UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

LARISSA GONÇALVES MACHADO

CARACTERIZAÇÃO DOS VENENOS DE

DIFERENTES POPULAÇÕES DE BOTHROPS

JARARACA E ANÁLISE DAS INTERAÇÕES COM

ANTIVENENO COMERCIAL

Niterói

2014

II

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

LARISSA GONÇALVES MACHADO

CARACTERIZAÇÃO DOS VENENOS DE DIFERENTES POPULAÇÕES DE BOTHROPS JARARACA E ANÁLISE DAS

INTERAÇÕES COM ANTIVENENO COMERCIAL

Monografia apresentada ao Curso de

Graduação em Biomedicina da Universidade

Federal Fluminense, como requisito parcial

para obtenção do grau de Bacharel em

Biomedicina com Habilitação em Pesquisa

Científica, Ênfase em Fisiologia e

Farmacologia.

Orientadora: Profª Drª RUSSOLINA BENEDETA ZINGALI

Coorientador: Drº JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET

Niterói

2014

III

M149 Machado, Larissa Gonçalves

Caracterização dos venenos de diferentes populações de

bothrops jararaca e análise das interações com antiveneno

comercial / Larissa Gonçalves Machado. - Niterói: [s.n.], 2014.

62 f. :il.

Trabalho de Conclusão de Curso ( graduação em

Biomedicina) - Universidade Federal Fluminense, 2014.

1.Veneno de cobra. 2. Jararaca (bothrops). 3. Toxina. I.

Título

CDD 615.942

IV

LARISSA GONÇALVES MACHADO

CARACTERIZAÇÃO DOS VENENOS DE DIFERENTES POPULAÇÕES DE BOTHROPS

JARARACA E ANÁLISE DAS INTERAÇÕES COM ANTIVENENO COMERCIAL

Monografia apresentada ao Curso de

Graduação em Biomedicina da Universidade

Federal Fluminense, como requisito parcial

para obtenção do grau de Bacharel em

Biomedicina com Habilitação em Pesquisa

Científica, Ênfase em Fisiologia e

Farmacologia.

Aprovada em 05 de dezembro de 2014

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________________________________

Profª. Drª. Helena Carla Castro

Universidade Federal Fluminense

____________________________________________________________________

Prof. Drº. Plinio Cunha Sathler

Universidade Federal do Rio de Janeiro

____________________________________________________________________

Profª. Drª. Russolina Benedeta Zingali - Orientadora

Universidade Federal do Rio de Janeiro

___________________________________________________________________

Prof. Drº. Silas Pessini Rodrigues - Suplente

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Niterói

2014

V

À minha avó Regina, minha vida, meu tudo.

VI

AGRADECIMENTOS

Sempre em primeiro lugar, agradeço a Deus por ser meu melhor amigo e por me amar

incondicionalmente. Sem Ele eu nada seria. Muito obrigada, Senhor, porque por onde andei

nesse mundo, eu nunca estive sozinha.

Em segundo lugar, meu muito obrigado à minha família. Em especial, minha mãe,

vovó Regina, vovô Pedro e Laila. Nenhum apoio pode ser comparado ao de vocês. Não só

minha formação, mas tudo na minha vida é fruto da dedicação e carinho que vocês me dão. O

exemplo que eu tenho de vocês e o amor que nos une é algo imensurável. Agradeço também

ao meu pai (in memoriam) que sem dúvida está orgulhoso de mim de onde ele estiver.

Ao meu melhor amigo, companheiro, família, namorado... Rafael. Você significa

tantas coisas! Muito obrigada por acreditar tanto em mim, me entender e me apoiar nas

minhas decisões. Ao longo do eixo Campos-Niterói-Espanha você foi a certeza de que

nenhum lugar do mundo se compara a estar ao seu lado.

Em relação à conclusão desse curso, não poderia deixar de fazer um agradecimento

especial à minha amiga Paula Justen. Seus ouvidos e sua paciência em me aturar todos os dias

fazem de você uma santa com lugar garantido no céu! Meu muito obrigado à minha best,

psicóloga favorita, Maria Carolina... pra qualquer coisa que eu passe nessa vida você foi e

sempre será mais do que importante! À minha gêmea, Luisa, obrigada por me fazer tão feliz

com sua amizade! Às minhas amigas (rxs) Roberta e Bel, família brasucada em Valência,

agradeço a cumplicidade de todo coração. Vocês foram maravilhosas!

À minha orientadora, Lina, por ter me acolhido em seu laboratório e ter me dado

tantas oportunidades. Acredito que o que você faz é mais do que orientar. Me sinto feliz e

sortuda por ser sua aluna! A mi codirector Juanjo, muchas gracias por la oportunidad y por el

conocimiento que compartiste conmigo.

Gracias a mis queridos amigos españoles o casi españoles por todo el cariño y ayuda

que me han dado a lo largo de mi estancia en Valencia… Gema, Carmen, Yania, Alicia, Susi,

Anna, Libia, Jordi, Karla, Atik, Marvin, Donderis, Elena, Carla, Carles, Lorena... Habéis sido

todos estupendísimos, inolvidables y únicos. De manera muy especial, quiero agradecer a mi

florecilla Davi... sin tí, no hubiera hecho nada. No habría llegado hasta el final. Me has

enseñado todo lo que he aprendido en el laboratorio, me has ayudado en mis momentos

VII

difíciles y me has hecho muy feliz. ¡Ojalá pudiera ser la mitad de lo que tú eres algún un día!

Gracias también a Kike, un chico maravilloso y que tiene mucha suerte. También de manera

muy especial agradezco a mi amiga Raquel… ¡tienes un corazón enorme! No podía

imaginarme que encontraría alguien tan igual a mí (pero mucho mejor) al otro lado del

océano. La verdad es que no hay palabras para agradecerte lo que hiciste. José Fernando y

Ascensión, mis papas españoles, el cariño que tengo por vosotros no es normal. ¡Muchas

gracias por todo! ¡Vuestra amistad la llevaré siempre conmigo!

Aos melhores amigos desse mundo, meu muito obrigado! Graças a Deus eu tenho

tantos amigos maravilhosos! Sem vocês nem o TCC nem nada na vida teriam o mesmo

sentido: Raquel, Raissa, Leandra, Leticia, Gabriella, Livinha, Patricia, Mariana, Juliana,

Karol, Luciano, Lucas, Gabriel, Caio, Thaís, Cunhado, Larissa, Mauro, Mariana Couto,

Nathália, Júlia... amo vocês!

Aos meus amigos da UFF: Naty, Thalia, Fredinho, Lu, Lorena, Fernanda, Gabi,

Taiane, Bia, Maria Clara, Jéssica, Liu, Thays, Dáliti, Lucas, Docinho... muito obrigada por

terem compartilhado comigo esse momento tão especial da vida que é universidade. Aos

meus professores, funcionários e à coordenação de Biomedicina da UFF, em especial Ronald,

Nathalia, Renata, Luiz Mors, Helena Castro, Silvia Cavalcanti e Joacir. Aos meus amigos

inesquecíveis do Labiomol: Leo, Juliana, André e é claro, meus primeiros orientadores Plinio

e Helena! Aos queridos companheiros do LabHemoVen: Felipe, Marjolly, Nola, Vanessa,

Aninha, Rosane, Jessica, Rafael, Augusto, Denise, Dario, Maria Clara, Barbara, Victor,

Ricardo, Carlos, Taissa, Viviane, Dione, Hellen, Sandra, Silas e Luciana. Agradeço a Nola e

ao Carlos, mais uma vez, em nome de todos do IVB! Todos vocês foram cruciais para minha

formação!

Às pessoas especiais que me ajudaram tanto nesse tempo de UFF ou de alguma outra

forma ou que simplesmente são especiais pra mim: Tia Tânia, Seu Renê, Marcia, Liene,

Mariana Couto, Tia Lelena, Tia Jô, Priscila, Tia Dani, Tio Assis, Tio Antônio, Raissa prima,

Tia Luiza, Tio Luciano, Tia Sueli, vovó Maria, vovó Zezé, vovô Carlinhos, Tia Sônia... tantas

outras pessoas! Obrigada por fazerem parte da minha vida!

Agradeço ao programa Ciência sem Fronteiras (INCT/INBEB – CNPq) pela bolsa de

estudo concedida, em especial ao Drº Jerson Lima, às agências de fomento CNPq, CAPES e

FAPERJ e ao Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC – Espanha.

VIII

“Deus não nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos.”

Albert Einstein

IX

RESUMO

Os acidentes ofídicos são doenças tropicais negligenciadas que representam grande

causa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No Brasil ocorrem milhares de acidentes

ofídicos por ano, dos quais a maioria está associada ao gênero Bothrops. Uma das espécies de

maior importância médica, a Bothrops jararaca, possui uma distribuição geográfica ampla

associada à alta densidade demográfica e habilidade de colonizar e se adaptar a diferentes

ambientes. A caracterização proteômica dos venenos (venômica) descreve a composição

global das toxinas combinando técnicas de fracionamento de proteínas com identificação por

espectrometria de massas. Esse conhecimento gera uma melhor compreensão das

manifestações clínicas dos acidentes, identifica variabilidades entre venenos e ajuda na

idealização de melhores protocolos para o desenvolvimento de antivenenos e estratégias de

tratamento. Apesar de vários estudos envolvendo o veneno de B. jararaca, pouco se conhece

a respeito de variações populacionais e do perfil global do veneno pela abordagem venômica.

Através da antivenômica é possível caracterizar a interação de venenos e antivenenos,

elucidando quais toxinas são neutralizadas e quais as possíveis toxinas escapam desse

reconhecimento. Nesse trabalho foi realizado um estudo proteômico comparativo do pool de

venenos da espécie B. jararaca procedentes das regiões sul e sudeste do Brasil (extremos

pontos de distribuição) e do perfil de seus representantes individuais. Além disso, foi

investigada a capacidade do soro antibotrópico (SAB) do Instituto Vital Brazil em neutralizar

os venenos provenientes dessas populações (antivenômica). Comparando as proteínas

majoritárias, o veneno do sudeste possui mais metaloproteinases, enquanto o veneno do sul

apresenta maior quantidade de fosfolipase A2 (PLA2). A população do sul possui uma toxina

exclusiva em relação ao sudeste, identificada como uma Lys49-PLA2. Os cromatogramas

individuais apresentaram o mesmo padrão dentro da mesma população e em comparação ao

seu pool correspondente. Apesar dessas diferenças, o SAB foi capaz de reconhecer as toxinas

de ambas populações de maneira similar. Os resultados mostraram que a complexidade dos

venenos é notável e que o protocolo de imunização para produção do SAB é eficiente,

cobrindo as diferenças encontradas possivelmente pelo uso do veneno de cinco espécies no

pool de imunização, especialmente a B. jararacussu. É a primeira vez que um estudo

proteômico do veneno de B. jararaca é feito com um pool representativo dos extremos da

distribuição geográfica da espécie e os resultados apontam a existência de duas populações

bem distintas no território brasileiro.

X

ABSTRACT

Snakebite is a neglected tropical disease and represents a large cause of mortality and

morbidity in the world. In Brazil, thousands accidents are registered per year, most of them

associated with Bothrops genus. Bothrops jararaca is a medically relevant species, witch

pursuits a wide geographical distribution range associated with the most populated area in

Brazil. It is able to adapt and inhabit different environments. Venomics is a proteomic

approach applied to the study of venoms. It reveals the overall toxin profile combining

classical protein fractionating techniques and protein identification by mass spectrometry.

This knowledge allows a better comprehension of snakebite symptoms, identifies variability

among venoms and helps to design best antivenoms and treatment. B. jararaca´s venom has

been largely characterized, however population variation is unknown and there are no

proteomic studies describing the global composition using a venomic approach. Antivenomics

provides relevant information about the interaction between venoms and antivenoms,

describing which toxins are recognized or not. Significant variation on the venom could lead

to less recognition of some toxins by the antivenom. This study consists on the comparison of

venom composition of Bothrops jararaca from South (BjS) and Southeast (BjSE) of Brazil

(extreme points of distribution), analysing a representative pool from each population and

individual specimens. Besides we investigated the capacity of antibothropic antivenom

(SAB) from Instituto Vital Brazil to neutralize differences in these venoms (antivenomics).

We demonstrated noteworthy differences in each population. The major components in

Southeast population are metalloproteinase. Otherwise South population possesses more

PLA2 and has an exclusive toxin that was identified as a Lys49-PLA2. The individual

chromatograms showed a similar profile for all specimens from each population that complies

with chromatogram of the corresponding pool. The antivenomics results showed that the

immunoreactivity of SAB is similar against both population. The results indicate that venoms

have high complexity and immunization protocol is efficient and cover the differences among

population, possibly because the use of five species in the venom pool of immunization,

especially B. jararacussu. This is the first report of a proteomic study using a representative

pool of B. jararaca´s extreme points of distribution and the results confirms that there are two

different populations in Brazil.

XI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Exemplos de famílias de proteínas expressadas nas glândulas de veneno do

Squamata. .................................................................................................................................. 1

Figura 2: Distribuição geográfica do complexo Bothrops jararaca com suas localizações

amostrais. ...................................................................................................................................7

Figura 3: Distribuição geográfica de Bothrops jararaca e indivíduos que originaram o pool

representativo da população do sudeste e do sul ......................................................................14

Figura 4: Sequência metodológica da venômica. ...................................................................15

Figura 5: Quantificação da abundância relativa das famílias de toxinas presentes no veneno

total. ................................................................................................................. .........................18

Figura 6: Etapas da incubação do veneno e a coluna de imunoafinidade. ..............................20

Figura 7: Cromatogramas das populações de Bothrops jararaca provenientes do Sul e do

Sudeste do Brasil utilizando-se cromatografia de fase reversa. .......................................24 e 25

Figura 8: Eletroforese das frações provenientes da fase reversa (RP-HPLC) ........................27

Figura 9: Cromatogramas individuais de representantes do sul e sudeste. .....................30 e 31

Figura 10: Dot blot da BthTX-I e dos venenos de B. jararaca e B. jararacussu frente a

anticorpos anti-BthTX-I. ..........................................................................................................33

Figura 11: Antivenômica do soro antibotrópico pentavalente (SAB) do IVB frente aos

venenos de B. jararaca do sul e sudeste. .................................................................................35

Figura 12: Western Blot dos venenos de B. jararaca do sul e do sudeste frente ao soro

antibotrópico pentavalente (SAB) do IVB. ..............................................................................36

Figura 13: Autodegradação do veneno de B. jararaca do sudeste..........................................37

Figura 14: Alinhamento múltiplo de Lys49-PLA2 do gênero Bothrops. ................................44

XII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Acidentes por animais peçonhentos por tipo de serpente no perído de 2008 –

2013. ...........................................................................................................................................2

Tabela 2: Identificações dos peptídeos trípticos das proteínas majoritárias da população de B.

jararaca da região sul. .............................................................................................................28

Tabela 3: Identificações dos peptídeos trípticos das proteínas majoritárias da população de B.

jararaca da região sudeste. ......................................................................................................29

XIII

LISTA DE ABREVIATURAS

BjS População de B. jarararaca do sul

BjSE População de B. jararaca do sudeste

BPP Bradykinin-potentiating peptides

BthTX-I Bothropstoxina-I

CID Collision Induced Dissociation

CRISP Cysteine-rich secretory proteins

CTL C-type lectin

Cyt b Mitochondrial cytochrome b gene

FUNASA-MS Fundação Nacional de Saúde – Ministério da Saúde

HRP Horseradish peroxidase

IVB Instituto Vital Brazil

LC-MS/MS Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

MS Espectrometria de massas ou aquisição de massa

MS Ministério da saúde

MS/MS Tandem mass spectrometry

m/z Relação massa/carga

ND4 NADH dehydrogenase subunit 4, mitochondrial gene

NHS N-hydroxysuccinimide

NOPA Núcleo de Ofiologia de Porto Alegre

OMS Organização Mundial da Saúde

PLA2 Phopholipase-A2

PVDF Difluoreto de polivinilideno

RP-HPLC Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography

SAB Soro antibotrópico

XIV

SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SVS/MS Secretaria de Vigilância à Saúde / Ministério da Saúde

SVMP – I, II, III Snake venom metalloproteinase, type I, II or III

SVSP Snake venom serine protease

UPLC Ultra Performance Liquid Chromatograph

XV

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO ..................................................................................................................1

1.1 – Venenos e acidentes ofídicos ................................................................................1

1.2 – Tratamento ............................................................................................................4

1.3 – Veneno de Bothrops jararaca ...............................................................................5

1.3.1 – Populações de Bothrops jararaca ................................................................6

1.4 – Caracterização e estudo de venenos ......................................................................8

1.5 – A importância de estudar venenos ........................................................................9

2 – OBJETIVOS .....................................................................................................................12

2.1 – Objetivo geral ......................................................................................................12

2.2 – Objetivos específicos ...........................................................................................12

3 – MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................13

3.1 – Aspectos Éticos ...................................................................................................13

3.2 – Venenos e Antivenenos .......................................................................................13

3.3 – Caracterização dos venenos ................................................................................14

3.3.1 – Cromatografia de Fase Reversa ............................................................15

3.3.2 – SDS-PAGE e digestão in gel ................................................................16

3.3.3 – Espectrometria de Massas ....................................................................17

3.3.4 – Quantificação da abundância relativa das toxinas ................................17

3.4 – Antivenômica ......................................................................................................18

3.5 – Western Blot ........................................................................................................21

3.6 – Dot Blot ...............................................................................................................21

4 – RESULTADOS .................................................................................................................23

4.1 – Perfis cromatográficos dos pools ........................................................................23

4.2 – Perfis eletroforéticos dos picos cromatográficos ................................................26

4.3 – Cromatogramas individuais .................................................................................26

4.4 – Lys49-PLA2 .........................................................................................................32

4.5 – Antivenômica e Western Blot .............................................................................33

4.5.1 – Degradação na antivenômica ................................................................36

5 – DISCUSSÃO .....................................................................................................................37

5.1 – Perfis dos venenos das populações (pools) .........................................................37

5.2 – Perfis cromatográficos dos venenos individuais .................................................39

5.3 – Bothropstoxina-I ..................................................................................................40

5.4 – Antivenômica ......................................................................................................47

6 – CONCLUSÃO ..................................................................................................................51

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................52

8 – ANEXOS ...........................................................................................................................61

1

1 - INTRODUÇÃO

1.1 – Venenos e acidentes ofídicos

Os venenos de serpentes são misturas complexas de componentes proteicos e não

proteicos que ao longo da evolução foram recrutados de determinados genes e selecionados

para exercerem funções de toxinas, à fim de garantirem a obtenção da presa e sobrevivência

das espécies que as produzem (Calvete et al., 2009; Odell et al., 1997). Apesar da diversidade

da composição dos venenos e da variedade de atividades biológicas que as toxinas podem

exercer, o arcabouço estrutural disponível, isto é, o grupo de famílias de proteínas que

participam da composição das toxinas é restrito (Fry et al., 2006). Deste modo, os genes

responsáveis pela expressão de toxinas nas glândulas de veneno sofrem uma evolução

acelerada, que primeiramente decorre de uma duplicação gênica e posteriormente de várias

mutações que levam a perda e/ou ganho de atividade da toxina em um mesmo arcabouço

molecular (Fry et al., 2008, 2009 ; Calvete et al., 2009 ; Calvete, 2013).

Figura 1: Exemplos de famílias de proteínas expressadas nas glândulas de veneno do Squamata. Vermelho: toxinas sequenciadas por ambas as glândulas maxilares e mandibulares; Vermelho escuro:

toxinas sequenciadas apenas nas glândulas maxilares de Serpentes e Iguania; Laranja: toxinas sequenciadas apenas nas glândulas mandibulares do grupo Anguimorpha; Rosa: toxinas sequenciadas

apenas nas glândulas maxilares de Serpentes; Azul: glândula secretora de muco, forma ancestral das

glândulas de veneno. 3FTx, three-finger toxins ; ADAM, a disintegrin and metalloproteinase; CNP-

BPP, C-type natriuretic peptide-bradykinin-potentiating peptide; CVF, cobra venom factor; NGF,

nerve growth factor; VEGF, vascular endothelial growth factor ; PLA2, phospholipase A2. (Retirada e

adaptada de Fry et al., 2006)

2

Apesar dos venenos representarem o meio pelo qual as serpentes se alimentam e

sobrevivem, acidentes ocorrem quando o animal, para sua própria defesa, inocula veneno em

seres humanos e animais domésticos ou de grande porte. Os acidentes por animais

peçonhentos são considerados “doenças tropicais negligenciadas” pela Organização Mundial

de Saúde (OMS) (WHO, 2010).

Como característica de uma doença negligenciada, o envenenamento por veneno de

serpentes é um problema de saúde pública, resultando não só em grande número de mortes,

como também em grande número de sequelas nas vítimas. De acordo com notificações

recentes do Ministério da Saúde, nos últimos 10 anos o número de acidentes com animais

peçonhentos vem crescendo acentuadamente. Só no período de 2008-2013 foram 791.425

casos notificados (Fonte: Sinan/SVS/MS). Embora o SINAN direcione os acidentes por

animais peçonhentos como notificação de agravo de interesse nacional, a problemática da

subnotificação é notável, pois justamente nas áreas rurais onde ocorre a maioria dos acidentes,

o relato dos casos é menos eficiente (Gutiérrez et al., 2013a). Os dados mostrados na tabela 1,

retirada do SINAN, apesar de mostrarem um aumento do número de casos notificados, ainda

representam uma notificação incompleta e insatisfatória, visto que a maior parte das

notificações não identifica a serpente causadora do acidente.

Tabela 1: Acidentes por animais peçonhentos por tipo de serpente no perído de 2008 – 2013.

Fonte: Ministério da Saúde/SVS - Sistema de Informação de Agravos de Notificação - Sinan Net. Cópia formato

CSV a partir de http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/tabnet?sinannet/animaisp/bases/animaisbrnet.def.

Dados de 2008 atualizados em 25/04/2014 ; Dados de 2009 atualizados em 24/04/2014 ; Dados de 2010

atualizados em 24/04/2014 ; Dados de 2011 atualizados em 24/04/2014 ; Dados de 2012 atualizados em

01/09/2014 ; Dados de 2013 atualizados em 01/09/2014, sujeitos à revisão.

ACIDENTES POR ANIMAIS PEÇONHENTOS

Notificações registradas no Sistema de Informação de Agravos de Notificação - Sinan Net

Tipo Serpente 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Total

Ign/Branco 81533 97269 98485 110932 116269 134176 638664

Bothrops 20450 21799 21583 21790 20422 19583 125627

Crotalus 1987 2164 2378 2486 2163 1796 12974

Micrurus 186 204 210 227 236 235 1298

Lachesis 852 950 1031 1002 871 903 5609

Não Peçonhenta 1024 1228 1185 1247 1260 1309 7253

Total 106032 123614 124872 137684 141221 158002 791425

3

Mesmo com a subnotificação, é bem conhecido que o acidente botrópico representa a

grande maioria dos acidentes com serpentes peçonhentas no país, representando até 90% dos

mesmos (Queiroz, et al., 2008). Além do Brasil, o gênero Bothrops, pertencente à família dos

viperídeos, é o de maior relevância no que diz respeito ao número de acidentes ofídicos nas

Américas (Gutiérrez, 1995).

No Brasil, a espécie de maior importância médica é a Bothrops jararaca. A espécie

combina dois fatores contribuintes para isso: i) sua ampla distribuição geográfica, que vai do

sul do estado da Bahia até o norte da Argentina e se encontra dentro do domínio

morfoclimático da Floresta Atlântica. Além de compreender um território amplo, a

distribuição coincide com as regiões de maior densidade demográfica do país; ii) habilidade

de colonizar diferentes ambientes. Seu habitat típico é a floresta tropical de umidade perene

ou semidecídua. Porém, a espécie já foi relatada em locais de diferentes altitudes, áreas de

degradação, campos cultivados e ao redor de cidades, em áreas próximas a remanescentes de

cobertura vegetal (Sazima, 1992). O próprio Instituto Vital Brazil (Niterói-RJ) recebe vários

animais encontrados na própria cidade, ao redor dos principais bairros residenciais

(comunicação pessoal, grupo do serpentário, IVB).

A gravidade clínica do acidente botrópico é classificada em mediana, moderada ou

severa, dependendo dos sintomas e sinais clínicos (FUNASA-MS, 2001). Esse quadro clínico

está relacionado à quantidade de veneno que a vítima tem no sangue, isto é, depende também

de quanto veneno a serpente injeta no local da picada. As vítimas podem apresentar diversos

efeitos locais e sistêmicos, marcados, sobretudo por severa coagulopatia, necrose, edema,

sangramentos espontâneos e em alguns casos em síndrome compartimental (França et al.,

2003; Santoro et al., 2008). As consequências mais graves do envenenamento são as sequelas,

derivadas dos efeitos locais, associados muitas vezes ao uso popular incorreto de torniquetes.

Esses efeitos locais geram abscessos e necrose tecidual que levam à amputação de membros

(França et al., 2003). Complicações a nível sistêmico que levam ao óbito são mais raras e

geralmente ocorrem pela falta de administração do soro ou incompatibilidade ao mesmo

(reações adversas). Esses casos mais graves estão associados à hemorragia intensa, choque e

falência renal aguda (FUNASA-MS, 2001).

4

1.2 – Tratamento

O tratamento recomendado pela OMS, que representa a única forma existente eficaz

de tratar o paciente envenenado, consiste na administração intravenosa de soro hiperimune

(antiveneno) específico (WHO, 2010). O soro antibotrópico é produzido no Brasil através da

imunização de equinos com um pool de venenos constituído por B. jararaca (50%), B.

alternatus (12.5%), B. jararacussu (12.5%), B. moojeni (12.5%) e B. neuwiedi (12.5%) (Raw

et al., 1991 ; Queiroz et al., 2008). Esse pool exclui várias espécies brasileiras do gênero

Bothrops, que conta com mais aproximadamente 20 representantes (Queiroz et al., 2008)

como B. insularis, B. erythromelas, B. fonsecai, B. pirajai e B. atrox, sendo essa última uma

espécie de extrema relevância para o norte do país (Calvete et al., 2011). O tratamento segue

sendo um problema nos dias de hoje, pois os antivenenos apesar de evitarem o óbito quando

administrados corretamente e no devido tempo (ação sistêmica), se mostram muitas vezes

ineficazes na neutralização dos efeitos locais, o que gera severas sequelas e representa além

de um problema de saúde pública, um problema social, pela incapacitação das vítimas que

muitas vezes não podem dar continuidade ao trabalho que exerciam ou que por alguma outra

razão social são excluídas (Gutiérrez et al., 2013a).

A grande biodiversidade de espécies gera também diferentes tipos de envenenamento,

para os quais não há produção específica de antivenenos. Além da variabilidade encontrada

nos venenos de espécies filogeneticamente diferentes, variações interespecíficas e

intraespecíficas acontecem de acordo com idade, sexo, dieta e distribuição geográfica da

serpente (Núñez et al., 2009 ; Antunes et al., 2010 ; Calvete et al., 2011 ; Gibbs et al., 2011 ;

Madrigal et al., 2012). Tanto as variações interespecíficas como as intraespecíficas geram

mudanças na composição e na proporção de toxinas presentes nos venenos. Essa diversidade

pode resultar em diferentes reatividades frente às imunoglobulinas presentes no soro

antiofídico, e, portanto, numa eficácia possivelmente variável em neutralizar os efeitos

tóxicos do veneno a partir do mesmo arsenal disponível de antivenenos a serem usados para

terapia.

Após 120 anos do surgimento da soroterapia, inaugurada por nomes como Vital Brazil

e Calmette pouco mudou nos protocolos e na conduta da produção do soro antiofídico. No

esforço de otimizar as propostas de tratamento, muito se tem discutido em relação à criação

de antivenenos poli ou pan-específicos levando-se em consideração a neutralização das

5

toxinas majoritárias dos venenos e suas reatividades cruzadas frente a diferentes antivenenos.

Conhecendo melhor a composição dos venenos e identificando-se os possíveis epítopos

conservados entre a diversidade de venenos de relevância médica é possível sugerir melhorias

na produção desses soros, a fim de alcançar um melhor “custo-benefício” entre menor

quantidade de antivenenos e maior abrangência de reatividade frente a venenos homólogos e

heterólogos (Willians et al., 2011; Calvete, 2010 ; Gutiérrez et al., 2013b ; Sousa, et al., 2013).

1.3 – Veneno de Bothrops jararaca

O veneno de Bothrops jararaca é talvez um dos mais estudados, e já se mostrou que

seu veneno sofre uma marcada mudança ontogenética, de um veneno mais coagulante rico em

metaloproteinases do tipo III (SVMP-III), nos indivíduos neonatos, para um veneno que

aumenta a expressão de metaloproteinases do tipo I (SVMP-I) nos indivíduos adultos, o que

por sua vez acompanha a mudança de hábitos alimentares da espécie de uma alimentação

ectotérmica para uma alimentação endotérmica, respectivamente (Antunes et al., 2010;

Zelanis, et al., 2010, 2011, 2012). Acompanhando a mudança de composição de veneno, a

reatividade do antiveneno varia, sendo o veneno dos indivíduos neonatos pouco neutralizados

pelo soro antibotrópico, visto que o pool de imunização para produção do soro conta apenas

com representes adultos da espécie (Antunes et al., 2010). É bem estabelecido também que o

veneno da espécie é bastante variável: diferentes indivíduos possuem variações nos seus

venenos. Diferenças no proteoma e na atividade biológica entre indivíduos juvenis nascidos e

criados sobre as mesmas condições controladas de laboratório (mesma dieta, condições

climáticas, frequência de extração de veneno etc.) mostraram que as diferenças individuais

ocorrem na espécie desde os primeiros estágios de vida e parecem ser herdadas geneticamente

(Dias et al., 2013). Da mesma forma, espécimes adultos de uma mesma ninhada mostraram

diferenças individuais (Menezes et al., 2006).

O veneno de B. jararaca é majoritariamente composto por Petídeos Potenciadores de

Bradicinina (BBPs), metaloproteinases (SVMP), desintegrinas, serino-proteases (SVSP) e

lectinas do tipo-C (CTL) que em conjunto são responsáveis pelos distúrbios hemostáticos que

caracterizam o envenenamento pela espécie. Diversas toxinas pertencentes a essas famílias já

foram isoladas e caracterizadas, confirmando seu papel na hemostasia ou vias relacionadas,

dentre as quais se podem destacar: HF3, bothropasina e jararhagina, SVMP-III hemorrágicas

(Oliveira et al., 2009; Moura-da-Silva & Baldo, 2012); bothrojaractivase, SVMP-I ativadora

6

de pró-trombina (Berger et al., 2008); PA-BJ, ativador de plaquetas e KN-BJ, liberador de

cininogênio e ativador de fibrinogênio, ambas SVSP (Serrano et al., 1995; Serrano et al.,

1998); botrojaracina, inibidor de trombina e botrocetina, agregrante plaquetário dependente de

vWF, ambas CTLs (Zingali et al., 1993; Usami et al., 1993); jararacina e jarastatina,

desintegrinas inibidoras da agregação plaquetária (Wermelinger et al, 2009); BPPs

hipotensores (Ferreira et al., 1970; Camargo et al., 2012).

1.3.1 – Populações de Bothrops jararaca

Apesar dos vários estudos publicados em relação ao veneno de jararaca e muito se

conhecer de suas toxinas e variações intraespecíficas, pouco se sabe das possíveis variações

populacionais da espécie. O princípio de que existem duas populações bem definidas de

Bothrops jararaca no território brasileiro surgiu com o trabalho de Grazziotin e colaboradores

em 2006. Nesse trabalho, o rastreamento da variabilidade genética pelo acesso ao gene

mitocondrial do citocromo b (cyt b) de uma ampla amostragem (159 indivíduos de 94

localidades) é contrastada com a história da formação da Floresta Atlântica ao longo de

períodos geológicos como Plioceno e Pleistoceno, a fim de entender a formação da

biodiversidade nessa floresta tropical, nesse caso, mais detalhadamente compreender a

evolução do complexo Bothrops jararaca.

Os resultados mostraram que existe uma grande variedade entre os indivíduos e que a

espécie pode ser dividida em dois filogrupos ou clados geograficamente distintos, separados

por uma divergência basal e de proporção relativamente alta quando comparada a outras

espécies. Essa classificação dividiria a espécie em uma população do norte e outra do sul,

separadas por análises estatísticas dos haplótipos encontrados. A barreira geográfica, gerada

por análises estatísticas, corresponderia ao atual Rio Paranapanema, que está localizado

aproximadamente entre os estados de SP e PR (Figura 2). A barreira geográfica estipulada

corresponde à localização aproximada de onde termina e começa outra população e não

necessariamente estaria diretamente envolvida em uma barreira geográfica física que

fragmentou as populações no passado.

7

Figura 2: Distribuição geográfica do complexo Bothrops jararaca com suas localizações amostrais. A área

circundada em cinza claro representa a distribuição geográfica de B. jararaca. Os quadrados indicam os

indivíduos pertencentes ao clado “northern” (norte) a as cruzes indicam os indivíduos do clado “southern” (sul).

A linha sólida e a linha pontilhada representam a principal barreira geográfica como definido pelos métodos

SAMOVA e AIS, respectivamente. (Retirada de Grazziotin et al., 2006).

A divisão entre os grupos populacionais foi tão clara e evidente que de toda

variabilidade de haplótipos encontrados, cerca de 70% da diversidade está entre os dois

grandes clados. Do ponto de vista mitocondrial, B. insularis e B. alcatraz, que são

reconhecidamente espécies distintas, são mais próximas ao clado de B. jararaca do norte (na

verdade estão dentro desse clado) do que as duas populações de B. jararaca entre si. Não

existe até o presente momento nenhum trabalho na literatura que estude as possíveis

diferenças entre os venenos dessas duas populações. Além disso, há carência de descrições

oficiais de acidentes reconhecidamente causados por jararaca no sul do país, que possam ser

comparados ao quadro clínico gerado já descrito que está associado aos casos registrados, na

maioria das vezes, na região sudeste. Possíveis diferenças entre os venenos podem significar a

descoberta de toxinas ainda não conhecidas, ajudarem a compreensão da fisiopatologia do

8

envenenamento nas diferentes regiões e demonstrarem a necessidade de avaliar a eficiência

do soro antibotrópico frente às diferenças dos venenos das duas populações.

1.4 – Caracterização e estudo de venenos

Com o advento dos recursos metodológicos que acompanham o desenvolvimento das

ciências “ômicas” (transcriptômica, metabolômica, proteômica) e das ferramentas de

bioinformática tem sido cada vez mais possível desenvolver meios para estudar amostras

biológicas complexas, dentre elas, os venenos. Combinando técnicas de descomplexização

das amostras por separação de proteínas com técnicas de identificação como o

sequenciamento de Edman e a espectrometria de massas, pode-se alcançar o que se conhece

como caracterização proteômica do veneno, isto é, a descrição de sua composição protéica

(Fox & Serrano, 2008 ; Calvete et al., 2007, 2009 ; Calvete, 2010, 2013). O conceito de

venômica foi introduzido em 2007 e consiste em uma abordagem metodológica que permite

caracterizar o proteoma do veneno visando à identificação de proteínas (inclusive as menos

abundantes, mais hidrofóbicas e de pequena massa molecular que não podem ser recuperadas

de um gel 2D). Além disso, disponibiliza resultados reprodutíveis que permitem comparações

minuciosas entre venenos muito distintos ou similares (Calvete et al., 2007, 2009; Gutiérrez

et al., 2009; Calvete, 2010, 2011 ; Williams et al., 2011).

Se por um lado a venômica consiste na caracterização proteômica dos venenos, a

antivenômica aponta quais toxinas do veneno possuem epítopos reconhecidos pelo antiveneno

através de técnicas proteômicas. A primeira geração da antivenômica baseava-se em um

protocolo de imunodepleção (Lomonte et al., 2008; Gutiérrez et al., 2008, 2009; Calvete et al.,

2009; Núñez et al., 2009), enquanto a abordagem mais atual (segunda geração) baseia-se em

cromatografia de imunoafinidade combinada com técnicas proteômicas (Pla et al., 2012).

Portanto, com a associação da venômica e da antivenômica, contando ainda em alguns

casos com o auxílio de transcriptomas, é possível conhecer a composição dos venenos, sua

variabilidade e quais são as toxinas de importância médica que estão sendo neutralizadas pelo

antiveneno comercial. Ou seja, as ciências “ômicas” aplicadas ao estudo de venenos têm

contribuído imensamente na questão de saúde pública, possibilitando a interpretação dos

fenômenos clínicos que ocorrem com as vítimas de envenenenamento, a caracterização da

eficácia do tratamento e, sobretudo, propondo novas estratégias para melhoria dos protocolos

de produção dos soros (Calvete, 2011; Gutiérrez et al., 2009) Levando-se em consideração às

9

variações geográficas e ontogenéticas dos venenos, a epidemiologia dos acidentes ofídicos em

cada região e as possíveis reatividades cruzadas entre venenos pertencentes a espécies

taxonomicamente próximas, torna-se viável propor novas composições para os pools de

imunização à fim de gerar antivenenos mais eficazes para a população em questão (Calvete, et

al., 2009 ; Gutiérrez et al., 2009 ; Calvete, 2010). As diferenças interespecíficas e

intraespecíficas dos venenos, que contribuem para diferentes manifestações clínicas e

imunorreatividades, devem ser racionalizadas no planejamento de melhores protocolos,

dispondo-se do princípio de que toxinas que pertencem à mesma família, ainda que sejam de

espécies diferentes, podem compartilhar estruturas antigênicas em comum (Calvete, 2010;

Williams et al., 2011). Nesse contexto, muitos esforços tem sido somados para aprimorar a

terapia antiofídica em várias partes do mundo, sobretudo em locais que mais sofrem com

envenenamentos, como a Ásia e a África (Williams et al., 2011) e América Central

(Gutiérrez et al., 2013).

No Brasil, esse tema ainda é pouco explorado e há a necessidade de se conhecer mais

sobre a eficácia da reatividade dos antivenenos. O desafio se torna ainda maior, visto que a

biodiversidade e variabilidade dos perfis biológicos dos venenos das serpentes nacionais,

sobretudo as do gênero Bothrops, são imensas (Queiroz et al., 2008). Ensaios que avaliam a

neutralização dos efeitos hemorrágicos, coagulantes, desfibrinogenantes e miotóxicos,

relevantes no gênero na América Latina (Segura et al., 2010) e mais especificamente no

Brasil (Zamunér et al., 2004), já foram feitos e corroboram mais uma vez com o fato de que

existe reatividade cruzada entre venenos e antivenenos, ainda que essa reatividade possa

variar de cobertura.

1.5 – A importância de estudar venenos

A caracterização dos venenos gera um conhecimento que se mostra relevante para

diversas aplicações biológicas. Através da composição dos venenos, pode-se compreender:

como as serpentes evoluíram e como se deu sua distribuição espacial ao longo de milhões de

anos; elucidar e compreender a variabilidade que ocorre entre os venenos de diferentes

espécies, diferentes populações e ainda diferentes indivíduos de um mesmo grupo;

compreender melhor as manifestações clínicas do envenenamento; desenvolver novos

fármacos e produtos biotecnológicos pela descoberta de novas toxinas que possuam alvos

farmacológicos de interesse; caracterizar a interação do antiveneno com o veneno, elucidando

10

quais toxinas são ou não são neutralizadas pelo mesmo através da antivenômica (Calvete et al.,

2009 ; Gutiérrez et al., 2009 ; Calvete , 2010, 2011, 2013 ; Williams et al., 2011).

As toxinas de venenos de serpentes, assim como outros produtos de origem natural,

tem sido alvo de estudos para protótipos farmacológicos, marcadores de auxílio de

diagnóstico de doenças e para produtos biotecnológicos em geral (Marsh, 2001; Koh et al.,

2006 ; Kini, 2011 ; McCleary & Kini, 2013). O desenvolvimento do primeiro inibidor da

enzima de angiotensina-I (ECA) (Captopril®), utilizado para o tratamento da hipertensão

arterial, foi inspirado na descoberta dos peptídeos potenciadores de bradicina do veneno de

Bothrops jararaca (Rocha e Silva et al., 1949), assunto que continuou sendo explorado e que

foi responsável por incentivar a busca de moléculas bioativas nos venenos animais

(bioprospecção) (Camargo et al., 2012). Exemplos como DEFIBRASE® (purificado do

veneno de Bothrops atrox) e ARVIN® (purificada do veneno de Calloselasma rodhostoma)

são usados no tratamento da trombose venosa profunda (TVP) e doenças vasculares

periféricas oclusivas, bem como profilaxia para prevenir TVP no estado pós-cirúrgico e

recorrência de trombose após cirurgia vascular (Braud et al., 2000). A Botrocetina, uma

lectina tipo-C isolada do veneno de Bothrops jararaca, induz aglutinação plaquetária

dependente de fator de Von Willebrand (vWF) e é usada para ensaios de detecção dos níveis

plasmáticos desse fator (Marsh, 2001).

Como mencionado, o veneno de jararaca é bem conhecido em relação a seus efeitos

farmacológicos e caracterização de muitas toxinas. Contudo, ainda não se conhece o perfil

detalhado da composição desse veneno pela abordagem venômica (isto é, detalhamento das

toxinas constituintes com identidade e abundância relativa das mesmas), o que pode ainda

revelar toxinas desconhecidas para essa espécie. Tendo em vista o trabalho de Grazziotin e

colaboradores, que propõe a existência de duas populações filogeneticamente distintas de B.

jararaca no Brasil e a provável história evolutiva por trás dessa divisão (flutuações no clima e

vegetação ao longo da formação do seu habitat principal que é a Mata Atlântica), espera-se

que os venenos também apresentem perfis diferentes. Até o presente momento não há nenhum

trabalho que estude as diferenças a nível populacional do veneno de Bothrops jararaca.

Tanto os efeitos tóxicos do envenenamento causado pelo gênero Bothrops, que

representa a maior causa de acidentes ofídicos no Brasil, quanto o potencial de moléculas de

interesse biotecnológico contidas nesse grupo, sobretudo no que diz respeito à hemostasia,

11

trazem a importância da continuidade do estudo proteômico do seu veneno. Com a

caracterização das populações de jararaca poderão ser encontradas novas moléculas com

potencial bioativo, além de fornecer informações importantes para ajudar a protocolar a

purificação de moléculas já conhecidas a fim de que se possa investigá-las melhor.

A determinação das possíveis diferenças dos venenos dessas duas populações além de

fornecer dados importantes corroborativos acerca da evolução e distribuição da espécie, é de

extrema importância médica e de saúde pública, já que a espécie Bothrops jararaca é

responsável pela grande maioria dos acidentes ofídicos no Brasil. Variações consideráveis na

composição do veneno podem significar a ausência de reconhecimento de algumas toxinas

pelo antiveneno em decorrência de seu protocolo de produção, visto que o pool de imunização

para produção do antiveneno ainda que utilize diferentes animais (soro antibotrópico) não

leva em consideração a existência de mais de uma população da espécie.

12

2 - OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Esse trabalho objetiva o estudo comparativo da composição dos venenos da espécie

Bothrops jararaca procedentes das regiões sul e sudeste do Brasil, por meio da análise de um

pool representativo de cada população e de representantes individuais, avaliando ainda a

capacidade de um antiveneno comercial em neutralizar as diferenças encontradas entre eles

(antivenômica).

2.2 – Objetivos Específicos

1. Separar os venenos por cromatografia de fase reversa (pools).

2. Realizar as eletroforeses das frações de massa molecular acima de 6 kDa.

3. Analisar por espectrometria de massas as frações intactas advindas das

cromatografias.

4. Separar os venenos individuais por cromatografia de fase reversa para averiguar

seu perfis e a representatividade das populações.

5. Analisar a reatividade entre o soro antibotrópico-IVB e os venenos das populações

do sul e do sudeste.

13

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Aspectos Éticos

O Instituto Vital Brazil, de onde são provenientes os animais do sudeste utilizados no

estudo, possui autorização do IBAMA-RJ para possuir o criadouro científico dos animais sob

o número de registro 1/33/95/0247-7. O NOPA (Núcleo de Ofiologia de Porto Alegre –

Museu de Ciências Naturais - Fundação de Zoobotânica, RS), por sua vez, possui registro no

IBAMA sob o número 1/43/1999/000764-9. O trabalho também está aprovado através

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) em Experimentação Cientifica do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob o número de referência

IBQM 077.

3.2 –Venenos e antiveneno

Dada a distribuição geográfica de Bothrops jararaca no território brasileiro (Figura 3,

A), foram incluídos representes adultos da espécie provenientes das duas regiões onde

estariam as diferentes populações à fim de constituir um pool representativo de cada uma

(Figura 3, B). Os indivíduos utilizados no estudo advêm dos extremos de sua distribuição, a

fim de evitar mesclas entre as populações. A população denominada como “do norte” no

trabalho de Grazziotin equivale à população do sudeste desse estudo, enquanto a “do sul”

continua sendo classificada como do sul. O pool constituinte do sudeste inclui um n=22,

correspondendo a indivíduos de diferentes procedências dentro do estado do Rio de Janeiro

(RJ), Espírito Santo (ES) e Minas Gerais (MG) que pertencem ao plantel do Instituto Vital

Brazil, Niterói-RJ. O pool do sul, por sua vez, conta com um n=22 proveniente de diferentes

localidades do Rio Grande do Sul (RS) fornecido pelo NOPA (Núcleo de Ofiologia de Porto

Alegre) – Museu de Ciências Naturais - Fundação de Zoobotânica, RS.

O antiveneno utilizado para os ensaios de antivenômica corresponde ao soro comercial

antibotrópico pentavalente (SAB) produzido pelo Instituto Vital Brazil – Niterói – Brasil.

Uma pergunta surgiu no decorrer do planejamento e primeiros ensaios desse trabalho: as

supostas diferenças populacionais são de fato populacionais ou seriam diferenças individuais

marcantes que estariam se sobressaindo na amostra agrupada? Para responder essa pergunta

foram efetuados cromatogramas referentes aos representantes individuais de cada região para

que o pool fosse validado como representativo de cada população.

A

14

3.3 – Caracterização dos venenos

A abordagem utilizada para realizar a caracterização proteômica do veneno de

Bothrops jararaca se enquadra na metodologia já bem descrita e reproduzida para proteômica

de venenos, que é a venômica (Calvete et al., 2007, 2009; Gutiérrez et al., 2009; Calvete,

2010, 2011). A sequência metodológica utilizada na venômica consiste, de maneira geral, no

fracionamento e recuperação do veneno bruto numa cromatografia de fase reversa (RP-

HPLC), seguida de análise dos picos cromatográficos por SDS-PAGE , digestão in gel das

bandas de interesse e sua posterior indentificação por espectrometria de massas. As frações

cromatográficas de baixo peso molecular (m/z ≤ 1700) são analisadas diretamente por LC-

MS/MS. A obtenção de espectros provenientes de CID- MS/MS permite a identificação, a

nível de família de proteínas, das bandas referentes a toxinas visualizadas e digeridas a partir

do gel de poliacrilamida e das frações de baixo peso. Uma vez identificadas, as toxinas podem

ter sua abundância relativa estimada no veneno (Fig. 4).

A BFigura 3: Distribuição geográfica de Bothrops jararaca (A) e indivíduos que originaram o pool

representativo da população do sudeste (círculos) e do sul (quadrados) (B). (Imagem de arquivo

pessoal de Diego Janisch Alvares, Laboratório de Herpetologia, Depto. de Zoologia, Instituto de

Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS).

15

3.3.1 - Cromatografia de Fase Reversa (RP-HPLC)

Para análise cromatográfica dos pools de cada população de Bothrops jararaca foram

utilizados 2-2,2 mg de veneno, ressuspendidos em 190 l de solução de acetonitrila (ACN)

5% + 0,1% de Ácido Trifluoroacético (TFA). Em alguns casos houve o acréscimo de 5 l de

Ácido Fórmico a 70%, dependendo da solubilidade da amostra. As amostras foram

centrifugadas a 13000 rpm por 10 min para eliminação de possíveis debris antes de serem

injetadas manualmente no sistema. A coluna utilizada para as corridas cromatográficas dos

pools foi uma Teknokroma Europa C18 (0.4 cm × 25 cm, 5 mm particle size, 300 Å pore size)

no sistema de gradiente de alta pressão Agilent LC 1100 equipado com detector DAD e

micro-autoinjeção. A taxa de fluxo foi setada para 1 ml/min e os experimentos foram

executados em gradiente linear de 0,1% TFA em água (solução A) e 0,1% de TFA em

acetonitrila (solução B) nas seguintes condições: isocraticamente 5% B por 5 min, seguido de

5-25% B por 10 min, 25-45% B por 60 min e 45-70%B por 10 min. A detecção dos picos foi

monitorada a 215 nm (com referência de comprimento de onda de 400 nm). Os picos foram

coletados manualmente, secos em uma centrífuga a vácuo (Savant) e posteriormente

ressuspendidos em água mili-Q para submissão das frações ao SDS-PAGE.

Para os cromatogramas individuais foram injetados 200 µg de veneno de cada

espécimen, ressuspendidos e centrifugados nas mesmas condições anteriores e utilizando o

microinjetor automático. As corridas foram realizadas utilizando uma coluna Dicovery® BIO

Wide Pore C18 (15 cm x 2.1 mm, 3 μm particle size, 300 Å pore size) nas seguintes

condições: isocraticamente 5% B por 1 min, seguido por 5-25% B por 5 min, 25-45% B por

RP-HPLCC18

12

3 45

SDS-PAGE

1 2 3 4 5

Digestãotríptica In-gel

CID – MS/MS

Identificação

Abundânciasrelativas

Figura 4: Sequência metodológica da venômica: o veneno bruto é fracionado por cromatografia de fase

reversa (RP-HPLC); as frações provenientes da cromatografia são submetidas a SDS-PAGE; digestão

tríptica das bandas de proteína de interesse; identificação dos peptídeos trípticos e naturais por CID -

MS/MS; análise dos resultados por interpretação manual ou uso de plataformas de busca frente aos banco de

dados, assinalando a família de proteína da amostra; estimação do perfil geral de toxinas expressada como

porcentagem total das proteínas do veneno.

16

35 min, e 45-70% por 5 min, com as mesma soluções e o mesmo sistema de alta pressão

utilizados para as análises dos pools.

3.3.2 - SDS-PAGE e digestão in gel

As frações provenientes do RP-HPLC, após terem sido secas em centrífuga a vácuo

(SPD SpeedVac®, ThermoSavant) foram devidamente ressuspendidas de acordo com a

proporção de cada pico, isto é, as frações não foram ressuspendidas nos mesmos volumes.

Cada uma foi ressuspendida de acordo com a área do seu pico, a fim de alcançar de maneira

aproximada uma proporção mais homogênea da concentração final de cada uma). As amostras

de cada fração foram preparadas nas seguintes condições: 10 µL de amostra + 2 µL de tampão

de amostra reduzido (200 mM Tris-HCl pH 6.8 + 6% SDS + 0.05% Azul de Bromofenol +

36% glicerol + 5% β-mercaptoethanol, 6X) ou não reduzido (200 mM Tris-HCl pH 6.8 + 6%

SDS + 0.05% Azul de Bromofenol + 36% glicerol 6X). Nas amostras que apresentaram, de

acordo com o indicador azul de bromofenol, uma coloração visual de pH abaixo da faixa

desejável (pH do gel de corrida) foram adicionados de 1–3 µL de tampão Tris 1.5 M pH 8.8

até que a amostra apresentasse uma coloração arroxeada indicativa do pH ideal para corrida.

Posteriormente, as amostras foram aquecidas a 100 ºC por 5 min em um Thermoblock. As

frações foram então submetidas à eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE),

utilizando o sistema Mini-PROTEAN® da Bio Rad em um sistema descontínuo de géis de

poliacrilamida de 0.75 mm (gel de stacking 4% e gel de corrida 15%, a partir de solução de

30% acrilamida/bis-acrilamida, 3,3% de cross-linker) na presença do tampão de corrida (25

mM Tris, 192 mM Glicina, 0.1% SDS, pH 8.3) e voltagem de 80 V nos primeiros 20 min,

seguidos de 110 V até o final da corrida eletroforética. Após três lavagens de 5 min com água

destilada, os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue (G250) (0.05 mg/ml de

Coomassie em água destilada + 0.15% de HCl 12 N) overnight sob agitação constante à

temperatura ambiente. Os géis foram descorados por sucessivas lavagens com água destilada

até que se eliminasse satisfatoriamente a coloração de fundo.

As bandas de interesse foram excisadas dos géis e posteriormente reduzidas,

alquiladas e digeridas com tripsina em um digestor automático (Genomics Solution ProGest

Protein Digestion Workstation) seguindo as intruções do fabricante (redução com 10 mM de

DTT, alquilação com 50 mM de iodoacetamida, digestão overnight com 0,25 µg de tripsina

por amostra em 25 mM de bicarbonato de amônio e 10% de acetonitrila). Os produtos da

17

digestão também foram secos em centrífuga a vácuo e posteriormente ressuspendidos em

0,1% de ácido fórmico para análise de LC-MS/MS.

3.3.3 – Espectrometria de Massas

Os peptídeos trípticos foram separados em uma coluna de ultra performance (nano-

Acquity LC® UPLC® com coluna BEH130 C18, 100 μm x 100 mm, 1.7 μm de tamanho de

partícula) acoplada a um sistema de espectrometria de massas de alta definição (Waters

SYNAPT G2). O fluxo da ultracromatografia foi setado para 0.6 μl/min nas seguintes

condições: isocraticamente 1% B, seguido por 1-12% B por 15 min, 40-85% B por 2 min,

utilizando as soluções 0,1% de ácido fórmico (solução A) e 0,1% de ácido fórmico em

acetonitrila (solução B).

Os íons de carga +2 ou +3 foram selecionados e submetidos a CID-MS/MS para

fragmentação e posterior elucidação da sequência. Os espectros adquiridos foram

interpretados manualmente ou utilizando a plataforma online MASCOT em

http://www.matrixscience.com (Mascot database search > Access Mascot Server > MS/MS

Ions Search) com busca na base de dados do SwissProt ou NCBI e taxonomia de busca dentro

do grupo “bony vertebrates”. Os parâmetros setados para a busca foram: ± 0,6 Da de

tolerância de massa; carbamidometilação dos resísuos de cisteína como modificação fixa;

oxidação da metionina como modificação variável. Os sequenciamentos de novo (manuais)

foram identificados submetendo as sequências encontradas à busca nos bancos de dados

disponíveis através do programa BLAST em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (Serpentes

taxid:8570).

3.3.4 – Quantificação da abundância relativa das toxinas

A obtenção de espectros provenientes de CID- MS/MS permite a identificação das

amostras analisadas a nível de família de proteínas. Uma vez identificadas, as toxinas podem

ter sua abundância relativa estimada no veneno a partir da soma das porcentagens das áreas

dos picos dos cromatogramas (Agilent ChemStation software), seguida pelo cálculo da

contribuição de cada banda dentro de cada fração por densitometria dos géis de poliacrilamida

(MetaMorph software, MDS Analytical Technologies) (Calvete, 2011). Se mais de uma

família de proteína for identificada em uma mesma banda, a quantificação é baseada na

intensidade dos picos no espectro de massas. Para cada grupo de toxina, extrai-se a média da

18

intensidade dos três picos mais intensos. As médias são somadas e o valor da soma é

normalizado para 100% e posteriormente dividido entre elas, dando um valor percentual para

cada grupo (Fig. 5).

3.4 – Antivenômica

Os ensaios de antivenômica foram realizados como descrito em Pla et al, 2012 com

algumas modificações. Seguem as etapas de preparo da coluna: 400 µL de matriz (NHS-

activated Sepharose 4 Fast Flow, Ge Healthcare) foram empacotados em um suporte de

coluna e lavados com 15 volumes de tampão frio 1 mM HCl. Para equilibrar a coluna para a

incubação com o antiveneno foram utilizados 2 volumes de tampão de acoplamento (0.2 M

Figura 5: Quantificação da abundância relativa das famílias de toxinas presentes no veneno total. Cálculo da porcentagem das áreas de cada pico do cromatograma (A). Cálculo da porcentagem que cada banda representa

dentro de cada pico (B). De acordo com a porcentagem de cada banda e de seu respectivo pico, cálculo da

porcentagem de cada banda em relação ao veneno total (C). Nos casos em que mais de uma família de proteína é

identificada em uma mesma banda, a quantificação é feita por Label-free MS, levando-se em consideração a

intensidade média dos três íons mais intensos de cada grupo (asteriscos). As médias de intensidade de cada

família são somadas (100%) e o valor total é dividido novamente entre elas. O valor percentual de cada família

de toxina é então dividido entre a porcentagem da banda (D).

18%

1

23 4

5+ + + + =100%

A1 A3 A4 A5A2

A

A4.1

A4.2

A4.3

densitometria A4.1 = 25%

A4.2 = 60%

A4.3 = 15%

B

A4.1

A4.2

A4.3

10,8% do proteoma total

C

D

m/z

Inte

nsi

dad

e

A4.2

**

*

**

*

PLA2

SVSP

No espectro:

55%

45%

No proteomatotal:

5,94%

4,86%

19

NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3). Foram incubados 51 mg de soro antibotrópico pentavalente

(SAB, Instituto Vital Brazil) dissolvidos em 300 µL do mesmo tampão de acoplamento,

overnight a 4ºC em um agitador orbital. O antiveneno não unido a matriz foi recuperado com

mais 2 volumes de matriz de tampão de acoplamento e quantificado por densitometria

(MetaMorph software, MDS Analytical Technologies) de SDS-PAGE, usando uma curva-

padrão construída por quantidades conhecidas do antiveneno pré-incubado. A estimativa da

quantidade da fração do SAB não unido a matriz foi feita pela subtração do valor inicial pelo

não unido, dando um rendimento de ~13 mg. Após o acoplamento, os grupos NHS-ativados

que não reagiram foram bloqueados com 400 μL de 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 a 4C, overnight

usando agitador orbital. Para remover os resíduos de moléculas não unidas, a coluna foi

lavada, alternando-se 6 vezes, 3 volumes de tampão ácido (0.1 M acetato de sódio, 0.5 M

NaCl, pH 4,0-5,0) e 3 volumes de tampão básico (0.1 M Tris-HCl, pH 8,5).

Para o preparo das colunas de controle, da mesma maneira descrita para o SAB, foram

acopladas IgGs séricas de cavalos não imunizados à matriz NHS-Sepharose (controle IgGs)

com um rendimento de ~8 mg. A coluna de controle de matriz foi feita pelo empacotamento

de 400 µL da matriz NHS-Sepharose, lavados com 15 volumes de tampão frio 1 mM HCl

seguidos diretamente pelo bloqueio dos grupos NHS-ativados não reagidos com 0.1 M Tris-

HCl, pH 8.5 a 4C, overnight. As colunas controles foram incubadas com os venenos nas

mesmas condições da coluna experimental (SAB) a fim de acompanhar a especificidade da

interação dos venenos com a coluna SAB.

As colunas foram equilibradas com 5 volumes de PBS antes da incubação com 300 μg

do veneno de Bothrops jararaca do sul ou sudeste em ½ volume de matriz (razão

veneno:antiveneno ~1:45, coluna SAB). Os venenos foram incubados por 3 hs à temperatura

ambiente em agitador orbital. A fração não retida na coluna foi recuperada com mais dois

volumes de PBS enquanto a fração retida foi eluída com 2,5 volumes de tampão 0.1 M

glicina-HCl, pH 2.0. As frações eluídas foram imediatamente neutralizadas com tampão 1 M

Tris-HCl, pH 9.0. A coluna foi armazenada em 20% de etanol e entre a incubação do veneno

de uma região e outra foi regenerada com 3 ciclos de lavagem entre tampão ácido e básico

como na etapa de montagem da coluna. As frações não retida e eluída foram concentradas em

centrífuga a vácuo (Savant) e injetadas com 40 µL por microinjetor automático no sistema de

gradiente de alta pressão Agilent LC 1100. O fracionamento ocorreu utilizando-se uma coluna

Dicovery® BIO WidePore C18 (15 cm x 2.1 mm, 3 μm particle size, 300 Å pore size) na

20

presença de 0,1% TFA em água (solução A) e 0,1% de TFA em acetonitrila (solução B) nas

seguintes condições de corrida: isocraticamente (5% B) por 1 min, seguido por 5-25% B por 5

min, 25-45% B por 35 min, e 45-70% por 5 min, com fluxo de 400 µL/min.

A antivenômica é um ensaio que tem como objetivo avaliar in vitro a imunorreativade

de um veneno e um antiveneno (soro antiofídico). De maneira geral, os anticorpos do

antiveneno são imobilizados para compor a coluna de imunoafinidade (e portanto essa coluna

pode ser reutilizada), onde posteriormente o veneno de interesse é carregado e incubado à fim

de que ocorram os possíveis reconhecimentos entre antígenos e anticorpos. O que não fica

retido na coluna, à princípio não foi reconhecido por nenhum anticorpo ou possui baixa

afinidade, e portanto corresponde a toxinas não neutralizadas eficientemente pelo antiveneno.

A fração eluída em pH ácido, por sua vez, corresponde às toxinas reconhecidas pelo

antiveneno. Ambas as frações, retida e não retida, passam por uma cromatografia de fase

reversa, o que assinala os picos reconhecidos ou não pelo antiveneno (Pla et al., 2012). Essa

metodologia apresenta diversas vantagens em relação às clássicas de imunorreatividade, como

Western Blot e ELISA, pois é possível não só a obtenção de um resultado qualitativo do tipo

“tudo-ou-nada” como alcançar dados quantitativos, além de eliminar os artefatos que podem

ocorrer utilizando-se as outras técnicas.

A B C

Figura 6: Etapas da incubação do veneno e a coluna de imunoafinidade: o veneno bruto é

incubado com a coluna (A); os componentes não retidos na coluna são lavados e recuperados (B); os componentes imunocapturados pela coluna são eluídos em pH ácido (C). Todas as frações e o

veneno bruto contendo a mesma quantidade inicial incubada são analisados por cromatografia de

fase reversa.

21

3.5 – Western Blot

As frações cromatográficas dos venenos (BjS e BjSE) provenientes de RP-HPLC

foram submetidas a SDS-PAGE 15% em condições redutoras como descrito para venômica.

As proteínas dos géis foram transferidas para membranas Hybond-P PVDF (GE-Healthcare)

no sistema Bio-Rad Semy-Dry mini-transfer cell, com 200 mA durante 90 min (tampão de

transferência 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 20% de etanol, 0.1% SDS, pH 8.3). As

membranas foram incubadas com 5% de leite desnatado em PBS overnight a 4ºC para

bloquear sítios reativos inespecíficos. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com o

soro antibotrópico (SAB, Instituto Vital Brazil) por 1h 30 min à temperatura ambiente em

agitador orbital.

Foi utilizada uma diluição 1:1500 (v/v) a partir de uma solução estoque de

concentração 28 mg/mL. Terminado o período de incubação, foram feitas 3 lavagens de 5 min

com PBS-Tween (20 mM fosfato, 135 mM NaCl, pH 7.3 + 0.1% Tween-20) para eliminar os

anticorpos não ligados a membrana. Seguindo a lavagem, as membranas foram incubadas

com os anticorpos secundários IgGs anti-horse conjugados a peroxidase (Sigma) numa

diluição 1:5000 (v/v). Após 1h 30min de incubação e 4 ciclos de lavagem as membranas

foram reveladas utilizando o reagente de detecção ECL Prime (Amersham) e as imagens do

sinal de quimiluminescência foram adquiridas em um Image Quant LAS 4000 mini (GE

Healthcare).

3.6 – Dot Blot

Os ensaios de dot blot foram realizados em colaboração com outro projeto do nosso

grupo, através da aluna de mestrado Eleonora Brazil-Más, do programa de pós-graduação do

IBqM-UFRJ e do Instituto Vital Brazil. No dot blot os venenos de B. jararacussu, B. jararaca

do sul, B. jararaca do Sudeste e a bothropstoxina-I (purificada de jararacuçu) foram diluídos

em PBS e aplicados diretamente na membrana de nitrocelulose (1 µg). Após bloqueios e

lavagens as membranas foram incubadas com anticorpos monoclonais (clones 1, 3 e 11) anti-

BthTX-I produzidos a partir de hibridomas em camundongos na concentração de 3 µg/ml.

Como controle positivo foi utilizado o soro policlonal produzido em cavalo a partir da

imunização com veneno total de B.jararacussu (diluição de 1:1000). Após 2 horas sob

agitação constante à temperatura de 37°C e sucessivas lavagens, as membranas foram

22

incubadas nas mesmas condições por mais 2 horas com anticorpo secundário marcado com

peroxidase na diluição de 1:500 antimouse (para os monoclonais) e 1:1000 antihorse (para o

policlonal) . A Revelação foi feita com o kit HRP da Bio Rad (colorimétrica) e visualizada a

olho nu.

23

4 – RESULTADOS

4.1 – Perfis cromatográficos dos pools

A cromatografia utilizada para caracterização e separação dos venenos foi a de fase

reversa (RP-HPLC). Os perfis cromatográfico dos pools representativos das regiões Sul (BjS)

e Sudeste (BjSE) do Brasil se demonstraram distintos entre si (Figura 7). Variações

quantitativas e qualitativas podem ser observadas em algumas regiões do cromatograma,

como por exemplo, a região compreendida entre os picos 18-28 BjS e 18-28 BjSE. Alguns

picos podem ser considerados por uma primeira análise visual como correspondentes, como

são os casos do pico 16 BjS e 15 BjSE e os picos 17 BjS e BjSE entre si.

A particularidade que merece ser destacada e que se revela como diferença marcante

entre as populações é a presença do pico 15 BjS, que sozinho representa uma porcentagem de

aproximadamente 13,8% do veneno total da região sul (ver quantificação em metodologia) e

que é inexistente na região sudeste. As características marcantes da região sudeste, por sua

vez, são evidenciadas pelos picos BjSE 33 e 36, que somados correspondem a

aproximadamente 27,7% do veneno total.

24

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 13 14

15

16

17

20

19

22

21

23

1824

25

28

26

29

27

30

32

31

33

36

37

38

34

35

39

A

BjS

Figura 7: Cromatogramas das populações de Bothrops jararaca provenientes do Sul (A) e do Sudeste (B) do Brasil

utilizando-se cromatografia de fase reversa.

25

9

13

4

13

14 15 16

12

18

17

2

2221

19

20

27

24

23

26

2528

30

29

31

32

33

34

36

7

8

10

65

11

37

35

38

39

BBjSE

Figura 8: Cromatogramas das populações de Bothrops jararaca provenientes do Sul (A) e do Sudeste (B) do Brasil

utilizando-se cromatografia de fase reversa (CONTINUAÇÃO).

26

4.2 – Perfis eletroforéticos dos picos cromatográficos

Cada pico proveniente da coluna de fase-reversa foi manualmente coletado, seco

e ressuspendido em H2O Mili-Q. Cada fração foi então submetida a SDS-PAGE 15%

em condições reduzidas e não-reduzidas (Figura 8). As frações que não aparecem nos

géis são aquelas que não apresentaram cadeias polipeptídicas de massa molecular

suficiente para serem retidas no gel ou que não se coram com o Coomassie Brilliant

Blue G250, constituindo frações peptídicas.

Como resultado da quantificação e identificações, as bandas que constituem as

proteínas majoritárias do veneno do sul são: 16 kDa do gel reduzido, do pico 15 (13%

do veneno total, Lys-49 PLA2); 17 kDa do gel reduzido, pico 27 (5,7% do veneno total,

D-49 PLA2); e as bandas 26 e 23 kDa do gel não reduzido, pico 28 (juntas constituem

7,3% do veneno total, SVSP) (Tabela 2). Por outro lado, na região sudeste as proteínas

majoritárias são: a de 11 kDa, do gel reduzido, pico 11 (5,16% do veneno total,

desintegrina); 25 kDa do gel não reduzido, pico 33 (8,4% do veneno total, SVMP-I); e a

banda de 46 kDa do gel não reduzido, pico 36 (11,4% do veneno total, SVMP-III)

(Tabela 3). Cada pico da fase reversa é composto por várias proteínas, o que é

evidenciado pela eletroforese e confirma mais uma vez a divergência que existe entre as

populações.

4.3 – Cromatogramas Individuais

Ao longo do desenvolvimento desse trabalho, surgiu o questionamento sobre a

validação dos pools de cada população e perguntava-se: as diferenças observadas são de

fato uma característica populacional ou algumas variações em alguns indivíduos podem

se sobrepor ao perfil do pool? Para responder a essa pergunta, analisamos os

cromatogramas de 22 indivíduos de cada região a fim de validar os pools como

representativos de cada população. Todos os indivíduos demonstraram um mesmo perfil

cromatográfico de acordo com sua origem geográfica, apresentando apenas pequenas

variações individuais. O perfil se reproduz em todos os representantes da mesma região

e se reflete no padrão do pool correspondente, o que pode ser observado na figura 9,

onde estão representados cinco cromatogramas de cada população e seu respectivo pool.

É interessante destacar que todos os indivíduos da população do sul possuem o pico BjS

27

15, ainda que o mesmo varie um pouco em sua quantidade relativa em alguns

indivíduos.

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

21.5

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

21.5

3.52.5

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

21.5

3.52.5

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

21.5

S 1412 1613 15 17 18 19 20 216 225 23 24 25

S 1412 1613 15 17 18 19 20 216 225 23 24 25

S 3028 3229 31 33 34 35 3627 3726 38 39

S 3028 3229 31 33 34 35 3627 3726 38 39

200 200

200 200

A

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

3.5

21.5

55.4

116.3

36.5

66.397.4

14.4

6.0

3.5

21.5

31

55.4

116.3

36.5

66.397.4

31

14.4

6.0

3.5

21.5

55.4

116.3

36.5

66.397.4

14.4

6.0

21.5

31

S 1513 1714 16 18 19 20 2110 225 23 24S 6 11 25

S 1513 1714 16 18 19 20 2110 225 23 24S 6 11 25

S 2826 3127 30 32 33 34 35 36 37 38 39

S 2826 3127 30 32 33 34 35 36 37 38 39

200 200

200200

B

Figura 9: Eletroforese das frações provenientes da fase reversa (RP-HPLC). SDS-PAGE 15% em

condições reduzidas (acima) e não reduzidas (abaixo) dos picos provenientes da cromatografia de fase reversa

das populações do sul (A) e sudeste (B). O lane S corresponde ao padrão de peso molecular e às massas à

esquerda estão representadas em kDa. As setas indicam as bandas majoritárias de cada veneno, excisadas,

digeridas e identificadas por espectrometria de massas.

28

Tabela 2: Identificações dos peptídeos trípticos das proteínas majoritárias da população de B.

jararaca da região sul. ▼ – gel reduzido ; ■ – gel não reduzido. Score = Protein score. Derivado dos

scores individuais dos íons (-10*Log(P), onde P é a probabilidade da identificação observada ser um

evento randômico) como uma base não probabilística para ranquear a lista de proteínas. Mox = Metionina

oxidada.

Pico banda m/z z Sequências Score Identificação

15 28 ▼ 673,4 2 MoxILQETGKNPAK 287 B. jararacussu Q90249

767,3 2 SYGAYGCNCGVLGR PLA2

824,4 2 DKTIVCGENNPCLK

868,9 2 ELCECDKAVAICLR

533,8 2 ENLGTYNKK

546,8 2 YHLKPFCK

16 ▼ 665,3 2 MILQETGKNPAK 523 B. jararacussu Q90249

673,4 2 MoxILQETGKNPAK PLA2

767,3 2 SYGAYGCNCGVLGR

538,8 2 YSYSWKDK

824,4 2 DKTIVCGENNPCLK

868,9 2 ELCECDKAVAICLR

533,8 2 ENLGTYNKK

610,8 2 YHLKPFCKK

9 ▼ 665,4 2 MILQETGKNPAK 244 B. jararacussu Q90249

673,3 2 MoxILQETGKNPAK PLA2

767,3 2 SYGAYGCNCGVLGR

702,8 2 TIVCGENNPCLK

401,7 2 AVAICLR

27 17 ▼ 753,3 2 CCFVHDCCYGK 245 B. jararaca P81243

959,4 3 TDSYTYTYSEENGDVVCGGDDLCKK D-49 PLA2

595,9 3 QICECDRVAATCFR

812,4 2 DTYDTKYWLYGAK

576,7 2 NCQEESEPC

28 26 ■ 511,8 2 LGVHSIKIR 291 B. jararaca P81824

532,3 2 EKFICPNR SVSP

416,7 2 KDDVLDK

611,6 3 ISSTKETYPDVPHCAK

785,1 3 AAYTWWPATSTTLCAGILQGGK

1043,8 3 DTCEGDSGGPLICNGLQGIVSGGGNPCGQPR

410,7 2 KPALYTK

964,1 3 LDSPVSDSEHIAPLSLPSSPPSVGSVCR 64 B. jararaca Q5W959

640,3 2 AAYPELPAEYR SVSP

23 ■ 532,3 2 EKFICPNR 169 B. jararaca P81824

658,8 2 ETYPDVPHCAK SVSP

605,8 2 INILDHAVCR

785,1 3 AAYTWWPATSTTLCAGILQGGK

1043,8 3 DTCEGDSGGPLICNGLQGIVSGGGNPCGQPR

410,7 2 KPALYTK

29

Tabela 3: Identificações dos peptídeos trípticos das proteínas majoritárias da população de B.

jararaca da região sudeste. ▼ – gel reduzido ; ■ – gel não reduzido. Score = Protein score. Derivado

dos scores individuais dos íons (-10*Log(P), onde P é a probabilidade da identificação observada ser um

evento randômico) como uma base não probabilística para ranquear a lista de proteínas. Mox = Metionina oxidada.

Pico banda m/z z Sequências Score Identificação

11 11 ▼ 684,3 3 LRPGAQCAEGLCCDQCR 323 B. jararaca Q0NZX5

433,9 3 FMoxKEGTVCRR Desintegrina

904,7 3 ARGDDMoxDDYCNGISAGCPRNPFHA

829,0 3 GDDMoxDDYCNGISAGCPRNPFHA

33 25 ■ 625,3 3 YIELFLVVDHGMoxFMoxK 294 B. jararaca Q98SP2

533,8 2 YNGNSDKIR SVMP

494,3 2 KTDLLNRK

1028,9 3 RSTAVIEDHSETDLLVAVTMAHELGHNLGIR

913,7 3 HDTGSCSCGGYSCIMAPVISHDIAK

551,3 2 DNPQCILNK

36 46 ■ 915,0 2 YVELFIVVDQEMoxVTK 475 B. insularis Q8QG88

508,8 2 NNGDLDKIK SVMP P-III

797,4 2 MoxYELANIVNEILR

732,7 3 YLYMHAALVGLEIWSNGDK

1077,6 2 ITVKPDVDYTLNSFAEWR

423,7 2 KTDLLTR

590,5 3 SGSQCGHGDCCEQCK

526,7 2 GNYYGYCR

578,8 2 KIPCAPEDVK

615,8 2 DNSPGQNNPCK

776,8 2 VCSNGHCVDVATAY

508,8 2 NNGDLDKIK 293 B. jararaca P30431

806,4 2 MYELANIVNEIFR SVMP P-III

1077,6 2 ITVKPDVDYTLNSFAEWR

423,7 2 KTDLLTR

590,5 3 SGSQCGHGDCCEQCK

526,7 2 GNYYGYCR

578,8 2 KIPCAPEDVK

615,8 2 DNSPGQNNPCK

776,8 2 VCSNGHCVDVATAY

30

A.1

A.2

A.3 A.6

A.5

A.4A

Figura 10: Cromatogramas individuais de representantes do sul (A) e sudeste (B): A.1 – A.5 e B.1 – B.5, representantes individuais. A.6 e B.6, pool

representativo de cada população.

31

B.1

B.2

B.3 B.6

B.5

B.4B

Figura 11: Cromatogramas individuais de representantes do sul (A) e sudeste (B): A.1 – A.5 e B.1 – B.5, representantes individuais. A.6 e B.6, pool

representativo de cada população (CONTINUAÇÃO).

32

4.4 – Lys49-PLA2

Para elucidação da identidade do pico cromatográfico diferencial 15 BjS, as

bandas provenientes de SDS-PAGE (15%, reduzido) do lane correspondente foram

excisadas, digeridas com tripsina e posteriormente analisadas por CID-MS/MS. Os

espectros gerados pela análise dos peptídeos trípticos foram submetidos à plataforma

MASCOT (ver metodologia). Os peptídeos trípticos de todas as três bandas digeridas no

gel reduzido foram identificadas para mesma proteína, a bothropstoxina-I (BthTX-I),

uma Lys49-PLA2 do veneno de Bothrops jararacussu. A BthTX-I é um homodímero

em solução em pH neutro (Ruller et al., 2005), o que pode ser observado comparando

os géis reduzidos e não reduzidos, nos quais a forma dimérica é predominante no gel

não reduzido e a forma monomérica prevalece no gel reduzido com β-mercaptoetanol.

A banda de aproximadamente 9 kDa no gel reduzido provavelmente provém de uma

degradação em decorrência do processo de redução. O mesmo pico sem sofrer nenhum

tipo de tratamento foi submetido à análise por espectrometria de massas, a fim de ter sua

massa total estimada. A massa experimental média encontrada foi de 13715 Da,

utilizando-se um QTrap™ 2000 (Applied Biosystems) acoplado a uma fonte de

nanospray (Protana, Denmark). Essa massa praticamente coincide com a massa teórica

da BthTX-I de B. jararacussu (13713 Da), sugerindo fortemente 100% de identidade

entre as duas toxinas, ou pelo menos extrema homologia entre elas.

Para confirmar a identidade e presença exclusiva da BthTX-I na população do

Sul, foram realizados ensaios de dot blot em colaboração com outro projeto do nosso

grupo, através da aluna de mestrado Eleonora Brazil-Más, do programa de pós-

graduação do IBqM-UFRJ e do Instituto Vital Brazil. Os anticorpos monoclonais já

haviam sido previamente caracterizados, sendo os clones 1 e 3 específicos para BthTX-I

de B. jararacussu, enquanto o 11 possui reatividade cruzada com veneno de B. jararaca.

Os resultados de dot blot confirmaram mais uma vez que a BthTX-I somente está

presente no pool de B. jararaca do sul (Figura 10).

33

4.5 – Antivenômica e Western Blot

Tendo em vista o protocolo da antivenômica, a fração recuperada após a

incubação do veneno com a coluna de imunoafinidade corresponde ao que não foi

reconhecido pelos anticorpos unidos à matriz (não retido). O que fica retido é o que

permaneceu unido aos anticorpos e essa união antígeno-anticorpo é posteriormente

desfeita em pH ácido (eluído). Os resultados da antivenômica mostraram que a

imunorreatividade do soro pentavalente antibotrópico (SAB) do IVB é similar frente às

duas populações (Figura 11). Nos dois pools de veneno apenas as regiões das frações de

baixo peso molecular não são reconhecidas pelo antiveneno de forma eficiente. A

diferença encontrada nessa região de baixo peso corresponde aos picos 10 e 11 da

região sudeste (diferenciais em relação à região sul), que são consideravelmente

reconhecidos pelo antiveneno. Esse reconhecimento pode ser confirmado pelo Western

Blot (figura 12), no qual as bandas desses picos previamente visualizadas por

eletroforese são evidenciadas.

Bothropstoxina-I

Najussu clone 1 clone 3 clone 11

B. jararacussu (pool)

Najussu clone 1 clone 3 clone 11

B. jararaca Sudeste (pool)

Najussu clone 1 clone 3 clone 11

B. jararaca Sul (pool)

Najussu clone 1 clone 3 clone 11

Figura 12: Dot blot da BthTX-I e dos venenos de B. jararaca e B.jararacussu frente a

anticorpos anti-BthTX-I. Anticorpos monoclonais específicos para BthTX-I de B. jararacussu

(clone 1 e 3) e de reatividade cruzada com veneno de B. jararaca (clone 11). Najussu, anticorpos

policlonais frente ao veneno total de B. jararacussu .

34

O Western Blot, nessa abordagem metodológica, é uma técnica qualitativa e,

portanto, não é possível afirmar que uma banda foi mais reconhecida do que a outra

entre diferentes picos. Essa comparação não pode ser feita por motivos inerentes a

sequência metodológica. Por exemplo, no sentido de concentrar picos menores, a

quantidade de proteína de cada lane não é padronizada e além disso a transferência das

proteínas dos géis para a membrana não ocorre de maneira homogênea para proteínas de

diferentes massas moleculares. Portanto, poucas afirmativas nesse sentido podem ser

feitas e a técnica complementa de forma qualitativa a antivenômica. O que se conclui é

que todas as proteínas majoritárias de ambos os venenos são reconhecidas e de maneira

geral os venenos são reconhecidos pelo soro antibotróbico.

Na região sul, o pico diferencial BjS 15 foi fortemente reconhecido. As demais

proteínas majoritárias, dos picos 27 BjS e 28 BjS também foram reconhecidas, embora

as bandas do pico 28 BjS (identificadas anteriormente no gel não reduzido, com 23 e 26

kDa, como SVSP) pareçam ser reconhecidas com menor intensidade. Por outro lado, as

bandas dos picos 36 ao 39 BjS que estão na mesma altura dessas majoritárias do pico 28

BjS apresentaram forte reconhecimento em relação não só às proteínas majoritárias,

como também a proteínas mais abundantes dentro dos próprios picos. Alguns picos

parecem ter sido menos reconhecidos, como é o caso dos picos 12, 14, 18, 25+26 e 33

BjS. Na região sudeste, como mencionado, todas as proteínas majoritárias foram

reconhecidas. Nos picos 35, 38 e 39 BjSE proteínas não majoritárias obtiveram forte

reconhecimento. O pico 18 BjSE não obteve nenhum reconhecimento aparente.

Na antivenômica, após o veneno passar pela coluna a região final do

cromatograma, que corresponde às proteínas de maior peso molecular e/ou mais

hidrofóbicas, pode perder-se. Isso ocorre por diversos motivos, dentre os quais estão a

degradação do veneno que ocorre em B. jararaca (Sousa et al., 2001) e a ligação

inespecífica desses elementos à matriz Sepharose (Pla et al., 2012). Essas ligações

inespecíficas que são inerentes à metodologia ocorrem em baixa porcentagem e foram

monitoradas através dos controles de coluna de matriz e IgGs séricas de equinos não

imunizados. De todas as formas, apesar dos picos da região final não serem bem

observados na antivênomica do sul (Figura 11, A), o blot confirma que essa região é

bem reconhecida.

35

Não retido

Eluído

Veneno Total

A

Não retido

Eluído

Veneno Total

B

Figura 11: Antivenômica do soro antibotrópico pentavalente (SAB) do IVB frente aos venenos de

B. jararaca do sul (A) e sudeste (B).

36

4.5.1 – Degradação na Antivenômica

Como mencionado, o veneno de B. jararaca, sobretudo o do sudeste, sofre um

alto grau de degradação e autoproteólise quando incubado a pH 8.5 (Sousa et al., 2001).

Nos ensaios de antivenômica também foi observada essa degradação, motivo pelo qual

não foi possível realizar as quantificações permitidas pela segunda geração da

antivenômica. Em detrimento da degradação, os picos perdem resolução e outros “picos

fantasmas” aparecem. Vários testes foram realizados a fim de se reduzir esse fenômeno

e compreendê-lo melhor, como por exemplo, o uso de inibidores das principais

proteases do veneno (SVMP e SVSP). Contudo, a presença dos inibidores gerou ruídos

intensos nos cromatogramas, sendo incompatível com o uso da técnica. Para

exemplificar que a degradação de fato ocorre por uma característica intrínseca do

veneno, e não em decorrência da metodologia, o veneno de B. jararaca do sudeste foi

ressupendido no tampão da antivenômica (PBS, pH 7.4) e a partir dessa mesma alíquota,

200 µg de veneno foram separados em um microtubo, enquanto o estoque foi

imediatamente congelado. Os 200 µg ficaram em agitação rotatória em microtubo (sem

passar por colunas) durante 2 horas à temperatura ambiente, simulando os ensaios de

16

36

50

64

1513 1714 16 18 19 20 2110 225 6 11

16

36

50

64

23 24 25 2826 3127 30 32 33 34 35 36 37

36.5

55.4

21.5

66.3

31

38 39

6

16

22

36

50

64

98148

1412 1613 15 17 18 20 216 225 23 24

6

16

22

36

50

6498148

25+26 3028 3229 31 33 34 35 3627 37 38 39

A

B

Figura 12: Western Blot dos venenos de B. jararaca do sul (A) e do sudeste (B) frente ao soro

antibotrópico pentavalente (SAB) do IVB. Setas pretas, bandas majoritárias reconhecidas. Setas

vermelhas, picos com reconhecimento menos evidenciados. Astericos, bandas não majoritárias com forte

reconhecimento.

* * * *

* * *

37

antivenômica. Após o período de incubação, uma amostra de 200 µg foi extraída do

veneno congelado, e juntamente com a incubada foram submetidas à fase reversa como

descrito para antivenômica (figura 13).

Figura 13: Autodegradação do veneno de B. jararaca do sudeste. Sobreposição dos cromatogramas:

em vermelho, o perfil cromatográfico do veneno (congelado); em azul, o perfil cromatográfico do veneno autodegradado (incubado).

5 - DISCUSSÃO

5.1 – Perfis dos venenos das populações (pools)

Neste trabalho, caracterizamos parcialmente os venenos de B. jararaca de

espécies provenientes de duas regiões distintas do Brasil. Desta forma pudemos

observar uma grande divergência entre os proteomas dos venenos das populações de

serpentes B. jararaca do sul e do sudeste, evidenciada pelos cromatogramas que

apresentam perfis bem distintos e confirmada pela comparação da mobilidade

eletroforética das frações. As diferenças observadas são significativas e mais

importantes que diferenças elucidadas na variabilidade em venenos de Bothrops

jararaca já descritas na literatura (Menezes et al., 2006; Dias et al., 2013). No entanto,

esse achado vem ao encontro do trabalho de Grazziotin e colaboradores (2006), que

através do estudo do DNAmt de uma vasta amostragem de indivíduos provenientes de

ambas regiões demonstrou com alto suporte estatístico uma notável variabilidade

genética na espécie, que a divide em clados que coincidem com sua distribuição

geográfica. Em outro estudo de Dias e colaboradores (2013), no qual foram avaliadas as

38

diferenças individuais entre representantes juvenis de B. jararaca, foi feita uma análise

multivariada na qual a origem geográfica foi omitida da análise a fim de clusterizar os

indivíduos de acordo com os ensaios de atividades enzimáticas e concentração de

proteína. Ainda que os resultados não tenham sido muito conclusivos (amostra pequena,

indivíduos provenientes da mesma ninhada etc) os representantes provenientes do

estado de Santa Catarina (SC) formaram um clado próprio e os autores evidenciaram a

necessidade de estudos com maior amostragem de venenos das diferentes populações no

sentido de confirmar se as diferenças populacionais existem. Esta é a primeira vez que

um estudo proteômico do veneno de B. jararaca é feito com um pool representativo dos

extremos da distribuição geográfica da espécie e os resultados do perfil de cada um

apontam a existência de duas populações bem distintas no território da Floresta

Atlântica, fato que até então era desconhecido e que ganhou evidência pela primeira

contribuição dada a partir do trabalho de Grazziotin e col.

O gênero Bothrops é o gênero de maior sucesso evolutivo na América do Sul,

tendo colonizado e se espalhado por todo o continente de maneira ampla e eficiente. Tal

sucesso se deve a bem sucedida adaptação aos diferentes tipos de habitats e presas do

vasto território em que o gênero se distribui. (Martins et al., 2001). Nesse contexto, a

espécie B. jararaca é um exemplo central, já que pode ser encontrada em diversos

habitats, adaptando-se aos mais distintos ambientes e condições (Sazima, 1992). O

veneno de jararaca já é conhecido por sua diversidade de toxinas. Os perfis

cromatográficos dos venenos provenientes das duas regiões mostram que de fato a

complexidade dos mesmos é notável, o que pode ser observado pela diversidade de

proteínas encontradas em cada pico cromatográfico. É bem provável que a variedade no

arsenal de toxinas que a espécie possui, a tenha ajudado a colonizar um território tão

amplo. Além da diversidade de toxinas presente em cada pool de veneno, a variedade

“extra” que aparece na existência de uma segunda população bem distinta aumenta

ainda mais o espectro de possibilidades do veneno e reforça esse quadro da ampla

distribuição geográfica. A alta conservação dos venenos individuais da região sul e a

presença de um pico marcadamente diferencial e conservado nessa população (pico 15

BjS) sugere uma pressão evolutiva em relação a essa “nova variante” que permitiu a

irradiação da espécie para a região sul.

A mudança ontogenética que ocorre em B. jararaca é bastante evidente e

acompanha a mudança da dieta da espécie, que muda a dieta preferencial baseada em

presas ectotérmicas para presas endotérmicas (Sazima, 1992). Ela é caracterizada pela

39

mudança de um veneno rico em metaloproteinases do tipo P-III com alta atividade

coagulante nos invíduos neonatos para um veneno rico em metaproteinases do tipo P-I e

mais hemorrágico nos adultos (Zelanis et al., 2010; Antunes et al., 2010). A atividade

hemorrágica do veneno de jararaca está vinculada a presença de metaloproteinases do

tipo P-III. Esse fato contraditório que ocorre com a espécie, no qual o veneno dos

neonatos seria mais rico em P-III e menos hemorrágico é explicado por Antunes e

colaboradores (2010) pela falta da presença da jararhagina ou bothropasina, SVMP-PIII

de atividades hemorrágicas. As SVMP-III do veneno dos neonatos são mais pró-

coagulantes, o que fica demonstrado nesse mesmo trabalho ao se inibir essa atividade

com EDTA e EGTA, inibidores de metaloproteinases. Essa postulação da mudança no

perfil das metaloproteinases foi feita comparando-se a região das P-III e P-I em géis

bidimensionais de ambas faixas etárias. No entanto, por essa abordagem é difícil

quantificar de maneira minuciosa os valores absolutos de cada família de toxinas em

cada veneno. Pela metodologia de quantificação apresentada neste trabalho é possível

estimar de maneira mais real a quantidade relativa das toxinas. Assim foi possível

mostrar que a proteína majoritária do veneno de B. jararaca do sudeste, veneno que

corresponde ao padrão conhecido para espécie e com o qual a maioria dos estudos foi

realizada, é uma SVMP-P-III. Deste modo, os resultados aqui descritos mostram que

apesar de o veneno de adulto comparativamente ao veneno de neonato contenha mais P-

I, a proporção dentro do veneno de adulto de forma absoluta continue sendo de maioria

do tipo P-III. Para tal esclarecimento ainda é necessário identificar todo o proteoma

seguido das respectivas quantificações. Num primeiro momento caracterizamos

somente as proteínas mais importantes dos cromatogramas, num futuro próximo

pretendemos realizar toda a caracterização proteômica e especialmente comparar com

resultados de transcriptômica obtidos no laboratório. Este passo será importante para o

estudo de novas moléculas expressas nos venenos dos indivíduos da região sul.

5.2 – Perfis cromatográficos dos venenos individuais

Para validar a representatividade dos pools que constituem cada população do

estudo foram avaliados os cromatogramas individuais de representantes de cada região.

Variações intraespecíficas em venenos de serpente são bem descritas na literatura e

estão associadas à dieta, sexo, idade e distribuição geográfica das espécies. O veneno de

40

Bothrops jararaca possui uma alta variabilidade individual, o que tem sido vastamente

demonstrado em diversos estudos (Menezes et al., 2006; Pimenta et al., 2007; Dias et

al., 2013). Além das diferenças ontogenéticas, que dizem respeito à idade e que estão

presentes em muitas espécies de serpentes, a espécie Bothrops jararaca apresenta grande

variabilidade individual que pode estar relacionada às variantes já citadas, mas que de

acordo com um estudo recente parecem ser independentes de fatores ambientais,

sugerindo uma herança genética que se faz presente desde os primeiros estágios de vida

dos animais (Dias et al., 2013). Isso foi demonstrado por diferenças encontradas no

perfil proteômico e em vários ensaios de atividades biológicas de indivíduos de mesma

faixa de idade, nascidos ou não de uma mesma ninhada e mantidos sob às mesmas

condições controladas de laboratório (Dias et al., 2013). Portanto, ao avaliar os

cromatogramas individuais dos espécimes do presente estudo, era esperado encontrar

pequenas variações, que são características da espécie. Os cromatogramas apresentaram

um perfil que constitui um padrão que se reproduz em todos os indivíduos da mesma

população e que se reflete no padrão do pool correspondente. Os representantes da

região sul apresentam um maior grau de conservação, enquanto os do sudeste

apresentam maior variabilidade nos seus perfis, ainda que o padrão não seja perdido. De

todas as formas, essa variabilidade provém, sobretudo, de indivíduos machos, o que

condiz com estudos prévios que demonstram uma maior diversidade nos venenos desse

sexo (Menezes et al., 2006). Essa característica corrobora também com o trabalho de

Grazziotin e col. que através das análises estatísticas baseadas nas sequencias do gene

cyt b encontrou 14 haplótipos (com diversidade nucleotídica de ~0,007) na população

do sul e 31 haplótipos na do sudeste (com diversidade nucleotídica de ~0,01),

mostrando que também por esse aspecto a população do sudeste é mais variável do que

a do sul. Desse modo, o pool constituído foi validado como representativo de cada

população.

5.3 – Bothropstoxina-I

A bothropstoxina-I (BthTX-I) é uma Lys49-PLA2 básica isolada primeiramente

no veneno de Bothrops jararacussu. As Lys49-PLA2 são miotoxinas amplamente

conservadas e distribuídas nos venenos de serpente. A substituição do Asp49 por uma

Lys49 no sítio catalítico, entre outras mutações, interfere na ligação ao Ca2+

promovendo a perda da atividade catalítica fosfolipásica clássica da toxina. A alta

41

atividade miotóxica se dá por um mecanismo independente de Ca2+

de dano a

membranas fosfolipídicas que possui uma estreita influência estrutural do loop C-

terminal e da conformação homodimérica flexível que a PLA2 possui. (Fernandes et al.,

2010; Ruller et al., 2005) No veneno de B. jararacussu a BthTX-I constitui cerca de

15% do veneno total (Homsi-Brandeburgo et al., 1988), o que se reflete na

sintomatologia marcada por extensa mionecrose e edematogenicidade decorrente do

envenenamento por essa espécie . Curiosamente essa abundância relativa é similar à

encontrada no pool de veneno de B. jararaca da região sul (~13,8%) como descrito

nesse trabalho. É a primeira vez que a uma Lys49-PLA2 é descrita no veneno de B.

jararaca. Em um trabalho no qual foi realizada cromatografia de troca catiônica a fim

de purificar miotoxinas básicas de oito venenos do gênero Bothrops, nenhuma molécula

com esse perfil foi encontrada no veneno de B. jararaca (Andrião-Escarso et al., 2000).

Enquanto o veneno de B. jararacussu é miotóxico e hemorrágico, o veneno de B.

jararaca conhecido até hoje é fundamentalmente hemorrágico, no qual a mionecrose

ocorre prevalentemente de maneira secundária a partir de eventos hemorrágicos

intramusculares derivados da ação de metaloproteinases (Teixeira et al., 2005). De que

maneira a vítima envenenada por B. jararaca na região sul evolui sintomaticamente

permanece carente de informações. Muitas vezes o diagnóstico preciso da espécie que

causou o envenenamento é difícil e o tratamento de escolha é baseado na sintomatologia

do paciente que classifica o acidente de maneira geral como botrópico, crotálico,

laquético e elapídico (FUNASA-MS, 2001). Nesse contexto, o envenenamento por B.

jararaca e B. jararacussu na região sul não devem ser bem diferenciados e

possivelmente até confundidos.

A distribuição geográfica de B. jararacussu coincide em sua maioria com a de B.

jararaca. Ainda que especificamente no estado do Rio Grande do Sul a espécie esteja

ameaçada de extinção (Livro vermelho da fauna brasileira ameaçada de extinção, 2008)

a jararaca e a jararacuçu são simpátricas nesse e em outros estados. As Lys49-PLA2 de

venenos de espécies do gênero Bothrops possuem alta homologia ainda que não sejam

totalmente idênticas. Através do acesso aos dados de dois transcriptomas, um de

jararaca do sudeste e outro do sul, adquirido pelo nosso grupo (dados em análise para

publicação) foi possível extrair a sequencia da “Bothropstoxina” da jararaca do sul. De

fato a sequencia do transcriptoma é 100% idêntica à sequencia já descrita da BthTX-I,

incluindo a região do peptídeo sinal, reafirmando os demais dados obtidos para

identificação dessa toxina. No alinhamento de algumas sequências maduras mais

42

próximas à BthTX-I (figura 13) é possível observar a alta homologia entre elas. O que

chama atenção é o fato das espécies B. jararaca e B. jararacussu pertencerem a grupos

filogenéticos distintos e ainda sim apresentarem identidade de 100% na toxina,

enquanto há variabilidade na sequencia da BthTX-I em relação a toxinas homólogas de

espécies filogeneticamente mais próximas da B. jararacussu como é o caso da B. brazili.

Da mesma maneira, as Lys49-PLA2 de B. n. pauloensis (BnSP-6 e BnSP-7) são as mais

homólogas depois da BjS, apresentando apenas uma substituição de aminoácido ao

contrário das sequências mais divergentes de B. asper, B. moojeni e B. atrox que

pertencem ao clado da B. jararacussu (Fenwick et al., 2009).

No trabalho mais completo sobre a biologia e ecologia de B. jararaca, Sazima

(1992), com base na literatura relata casos possíveis de ocorrência natural de indivíduos

híbridos entre B. jararaca e as espécies B. cotiara, B. neuwiedi e B. jararacussu, sendo

que a hibridação com B. jararacussu seria a mais provável de acontecer na natureza.

Essas observações foram feitas com base em características morfológicas, de padrão

eletroforético de proteínas plasmáticas e organização nucleolar. O autor também

menciona que um possível híbrido foi capaz de se reproduzir. Antigamente a hibridação

e a introgressão gênica eram vistas como eventos raros no meio animal que quando

ocorridos geravam descendentes inférteis. Contudo se tem demonstrado que o fluxo

gênico, a introgressão e a hibridação são uma realidade e participam ativamente da

história evolutiva das espécies. A hibridação pode gerar descendentes férteis, que por

sua vez podem se reproduzir com uma das espécies parentais ou com outros híbridos,

proporcionando o surgimento de diferentes populações e até mesmo de novas espécies

(especiação) (Trigo, 2008; Harrison & Larson, 2014). Todos esses processos dependem

de fatores como: mudanças ambientais, forças de seleção, arquitetura genética entre as

espécies (que pode funcionar como barreira ou ser semipermeável ao fluxo gênico)

entre outros. Existem diversas teorias que tentam explicar o surgimento de zonas

híbridas e seus diferentes tipos. Do ponto de vista da teoria da hibridação in situ, esta

ocorreria entre espécies simpátricas e as consequências evolutivas estariam sob

influência de padrões de seleção variáveis ao longo de gradientes ambientais. Indivíduos

híbridos poderiam ser mais adaptados e favorecidos em diferentes gradientes ambientais,

propiciando a dispersão da população híbrida em direção a outros habitats. Por outro

lado, a hibridação pode ocorrer por um contato secundário de espécies previamente

isoladas cuja barreira genética não foi totalmente rompida. (Barton, 2001 ; Durett et al.,

2000)

43

No trabalho de Grazziotin e colaboradores foi demonstrada a existência de dois

filogrupos geneticamente distintos de B. jararaca no Brasil. Os autores estimaram a

fragmentação das duas populações por volta de 3,8 milhões de anos, no período do

Plioceno. Esse período foi marcado por intensas mudanças climáticas e da

fisiogeografia da Floresta Atlântica, gerando sua fragmentação e favorecimento do

surgimento de vários grupos taxonômicos. Com base nesse resultado e em outros que

estimam baixa taxa migratória e baixo fluxo gênico, eles sugeriram que a fragmentação

das populações ocorreu durante esse período por isolamento geográfico da espécie

ancestral previamente bem distribuída ao longo do território. Os autores também

citaram o trabalho de Hoge e coloboradores (1977) que descreve uma variação

morfológica na distribuição das escamas ventrais da espécie B. jararaca que acompanha

a distribuição geográfica das populações, com presença de uma média de 188 escamas

ventrais nos indivíduos analisados dos estados de SC e PR e 203 escamas ventrais nos

indivíduos do RJ, ES e MG. O trabalho descreve esse padrão morfológico como

intermediário nos espécimes do estado de SP. Grazziotin sugere, então, que deve existir

uma zona híbrida entre as duas populações em SP. Por fim ele conclui que a teoria da

orogênese no Plioceno e outras teorias da formação da biodiversidade na Floresta

Atlântica não eram suficientes para explicar os resultados filogenéticos encontrados, e

que estudos mais profundos deveriam ser realizados com marcadores moleculares de

herança biparental para melhor compreensão a até mesmo revisão da taxonomia do

grupo.

44

Figura 14: Alinhamento múltiplo de Lys49-PLA2 do gênero Bothrops. De acordo com a sequência do transcriptoma (em análise), a única PLA2 idêntica a BthTX-I é a

de B. jararaca do sul. Vermelho, aminoácidos conservados; azul, aminoácidos não conservados; cinza, gap. Destaques para os aminoácidos divergentes em relação à

sequência da BthTX-I. Alinhamento utilizando Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT) da plataforma BLAST.

|Q90249|B.jararacussu_BthTX-I

BjS_transcriptoma

|1PA0:A|PDBID|B.n.pauloensis|BnSP-7

|1PC9:A|PDBID|B.n. pauloensis|BnSP-6

|P58399|B.pirajai_PrTx-I

|P82287|B.pirajai_PrTX-II

|P86975|B.leucurus

|P24605|B.asper

|I6L8L6|B.brazili_MTX-II

|Q9I834|B.moojeni

|Q6JK69|B.atrox

|Q90249|B.jararacussu_BthTX-I

BjS_transcriptoma

|1PA0:A|PDBID|B.n.pauloensis|BnSP-7

|1PC9:A|PDBID|B.n. pauloensis|BnSP-6

|P58399|B.pirajai_PrTx-I

|P82287|B.pirajai_PrTX-II

|P86975|B.leucurus

|P24605|B.asper

|I6L8L6|B.brazili_MTX-II

|Q9I834|B.moojeni

|Q6JK69|B.atrox

45

A introgressão eventualmente produz indivíduos estáveis e independentes

sexualmente. Contudo, a diversificação de uma população originária de uma hibridação

não ocorre de maneira imediata, e um isolamento geográfico deve ocorrer em um tempo

suficiente que permita a estabilização da independência dessa nova população até que

ela possa coexistir com a parental. Ainda que os primeiros híbridos registrados na

literatura foram assim identificados pela morfologia intermediária entre as espécies

parentais, nem todo indivíduo híbrido possui morfologia intermediária e nem todo

aquele de morfologia intermediária é um híbrido (Dowling & Secor, 1997). Dado que a

introgressão gênica pode ocorrer de maneira assimétrica, uma geração híbrida pode ser

mais semelhante a uma espécie parental do que a outra. Além disso, de acordo com a

regra de Haldane, os descendentes híbridos heterogaméticos (no caso das serpentes, os

machos) por diversas características genéticas intrínsecas da heterogamia são mais

inviáveis ou estéreis (Wu et al., 1996). Portanto, a tendência reprodutiva é que ocorram

retrocruzamentos de indivíduos híbridos fêmeas com machos da espécie parental. De

fato, Sazima (1992) cita o cruzamento de uma suposta híbrida fêmea de B. neuwiedi e B.

jararaca com um macho de B. jararaca gerando 21 filhotes híbridos. Da mesma forma,

Balestrin e colaboradores (2002) relatam esse mesmo tipo de cruzamento de ocorrência

não natural (em cativeiro, no Núcleo Regional de Ofiologia de Porto Alegre -NOPA).

Recentemento foi realizado um trabalho extenso da filogenia do grupo neuwiedi,

baseado nas análises das sequencias mitocondriais do cyt b e ND4, no qual foi sugerido

que a divergência entre os clados ocorreu também nos períodos do Plioceno e

Pleistoceno (Machado et al., 2014). Os resultados sugeriram hibridação introgressiva

entre B. erythromelas e B. lutzi em decorrência da dinâmica de expansão e contração

dos biomas da Caatinga e do Cerrado durante o Pleistoceno. Também foi evidenciada

uma hibridação introgressiva entre as espécies simpátricas B. marmoratus e B.

pauloensis como um possível resultado de um contato secundário, justificado também

pela zona de transição de vegetação do Cerrado que ocorre na área central do Brasil,

onde a introgressão ocorre (Machado et al., 2014). Esses exemplos mostram que o fluxo

gênico pode ter contribuído mais do que se imaginava para a diversificação e interação

entre as espécies.

A presença de uma proteína altamente homóloga da BthTX-I na população de B.

jararaca do sul, demonstrada por esse trabalho, levanta a hipótese de que essa

população provém de uma hibridação entre B. jararaca e B. jararacussu, e

possivelmente, essa introgressão ocorreu no sentido da espécie B. jararaca, ou pelo

46

menos esse perfil foi mais favorecido. Estudos futuros utilizando ferramentas de

biologia molecular devem ser realizados a fim de se investigar melhor a história

evolutiva da espécie e sua intrigante variabilidade populacional. Diante dessa hipótese

ficam as seguintes possibilidades: i) a presença do gene codificante para BthTX-I na

população de B. jararaca da região sul é produto de uma introgressão gênica

proveniente de uma hibridação entre as espécies B. jararaca e B. jararacussu e isso

favoreceu a expansão e divisão populacional da espécie B. jararaca em direção ao sul

do país ; ii) a fragmentação ocorreu de acordo com a teoria sugerida por Grazziotin e as

populações derivam de um ancestral previamente distribuído, e que por alguma razão

esse gene deixou de ser expresso no sudeste e/ou foi selecionado no sul; iii) ou se ,ainda,

ambos os fatores contribuíram para o surgimento das duas populações.

Uma questão importante e que merece destaque é que a alimentação é um fator

relacionado à composição do veneno (Wasko & Sasa, 2012; Richards et al., 2012).

Além do fato bem conhecido da mudança ontogenética que ocorre nos venenos de

algumas serpentes, que acompanha a mudança na alimentação da espécie (no gênero

Bothrops, geralmente de presas ectotérmicas na juventude para presas endotérmicas na

fase adulta) (Martins et al., 2002), a evolução adaptativa do veneno em relação a presa é

uma evidência largamente discutida na literatura (Barlow et al., 2009). Um exemplo

claro é o caso da divergência dos proteomas dos venenos de Sistrurus taxonomicamente

próximas que se diferenciam em suas dietas. Notavelmente, a família de toxinas de

maior divergência entre elas foram as PLA2. (Sanz et al., 2006). Posteriormente, foi

sugerido pelos autores que os genes codificantes das PLA2 são resultado de uma

evolução rápida por seleção positiva nessas Sistrurus de diferentes hábitos alimentares,

evidenciando a divergência adaptativa dos venenos (Gibbs & Rossiter, 2008).

No estudo da distribuição geográfica do veneno de B. atrox ao longo do terrtório

amazônico foi demonstrado que classes de toxinas como as SVMP-III e CRISPs se

conservam entre as populações, enquanto as PLA2 apresentam alta variabilidade

intraespecífica de acordo com a localização geográfica (Calvete et al., 2011). No caso

do gênero Crotalus no Brasil, foi descrito um aumento da expressão de crotamina, uma

PLA2 miotóxica, que acompanha a dispersão de C. durrissus spp. em direção ao sul do

continente americano. De maneira interessante, a C. d. cascavella que se distribui mais

ao norte, no bioma mais seco da Caatinga, se alimenta de pássaros, lagartos e pequenos

mamíferos e ao invés de expressar crotamina, expressa maior quantidade de crotoxina e

D49-PLA2. As subespécies C. d. terrificus e C. d. collineatus, distribuídas do centro ao

47

sul do Brasil, possuem uma alimentação supostamente exclusiva de roedores quando

nascem e expressam mais crotamina, indicando uma especialização dessas moléculas

como adaptação a diferentes habitats. (Boldrini-França et al., 2010). Nesse e em outros

casos descritos na literatura, a família das PLA2 parece estar diretamente envolvida na

adaptação e evolução dos venenos.

No caso da jararaca, durante o período das mudanças climáticas que ocorreram

no Plioceno ocorreram modificações nas condições de humidade, vegetação e clima,

fragmentando a Floresta Atlântica. Essa fragmentação provavelmente influenciou na

disponibilidade e tipo de presas em uma região comparada à outra. De fato, Machado e

colaboradores (2014) citam diversos exemplos de grupos animais que correspondem ao

repertório de opções para alimentação da maioria das serpentes do gênero Bothrops que

se diversificaram concomitantemente no período do Plioceno-Pleistoceno.

Independentemente a qual teoria se deve a divergência entre as populações de B.

jararaca, a diferença na disponibilidade de alimentação em cada região deve ter sido

crucial na adaptação do veneno.

5.4 – Antivenômica

A antivenômica foi uma metodologia desenvolvida e que vem sendo

aperfeiçoada para estudar a imunoreatividade entre venenos e antivenenos. Essa

necessidade cresceu como consequência das limitações de metodologias pré-existentes

para esse tipo de análise como o Western Blot e protocolos de ELISA, que entre várias

limitações técnicas, pode-se destacar seus resultados do tipo “tudo-ou-nada” (Pla et al.,

2012). A primeira geração da antivenômica consistia basicamente em um protocolo de

imunodepleção no qual o veneno e o antiveneno (no caso, IgGs purificadas) eram

incubados em solução. Posteriormente eram adicionados anticorpos secundários ou

alguma molécula com afinidade de ligação às IgGs. A imunoprecipitação dos

complexos Ag-Ac depletava do sobrenadante as toxinas reconhecidas pelas IgGs,

enquanto as toxinas que permaneciam em solução correspondiam àquelas não

reconhecidas eficientemente pelo antiveneno. A identificação das toxinas reconhecidas

ou não era feita pela comparação entre o cromatograma de fase reversa da fração

imunoprecipitada e do veneno total já caracterizado pela venômica. Os resultados eram

então qualitativos e a técnica não era aplicável a todos os tipos de antivenenos

comerciais. Na segunda geração da antivenômica, baseada em coluna de

48

imunoafinidade, resultados qualitativos com maior resolução puderam ser gerados além

de, pela primeira vez, poder-se estimar valores quantitativos para a imunodepleção das

toxinas já identificadas previamente pela venômica. Comparações entre a primeira e a

segunda geração da antivênomica demonstraram diversas vantagens para a última (Pla

et al., 2012 ; Gutiérrez et al., 2014).

Entretanto, no presente estudo a vantagem de se poder quantificar a porcentagem

reconhecida e não reconhecida de um pico não pôde ser aplicada por uma característica

inerente ao veneno de Bothrops jararaca que é sua elevada autodegradação. Já foi

demonstrado na literatura que o veneno de jararaca, quando mantido em pH básico,

sofre maior autoproteólise e variações em diversas atividades biológicas em comparação

a sua manutenção em pH ácido. Esses efeitos são significativamente abolidos quando é

utilizado um conjunto de inibidores de proteases (Sousa et al., 2001). O pH do veneno

fresco ao sair da glândula é ácido, o que caracteriza um dos motivos pelos quais o

veneno não se ativa dentro da própria glândula. Ao encontrar o pH fisiológico da presa

ou vítima muitas toxinas se ativam e exercem sua atividade biológica (Mackessy &

Baxter, 2006). A incubação entre o veneno e a coluna no ensaio de antivenômica ocorre

em pH 7.4. Essa faixa de pH equivale às condições fisiológicas necessárias para que

ocorram os possíveis reconhecimentos entre antígeno e anticorpo, sendo por sua vez,

uma característica inerente à metodologia. Por esses motivos durante os ensaios de

antivênomica foi observado um alto grau de degradação dos venenos, sobretudo da

região sudeste. Essa degradação foi acompanhada por uma diminuição na resolução dos

picos resultantes da incubação com a coluna (figura 11). Vários testes foram feitos e

corroborando com os estudos prévios constatou-se que de fato a degradação ocorre ao

manter o veneno em pH 7.4 por poucas horas, mesmo sem o veneno passar por alguma

coluna (figura 13).

A degradação observada nos ensaios controle foi alta, inclusive com presença de

“picos fantasmas” resultantes da degradação majoritária de SVMPs. O fato da

degradação ocorrer principalmente nas SVMPs está de acordo com o estudo de Sousa e

colaboradores (2001), que demonstrou uma diminuição progressiva nas bandas entre

45-66 kDa ao longo da incubação do veneno em pH 8.5. De fato, os “picos fantasmas”

foram identificados com m/z equivalentes a peptídeos da jararhagina, uma SVMP do

tipo III que corresponde à toxina mais abundante do veneno do sudeste como

demonstrado nesse estudo (banda 46 kDa, pico 36 BjSE) e em estudos prévios (Paine et

al., 1992 ; Moura-da-Silva & Baldo, 2012). É provável que esses picos correspondam à

49

jararhagina-C, uma molécula de 28 kDa que consiste nos domínios disintegrin-like e

cysteine-rich da jararhagina. (Usami et al., 1994). O maior grau de degradação

observada nos controles se deve ao fato das proteases do veneno não estarem sendo

imunocapturadas e, portanto, estarem livres em solução para clivarem possíveis alvos.

Apesar de todos esses fatores, os resultados da antivenômica puderam responder

à principal pergunta que levou a esses ensaios: o soro comercial antibotrópico é eficaz

em reconhecer o veneno das duas populações? O reconhecimento do antiveneno frente

às duas populações foi similar e demonstrou-se eficaz em ambas. Era esperado que as

primeiras frações do veneno não fossem bem reconhecidas, já que se sabe que as

frações peptídicas dos venenos possuem baixa imunogenicidade e por isso não são bem

depletadas pelos antivenenos (Lomonte et al., 2008; Pla et al., 2013). No entanto, do

ponto de vista fisiopatológico do envenenamento, o escape no reconhecimento desses

tipos de frações não se manifestaram como relevantes em um estudo com o gênero

Lachesis (Pla et al., 2013).

Os ensaios de Western Blot foram realizados, então, a fim de complementar os

dados fornecidos pela antivenômica, já que a degradação dos venenos impossibilitou

uma visualização de cada pico separadamente. Para esse tipo de abordagem o blotting é

fundamentalmente não quantitativo (Gutiérrez et al., 2014) e portanto integra valor

qualitativo à antivenômica. As duas técnicas juntas constatam a capacidade do soro

antibotrópico em reconhecer os dois pools de veneno, de maneira abrangente,

interagindo pelo menos com as proteínas majoritárias de cada um (ver resultados, figura

11). Como já foi citado anteriormente, a região final do cromatograma (proteínas de

maior peso molecular e/ou mais hidrofóbicas) pode perder-se devido a ligações

inespecíficas desses elementos à matriz Sepharose (Pla et al., 2012). Nesse contexto, o

western blot confirma que esses picos são reconhecidos, apesar de na região sul se

“perderem” e na região sudeste diminuírem em quantidade no perfil cromatográfico.

Perdas na quantidade total de veneno final em relação à inicial (veneno total) são

previstas pela técnica, por motivos de manipulação da amostra. Quando uma

quantificação é feita numa segunda geração da antivenômica, a porcentagem de uma

fração retida (R) ou não retida (NR) é calculada por sua razão com a soma da área do

mesmo pico em questão nas duas frações provenientes da coluna (R/[R+NR] ou

NR/[R+NR]). Ou seja, a área total de um pico não é considerada como a área do pico

que aparece no cromatograma do veneno total, e sim da soma das áreas do mesmo que

aparecem nas frações não retida e eluída da coluna, compensando assim as possíveis

50

perdas que em teoria acontecem de forma proporcional em ambas as frações (Pla et al.,

2012). O cromatograma do veneno total é exposto apenas para comparação dos

resultados.

O protocolo do pool de imunização dos equinos para produção do soro

antibotrópico no Brasil utiliza as seguintes espécies e suas respectivas proporções:

Bothrops jararaca (50%), Bothrops jararacussu (12,5%), Bothrops neuwiedi (12,5%),

Bothrops alternatus (12,5%) e Bothrops moojeni (12,5%) (Raw et al., 1991). É muito

provável que o fato dessa mistura de venenos ser utilizada no protocolo de imunização

contribua para ampliar o espectro de abrangência do antiveneno. Nesse caso, a presença

da espécie B. jararacussu no pool de imunização parece ser crucial para que ocorra o

reconhecimento do veneno de B. jararaca da região sul, visto que sua principal

diferença em relação ao sudeste é a presença da BthTX-I.

Tendo em vista que esses ensaios são testes in vitro, futuros ensaios in vivo

devem ser realizados para comprovar a eficácia biológica do soro antibotrópico em

neutralizar o veneno do sul. Vale ressaltar que os pools utilizados para esse estudo

foram constituídos apenas de indivíduos adultos. Estudos prévios mostraram que o soro

antibotrópico não é capaz de reconhecer e neutralizar de forma eficiente os efeitos do

veneno de indivíduos neonatos de B. jararaca, dada a marcada mudança ontogenética

da espécie. Futuros estudos da imunorreatividade de antivenenos comerciais frente a

essa população de neonatos do sul são necessários. Uma possível falta de reatividade

reforçaria a questão já levantada previamente de que é necessário realizar melhorias no

planejamento dos protocolos de imunização, visto que nos protocolos atuais somente

são utilizados venenos de representantes adultos e isso se reflete no fato do soro

antibotrópico ser menos eficaz em neutralizar o veneno de neonatos (Antunes et al.,

2010; Zelanis et al., 2010). Além disso, os envenenamentos, em geral, podem levar a

diversas sequelas e incapacitação das vítimas, o que atesta a necessidade de buscar

sempre melhores protocolos e novas opções de tratamento para as vítimas envenenadas.

51

6 – CONCLUSÃO

Através desse trabalho foi confirmado que existem duas populações distintas de

Bothrops jararaca no Brasil, com diferenças marcantes em seus venenos. Essa é a

primeira vez que um estudo proteômico com pools de veneno dos extremos pontos de

distribuição da espécie é realizado. Apesar dos numerosos estudos com o veneno de B.

jararaca também é a primeira vez que um estudo é feito utilizando-se a abordagem da

venômica. No que diz respeito às proteínas majoritárias, por essa primeira análise pode-

se dizer que o veneno do sudeste, como previamente conhecido, é rico em

metaloproteinases, enquanto o veneno do sul possui uma maior quantidade de PLA2. O

pool de cada população foi confirmado como representativo e apesar das pequenas

diferenças individuais, os venenos parecem ser bastante conservados de acordo com sua

distribuição geográfica.

A presença de uma toxina exclusiva na população do sul abriu discussões acerca

da evolução e irradiação da espécie no território da Floresta Atlântica, o que deverá ser

estudado mais profundamente no futuro para um maior esclarecimento das possíveis

razões e história evolutivas. De todo modo, as diferenças encontradas entre os venenos

não resultaram na perda do reconhecimento das toxinas majoritárias pelo soro

antibotrópico comercial.

Do ponto de vista da bioprospecção, a elucidação de uma nova população de um

veneno tão complexo abre novas oportunidades para moléculas biologicamente ativas

como possíveis agentes terapêuticos. Conhecendo-se o perfil geral das toxinas de ambas

populações torna-se viável a purificação de proteínas de interesse para futuros estudos

de atividades biológicas.

52

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRIÃO-ESCARSO, S.H.; SOARES, A.M.; RODRIGUES, V.M.; ANGULO, Y.;

DÍAZ, C.; LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J.M.; GIGLIO, J.R.. Myotoxic

phospholipases A2 in Bothrops snake venoms: Effect of chemical modifications on the

enzymatic and pharmacological properties of bothropstoxins from Bothrops

jararacussu. Biochimie, v. 82, p.755−763, 2000.

ANTUNES, T.C.; YAMASHITA, K.M.; BARBARO, K.C.; SAIKI, M.; SANTORO,

M.L.. Comparative analysis of newborn and adult Bothrops jararaca snake venoms.

Toxicon, v.56, p. 1443–1458, 2010.

BALESTRIN, R.L.; LEITÃO-DE-ARAUJO, M.; ALVES, M.L.M.. Ocorrência de

híbridos não naturais entre Bothrops jararaca e B. neuwiedi (Serpentes, Viperidae).

Iheringia, v. 92, p. 85-90, 2002.

BARLOW, A.; POOK, C.E. ; HARRISON, R.A.; WÜSTER, W.. Coevolution of diet

and prey-specific venom activity supports the role of selection in snake venom

evolution. Proceedings of the Royal Society B, v. 276, p. 2443–2449, 2009.

BERGER, M.; PINTO, A.F.; GUIMARÃES, J.A.. Purification and functional

characterization of bothrojaractivase, a prothrombin-activating metalloproteinase

isolated from Bothrops jararaca snake venom. Toxicon, v.51, p. 488-501, 2008.

BOLDRINI-FRANÇA, J.; CORRÊA-NETTO, C.; SILVA, M.M.S.; RODRIGUES,

R.S.; DE LA TORRE, P.; PÉREZ, A.; SOARES, A.M.; ZINGALI, R.B.; NOGUEIRA,

R.A.; RODRIGUES, V.M.; SANZ, L.; CALVETE, J.J.. Snake venomics and

antivenomics of Crotalus durissus subspecies from Brazil: Assessment of geographic

variation and its implication on snakebite management. Journal of Proteomics, v. 73, p.

1758 – 1776, 2010.

BRAUD, S.; BON, C.; WISNER, A.. Snake venom proteins acting on hemostasis.

Biochimie, v.82, p.851–859, 2000.

CALVETE, J.J.. Antivenomics and venom phenotyping: a marriage of convenience to

address the performance and range of clinical use of antivenoms. Toxicon, v.56,

p.1284–1291, 2010.

CALVETE, J.J.. Proteomic tools against the neglected pathology of snake bite

envenoming. Expert Review of Proteomics, v.8, p.739–758, 2011.

CALVETE, J.J.. Snake venomics: From the inventory of toxins to biology. Toxicon,

v.75, p.44–62, 2013.

CALVETE, J.J.; JUÁREZ, P.; SANZ, L.. Snake venomics. Strategy and applications.

Journal of Mass Spectrometry, v.42, p.1405–1414, 2007.

CALVETE, J.J.; SANZ, L.; ANGULO, Y.; LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J.M..

Venoms, venomics, antivenomics. FEBS Letters, v.583, p.1736–1743, 2009.

53

CALVETE, J.J.; SANZ, L.; PÉREZ, A.; BORGES, A.; VARGAS, A.M.; LOMONTE,

B.; ANGULO, Y.; GUTIÉRREZ, J.M.; CHALKIDIS, H.M.; MOURÃO, R.H.;

FURTADO, M.F.; MOURA DA SILVA, A.M.. Snake population venomics and

antivenomics of Bothrops atrox: paedomorphism along its transamazonian dispersal and

implications of geographic venom variability on snakebite management. Journal of

Proteomics, v.74, p.510–527, 2011.

CAMARGO, A.C.; IANZER, D.; GUERREIRO, J.R.; SERRANO, S.M.. Bradykinin-

potentiating peptides: beyond captopril. Toxicon, v.59, n.4, p.516−523, 2012.

DE-SIMONE, S.G.; NAPOLEÃO-PEGO, P.; TEIXEIRA-PINTO, L.A.L.; SANTOS,

J.D.L.; DE-SIMONE, T.S.; MELGAREJO, A.R.; AGUIAR, A.S.; MARCHI-

SALVADOR, D.P.. Linear B-cell epitopes in BthTX-1, BthTX-II and BthA-1,

phospholipase A2’s from Bothrops jararacussu snake venom, recognized by

therapeutically neutralizing commercial horse antivenom. Toxicon, v.72, p. 90–101,

2013.

DIAS, G.S.; KITANO, E.S.; PAGOTTO, A.H.; SANT’ANNA, S.S.; ROCHA, M.M.

T.; ZELANIS, A.; SERRANO, S.M.T.. Individual Variability in the Venom Proteome

of Juvenile Bothrops jararaca Specimens. Journal of Proteome Research, v.12,

p.4585−4598, 2013.

DOS-SANTOS, M.C.; GONÇALVES, L.R.; FORTES-DIAS, C.L.; CURY, Y.;

GUTIÉRREZ, J.M.; FURTADO, M.F.. A eficácia do veneno antibotrópico-crotálico na

neutralização das principais atividades do veneno de Bothrops jararacussu. Rev. Inst.

Med. Trop. v. 34, p. 77–83, 1992.

DOWLING, T.E.; SECOR, C.L.. The role of hybridization and introgression in the

diversification of animals. Annu. Rev. Ecol. Syst., v. 28, p.593–619, 1997

DURRETT, R.; BUTTEL, L.; HARRISON, R.. Spatial models for hybrid zones.

Heredity, v. 84, p. 9-19, 2000.

FENWICK, A.M.; GUTBERLET JR, R.L.; EVANS, J.A.; PARKINSON, C.L..

Morphological and molecular evidence for phylogeny and classification of South

American pitvipers, genera Bothrops, Bothriopsis, and Bothrocophias (Serpentes:

Viperidae). Zoological Journal of the Linnean Society, v.156, p. 617–640, 2009.

FERNANDES, C.A.H.; MARCHI-SALVADOR, D.P.; SALVADOR, G.M.; SILVA,

M.C.O.; COSTA, T.R.; SOARES, A.M.; FONTES, M.R.M.. Comparison between apo

and complexed structures of bothropstoxin-I reveals the role of Lys122 and Ca2+-

binding loop region for the catalytically inactive Lys49-PLA2s. Journal of Structural

Biology, v. 171, p. 31–43, 2010.

FERREIRA, S.H.; BARTELD, D.C.; GREENE, L.J.. Isolation of bradykinin

potentiating peptides from Bothrops jararaca venom. Biochemistry, v.9, p.2583–2593,

1970.

FOX, J. W.; SERRANO, S. M.. Exploring snake venom proteomes: multifaceted

analyses for complex toxin mixtures. Proteomics, v.8, p.909–20, 2008.

54

FRANÇA, F.O.S.; BARBARO, K.C.; FAN, H.W.; CARDOSO, J.L.C.; SANO-

MARTINS, I.S.; TOMY, S.C.; LOPES, M.H.; WARREL, D.A.; THEAKSTON,

R.G.D.; THE BUTANTAN INSTITUTE ANTIVENOM STUDY GROUP.

Envenoming by Bothrops jararaca in Brazil: association between venom antigenaemia

and severity at admission to hospital. Transactions of the royal society of tropical

medicine and hygiene, v. 97, p. 312-317, 2003.

FRY, B.G.; SCHEIB, H.; VAN DER WEERD, L.; YOUNG, B.; MCNAUGHTAN, J.;

RAMJAN S. F. R.; VIDAL, N. ; POELMANN, R.E. ; NORMAN, J.A.. Evolution of an

arsenal. Molecular & Cellular Proteomics, v.7, n.2, p.215–246, 2008.

FRY, B.G.; VIDAL, N.; NORMAN, J.A.; VONK, F.J.; SCHEIB, H.; RAMJAN, S.F.R.;

KURUPPU, S.; FUNG, K.; HEDGES, S.B.; RICHARDSON, M.K.; HODGSON, W.C.;

IGNJATOVIC, V.; SUMMERHAYES, R.; KOCHVA, E.. Early evolution of the venom

system in lizards and snakes.Nature, v. 439, p. 584 – 588, 2006.

FRY, B.G.; VIDAL, N.; VAN DER WEERD, L.; KOCHVA, E.; RENJIFO, C..

Evolution and diversification of the Toxicofera reptile venom system. Journal of

Proteomics, v. 72, p. 127 – 136, 2009.

GIBBS, H.L.; ROSSITER, W.. Rapid Evolution by Positive Selection and Gene Gain

and Loss: PLA2 Venom Genes in Closely Related Sistrurus Rattlesnakes with Divergent

Diets. J Mol Evol, v. 66, p. 151–166, 2008.

GIBBS, H.L.; SANZ, L.; CHIUCCHI, J.E.; FARRELL, T.M.; CALVETE, J.J..

Proteomic analysis of ontogenetic and diet-related changes in venom composition of

juvenile and adult Dusky Pigmy rattlesnakes (Sistrurus miliarius barbouri). Journal of

Proteomics, v.74, n.10, p.2469−2179, 2011.

GRAZZIOTIN, F.G.; MONZEL, M.; ECHEVERRIGARAY, S.; BONATTO, S.L.

Phylogeography of the Bothrops jararaca complex (serpentes: Viperidae): past

fragmentation and island colonization in the Brazilian Atlantic Forest. Molecular

Ecology, v.15, n.13, p, 3969−3982, 2006.

GUTIÉRREZ, J.M.. Clinical toxicology of snakebite in Central America. In: Meier J,

White J, eds. Handbook of Clinical Toxicology of Animal Venoms and Poisons.

Florida: CRC Press. p. 645–665, 1995.

GUTIÉRREZ, J.M.; LOMONTE, B.; LEÓN, G.; ALAPE-GIRÓN, A.; FLORES-DÍAZ,

M.; SANZ, L.; ANGULO, Y.; CALVETE, J.J.. Snake venomics and antivenomics:

proteomic tools in the design and control of antivenoms for the treatment of snakebite

envenoming. Journal of Proteomics, v.72, p.165–182, 2009.

GUTIÉRREZ, J.M.; LOMONTE, B.; SANZ, L.; CALVETE, J.J. ; PLA, D..

Immunological profile of antivenoms: Preclinical analysis of the efficacy of a

polyspecific antivenom through antivenomics and neutralization assays. Journal of

Proteomics, v. 105, p. 340-350, 2014.

55

GUTIÉRREZ, J.M.; SANZ, L.; ESCOLANO, J.; FERNÁNDEZ, J.; LOMONTE, B.;

ANGULO, Y.; RUCAVADO, A.; WARRELL, D.A.; CALVETE, J.J.. Snake venomics

of the lesser Antillean pit vipers Bothrops caribbaeus and Bothrops lanceolatus.

Correlation with toxicological activities and immunoreactivity of a heterologous

antivenom. Journal of Proteome Research, v.7, p.4396–4408, 2008.

GUTIÉRREZ, J.M.; TSAI, W.C.; PLA, D.; SOLANO, G.; LOMONTE, B.; SANZ, L.;

ANGULO, Y.; CALVETE, J.J.. Preclinical assessment of a polyspecific antivenom

against the venoms of Cerrophidion sasai, Porthidium nasutum and Porthidium

ophryomegas: Insights from combined antivenomics and neutralization assays. Toxicon,

v.64, p.60–69, 2013b.

GUTIÉRREZ, J.M.; WARRELL, D.A.; WILLIAMS, D.J.; JENSEN, S.; BROWN, N.;

CALVETE, J.J.; HARRISON, R.A.; GLOBAL SNAKEBITE INITIATIVE.. The Need

for Full Integration of Snakebite Envenoming within a Global Strategy to Combat the

Neglected Tropical Diseases: The Way Forward. PLoS Neglected Tropical Diseases,

v.7, n.6, 2013a.

HARRISON, R.G.; LARSON, E.L.. Hybridization, Introgression, and the Nature of

Species Boundaries. Journal of Heredity, i. 105, p. 795-809, 2014.

HOGE, A.R.; BELLUOMINI, H.E.; FERNANDES, W.. Variação do número de placas

ventrais de Bothrops jararaca em função dos climas (Viperidae, Crotalinae). Memórias

do Instituto Butantan, v. 40/41, p. 11–17, 1977.

HOMSI-BRANDEBURGO, M.I.; QUEIROZ, L.S.; SANTO-NETO; RODRIGUES-

SIMIONI, H.L.; GIOLIO, J.R.. Fractionation of Bothrops jararacussu snake venom:

partial chemical characterization and biological activity of bothropstoxin. Toxicon, v.

26, n. 7, p. 613-627, 1988.

KINI, R.M. Toxins in thrombosis and haemostasis: potential beyond imagination.

Journal of Thrombosis and Haemostasis, v.9, n.1, p.195−208, 2011

KOH, D.C. I.; ARMUGAM, A.; JEYASEELAN, K.. Snake venom components and

their applications in biomedicine. Cellular and Molecular Life Sciences, v.63,

p.3030–3041, 2006.

Livro vermelho da fauna brasileira ameaçada de extinção. Editores Angelo Barbosa

Monteiro Machado, Gláucia Moreira Drummond, Adriano Pereira Paglia. - 1.ed. -

Brasília, DF : MMA; Belo Horizonte, MG : Fundação Biodiversitas, 2008. Cap.

Panorama Geral dos Répteis Ameaçados do Brasil, volume II.

LOMONTE, B.; ESCOLANO, J.; FERNÁNDEZ, J.; SANZ, L.; ANGULO, Y.;

GUTIÉRREZ, J.M.; CALVETE, J.J.. Snake venomics and antivenomics of the arboreal

neotropical pitvipers Bothriechis lateralis and Bothriechis schlegelii. Journal of

Proteome Research, v.7, p.2445–2457, 2008.

NÚÑEZ, V.; CID, P.; SANZ, L.; DE LA TORRE, P.; ANGULO, Y.; LOMONTE, B.;

GUTIÉRREZ, J.M.; CALVETE, J.J.. Snake venomics and antivenomics of Bothrops

atrox venoms from Colombia and the Amazon regions of Brazil, Perú and Ecuador

56

suggest the occurrence of geographic variation of venom phenotype by a trend towards

paedomorphism. Journal of Proteomics, v.73, p.57–78, 2009.

MACHADO, T.; SILVA, V.X.; SILVA, M.J.J.. Phylogenetic relationships within

Bothrops neuwiedi group (Serpentes, Squamata): Geographically highly-structured

lineages, evidence of introgressive hybridization and Neogene/Quaternary

diversification. Molecular Phylogenetics and Evolution , v. 71, p. 1–14, 2014.

MADRIGAL, M.; SANZ, L.; FLORES-DIAZ, M.; SASA, M.; NÚÑEZ, V.; ALAPE-

GIRÓN, A.; CALVETE, J.J.. Snake venomics across genus Lachesis. Ontogenetic

changes in the venom composition of L. stenophrys and comparative proteomics of the

venoms of adult L. melanocephala and L. acrochorda. Journal of Proteomics, v.77, p.

280–297, 2012.

MARSH, N.A.. Diagnostic Uses of Snake Venom. Haemostasis, v.31, p.211–217, 2001.

MARTINS, M.; ARAUJO, M.S.; SAWAYA, R.J.; NUNES, R.. Diversity and evolution

of macrohabitat use, body size and morphology in a monophyletic group of Neotropical

pitvipers (Bothrops). J. Zool., Lond, v. 254, p. 529-538, 2001.

MARTINS, M.; MARQUES, O. A. V; SAZIMA, I.. Ecological and phylogenetic

correlates of feeding habits in Neotropical pitvipers (Genus Bothrops), pp. 307-328. In

G. W. Schuett, M. Höggren, M. E. Douglas and H. W. Greene (Eds.), Biology of the

vipers. Eagle Mountain Publishing, Eagle Mountain, 2002.

MACKESSY, S.P.; BAXTER, L.M. Bioweapons synthesis and storage: the venom

gland of front-fanged snakes. Zoologischer Anzeiger, v.245, p. 147–59, 2006.

MCCLEARY, R.J.; KINI, R.M.. Non-enzymatic proteins from snake venoms: a gold

mine of pharmacological tools and drug leads. Toxicon, v.62, p.56−74, 2013.

MENEZES, M.C. ; FURTADO, M.F.; TRAVAGLIA-CARDOSO, S.R.; CAMARGO,

A.C.M.; SERRANO, S.M.T.. Sex-based individual variation of snake venom proteome

among eighteen Bothrops jararaca siblings. Toxicon , v.47, p. 304–312, 2006.

MINISTÉRIO DA SAÚDE, FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE (FUNASA).

Manual de diagnostico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília,

2ª ed, 2001.

MOURA-DA-SILVA A.M.; BALDO, C.. Jararhagin, a hemorrhagic snake venom

metalloproteinase from Bothrops jararaca. Toxicon, v. 60, p. 280–289, 2012.

ODELL, G.V.; FERRY, P.C.; VICK, L.M.; FENTON, A.W.; DECKER, L.S.;

COWELL, R.L.; OWNBY, C.L.; GUTIÉRREZ, J.M.. Citrate inhibition of snake venom

proteases. Toxicon, v. 36, n. 12, p. 1801-1806, 1998.

OLIVEIRA, A.K.; LEME, A.F.P.; ASSAKURA, M.T.; MENEZES, M.C.; ZELANIS,

A.; TASHIMA, A.K.; LOPES-FERREIRA, M.; LIMA, C.; CAMARGO. A.C.M.; FOX,

J.W.; SERRANO, S.M.T.. Simplified procedures for the isolation of HF3, bothropasin,

57

disintegrin-like/cysteine-rich protein and a novel P-I metalloproteinase from Bothrops

jararaca venom. Toxicon, v. 53, p. 797–801, 2009.

PAINE, M.J.I.; DESMOND, H.P.; THEAKSTON, R.D.G.; CRAMPTON, J.M..

Purification, Cloning, and Molecular Characterizatioonf a High Molecular Weight

Hemorrhagic Metalloprotease, Jararhagin, from Bothrops jararaca Venom. Journal of

Biological Chemistry, v. 267, n. 32, p. 22869-22876, 1992

PIMENTA, D.C.; PREZOTO, B.C.; KONNO, K.; MELO, R.L.; FURTADO, M.F.;

CAMARGO, A.C.; SERRANO, S.M.. Mass spectrometric analysis of the individual

variability of Bothrops jararaca venom peptide fraction. Evidence for sex-based

variation among the bradykinin-potentiating peptides. Rapid Commun Mass

Spectrom, v. 21, p. 1034-1042, 2007.

PLA, D.; GUTIÉRREZ, J.M.; CALVETE, J.J.; Second generation snake antivenomics:

comparing immunoaffinity and immunodepletion protocols. Toxicon v.60, p.688–699,

2012.

PLA, D.; SANZ, L.; MOLINA-SÁNCHEZ, P.; ZORITA, V.; MADRIGAL, M.;

FLORES-DÍAZ, M.; et al. Snake venomics of Lachesis muta rhombeata and genus-

wide antivenomics assessment of the paraspecific immunoreactivity of two antivenoms

evidence the high compositional and immunological conservation across Lachesis.

Journal of Proteomics, v.89, p.112–23, 2013.

QUEIROZ, G.P.; PESSOA, L.A.; PORTARO, F.C.; FURTADO, M.F.; TAMBOURGI,

D.V.. Interspecific variation in venom composition and toxicity of Brazilian snakes

from Bothrops genus. Toxicon, v.52, p.842–851, 2008.

RAW, I.; GUIDOLIN, R.; HIGASHI, H.; KELEN, E.M.A.. Antivenins in Brazil:

preparation. Handbook of Natural Toxins, v 5, p.557–581, 1991.

RICHARDS, D.P.; BARLOW, A.; WÜSTER, W.. Venom lethality and diet:

Differential responses of natural prey and model organisms to the venom of the saw-

scaled vipers (Echis). Toxicon, v. 59, p. 110–116, 2012.

ROCHA E SILVA, M.; BERALDO, W.T.; ROSENFELD, G.. Bradykinin hypotensive

and smooth muscle stimulating factor released from plasma globulins by snake venoms

and by trypsin. American Journal of Physiology, v.156, p.261–273, 1949.

RULLER, R.; ARAGÃO, E.A.; CHIOATO, L.; T. LOPES FERREIRA, T.; DE

OLIVEIRA, A.H.C. ; SÀ, J.M.; WARD, R.J.. A predominant role for hydrogen bonding

in the stability of the homodimer of bothropstoxin-I, A lysine 49-phospholipaseA2.

Biochimie, v. 87, p. 993–1003, 2005.

SANTORO, M.L.; SANO-MARTINS, I.S.; FAN, H.W.; CARDOSO, J.L.C.;

THEAKSTON, R.D.G.; WARRELL, D.A.; BIASG. Haematological evaluation of

patients bitten by the jararaca, Bothrops jararaca, in Brazil. Toxicon, V.51, p.1440–

1448, 2008.

58

SANZ, L.; ESCOLANO, J.; FERRETTI, M.; BISCOGLIO, MJ.; RIVERA, E.;

CRESCENTI, EJ.; ET AL.. Snake venomics of the South and Central American

Bushmasters. Comparison of the toxin composition of Lachesis muta gathered from

proteomic versus transcriptomic analysis. Journal of Proteomics, v.71, p.46-60, 2008

SANZ, L.; GIBBS, H.L.; MACKESSY, S.P.; CALVETE, J.J.. Venom Proteomes of

Closely Related Sistrurus Rattlesnakes with Divergent Diets. Journal of Proteome

Research, v. 5, p. 2098-2112, 2006.

SAZIMA, I.. Natural history of the jararaca pitviper, Bothrops jararaca, in

southeastern Brazil. Biology of the Pitvipers, p.199-216, 1992.

SEGURA, A.; VILLALTA, M.; HERRERA, M.; LEÓN, G.; HARRISON, R.; DURFA,

N.; NASIDI, A.; CALVETE, J.J.; THEAKSTON, R.D.; WARRELL, D.A.;

GUTIÉRREZ, J.M.. Preclinical assessment of the efficacy of a new antivenom

(EchiTAb-Plus-ICP) for the treatment of viper envenoming in sub- Saharan Africa.

Toxicon, v.55, p.369–374, 2010.

SERRANO, S.M.T.; HAGIWARA, Y.; MURAYAMA, N.; HIGUCHI, S.; MENTELE,

R.; SAMPAIO, C.A.M.; CAMARGO, A.C.M.; FINK, E.. Purification and

characterization of a kinin-releasing and fibrinogen-clotting serine proteinase (KN-BJ)

from the venom of Bothrops jararaca, and molecular cloning and sequence analysis of

its cDNA. Eur. J. Biochem, v. 251, p. 845-853, 1998.

SERRANO, S.M.T.; MENTELE, R.; SAMPAIO, C.A.M.; FINK, E.. Purification,

Characterization, and Amino Acid Sequence of a Serine Proteinase, PA-BJ, with

Platelet-Aggregating Activity from the Venom of Bothrops jararaca. Biochemistry, v.

34, p. 7186-7193, 1995.

SOUSA, J.R.F.; MONTEIRO, R.Q.; CASTRO, H.C.; ZINGALI, R.B.. Proteolytic

action of Bothrops jararaca venom upon its own constituents. Toxicon, v.39, p.787-792,

2001.

SOUSA, L.F.; NICOLAU, C.A.; PEIXOTO, P.S.; BERNARDONI, J.L.; OLIVEIRA,

S.S.; ET AL.. Comparison of Phylogeny, Venom Composition and Neutralization by

Antivenom in Diverse Species of Bothrops Complex. PLoS Neglected Tropical

Diseases, v.7, n.9, e2442, 2013.

TEIXEIRA, C.F.P.; CHAVES, F.; ZAMUNÉR, S.R.; FERNANDES, C.M.; ZULIANI,

J.P.; CRUZ-HOFLING, M.A.; FERNANDES, I.; GUTIÉRREZ, J.M.. Effects of

neutrophil depletion in the local pathological alterations and muscle regeneration in

mice injected with Bothrops jararaca snake venom. International Journal of

Experimental Pathology, v. 86, p. 107–115, 2005.

TRIGO, Tatiane Campos. Hibridação e Introgressão entre espécies de felídeos

neotropicais (Mammalia, Carnivora). 2008. Tese (Doutorado em Ciências). Pós-

graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade do Rio Grande do Sul,

Porto Alegre, 2008.

59

USAMI, Y.; FUJIMURA, Y.; MIURA, S.; SHIMA, H.; YOSHIDA, E.; YOSHIOKA,

A.; HIRANO, K.; SUZUKI, M.; TITANI, K.. A 28 kDa-protein with disintegrin-like

structure (jararhagin-C) purified from Bothrops jararaca venom inhibits collagen- and

ADP-induced platelet aggregation. Biochemical and Biophysical Research

Communications, v. 201, n. 1, p. 331 – 339, 1994.

USAMI, Y.; FUJIMURA, Y.; SUZUKI, M.; OZEKI,Y.; NISHIO, K.; FUKUI, H.;

TITANI, K.. Primary structure of two-chain botrocetin, a von Willebrand fator

modulator purified from the venom of Bothrops jararaca. Proc. Nati. Acad. Sci. USA

(Biochemistry), v. 90, p. 928-932, 1993.

WASKO, D.K.; SASA, M.. Food resources influence spatial ecology, habitat selection,

and foraging behavior in an ambush-hunting snake (Viperidae: Bothrops asper): an

experimental study. Zoology, v. 115 p. 179– 187, 2012.

WERMELINGER, L.S; GERALDO, R.B.; FRATTANI, F.S.; RODRIGUES, C.R.;

MARIA A. JULIANO, M.A.; CASTRO, H.C.; ZINGALI, R.B.. Integrin inhibitors from

snake venom: Exploring the relationship between the structure and activity of RGD-

peptides. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 482, p. 25–32, 2009.

WILLIAMS, D.J.; GUTIÉRREZ, J.M.; CALVETE, J.J.; WUSTER,W.;

RATANABANANGKOON, K.; PAIVA, O.; BROWN, N.I.; CASEWELL, N.R.;

HARRISON, R.A.; ROWLEY, P.D.; O’SHEA, M.; JENSEN, S.D.; WINKEL, K.D.;

WARRELL, D.A.. Ending the drought: new strategies for improving the flow of

affordable, effective antivenoms in Asia and Africa. Journal of Proteomics, v.74,

p.1735–1767, 2011.

World Health Organization. Rabies and envenomings. A neglected public health issue.

Geneva: WHO, 2007.

World Health Organization. Guidelines for Production Control and Regulation of

Snake Antivenom Imunoglobulins. WHO, 2010.

WU, C.-I; JOHNSON, N.A.; PALOPOLI, M.F.. Haldane’s rule and its legacy: why are

there so many sterile males? TREE, v. 2, n. 7, 1996.

ZAMUNÉR, S.R.; DA CRUZ-HOFLING, M.A.; CORRADO, A.P.; HYSLOP, S.;

RODRIGUES-SIMIONI, L.. Comparison of the neurotoxic and myotoxic effects of

Brazilian Bothrops venoms and their neutralization by commercial antivenom. Toxicon,

v.44, p.259–271, 2004.

ZELANIS, A.; TASHIMA, A.K.; ROCHA, M.M.; FURTADO, M.F.; CAMARGO,

A.C.; ET AL.. Analysis of the ontogenetic variation in the venom proteome/peptidome

of Bothrops jararaca reveals different strategies to deal with prey. Journal of

Proteome Research, v.9, n.5, p.2278–2291, 2010.

ZELANIS, A.; TASHIMA, A.K.; PINTO, A.F.; LEME, A.F.; STUGINSKI, D.R.;

FURTADO, M.F.; SHERMAN, N.E.; HO, P.L.; FOX, J.W.; SERRANO, S.M..

Bothrops jararaca venom proteome rearrangement upon neonate to adult transition.

Proteomics, v.11, p.4218–4228, 2011

60

ZELANIS, A.; ANDRADE-SILVA, D.; ROCHA, M.M.; FURTADO, M.F.;

SERRANO, S.M.; JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO, I.L.; HO, P.L.. A transcriptomic

view of the proteome variability of newborn and adult Bothrops jararaca snake venoms.

PLoS Neglected Tropical Diseases, v.6, e1554, 2012.

ZINGALI, R.B.; JANDROT-PERRUS, M.; GUILLIN, M.C.; BON, C.. Bothrojaracin, a

new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jararaca venom: Characterization and

mechanism of thrombin inhibition. Biochemistry, v. 32, p.10794–10802, 1993.

61

8 - ANEXOS

Lista de indivíduos de B. jararaca da região sul

Número Procedência Sexo

3829 Salvador do Sul – RS F

3738 Veranópolis - RS F

3908 São José do Sul – RS F

3899 São José do Sul – RS F

3929 São José do Sul – RS M

3930 Ivoti – RS F

3935 São José do Sul – RS F

3996 Nova Petrópolis – RS F

3997 Nova Petrópolis – RS F

3998 Nova Petrópolis – RS F

3739 Novo Hambvurgo – RS F

3999 Nova Petrópolis – RS F

4000 Nova Petrópolis – RS F

3878 Dom Pedro de Alcântara - RS F

3963 São José do Sul – RS M

4055 E Dois Irmãos – RS F

3923 São Francisco de Paulo – RS F

4036 D São José do Sul – RS F

4055 B Dois Irmãos – RS M

4087 Sapucaia do Sul – RS M

4001 Nova Petrópolis – RS M

4018 São José do Sul – RS M

62

Lista de indivíduos de B. jararaca da região sudeste

Número Procedência Sexo

3345 Búzios - RJ F

3527 151/06 - ES F

3703 Guapimirim – RJ F

3779 Mendes - RJ F

4177 Nova Friburgo – RJ F

4367 Maricá – RJ F

5084 D. Caxias - RJ F

5268 Caxambu - MG F

5416 Areal - RJ F

5480 Pendotiba (Niterói) - RJ F

5507 Rio de Janeiro - RJ M

5921 Niterói – RJ F

6508 Seropédica – RJ F

6510 Rio de Janeiro - RJ M

6517 Petrópolis - RJ F

6702 Petrópolis - RJ F

6871 Petrópolis - RJ M

6880 Niterói - RJ F

6888 Niterói - RJ M

6942 Niterói - RJ ?

6879 Pendotiba (Niterói) - RJ M

4277 Itaipu (Niterói) - RJ M

A