UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF

INSTITUTO DE QUÍMICA – IQ

QUÍMICA INDUSTRIAL

ANA CHRISTINA SILVA DE OLIVEIRA

DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS EM VINHOS POR

ESPECTROFLUORIMETRIA

NITERÓI - RJ

2016

II

ANA CHRISTINA SILVA DE OLIVEIRA

DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS EM VINHOS POR

ESPECTROFLUORIMETRIA

Monografia de final de curso apresentada ao

Curso de Graduação em Química Industrial

da Universidade Federal Fluminense, como

requisito parcial para obtenção do Grau de

Bacharel em Química Industrial.

Orientadora: Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques

Coorientadora: Profa. Dra. Raquel Andrade Donagemma

NITERÓI - RJ

2016

III

O 48 Oliveira, Ana Christina Silva de

Determinação de polifenóis totais em vinhos por espectrofluorimetria/

Ana Christina Silva de Oliveira. - Niterói: [s. n.], 2016.

49f.

Trabalho de Conclusão de Curso – (Bacharelado em Química

Industrial) – Universidade Federal Fluminense, 2016.

1. Composto fenólico. 2. Vinho. 3. Espectroscopia de fluorescência.

4. Método analítico. I. Título.

CDD.: 547.632

IV

V

Agradecimentos

Primeiramente a Deus, que sempre esteve comigo e me deu tudo o que tenho.

Obrigada por me fortalecer a cada dia e me dar razões para continuar.

Às professoras Flávia Marques e Raquel Donagemma pela orientação na

elaboração dessa pesquisa. Muito obrigada pelo suporte, auxílio e por me permitir

usufruir dos equipamentos do Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada

(LaQAFA). Aos amigos do LaQAFA que tornaram este período de pesquisa o mais

agradável possível.

Aos meus pais, Myrian e Waldecy que sempre me apoiaram e acreditaram em

mim. Sempre me incentivaram em todos os momentos para que esse sonho se tornasse

realidade. Muito obrigada pelo amor, carinho e apoio. Amo vocês!

À minha querida irmã Ana Claudia, que sempre traz alegria ao meu dia. Obrigada

pela compreensão todas as vezes que tive que negar algum evento por causa dos afazeres

da universidade. Obrigada pela sua amizade e companheirismo.

À minha avó Almerinda, que desde sempre cuidou de mim como uma filha e

sempre esteve por perto quando precisei. Obrigada por sempre acreditar em mim e

sempre sonhar com meu sucesso.

Aos meus queridos amigos da UFF que tornaram esses anos incríveis. Obrigada

por todas as risadas, brincadeiras, e a relação de parceria que construímos. Aos queridos

amigos que fiz durante o intercâmbio e contribuíram para que eu tivesse os 16 meses

mais intensos da vida. Obrigada por tudo que vivemos juntos e todas as memórias que

escrevemos. As minhas amigas que moraram comigo durante esses anos em Niterói.

Obrigada por serem minha família do lado de cá da baía.

VI

I have no special talents, I am just passionately curious.

Albert Einstein

VII

Resumo

Os compostos fenólicos são responsáveis pela cor, aroma e sabor nos vinhos e sucos de

uva. Estes apresentam propriedades antioxidantes importantíssimas que vem sendo

estudadas para a prevenção de doenças como o mal de Alzheimer e Parkinson. Existe

então, a necessidade que a determinação de compostos fenólicos seja estudada e novos

métodos sejam desenvolvidos para tal análise. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho

foi desenvolver um método simples para determinação de polifenóis totais por

espectrofluorimetria. As condições analíticas otimizadas foram: soluções da amostra e

padrão preparadas em água ultrapura e solução tampão Britton-Robinson pH 8,5 e

varredura normal com medições dos sinais fluorescentes em exc / em = 280/360 nm. O

método analítico foi validado demonstrando linearidade na faixa de 0,01 a 0,3 mg L-1

. Os

limites de detecção e quantificação foram 0,003 e 0,01 mg L-1

respectivamente.

Repetitividade e precisão intermediária com RSD menores que 1,6% demonstrando boa

precisão do método. A viabilidade e exatidão do método foram avaliadas através dos

testes de recuperação (n=3) do analito nas amostras de vinho branco e tinto na faixa de 98

a 101% indicando exatidão e aplicabilidade apropriada. O método foi aplicado na

quantificação de polifénois totais em amostras de vinhos brancos e tintos de várias

marcas e o resultado foi expresso em mg equivalentes de ácido gálico (EAG) L-1

. A

determinação quantitativa foi realizada de forma direta, sem tratamento das amostras. O

índice de polifenóis totais em vinhos tintos variou de 71 a 110 mg EAG L-1

e em vinhos

brancos de 58 a 60 mg EAG L-1

. O método desenvolvido apresentou bom potencial para

determinação de polifenóis totais em amostras de vinhos tintos e brancos.

Palavras-chave: Polifenóis totais, vinhos, espectrofluorimetria.

VIII

Abstract

Phenolic compounds are responsible for the color, flavor and taste in wine and grape

juices. Those present very important antioxidant characteristics that have been being used

for studies to prevent diseases like Alzheimer and Parkinson. In this way, there is the

necessity to improve the determination of phenolic compounds to suggest a new method

to develop this kind of analysis. Along these lines, the aim of this project was to develop

a new method for the determination of total polyphenols using spectrofluorimetry. The

optimized analytical conditions were: sample and standard solutions prepared in ultrapure

water and Britton-Robinson buffer pH 8.5; normal scanning with fluorescent

measureaments at exc / em = 280/360 nm. The analytical method was validated showing

linearity from 0.01 to 0.03 mg L-1

. The detection and quantification limits were 0.003 and

0.01 mg L-1

respectively. Repeatability and intermediate precision presented RSD lower

than 1,6% showing a good precision of the method. The viability and accuracy were

verified through recuperation tests (n=3) presenting results from 98% to 101% showing a

good accuracy and applicability. The method was applied in the quantification of total

polyphenols in red and white wine from different brands and the results were expressed

in mg acid gallic equivalent (GAE) L-1

. The analysis could be done without treating the

samples. The analysis showed the presence of gallic acid in wine and juice samples. In

red wine, the index of total polyphenol content varies from 71 to 110 mg GAE L-1

. To

white wine it was found a concentration between 58 and 60 mg GAE L-1

. The method

developed showed itself a good potential to the total polyphenol content in red and white

wine samples.

Keywords: Spectrofluorimetry, wines, total polyphenols content.

IX

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 13

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 14

2.1. Produção do vinho 14

2.1.1. Aspectos importantes na produção de vinho tinto 14

2.1.2. Aspectos importantes na produção de vinho branco 15

2.1.3. Fermentação alcoólica 15

2.2. Qualidade do Vinho 16

2.3. Compostos Fenólicos 16

2.4. Antioxidantes e sua função no combate à doenças 19

2.5. Métodos de análise 20

2.6. Espectrofluorimetria 21

3. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS 25

3.1. Objetivos 25

3.1.1. Objetivo geral 25

3.1.2. Objetivos específicos 25

3.2. Justificativas 25

4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO

E MÉTODOS

26

4.1. Materiais, reagentes e soluções 26

X

4.2. Amostras 27

4.3. Instrumentação e condições para medidas

espectrofluorimétricas

27

4.4. Tratamento de rejeitos 28

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29

5.1. Estudo da influência solvente 29

5.2. Estudo da influência do pH 30

5.3. Estudo da influência do tratamento fotoquímico 31

5.4. Estudo da influência da proporção água ultrapura:tampão

Britton-Robinson

33

5.5. Condições finais experimentais otimizadas para a determinação

espectrofluorimetria do ácido gálico

34

5.6. Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito 38

5.7. Aplicação do método analítico 39

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

XI

Lista de Figuras

Figura 1: Estrutura básica de um flavonóide. 17

Figura 2: Estrutura de um tanino hidrolisável. 18

Figura 3: Estrutura do ácido gálico. 18

Figura 4: Diagrama simplificado do processo de fluorescência. 21

Figura 5: Modelo simplificado de um espectrofluorímetro. 24

Figura 6: Espectrofotômetro de Fluorescência Varian modelo Cary Eclipse. 28

Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de

ácido gálico 1,0 mg L-1

e (b) água ultrapura (branco). Medições feitas em fenda de

10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.

29

Figura 8: Espectros de excitação e emissão fluorescentes da solução aquosa de

ácido gálico 1,0 mg L-1

preparada em tampão Britton-Robinson em diferentes

valores de pH: (a) 7,0; (b) 8,0; (c) 8,5; (d) 9,0; (e) 10,0; (f) 11,0. Medições feitas

em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.

31

Figura 9: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem =

360 nm, fenda de 10 nm) da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1

, após

diferentes tempos de irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os

espectros da água ultrapura (branco) apresentados em (d).

32

Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem =

360 nm, fenda de 10 nm) de soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1

preparadas em

água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 nas seguintes proporções (% v/v):

(a) 100% tampão; (b) 3:7; (c) 1:1; (d) 7:3; (e) 9:1.

33

Figura 11: Curva analítica para as soluções de ácido gálico em água ultrapura:

tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v). Medições em λem = 360 nm; fenda de

10 nm.

35

XII

Lista de Tabelas

Tabela 1: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do ácido gálico 1,0 mg L-1

.

Medições realizadas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.

32

Tabela 2: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação

espectrofluorimétrica do ácido gálico.

34

Tabela 3: Recuperações obtidas na amostras de vinhos tintos e branco. 37

Tabela 4: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por

espectrofluorimetria.

38

Tabela 5: Determinação de polifenóis totais em vinhos tintos em equivalentes de

ácido gálico.

39

Tabela 6: Determinação de polifenóis totais em vinhos brancos em equivalentes de

ácido gálico.

40

XIII

Lista de Siglas e Abreviaturas

IBRAVIN – Instituto Brasileiro do Vinho

LD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

OIV – International Organization of Vine and Wine

LaQAFA – Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada

CLAE – Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

CG – Cromatografia Gasosa

exc – Comprimento de onda de excitação

em – Comprimento de onda de emissão

EAG – Equivalentes de ácido gálico

IPT – Índice de polifenóis totais

14

1. INTRODUÇÃO

Os vinhos são obtidos através do processo de fermentação alcoólica da uva

madura e fresca ou do suco de uva fresco. Fatores como o tipo de tratamento pelos quais

as uvas são submetidas durante o processo de produção, o tipo de solo e o clima da região

em que as uvas são cultivadas afetam diretamente a composição do vinho (AQUARONE,

2001).

Os vinhos são conhecidos pelo alto teor de polifenóis totais em sua composição.

Estes agem como antioxidantes, impedindo a destruição de células, além de influenciar

diretamente na sua qualidade (DALLABRIDA, 2008). O estudo da determinação de

polifenóis totais em matrizes alimentícias é de extrema relevância, pois a ingestão de

alimentos ricos nestes compostos pode auxiliar no tratamento de doenças causadas pela

degeneração de células.

Atualmente, a determinação de polifenóis totais em vinhos pode ser feita através

de métodos espectrofotométricos, cromatográficos (geralmente associados aos

espectrofotométricos), eletroquímicos e pelo uso de biossensores (ARCHELA, 2013).

Estes têm se mostrado eficazes em seus objetivos, porém ainda apresentam algumas

limitações como a degradação da amostra, elevado consumo de reagentes e o alto tempo

de reação (ZAIA et al, 1998).

Visto a importância do estudo de polifenóis totais, este trabalho tem por objetivo

desenvolver, validar e implementar um novo método de determinação destes em vinhos

por espectrofluorimetria, buscando eliminar as limitações dos métodos atuais.

15

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. Produção do vinho

O vinho é obtido através do processo de fermentação alcoólica da uva madura e

fresca ou suco de uva fresco e sua composição está relacionada com a origem das uvas;

ou seja, o tipo de solo, clima, região onde são cultivadas e o tipo de tratamento pelos

quais estas são submetidas durante o processo de produção e conservação do vinho

(AQUARONE, 2001).

2.1.1. Aspectos importantes da produção de vinho tinto

Numa produção convencional de vinho tinto a extração de sólidos dos cachos de uva

geralmente é feita por maceração e acompanha a fermentação alcoólica. A intensidade da

maceração determina fatores importantes para a qualidade do vinho. Um exemplo disso é

a cor característica do vinho tinto, causada pela intensa maceração. Embora vinhos

brancos e champanhes também envolvam o processo de maceração da casca, como nestes

o processo é feito por menos tempo e menor intensidade, o pigmento presente na casca

não é transferido ao suco em larga escala. Assim como os pigmentos, compostos

fenólicos também são transferidos da casca para o suco. Assim, a intensidade da

maceração deve ser ajustada ao tipo de vinho que se quer produzir (RIZZON et al, 2009).

A qualidade da uva também influencia diretamente na qualidade do vinho,

determinando qual será a composição de compostos fenólicos, teor de açúcar e acidez.

Assim, o tempo da colheita também deve ser estipulado para que a uva tenha atingido

maturidade suficiente para cumprir seus objetivos na produção de vinho (SANTOS,

2007).

Resumidamente a produção de vinho tinto se define em quatro etapas: processos

mecânicos da colheita (esmagamento, desengace e enchimento de tanques); processos no

reator (fermentação alcoólica primaria e maceração); drenagem (separação do vinho e do

bagaço por desengorduramento) e fermentações finais (exaustão do açúcar restante por

fermentação alcoólica e maloláctica) (RIBÉREAU-GAYON et al, 2006).

16

2.1.2. Aspectos importantes na produção de vinho branco

Diferentemente do vinho tinto, o vinho branco é obtido a partir da fermentação

alcoólica do suco sem a presença dos sólidos e essa é a principal distinção entre a

produção dos dois tipos de vinho. Assim, a produção de vinhos brancos pode ser feita

com uvas tintas desde que essas sejam prensadas antes da fermentação de forma que não

passem pigmentação ao suco (GÓES, 2005).

Outro fator importante é que na produção de vinho branco a etapa de maceração é

praticamente nula e ocorre na ausência de álcool, na etapa de pré-fermentação. Como não

existe a etapa de maceração propriamente dita, a etapa de pré-fermentação age

delimitando a passagem de compostos responsáveis pelas qualidades e defeitos da uva

(RIZZON et al, 2009).

A produção de vinho branco se resume nas seguintes etapas: Pré-fermentação

(colheita, esmagamento, prensa e clarificação); processos no reator (fermentação

alcoólica e maloláctica); transfega; classificação e filtração (RIBÉREAU-GAYON et al,

2006).

2.1.3. Fermentação Alcoólica

A história do vinho é tão antiga que tem relação com as primeiras reações químicas

percebidas pelo homem através do processo de fermentação alcoólica. Esta é um

processo biológico que ocorre em substratos açucarados, no qual estes se transformam

em etanol e dióxido de carbono. Microrganismos podem catabolizar açúcares com o fim

de produzir energia química celular por vias aeróbia e anaeróbia. Assim, chama-se de

fermentação alcoólica, quando uma molécula de sacarose é oxidada produzindo etanol e

gás carbônico, como mostra a Equação 1 (STEINLE, 2013).

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2

Equação 1: Fermentação alcoólica

As leveduras, organismos eucariotos pertencentes a classe dos fungos, são os

microrganismos mais utilizados na fermentação alcoólica. Devido a sua anatomia, as

leveduras são capazes de utilizar duas vias no processo fermentativo. Assim, a sacarose

17

pode ser degradada por meio de uma sequencia de reações em cadeia ativadas por

enzimas específicas (SILVA, 2007).

2.2. Qualidade do Vinho

si ei . 8 de 1 88 de ine e vin e id id e

e men çã c ó ic d m s sim es de v sã esc e m d ”. Segundo o Art. 8º

da mesma lei, o vinho pode ser caracterizado com base em sua classe, cor, e teor de

açúcar, levando em conta fatores característicos de cada caracterização como teor

alcoólico, pela presença de bolhas e variedade da uva (BRASIL, 1988).

A composição do vinho consiste em basicamente 86% de água, 12% de etanol, 1%

de glicerol, 0,4% ácidos orgânicos e 0,1% de taninos e fenólicos. Os taninos são

polímeros de outros compostos químicos presentes no vinho. Mudanças na estrutura dos

taninos gera uma alta influencia no envelhecimento, na cor, no corpo e no sabor do vinho

(BRUNNING, 2015). A composição está associada a origem das uvas pelo qual foi

produzido. Fatores como o tipo de solo, o tipo de tratamento que se dá as uvas durante a

produção e o clima da região em que são cultivadas determinam a proporção desses

compostos no vinho. Assim, dependendo da origem da uva o vinho será uma boa fonte de

compostos fenólicos que apresentam propriedades antioxidantes (SANTOS, 2007).

2.3. Compostos fenólicos

Compostos fenólicos são basicamente aqueles que possuem uma ou mais

hidroxilas ligadas ao anel benzênico. Apesar de terem a função que denomina álcoois,

estes são mais ácidos do que álcoois de cadeia alifática. Compostos fenólicos podem se

associar entre si e formar compostos mais complexos que seus respectivos originais. A

composição dos compostos fenólicos em uvas também pode depender do meio ambiente,

época da colheita, processamento e armazenamento. Gerando assim, diferentes

propriedades nas uvas e consequentemente nos vinhos. (ARCHELA et al, 2013).

18

Compostos fenólicos em geral são relacionados a qualidade do vinho por

influenciarem na cor, aroma, corpo, estabilidade oxidativa e sabor. Sua presença também

denota as maiores diferenças entre vinhos brancos e tintos já que espera-se que estes

tenham um maior teor de compostos fenólicos em geral. Além disso, compostos fenólicos

também são conhecidos por suas propriedades antioxidantes que acredita-se serem

eficazes na prevenção de doenças por combaterem a oxidação das células. Por estes

motivos, o teor de compostos fenólicos em vinhos é recorrentemente estudado

(CABRITA et al, 2014).

Os polifenóis são resultados de combinações das diversas estruturas dos

compostos fenólicos existentes. Nos vinhos, os polifenóis estão representados, pelos os

flavonóides e os taninos (BRUNNING, 2015). Os flavonóides são caracterizados pela

estrutura de um difenil propano com dois anéis benzênicos ligados a um anel pirano

(Figura 1). Essa estrutura básica varia de acordo com a quantidade de hidroxilas que

podem estar ligadas a ela (BEHLING, 2004).

Figura 1: Estrutura básica de um flavonóide.

Os taninos podem ser hidrolisáveis ou condensados. Os hidrolisáveis consistem

de ácidos elágicos glicosilados (Figura 2) e de ésteres de ácidos fenólicos. Estes após

hidrólise ácida dão origem a pequenas moléculas. Já os condensados são polímeros e

oligômeros formados pela policondensação de flavan-3-ol e flavan-3,4-diol

(MONTEIRO, 2005).

19

Figura 2: Estrutura de um tanino hidrolisável.

O ácido gálico (Figura 3) é um sólido orgânico cristalino de cor branca ou

levemente amarelado. Este é um dos ácidos fenólicos presentes no vinho, na classe dos

taninos. Na natureza é encontrado em plantas e frutos como a uva. Pode ser obtido pela

hidrólise do ácido tânico com ácido sulfúrico ou através da extração em planta

(POLEWSKI et al, 2005).

Figura 3: Estrutura do ácido gálico.

O ácido gálico, assim como outros ácidos fenólicos, tem propriedades

antioxidantes e é muito importante na indústria farmacêutica, na produção de papel,

corantes e tintas e como antioxidante na indústria de alimentos. Assim como outros

compostos fenólicos, este também é transmitido para o vinho no processo de fermentação

(ZHENG & WANG, 2001).

O ácido gálico demonstra atividade antifúngica e antiviral. Também age como

antioxidante na prevenção da destruição de células. Especificamente apresentou

citoxidade no combate à células cancerosas, no entanto, sem prejudicar células saudáveis.

Também pode ser utilizado como adstringente em casos de hemorragia interna e no

tratamento de diabetes (BADHANI et al, 2015).

20

2.4. Antioxidantes e sua função no combate à doenças

Em plantas e seres vivos ocorrem reações de oxidação vitais para o bom

funcionamento do organismo. Estas começam pela ação dos radicais livres, no entanto,

quando acontecem em larga escala podem causar um tipo de dano conhecido como stress

oxidativo. Nesses casos, substâncias antioxidantes são de grande importância porque elas

agem impedindo a reação de oxidação no sistema em questão. A presença de radicais

livres em excesso pode gerar reações de oxidação destruindo as células do organismo, o

que é o princípio de muitas doenças como o câncer, mal de Parkinson, doenças

cardiovasculares e o mal de Alzheimer (FERREIRA & ABREU, 2007).

A importância dos antioxidantes é tanta que similares sintéticos começaram a ser

produzidos. Porém indícios de problemas causados provavelmente por estes já

começaram a serem detectados e mais pesquisas a respeito de antioxidantes naturais vem

sendo realizadas (DONNELLY & ROBINSON, 1995).

Dentre as muitas formas que os antioxidantes podem agir, no corpo humano estes

podem reduzir os níveis de colesterol oxidado. Antioxidantes são capazes de doar

hidrogênios à radicais livres o tornando inertes por ressonância. Assim, os radicais livres

são reduzidos por meio dessa neutralização (DALLABRIDA, 2008).

2.5. Métodos de análise

Vários métodos para identificação e quantificação de compostos fenólicos em

alimentos têm sido desenvolvidos. Esses métodos são baseados em diferentes princípios e

são usados para quantificar polifenóis totais, determinar um composto específico ou uma

classe de fenólicos.

Existem algumas metodologias descritas para a determinação de compostos

fenólicos por cromatografia. A cromatografia gasosa (CG) (LAMIKANRA et al, 1996) e

a cromatografia a líquido a de alta eficiência (CLAE) (DUTRA et al, 2010) por exemplo,

são técnicas usadas tanto na separação quanto na quantificação de fenólicos. Os métodos

21

eletroanalíticos, usam as propriedades elétricas dos analitos presentes em uma amostra

provendo resultados quantitativos e qualitativos (OLIVEIRA-ROBERTH et al, 2012).

Os métodos espectrofotométricos são os mais utilizados na determinação de

polifenóis totais. Estes medem quantitativamente as propriedades de reflexão ou

transmissão de uma amostra em função do comprimento de onda. Porém independente do

tipo de reagente utilizado, não são métodos específicos, pois detectam todos os grupos

fenólicos presentes no extrato (NACZK & SHAHIDI, 2004).

O método de Folin-Ciocalteau tem sido usado como método oficial pela

International Organization of Vine and Wine na determinação de compostos fenólicos

totais em vinhos. Este método utiliza uma mistura de ácido fosfotúngstico (H3PW12O40)

e ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40 que tem a função de oxidar os compostos fenólicos

presentes no vinho. Após a oxidação, a mistura é reduzida ao óxidos azuis de Molibdênio

(Mo8O23) e Tungstênio (W8O23). Essa solução pode ser determinada por

espectrofotometria já que apresenta absorção máxima em 750 nm (INTERNATIONAL

ORGANIZATION OF VINE AND WINE, 2016).

Apesar de muito eficiente o método de Folin-Ciocalteau apresenta algumas

desvantagens em relação a espectrofluorimetria. A técnica de Folin-Ciocalteau necessita

de operações múltiplas enquanto que a técnica de espectrofluorimetria necessita apenas

da diluição da amostra. Por ser um método que utiliza reações intermediárias, a técnica de

Folin-Ciocalteau causa alterações químicas na amostra o que não ocorre por

espectrofluorimetria. A técnica de Folin-Ciocaleteau necessita de um período de

incubação entre a adição dos reagentes, o que deixa o processo mais lento. Em oposição,

na técnica de espectrofluorimetria as amostras podem ser preparadas e lidas em seguida

deixando o processo mais rápido (ZAIA et al, 1998).

Quando a determinação é espectrofotométrica, os polifenóis totais são expressos

em equivalentes de ácido gálico ou outro composto fenólico. Isso se dá devido a

impossibilidade da técnica de determinar a presença de um ou grupo de fenólicos. A

ampla variedade de compostos fenólicos em vinhos dificulta a determinação dos mesmos.

22

Fatores como a dificuldade de extração, a presença de interferentes e complexidade

química da matriz também dificultam sua determinação em matrizes alimentícias

(ARCHELA, 2013).

Assim, faz-se uma estimativa da concentração dos fenólicos e o resultado é

apresentado como o índice de polifenóis totais (IPT). Muitos compostos fenólicos podem

ser usados como padrão, o critério de escolha envolve a estabilidade e a abundância no

composto na matriz. No método de Folin-Ciocalteau, por exemplo, para vinhos o índice

de polifenóis totais é determinado em equivalentes de ácido gálico (EAG) visto que este é

um ácido fenólico proeminente e representativo no vinho (ONIVOGUI et al, 2014).

2.6. Espectrofluorimetria

A espectrofluorimetria, é o método que utiliza a fluorescência para caracterizar ou

medir substâncias químicas. A medida que uma molécula absorve um fóton, esta é

promovida para um estado de maior energia chamado de estado singleto (S1). Se esta não

absorver nenhum fóton, permanece no estado fundamental singleto (S0). Assim,

denomina-se então fluorescência quando uma molécula transita de um estado excitado de

energia para o estado fundamental liberando fótons com o mesmo número quântico de

spin (Figura 4) (AYOLOTU, 2012).

Figura 4: Diagrama simplificado do processo de fluorescência (MARQUES, 2009).

23

Quando uma molécula é excitada, esta muda para níveis vibracionais mais altos

de um nível eletrônico, assim o excesso de energia pode ser dissipado levando o

fluoróforo para o fundamental singleto excitado. Devido a relaxação que ocorre durante o

processo, o espectro de emissão é obtido independente do comprimento de onda de

excitação e assim os espectros de fluorescência vão estar deslocados para comprimentos

de onda maiores, ou seja, de menor energia do que os da banda de absorção. Dessa

forma, a banda emissão será uma imagem especular da banda de absorção, com seu

máximo em comprimentos de onda maiores também que os da banda de absorção.

Chama-se esse deslocamento de deslocamento de Stokes (LIMA, 2012).

Alguns fatores como a estrutura da molécula, temperatura, solvente utilizado e o

pH da solução influenciam a fluorescência de uma amostra. No caso do solvente, por

exemplo, sua polaridade e viscosidade podem aumentar ou diminuir o sinal fluorescente.

A quantidade de elétrons deslocalizados também interfere na fluorescência, quanto maior

a população destes, maior será o potencial fluorescente da amostra. Assim, na

determinação do procedimento experimental deve se considerar aspectos como a escolha

do solvente e do pH da solução pois dentre outros, estes podem alterar o sinal de

fluorescência (VO-DINH, 1984).

Moléculas orgânicas, principalmente aromáticas como o acido gálico, apresentam

elétrons em sistemas deslocalizados, acarretando em forte luminescência. Quando não

se tem heteroátomos na estrutura, as transições eletrônicas geralmente envolvem a

promoção de um eletron de um orbital ligante para um orbital antiligante . Dá-se a

este processo o nome de transição – e ao estado eletrônico resultante de estado

excitado *. Em alguns casos, tem-se o estado eletrônico chamado de estado excitado

n . Estes ocorrem quando na presença de heteroátomos no sistema conjugado, um

estado eletrônico pode resultar da promoção de um elétron de orbital ligante n para um

orbital antiligante (HURTUBISE, 1990).

A partir técnica de espectrofluorimetria é possível se obter espectros de emissão

molecular através da excitação do analito em comprimentos de onda específicos. Uma

vez que uma fonte de energia incide o analito, se obtêm a excitação da amostra no seu

comprimento de onda de absorção, denominado excitação, e em um comprimento de

24

onda maior de emissão. Diferenças de energia entre os estados vibracionais no estado

fundamental e no estado excitado são as mesmas, isso acarreta na sobreposição das

imagens de excitação e emissão em espectros fluorescentes (HARRIS, 2001).

Num processo de fluorescência, espera-se um aumento da intensidade de

fluorescência à medida que se aumenta a concentração da amostra. Quando se observa

um decréscimo, tem-se um processo chamado Queenching. Este pode ocorrer durante o

estado excitado como o queenching colisional e transferências de energia. O quenching

colisional por exemplo, acontece quando o fluoróforo excitado entra em contato com uma

molécula que facilita transições do estado fundamental. O queenching também pode

ocorrer no estado fundamental através da formação de complexos. O queenching estático

ocorre quando o fluoróforo forma um complexo estável com outra molécula (HOF et al,

1997). Para saber um pouco mais sobre a contribuição da fluorescência para reações do

estado excitado pode analisar o rendimento quântico. Este definido pelo símbolo ΦF, é

medido pela razão entre numero de fótons emitidos pelo numero total de fótons

absorvidos (LIMA, 2012).

Um espectrofluorímetro é formado por um conjunto de componentes conforme

apresentado na Figura 5.

A fonte de luz gera um alto nível de radiação visível e ultravioleta. Essa radiação

deve atingir o colimador onde será absorvida e orientada na direção da fenda. Esta limita

a passagem de radiação determinando quanto da mesma chegará a amostra. O

monocromador de excitação seleciona o comprimento de onda em que a amostra será

incidida. Depois que a amostra é incidida pela radiação, esta passa por outra fenda e pelo

monocromador de emissão até chegar ao detector que coletará a informação

direcionando-a ao computador (AYOLOTU, 2012).

25

Figura 5: Modelo simplificado de um espectrofluorímetro (AYOLOTU, 2012).

Fonte de luz Colimador Fenda Monocromador

Amostra Fenda Monocromador Detector

26

3. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS

3.1. Objetivos

3.1.1. Objetivo geral

Desenvolver e validar um novo método analítico para determinação de polifenóis

totais em vinhos tintos e brancos por espectrofluorimetria.

3.1.2. Objetivos específicos

Estudar as características fluorescentes da molécula do ácido gálico para obtenção

de condições experimentais que proporcionem uma melhor sensibilidade ao

método espectrofluorimétrico;

Validar o método analítico para a determinação do índice de polifenóis totais;

Aplicar o método analítico desenvolvido na determinação do índice de polifenóis

totais em diferentes amostras de vinhos tintos e brancos.

3.2. Justificativas

A presença de compostos fenólicos em vinhos caracteriza aspectos importantes da sua

qualidade. Além disso, estes também podem agir como antioxidantes combatendo a

degeneração de células prevenindo doenças. Por isso, existe a necessidade de serem feitos

testes analíticos de determinação dos mesmos.

Os métodos existentes são eficientes, porém, com algumas desvantagens, em relação

ao proposto por este trabalho. O método aqui descrito propõe inovação através da

determinação de compostos fenólicos por meio da espectrofluorimetria de forma

simplificada, sem a necessidade de reações de derivatização.

27

4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E

MÉTODOS

Este trabalho foi realizado no Instituto de Química da Universidade Federal

Fluminense (UFF), no laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada

(LaQAFA). Todos os reagentes, materiais e equipamentos necessários foram cedidos pelo

mesmo.

4.1. Materiais, reagentes e soluções

A água ultrapura (18,2 MΩcm) utilizada para o preparo de todas as

soluções aquosas foi obtida a partir do sistema de purificação de água Arium Bagtanks,

Sartorius, Alemanha. Padrão de ácido gálico hidratado (Sigma-Aldrich, EUA), ácido

clorídrico P.A. (Vetec, Brazil), hidróxido de sódio (Merck, Brasil), etanol (Vetec, Brasil)

e metanol (J.T.Baker, EUA) foram utilizados na otimização do método

espectrofluorimétrico. Ácido bórico (Vetec, Brasil), ácido fosfórico (Vetec, Brasil) e

ácido acético (Vetec, Brasil) foram utilizados no preparo do tampão Britton-Robinson

aplicado no estudo do pH.

Para a otimização do método espectrofluorimétrico foi utilizada solução padrão

de ácido gálico 0,06 mg L-1

, obtida a partir da diluição de solução estoque 1 mg L-1

em

água ultrapura, HCl 0,1 mol L-1

, NaOH 0,1 mol L-1

e tampão Britton-Robinson em

diferentes valores de pH.

O tampão Britton-Robinson foi preparado com a mistura de partes iguais das

soluções de ácido fosfórico 0,04 mol L-1

, ácido acético 0,04 mol L-1

e ácido bórico 0,04

mol L-1

com adições de volume adequado de NaOH 0,1 mol L-1

para atingir o pH

desejado com o auxílio de um pHmetro (DM-22, Digimed, Brasil).

O estudo do efeito da radiação ultravioleta foi realizado com a solução aquosa

de ácido gálico 1,0 mg L-1

. Esta solução foi colocada em tubos de quartzo (1,9 cm de

diâmetro e 13,7 cm de altura) e posicionada no centro do reator fotoquímico por 15 e 30

min. Vale ressaltar que este reator foi construído no próprio laboratório com uma

28

carcaça de forno elétrico e está muito bem descrito na referência de Gouvêa e

colaboradores (GOUVÊA et al, 2014).

Após a otimização do método, a partir da solução estoque 1,0 mg L-1

preparada

em água ultrapura a cada dia de análise, foram feitas diluições em água ultrapura: solução

tampão Britton-Robinson pH 8,5 1:1 % v/v, e soluções de 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08;

0,1; 0,2; 0,3 mg L-1

foram utilizadas na construção das curvas analíticas.

4.2. Amostras

Amostras de vinho tinto (A, B, C, D, E), vinho branco (F, G, H, I) de

diferentes fabricantes foram adquiridas em estabelecimentos comerciais localizados nas

cidades do Rio de Janeiro e Niterói.

Nenhum preparo de amostra foi necessário. Somente uma diluição na razão

1:2000, utilizando a mistura água ultrapura:solução tampão Britton-Robinson pH 8,5 1:1 %

v/v, foi realizada para que a concentração obtida estivesse dentro da faixa linear da curva

analítica.

4.3. Instrumentação e condições para as medidas espectrofluorimétricas

O estudo da fluorescência do ácido gálico foi realizado no espectrofluorímetro da

marca VARIAN, modelo Cary Eclipse (Figura 6), tendo como fonte de excitação uma

lâmpada pulsátil do tipo descarga de xenônio, com 80 Hz e 12 watts. O equipamento

apresenta abertura de fenda (banda espectral de passagem) variando de 1,5 a 20 nm e seu

detector, um fotomultiplicador PMT R928, tem resposta que detecta radiação até 900 nm.

A aquisição de dados e controle do equipamento foi feita com o sistema operacional

SWEclipse® Bio Pack V 1.1 (XP WIN2000) software.

Neste trabalho, bandas espectrais de passagem de 10 ou 20 nm com velocidade de

varredura de 1200 nm s-1

e cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm foram usadas

para as medições espectrofluorimétricas.

29

As medidas foram sempre realizadas nos comprimentos de onda máximos de

excitação ( exc = 280 nm) e emissão ( em = 360 nm) do ácido gálico. Os valores dos sinais

dos brancos também foram medidos para que fossem feitos os cálculos dos valores

líquidos referentes ao sinal fluorescente do analito.

Figura 6: Espectrofotômetro de fluorescência da Varian, modelo Cary Eclipse.

4.4. Tratamento de rejeitos

Como foram apenas usados solventes e analitos não nocivos ao meio ambiente,

não foi necessário nenhum tratamento de rejeitos.

30

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesta Seção serão mostrados os resultados encontrados em todas as etapas do

desenvolvimento do método.

Foram realizados estudos para otimização do sinal analítico, através da avaliação

de parâmetros como solvente, pH do meio e irradiação ultravioleta, com o objetivo de

verificar a influência destes no sinal fluorescente do ácido gálico e garantir maior

seletividade e sensibilidade ao método.

5.1. Estudo da influência do solvente

As características do solvente afetam diretamente a fluorescência de uma

molécula, e os solventes com maior polaridade tendem a estabilizar os luminóforos no

estado excitado, desfavorecendo a perda de energia por processos não radiativos como

relaxação vibracional e cruzamento interssistemas, favorecendo a fluorescência

(HURTUBISE, 1990).

A escolha do melhor solvente deve levar em consideração a solubilidade do

analito no solvente a ser utilizado, o sinal de fundo (branco do solvente), custo e

toxicidade. O primeiro solvente estudado foi a água ultrapura, no qual o ácido gálico

apresentou excelente solubilidade e ótimo sinal fluorescente, como mostra a Figura 7.

Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de ácido

gálico 2,0 mg L-1

em pH 7 e (b) água ultrapura (branco). Medições feitas em fenda de 10

nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.

200 300 400 5000

100

200

300

Comprimento de onda (nm)

Inte

nsi

dad

e d

e si

nal f

luo

resc

ente

(u

.a.)

(a)

(b)

31

Sendo assim, considerando a alta intensidade de sinal fluorescente obtida (Figura

7), além de todas as vantagens que o uso da água ultrapura como solvente traria para o

método, tais como nenhuma toxicidade, baixo custo e alta solubilidade, optou-se por

continuar em meio aquoso (e não mais estudar outros possíveis solventes) e investigar a

influência do pH (Seção 5.2) na intensidade do sinal fluorescente.

5.2. Estudo da influência do pH

A forma como uma molécula se apresenta (com carga positiva, negativa ou neutra)

está diretamente relacionada ao pH do meio. Portanto, este é um parâmetro muito

importante na fluorescência, visto que geralmente moléculas eletricamente carregadas

tendem a apresentar maior fluorescência devido à maior rigidez molecular (SKOOG,

2002).

Sendo assim, foi realizado um estudo das características fluorescentes de solução

de ácido gálico 1,0 mg L-1

(pKa = 4,40) na faixa de pH compreendida entre 2 e 12,

utilizando para isto solução tampão Britton-Robinson (Seção 4.1), mas as soluções de pH

abaixo de 7 apresentaram um sinal não significativo e por isso não foram representadas.

Conforme pode ser visto na Figura 8, o analito apresentou os melhores sinais nos

valores de pH 8,0; 8,5 e 9,0, sendo estes sinais muito similares, mostrando que o método

pode apresentar boa robustez neste intervalo de pH. Sendo assim, o pH 8,5 (meio do

intervalo entre 8,0 e 9,0) foi selecionado para prosseguir com o trabalho por se encontrar

no meio desta faixa robusta. Vale ressaltar que os resultados das medições das soluções

de ácido gálico em valores de pH menores que 7,0 não foram mostrados na Figura 8

porque apresentaram sinais próximos ao do branco.

32

Figura 8: Espectros de excitação e emissão fluorescentes da solução aquosa de ácido

gálico 1,0 mg L-1

preparada em tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH:

(a) 7,0; (b) 8,0; (c) 8,5; (d) 9,0; (e) 10,0; (f) 11,0. Medições feitas em fenda de 10 nm e

λexc/λem = 280/ 360 nm.

5.3. Estudo da influência do tratamento fotoquímico

Apesar de já terem sido alcançados sinais analíticos bastante satisfatórios após o

estudo do pH (Seção 5.2), neste trabalho também foi realizado um estudo do efeito da

radiação UV sobre o sinal do ácido gálico com o intuito apenas de explorar um pouco

mais as suas características luminescentes.

O uso da incidência de radiação UV sobre a solução do analito é um artifício

bastante útil para tentar produzir derivados fotoquímicos com fluorescência maior do que

a molécula original (ganho de sensibilidade para o método) e/ou tentar reduzir/ eliminar o

sinal de potenciais interferentes. Por outro lado, o efeito contrário também pode ocorrer,

ou seja, a irradiação por UV pode produzir derivados com menor eficiência quântica

(SKOOG & HOLLER, 2002).

As soluções aquosas de ácido gálico 1,0 mg L-1

preparadas em tampão Britton-

Robinson pH 8,5 foram condicionadas em tubos de quartzo e submetidas a diferentes

tempos (15 e 30 min) de irradiação por UV em câmara de UV artesanal construída no

200 300 400 500

50

100

150

(a)

(b)

(d)

(e)

(f)

Comprimento de onda (nm)Inte

nsi

dad

e d

e si

nal

flu

ore

scen

te (u

.a.)

0

(c)

33

próprio laboratório (GOUVÊA, 2014). Os resultados obtidos estão na Tabela 1, na qual é

possível observar uma queda considerável na intensidade do sinal fluorescente do analito

quando exposto à irradiação por UV.

Tabela 1: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do ácido gálico 1,0 mg L-1

.

Medições realizadas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.

Tempo na câmara de

UV (min)

Sinal líquido fluorescente

(u.a.)

0 220

15 0

30 0

Portanto, estes estudos demonstraram que o uso da irradiação por UV não foi

vantajoso para o método, pois o sinal foi eliminado, conforme também pode ser visto

nos espectros de excitação e emissão fluorescentes mostrados na Figura 9.

Figura 9: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm,

fenda de 10 nm) da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1

, após diferentes tempos de

irradiação por UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água

ultrapura (branco) apresentados em (d).

200 300 400 5000

100

200

300

Comprimento de onda (nm)

Inte

nsi

dad

e d

e si

nal f

luo

resc

ente

(u

.a.)

(a)

(b) (c) (d)

34

5.4. Estudo da influência da proporção água ultrapura:tampão Britton

Robinson

Com o objetivo de uniformizar a porporção de água ultrapura e solução tampão

Britton Robinson pH 8,5 que seria utilizada nas soluções de cada ponto das curvas

analíticas, soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1

foram preparadas em diferentes

proporções (100% tampão; 1:1; 3:7; 7:3 e 9:1) de água ultrapura:tampão Britton

Robinson pH 8,5 (% v/v).

Conforme pode ser visto na Figura 10, o maior sinal fluorescente foi obtido na

solução preparada em 100% tampão pH 8,5. A Figura 10 também mostrou que quanto

maior a diluição da solução tampão, menor o sinal. No entanto, a proporção 1:1 % v/v de

água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 foi selecionada, pois desta forma

ficariam uniformes todas as soluções de cada ponto da curva analítica com relação a

proporção de solução tampão e água ultrapura. Vale ressaltar que, apesar de o sinal

analítico nesta condição não ser o maior, isto não é um problema porque a quantidade de

polifenóis totais é extremamente alta nas amostras estudadas neste trabalho.

Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm,

fenda de 10 nm) de soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1

preparadas em água

ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 nas seguintes proporções (% v/v): (a) 100%

tampão; (b) 3:7; (c) 1:1; (d) 7:3; (e) 9:1.

200 300 400 500

50

100

150

(a)

(f)

Comprimento de onda (nm)

Inte

nsi

dad

e d

e si

nal f

luo

resc

ente

(u

.a.)

0

200

35

5.5. Condições finais experimentais otimizadas para a determinação

espectrofluorimétrica do ácido gálico

Após os estudos de otimização dos parâmetros principais para obtenção do

melhor sinal analítico e, consequentemente, melhor sensibilidade, realizados nas Seções

de 5.1 a 5.4, a Tabela 2 apresenta as condições finais obtidas.

Tabela 2: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação

espectrofluorimétrica do ácido gálico.

Tipo de Varredura Normal

λexc/λem 280/360

pH 8,50

Solvente Água ultrapura: tampão Britton-Robinson (1:1 % v/v)

Como pode ser visto, o método desenvolvido apresenta condições experimentais

que são extremamente simples, sendo esta uma grande vantagem que favorece a sua

aplicação para a determinação dos compostos fenólicos totais em vinhos em equivalentes

de ácido gálico (EAG).

5.6. Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito

Os parâmetros analíticos de mérito foram obtidos de acordo com as condições

estabelecidas na Tabela 2 e com o documento DOQ-CGCRE-008 ( O ien çã s e

v id çã de m d s n í ic s”) d I METRO (BRASIL, 2011).

Para a obtenção dos parâmetros relacionados com a resposta linear, foram

construídas três curvas analíticas e, para cada ponto da curva três medições foram

realizadas no comprimento de onda máximo de emissão (360 nm) para se o obter o valor

36

médio como resultado. Este estudo permitiu verificar uma faixa de resposta linear que se

estendeu de 0,01 mg L-1

a 0,3 mg L-1

, caracterizada pelo valor de R2 igual a 0,9995

(Figura 11).

Figura 11: Curva analítica para as soluções de ácido gálico em água ultrapura: tampão

Britton-Robinson pH 8,5 (1:1 % v/v). Medições em λem = 360 nm; fenda de 10 nm.

A detectabilidade do método foi avaliada pelos valores de limite de detecção (LD)

e de quantificação (LQ). No caso do LQ, foi considerado o primeiro ponto da curva

analítica (0,01 mg L-1

). Já o LD foi calculado dividindo-se o LQ por 3,33 (10/3). Foram

obtidos os valores bastante satisfatórios de 0,003 mg L-1

e 0,01 mg L-1

para LD e LQ,

respectivamente (MAGNUSSON et al, 2014).

A precisão foi avaliada em termos de repetitividade e precisão intermediária.

A repetitividade é definida como a concordância entre os resultados de medições

sucessivas efetuadas sob as mesmas condições de medição em um curto intervalo de

tempo (BRASIL, 2011). Neste trabalho, a repetitividade foi avaliada através de 7

medições consecutivas, usando solução de ácido gálico de 0,1 mg L-1

(centro da curva

0

200

400

600

800

1000

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

Inte

nsi

dad

e do s

inal

flu

ore

scen

te

(u.a

.)

Concentração da solução de ácido gálico (mg L-1)

37

analítica) em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5 (1:1 % v/v). O resultado

obtido produziu um desvio padrão relativo de 1,2%, sendo este valor considerado

satisfatório, pois é menor que o valor máximo permitido (5%).

A precisão intermediária diz respeito à concordância obtida entre resultados

utilizando o mesmo método e laboratório podendo-se variar uma ou mais condições de

análise (BRASIL, 2011). Neste trabalho, a precisão intermediária foi avaliada através de

7 medições independentes de solução de ácido gálico 0,1 mg L-1

em água ultrapura:

tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v), realizadas pelo mesmo analista em dias

diferentes. O teste t-Student (nível de confiança de 95%) foi usado para comparar as

médias do sinal líquido fluorescente obtidas em dias diferentes. O valor de tcalculado (0,775)

obtido foi menor que o valor de tcrítico (2,780), sendo assim, pode-se concluir que não

existe diferença entre as médias dos sinais fluorescentes obtidos em dias diferentes, e,

portanto, o método apresenta boa precisão intermediária.

A viabilidade do método foi verificada através de ensaios de recuperação.

Amostras de vinho tinto e branco em triplicatas foram fortificadas com concentração

conhecida de ácido gálico (0,06 mg L-1

) e as recuperações foram obtidas através da

seguinte equação: Recuperação (%) = [(C1-C2)/C3]*100, em que C1 é a concentração do

analito na amostra fortificada; C2 é a concentração dos analito na amostra não fortificada

e C3 é a concentração dos analito adicionado na amostra. A recuperação média do ácido

gálico nas amostras variou de 98% a 101% (Tabela 3), representando um resultado

satisfatório aferindo viabilidade ao método desenvolvido (BRASIL, 2011).

38

Tabela 3: Recuperações obtidas na amostras de vinhos branco e tinto.

Amostraa Média (n = 3) da

intensidade sinal

fluorescente (u.a.)

Desvio-

padrão

Índice de

polifenóis totais

(EAG mg L-1

)b

Recuperação

média (%)

Vinho branco 79 0,5 0,026

Fortificada com

0,06 mg L-1

241 0,4 0,086 101

Vinho tinto 133 0,7 0,046

Fortificada com

0,06 mg L-1

292 0,6 0,105 98

aApós diluição de 2000 vezes em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v)

bExpresso em equivalentes de ácido gálico (EAG)

A Tabela 4 apresenta os parâmetros analíticos de mérito calculados para o método

desenvolvido neste trabalho.

39

Tabela 4: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por

espectrofluorimetria.

Parâmetros analíticos de mérito Ácido gálico

Equação da curva analítica Y = 2700,8*X + 3,1548

Coeficiente de determinação (R2) 0,9995

Faixa linear (mg L-1

)

0,01 – 0,3

LD (mg L

−1) 0,003

LQ (mg L

−1) 0,01

Repetitividade (DPR%, n = 7) 1,2%

Precisão Intermediária (teste t-Student; 95%

confiança; n = 14 , 2 dias)

tcalculado (0,775) < tcrítico (2,780)

Recuperação média (n = 3) 98 -101%

5.7. Aplicação do método analítico

O método analítico espectrofluorimétrico desenvolvido neste trabalho nas

condições otimizadas mostradas na Tabela 2, foi aplicado para determinar o índice de

polifenóis totais (expresso em EAG) das amostras de vinhos, conforme descrito na Seção

4.2.

Vale ressaltar que o índice de polifenóis totais nos vinhos foi expresso em

equivalentes de ácido gálico, pois há uma grande variedade de polifenóis neste tipo de

amostra, impedindo que sejam quantificados individualmente, já que a fluorimetria não é

um método seletivo. Portanto, é comum o uso de um composto fenólico como padrão de

quantificação (como o ácido gálico) e que represente o total de polifenóis na amostra.

(ARCHELA, 2013).

40

De acordo com a literatura, o índice de polifenóis totais em vinhos pode variar de

60 a mais de 1000 mg L-1

em equivalentes de ácido gálico. Este valor pode variar em

larga escala de acordo com o tipo de uva, solo, meios de produção e clima da região em

que a uva foi cultivada (STRATIL et al, 2008; ZHU et al, 2014).

Obviamente, para a obtenção do valor do índice de polifenóis totais na amostra é

necessário considerar a diluição realizada. Neste trabalho, a diluição foi na razão de

1:2000, de forma que cada valor de fluorescência obtido foi multiplicado por 2000 para

obter-se o valor real do índice de polifenóis totais. Os resultados obtidos estão descritos

nas Tabelas 5 e 6.

Tabela 5: Determinação de polifenóis totais em vinhos tintos em equivalentes de ácido

gálico.

Amostras de

vinho tinto

Índice de polifenóis totais na

amostra diluída (EAG mg L-1

) *

Índice de polifenóis totais na

amostra inicial (EAG mg L-1

)

A 0,046 91

B 0,052 103

C 0,055 110

D 0,039 79

E 0,035 71

* Diluído por um fator de 2000 vezes.

41

Tabela 6: Determinação de polifenóis totais em vinhos brancos em equivalentes de ácido

gálico.

Amostras de vinho

branco

Índice de polifenóis totais na

amostra diluída (EAG mg L-1

) *

Índice de polifenóis totais na

amostra inicial

(EAG mg L-1

)

F 0,029 59

G 0,030 60

H 0,029 58

I 0,029 59

* Diluído por um fator de 2000 vezes.

As Tabelas 5 e 6 mostram os resultados obtidos para o índice de polifenóis totais

em equivalentes de ácido gálico nas amostras diluídas e nas amostras originais pelo

método proposto neste trabalho. Pôde-se observar que mesmo diluindo-se a amostra em

2000 vezes é possível se fazer uma determinação eficaz. Reafirma-se também pelas

Tabelas 5 e 6 a boa escolha do ácido gálico como padrão na análise visto sua

proeminência na amostra.

Como esperado, o índice de polifenóis totais em vinhos tintos é maior do que o

índice de polifenóis totais em vinhos brancos. Conforme citado na Seção 2, isso se deve

ao fato de na casca se encontrar a maior parte dos compostos fenólicos, que também se

fazem presente no corpo da uva em si (RIZZON et al, 2009). A medida que a casca fica

em contato com o suco na etapa de fermentação, durante a produção do vinho tinto, os

compostos fenólicos passam da casca para o suco deixando neste um alto índice de

polifenóis totais (Ribéreau-Gayon et al, 2006).

Além desse fator principal, este índice pode variar de acordo com a origem da uva

e com o tratamento que esta recebeu durante a produção de vinho. Determinar o índice de

polifenóis totais em vinhos é importante para combater fraudes na produção dos mesmos

e para controlar o processo fermentativo conferindo uma boa qualidade ao produto.

42

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com o intuito de determinar o índice de polifenóis totais em amostras de vinhos tinto

e branco em equivalentes de ácido gálico, um método baseado na espectrofluorimetria foi

desenvolvido e validado com sucesso. Estudos das características fluorescentes do ácido

gálico foram realizados e as condições finais mostraram que o método apresentou

sensibilidade, precisão e exatidão adequadas. Além disso, o método foi aplicado em

diferentes amostras de vinho e as concentrações encontradas (Tabelas 5 e 6) estão em

coerência com o esperado, segundo informações da literatura (STRATIL et al, 2008;

ZHU et al, 2014).

Vale ressaltar que este trabalho permitiu a determinação do índíce de polifenóis totais

de forma direta, ou seja, sem a necessidade de reações de derivatização. E isto é uma

grande vantagem quando comparado ao método de Folin-Ciocalteau, que tem sido usado

como método oficial na determinação de compostos fenólicos totais em vinhos. Outra

vantagem considerável é que não foi necessário nenhum tratamento de amostra, mas

apenas uma etapa de diluição.

Como continuação e trabalho futuro, para uma validação mais completa pretende-se

ainda realizar ensaios para comparação do método desenvolvido com o método oficial

(Folin-Ciocalteau), além de analisar um número bem maior de amostras de vinhos tinto e

branco e também de sucos de uva integral de diferentes procedências, assim como

determinar a atividade antioxidante dos mesmos.

Enfim, o método desenvolvido neste trabalho pode ser uma ótima alternativa para

análise de rotina no controle de qualidade de vinhos.

43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALPUIM J.P. A endend ímic d vin ”. Revis Q ímic P ic d em:1

páginas 13-27

ANLI, R. E.; VURAL . An i xid n P en ic S s nces T kis Red Wines m

Di e en Wine Regi ns” M ec es 200 14 28 -297; doi:10.3390/molecules14010289

A TO IO L. A s çã de Ene gi Emissã de Ene gi Exci çã e e ônic ”.

<http://slideplayer.com.br/slide/1697750/> Consultado em 6 de dezembro de 2016

AQUARONE, E. Biotecnologia Industrial. 1ª ed. São Paulo: Edgar Blücher, 2001.

ARCHELA E.; DALL’A TO IA L.H. De e min çã de C m s s Fenó ic s em

Vinho: Uma revisão”. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, Londrina, v. 34, n. 2, p.

193-210, jul./dez. 2013. Consultado em 11 de abril de 2016.

AYOLOTU M. A. C m e s ec me y s ec ime y nd ic i n in

Ag ic e nd medicine.” University of Nigeria, Nsukka, 2012.

BAHANI, B. SHARMA, N. KAKKAR, R. G ic cid: ve s i e n i xid n wi

promising therapeutic and industrial applications”. RSC Adv., 2015,5, 27540-27557 DOI:

10.1039/C5RA01911G, 2015.

EDE DO G. C. Es d de s nd s escen es determinação de cátions”.

Universidade federal de Santa Catarina. P g m de ós-g d çã em ímic . Tese de

Mestrado. Florianópolis, 2007

EHLI G E. .; SE D O M. C.; A TU ES L. M. G.; IA CHI M. L. P.

F v nóide e ce in : aspectos gerais e ções i ógic s” A im. Nutr., Araraquara, v.

15, n. 3, p. 285-292, 2004

44

BERNARDES, N. R.; GLÓRIA, L.L.; NUNES, C. R.; PESSANHA, F. F.; MUZITANO,

M. F.; OLIVEIRA D. . Q n i ic çã d s Te es de T nin s e Fenóis T is e

Av i çã da Atividade Antioxidante dos Frutos de Aroeira”. V RTICES, Campos dos

Goytacazes/RJ, v. 13, n. 3, p. 117-128, set./dez. 2011. Consultado em 12 de maio de

2016.

BRASIL. Documento de caráter orientativo. Orientação sobre validação de métodos

analíticos. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, 2011.

BRASIL. Lei nº 7.678, de 8 de novembro de 1988.

RITO . M.; JU IOR O. P. A.; POLESE L.; RI EIRO M. L. VALIDAÇ O DE

MÉTODOS A ALÍTICOS: ESTRAT GIA E DISCUSS O”. Pes icid s: R. Ec xic .

e Meio Ambiente, Curitiba, v. 13, p. 129-146, jan./dez. 2003.

BRUNNING, A. COMPOUND INTEREST. Copyright 2015 Andy Brunning/Compound

Interest. The Key Chemicals in Red Wine – Colour, Flavour, and Potential Health

ene i s”. http://www.compoundchem.com/2014/05/28/redwinechemicals/”. C ns d

em 29 de Agosto de 2016.

CA RITA M.J.; SILVA J.R.; LAUREA O O.

Os c m s s i enó ic s d s v s e d s vin s.

http://www.isa.utl.pt/riav/Pdf/Memoria%20del%20Seminario%202003.3.pdf”.

Consultado em 23 de junho de 2016.

CI TRA R.M.G. MA CI I FILHO J. An i xid n c ivi y s ices in di e en

sys ems”. In: BIENNIEAL MEETING INTERNATIONAL SOCIETY FOR FREE

RADICAL RESEARCH, 8., 1996, Barcelona. Abstract Book. Barcelona: ISFRR, 1996.

p.90.

DALLABRIDA, J. C. An i xid n es d C c e e d Vin Tin . 2008. 2 . T

c d mic esen d C s de c e d em Q ímic de Alimentos.

Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

45

DHARMADHIKARI M. C m si i n

G es”< s://www.ex ensi n.i s e.ed /wine/si es/www.ex ensi n.i s e.ed / i es/wi

ne/compositionofgrapes.pdf > Consultado em 7 de dezembro de 2016

DIAS, S. P.; ME EGO R. F. C m çã d e de enó ic s is e d çã

n i xid n e de s c s ind s i iz d s de v e de vin s in ”. Revis Univ Sã

José dos Campos-SP, v. 18, n. 32, dez.2012. ISSN 2237-1753

DONNELLY, J.K., ROBINSON, D.S. Invited review. F ee dic in ds”. Free

Radical Research, Yverdon, v.22, n.2, p.147-176, 1995.

DUTRA, F. L. G.; HOFFMANN-RI A I R.; RI A I M. De e min çã de

compostos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência isocrática durante

estacionamento da erva-m e”. Quím. Nova vol.33 no.1 São Paulo 2010.

ETS LA ORATORIES. P i ing en ic c m nds in ed wine”

<https://www.etslabs.com/library/34> Consultado em 20 de outubro de 2016

FERREIRA I.; A REU R. S ess Oxid iv An i xid n es e Fi ímic s”.

es .i . / d / e ei _1 . d ” c ns d em 08 de g s de 201 .

FO SECA S.; JA M. R. G.; I RAHIM M. O vin n An ig Egi : m is ó i

medi e ne ”. Revista Mundo Antigo – Ano I – Volume I – Junho – 2012 ISSN 2238-

8788.

GÓES F. J. Desenv vimen e imiz çã d cess e men iv d çã

de vin nc i d v I i ”. P g m de ós-g d çã em engen i

química. Tese de mestrado. 2005

GOUVÊA, M.M., LIMA, G.S., SILVA, A.A., NETTO, A.D.P., MARQUES, F.F.C.

A ic çã d di çã vi e c m m de c n i içã ímic ve de e

construção de um reator fotoquímico alternativo e de baixo custo para pré-tratamento de

m s s.” Química Nova (Impresso); v.37, p. 337-343, 2014.

46

HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e

Científicos, 5a ed, 2001.

HARVARD T. H. C. An i xid n s: ey nd e Hy e”.

<https://www.hsph.harvard.edu/nutritionsource/antioxidants/#antioxidants%20and%20di

sease%20prevention%20studies> Consultado em 17 de dezemvro de 2016.

HO C.T. P en ic c m nds in d- n ve view”. In: HO C.T. LEE C.Y.

HUANG, M.T. Phenolic compounds in food and their effects on health. Washington :

American Chemical Society, 1992. p.2-7. (ACS Symposium Series, n.506).

HOF, M. MACHÁ R. Q eenc ing escence” Czec ec nic nive si y in

prague. Faculty of biomedical engineering.

HUA G M.T. FERRARO T. C nce c em even i n y y c emic s in i s nd

vege es: n ve view”. In: HO, C.T., OSAWA, T., HUANG, T.M., ROSEN, R.T.

Food phytochemicals for cancer prevention. Washington : American Chemical Society,

1994. p.2-16. (ACS Symposium Series, n.546).

HURTUBISE, R. J. Phosphorimetry. Theory, Instrumentation and Applications. VHC:

New York, 1990.

INSTITUTO BRASILEIRO DO VINHO – I RAVI . His ó i d vin n si ”.

<http://www.ibravin.org.br/historia-do-vinho-no-brasil> Consultado em 29 de julho de

2016.

INSTITUTO BRASILEIRO DO VINHO – IBRAVIN2. 2008 Es d d me c d

si ei de vin s”. < http://www.ibravin.org.br/downloads/1402931249.pdf>

Consultado em 11 de dezembro de 2016.

INTERNATIONAL ORGANIZATION OF VINE AND WINE. Me ds nd An ysis”

http://www.oiv.int/en/technical-standards-and-documents/methods-analysis” Consultado

em 21 de junho de 2016.

47

JOHNSON, H. "The Story of Wine". Editora Mitchell-Beazley, Londres, 1989.

http://www.cca.ufscar.br/~vico/Vinho/A%20HISTORIA%20DO%20VINHO.pdf”

Consultado em 29 de julho de 2016.

LAMIKANRA, GRIMM, O. C. C.; RODIN, J. B.; INYANG, D. Hydroxilated stilbenes

in selected American wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v. 44,

n. 4, p. 1111-1115, 1996.

LIMA L.S. Sín ese e estudo das propriedades luminescentes do SrGa2O4 dopado com

íons de Cr3+”. Tese (Mestrado) Programa de Pós Graduação em Física, Universidade do

Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012.

MAGNUSSON, B.; ÖRNEMARK, U.; Eurachem guide: The fitness for purpose of

analytical methods – a laboratory guide to method validation and related topics. 2014

<www.eurachem.org> Consultado em julho de 2016.

MARQUES, F. F.; Desenvolvimento de métodos analíticos espectroluminescentes e

eletroforéticos para a determinação de alcaloides(beta-carbolinas, camptotecina e

derivados) de interesse farmacológico. Tese (Doutorado em Química), programa de Pós-

Graduação em Química, Pontíficia Universidade Católica, Rio Janeiro, 2009.

MIQUEL, J. <https://www.pinterest.com/pin/389491067756508757/> Consultado em 6

de dezembro de 2016.

MONTEIRO, J.M.; ALBUQUERQUE, U. P.; ARAÚJO, E. L.; AMORIM, E. L. C.

T nin s: m d gem d ímic à ec gi ”. Quím. Nova vol.28 no.5 São

Paulo Sept./Oct. 2005.

AKATA I . n i xid n s m s ices.” In: HO, C.T., Lee, C.Y., Huang,

M.T. Phenolic compounds in food and their effects on health. Washington : American

Chemical Society, 1992. p.72-86. (ACS Symposium Series, n.507).

AMIKI M. An i xid n s/ n im gens in d”. Journal of Nutrition, Boca Raton.

v.29, n.4, p.273-300, 1990.

48

ASCIME TO C. K.; OLIVEIRA J.M.; RAGA J.P.; FA RIS J.D. M xim

s çã ess n n e em es ec sc i Möss e ”. Rev. s. Ensin

Fís. vol.35 no.4 São Paulo Oct./Dec. 2013

NAWAR, W.W. Lipids. In: FENNEMA, O.R. (Ed.). Food Chemistry. 2.ed. New York:

Marcel Dekker, 1985. p.139-244.

NACZK M, SHAHIDI F. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal

Chromatography A 2004; 1054 (1/2): 95-111

OLIVEIRA-ROBERTH, A.; SANTOS, D. I. V.; CORDEIRO, D. D.; LINO, F. M. DE

A.; BARA, M. T. F.; GIL, E. S. Voltammetric determination of Rutin at Screen-Printed

carbon disposable electrodes”. Central European Journal of Chemistry, v.10, n. 5, p. 1609

– 1616. 2012.

ONIVOGUI, G.; ZHANG, H.; MLYUKA, E.; DIABY, M.; YUANDA SONG, Y.

Chemical Composition, Nutritional Properties and Antioxidant Activity of Monkey

Apple (Anisophyllea laurina R. Br. ex Sabine)”. Journal of Food and Nutrition Research,

2014, Vol. 2, No. 6, 281-287

POLEWSKI K. K IAT S. SLAWI SKA D. G ic cid n n i xid n in

e s nd mice envi nmen : s ec sc ic s dies”. Ins i e P ysics August

Cieszkowski Agricultural University, Poznań Poland

RIBÉREAU-GAYON, P.; GLORIES, Y.; MAUJEAUN, A.; DUBOURDIEU, D.

Handbook of Enology: The Microbiology of Wine and Vinifications. 2. ed. England:

John Wiley & Sons, 2006. v. 1.

RIBÉREAU-GAYON, P. GLORIES, Y.; MAUJEAUN, A.; DUBOURDIEU, D.

Handbook of Enology: The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. 2. ed.

England: John Wiley & Sons, 2006. v. 2.

RIZZON, L. A.; DALL’AGNOL, I. Vinho Branco”. Embrapa Informação Tecnológica.

Brasília, DF 2009

49

RIZZO L. A.; DALL’AG OL I. Vinho Tinto”. Embrapa Informação Tecnológica.

Brasília, DF 2009

SA TOS J.; MACHADO A.; DIAS E.; OVAIS A. FERREIRA A. P cess men

Ind s i d Vin Tin ”. Ins i P i cnic de C im Esc S e i Ag i .

2007

SILVA, C. E. L; VALOTA, R.; GEBARA, K. S.; SILVA, R. C. L.; SIMIONATTO, E.

Av i çã d ivid de n i xid n e e e de c m s s enó ic s em ex

me nó ic id de s d C mmi My ”. Semin : Ci nci s Ex s e

Tecnológicas, Londrina, v. 34, n. 1, p. 117-124, jan./jul. 2013. Consultado em 12 de

maio de 2016.

SIMIC M.G. JAVA OVIC S.V. In c iv i n xygen dic s y die y en ic

c m nds in n ic cin genesis”. In: HO, C.T., OSAWA, T., HUANG, T.M., ROSEN,

R.T. (Ed.). Food phytochemicals for cancer prevention. Washington : American

Chemical Society, 1994. p.20-33. (ACS Symposium Series, n.546).

SHAHIDI F.; JA ITHA P.K. WA ASU DARA P.D. P en ic n i xid n s”. CRC

Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v.32, n.1, p.67-103, 1992.

SILVA J. S. P d çã de Á c n F zend ”. A end F ci Edi – AFE. ISBN-

978-85-62032-23-3. 2007

SKOOG D.A.; HOLLER F.J.; IEMA T.A. P incí i s de An ise Ins men ”.

5ed. Porto Alegre: Bookman, 2002.

SOUSA, C. M DE M,; ROCHA E SILVA, H.; VIEIRA-JR G. M. Fenóis totais e

ivid de n i xid n e de cinc n s medicin is” Química Nova. On-line version ISSN

1678-7064. Química Nova. vol.30 no.2 São Paulo Mar./Apr. 2007. Consultado em 12 de

maio de 2016.

50

STEINLE, L. A. F es e in e e em n e men çã c ó ic ”.

<http://www.etanol.ufscar.br/trabalhos-mta/sertaozinho-iii-c/trabalhos/fatores-que-

interferem-na-fermentacao-alcoolica> Consultado em 28 de dezembro de 2016.

STRATIL, P.; KU Á , V.; FOJTOVÁ, J. Comparison of the Phenolic Content and

Total Antioxidant Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods”.

Vol. 26, No. 4: 242–253 Czech J. Food Sci.

U IVERSIDADE OVA DE LIS OA. Sín ese em ó i d Mesc in ”..

Faculdade de Ciências e Tecnologia. 2001-2002. Consultado 11 de abril de 2016.

VO-DINH, T. Room Temperature Phosphorimetry for Chemical Analysis. Canadá: John

Wiley & Sons, 1984.

WILLIAMSO G. FAULK ER K. PLUM G.W. G c sin es nd en ics s

antioxidants m n ds”. European Journal of Cancer Prevention, Oxford, v.7, n.1,

p.17-21, 1998.

WÜRTZE G. S c mings c en s egy xici y es ing d c emic s:

n i xid n s”. Food Chemistry and Toxicology, Oxford, v.28, n.11, p.743-745, 1990.

ZAIA D. A. M.; ZAIA C. T. . V.; LICHTIG J. De e min çã de eín s is vi

es ec me i : v n gens e desv n gens d s m d s exis en es”. Quím.

Nova vol.21 no.6 São Paulo Nov./Dec. 1998

ZHENG W. & WANG S.Y. Antioxidant Activity and Phenolic Compounds in Selected

Herbs”. J Agric Food Chem, 49, 5165-5170, 2001.

ZHU F.; DU .; SHI P.; LI F. P en ic P i e nd An i xid n C ci y Ten D y

Red Wines from Two Major Wine- d cing Regi ns in C in ”. Adv nce J n

Food Science and Technology 6(3): 344-349, 2014