universidade federal fluminense · albuquerque, ricardo diego duarte galhardo de. estudo...

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE FOLHAS DA ESPÉCIE VEGETAL

Xylopia ochrantha (Mart.)

RICARDO DIEGO DUARTE GALHARDO DE ALBUQUERQUE

NITERÓI

2013

ii




Dissertação de mestado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde da

Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal Fluminense como requisito

parcial para obtenção do Grau de Mestre

na Área de Concentração: Pesquisa e

Desenvolvimento de Produtos para a

Saúde.

Orientadora: Profa Dr

a THELMA BARROS MACHADO

Niterói

2013

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Albuquerque, Ricardo Diego Duarte Galhardo de.

Estudo fitoquímico e biológico de folhas da espécie

vegetal Xylopia ochrantha (Mart.)/ Ricardo Diego Duarte

Galhardo de Albuquerque; orientadora: Thelma Barros

Machado. ____Niterói, 2013.

81f.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal

Fluminense, 2013.

1. Xylopia 2. Óleos essenciais 3. Planta medicinal 4.

Atividade antimicrobiana 5. Atividade antioxidante 6.

Atividade citotóxica 7. Esteroides 8. Flavonoides I.

Machado, Thelma Barros II. Título

iv




Dissertação de mestado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde da

Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal Fluminense como requisito

parcial para obtenção do Grau de Mestre

em Área de Concentração: Pesquisa e

Desenvolvimento de Produtos para a

Saúde.

Aprovado por:

Prof ª. Dra. THELMA BARROS MACHADO - Orientadora

Universidade Federal Fluminense - UFF

Profª. Drª. SABRINA CALIL ELIAS

Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof ª. Drª. NAOMI KATO SIMAS

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Profª. Drª. ADRIANA PASSOS DE OLIVEIRA - Revisora

Universidade Estadual da Zona Oeste - UEZO

Niterói

2013

v

Este trabalho foi

realizado sob a

orientação da Profª. Drª.

Thelma de Barros

Machado.

vi

DEDICATÓRIA

“... à minha família, primeiramente, aos

amigos e a todos que contribuíram para o

alcance do meu sucesso e me deram forças

para seguir meu caminho...”

vii

“... A amizade é um meio de nos isolarmos da

humanidade cultivando algumas pessoas...”

(Carlos Drummond de Andrade)

“... Os únicos limites do homem são: o tamanho

das suas ideias e o grau da sua dedicação...”

(Autor desconhecido)

“... O primeiro passo para a vitória é acreditar que

ela exista e que possamos ser os protagonistas em

conduzi-la, não importando o quão longínqua e

tortuosa esta venha a se mostrar...”

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pela saúde, força e luz que tem me dado durante todo o

percurso.

Aos meus pais e minha irmã pelo apoio e por acreditarem sempre no meu sucesso.

Aos meus familiares, inclusive aqueles que infelizmente não estão mais presentes neste

mundo, que sempre estiveram dispostos a me apoiar e torcendo pelas minhas conquistas.

Aos meus amigos que fazem parte do LTPN pela força, incentivo, companhia, acolhimento e

aprendizado profissional.

Aos meus demais amigos que me incentivaram e deram todo apoio nos momentos de

necessidade.

À coordenação do PG-CAPS pelo suporte e apoio científico durante todo o projeto.

À Faculdade de Farmácia e Universidade Federal Fluminense pela oportunidade de iniciar

minha vida científica.

À CAPES pelo suporte e apoio científico.

À minha orientadora Profª Drª. Thelma Machado.

Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra pelo conhecimento e apoio científico.

À Profª Drª. Kátia Lima pelo suporte técnico e científico.

Ao saudoso Prof. Dr. Moacélio Silva-Filho e ao mestre Róber Bachinski pela colaboração e

conhecimento.

Ao Arthur, Bruna e Profª Drª. Ivana Leal pela avaliação antimicrobiana.

À Mariana e Suellen pela colaboração durante todo o projeto.

Aos técnicos Pedro Couteiro, Débora Eiriz e Aline Marques pelas análises em CG-MS.

Ao Laboratório de Interações Celulares – UFRJ pela colaboração com a avaliação citotóxica.

ix

Ao Instituto de Tecnologia de Fármacos (FIOCRUZ) pelas análises em LC-DAD-MS.

Ao Laboratório de Epidemiologia Molecular e Biotecnologia (Faculdade de Farmácia – UFF)

e Laboratório de Infecção Hospitalar (UFRJ) pela colaboração com a avaliação

antimicrobiana.

Aos Profs. Dr. Ciro Pregnolatto e Drª. Maria Abadia Vera pelo apoio e conhecimento.

À Profª Drª. Adriana Passos pelo apoio científico e revisão do projeto.

À Profª Drª. Deborah Quintanilha pelas sugestões de modificação durante a defesa do projeto.

Às Professoras Drª. Sabrina Calil e Drª. Naomi Kato pela participação na banca de avaliação.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Árvore de Xylopia ochrantha (p.3)

Figura 2 – Folhas e fruto de Xylopia ochrantha (p.5)

Figura 3 - Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Carapebus - RJ) (p.10)

Figura 4 - Fruto de Xylopia aethiopica (p.11)

Figura 5 - Folhas e flores de Xylopia parviflora (p.11)

Figura 6 - Frutos de Xylopia aromática (p.12)

Figura 7 - Árvore de Xylopia brasiliensis (p.12)

Figura 8 – Espatulenol (X.laevigata e X.brasiliensis) (p.15)

Figura 9 – Estrutura química do ácido kovalênico (X.aethiopica) (p.15)

Figura 10 – Estrutura química do ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.aethiopica) (p.15)

Figura 11 – Estrutura química do ácido traquiloban-19-óico (X.aethiopica) (p.15)

Figura 12 - Estrutura química do ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.cayennensis) (p.15)

Figura 13 - Estrutura química do ent-kaur-16-en-19-ol (X.cayennensis) (p.15)

Figura 14 – Estrutura química da emarginatina 1 (X.emarginata) (p.15)

Figura 15 – Estrutura química da emarginatina 2 (X.emarginata) (p.15)

Figura 16 - Estrutura química do ácido ent-3-beta-hidroxi-16-caruren-19-óico (X.laevigata)

Figura 17 - Estrutura química do ácido ent-16-cauren-19-óico (X. laevigata) (p.15)

Figura 18 - ent-atisano-7alfa-acetoxi-16alfa-ol (X.langsdorffiana) (p.15)

Figura 19 - ent-atisano-7-oxo-16alfa-ol (X.langsdorffiana) (p.15)

Figura 20 - Estrutura química do α-pineno (1) , terpin-4-ol (2) , β-pineno (3) e Δ-3-careno (4)

(X.aromatica e X.aethiopica) (p.16)

Figura 21 – Quercetina-3-α-raminosídeo (X. emarginata e X. langsdorffiana) (p.17)

Figura 22 – Dicentrinona (X. championii) (p.19)

Figura 23 – Buxifolina (X buxifolia) (p.19)

Figura 24 – Nornantenina (X. danguyella) (p.19)

Figura 25 – Danguielina (X. danguyella) (p.19)

xi

Figura 26 – o-metilmoscatolina (X. Championii) (p.19)

Figura 27 - Cromatografia em Camada Delgada das frações obtidas do extrato hexânico. Fase

estacionária: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente:

Acetato de Etila: Hexano (50%). Revelador: NP/PEG em UV 365nm. (p.28)

Figura 28 – Cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM. (p.29)

Figura 29 – Espectro de massas da substância 1. (p.30)



Figura 32 – Campesterol (p.33)

Figura 33 – Estigmaesterol (p.34)

Figura 34 - γ-sitoesterol (p.35)

Figura 35 - Cromatograma obtido por LC-MS da partição em acetato das folhas de Xylopia

ochrantha. (p.37)

Figura 36 – Identificação dos íons moleculares [M-H] 447 e 593 e cromatograma LC-MS do

extrato etanólico bruto foliar de Xylopia ochrantha. (p.37)

Figura 37 – Análise SIM do íon molecular [M-H] 447, relacionado à estrutura da quercitrina.

Figura 38 - Análise SIM do íon molecular [M-H] 593, relacionado à estrutura da luteolina-7-

O-rutinosídeo. (p.38)

Figura 39 – Espectro de absorção na região de UV-Vis do flavonoide majoritário presente na

partição acetato foliar de Xylopia ochrantha em LC-DAD. (p.39)

Figura 40 – Espectro de absorção na região de UV-Vis do flavonoide presente no extrato

etanólico bruto foliar de Xylopia ochrantha em LC-DAD. (p.39)

Figura 41 – Cromatograma obtido por CG-MS do óleo essencial de frutos de Xylopia

ochrantha (Mart.) (p.41)

Figura 42 – Cromatograma obtido por CG-MS do óleo essencial das folhas de Xylopia

ochrantha (Mart.). (p.41)

Figura 43 – Estrutura química do alfa-bergamoteno (p.44)

Figura 44 - Estrutura química do alfa-bisaboleno (p.44)

Figura 45 - Estrutura química do alfa-copaeno (p.44)

xii

Figura 46 - Estrutura química do alfa-felandreno (p.44)

Figura 47 - Estrutura química do alfa-humuleno (p.44)

Figura 48 - Estrutura química do alfa-pineno (p.44)

Figura 49 - Estrutura química do alfa-terpineno (p.44)

Figura 50 - Estrutura química do alfa-terpineol (p.44)

Figura 51 – Estrutura química do alfa-tujeno (p.44)

Figura 52 - Estrutura química do beta-bisaboleno (p.44)

Figura 53 - Estrutura química do beta-cubebeno (p.44)

Figura 54 – Estrutura química do beta-elemeno (p.44)

Figura 55 – Estrutura química do beta-felandreno (p.45)

Figura 56 – Estrutura química do beta-ocimeno (E) (p.44)

Figura 57 – Estrutura química do beta-ocimeno (Z) (p.45)

Figura 58 – Estrutura química do beta-pineno (p.45)

Figura 59 – Estrutura química do biciclogermano (p.45)

Figura 60 - Estrutura química do cariofileno (p.45)

Figura 61 – Estrutura química do cipereno (p.45)

Figura 62 – Estrutura química do delta-elemeno (p.45)

Figura 63 – Estrutura química do delta-elemeno (p.45)

Figura 64 – Estrutura química do espatulenol (p.45)

Figura 65 – Estrutura química do eucaliptol (p.45)

Figura 66 - Estrutura química do gama-muuroleno (p.45)

Figura 67 - Estrutura química do gama-terpineno (p.45)

Figura 68 - Estrutura química do germacreno b (p.45)

Figura 69 - Estrutura química do germacreno d (p.45)

Figura 70 – Estrutura química do linalool (p.45)

Figura 71 - Estrutura química do mirceno (p.45)

Figura 72 - Estrutura química do orto-cimeno (p.46)

xiii

Figura 73 - Estrutura química do óxido de cariofileno (p.46)

Figura 74 - Estrutura química do sabineno (p.46)

Figura 75 – Estrutura química do sesquisabineno (p.46)

Figura 76 – Estrutura química do silvestreno (p.46)

Figura 77 - Estrutura química do terpinoleno (p.46)

Figura 78 - Estrutura química do terpinen-4-ol (p.46)

Figura 79 – Curva Padrão de Ácido Gálico preparada para o método de doseamento de

fenólicos totais. (p.49)

Figura 80 - Avaliação da viabilidade e proliferação celular de células AtT20 na presença do

extrato etanólico de Xylopia ochrantha. (p.51)

Figura 81 – Avaliação da viabilidade e proliferação celular de células AtT20 na presença do

óleo essencial das folhas de Xylopia ochrantha. (p.51)

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Fragmentos, intensidades relativas e íon molecular dos fitoesteróis encontrados

em Xylopia ochrantha. (p.32)

Tabela 2 - Constituintes químicos do óleo essencial de frutos de Xylopia ochrantha (Mart.)

(p.42)

Tabela 3 - Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de Xylopia ochrantha (Mart.).

(p.43)

Tabela 4 - Rendimento do óleo essencial foliar em diversas espécies do gênero Xylopia.

(p.43)

Tabela 5 – Resultado da Avaliação Antimicrobiana do Óléo Essencial e Extratos de Xylopia

ochrantha frente S.aureus. As lacunas em amarelo indicam inibição do crescimento

bacteriano. Controle positivo: Vancomicina. A análise foi realizada em duplicata (colunas 1 a

5 e 7 a 11). (p.47)

Tabela 6 - Espécies e cepas bacterianas testadas pelo método de diluição em placa e seus

resultados. Extrato diclorometânico (DCM), extrato em acetato de etila (AE) e óleo essencial

(OE) demonstraram atividade. (p.48)

Tabela 7 - Valor ORAC de extratos e óleo essencial das folhas de Xylopia ochrantha (Mart.).

(p.49)

xv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AI - Índice Aritmético

ATCC – American Type Culture Colection

AtT20 – Linhagem de Tumor Hipofisário Murino

µL – microlitro

CCF - Cromatografia em Camada Fina

CG - Cromatógrafo em Fase Gasosa

CG-DIC – Cromatógrafo a Gás acoplado a Detector por Ionização em Chama

CG-EM – Cromatografia com Fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE-DAD-EM – Cromatografia com Fase Líquida de Alta Performance acoplada a Diodo

de Arranjo Eletrônico e Espectrometria de Massas

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO – Dimetilsulfóxido

ELISA – Enzyme-linked Immunosorbent Assay

EM - Espectrometria de Massas

eV- elétron volt

mg- miligrama

min. - minuto

mL - mililitro

m/z - massa/carga

xvi

NIST- National Institute of Standards and Technology

nm – nanômetro

NP/PEG – difenilborioxetilamina/polietilenoglicol

PBS – Phosphate Buffer Saline

Rf - Fator de Retenção

TE- Trolox Equivalent

Trolox – ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico

UV- Ultravioleta

xvii

RESUMO

ALBUQUERQUE, Ricardo Diego Duarte Galhardo de. Estudo fitoquímico e biológico de

folhas da espécie vegetal Xylopia ochrantha (Mart.). Niterói, 2013. Dissertação de

Mestrado (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde), Faculdade de Farmácia,

Universidade Federal Fluminense.

Xylopia ochrantha (Mart.) é uma espécie endêmica do Brasil, ocorrendo principalmente na

Floresta de Restinga localizada ao longo da costa brasileira. Os estudos químico e biológico

presentes neste trabalho são os primeiros relacionados a esta espécie. No estudo fitoquímico,

os óleos essenciais das folhas e frutos foram obtidos através de extração por hidrodestilação e

analisados por GC-MS e GC-FID. No total, foram identificadas 36 substâncias, das quais,

germacreno D, biciclogermacreno e silvestreno (folhas), α-felandreno, β-felandreno e

sabineno (frutos) foram os principais componentes identificados. Os fitoesterois campesterol,

estigmaesterol e gama-sitosterol, provenientes do extrato hexânico foliar, além dos

flavonoides majoritários quercitrina e luteolina-7-O-rutinosídeo, encontrados no extrato de

acetato de etila foliar, foram identificados através de análises em CG-EM e CLAE-DAD-EM.

Análises realizadas em CCF demonstraram a presença de terpenos, alcaloides e cumarinas,

sendo estas, portanto, classes de substâncias representativas da espécie. A atividade

antioxidante do óleo essencial e seis extratos das folhas de Xylopia ochrantha foram avaliadas

utilizando o método ORAC, com valores na faixa entre 0,42 ± 0,01 e 1,85 ± 0,03 mmolTE / g.

A atividade antimicrobiana do óleo essencial e extratos de Xylopia ochrantha também

puderam ser analizados através dos métodos de diluição em placas e microdiluição em caldo.

O óleo essencial e as partições diclorometânica e de acetato de etila das folhas de Xylopia

ochrantha apresentaram atividade contra diferentes cepas de Staphylococcus aureus, além de

serem ativos também contra Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticcus,

Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus

capitis e Staphylococcus hominis. O extrato diclorometâncio apresentou um MIC de 128

mcg/mL contra ORSA sanguíneo. Nas demais análises, os extratos ativos apresentaram MIC

de 512 mcg/mL. O extrato etanólico demonstrou atividade citotóxica contra células de tumor

hipofisiário (AtT20), sendo possível observar uma diminuição significativa da proliferação e

viabilidade celular dentro de 24 horas.

Palavras-chave: Xylopia ochrantha, óleo essencial, fitoesteróis, flavonoides, antioxidante,

antimicrobiano, Staphylococcus aureus, citotoxidade.

xviii

ABSTRACT

ALBUQUERQUE, Ricardo Diego Duarte Galhardo de. Phytochemical and Biological studies of

leaves from vegetal species Xylopia ochrantha (Mart.). Niterói, 2013. Master’s dissertation (Master

in Applied Sciences to Health Products), School of Pharmacy, Fluminense Federal University.

Xylopia ochrantha (Mart.) is a endemic species from Brazil, occurring mainly in the Restinga

Forest located along the Brazilian coast. The chemical and biological studies in this work are

the first related to this species. In phytochemical study, the extraction of essential oils from

leaves and fruits of this species was performed by hydrodistillation and analyzed by GC-

MS/GC-FID. In total, 36 compounds were identified, of which germacrene D,

bicyclogermacrene, silvestrene (leaves), α-phellandrene, β-phellandrene and sabinene (fruits)

were the main components. The phytosterols campesterol, stigmasterol and gamma-sitosterol,

from the foliar hexane extract, besides the majority flavonoids quercitrin and luteolin-7-O-

rutinoside, found in the foliar ethyl acetate extract, were identified through analysis on GC-

MS and HPLC-DAD-MS. Analyzes made in TLC showed the presence of terpenes, alkaloids

and coumarins, which are also representative substances of the species. Regarding the study

of biological species, the antioxidant activity was held to six extracts and essential oil from

the leaves of Xylopia ochrantha using the ORAC method, with values in the range between

0.42 ± 0.01 and 1.85 ± 0.03 mmolTE / g. The antimicrobial activity of essential oil and

extracts of Xylopia ochrantha could be analyzed by plate dilution and broth microdilution

methods. The essential oil and extracts of dichloromethane and ethyl acetate from leaves of

Xylopia ochrantha showed activity against different strains of Staphylococcus aureus, and

were also active against Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticcus,

Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus

capitis and Staphylococcus hominis. Dichloromethane extract showed a MIC of 128 mcg / mL

against ORSA blood. In other analysis, active extracts showed MIC of 512 mcg / mL. Ethanol

extract showed cytotoxic activity against tumor cells of the pituitary (AtT20), where was

possible to observe a significant decrease in cell viability and proliferation within 24 hours.

Keywords: Xylopia ochrantha, essential oil, phytosterols, flavonoids, antioxidant,

antimicrobial, Staphylococcus aureus, cytotoxicity.

xix

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

2. OBJETIVOS 6

2.1 Objetivos gerais 6

2.2 Objetivos específicos 6

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7

3.1. História dos produtos naturais 7

3.2. Floresta de Restinga e seus recursos vegetais 9

3.2.1. Restinga de Jurubatiba (RJ) 9

3.3. O gênero Xylopia 9

3.3.1. Xylopia aethiopica 10

3.3.2. Xylopia parviflora 11

3.3.3. Xylopia aromatica 12

3.3.4. Xylopia brasiliensis 12

3.3.5. Xylopia discreta 13

3.4. Principais grupos de metabólitos do gênero Xylopia 13

3.4.1. Metabólitos primários e secundários 13

3.4.2. Biossíntese de metabólitos secundários 13

3.4.3. Terpenoides 14

3.4.4. Flavonóides 16

3.4.5. Alcalóides 17

4. METODOLOGIA 20

4.1. Material vegetal 20

xx

4.2. Extratos e partições 20

4.3. Extração do óleo essencial 21

4.4. Determinação estrutural 21

4.5. Avaliação de atividade biológica 22

4.5.1. Atividade antimicrobiana 22

4.5.1.1. Método Qualitativo 23

4.5.1.2. Teste da Microdiluiçpão em caldo e Determinação da concentração mínima inibitória

(CMI) 23

4.5.1.3. Método da diluição em placa 24

4.5.2. Atividade antioxidante 24

4.5.2.1. Capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC) 24

4.5.2.2. Doseamento dos fenolicos totais 25

4.5.3. Atividade citotóxica 25

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 27

5.1. Obtenção do extrato etanólico bruto, partições e resíduo aquoso 27

5.2. Separação e identificação de substâncias majoritárias 27

5.2.1. Identificação de fitoesteróis por CG-EM 29

5.2.2 Análise do conteúdo flavonoídico por LC-MS e LC-DAD 36

5.3. Composição química dos óleos essencias de folhas e frutos de X. ochrantha 40

5.4. Atividade antimicrobiana 46

5.5. Atividade antioxidante 48

5.6. Atividade citotóxica 51

6. CONCLUSÃO 53

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54

ANEXO 1 – ARTIGO SUBMETIDO 72

1

1. INTRODUÇÃO

A necessidade da obtenção de produtos naturais com fins farmacológicos remonta

desde o início da formação das civilizações, onde os primeiros achados arqueológicos são

datados de mais de 60 mil anos, ainda na era dos neandertais. Ao longo dos séculos, a

utilização de plantas medicinais para a obtenção de extratos, elixires, óleos essenciais e outros

produtos, foi amplamente inserida na medicina popular de diversos povos pelo mundo, ao

passo que, as técnicas utilizadas para a obtenção destes produtos foram gradativamente

otimizadas. Com o advento do desenvolvimento da química, já no século XIX, foram isoladas

as primeiras substâncias oriundas de produtos naturais, surgindo então, uma revolução na

síntese de produtos farmacológicos. (Bevilacqua, 2010).

O avanço da química também permitiu o desenvolvimento da produção de substâncias

químicas sintéticas, que rapidamente encontraram espaço no mercado, levando a um

abandono gradual da utilização de produtos naturais, embora esta jamais tenha deixado de ser

uma alternativa bastante usual em terapias medicamentosas e na produção de fármacos,

principalmente medicamentos anticancerígenos e anti-infecciosos (McChesney et. al., 2007).

Somadas a isso, as novas tendências globais de utilização de fitoterápicos e aproveitamento da

biodiversidade, a necessidade da obtenção de novas drogas, e ainda, o desenvolvimento de

novas técnicas químicas e biológicas - como a otimização de metodologias de separação e

identificação de substâncias, além de plataformas de bioensaios - a pesquisa no âmbito dos

produtos naturais, vem retomando uma posição proeminente no desenvolvimento de fármacos

(Bevilacqua, 2010; McChesney et. al., 2007).

A utilização de produtos naturais no Brasil é documentada desde a chegada dos

portugueses, sendo descrito o uso de plantas pelos habitantes indígenas, com diversas

finalidades, desde a obtenção de corantes e venenos utilizados para caça, até a utilização de

drogas vegetais para fins curativos ou paliativos. Devido à riqueza de complexos vegetais ao

longo do território brasileiro, o país vem sendo alvo de interesse científico para pesquisa de

novas substâncias de origem natural, visto que há um aumento significante de publicações

recentes de pesquisas sobre espécies vegetais consideradas nacionais (Bevilacqua, 2010).

Um importante exemplo desses ricos complexos vegetais são as restingas, que situadas

entre a Mata Atlântica e o mar, ocupam os solos arenosos de origem marinha ao longo do

2

litoral brasileiro. Estes solos foram formados através de uma série de regressões e

transgressões marinhas ocorridas durante o período Quaternário, onde cordões arenosos foram

depositados paralelos ao mar, delineando as planícies costeiras (Rizzini et. al, 1997; Scarano

et. al, 2002; Suguio & Tessler 1984).

O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (PNRJ) está localizado no litoral norte

do estado do Rio de Janeiro (Brasil), abrangendo os municípios de Macaé, Quissamã e

Carapebus. Está disposto em uma planície arenosa com vegetação distribuída em moitas, além

de apresentar mata periodicamente inundável (Araújo et al. 1998). Entre as principais famílias

botânicas presentes na restinga de Jurubatiba, podemos citar Myrtaceae, Clusiaceae e

Rubiaceae, embora outras famílias também sejam encontradas significativamente, como

Asteraceae, Bromeliaceae e Annonaceae (Santos et al. 2009).

Xylopia L. pertence a família Annonaceae e inclui cerca de 150 espécies entre árvores e

arvoretas aromáticas, das quais 40 espécies são encontradas na América Tropical (Costa et al.,

2011). As espécies mais amplamente estudadas, tais como X. aethiopica, X. parviflora e X.

brasiliensis, apresentam-se na literatura científica como possuindo diversas classes de

substâncias, principalmente ácidos graxos, esteróides, saponinas, taninos, glicosídeos

cianogênicos, além de sesquiterpenos e diterpenóides, alcalóides e acetogeninas. Muitas

dessas substâncias demonstraram ser responsáveis por diferentes atividades farmacológicas

encontradas nesse gênero, entre elas, propriedades analgésica, antiinflamatória, antibacteriana,

antifúngica, sedativa, antiparasitária, antitumoral, entre outras (Colman-Saizarbitoria et. al.

1994a; Colman-Saizarbitoria et. al. 1994b; Ezekwesili et. al. 2010; Nishiyama et. al. 2006).

Uma das representantes desta família na restinga de Jurubatiba é a espécie Xylopia ochrantha

(Mart.), popularmente conhecida como “imbiú-prego”, sendo utilizada pela população local

apenas para a fabricação de cabos de ferramentas (Figura 1 e 2). Esta espécie vegetal é uma

arvoreta de cerca de 4 metros de altura e está presente nas formações vegetais arbustivas

abertas de Clusia e na mata periodicamente inundada da Restinga de Jurubatiba (Santos et.

al., 2009). Segundo um estudo botânico de espécies da família Annonaceae de Restingas

Fluminenses, as demais características botânicas da espécie são as seguintes: pecíolo marrom

com tamanho de 6 mm de comprimento, lâminas foliares de 6 x 10 a 2,5 x 4 cm, cartáceas a

subcoriáceas, elípticas, verdes discolores, glabras em ambas as faces, brilhantes na adaxial,

base aguda, ápice acuminado, acúmem de 5 a 10 cm de comprimento, nervura primária

impressa na face adaxial e proeminente na abaxial; flores em inflorescência caulinares, botão

piramidal 1 a 2 x 1 cm, pedicelo com 2 a 5 mm de comprimento, 1 a 4 brácteas, sépalas e

3

pétalas densamente cobertas por tricomas ferrugíneos adpressos, sépalas de 5 x 8 mm, pétalas

do ciclo externo de 17 – 20 x 20 mm, pétalas do ciclo interno de 15 x 7 mm, estames com 1 a

2 mm de comprimento; fruto apocárpico, carpídios, de 15 – 40 x 6 x 10 mm, deiscentes,

densamente cobertos por tricomas ferrugíneos adpressos, com 4 a 7 sementes (Lobão et al.,

2005).

Figura 1 – Árvore de Xylopia ochrantha

O potencial efeito antioxidante de substâncias encontradas no reino vegetal, como é o

caso dos flavonoides e alguns terpenoides, vem sendo apontado como um dos fatores

responsáveis no tratamento de diversas patologias que possuem como origem a degradação de

estruturas celulares causada por agentes oxidantes. (Simões & Spitzer, 2004; Zuanazzi &

Montanha, 2004). Alguns estudos toxicológicos demonstraram a relação entre o mecanismo

de estresse oxidativo e o desenvolvimento de retinopatia diabética, aterosclerose e patologias

neurodegenerativas, como o Mal de Alzheimer, responsáveis pela diminuição progressiva da

qualidade de vida dos pacientes, e que são frequentemente fatais em um curto período de

tempo. A avaliação da atividade antioxidante de produtos de origem natural e estudos que

avaliam a sobrevida e proliferação de células neuroniais são de grande importância para o

tratamento destas patologias, que atualmente encontram apenas medidas paliativas, e não

curativas. (Vidya et. al., 2011; Al-Aly, 2011; Rojas et. al., 2006; Citron, 2010). A presença

majoritária de flavonoides e terpenoides, substâncias relacionadas com atividade antioxidante,

4

para diversas espécies do gênero Xylopia é um indicativo do possível uso das mesmas no

tratamento de patologias relacionadas a efeitos oxidativos (Costa et. al., 2011; Diderot et.

al.,2005; Andrade et. al., 2004; Moreira et. al., 2003a; idem, 2006; Santos et. al., 2011;

Moreira et. al., 2003b; Silva et. al.,2009).

A hipófise é uma glândula responsável pela secreção de hormônios que regulam

funções de essencial importância em nosso organismo, como por exemplo, o crescimento, o

ciclo menstrual e o controle diurético. O desenvolvimento de adenomas hipofisários reflete no

desempenho destas funções, aumentando ou diminuindo-as, sendo que vários mecanismos

contribuem no crescimento deste tipo de tumor, incluindo a expressão do gene de

transformação de tumor hipofisário (PTTG) e angiogênese. (Santos-Ortiga et. al., 2010). A

necessidade do tratamento para este tipo de tumor, visto que, os medicamentos atualmente

existentes para este fim causam efeitos colaterais indesejados, ou ainda, sendo necessária a

realização de procedimento cirúrgico em diversos casos, implica na continuação da busca por

alternativas que possam tratar a patologia sem que haja uma perda significativa da qualidade

de vida dos pacientes. (Merza, 2003; Katznelson, 2003; Wand, 2003). Algumas espécies do

gênero Xylopia demonstraram possuir atividade contra células tumorais, sendo este fato

frequentemente relacionado com a presença de acetogeninas, abundantes na família

Annonaceae (Colman-Saizabitorria et .al., 1994a; idem, 1995; Alfonso et. al., 1996).

O sucesso do tratamento de infecções bacterianas por antibióticos desde a descoberta

da penicilina por Fleming, em 1928, vem sofrendo um declínio no que se concerne à eficácia

destes medicamentos, devido ao uso indiscriminado e surgimento de novas cepas resistentes

aos antibióticos comumente utilizados. Algumas espécies bacterianas causadoras de

conhecidas patologias em seres humanos, tais como Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Enterococcus faecalis, entre outras, apresentam cepas com inúmeros fatores de

resistência contra antimicrobianos, responsáveis pelo surgimento de infecções hospitalares,

ocorrência de infecções generalizadas, frequentemente levando ao óbito de pacientes

internados. Deste modo, a busca por novas alternativas medicamentosas para o tratamento

destas doenças é algo estritamente necessário nos dias atuais, visando contornar um grande

problema de saúde pública, que por sinal, existe em âmbito mundial (Sangappa & Padma,

2012; Remy et al., 2012; Master et al., 2012; Huo et al., 2010). Em estudos envolvendo

avaliação de atividade antimicrobiana com espécies do gênero Xylopia foi relatado o poder

inibitório contra diversas espécies bacterianas como Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Kleibsiella pneumoniae e Bacillus subtilis (Oloyede & Aduramigba-Modupe,

5

2011; Fleischer et al., 2008; Ilusanya et al., 2012).

Figura 2 – Folhas e fruto de Xylopia ochrantha

A identificação e quantificação de substâncias vegetais nos dias atuais estão cada vez

mais relacionadas ao uso de técnicas cromatográficas hifenadas como é o caso da

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) e da cromatografia gasosa

acoplada a espectrometria de massa (CG-EM), esta última especialmente utilizada para a

detecção de componentes com característica apolar como derivados do extrato hexânico ou

componentes de óleos voláteis. Para a detecção de componentes de característica polar, como

os flavonoides, o LC-MS é uma poderosa ferramenta analítica que explora a capacidade

elevada de resolução da cromatografia líquida juntamente com a confiabilidade e acurácia da

identificação de moléculas por espectrometria de massa. A utilização desta técnica é

compatível ainda com outras áreas da ciência como a química orgânica e analítica,

bioquímica, toxicologia e ciências forenses (Colegate & Molyneux, 2008).

6

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Realizar o estudo fitoquímico e avaliação do potencial biológico das folhas da espécie

vegetal Xylopia ochrantha (Mart.).

2.2 Objetivos específicos

- Identificar a estrutura química dos constituintes químicos das folhas de Xylopia

ochrantha através de diferentes técnicas cromatográficas e espectroscópicas;

- Avaliar as atividades antimicrobiana, antioxidante e citotóxica dos extratos e óleo

essencial obtido das folhas de Xylopia ochrantha

- Submeter, ao menos, um manuscrito para revista com conceito mínimo B1 CAPES

Interdisciplinar, abrangendo conteúdo relacionado ao trabalho realizado nesta dissertação.

7

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. História dos produtos naturais

A utilização de plantas no tratamento de doenças é considerada tão antiga quanto a

própria humanidade, sendo este costume presente em todas as civilizações existentes. Além

de outras utilidades, como o uso para fabricação de ferramentas, confecção de roupas, armas

de caça, e ainda, o uso alimentício, o ser humano percebeu a capacidade de cura através de

vegetais, bem como o poder nocivo, ou de produzir alucinações, causados por algumas

espécies (Bevilacqua, 2010).

A relação do homem com o poder curativo das plantas foi por um grande período

baseado em observações, e quase sempre, associada a mecanismos espirituais. A produção de

elixires, tinturas e outros derivados do processo de destilação, já era desenvolvida desde o

século XI, inicialmente pelos egípcios, sendo que estes produtos eram frequentemente

relacionados com propriedades espirituais das plantas de onde foram extraídos. Com a

revolução da ciência na era renascentista, os estudos com produtos naturais passaram a tomar

uma diretriz mais baseada em experimentações e investigações médicas (Beltran, 1996).

As primeiras descobertas arqueológicas mostram o uso de diversas plantas pelos

neandertais, entre elas, a alteia (Althaea officinalis), há mais de 60 mil anos, na região onde

hoje se situa o Iraque. Mais tardiamente, por volta do ano 4000 a.C., os sumérios e babilônios

utilizavam espécies como o tomilho, mostarda, canela, alho e folhas de sene para fins

farmacológicos. No Antigo Egito, no século XVI a.C., já eram utilizadas cerca de 700 drogas,

incluindo a babosa, o absinto, a hortelã, a mirra e o cânhamo (Bevilacqua, 2010). Na China,

Índia e Grécia antigas, também existem relatos da utilização de compêndios que descrevem

diversas plantas e suas respectivas finalidades curativas (Beltran, 1996).

No século II a.C., o médico grego Galeno, foi o pioneiro em experimentos com

animais, desenvolvendo as primeiras teorias médicas baseadas em experimentações

científicas, revolucionando o estudo da medicina, e sendo importante posteriormente para a

compreensão da atuação dos medicamentos no organismo humano. Após uma relativa

paralisação no desenvolvimento de estudos médicos e sobre plantas medicinais, devido ao

controle do conhecimento médico pela Igreja, o Renascimento proporcionou um avanço no

8

que se refere a estudos científicos, se iniciando os primeiros estudos feitos com o corpo

humano, onde se descrevia com precisão a anatomia humana. Nesta época também se

destacou a figura de Paracelso, que foi o primeiro a defender a importância da química na

preparação de medicamentos, além de ser considerado o primeiro a propor a cura através de

princípios homeopáticos (Bevilacqua, 2010).

No Brasil, a utilização de produtos naturais pelos índios foi descrita desde a vinda dos

portugueses em 1500, onde diversas espécies vegetais eram citadas, como é o exemplo da

Bixa orellana (urucum), Carapa guianensis (andiroba) e Chlorophora tinctoria (tatajuba),

utilizadas como produtoras de corantes, sendo que a última produz a substância morina, ainda

hoje, largamente utilizada como reveladora de açucares em cromatografia de camada delgada.

Outras espécies, como é o caso da Hymeneae coubaril (jatobá), produtora de resina, e

Strychnos guianensis, que dá origem ao curare, também foram bastante procuradas por

exploradores europeus, ainda antes do século XVIII (Pinto, 1995).

No início do século XIX, com o desenvolvimento da química, foram isoladas as

primeiras substâncias ativas oriundas de produtos naturais, entre elas, a morfina, um alcaloide

proveniente da papoula (Papaver somniferum), considerada uma planta com propriedades

anestésicas e soníferas. O avanço do conhecimento químico e de técnicas laboratoriais

permitiu o surgimento das indústrias farmacêuticas, que utilizavam os constituintes básicos

das drogas naturais como matéria-prima para a produção de medicamentos, ou como

precursores de medicamentos mais potentes.

O desenvolvimento da química orgânica contribuiu para o aumento da produção de

medicamentos baseados em substâncias sintéticas, que gradativamente, ocuparam o lugar dos

medicamentos de origem natural, devido à diminuição do custo e de quantidade de matéria-

prima utilizada para os testes e atendimento da demanda (Bevilacqua, 2010). No entanto,

muitos medicamentos anticancerígenos e antiinfecciosos têm sua origem em substâncias

obtidas de produtos naturais, como é o caso do paclitaxel, um agente anticancerígeno oriundo

da espécie Taxus brevifolia (McChesney et. al., 2007).

Com o aumento da procura de novos medicamentos para atender a demanda

mercadológica, e outros fatores como a valorização da biodiversidade e desenvolvimento de

metodologias químicas e de testes biológicos, os investimentos em pesquisas para obtenção

de medicamentos baseados em produtos naturais estão atualmente em ascensão, e cada vez

9

mais, sendo necessários para o desenvolvimento da indústria farmacêutica (Bevilacqua,

2010).

3.2. Floresta de Restinga e seus recursos vegetais

Os sistemas de classificação dos diversos tipos de vegetação presentes no Brasil

variam de acordo com a abordagem de cada autor, e na tentativa da realização de uma

classificação universal, reunindo pontos de concordância entre os autores, podemos dividir os

tipos de vegetação em seis sistemas de classificação: fisionômico-ecológico, formações

pioneiras, de transição, relíquias, vegetação disjunta e vegetação secundária (IBGE, 1992).

As restingas, classificadas como formações pioneiras, abrangem comunidades

vegetais em contato direto com águas marinhas, como é o caso dos gêneros Remirea e

Salicornia, bem como comunidades presentes em dunas, tendo como exemplo de espécie

nativa o Schinus terebinthifolius, e também presentes em pontais rochosos, caso de várias

espécies da família Bromeliaceae. As formações vegetais podem ser classificadas em:

arbustivas abertas de Clusia, mata periodicamente inundada, mata permanentemente

inundada, arbustiva aberta de Ericaceae, arbustiva de pós-praia, arbustiva aberta de Palmae,

vegetação aquática, herbácea brejosa, mata de cordão arenoso, halófila/psamófila reptante e

vegetação alterada (IBGE, 1992).

3.2.1. Restinga de Jurubatiba (RJ)

A restinga de Jurubatiba (Figura 3) abrange os municípios fluminenses de Macaé,

Carapebus e Quissamã (Araújo et. al, 1998), onde segundo a informação de um especialista

local, existe a ocorrência de 119 espécies utilizadas para diversos fins, distribuídas em 100

gêneros e 49 famílias (Santos et al, 2009), embora existam de maneira total, o registro de 618

espécies vasculares para o Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Araújo et. al, 2001).

As famílias mais representativas em número de espécies são a Myrtaceae, Clusiaceae e

Rubiaceae, no entanto, algumas famílias também foram consideradas muito importantes do

ponto de vista florístico e etnobotânico, como a Asteraceae, Bromeliaceae e Fabiaceae. O uso

medicinal predominou em 45 espécies, sendo 29 destas utilizadas exclusivamente com

10

propósitos medicinais. Em relação às formações vegetais da restinga de Jurubatiba, as que

apresentaram maior número de espécies utilizadas medicinalmente foram a arbustiva aberta

de Clusia e mata periodicamente inundada - formações onde é encontrada a espécie Xylopia

ochrantha - além das formações arbustivas abertas de Ericaceae e mata permanentemente

inundada (Santos et. al, 2009).

Figura 3 - Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Carapebus - RJ)

3.3. O gênero Xylopia

Diversas espécies do gênero Xylopia tiveram sua composição química e atividade

biológica investigadas por pesquisadores em várias regiões do mundo, sendo que algumas

foram mais extensivamente estudadas, obtendo-se informações mais detalhadas a respeito da

sua natureza química e ação farmacológica.

3.3.1. Xylopia aethiopica

A espécie X. aethiopica (Figura 4) é a mais amplamente estudada e ocorre

principalmente na África subsaariana. A espécie demonstrou variadas atividades biológicas,

dentre elas, reguladora de desordens inflamatórias e ação analgésica. Seus extratos

apresentaram principalmente ácidos graxos, carboidratos, glicosídeos cianogenéticos,

acetogeninas, taninos, saponinas e flavonoides (Ezekwesili et. al., 2010; Colman-Saizabitorria

11

et. al., 1994b). Além disso, identificou-se nessa espécie a atividade hipotensiva e

vasodilatadora relacionada aos diterpenóides caurênicos, que atuam pela antagonização do

cálcio (Somova et. al., 2001). A ação antioxidante também foi verificada experimentalmente,

por ação de monoterpenos presentes no óleo essencial de folhas, frutos, caule e raiz, tendo

como um dos componentes principais o germacreno-D (Karioti et.al., 2004). Outras

atividades interessantes também foram encontradas para esta espécie, tais como, atividade

citotóxica, demonstrada pela ação de dois alcalóides oxoaporfínicos - a oxofebina e a

liriodenina - além da inibição da trombina e prolil endopeptidase, por ação de diterpenóides

como o ácido colavênico e ácido traquiloban-19-óico, sugerindo que esses últimos podem ser

úteis no tratamento da trombose e da demência (Harrigan et. al., 1994; Diderot et. al.,2005) e

atividade contra diversas espécies bacterianas (Oloyede & Aduramigba-Modupe, 2011;

Fleischer et al., 2008; Ilusanya et al., 2012).

Figura 4 - Fruto de Xylopia aethiopica

3.3.2. Xylopia parviflora

A espécie X. parviflora (Figura 5) é originária do leste da África e o decocto de suas

raízes é muito utilizado pelos povos da região para desordens gástricas, cólicas menstruais e

enxaquecas. Os alcalóides oriundos do extrato metanólico da casca demonstraram possuir

efeito nociceptivo, enquanto que, mais especificamente, alcalóides do tipo isoquinolínico

presentes nas raízes e também nas cascas da árvore, demonstraram atividade analgésica e

antiespasmódica. (Nishiyama et. al., 2006).

Figura 5 - Folhas e flores de Xylopia parviflora

12

3.3.3. Xylopia aromatica

O óleo essencial obtido de frutos da espécie Xylopia aromatica (Figura 6) ao ter sua

composição investigada, mostrou a presença de β-felandreno, p-cineno, β-mirceno,

majoritariamente, dentre outros compostos voláteis (Stashenko et al., 2004). As acetogeninas

oriundas do extrato etanólico de cascas do caule demonstraram atividade citotóxicas frente a

diversos tipos de células tumorais, principalmente pela inibição da NADH-ubiquinase óxido-

redutase e da enzima NADH oxidase, sendo que algumas substâncias ativas desta classe já

foram isoladas, como é o caso da venezenina, xilopeína, aromina e aromacina. (Colman-

Saizabitorria et .al., 1994a; idem, 1995; Alfonso et. al., 1996).

Figura 6 - Frutos de Xylopia aromática

3.3.4. Xylopia brasiliensis

Estudos realizados com a espécie Xylopia brasiliensis demonstraram a atividade

antifúngica proveniente de terpenoides presentes no óleo volátil oriundo das folhas, entre eles,

o espatulenol (Figura 7), sendo que outros compostos como esteroides e alcaloides aporfíricos

também se encontram presentes em frutos e nas cascas do caule, podendo estar relacionados

com atividade sedativa e analgésica, propriedades que são descritas para a espécie na

medicina popular. (Moreira et. al., 2003, idem, 2005a)

Figura 7 - Árvore de Xylopia brasiliensis

13

3.3.5. Xylopia discreta

O óleo essencial e extratos obtidos de folhas e sementes de Xylopia discreta

demonstraram atividades anti-leishmania e imunomodulatória. Estas atividades foram

relacionadas ao aumento da atividade de macrófagos e indução da produção de MCP-1,

possivelmente levando à diminuição da carga do parasita no hospedeiro através do aumento

da produção de quimiocinas pró-inflamatórias (Lopes et. al., 2009).

3.4. Principais grupos de metabólitos do gênero Xylopia

3.4.1. Metabólitos primários e secundários

Dá se o nome de metabolismo ao conjunto de reações químicas que continuamente

ocorrem em uma célula, classificando-se como metabolismo primário o conjunto de reações

participantes de processos essenciais à vida, sendo comuns aos seres vivos, como é o exemplo

da glicólise e síntese de aminoácidos. O metabolismo secundário, mais presente em vegetais e

microorganismos, embora também seja encontrado em vida animal, é capaz de produzir,

transformar e acumular inúmeras substâncias não necessariamente relacionadas de forma

direta à manutenção da vida do organismo produtor. Os metabólitos secundários já foram

considerados por diversos autores como simplesmente produtos de excreção vegetal,

entretanto, atualmente, sabe-se que muitas destas substâncias estão diretamente envolvidas

com a adequação do seu produtor ao meio, como por exemplo, a defesa contra herbívoros e

microorganismos, proteção contra raios UV, atração de polinizadores ou animais dispersores

de sementes, entre outras. Alguns autores também citam o termo metabolismo intermediário,

que descreve as várias reações químicas envolvidas na transformação de moléculas de

nutrientes nas unidades constitutivas essenciais da célula. (Santos, 2004).

3.4.2. Biossíntese de metabólitos secundários

Muitos metabólitos secundários demonstraram ter interessantes atividades biológicas,

sendo já há algum tempo, objeto de estudo para descoberta de novos fármacos. As vias do

14

metabolismo secundário se originam na via glicolítica, que produz dois intermediários

principais: o ácido chiquímico e o acetato. A partir do ácido chiquímico tem-se a formação

dos aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos secundários aromáticos,

sendo esta etapa conhecida como via do chiquimato. Os derivados do acetato podem ser

classificados, segundo a via metabólica, como: provenientes da via cíclica do ácido cítrico;

oriundos da via mevalonato; e produtos da condensação do acetato, tendo como exemplo, os

glicosídeos cianogenéticos, saponinas e heterosídeos cardiotônicos. Outros metabólitos

secundários são derivados da combinação de uma unidade de ácido chiquímico e uma ou mais

unidades de acetato ou derivados deste, como é o caso das antraquinonas, dos flavonoides e

dos taninos condensados (Santos, 2004).

3.4.3. Terpenoides

Os terpenoides constituem uma classe de substâncias cuja origem biossintética deriva

de unidades de isopreno, que por sua vez, são originadas a partir do ácido mevalônico. De

acordo com a quantidade de unidades isoprênicas, os terpenos podem ser classificados em

isopreno (1 unidade), monoterpenoides (2), sesquiterpenoides (3), diterpenoides (4),

sesterpenoides (5), triterpenoides (6), tetraterpenoides (8) ou polisoprenoides (maior que 8

unidades). Esta classe de substância pode ser encontrada preferencialmente como principal

constituinte de óleos voláteis e em extratos apolares, como o hexânico ou diclorometânico.

(Simões & Spitzer, 2004). A identificação de óleos voláteis pode ser feita através de

diferentes métodos, desde métodos cromatográficos de análise, ressonância magnética

nuclear, até a análise por testes organolépticos, visto que os óleos voláteis apresentam com

uma das mais evidentes características o odor.

Exemplos de terpenoides são o mirceno, linalol, geraniol, cânfora, mentona, limoneno,

e mais especificamente dentro do gênero Xylopia (Figuras 8 a 19), o espatulenol (X. laevigata

e X. brasiliensis), os ácidos kovalênico, ent-kaur-16-em-19-óico e traquiloban-19-óico (X.

aethiopica), o ent-kaur-16-en-19-ol e o ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X. cayennensis), as

emarginatinas 1 e 2 (X. emarginata), e o ent-atisano-7-oxo-16-alfa-ol (X. langsdorffiana)

(Costa et. al., 2011; Diderot et. al.,2005; Andrade et. al., 2004; Moreira et. al., 2003; idem,

2006; Santos et. al., 2011).

15

Figura 8 – Espatulenol (X.laevigata e X.brasiliensis) Figura 9 – Ácido kovalênico (X.aethiopica)

Figura 10 – Ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.aethiopica) Figura 11 – Ácido traquiloban-19-óico (X.aethiopica)

Figura 12 - Ácido ent-kaur-16-en-19-óico (X.cayennensis) Figura 13 - ent-kaur-16-en-19-ol (X.cayennensis)

Figura 14 – Emarginatina 1 (X.emarginata) Figura 15 – Emarginatina 2 (X.emarginata)

Figura 16 – Ácido ent-3-beta-hidroxi-16-caruren-19-óico (X.laevigata) Figura 17 – Ácido ent-16-cauren-19-óico (X. laevigata)

Figura 18 – ent-atisano-7alfa-acetoxi, 16alfa-ol (X.langsdorffiana) Figura 19 – ent-atisano-7-oxo-16alfa-ol (X.langsdorffiana)

16

Quanto a importância farmacológica, muitas propriedades são estabelecidas a respeito

dos terpenoides, entre elas, ação carminativa, antiespasmódica, ação estimulante gastro-

intestinal, secretolítica, estimulante do SNC, anestesia local, atividade anti-inflamatória e anti-

séptica. (Simões & Spitzer, 2004). Algumas espécies do gênero Xylopia são conhecidas como

produtoras de óleos voláteis de importância farmacológica, tendo como alguns exemplos, a X.

aromatica e a X. aethiopica, que apresentam em seus óleos, terpenoides como o 1,8-cineol,

terpinen-4-ol, β-felandreno, Δ-3-careno, α-pineno, β-pineno e β-mirceno (Nguemtchouin et.

al., 2009; Kouninki et. al., 2007; Lago et. al., 2003).

1 2 3 4

Figura 20 - α-pineno (1) , terpin-4-ol (2) , β-pineno (3) e Δ-3-careno (4) (X.aromatica e X.aethiopica)

3.4.4. Flavonoides

Os flavonoides constituem uma importante classe de polifenóis, presentes em relativa

abundância entre os metabólitos secundários de vegetais, sendo divididos em várias

subclasses: flavonas, flavonóis, antocianos e antocianinas, chalconas, auronas, di-

hidroflavonoides, isoflavonoides, flavanas, leucoantocianidinas e proantocianidinas,

neoflavonoides e biflavonoides. Também podem ser classificados como agliconas ou

heterosídeos. As agliconas aparecem geralmente sob a forma de cristais amarelos, sendo

normalmente solúveis em solventes orgânicos apolares, e por possuírem caráter fenólico, em

soluções aquosas alcalinas, enquanto que os heterosídeos são geralmente solúveis em água,

em álcool diluído, mas insolúveis nos solventes orgânicos habituais. A caracterização pode

ser realizada diretamente no farmacógeno (histoquímica), ou em extratos vegetais, por ensaios

cromáticos, cromatográficos, espectroscópicos ou fotométricos. As antocianinas são

facilmente caracterizadas devido a sua coloração, particularmente em flores e folhas

(Zuanazzi & Montanha, 2004).

17

Esta classe de substância possui inúmeras atividades biológicas, incluindo atividade

antiviral, antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral, atividade sobre a permeabilidade capilar

e atividade hormonal (Zuanazzi & Montanha, 2004). As espécies Xylopia emarginata e

Xylopia langsdorffiana são produtoras do flavonóide glicosilado denominado quercetina-3-α-

ramnopiranosídeo (Figura 21) (Moreira et. al., 2003b; Silva et. al.,2009).

Figura 21 – Quercetina-3-α-raminosídeo (X. emarginata e X. langsdorffiana)

3.4.5. Alcaloides

Os alcaloides são definidos como compostos nitrogenados farmacologicamente ativos

e são encontrados predominantemente nas Angiospermas. Em sua maioria, possuem caráter

básico, tendo exceções como colchicina, piperina, oximas e alguns sais quaternários. A

denominação alcaloide exclui compostos nitrogenados como aminas simples, aminoácidos,

peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, porfirinas e compostos com grupos nitro

e nitroso. Também pode-se utilizar a denominação alcaloides verdadeiros, para alcaloides

contendo um átomo de nitrogênio em um anel heterocíclico, protoalcaloides, para alcaloides

com átomo de nitrogênio não pertencente ao anel, e ainda, pseudoalcaloides, para alcaloides

sem anéis e não-derivados de aminoácidos. Possuem grande variedade estrutural, tal como no

caso dos terpenoides, sendo classificados de acordo com o precursor biogenético:

a) Derivados da L-ornitina: pirrolidínicos, tropânicos, pirrolizidínicos e

fenantroindolizidínicos.

b) Derivados da L-lisina: piperidínicos, quinolizidínicos e indolizidínicos.

c) Derivados do ácido nicotínico: piridínicos.

d) Derivados dos policetídeos: piperidínicos e lactamas policetídicas.

18

e) Derivados do isopreno: monoterpênicos, sesquiterpênicos, diterpênicos e triterpênicos.

f) Derivados do ácido antranílico: quinolínicos e quinazolínicos.

g) Derivados do ácido antranílico: acridínicos.

h) Derivados do L-triptofano: indóis simples, beta-carbolinas, indol-monoterpênicos,

quinolínicos, pirroloindólicos e ergolinas.

i) Derivados da L-fenilalanina: feniletilaminas.

j) Derivados da L-tirosina: feniletilaminas, tetraidroisoquinolínicos,

benzilisoquinolínicos, aporfínicos, aristolactamas, morfinanos, bisbenzilisoquinolínicos,

protoberberinas, isoquinoleínicos-monoterpênicos, betalaínas, benzilisoquinolinas e

fenetilisoquinolinas.

k) Derivados da L-histidina: imidazólicos.

l) Derivados de vários aminoácidos: ciclopeptídeos.

m) Derivados da purina: xantinas.

Devido a variedade estrutural dos alcaloides, são utilizados diversos métodos de

detecção específicos, sendo que de maneira geral, com exceção dos alcaloides contendo

nitrogênio quaternário, são extraídos através de reações ácido-base.

A função dos alcaloides nos vegetais ainda é objeto de estudo, sendo que algumas

hipóteses foram formuladas, como proteção contra predadores, por causa do sabor amargo,

reserva de nitrogênio, hormônios reguladores de crescimento, e proteção contra raios UV,

devido a presença de núcleos aromáticos.

Várias espécies do gênero Xylopia são produtoras de diversos grupos de alcaloides

(Figuras 22 a 26), entre eles, o-metilmoscatolina e dicentrinona (X. championii), discretamina

(X. langsdorffiana), buxifolina (X. buxifolia), nornantenina (X. danguyella), deidroxilopina e

deidroaporfina, alcalóides isoquinolínicos (X. vieillardi), e a danguielina, um alcalóide

aporfínico isolado de X. danguyella (Wueratine et. al., 1996; Silva et. al., 2009; Jossang et.

al., 1991; Hocquemiller et. al., 1981).

19

A variedade estrutural dos alcaloides implica na diversidade de atividades

farmacológicas inerentes a esta classe, entre elas, ação repelente de herbívoros (alcaloides

pirrolizidínicos), atividade emética (emetina), anti-hipertensiva (reserpina), antimalárica

(quinina), antitussígena (codeína), estimulante do SNC (cafeína), miorrelaxante (tubocurarina)

anticolinérgicos (atropina), entre outros (Henriques et. al., 2004).

Figura 22 – Dicentrinona (X. championii) Figura 23 – Buxifolina (X buxifolia) Figura 24 – Nornantenina (X. danguyella)

Figura 25 – Danguielina (X. danguyella) Figura 26 – o-metilmoscatolina (X. championii)

20

4. METODOLOGIA

4.1. Material Vegetal

Folhas (3600 g) e frutos (200 g) de X. ochrantha foram coletados na Restinga de

Jurubatiba, localizada no município de Carapebus (22º13’5,08”S - 41º35’10,24”W), RJ,

Brasil nos dias 27 de outubro de 2010, 14 de julho de 2011 (folhas) e 3 de agosto de 2012

(frutos). A identificação da espécie vegetal foi realizada pelo Prof. Dr. Marcelo Guerra Santos

da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do material vegetal foi realizada

e a exsicata foi depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da

Universidade do Estado do Rio de Janeiro, sob o registro de nº 14.500. As folhas foram

submetidas ao processo de secagem em estufa com ventilação forçada, com temperatura de

aproximadamente 35°C durante o período de 48 horas.

4.2. Extratos e Partições

460 g de folhas secas foram moídas em moinho de facas e em seguida submetidas à

extração por maceração a frio, em etanol 96%, durante um período de 15 dias com agitação

diária. Após este período, o macerado foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório,

obtendo assim o extrato hidroetanólico das folhas, após ressuspensão em etanol 90%. Em

seguida, este extrato foi submetido ao particionamento com solventes de polaridade crescente

(hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol), utilizando volume de 250 mL. As

partições hexânica, diclorometânica e de acetato de etila foram submetidas aos processos de

purificação e identificação dos componentes majoritários através de métodos cromatográficos

usuais com prévia revelação das principais classes de substâncias em cromatofolhas utilizando

reagentes específicos.

21

4.3. Extração do óleo essencial

Folhas e frutos frescos de X.ochrantha (1237 g e 200 g, respectivamente) foram

colocados separadamente em um balão de 5L sob uma manta térmica, e então, submetidas à

hidrodestilação durante 4 horas em um aparato do tipo Clevenger. Ao final da extração, os

óleos essenciais foram coletados e acondicionados em geladeira para posteriores análises

químicas e verificação de atividade biológica (antioxidante, antimicrobiana e citotóxica).

4.4. Determinação Estrutural

As metodologias utilizadas na determinação estrutural de substâncias foram realizadas

na Faculdade de Farmácia-UFF e Instituto de Tecnologia de Fármacos – FIOCRUZ.

O óleo essencial e os esteroides foram analisados por cromatografia acoplada a

espectrometria de massa (CG-EM), onde os espectros de massas foram obtidos em um

aparelho Shimadzu QP 5000 utilizando ionização por impacto de elétrons (70 eV; 1 scan/s)

sob as seguintes condições: temperatura do injetor: 260ºC (para o óleo essencial) e 200ºC

(para fração hexânica); temperatura do detector: 290ºC (para ambos); fase móvel: hélio; fluxo

médio de 1 mL/min (para ambos); injeção no modo split (1:40); temperatura inicial do forno:

60ºC (o.e.) e 40ºC (fr.hex.); rampa de aquecimento: 3ºC/min até 290ºC (o.e.); 3ºC/min até

110ºC e 2ºC/min até 280ºC (fr.hex.); concentração inicial da amostra: 1:100 mg/uL (o.e em

diclorometano.) e 1:500 mg/uL (fr.hex. em diclorometano); quantidade para injeção: 1 uL

(para ambos). As amostras foram injetadas em coluna RTX-5 (0,25 mm X 30 m X 0,25 µm).

A composição percentual dos óleos foi calculada pelo método de normalização das

áreas de pico CG-DIC. A identificação das substâncias foi realizada comparação do índice

aritmético (AI), determinado em relação ao tempo de retenção de uma série de n-alcanos (C7-

C40 – Sigma Aldrich Corp.), com dados de referência correspondente (Adams, 2007) e o

padrão de fragmentação do espectro de massas foi comparado com bibliotecas de espectro de

massas NIST.

A elucidação estrutural dos esteroides foi feita de acordo com o padrão de

fragmentação, os valores dos íons e as respectivas intensidades relativas que foram

comparadas com os descritos na literatura para a respectiva classe química (Jain & Bari, 2010;

22

Moreira et al., 2005; Silva et al., 2012; Balamurugan et al., 2011; Manoharan et al., 2005;

Sales, 2007).

Para a análise da composição flavonoídica primeiramente, foi utilizada a técnica de

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) integrada a um detector de feixe de diodos

(DAD - Shimadzu SPD-M10Avp) na região de 200 a 600 nm e fluxo de 1 mL/min. Todas as

análises em CLAE foram efetuadas em coluna de fase inversa Symmetry (4,6mm x 15 cm),

utilizando partículas de 5µm (analítica). Os solventes utilizados foram metanol e acetonitrila

grau CLAE/UV (TEDIA). A água foi obtida por destilação em sistema Milli-Q e os solventes

previamente filtrados em filtro 0,45 µm (Millipore). Também foi possível realizar a análise

dos componentes flavonoídicos através da técnica cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada a DAD e espectrometria de massas (CLAE-DAD-EM) utilizando ionização por

“eletrospray” em aparelho LC Micromass triplo – quadrupolo Q-4000, no modo negativo. A

detecção dos íons moleculares foi feita através do monitoramento selecionado de íons (SIM).

Como solventes, foram utilizados ácido trifluoroacético 0,1% (A) e acetonitrila (B). A

composição do gradiente de eluição foi a seguinte: 0–15min, 0–20% B em A (gradiente

linear); 15–35 min, 20–40% B em A (gradiente linear); 35 – 50 min, 40 – 100% B em A. As

condições utilizadas para o “eletrospray” foram: voltagem do spray, 3.5 kV; velocidade do

fluxo de gás de revestimento, 40 unidades; velocidade do fluxo de gás auxiliar, 15 unidades;

temperatura de dessolvatação, 300° C; voltagem do capilar, 10 V.

4.5. Avaliações de atividade biológica

4.5.1. Atividade antimicrobiana

Para a determinação da atividade bacteriana de extratos, partições e óleo essencial

foliares de Xylopia ochrantha, foram realizados os métodos qualitativo e quantitativo

(microdiluiçao em caldo e ensaio da diluição em placas). As análises foram realizadas nos

Laboratórios de Epidemiologia Molecular e Biotecnologia (Faculdade de Farmácia – UFF) e

Laboratório de Infecção Hospitalar (UFRJ).

23

4.5.1.1. Método Qualitativo

Placas contendo meio cromogênico CPS semeadas com Staphylococcus aureus ATCC

29213 foram utilizadas para verificação de atividade antimicrobiana do extrato bruto,

partições e óleo essencial foliares de Xylopia ochrantha. Pequenos discos de papel de filtro

Whatman nº1, com raio de 0,5 mm, inseridos em solução metanólica das amostras (100

mg/mL), foram postos em contato com a placa semeada com a cepa bacteriana (106

UFC/mL)

a ser analisada. Após incubação pelo período de 24 horas, a leitura foi realizada visualmente.

A formação de halos em volta dos papéis de filtro demonstra a existência de atividade

antimicrobiana.

4.5.1.2. Teste da Microdiluição em caldo e Determinação da Concentração Mínima

Inibitória (CMI)

Oito tubos de 20 cm, com exceção do primeiro, foram preenchidos com 2mL de caldo

Mueller-Hinton (MH) estéril. No primeiro tubo foram inseridos 3,8mL do caldo e 0,2 mL do

extrato, fração ou óleo essencial de Xylopia ochrantha a serem testados, diluídos em dimetil

sulfóxido (DMSO), na concentração final de 500 µg/mL. Metade do volume do primeiro tubo

foi transferida para o próximo tubo, repetindo-se o procedimento para os tubos subsequentes,

obtendo-se assim um gradiente de concentração. Em seguida, foram aplicados na microplaca

0,2 mL de cada diluição nos poços de uma fileira, em duplicata, sendo que, como controle

negativo, duas colunas da placa foram preenchidas com 0,2 mL de caldo MH sem a amostra.

Também foram utilizados poços para diluições contendo vancomicina, o antibiótico de

referência. Logo após, 0,01mL da suspensão bacteriana de Staphylococcus aureus ATCC

29213 (102 UFC/mL), previamente ajustada em salina estéril, foi aplicada em cada poço. As

placas foram incubadas por 24 horas, a 35ºC, dentro de sacos plásticos. Após o tempo de

incubação foram adicionados 30 µL do corante resazurina (Sigma-Aldrich) e as placas

incubadas por mais 24 horas à 35ºC. Após este período, a leitura foi feita visualmente

observando-se a coloração nos poços, e identificando-se a presença ou não de células

bacterianas viáveis, pois a presença de células bacterianas viáveis promove o descoramento da

resazurina. A CMI corresponde à primeira diluição na qual não for observada coloração rosa

(CLSI, 2008).

24

4.5.1.3. Ensaio da diluição em placa

Suspensões bacterianas de diferentes cepas (Tabela 5) contendo cerca de 1x106

UFC /

mL foram depositadas em cavidades de um replicador de Steers. Posteriormente, foram

semeadas sobre a superfície de placas de Petri contendo ágar Mueller-Hinton em quatro

concentrações seriadas 512 - 64 mcg / mL de extratos foliares de Xylopia ochrantha diluídas

em ágar. Para analisar a atividade de óleo essencial da folha foram dispensados 10 e 20 µL do

mesmo em placas contendo ágar Mueller-Hinton previamente semeados com diferentes

espécies bacterianas (106 UFC/mL). As placas foram incubadas a 37 ° C durante 24 horas.

Após este período, a leitura foi realizada. A CMI corresponde à concentração mais baixa na

qual ocorreu a inibição do crescimento bacteriano (Shadomy et al., 1985).

4.5.2. Atividade antioxidante

Na determinação da atividade antioxidante foliar de Xylopia ochrantha, foram

avaliadas a capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC) e concentração de

fenólicos totais. Ambas as análises foram realizadas na Faculdade de Farmácia – UFF.

4.5.2.1. Capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC)

Este ensaio é baseado na determinação da atividade antioxidante através da reação de

oxidação da fluoresceína, onde componentes geradores de radicais livres inativam a proteína,

diminuindo sua fluorescência.

Neste método, 20 μL das partições, extrato bruto e óleo essencial diluídos foram

inseridos em uma microplaca para fluorimetria com 96 poços. Logo em seguida, 120 μL da

solução de fluoresceína foram adicionados em cada poço, misturando bem a solução, e a placa

incubada por 10 minutos a 37ºC. Posteriormente, 60 μL do iniciador de radicais livres foram

inseridos em cada poço, homogeneizando com auxílio de uma pipeta, e imediatamente após,

as placas com a amostra e o padrão (Trolox) foram postos no leitor de fluorescência, ajustado

o comprimento de onda excitatório em 480nm, e o comprimento de onda de emissão em

530nm. A leitura foi feita em intervalos de 15 minutos, dentro de um tempo total de 60

minutos.

25

Para calcular os resultados do ensaio, foi construída a AUC para cada amostra e para o

padrão usando os valores finais e a seguinte fórmula de regressão linear:

AUC = 1 + RFU1/RFU0 + RFU2/RFU0 + RFUn/RFU0 + ... + RFU60/RFU0

Onde,

RFU0 = valor de fluorescência relativa no tempo zero

RFUn = valor de fluorescência relativa em um determinado tempo (minutos)

Finalmente, após o tratamento adequado da AUC, foram calculados os equivalentes

em μmol das amostras em comparação com o padrão (Trolox equivalent – TE). Os resultados

foram expressos em TE/g da amostra e realizados em triplcata. (Cao et.al., 1993).

4.5.2.2. Determinação dos fenólicos totais

O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método de Folin-

Ciocalteau (Ebrahimzaded et al., 2008; Nabavi et al., 2008). Diluições em triplicata de 1

mg/mL do extrato etanólico bruto de Xylopia ochrantha foram misturadas com o reagente de

Folin-Ciocalteu (5 mL, 1:10 diluído com água destilada) durante 5 min, posteriormente

adicionando-se Na2CO3 aquoso (4 mL, 1 M). A mistura foi deixada em repouso durante 15

minutos e os fenóis foram determinados por colorimetria a 765 nm. A curva padrão foi

preparada nas concentrações de 0,001, 0,01 e 0,1 mg/mL de ácido gálico em metanol:água

(50:50, v/v). A concentração de polifenóis totais é expressa em termos de equivalente de

ácido gálico (EAG) (mg/g de massa seca).

4.5.3. Atividade citotóxica

A avaliação da atividade citotóxica de folhas de Xylopia ochrantha foi analisada na

presença de células de tumor hipofisário murino (linhagem AtT20). Os ensaios foram

realizados no Laboratório de Interações Celulares – UFRJ.

As culturas das células AtT20 foram realizadas em meio de cultura DMEM

26

suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa à 37ºC, com 5% de CO2.

Posteriormente, as células AtT20 foram transferidas para placas de 24 poços (103

células/poço) e mantidas por 48 horas com DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino. A

avaliação dos efeitos dos extratos e do óleo essencial foliar de Xylopia ochrantha foi realizada

utilizando o MTT, para avaliação da viabilidade celular. Para avaliação da proliferação

celular, foi utilizado o Cristal Violeta. Nesta avaliação, apenas os extratos foram avaliados. O

tratamento com os extratos de Xylopia ochrantha foi realizado nas concentrações de 10, 50 e

100 µg/mL, enquanto que para o óleo essencial, as concentrações foram de 0,5, 1, 5, 10, 25,

50, 75, 100, 150 e 200 µg/mL. O controle foi realizado com o meio de cultura sem soro e com

meio de cultura sem soro veiculado com etanol 0,5%.

No ensaio de viabilidade celular com MTT, o tratamento foi retirado após o tempo

estimado (24 e 72 horas para o extrato bruto e 48 horas para o óleo essencial) e adicionado

200 µL de MTT em cada poço. Após duas horas de incubação em estufa à 37ºC, todo o MTT

foi retirado e adicionado 200 µL de DMSO em cada poço. Em seguida, o conteúdo foi

retirado e transferido para uma placa de 96 poços (100µL/poço).

No ensaio de proliferação com Cristal Violeta, o tratamento foi retirado após o tempo

estimado (24 e 72 horas) e as células lavadas com solução PBS 0,05% e fixadas com 400 µL

de etanol P.A. Em seguida, o etanol foi retirado, adicionando-se 300 µL de Cristal Violeta em

cada um dos poços. Após 10 minutos, cada poço foi lavado com água destilada até a

clarificação da água. Na sequência, foram adicionados 300 µL de metanol em cada um dos

poços, e então, a placa foi incubada por 5 minutos à 37ºC. O conteúdo foi passado para uma

placa de 96 poços (100µL/poço).

As leituras dos resultados foram feitas após 24 e 72 horas (tempos intermediários). A

análise dos resultados foi realizada em leitor de ELISA, a 570 nm. (Mozman, 1983; Nicks &

Otto, 1990). Os ensaios foram realizados em triplicata.

27

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Obtenção do Extrato Etanólico , Partições e Resíduo Aquoso

Na realização da primeira extração, o material vegetal foliar (460 g) submetido à

extração por maceração à frio em etanol, e posteriormente evaporado, apresentou massa de

24,58 g, com um rendimento final de 5,343%. Após o particionamento do extrato etanólico

bruto em solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e n-

butanol), a massa final obtida de cada partição, com seu respectivo rendimento em relação ao

material foliar foi o seguinte:

a) Partição hexânica: 7,1 g. (1,54%)

b) Partição diclorometânica: 3,73 g (0,81%)

c) Partição de acetato de etila: 1,56 g (0,34%)

d) Partição n-butanólica: 3,64 g (0,79%)

Uma segunda extração foi realizada posteriormente para análise da fração alcaloídica,

onde o extrato bruto etanólico apresentou uma massa total de 120 g obtidos a partir de 1250 g

de folhas (rendimento de 9,6%).

Os rendimentos das partições hexânica e diclorometânica das folhas de Xylopia

ochrantha, de acordo com a literatura, são considerados satisfatórios, visto que, na espécie

Xylopia aromatica, o rendimento da partição hexânica foi de 1,33% e da diclorometânica de

0,45%, enquanto que na espécie Xylopia emarginata, o rendimento da partição hexânica foi

de 0,91% (Martins et al., 1998; Moreira et al., 2003b).

5.2. Separação e Identificação de Substâncias Majoritárias

As partições hexânica e diclorometânica foram submetidas à separação cromatográfica

em coluna, utilizando Sílica Gel 60 e Sephadex, como fases estacionárias, e gradiente de

hexano:acetato e acetato:metanol (100% hexano no início, 30% metanol em acetato no final)

28

como fase móvel. Posteriormente, suas frações foram recolhidas, analisadas em cromatofolhas

e reveladas com o auxílio de reagentes colorimétricos e absorção na região do UV em 254 e

365 nm. Após o fracionamento da partição hexânica, foram obtidas 101 frações denominadas

H1 a H101, que foram reveladas com Reagente de Kedde, NP/PEG e ácido sulfúrico a 10%.

Após a revelação, foi observada nas placas de CCF a presença de bandas com coloração

característica de ácidos graxos e esteroides, além de cumarinas, visíveis em UV 365 nm

(Figura 27). Na separação da partição diclorometânica, os procedimentos cromatográficos,

incluindo os gradientes de eluição, e os reveladores específicos foram os mesmos utilizados

na análise da partição anterior, sendo obtidas 133 frações, nas quais puderam ser observadas

principalmente cumarinas, terpenoides e flavonoides. As duas últimas classes são descritas

amplamente na literatura para espécies do gênero Xylopia, inclusive relacionando-as com

atividades farmacológicas.

Figura 27 – Identificação de cumarinas (em azul fluorescente). Cromatografia em Camada Delgada de frações obtidas do extrato hexânico

(H86-H100). Fase estacionária silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: Acetato de Etila: Hexano

(50%). Revelador: NP/PEG em UV 365nm.

Também foi possível realizar a obtenção da fração total alcaloídica (FTA) através do

método de extração ácido-base, partindo de 120 g de extrato bruto, com um total de 331 mg

de FTA (0,028% de rendimento). Posteriormente, a fração obtida foi cromatografada em

coluna de sílica-gel, utilizando um gradiente de diclorometano e metanol como eluente (99%

de diclorometano no início e 70% no final), com proporção constante de 1% de dietilamina.

Foram coletadas 25 frações. Após a análise qualitativa em CCF, utilizando o Reagente de

Draggendorf como revelador e um sistema eluente de tolueno:acetato de etila:dietilamina

(7:2:1), foi constatada, de acordo com as manchas características em coloração amarela sob

fundo laranja, a presença de pelo menos três alcaloides majoritários, apresentando Rf de 0,20,

0,35 e 0,45. Ambas as manchas não foram visíveis em 365 nm.

29

O rendimento da FTA, comparativamente com outros estudos realizados com espécies

do gênero Xylopia, foi abaixo do esperado. As espécies X. viellardi, X. buxifolia e X.

danguyella apresentaram um rendimento de 0,33%, 0,22% e 0,20%, respectivamente (Jossang

et al., 1991; Hocquemiller et al., 1981).

5.2.1. Identificação de fitoesteróis por CG-EM

A fração H27 (17,5 mg), proveniente da separação cromatográfica primária da partição

hexânica, apresentou-se como uma mistura de um sólido cristalino em formato de agulha, um

sólido amorfo de coloração bege, além de um pó branco. Após análise em CCF, utilizando

ácido sulfúrico a 10% como revelador e uma mistura de hexano/acetato (7:3) como eluente, a

amostra apresentou uma mancha de coloração azul e outra avermelhada, mais distendida, em

ordem crescente de Rf (Ratio of Front).

O cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM obtido apresentou três sinais

principais, conforme ilustrado na Figura 32.

Figura 28 – Cromatograma da fração H27 obtido por CG-EM.

30

Substância 1 (Tabela 1 e Figura 35)

O sinal 1 do cromatograma (Figura 28) apresentou o tempo de retenção de 30,2 min e

o respectivo espectro de massas com uma série de íons fragmentos de m/z característicos de

núcleos esteroidais, ilustrados na figura 29. O íon molecular [M+] apresentou m/z 400. Os

principais fragmentos e suas respectivas intensidades relativas (em %) foram os seguintes: m/z

43 (63,49), 81 (86,11), 95 (81,05), 105 (85,33), 145 (100), 255 (46,71) e 273 (24,56), 315

(47,01), 367 (41,83) e 382 (35,61). O íon m/z 43 é referente ao radical propila terminal da

ramificação ligada ao anel D, enquanto os íons m/z 81, 95 e 105, 145 são referentes às

clivagens na mesma ramificação. Os fragmentos de m/z 255 e 273 são inerentes à perda da

ramificação somada à perda da molécula de água. Além disso, o íon m/z 315 corresponde à

clivagem da ramificação e formação de radical C6H13. Os fragmentos de m/z 367 e 382 são

referentes à perda do íon metila (m/z = 15) e molécula de água (m/z = 18) e o íon m/z 382,

referente à perda da molécula de água (m/z = 18) (Sales, 2007). De acordo com estes dados

espectrais, foi possível caracterizar a molécula como sendo o fitoesteroide campesterol (1)

(Jain & Bari, 2010; Sales, 2007), já identificado na espécie Xylopia laevigata (Silva et al.,

2012).

Figura 29 – Espectro de massa da substância 1.


O sinal 2 do cromatograma (Figura 28) apresentou tempo de retenção de 30,8 min e

íons fragmentos de m/z característicos de núcleos esteroidais, ilustrados na figura 30. O íon

molecular (M+) apresentou m/z 412. Os principais fragmentos e suas respectivas intensidades

relativas (em %) foram os seguintes: m/z 43 (24,86), 55 (99,03), 69 (68,77), 83 (100), 255

(55,09), 273 (7,73), 301 (4,76), 379 (12,50), 394 (11,05). O íon m/z 43 é referente ao radical

propila terminal da ramificação ligada ao anel D. Enquanto, os íons m/z 43, 55, 69 e 83 são

referentes à perda sucessiva de CH2 presentes na ramificação. Os fragmentos m/z 255 e 273

ocorreram devido à perda da ramificação somada à perda da molécula de água. O íon m/z 301

31

é devido ao rompimento de uma ligação simples adjacente a um dos carbonos sp2

da

ramificação ligada ao anel D e consequente perda de fragmento (m/z = 112). O fragmento

iônico m/z 379 é inerente à perda do íon metila e molécula de água e o m/z 394 está

correlacionado com a perda de uma molécula de água (Sales, 2007). Desta forma, foi possível

a identificar da substância 2 como sendo o fitoesteroide estigmaesterol (2) (Jain & Bari, 2010;

Sales, 2007), já identificado no gênero Xylopia (Moreira et al., 2005; Silva et al., 2012)..



O sinal 3 do cromatograma (Figura 28) apresentou tempo de retenção de

aproximadamente 32 mins e íons fragmentos característico de núcleos esteroidais, ilustrados

na figura 31. O íon molecular [M+] apresentou m/z = 414. Os principais fragmentos (m/z) e

suas respectivas intensidades relativas (em %) foram os seguintes: 43 (75,25), referente ao

radical propila terminal da ramificação ligada ao anel D, 57 (62,85), 81 (93,66), 93 (67,87) e

107 (94,53), 145 (100), referentes às clivagens da mesma ramificação, 255 (55,76) e 273

(33,20), devido à perda da ramificação somada à perda da molécula de água, além de 303

(43,81) e 329 (56,63), relacionados com a clivagem de ligações entre carbonos sp3 presentes

na ramificação, 381 (45,24), relacionado à perda do íon metila e molécula de água e 396

(46,40), referente à perda da molécula de água (Sales, 2007). De acordo com os dados

espectrais de massa, foi possível identificar a substância como o fitoesteroide γ-sitoesterol (3)

(Balamurugan et al., 2011; Manoharan et al., 2005).


32

Os fragmentos e as respectivas intensidades relativas são mostrados na Tabela 1. A

ilustração e origem de alguns íons fragmentos derivados destas substâncias, de acordo com a

literatura (Sales, 2007), é mostrada nas Figuras 32, 33 e 34.

Tabela 1 – Fragmentos, intensidades relativas e íon molecular de fitoesteróis encontrados em Xylopia ochrantha e dados encontrados na

literatura.

Substância [M+] m/z (Intensidade relativa%) exp. m/z encontrados na literatura

43 (63,49), 55 (59,75), 57 (50,79),

67 (45,40), 71 (43,25), 81 (86,11),

91 (65,38), 93 (65,31), 95 (81,05), 43, 55, 57, 67,

Campesterol 400 105 (85,33), 107 (82,33), 121 (61,95), 81, 91, 93, 95, 105, 107, 145,

(Jain & Bari, 2010; Sales, 2007) 131 (56,60), 133 (56,09), 145 (100), 147, 159, 163, 213, 255,

147 (66,62), 159 (65,15), 163 (50,37) 315, 367, 382

213 (74,64), 255 (46,71), 315 (47,01)

367 (41,43), 382 (35,61)

43 (24,86), 55 (99,03), 69 (68,

universidade federal fluminense · albuquerque, ricardo diego duarte galhardo de. estudo...

Documents