UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

CAMPUS CURITIBA - ECOVILLE

DEPARTAMENTO ACADÊMICO DE QUIMICA E BIOLOGIA

CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM QUÍMICA AMBIENTAL

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO

LIANA CRISTIANE DE SOUSA

CURITIBA 2013

LIANA CRISTIANE DE SOUSA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO

Relatório de Estágio Supervisionado,

apresentado à disciplina de Estágio

Supervisionado do Curso Superior de

Tecnologia em Química Ambiental do

Departamento Acadêmico de Química e

Biologia – DAQBI – da Universidade

Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR.

Orientadora: Profª Marlene Soares

Supervisora: Profª Marlene Soares

CURITIBA 2013

IDENTIFICAÇÃO

Aluna

Nome: Liana Cristiane de Sousa

E-mail: liana.sousa@gmail.com

Código: 890146

Empresa

Razão Social: Universidade Tecnológica Federal Do Paraná – Curitiba

CNPJ:75.101.873/0008-66

Endereço: Av. Silva Jardim, 879 – Rebouças - CEP 80230-901 – Curitiba - PR

– Brasil. Telefone: (41) 3310-4545

Departamento Acadêmico de Química e Biologia: Rua Deputado Heitor de

Alencar Furtado, 4900 – Bairro Cidade Industrial - CEP 81280-340 - Curitiba -

PR – Brasil. Telefone: (41) 33730832 R.237

Supervisão

Orientadora: Profª Marlene Soares

Supervisor: Profª Marlene Soares

Carga Horária do Estágio Obrigatório

Período: 22/04/2013 a 21/10/2013

Carga horária: 20 horas semanais – 08h às 12h

Horas Obrigatórias: 400 horas

Horas Cumpridas: 400 horas

Atividades Desenvolvidas

- Auxílio no preparo de aulas práticas da disciplina de Microbiologia Ambiental;

- Preparo de soluções e reagentes;

- Acompanhamento da qualidade microbiológica das águas dos bebedouros do

Bloco C, sede Ecoville;

- Manutenção do laboratório.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................6

2 UTFPR .............................................................................................................6

3 LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UTFPR (DAQBI) .......................7

4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ...................................................................9

4.1 AUTOCLAVE ............................................................................................. 10

4.1.1 Procedimento Para Operação Da Autoclave........................................... 12

4.2 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA ....................................................... 12

4.4 PREPARO DE CRISTAL VIOLETA, SOLUÇÃO DE LUGOL, FUCSINA,

ÁLCOOLACETONA, ÁLCOOL 70% E ÁLCOOL IODADO............................... 14

4.4.1 Cristal Violeta........................................................................................... 14

4.4.2 Solução Lugol.......................................................................................... 15

4.4.3 Álcool Acetona......................................................................................... 15

4.4.4 Fucsina.................................................................................................... 15

4.4.5 Álcool 70.................................................................................................. 16

4.4.6 Álcool Iodado........................................................................................... 16

4.5 ACOMPANHAMENTO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DAS ÁGUAS

DOS BEBEDOUROS DO BLOCO C – SEDE ECOVILLE.................................16

4.5.1 Objetivos...................................................................................................18

4.5.2 Materiais e métodos.................................................................................18

4.5.2.1 Amostras................................................................................................18

4.5.2.2 Preparo de Amostras.............................................................................19

4.5.2.3 Rapid Coliform Broth/Rapid Coliform Agar............................................20

4.5.2.4 Reativo de Kovacs.................................................................................21

4.5.3 Resultados................................................................................................22

4.5.4 Discussão dos Resultados........................................................................24

5 CONCLUSÃO ................................................................................................25

6 REFERÊNCIAS..............................................................................................26

6

1 INTRODUÇÃO

O presente relatório tem como objetivo a descrição das atividades

desenvolvidas pela aluna Liana Cristiane de Sousa no laboratório de

Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, no Campus

Curitiba – Ecoville. O estágio foi realizado no período de 22/04/2013 a

21/10/2013 para o cumprimento do estágio obrigatório, necessário para a

graduação do Curso Superior de Tecnologia em Química Ambiental.

As atividades realizadas no laboratório durante o período de estágio

foram: auxílio no preparo de aulas práticas para as disciplinas de Microbiologia

Básica, Microbiologia Ambiental e Biotecnologia, preparo de soluções e

reagentes, acompanhamento da qualidade microbiológica das águas dos

bebedouros do bloco C – sede Ecoville e a manutenção do laboratório.

2 UTFPR

A história da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR) teve

início em 1909 com a Escola de Aprendizes Artífices. Sua função era oferecer

conhecimentos elementares e ensino profissionalizante a garotos de classes

menos favorecidas (UTFPR, 2012).

No ano de 1937, a escola começou a oferecer o ensino de 1º grau e

passou a ser denominada Liceu Industrial do Paraná. Em 1942, após a

organização e reestruturação do ensino industrial em todo o país, a instituição

passou a se chamar Escola Técnica de Curitiba. Em 1959, o ensino técnico no

Brasil foi unificado pela legislação, foi renomeada Escola Técnica Federal do

Paraná (UTFPR, 2012).

Em 1978, a instituição foi transformada em Centro Federal de Educação

Tecnológica do Paraná (CEFET-PR), oferecendo cursos de graduação plena e,

posteriormente, cursos de pós-graduação. No ano de 1996, devido à restrição

de implementação de cursos técnicos integrados, o CEFET-PR passou a

oferecer cursos de Tecnologia e o Ensino Médio (UTFPR, 2012).

7

Finalmente no ano de 2005, após a aprovação de um projeto de lei o

CEFET-PR foi elevado à categoria de Universidade Tecnológica Federal do

Paraná (UTFPR), a primeira universidade especializada do país (UTFPR,

2012).

A UTFPR possui 12 campus no estado do Paraná, sendo eles:

Apucarana, Campo Mourão, Cornélio Procópio, Curitiba, Dois Vizinhos,

Francisco Beltrão, Guarapuava, Londrina, Medianeira, Ponta Grossa, Pato

Branco e Toledo. Cada Campus oferece cursos visando atender necessidade

da região onde está situado. No total são 63 cursos superiores de tecnologia,

bacharelados, engenharias e licenciaturas. A Universidade Tecnológica

também oferta cursos técnicos em diversas áreas para pessoas que desejam

qualificação profissional de nível médio (UTFPR, 2012).

3 LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DA UTFPR

O Laboratório de Microbiologia da UTFPR realiza as aulas práticas das

disciplinas de Microbiologia Básica, Microbiologia Ambiental, Biossegurança e

Biotecnologia, sob responsabilidade do Departamento Acadêmico de Química

e Biologia (DAQBI). No laboratório também são desenvolvidas atividades de

pesquisa relacionadas ao estágio supervisionado, iniciação científica, trabalhos

de conclusão de curso e mestrado.

O laboratório possui nível de biossegurança 2, por possuir

microrganismos da classe de risco 2. São microrganismos de risco individual

moderado e baixo para a comunidade, que podem provocar infecções, porém,

dispõe-se de medidas terapêuticas e profiláticas eficientes, sendo o risco de

propagação limitado. Entre os microrganismos classe 2 pertencentes ao banco

de cepas do laboratório estão: Acinetobacter baumannii, Staphylococcus

aureus, Streptococcus pyogenes e Aspergillus niger (Ministério da Saúde,

2006). Sendo assim, normas e práticas devem ser seguidas para garantir a

segurança e o bom funcionamento do laboratório, como:

O acesso ao laboratório é restrito ou limitado somente às pessoas

autorizadas pela chefia;

8

Não é permitida a presença de crianças;

As salas devem ser mantidas trancadas quando fora de uso. Manter um

controle de chaves;

É proibido comer, beber, fumar, mascar chicletes, manusear lentes de

contato e aplicar cosméticos nas áreas de trabalho;

Utilização de roupas apropriadas como jalecos, gorros ou uniformes de

proteção, dentro do laboratório. Antes de sair do laboratório para as

áreas externas (cantina, biblioteca, escritório administrativo), a roupa

protetora deve ser retirada e deixada no laboratório;

Manter cabelos compridos presos;

Devem ser usadas luvas, quando houver um contato direto com

materiais e superfícies potencialmente infecciosas ou equipamentos

contaminados;

Lavar as mãos: antes e após o manuseio de materiais viáveis, após a

remoção das luvas e antes de sair do laboratório; antes e após o uso de

luvas; depois de manusear material infectante, mesmo quando as luvas

tenham sido usadas; mãos e antebraços devem ser lavados

cuidadosamente;

É proibida a pipetagem com a boca; devem ser utilizados dispositivos

mecânicos. É proibido lamber as etiquetas ou colocar os materiais na

boca;

As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas com

desinfetantes que sejam eficazes contra os agentes manipulados, ao

final do trabalho ou no final do dia e após qualquer vazamento ou

borrifada de material viável;

Todas as culturas, colônias e outros resíduos devem ser

descontaminados antes de serem descartados através de um método de

descontaminação aprovado como, por exemplo, esterilização por calor

úmido (autoclave);

O pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no

manejo de agentes patogênicos e devem ser supervisionados por

profissionais competentes;

A manipulação de microrganismos viáveis ou de meios de cultivos em

placas ou tubos não fechados deve ser realizada nas proximidades da

9

chama, onde o risco de contaminação por agentes aéreos é menor,

devendo-se evitar ao máximo as correntes de ar;

O acesso ao laboratório deve ser limitado durante os procedimentos

operacionais.

Figura 1: Laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.

4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

As principais atividades desenvolvidas no laboratório de Microbiologia

durante o estágio foram:

Preparo e plaqueamento de meios de cultura a serem utilizados nas

aulas práticas, sendo os mais comuns: PCA (Plate Count Agar), PDA

(Potato Dextrose Agar), Ágar Sabouraud, Ágar Nutriente, Ágar Ágar e

Ágar Mueller Hinton;

10

Preparo de diferentes materiais e reagentes para as aulas práticas

ministradas no laboratório nas disciplinas de Microbiologia Básica,

Microbiologia Ambiental, Segurança Biológica e Biotecnologia;

Preparo de soluções para limpeza, higiene e desinfecção das mãos,

bancadas e materiais, como álcool 70%, álcool iodado;

Preparo de reagentes utilizados em coloração de Gram, como cristal

violeta, fucsina, solução de lugol e álcool acetona;

Controle de estoque dos materiais do laboratório como vidrarias,

reagentes e meios de cultivo;

Acompanhamento da qualidade microbiológica das águas do bloco C, da

sede Ecoville;

Organização e manutenção do laboratório.

Para a manutenção e limpeza das vidrarias utilizadas no laboratório, os

materiais que foram contaminados devem ser esterilizados antes de serem

lavados ou devidamente destinados. Alguns materiais devem ser esterilizados

antes da sua utilização. Para esterilizar materiais e meios de culturas utiliza-se

a autoclave. Depois de serem descontaminados, os meios contendo

microrganismos são descartados. As vidrarias são lavadas com água e sabão,

enxaguadas com água corrente e com água deionizada respectivamente. O

material lavado é destinado à secagem natural em um compartimento próprio.

4.1 AUTOCLAVE

O princípio de operação de uma autoclave é governado pela Lei de

Boyle, a qual relaciona pressão, temperatura e volume. Na autoclave de vapor

saturado de água, a função esterilizante é baseada, principalmente, na perfeita

distribuição do calor propiciado pelo vapor que transmite o calor a todo o

material a ser esterilizado na câmara de forma efetiva. A principal razão pela

qual a esterilização com vapor saturado sob pressão é eficiente para todo

material, quer líquido quer sólido, é que estes materiais recebem de uma forma

rápida grande quantidade de caloria, propiciada pelo vapor saturado à alta

temperatura em virtude de grande pressão. A pressão em si não contribui para

o processo de esterilização. O processo ocorre mesmo em virtude de vapor ser

11

ótimo para transmitir calor aos materiais que estiverem dentro da câmara de

esterilização.

A autoclave é essencial no laboratório de microbiologia, pois é o

equipamento com o método mais eficaz para esterilizar e desinfectar materiais

e meios de cultivo. Normalmente opera sob pressão de 1,02 bar e temperatura

de 121ºC. A pressão é usada para elevar a temperatura do vapor acima dos

100ºC, já que a temperatura de 121ºC permite a esterilização dos endosporos,

que são as formas de vida das bactérias mais resistentes ao calor.

Materiais não contaminados são esterilizados depois de 15 minutos sob

a pressão de 121°C na autoclave, enquanto os contaminados são esterilizados

depois de 30 minutos. A esterilização de placas de Petri e pipetas graduadas

não contaminadas é feita com o acondicionamento em containers, enquanto

que as contaminadas são colocadas em sacos plásticos. Os tubos de roscas

devem estar com as tampas afrouxadas, permitindo a saída de ar e entrada de

vapor, evitando a quebra do material dentro da autoclave. Nos tubos grandes

lisos, assim como em béqueres e erlenmeyers, devem-se utilizar tampões

feitos de algodão e gaze, sendo evolto individualmente por papel Kraft ou no

caso dos tubos, devem ser arranjados dentro de cestas apropriadas. É

importante que todos os materiais, principalmente aqueles contaminados,

sejam identificados antes da autoclavagem, com o nome do responsável pelo

material e o nome do microrganismo presente, evitando acidentes e

possibilitando que os procedimentos corretos sejam seguidos em caso de

acidente.

Figura 2: Autoclaves do Laboratório de Microbiologia. Uma é utilizada para material não contaminado (à esquerda) e outra para material contaminado (à direta).

12

4.1.1 Procedimentos para a Operação Da Autoclave

O uso da autoclave é um dos passos primordiais para a obtenção do material

estéril. A utilização correta da autoclave garante segurança, material

esterilizado e interfere na conservação do equipamento.

É necessário verificar o nível da água. Adicionando água destilada

suficiente para cobrir a resistência, de forma a impedir a oxidação do

metal e danificação da resistência; em seguida introduzir o material a ser

esterilizado, fechar a tampa, apertando por igual os manípulos;

Para que a esterilização seja bem feita, é necessário ter em atenção que

no início do aquecimento existe ar no interior da autoclave além do

vapor de água, deve-se ligar na temperatura máxima, e abrir a válvula

para deixar sair o ar. Quando o vapor estiver constante, a válvula pode

ser fechada. Esperar que o termômetro atinja a temperatura de

esterilização desejada 121ºC, ou que a pressão indicada seja 1,02bar, e

então reduzir a potência do termostato para o mínimo, mantendo a

temperatura constante;

Iniciar a contagem de tempo (15 ou 30 minutos);

Quando termina o tempo calculado para uma correta esterilização, deve-

se desligar o equipamento e deixar arrefecer lentamente, só abrindo a

torneira de descarga e lentamente, após o manómetro indicar zero.

Deve-se ter o máximo de cuidado ao abrir devido à pressão interna,

Remover os materiais utilizados.

4.2 PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA

Primeiramente deve-se determinar a quantidade de meio a ser

preparado tendo em vista que para cada placa de Petri são utilizados 20 mL de

meio, para cada tubo pequeno com tampa de rosca 5 mL e para os demais

tubos de ensaio 10 mL. Para preparar meios de cultivo deve-se adicionar água

deionizada ou outro solvente, se for o caso, ao meio desidratado.

13

Se o meio de cultivo já vier pronto é feita a relação da quantidade

indicada pelo fabricante que deve ser utilizada por litro de água e a quantidade

a ser preparada através de regra de três:

g de meio ------------------------- 1000mL

X -------------------------- Quantidade a ser preparada (mL)

Sendo X a quantidade de meio de cultivo a ser dissolvida.

Deve-se então pesar a quantidade de meio em um erlenmeyer e

adicionar a água deionizada necessária. A mistura deve então ser levada para

o microondas para que possa dissolver o ágar. O recipiente deve ser retirado

do interior do microondas de tempo em tempo, e o meio deve ser misturado

com um bastão de vidro. Este procedimento deve ser repetido até que levante

fervura da solução, para que o meio possa se dissolver bem na água. Quando

o meio estiver dissolvido, deve-se retirar o erlenmeyer do microondas e tampá-

lo com um tampão de algodão, embrulhando a boca do mesmo com papel

alumínio e papel Kraft, prendendo com um elástico de borracha. Caso o meio

seja destinado a tubos, deve-se transferi-lo com o auxílio de uma pipeta

graduada antes da autoclavagem. Após a autoclavagem os meios são

plaqueados em câmara de fluxo laminar, que deve ser previamente preparada

e higienizada. A câmara de fluxo laminar permite a obtenção de uma área

limpa, em cujos trabalhos requeiram total proteção ao material que está sendo

manipulado.

Figura 3: Plaqueamento dos meios de cultivo na câmara de fluxo laminar.

14

4.4 PREPARO DE CRISTAL VIOLETA, SOLUÇÃO DE LUGOL, FUCSINA,

ÁLCOOLACETONA, ÁLCOOL 70% E ÁLCOOL IODADO

Considerando-se a constituição das membranas das células bacterianas,

podemos observar, basicamente, dois grupos de bactérias. Em um grupo

predominam ácidos teicóicos e no outro, lipopolissacarídeos. Em 1984,

Christian Gram desenvolveu uma técnica de coloração onde um grupo de

bactérias se corava de azul escuro, enquanto outro grupo permanecia incolor,

ou se corava por um segundo corante. As bactérias gram positivas possuem

grande quantidade de ácidos teicóicos na membrana. Após coloração por

violeta de genciana, seguida de tratamento com solução de iodo (lugol), forma-

se um complexo corado, cor escura, entre a violeta de genciana e o iodo. Essa

coloração é fortemente retida pelas bactérias, não sendo facilmente removida

após tratamento com álcool. As demais bactérias descoradas (gram negativas)

são reveladas com solução de Fucsina e apresentam coloração avermelhada.

Fungos e famílias bacterianas são, em geral, gram positivos. Protozoários e

células animais são gram negativos.

As soluções preparadas no laboratório de microbiologia vão verificar e

caracterizar em cada caso, o tipo de microorganismo em questão.

4.4.1 Cristal Violeta

O corante cristal violeta é usado na coloração de gram. A coloração

recorre do uso de corantes e permite aumentar o contraste e evidenciar a

estrutura bacteriana, corando a parede celular bacteriana de violeta ou púrpura.

As bactérias que retêm a coloração após o uso de álcool são classificadas

como gram-positivas.

Para o preparo do cristal violeta é necessário o preparo de duas

soluções, sendo a solução A composta por 2g de cristal violeta e 20mL de

etanol, e ao solução B composta por 0,8g de oxalato de amônia e 80 mL de

água destilada. As duas soluções devem ser misturadas e transferidas para um

frasco âmbar.

15

4.4.2 Solução Lugol

Para o preparo do lugol para gram é necessário misturar 1g de iodo e 2g

de iodeto de potássio em 300 mL de água destilada, em uma proveta ou

béquer de 500 mL. A aplicação de lugol em células gram-positivas e negativas

fará com que haja a formação do complexo CV-I no interior da célula, que

permanece violeta.

4.4.3 Álcool Acetona

Para preparar álcool acetona deve-se colocar, em uma proveta de 1L,

800mL de álcool comercial 92,8º INPM e completar o volume para 1L com

acetona. A proveta deve ser tampada e agitada para que ocorra a mistura do

álcool e da acetona. A solução deve ser armazenada em frasco âmbar.

O álcool-acetona irá fazer com que ocorra a desidratação da parede

celular de bactérias gram-positivas, diminuindo sua porosidade e a

permeabilidade, não permitindo que o complexo CV-I saia da célula, o violeta.

Já em células gram-negativas com a aplicação do álcool-acetona haverá a

extração dos lipídeos da parede celular, o que irá aumentar a porosidade e o

complexo CV-I será removido da célula.

4.4.4 Fucsina

As bactérias que perdem a coloração púrpura após a descoloração com

álcool acetona são chamadas de gram-negativas. Para que as células possam

ser visualizadas é aplicado outro corante, geralmente a fucsina, colorindo as

células de rosa.

Para o preparo da fucsina é preciso fazer duas soluções, a fucsina

concentrada composta por 2,5g de fucsina e 100 mL de etanol, e a fucsina

diluída (para uso na coloração) composta pela fucsina concentrada (10mL) e

90mL de água destilada. Tudo preparado em béquer ou provetas.

16

4.4.5 Álcool 70

Soluções alcoólicas com atividade microbiana ideal dependem de uma

concentração em peso ou em volume em relação à agua, sendo ela 70% p/p

(70ºINPM) ou 77% v/v (77ºGL). Nesta concentração a parede celular do

microrganismo não será desidratada pelo álcool, o qual pode penetrar no

interior da mesma desnaturando proteínas, fato que não ocorre quando utiliza o

álcool acima ou abaixo da concentração ideal.

Para preparar o álcool 70 deve-se colocar em uma proveta de 1L, 700

mL de álcool comercial e completar o volume da proveta com água deionizada.

Em seguida deve-se tampar a proveta e promover a mistura do álcool com a

água. Depois se deve colocar o alcoômetro na solução, o qual deverá marcar

70 Gay-Lussac.

4.4.6 Álcool Iodado

O álcool 70% quando associado a iodo, formulando Álcool Iodado,

apresenta um maior efeito residual e bactericida.

Para o preparo do álcool iodado deve-se colocar 8 mL de lugol forte em

um balão volumétrico de 1L e adicionar 300mL de água deionizada. Completa-

se o volume do balão com álcool 70%. Deve-se misturar bem e armazenar o

álcool iodado em frasco âmbar.

4.5 ACOMPANHAMENTO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DAS ÁGUAS

DOS BEBEDOUROS DO BLOCO C – SEDE ECOVILLE

A água é uma substância que se manifesta sob a forma de numerosas

dispersões aquosas, de composição muito variável, que lhe conferem, em

consequência, características que nem sempre são aquelas que representam a

condição desejada. Quando se pensa em qualidade da água para consumo

humano, surge a necessidade de conhecer, estabelecer, estudar e controlar o

conjunto de características que fazem (ou não) com que ela seja considerada

adequada para este fim. É fundamental conhecer essas características com o

17

objetivo de saber quais são e por que representam a condição pretendida;

estabelecê-las para evidenciar a opção por determinada qualidade; estudá-las,

a fim de aperfeiçoar seu conhecimento e, controlá-las, visando garantir sua

adequação ao consumo humano.

Os indicadores de contaminação fecal, tradicionalmente aceitos,

pertencem a um grupo de bactérias denominadas coliformes. O principal

representante desse grupo de bactérias chama-se Escherichia coli. O

“Standard Methods for the Examinations of Water and Wastewater” define o

grupo coliforme como: “todas as bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas,

gram negativas, não esporuladas e na forma de bastonete”, as quais

fermentam a lactose e produzem ácido, gás e aldeído em um prazo de 24-48

horas a 35°C. Neste grupo são incluídos organismos que diferem nas

características bioquímicas, sorológicas e no seu habitat. Podem ser

classificadas em: Escherichia, Aerobacter, Citrobacter, Klebsiela e outros

gêneros que quase nunca aparecem em fezes como a Serratia.

A razão da escolha dos coliformes como indicadores de contaminação

da água deve-se aos seguintes fatores:

• estão presentes nas fezes de animais de sangue quente, inclusive os

seres humanos;

• sua presença na água possui uma relação direta com o grau de

contaminação fecal;

• são facilmente detectáveis e quantificáveis por técnicas simples e

economicamente viáveis, em qualquer tipo de água;

• possuem maior tempo de vida na água que as bactérias patogênicas

intestinais, por serem menos exigentes em termos nutricionais, além de ser

incapazes de se multiplicarem no ambiente aquático;

• são mais resistentes à ação dos agentes desinfetantes do que os

germes patogênicos.

18

4.5.1 Objetivo

O objetivo do estudo foi avaliar a potabilidade da água mineral que abastece os

bebedouros do bloco C – sede Ecoville, quanto à presença de coliformes totais

e fecais.

4.5.2 Material e Métodos

4.5.2.1 Amostras

Um total de cinco amostras de água, sendo elas dos bebedouros: Térreo,

Primeiro Segundo e Terceiro andar, mais uma amostra do Daqbi (terceiro

andar), do bloco C - sede Ecoville. Todas as amostras foram coletadas em

duplicata, em tubos de ensaio e suas quantidades medidas em proveta

analítica.

Figura 4: Preparação dos frascos para as análises.

19

4.5.2.2 Preparo de Amostras

Para 100 mL de amostra foram utilizados 50 mL do meio Rapid

HiColiform Broth/ Rapid HiColiform Agar.

Para preparar o meio, conforme orientações do Fabricante devem ser

utilizados 16,03g do meio para 1000 mL de água destilada. Foram feitas cinco

amostras em duplicata (total de 10 amostras), cada uma com 50 mL, sendo

utilizados 8,015g para preparo de 500 mL de meio, distribuídos e autoclavados

por quinze minutos, a 15lbs. Quando em temperatura ambiente, foi feito a

coleta de amostras e adicionado a estes meios, sendo identificados e

colocados na estufa a uma temperatura de 37°C para permanência de 24

horas.

Figura 5: Frascos com amostras na estufa.

20

4.5.2.3 Rapid HiColiform Broth/Rapid Hicoliform Agar

Rapid HiColiform Broth é um caldo modificado do descrito por LMX

MANAFI Kneifel. Este meio é útil para a detecção e confirmação de Escherichia

coli e coliformes totais em amostras de água e contém substratos de bases

cromogênicos e fluorogênicos.

Sua composição é rica em Peptona, Cloreto de Sódio, Sorbitol, Fosfato

de Hidrogênio Dipotássico, Dihidrogeno Fosfato de Potássio e Lauril sulfato de

Sódio. O substrato fluorogênico é dividido pela enzima ß-D-glucuronidase

especificamente encontrado em Escherichia coli. A reacção é indicada pelo

desenvolvimento de uma fluorescência azul sob a luz UV. A presença de

coliformes totais é indicada pela coloração azul-esverdeado, devido à clivagem

do substrato cromogênico. A Peptona é rica em triptofano, fornecendo

nutrientes de crescimento essenciais e é útil para a detecção simultânea de

produção de indol. O Sorbitol é a fonte de carbono. Os sais de fosfato irão

fornecer a ação de tamponamento para o rápido crescimento de coliformes.

Lauril sulfato de sódio torna o meio seletivo inibindo microflora acompanhante,

especialmente organismos gram positivos.

Figura 6: Rapid HiColiform Broth

21

4.5.2.4 Reativo de Kovacs

A prova do indol é útil para a diferenciação entre Escherichia coli das demais

Enterobacterias. Alguns não fermentadores e anaeróbios podem também ser

diferenciados através desta prova. Após crescimento em caldo, contendo

triptofano, a formação de metabólitos indólicos é determinada pela reação com

o reativo de Kovacs. Devem ser pingadas 4-5 gotas do reativo, que formará um

anel vermelho dentro de dois minutos caso haja reação positiva.

Figura 7: Reativo de Kovacs

22

4.5.3 Resultados

Na primeira vez que a pesquisa foi realizada, em apenas um bebedouro

(segundo andar) houve reação positiva para coliformes totais e resultado

negativo para Escherichia coli.

Figura 8: Resultado da Análise 1 para Coliformes Totais.

Figura 9: Resultado Análise 1 para Escherichia coli (Teste com reativo de kovaks).

23

Na segunda vez que a pesquisa foi realizada, o resultado foi positivo para

coliformes totais em dois bebedouros do bloco, e negativo para presença de

Escherichia coli em ambos.

Figura 10: Resultado da Análise 2 para Coliformes Totais.

Figura 11: Resultado Análise 2 para Escherichia coli (Teste com reativo de kovaks).

24

4.5.4 Discussão dos Resultados

Na análise da qualidade microbiológica da água, 30% das amostras

coletadas estavam contaminadas por coliformes totais, sendo que 70%

estavam aptas para o consumo. Este resultado é importante visto que

contaminantes como a E. Coli podem causar infecção das vias urinárias e

também pode provocar diarreia.

A Portaria nº 518/2004 do Ministério da Saúde estabelece que sejam

determinados, na água, para aferição de sua potabilidade, a presença de

coliformes totais e termotolerantes de preferência Escherichia coli e a

contagem de bactérias heterotróficas. A mesma portaria recomenda que a

contagem padrão de bactérias não deve exceder a 500 Unidades Formadoras

de Colônias por 1 mililitro de amostra (500/UFC/ml).

Conforme a RDC nº 275/2005 da ANVISA, a água mineral natural e a

água natural envasadas não devem apresentar risco à saúde do consumidor e

devem estar em conformidade com as características microbiológicas. Devem

ser rejeitadas águas onde que tiverem sido constatadas a presença de

Escherichia coli ou coliformes (fecais) termotolerantes em uma das unidades

da amostra representativa; ou apresentar contagem de coliformes totais em

uma das unidades da amostra representativa, maior que "M" (limite máximo

aceitável - 2,0 UFC); apresentar contagem de coliformes totais em mais de

uma unidade da amostra representativa, maior que "m"(limite mínimo aceitável

– menor que 1,0 UFC).

Traçando as bases do Programa Nacional de Vigilância em Saúde

Ambiental relacionadas à qualidade da água para consumo humano, a

Secretaria de Vigilância em Saúde, órgão vinculado ao Ministério da Saúde,

afirma que: “A vigilância da qualidade da água para consumo humano deve

ser uma atividade rotineira, preventiva, de ação sobre os sistemas públicos e

soluções alternativas de abastecimento de água, a fim de garantir o

conhecimento da situação da água para consumo humano, resultando na

redução das possibilidades de enfermidades transmitidas pela água”. Portanto,

através do monitoramento contínuo da qualidade da água, é possível se obter

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um produto dentro das normas de qualidade da água para consumo humano. E

nisso se resume a finalidade dos sistemas de abastecimento/distribuição de

água.

A água é um produto essencial para a existência do ser humano. E, por

essa razão, deve ser disponibilizada em quantidade suficiente e em boa

qualidade para garantir a manutenção e qualidade de vida. No entanto, o que

se percebe é que a observância dos parâmetros de qualidade nem sempre é

realizada. Por diversos fatores a qualidade da água é vulnerável,

principalmente, devido às condições ambientais a qual está exposta. Preservar

a qualidade da água é uma necessidade e ao mesmo tempo um problema

universal, que vem exigindo o empenho não somente dos organismos de

governo, mas também da sociedade civil organizada.

5 CONCLUSÃO

O estágio no laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal

do Paraná – UTFPR realizado pela aluna Liana Cristiane de Sousa foi

importante para sua formação profissional, proporcionando a chance de

aplicação de conceitos teóricos e práticos adquiridos antes e durante o período

de estágio. Além disso, foram desenvolvidas a capacidade de comunicação e

relação interpessoal e profissional que serão importantes para o aluno no

mercado de trabalho.

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6 REFERÊNCIAS

[CETESB] Companhia Estadual de Tecnologia e Saneamento Ambiental.

Controle da qualidade da água para consumo humano: bases conceituais e

operacionais. São Paulo; 1997. p. 152-4.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução 275 de setembro de 2005. Regulamento Técnico de Características Microbiológicas para Água Mineral Natural e Água Natural. Diário Oficial da União, 2005.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos

Estratégicos. Departamento de Ciência e Tecnologia. Classificação de risco

dos agentes biológicos / Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência,

Tecnologia e Insumos Estratégicos, Departamento de Ciência e Tecnologia. –

Brasília : Editora do Ministério da Saúde, 2006.

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Portaria MS nº 518/2004. Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2004. Vigilância e controle da qualidade da água para consumo humano. Brasília: Ministério da Saúde, 2005.

PELCZAR, Jr., M. J. ; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: Conceitos e

Aplicações. 2ª edição; São Paulo-SP: Makron Books, 1997. v.2.

PERAZOLLO, L.M. Coloração de Gram: Princípios e Características.

Disponível em: <http://www.liaaq.ufsc.br/aulas/Gram%20complemento.PDF>.

Último acesso: 23 de outubro de 2013.

TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 8a. ed. Porto

Alegre, Brasil: ARTMED, 2004.