV-Infektion durch

RNAi.

102

Abbildung 31 Freisetzung reifer MARV-Partikel nach siRNA-Behandlung. 104

Abbildung 32 Schematische Darstellung der filoviralen Hüllmembran. 108

Tabellen:

Tabelle 1 Ausbrüche von Filovirus-Infektionen. 8

Tabelle 2 Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und

Oligonukleotide.

36


9 Abkürzungsverzeichnis

Die Abkürzungen für SI-Einheiten, Aminosäuren und Nukleotide entsprechen den

international verbindlichen Normen. Die Abkürzungen der chemischen Substanzen

wurden im Materialteil aufgeführt.

α anti AK Antikörper AS Aminosäure bp Basenpaare CDC Centers for Disease Control (Atlanta/USA) C-Terminus Carboxyterminus d (bei dH2O) deionisiert ddNTP 2’3’ -Didesoxynukleosidtriphosphat def deficient DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP 2’ -Desoxynukleosidtriphosphat DRC Demokratische Republik Kongo (früher Zaire) EBOV Ebolavirus EM Elektronenmikroskop ER Endoplasmatisches Retikulum FCS fetales Kälberserum FITC Fluorescein-Isothiocyanat Isomer 1 GP Glykoprotein GST Glutathion-S-Transferase h Stunden HIV Humanes-Immundefizienzvirus ICTV International Committee on Taxonomy of VirusesIFN Interferon IgG Immunglobulin G IRES interne Ribosomeneintrittsstelle ISRE “interferon-stimulated response element“ kb Kilobasen kD Kilodalton KoIP Koimmunpräzipitation Lamp-1 “lysosome-associated membrane protein 1“ L-Protein Large-Protein (Polymerase) MARV Marburgvirus MEM Modified Eagle Medium min Minuten Mock Scheininfektion


m.o.i. multiplicity of infection mRNA messenger RNA MVA-T7 Modified Vaccinia-Virus Ankara-T7 MVB “multi vesicular bodies“ = multivesikuläre

Strukturen NNS nichtsegmentiert, negativsträngig NP Nukleoprotein N-Terminus Aminoterminus OD Optische Dichte ORF offener Leserahmen p.i. “post infection” = nach Infektion POD Peroxidase p.t. “post transfection” = nach Transfektion P/S Penicillin/Streptomycin PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PAS Protein-A-Sepharose PCR Polymerase-Kettenreaktion PNÜ postnukleärer Überstand PTGS “post trancriptional gene silencing“ Q L-Glutamin RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA Interferenz RNP-Komplex Ribonukleoproteinkomplex RT Raumtemperatur sec Sekunden siRNA small interfering RNA TNF α Tumor Nekrose Faktor α U “unit“ = Einheit ÜKR Überkopfrotierer ÜN über Nacht ÜNK Übernachtkultur UpM Umdrehungen pro Minute UTR “untranslated region” = nichttranslatierte Region VLP “virus-like particles” = virusähnliche Partikel VP Virusprotein vRNA virale RNA VSV Vesikular-Stomatitis-Virus VT Volumenteil v/v Volume per volume w/v weight per volume WHO World Health Organisation WT Wildtyp


10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen

Veröffentlichungen

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurden folgende Publikationen erstellt:

“Molecular Characterisation and Silencing of VP24 in Marburgvirus Infection: Implications for Maturation of Filoviral Particles” Sandra Bamberg, Peggy Möller, Larissa Kolesnikova, Hans-Dieter Klenk, Stephan Becker (in Vorbereitung)

Weitere Publikationen während der Dissertation:

"The matrix protein of Marburg virus is transported to the plasma membrane along cellular membranes: exploiting the retrograde late endosomal pathway." Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Beate Berghöfer, Stephan Becker J Virol. 2004 Mar;78(5): 2382-93

"Multivesicular bodies as a platform for the formation of Marburgvirus envelope"

Larissa Kolesnikova, Beate Berghöfer, Sandra Bamberg, Stephan Becker; (J Virol.,

akzeptiert)

"Inhibition of Marburgvirus Protein Expression and Viral Release by RNAi" Trent Fowlerª, Sandra Bambergª, Peggy Möller, Thomas F. Meyer. Stephan Becker, Thomas Rudel ª both authors contributed equally to this work (übermittelt)

Vorträge:

"Inhibition of Marburgvirus protein expression and viral release by RNAi" Sandra Bamberg, Trent Fowler, Stephan Becker, Peggy Möller, Thomas F. Meyer, Thomas Rudel Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2004, Tübingen

“Molecular Characterization and Intracellular Distribution of the Marburgvirus VP24” Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Progress Report SFB 535 2002, Gießen


“The Role of the Late Endosome in the Transport of a Viral Matrix Protein” Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Stephan Becker SFB 535: Symposium on “Visualisation of infectious agents and structures in living cells”

2002, Schloss Rauischholzhausen

“Interaction of the Marburgvirus VP24 and the Surface Protein GP” Sandra Bamberg, Christian Sänger, Stephan Becker Klausurtagung SFB 286 2001, Hirschegg, Österreich

Posterpräsentationen:

“Employment of RNAi to Reduce Marburgvirus Replication” Trent Fowler, Sandra Bamberg, Peggy Möller, Thomas F. Meyer, Stephan Becker, and

Thomas Rudel

ASM Biodefense Meeting, März 2004, Baltimore, USA

“Biochemical Analysis of the Marburgvirus VP24“ Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses 2003, Pisa, Italy

“Exploiting the Late Endosomal Pathway: Implications for Budding of Marburgvirus” Larissa Kolesnikova, Sandra Bamberg, Stephan Becker Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses 2003, Pisa, Italy; 2003

“Biochemical Analysis of the Marburgvirus VP24“ Sandra Bamberg, Larissa Kolesnikova, Stephan Becker Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2003, Berlin “Interaction of the Marburgvirus VP24 with the Surface Protein GP and Anionic Membrane Structures“ Sandra Bamberg, Christian Sänger, Elke Mühlberger, Stephan Becker Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2001, Dresden

11 Curriculum Vitae 133

11 Curriculum Vitae

Persönliche Daten

Name: Sandra Bamberg

Anschrift: Hübingerweg 15d

56323 Waldesch

Geburtsdatum: 24.05.1976

Geburtsort: Koblenz

Schulausbildung

1982 – 1986 Grundschule in Buchholz

1986 – 1990 priv. Realschule Marienberg in Boppard/Rhein

1990 – 1995 Gymnasium auf der Karthause in Koblenz

Abschluss: Abitur (1,3)

Hochschulausbildung

10/1995 – 12/2000 Studium der Humanbiologie, Philipps-Universität Marburg

Hauptfach: Virologie

Nebenfächer: Zellbiologie, Immunologie

10/1997 Vordiplom (Note: gut)

01/2000 Diplom-Prüfung (Note: sehr gut)

02/2000 – 12/2000 Diplomarbeit am Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg

Thema: „Interaktion des Marburgvirus VP24 mit dem

Oberflächenprotein GP und anionischen Membranstrukturen“

(Note: sehr gut)

01/2001 – 07/2004 Promotion am Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg

Thema: „Untersuchungen zur Rolle des VP24 im

Vermehrungszyklus des Marburgvirus“

03/2003 – 05/2003 Trainee am EMBL (European Molecular Biology Laboratory) in

Grenoble, Frankreich

Marburg, den 13.08.04

(Sandra Bamberg)

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 134

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer an der Philipps-Universität Marburg waren die folgenden

Damen und Herren:

Arnold, Aumüller, Aurich, Barth, Becker, Brandis-Heep, Dobbelstein, Elsässer, Fischer,

Frenking, Fruhstorfer, Garten, Grzeschik, Gudermann, Habermehl, Hartmann, Jungclas,

Kern, Kirchner, Klenk, Knöller, Koch, Koolman, Lammel, Lang, Lill, Löffler, Lührmann,

Maisner, Mazummda, Melsheimer, Mühlberger, Müller, Radsak, Röhm, Schachtschabel,

Schäfer, Schulz, Schwee, Seifart, Seitz, Steinmetz, von Löw, Westermann.

13 Danksagung 135

13 Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk vom Institut für Virologie für die Bereitstellung

des interessanten und vielseitigen Themas.

Außerdem danke ich der Philipps-Universität Marburg, dem Hessischen Ministerium für

Wissenschaft und Kunst sowie der Frauenbeauftragten Dr. Silke Lorch-Göllner für die

Förderung meiner Arbeit durch ein Promotionsstipendium für Frauen in den Ingenieur- und

Naturwissenschaften.

Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn PD Dr. Stephan Becker für die hervorragende

Betreuung meiner Dissertation in der Arbeitsgruppe am Institut für Virologie. Er stand mir

jederzeit mit Rat und Tat zur Seite und förderte den erfolgreichen Fortgang der Arbeit.

Auch möchte ich mich bei PD Dr. Winfried Weissenhorn für den interessanten und

erfolgreichen Aufenthalt am EMBL in Grenoble bedanken.

Mein besonderer Dank gilt den Kollegen aus dem Labor G23. Peggy Möller für ihren

permanenten Beistand und seelischen Zuspruch sowie natürlich für die vielen Stunden im

Sicherheitslabor, Dr. Larissa Kolesnikova für ihre ständige Diskussionsbereitschaft und

methodische Hilfestellung und Angelika Lander für ihre technische Unterstützung und den

netten Tratsch in den Kaffeepausen. Außerdem Andrea DiCarlo, Bettina Hartlieb, Thomas

Hoenen, Daniel Voss, Annika Kern, Beate Berghöfer, Dr. Jens Modrof, Dr. Christian

Sänger, Dr. Michael Weik sowie allen Praktikanten, die gemeinsam zu einer hervorragend

kollegialen und fruchtbaren Arbeitsatmosphäre beigetragen haben.

Ich danke ebenfalls allen anderen Mitarbeitern des Instituts für Virologie für die gute

Zusammenarbeit, v.a. der Arbeitsgruppe um PD Dr. Elke Mühlberger.

Ganz besonders möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mich während der

gesamten Zeit meines Studiums und der Promotion nicht nur materiell gefördert, sondern

mir in allen Situationen und Entscheidungen den Rücken gestärkt und mich unterstützt

haben.

Zuletzt gilt mein persönlicher Dank Meik Szelies, der mich stets in meinem Fortkommen

unterstützt und meine Launen und Eigenarten „ertragen“ hat.

14 Ehrenwörtliche Erklärung 136

14 Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur

Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel:

„Untersuchungen zur Rolle des VP24 im Vermehrungszyklus des Marburgvirus“ im Medizinischen Zentrum für Hygiene und Infektionsbiologie unter Leitung von Prof. Dr.

Hans-Dieter Klenk mit Unterstützung durch PD Dr. Stephan Becker ohne sonstige Hilfe

selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der

Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.

Ich habe bisher an keinem in- und ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch

um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als

Dissertation vorgelegt.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht (Kapitel 10).

Marburg, den 13.08.04

(Sandra Bamberg)

untersuchungen zur rolle des vp24 im vermehrungszyklus des ... · rhabdoviridae paramyxoviridae...

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