universidade federal do rio grande do norte centro … · tabela 11-frações reunidas e massas...

$: UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO … · Tabela 11-Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WFIM-H ..... 48 Tabela 12-Solventes utilizados na cromatografia$
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTECENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

INSTITUTO DE QUÍMICAPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo fitoquímico e biológico de quatro diferentesespécies do gênero Waltheria

Taiza Nayara da Silva CaridadeDissertação de MestradoNatal/RN, julho de 2018

TAIZA NAYARA DA SILVA CARIDADE

ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE QUATRO DIFERENTES ESPÉCIES

DO GÊNERO Waltheria.

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química - PPGQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química. Área de concentração: Química Orgânica Orientadora: Profª. Dra. Renata Mendonça Araújo

NATAL/RN

2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Caridade, Taiza Nayara da Silva.

Estudo fitoquímico e biológico de quatro diferentes espécies

do gênero Waltheria / Taiza Nayara da Silva Caridade. - 2018.

106 f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Ciências Exatas e da Terra, Programa de Pós

Graduação em Química. Natal, RN, 2018.

Orientadora: Profª. Drª. Renata Mendonça Araújo.

1. Waltheria - Dissertação. 2. Malvaceae - Dissertação. 3.

Flavonoides - Dissertação. 4. Auranamida - Dissertação. 5.

Artemia salina - Dissertação. 6. DPPH - Dissertação. I. Araújo,

Renata Mendonça. II. Título.

RN/UF/UFRN CDU 639.63

Elaborado por Ana Cristina Cavalcanti Tinôco - CRB-15/262

AGRADECIMENTOS

A minha família por apoiar minha escolha e ajudar de sua forma. Em especial,

a minha mãe, Doraci, por me incentivar direta e indiretamente a estudar e ser alguém

melhor e ao meu sobrinho Pedro, por ser para mim a personificação do que é o amor

e por me ajudar a ter forças para seguir em frente diariamente.

A todos os professores que passaram pela minha vida acadêmica e que

contribuíram significativamente para o meu crescimento pessoal e profissional.

A Prof. Renata Mendonça pela amizade, risadas, ensinamentos e orientação.

A todos os colegas e professores do LISCO (Laboratório de Isolamento e

Síntese de Compostos Orgânicos) que me ajudaram nessa caminhada, seja pela

presença agradável ou pelo conhecimento compartilhado, em especial a Jany,

Marcela, Gizely e Edson pelos momentos de descontração e amizade.

Ao meu tesouro, Rus, por ser minha muleta emocional e amigo de todas as

horas e momentos, sejam bons ou ruins. Sou muito grata a você por tudo que aprendi

e aprendo contigo diariamente, por me ajudar sempre que precisei e ainda meter a

mão na massa comigo quando eu não sabia fazer, e ainda, me treinar para ser a Celi

(risos).

Minha amiguinha Lilian Kelly pelos dias agradáveis em sua presença, e pelos

abraços fortes (risos), pelos almoços no shopping, as risadas, os doces quase que

diários, que foram extremamente renovadores.

Aos amigos Hanna Stephanny, Maria Clara e Yuri por todos os momentos de

descontração com eles vividos durante esse período, os quais foram essenciais

durante esta caminhada. Muito obrigada pela amizade de vocês!

Ao Instituto de Química/UFRN pela estrutura cedida para o desenvolvimento

da minha pesquisa.

Ao PPGQ/UFRN pelo auxílio financeiro concedido para realização desta

pesquisa.

A técnica do instituto de química/UFRN, Elânia, pela boa vontade e prontidão

em me ajudar, seja em análises ou tratamento de dados.

Ao CENAUREM/UFC pela estrutura fornecida para realização deste trabalho.

Ao Prof. Edilberto Silveira pela maravilhosa receptividade e pelo cappuccino

que fazia todas as tardes no CENAUREM.

Ao técnico do CENAUREM Herbert, pela ajuda no envio dos FID’s sempre com

muita boa vontade e prontidão.

A EMBRAPA por ceder a estrutura e equipamentos para realização deste

trabalho.

Ao Prof. Kirley Marques Canuto e ao Paulo pelo auxílio na realização dos

experimentos de derreplicação.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

A todos, meu muito obrigada!

Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota no mar. Mas o mar seria menor

se lhe faltasse uma gota.

Madre Teresa de Calcutá

RESUMO

O gênero Waltheria pertence à família Malvaceae, que é composta por 243

gêneros e 4225 espécies distribuidas em diferentes regiões do mundo, principalmente

em regiões tropicais da América do Sul, são popularmente utilizadas no tratamento de

úlceras, hemorroidas, asma, diarreia, além de apresentar alta atividade antioxidante,

anticâncer, antiinflamatória e anticonvulsiva. Espécies deste gênero são ricas em

flavonoides, terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, dentre outros metabólitos

secundários. O estudo fitoquímico das partes aéreas e caule de diferentes espécies

de Waltheria conduziu ao isolamento de um triterpeno pentaciclíco do tipo lupano, o

ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-óico (ácido betulônico), quatro flavonoides: 5-hidroxi-

3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona (retusina), 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona, canferol-3-O-

β-glicopiranosídeo, glicopiranosídeo e canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo

(tilirosídeo), ambos inéditos para as espécies estudada. Além do dipeptídeo N-benzoil-

L-fenilalaninato de N-benzoil-2- amino-3-fenilpropila conhecido como auranamida,

inédito para o gênero estudado. Ambos obtidos por meio de fracionamentos

cromatográficos, e caracterizados por RMN 1H e 13C. Um ensaio preliminar de

toxidade dos extratos com Artemia salina revelou a baixa toxicidade das espécies

estudadas com DL50 superiores a 1000 ug/mL, além de alta atividade antioxidante

frente ao radical DPPH, com destaque para Waltheria cinerescens, que apresentou

atividade superior as demais espécies estudadas.

Palavras chave: Waltheria. Malvaceae. Flavonoides. Auranamida. Artemia salina.

DPPH.

ABSTRACT

The genus Waltheria belongs to the family Malvaceae, which is composed of

243 genera and 4225 species distributed in different regions of the world, mainly in

tropical regions of South America. Its popular use is vast, and its species are used in

the treatment of ulcers, hemorrhoids, asthma, diarrhea, in addition to presenting high

antioxidant, anticancer, anti-inflammatory and anticonvulsive activity. Species of this

genus are rich in flavonoids, terpenes, alkaloids, cyclopeptides, among other

secondary metabolites. The phytochemical study of the aerial parts and stem of

different Waltheria species led to the isolation of a pentacyclic triterpene of lupan type,

3-oxolup-20 (29) -en-28-oic acid (betulonic acid), four flavonoids: 5- hydroxy-3,3,4,4-

trimethoxyflavone, canferol-3-O-β-glucopyranoside, glycopyranoside and canferol-3-

O-β-hydroxy-3,3 ', 4' (6 '' - cumaroyl) -glycopyranoside (tyloside), both unpublished for

the species studied. In addition to the N-benzoyl-2-amino-3-phenylpropyl N-benzoyl-

L-phenylalaninate dipeptide known as auranamide, unheard of for the genus studied.

Both obtained by chromatographic techniques, and characterized using 1 H and 13 C

NMRA preliminary toxicity test of the extracts with Artemia salina revealed the low

toxicity of the studied species with LD50 higher than 1000 ug / mL, in addition to high

antioxidant activity against the DPPH radical, especially Waltheria cinerescens which

showed superior activity to the other species studied.

Key words: Waltheria. Malvaceae. Flavonoids. Auranamide. Artemia salina. DPPH.

LISTAS DE TABELAS

Tabela 1- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato

WCCH ....................................................................................................................... 40

Tabela 2- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WCCH

.................................................................................................................................. 41

Tabela 3- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento da sub fração

WCTH (14-16) ........................................................................................................... 41

Tabela 4- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento da sub fração WCTH

(14-16) ....................................................................................................................... 42

Tabela 5- Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WDFM

.................................................................................................................................. 43

Tabela 6- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WDFM

.................................................................................................................................. 44

Tabela 7- Frações reunidas e suas respectivas massas no fracionamento de WFFE-

Ac ............................................................................................................................. 45

Tabela 8- Frações e solventes usados no procedimento cromatográfico de WFCH

.................................................................................................................................. 46

Tabela 9- Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento WFCH ................ 46

Tabela 10- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H ....... 48

Tabela 11- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WFIM-H ....... 48

Tabela 12- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

.................................................................................................................................. 48

Tabela 13- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

H (45-54) ................................................................................................................... 49

Tabela 14- Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WFIM-H (45-54)

21-39 ......................................................................................................................... 49

Tabela 15- Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WFIM-

H (45-54) 21-39 ......................................................................................................... 49

Tabela 16- Preparo de soluções .............................................................................. 52

Tabela 17- Preparação de soluções para teste ....................................................... 54

Tabela 18- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH 19 comparados com a literatura

.................................................................................................................................. 61

Tabela 19- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 13 comparados com

a literatura. ................................................................................................................ 66

Tabela 20- Dados de RMN de 1H e 13C para WdFM-Ac ppt 26 comparados com a

literatura .................................................................................................................... 71

Tabela 21- Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 22 comparados com

a literatura ................................................................................................................. 75

Tabela 22- Dados de RMN de 1H e 13C para WfCH ppt 14 comparados com a

literatura ................................................................................................................... 83

Tabela 23- Compostos insaponificáveis identificados via CG/MS ............................ 85

Tabela 24- Compostos saponificáveis identificados via CG/MS .............................. 88

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Arbusto (A) e partes aéreas (B) de W. cinerescens (A e B), W. ferruginea

(A’ e B’) e W. douradinha (A’’ e B’’) .......................................................................... 24

Figura 2- Flavonoides isolados a partir de diferentes partes de W. indica .............. 26

Figura 3- Alcaloides isolados a partir de diferentes partes de W. indica e W.

douradinha ................................................................................................................ 27

Figura 4- Derivados de triterpenos pentaciclicos isolados a partir da raiz e partes

aéreas de W. indica ................................................................................................... 28

Figura 5- Estrutura química de um flavonoide (34) e isoflavonoide (35) ................. 29

Figura 6- Classificação dos flavonoides .................................................................. 30

Figura 7- Formação do ácido chiquímico ................................................................ 31

Figura 8- Formação da fenilalanina .......................................................................... 32

Figura 9- Proposta de mecanismo biossintético para o asperfenamato ................... 33

Figura 10- Redução do radical livre DPPH .............................................................. 34

Figura 11- Esquema de fracionamento para W. cinerescens .................................. 42

Figura 12- Esquema de fracionamento para W. douradinha .................................. 44

Figura 13- Esquema de fracionamento da W. ferrugínea ........................................ 47

Figura 14- Esquema de fracionamento da W. indica. .............................................. 50

Figura 15- Esquema de preparo das amostras a serem analisadas em

espectrofotômetro. .................................................................................................... 53

Figura 16- Estrutura química das substâncias isoladas das espécies de Waltheria .

.................................................................................................................................. 55

Figura 17- Espectro de RMN 1H de WcCH 19 (300MHz; CDCl3) ........................... 57

Figura 18- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)

.................................................................................................................................. 57

Figura 19- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)

.................................................................................................................................. 58

Figura 20- Espectro de RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3) ............................ 58

Figura 21- Expansão [1] do espectro RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)....... 59

Figura 22- Espectro de RMN 13C [DEPT 135] de WcCH 19 (75MHz; CDCl3) ........ 59

Figura 23- Espectro de RMN HSQC de WcCH 19 ................................................. 60

Figura 24- Espectro de RMN COSY de WcCH 19 .................................................... 60

Figura 25- Espectro de RMN 1H de WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3).......... 63

Figura 26- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)

.................................................................................................................................. 63

Figura 27- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz;

CDCl3) ...................................................................................................................... 64

Figura 28- Espectro de RMN 13C para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3) .... 64

Figura 29- Espectro de RMN HSQC para WcCH (14-16) ppt 13 .............................. 65

Figura 30- Espectro de RMN COSY para WcCH (14-16) ppt 13 .............................. 65

Figura 31- Espectro de RMN 1H para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO) ............. 68

Figura 32- Expansão [1] do espectro de RMN para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)

.................................................................................................................................. 68

Figura 33- Espectro de RMN 13C para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO) ............. 69

Figura 34- Espectro de RMN DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO) ... 69

Figura 35- Espectro de RMN HSQC para WdFM-Ac ppt 26 .................................... 70

Figura 36- Espectro de RMN HMBC para WdFM-Ac ppt 26 ................................... 70

Figura 37- Espectro de RMN 1H para WfFe-Ac (28-31) (MeOD, 500MHz e 125MHz)

.................................................................................................................................. 73

Figura 38- Espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d) 74

Figura 39- Espectro de RMN 13C de WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d) .. 74

Figura 40- Espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3) ................... 77

Figura 41- Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

.................................................................................................................................. 78

Figura 42- Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

.................................................................................................................................. 78

Figura 43- Espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3) ................ 79

Figura 44- Expansão do espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)

.................................................................................................................................. 79

Figura 45- Espectro de RMN DEPT 135 para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3) ....... 80

Figura 46- Expansão [1] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14 ............... 80

Figura 47- Expansão [2] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14 ................. 81

Figura 48- Espectro de RMN HSQC para WfCH ppt 14 ......................................... 81

Figura 49- Espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14 ........................................... 82

Figura 50-Expansão do espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14 ..................... 82

Figura 51- Estrutura dos compostos insaponificáveis de Waltheria ......................... 87

Figura 52- Estrutura dos compostos saponificáveis de Waltheria ............................ 89

Figura 53- Graficos de concentração vs AA% para as espécies W. cinerescens

(WcCE), W. douradinha (WdFM), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM) ........... 90

Figura 54- Gráficos de concentração vs % mortalidade para as espécies W.

cinerescens (WcTE), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM) ............................... 93

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DPPH: 2,2-difenil-picrilhidrazil

CG-MS: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas

UPLC-MS QTof: Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho Acoplado a

Espectrômetro de Massa do tipo quadrupolo/tempo de voo

ESI: Ionização por electrospray

NADPH: Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e Nicotinamida

PAL: Fenilalanina Amonia-Liase

LPO: Peroxidação Lipídica

FRAP: Potencial Antioxidante Redutor Férrico

TAS: Teste Preliminar de Toxicidade

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

UV-VIS: Ultravioleta visível

RMN 1H: Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13C: Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

1D: Unidimensional

2D: Bidimensional

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

COSY: homonuclear Correlation Spectroscopy

HSQC: Heteronuclear Single-Quantum Correlation

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

DMSO: Dimetilsufóxido

CD3OD: Metanol deuterado

D2O: Água deuterada

CDCl3: Clorofórmio deuterado

C5D5N: Piridina deuterada

MHz: Mega Hertz

T: tesla

A: ampere

ppm: Partes por Milhão

s: simpleto

d:dupleto

t: tripleto

q: quarteto

dd: duplo dupleto

m: multipleto

δ 1H: Deslocamento químico do hidrogênio em ppm

δ 13C: Deslocamento químico do carbono em ppm

Hex: Hexano

AcOEt: Acetato de etila

CH2Cl2 :Diclorometano

MeOH: Metanol

EtOH: Etanol

CHCl3: Clorofórmio

ppt: Precipitado

CL50: Concentração Letal

DL50: Dose letal

R2: Índice de correlação

RF: Fator de retenção

AA%: Porcentagem de atividade antioxidante

Abs: Absorbância

PROBIT: Estimativas de probabilidades

WcCH: Waltheria cinerescens caule hexano

WcCE: Waltheria cinerescens caule etanol

WdFM: Waltheria douradinha folha metanol

WdFM-H: Waltheria douradinha folha parte hexano

WdFM-C: Waltheria douradinha folha parte clorofórmio

WdFM-Ac: Waltheria douradinha folha parte acetato

WfFH: Waltheria ferruginea folha hexano

WfFE: Waltheria ferruginea folha etanol

WfFE-H: Waltheria ferruginea parte hexano

WfFE-C: Waltheria ferruginea parte clorofórmio

WfFE-Ac: Waltheria ferruginea parte acetato

WfCH: Waltheria ferruginea caule hexano

WfCE: Waltheria ferruginea caule etanol

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 19

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 21

2.1 Geral .............................................................................................................. 21

2.2 Específicos ................................................................................................... 21

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................... 22

3.1 Importância das plantas medicinais ........................................................... 22

3.2 Aspectos etnobotânicos e etnofarmacológicos da família malvaceae .... 23

3.3 Considerações sobre o gênero waltheria .................................................. 24

3.4 Metabólitos secundários .............................................................................. 28

3.4.1 Flavonoides e sua estrutura ..................................................................... 29

3.4.1.1 Rota biossintética ............................................................................. 30

3.4.1.1.1 Formação do ácido chiquímico .................................................. 30

3.4.1.1.2 Formação da fenilalanina ......................................................... 31

3.4.1.1.3 Proposta biossintética para o asperfenamato ........................... 32

3.5 Atividades biológicas ................................................................................... 33

3.5.1 Processo oxidativo e atividade antioxidante ............................................ 33

3.5.2 Toxicidade frente ao microcrustacéo Artemia salina ................................ 35

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 35

4.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas ................ 36

4.2 Cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrômetro de

massas e detector quadrupolo- UPLC-MS QTOF ............................................ 37

4.2.1 Condições do massas de alta resolução - XEVO-QTOF ........................ 37

4.3 Análises espectroscópicas ......................................................................... 37

4.3.1 Ultravioleta visível (UV-Vis) ..................................................................... 37

4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13

(RMN 13C) ........................................................................................................ 38

4.4 Procedimento experimental ........................................................................ 39

4.4.1 Coleta do material vegetal ...................................................................... 39

4.4.2 Processamento da planta e obtenção dos extratos ................................ 39

4.4.3 Fracionamento cromatográfico ............................................................... 40

4.4.3.1 W. cinerescens ................................................................................ 40

4.4.3.1.1 Fracionamento de WCCH ......................................................... 40

4.4.3.2 W. douradinha ................................................................................. 43

4.4.3.1.1 Fracionamento de WDFM ......................................................... 43

4.4.3.3 W. ferrugínea ..................................................................................... 44

4.4.3.3.1 Fracionamento de WFFE .......................................................... 44

4.4.3.3.1.1 Fracionamento da parte WFFE-Ac ......................................... 45

4.4.3.3.2 Fracionamento de WFCH ......................................................... 45

4.4.3.4 W. indica ...................................................................................... 47

4.4.3.4.1 Fracionamento de WIFM .......................................................... 47

4.4.3.4.2 Fracionamento da subfração WFIM-H ...................................... 47

4.4.3.4.3 Fracionamento da subfração WFIM-H (45-54) ......................... 48

4.4.3.4.4 Fracionamento da subfração WFIM-H(45-54)21-39 ................. 49

4.4.4 Obtenção dos ésteres metílicos .............................................................. 50

4.4.4.1 Reação de saponificação ................................................................. 50

4.4.4.2 Reação de esterificação .................................................................. 51

4.5 Atividades biológicas .................................................................................. 52

4.5.1 Avaliação da atividade antioxidante ........................................................ 52

4.5.2 Avaliação da toxidade frente a Artemia salina ........................................ 53

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................... 54

5.1. Caracterização estrutural das substâncias isoladas ............................... 54

5.1.1. Elucidação estrutural de WcCH 19 ......................................................... 54

5.1.2 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 13 ........................................ 63

5.1.3 Elucidação estrutural de WdFM-Ac ppt 26 ............................................... 67

5.1.4 Elucidação estrutural de WfFe-Ac (28-31) ............................................... 72

5.1.5 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 22 ........................................ 73

5.1.6 Elucidação estrutural de WfCH ppt 14 ..................................................... 76

5.2 Identificação dos compostos saponificáveis e insaponificáveis das

espécies de Waltheria ....................................................................................... 84

5.2.1 Compostos insaponificáveis ..................................................................... 84

5.2.2 Compostos saponificáveis ....................................................................... 84

5.3 Atividades biológicas .................................................................................. 89

5.3.1 Avaliação da atividade antioxidante via DPPH ....................................... 89

5.3.2 Avaliação da toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina ............. 93

6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 95

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 97

19

1. INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são consideradas como uma rica fonte de princípios

ativos e podem ser usadas como matérias-primas na extração de ingredientes ativos

utilizados na síntese de diferentes tipos de drogas, em que estes podem estar

diretamente relacionados com atividades biológicas. Estima-se que a maior parte da

população de países em desevnolvimento dependa das práticas tradicionais usando

plantas medicinais para atender suas necessidades primárias de cuidados com a

saúde. Apesar do crescimento da medicina moderna no desenvolvimento de

medicamentos, o uso de fitoterápicos continua crescendo por motivos históricos e

culturais (SAHOO, MANCHIKANT e DEY, 2010; HASSAN, 2012; SINGH, 2015).

A grande área territorial brasileira e sua biodiversidade, estimada em mais de

56.000 espécies, permitindo o desenvolvimento de novas pesquisas utilizando plantas

como alvo de estudos. O norte e nordeste são responsáveis pela maior biodiversidade

existente no país, e permite com facilidade o acesso a inúmeros tipos de plantas e

espécies frutíferas das mais diversas famílias existentes na flora do Brasil, permitindo

seu fácil acesso, facilitando a realização de estudos com as mais diversas classes de

plantas. (MATTIETTO, 2010).

A família Malvaceae é composta por 243 gêneros e 4225 espécies que podem

ser encontradas em diversas regiões do mundo, com predominância nas regiões

tropicais da América do Sul. Sua representação no Brasil conta com 80 gêneros e 400

espécies, dentre as quais é possível destacar os gêneros Ceiba (paineira e sumaúma)

e Theobroma (cacau e cupuaçu) pela ampla comercialização dos seus frutos (COSTA

et al., 2010; EMBRAPA, 2017).

O gênero Waltheria tem um amplo uso na medicina popular, dentre as

atividades descritas na literatura para o gênero destacam-se: anticonvulsiva,

antioxidante, anticâncer, anti-inflamatória, além de ser usada no tratamento de

úlceras, hemorroidas, asma, reumatismo, diarreia, infecção dental, e malária (MUNDO

et al.,2017; VEERAMANI, 2016; MONTEILLIER et al., 2017; ZONGO, 2013;

CRETTON et al., 2014; CRETTON et al., 2015).

Investigações químicas realizadas para o gênero revelam que suas espécies

são ricas em flavonoides, terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, dentre outros

metabólitos secundários, mostrando-se como uma promissora fonte de compostos

20

bioativos. Estudos realizados nos mesmos laboratórios para Waltheria cinerescens e

Waltheria ferruginea apontou flavonoides como sendo a classe de metabólitos

predominantemente encontrada, no entanto, estudos realizados no sul do país para o

mesmo gênero relatam os alcaloides como sendo o principal metabólito isolado

(TSCHESCHE, 1975; HOELZEL, 2005; GRESSLER, 2008). Estudos preliminares

realizados no nosso grupo de pesquisa detectou a presença majoritária de flavonoides

(FERREIRA, 2014).

A divergência encontrada entre os metabólitos isolados e a presença de

compostos com atividade biológica relatadas para espécies do gênero motivou o

estudo químico das espécies W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W.

indica, visando identificar os metabólitos para cada espécie estudada, bem como seu

potencial biológico.

21

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Estudo da composição química e avaliação da atividade antioxidante e

toxicidade para as espécies Waltheria cinerescens, Waltheria douradinha, Waltheria

ferrugínea e Waltheria indica;

2.2 Específicos

Preparar extratos orgânicos das folhas e caule de W. cinerescens, W.

douradinha, W. ferrugínea e W. indica;

Fracionar os extratos por meio de técnicas cromatográficas;

Isolar e caracterizar os metabólitos secundários majoritários a partir de técnicas

cromatográficas e espectroscópicas;

Submeter os extratos ao teste antioxidante utilizando o radical 2,2-difenil-

picrilhidrazil (DPPH);

Avaliar a toxicidade dos diferentes extratos frente ao microcrustáceo Artemia

salina;

Submeter os extratos à reação de saponificação seguida de metilação para

avaliação de parte de sua composição química usando Cromatografia Gasosa

acoplada Espectrômetro de Massas CG-MS;

Realizar estudo de dereplicação usando UPLC-MS QTof.

22

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Importância das plantas medicinais

O homem pré-histórico fazia uso de plantas medicinais como fonte de cura,

prevenção e tratamentos de diversas doenças, e o mesmo comportamento se

prolonga até os dias atuais. O uso dessas plantas no Brasil tem influência europeia,

devido os primeiros padres a virem pro Brasil, com a finalidade de catequizar os índios

da época, trazerem consigo diversas plantas que foram adaptadas ao clima do país

se reproduzindo e dando origem a variedade de espécies existentes atualmente. Além

da própria influência indígena, pois os índios se baseavam no misticismo e senso

comum para utilização e aperfeiçoamento do uso da fitoterapia. E ainda de origem

africana, devido seu uso em conjunto com o exorcismo para expulsar o espírito mau

que causava doenças (MARTINS et al, 2003).

O documento escrito pelo imperador chinês Shen Nung em 3.000 a.C é o

primeiro registro da fitoterapia. O mesmo catalogou aproximadamente 365 espécies

de origem vegetal, sendo estas plantas e venenos utilizados na época (TOMAZZONI

et al., 2006). Algumas espécies já são conhecidas e catalogadas pela ANVISA devido

sua larga utilização e potencial farmacológico que permeiam desde muito tempo,

como por exemplo, as folhas de Capim santo (Cymbopogon citratus) utilizadas no

combate a cólicas intestinais e uterinas, além de reduzir significamente a ansiedade e

insônia em quadros leves, pois possui efeito calmante.

O Brasil possui a flora mais rica de todo o mundo, correspondendo a 19% da

flora mundial com mais de 56.000 espécies de plantas, o que possibilita o estudo das

mais diversas espécies para comprovação da ação terapêutica e consequentemente

o desenvolvimento de fitoterápicos que auxiliem na prevenção ou cura de doenças,

uma vez que o país é considerado detentor da maior biodiversidade do mundo

(GIULIETTI et al., 2005; KLEIN et al., 2009).

No entanto, há estimativas de que somente 17% das plantas pertencentes a

flora mundial foram exploradas em estudo para aplicação medicinal, e em grande

parte, sem abordar seus aspectos químicos, farmacológicos e toxicológicos. Esses

dados ressaltam o potencial que a natureza tem no auxílio da descoberta de novos

fármacos que possam auxiliar no desenvolvimento de novos fitoterápicos (FOGLIO et

al., 2006).

23

Com isso surge a necessidade de aprofundamento dos conhecimentos acerca

de espécies com potencial para desenvolvimento de um medicamento fitoterápico.

Deste modo, o presente estudo apresenta grande relevância para a comunidade

científica, pois contribui para o conhecimento químico e biológico das espécies do

gênero Waltheria, bem como no desenvolvimento de novos fitoterápicos.

3.2 Aspectos etnobotânicos e etnofarmacológicos da família malvaceae

Espécies da família Malvaceae podem ser encontradas por muitos lugares do

mundo, em destaque encontram-se as regiões tropicais da américa do sul. As

espécies pertencentes a esta família podem ser encontradas na forma de arbusto,

subarbusto, erva e árvore, e sua maior ocorrência é na região amazônica, caatinga,

mata atlântica, e cerrado. No Brasil, especificamente na região nordeste é encontrada

nos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio

Grande do Norte e Sergipe, sendo encontrado também em outras regiões do país

(COSTA et al., 2007; SAUNDERS, 1995).

No Brasil, a família é representada por 80 gêneros e 400 espécies, das quais

podemos destacar espécies pertenentes ao gênero Alcea, Hibiscus e Malvaviscus,

pois desempenham alto valor econômico. Além de alguns gêneros largamente

utilizados na gastronomia, com destaque para o gênero Theobroma (cacau e

cupuaçu), Ceiba (paineira e sumaúma) e o gênero Sida, que é um dos maiores da

família em número de espécies, classificadas como daninhas. Além de espécies que

comumente são usadas no ramo textil como o algodão (Gossypium) e juta (Urena). A

família Malvaceae é portanto, uma rica fonte de fibras, bebidas, alimentos,

paisagismo, madeira e fármacos (BRANDAO, FERREIRA e MACEDO, 1984;

EMBRAPA, 2017).

Os usos de espécies dessa família permeiam por vários ramos, tais como

alimentação, têxtil, decoração, além de ser usado no auxílio a cura de doenças.

Estudos realizados com sementes e folhas de Alcea hyrcana Grossh e folhas de Alcea

kurdica Alef revelaram seu alto poder antioxidante e antimicrobiano (ZAKIZADEH,

2011; QADER, 2014).

A espécie Hibiscus cannabinus L. e Hibiscus sabdariffa L., que são

importantes fontes de fibra comercial apresentaram atividade antifúngica e

antioxidante, respectivamente (KOBAISY et al., 2001; ALI et al., 2003). Além disso, a

24

literatura relata que espécies desse gênero apresentam alta atividade anti-

inflamatória, antimicrobiana, antifertilidade, antitumoral, anti-hipertensiva,

hipocolesterolémica e hipoglicemica (VASUDEVA, 2008).

Espécies dessa familia são ricas em flavonoides, alcaloides,

sesquiterpenoides, taninos, saponinas, triterpenos, esteróis, lactonas, ácidos

fenólicos, dentre outros. (HAMED, 2017; SHARMA, 1989; AHMED, 1990)

3.3 Considerações sobre o gênero Waltheria

O gênero Waltheria é composto por 60 espécies amplamente distribuídas em

regiões de clima tropical que se apresentam sob a forma de subarbustos perenes que

vão de 20 a 50 cm de altura. Apresentam raiz bem desenvolvida, rugosa e profunda,

além de folhas simples que exibem nervuras sulcadas na face superior e ramos eretos,

conforme mostra a Figura 1 (SAUNDERS, 2007; CORRÊA, 1931).

Figura 1: Arbusto (A) e flores e folhas (B) de W. cinerescens (A e B), W. ferruginea (A’ e B’) e

W. douradinha (A’’ e B’’)

Fonte: Arquivo pessoal de Renata M. Araújo

Espécies desse genêro são abundantes no Brasil, além de outros países como

México, Estados Unidos, Paraguai, dentre outros. Por crescerem espontaneamente

25

em beiras de estradas, lavouras e terrenos baldios são consideradas “plantas

daninhas” por (CORRÊA, 1931; LORENZI; MATOS, 2002)

A espécie conhecida como douradinha-do-campo (Waltheria douradinha St.

Hilaire), é utilizada na medicina popular como cicatrizante, antissifilítica e no

tratamento de laringites, bronquites e inflamações na bexiga. A mesma também é

utilizada na medicina caseira como estimulante, sudorífica, diurética e emética, além

de ser indicada no tratamento da desenteria, afecções nos pulmões, catarro-brônquico

e cistite. Waltheria americana é comumente usada na medicina tradicional mexicana

para tratar doenças no sistema nervoso. A espécie Waltheria indica encontrada em

regiões tropicais e subtropicais do mundo é usada para tratamento de inflamações e

carcinogênese (SOUZA E LORENZI, 2012; MUNDO, 2017; MONTEILLIER, 2017).

O levantamento bibliográfico realizado para espécies do gênero Waltheria

mostra o isolamento de compostos das classes dos flavonoides e alcaloides em várias

espécies. W. indica apresenta uma vasta quantidade de estudos, e estes permitiram

o isolamento de alguns flavonoides, sendo eles (1-3) isolados de diferentes partes da

planta, onde ambos apresentaram atividade anti-inflamatória, sendo a atividade do

composto 3 superior as demais (RAO ET AL, 2005). Outro estudo permitiu o

isolamento de sete flavonoides, sendo os compostos 2 e 3 relatados anteriormente,

juntamente com os flavonoides 4-8, isolados de diferentes partes, e os mesmos

apresentaram atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia

coli (MAHESWARA ET AL., 2006). O estudo das partes aéreas permitiu o isolamento

das substâncias 9-13 (PETRUS, 1990), no entanto, nenhuma atividade biológica foi

relatada. (Figura 2)

Os compostos 14-15 isolados de W. indica apresentaram atividade antifúngica,

sendo o primeiro contra Candida albicans com efeito semelhante a 30 mg de

clotrimazol, o segundo apresentou atividade moderada contra Aspergillus niger e T.

mentagrophytes, bem como os compostos 16-20 isolados da mesma espécie

(RAGASA ET AL.,1997; CRETON, 2016) (Figura 2).

26

Figura 2: Flavonoides isolados a partir de diferentes partes de W. indica

Fonte: Autor, 2018

Relatos da literatura também apontam o isolamento de compostos da classe

dos alcaloides, onde os compostos 21-23 e 29-30 foram extraídos a partir de

diferentes partes de W. indica. O composto 30 apresentou alta atividade

27

antitripanossoma frente a T. cruzi (Figura 3) (PAIS, MAINIL, GOUTAREL, 1963; PAIS,

JARREAU, GOUTAREL 1968; CRETTON, 2015).

Já o estudo realizado com W. douradinha permitiu o isolamento de cinco

alcalóides (24-28) a partir do caule da mesma. Além disso, o mesmo estudo permitiu

identificar alta atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, Salmonela setubal e

Klebsiella pneumoniae para o alcaloide 25 (Figura 3) (GRESSLER, 2008).

Figura 3: Alcaloides isolados a partir de diferentes partes de W. indica e W. douradinha

Fonte: Autor, 2018

28

Além dos compostos citados, outros três derivados triterpenicos pentaciclicos

foram isolados a partir da raiz e partes aéreas de W. indica (31-33) (Figura 4)

(CRETTON, 2015).

Figura 4: Derivados de triterpenos pentaciclicos isolados a partir da raiz e partes aéreas de

W. indica

Fonte: Autor, 2018

De modo geral, a literatura relata que espécies de Waltheria apresentam

metabólitos de diferentes classes, como flavonoides, alcaloides e triterpenos, além

das diversas atividades acima citadas.

3.4 Metabólitos secundários

São compostos que desempenham um papel importante na adaptação das

plantas ao seu habitat, além de ser uma fonte rica de substâncias farmacologicamente

ativas. Os metabolitos secundários são usualmente classificados de acordo com a sua

29

rota biossintética e divididos em três grupos, sendo eles terpenos, compostos

fenólicos e compostos nitrogenados. (FUMAGALI, 2008; HARBONE, 1999).

3.4.1 Flavonoides e sua estrutura

Os flavonoides são compostos fenólicos, que por vezes, apresentam diversos

efeitos benéficos a saúde e podem ser encontrados em frutas, vegetais e certas

bebidas. Biologicamente, os flavonoides podem ser encontrados em diversas partes

da planta, como, fruto, caule, raiz e flores. (FERREYRA, 2012; PANCHE, 2016).

Sua estrutura básica é formada por quinze átomos de carbonos distribuídos

entre dois anéis aromáticos, sendo o anel A derivado da cadeia policetídica e o anel

B derivado do ácido chiquímico, além de um heterociclo oxigenado (anel C), como

mostra a Figura 5.

Figura 5: Estrutura química de um flavonoide (34) e isoflavonoide (35)

Fonte: Autor, 2018

Os flavonoides estão inseridos na classe de compostos polifenólicos de baixo

peso molecular, e podem ser subdivididos classes como catequinas, flavanonas,

flavonóis, flavonas e antocianinas (Figura 6). Sua classificação depende basicamente

do carbono do anel C em que o anel B está ligado, além do grau de insaturação e

oxidação do anel C. Quando o anel B é diretamente ligado a posição 3 do anel C dá-

se origem as isoflavonas (Figura 5- 35). Caso o anel B esteja ligado na posição 2

(Figura 5-34) resultará em diferentes subgrupos baseado em características

estruturais do anel C. (FERREYRA, 2012; PANCHE, 2016).

30

Figura 6: Classificação dos flavonoides

Fonte: Autor, 2018

3.4.1.1 ROTA BIOSSINTÉTICA

3.4.1.1.1 Formação do ácido chiquímico

O ácido chiquímico éo principal percursor dos compostos fenolicos de micro-

organismos e plantas. É obtido através do acoplamento entre fosfoenolpiruvato e D-

eritose-4-fosfato (derivados da degradação da glicose). Incialmente ocorre a

formação do 7-fosfato-3-desoxi-D-arabino-heptulosonico (38) a partir do ataque inicial

da dupla ligação do D-eritose-4-fosfato (36) a carbonila do fosfoenolpiruvato (37), via

reação aldol. Como o produto gerado contém um grupo abandonador [PO4-], o mesmo

participa de uma β-eliminação, onde o hidrogênio eliminado da origem a dupla ligação,

e esta por ser nucleofílica ataca o carbono carbonílico (39) em uma nova reação aldol

seguida de outra reação aldol intramolecular (40) dando origem ao ácido 3-dehidro-

quínico (41), que é convertido em ácido chiquímico após sofrer desidratação e

redução com NADPH (Figura 7).

31

Figura 7: Formação do ácido chiquímico

Fonte: Autor, 2018

3.4.1.1.2 Formação da fenilalanina

Para formação da fenil-alanina, o ácido chiquímico (41) sofre oxidação por uma

molécula de ATP, gerando o acido 3-fosfo-chiquímico (42), e este por sua vez, reage

com D-eritose-4-fosfato (43) por meio de uma reação aldol formando o ácido 5-

enolpiruvil-3-fosfo-chiquímico (44), que sofre uma eliminação 1,2 com eliminação de

[PO4-], gerando o ácido corísmico (45), que através de um rearrajo sigmatrópico [3,3]

se transforma em ácido prefênico (46), e este após eliminar H2O e CO2 se transforma

em ácido fenil-piruvico (47). Uma transaminação via piridoxal fosfato (PLP) origina L-

fenil-alamina (48) (Figura 8).

32

Figura 8: Formação da fenilalanina

3.4.1.1.3 Proposta biossintética para o asperfenamato

A Fenilalanina (48) reage com o benzoil-CoA (49) por meio de uma reação aldol

com a eliminação do grupo abandonador coenzima SCoA e nova reação aldol para

formação de 52. A redutase e álcool desidrogenase ocorrem para obtenção do aldeído

correspondente (53) e ácido carboxílico (54) e álcool (55). O asperfenamato é formado

a partir de um equivalente de 54 e 55, respectivamente por meio de uma reação aldol

seguida de eliminação de H2O, como ilustrado na Figura 9.

33

Figura 9: Proposta de mecanismo biossintético para o asperfenamato

3.5 ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.5.1 Processo oxidativo e atividade antioxidante

Radicais livres são espécies instáveis, e portanto, altamente reativas. Sua

instabilidade permite a ocorrência de reações de oxirredução, onde o radical livre sofre

oxidação perdendo elétron ou redução, ganhando elétron (Figura 10). Os radicais

livres são os principais responsáveis pelo desencadeamento de doenças, como

diabetes e hipertensão por exemplo (BONOMINI; RODELLA; REZZANI , 2015).

Os agentes antioxidantes são responsáveis pela minimização do processo de

oxidação diminuindo sua velocidade. O corpo humano é capaz de produzir de forma

natural os antioxidantes endógenos, no entanto, a velocidade de oxidação só é

reduzida caso a quantidade de antioxidantes seja suficiente, caso contrário, surge a

34

necessidade do uso de antioxidantes provenientes de fontes externas, pois resultará

em lesões oxidativas (BERGER, 2005; SOUSA et al., 2007).

Dentre os principais compostos naturais com ação antioxidante estão os

compostos fenólicos e polifenólicos, e estes podem ser facilmente encontrados em

espécies vegetais. Relatos da literatura apontam o extrato metanol das folhas de

Waltheria indica como um antioxidante em potencial, e essa atividade pode ser

comprovada através dos métodos DPPH, LPO e FRAP (KRISHNA; SUDARSANAM,

2015).

Segundo BORGUINI (2006), o método 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) é um

recurso fácil e preciso para avaliar atividade antioxidante in vitro em extratos; também

é, amplamente, usado por requerer tempo relativamente curto, em relação a outros

métodos. O efeito dos antioxidantes sobre o sequestro do radical DPPH é atribuído à

habilidade destes compostos de doar hidrogênio.

O ensaio usando o radical livre DPPH, vem sendo comumente utilizado para

determinação do percentual antioxidante. Trata-se de um ensaio in vitro onde a

capacidade antioxidante via atividade sequestradora do radical livre é analisada

utilizando o UV-Vis num comprimento de onda de 517 nm. O DPPH na sua forma

oxidada apresenta a cor purpura, e absorve em comprimento de onda 517 nm, ao

receber um hidrogênio, o radical livre DPPH sofre redução a difenil-picril-hidrazina, e

este possui uma coloração amarelada devido ao decréscimo na absorção citada. A

mudança de coloração pode ser observada alguns minutos após a adição do DPPH

na solução extrativa (TEIXEIRA et al., 2013).

Figura 10: Redução do radical livre DPPH

Fonte: Autor, 2018

Trata-se, portanto, de experimento de fácil realização capaz de comprovar de

forma rápida e segura a capacidade antioxidante de extratos e/ou moléculas isoladas.

35

Seu potencial é medido através da porcentagem oxidante, onde quanto menor for a

concentração de extrato e/ou composto puro e mais elevada for essa capacidade,

maior atividade antioxidante.

3.5.2 Toxicidade frente ao microcrustacéo Artemia salina

A Artemia salina é um microcrustáceo de água salgada que vive sob condições

de alta salinidade e baixa oxigenação da água. É comumente usado como alimento

vivo para peixes, e sua aquisição é de fácil acesso, além de seus cistos

permanecerem viáveis por anos no estado seco. Estes microcrustáceos podem ser

utilizados em testes preliminares de toxicidade (TAS), pois esta espécie geralmente é

utilizada como biomarcadora de toxidade. A simplicidade para realização da TAS

favorece seu uso, pois o mesmo pode ser desenvolvido sem exigir grandes estruturas

e ainda apresentou resultados semelhantes ao teste de viabilidade celular (MTT),

sugerindo que o mesmo se trata de uma alternativa rápida e viável para o ensaio in

vitro (MCLAUGHLIN, 1993; RAJABI, 2015)

Seu uso permitiu estabelecer uma boa correlação da toxicidade, deste modo,

este estudo preliminar se mostrou vantajoso na avaliação da bioatividade dos

produtos naturais, e seu uso é viável como triagem biológica a fim de buscar novas

substâncias bioativas capazes de exercer tal atividade (RAJABI et al., 2015; WANG

et al. 2017)

4. MATERIAIS E MÉTODOS

As colunas cromatográficas foram realizadas com silica em gel (ɸ - µm 400-

200) e (ɸ - µm 63-200), e Sephadex LH-20. O diâmetro e comprimento da coluna

variou de acordo com a quantidade de amostra a ser tratada, bem como a resistência

do material usado, sendo na cromatografia de adsorção (cromatografia flash) um

material resistente a pressão, além do bulbo para armazenamento do solvente neste

procedimento.

Na cromatografia de camada delgada (CCD) foram utilizadas cromatoplacas

de gel de sílica 60 F254 ( m 2-25) sobre alumínio da marca MERCK, e reveladas

36

usando solução de vanilina (C8H8O3 – 3 g dissolvidas em 100 mL de etanol) e ácido

sulfúrico 10% (H2SO4) (Vetec) com proporção de 1:1, seguido de aquecimento para

revelação.

Os solventes hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila, etanol,

metanol todos da marca SYNTH e água destilada, além dos solventes deuterados,

clorofórmio, metanol e acetona comercializados pela companhia TEDIA BRAZIL foram

usados como eluentes nos procedimentos cromatográficos e espectroscópicos.

Nas reações de saponificação e esterificação foram utilizados hidróxido de

sódio em micropérolas (NEON), sulfato de sódio anidro (ANDROL) e ácido clorídrico

(SYNTH).

Nos ensaios biológicos de atividade antioxidante e toxidade foram utilizados o

radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) da Sigma Aldrich e cistos de artemia

salina (comercial), respectivamente.

4.1 Cromatografia gasosa acoplada à espectrômetria de massas

Uma massa de 2 mg dos saponificáveis e insaponificavéis foram pesadas e

solubilizadas com diclorometano HPLC, e sua dissolução completa foi possível após

submeter a amostra no ultrassom. Realizado o procedimento a amostra foi filtrada e

injetada no equipamento seguindo a metodologia abaixo.

As análises de CG/EM foram realizadas em cromatografo Thermo Scientific

modelo Focus GC, acoplado a um espectrômetro modelo ISQ, com injetor Split 1:7 e

temperatura de 250 ºC, gás de arraste hélio a fluxo contínuo de 1,5 mL/min e coluna

NST-5MS (30 m x 25 mm x 10 µm) operando em rampa de aquecimento de 80 ºC a

280 °C, sendo 80 – 260 °C (5°C/min); 260 – 280 °C (10 °C/min) por 5 minutos e volume

de injeção 1 uL. O espectrômetro operando na faixa de 35 – 500 amu, e fonte de íons

(70 eV) foi mantida a 240 ºC e a interface a 300 ºC. A identificação dos compostos foi

realizada através da comparação entre os espectros de massas com o banco de

dados do equipamento, utilizando a biblioteca mainlab, como também dados da

literatura.

37

4.2 Cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrômetro de

massas e detector quadrupolo- UPLC-MS QTOF

A análise foi realizada em um sistema Acquity UPLC (Waters), acoplado ao

sistema de Quadrupolo / Tempo de Voo (QtoF, Waters) da Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA. A coluna utilizada nas corridas cromatográficas

foi UPLC BEH (150 x 2,1 milímetros, 1,7 um) Waters Acquity, com temperatura fixa de

40 ◦C. As fases móveis utilizada no procedimento foram água com 0,1% de ácido

formico (A) e acetonitrila com 0,1% de ácido formico (B), com gradiente variando de

2% a 95% B (15 min), fluxo de 0,4 mL / min e volume de injeção de 5 µl.

4.2.1 Condições do massas de alta resolução - XEVO-QTOF

O modo ESI- foi adquirido na faixa de 110-1180 Da, temperatura da fonte fixa

a 120 ◦C, temperatura de dessolvatação 350 ◦C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L

/ h, cone de extração de 0,5 V, voltagem capilar de 2,6 kV. O modo ESI+ foi adquirido

na faixa de 110-1180 Da, temperatura da fonte fixa de 120 ◦C, temperatura de

dessolvatação 350 ◦C, fluxo do gás dessolvatação de 500 L / h e voltagem do capilar

de 3,2 kV. Leucina encefalina foi utilizada como lock mass. O modo de aquisição foi

MSE. O instrumento foi controlado pelo software Masslynx 4.1 (Waters Corporation).

4. 3 ANÁLISES ESPECTROSCÓPICAS

4.3.1 Ultravioleta visível (UV-Vis)

O espectrofotômetro utilizado nas análises do ultravioleta visível foi Evolution

60S da Thermo Scientific, com cubetas de quartzo com caminho ótico de 1,0 cm, além

do comprimento de onda de 517 nm.

38

4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono-13

(RMN 13C)

Os espectros de RMN foram obtidos atráves de espectrômetros Bruker

Avance DPX 300 MHz E DRX 500 MHz pertencente ao Centro Nordestino de

Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do

Ceará (CENAUREMN- UFC). As amostras foram dissolvidas em 0,6 mL de solvente

deuterado: dimetilsufóxido – DMSO ((CD3)2SO), metanol (CD3OD), água (D2O),

clorofórmio (CDCl3) e piridina (C5D5N) comercializados pela companhia TEDIA

BRAZIL.

No espectrômetro Bruker Avance DRX-300 foi utilizado uma sonda de

detecção inversa de 5 mm e magneto de 7,0 T, operando em frequências de 300,13

MHz para hidrogênio e 75,47 MHz para carbono. Já o equipamento Bruker Avance

DRX-500 operou em frequências de 500,13 MHz e 125,75 MHz, para carbono e

hidrogênio, respectivamente, sob um campo magnético de 11,7 T. O tipo de sonda

varia conforme a técnica utilizada: sonda dual de 5 mm com detecção direta (1D) e

sonda multinuclear de 5 mm com detecção inversa (2D).

Os deslocamentos químicos () foram expressos em partes por milhão (ppm) e

padronizados de acordo com o valor de deslocamento químico tabelado para o

solvente, onde: acetona ( δ 2,05), DMSO ( 2,51), metanol ( 3,31) e clorofórmio (

7,27), para o espectro de 1H, e DMSO ( 39,51), metanol ( 49,15), clorofórmio (

77,23) e acetona ( δ 206,68 e 29,92) nos espectros de 13C.

As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram

indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), q (quarteto), dd

(duplo dupleto) e m (multipleto).

A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com

ângulos de nutação de 135, úteis na caracterização de carbonos metilênico (CH2) e

carbono metínico (CH) e metílico (CH3) através da subtração do espectro DEPT 135

do espectro BB.

Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY: homonuclear

Correlation Spectroscopy) e heteronuclear (HSQC: Heteronuclear Single-Quantum

Correlation, HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence e HMBC:

Heteronuclear Multiple Bond Coherence), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-

39

300 ou DRX-500, foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção

inversa, empregando-se gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de

10 A. Os valores de J utilizados para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145

nJH,C = 7, onde n ≥ 2.

4.4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.4.1 Coleta do material vegetal

O caule de Waltheria cinerencens foi coletado na Chapada da Ibiapaba (CE) e

sua identificação foi realizada pela Prof. Dra. Maria Lenise Silva Guedes (UFBA) no

herbário Alexandre Leal Costa (ALCB), sob o número de exsicata 47.508. As folhas

da Waltheria douradinha foram coletadas no município de Tibau do Sul (RN) e

depositadas no herbário da UFRN e apresenta o número de registro 24100. As folhas

e caule de Waltheria ferruginea, assim como as folhas de Waltheria indica foram

coletadas no município de Beberibe e Russas, respectivamente, ambas localizadas

no estado do Ceará (CE). As exsicatas foram depositadas no herbário Prisco Bezerra

do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, sob o número de

registro 94575 e 58398, respectivamente. Todas as espécies utilizadas encontram-se

registradas no SisGen no cadastro de número A12E895.

4.4.2 Processamento da planta e obtenção dos extratos

O caule de W. cinerescens (607,5 g) e W. ferruginea (1058,6 g) e folhas de W.

douradinha (71,99 g), W. ferruginea (70,97 g) e W. indica (73,87 g) foram desidratados

e submetidos a secagem em temperatura ambiente por duas semanas e processada

em moinho de facas. Em seguida foram colocadas em contato com hexano de forma

exaustiva (3x 72h), posteriormente o material vegetal foi concentrado dando origem

aos extratos WCCH (3,736 g), WFCH (2,100 g), WDFH (2,104 g), WFFH (9,862 g) e

WIFH (1,301 g). Após extração da fração hexano, o material vegetal foi submetido a

extração com etanol ou metanol por igual período e procedimento, fornecendo os

40

extratos e WCCE (12,28 g), WFCE (21,32 g), WDFM (15,29 g), WFFE (2,733 g) e

WIFM (15,67 g), respectivamente.

4.4.3 Fracionamento cromatográfico

4.4.3.1 Estudo fitoquímico de W. cinerescens

4.4.3.1.1 Fracionamento de WCCH

O extrato WCCH (3,736 g) foi particionado usando uma coluna com sílica em

gel e eluída segundo gradiente com solventes hexano, acetato de etila e metanol,

rendendo 36 frações, como mostra a Tabela 1. Todas as frações foram submetidas a

cromatografia de camada delgada (CCD) com fase móvel clorofórmio e

clorofórmio/metanol (9:1), e reunidas conforme semelhança cromatográfica (Tabela

2).

Tabela 1: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WCCH

FRAÇÕES SOLVENTE

WCCH 1-13 Hex

WCCH 14-22 Hex/AcOEt 10%




WCCH 35 AcOEt

WCCH 36 MeOH

41

Tabela 2: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WCCH

FRAÇÃO MASSA (g) FRAÇÃO MASSA (g)

1-6 0,018 19 0,007

7 0,013 20-23 0,050

8-10 0,020 24-26 0,059

11 0,003 27-29 0,065

12 0,032 30-32 0,130

13 0,001 33 0,075

14-16 1,839 34 0,039

17-18 0,079 35-36 0,136

Rendimento: 68,9 %

A fração 19 (0,007 g) (Hex/AcOEt 10%) nomeada como WcCH 19 se

apresentou como cristais amarelos, onde a mesma era insolúvel em hexano, deste

modo, foi lavada com esse solvente e submetida a análise por RMN 1H e 13C 1D e 2D

para sua elucidação.

A fração 14-16 (1,839 g) obtida nesse procedimento foi submetida a uma coluna

flash usando os solventes hexano, acetato de etila e metanol nas proporções da

Tabela 3, rendendo 26 frações.

Tabela 3: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento da subfração WCCH

(14-16)

FRAÇÕES SOLVENTE

WCCH (14-16) 1-16 Hex/AcOEt 5 %

WCCH (14-16) 17-23 Hex/AcOEt 10%

WCCH (14-16) 24 Hex/AcOEt 50%

WCCH (14-16) 24-25 AcOEt

WCCH (14-16) 26 MeOH

Todas as frações foram analisadas em CCD e as semelhantes reunidas, como

mostrado na Tabela 4. As frações WCCH (14-16) ppt 13 (0,006 g) (acetato de etila 5

%) e WCCH (14-16) ppt 22 (0,008 g) (Hex/AcOEt 10%) se apesentaram como puras,

com aspecto de cristais amarelos e um sólido amorfo de cor branca, respectivamente.

42

Estes foram lavados com hexano e submetidos a análise de RMN 1H e 13C 1D e 2D

para confirmação da estrutura química. As referidas substâncias foram denominadas

de WcCH (14-16) ppt 13 e WcCH (14-16) ppt 22, respectivamente.

Tabela 4: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento da subfração WCCH (14-16)


1-4 0,1281 16-18 0,0297

5-8 0,0100 19-21 0,0058

9-10 0,0383 22-23 0,0127

11-13 0,0805 ppt 22 0,0075

ppt 13 0,0060 24-25 0,0173

14-15 0,0981 26 0,0298

Rendimento: 25,2%

A Figura 11 ilustra o esquema de fracionamento dos estratos de Waltheria

cinerescens para obtenção de WcCH 19, WcCH (14-16) ppt 13 e WcCH (14-16) ppt

22, respectivamente.

Figura 11: Esquema de fracionamento da W. cinerescens

43

4.4.3.2 Estudo fitoquímico de W. douradinha

4.4.3.1.1 Fracionamento de WDFM

Uma alíquota de 9,26 g do extrato WDFM foi submetida a partição liquído-liquído

com os solventes hexano, clorofórmio e acetato de etila, e a partir disso, foi possível

obter as frações WDFM-H (0,0069 g), WDFM-C (0,052 g) e WDFM-Ac (0,292 g) e

WDFM-Hidro (7,934 g).

A fração WDFM-Ac (0,2915 g) foi submetida a coluna flash e fase móvel composta

pelos solventes hexano, clorofórmio e metanol, puros ou em proporções, rendendo 36

frações como mostra Tabela 5. Todas as frações foram reunidas de acordo com a

semelhança cromatográfica apresentada em na cromatografia de camada delgada

(Tabela 6), e a fração ppt 26 (0,003 g) (Clo/MeOH 30%) apresentou um aspecto de

substância pura com um sólido de cor amarela. A mesma foi submetida a análise de

RMN 1H e 13C 1D e 2D para sua elucidação estrutural e denominada de WdFM-Ac ppt

26.

Tabela 5: Solventes utilizados e frações coletadas no fracionamento do extrato WDFM

FRAÇÕES SOLVENTES

WDFM 1 Hex/CHCl3 20 %

WDFM 2 Hex/CHCl3 70 %

WDFM 3-7 CHCl3

WDFM 8-10 CHCl3/MeOH 2%





WDFM 32-36 MeOH

44

Tabela 6: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento do extrato WDFM

A Figura 12 ilustra os extratos trabalhados e substância WdFM-Ac ppt 26

isolada de Waltheria douradinha.

Figura 12: Esquema de fracionamento da W. douradinha

4.4.3.3 Estudo fitoquímico de W. ferrugínea

4.4.3.3.1 Fracionamento de WFFE

O extrato WFFE (9,862 g) foi dissolvido em metanol e submetido a partição

líquido-líquido usando hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol/H2O, rendendo


1-3 0,012 21-25 0,013

4-10 0,011 ppt 26 0,003

11-16 0,013 26-30 0,106

17-20 0,031 31-36 0,046

Rendimento: 80,6%

45

as frações WFFE-H (1,65 g), WFFE-C (0,27 g), WFFE-Ac (1,17 g), WFFE-Hid (6,12

g).

4.4.3.3.1.1 Fracionamento da parte WFFE-Ac

A fração foi tratada através de coluna cromatográfica Sephadex LH-20,

rendendo 60 frações que foram reunidas conforme semelhança de fator de retenção

analisado por CCD (Tabela 7).

Tabela 7: Frações reunidas e suas respectivas massas no fracionamento de WFFE-Ac

Frações Massas (g)

1-6 0,159

7-8 0,046

9-16 0,106

17-21 0,120

22-27 0,141

28-31 0,371

32-37 0,060

38-60 0,122

Rendimento: 96,2%

Após análise cromatográfica, as frações WFFE-Ac (28-31) (0,371 g) e WFFE-

Ac (32–37) (0,060 g) se mostraram quase puras, sendo portanto submetidas ao

processo de purificação utilizando CLAE com eluição no modo reverso e fluxo de 4,7

mL/min, com fase móvel água-acetonitrila (70:30). Realizado o procedimento, foram

obtidas as substâncias WfFE-Ac (28-31) e WfFE-Ac (32–37), respectivamente.

4.4.3.3.2 Fracionamento de WFCH

O extrato WFCH (2,100 g), foi submetido ao procedimento cromatográfico

usando coluna comum com os solventes hexano, clorofórmio, acetato de etila e

46

metanol rendendo 20 frações (Tabela 8), e reunidas conforme Tabela 9. A fração 14

(ppt 14) (0,010 g) (Clo/AcOEt 50%) deste procedimento se mostrou quase pura, sendo

necessária a lavagem com clorofórmio para obtenção de substância pura denominada

de WfCH ppt 14, confirmada através da cromatografia de camada delgada. A fração

foi submetida a análise de RMN de 1H e 13C (1D e 2D) para elucidação de sua

estrutura.

Tabela 8: Frações e solventes usados no procedimento cromatográfico de WFCH

Fração Solvente

1-4

5-7

8-9

10-14

15-17

18-20

Hex/CHCl3 50%

CHCl3

CHCl3/AcOEt 20%

CHCl3/AcOEt 50%

AcOEt/MeOH 50%

MeOH

Tabela 9: Frações reunidas e massas obtidas no fracionamento WFCH

Fração Massa (g)

1-9 0,793

10-14

ppt 14

0,076

0,010

15-20 0,372

Rendimento: 59,6%

O esquema abaixo (Figura 13) mostra de forma como se deu o isolamento de

WfFE-Ac (28-31), WfFE-Ac (32–37) e WfCH ppt 14 de W. ferrugInea.

47

Figura 13: Esquema de fracionamento da W. ferrugínea

Fonte: Autor, 2018

4.4.3.4 Estudo fitoquímico de W. indica

4.4.3.4.1 Fracionamento de WIFM

O extrato WIFM (2,5 g) foi submetido a partição liquído-liquído com os solventes

hexano, clorofórmio e acetato de etila em diferentes proporções, e a partir disso, foi

possível obter as frações WFIM-H (0,599 g), WFIM-C (0,033 g), WFIM-Ac (0,775 g) e

WFIM-Aq (1,407 g).

4.4.3.4.2 Fracionamento da subfração WiFM-H

WiFM -H (0,599 g) foi submetida a uma coluna flash utilizando os solventes

hexano, clorofórmio e metanol, puros ou em proporções rendendo 54 frações (Tabela

10). Todas foram analisadas em CCD e reunidas conforme Rf’s, como mostra Tabela

11.

48

Tabela 10: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H

FRAÇÃO SOLVENTE FRAÇÃO SOLVENTE

1 – 6 Hex 23-28 CHCl3

7-12 Hex/CHCl3 5% 29-38 CHCl3/MeOH 5%

13-19 Hex/CHCl3 10% 39-45 CHCl3/MeOH 10%

20 Hex/CHCl3 20% 46-48 CHCl3/MeOH 50%

21 Hex/CHCl3 40% 49-54 MeOH

22 Hex/CHCl3 50%

Tabela 11: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento de WiFM-H

FRAÇÃO Massa (g) FRAÇÃO Massa (g)

1 – 15 0,024 23-36 0,179

16-18 0,003 37-44 0,046

19-22 0,021 45-54 0,284

Rendimento: 93,2%

4.4.3.4.3 Fracionamento da subfração WiFM -H (45-54)

WiFM H (45-54) (0,284 g) foi submetida ao procedimento cromatográfico usando

coluna comum usando hexano, clorofórmio e metanol puros ou em proporções

rendendo 54 frações (Tabela 12). Estas foram reunidas após análise por CCD, como

mostra Tabela 13.

Tabela 12: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H (45-54)

Fração Solvente

1-6 Hex/CHCl3 30%

7-12 Hex/CHCl3 50%

13-20 CHCl3

21-30 CHCl3/MeOH 5%

31-33 CHCl3/MeOH 10%



46-54 MeOH

49

Tabela 13: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WiFM-H (45-54)


1-3 0,005 21-39 0,116

4-14 0,006 50-54 0,074

15-20 0,012 Rendimento: 75,2%

4.4.3.4.4 Fracionamento da subfração WiFM-H (45-54) 21-39

A subfração WiFM-H (45-54) 21-39 (0,116 g) foi submetida ao procedimento

cromatográfico coluna flash usando os solventes clorofórmio e metanol puro ou em

proporções, rendendo 25 frações (Tabela 14). Todas as frações obtidas neste

procedimento foram submetidas a análise em cromatografia de camada delgada e

reunidas conforme Tabela 15.

Tabela 14: Solventes utilizados na cromatografia flash da subfração WiFM-H (45-54) 21-39

Fração Solvente

1-7 CHCl3

8-13 CHCl3/MeOH 5%




24-25 MeOH

Tabela 15: Frações reunidas e massas obtidas do fracionamento da subfração WiFM-H (45-54) 21-39


1-5 0,020 15-18 0,007

6-9 0,016 19-25 0,015

10-14 0,021 Rendimento: 67,6%

50

A fração 6-9 (0,016 g) (CHCl3/MeOH 5%) foi submetida a análises de RMN 1H e

13C 1D e 2D para elucidação estrutural, e a mesma foi denominada de WiFM-H(45-

54) 21-39 (2). Tal substância já foi isolada a partir da W. ferruginea e W. douradinha

neste estudo.

A Figura 14 mostra o esquema para obtenção de WiFM-H(45-54) 21-39 (2) a

partir das folhas de W. indica.

Figura 14: Esquema de fracionamento da W. indica

Fonte: Autor, 2018

4.4.4 Obtenção dos ésteres metílicos

4.4.4.1 Reação de saponificação

Os extratos alcóolicos das diferentes espécies (WcCE, WdFM, WfFE e WiFM)

foram submetidas a reação de saponificação. Todos os extratos foram solubilizados

adicionando-se algumas gotas de MeOH em seguida adicionou-se uma solução

alcoólica de NaOH. A solução de NaOH foi preparada através da dissolução do

51

mesmo em uma pequena quantidade de água, e o volume máximo completado com

etanol. A mistura reacional foi transferida para balão de fundo redondo, e mantida sob

agitação e refluxo, com temperatura de 60 ºC, durante o período de duas horas.

Ao final da reação foram adicionados 20 mL de água destilada, e todo volume

transferido para um funil de separação, de modo a realizar uma partição líquido-líquido

e obter os compostos insaponificáveis. Foram utilizados os solventes diclorometano

(CH2Cl2) e acetato de etila (AcOEt) e as partes obtidas foram coletadas em

erlenmeyer. Às partes obtidas foram adicionadas sulfato de sódio anidro para remoção

de resíduo de água, seguido de filtração e então concentrado em evaporador rotativo.

Após secagem, as amostras foram analisadas em cromatográfo gasoso acoplado a

espectrômetro de massas – CG-EM, segundo o procedimento 4.1.

4.4.4.2 Reação de esterificação

A parte aquosa obtida no procedimento 4.4.4.1 foi acidificada com ácido

clorídrico concentrado (HCl) até obter um pH ~ 2 – 3 e submetida a esterificação afim

de obter os compostos saponificáveis. Após acidificação do meio foram adicionados

5mL de MeOH e a reação foi posta sob agitação e refluxo por 1h em temperatura de

60 ºC.

Após finalização do procedimento foram adicionados 10 mL de uma solução

saturada de KCl, e a mistura obtida foi transferida para um funil de separação para

obtenção dos ésteres metílicos. Para o procedimento citado foram utilizados os

solventes CH2Cl2 e AcOEt. Realizada a partição, às partes que continham o material

de interesse foram adicionadas sulfato de sódio anidro, seguido de filtração e

concentração da fase orgânica em evaporador rotativo. Depois de secas, as partes

saponificáveis foram submetidas a análise de CG-MS.

52


4.5.1 Avaliação da atividade antioxidante

O procedimento foi adaptado do trabalho de SOUSA et al. (2007), e realizada

para os extratos hexano e etanol das quatro espécies de Waltheria. A partir do extrato

alcoólico das espécies foi preparada uma solução de concentração de 500 µg/mL. A

partir dessa, foram preparadas diluições conforme Tabela 16.

Tabela 16: Preparo de soluções

Concentração (µg/mL) Solução de estoque (mL) Volume de MeOH (mL)

25 0,1 1,9

50 0,2 1,8

100 0,3 1,7

150 0,4 1,6

200 0,6 1,4

250 1 1

Para cada diluição foram adicionadas a solução de DPPH com concentração

de 40 µg/mL (4 mg de DPPH /100 mL de EtOH), exceto nos brancos, onde é

adicionado apenas a amostra e solvente, neste caso o metanol. Após a adição do

DPPH nas amostras, foi necessário esperar 30 minutos para início do procedimento

de leitura no espectrofotômetro a 517 nm, que é o comprimento de onda de absorção

máxima do DPPH. A Figura 15 ilustra este procedimento.

53

Figura 15: Esquema de preparo das amostras a serem analisadas em espectrofotômetro.

Fonte: Autor, 2018

Após obter os valores de absorbância medidos em triplicata e calcular os

valores médios, os mesmos foram aplicados na equação abaixo para obtenção da

concentração mínima necessária para a redução de 50% dos radicais livres.

AA% = 100 – {[Absamostra - Absbranco) x 100] / Abscontrole}

Onde:

Absamostra = Absorbância do extrato vegetal com o DPPH

Absbranco = Absorbância do extrato solubilizado

Abscontrole = Absorbância do DPPH puro (40 µg/mL)

4.5.2 Avaliação da toxidade frente a Artemia salina

Os extratos hexano e etanol de todas as espécies foram submetidos a

avaliação da toxidade frente ao minicrustáceo Artemia salina. O procedimento seguiu

a metodologia de MCLAUGHLIN et al. (1988) com algumas modificações.

Preparou-se uma solução salina utilizando 35 g de sal marinho sintético e 951

mL de água destilada. Em média 500 mL desta solução foi transferida para um funil

de decantação e os cistos de Artemia foram postos em contato de modo a ocorrer a

sua eclosão. Para isto, foi necessário cobrir o funil com papel alumínio e usar uma

iluminação artificial com temperatura ambiente controlada (±30 °C). Após um período

54

de 24 h os náuplios foram transferidos para uma placa de Petri e ficaram em repouso

por mais 24 h, até atingir o estado de maturação esperado, o metanáuplios.

Foram utilizados 50 mg do extrato bruto e dissolvidos em 25 mL, dos quais 4,2

mL eram de tween 5% e 20,8 mL eram solução salina, obtendo, portanto, uma solução

estoque com concentração de 2 mg/mL, onde a partir da mesma foram preparadas

diluições. A Tabela 17 apresenta os volumes utilizados da solução estoque e

concentração final de cada diluição para um volume final de 5 mL.

Tabela 17: Preparação de soluções para teste

Solução de estoque (µL)

Concentração (µg/mL)

0,13 50

0,25 100

0,63 250

1,25 500

1,88 750

2,5 1000

Após 48 h, 10 espécimes foram postas em um tubo de ensaio contendo a

solução com concentração conhecida citada acima, e mantidos a temperatura

ambiente e luz natural. Após 24 h foi verificado o número de sobreviventes e este

número foi submetido a análise PROBIT para aquisição da concentração letal. O

procedimento foi realizado em triplicata para cada concentração especificada.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Caracterização estrutural das substâncias isoladas

O estudo permitiu o isolamento de seis substâncias químicas (Figura 16)

dentre as quais quatro flavonoides, sendo eles 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona

(retusina) (WcCH 19), 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona (WcCH (14-16) ppt 13),

canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo) (WdFM-Ac ppt 26, WfFE-Ac

(32–37 e WiFM- H(45-54) 21-39 (2) ) e canferol-3-O-β-glicopiranosídeo (WfFE-Ac (28-

31)), ambos inéditos para a espécie. Além do triterpeno ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-

55

óico (ácido betulônico) (WcCH (14-16) ppt 22) e o N-benzoil-L-fenilalaninato de N-

benzoil-2- amino-3-fenilpropila (auranamida) (WfCH ppt 14), inédito para o gênero.

Figura 16: Estrutura química das substâncias isoladas das espécies de Waltheria

5.1.1. Elucidação estrutural de WcCH 19

Os cristais amarelos de WcCH 19 (Hex/AcOEt 10%) foram submetidos a

análise RMN 1H e 13C 1D e 2D para sua elucidação. O espectro de RMN 1H (Figuras

17, 18 e 19) apresentou um total de 9 sinais, sendo cinco na região de aromáticos,

característicos de flavonoides com deslocamentos químicos específicos, além de

permitir a identificação do padrão de oxigenação.

Os sinais em δ 7,76 [dd, 8,6 e 1,8 Hz] (H-6’), 7,70 [d, 1,8 Hz] (H-2’), 7,00 [d, 8,4

Hz] (H-5’), 6,46 [d, 2,1 Hz] (H-8) e 6,37 [d, 2,1 Hz] (H-6) evidenciados na figura 18

são característicos de hidrogênios aromáticos. Onde H-6 e H-8 sofrem o efeito doador

56

de elétrons livres do oxigênio, e portanto, são os mais protegidos. A partir dos

hidrogênios em δ 6,37 e 6,46 com J= 2,1 Hz que aparecem no espectro como dupletos

foi possível identificar o padrão de substituição do anel A, onde existe substituinte em

C-5 e C-7. Além disso, os hidrogênios δ 7,70 [d, 1,8Hz] (H-2’), δ 7,0 [d, 8,4Hz] (H-5’)

e δ 7,75 [dd, 8,6 e 1,8 Hz] (H-6’). O sistema AMX permitiu identificar o padrão de

substituição do flavonoide como sendo tetrasubstituído.

Os hidrogênios da região entre δ 7,76 e 6,37 permitiram identificar o padrão de

substituição do flavonoide, e a partir das constantes de acoplamento as posições dos

substituintes em 3, 7, 3’ e 4’. Além disso, os valores de deslocamento δ 3,98, 3,97,

3,89 e 3,87 permitiram identificar os substituinte como sendo metoxilas, uma vez que

o deslocamento é superior ao esperado.

A análise do RMN 13C (Figuras 20 e 21), mostrou 19 linhas espectrais, das

quais um sinal em δ(C-4) 179,11 que evidencia a presença de uma carbonila de

cetona α,β insaturada, onde é possível evidenciar a presença de uma metoxila

adjacente a mesma, além de quatro sinais que evidenciam a presença dos carbonos

metílicos das metoxilas em δ 60,4, 56,3, 56,2 e 56,0 que correspondem a C-3, C-7, C-

3’ e C-4’, respectivamente. Onde C-3 apresenta um deslocamento superior aos

demais, visto que o mesmo sofre o efeito desprotetor mesomérico retirador da

carbonila, com isso, fica mais desprotegido que os demais. Além de um sinal em δ

162,33 que indica o carbono que contém a hidroxila do núcleo flavonoídico. Os demais

sinais apresentados no espectro se referem as demais carbonos não hidrogenados e

carbonos metínicos, em que os últimos podem ser confirmados através do espectro

13C DEPT 135 (Figura 22), que mostrou a existência dos mesmos e carbonos

metílicos.

As correlações mostradas no espectro HSQC (Figura 23) evidenciam os

acoplamentos (J1) entre o dupleto de dupleto em δ 7.75, os dupletos em δ 7,70, 7,00,

6,46 e 6,37 com seus respetivos carbonos metínicos δ 122,4, 111,6, 111,1, 92,4 e

98,0, respectivamente. A análise do espectro COSY (Figura 24) mostra o

acoplamento vicinal (J3) entre os hidrogênios 5’ e 6’.

57

Figura 17: Espectro de RMN 1H de WcCH 19 (300MHz; CDCl3)

Figura 18: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)

58

Figura 19: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH 19 (300MHz; CDCl3)

Figura 20: Espectro de RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)

59

Figura 21: Expansão [1] do espectro RMN 13C de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)

Figura 22: Espectro de RMN 13C [DEPT 135] de WcCH 19 (75MHz; CDCl3)

60

Figura 23: Espectro de RMN HSQC de WcCH 19

Figura 24: Espectro de RMN COSY de WcCH 19

61

A Tabela 18 apresenta os valores de deslocamento químico e correlações do

espectros de RMN COSY, juntamente com os dados da literatura.

Tabela 18: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH 19 comparados com a literatura

POSIÇÃO HSQC δ 1H δ 13C

δ 1H (lit)* δ 13C (lit)*

2 - 156,1 - 156,1

3 - 139,3 - 137,0

4 - 178,9 - 175,7

5 - 162,3 - 160,9

6 6,37 (1H, d, J=2,1) 98,3 6,38 (1H, s) 98,1

7 - 165,7 - 163,0

8 6,46 (1H, d, J=2,1) 92,7 6,79 (1H, s) 93,3

9 - 156,9 - 157,2

10 - 106,3 - 104,0

1’ - 123,2 - 121,9

2’ 7,70 (1H, d, J=1,8) 111,6 7,65 (1H, s) 115,1

3’ - 148,9 - 147,7

4’ - 151,8 - 149,6

5’ 7,00, (1H, d,

J=8,4)

111,2 7,15 (1H, d, J

= 8,5)

115,9

6’ 7.76, (1H, dd,

J=8,6 e 1,8)

122,4 7,72 (1H, dd, J

= 8,5; 1,9)

119,9

OCH3 (3) 3,98 (3H, s) 60,4 3,81 (3H, s) 60,6

OCH3 (7) 3,97 (3H, s) 56,3 3,85 (3H, s) 56,4

OCH3 (3’) 3,89 (3H, s) 56,2 3,85 (3H, s) 56,2

OCH3 (4’) 3,87 (3H, s) 56,0 3,85 (3H, s) 56,5

*Al-Oqail, 2012.[ DMSO, 500MHz e 125MHz]

Fonte: Autor, 2018

A partir das informações obtidas nos espectros de 1H e 13C (1D e 2D), e

comparação com os dados presentes na literatura, é possível concluir que a

substância WcCH 19 trata-se do flavonoide 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona

(retusina), já relatada para outras espécies, no entanto, nunca citados na espécie

estudada. Existem relatos na literatura que derivados de retusina aminoalquiladas

apresentaram atividade antiproliferativa contra as células de câncer HeLa, HCC1954

e SK-OV-3 (LI et al., 2017).

62

5.1.2 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 13

O espectro de RMN de 1H (Figuras 25, 26 e 27) mostrou um conjunto de

absorções semelhantes a WcCH 19 (Ver tópico 5.1.1), sugerindo a existência de um

composto flavonoídico mudando apenas o padrão de substituição do anel aromático.

O mesmo apresentou quinze sinais de hidrogênio dos quais quatro sinais pertencem

a hidrogênios δ 8,04, 7,03, 6,46 e 6,36, sugerindo eixos de simetria na molécula. Os

hidrogênios, localizados em campo baixo, são simétricos, sendo o δ (H2’-H6’) 8,04 [d;

8,4Hz] os mais desprotegidos pelo efeito retirador da carbonila do anel C do

flavonoide, enquanto que δ(H3’-H5’) 7,03 [d; 8,4Hz] são favorecidos pelo efeito doador

de elétrons do oxigênio da metoxila em C-4’. A simetria do anel B juntamente com o

acomplamento orto entre esses hidrogênios permitiram identificar o mesmo como

sendo para-substituindo em H-4’.

Além disso, os hidrogênios H-6 e H-8 em δ 6,46 e δ 6,36, respectivamente,

encontram-se em uma região de maior proteção comparada aos demais devido ao

efeito doador do oxigênio que deixa tais posições mais protegidas. Estes sinais

associados ao acoplamento meta desses hidrogênios foram úteis na identificação da

posição do substituinte no anel A, onde este encontra-se em H-7. O espectro COSY

(Figura 30) mostrou uma correlação (Figura 31) característica de hidrogênios vicinais

(3J) entre H-2’/H-6’ e H-3’/H-5’.

O espectro RMN 13C (Figura 28) apresentou 16 linhas espectrais. O sinal em

δ(C-4) 179,02 sugere a presença do carbono carbonílico com deslocamento inferior

ao característico de cetona, pois o mesmo sofre o efeito da conjugação ficando mais

protegido. Além disso, três sinais em δ 60,36, 56,00 e 56,65 característicos de carbono

metoxílicos, onde o sinal em δ 60,36 (C-3) sofre efeito desprotetor da carbonila. Os

demais sinais pertencentes ao espectro correspondem aos demais carbonos do anel

flavonoídico. O espectro de RMN 2D HSQC (Figura 29) permitiu a visualização das

correlações 1J (C-H), utéis na determinação estrutural do composto.

63

Figura 25: Espectro de RMN 1H de WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)

Figura 26: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)

64

Figura 27: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)

Figura 28: Espectro de RMN 13C para WcCH (14-16) ppt 13 (300MHz; CDCl3)

65

Figura 29: Espectro de RMN HSQC para WcCH (14-16) ppt 13

Figura 30: Espectro de RMN COSY para WcCH (14-16) ppt 13

66

Na Tabela 19 é apresentado os valores de deslocamentos químicos para

WcCH (14-16) ppt 13 juntamente com os dados da literatura.

Tabela 19: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 13 comparados com a literatura.

POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 1H(lit)* δ 13C (lit)*

2 - 156,0 - 156,2 3 - 139,1 - 139,1 4 - 179,0 - 179,0 5 - 161,8 - 161,9 6 6,36, (1H, d,

J=2,1) 98,0 6,35 (1H, d,

J= 2.1) 98,1

7 - 165,6 165,6 8 6,46, (1H, d,

J=2,1) 92,4 6,45 (1H, d,

J= 2.1) 92,4

9 - 157,0 - 157,0 10 - 106,3 - 106,3 1’ - 123,1 - 123,0

2’ e 6’ 8,04, (1H, d, J=8,4)

130,4 8,08 (1H, d, J= 9)

130,4

3’ e 5’ 7,03, (1H, d, J=8,4)

114,3 7,02 (1H, d, J= 9)

114,3

4’ - 162,3 - 162,2 OCH3 (3) 3,91 (3H, s) 60,4 3,90 (3H, s) 60,4 OCH3 (7) 3,88 (3H, s) 56,0 3,87 (3H, s) 56,1 OCH3 (4’) 3,87 (3H, s) 55,7 3,85 (3H, s) 55,7

*Paula & Cruz, 2006. [CDCl3, 300MHz e 75MHz]

Fonte: Autor, 2018

A partir da análise espectral juntamente com os dados contidos na literatura foi

possível identificar a substância WcCH (14-16) ppt 13 como sendo 5-hidroxi-3,7,4’-

trimetoxiflavona, que já foi identificada no gênero nas partes áereas de W. indica

(CRETTON, 2016), porém, é inédita para espécie W. cinerescens da qual foi isolada.

Relatos da literatura apontam que a 5-hidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavona apresenta

atividade anti-hipertensiva (AHMED, 2005).

67

5.1.3 Elucidação estrutural de WdFM-Ac ppt 26

A substância WdFM-Ac ppt 26, assim como os demais flavonoides isolados das

espécies de Waltheria, apresentou-se na forma de sólido amarelo. O espectro de RMN

de 1H (Figuras 31 e 32) mostrou um simpleto em δ 12,5 característico de hidrogênio

de hidroxila (C-5) em ponte com o oxigênio da carbonila (C-4). A análise permitiu

identificar dois sinais em δ 6,1 e 6,3 que aparecem na forma de simpleto e dupleto,

respectivamente, em que o último exibiu um acoplamento meta (J= 2,0 Hz), os quais

foram atribuidos aos hidrogênios 6 e 8 do anel A. Além de dupletos em δ 8,0 (H2’ e

H6’) e 6.8 (H3’e H5’) ambos acoplando orto (J= 8,7 e 7,9 Hz) entre si, sugerindo a

existência de um sistema do tipo AA’BB’ para o anel B do flavonoide.

Sinais entre δ 4,0 e 5,2 indicam a presença de uma unidade de açúcar. Um

dupleto em δ 5,2 (J= 7,25Hz) é característico de hidrogênio ligado a carbono

anomérico o que sugere que a estrutura apresenta um glicosídeo em sua composição.

Além disso, um novo sistema AA’BB’ foi identificado em δ 7,32 (J= 8,3 Hz) e 6,80 (J=

7,9Hz) que se apresentaram na forma de dupletos e se referem aos hidrogênios H2’’’

e H6’’’, e H3’’’ e H5’’’, respectivamente. Os hidrogênios em δ 7,41 e 6,09 que aparecem

na forma de dupletos no espectro 1H, ambos com acoplamento trans (J= 15,9Hz), são

típicos de hidrogênios olefínicos. Tal proposição aliada aos sinais que se apresentam

como dupletos em δ 7,32 e 6,80 sugerem a existência de uma unidade p-cumaroil

ligada ao oxigênio do carbono metilênico (C-6’’) da glicose, pois há ausência de sinais

na região de δ 3,20 a 3,60 que indicam o grupo CH2OH em posição terminal.

Os espectros de RMN 13C e DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (Figuras 33 e

34) permitiram identificar a presença de um grupo carbonílico (C-4), além de carbonos

ligados a átomos de oxigênio em C-3, C-5, C-7, C-4’ e C-4’’’ e sinais com

deslocamentos entre δ 69.9 e 76.1 pertencentes a unidade sacarídica. Além desses

sinais, foi possível confirmar a existência de um carbono metilênico em δ 62,9

referente a C-6’’ da unidade cumaroil.

68

Figura 31: Espectro de RMN 1H para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)

Figura 32: Expansão [1] do espectro de RMN para WdFM-Ac ppt 26 (300MHz; DMSO)

69

Figura 33: Espectro de RMN 13C para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO)

Figura 34: Espectro de RMN DEPT 135 para WdFM-Ac ppt 26 (75MHz; DMSO)

70

Figura 35: Espectro de RMN HSQC para WdFM-Ac ppt 26

Figura 36: Espectro de RMN HMBC para WdFM-Ac ppt 26

71

Na Tabela 20 são expressados os valores de deslocamentos químicos e suas

respectivas correlações em comparação com os dados da literatura.

Tabela 20: Dados de RMN de 1H e 13C para WdFM-Ac ppt 26 comparados com a literatura

POSIÇÃO

HMBC HSQC 3J δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*

1’ H-3’ e 5’ - 121,3 120,7 2’ e 6’ - 8,00, d (8,7) 130,8 130,1 3’ e 5’ - 6,82, d (7,9) 115,4 115,8

4’ H-2’ e 6’ - 161,1 160,0 2 H-2’ e 6’ - 157,9 156,6 3 H-2’ e 6’ - 132,9 132,9 4 - - 177,9 176,7 5 - - 160,8 161,0 6 - 6,09, s 98,9 99,6 7 - - 164,4 164,1 8 - 6,39, d (2,0) 93,6 94,1 9 - - 156,6 155,8

10 - - 103,6 102,5 1’’ - 5,42, d (7,25) 101,0 101,4 2’’ - - 74,2 74,2 3’’ - - 76,1 76,3 4’’ - - 69,9 69,9 5’’ - - 74,1 74,1 6’’ - 4,11, dd (11,5

e 6,5) e 4,24, d (11,8)

62,9 62,9

1’’’ H-3’’’ e 5’’’ - 125,7 124,7 2’’’ e 6’’’ H-7’’ 7,32, d (8.3) 129,8 130,6 3’’’ e 5’’’ - 6,79, d (7.9) 114,6 115,0

4’’’ H-7’’’ - 159,7 159,9 7’’’ H-2’’’ e 6’’’ 7,39, d (15.9) 144,7 144,6 8’’’ - 6,12, d (15.9) 113,3 113,5 9’’’ H-2’’’ e 6’’’ - 166,4 166,2

*SANTOS JÚNIOR, 2010 [DMSO, 500MHz e 125MHz]

Os espectros de correlação heteronuclear HMBC e HSQC (Figuras 35 e 36)

juntamente com os dados presentes na literatura permitiram a identificação de WdFM-

Ac ppt 26 como sendo canferol-3-O-β-(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo)

(C30H26O13), substância inédita para as espécies W.ferruginea e W douradinha. O

tilirosideo apresenta atividades diversas como anti-inflamatória, antioxidante, anti

hiperlipidemia, hiperglicêmica, antigiardial e antinociceptiva, dentre outras (SALA et

al. 2003; ZHANG, et al. 2015; BARBOSA, 2007; ORHAN, 2007). O mesmo também

foi isolado em W. ferruginea e W. indica nas frações WfFE-Ac (32-37) e WiFM-H (45-

54) 21-39 (2), respectivamente.

72

5.1.4 Elucidação estrutural de WfFe-Ac (28-31)

O espectro de RMN 1H do composto WfFe-Ac (28-31) (Figura 37) apresentou

um padrão característico de flavonoides. Além disso, o mesmo mostrou similaridade

com WdFM-Ac ppt 26, diferenciando apenas na ausência da unidade do ácido

cumárico. O espectro evidencia a presença de seis hidrogênios de natureza

aromática entre δ 6 e 8,5, sendo dois dupletos em δ 8,0 (H-2’ e H-6’) e 6,9 (H-3’ e H-

5’) ambos acoplando em orto com J= 8,8 Hz, referentes aos hidrogênios do anel B,

além de dois dupletos em δ 6,2 e 6,4 (J= 1,4), que correspondem a H-8 e H-6, em

meta, respectivamente.

Juntamente com os sinais de natureza aromática, o espectro de RMN 1H

apresenta deslocamentos químicos referentes a uma unidade de açúcar, essa região

compreende a área entre δ 3,15 e 5,2, onde o último refere-se ao deslocamento

correspondente ao hidrogênio anomérico. A existência de um hidrogênio anomérico

juntamente com a constante trans-diaxial (J= 9 Hz) e os dados contidos na literatura,

possibilitaram a identificação do açúcar na forma β-D-glicopiranosídica, com isso, foi

possível caracterizar WfFe-Ac (28-31) como sendo canferol-3-O-β-glicopiranosídeo.

O mesmo é inédito para a espécie W. ferruginea, e apresenta atividade

antiproliferativa moderada e atividade antioxidante relatadas na literatura (YILDIZ,

2017; SIANTURI, 2016).

73

Figura 37: Espectro de RMN 1H para WfFe-Ac (28-31) (MeOD, 500MHz e 125MHz)

5.1.5 Elucidação estrutural de WcCH (14-16) ppt 22

O espectro de RMN 1H (Figura 38) apresentou sinais entre δ 0,5 e 2,5 que são

característicos de esteroides e triterpenos. Podemos destacar simpletos pertencentes

a grupos metila em δ 1,69, 1,07, 1,01, 0,99, 0,97 e 0,92. Contudo, o espectro também

mostrou dois simpletos largos na região de hidrogênios olefínicos, em δ 4,75 e 4,62.

Dados do espectro de RMN 13C (Figura 39) revelaram diversas linhas

espectrais. Sinais entre δ 10 e 50, característicos de esteroides e triterpenos. Além de

sinais em campo mais baixo δ 216,28 (C-3) e outro em δ 178,68 (C-28), relativos a

carbonila da cetona e de ácido carboxílico, respectivamente. A quantidade de sinais

no espectro de carbono elimina a possibilidade de ser um esteroide, isto, juntamente

com dois sinais em δ 109,65 (C-29) e δ 19,2 (C-30), que evidenciam a presença de

uma dupla terminal, juntamente com os valores de hidrogênio sugerem a presença de

um triterpeno de esqueleto lupano.

74

Figura 38: Espectro de RMN 1H para WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d)

Figura 39: Espectro de RMN 13C de WcCH (14-16) ppt 22 (500MHz/ Acetona-d)

75

Os valores de deslocamentos químicos da Tabela 21, referentes ao composto

WcCH (14-16) ppt 22 em comparação com os dados da literatura são expressos

abaixo.

Tabela 21: Dados de RMN de 1H e 13C para WcCH (14-16) ppt 22 comparados com a literatura

POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*

1 - 39,5 39,6 2 - 34,1 34,0 3 - 216,3 218,1 4 - 47,5 47,3 5 - 56,4 54,8 6 - 19,6 19,5 7 - 33,8 33,6 8 - 40,7 40,6 9 - 49,9 49,8

10 - 36,8 36,8 11 - 21,4 21,3 12 - 25,8 25,4 13 - 38,4 38.5 14 - 42,6 42,5 15 - 29,7 29,6 16 - 32,6 32,0 17 - 56,4 56.3 18 - 49,4 49,1 19 3,0, td 47,1 46,8 20 - 150,2 150,2 21 - 30,1 30,5 22 - 36,8 36,8 23 1,12, s 26,5 26,6 24 1,06, s 21,0 20,9 25 0,99, s 15,8 15,8 26 1,00, s 15,8 15,9 27 1,04, s 14,6 14,6 28 - 178,7 181,8 29 4,75, s

4,62, s 109,7 109,7

30 1,70, s 19,2 19,3 * CARPENTER et al.,1980 [25MHz, CDCl3]

A análise espectral juntamente com os dados contidos na literatura permitiram

a identificação da substância WcCH (14-16) ppt 22 como sendo ácido 3-oxolup-

20(29)-en-28-óico (ácido betulônico), já identificado em espécie do gênero

(CRETTON, 2015).

76

5.1.6 Elucidação estrutural de WfCH ppt 14

A substância denominada de WfCH ppt 14 se apresentou como um sólido

amarelo, solúvel em clorofórmio. O espectro de 1H (Figuras 40, 41 e 42), evidenciou

sinais entre δ 6,5 e 8,0 pertencentes a hidrogênios aromáticos, como também sinais

entre δ 2,5 e 5,0 pertencentes a hidrogênios alifáticos que sofrem efeito desprotetor

indutivo. Seis dupletos de dupletos δ 2,90 (8,4 Hz/ 8,3 Hz), δ 3,01 (6,5 Hz/6,5 Hz); δ

4,05 (4,3 Hz/ 11, Hz), δ 4,55 (3,35 Hz/ 11,3 Hz), 3,22 (7,1 Hz/ 7,1 Hz) e 3,3 (6,5 Hz/

6,5 Hz) pertencentes aos hidrogênios diasterotópicos H-3, H-1 e H-3’,

respectivamente. Um quarteto em δ 4,93 (6,7 Hz, H-2’) e um multipleto em δ 4,63 (H-

2), correspondente ao hidrogênio adjacente a heteroátomo Além destes sinais citados,

dois dupletos em δ 6,58 (6,4 Hz) e δ 6,67 (8,3 Hz) indicam a presença de um grupo

amida secundário.

O espectro de RMN 13C (Figuras 43, 44 e 45), apresentou 24 linhas espectrais,

das quais cinco são referentes a carbonos alifáticos: 3 de carbonos metilênicos, um

oxigenado em δ 65,66 (C-1) e dois ligados a núcleos aromáticos em δ 37,50 (3) e δ

37,77 (C-3’); dois metínicos ligados a nitrogênio δ 50,51 (C-2) e δ 54,69 (C-2’); sinais

em δ 137,38 (C-4), δ 135,99 (C-4’), δ 134,44 (C-11) e δ 133,56 (C-11’), juntamente

com outros entre δ 127,03 a δ 135,99 relacionados a carbonos aromáticos; e três

sinais de carbonilas: δ 167,46 (C-10) e δ 167,66 (C-10’) pertencentes a grupos amida

e δ 172,14(C-1’) referente a função éster.

O espectro de RMN COSY (Figuras 46 e 47) exibiu correlação entre os

hidrogênios em NH ligados ao carbono 2 e 2’ do peptideo em δ 6.67 e 6.58 com os

hidrogênios H-2 e H-2’ em δ 4,63 e 4,93, além das correlações entre estes e os

hidrogênios diasterotópicos H-3 (δ 2,90 e 3,01) e H-3’ (δ 3,22 e 3,30),

respectivamente.

O espectro de correlação heteronuclear HSQC (Figura 48) exibiu as

correlações 1J entre os núcleos de carbono e hidrogênio utéis para confirmação

estrutural. O espectro de RMN HMBC (Figuras 49 e 50) mostrou correlação entre os

hidrogênios exibidos na Tabela 22. Essas informações aliadas aos dados presentes

na literatura permitiram identificar a estrutura como o dipeptídeo N-benzoil-L-

fenilalaninato de N-benzoil-2- amino-3-fenilpropila, também conhecido como

auranamida, um alcaloide já identificado em outras espécies vegetais e também em

77

micro-organismos, porém, inédito para o gênero Waltheria. A literatura relata sua

moderada atividade anti-HIV (WU, 2004).

Figura 40: Espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

78

Figura 41: Expansão [1] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

Figura 42: Expansão [2] do espectro de RMN 1H para WfCH ppt 14 (500 MHz/CDCl3)

79

Figura 43: Espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)

Figura 44: Expansão do espectro de RMN 13C para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)

80

Figura 45: Espectro de RMN DEPT 135 para WfCH ppt 14 (125 MHz/CDCl3)

Figura 46: Expansão [1] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14

81

Figura 47: Expansão [2] do espectro de RMN COSY para WfCH ppt 14

Figura 48: Espectro de RMN HSQC para WfCH ppt 14

82

Figura 49: Espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14

Figura 50: Expansão do espectro de RMN HMBC para WfCH ppt 14

83

Tabela 22: Dados de RMN de 1H e 13C para WfCH ppt 14 comparados com a literatura

POSIÇÃO δ 1H δ 13C δ 13C (lit)*

1 4,05, dd (4,3 e 11,3); 4,55, dd (3.35 e11,3)

65,66 65,4

2 4,63, m 50,51 50,2 3 2,90, dd (8,4 e 8,3);

3,01, dd (6,5 e 6,5) 37,50 37,0

4 - 137,38 137,2 5 e 9 7,24, m 129,40 129,0 6 e 8 7,40, t (7,8) 128,65 128,3

7 7,33, m 127,62 127,2 10 - 167,46 168,0 11 - 134,44 134,0

12 e 16 7,67, dd (7,8 e1,3) 127,28 127,0 13 e 15 7,33, m 128,89 128,5

14 7,51, tt (6,8 e 1,15) 132,64 131,9 1’ - 172,14 172,0 2’ 4,93, q (6,7) 54,69 54,5 3’ 3,22, dd (7,1 e 7,1);

3,3, dd (6,5 e 6,5) 37,77 37,2

4’ - 135,99 136,0 5’ e 9’ 7,24, m 129,53 129,2 6’ e 8’ 7,24, m 129,10 128,7

7’ 7,24, m 127,03 126,6 10’ - 167,66 168,1 11’ - 133,56 133,0

12’ e 16’ 7,70, dd (7,7 e 1,3) 127,34 127,1 13’ e 15’ 7,33, m 128,92 128,6

14’ 7,44, tt (6,8 e 1,15) 131,62 131,4 2‘- NH 6,58, d (6,,4) - - 2 - NH 6,67, d (8,3) - -

* CDCl3/MeOD 500 MHz

84

5.2 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS SAPONIFICÁVEIS E INSAPONIFICÁVEIS

DAS ESPÉCIES DE Waltheria

5.2.1 Compostos insaponificáveis

A análise dos compostos insaponificáveis das espécies de Waltheria permitiu a

identificação de 20 constituintes dentre as partes clorofórmio e acetato de etila, onde

p-Hidroxifenilactato e fitol foram identificados em todas as espécies estudadas. Além

da identificação de um flavonoide isolado neste estudo, no entanto, a identificação foi

em W. douradinha (Tabela 23 e Figura 51)

O álcool diterpenico fitol é majoritário para as quatro espécies estudadas e a

literatura relata que o mesmo apresenta uma boa atividade antitumoral,

antinflamatória (HARADA, 2002;SILVA et al. 2014). Além deste, o p-hidroxifenilactato

nunca identificado para família foi encontrado para as quatro espécies, e sua atividade

antimicrobiana relatada (FEDOTCHEVA et al. 2008).

5.2.2 Compostos saponificáveis

O procedimento permitiu a identificação de 10 compostos na fração

saponificável (Tabela 24 e Figura 52) entre as partes clorofórmio e acetato de etila

para W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W. indica.

A partir disso, foi possível identificar o hidroxitolueno butilado, 14-metil

hexadecanoato e 2-benzamido-3-fenilpropanoato como sendo os compostos

majoritários. O hidroxitolueno butilado já foi relatado para família, no entanto foi

identificado pela primeira vez em Waltheria, e apresenta atividade antioxidante

(ELMASTAS et al. 2003). Já 14-metil hexadecanoato foi identificado pela primeira vez

na família e gênero, e não apresenta atividade biológica relatada. Além do

ciclopeptídeo 2-benzamido-3-fenilpropanoato inédito para a família Malvaceae.

85

Tabela 23: Compostos insaponificáveis identificados via CG/MS

Nº Substâncias W. cinerescens W. douradinha W. ferruginea W. indica

RT %área RT %área RT %área RT %área

1 Dibutilamina 7,59 3,9 - - 7,6 4,91 - -

2 (2,3,3-Trimetil-2-oxiranil) metanol 10,2 6,02 - - 10,2 6,06 - -

3 Ácido vanílico - - - - 22,93 41,07 - -

4 (3E, 7E) -10-Isopropenil-3,7-ciclodecadien-1-ona - - 23,76 5,71 - - - -

5 1-Metil-4-metileno-2- (2-metil-1-propenil) -1-

vinilcicloheptano - - 25,33 5,8

-

-

-

-

6 Epoxido de Humuleno II - - 25,83 12,63 - - - -

7 Óxido de cariofileno - - 26,32 14,28 - - - -

8 Ácido 3-(4-hidroxifenil)-2-propenóico 28,16 64,42 28,16 11,56 28,16 39,09 28,17

13,7

9 Zerumbona - - 28,71 17,27 - - - -

10 6,10,14-trimetilpentadecan-2-ona 30,35 3,95 - - 30,35 5,15 - -

11 Geranilfenol 31,08 8,62 - - - - - -

12 12-heptadecinol - - 32,21 2,62 - - - -

13 Triacrilato de trimetilolpropano 34,01 6,16 34,01 3,62 34,01 14,93 - -

14 7-hexadecin-1-ol - - 34,05 6,93 - - - -

15 Fitol 36,11 86,38 35,75 12,72 35,74 61,68 35,74 86,3

16 Geranilgeraniol - - 38,42 5,58 - - - -

86

Continuação da Tabela 23

17 2- (7-Hidroximetil-3,11-dimetil-dodeca-2,6,10-trienil) - [1,4]

benzoquinona 38,53 10,84

- - - - - -

18 Ácido 5-benzamido-4-oxo-6-fenil-hexanóico - - - - 39,69 30,48 - -

19 Adipato de dioctila 40,27 2,73 - - 40,27 2,69 - -

20 3'-Hidroxi-3,4 ', 7-trimetoxiflavona - - 40,95 76,32 - - - -

Fonte: Autor, 2018

87

Figura 51: Estrutura dos compostos insaponificáveis de Waltheria

88

Tabela 24: Compostos saponificáveis identificados via CG/MS

Nº Substâncias W. cinerescens W. douradinha W. ferruginea W. indica

RT %área RT %área RT %área RT %área

1 N-butil-N-nitroso-1-butanamina 16,19 7,04 - - - - - -

2 2-metil-2-propil-hexanoato 16,38 12,4 - - - - - -

3 2,4-dinitrofenol 22,71 36,52 - - - - - -

4 Hidroxitolueno butilado 22,94 100,0 22,94 100,0 22,95 12,39 - -

5 3-nitro-4-hidroxibenzoato de metila 23,13 10,37 - - - - - -

6 Azelato de dimetila 23,38 26,5 - - - - - -

7 Dimetil undecanodioato 28,12 6,53 - - - - - -

8 14-metil hexadecanoato 31,93 8,06 31,94 3,84 31,94 82,23

9 3-hidroxi-hexadecanoato de metila - - - - - - 34,95 11,32

10 2-benzamido-3-fenilpropanoato - - - - 38,65 83,77 - -

Fonte: Autor, 2018

89

Figura 52: Estrutura dos compostos saponificáveis de Waltheria


5.3.1 Avaliação da atividade antioxidante com DPPH

Para cada extrato foram testadas sete concentrações distintas (conforme

item 4.5.1) fornecendo graficamente sete pontos, dentre os quais foram

selecionados apenas seis pontos para traçar a curva, onde os mesmos foram

escolhidos em função do índice de correlação (R2) que mais se aproximasse de

1, Para otimização dos valores de CI50.

Os diferentes extratos das espécies de Waltheria tiveram sua capacidade

de captura do radical livre DPPH testadas. As curvas referentes a esse

procedimento, bem como os valores da concentração inibitória mínima

necessárias para redução de 50% da quantidade dos radicais livres presentes

(CI50) valores dos coeficientes a e b das equações, assim como o desvio padrão,

serão apresentados a seguir.

O efeito antioxidante está diretamente relacionado a classe de metabólitos

presente na matriz complexa e/ou substância pura. Os estudos realizados com

espécies do gênero Waltheria revelam que estas são ricas em flavonoides,

90

terpenos, alcaloides, ciclopeptídeos, flavonas, isoflavonas, flavonoides,

antocianinas, catequinas e isocatequinas dentre outros metabólitos secundários

(TSCHESCHE e KAUSSMAN, 1975; KRISHNA, 2015; MONTEILLIER et al,

2017). O presente estudo possibilitou predominantemente o isolamento de

compostos da classe dos flavonoides, podendo esta atividade ser relacionada a

presença dos mesmos nos extratos estudados.

De acordo com as curvas e dados apresentados na Figura 53, bem como

os valores de CI50 podemos afirmar que os extratos estudados apresentaram

boa atividade antioxidante, apresentando valores de CI50±DP de 0.06963 ±

0.00154ug/mL, 0,2293 ± 0.0076 ug/mL, 0,7761 ± 0,0219 ug/mL e 0,2338±

0,0051ug/mL ug/mL para W. cinerescens, W. douradinha, W. ferrugínea e W.

indica, respectivamente. Todos os extratos apresentaram boa atividade

antioxidante através do metodo estudado, no entanto, o extrato WCTE se

mostrou com um alto poder antioxidante (CI50 = 0.06963 ± 0.00154ug/mL) frente

aos demais pois apresenta menor concentração inibitória.

Figura 53: Graficos de concentração vs AA% para as espécies W. cinerescens (WcCE), W.

douradinha (WdFM), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM)

Y=ax + b

EXP a b CI50 (ug/mL)

1 550.52 12.996 0.0672

2 550.78 11.647 0.0696

3 539.76 12.229 0.0700

CI50 = 0.06963 ± 0.00154ug/mL

R21=0.9983 R22=0.9977 R23=0.9996

y = 539,76x + 12,229R² = 0,9996

0

20

40

60

80

100

0 0 , 0 2 0 , 0 4 0 , 0 6 0 , 0 8 0 , 1 0 , 1 2 0 , 1 4 0 , 1 6

AA

%

CONCENTRAÇÃO (UG/ML)

WCCE

AA% 1 AA% 2 AA% 3 Linear (AA% 3)

91

Y=ax + b


1 173.10 11.802 0.2206

2 153.27 14.346 0.2326

3 154.97 13.622 0.2347

CI50 = 0,2293 ± 0.0076 ug/mL

R21=0.9905 R22=0.9964 R23=0.9989

Y=ax + b


1 47.299 14.541 0.7508

2 45.171 14.458 0.7868

3 44.695 14.662 0.7906

CI50 = 0,7761 ± 0,0219 ug/mL

R21=0.9952 R22=0.9939 R23=0.9965

y = 154,97x + 13,622R² = 0,9989

0

20

40

60

80

100

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

AA

%

Concentração

WfFE

Série1 Série2 Série3 Linear (Série3)

y = 44,695x + 14,662R² = 0,9965

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

AA

%


WdFM


92

Y=ax + b


1 145.04 16.525 0.2308

2 144.40 15.382 0.2397

3 146.73 16.103 0.2310

CI50 = 0,2338± 0,0051ug/mL

R21=0.9990 R22=0.9992 R23=0.9972

Fonte: Autor, 2018

y = 146,73x + 16,103R² = 0,9972

0

20

40

60

80

100

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

AA

%

Concentração

WiFE


93

5.3.2 Avaliação da toxidade frente ao microcrustáceo Artemia salina

A figura abaixo expressa a taxa de mortalidade da Artemia salina após o

período de 24h de contato com os extratos das espécies de Waltheria em função da

concentração. Neste procedimento foram analisadas seis concentrações distintas, no

entanto, um ponto foi removido de cada gráfico de todos os ensaios para obtenção de

um melhor comportamento da curva e índice de correlação, R2.

A partir da equação da reta foram obtidos os valores de dose letal para metade

da população (DL50), como mostra a Figura 54, abaixo.

Figura 54: Gráficos de concentração vs % mortalidade para as espécies W. cinerescens

(WcTE), W. ferrugínea (WfFE) e W. indica (WiFM)

y = 0,0331x + 1,7846R² = 0,9989

DL50= 1456.7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 200 400 600 800 1000 1200

%M

OR

TALI

DA

DE


WcCE

94

Fonte: Autor, 2018

Através do valor de DL50 obtido é possível avaliar o extrato vegetal como sendo

altamente tóxico, moderadamente tóxico, fracamente tóxico e atóxico, quando

apresentam valores menores que 100 µg/mL, entre 100 e 500 µg/mL, entre 500 e

1000 µg/mL e acima de 1000 µg/mL, respectivamente (NGUTA E

COLABORADORES, 2011). A partir dessa hipótese, verificamos que todos os extratos

de Waltheria são atóxicos.

y = 0,0149x + 5,7293R² = 0,9938

DL50= 2971,2

0

5

10

15

20

25

0 200 400 600 800 1000 1200

%M

OR

TALI

DA

DE


WfFE

y = 0,0149x + 5,7293R² = 0,9938

DL50= 2971,2

0

5

10

15

20

25

0 200 400 600 800 1000 1200

WiFM

95

6. CONCLUSÕES

A investigação química e biológica das diferentes espécies de Waltheria

mostrou resultados satisfatórios frente ao objetivo principal do estudo, no qual foi

possível comprovar a predominância de flavonoides frente aos alcaloides como

mostrou os estudos realizados no sul do país. A partir do fracionamento do caule de

W. cinerescens foi possível obter 5-hidroxi-3,3’,4’,7-tetrametoxiflavona, 5-hidroxi-

3,7,4’-trimetoxiflavona e ácido 3-oxolup-20(29)-en-28-óico (ácido betulônico) que

apresentam atividade antiproliferativa contra células de câncer e anti-hipertensiva

relatadas na literatura. Além disso, o estudo permitiu o isolamento de canferol-3-O-β-

(6''-cumaroil)-glicopiranosídeo (tilirosídeo) em três das quatro espécies estudadas, já

isolada de W. indica, no entanto, inédita para W. ferrugínea e W. douradinha. A

literatura relata que a substância apresenta diversas atividades biológicas como anti-

inflamatória, antioxidante, anti hiperlipidemia, hiperglicêmica, antigiardial e

antinociceptiva, como já mencionado. O fracionamento das folhas de W. ferrugínea

ainda permitiu o isolamento de canferol-3-O-β-glicopiranosídeo, que apresenta

atividade antiproliferativa moderada e atividade antioxidante e atividade

antibacteriana, respectivamente, como citado anteriormente. A partir do caule de W.

ferrugínea foi possível isolar o dipeptídeo auranamida, que já foi identificado em outras

espécies vegetais e também em micro-organismos, porém, inédito para o gênero

Waltheria.

A reação de saponificação/esterificação dos extratos permitiu a identificação de

31 compostos via CG/MS, sendo 21 insaponificáveis e 10 saponificáveis, com

destaque para o fitol e p-hidroxifenilactato, ambos majoritários na fração

insaponificável para as quatro espécies estudadas, onde o primeiro apresenta boa

atividade antitumoral e antinflamatória relatadas (HARADA, 2002; SILVA et al. 2014).

Além do hidroxitolueno butilado que foi identificado pela primeira vez em Waltheria, e

apresenta atividade antioxidante, e 4-metil hexadecanoato e 2-benzamido-3-

fenilpropanoato, sendo ambos inéditos para a família.

Os extratos estudados apresentaram atividade antioxidante significativa, com

destaque para o extrato das folhas de W. cinerescens, que apresentou CI50 = 0.06963

± 0.00154ug/mL, sendo, portanto, o que apresentou melhor resultado. O estudo

preliminar de toxidade frente ao microcrustáceo A. salina permitiu avaliar os extratos

96

testados como atóxicos, isso corrobora para continuidade do uso da douradinha do

campo (W. douradinha) na medicina popular como vem sendo comumente utilizada.

97

REFERÊNCIAS

AGÊNCIA EMBRAPA DE INFORMAÇÃO TECNOLÓGICA. Espécies arbóreas

brasileiras. Disponível em:

<http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/especies_arboreas_brasileiras/arvore/

CONT000fu1ekyj602wyiv807nyi6s9rqihfq.html >. Acesso em: 29 de agosto de 2017.

AHMED, Z., KAZMI, S. N. and MALIK, A., New pentacyclic triterpene from Abutilon

pakistanicum. Journal of Natural Products , 53, 5, 1342-1344, 1990.

AHMED, B.; AL-HOWIRINY, T. A.; MOSSA, J. S.; EL TAHIR, K. E. H.; Isolation,

Antihypertensive Activity and Structure—Activity Relationship of Flavonoids from

Three Medicinal Plants. Indian J. Chem., Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem. 44 ,2,

400-404, 2005.

ALI, B. H., MOUSA, H. M. and EI-MOUGY, S. The effect of a water extract and

anthocyanins of Hibiscus sabdariffa L. on paracetamol-induced hepatoxicity in rats.

Phytother Res 17: 56–59, 2003.

AL-OQAIL, M., HASSAN, W. H. B., AHMAD, M. S. and AL-REHAILY, A. J.,

Phytochemical and biological studies of Solanum schimperianum Hochst. Saudi

Pharmaceutical Journal, 20: 371-379, 2012.

Barbosa, E., Calzada, F., Campos, R., 2007. J. Ethnopharmacol. 109 (3), 552–554.

BERGER, M. M.,Can oxidative damage be treated nutritionally?. Clin Nutr.;24(2):172-

83, 2005.

BONOMINI, F; RODELLA, L. F.; REZZANI, R., Metabolic syndrome, aging and

involvement of oxidative stress. Aging Dis.;6(2):109-20, 2015.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15784476

98

BORGUINI, R. G. Avaliação do potencial antioxidante e algumas características do

tomate (Lycopersiconesculentum) orgânico em comparação ao convencional. 2006.

178 f. Tese (Doutorado em Saúde Pública)-Faculdade de Saúde Pública,

Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.

BRANDAO, F. M.; MACEDO, G. A. R.; LACA-BUENDIA, J. P.; Plantas daninhas

com possibilidades de forrageiras para bovinos em condições de cerrado. Planta

daninha., v. 7, nº1, 41-48, 1984.

CARPENTER, R.C.; SOTHEESWARAN, S.; SULTANBAWA, U.S. 13C NMR studies

of some lupane and taraxerane triterpenes. Organic Magnetic Resonance. 14, 6, 462-

465, 1980.

CHEN, T.Y., HUANG, S. K. H., LEE, C. J., TSAI, P. W. and WANG, C. C.

Antinociceptive and anti-inflammatory effects of zerumbone against mono-

iodoacetate-induced arthritis. Int J Mol Sci. 17:249–256, 2016.

CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas.

Ministério da Agricultura, Rio de Janeiro, v. 2, p. 541, 1931

COSTA, D. A ; CAVALCANTI, A. C. ; SILVA, D. A. E. ; CAVALCANTE, J. M.

S.;MEDEIROS, M. A. A; LIMA, J. T. ; SILVA, B. A. ; AGRA, M. F; SOUZA, M. F. V.

Chemical constituents from Bakeridesia pickelii (H. Monteiro) (Malvaceae) and the

relaxant activity of kaempferol-3-O-β-D-(6´´-E-p-coumaroyl) glucopyranoside on

guinea-pig ileum. Química nova, 30, 4, 901-903, maio 2007.

CRETTON, S.; BREANT L.; POURREZ L.; AMBUEHL C.; MARCOURT L.; EBRAHIMI

S.N.; HAMBURGER M.; PEROZZO R.; KARIMOU S.; KAISER M.; CUENDET M.;

CHRISTEN P.; Antitrypanosomal quinoline alkaloids from the roots of Waltheria indica,

Journal of Natural Products, 77, 10, 2304-2311, Outubro 2014.

99

CRETTON S, BRÉANT L, POURREZ L, AMBUEHL C, PEROZZO R, MARCOURT L,

KAISER M, CUENDET M, CHRISTEN P. Chemical constituents from Waltheria indica

exert in vitro activity against Trypanosoma brucei and T. cruzi. Fitoterapia, 105, 55-60,

Junho 2015.

CRETTON, S., DORSAZ, S., AZZOLLINI, A., FAVRE-GODAL, Q., MARCOURT, L.,

EBRAHIMI, S. N., VOINESCO, F., MICHELLOD, M., SANGLARD, D., GINDRO, K.,

WOLFENDER, J., CUENDET, M, and CHRISTEN, P. Antifungal Quinoline Alkaloids

from Waltheria indica, Journal of Natural Products, 79, 2, 300-307, Fevereiro 2016.

FERREIRA, N. C. F.; Estudo fitoquimico de Waltheria ferrugínea, 2014, 96.

Dissertação de mestrado- UFRN/Instituto de química, Natal-RN, 2014.

FERREYRA, M.L. F.; RIUS, S. P. AND CASATI, P.; Flavonoids: biosynthesis,

biological functions, and biotechnological applications, Plant Science. 3, 222, Agosto

de 2012. doi: 10.3389/fpls.2012.00222

FOGLIO, M.A.; QUEIROGA, C. L.; SOUSA, I. M.O.; RODRIGUES, R. A. F. Plantas

Medicinais como Fonte de Recursos Terapêuticos: Um Modelo Multidisciplinar.

MultiCiência: Construindo a História dos Produtos Naturais. 7, 2006.

FUMAGALI, E., GONÇALVES, R. A. C., MACHADO, M. F. P. S., VIDOTI, J. and

OLIVEIRA, A. J. B. Produção de metabólitos secundários em cultura de células e

tecidos de plantas: o exemplo dos gêneros Tabernaemontana e Aspidosperma

Revista Brasileira de Farmacognosia, 18, 4, Dezembro de 2008.

GIULIETTI, A. M.; HARLEY, R. M.; QUEIROZ , L. P.; WANDERLEY, M. G. L.; BERG,

C. V. D.; Biodiversidade e conservação das plantas no Brasil. Megadiversidade,

Volume 1, nº 1, 2005.

GRESSLER, V.; STUKER, C. Z.; DIAS, G. O. C, et al, Quinolone alkaloids from

Waltheria douradinha, Phytochemistry, 69, 4, 994-999 Fevereiro 2008.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Falcone%20Ferreyra%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23060891

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Casati%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23060891

100

HARBORNE, J.B. Classes and functions of secondary products, Chemicals from

plants, perspectives on secondary plant products. 1-25, 1999.

HASSAN, B. A.R. Medicinal Plants (Importance and Uses), Pharmaceutica Analytica

Acta, 3, 10, Dezembro 2012.

HAMED, M. M., REFAHY, L.A., ABDEL-AZIZ, M. S., Assessing the bioactivity and

antioxidative properties of some compounds isolated from abutilon hirtum (lam)., Asian

jornal of pharmaceutical and clinical research, 10, 3, 333-340, Março 2017.

KLEIN, T.; LONGHINi, R.; BRUSCHI, M. L.; MELLO, J. C. P.; Fitoterápicos: um

mercado promissor. Revista Ciência Farmacológica Básica Aplicada. 2009, 30(3):241-

248.

KOBAISY, M., TELLEZ, M. R., WEBBER, C. L., DAYAN, F. E., SCHRADER, K. K. and

WEDGE, D. E. Phytotoxic and fungitoxic activities of the essential oil of kenaf (Hibiscus

cannabi-nus L.) leaves and its composition. J. Agric Food Chem 49: 3768–3771, 2001.

KRISHNA, S. G.; SUDARSANAM, G., Cytotoxicity of chloroform extract of Waltheria

indica l. leaf. International Journal of Ayurveda and Pharma Research, 3, 11, 2015.

LI, X.; ZHANG, Y.; WANG, C. and WANG, Q. Synthesis and antiproliferative activities

of aminoalkylated polymethoxyflavonoid derivatives. Natural Product Research (2017).

LORENZI, H; MATOS, F.J. A. Plantas Medicinais no Brasil – Nativas e Exóticas.,

Instituto Plantarum de Estudos da Flora LTDA, p. 469-470, 2002.

101

MAHESWARA,M., RAO,K.Y., RA,V.M. and RAO,C.V., .Antibacterial activity of

acylated flavonol glycoside from Waltheria indica. Asian Journal of Chemistry.18,

2761–2765, 2006.

MARTINS, E. R.; CASTRO, D. M.; CASTELLANI, D. C.; DIAS, J. E.; Plantas

medicinais. Viçosa/MG, Ed. UFV, 5, 15-19, 2003.

MATTIETTO, R. A.; LOPES, A. S.; MENEZES, H. C., Caracterização física e físico-

química dos frutos da cajazeira (Spondias mombin L.) e de suas polpas obtidas por

dois tipos de extractor. Revista Brasileira de Fruticultura, 32, 4, 1089-1097, Dezembro

2010.

McLAUGHLIN, J. L.; CHANG, C-J. and SMITH, D. L; In Human Medicinal Agents from

Plants, Kinghorn, A. D. & Balandrin, M. F., eds., Symposium Series No . 534, American

Chemical Society, Washington, D.C. 1993, p. 112-137.

McLAUGHLIN, J. L. and ROGERS, L. L., 1988. The use of biological assays to

evaluate botanicals. Drug Information Journal, vol. 32, p. 513-524.

MONTEILLIER, A.; CRETTON, S.; CICLET, O.; MARCOURT, L.; EBRAHIMI, S. N.;

CHRISTEN, P.; CUENDET, M., Cancer chemopreventive activity of compounds

isolated from Waltheria indica, Journal of Ethnopharmacology, 203, 214-225, Março

2017.

MOREIRA, F.; Plantas que curam: Cuide da sua saúde através da natureza. São

Paulo, Ed. Hemus LTDA, 5, 183, 1996.

MUNDO, J.; VILLEDA-HERNANDEZ, J.; HERRERA-RUIZ, M.; GUTIERREZ, M. C.;

ARELLANO-GARCIA, J.; LEON-RIVERA, I.; PEREA-ARANGO, I.,

Neuropharmacological and neuroprotective activities of some metabolites produced by

102

cell suspension culture of Waltheria americana Linn. Biomedicine & Pharmacotherapy,

94, 129-139 Julho 2017.

MOSTARDEIRO, C. P., MOSTARDEIRO, M. A., MOREL, A. F., OLIVEIRA, R. M.,

MACHADO, A. K., LEDUR, P., CODONÁ, F.C., DA SILVA, U. F. e MÂNICA DA CRUZ,

I. B.; The Pavonia xanthogloea (Ekman, Malvaceae): Phenolic compounds

quantification, anti-oxidant and cytotoxic effect on human lymphocytes cells.

Pharmacognosy Magazine, 10, 39, 630-638, 2014.

NEGRI, G., SANTI, D. e TABACH, R., Flavonol glycosides found in hydroethanolic

extracts from Tilia cordata, a species utilized as ansiolytics. Rev. Bras. Pl. Med.,

Campinas, 15, 2, 217-224, 2013.

ORHAN, N., ASLAN, M., HOSBAS, S., DELIORMAN, O.D., 2009. Phcog. Mag. 5, 309–

315.

PAÏS, M., MAINIL,J. and GOUTAREL,R., The adouetins X, Y and Z, alkaloids of

Waltheria americanan L. (Sterculia). Annales Pharmaceutiques Françaises. 21,139–

146, Fevereiro de 1963.

PAÏS, M., MARCHAND, J., JARREAU, F.X. and GOUTAREL, R. Reptide alkaloids. V.

Structures of adouetines X,Y,Y1, and Z, the alkaloids of Waltheria americana L.

(Sterculiaceae). Bull Soc Chim Fr., 1145–1148, Março de 1968.

PANCHE, N., DIWAN, A. D., AND CHANDRA, S. R. Flavonoids: an overview. Journal

of Nutritional Science. 5, 47, Dezembro 2016.

PATTERSON, J. M.; BURKA, L. T. .The stereochemistry of the thermally induced

isomerization of N-substituted pyrroles. Journal of the American Chemical Society,

88(15), 3671-3672, 1966.

PETRUS, A.J.A.,Polyphenolic Components of. Waltheria indica. Fitoterapia.61, 371.

1990.

https://scifinder-cas.ez18.periodicos.capes.gov.br/scifinder/references/answers/53955BFBX86F35093X4E5265354A3753A5FC:53A06E26X86F35093X7A087C751BD396B5E2/1.html?nav=eNpb85aBtYSBMbGEQcXU2NHAzNXILMLCzM3Y1MDSOMLc0cDC3Nnc1NDJxdjSzMnU1QioNKm4iEEwK7EsUS8nMS9dzzOvJDU9tUjo0YIl3xvbLZgYGD0ZWMsSc0pTK4oYBBDq_Epzk1KL2tZMleWe8qCbiYGhooCBgYEbaGBGCYO0Y2iIh39QvKdfmKtfCJDh5x_vHuQfGuDp517CwJmZW5BfVAI0obiQoY6BGaiPASianVsQlFqIIgoAL9o7RA&key=caplus_1966:490140&title=VGhlIHN0ZXJlb2NoZW1pc3RyeSBvZiB0aGUgdGhlcm1hbGx5IGluZHVjZWQgaXNvbWVyaXphdGlvbiBvZiBOLXN1YnN0aXR1dGVkIHB5cnJvbGVz&launchSrc=reflist&pageNum=1&sortKey=ACCESSION_NUMBER&sortOrder=DESCENDING

https://scifinder-cas.ez18.periodicos.capes.gov.br/scifinder/references/answers/53955BFBX86F35093X4E5265354A3753A5FC:53A06E26X86F35093X7A087C751BD396B5E2/1.html?nav=eNpb85aBtYSBMbGEQcXU2NHAzNXILMLCzM3Y1MDSOMLc0cDC3Nnc1NDJxdjSzMnU1QioNKm4iEEwK7EsUS8nMS9dzzOvJDU9tUjo0YIl3xvbLZgYGD0ZWMsSc0pTK4oYBBDq_Epzk1KL2tZMleWe8qCbiYGhooCBgYEbaGBGCYO0Y2iIh39QvKdfmKtfCJDh5x_vHuQfGuDp517CwJmZW5BfVAI0obiQoY6BGaiPASianVsQlFqIIgoAL9o7RA&key=caplus_1966:490140&title=VGhlIHN0ZXJlb2NoZW1pc3RyeSBvZiB0aGUgdGhlcm1hbGx5IGluZHVjZWQgaXNvbWVyaXphdGlvbiBvZiBOLXN1YnN0aXR1dGVkIHB5cnJvbGVz&launchSrc=reflist&pageNum=1&sortKey=ACCESSION_NUMBER&sortOrder=DESCENDING

103

PAULA, V. F. and CRUZ, M. P., Chemical constituents of Bombacopsis glabra

(Bombacaceae). Quimíca Nova, 29, 213–215, 2006.

QADER , S. W. and AWAD ,H. M. Evaluation of Antioxidant, Antimicrobial and

Cytotoxicity of Alcea kurdica Alef, 7, 3. 205-209, Setembro de 2014.

RAGASA, C.Y., CRUZ,C.A., CHIONG,I.D., TADA,M. and RIDEOUT,J.A. Antifungal

flavonoidsfrom WaltheriaAmericana. PhilippineJournalofScience126, 243–250, 1997.

RAJABI, S., RAMAZANI, A., HAMIDI, M., E NAJI, T., Artemia salina as a model

organismo in toxicity assessment of nanoparticles. Journal of Pharmaceutical

Sciences (2015).

RAMAKRISHNA, A., RAVISHANKAR, G. A., Influence of abiotic stress signals on

secondary metabolites in plants. Plant Signal Behav. 1; 6(11): 1720–1731, Novembro

de 2011.

RAO, Y.K., FANG, S-H. and TZENG, Y-M., Inhibitory effects of the flavonoids isolated

from Waltheria indica on the production of NO, TNFα and IL-12 in activated

macrophages. Biological & Pharmaceutical Bulletin28, 912–915, 2005.

SAHOO, N,; MANCHIKANT, P.; DEY, S.. Herbal drugs: Standards and regulation.

Fitoterapia, 81, 6, 462-471, Setembro 2010.

SALA, A., RECIO, M.C., SCHINELLA, G.R., MANEZ, S., GINER, R.M., CERDA-

NICOLAS, M. AND RIOS, J.L., Assessment of the anti-inflammatory activity and free

radical scavenger activity of tiliroside. Eur. J. Pharmacol., 461: 53-61, 2003.

104

SANTOS JÚNIOR, H. M.; TIRELLI, A.A.; CARVALHO, H. W. P.; OLIVEIRA, D. F.;

PRADO, N. R. T; CAMPOS,V. P. Purificação do flavonóide trans-tilirosídeo do extrato

metanólico das folhas de Gochnatia barrosii Cabrera (asteraceae) e avaliação da sua

atividade nematicida. Ciência e Agrotecnologia, 34, 5, 1224-1231, 2010.

SAUNDERS, J. G., Sterculiaceae pf Paraguay. II. Waltheria. Bonplandia 16(1-2), 143-

180, 2007.

SHARMA, P. V.; AHMAD, Z. A.; Two sesquiterpene lactones from Abutilon indicum.

Phytochemistry, 28, 3525, 1989

SINGH R.. Medicinal Plants: A Review. Journal of Plant Sciences. Medicinal Plants. 3,

1-150-55, Janeiro 2015.

SOUSA, C. M. M., SILVA, H. R., VIEIRA-JUNIOR, G. M., AYRES, M. C. C., COSTA,

C. L. S., ARAUJO, D. S., CAVALCANTE, L. C. D., BARROS, E. D. S., ARAUJO, P. B.

M., BRANDAO, M. S., CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco

plantas medicinais, Química nova, 30, 351-355, Abril 2007.

SOUZA, V. C.; LORENZI H., Botânica Sistemática: Guia ilustrado das famílias de

Fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado no APG III, 2012.

TEIXEIRA, J.; GASPAR, A; GARRIDO, E.; GARRIDO, J. E BORGES, F.,

Hydroxycinnamic Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview. BioMed Research

International, 2013.

TELES, Y.C.F.; HORTA, C.C.R.; AGRA, M.F.;SIHERI, W.; BOYD, M. IGOLI, J.O.;

GRAY, A.I.; SOUZA, M.F.V., Molecules, 2015, 20, 20161-20172.

105

TOMAZZONI, M. I.; NEGRELLE, R. R. B.; CENTA, M. L.Fitoterapia popular : A busca

Instrumental Enquanto prática Terapêutica. Texto Completo Enfermagem, 1, 1, 115-

121, 2006.

TSCHESCHE, R.; KAUSSMAN, E.U. The Alkaloids. Academic Press, 15, p. 165-205,

1975.

VASUDEVA, N. & SHARMA,S. K. Biologically Active Compounds from the Genus

Hibiscus. Pharmaceutical Biology, 46:3, 145-153, 2008. DOI:

10.1080/13880200701575320

VEERAMANI, P.; ALAGUMANIVASAGAM, G., In-vitro antioxidant activities of

ethanolic extract of whole plant of Waltheria indica (Linn.), Der Pharmacia Lettre 8, 2,

299-302 2016.

WANG, C., JIA, H., ZHU, L., ZHANG, H., WANG, Y., Toxicity of α-Fe2O3 nanoparticles

to Artemia salina cysts and three stages of larvae. Sci Total Environ. 2017 Nov

15;598:847-855.

WANG, H., YANG, Y., LIN, L., ZHOU, W., LIU, M., CHENG, K. e WANG, W.

Engineering Saccharomyces cerevisiae with the deletion of endogenous glucosidases

for the production of flavonoid glucosides. Microb Cell Fact. 4;15(1):134, Agosto de

2016.

WU, P. L., LIN, F. W., WU, T. S., KUOH, C. S., LEE, K. H., & LEE, S. J.; Cytotoxic and

anti-HIV principles from the rhizomes of Begonia nantoensis. Chemical and

Pharmaceutical Bulletin, 52(3), 345-349, 2004.

WU, Q., LI, P. C., ZHANG, H. J., FENG, C. Y., LI, S. S., YIN, D. D., TIAN, J., XU, W.

Z. E WANG, L.S., Relationship between the flavonoid composition and flower colour

variation in Victoria. Plant Biology 20 (2018) 674–681.

106

XINA, Z., MAA, S., RENA, D., LIUA,, W., HANA, B., ZHANGD, Y., XIAOC, J., YIA, L.,

DENGB, B., UPLC–Orbitrap–MS/MS combined with chemometrics establishes

variations in chemical components in green tea from Yunnan and Hunan origins. Food

Chemistry, 266, 15, 534-544, 2018.

YAN, W., HAN, Q., GUO, P., WANG, C e ZHANG, Z. Simultaneous detection of

flavonoids, phenolic acids and alkaloids in abri herba and abri mollis herba using liquid

chromatography tandem mass spectrometry. Phytochem. Anal. 2016, 27, 50–56

ZAKIZADEH, M. , NABAVI, S. F. , NABAVI, S. M. and EBRAHIMZADEH, M. A. In

vitro antioxidant activity of flower, seed and leaves of Alcea hyrcana Grossh. European

Review for Medical and Pharmacological Sciences. 15(4):406-412, Abril de 2011.

ZHANG, T. T., WANG, M., YANG, L., JIANG, J. G., ZHAO, J. W., & ZHU, W.; Flavonoid

glycosides from Rubus chingii Hu fruits display anti-inflammatory activity through

suppressing MAPKs activation in macrophages. Journal of Functional Foods, 18, 235-

243, 2015.

ZONGO, F., RIBUOT, C., BOUMENDJEL, A., GUISSOU, I., Botany, traditional uses,

phytochemistry and pharmacology of Waltheria indica L. (syn. Waltheria americana):

A review, Journal of Ethnopharmacology 148, 1, 14-26, Abril 2013.

WANG, H., YANG, Y., LIN, L., ZHOU, W., LIU, M., CHENG, K. and WANG, W.

Engineering Saccharomyces cerevisiae with the deletion of endogenous glucosidases

for the production of flavonoid glucosides. Microb Cell Fact. 4;15(1):134, Agosto de

2016.

WU, P., LIN, F., WU, T., KUOH, C., LEE, K. e LEE, S. , Cytotoxic and Anti-HIV

Principles from the Rhizomes of Begonia nantoensis. Chem. Pharm. Bull. 52(3) 345—

349, 2004.

http://europepmc.org/search?query=AUTH:%22Zakizadeh+M%22&page=1

http://europepmc.org/search?query=AUTH:%22Nabavi+SF%22&page=1

http://europepmc.org/search?query=AUTH:%22Nabavi+SM%22&page=1

http://europepmc.org/search?query=AUTH:%22Ebrahimzadeh+MA%22&page=1

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lin%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhou%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Liu%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cheng%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27491546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27491546

universidade federal do rio grande do norte centro … · tabela 11-frações reunidas e massas...

Documents