universidade federal do rio grande do norte ......inspiradas em produtos naturais marinhos,...

Rusceli Diego de Araújo

Bioprospecção Química da Esponja Callyspongia vaginalis

(CALLYSPONGIIADAE)

NATAL – RN

2013

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Química. Área de concentração: Química Orgânica Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial do Instituto de Química

Araújo, Rusceli Diego de.

Bioprospecção Química da Esponja Callyspongia vaginalis (CALLYSPONGIIDAE) / Rusceli Diego de Araújo. Natal, RN, 2013.

99 f.

Orientadora: Araújo, Renata Mendonça.

Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química. Afetividade. Química. Aulas experimentais.

1. Química Orgânica – Dissertação. 2. Callyspongia vaginalis - Dissertação.

3. Metabólitos secundários - Dissertação. 4. polissacarídeos – Dissertação. I. Araújo, Renata Mendonça. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UFRN/BSE- Instituto de Química CDU 547(043)

Dedico este trabalho aos meus pais, que tanto me

incentivaram e cuidaram de mim. Que me deram força e

tudo o mais que precisei. À tia Cláudia e vovó, que me

escutaram e sempre me acolheram de braços abertos.

Aos meus amigos que muito contribuíram para minha

formação, além de todas as informações que pudemos

trocar nestes anos de convivência. À professora Renata,

que muito me ajudou e motivou com o trabalho, sempre

me dizendo que daria certo. É pra vocês!!

“Elevo os meus olhos para os montes, de onde me virá o

socorro?

O meu socorro vem do Senhor, que fez os céus e a

terra.”

(Salmos, 121.1)

AGRADECIMENTOS

Quero primeiramente agradecer a Deus por toda a força e capacitação

para realização deste trabalho, sem Ele, de fato, não estaria aqui.

Quero também agradecer aos meus amados pais que me deram todo o

suporte. Pelas orações e palavras de força e ânimo que sempre me serviram

de “trampolim” para passar pelas horas em que as dificuldades apareceram.

Amo-os.

Aos grandes amigos: Camila Lima, Heloíza Fernanda, Denise Sales,

Denise Emerenciano, Rosemiro Barros e Taíza Nayara que nas horas certas e

incertas sempre estiveram ali dizendo que no final tudo daria certo. E num é

que deu! Valeu galera.

Aos “meus cantores”: Adriano, Dyana , Thays, Kézia e Jerlayne que

sempre ouviram meus pedidos de oração e me ajudaram com suas palavras de

motivação e suporte. Pelas risadas e todos os momentos que me

proporcionaram. Além disto, suas vozes juntas a minha me fazem flutuar!

Às amigas cearenses que muito me acrescentaram: Isabel Vitorino,

Ceiça Menezes pela hospedagem, conversas, risos, lanches, danças e

confiança. Meninas, muito obrigado mesmo!!! Como também as companheiras

de viagem e laboratório: Patrícia, Karísea, Nayara e Paula, por tudo que me foi

ensinado, pelas boas risadas, fotos e frio. Foi ótimo conhece-las!

À querida orientadora Renata Mendonça, pelos puxões de orelha e

força. Por toda a ajuda disponibilizada no decorrer deste tempo em que

convivemos, por acreditar em meu potencial e pela formação oferecida.

Obrigado professora!

Aos companheiros de laboratório: Anne, Deusielly, Taiannie, Sheeza,

Nara, Marcela, Gisele e Kleiton por tornar nosso ambiente de trabalho tão

divertido, pelas informações trocadas, pelos bolos, pizzas e lanches da tarde.

Em especial a Vanessa Queiroz, pelas conversas, desabafos, estímulos, ajuda,

risos, jogos e tudo mais. Muito obrigado gente.

Ao sr. Jose Anchieta de Queiroz e srª. Maria Luisa Araujo Queiroz que

abriram as portas de sua casa pra mim. Fizeram-me sentir em casa! Pelas

conversas trocadas, risos e cuidado... O meu muito obrigado!

Ao professor Carlos Souto por dividir a estrutura física do laboratório de

química orgânica com o grupo de pesquisa em produtos naturais.

Ao professor Edilberto Silveira por abrir as portas do CENAUREMN,

muito obrigado pela disponibilização de equipamentos e material, sem os quais

a pesquisa não teria fluído.

Ao Dr. Braz, pelo auxílio na elucidação das estruturas. Muito obrigado.

Aos professores do IQ, por toda bagagem que me acrescentaram, pelas

dúvidas tiradas e pela convivência que tivemos. Em especial a professora

Maria Aparecida Medeiros Maciel, por quem tenho muito apreço. Obrigado.

Enfim, a todos aqueles que me ajudaram direta ou indiretamente, que de

alguma forma me auxiliaram na realização deste trabalho. O meu muito

obrigado!

A CNPq, PROPESQ e FAPESP, pela concessão da bolsa de pesquisa e

suporte financeiro, respectivamente.

MUITO OBRIGADO!

“Temos o destino que merecemos.

O nosso destino está de acordo com os nossos méritos.”

(Albert Einstein)

RESUMO

A diversidade estrutural de substâncias de origem marinha, associadas

as suas atividades biológicas, têm atraído atenção de pesquisadores do mundo

inteiro. Dentre os organismos estudados atualmente dois grupos de

invertebrados marinhos, as ascídias e as esponjas, merecem destaque. Estes

animais sésseis e filtradores, segundo inúmeras pesquisas, vêm se mostrando

verdadeiras “fábricas químicas”, produzindo substâncias que por vezes

apresentam-se como aspirantes a agentes terapêuticos, com eficácia clínica

comprovada. Além dos metabólitos secundários, os polissacarídeos de origem

marinha também tem sido alvo de estudos, sendo relatados diversos

compostos sulfatados e com diferentes atividades biológicas associadas a

estes. Tendo em vista a pequena quantidade de espécies de esponjas

estudadas até o momento, comparado ao potencial químico destes

organismos, o presente trabalho apresenta a prospecção química da esponja

Callyspongia vaginalis. Técnicas clássicas de cromatografia em gel de sílica

permitiram o isolamento de dois metabólitos secundários: o β-sitosterol e uma

ceramida, ambos inéditos no gênero Callyspongia. A análise das frações

lipídicas mostraram diferentes tipos de ácidos graxos com variados tamanhos

de cadeia (fração saponificável), e de outros metabólitos como lupenona e

estigmasterol, também inéditos no gênero em questão. O polissacarídeo obtido

através do material animal também foi isolado e, como amplamente relatado na

literatura apresentou-se sulfatado, característica diferencial dos polissacarídeos

de origem marinha. A caracterização do polissacarídeos e a elucidação

estrutural dos metabólitos secundários foram realizadas através da análise dos

dados de espectrometria de massa, Infravermelho e Ressonância Magnética

Nuclear de Hidrogênio-1 e Carbono-13, através de sequências de pulsos uni e

bidimensionais e comparação com dados da literatura.

Palavras-chave: Callyspongia vaginalis. Metabólitos secundários.

polissacarídeos.

ABSTRACT

Recently, marine organisms have attracted attention because of the

complexity and potent biological activity from your secondary metabolites. Our

planet has 80% it surface covered by oceans and seas, therefore, housing a

wide number of different forms of life, among them, the sponges. These sessile

and filtrating animals, according to numerous researches, come showing like

true chemistry factories. The substances from these animals, sometimes show

as news targets to therapeutics agents, and some countries has already use

them for treatment of some diseases. Further of the secondary metabolites, the

polysaccharides of marine origin also have been target of studies, because the

presence of the sulfates groups in its molecules. Polysaccharides with differents

biological activities have been related in a large number of researches. Actually,

many studies show the sponges as source of promising medicine. These

studies inspire new researches, because the few number of sponges species

studied until now. Because of that, the present work shows the chemistry

prospection of the sponge Callyspongia vaginalis. Chromatographic methods in

silica gel allowed the isolations of two secondary metabolites: the known β-

sitosterol and a ceramide, no reported in the genus Callyspongia, previously.

The analysis of the their lipid extracts show different kinds of fatty acids with a

variety of chain length (saponifiable fraction), and others metabolites like

Lupenone and stigmasterol, also unprecedented in the genus. The

Polysaccharide characterization and the elucidation of the secondary

metabolites acquired through of chromatography analysis (CC, molecular

exclusion) and spectrometric (NMR 1H and 13C, mass, IR), respectively and

comparison with literature data.

Key-words: Callyspongia vaginalis. Secondary metabolites. Polysaccharides.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estruturas do Ara-A e Ara-C................................................... 15

Figura 2 - Gráfico A, ilustrando o número de substâncias originais ou

inspiradas em produtos naturais marinhos, totalizando 20;

Gráfico B, ilustrando o número de moléculas isoladas de

diferentes fontes, utilizadas em pesquisa

bioquímica...............................................................................

17

Figura 3 - Callyspongia vaginalis em ambiente natural........................... 20

Figura 4 - Mero da Heparina................................................................... 46

Figura 5 - Acetil Coenzima A (Acetil-CoA)............................................... 47

Figura 6 - Esquema de diferentes rotas biossintéticas que tem a acetil-

CoA como precurssora...........................................................

48

Figura 7 - Esquema de formação de ácidos graxos a partir do ácido

oleico.......................................................................................

51

Figura 8a - Descrição do trabalho experimental realizado com C.

vaginalis...................................................................................

54

Figura 8b - Descrição do trabalho experimental realizado com C.

vaginalis...................................................................................

55

Figura 9 - Espectro de RMN 1H da amostra CV-1, CDCl3, 500 MHz...... 69

Figura 10 - Espectro de RMN 13C e DEPT 135 da amostra CV-1, CDCl3,

125 MHz..................................................................................

69

Figura 11 - Estrutura do β-Sitosterol (C29H50O)....................................... 70

Figura 12 - Espectro de RMN 1H da amostra CV-2, piridina, 300 MHz... 71

Figura 13 - Espectro de RMN 13C da amostra CV-2, piridina, 75 MHz... 72

Figura 14 - Espectro de HMBC, apontando as principais correlações de

CV-2.........................................................................................

74

Figura 15 - Correlações HMBC de CV-2.................................................... 75

Figura 16 - Estrutura CV-2, ceramida, C31NO3H61..................................... 75

Figura 17 - Cromatograma (CG-MS) de CVEC-1...................................... 77

Figura 18 - Fragmentações de um ácido graxo genérico, em

fragmentos de -14....................................................................

81

Figura 19 -

Formação do fragmento m/z=74 para um ácido graxo

saturado genérico....................................................................

81

Figura 20 - Relação m/z=87 para um ácido graxo saturado genérico..... 81

Figura 21 - Espectro de FTIR dos polissacarídeos isolado e purificado (à

esquerda) em comparação com dados da

literatura...................................................................................

87

Figura 22 - Curva analítica construída a partir dos padrões de galactose

em concentrações de 0,8; 1; 3; 5; 7; 9 e 10

mg/mL......................................................................................

88

Figura 23- Curva de TG e DTG para o polissacarídeo CV..................... 89

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação biológica de Callyspongia vaginalis................... 20

Tabela 2 - Substâncias isoladas de diferentes esponjas pertencentes

ao gênero Callyspongia...........................................................

44

Tabela 3 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento CVEHA......... 57

Tabela 4 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento CVEHB......... 57

Tabela 5 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento CVEHC......... 58

Tabela 6 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento CVEC.......... 59

Tabela 7 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento CVEA.......... 60

Tabela 8 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHA. 65

Tabela 9 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHB. 66

Tabela 10 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHC. 66

Tabela 11 - Comparação entre os dados obtidos e da literatura para o

esteróide β-sitosterol (*,a,b CDCl3; *125 MHz)..........................

68

Tabela 12 - Dados de 1H, 13C e correlações HMBC da amostra CV-2,

ceramida..................................................................................

73

Tabela 13 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEC... 76

Tabela 14 - Composição dos constituintes da fração lipídica da fração

CVEC.......................................................................................

77

Tabela 15 - Constituintes insaponificáveis com seus da fração CVEC...... 82

Tabela 16 - Deslocamento das bandas no infravermelho para o

polissacarídeo isolado e purificado em comparação com

dados da literatura...................................................................

87

Tabela 17 - Temperaturas inicial, final e máxima dos picos de

degradação do polissacarídeo, CV..........................................

89

LISTA DE ABREVIATURAS

CC - Cromatografia em Coluna

CCD - Cromatografia em Camada Delgada;

CVEA, B e C - Callyspongia Vaginalis em Etanol – extratos brutos A, B e C;

CVEH - Callyspongia Vaginalis em Etanol – Hexano;

CVEC - Callyspongia Vaginalis em Etanol – Clorofórmio;

CVEA - Callyspongia Vaginalis em Etanol – Acetato de etila;

CENAUREMN - Centro Nordestino da Aplicação e Uso da Ressonância

Magnética Nuclear

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

EM - Espectroscopia de Massas

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO - Dimetil Sufóxido

FTIR - Fourier Transform Infra-Red

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Hz - Hertz

IV - Infravermelho

ppm - Partes por milhão

RMN 1H - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

EtOH – Etanol

MeOH - Metanol

CH2Cl2 – Cloreto de metileno

HCl – Ácido cloridríco

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO…………………………………………………………… 15

1.1 A QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS MARINHOS...................... 15

1.2 POTENCIAL CITOTÓXICO DE INVERTEBRADOS MARINHOS...... 16

2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE Callyspongia vaginalis............. 19

2.1 ESPONJAS........................................................................................ 19

2.2 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS............................. 20

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................. 22

3.1 OCORRÊNCIA DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS NO GÊNERO

CALLYSPONGIA................................................................................

22

3.2 POLISSACARÍDEOS......................................................................... 46

3.3 BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS.............................................. 47

4 OBJETIVOS....................................................................................... 51

4.1 GERAIS.............................................................................................. 51

4.2 ESPECÍFICOS................................................................................... 51

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL................................................. 52

5.1 ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS..................... 52

5.1.1 Obtenção dos extratos..................................................................... 52

5.1.2 Partição líquido-líquido.................................................................... 52

5.2 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS................................................... 56

5.2.1 Fracionamento cromatográfico dos extratos obtidos.................. 56

5.2.2 Fracionamento de CVEHA................................................................ 57

5.2.3 Fracionamento de CVEHB................................................................ 57

5.2.4 Fracionamento de CVEHC................................................................ 58

5.2.5 Fracionamento de CVEC.................................................................. 59

5.2.6 Fracionamento de CVEA ................................................................. 59

5.3 OBTENÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS........................................ 60

5.3.1 Saponificação................................................................................... 60

5.3.2 Esterificação..................................................................................... 60

5.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTRÔMETRO

DE MASSAS – CG-MS.......................................................................

61

5.5 ISOLAMENTO DO POLISSACARÍDEO............................................. 61

5.5.1 Purificação dos polissacarídeos..................................................... 62

5.2.2 Infravermelho.................................................................................... 62

5.5.3 Hidrólise............................................................................................ 62

5.5.4 Dosagem de açúcar redutor............................................................ 63

5.5.5 Análise Termogravimétrica............................................................. 63

5.6 5.6 MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS - CARACTERIZAÇÃO

DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS .............................................

63

5.6.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de

Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN

13C).....................................................................................................

63

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................... 65

6.1 FRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES HEXÂNICAS DE

CVEH..................................................................................................

65

6.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE CV-1........................................... 67

6.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE CV-2........................................... 69

6.4 CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO LIPÍDICA DE CVEC................... 76

6.5 CARACTERIZAÇÃO DO POLISSACARÍDEO................................... 86

6.5.1 FTIR.................................................................................................... 86

6.5.2 HIDRÓLISE E CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR REDUTOR............ 88

Análise Termogravimétrica............................................................. 88

7 CONCLUSÕES.................................................................................. 91

REFERÊNCIAS.................................................................................. 92

6.5.3

Introdução

Rusceli Diego de Araújo 15

1 INTRODUÇÃO

1.1 A QUÍMICA DE PRODUTOS NATURAIS MARINHOS

A terra possui 2/3 de sua superfície coberta por mares e oceanos,

abrigando uma gama de espécies de plantas e animais. Para se ter ideia,

dentre os 36 filos existentes, 34 deles possuem representantes no mar.

Contudo, apesar de tão promissor, o ambiente marinho passou a ser explorado

de forma mais audaz apenas recentemente, devido às dificuldades enfrentadas

para se alcançar grandes profundidades. O avanço da tecnologia na

construção de veículos resistentes a maiores pressões possibilitou o alcance

de maiores profundidades e por consequência, o conhecimento de um número

maior de espécies (LOTUFO, WILKE , JIMENEZ, 2009).

Werner Bergmann (1950), da Universidade de Yale (EUA), relatou em seu

trabalho, dois nucleosídeos, produzidos por via sintética, Ara-A (Adenina-

arabinosídeo) e Ara-C (Citosina-arabinosídeo) (Figura 1), oriundos da esponja

Tectitethya cripta (Cryptotethya), que são utilizados até hoje na terapêutica

devido às suas atividades antiviral e antitumoral, respectivamente, mostrando

que o mar pode ser fonte de poderosos fármacos, o que motiva o estudo

dessas formas de vida, desde aquela década. Porém, o interesse de

laboratórios de pesquisa em produtos naturais de origem marinha veio somente

após a descoberta de grandes quantidades de prostraglandinas no octoral

Plexaura homomalla (VOOGD, 2007; LOTUFO, WILKE, JIMENEZ, 2009;

SEPCIC et al, 2010; GERWICK, MOORE, 2012).

Figura 1 - Estruturas do Ara-A e Ara-C.

Ara - A Ara - C

Fonte: Autor, 2013.

Ara

ARA-A

ARA-C

O

NN

NN

OH

OH

OH

NH2

O

OH

OH

OH

N

N

NH2

O

Introdução


Segundo Blunt (2008 apud LOTUFO, WILKE, JIMENEZ, 2009) cerca de

18.500 substâncias de organismos marinhos foram isoladas entre 1965 e 2006,

mas calcula-se que menos de 3% do total estimado já tenham sido alvo de

estudos biológicos ou farmacológicos.

De um modo geral, invertebrados marinhos como esponjas e ascídeas,

assim como cnidários, apresentam defesas provenientes de agentes químicos.

E é isto que torna os invertebrados marinhos fonte de estudos e investigações

a respeito de seus metabólitos secundários (SELEGHIM et al, 2007). A

bioatividade de moléculas de origem marinha, não é rara, é extremamente

potente, o que reforça a hipótese da sua função protetora, já que elas devem

superar a incrível capacidade diluente da água do mar para alcançar seu alvo

(LOTUFO, WILKE, JIMENEZ, 2009). O mar abriga segredos ainda

desconhecidos, por isso, a necessidade e importância de pesquisá-lo.

1.2 POTENCIAL CITOTÓXICO DE INVERTEBRADOS MARINHOS

Invertebrados marinhos são bastante conhecidos por sua capacidade de

produzir um grande número de produtos naturais (CAPON et al, 2002). Dentre

tantos grupos de animais e plantas pertencentes à este ecossistema destacam-

se as esponjas e as ascídeas. Esses dois grupos de invertebrados têm sido

continuamente explorados durante os últimos 25 anos, devido ao potencial de

aplicação farmacológica de várias substâncias isoladas desses animais

(GRANATO et al. 2005).

Organismos marinhos apresentam-se como interessante fonte de

moléculas que podem ser utilizadas como agentes terapêuticos contra o câncer

(FAROKHI et al, 2012). Um levantamento realizado por pesquisadores do

Instituto Nacional de Câncer indicou que, dentre as fontes naturais de

substâncias antitumorais, os organismos marinhos são os que forneceram o

maior número de extratos orgânicos com alto percentual de atividade. Dentre

as substâncias antitumorais oriundas de invertebrados marinhos em avaliação

clínica, duas têm origem em esponjas, uma de octocoral, uma de briozoário, e

três em ascídias, o que demonstra o grande potencial destes animais na

produção de substâncias bioativas (GRANATO et al, 2005).

Introdução


Existem sete agentes terapêuticos derivados de origem marinha, quatro

anticâncer, um antiviral, um analgésico, e um para hipertrigliceridemia, sendo

dois destes moléculas isoladas e cinco outros sintéticos, inspirados em sua

estrutura natural. A Eribulina, derivada da Halicondrina B, isolado da esponja

Halichondria okadai, é utilizada na metástase do câncer de mama e a

Trabectedina, isolada do tunicato marinho Ecteinascidia turbinata, foi licenciada

em 2007 como segunda alternativa no tratamento de sarcomas de origem

cancerígena no ovário (WHITE et al, 2012).- Ainda existem treze possíveis

moléculas, estando em fase clínica I, II ou III (SIMMONS et al, 2011;

GERWICK, MOORE, 2012). Os gráficos seguintes, Figura 2, mostram o

número de substâncias desenvolvidas a partir em substâncias isoladas de

organismos marinhos (A); e (B) apresenta o número de moléculas isoladas que

estão sendo utilizadas na pesquisa bioquímica:

Figura 2 - Gráfico A, ilustrando o número de substâncias originais ou inspiradas em produtos naturais marinhos, totalizando 20; Gráfico B, ilustrando o número de moléculas isoladas de diferentes fontes, utilizadas em pesquisa bioquímica.

Fonte: (GERWICK; MOORE, 2012).

Após anos de estudos com metabólitos secundários de fontes

tradicionais, e seu pouco retorno econômico, a busca de novas fontes de

metabólitos secundários se fez necessária. Com isso, a pesquisa com

organismos marinhos torna-se uma alternativa na pesquisa de substâncias

bioativas (SIMMONS et al, 2011).

Fungo (1)

Bactéria (1)

Esponja (4)

Tunicatos (3)

Corais (1)

Briozoários (1)

Moluscos (7)

Vermes (1)

Peixes (1)

Cianobactérias (29)

Esponjas (43)

Fungos(1)

Algas/plantas (26)

Peixes (1)

Vermes(1)

Briozoários (1)

Moluscos (12)

Cnidários (6)

Tunicatos (1)

A B

Introdução


A química de produtos naturais marinhos no Brasil, que possui a segunda

maior extensão litorânea, com cerca de 8.500 km², tem se desenvolvido

somente nos últimos 10 anos. Considerando sua extensão e que a fauna

marinha do mesmo é praticamente inexplorada, e ainda, que os organismos

marinhos são fontes promissoras de metabólitos secundários potencialmente

importantes do ponto de vista biológico, a costa brasileira representa uma

incontestável fonte de substâncias com potencial biológico ativo, a serem

exploradas (GRANATO et al, 2005; FOUAD et al, 2012).

Assim, tendo em vista o grande potencial observado nas esponjas, e o

acesso às técnicas de isolamento e purificação, o presente trabalho propõe o

desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais marinhos oriundos da

esponja Callyspongia vaginalis. Promovendo o isolamento e caracterização

estrutural de suas substâncias, através de procedimentos laboratoriais que

utilizam diretamente os conceitos fundamentais de química orgânica e técnicas

analíticas modernas, principalmente Ressonância Magnética Nuclear (RMN),

como também técnicas simples como Cromatografia em Camada Delgada

(CCD) e em Coluna. Os estudos nesta área são também considerados

importantes por contribuir com o conhecimento da biodiversidade do litoral

brasileiro, em particular da região Nordeste.

Considerações Gerais


2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE Callyspongia vaginalis

2.1 ESPONJAS

As esponjas são animais sésseis pertencentes ao filo Porífera, e

constituem um importante grupo no reino animal. Devido à sua natureza séssil

e filtradora, as esponjas marinhas desenvolveram um sistema “anti-stress”

ambiental bastante efetivo, produzindo toxinas e outras substâncias com

propostas defensivas, competitivas e comunicativas (JUNIOR, 2008; WHITE et

al, 2012; DIYABALANAGE et al, 2012; TRAN et al, 2012). Estes animais

surgiram há cerca de 550 milhões de anos atrás, e estima-se que existam

aproximadamente 15.000 espécies, onde cerca de 99% pertencem à

ambientes marinhos e apenas 1% ocorra em águas doces. As esponjas são

consideradas “fábricas químicas”, produzindo centenas de compostos químicos

de estruturas únicas, dos quais muitos foram isolados e tiveram sua estrutura

elucidada (SEPCIC et al, 2010).

Nos últimos anos, o ambiente marinho tem sido pesquisado devido à

grande variedade de compostos com diferentes atividades biológicas. Entre

todos os organismos marinhos, as esponjas representam uma das fontes mais

promissoras de novas drogas contra o câncer, demonstrando assim um

poderoso arsenal, como o Ara-A e Ara-C, entre outros já citados. Apesar do

litoral brasileiro ser bastante extenso, poucos estudos com esponjas coletadas

no Brasil foram feitos. Com isso houve um aumento do interesse na pesquisa

de esponjas nos últimos anos, incentivado principalmente pela descoberta

destes possíveis novos compostos bioativos, tendo em mente que ainda é

insuficiente o estudo sobre estes animais (GRANATO et al, 2005; LOTUFO,

WILKE, JIMENEZ, 2009; WHITE et al, 2012; GERWICK, MOORE, 2012).

Foi realizado um screen com extratos de esponjas coletados no atol das

rocas – CE/Brasil, dentre os extratos estudados o extrato hidroalcoólico de

Callyspongia vaginalis apresentou atividade citotóxica em testes preliminares

realizados com linhagens de células leucêmicas, e isso motivou o estudo desta

espécie (FERREIRA et al, 2007).



2.2 TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS

A esponja estudada no presente trabalho é classificada conforme

descrito na tabela abaixo:

Tabela 1 - Classificação biológica de Callyspongia vaginalis.

Callyspongia vaginalis se caracteriza pela forma de tubos largos

agrupados, com grandes ósculos apicais e superfície fortemente conulosa.

Figura 3 - Callyspongia vaginalis em ambiente natural.

O gênero Callyspongia compreende 182 espécies, das quais apenas 15

foram estudadas (IBRAHIM et al, 2010). As esponjas pertencentes a este

gênero são conhecidas como fontes de moléculas com atividades biológicas,

como poliacetilenos, peptídeos, terpenóides, alcalóides, ácidos graxos,

policetídeos, esteróis, peróxidos, nitrotetradecenil piridina e butenolídeos.

Dentre estes, existem compostos com propriedades antifúngicas, citotóxicas e

antimicrobiana (YANG et al, 2009; HUANG et al, 2010; IBRAHIM et al, 2010;

Classe Demospongiae

Subclasse Ceractinomorpha

Ordem Haplosclerida

Família Callyspongiidae

Gênero Callyspongia

Espécie Callyspongia vaginalis

Fonte: http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/

Fonte: http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/

http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/

http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/



SIMMONS et al, 2011). A ordem Haplosclerida é conhecida por ser fonte de

alquil-piridinas e alquil-piperidinas (SELEGHIM et al, 2007), compostos

poliacetilênicos, com diferentes comprimento de cadeia e padrão de

oxigenação (YOUSSEF, SOEST & FUSETANI, 2003), e moléculas pirimídicas

de baixo peso molecular ainda não foram reportadas (BUCHANAN et al, 2007).

Revisão Bibliográfica


3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 OCORRÊNCIA DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS NO GÊNERO

CALLYSPONGIA

Foi realizado um levantamento bibliográfico no Scifinder, sobre as

substâncias isoladas de esponjas pertencentes ao gênero Callyspongia, desde

o ano 1991, onde foi reportado o relato mais antigo, até fevereiro de 2013.

Foram encontrados relatos de: policetídeos, poliacetilenos, terpenóides, alquil-

piridinas (halitoxinas), peptídeos, ácidos graxos, peróxidos, e esteroides

(SARQUER, NAHAR, 2009; SIMMONS et al, 2011; NUZZO et al, 2012). Este

levantamento bibliográfico foi realizado com o intuito do conhecimento das

diferentes classes de substâncias encontradas no gênero em questão. Abaixo,

de forma sumarizada, estão apresentados os metabólitos registardos na

literatura, obtidos a partir de espécies do gênero Callyspongia, com seus

respectivos dados de RMN 13C e suas respectivas atividades biológicas,

quando reportadas. Ao final desta lista, a tabela 2 resume todas as substâncias

aqui descritas.

POLICETÍDEOS

Callyspongia pseudoreticulata

BRAEKMAN et al, 2003

Tóxico para microcrustáceos da espécie Artemia Salina

CDCl3, 150 MHz

(3S,18S,4E,16E)-eicosa-1,19 dine-3,18-diol-4,16 dieno (1)



Callyspongia truncata

KOBAYASHI et al, 1997

Propriedade Citotóxica

CDCl3, 125 MHz


NAKAO et al, 2002

Auxilia no controle da diabetes tipo II

CD3OD, 150 MHz

Callyspongia flammea

MIAO & ANDERSEN, 1991

Atividade não relatada

CDCl3, 75 MHz

POLIACETILENOS

Calistatina A (2)

Ácido Calispongínico (3)

Calidina (4)



Callyspongia sp.

ROONEY & CAPON, 1998


CDCl3, 100 MHz

Callyspongia fisturalis

YOUSSEF, SOEST & FUSETANI, 2003


CDCl3, 125 MHz

Calispongina A (5) n + m = 18

Calispongina B (6) n + m = 20

Calispongamida (7)

Callispongidiol (8)



Callyspongia sp.

UMEYAMA et al, 2010

Atividade Anticâncer

CDCl3, 75 MHz

Callyspongia sp. & Callyspongia truncata

UMEYAMA et al, 2010;

UMEYAMA, NAGANO & ARIHARA, 1997;

TSUKAMOTO et al, 1997

CDCl3, 75 MHz; CDCl3, 150 MHz, CD3OD, 125 MHz

Atividade anticâncer e Inibidor da H-K ATPase

Dihidroxi-Sifonodiol (9)

Sifonodiol (10)

Caliberina A (11)



Callyspongia sp. & Callyspongia truncata

UMEYAMA, NAGANO & ARIHARA, 1997; TSUKAMOTO et al, 1997


CDCl3, 150 MHz; CD3OD, 125 MHz

Callyspongia sp.

UMEYAMA, NAGANO & ARIHARA, 1997


CDCl3, 150 MHz

Caliberina B (12)

Caliberina C (13)

Calispongina A (14)




TSUKAMOTO et al, 1997; UNO et al, 1996;

Inibidor da fertilização de gametas de estrela-do-mar

CD3OD, 125 MHz; CD3OD (14) e DMSO (15), 125 MHz

Calispongina B (15)

Calisponginol A (16)

Calisponginol B (17)

Calisponginol C (18)



Callyspongia sp

YOUSSEF, SOEST & FUSETANI, 2003

Propriedade citotóxica

CDCl3, 150 MHz

Dehidroisofonocalinol (19)

Calitriol A (20)

Calitriol B (21)

Calitriol C (22)




TSUKAMOTO et al, 1997

Atividade antifúngica

CD3OD, 125 MHz

POLIACETILENOS AICUPICANINOS

Calitriol D (23)

Callitriol E (24)

Aicupicanino A (25)

Aicupicanino B (26)



Aicupicanino C (27)

Aicupicanino D (28)

Aicupicanino E (29)

Aicupicanino F (30)



Callyspongia ssp.

YOUSSEF et al, 2000

Atividade antitumoral (Estruturas 29 e 30)

CDCl3, 100 e 125 MHz

Callyspongia spinosissima

GARG & AGRAWAL, 1995

Atividade antiviral

Dados do solvente e do aparelho não relatados

DITERPENO

Octahidrosifonochalina (31)

Callipinol (32)



Callyspongia sp

FUKAMI et al, 1997


CDCl3, 100 u 125 MHz

MEROTRITERPENOS

Acaterpina (33)

Ilhabelanol (34)



Callyspongia sp

GRAY et al, 2006; SELEGUIM et al, 2007

Atividade Anticâncer

CD3OD, 150 MHz


FUGITA et al, 2003

Inibidor da enzima MT1-MMP

CD3OD, 150 MHz

ÁCIDO GRAXO

Ilhabreno (35) Isoakaterpina (36)

Sulfato Callisponginol A (37)



Callyspongia sp

BUCHANAN et al, 2007


DMSO, 150 MHz

Callyspongia sp

WANG, KUTAMOTO & UEMURA, 1996

Atividade Antifúngica

CD3OD, 100 MHz

ALCALÓIDE

Nifatoxina C (38)

Untenina A (39)

Untenina B (40)

Untenina C (41)



Callyspongia ridleyi

SCOTT et al, 2000


D2O, 62,9 MHz

Halitoxina (42) Anfitoxina (43)

Valor médio n = 3

X = CH2CH2CH2

ou

CH2CH=CH

Razão 1:1

1,3 - Sal de alquilpiridinium (44)



Callyspongia sp

TOTH & SCHMITZ, 1994


CDCl3, 125 MHz (45); CDCl3/C6D6 75,4 MHz (46)

Callyspongia sp

URBAN & CAPON, 1997


CDCl3, 75 MHz

PERÓXIDOS ÁCIDOS

LIPÍDEOS

Nome não especificado (45) Nome não especificado (46)

(6Z,9Z,12Z,15Z)-1,6,9,12,15-octadecapenten-3-ona (47)



Callyspongia spp

YANG et al, 2009

Atividade anticâncer

CD3OD, 125 MHz

PEPTÍDEOS

Calispongidipeptídeo A (49)

Seco-((S)-Pro-(R)-Val) (50)

Ciclo-((S)-Pro-(R)-Leu) (48)

Ciclo-((S)-Pro-R)Ile) (51)



Callyspongia abnormis

BERER et al, 2004


CD3OD, 125 MHz

Calinormina A (52)



Callyspongia bilamellata

CAPON et al, 2002

Atividade antiparasitária

CD3OD, 100 MHz

Foriospongina A (53)

Foriospongina B (54)



Caliaerina E (55)



Callyspongia aerizusa

IBRAHIM et al, 2010

Propriedade citotóxica

DMSO, 150 MHz

Calliaerina H (56)



ESTERÓIDES

24S-24-metil colastano-3b,6b,25-triol-25-O-

acetato (57)

24S-24-metil colestano-3b,6b,8b,25- tetraol-

25-O-acetato (58)

24S-24-metil colest-25-eno-3b,5a,6b,

12b-tetrol (59)



Callyspongia fibrosa

RAO et al, 2010

Atividade antimalarial (estruturas 60 e 61)

Dados do solvente e aparelho não relatados

24S-24-metilcolastano-3b,5a,6b,25-

tetraol-3,6,25-O-triacetato (60)

24S-24 metil-colastano-3b,5a,6b,25-

tetraol-25-monoaacetato (61)

24S-24-metil celestane-3b,5a,6b,12b,25-

pentaol-25-O-acetato (62)



ESPÉCIE SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA

abnormis Calinorminas A (52) BERER et al 2004 (52)

aerizuza Calierina E (55) e H (56) IBRAHIM et al 2010 (55 e 56)

bilamelata Foriosponginas A (53) e B (54) CAPON et al 2002 (53 e 54)

Fibrosa

24S-24-metil colastano-3b,6b,25-triol-25-O-acetato (57),

24S-24-metil colestano-3b,6b,8b,25- tetraol-25-O-acetato(58)

24S-24-metil colest-25-eno-3b,5a,6b,12b-tetrol (59),

24S-24-metilcolastano-3b,5a,6b,25-tetraol-3,6,25-O-triacetato (60),

24S-24 metil-colastano-3b,5a,6b,25-tetraol-25-monoaacetato (61) e

24S-24-metil celestane-3b,5a,6b,12b,25-pentaol-25-O-acetato (62)

RAO et al 2010 (57 – 62)

fisturalis Calispongamida A (7)

flammea Calidina (4) MIAO & ANDERSEN, 1991

pseudoreticulada (3S,18S,4E,16E)-eicosa-1,19 dine-3,18-diol-4,16 dieno (1) BRAEKMAN et al 2003 (1)

Ridleyi Halitoxina (42), Anfitoxina (43) e

Sal de alquilpiridinium (44) SCOTT et al 2000 (42 – 44)

Sp

Calisponginas A (5) e B (6)

Calispongidiol (8)

Dihidroxi-Sifonodiol (9)

Sifonodiol (10)

Caliberinas A(11) e B (12)

Caliberina C (13)

Calisponginols A (16), B (17), C (18) e Dehidroisofonocalinol (19)

ROONEY & CAPON, 1998 (5 e 6)

UMEYAMA et al 2010 ( 8, 9 e 10)

UMEYAMA, NAGANO e ARIHARA, 1997;

TSUKAMOTO, 1997 (10 )

UMEYAMA, NAGANO e ARIHARA, 1997 (11 - 13)

YOUSSEF, SOEST & FUSETANI, 2003 (16 – 19)

FUKAMI et al 1997 (33)

TABELA 2 - Substâncias isoladas de diferentes esponjas pertencentes ao gênero Callyspongia.



Acaterpina (33)

Ilhabelanol (34), Ilhabreno (35) e Isoacaterpina (36) Nifatoxina (38)

Unteninas A (39), B (40), C (41)

Nome não especificado (45) e (46)

(6Z,9Z,12Z,15Z)-1,6,9,12,15-octadecapenten-3-ona (47)

GRAY et al 2006; SELEGUIM et al 2007 (34 – 36)

BUCHANAN et al 2007 (38)

WANG, KUTAMOTO & UEMURA, 1996 (39 – 41)

TOTH & SCHMITZ, 1994 (45 e 46)

URBAN & CAPON, 1997 (47)

spinosissima Calipinol (32) GARG & AGRAWAL, 1995 (32)

Spp

Aicupicaninos A (25), B (26), C (27), D (28), E (29), F (30) e

Octahidrosifonochalina (31)

Ciclo-((S)-Pro-(R)-Leu) (48)

Calispongidipeptídeo A (49),

Seco-((S)-Pro-(R)-Val) (50), e

Ciclo-((S)-Pro-R)Ile) (51)

YOUSSEF et al 2000 (25 – 31)

YANG et al 2009 (48 – 51)

Truncata

Ácido Calispongínico (3),

Calistatina A (2),

Sifonodiol (10)

Caliberinas A(11) e B (12)

Calisponginas A (14) e B (15)

Calitriols A (20), B (21), C (22), D (23), E (24)

Sulfato Calisponginol (37)

NAKAO et al 2002 (3)

KOBAYASHI et al 1997 (2)

TSUKAMOTO et al 1997 (10 – 12, 14 – 15 e 20 - 24)

UNO et al 1996 (14 e 15)

FUGITA et al 2003 (37)



3.2. POLISSACARÍDEOS

Os açúcares complexos ou polissacarídeos são polímeros naturais

formados por unidades repetidas (meros) de monossacarídeos. Eles podem ser

obtidos de plantas (incluindo as algas), bactérias, fungos, animais superiores e

invertebrados. Nas últimas décadas os polissacarídeos foram alvo de estudos

por contribuírem em muitos processos celulares e apresentarem várias

propriedades como estabilizantes e espessantes (indústria alimentícia);

biossensores, veículo de liberação de fármacos (indústria farmacêutica); além

de atividades biológicas como: antitumorais, anticoagulantes e antioxidante

(CUNHA, PAULA, FEITOSA, 2009).

Os animais invertebrados de um modo geral, e, principalmente os de

origem marinha, têm se mostrado bastante promissores na obtenção de

polissacarídeos sulfatados com estruturas únicas como L-galactanas e L-

fucanas sulfatadas. Nos animais, os polissacarídeos mais conhecidos são os

glicosaminoglicanos, destacando-se, por exemplo, o sulfato de condroitina,

sulfato dermatamo e heparina (MOURÃO, ZIERER, 2000; RODRIGUES,

FARIAS, 2010). Estes polissacarídeos apresentam atividades anticoagulantes

e antitrombóticas devido a sua similaridade com a heparina (figura 4), que é um

mucopolissacarídeo sulfatado, com grande quantidade de cargas elétricas

negativas e constitui o ácido macromolecular mais forte existente no

organismo. Pode ser distinguida de outros polissacarídeos pela sua extrema

acidez, decorrente da grande quantidade de radicais sulfatados na sua

molécula (CUNHA, PAULA, FEITOSA, 2009). Até mesmo polissacarídeos

sulfatados com ação anti-HIV já foram identificados (CIMINO et al, 2001).

Figura 4 - Mero da Heparina.

ou

Fonte: Autor, 2013.

O

O

OSO3

-

COOH

O

O

NH

SO3

-

OSO3

-

OH OH

CO

NH

CH3



3.3. BIOSSÍNTESE DE ÁCIDOS GRAXOS

Dentre as estruturas encontradas na revisão apresentada, há um grande

número de poliacetilenos, isto se deve a sua fácil via de produção biológica.

Poliacetilenos são produzidos através da desidrogenação de ácidos graxos,

que são substâncias encontradas em todos os organismos vivos. Logo, supõe-

se a existência de uma grande quantidade de ácidos graxos na composição

química das esponjas pertencentes ao gênero Callyspongia, em virtude da

quantidade de poliacetilenos encontrados. Logo, se faz interessante saber

como a natureza produz essas substâncias.

Acetilenos são amplamente encontrados em plantas superiores, liquens,

musgos, algas marinhas, esponjas, tunicatos, fungos, insetos e sapos. Dentre

os organismos marinhos, a principal fonte de poliacetilenos e ácidos graxos são

as esponjas. Os gêneros Petrosia, Xestospongia, Cribochalina, Siphonochalina,

Haliclona e Callyspongia são conhecidos como fontes de poliacetilenos. Estas

moléculas apresentam insaturações (duplas ou triplas), podendo ser

conjugadas, ou não, conter diferentes grupos funcionais como halogênios,

hidroxilas e cetonas (NUZZO et al, 2012).

A biossíntese dos ácidos graxos acontece a partir de um produto final do

catabolismo de carboidratos e aminoácidos, a acetil coenzima A (Figura 5), ou

acetil-SCoA. É um processo conhecido como lipogênese, e sua produção está

interligada aos metabolismos de carboidratos, lipídeos e proteínas (CLAYDEN,

2000).

Figura 5 - Acetil Coenzima A (Acetil-CoA).

Fonte: Autor, 2013.

N

N

N

N

O

OH

OP

OH

OH

O

O

P

O

P

OH OHO O

O

NH2

N N

CH3 CH3

OH

O

H

O

H

S CH3

O



A acetil-CoA, através de rotas biossintéticas diferentes, é responsável

pela produção de várias classes de metabólitos secundários (Figura 6):

Figura 6 - Esquema de diferentes rotas biossintéticas que tem a acetil-CoA como precursora.

Os ácidos graxos produzidos através dessa rota biossintética possuem

peculiaridades, como a ausência de ramificações, números pares de átomos de

carbono, podem ou não conter insaturações, entretanto, estas insaturações

nunca são conjugadas.

A primeira etapa na biossíntese de ácidos graxos é a condensação entre

acetil-CoA e malonil-CoA (onde CoA = SR), com perda de CO2 e formação de

uma nova ligação C-C, este processo ocorre devido a acidez do hidrogênio α a

carbonila, e o meio deve conter moléculas capazes de carregar H, assim:

Posteriormente, ocorre a redução de uma carbonila cetônica (o NADPH

promove uma reação regiosseletiva), seguida por desidratação. A eliminação

da hidroxila e hidrogênio, nesta etapa, ocorre de forma cis, e a dupla formada é

exclusivamente trans:

O

SR

S

O-

O

O

R

CO2

SR

O O

Condensação

Enzimática

Acetil-CoA

Ácido Mevalônico

Malonil-CoA

Policetídeos

Ácidos Graxos

Terpenos

Esteróides

Fonte: Autor, 2013.



Para encerrar este ciclo, ocorre a redução da dupla ligação por uma

molécula de NADPH, ocasionando assim, em uma cadeia saturada:

Agora, todo este ciclo pode recomeçar, inicialmente quatro átomos de

carbono são adicionados, formando uma cadeia de 6 átomos de carbono. A

partir de agora, cada vez que este processo ocorrer novamente, 2 átomos de

carbono são inseridos na cadeia e assim a parte hidrofóbica do ácido graxo

segue sendo incrementada. No decorrer do processo de biossíntese de ácidos

graxos, enzimas complexas e proteínas transportadoras participam

efetivamente deste processo, por isso suas estruturas não estão relatadas

aqui.

Por fim, uma reação de hidrólise ocorre para conversão do tio éster em

ácido carboxílico, como mostrado a seguir:

SR

O O

SR

OH O

SR

O

H2O

B-cetoacil-ACP

Redutase

3-hidroxiacil-ACP

Dehidratase

NADPH

SR

O

SR

O

NADPH

O-

SCoA

O O

SCoA

O CO2

SCoA

O



Como já mencionado, os poliacetilenos são produzidos pela

desidrogenação de ácidos graxos. Já mostramos como a formação de ácidos

graxos é feita através da acetil-CoA. Enzimas promovem a captura de

hidrogênios, permitindo assim que os poliacetilenos sejam formados. O

esquema a seguir, figura 7, apresenta a formação de alguns poliacetilenos

oriundos do ácido oleico (CLAYDEN et al, 2000).

Figura 7 - Esquema de formação de ácidos graxos a partir do ácido oleico.

SR

O

OH-

SR

OH O-

OH

O

Ácido eicosa-

8,11,14-trióico

Ácido

Araquidônico

Oxidação

Oxidação

Oxidação

Ácido

oleico

Ácido

linoleico

Ácido γ-

linolênico

Outra acilação

Fonte: Autor, 2013.

CO2H

CO2H

CO2H

CO2H

CO2H

1

1

1

1

1

9

9

9

12

12

18

20

18

18

20

6

14

14

11

11

8

58

Objetivos


4 OBJETIVOS

4.1 GERAIS

Prospecção química da Callyspongia vaginalis.

4.2 ESPECÍFICOS

Preparação de um extrato orgânico e um aquoso de um espécime de

Callyspongia vaginalis;

Particionamento do extrato orgânico obtido, através de partição

líquido/líquido e/ou cromatografia em gel de sílica;

Isolamento dos metabólitos secundários presentes nas frações,

utilizando métodos cromatográficos apropriados como: CC, Sephadex,

CLAE;

Obtenção e caracterização do polissacarídeos de C. vaginalis através

do extrato aquoso;

Elucidar as estruturas dos compostos isolados, empregando métodos

espectroscópicos como IV, EM, RMN 1H e 13C, uni e bidimensional;

Procedimento Experimetnal


5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5.1 ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS

5.1.1 Obtenção dos extratos

O material de estudo foi cedido pelo prof. Edilberto Rocha Silveira,

coordenador do LAFIPLAM, onde se encontrava armazenado este animal. Um

espécime de Callyspongia vaginalis, foi coletado na pedra da risca do meio, no

Atol das Rocas-CE em 14 de julho de 2004, no estado do Ceará, e identificado

pelo prof. Dr. Eduardo Carlos Meduna Hajdu, da Universidade Federal do Rio

de Janeiro. Foram coletados 5,345 Kg do animal (peso úmido). Após coleta, a

esponja foi alocada em mariote contendo etanol e armazenada em freezer até

o início do trabalho. Posteriormente a esponja foi removida e solvente foi

filtrado com algodão, para remoção de partículas maiores, em seguida o

solvente foi evaporado em temperatura de 60°C à pressão reduzida, dando

origem ao extrato bruto CVEA (~30 g – peso úmido). Em seguida, a esponja foi

triturada em liquidificador industrial, e então colocada novamente no mariote

contendo EtOH, por três dias, este procedimento foi reproduzido. As soluções

resultantes destes processos, denominadas B e C foram filtradas e os

solventes evaporados, dando origem aos extratos brutos CVEB (~23 g peso

úmido) e CVEC (~20 g peso úmido), respectivamente. Os extratos foram

mantidos separados, na intenção de diminuir a quantidade de sal em cada um.

5.1.2 Partição líquido-líquido

Os extratos brutos obtidos foram submetidos à extração líquido-líquido,

separadamente, utilizando como solventes hexano (C6H14), clorofórmio (CHCl3)

e acetato de etila (C4H8O2). A cada um deles, A, B e C foram adicionados 80

mL de água e 30 mL de MeOH, e então esta foi colocada em funil de

separação, juntamente com 120 mL de hexano (4 x 30 mL) então separou-se a

solução hexânica (CVEH) para cada um dos extratos brutos (A, B e C). Em

seguida, adicionou-se à fase hidro-alcoolica 100 mL de clorofórmio (2 x 50 mL),

e separou-se a solução clorofórmica (CVEC) para cada extrato bruto.



Removida esta fração, adicionou-se ao funil 50 mL de acetato de etila,

separando então a solução (CVEA) para cada extrato bruto. Logo após estes

procedimentos, os resíduos hidro-alcoolicos foram reunidos As extrações com

solventes foram concentradas em evaporador rotativo, originando seus

respectivos extratos, conforme mostrados nas figuras 8 (A e B) , a seguir:



Figura 8a - Obtenção do extrato (CVE) e obtenção de suas subfrações, assim como polissacarídeo.

Callyspongia vaginalis

(CV)

Extrato Etanólico

(CVE) – 73 g (peso úmido)

CVE – A

~ 30 g

CVE – B

~ 23 g

CVE – C

~ 20 g

Polissacarídeo

Concentração do extrato

Divisão do extrato

Secagem do material

animal, seguido de

trituração e extração

com água e precipitação

com etanol.

Partição com solventes

CVEHA, B e C

CVECA, B e C

CVEAA, B e C

Análise por CCD

Residuo Aquoso

67,3863 g

Fonte: Autor, 2013.



Figura 8b - Obtenção das substâncias isoladas e ésteres metílicos.

CV-1 e CV-2

Purificação por

recristalização

CVEHA (1,2373 g)

CVEHB (1,4826 g)

CVEHC (1,8838 g)

A

B

C

6 frações

10 frações

9 frações

CC. flash

CC. flash

CC. flash

Reunidas após

CCD P

AR

TIÇ

ÃO

LÍQ

UID

O -

LÍQ

UID

O

CVECA

CVECB

CVECC

CVEC

0,7274 g

Reunidas após

CCD CC. flash

6 frações

CVEAA

CVEAB

CVEAC

CVEA

0,2826 g

Reunidas após

CCD CC. flash

4 frações

CVEC – 1

Ésteres

metílicos

Fonte: Autor, 2013.



5.2 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Nas cromatografias de adsorção foram utilizadas gel de sílica 60 ( μm

63-200) e de sílica 60 para coluna cromatográca flash ( μm 400 - 200) da

Ultra Chem. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com

as alíquotas das amostras e as quantidades de gel de sílica utilizadas. As

colunas utilizadas na cromatografia de adsorção sob pressão média

(cromatografia flash) foram de vidro resistente à pressão e continham bulbos

no ápice, para armazenamento do solvente.

Para cromatografia de camada delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas

de gel de sílica 60 ( m 2-25) sobre poliéster e/ou alumínio T-6145 da Sigma

Chemical CO.

Os eluentes utilizados foram: hexano, clorofórmio, diclorometano,

acetato de etila, e metanol, puros ou combinados em proporções crescentes de

polaridade.

A revelação das substâncias nas cromatoplacas analíticas foi realizada

por imersão em solução de vanilina (C8H8O3) e ácido perclórico (HClO4) em

etanol (C2H6O), seguido de aquecimento em chapa a 100 0C por

aproximadamente 5 minutos, ou ainda por exposição a vapores de iodo e

observação sob luz UV.

5.2.1 Fracionamento cromatográfico dos extratos obtidos

Inicialmente cada extrato (CVEH, CVEC e CVEA) foi submetido à

cromatografia em coluna para separação de substâncias por diferença de

polaridade, utilizando os solventes mencionados acima, em gradiente de

eulição. Após o término de cada procedimento cromatográfico, suas frações

foram analisadas por CCD.

O texto abaixo relata a forma de como os procedimentos

cromatográficos foram realizados. Para cada extrato são relatados o diâmetro

da coluna (todas de 50 cm), assim como os solventes utilizados na eluição de

cada fração e o volume coletado para cada uma.



5.2.2 Fracionamento de CVEHA

A fração CVEHA (1,2373 g) foi adsorvida em gel de sílica flash numa

proporção 1:2 e pulverizado em gral de porcelana, sendo acondicionada sobre

12,3730 g (1:10) de gel de sílica flash, numa coluna cromatográfica ( = 2,5

cm). A eluição foi feita com solventes puros ou mistura binária dos solventes

hexano, clorofórmio e acetato de etila seguindo uma ordem crescente de

polaridade, e por fim metanol foi utilizado para eluição dos compostos mais

polares. Conforme tabela abaixo:

Tabela 3 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento de CVEHA.

FRAÇÃO SOLVENTE / VOLUME (mL)

CVEHA – 1 CHCl3/AcOEt 5% (200)

CVEHA – 2 CHCl3/AcOEt 50% (200)

CVEHA – 3 AcOEt 20% (100)

CVEHA – 4 AcOEt/MeOH 20% (300)

CVEHA – 5 AcOEt/ MeOH 50% (200)

CVEHA – 6 MeOH 100% (200)

5.2.3 Fracionamento de CVEHB

A fração CVEHB (1,4826 g) foi adsorvida em gel de sílica flash (1:2) e o

produto alocado em coluna contendo gel de sílica (1:10). O procedimento

ocorreu sob média pressão em coluna 2,5 cm de diâmetro. Como resultado,

obtiveram-se 10 frações de 100 mL cada.

Tabela 4 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento de CVEHB.


CVEHB – 1 CH2Cl2 – (100)

CVEHB – 2 CH2Cl2 (100 mL) e CH2Cl2/AcOEt 10% - (100)

CVEHB – 3 CH2Cl2/AcOEt 10% - (100)

CVEHB – 4 CH2Cl2/AcOEt 20% - (100)

CVEHB – 5 CH2Cl2/AcOEt 1:1 – (100)

Fonte: Autor, 2013.



CVEHB – 6 AcOEt – (100)

CVEHB – 7 AcOEt/MeOH 10% - (100)

CVEHB – 8 AcOEt/MeOH 10% (100 mL) e AcOEt/MeOH 20%- (100)

CVEHB – 9 AcOEt/MeOH 1:1 (100) e AcOEt/MeOH 70% - (100)

CVEHB – 10 MeOH – (200)

Em seguida as frações das colunas A e B foram analisadas por CCD e

reunidas de acordo com sua semelhança cromatográfica.

5.2.4 Fracionamento de CVEHC

A fração CVEHC (1,8838 g) foi cromatografada em 47,095 g de gel de

sílica flash, (1:25) numa coluna de 3 cm de diâmetro, sob pressão reduzida.

Foram obtidas 9 frações, sendo o volume de coleta de 100 mL:

Tabela 5 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento de CVEHC.


CVEHC – 1 CHCl3/AcOEt 5% - (400)



CVEHC – 4 CHCl3/AcOEt 1:1 – (200)

CVEHC – 5 AcOEt (100 mL) e AcOEt/ MeOH 10% - (100)

CVEHC – 6 AcOEt/ MeOH 20% - (100)

CVEHC – 7 AcOEt/ MeOH 30% (100 mL) e AcOEt/ MeOH 1:1–(100)

CVEHC – 8 MeOH – (100)

CVEHC – 9 MeOH – (100)

As frações CVEHC 1 e 5 foram analisadas por CCD e em seguida

lavadas em metanol e então submetidas à análises de RMN 1H e 13C, e tiveram

suas estruturas químicas elucidadas.

Fonte: Autor, 2013.

Fonte: Autor, 2013.



5.2.5 Fracionamento de CVEC

Para esta coluna foram reunidas as frações CVECA (0,1951), CVECB

(0,1869) e CVECC (0,3454), por possuírem perfil cromatográfico semelhante

após análise em CCD. Utilizou-se a proporção 1:2 entre a massa de extrato

(0,7674 g) e sílica. O adsorvato foi acondicionado sobre gel de sílica flash

1:20(14,548 g), em coluna ( = 2,5 cm). O resultado cromatográfico originou 6

frações, coletadas em volume de 50 mL, segundo tabela abaixo:

Tabela 6 - Solventes (volume) utilizados no fracionamento de CVEC.


CVEC – 1 CHCl3/AcOEt 5% - (200)

CVEC – 2 CHCl3/AcOEt 15% (100 mL) e CHCl3/AcOEt 30% - (100)

CVEC – 3 CHCl3/AcOEt 60% (100) , AcOEt (100) e AcOEt/MeOH 10%-(100)

CVEC – 4 AcOEt/MeOH 20% - (100)

CVEC – 5 AcOEt/MeOH 30% - (100)

CVEC – 6 AcOEt/MeOH 50% (100) e MeOH – (100)

5.2.6 Fracionamento de CVEA

Nesta coluna foram unidas as frações CVEAA (0,0855 g), CVEAB

(0,1149) e CVEAC (0,0822 g), devido suas semelhanças cromatográficas em

CCD. Foram utilizadas as mesmas proporções acima citadas (1:2), e o

adsorvato foi acondicionado sobre gel de sílica flash 1:20 (5,652 g), em coluna

de 2,5 cm de diâmetro. Foram utilizados hexano, clorofórmio, acetato de etila e

metanol como eluentes. Foram coletados volumes de 50 mL, e ao final obteve-

se 4 frações, conforme tabela a seguir:

Fonte: Autor, 2013.



Tabela 7- Solventes (volume) utilizados no fracionamento de CVEA.


CVEA – 1 AcOEt (100) e AcOEt/MeOH 25% - (100)

CVEA – 2 AcOEt/MeOH 50% - (100)

CVEA – 3 MeOH – (100)

CVEA – 4 MeOH – (100)

5.3. OBTENÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS

5.3.1. Saponificação

A fração CVEC -1 (94,9 mg) foi submetida a reação de saponificação.

Inicialmente ela foi solubilizada adicionando-se algumas gotas de CH2Cl2, em

seguida adicionou-se 0,4 mL de uma solução alcoólica de NaOH, (1 g/5 mL de

etanol). A mistura reacional foi transferida para balão de fundo redondo,

mantido sob agitação e refluxo, 60º C, por duas horas. Posteriormente,

adicionou-se ao produto de reação 30 mL de água destilada, e então transferiu-

se para funil de separação. Em seguida a fração insaponificável foi extraída

com 2 x 20 mL de CH2Cl2 e coletada em erlenmeyer. A este foi adicionado

sulfato de sódio anidro, seguida de filtração, e esta fração foi concentrada em

evaporador rotativo, resultando em 25 mg.

Após a remoção do material insaponificável, o meio foi acidificado pela

adição de 0,5 mL de HCl concentrado e os ácidos graxos livres foram

removidos pela adição de 3 x 20 mL de CH2Cl2. Da fração rica em ácidos

graxos foi removida a água residual com NaSO4 anidro. Logo após, a fração

orgânica foi filtrada e o solvente evaporado em rotaevaporador, originando 60

mg.

5.3.2 Esterificação

Os ácidos graxos livres (60 mg) (item 5.3) foram submetidos a reação de

esterificação para análise de seus ácidos graxos correspondentes. Adicionou-

se algumas gotas de CH2Cl2, para solubilização da amostra, em seguida

Fonte: Autor, 2013.



adicionou-se 5 mL de MeOH e 0,5 mL de HCl concentrado. A mistura reacional

foi mantida sob agitação e refluxo, 60º C, por uma hora. Ao término da reação,

adicionou-se ao produto reacional 10 mL de uma solução saturada de NaCl.

Esta mistura foi transferida para um funil de separação, e os ésteres metílicos

foram extraídos com 3 x 20 mL CH2Cl2. À fração que continha os ésteres foi

adicionada sulfato de sódio anidro, seguida de filtração e concentração da fase

orgânica, resultando em 36,5 mg. Os ésteres foram submetidos a análise de

CG-MS para conhecimento de seus ácidos graxos.

5.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTRÔMETRIA DE

MASSAS – CG-MS

As análises de CG/MS foram realizadas em cromatógrafo a gás da

marca Shimadzu modelo GC-2010 acoplado a um espectrômetro da mesma

marca de modelo GC-MS-QP2010 Plus, com injetor split a temperatura de

220ºC, gás de arraste hélio a fluxo contínuo de 1mL/min e a coluna utilizada foi

RTx-5 (30m x 0,25 mm x 0,25 micrômetros) operando a 60ºC-240C a 3ºC/min.

A fonte de íons foi mantida a 240ºC e a interface a 240ºC. A identificação dos

compostosfoi realizada através de comparação dos espectros de massas

obtidos com aqueles existentes no banco de dados do aparelho, NIST08s.LIB.

5.5 ISOLAMENTO DA FRAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS

O material animal resultante, após sucessiva extrações com etanol

(item5.1.1), foi seco em estufa aerada, sob 70° C por 12 horas, em seguida foi

triturado em liquidificador. Após esta etapa deu-se início ao processo de

isolamento do polissacarídeo dissolvendo-se 1 g do material seco em 200 mL

de água destilada. A mistura foi mantida sob agitação e aquecimento, 70 ° C,

por 2 horas. Após esse tempo, a mistura permaneceu sob agitação por 24

horas a temperatura ambiente.

Em seguida, a mistura foi filtrada à vácuo em funil de buchner e papel de

filtro. O filtrado foi transferido para outro erlenmeyer e a ele foi adicionado 500

mL de etanol puro, para precipitação dos polissacarídeos. Esta solução foi

alocada em geladeira, por 24 horas. Após precipitação o material foi filtrado em



funil de placa sinterizada e precipitado mantido no funil foi lavado com

pequenas porções de etanol e acetona, resultando grânulos de cor marrom

escuro. Após maceração, para unificação do tamanho das partículas, o pó

resultante era de coloração cinza bem claro.

5.5.1 Purificação dos polissacarídeos

O método de purificação é semelhante ao proposto por (COSTA,

RODRIGUES; DE PAULA, 1996), com modificações. Para sua purificação o

polissacarídeo isolado é novamente solubilizado em água destilada, e mantido

nas mesmas condições de agitação, temperatura, precipitação e filtragem do

item 5.5.

5.5.2 Infravermelho

A amostra do polissacarídeo formado foi misturado ao brometo de

potássio (KBr) e maceradas em um almofariz até a obtenção de um pó fino

homogêneo. Posteriormente, este pó foi colocado em um pastilhador e

prensado. A pastilha obtida foi analisada em um espectrômetro de

infravermelho na região de 4000 a 400 cm-1. Tendo como modelo Nexus 470

FT-IR e fabricante Themo Nicolet.

5.5.3 Hidrólise

Pesou-se 20 mg do polissacarídeo purificado em tubo de ensaio, em

triplicata, posteriormente todos foram solubilizados com 1 mL de água

destilada, mantido sob agitação por 24 h. Em seguida adicionou-se 1 mL de

HCl 4 M, para início da hidrólise do mesmo. Este foi hidrolisado por 2, 6 e 8

horas.

5.5.4 Dosagem de açúcar redutor

Para a dosagem do açúcar redutor, foi utilizado o método de Nelson

Somogyi (SILVA et al, 2003) o qual consiste na determinação de açucares



redutores solúveis. A quantidade recomendada pela técnica é de 100 mg. A

curva de calibração foi construída utilizando como padrão a galactose com

concentrações variando de 0,8, 1, 3, 5, 7. 9 e 10 mg/mL.

5.5.5 Análise Termogravimétrica

Uma massa de aproximadamente 5,17 mg de material isolado foi

aquecida em equipamento SDT-Q 600 fabricante TA, em atmosfera inerte e

com taxa de aquecimento de 2,5 oC\min com uma variação de 25ºC à 900ºC.

5.6 MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS - CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS E POLISSACARÍDEOS

5.6.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

(RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H)

e Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em

espectrômetros Bruker, modelo Avance DRX-500, pertencentes ao Centro

Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da

Universidade Federal do Ceará (CENAUREMN-UFC).

Os experimentos foram realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500 e

DPX-300. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: sonda dual de 5

mm com detecção direta (experimentos unidimensionais) e sonda multinuclear

de 5 mm com detecção inversa (experimentos bidimensionais). As amostras

foram dissolvidas em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado: clorofórmio

(CDCl3), água (D2O) e metanol (CD3OD), Tedia Brazil. Os deslocamentos

químicos () foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados, no

caso dos espectros de Hidrogênio, pelos picos dos hidrogênios pertencentes às

moléculas residuais não-deuteradas dos solventes deuterados utilizados:

clorofórmio ( 7,27), metanol ( 3,31), água ( 4,80), piridina ( 8,73, 7,59 e

7,22) e DMSO ( 2,71) . Nos espectros de 13C, os deslocamentos químicos



foram referenciados pelos picos centrais dos carbonos-13 dos solventes:

clorofórmio ( 77,23), metanol ( 49,15), piridina ( 150,2 ) e DMSO ( 40,1).

As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H

foram indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (duplo

dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).

Os microprogramas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg),

13C-CPD (zgpg), 13C-DEPT 135 (dept135), gs-COSY (cosygp), gs-HSQC

(hsqcgpph), gs-HMBC (hmbclpndqf).

A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer),

com ângulos de nutação de 135, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos

CH2, e 90, somente CH, foi utilizada na determinação do padrão de

hidrogenação dos carbonos em RMN 13C, descrito segundo a convenção: C

(carbono não-hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico

ou metilidênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não-hidrogenados

foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.

Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY) e

heteronuclear (HSQC-editado, HSQC e HMBC), realizados no aparelho Bruker

Avance DRX-500, foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com

detecção inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e

magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados para os experimentos

pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n 2.

Resultados e Discussão


6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um espécime, triturado, de C. vaginalis, foi submetida a 3 extrações

sucessivas com etanol, rendendo os extratos CVE- A, CVE-B e CVE-C. O

resíduo resultante do animal, após extrações, foi tratado com água e etanol

para extração da fração de polissacarídeos deste animal. Os extratos

etanólicos foram submetidos a tratamentos cromatográficos e análise por

espectrometria de massa e Ressonância Magnética Nuclear, o que permitiu a

identificação de alguns metabólitos secundários presentes na espécie, bem

como conhecer a composição lipídica do animal.

6.1 FRACIONAMENTO DAS FRAÇÕES HEXÂNICAS DE CVEH

Cromatografiade adsorção em gel de sílica das frações hexânicas,

produzidas por particionamento dos extratos etanólicos de C. vaginalis,

conforme descritas nas tabelas 8 - 10, permitiram o isolamento das substâncias

CV-1 e CV-2.

CV-1 foi isolado na primeira fração de CVEHc, com amistura binária de

clorofórmio/acetato de etila5% e foi novamente isolado pela reunião das

frações CVEHB-3 e CVEHA-2. CV-2 foi isolado também na fração CVEHc com a

mistura de solventes acetato de etila e acetato/metanol 10%. Na tabela 10,

estão esses metabólitos destacados.

Tabela 8 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHA

FRAÇÃO MASSA (g) CCD (CHCl3:MeOH 20%)

CVEHA – 1 0,1066

CVEHA – 2 0,4661

CVEHA – 3 0,0993

CVEHA – 4 0,1107

CVEHA – 5 0,1873

CVEHA – 6 0,1298

Fonte: Autor, 2013. Rendimento = 96,09%



Tabela 9 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHB.


CVEHB – 1 0,3055

CVEHB – 2 0,1339

CVEHB – 3 0,1300

CVEHB – 4 0,1119

CVEHB – 5 0,1155

CVEHB – 6 0,1072

CVEHB – 7 0,2068

CVEHB – 8 0,1543

CVEHB – 9 0,0500

CVEHB – 10 0,1092


Tabela 10 - Frações, massas e rendimento do fracionamento de CVEHC.


CVEHC – 1 0,2498

CVEHC – 2 0,1968

CVEHC – 3 0,1064

CVEHC – 4 0,0715

CVEHC – 5 0,1767

CVEHC – 6 0,1323

CVEHC – 7 0,2207

CVEHC – 8 0,1205

CVEHC – 9 0,1749

Para todas as CCD mostradas nas tabelas anteriores, a vanilina foi

utilizada como revelador.


CV-1

CV-2



6.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE CV-1

A amostra CV-1 apresentou-se como um sólido amorfo de coloração

branca, solúvel em clorofórmio. A fração foi lavada com metanol para

purificação, e após a lavagem a substância foi analisada por ressonância

magnética nuclear de hidrogênio e carbono – 13. Esta substância, também foi

encontrada na fração, CVEH3b2a (5 mg).

No espectro de RMN 1H verificou-se sinais característicos de

hidrogênios de esteróides na região entre 0,5 e 2,5 ppm, caracterizando

hidrogênios ligados a carbonos metílicos, metilênicos, metinos. Observou-se

um dubleto em 5,35 ppm (J = 7,5 Hz), relativo ao hidrogênio (H-6); um

multipleto em δ 3,47 – 3,56, correspondente ao hidrogênio oximetínico H-3. No

espectro de carbono – 13, através do DEPT, podemos ver a presença de um

carbono olefínico não hidrogenado, C-5, em 140,99 ppm, assim como um sinal

em δ 121,84 para o carbono 6. Através dos resultados analisados, assim como

por comparação destes com dados da literatura, como mostrado na tabela 11,

chegou-se a conclusão de que a substância em questão trata-se do β-sitosterol

(figura 11). Este esteroide é amplamente encontrado em plantas, e também já

foi relatado em esponjas, contudo, sendo inédito no gênero Callyspongia.



Tabela 11 - Comparação entre dados obtidos e da literatura para o esteróide β-Sitosterol. (*, a, b

CDCl3, *125 MHz).

DADOS DA LITERATURA CV -1*

CARBONO β-SITOSTEROLa β-SITOSTEROLb β-SITOSTEROL

1 37,5 37,3 37,41

2 31,9 29,8 31,60

3 72,0 71,7 71,83

4 42,5 42,3 42,34

5 141,0 140,7 140,99

6 121,9 121,7 121,84

7 31,9 31,6 32,03

8 32,1 31,9 32,03

9 50,4 50,1 50,28

10 36,4 36,5 36,34

11 21,3 21,1 21,21

12 40,0 39,8 39,92

13 42,6 42,3 42,44

14 57,0 56,8 57,01

15 24,6 24,3 24,45

16 29,0 28,3 28,94

17 56,3 56,1 56,10

18 12,1 11,9 11,9

19 19,3 19,4 19,52

20 36,4 36,1 36,62

21 19,0 19,1 21,14

22 34,2 33,9 33,33

23 26,1 26,1 28,12

24 46,0 45,8 46,2

25 29,4 29,1 29,50

26 19,7 18,8 20,28

27 19,2 19,9 19,52

28 23,3 23,1 22,95

29 12,4 12,0 12,2

Fonte: (GOAD, 1991a; MOREIRA

b 2001).



Figura 9 - Espectro de RMN 1H da amostra CV-1, CDCl3, 500 MHz.

Fonte: Autor, 2013.

Figura 10 - Espectro de RMN 13

C e DEPT 135 da amostra CV-1, CDCl3, 125 MHz.

Fonte: Autor, 2013.



Figura 11 – Estrutura do β-Sitosterol (C29H50O).

Fonte: Autor, 2013.

As esponjas apresentam-se como fontes de esteroides. Esteróides são

mensageiros químicos, também conhecidos como hormônios. Eles são

apolares, e portanto, lipídeos. Seu caráter apolar permite que atravesse as

membranas celulares, de modo que podem deixar as células nas quais são

sintetizadas e entrar em células alvo (SIMMONS et al 2011).

Em muitas esponjas, esteróis polares ocorrem como constituintes

majoritários (RAO et al, 2010).

6.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE CV-2

A fração CV-2 apresentou-se como um sólido amorfo de cor marrom,

solúvel em clorofórmio. Antes de sua análise por RMN, foram feitas sucessivas

lavagens com metanol para purificação desta substância.

A analise por RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais, forneceram dados

que foram compatíveis com a estrutura de uma ceramida, classe de substância

também inédita no gênero Callyspongia.

O espectro de RMN 1H mostrou sinais correspondentes a vários

hidrogênios metilênicos entre δ 1,28 a 2,56 característicos de cadeia lipídica.

Mostra também um sinal em torno δ 6,00 (m) característico um H metino ligado

a um nitrogênio; sinais em δ 4.48 e 4.31 (dd, 5,1 e 4,23 Hz e dd 5,1 e 4,23 Hz)

para um hidroximetileno, e sinal em δ 4,86 (t) de oximetino. Além destes, sinais

OHOH

1

2

3

45

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

19

20

2122

23

24

25

26

27

28

29



para uma ligação dupla, com geometria E, em δ 6,00 (m) e dois terminais

metila em δ 0,88 (t, J 6,0 Hz). Ainda pode-se observar um dubleto em δ 8,34

(8,31Hz), atribuído ao hidrogênio ligado ao nitrogênio da amida. O espectro

ainda fornece sinais em δ 2,48 (t) e δ 1,85 (m) que são atribídos aos

hidrogênios 2’ e 3’, da cadeia lateral pertencente à cabonila. Por fim, um sinal

em δ 2,11 (q, 6,63 Hz), para o hidrogênio 6, alílico.

Como esperado, o espectro de RMN 13C exibiu sinais de carbono sp2 em

δ 173,8 (C-1’), 132,67 (C-4 e 5), correspondentes a carbonila de amida e a

ligação dupla, respectivamente. Sinais de metínico nitrogenado em δ 57,23 (C-

2), um oximetileno em δ 62,52 (C-1) e um oximetinico em δ 73,68 (C-3). Além

disso, vários sinais de carbono na faixa de δ 39,62 – 23,28 relacionados com

os grupos metilenos e um sinal de carbono em 14,3 correspondente aos dois

grupos metila terminal, também foram interpretados no espectro de 13C RMN,

inferindo para o composto a estrutura de uma ceramida, com uma cadeia

lateral completamente saturada ligada ao carbono carbonílico e uma cadeia

lateral hidroxilada e insaturada ligada ao carbono nitrogenado.

Figura 12 - Espectro de RMN 1H da amostra CV-2, piridina, 300 MHz.

Fonte: Autor, 2013.



Figura 13 - Espectro de RMN 13

C da amostra CV-2, piridina, 75 MHz.

Fonte: Autor, 2013.

Como já mencionado, trata-se de uma ceramida (figura 16). Esta possui

duas cadeias laterais, uma saturada ligada á carbonila, contendo 13 carbonos

e outra insaturada e hidroxilada contendo 12 carbonos. A tabela seguinte nos

mostra os dados de carbono-13, 1H com respectiva constante de acoplamento,

assim como as correlações obtidas através do espectro bidimensional HMBC.



Tabela 12 - Dados de 1H,

13C e correlações HBMC da amostra CV-2, ceramida.

Δ HMBC δ

13C δ 1 H/ J Hz 2JCH 3JCH

C

1’ 173,88 - - -

CH

2 57,23 6,00 (m)

3 73,68 4.86 (t) 2, 4 1

4 132,67 5,91 – 6,10 (m) 3 e 5 6

5 132,67 5,91 – 6,10 (m) 4 e 6 3

CH2

1 62.52 4,48 e 4,23 (dd 5,1 e 4,23 Hz)

2 3

2’ 37,24 2.48 (t) 1’ -

6 32,51 2.08 (q, 6,63 Hz)

5 -

3’ 27.76 1.85 (m) - 1’

(CH2)10 30.36 1.28 – 1,32 - -

(CH2)10 30,36 1.28 – 1,32 - -

CH3 14,61 0,89 - -

N-H - 8,34 (d) 2 e 1’ -

Fonte: Autor, 2013.

Para as cadeias laterais (CH2)10 existem muitas correlações e não há

como especificá-las, o que ocorre também para os carbonos 2’ e 3’. Não é

possível, através das informações observadas no espectro, estabelecer

relações claras entre as metilas terminais, já que alguns sinais se mostram

sobrepostos. A figura 14, a seguir, mostra a relação entre os hidrogênios e

carbonos da estrutura.



Figura 14 - Espectro de HMBC, apontando os principais correlações de CV-2.

Fonte: Autor, 2013.

A figura 15, abaixo, apresenta a correlação dos hidrogênios 3 com os

carbonos 1, 2 e 4; dos hidrogênios 6 com o carbono 5; dos hidrogênios 2’ e 3 ‘

com o carbono carbonílico 1’ (a esquerda); hidrogênio 4 com os carbonos 3, 5

e 6; do hidrogênio 5 com os carbonos 3, 4 e 6; dos hidrogênios 1 e 3 ‘ com os

carbonos 2 e 3; e do hidrogênio ligado ao nitrogênio com os carbonos 2 e

cabonílico 1’ (a direita).

Figura 15 - Correlações HMBC CV-2.

C=O

C=C

H-C-OH

CH2-OH

CH-N

CH2-C=C



NH

O

OH

OH

CH3

CH3

H H

H

HH

HH

12

3

4

5

1'

2'

6

3'

10

10

N

O

OH

OH

CH3

CH3

H

H

H H

H1

2

3

4

5

1'

2'

6

3'

10

10

Fonte: Autor, 2013.

A figura 16 abaixo apresenta a possível estrutura do composto em

questão. O espectro de HMBC apresenta muitas correlações referente a cadeia

lipídica lateral, impossibilitando sua análise.

Figura 16 - Estrutura CV-2, ceramida, C31NO3H61.

NH

O

OH

OH

CH3

CH3

12

3

4

5

1'

2'

6

3'

10

10

Fonte: Autor, 2013.

Ceramidas, como o próprio nome já diz, são ceras que contém um

grupamento amida em sua estrutura. Segundo TANG e colaboradores (2002)

esse grupo de metabólitos exerce importante função no organismo, pois tem

sido identificado como um mensageiro lipídico ativo na regulação do

crescimento celular.

6.4 CARACTERIZAÇÃO DA FRAÇÃO LIPÍDICA DE CVEC

A fração clorofórmica do extrato etanólico de C. vaginalis foi inicialmente

submetida a cromatografia em coluna rendendo 6 frações, conforme descrito

na tabela11. A fração 1 foi analisada por RMN 1H, e este espectro apresentou

(destaque) sinais característicos da presença de ácidos graxos na fração,



sendo por isto submetida à saponificação (MATOS, 1988) seguida de

metilação, seguindo procedimento descrito no item 5.3.

Tabela 13 - Frações, massas e rendimento do fracionamento CVEC.


CVEC – 1 0,0949

CVEC – 2 0,1179

CVEC – 3 0,0122

CVEC – 4 0,0621

CVEC – 5 0,0691

CVEC – 6 0,0740

Os produtos saponificáveis e insaponificáveis foram analisados por

CG/EM, e os espectros obtidos através de impacto eletrônico (IE). A

identificação dos constituintes presentes na fração foi realizada por

comparação do espectro de massas referente a cada pico do cromatograma

com espectros de massas em banco de dados da literatura (STENHAGEM et

al., 1974). A partir destes dados foi possível caracterizar os ésteres metílicos

referentes aos ácidos graxos presentes na fração, descriminados na tabela 14,

a seguir, e logo em seguida o cromatograma do mesmo, figura 17.

Tabela 14 - Composição dos constiuintes da fração lipídica da fração CVEC.

CONSTITUINTES NOME COMUM TEMPO DE RETENÇÃO (MIN)

Ácido tetradecanóico (1) Ác. Mirístico 19.740 Ácido pentadecanóico (2) Ác. Valérico 21,131

Ácido hexadec-9-enóico (3) Ác. Palmitoleico 23,593 Ácido hexadecanóico (4) Ác. Palmítico 25,485 Ácido triacontanóico (5) Ác. Melíssico 24,868

Ácido heptadecanóico (6) Ác. Margarítico 25.284 Ácido octadec-9-enóico (7) Ác. Oleico 27.555 Ácido Octadecanóico (8) Ác. Esteárico 27.993 Ácido docosanóico (9) Ác. Beênico 34,821

Ácido Benzeno-1,2-dicarboxílico (10) Ác. Tereftálico 35,207

Rendimento = 59,15%

Fonte: Autor, 2013.



Ácido tetracos-15-enoico (11) Ác. Nervônico 37,656 Ácido tetracosanóico (12) Ác. Lignoleico 37,883

Figura 17 - Cromatograma (CG-MS) de CVEC-1.

O cromatograma acima indica os diferentes ácidos graxos que compõe a

fração CVEC-1. Cada pico representa um ácido diferente, e para cada ácido

tem-se um tempo de retenção associado. Através da comparação com o banco

de dados NIST08s.LIB o ácido graxo correspondente é identificado. Abaixo

estão relatados os espectros de massa para cada ácido graxo, pertencente à

amostra, assim como sua estrutura correspondente.

Fonte: Autor, 2013.

Fonte: Autor, 2013.



Normalmente os ácidos graxos apresentam um perfil de fragmentação

bem simples de visualizar. Inicialmente radicais CH2. são perdidos, ou seja,

uma perda de m/z = 14, como mostrado abaixo:

Figura 18 - Fragmentações de um ácido graxo genérico, em fragmentos de -14.

Além desta perda de -14, eles apresentam como pico base um pico que

possui uma relação m/z=74 (para ésteres metílicos, e 88 para ésteres

originados do etanol), que é originado por um cátion-radical formado a partir do

rearranjo de McLafferty, como mostrado na figura abaixo:

Figura X: Rearranjo de McLafferty para um ácido graxo saturado genérico.

Figura 19 - Formação do fragmento m/z = 74 para um ácido graxo saturado genérico.

Este perfil pode ser observado para os ácidos mostrados na lista acima,

exceto para os ácidos de número 7, 9, 10, 12, 13 e 15, pois estes apresentam

insaturações ou são ácidos dicarbixílicos.

Outro pico característico de ácidos graxos é o de relação massa carga

87, mostrado a seguir (figura 20):

Figura 20 - Relação m/z = 87 para um ácido graxo saturado genérico.

-14

-14

-14 -14

m/z = 74

m/z = 87

Fonte: Autor, 2013.

Fonte: Autor, 2013.

Fonte: Autor, 2013.

R

O O R

H

CH2

C

OH O R

RO

O



Os constituintes insaponificáveis da fração CVEC-1, também foram

identificados por CG/MS, o que permitiu verificar a presença de mais 13

compostos orgânicos (16-28) nesta fração, dentre eles os esteroides

estigmasterol e lupenona, inéditos no gênero Callyspongia (tabela 15).

Tabela 15 - Constituintes insaponificáveis com seus respectivos espectros de massa da fração lipídica da fração CVEC

CONSTITUINTES INSAPONÍFICÁVEIS

Cicloheptanona (13) Nonacosano (14)

Lupenona (15) Propiofenona (16)

2,5-dimetoxi-4-propoxi (17) beta.,22E-Stigmasta-5,22-dien-3-ol (18)

1,1'-Bifenil, 4-(4-pentilciclohexil)-4'-(4-propilciclohexil) (19) Butan-1-one, 1-(2,3-dihydro-7,8-dinitro-1,4-benzodioxin-6-il) (20)

Colesta-5,22-dien-3-ol (21) Colesterol (22)

Ciclotetrasiloxano (23) Chlorothiophos O-analog 2,5-isomer (24)

Ciclopropano, 1-(1-hidroxietil)-1-(dietilfosfonil)-2-metileno (25)

Abaixo estão relacionados os espectros de massas, assim como a

respectiva estrutura encontrada na fração insaponificável de CVEC-1.

Fonte: Autor, 2013.



6.5 CARACTERIZAÇÃO DO POLISSACARÍDEO

A literatura relata o isolamento de polissacarídeos através de digestão

enzimática. Este tipo de isolamento é caro e o rendimento é bastante baixo,

contudo sabe-se que reações por via enzimática são bastante seletivas

(ZIERER, MOURÃO, 2000). Extrações com água e precipitação com etanol

também são relatadas, por custo mais acessível, além de rendimentos maiores,

por isso este foi o método adotado para o isolamento do polissacarídeo de C.

vaginalis (CHEN et al 2010). Os percentuais de isolamento e purificação foram

de 2,9% e 50%, respectivamente. Com o material purificado foi possível iniciar

a caracterização do polissacarídeo.

6.5.1 FTIR

O polissacarídeo isolado e o purificado foram submetidos à análise de

espectroscopia na região do infravermelho para identificação das possíveis

diferenças entre as duas amostras, assim como para conhecimento dos grupos

funcionais existentes nos mesmos. O polissacarídeo isolado é aquele

proveniente do próprio material animal, e o purificado é a partir do

polissacarídeo isolado, como descrito no procedimento 5.5.

Por meio das análises do espectros de IV (figura 21) pode ser observado

que não existem diferenças significativas entre as amostras do polissacarídeo

isolado do purificado.



Figura 21 - Espectro de FTIR do polissacarídeo isolado e purificado (à esquerda) em comparação com dados da literatura.

A banda em 3405 cm-1 é característica de deformação axial de hidroxila

associada. Observa-se também bandas em 2918 e 1415 cm-1, proveniente da

deformação axial e angular de hidrogênio ligado à carbono saturado (CH2 e/ou

CH3). Uma banda intensa e característica do grupo carbonila em 1646 cm-1.

Devido à intensidade da banda de O-H, não consegue-se enxergar a banda

característica do estiramento N-H, mas podemos identifica-lo como o ombro

existente em 1543 cm-1. E assim como descrito na literatura, muitos

polissacarídeos de origem marinha são sulfatados (S=O), percebe-se a

existência desse grupo pela discreta banda em 1237 cm-1 (CHEN et al 2010).

Todos esses deslocamentos são mostrados na tabela 16.

Tabela 16 - Deslocamento das bandas no infravermelho para o polissacarídeo isolado e purificado em comparação com dados da literatura.

Comprimento de

Onda cm-1 (λ)

Comprimento de

onda cm-1 (λ)*

Grupo funcional

correspondente

3405 3416 OH

2918 2930 CH3 e CH2

1646 1646 C=O

1543 1534 N-H

1415 1447 CH3 e CH2

1237 1238 S=O

Fonte: Autor, 2013. Fonte: CHEN et al, 2010.

Fonte - CHEN et al, 2010. Fonte - Autor, 2013.



6.5.2 Hidrólise e concentração de açúcar redutor

Após ensaio de hidrólise e açúcar redutor, os dados foram tratados com

programa oringinPro8. Construiu-se uma curva analítica (figura 23), como

mostrado abaixo:

Figura 22 - Curva analítica construída a partir dos padrões de galactose em concentrações de 0,8, 1, 3, 5, 7, 9 e 10 mg/mL.

Pode-se observar que o índice de correlação obtido para a curva padrão

foi 0,99763.

Após leitura das absorbâncias das amostras hidrolisadas obtivemos as

concentrações de 2,5 mg/mL, 4,71 mg/mL e 4,61 mg/mL para as amostras

hidrolisadas com 2, 6 e 8 horas respectivamente. Desse modo, concluímos que

o melhor tempo de hidrólise é 6 horas uma vez que para tempos maiores a

concentração de açúcar redutor parece diminuir, indicando a queima dos

açúcares que compõe o polissacarídeo.

6.5.3 Análise termogravimétrica

Quando polímeros são aquecidos a temperaturas mais elevadas, várias

mudanças físico-químicas podem ocorrer como a formação de gases, líquidos

Fonte: Autor, 2013.



e mudanças de coloração. A degradação térmica é uma reação que envolve a

ruptura das ligações das cadeias principais e secundárias. A habilidade do

polímero em resistir à decomposição química causada pelo aquecimento a

altas temperaturas é chamada de estabilidade térmica. A estabilidade térmica é

geralmente caracterizada pela temperatura na qual a decomposição do

polímero se torna perceptível pela formação de produtos e cinética do

processo. Um dos fatores determinantes da estabilidade térmica do polímero é

a energia das ligações da cadeia principal (LIM, L. Y., WAN, L. S. C., 1995).

A ligação C-C é uma das mais resistentes à degradação térmica. A

presença de átomos de hidrogênio na molécula do polímero a estabiliza,

diminuindo assim a energia entre a ligação C-C, por isso os hidrocarbonetos

com elevada massa molecular e seus derivados possuem comparativamente

baixa estabilidade sendo facilmente degradados com o aquecimento a

temperaturas mais elevadas (DAMIAN et al, 2005).

A figura 23 mostra o perfil de análise térmica do polissacarídeo onde se

pode observar 5 picos característicos e devidamente identificados na tabela 18.

Figura 23 - Curva TG e DTG para o polissacarídeo CV.

I II

III

IV

V

Fonte: Autor, 2013.



A curva de DTG é dividida em 5 grupos de degradação, com as

respectivas temperaturas que marcam o início, final e o ponto máximo do pico

durante a degradação do material, conforme mostra a tabela a adiante:

A primeira degradação do material, região I, é característica de saída de

água residual da amostra e corresponde a 15% da perda de massa total da

amostra. As regiões II a IV correspondem a degradação do material orgânico

com liberação de H2O, CO, CO2, and CH4 e responsável pela perda de cerca

de 70% de degradação do material em questão. Por fim, a região 5, nos

fornece os dados sobre as cinzas, que são pertencentes ao material inorgânico

presente na amostra ou residual no cadinho, em nosso caso corresponde à

20% da massa do material, indicando um percentual elevado de sais sais

inorgânicos.

Tabela 17 - Temperaturas inicial, final e máxima do pico de degradação do polissacarídeo CV.

Região T°C INICIAL T°C PICO T°C FINAL

I 28,07 32,98 123,09

II 180,67 300,35 448,04

III 454,63 475,89 515,40

IV 516, 90 543,25 575,99

V 702,42 713,91 728, 59

Fonte: Autor, 2013.

Conclusão


7 Conclusões

Através dos estudos realizados percebe-se que a bioprospecção da

esponja Callyspongia vaginalis se mostrou bastante promissora, levando ao

isolamento de 2 metabólitos secundários: CV-1, o esteroide β-sistosterol, muito

comum em plantas, conhecido como fitoesterol, com apenas duas ocorrências

em esponjas e CV-2 que revelou a estrutura de uma ceramida, sendo ambos

inéditos no gênero Callyspongia. Ainda foram identificados por CG/MS mais 12

ácidos graxos (fração saponificável) e 13 substâncias na fração insaponificável,

destacando-se a presença do triterpeno lupenona e do esteroide estigmasterol,

que também estão sendo reportados pela primeira vez neste gênero.

Foram ainda caracterizados parcialmente os polissacarídeos da espécie

em estudo, indicando a presença de grupos sulfato em sua estrutura e valores

percentuais de umidade e cinzas de 15 e 20%, respectivamente. Este também

é o primeiro relato de polissacarídeos provenientes do gênero Callyspongia, o

que estimula a continuação de seus estudos, tomando por base as atividades

relatadas por estas moléculas na literatura. Ainda são necessários mais teste

para caracterização total do polissacarídeo, como identificação de seus meros,

para assim ter sua elucidação estrutural.

Os resultados obtidos motivam a continuação do estudo químico da

espécie em questão e a investigação de atividades farmacológicas dos

constituintes isolados.

Referências


Referências

BERER, N. callynormine a, a new marine cyclic peptide of a novel class. Organic Letters, v. 6, n. 15, p 2543 – 2545, 2004. Disponível em: <http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ol0491787> Acesso em: Abril de 2011. BRAEKMAN, J. C. et al. a new c-20 polyacetilene from the sponge Callyspongia pseudoreticulata. Journal of Natural Products, v. 66, n. 6, p 871-872, 2003. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np0300840> Acesso em: Abril de 2011. BUCHANAN, M. S. et al niphatoxin c, a cytotoxic tripyridine alkaloid from Callyspongia Sp. Journal of Natural Products, v. 70, n. 12 , p 2040 – 2041, 2007. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/np070366q> Acesso em: Julho de 2012.

CAPON, R. J. et al phoriospongin a and b: two new nematocidal depsipeptides from the australian marine sponges Phoriospongia Sp. AND Callyspongia Bilamellata. Journal of Natural Products, v. 65, n. 3, p 358 – 363, 2002. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np010329d> Acesso em: Dezembro de 2012. CARBALLEIRA, N.; PAGÁN, M. new methoxilated fatty acids from the caribbean sponge Callyspongia Fallax. Journal of Natural Products, v. 64, n. 5, p 620 – 623, 2001. CHEN, D. et al. effects of gekko sulfated polysaccharide-protein complex on human hepatoma smmc-7721 cells: inhibition of proliferation and migration. Journal of Ethnopharmacology. v. 127, p 702 – 708, 2010. Disponível em: <http://ac.els-cdn.com/S0378874109007429/1-s2.0-S0378874109007429-main.pdf?_tid=1d3a2a46-ed89-11e2-bf7f-00000aab0f01&acdnat=1373918573_24b09a066c6fc0772a9c48ec23e293de> Acesso: Janeiro de 2013. COSTA-LOTUFO. L, V, et al. organismos marinhos como fontes de novos fármacos: história e perspectivas. Quimica Nova, v. 32, n. 3, p 703 – 716, 2009). Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/qn/v32n3/a14v32n3.pdf> Acesso em: Março de 2011. COSTA, S. M. O.; RODRIGUES, J. F.; & DE PAULA, R. C. M. monitoração do processo de purificação de gomas naturais: goma do cajueiro. Polimeros: Ciencia e Tecnologia. v. 6, p 49 – 55, 1996. Disponível em: < http://revistapolimeros.org.br/files/v6n2/v6n2a04.pdf> Acesso em: Agosto de 2012.

http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ol0491787

http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np0300840

http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/np070366q

http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np010329d

http://ac.els-cdn.com/S0378874109007429/1-s2.0-S0378874109007429-main.pdf?_tid=1d3a2a46-ed89-11e2-bf7f-00000aab0f01&acdnat=1373918573_24b09a066c6fc0772a9c48ec23e293de



http://www.scielo.br/pdf/qn/v32n3/a14v32n3.pdf

http://revistapolimeros.org.br/files/v6n2/v6n2a04.pdf

Referências


DAMIAN, C. et al Quitosana: um amino polissacarídeo com características funcionais. Alim. Nutr. v. 16, n° 2, p 195 – 205, 2005. Disponível em: < http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/320/310> Acesso em: Julho de 2013. SEBASTIANES, F. L. S., PIZZIRANI-KLEINER, A. A. Vias de Biossíntese de Antibióticos. Disponível em:<http://www.genetica.esalq.usp.br/pub/seminar/FLSSebastianes-200801-Seminario.pdf> Acesso em 22 de dezembro de 2010. Disponível em: <http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB00852> Acesso em 27 de dezembro de 2010. DIYABALANAGE, T. et al. flabelliferins a and b, sesterterpenoids from the south pacific sponge Carteriospongia flabellifera. Journal of Natural Products. v. 75, p 1490 – 1494, 2012. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/ipdf/10.1021/np3003518> Acesso em: Novembro de 2012. FAROKHI, F. et al antiproliferative activity against human non-small cell lung cancer of two o-alkyl-diglycosylglycerols from the marine sponges Myrmekioderma dendyi AND Trikentrion laeve. European Journal of Medicinal Chemistry. v. 49, p 406 – 410, 2012. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S022352341200044X/1-s2.0-S022352341200044X-main.pdf?_tid=0585ebb4-ed8a-11e2-9e7d-00000aab0f6c&acdnat=1373918963_877a6be70688043b2fa93c2f3da5fc41> Acesso em: Julho de 2012. FERREIRA, E. G. et al cytotoxic activity of hydroethanolic extrats of sponges (porifera) collected at pedra da risca do meio marine state park, ceará state, brazil. Porifera Research: Biodiversity, Innovation and Sustainability, p 313 – 318, 2007. Disponível em: < http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/iss/09-book/pdf/Ferreira%20et%20al%20-%20Cytotoxic%20activity%20of%20hydroethanolic%20extracts%20of%20sponges.pdf> Acesso em: Julho de 2012. FOUAD, M. et al new bioactive alkaloids from the marine sponge Stylissa sp. Tetraehdron. v. 68, p 10176 – 10179, 2012. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0040402012015116/1-s2.0-S0040402012015116-main.pdf?_tid=96b3f4d2-ed8a-11e2-b227-00000aab0f02&acdnat=1373919206_7bcaa4529a5df4d9a9ec84a69b220505> Acesso em: Julho 2012.

FUGITA, M. et al callysponginol sulfate a, an mt1-mmp inhibitor isolated from the marine sponge Callyspongia Truncata. Journal of Natural Products, v. 66, n. 4, p 569 – 571, 2003. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/np020572s> Acesso em: Julho de 2013.

http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/320/310

http://serv-bib.fcfar.unesp.br/seer/index.php/alimentos/article/viewFile/320/310

http://pubs.acs.org/doi/ipdf/10.1021/np3003518

http://ac.els-cdn.com/S022352341200044X/1-s2.0-S022352341200044X-main.pdf?_tid=0585ebb4-ed8a-11e2-9e7d-00000aab0f6c&acdnat=1373918963_877a6be70688043b2fa93c2f3da5fc41



http://www.poriferabrasil.mn.ufrj.br/iss/09-book/pdf/Ferreira%20et%20al%20-%20Cytotoxic%20activity%20of%20hydroethanolic%20extracts%20of%20sponges.pdf




http://ac.els-cdn.com/S0040402012015116/1-s2.0-S0040402012015116-main.pdf?_tid=96b3f4d2-ed8a-11e2-b227-00000aab0f02&acdnat=1373919206_7bcaa4529a5df4d9a9ec84a69b220505



http://pubs.acs.org/doi/pdfplus/10.1021/np020572s

Referências


FUKAMI, A. akaterpin, a novel bioactive triterpene from the marine sponge Callyspongia sp. Tetrahedron Letters, v. 38, n. 7, p 1201 – 1202, 1997. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0040403997000166/1-s2.0-S0040403997000166-main.pdf?_tid=e67589a4-ed8a-11e2-a16e-00000aab0f27&acdnat=1373919340_b932f924ded00d645e0e28d937d6c85c> Acesso em: Julho de 2013. GARG, H. S.; AGRAWAL, S. callypinol, a new diterpene from sponge Callyspongia Spinosissima. Tetrahedron Letters, v. 36, n. 49, p 9035 – 9038, 1995. GERWICK, W. H. & MOORE, B. S. lessons from the past and charting the future of marine natural products drug discovery and chemical biology. Chemistry & Biology, v. 19, 85 – 98, 2012. Disponível em: <http://ac.els-cdn.com/S1074552112000075/1-s2.0-S1074552112000075-main.pdf?_tid=1f60f1d6-ed8b-11e2-bc8e-00000aacb360&acdnat=1373919436_cb47e46afa78f376c0d59b3512724b61> Acesso em: Julho de 2013. GOAD, L. J. Phytosterols, in: methods in plant biochemistry. TERPENOIDS, Academic Press Ltd. 1991. GRANATO, A. C., et al. Produtos naturais da ascídia botrylloides giganteum, das esponjas verongula gigantea, ircina felix, cliona delitrix e do nudibrânquio tambja eliora, da costa do Brasil. Química Nova, v. 28, n. 2, p 192-198, 2005. GRAY, C. A. et al Sulfated meroterpenoids from brasilian sponge callyspongia sp. are inhibitors of the antileishmaniasis target adenosine phosphoribosyl transferase. Journal of Organic Chemistry, v. 71, p 1062, 2007. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jo060295k> Acesso em: Agosto de 2012. HUANG, R. et al. A new 1,4 diazepine from south china sea marine sponge Callyspongia species. Molecules, n.15, p 871-877, 2010. Disponível em: < http://www.mdpi.com/1420-3049/15/2/871> Acesso em: Agosto de 2012. HUNG, C.; YEN, G. Extraction and identification of antioxidative components of hsian-tsao (Mesona Procumbens HEMSL). Lebensm. Wiss. U. Technol, v. 34, p 306-311, 2001. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0023643801907753/1-s2.0-S0023643801907753-main.pdf?_tid=0094b192-ed8c-11e2-a16e-00000aab0f27&acdnat=1373919813_6e05ac6d63d697ad60bf38d17764ce0f> Acesso em: Agosto de 2012. IBRAHIM, S.R.M. et al Callyaerins a-f and h, new cytotoxic cyclic peptides frim the indonesian marine sponge Callyspongia aerizusa. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 18, p 4947 – 4956, 2010.

http://ac.els-cdn.com/S0040403997000166/1-s2.0-S0040403997000166-main.pdf?_tid=e67589a4-ed8a-11e2-a16e-00000aab0f27&acdnat=1373919340_b932f924ded00d645e0e28d937d6c85c



http://ac.els-cdn.com/S1074552112000075/1-s2.0-S1074552112000075-main.pdf?_tid=1f60f1d6-ed8b-11e2-bc8e-00000aacb360&acdnat=1373919436_cb47e46afa78f376c0d59b3512724b61



http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jo060295k

http://www.mdpi.com/1420-3049/15/2/871

http://ac.els-cdn.com/S0023643801907753/1-s2.0-S0023643801907753-main.pdf?_tid=0094b192-ed8c-11e2-a16e-00000aab0f27&acdnat=1373919813_6e05ac6d63d697ad60bf38d17764ce0f



Referências


Disponível em: <http://ac.els-cdn.com/S0968089610005407/1-s2.0-S0968089610005407-main.pdf?_tid=ddfad53a-ed86-11e2-85ca-aacb361&acdnat=1373917608_15473f10832df3eec6276d6409d3e751> Acesso em: Julho de 2012. JUNIOR, M. L. C. F. A esponja marinha Polymastia janeirensis como fonte de novos fármacos contra o câncer, Dissertação de Mestrado, UFRS, Brasil, 2008. KOBAYASHI, M. et al Callystatin a, a potent cytotoxic polyketide from the marine sponge, Callyspongia truncate. Tetrahedron. v. 38, p 2859 – 2862, 1997. LÓPEZ, S. et al Syntesis of callyberynes a and b, polyacetylenic hidrocarbons from marine sponges. Organic Letters, v. 5, n. 20, p 3725-3728, 2003. Disponível: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ol0354270> Acesso em: Agosto de 2012. MIAO, S.; ANDERSEN, R. J. Callydine, a new diacetylenic hydrocarbon from the sponge Callyspongia Flammea. Journal of Natural Products, v. 54, n. 5, p 1433 – 1434, 1991. MURAMAKI, N. Absolute stereostructure of callystatin a, a potent cytotoxic polyketide from marine sponge, Callyspongia truncata. Tetrahedron Letters, v. 38, n. 31, p 5533-5536, 1997. Disponível em: <http://www.ingentaconnect.com/content/els/00404039/1997/00000038/00000031/art01194> Acesso em: Janeiro de 2013. NAKAO, Y. et al Callyspongynic acid, a polyacetylenic acid which inhibits α-glucosidase from the marine sponge Callyspongia Truncata. Journal of Natural Products, v. 65, n. 6, p 922 – 924, 2002. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np0106642> Acesso em: Agosto de 2012. NETO, F. R. A.; NUNES, S. S. S. Cromatografia: Principios básicos e técnicas afins. Rio de Janeiro. Interciência, 2003. NUZZO, G. et al Fulvynes antimicrobial polyoxygenated acetylenes from the mediterranean sponge Haliclona fulva. Tetrahedron. v. 68, p 754 – 760, 2012. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0040402011016243/1-s2.0-S0040402011016243-main.pdf?_tid=3c340f12-ed8d-11e2-8f8c-00000aab0f02&acdnat=1373920343_d85a2722e40c9f91b2bad8d52cee8c7d> Acesso em: Agosto de 2012. PAVIA, D. L. et al Introdução à Espectroscopia. 4. ed. São Paulo. Cengage Learning, 2010.

http://ac.els-cdn.com/S0968089610005407/1-s2.0-S0968089610005407-main.pdf?_tid=ddfad53a-ed86-11e2-85ca-00000aacb361&acdnat=1373917608_15473f10832df3eec6276d6409d3e751



http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ol0354270

http://www.ingentaconnect.com/content/els/00404039/1997/00000038/00000031/art01194

http://www.ingentaconnect.com/content/els/00404039/1997/00000038/00000031/art01194


http://ac.els-cdn.com/S0040402011016243/1-s2.0-S0040402011016243-main.pdf?_tid=3c340f12-ed8d-11e2-8f8c-00000aab0f02&acdnat=1373920343_d85a2722e40c9f91b2bad8d52cee8c7d



Referências


PINTO, A. C, et al. Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v. 25, n. 6, p 45 – 61, 2002. Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/qn/v25s1/9413.pdf> Acesso em: Agosto de 2012. RAO, T. S. P. et al New polyhydroxi sterols from the marine sponge Callyspongia Fibrosa (RIDLEY & DENDLY). Tetrahedron Letters, v. 51, p 3583 – 3586, 2010. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0040403910007902/1-s2.0-S0040403910007902-main.pdf?_tid=96d0382e-ed8d-11e2-a2b5-00000aab0f6c&acdnat=1373920495_3a7c3f287d45681e781ca2589430bb3f> Acesso em: Junho de 2013. ROONEY, F.; CAPON, R. J. Callyspongynes a and b: new polyacetylenic lipids from a southern australin marine sponge, Callyspongia Sp. Lipid, v. 33, n. 6, p 639 – 642, 1998. Disponível em: < http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs11745-998-0251-5.pdf> Acesso em: Junho de 2013. SCOTT, R. H. Analysis of the structure and electrophysiological actions of halitoxins 1,3 alkyl-pyridinium salts from Callyspongia Ridleyi. The Journal of Membrane Biology, n.176, p 119 – 131, 2000. Disponível em: < http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs00232001078.pdf> Acesso em: Janeiro de 2013. SELEGHIM, M. H. R. Antibiotic, cytotoxic an enzyme inhibitory activity of crude extracts from brazilian marine invertebrates. Revista Brasileira de Farmacologia, v. 17, p 287 – 318, 2007. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/rbfar/v17n3/01.pdf> Acesso em: Julho de 2012. SILVA, R. N. et al. Compração de métodos para determinação de açúcares redutores e totais em mel. Ciências e Tecnologia de Alimentos, v. 23, p 337 – 341, 2003. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf> Acesso em: Julho de 2012. SEPCIC, K. et al Biological activities of aqueous and organic extracts from tropical marine sponges. Marine Drugs, v. 8, 1550 – 1566, 2010. Disponível em: < http://www.mdpi.com/1660-3397/8/5/1550> Acesso em: Julho de 2012. SIMMONS, L. et al Bendigoles d - f bioactive sterols from the marine sponge derived Actinomadura sp. SBMS009. Bioorganic & Medicinal Chemistry. v. 19, p 6570 – 6575, 2011. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S096808961100397X/1-s2.0-S096808961100397X-main.pdf?_tid=a5f9a88e-ed8e-11e2-8dc8-00000aacb361&acdnat=1373920950_2940136ca745b467ff5d21c78f59cd1c> Acesso em: Agosto de 2012.

http://www.scielo.br/pdf/qn/v25s1/9413.pdf

http://ac.els-cdn.com/S0040403910007902/1-s2.0-S0040403910007902-main.pdf?_tid=96d0382e-ed8d-11e2-a2b5-00000aab0f6c&acdnat=1373920495_3a7c3f287d45681e781ca2589430bb3f



http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs11745-998-0251-5.pdf

http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs11745-998-0251-5.pdf

http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs00232001078.pdf

http://www.scielo.br/pdf/rbfar/v17n3/01.pdf

http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf

http://www.mdpi.com/1660-3397/8/5/1550

http://ac.els-cdn.com/S096808961100397X/1-s2.0-S096808961100397X-main.pdf?_tid=a5f9a88e-ed8e-11e2-8dc8-00000aacb361&acdnat=1373920950_2940136ca745b467ff5d21c78f59cd1c



Referências


TAKEARA, R. LOPES, J. L. C. LOPES, N. P. Constituintes químicos da ascídia didemnum psammadotes (sluiter, 1895) coletada na costa cearense. Química Nova, v. 30, n. 5, p 1179-1181, 2007. Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n5/a24v30n5.pdf> Acesso em: Agosto de 2012. TANG, L. X. et al Conformational characterization of ceramides by nuclear magnetic ressonance spectroscopy. Biophysical Journal, v. 82, p 2067-2080, 2002. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0006349502755549/1-s2.0-S0006349502755549-main.pdf?_tid=f9c9a9d2-ed8e-11e2-921a-00000aab0f26&acdnat=1373921090_773feb3aa521c7effa49a46de74fd8d6> Acesso em Setembro de 2012. TOTH, S. I.; SCHMITZ F. J. Two new cytotoxic peroxide-containing acids from a new guinea sponge, callyspongia sp. Journal of Natural Products, v. 57, n. 1, p 123 – 127, 1994. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np50103a017> Acesso em Janeiro de 2013. TRAN, T. D. et al. Cytotoxic cyclic depsipeptides from the australian marine sponge Neamphius huxleyi. Journal of Natural Products, v. 75, p 2200 – 2208, 2012. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/ipdf/10.1021/np3006474> Acesso em: Julho de 2012. TSUKAMOTO, S. et al Seven new polyacetylene derivatives, showing both potent metamorphosis-inducing activity in ascidian larvae and antifouling activity against barnacle larvae,from the marine sponge Callyspongia Truncata. Journal of Natural Products, v. 60, n. 2, p 126 – 130,1997. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np9606097> Acesso em: Julho de 2013. URBAN, S. U. & CAPON, R. J. A new lipid from an australian marine sponge, Callyspongia sp. Lipid. v. 32, p 675 – 677, 1997. Disponível em: < http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11745-997-0086-0> Acesso em: Março de 2012. UMEYAMA, A. NAGANO, C. & ARIHARA, S. Three novel c21 polyacetylenes from the marine sponge Callyspongia sp. Journal of Natural Products. v. 60, p 131 – 133, 1997. Disponível em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np960682x> Acesso em: Abril de 2012. UMEYAMA, A. et al Polyacetylene diols with antiproliferative and driving th1 polarization effects from the marine sponge Callyspongia sp. Journal of Natural Medicines, v. 64, p 93 – 97, 2010. Disponível em: < http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11418-009-0363-3> Acesso em: Agosto de 2012.

http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n5/a24v30n5.pdf

http://ac.els-cdn.com/S0006349502755549/1-s2.0-S0006349502755549-main.pdf?_tid=f9c9a9d2-ed8e-11e2-921a-00000aab0f26&acdnat=1373921090_773feb3aa521c7effa49a46de74fd8d6



http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np50103a017

http://pubs.acs.org/doi/ipdf/10.1021/np3006474


http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11745-997-0086-0


http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np960682x



Referências


UNO, M. et al Callyspongins a and b: novel polyacetylene sulfates from the marine sponge callyspongia truncate that inhibit fertilization of starfish gametes. Journal of Natural Products, v. 59, p 1146 – 1148., 1996. WANG, G. Y. S.; KURAMOTO, M.; UEMURA, D. Three novel anti-microfouling nitroalkyl pyridine alkaloids from the okinawan marine sponge Callyspongia sp. Tetrahedron Letters, v. 37, nº 11, p 1813 – 1816, 1996. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/0040403996001256/1-s2.0-0040403996001256-main.pdf?_tid=1933d210-ed90-11e2-921a-00000aab0f26&acdnat=1373921573_384ba9748aa9416fb50c5006911dbcb0> Acesso em: Agosto de 2012. WHITE, A. W. et al Synthesis and evaluation of novel anti-proliferative pyrroloazepinone and indoloazepinone oximes derived from the marine natural product hymenialdisine. European Journl of Medicinal Chemistry, v. 56, p 246 – 253, 2012. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0223523412005132/1-s2.0-S0223523412005132-main.pdf?_tid=34af01b8-ed90-11e2-9fc5-00000aab0f27&acdnat=1373921619_cb7b7c09a2074630fcfb1d8d41b56bd2> Acesso em: Janeiro de 2013. YANG, B. et al Proline-containing dipeptides from a marine sponge of a Callyspongia Species. Helvetica chimica, v. 92, p 1112 - 1117, 2009. Disponível em: < http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hlca.200800422/pdf> Acesso em: Novembro de 2012. YOUSSEF, D. T. A. et al Polyacetylenes from red sea sponge Callyspongia Species. Journal of Natural Products, v. 62, n. 10, p 1406 – 1410, 2000. Disponivel em: < http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/np0000668> Acesso em: Março de 2012. - YOUSSEF, D. T. A.; SOEST, R. W. M.; FUSETANI, N. Callyspongamide a, a new cytotoxic polyacetylenic amide from the red sea sponge Callyspongia Fisturlis. Journal of Natural Products, v. 66, n. 6, p 861 – 862, 2003. YOUSSEF, D. T. A.; SOEST, R. W. M.; FUSETANI, N. Callyspongenols a – c, new cytotoxic c22-polyacetilene alcohols from red sea sponge Callyspongia Species. Journal of Natural Products, v. 66, n. 5, p 679 – 681, 2003.

VOLLHARDT, K. P. C.; SCHORE, N. E. Química orgânica: estrutura e função, 4 ed.Porto Alegre. Bookman, 2006. VOOGD, N. J. The mariculture pontential of the indonesian reef-dwelling sponge callyspongia (euplacella) biru: growth, survival and bioactive compounds. Aquaculture, p 54 – 64, 2007. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0044848606007095/1-s2.0-S0044848606007095-main.pdf?_tid=ca492e56-ed90-11e2-b90d-00000aacb35e&acdnat=1373921870_6bb941f4e940cedc9e04c7a463c573d3> Acesso em: Agosto de 2012.

http://ac.els-cdn.com/0040403996001256/1-s2.0-0040403996001256-main.pdf?_tid=1933d210-ed90-11e2-921a-00000aab0f26&acdnat=1373921573_384ba9748aa9416fb50c5006911dbcb0



http://ac.els-cdn.com/S0223523412005132/1-s2.0-S0223523412005132-main.pdf?_tid=34af01b8-ed90-11e2-9fc5-00000aab0f27&acdnat=1373921619_cb7b7c09a2074630fcfb1d8d41b56bd2



http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hlca.200800422/pdf


http://ac.els-cdn.com/S0044848606007095/1-s2.0-S0044848606007095-main.pdf?_tid=ca492e56-ed90-11e2-b90d-00000aacb35e&acdnat=1373921870_6bb941f4e940cedc9e04c7a463c573d3



Referências


ZIERER, M. S. & MOURÃO, P. A. S. A wide diversity of sulfated polysaccharides are synthesized by different species of marine sponges. Carbohydrate Research, v. 328, p 209 – 216, 2000. Disponível em: < http://ac.els-cdn.com/S0008621500000768/1-s2.0-

S0008621500000768-main.pdf?_tid=e07999a4-ed90-11e2-b501-

00000aab0f6b&acdnat=1373921907_7c02954040ad2ca98edc2c9c51f1ef97>

http://ac.els-cdn.com/S0008621500000768/1-s2.0-S0008621500000768-main.pdf?_tid=e07999a4-ed90-11e2-b501-00000aab0f6b&acdnat=1373921907_7c02954040ad2ca98edc2c9c51f1ef97



universidade federal do rio grande do norte ......inspiradas em produtos naturais marinhos,...

Documents