UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

ALINE LIMA DIERSCHNABEL

O TRATAMENTO COM A FLUOXETINA (MAS NÃO COM OUTROS FÁRMACOS

ANTIDEPRESSIVO E ANSIOLÍTICOS) REVERTE O DÉFICIT DE MEMÓRIA

AVERSIVA CAUSADO POR ESTRESSE AGUDO DE CONTENÇÃO EM

CAMUNDONGOS

NATAL-RN

2014

ALINE LIMA DIERSCHNABEL

O TRATAMENTO COM A FLUOXETINA (MAS NÃO COM OUTROS FÁRMACOS

ANTIDEPRESSIVO E ANSIOLÍTICOS) REVERTE O DÉFICIT DE MEMÓRIA

AVERSIVA CAUSADO POR ESTRESSE AGUDO DE CONTENÇÃO EM

CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia (Área Fisiológica).

Orientadora: Profª Drª Alessandra Mussi Ribeiro

Co-orientadora: Profª Drª Regina Helena da Silva

NATAL-RN

2014

“É preciso força pra sonhar e perceber que

a estrada vai além do que se vê!”

(Los Hermanos)

Dedicatória:

A voinho, voinha, mainha e painho, por nunca

terem desistido de mim.

Agradecimentos:

Esse é o momento que a gente olha pra trás e pensa: deu tudo certo,

valeu a pena. Parece que foi ontem que estava de mãos dadas com minha mãe

esperando sair a lista dos aprovados do vestibular, e agora, olha só, lá se vai uma

bióloga se tornar mestre. Sem dúvida a caminhada foi dura, foi sofrida, mas ao

mesmo tempo tão alegre, tão feliz e satisfatória. Ao final desse pequeno degrau que

subo, tenho certeza que sorri mais que chorei. Tenho certeza que minhas mãos

nunca ficaram sozinhas, pois nos diversos momentos que atravessei, sempre fui

acompanhada de pessoas a quem dedico essa conquista.

A toda espiritualidade amiga, que sempre me deu a mão nos momentos

mais difíceis, sempre me colocou no eixo e sempre me fez ter a certeza que religião

e ciência não precisam se contradizer e que podem sim se somar;

Aos meus avós, Ismael e Esmeralda, que não apenas me deram as

mãos, mas sim, me colocaram no colo desde que nasci. Por todo o esforço,

sacrifício, carinho e amor. Por lapidarem meu caráter e serem exemplos de seres

humanos;

Aos meus pais, Andréa e Sidnei, que sempre me puxam pela mão quando

eu esboço fraquejar. Por serem as pessoas que mais acreditam em mim e na minha

capacidade, muitas vezes mais que eu mesma;

Aos meus irmãos, Ítalo e Bruna, por me ensinarem que também

precisamos oferecer nossas mãos;

À minha querida orientadora, Alessandra Mussi Ribeiro, minha eterna

mãe na ciência, por ter segurado minha mão e me guiado nos primeiros passos na

ciência, me mostrando sempre o melhor caminho a seguir nesse encantador mundo.

Por junto com minha co-orientadora e tia na ciência, Regina Helena da Silva, terem

aberto as portas do LEME e terem me mostrado a verdadeira conduta e caráter que

um cientista precisa ter;

Aos meus amigos Ezequiel, Valciclênio e Victor, pelas tarde de mãos

dadas que passamos compartilhando nossos sonhos e medos. Por todas as risadas,

conselhos, puxões de orelhas e muito amor. Obrigada por tornarem meus dias mais

leves;

À família LEME, os que ainda estão aqui e os que já passaram, pela mão

amiga dentro e fora do laboratório. Fazer ciência com vocês sempre será um dos

grandes prazeres da minha vida;

Aos camundongos, por terem morrido em minhas mãos em nome da

ciência;

Aos que largaram minhas mãos pelo caminho. Obrigada por terem me

ensinado a perder e a levantar depois de cada perda;

Ao PPG em Psicobiologia e a CAPES pelo apoio financeiro.

Termino aqui a primeira parte da minha caminhada na pós-graduação

com a certeza de que cresci e venci. Que venha o doutorado!

Resumo

O fisiologista H. Selye definiu estresse como a resposta não específica do

organismo a quaisquer fatores que coloquem em risco a homeostase (equilíbrio do

meio interno) do indivíduo. Esses fatores, os agentes estressores, são capazes de

ativar o eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA), resultando assim na resposta

fisiológica ao estresse pela liberação de glicocorticoides que leva à modificações

psicofisiológicas, entre elas, efeitos sobre as funções cognitivas, como na

aprendizagem e na memória. Quando esse eixo é agudamente estimulado, ocorre

um repertório de mudanças comportamentais e fisiológicas que podem ser

adaptativas ao indivíduo. Por outro lado, quando o eixo HPA é cronicamente

estimulado, as modificações podem favorecer o desenvolvimento de patologias,

como os transtornos de ansiedade. Alguns fármacos utilizados na clínica para o

tratamento de transtornos de ansiedade podem exercer efeitos sobre funções

cognitivas, sobre o eixo HPA e sobre a ansiedade. Neste contexto, o objetivo de

nosso estudo foi verificar os efeitos da administração i.p. aguda de quatro fármacos,

o diazepam (DZP, 2 mg/Kg), a buspirona (BUS, 3 mg/Kg), a mirtazapina (MIR, 10

mg/Kg) e a fluoxetina (FLU, 10 mg/Kg) em camundongos machos submetidos ao

estresse agudo por contenção, utilizando a tarefa de esquiva discriminativa em

labirinto em cruz elevado, que avalia simultaneamente parâmetros de aprendizagem,

memória e ansiedade. Nossos resultados demonstraram que (1) a administração do

DZP e da BUS, mas não da FLU, promoveu efeitos ansiolíticos nos animais; (2) a

MIR causou efeito sedativo aos animais; (3) durante a sessão de treino, os animais

tratados com BUS, MIR e FLU aprenderam a tarefa, por outro lado o grupo DZP

demonstrou prejuízo na aprendizagem; (4) na sessão teste, animais tratados com

DZP, BUS, e MIR mostraram déficit na discriminação entre os braços fechados,

aversivo versus não aversivo, demonstrando um prejuízo na memória, entretanto,

animais que receberam FLU não mostraram interferência na evocação dessa

memória; (5) o estresse agudo não interfere na atividade locomotora, na ansiedade,

nem na aprendizagem da tarefa, mas induz prejuízo na evocação da memória,

sendo este prejuízo revertido apenas para o grupo tratado como FLU. Esses

resultados sugerem que a administração aguda de fármacos com atividade

ansiolítica e antidepressiva não interferem no processo de aprendizagem desta

tarefa aversiva, mas prejudicam sua evocação, assim como o estresse agudo de

contenção. Contudo, o antidepressivo fluoxetina foi capaz de reverter o déficit de

memória promovido pelo estresse agudo, o que pode sugerir que a modulação,

mesmo que agudamente da neurotransmissão serotoninérgica, por inibidores

seletivos da recaptação desse neurotransmissor, interfere no processo de evocação

de uma memória aversiva.

Palavras-chave: Memória Aversiva, Aprendizagem, Ansiolítico, Antidepressivo,

Estresse Agudo de Contenção, Camundongo.

Abstract

The physiologist H. Selye defined stress as the nonspecific response of the body to

any factors that endanger homeostasis (balance of internal environment) of the

individual. These factors, agents’ stressors, are able to activate the Hypothalamic-

Pituitary-Adrenal (HPA) axis, thus resulting in the physiological responses to stress

by the release of glucocorticoids that leads to psychophysiological changes, including

effects on cognitive functions such as learning and memory. When this axis is acutely

stimulated occurs a repertoire of behavioral and physiological changes can be

adaptive to the individual. Notwithstanding, when the HPA axis is chronically

stimulated, changes may favor the development of, such as anxiety disorders. Some

drugs used in the clinic for the treatment of anxiety disorders these can exert effects

on cognitive function, on the HPA axis and on the anxiety. In this context, the aim of

our study was to investigate the effects of administration i.p. acute of diazepam

(DZP, 2 mg/kg), buspirone (BUS, 3 mg/kg), mirtazapine (MIR, 10 mg/kg) and

fluoxetine (FLU, 10 mg/kg) in male mice submitted to acute restraint stress, and

evaluated using plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT), which

simultaneously evaluates parameters such as learning, memory and anxiety. Our

results demonstrated that (1) the administration of DZP and BUS, but not FLU,

promoted anxiolytic effects in animals; (2) administration mirtazapine caused

sedative effect to animals; (3) in the training session, the animals treated with BUS,

MIR and FLU learned the task, on the other hand DZP group showed impairment in

learning; (4) in the test session, animals treated with DZP, BUS, and MIR showed

deficits in relation to discrimination between the enclosed arms, aversive versus non-

aversive arm, demonstrating an impairment in memory, however, animals treated

with FLU showed no interference in the retrieval of this memory; (5) acute stress did

not interfere in locomotor activity, anxiety, or learning on the learning task, but

induced impairment in retrieval memory, and the group treated with FLU did not

demonstrated this deficit of memory . These results suggest that acute administration

of drugs with anxiolytic and antidepressant activity does not interfere with the

learning process this aversive task, but impair its retrieval, as well as the acute

restraint stress. However, the antidepressant fluoxetine was able to reverse memory

deficits promoted by acute stress, which may suggest that modulation, even acutely

serotonergic neurotransmission, by selectively inhibiting the reuptake of this

neurotransmitter, interferes on the process of retrieval of an aversive memory.

Key words: Aversive memory, Learning, Anxiolytic, Antidepressant, Acute restraint

stress, Mice.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ……………………………………………………………………... 10

1.1. Estresse .................................................................................................. 10

1.2. Ansiedade ............................................................................................... 13

1.3. Aprendizagem e Memória ...................................................................... 16

1.4. Estresse, Ansiedade e Memória ............................................................. 18

1.5. Principais fármacos utilizados no tratamento dos Transtornos de

Ansiedade....................................................................................................... 19

2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 27

2.1. Geral ....................................................................................................... 27

2.2. Específicos ............................................................................................. 27

3. ARTIGO CIÊNTÍFICO....................................................................................... 28

4. CONCLUSÃO GERAL ...................................................................................... 59

5. PERSPECTIVAS .............................................................................................. 60

6. REFERÊNCIAS GERAIS ................................................................................. 61

7. ANEXO.............................................................................................................. 70

10

1. INTRODUÇÃO

1.1. Estresse

Charles Darwin foi pioneiro no entendimento de que populações de

animais são formadas por indivíduos que diferem entre si em suas qualidades e

limitações, nas quais os mais adaptados ao ambiente em que vivem terão

vantagem de sobrevivência sobre os demais, permitindo sucesso reprodutivo e

passagem de seus traços genéticos para gerações subsequentes. Nessa linha

de pensamento que envolve a seleção natural, torna-se claro que diferentes

características selecionadas nos indivíduos proporcionam a utilização de

diferentes estratégias, baseadas em respostas ambientais e comportamentais,

para melhor lidar com diversas situações, e entre estas, as que culminam em

estresse (Korte et al., 2005).

As primeiras contribuições para definição do termo “estresse”

surgiram na civilização grega, onde os filósofos expressavam pensamentos

sobre um equilíbrio ou harmonia como condição necessária para a vida dos

organismos, e que, a falta desse aspecto, resultaria em doenças. Em 1859,

Claude Bernard, foi o primeiro a explicar formalmente que o meio interno dos

organismos não é apenas um veículo para a distribuição de nutrientes ou

outras substâncias através do corpo, mas sim, um meio que, em constante

comunicação com o meio externo, ameniza as mudanças bioquímicas,

fornecendo pontos de ajustes e favorecendo um estado estacionário. Mais

tarde, Walter Bradford Cannon (1932) sugeriu o termo “homeostase” como

sendo o processo que mantinha os estados fisiológicos estáveis no organismo.

A homeostase seria mantida por pontos de ajustes em níveis locais que

quando falhos, favoreciam ao aparecimento de patologias. Cannon ainda

incluiu na literatura o termo “luta e fuga” para a resposta dos animais às

ameaças ambientais, com participação do sistema nervoso simpático, sistema

esse que garantiria as condições homeostáticas internas (Moal, 2007; Fink,

2009).

Em 1936, Hans Hugo Bruno Selye, considerado o “pai do estresse”,

baseado em observações clínicas, verificou que os pacientes com diferentes

doenças apresentavam muitos sintomas inespecíficos semelhantes.

11

Juntamente a uma série de experimentos em ratos, Selye descreveu a

Síndrome de Adaptação Geral (SAG), a qual foi dividida em três fases: uma

fase de alarme, na qual a adaptação a um determinado estímulo nocivo ainda

não foi adquirida e onde se caracteriza a resposta de “luta e fuga”; uma fase de

adaptação, na qual a adaptação a esse mesmo estímulo é ideal; e uma fase de

exaustão, na qual se perde essa adaptação (Selye, 1936). Desta forma, o

termo “estresse” foi então definido por Selye (1976) como sendo uma resposta

não específica do organismo a quaisquer fatores, somático ou mental, que

coloquem em risco a homeostase do indivíduo. Esse mesmo pesquisador foi o

primeiro a reconhecer que a estabilidade dos sistemas do corpo frente ao

estresse não poderia ser assegurada apenas pela homeostase, e formulou o

termo heterostasia para o processo pelo qual um novo estado de equilíbrio do

meio interno é alcançado por mecanismos adaptativos (Fink, 2009).

Os fatores que perturbam a homeostase de humanos e animais não

humanos, os agentes estressores, por muito tempo foram comumente

classificados: (1) quanto a sua alta ou baixa intensidade; (2) quanto à sua

duração, podendo ser agudos (quando o estímulo é dado de forma única) ou

crônicos (quando o estímulo é contínuo ou por um longo período) e (3) quanto

à sua característica, podendo ser físicos (vibrações mecânicas, altas ou baixas

temperaturas, insulina), químicos (como administração de veneno),

psicofisiológicos (como conflito, medo e frustração, por exemplo) e sociais

(derrota social, separação maternal, entre outros) (Pacak & McCarty, 2007).

Entretanto, por não ser possível uma distinção precisa entre as características

desses agentes [por exemplo, o estresse de contenção que foi considerado por

Van de Kar e Blair, (1999) como um estressor misto por ter características

físicas com forte componente psicofisiológico], a classificação dos estressores

se resume quanto a sua percepção psicofisiológica, podendo ser físicos ou

psicossociais (Koolhaas et al., 2011). Independente da categorização, a

exposição a esses estressores proporciona a resposta fisiológica

desencadeada pelo estresse que é mediada principalmente pelo o sistema

nervoso autônomo (SNA) e pelo eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HPA).

Frente à exposição de um estressor, o SNA constitui a resposta

fisiológica mais imediata com rápidas alterações de órgãos alvos que são

12

inervados pelas porções simpática e parassimpática desse sistema. A porção

simpática estimula a liberação de catecolaminas - adrenalina, principalmente

em situações inescapáveis, e noradrenalina, principalmente em situação de

atividade física, na medula da glândula adrenal; enquanto a porção

parassimpática diminui essa excitação, resultando em uma resposta de curta

duração (Ulrich‑La & Herman, 2009; Koolhaas et al., 2011).

A ativação do eixo HPA tem início com a estimulação dos neurônios

do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), resultando na secreção de

hormônio liberador de corticotropina (corticotropin-releasing hormone - CRH) e

vasopressiva (AVP). A hipófise é então estimulada na sua porção anterior a

liberar o hormônio adrenocorticotrópico (adrenocorticotropic hormone - ACTH),

o qual, por sua vez, estimula a secreção de hormônios esteroides

(glicocorticóides) no córtex da glândula adrenal (Sapolsky, 2002), regulando o

eixo HPA por meio de feedback negativo. A liberação de glicocorticoides, além

de mediar mudanças na resposta ao estresse, é essencial para a resposta

adaptativa do organismo, pois gera uma mobilização de substratos necessários

para o enfrentamento aos agentes estressores (Sapolsky, 2002; Aguilera,

2011), como a regulação, armazenamento e mobilização de energia através do

metabolismo da glicose e alteram a excitabilidade de células nervosas,

exercendo exercerem efeito nas funções cognitivas (Lupien & McEwen, 1997).

A ação dos glicocorticóides se dá através da sua ligação a dois tipos

de receptores específicos amplamente distribuídos em todas as estruturas do

sistema nervoso central (Lupien & McEwen, 1997): o receptor de

mineralocorticoide (MR), ou tipo I, o qual possui alta afinidade para

corticosterona e aldosterona e são parcialmente ocupados com concentrações

basais de corticosteroides plasmáticos e totalmente ocupados em altas

concentrações destes; e o receptor de glicocorticoide (GR), ou tipo II, o qual

possui uma menor afinidade para corticosterona e uma afinidade menor ainda

para aldosterona e são apenas ocupados com altas concentrações de

corticosteroides plasmáticos (Pavlides et al., 1995).

Enquanto esse eixo é ativado agudamente, seja por aumento de

vigilância, medo ou ansiedade em um ambiente que oferece uma ameaça, as

13

modificações fisiológicas são adaptativas, preparando o organismo para agir de

forma rápida e eficiente. Entretanto, se ao cessar a ameaça e o estado

comportamental persistir, juntamente à alteração nos circuitos neuronais,

ativando esse eixo de forma crônica, as modificações fisiológicas podem ser

prejudiciais, resultando em fadiga, miopatias, hipertensão, imunossupressão,

infertilidade, desordens gastrointestinais, possibilitando alterações cognitivas e

comportamentais negativas, além de favorecer o aparecimento de estados

patológicos como, por exemplo, os transtornos de ansiedade (Chrousos, 1998;

McEwen, 2000; 2012).

1.2. Ansiedade

Ansiedade pode ser definida como o estado emocional desagradável

para o indivíduo envolvendo espera por uma ameaça aversiva não real, com

desconforto somático como taquicardia, sudorese e tremores, juntamente a

relatos de angústia, apreensão e medo. Sob o ponto de vista biológico, a

ansiedade teria raízes nas estratégias de defesa dos mamíferos com grande

valor adaptativo e seria desencadeada por situações onde o perigo é apenas

potencial, vago e obscuro. Entretanto, em humanos, quando os sintomas acima

mencionados impedem a realização de atividades rotineiras, envolvem grau de

sofrimento ou ainda são recorrentes durante tempo considerável do dia, há a

caracterização clínica dos Transtornos de Ansiedade (Blanchard et al., 1990;

Graeff, 2005; Banaco & Zamignani, 2004).

Segundo o Manual de Diagnóstico e Estatística de Transtornos

Mentais – DSM V (APA, 2013), são tipos de transtornos de ansiedade:

transtorno de ansiedade de separação que caracteriza-se pela experimentação

de ansiedade excessiva em função do afastamento de casa ou de figuras de

vinculação; transtorno de pânico que caracteriza-se por episódios de medo

intenso; agorafobia que caracteriza-se por uma perturbação antecipatória de

mal-estar; fobia específica que caracteriza-se pelo medo persistente a um

determinado objeto ou circunstância; transtorno de ansiedade social (fobia

social) que caracteriza-se pela vivência exagerada e persistente de ansiedade

pela exposição a pessoas estranhas ou a possível zombaria de terceiros;

14

transtorno de ansiedade generalizada que caracteriza-se pela presença de

preocupações excessivas e incontroláveis sobre diferentes aspectos da vida;

transtorno de ansiedade induzido por substância que caracteriza-se pela

ansiedade decorrente de efeitos fisiológicos de uma substância; transtorno de

ansiedade associado a outra condição médica que caracteriza-se pela

consequência fisiológica direta de uma condição médica geral e transtorno de

ansiedade sem outra especificação que engloba transtornos com ansiedade

proeminente ou esquiva fóbica que não satisfazem os critérios para qualquer

transtorno de ansiedade específico.

Os diferentes tipos de transtornos de ansiedade são bastante

recorrentes na população mundial. Lepine (2002) descreve que nos Estados

Unidos, um em cada quatro indivíduos relata ocorrência de pelo menos um

episódio de algum transtorno de ansiedade durante a vida. No Brasil, ainda são

poucos os dados epidemiológicos acerca do assunto, no entanto, Almeida-Filho

e colaboradores (1997), em um estudo na região metropolitana das cidades de

São Paulo, Brasília e Porto Alegre, relataram a prevalência de transtornos de

ansiedade em 6,9%, 12,1% e 5,4% dos indivíduos, respectivamente.

Entretanto, estudo recente aponta um aumento da ocorrência desses

transtornos. Na região metropolitana de São Paulo, por exemplo, cerca de 20%

da população sofre de algum tipo de transtorno de ansiedade, sendo

correlacionado com o rápido crescimento da cidade e o aumento da violência,

trazendo fortes sentimentos de insegurança aos indivíduos (Andrade et al.,

2012). Cada transtorno de ansiedade possui suas peculiaridades, mas todos

estão ligados ao medo exacerbado, perda de controle, nervosismo e

pensamentos negativos (Brody et al., 2006).

O processamento emocional, sobretudo os relacionados ao medo e

ansiedade, envolve áreas encefálicas do sistema límbico, sendo a amígdala a

estrutura responsável pelo início da adequada resposta comportamental aos

estímulos externos emocionais (Martin et al., 2010). O aumento da atividade

em regiões de processamento da emoção no cérebro de pacientes que têm

algum tipo de transtorno de ansiedade pode ser um possível resultado: (1) da

diminuição da sinalização inibitória pelo ácido gama-amino-butírico (GABA); (2)

aumento da neurotransmissão excitatória pelo glutamato, (3) aumento ou

15

diminuição da ação monoaminérgica, responsável por exercer regulação sobre

o funcionamento emocional, já que as monoaminas se relacionam com quase

todas as estruturas límbicas e (4) hiperatividade ou hipoatividade regulatória do

eixo HPA (Yehuda, 2002; Graeff, 2005; Teixeira et. al., 2000; Martin et al.,

2010). Desta forma, estresse e medo, sem desconsiderar fatores individuais

como predisposições genéticas, contribuem para a ocorrência de desequilíbrios

neuroquímico e neuroendócrino, que podem levar ao desenvolvimento dos

transtornos de ansiedade, comprometendo os indivíduos (Harvey & Shahid,

2012).

Neste contexto, apesar de certas manifestações associadas à

ansiedade serem exclusivamente humanas, componentes básicos dessa

condição, principalmente somáticos e autonômicos, podem ser investigados em

estudos com animais em laboratório, representando um bom modelo para

investigação da neurobiologia da ansiedade. Um dos modelos

comportamentais mais usados para esse fim é o labirinto em cruz elevado

(Elevated Plus- Maze - EPM), padronizado tanto para rato (Pellow et al., 1985)

quanto para camundongo (Lister, 1987). No EPM, os animais exploram

livremente dois braços abertos e dois braços fechados. A passagem pelos

braços abertos e o tempo de permanência nestes, está relacionada com

comportamentos de ansiedade, já que a administração de fármacos ansiolíticos

aumenta a exploração nesse braço e a administração de fármacos

ansiogênicos diminui essa exploração pelos animais. Medidas etológicas

também são avaliadas nesse aparato, incluindo uma variedade de ações

específicas que revelam mensurações adicionais da ansiedade como, por

exemplo, a avaliação de risco (risk assessment), usada pelos animais para

obter informações sobre o ambiente em que se encontram e para tomada de

decisão (Pellow, 1985; Lister, 1987; Hogg, 1996). Posteriormente, o Labirinto

em Cruz elevado modificado (Plus-Maze Discriminative Avoidance Task –

PMDAT), apresentando em um dos braços fechados um estímulo aversivo

composto por uma luz e um som (braço aversivo) acionados todas as vezes

que o animal entra nesse braço, possibilitando a mensuração também de

medidas de aprendizagem e memória (Silva e Frussa-Filho, 2000).

16

1.3. Aprendizagem e Memória

A aprendizagem é o processo pelo qual novas informações podem

ser armazenadas como traços de memórias recuperáveis, através de uma

mudança na excitabilidade dos circuitos neurais, reforçando as sinapses já

existentes ou formando novas, contribuindo para um maior e mais complexo

arranjo comportamental (Schmidt, 1995).

Já a memória, é um processo medido através de mudanças

comportamentais algum tempo após a aprendizagem. É um atributo

multifacetado de todos os animais e pode ser encontrada tanto em organismos

mais simples quanto em espécies de animais filogeneticamente mais

complexos. Pode ser definida como a capacidade do indivíduo em receber,

reter e evocar informações, envolvendo todos os tipos de atividades

comportamental ou fisiológicas relacionadas à vida desse indivíduo como a

reprodução, a busca por alimentos, reconhecimento de predador, homeostase,

imunidade, entre outros (Kometiani et al., 1982; Brenner et al., 2006;

Markowitsch & Staniloiu, 2011).

Diversos são os sistemas de classificação de memória. Por exemplo,

em relação ao tempo de retenção, as memórias que podem ser recordadas por

até poucos minutos são classificadas como de curto-prazo, enquanto as que

podem ser recordadas por horas e até anos são classificadas como de longo

prazo (Squire & Zola, 1996; Eichenbaum, 2000; Tulving, 2001 e 2002). A

memória de longo prazo pode ser dividida em relação à dependência ou não de

evocação consciente, consistindo em memórias declarativas e não

declarativas, respectivamente (Squire & Zola, 1996). No entanto, estudos

envolvendo o hipocampo, estrutura que medeia à aprendizagem e a formação

de novas memórias declarativas, demonstram que novas memórias podem ser

formadas independentes da consciência do indivíduo (Henke et al., 2003a e

2003b; Degonda et al., 2005). Desta forma, diferentes modelos para a

classificação de memórias estão sendo propostos, como por exemplo, baseado

na operação de processamento envolvida (Henke, 2010).

Vários estudos propõem um processo de evolução da memória ao

longo de milhões de anos, apontando para sistemas de processamentos e

17

armazenamento de informações diferentes para as espécies (Kometiani et al.,

1982; Markowitsch & Staniloiu, 2011). Para os mamíferos, uma das teorias

seria o sistema de memória em paralelo, lidando com três hipóteses de

sistemas neurais. Cada sistema possui uma estrutura central (hipocampo,

estriado dorsal ou amígdala) e as conexões aferentes e eferentes dessas

estruturas, as quais recebem as mesmas informações, diferindo, porém no seu

processamento e armazenamento. Entretanto, esses sistemas interagem entre

si e influenciam diretamente uns aos outros. A interação pode ser cooperativa,

quando resulta em um mesmo comportamento, ou competitiva, quando resulta

em comportamentos diferentes (White & McDonald, 2002).

Apesar de várias áreas cerebrais estarem envolvidas com o

processamento de vários tipos de memórias, o hipocampo tem um papel

fundamental na formação de memória declarativa, pois mudanças na eficiência

sináptica nessa região permite um fortalecimento na comunicação entre

neurônios alcançada através da potenciação de longa duração (Long-term

potentiation – LTP), demonstrada pelos pesquisadores Bliss e Lomo (1973). O

processo de LTP consiste na estimulação de um axônio pré-sináptico produzir

um aumento na magnitude da resposta de um neurônio pós-sináptico, através

da excitação glutamatérgica de receptores NMDA, com manutenção duradoura

dessa estimulação. Esse aumento pode durar algumas horas, vários dias ou

mesmo meses e contribui para a plasticidade sináptica, ou seja, a capacidade

das sinapses químicas se tornarem estáveis e serem facilitadas, ocorrendo

sincronia entre os neurônios, mas podendo ser reguladas (Lynch, 2004).

A memória é considerada um processo com vários estágios. O

primeiro é a aquisição, nesse período a atenção e integração sensorial são

essenciais para que a informação seja devidamente adquirida. Após esse

evento, ocorre o evento da retenção, período que serve para reforçar a

consolidação do traço de memória a ser formado. No evento de consolidação,

dinâmico e de longo prazo, a memória é fixada (aprendida), mas passível de

interferências por eventos externos. A evocação é o evento onde há a

recuperação desse traço de memória, importante, entre outros fatores, para a

elaboração de estratégia comportamental adequada. Essa memória pode ainda

18

ser esquecida, ou seja, apagada ou mascarada por outras informações, bem

como pela ação de fármacos e do estresse (Lupien & McEwen, 1997).

1.4. Estresse, Ansiedade e Memória

A influência emocional sobre a aprendizagem e memória,

principalmente em relação aos efeitos da ansiedade e estresse, são

amplamente investigados. Atenção, motivação, vigília e também a ansiedade

são mecanismos cognitivos que modulam o processo mnemônico. Embora seja

geralmente reconhecido que um evento é “melhor” lembrado quando

relacionado a aspectos emocionais (Schwabe et al., 2010), esse tipo de

memória tanto pode estar sujeita a falhas, quanto mudar ao longo do tempo ou

ainda ser influenciada por novos eventos (Mechanic et al., 1998).

Como mencionado anteriormente, o papel da amígdala na excitação

emocional parece fornecer uma modulação sobre os processos cognitivos e de

memórias emocionais, reforçando a abordagem dos sistemas múltiplos de

memória (Packard, 2009). Apesar da amígdala não parecer ser o local

específico de armazenamento de memórias com caráter aversivo (Ribeiro et

al., 2011), esta tem importante função na regulação e na consolidação de

memórias por enviar projeções diretas ao hipocampo (Lynch, 2004).

O hipocampo, outra estrutura relacionada ao sistema límbico, além

de estar envolvido com memória episódica, também é importante para a

detecção de alterações espaciais no ambiente (Barbosa et al., 2012). Juntos,

hipocampo e amígdala exercem regulação do eixo HPA. O hipocampo inibe

esse eixo através de fibras aferentes glutamatérgicas que partem do subiculum

para o núcleo do leito da estria terminalis (bed nucleus of stria terminalis –

BNST). Desse núcleo, agora as fibras gabaérgicas, chegam ao PVN. Desta

forma, quando o hipocampo é ativado, o hipotálamo é inibido. Em contraste, a

amígdala excita o eixo HPA através de projeções para o BNST e deste para os

PVN. Assim, o BNST pode ser considerado a maior via extrahipotalâmica de

entrada - inibitória e excitatória – ao eixo HPA (Forray & Gyslin, 2004).

19

O tipo de estresse, sua intensidade e duração, bem como os hormônios

liberados em sua resposta, também podem influenciar a ansiedade,

aprendizagem e a memória, ainda que os resultados sejam muito

controversos. Alguns autores relataram aumento (Mendonça & Guimarães,

1998; Padovan et al., 2000; Padovan & Guimarães, 2000; Busnardo et al.,

2013) ou nenhum efeito (Padovan & Guimarães, 2000) do estresse na

ansiedade; bem como efeitos benéficos do estresse sobre a memória (Nater et

al., 2007; Schwabe et al., 2008), enquanto que outros demonstraram prejuízos

mnemônicos (Elzinga et al., 2005; Kim et al., 2001).

Nos últimos anos tem sido demonstrado que o estresse não somente

afeta a intensidade e o tempo de aquisição de uma nova memória, mas

também a forma como esta memória é aprendida ou evocada (Kim et al., 2001;

Schwabe et al., 2007). Sabe-se que o estímulo estressor irá exercer sua ação

principalmente através de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e dos

glicocorticóides através de seus receptores (tipo I e tipo II). Os receptores tipo II

estão distribuídos amplamente pelas estruturas do sistema nervoso central

(Schwabe et al., 2010). O sistema límbico conta com a presença dos

receptores tipo I, mais densamente concentrados no hipocampo (Lupien &

McEwen, 1997).

Modelos animais têm sido propostos para estudo dos efeitos

neurofisiológicos de diversos agentes estressores na memória e ansiedade. O

modelo de indução de estresse por contenção consolidou-se na literatura como

um método prático e eficiente para se estudar as respostas comportamental,

bioquímica e neurofisiológica em roedores. É amplamente descrito que a

indução aguda de estresse por contenção mimetiza os parâmetros etológicos

de resposta ao estresse nos animais, promovendo ativação do SNA e do eixo

HPA e aumentando, consequentemente, os níveis de glicocorticóides

(Buynitsky & Motofsky, 2009).

1.5. Principais fármacos utilizados no tratamento dos Transtornos de

Ansiedade

20

Como já descrito, estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado

múltiplas causas para os transtornos de ansiedade, como hiperatividade

funcional das regiões límbicas, especialmente amígdala; incapacidade das

regiões corticais para normalizarem a resposta límbica aos estímulos;

interrupção de neurotransmissão monoaminérgica e sinalização

neuroendócrina; e hiperatividade do eixo HPA devido à longa exposição a

agentes estressores (Martin et al., 2010). O que leva a uma ampla margem de

ação terapêutica.

A maioria dos fármacos ansiolíticos e antidepressivos, utilizados

como intervenções farmacológicas para o tratamento dos transtornos de

ansiedade, apesar de já exercerem ação após administração aguda, apenas

apresentam seus efeitos terapêuticos após tratamento contínuo, sendo esse

efeito crônico o mais investigado e relacionado com alterações nos processos

cognitivos. Exemplos de drogas descritas como eficazes no tratamento desses

transtornos incluem benzodiazepínicos (como o Diazepam); agonistas parciais

de receptor 5-HT1A serotoninérgicos (como a buspirona); antidepressivos

atípicos com ação noradrenérgica e serotoninérgica (como a mirtazapina);

inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) (como a fluoxetina),

entre outros (Baldwin & Garner, 2008).

No início da década de 1970, os derivados benzodiazepínicos

começaram a ser utilizados. Estes fármacos apresentam efeitos ansiolíticos e

podem fornecer alívio agudo aos sintomas de alguns transtornos de ansiedade,

apesar do grande potencial de desenvolvimento de tolerância fisiológica,

dependência e sedação (Kodish et al., 2011). O diazepam (DZP), um derivado

benzodiazepínico, é frequentemente prescrito para o tratamento de sintomas

de ansiedade por facilitar a ação do GABA, principal neurotransmissor inibitório

do cérebro de mamíferos adultos, através do influxo de cloreto (Muñoz-Torres

et al., 2011). Seus níveis séricos máximos são alcançados entre 30 minutos a 8

horas depois da administração com meia-vida de 20 a 90 horas (Cordioli et al.,

2010). Seu mecanismo de ação inclui principalmente atuação sobre os

receptores GABAA. A subunidade alfa-1 desses receptores parece ser

responsável pelos efeitos sedativos e a alfa-5 pelos efeitos amnésicos

relacionados aos benzodiazepínicos, pelo seu efeito modulador sobre as

21

projeções monoaminérgicas do núcleo da rafe e do locus coeruleus. Por outro

lado, a subunidade alfa-2, parece ser responsável pelos efeitos ansiolíticos

(Fritschy & Mohler, 1995).

Os efeitos da administração do DZP em ratos já foram investigados

no labirinto em cruz elevado, promovendo em doses agudas baixas (Pellow,

1985) e altas (Sorregotti, 2013) efeito ansiolítico. Além da avaliação etológica,

nesses mesmos estudos, demonstrarem a diminuição da frequência da

avaliação de risco pelos animais.

A relação do DZP com o eixo HPA ainda é controversa. Um estudo

em roedores com administração aguda de DZP na dose de 10 mg/Kg foi capaz

de aumentar a atividade desse eixo, evidenciado pelo aumento da secreção de

ACTH e corticosterona (Vargas et al., 2001). Já uma baixa dose de DZP

(1mg/Kg) demonstrou aumento nos níveis de glicocorticóides em roedores

machos, mas não demonstrou essa alteração em machos estressados

(Matheson et al., 1988). Já em fêmeas, a mesma dose demonstrou uma

inibição do eixo HPA, com consequente redução dos níveis de ACTH e

corticosterona (Strac, et al., 2012).

Em relação à memória e aprendizagem, já são bem elucidados os

efeitos amnésicos indesejáveis evidenciados na prática clínica e em modelos

animais por esse fármaco. Orzelska (2013) relatou prejuízo na aprendizagem e

memória de camundongos submetidos à administração aguda de DZP em uma

modificação do labirinto em cruz elevado. Assim, como também foi

demonstrado um prejuízo na memória de ratos tratados por quatro dias com 2

mg/Kg de DZP quando submetidos à tarefa do labirinto aquático de Morris,

ocorrendo aumento de latência e da distância para encontrar a plataforma

(Joksimovic et al., 2013). Esses resultados acerca da modulação da memória

podem ocorrer devido à localização de receptores benzodiazepínicos no septo

medial, amígdala e hipocampo, que como já mencionado, são estruturas

envolvidas na formação de novas memórias (Abel & Lattal, 2001).

No fim da década de 60 iniciou-se uma ampla investigação sobre o

papel da serotonina (5-HT) na ansiedade. Atualmente sabe-se que o sistema

serotonérgico, além de estar relacionado com nocicepção e termorregulação,

22

quando é hiperativado pode estar envolvido com o desenvolvimento de

transtornos depressivos e de ansiedade, tanto em roedores como em humanos

(Graeff 2002; Hata et al., 2001).

Deakin e Graeff (1991) propuseram três sistemas serotoninérgicos

para o controle das respostas comportamentais a estímulos aversivos. A

primeira via trata-se da dorsal da rafe responsável pelo comportamento de

congelamento frente a eventos de luta ou fuga. Uma disfunção serotoninérgica

nessa via é relatada ser responsável pela estimulação desenfreada do sistema

nervoso simpático e comportamento de transtorno de pânico. A segunda via

parte do núcleo dorsal da rafe e chega à amígdala, hipocampo e córtex pré-

frontal, e tem o objetivo de facilitar a avaliação do estímulo aversivo e

prevenção deste. Anomalias nessa via estão relacionadas com transtornos de

ansiedade. A terceira via, medial da rafe se projetando para o septo-

hipocampal, está relacionada com a resiliência e tolerância ao estresse crônico

e disfunção de serotonina nessa via é relevante para a depressão.

A 5-HT desempenha importante papel nos processos cognitivos através

de ações de neuromoduladores no córtex (Deakin et al., 2004). Alteração no

repertório comportamental também é evidenciada pela liberação de 5-HT no

hipocampo na presença de eventos estressores, facilitando a tolerância e

habituação ao estresse (Netto, 2002). Até o momento, 14 subtipos de

receptores de serotonina foram identificados no cérebro de mamíferos. Mas a

atenção tem se concentrado nos subtipos 5HT1A e 5HT2A, por responderem a

todos os tipos de antidepressivos, incluindo os inibidores seletivos da

recaptação de serotonina (ISRS) (Graeff, 2002).

A buspirona (BUS) é um agonista parcial de um tipo específico de

receptor serotoninérgico: o 5-HT1A, que são autorreceptores pré-sinápticos

presentes nos núcleos da rafe, ou receptores pós-sinápticos localizados no

hipocampo, amígdala e outras áreas do sistema córtico-limbico. A ativação

desses receptores resulta na abertura de canais de K+ que provocam

hiperpolarização e, dessa forma, agem como reguladores da transmissão

sináptica (Hata et al., 2001). A ação desse fármaco é mais lenta no início do

tratamento, porém possui a vantagem de não promover sedação, dependência

23

ou efeito de retirada. A sonolência é o principal efeito indesejado descrito pelos

pacientes que o utilizam (Nutt, 1990) e é indicado na prática clínica como

potencializador dos ISRS. Possui um pico de concentração plasmática cerca de

1,5 h após a administração aguda oral com meia vida entre 2 e 3 horas

(Cordioli et al., 2010).

A interação da buspirona com o eixo HPA parece ocorrer através

dos receptores 5-HT1A nas vias neuronais serotonérgicas que exercem um

efeito modulador sobre o eixo (Fuller, 1991). A administração aguda de

buspirona promove um efeito facilitador do eixo HPA, aumentando os níveis de

corticosterona circulante em ratos estressados (Matheson et al., 1988) e de

cortisol em pacientes com depressão (Maes et al., 1996). Estudos também têm

demonstrado influência da buspirona em vários modelos animais de medo e

ansiedade e relatam efeito ansiolítico da buspirona tanto em tratamentos

agudos quanto crônicos (Majercsik et al., 2003; Brodkin et al., 2002). Em

animais adrenalectomizados, o efeito ansiolítico da buspirona não é mais

visualizado (López-Rubalcava et al., 1999), mostrando a relação existente entre

o efeito ansiolítico desse fármaco e o eixo HPA. No entanto, alguns autores

sugerem que injeção pós-estresse de agonistas de receptores 5-HT1A são

capazes de atenuar as consequências comportamentais do estresse. Os

resultados sugerem que o aumento de ativação desses receptores melhora a

tolerância ao estresse (Guimarães et al., 1993; Padovan & Guimaraes, 1993).

Em relação à aprendizagem e memória, a ação da buspirona ainda é

contraditória, variando conforme a escolha do delineamento experimental e da

tarefa comportamental escolhida. Seu efeito negativo foi demonstrado quando

a administração de buspirona (1 mg/Kg e 2 mg/Kg) prejudicou o desempenho

quando administrada 30 min antes do treino ou teste da tarefa de esquiva

passiva, aumentando o número de entradas no compartimento aversivo. Já

quando a buspirona (2 mg/Kg) foi administrada 30 min antes do primeiro treino,

também ocorreu déficit na aquisição da tarefa espacial no labirinto aquático de

Morris, aumentando a latência para encontrar a plataforma submersa (Rowan

et al., 1990). Por outro lado, Rapanelli (2013), não constatou nenhum efeito da

administração de buspirona (1 mg/Kg e 10 mg/Kg) em relação a memória no

teste de condicionamento operante.

24

Os ISRSs estão entre os fármacos mais comumente prescritos no

tratamento dos transtornos de ansiedade e humor e a fluoxetina é um dos

fármacos mais utilizados atualmente na clínica. A fluoxetina (FLU) age

bloqueando a bomba de recaptação pré-sináptica, elevando assim os níveis de

5-HT na fenda sináptica, estimulando os autorreceptores 5HT1A do núcleo da

Rafe. A elevação dos níveis desse neurotransmissor ocorre primeiramente na

região somatodendrítica, onde há a presença desses receptores. No entanto,

seu uso recorrente provoca down regulation nos neurônios serotoninérgicos e

dessensibilização dos auto-receptores 5HT1A, resultando em uma descarga de

5-HT que resulta em uma normalização da atividade serotoninérgica (Stahl,

2000). A fluoxetina ainda age indiretamente sobre o subtipo 5-HT2 (Silva &

Brandão, 2000). Seus níveis séricos máximos são alcançados de 6 a 7 horas,

com meia vida de 1 a 3 dias após a administração aguda oral (Cordioli et al,

2000).

Os efeitos da FLU sobre a atividade do eixo HPA é relatada na

literatura pela diminuição nos níveis de cortisol em pacientes depressivos

tratados com 20 mg desse fármaco por dia durante oito semanas (Jazayeri et

al., 2010). Entretanto, estudo recente relatou esse mesmo resultado com

apenas duas semanas de tratamento (Piwowarska et al., 2012), juntamente à

diminuição dos sintomas depressivos.

A influência desse fármaco sobre a ansiedade ainda é contraditória.

Sun e colaboradores (2013) demonstraram que ratos isolados socialmente por

6 semanas e tratados com fluoxetina durante 3 semanas, quando submetidos

ao teste de alimentação suprimida pela novidade, demonstraram

comportamento ansiolítico, mas não demonstraram efeito sobre a depressão

nesse mesmo protocolo quando submetidos ao teste de nado forçado. A

fluoxetina administrada por 4 semanas em animais submetidos por estresse de

contenção durante 2h/5dias/4semanas promoveu efeito panicolítico no teste de

labirinto em T elevado, com diminuição da latência de fuga dos braços abertos

para o braço fechado, mas não mostrou efeito na exploração dos braços

abertos no labirinto em cruz elevado quando comparado com animais do grupo

controle (Lapmanee et al., 2013). Quanto a sua administração aguda, muitos

autores sugerem efeito ansiogênicos desse fármaco nas doses de 5 mg/Kg e

25

10 mg/Kg no labirinto em cruz elevado, com diminuição da %TAB e aumento

nos parâmetros de avaliação de risco (Drapier et al., 2007; Robert et al., 2011)

e redução de interação social, diminuindo esse fator (Andó et al., 2010).

Em relação aos processos mnemônicos, já foi demonstrado que uma

administração por quatro semanas de fluoxetina 0,7 mg/kg em ratos não afetou

a aprendizagem e memória quando testados no labirinto aquático de Morris.

Entretanto, ocorreu déficit da memória de longo prazo, porque os animais

testados 17 dias após o treino aumentaram a latência para encontrar a

plataforma. Esse prejuízo foi revertido quando os animais passaram por uma

retirada de 6 semanas da fluoxetina, antes das sessões treino e teste, para

avaliar a memória de curta e longa duração (Ampuero et al., 2013). Por outro

lado, a administração de fluoxetina 10 mg/kg em ratas durante 4 semanas

também promove alteração da aprendizagem e da memória quando os animais

são submetidos ao labirinto em cruz elevado modificado, como também

melhora o padrão de extinção de uma memória aversiva em roedores (Melo et

al., 2012).

Os demais receptores para 5-HT, que não os do tipo 5-HT1A, e as

demais monoaminas, que não a 5-HT, também parecem influenciar os níveis

de ansiedade. Assim, são utilizados na clínica fármacos antidepressivos

atípicos, como a mirtazapina. Esse fármaco possui dois principais mecanismos

de ação, o primeiro envolve a ação antagonista sobre os receptores alfa-2-

adrenérgicos nos neurônios pré-sinápticos serotoninérgicos e noradrenérgicos.

E o segundo mecanismo seria através do antagonismo sobre os receptores 5-

HT2 e sobre os receptores e 5-HT3 (de Boer et al., 1996), assim, ocorreria a

estimulação da transmissão serotoninérgica via 5-HT1A, além da transmissão

noradrenérgica. A sedação e o aumento de apetite estão entre os efeitos

adversos descritos pelo uso desse fármaco (Kodish et al., 2011). Seus níveis

séricos máximos são alcançados em até 2 horas após a administração aguda

oral, com meia vida média de 21,5 horas (Cordioli et al., 2000).

A mirtazapina (MIR) parece inibir o eixo HPA. Em experimentos

realizados com pacientes depressivos que passaram pelo tratamento com

mirtazapina com 15 mg ou 30 mg por 1, 3, ou 4 semanas foi observado uma

26

redução nas concentrações de cortisol (Schule et al., 2006; Scharnholz et al.,

2010). Mais recentemente foi descrito que a inibição ao eixo HPA pode ser

visualizada com uma única administração desse fármaco, já que uma dose de

15 mg, em pacientes saudáveis, levou a uma diminuição das concentrações de

ACTH (Suzuki et al., 2012).

Estudos demonstram que além da ação ansiolítica ou não desse

fármaco (Kakui et al., 2009), seu uso também promove um aumento dos níveis

de noradrenalina e 5-HT em regiões cerebrais relacionadas a processos

cognitivos, como por exemplo, o hipocampo (de Boer et al., 1996). Assim,

Andrews e colaboradores (1997) demonstraram que o uso de MIR em ratos

submetidos a um tipo de autocondicionamento (Pavlovian autoshaping task)

promove um déficit na aquisição da aprendizagem. Melo e colaboradores

(2012) observaram que mesmo esse fármaco cronicamente não interferindo na

aprendizagem e memória de roedores submetidos à esquiva discriminativa em

labirinto em cruz elevado, houve uma falha na extinção dessa memória

aversiva. Ademais, em humanos, foi demonstrado que o tratamento com MIR

durante 2 ou 6 semanas, melhora a função de memória em pacientes com

estresse pós traumático (Chung et al., 2007).

Assim, é evidente que ainda é contraditório na literatura a influência

positiva ou negativa desses fármacos sobre o eixo HPA, a ansiedade e as

funções de aprendizagem/memória, sempre variando conforme o protocolo

utilizado, a dose do fármaco escolhida, o tipo de tratamento (agudo ou crônico)

e a tarefa comportamental realizada.

27

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos da

administração aguda de fármacos ansiolíticos e antidepressivos no

desempenho de camundongos machos submetidos ao estresse agudo de

contenção, utilizando a tarefa de esquiva discriminativa em labirinto em cruz

elevado modificado (PMDA).

2.2. Objetivos Específicos

Verificar os efeitos da administração dos fármacos ansiolíticos diazepam

e buspirona e antidepressivos, mirtazapina e fluoxetina, na ansiedade,

aprendizagem e memória de camundongos machos;

Analisar parâmetros etológicos de avaliação de risco.

28

3. ARTIGO:

FLUOXETINE (BUT NOT OTHER ANTIDEPRESSANTS OR

ANXIOLYTICS) REVERSE AVERSIVE MEMORY DEFICITS INDUCED BY

ACUTE STRESS IN MICE.

Aline Lima Dierschnabel, Ana Paula Nascimento de Lima, Ezequiel Batista

do Nascimento, Regina Helena da Silva, Alessandra Mussi Ribeiro*.

Laboratory of Memory Studies, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal,

Brazil

*Corresponding author: Alessandra M Ribeiro

Laboratory of Memory Studies, Department of Physiology

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Av. Salgado Filho, s/n - Caixa Postal 1511 - CEP 59078-970 - Natal, RN, Brazil

fax: (55) 84 3211 9206 e-mail: alemrib@gmail.com

List of abbreviations:

% TOA – percentage of total time spent in the open arms %TAV – percent time spent in aversive arm 5-HT – serotonin ACTH – adrenocorticotropic hormone AV – aversive enclosed arm

AVP – vasopressin BUS – buspirone DZP - diazepam HPA – hypothalamic-pituitary-adrenal axis MIR – mirtazapine NA – noradrenaline NAV – non-aversive enclosed arm OA – open arms OA – two open arms PHD – protected head dipping PMDAT – plus-maze discriminative avoidance task PVN – paraventricular nucleus of the hypothalamus SAL - Saline SAP – stretched attend postures SSRIs – selective serotonin reuptake inhibitors STR - Stress UHD – unprotected head dipping

29

Abstract:

Stressful events activate the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA)

axis, which represents part of the physiological responses to stress. When this

axis is acutely stimulated, a repertoire of adaptive behavioral and physiological

changes occurs in the individual. On the other hand, when the HPA axis is

chronically stimulated, harmful psychophysiological changes may occur,

including impairment in cognitive functions (e.g. in learning and memory) and

the development of psychiatric diseases (e.g. anxiety disorders). Some

anxiolytic agents used in clinical practice for the treatment of anxiety disorders

can affect cognitive function and the activity of HPA axis. The aim of our study

was to investigate the effects of acute intraperitoneal administration, 30 minutes

before session training, of diazepam (DZP, 2 mg / kg), buspirone (BUS, 3 mg /

kg), mirtazapine (MIR, 10 mg / kg) and fluoxetine (FLU, 10 mg / kg) in male

mice submitted or not to acute restraint stress, using the plus-maze

discriminative avoidance task (PMDAT). A task that simultaneously evaluates

learning, memory and anxiety parameters. Our results demonstrated that

animals treated with BUS, MIR and FLU learned the task. However, DZP-

treated group showed impaired learning. Acute restraint stress induced

impaired retrieval and only the treatment with fluoxetine was able to counteract

this impairment. Furthermore, DZP and BUS induced anxiolytic effects, as

shown by the increased percentage of time spent in the open arms and change

in risk assessment behavior during training. FLU had no effects on anxiety.

These results suggest that acute administration of drugs with anxiolytic and

antidepressant activity does not necessarily interfere with the learning process

in this aversive task, but as acute restraint stress impair its retrieval. However,

the antidepressant fluoxetine reversed memory deficits promoted by acute

stress, which may suggest a modulatory role of serotonin on the process of

consolidation of an aversive memory.

Key words: Aversive memory, Learning, Antidepressant, Anxiolytic, Acute

restraint stress, Mice.

30

1. Introduction

Stress is defined as a nonspecific response of the body to any factors,

somatic or mental, that endangers the homeostasis of the individual (Selye,

1976). After exposure to a stressor, the body generates a physiological

response that is mainly mediated by the hypothalamic-pituitary-adrenal axis

(HPA). Ascendant sensory inputs stimulate neurons of the paraventricular

nucleus of the hypothalamus (PVN), resulting in the secretion of corticotropin-

releasing hormone (CRH) and vasopressin (AVP). Then, the anterior pituitary

gland is stimulated, releasing adrenocorticotropic hormone (ACTH), which in

turn stimulates the secretion of steroid hormones (glucocorticoids, cortisol in

humans and non-human primates and corticosterone in some rodents) by the

cortex of the adrenal gland. Finally, these hormones regulate the HPA axis by

negative feedback (Sapolsky, 2002). Therefore, the glucocorticoids mediate

changes induced by the stress response, as well as they are essential for the

adaptive response of the body, because they mobilize substrates necessary for

coping with stressors (Sapolsky, 2002; Aguilera, 2011). For example, the stress

hormones are related to the regulation, storage and mobilization of energy

through glucose metabolism, alter nerve cells excitability and exert effects on

cognitive functions (Lupien & McEwen, 1997).

When the HPA axis is activated acutely, for example by arousal related

to fear or anxiety, the physiological consequences are adaptive, because they

prepare the body to act fast and efficiently. However, when the stressor is

removed and the altered physiological state persists, an imbalance of the neural

circuitry may occur, leading to cognitive and behavioral alterations that can

increase the expression of pathological states, such as anxiety disorders

(Chrousos, 1998; McEwen 2000, 2012).

Anxiety is one of the most prominent psychiatric disorders related to

stress, with an estimated 28% lifetime prevalence worldwide (Nishikawa et al.,

2004; Kessler et al., 2010). Anxiety disorders are characterized by exacerbated

response to an unpleasant emotional state in the absence of immediate threat

(Blanchard et al., 1990; Graeff, 2005; Banaco & Zamignani, 2004; Kessler et al.,

2010). Clinical anxiety is a heterogeneous syndrome, comprising distinctive

31

pathological conditions such as separation anxiety disorder; panic disorder,

agoraphobia, specific phobia, social anxiety disorder (social phobia) and

generalized anxiety disorder (APA, 2013).

Several drugs are effective for the treatment of these disorders,

including benzodiazepines, serotonin 5-HT1A receptor partial agonists, specific

noradrenergic and serotonergic antidepressants and selective serotonin

reuptake inhibitors (SSRIs) (Baldwin & Garner, 2008). Most of these anxiolytic

and antidepressant drugs, which are used as pharmacological interventions for

the treatment of anxiety disorders, interfere with the activity of the HPA axis

(Busnardo et al., 2013; Sun, 2013; de Boer et al., 1990; Matheson et al., 1988;

Schule et al., 2006; Scharnholz et al., 2010; Jazayeri et al., 2010; Piwowarska

et al., 2012) and cognitive functions (Li et al., 2012; Smeets, 2011; de Quervain

et al., 1998; de Quervain et al., 2000; Orzelska, 2013; Joksimovic et al., 2013;

Quartermain et al., 1993; Mendelson et al., 1993; Melo et al., 2012; Hage et al.,

2004; Meneses e Hong, 1995). Although effective acute administration has

been described, some of these drugs usually present their therapeutic effects

after continuous treatment (Baldwin & Garner, 2008). This chronic treatment is

the most investigated as regards changes in the cognitive processes.

Several studies report on the neurophysiological effects of the various

stressors in combination with pharmacological treatments on memory and

anxiety features (Sun et al., 2013; Silva & Brandão, 2000; Sorregotti, et al.,

2013; Orzelska et al., 2013; Brodkin et al., 2002; Kakui et al., 2009). However,

few focused on acute effects of anxiolytic-like drugs specifically on the aversive

memory in stressed animals. In the present study, we investigated the effects of

acute administration of anxiolytic and antidepressant drugs on the performance

of male mice after acute restraint stress. Mice were tested in the plus-maze

discriminative avoidance task (PMDAT). Which is an efficient model for

evaluating memory and anxiety parameters simultaneously (Silva and Frussa-

Filho, 2000).

32

2. Materials and methods

2.1. Animals

Three-month-old male Swiss mice (35-45g) were housed in a groups of

8 animals, under controlled conditions of temperature (22-25°C), humidity and a

12 h light/12 h dark cycle (lights on 06:30 am), with free access to water and

food. All animals were handled in accordance to the Brazilian law for the use of

animals in scientific research (Law Number 11.794) and procedures were

approved by the local ethical committee (CEUA/UFRN - Nº 034/2012). All

efforts were made to minimize animal pain, suffering or discomfort as well as

the number of animals used.

2.2. Drugs

Diazepam (2 mg/ml/Kg; Santiva, Brazil) was diluted in physiological

saline. Buspirone (3 mg/ml/Kg; Torrent, Brazil), mirtazapine (10 mg/ml/Kg;

Libbs, Brazil) and fluoxetine (10 mg/ml/Kg; Mendley, Brazil) were diluted in

physiological saline containing three drops of Tween 20 per 1 ml.

2.3. Experimental procedure

The animals were randomly assigned into two conditions: control

condition (Cont) and stress condition (Str). For each condition, the mice

received an intraperitoneal (i.p.) injection of saline or one of the drugs: (a)

diazepam (DZP), (b) buspirone (BUS), (c) mirtazapine (MIR) or (d) fluoxetine

(FLU). Thus, the organization of the groups for conditions and treatments for

each experiment was structured as shown in table 1.

33

Table 1: Schematic representation of the distribution of animals/group and number of

animals used in each experiment.

Groups

N° of

animals

Experiment with Diazepam (DZP)

Control-Saline (Cont-Sal) 8

Control-Diazepam (Cont-DZP) 9

Stress-Saline (Str-Sal) 8

Stress-Diazepam (Str-DZP) 9

Experiment with Buspirone (BUS)

Control-Saline (Cont-Sal) 9

Control-Buspirone (Cont-BUS) 9

Stress-Saline (Str-Sal) 8

Stress-Buspirone (Str-BUS) 10

Experiment with Mirtazapine (MIR)

Control-Saline (Cont-Sal) 9

Control-Mirtazapine (Cont-MIR) 9

Stress-Saline (Str-Sal) 10

Stress-Mirtazapine (Str-MIR) 9

Experiment with Fluoxetine (FLU)

Control-Saline (Cont-Sal) 8

Control-Fluoxetine (Cont-FLU) 9

Stress-Saline (Str-Sal) 6

Stress-Fluoxetine (Str-FLU) 9

The doses were chosen based on previous studies (Orzelska et al.,

2013; Brodkin et al., 2002; Drapier et al., 2007; Kakui et al., 2009; Melo et al.,

2012) that demonstrated the efficacy of these drugs in rodents.

Before the beginning of the experiments, all animals were handled for 5

min/day for a period of 5 days. On the 1st day, the animals of the stress

condition were submitted to a single session of restraint stress for 1 hour while

the animals in the control condition remained in their home cages. At the end of

restraint or at the corresponding time-point the that groups, mice were injected

with saline or drug, and 30 minutes later each animal was submitted to the

training session (10 min) of the plus-maze discriminative avoidance task

(PMDAT). On the 2nd day, 24 hours after training, the animals were re-exposed

to the apparatus in the test session (10 min) (Figure 1). All behavioral tests

started at 7:00 a.m. and after the test session, each animal was decapitated

and blood samples were collected for determination of plasma corticosterone

levels.

34

Figure 1: Schematic representation of the experimental design.

2.4. Restraint stress

Animals were submited to a 1-hour period (from 7:00 to 8:00 a.m.) of

restraint stress. The procedure of stress used was performed according to the

methods described previously (Harada et al., 2008; Stroth & Eiden, 2010; Li et

al., 2012;). Animals were placed an acrylic tube (14 cm x 7 cm). That contained

a 0.3 cm hole in one of the extremity where the head of the mouse was

positioned for breathing. During the stress procedure the animals were kept in a

vertical position. After exposure to the stressor the animals were returned to the

home cage. Despite of the physical nature of this stress procedure (limited

behavioral responses of the animal), this model of restraint has a strong

psychophysiological component (inescapable situation) (Van de Kar and Blair,

1999).

2.5. Plus-maze discriminative avoidance task (PMDAT)

The apparatus consisted of an elevated plus-maze, made of wood,

containing two open arms (OA) (28.5 cm x 7 cm) opposite to two enclosed arms

(28.5 cm x 7 cm x 14 cm; an aversive arm (AV, the aversive stimuli were a

100W light and an 80dB noise applied through a speaker placed over the

aversive enclosed arm) and a non-aversive (NAV) arm. In the training session,

each animal was placed individually in the center of the apparatus, for a period

of 10 min, and every time the animal entered the aversive arm the stimuli were

produced until the animal left the arm. In the test session (24 hours later), the

animals were again placed in the center of the apparatus and allowed to explore

it for 10 min, without receiving the aversive stimulation. The lamp and the

35

speaker were still present on the aversive arm, but turned off (Silva & Frussa-

Filho, 2000). At the end of each behavioral session the apparatus was cleaned

with a 5% alcohol solution to avoid olfactory cues.

All experimental sessions were recorded by a digital camera place

above the apparatus and the behavioral parameters were registered by a video-

tracking software (Anymaze®, Stoelting, USA). The behavioral sessions were

monitored in a computer screen placed in a separate room to avoid any

interference caused by the experimenter.

Learning was evaluated by comparing the total time spent in the

aversive (AV) in relation to the non-aversive enclosed arm (NAV) in the training

and test session. The percent of time spent in the aversive arm [%TAV = time in

AV/(time in NAV + AV) x 100] was used to assess retrieval of the aversive

memory in the test session. The anxiety-like behavior was evaluated by the

percentage of time spent in the open arms (OA) [% TOA = time in OA/(time in

OA + NAV +AV) x 100]. Moreover, in the training session, the ethological

components of risk assessment were evaluated by the parameters: head

dipping (frequency of movements of the head toward the floor), divided into

protected head dipping (PHD - when performed from the center of the

apparatus) and unprotected head dipping (UHD - when performed from the

open arms), and stretched attend postures (SAP - defined by the stretching and

contraction of the body to its original position without locomotion). Moreover, the

locomotor activity of the animals was evaluated by the total distance travelled

(m) in the whole apparatus.

2.6. Statistical analyses

Data normality of variances were tested by the Kolmogorov-Smirnov

test. Analysis of variance (two-way ANOVA) with a post-hoc with Duncan’s test

was used for each drug separately to evaluate percent time spent in aversive

arm (%TAV) in the test session, percent time spent in the open arms (% TOA)

in the training and test sessions, risk assessment parameters in the training

session and the total distance traveled in the training and test sessions.

36

Pairwise comparisons between the time spent in AV and NAV arms were

performed using the paired-samples Student t-test. Differences were

considered statistically significant at p < 0.05.

3. Results

3.1. Learning and Memory

3.1.1. Total time spent in the enclosed arms

In the training session, the paired-samples t-tests revealed that all

groups treated with saline solution, stressed or not, spent less time in the

aversive enclosed arm (AV) in comparison with the non-aversive enclosed arm

(NAV) in all experiments, as displayed in figure 2A [Cont-Sal, t(8) = 5.593; p =

0.001 and Str-Sal, t(8) = 5.71; p < 0.001)], figure 2C (Cont- Sal, t(9) = 5.56; p <

0.001 and Str-Sal, t(8) = 2.63; p = 0.03), figure 2E (Cont-Sal, t(9) = 3.10; p =

0.013 and Str-Sal, t(10) = 4.00; p = 0.002) and figure 2G (Cont-Sal, t(8) = 4.95;

p = 0.001 and Str-Sal, t(6) = 0; p = 0.001).

Mice treated with diazepam, regardless of the condition, did not

discriminate the arms in the training session [Cont-DZP, t(9) = 1.74; p = 0.114

and Str-DZP, t(9) = 0.75; p = 0.468)] (Figure 2A). However, the paired-samples

t-tests revealed that animals treated with buspirone [Cont-BUS, t(9) = 5.62; p <

0.001 and Str-BUS: t(10) = 4.16; p = 0.002)] (Figure 2C), mirtazapine [Cont-

MIR: t(9) = 7.06; p < 0.001 and Str-MIR, t(9) = 7.15; p < 0.001)] (Figure 2E) and

fluoxetine [Cont-FLU, t(9) = 10.26; p < 0.001 and Str-FLU, t(9) = 9:36; p <

0.001)] (Figure 2G), showed a preference fot the NAV compared to the AV.

In the test session, all animals of the Cont-Sal groups [Figure 2B: t(8) =

6.00; p< 0.001; Figure 2D: t(9) = 2.35; p = 0.043; Figure 2F: t(9) = 0.35; p =

0.731; and Figure 2H: t(8) = 3.82; p = 0.005] exhibited a preference for the NAV

compared to the AV arm. On the other hand, Str-Sal groups did not discriminate

the arms [Figure 2B: t(8) = 0.85; p = 0.418); Figure 2D: t(8) = 1.70; p = 0.126;

Figure 2F: t(10) = 1.23; p = 0.245; and Figure 2H: t(6) = 1.20 p = 0.275].

Moreover, regardless of the condition, mice treated with DZP [Cont-DZP: t(9) =

37

1.47; p = 0.173 snd Str-DZP: t(9) = 1,37; p = 0,202], BUS [Cont-BUS: t(9) =

0.38; p = 0.708 and Str-BUS, t(10) = 0.54; p = 0.60] and MIR [Cont-MIR, t(9) =

0.35; p = 0.731 and Str-MIR, t(9) = 0.01; p = 0.991] also failed to discriminate

between AV and NAV arms (Figure 2B, D and F). On thr contrary, Cont-FLU

[t(9) = 2.66; p = 0.026] and Str-FLU groups [t(9) = 2.39; p = 0.040] showed a

preference for the NAV when compared to the AV arm (Figure 2H).

3.1.2. Percentage of exploration of aversive enclosed arm (%TAV) in

the test session

Two-way ANOVA revealed effects of treatment with diazepam and

mirtazapine [F(1,38) = 14.87; p < 0.001 and F(1,41) = 6.54; p = 0.015,

respectively], but not effects of condition [Figure 3A: F(1,38) = 4.00; p = 0.053

and Figure 3C: F(1,41) = 2.57; p = 0.117] or condition x treatment interaction

[Figure 3A: F(1,38) = 3.45; p = 0.072 and Figure 3C: F(1,41) = 2.65; p = 0.112].

Duncan’s post hoc showed increase of %TAV for Cont-DZP, Str-Sal and Str-

DZP groups compared to Cont-Sal (Figure 3A), and increase of %TAV for Cont-

MIR, Str-MIR and Str-MIR compared to Cont-Sal (Figure 3C).

Regarding treatment with buspirone, two-way ANOVA revealed an

effect of treatment [F(1,40) = 14.87; p < 0.001], and a marginally significant

effects of condition [F(1,40) = 4.00; p = 0.053] and condition x treatment

interaction [F(1,40) = 3.45; p = 0.072]. Duncan’s post-hoc showed increased

%TAV in Cont-BUS, Str-Sal and Str-BUS groups compared to Cont-Sal.

Moreover, increased %TAV in Cont-BUS and Str-BUS compared to Str-Sal was

observed (Figure 3B).

Two-way ANOVA for the data with fluoxetine revealed condition x

treatment interaction [F(1,36) = 4.54; p = 0.041]. Duncan’s post-hoc test

showed increased %TAV only in Str-Sal group compared to Cont-Sal group

(Figure 3E).

38

Figure 2: Effects of treatment with (A) diazepam (2 mg/Kg), (b) buspirone (3 mg/kg), (C)

mirtazapine (10 mg/kg) and (D) fluoxetine (10 mg/kg) in control (Cont) mice or mice

submitted to acute restrain stress (Str) at the PMDAT. Data are expressed as mean ± SE

for time (s) spent in aversive enclosed arm (AV) compared to the non-aversive enclosed

arm (NAV) in the training (A, C, E, G) and test (B, D, F, H ) sessions. *p < 0.05; **p <

0.01; ***p 0.001 (paired-samples t test).

39

Figure 3: Effects of treatment with (A) diazepam (2 mg/Kg), (b) buspirone (3 mg/kg),

(C) mirtazapine (10 mg/kg) and (D) fluoxetine (10 mg/kg) in control (Cont) mice or mice

submitted to acute restrain stress (Str) of %TAV in test session at the PMDAT. Data are

expressed as mean ± SE. *p < 0.05 compared to Cont-Sal; #p < 0.05 compared to Str-

Sal (two-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc test).

3.2. Anxiety-like behavior

3.2.1. Percentage spent time in the open arms (%TOA)

In the training session, two-way ANOVA revealed an effect of the

treatment with diazepam [F(1,38) = 8.84; p = 0.005], but not of condition

[F(1,38) = 0.16; p = 0.684] or condition x treatment interaction [F(1,38) = 0.09; p

= 0.762]. Duncan’s post-hoc test showed an increase in %TOA of the Cont-DZP

group compared with Cont-Sal and Str-Sal groups (Table 2). Also, the analysis

of the experiment with mirtazapine revealed an effect of treatment [F (1,41) =

8.00; p = 0.007], but not of condition [F (1,41) = 0.76; p = 0.387] or condition x

treatment interaction [F (1,41) = 0.00; p = 0.928]. Duncan’s test showed a

decrease in %TOA of the Str-MIR group compared to Cont-Sal. No effects were

observed for this parameter in the experiments with buspirone or fluoxetine

(Table 2).

40

In the test session, no significant effects of treatment or condition

were found for %TOA, indicating the absence of anxiolytic effects by these

drugs (Table 2).

Table 2: Effects of acute treatment with diazepam (DZP 2 mg/kg), buspirone (BUS 3

mg/kg), mirtazapine (MIR 10 mg/kg) and fluoxetine (FLU10 mg/kg) in relation to %TOA in the plus-maze discriminative avoidance.

Traning Session Test Session

Diazepam

Cont-Sal 10.90 ± 3.17 14.86 ± 2.46

Cont-DZP 26.26 ± 3.26* 23.99 ± 4.80

Str-Sal 10.41 ± 1.82 25.36 ± 4.49

Str-DZP 22.90 ± 7.55 26.98 ± 4.66

Buspirone

Cont-Sal 28.55 ± 3.25 24.80 ± 2.57

Cont-BUS 21.95 ± 5.54 24.73 ± 4.96

Str-Sal 27.33 ± 4.18 15.90 ± 4.00

Str-BUS 20.08 ± 3.18 29.51 ± 3.64

Mirtazapine

Cont-Sal 34.07 ± 5.40 26.29 ± 4.02

Cont-MIR 19.42 ± 6.41 28.77 ± 3.97

Str-Sal 29.21 ± 4.24 22.1 ± 4.32

Str-MIR 15.48 ± 3.67# 25.79 ± 4.01

Fluoxetine

Cont-Sal 20.13 ± 6.79 29.54 ± 5.65

Cont-FLU 14.31 ± 3.26 35.08 ± 4.42

Str-Sal 15.46 ± 5.13 35.48 ± 5.24

Str-FLU 17.30 ± 5.28 39.23 ± 5.70

Data are expressed as Mean ± S.E.M. *p < 0.01 compared to Cont-Sal and Str-Sal; #p < 0.01 compared to Cont-Sal (two-way ANOVA followed by Duncan’s test).

3.2.2. Risk Assessment

Anxiety was also evaluate by the frequency of risk assessment

behaviors in the training session (Figure 4). Two-way ANOVA revealed

condition x DZP treatment interaction [F(1,38) = 4.98; p = 0.032] for PHD, and

Duncan’s test showed a decrease of the frequency of PHD to Str-DZP group

compared to Cont-DZP. Additionally, significant effects of treatment were also

observed for the UHD [F(1,38) = 10.06; p = 0.003], but not of condition [F(1,38)

= 2.47; p = 0.125] or condition x treatment interaction [F(1,38) = 3.27; p =

0.079]. Duncan’s post hoc showed increased frequency of UHD for Cont-DZP

group compared with the other groups. The analysis of SAP revealed effect of

the treatment [F(1,38) = 7.86; p = 0.008], but not of condition [F (1,38) = 0.06; p

= 0.795] or condition x treatment interaction [F (1,38) = 0.10; p = 0.748].

41

Duncan’s post hoc showed decreased frequency of SAP for Str-DZP group

compared to Cont-Sal and Str-Sal groups (Figure 4A).

A significant effect of treatment with buspirone was detected for PHD

[F(1,40) = 20.60; p < 0.001] and SAP [F(1,40) = 25.86; p < 0.001], but no effect

of condition [PHD, F(1,40) = 0.59; p = 0.447 and SAP, F(1,40) = 0.83; p =

0.368] or condition x treatment interaction [PHD, F(1,40) = 0.21; p = 0.645 and

SAP, [F(1,40) = 0.00; p = 0.965, respectively]. Displayed less PHD Cont-BUS

and Str-Bus groups compared to respective Sal-treated mice. In addition, there

was a decrease in the frequency of SAP in BUS compared to Sal-treated

goups. However, no significant effects of treatment were detected for UHD

(Figure 4B).

Two-way ANOVA revealed a treatment effect with mirtazapine for PHD,

UHD and SAP [F(1,41) = 15.07; p < 0.001, F(1,41) = 13.48; p = 0.001 and

F(1,41) = 18.20; p < 0.001, respectively], but not of condition [F(1,41) = 0.19; p

= 0.659, F(1,41) = 0.05, p = 0.820 and F(1,41) = 0.05, p = 0.820] or condition x

treatment interaction [F(1,41) = 0.62; p = 0.434, F(1,41) = 0.25; p = 0.616 and

F(1,41) = 0.20; p = 0.887, respectively]. Duncan’s post hoc showed decreased

frequency of PHD, UHD and SAP for Cont-MIR and Str-MIR groups compared

to Cont-Sal and Str-Sal (Figure 4C).

Two-way ANOVA did not reveal significant differences for risk

assessment parameters when data of the experiment with fluoxetine were

analyzed (Figure 4D).

42

Figure 4: Effects of treatment with (A) diazepam (2 mg/Kg), (b) buspirone (3 mg/kg), (C)

mirtazapine (10 mg/kg) and (D) fluoxetine (10 mg/kg) in control (Cont) mice or mice

submitted to acute restrain stress (Str) in the frequency of risk assessment behaviors

[protected head dipping (PHD), unprotected head dipping (UHD) and the

stretched attend postures (SAP)] in the training session at the PMDAT. Data are

expressed as Mean ± SE, *p < 0.001 compared to Cont-Sal and Str-Sal; **p = 0.00

compared to Cont-Sal and Str-Sal; #p < 0.05 compared to Cont-DZP; €p < 0.01compared

to Cont-Sal, Str-Sal and Str-DZP; $p < 0.01 compared to Cont-Sal and Str-Sal (two-way

ANOVA followed by Duncan’s post hoc test).

3.3. Locomotor activity

In the training session, two-way ANOVA revealed an interaction

between condition x treatment with diazepam [F(1,38) = 5.27; p = 0.002]. Post-

hoc analysis with Duncan’s test showed that non-stressed animals treated with

diazepam exhibited significantly greater locomotor activity compared to the

other groups (Table 3). Moreover, ANOVA revealed an effect of mirtazapine

treatment [F(1,41) = 19.54; p < 0.001], but not of condition [F(1,41) = 1.232; p =

0.274] or condition x treatment interaction [F(1,41) = 0.22; p = 0.637]. Post-hoc

analysis showed decreased locomotor activity of MIR-treated compared to Sal-

treated. Conversely, the analysis of locomotion data after treatment with

buspirone or fluoxetine did not reveal statical differences (Table 3).

43

In the test session, no significant effects of treatment or stress condition

were found for the total distance travelled in apparatus, indicating the absence

of effects on locomotor activity (Table 3).

Table 3: Effects of acute treatment with diazepam (DZP 2 mg/kg), buspirone (BUS 3 mg/kg), mirtazapine (MIR 10 mg/kg) and fluoxetine (FLU10 mg/kg) in relation to total distance travelled (m) in the plus-maze discriminative avoidance task.

Traning Session Test Session

Diazepam

Cont-Sal 10.81 ± 0.87 9.77 ± 2.27

Cont-DZP 20.00 ± 1.40* 14.89 ± 1.26

Str-Sal 10.60 ± 0.79 16.96 ± 5.14

Str-DZP 12.27 ± 2.55 15.85 ± 1.57

Buspirone

Cont-Sal 18.06 ± 1.21 13.79 ± 0.91

Cont-BUS 15.05 ± 3.15 14.26 ± 1.19

Str-Sal 16.66 ± 1.27 11.8 ± 1.43

Str-BUS 12.18 ± 1.64 14.01 ± 0.98

Mirtazapine

Cont-Sal 19.72 ± 1.98 15.84 ± 1.61

Cont-MIR 12.01 ± 2.18# 13.91 ± 1.79

Str-Sal 18.48 ± 1.90 14.86 ± 2.31

Str-MIR 8.90 ± 1.70# 13.37 ± 1.62

Fluoxetine

Cont-Sal 10.51 ± 1.64 12.13 ± 0.96

Cont-FLU 13.48 ± 1.27 16.17 ± 1.37

Str-Sal 11.80 ± 1.50 13.77 ± 1.44

Str-FLU 11.28 ± 1.40 14.13 ± 1.24

Data are expressed as Mean ± S.E.M. *p < 0.01 compared to Cont-Sal, Str-Sal and Str-DZP; #p < 0.001 compared to Cont-Sal and Str-Sal (two-way ANOVA followed by Duncan’s test).

4. Discussion

In this study, we evaluated the acute effect of antidepressant and

anxiolytic drugs on anxiety and learning/memory of male mice submitted or not

to acute restraint stress in the PMDAT (Silva & Frussa-Filho, 2000). This task

has been an effective model to simultaneously evaluate anxiety, learning and

memory, in addition to allowing evaluation of risk assessment (Calzavara et al.,

2004; Ribeiro et al., 2010; Munguba et al., 2011; Melo et al., 2012). In

summary, our results showed that (1) during the training session, animals

treated with BUS, MIR and FLU learned the task; however DZP group

demonstrated learning impairment (Figure 2); (2) DZP, BUS and MIR given

before training disrupted memory formation – reflected by the failure to

44

discriminate between the two enclosed arms in the test session, whereas FLU

did not interfere with the memory formation; (3) acute restraint stress impaired

task retrieval (Figure 2 and 3) and only the treatment with fluoxetine reverse this

impairment (Figure 2H and 3D); (4) DZP and BUS induced an anxiolytic effect –

reflected by increased percentage of time spent in the open arms and risk

assessment behaviors during training (Table 2), while FLU had no effects on

anxiety (Table 2 and Figure 4); (5) administration of DZP increased the

locomotor activity of the animals whereas MIR decreased exploration of the

apparatus (Table 3).

As mentioned, analysis of the enclosed arms exploration and the

percentage time spent in aversive arm in the training session provides

indication that anxiolytic drugs may disrupt learning and retrieval of the aversive

memory. Diazepam was, therefore, the only drug that impaired learning per se,

because irrespective of stress condition the groups that received this drug did

not show preference for the NAV arm in the training session. Furthermore,

these groups showed increased %TAV compared to Cont-Sal group, indicating

impairment of the aversive memory. Conversely, buspirone and mirtazapine did

not impair the learning of the task, but caused a deficit of retrieval, as suggested

by the fact that the animals treated with these drugs, whether stressed or not,

did not exhibit preference for the NAV compared to the AV arm. Mice

administered with fluoxetine, stressed or not, preferred NAV arm compared to

the AV arm in the training session and this preference was maintained in the

test session, showing that this drug affected neither learning nor retrieval, and

also reversed the deficits caused by acute restraint stress.

Diazepam is a benzodiazepine with action on GABAA receptors, which

are present in the amygdala and hippocampus, both involved in the formation of

memories (Fritschy & Mohler, 1995). While NMDA, beta-adrenergic and

muscarinic receptors stimulate and strengthen synaptic mechanisms, GABAA

receptors inhibit this process and down-regulate the formation of new memories

(Izquierdo et al., 1992; McGaugh & Izquierdo, 2000; Orzelska et al., 2013;

Joksimovic et al., 2013). Our results corroborates this idea, because the

administration of DZP disrupted learning of the task and, as a consequence, the

animals showed deficit in memory retrieval. Moreover, not only GABAergic

45

neurotransmission but also other neurotransmitters can modulate cognitive

processes as learning/memory. There is considerable evidence of the

involvement of noradrenaline in the improvement of memory formation when

administered intra-hippocampus (Izquierdo et al., 2000) and amygdala (Clayton

& Williams, 2000; Hatfield & McGaugh, 1999). Mirtazapine is an antidepressant

drug with noradrenergic and serotonergic actions, which is an alpha-2-

adrenergic receptor antagonist on presynaptic neurons, increasing the release

of both noradrenaline (NA) and serotonin (5-HT). Suggested that the

noradrenergic influence in the moment of learning would reflect a labile short-

term memory. After this learning, a release of additional noradrenaline would be

required, as a reinforcing mechanism for the memory to be consolidated and

stored in a long-term memory trace (Gibbs & Summers, 2002). Thereby, this

hypothesis could explain why animals treated with MIR could learn the task but

did retrieve it the aversive memory. It is possible that another stimulus or an

additional release of noradrenaline between the acquisition and consolidation

periods would be necessary to reinforce the mechanisms to consolidate

memory.

The role of serotonin in learning and memory has also been

investigated (Meneses & Perez-Garcia, 2007; Nitsche, 2011). There are

serotonergic projections to brain areas involved in memory, including the

hippocampus and cortex (Meneses & Perez-Garcia, 2007). Buspirone is a

serotonin 5-HT1A receptor partial agonist. 5-HT1A receptors are presynaptic

autoreceptors present in the raphe nuclei or postsynaptic receptors located in

the hippocampus, amygdala, and other areas of the cortico-limbic system, and

have a modulatory effect on learning and memory. Stimulation of the

autoreceptors decreases neuronal firing rate, and decreasing of 5-HT release in

projection areas (Meneses & Perez-Garcia, 2007). Administration of

serotonin 5-HT1A receptor partial agonists impairs retrieval of an aversive

memory when administered before training, but not in its acquisition. This

suggests that these drugs disrupt the processing of the aversive stimulus, but

not the reaction to it (Quarterrmain et al., 1993). Anterograde amnesia is also

described after activation of the 5-HT1A receptor (Quarterrnain et al., 1993;

46

Mendelson et al., 1993). In this context, our results corroborate the retrieval

deficit of the aversive task in groups administered with buspirone.

The selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI) fluoxetine increases

the availability of serotonin in the synaptic cleft (Hjorth & Auerbach, 1995). It

has been shown that serotonin reuptake inhibitors increase the expression of

fear memories (Ravinder at el., 2013), in addition to playing a fundamental role

in cognitive processes (Meneses et al., 2011; Tellez et al., 2010). For example,

pre- and post-training administration of fluoxetine improves memory acquisition

and consolidation in auditory fear conditioning and passive avoidance tasks in

rats (Ravinder et al., 2013; Meneses & Hong, 1995), in agreement with our

data. In our results, the previous administration of fluoxetine in mice did not

affect acquisition and retrieval and reversed the deficit caused by acute stress.

Regarding the effects of acute stress, it has been shown that a single

session of restraint stress increases corticosterone levels in rodents (Li et al.,

2012; Busnardo et al., 2013). Our results demonstrated that restraint stress did

not interfere with the learning of the task because all animals showed a

preference for the NAV compared to the AV arm in the training session (Figure

2). Notwithstanding, there was a disruption in the retrieval of the task. Indeed,

stressed animals showed increased %TAV when compared to saline-treated

animals, as well as a lack of preference for the NAV arm. Despite the acute

stress response being regarded as an adaptive mechanism, some key factors

can modulate the effects of stress on the formation of the new memories, such

as the levels of glucocorticoids, type or intensity of the stressor, the interval

between the stressor and learning, and the phase of the memory process

(acquisition, consolidation or retrieval) that the stressor is applied (McEwen &

Sapolsky, 1995; Kim et al., 2001). Diamond et al. (1992) showed that the

relationship between glucocorticoids concentrations in the hippocampus and

memory performance exhibit an inverted-U shaped curve, revealing improved

consolidation when the stressor is applied after the training session. Further, the

participation of the amygdala, which facilitates the processing of emotional

memories, is suggested. Conversely, previous studies showed that animals

submitted to acute stress before an aversive memory training do not display

learning impairment, but show disruption of memory retrieval (Smeets, 2011; de

47

Quervain et al., 1998; de Quervain et al., 2000). Rocher et al. (2004)

demonstrated that a single 30-minute long stressor inhibits synaptic plasticity in

the hippocampus-prefrontal cortex circuit of the rodent’s brain, suggesting that

probably the acute deleterious action of glucocorticoids in the hippocampus

interfere with long-term storage in this structure, but does not affect its role in

expressing memory formation (Conrad et al., 2009). Considering this hypothesis

and the fact that fluoxetine reversed the memory deficit caused by the acute

stressor, perhaps the increase the levels of serotonin, even sharply, was able to

surpass the negative effects of glucocorticoids. In line with this reasoning, other

studies demonstrated that fluoxetine reverses memory deficit caused by an

acute stressor in the object recognition task (Hage et al., 2004), suggesting that

this drug’s effect opposes the negative impact of stress on memory. Blockade of

deleterious effects of stress on memory also may result from the fact that

fluoxetine restores the synaptic plasticity previously inhibited by stress (Rocher

et al., 2004).

It has been reported that high doses of diazepam or buspirone promote

an exaggerated activation of the HPA axis with consequent increase in the

release of glucocorticoids (Vargas et al., 2001; Matheson et al., 1988; Nash &

Meltzer, 1991; Maes et al., 1996), while chronic administration of mirtazapine

and fluoxetine decrease the activation of this axis (Schule et al., 2006; Jazayeri

et al., 2010; Scharnholz et al., 2010; Piwowarska et al., 2012). However, the

interaction between anxiolytics and antidepressants in stressed animals in

modulating learning and memory is still contradictory and understudied.

Concerning anxiety-like behavior, studies have shown that anxiety can

interfere with the locomotor activity of the animals in the elevated plus-maze,

given that it modulates the motivation to explore the apparatus. Thus, an

increase or decrease in anxiety could lead to a decrease or increase,

respectively, in the locomotor activity (Pellow et al., 1985). Furthermore, it has

been shown that restraint stress promotes changes in locomotor activity and

anxiety when tested in the elevated plus-maze 24 or 48h after the restraint

session (Mendonça & Guimarães, 1998; Padovan et al., 2000; Padovan &

Guimarães, 2000; Busnardo et al., 2013), leading to decreased exploration of

the open arms. This indicates that a previous aversive situation (restraint) can

48

modify the behavior of the animal when it is exposed to a new aversive situation

(maze), reinforcing the aversive situation (Padovan et al., 2000; Padovan &

Guimarães, 2000). However, in the present study we did not observe alterations

in locomotor activity or in anxiety parameters in the groups Str-Sal (in all

experiments). The behavioral test was perfomed within 2 hours after the stress

session, indicating that a longer interval is probably necessary for these

alterations to emerge (Padovan & Guimarães, 2000). Moreover, these changes

vary according to the type and duration of the restraint stress session and also

to behavioral paradigm used (Padovan et al., 2000; Padovan & Guimarães,

2000; Chotiwat & Harris, 2006; Navarro-Francés & Arenas, 2014).

Studies evaluating systemic administration of benzodiazepines report

that, depending on the experimental settings, these drugs may exert a bimodal

effect on locomotor activity and that this effect can be influenced by emotional

reactivity, such as anxiety, or a possible habituation to the behavioral task

(Savic et al., 2006; Vlainic & Pericic, 2009). Furthermore, the modulation of

GABA neurotransmission can cause increase or decrease of risk assessment in

different experimental conditions (Sorregotti et al., 2013; Pellow, 1985), and this

effect can be reduced in stressed animals (Sun, 2013). In the present study,

Cont-DZP group exhibited increased locomotion in the training session, which

might have been related to anxiolitic effect of this drug, as evidenced by the

increased exploration of the open arms and increased UHD. Our results also

suggest that stress might have attenuated the anxiolytic effect of this drug,

since Str-DZP group showed no change in locomotor activity, or open arms

exploration, even though it also decreased PHD and SAP in the training

session.

Treatment with mirtazapine at 10 mg/kg is widely used in the literature

associated with different behavioral tasks, but there are no reports of changes

in locomotor activity, despite the evidence of anxiolytic effect (Kakui, et al.,

2009; Rogóz, 2010). However, Wezenberg et al. (2005), in a 7-day treatment of

volunteers, demonstrated a strong sedative effect of mirtazapine. In addition, a

previous study from our lab demonstrated that a 19-day treatment with MIR

decreased the locomotor activity of rats in the PMDAT, corroborating our

findings that MIR induced sedation, clearly evidenced by the decrease in

49

locomotor activity shown by Cont-MIR and Str-MIR groups. Corroborating this

effect, there was a decrease in the %TOA by Str-MIR group and a reduction of

all parameter settings of risk assessment by Cont-MIR and Str-MIR groups in

the training session. Probably due to this sedative effect, it is was not possible

to detect the anxiolytic action of this drug in this task. Beyond the action on

alpha-2-adrenergic receptors, mirtazapine also induces blockade of histamine-

H1 receptors (de Boer, 1996), a possible mechanism that explains the

hypolocomotion observed in our results. Despite this fact, it is clear that the

groups of animals treated with MIR prefered the NAV arm compared to the AV

arm during the training session, but not in the test session, suggesting that MIR

did not affect learning, but caused a deficit in the retrieval of the task.

Studies on the effects of buspirone also present controversial results

regarding the locomotor activity and anxiety in the plus-maze. Majercsik and

collaborators (2003) reported that a single administration of 6 mg/kg or 10

mg/kg of BUS, 30 minutes before the exposure to the maze, caused a decrease

in locomotor activity, %TOA and percent of risk assessment in rodents, while

the dose of 3 mg/kg, in the same protocol, did not alter locomotion or exertes

any effects on %TOA and risk assessment. On the other hand, Griebel and

collaborators (1997) reported that 1 mg/Kg, 30 minutes before exposure to the

maze, had no effect in %TOA, but decreased risk assessment. Thus, as noticed

in our data, it is evident that lower doses of BUS did not alter locomotor activity

but exerted an anxiolytic effect in rodents, even under stress, since the Cont-

BUS and Str-BUS groups showed no change in locomotor activity alteration bret

decreased the frequency of PHD and SAP. Our results showed that the groups

administered with BUS, irrespective of stress condition, learned the task, but did

not retriev the memory. Further, this deficit appeared to be larger than the deficit

caused by the restraint stress in this phase of memory.

Clinically, the anxiogenic effect of acute treatment with FLU is well

described. It is caused by the peak of extracellular serotonin (5-HT), which

inhibits the firing rate of serotonergic neurons, thus decreasing the

neurotransmitter content in synaptic cleft. Conversely, an anxiolytic effect is

obtained by its chronic administration, with normalization of the 5-HT levels,

underlying the therapeutic effects of this drug (Hjorth & Auerbach, 1995).

50

However, in the literature, the effects of acute and chronic administration of

fluoxetine on anxiety and on the locomotor activity are contradictory, possibly

due to the fact that most studies use healthy animals, besides the large range of

doses and animal models used. Thus, it has been reported that a chronic (22-

day) or acute administration of 5 mg/Kg fluoxetine increase anxiety and

decrease locomotor activity in the elevated plus-maze (Silva et al., 1999). On

the other hand, acute treatment with 10 mg/kg showed an anxiogenic effect of

FLU by decreasing %TOA and risk assessment, and also a hipolocomotor

effect in the elevated plus-maze. In that same protocol, chronic administration

for 15 days did not reveal alterations on anxiety or locomotor activity (Silva &

Brandão, 2000). Griebel and collaborators (1999) managed to find the

anxiogenic effect of the acute administration of FLU in the plus-maze only with

an interval of 24 hours after your administration. Thus, in our work, a 30 minute

interval would not be sufficient for this observation. It was also shown that the

effect of stress did not interfere with the anxiogenic effect of fluoxetine

described above (Robert et al., 2011). However, previous studies showed no

modification in locomotor activity and anxiety (Holmes & Rodgers, 2003; Melo et

al., 2012), corroborating our results.

In the test sessions of the experiments performed with all drugs, there

were no differences in locomotor activity or percentage of total time spent in the

open arms (% TOA). These results are probably related to the absence of

stressor and the pharmacological effect, as administration of drugs and stress

were applied only before the training session. In addition, there was probably

the habituation caused by the second exposure to the apparatus, which

decreases motivation to explore (File & Zangrossi, 1993; Holmes & Rodgers

1998; Rodgers & Shepherd, 1993).

5. Conclusions

The results confirm the learning deficit and anxiolytic effect of DZP,

widely reported in the literature, can still be seen in stressed animals. Except for

FLU, all drugs used induced retrieval deficits. Under our experimental

conditions, acute restraint stress impaired retrieval of the aversive task, without

51

any effects on locomotor activity and anxiety in the PMDAT. Only the acute

administration of fluoxetine was able to reverse this deficit, which may suggest

a modulatory role of serotonin on the process of consolidation of an aversive

memory. In general, despite some experimental manipulations have caused

alterations in anxiety and locomotor parameters, these effects did not interfere

with the evaluation of learning and memory.

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4. CONCLUSÃO GERAL:

Em conclusão, os resultados do presente estudo evidenciaram os

efeitos ansiolíticos dos fármacos diazepam e buspirona em baixas doses. Além

disso, o diazepam promoveu um efeito deletério na aquisição de uma nova

memória aversiva. Relatamos o efeito sedativo da mirtazapina na dose

escolhida para camundongos, o que não prejudicou a avaliação da

aprendizagem e memória desse fármaco. Ademais, um único evento de

estresse por contenção antes do treino, não interferiu na aprendizagem da

tarefa, mas prejudicou sua evocação, demonstrando possivelmente uma

influência do estresse na consolidação da memória. E, principalmente a

administração aguda de fluoxetina, depois do estresse e antes do treino,

reverteu o prejuízo de memória aversiva causado pelo estresse, sugerindo que

uma alteração nos níveis de serotonina mesmo que agudamente pode

influenciar o processo de consolidação de uma memória aversiva. Entretanto,

outros experimentos são necessários a fim de confirmar essa hipótese.

60

5. PERSPECTIVAS:

Avaliar a resposta fisiológica ao estresse e aos tratamentos com os

fármacos pela dosagem do hormônio corticosterona no plasma.

61

6. REFERÊNCIAS GERAIS:

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70

7. ANEXO:

Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN