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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOECOLOGIA AQUÁTICA

AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE FLORAÇÕES NATURAIS E DE CULTURA DE CIANOBACTÉRIAS: EFEITOS SOBRE

Ceriodaphnia silvestrii (CRUSTACEA, CLADOCERA)

JUSKA MILENA DOS SANTOS MENDONÇA

ORIENTAÇÃO: Profa. Dra. IVANEIDE ALVES SOARES DA COSTA

NATAL/RN2006






Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Oceanografia e Limnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Bioecologia Aquática.

NATAL/RN2006






Esta dissertação, apresenta pela aluna Juska Milena dos Santos Mendonça ao Programa de Pós-graduação em Bioecologia Aquática do Departamento de Oceanografia e Limnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foi julgada adequada e aprovada pelos Membros da Banca Examinadora, na sua redação final, para a conclusão do Curso e à obtenção do título de Mestre.

___________________________________________________Profa. Dra. Ivaneide Alves Soares da Costa (Orientadora)

___________________________________________________Profa. Dra. Sandra Maria Feliciano de Oliveira Azevedo (UFRJ)

___________________________________________________Profa. Dra. Eneida Eskinazi Sant’ana (DOL/UFRN)

Natal, 30 de julho de 2006.

IV

Ao meu filho, Itzzac Guilherme, a mais perfeita realização da minha vida.

VAGRADECIMENTOS

Á todos aqueles que me ajudaram a crescer...

À Profa. Dra. Ivaneide Alves Soares Costa pela orientação e paciência;

Aos Professores da Banca da Qualificação, Prof. Dr. Guilherme Fulgêncio e Profa. Dra. Renata Panosso, pelas valiosas sugestões;

Aos Professores da Banca de Defesa, Profa. Dra. Sandra Maria F. O. Azevedo e Profa. Dra. Eneida Eskinazi Sant’anna;

À Profa. Dra. Magnólia Fernandes Florência Araújo do LETMA pelo apoio;

Ao Pessoal do Curso de Pós-Graduação em Bioecologia Aquática do Departamento de Oceanografia e Limnologia da UFRN;

A Profa. Sandra Amaral e ao Biólogo Tacíscio Bruno Sampaio, do Biotério da Universidade Potiguar – UNP;

A Profa. Dra. Silvia do Departamento de Genética e Biologia Celular, e ao Prof. Dr. Luiz Dias do Departamento de Bioquímica pelo uso dos laboratórios;

Aos colegas do LETMA, Amanda, Sheila, Layse, Marquele, Cirleide, Elinez, Wanessa, Cristina, Janderson, Gustavo, Fabrício;

Aos meus pais, Jairo e Francisca, alicerces da minha vida;

Jaisa, Tia Leila, Flavinha, Ia e a todo restante da família, muito obrigada mesmo;

E especialmente ao meu marido Jean Túlio e meu filhote Itzzac Guilherme, juntos são a maior alegria de minha vida.

A FAPERN e CNPq pela concessão dos recursos financeiros.

OBRIGADA!!!

VISUMÁRIO

RESUMO ...............................................................................................................IXABSTRACT............................................................................................................X1. INTRODUÇÃO .................................................................................................1

1.1 Cianobactérias e Cianotoxinas....................................................................11.2 Impacto de florações de cianobactérias nos ecossistemas aquáticos...........................................................................................................41.3 Testes ecotoxicológicos como Instrumento de Avaliação de Cianotoxinas......................................................................................................7

2. OBJETIVOS......................................................................................................93. ÁREA DE ESTUDO.........................................................................................104. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................13

4.1 Procedimento de amostragens..................................................................134.2 Identificação e quantificação de cianobactérias....................................... 14 4.3 Isolamento e cultivo de cianobactérias..................................................... 14 4.4 Preparação do extrato cru de cianobactérias ...........................................164.5 Bioensaios com camundongos..................................................................164.6 Organismo – teste.....................................................................................16 4.7 Cultivo dos Cladóceros............................................................................. 17

4.8 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii ..................................................18 4.9 Análise Estatística ....................................................................................20

5. RESULTADOS ...............................................................................................21 ARTIGO 1: Efeito de florações naturais hepatotóxicas e de culturas neurotóxicas de cianobactérias sobre Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea,Cladocera).......................................................................................................22Resumo...........................................................................................................23Introdução........................................................................................................24Materiais e Métodos .......................................................................................26Resultados.......................................................................................................30 Discussão........................................................................................................37Conclusão........................................................................................................43Referências......................................................................................................44 ARTIGO 2: Identificação e Toxicidade de Cepas de Cianobactérias Isoladas de Ambientes Aquáticos do Rio Grande do Norte...........................................51Resumo...........................................................................................................52Introdução........................................................................................................53Materiais e Métodos........................................................................................54Resultados e Discussão..................................................................................56 Referências.....................................................................................................59

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 617. ANEXOS..........................................................................................................74

LISTAGEM DE FIGURAS VII

FIGURA 01 – Localização geográfica do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves e Gargalheiras no Rio Grande do Norte.............................................11

FIGURA 02 – Imagem fotográfica do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves/RN.......................................................................................................12.FIGURA 03 - Imagem fotográfica do Reservatório Gargalheiras/RN...................12

FIGURA 04 - Desenho esquemático das técnicas de isolamento de cianobactérias. .....................................................................................................15

FIGURA 05 - Aspecto do cladócero Ceriodaphnia silvestrii ................................17

FIGURA 06 – Desenho esquemático para obtenção dos C. silvestriineonatos...............................................................................................................18

FIGURA 07 – Desenho experimental com C. silvestrii.........................................19

ARTIGO 1

FIGURA 1 – Controle da sensibilidade de C. silvestrii para a substância de referência NaCl.....................................................................................................32

FIGURA 2 - Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de cianobactérias do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves em julho de 2004..................................................................................................................... 35

FIGURA 3 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de cianobactérias do Reservatório Gargalheiras em março de 2005....................... 35

FIGURA 4 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de cianobactérias da Reservatório Gargalheiras em outubro de 2005..................... 36

FIGURA 5 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com cultura monoespecífica neurotóxica de C. raciborskii (ITEP 018) produtora de saxitoxina..................................................................... 36

ARTIGO 2

PRANCHA 1 – Cepas de Cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Anabaenopsis sp, Planktothrix agardhii, Cylindrospermopsis raciborskiiGeitlerinema unigranulatum .................................................................................64

PRANCHA 2 - Cepas de Cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Microcystispanniformis e Chroococcus sp. ...........................................................................65

VIIILISTAGEM DE TABELAS

ARTIGO 1

TABELA 1 – Parâmetros de qualidade da água monitorados durante as coletas nos Reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras (GARG)...................................................................................30

TABELA 2 – Densidade de cianobactérias e espécies dominantes nas amostras dos reservatórios .........................................................................31

TABELA 3 - Estimativa da CL50-24h e CL50-48h (intervalo de confiança 95%) de C. silvestrii expostos ao extrato cru de florações e culturas de cianobactérias .............................................................................................34

TABELA 4 - Resultados comparativos entre bioensaios com camundongos, quantificação MC-LR mol/g, e as respectivas LC50-24h e LC50-48h (µg.L-1), para as amostras de florações naturais e cepas cultivadas.........................41

ARTIGO 2

TABELA 1 – Caracterização das cepas de cianobactérias mantidas no Banco de Cultura no LETMA/UFRN.............................................................59

IXRESUMO

Incidência de florações tóxicas de cianobactérias é uma das conseqüências da eutrofização nos ecossistemas aquáticos, sendo comum a sua ocorrência em reservatórios e viveiros de cultivo de camarão no Estado Rio Grande do Norte. Cianobactérias podem produzir toxinas que podem afetar organismos aquáticos e o homem através da cadeia alimentar. Visando contribuir com o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos de cianobactérias no RN, nos propomos avaliar a toxicidade de cianobactérias isoladas de ambientes de águas doces e verificar o efeito de cultura e florações naturais ocorridas em reservatórios para abastecimento humano, no crustáceo cladócero Ceriodaphnia silvestrii. Oestudo foi conduzido com amostras de florações naturais ocorridas em março e outubro de 2004 na Barragem Gargalheiras (08º L e 39º W), em julho de 2004 na Barragem Armando Ribeiro Gonçalves (06o S e 37o W) e em fazendas comerciais de cultivo de camarão (Litopenaeus vannamei), localizadas em ambientes de água doce do RN (6o 58’ S e 38o 36’

W). As amostras de florações foram coletadas com rede de plâncton (20µm) para identificação, isolamento e obtenção de biomassa fitoplanctônica para liofilização e posterior determinação da toxicidade por bioensaios. A toxicidade das amostras de culturas e florações naturais foi investigada através de bioensaios em camundongos Swiss. A quantificação das cianobactérias foi realizada pelo método de Ütermol, utlizando-se amostras (300mL) fixadas com lugol. O teste de toxicidade com Ceriodaphnia silvestrii seguiu as recomendações da ABNT (2001) e foram realizadas com amostras de florações naturais hepatotóxicas e culturas de C. raciborskii neurotóxica e não tóxica. No teste, cinco neonatos com idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes concentrações (0 a 800 mg.L-1) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48 horas. Três replicatas por tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH, a temperatura e o oxigênio dissolvido no início, com 24 e com 48 horas do teste. Através do método Trimmed Spearman-Karber foi estimado a CL50. As florações eram mistas e compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii,produtoras de microcistina- LR, confirmada através de análise por HPLC. Amostras de florações hepatotóxicas registraram potencial toxinogênico para o C. silvestrii, com valores de CL50-24h de 47.48 mg.L-1 e CL50-48h de 38.15 mg.L-1 para a amostra de GARG mar/05; CL50-24h de 113,13 mg.L-1 e CL50-48h de 88,24 mg.L-1 para ARG jul/04; CL50-24h de 300.39 mg.L-1 e CL50-48h de 149.89 mg.L-1 para GARG 10/05. Para as amostras de cultura valores de CL50-24h e CL50-48h para a cepa tóxica de C. raciborskii foram de 228.05 e 120.28 mg.L-1, respectivamente. Não houve mortalidade dos C. silvestrii nos testes com a cepa de C. raciborskii não-tóxica. O teste de toxicidade com C. silvestrii apresentou um bom grau de sensibilidade às cianotoxinas. A toxicidade das amostras de florações naturais hepatotóxicas (microcistinas) e culturas neurotóxicas produtoras de saxitoxinas verificadas neste estudo fornece forte indicativos da influência dessas toxinas sobre a estrutura da comunidade zooplanctônica em ambientes aquáticos tropicais. Foram isoladas 11 cepas de cianobactérias de reservatórios e viveiros do Estado, representadas por 6 espécies:Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis panniformis, Geitlerinema unigranulatum e Planktothrix agardhii. Nenhuma cepa apresentou toxicidade em camundongos Swiss. As cepas foram catalogadas e depositadas no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos (LETMA) da UFRN e serão utilizadas em estudos ecotoxicológicos e ecofisiológicos visando esclarecer as causas e controle de florações de cianobactérias nos ambientes aquáticos do Estado. Os reservatórios do Rio Grande do Norte devem merecer maior atenção perante os órgãos responsáveis, tendo em vista os constantes florescimentos tóxicos de cianobactérias em águas utilizadas para consumo humano.

XABSTRACT

The incidence of toxic cyanobacterial blooms is one of the important consequences of eutrophication in aquatic ecosystems. It is a very common phenomenon in reservoirs and shrimp ponds in the State of Rio Grande do Norte (RN), Brazil. Cyanobacterias produce toxins which can affect aquatic organisms and men trough the food chain. Aiming to contribute to the studies of cyanobacterias in RN, we propose: a) to evaluate the toxicity of isolated cyanobacterias in important fresh-water environments; and b) to verify the effects of both natural and cultured blooms occurred in reservoirs for human supply and in the cladoceran Ceriodaphnia silvestrii. This study was carried out using samples of natural blooms occurred between March and October of 2004 in Gargalheiras Dam (08º L e 39º W), in July of 2004 in Armando Ribeiro Gonçalves Dam (06o S e 37o W) and in commercial shrimp ponds (Litopenaeus vannamei) located in fresh-water environments. The samples were collected with plankton net (20µm.) for identification, isolation and obtaining of phytoplanktonic biomass for liophilization and later toxicity bioassays. The toxicity of cultured samples and natural blooms was investigated through bioassays in Swiss mice. Quantification of cyanobacteria in samples was conducted following the Ütermol method, with 300mL samples fixed with lugol. The toxicity test with Ceriodaphnia silvestrii followed ABNT, 2001 recommendations, and were accomplished with natural hepatotoxic bloom’s samples and cultured samples of both non-toxic and neurotoxic C. raciborskii. In this test, five newborns, aged between 6 and 24 hours, were exposed to different concentrations (0 a 800 mg.L-1) of crude cyanobacterial extracts during 24 and 48 hours. Three replicates were used per treatment. The pH, temperature and dissolved oxygen – at the beginning and after 24 and 48hours from the test – were measured. We estimated the CL50 through the Trimmed Spearman-Karber method. The blooms were constituted by Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii and Planktothrix agardhii, producers of mycrocistin-LR confirmed with HPLC analysis. Samples of hepatotoxic blooms registered toxinogenic potential for C. silvestrii, with CL50-24h value of 47.48 mg.L-1 and CL50-48h of 38.15 mg.L-1 for GARG samples in march/2005; CL50-24h of 113,13 mg.L-1 and CL50-48h of 88,24 mg.L-1 for ARG July/2004; CL50-24h of 300.39 mg.L-1 and CL50-48h of 149.89 mg.L-1 for GARG October/2005. For cultured samples, values of CL50-24h and CL50-48h for C. raciborskii toxic strains were 228.05 and 120.28 mg.L-1, respectively. There was no mortality of C. silvestrii during the tests with non-toxic C. raciborskii strain. The toxicity test with C. silvestrii presented good sensitivity degree to cyanotoxins. The toxicity of natural hepatotoxic blooms samples (microcystins) and cultured neurotoxic saxitoxins producer samples analyzed in this study give us strong indications of that toxin’s influence on the zooplanktonic community structure in tropical aquatic environments. Eleven cyanobacteria strains were isolated, representing 6 species: Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis panniformis, Geitlerinema unigranulatum ePlanktothrix agardhii. None presented toxicity in Swiss mice. The strains were catalogued and deposited in the Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos (LETMA), in UFRN, and will be utilized in ecotoxicológical and ecophysiological studies, aiming to clarify the causes and control of cyanobacterial blooms in aquatic environments in RN. This state’s reservoirs must receive broader attention from the authorities, considering the constant blooms occurring in waters used for human consumption.

MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii

1. INTRODUÇÃO

1.1 Cianobactérias e Cianotoxinas

As Cianobactérias são microrganismos procarióticos popularmente

conhecidos como algas azuis, devido a sua capacidade de produção de um

pigmento acessório, a ficocianina. Também possuem a clorofila-a, um pigmento

fotossintético existente nas algas e vegetais. Recentes estudos comparativos da

constituição genética das cianobactérias mostram significantes contribuições

para a revisão de sua taxonomia (MUR et al., 1999).

Estes microrganismos fotossintéticos são pioneiros da vida na Terra.

Fósseis do que certamente são hoje as cianobactérias foram encontrados em

rochas sedimentares da Austrália, datados de cerca de 3,5 bilhões de anos.

Foram provavelmente os primeiros seres a realizarem produção da matéria

orgânica e liberar oxigênio elementar na atmosfera primitiva (SCHOPF, 1996).

A morfologia das cianobactérias é bastante variada, podendo ser

encontrada como forma unicelular, colonial e filamentos. Suas células

apresentam-se esféricas, cúbicas, ovóides, cilíndricas, sem forma definida,

formando filamentos simples ou com ramificações e colônias com diferentes

arranjos. Podem apresentar células vegetativas diferenciadas, como os

heterócitos (com função de fixação do nitrogênio) e os acinetos (funcionam como

esporos de resistência e estoca substância de reserva).

As cianobactérias são organismos cosmopolitas amplamente adaptados

e muito tolerantes a ambientes extremos (BROCK, 1972). Muitas espécies são

capazes de sobreviver em solos ou outros habitats terrestres, interagindo nos

processos funcionais do ecossistema e no ciclo de nutrientes (WHITTON, 1992).

No entanto, as cianobactérias habitam vastamente os ecossistemas aquáticos,

principalmente os ambientes de água doce, que propiciam condições ideais para

o seu desenvolvimento como águas neutro-alcalinas (pH 6-9), temperaturas entre

15 a 30°C e altas concentrações de nutrientes, principalmente de fósforo e

nitrogênio (AZEVEDO, 1998).

Sendo componente natural do fitoplâncton, estes organismos têm

importância na produção primária e fixação de nitrogênio para todo elo da cadeia

1


alimentar aquática e terrestre (RAI, 1990). Algumas cianobactérias possuem

altos níveis protéicos, vitaminas e outros nutrientes ideais na formulação de

rações para animais domésticos e de engorda (BOROWITZKA & BOROWITZKA,

1988) e são também de interesse farmacêutico por suas propriedades

antibióticas, antitumorais, antivirais e antifúngicas (FALCH et al., 1995).

Todavia, algumas espécies de cianobactérias são conhecidas por

produzirem diferentes metabólitos secundários, incluindo substâncias tóxicas

conhecidas como cianotoxinas. De acordo com o mecanismo de ação quando em

contato com mamíferos, as cianotoxinas podem ser classificadas como

hepatotoxinas, neurotoxinas e dermatoxinas (CODD et al., 1999; SILVONEN &

JONES, 1999).

As principais hepatotoxinas são peptídeos cíclicos da família das

nodularinas e das microcistinas, e também alcalóides hepatotóxicos da família

das cilindrospermopsinas. A microcistina-LR é uma das variantes mais estudadas

de microcistinas. São amplamente distribuídas e produzidas por espécies de

Microcystis spp, Anabaena, Oscillatoria (Planktothrix), Nostoc, e Anabaenopsis

(DAWSON, 1998).

Uma toxina com ação e estrutura similar às microcistinas é característica

da espécie Nodularia spumigena, assim chamada de nodularina. Essas

hepatotoxinas agem desorganizando a arquitetura citoesquelética dos

hepatócitos de mamíferos, ocasionando danos no fígado e extravasamento do

sangue, levando à morte em horas ou em poucos dias (CARMICHAEL, 1994). Os

principais sintomas observados em mamíferos contaminados com esses tipos de

toxinas são contrações abdominais, hemorragia hepática, diarréia e palidez nas

extremidades corpóreas (KUIPER-GOODMAN et al., 1999). A hepatotoxina

cilindrospermopsina, produzida principalmente por Cylindrospermopsis

raciborskii, Aphanizomenon ovasliporum e Umezakia natans pode induzir danos

no fígado dos mamíferos, mas também nos rins, baço, timo e coração

(SILVONEN & JONES, 1999).

As neurotoxinas são toxinas alcalóides, pertencentes a três famílias: as

anatoxinas-a, anatoxinas-a(S) e saxitoxinas. Esses tipos de cianotoxinas são

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potentes bloqueadores de transmissão neuromuscular pós-sináptico de

receptores nicotínicos e colinérgicos, ou inibidor da condução nervosa por

bloqueamento dos canais de sódio nos mamíferos (CHORUS & BARTRAN,

1999). Sua ação é mais rápida que as hepatotoxinas, podendo ocorrer morte de

poucos minutos a poucas horas, com sintomas de desequilíbrio, fasciculação

muscular, respiração ofegante, convulsões, taquicardia e intensa salivação. As

neurotoxinas são produzidas principalmente pelos gêneros de cianobactéria

Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis (SILVONEN &

JONES, 1999). Saxitoxinas têm sido detectadas em Cylindrospermopsis

raciborskii nas águas do Brasil e suas concentrações comparáveis às

encontradas em Anabaena circinalis (LAGOS et al., 1998).

As dermatoxinas são produzidas por cianobactérias do gênero Lyngbya,

Oscillatoria e Schizothrix, capazes de causar dermatite aguda com inflamação

cutânea, bolhas, descamações e também inflamações gastrointestinais

(SILVONEN & JONES, 1999).

Ainda não há claras evidências das causas da produção dessas toxinas

pelas cianobactérias, mas é senso que tais compostos estejam relacionados com

a defesa natural contra a predação pelo zooplâncton, fato igualmente verificado

por plantas terrestres contra a predação de insetos (KIRK & GILBERT, 1992). A

produção e a regulação de cianotoxinas por espécies individuais de

cianobactérias podem ser afetadas por fatores ambientais tais como temperatura,

luminosidade, quantidade de nutrientes e pH, e, apesar de serem ainda pouco

entendidos, fatores genéticos também são atribuídos (SILVONEN & JONES,

1999).

3


1.2 Impactos de florações de cianobactérias nos ecossistemas aquáticos

O crescimento populacional e da produção agrícola e industrial, traz

conseqüências negativas para os corpos hídricos, que têm se tornado cada vez

mais eutrofizados devido, principalmente, aos lançamentos de esgotos

domésticos in natura, efluentes líquidos industriais ricos em nutrientes,

carreamento de fertilizantes utilizados na lavoura e dejetos oriundos da criação

de animais domésticos nas proximidades dos cursos hídricos (BELL & CODD,

1994).

Em resposta ao processo de eutrofização, a comunidade fitoplanctônica

apresenta redução na diversidade de espécies e um aumento considerável da

biomassa de espécies dominantes e, conseqüente desenvolvimento de florações

de cianobactérias. Estes organismos exercem efeitos variados sobre o

zooplâncton que podem ser de natureza inibitória ou toxicológica. Modificações

na estrutura e abundância do fitoplâncton reflete conseqüentes mudanças na

comunidade zooplanctônica (ROLLAND et al., 2005).

Está bem documentado na literatura que as novas condições

estabelecidas na água pela eutrofização, como elevadas turbidez e temperaturas

e baixa luminosidade, até mais do que pelas altas concentrações de nutrientes,

favorecem a dominância de cianobactérias em ambientes limnéticos (SCHEFFER

et al., 1997). Tais condições proporcionam vantagens competitivas para as

cianobactérias, favorecendo a dominância por espécies que formam grandes

colônias e filamentos, como é o caso de muitos reservatórios do Rio Grande do

Norte (COSTA et al., 2006a). A resposta do zooplâncton à presença de

cianobactérias varia com o tamanho do herbívoro, capacidade de ingerir

filamentos e colônias, grau de inibição alimentar (EPP, 1996, HIETALA et al,

1996). O zooplâncton tropical é formado predominantemente de espécies com

pequena escala (microcrustáceos e rotíferos), que exercem maior força de

predação sobre fitoplâncton de pequeno tamanho, favorecendo ainda mais a

dominância de cianobactérias filamentosas e coloniais. Pequenos cladóceros,

rotíferos e copépodos são menos afetados pelas cianobactérias do que

cladóceros de grande porte (SMITH & GILBERT, 1995). De fato, ESKINAZI-

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SANT’ANA et al. (2005) observaram que em reservatórios eutrofizados no Rio

Grande do Norte com freqüentes florações mistas de cianobactérias compostas

por grandes colônias e filamentos, a comunidade zooplanctônica é bem

representada por cladóceros e rotíferos. Em eventos de floração, ocorre aumento

considerável na abundância de rotíferos coloniais (>90%). Agregados de colônias

e filamentos de cianobactérias são ainda impalatáveis para a maioria dos

herbívoros planctônicos (GLIWICZ, 1980), o que favorece a redução ou

eliminação de outros grupos do fitoplâncton mais vulneráveis à pressão de

herbivoria (SOMMER et al., 1986). É comum encontrar em corpos d’água

eutrofizados, principalmente próximos aos centros urbanos, dominância de

espécies de cianobactérias em florações com diferenças sazonais e espaciais de

toxicidade, provavelmente decorrentes de mudanças na proporção de cepas

tóxicas e não tóxicas na população (AZEVEDO et al., 1994).

As cianotoxinas também exercem influências negativas nos organismos

aquáticos, seja através da redução ou eliminação de espécies ou pela

bioacumulação de toxinas (ENGSTRÖM-ÖST et al., 2002; FERRÃO-FILHO et al.,

2000 e 2003). Florações de cianobactérias produtoras de toxinas têm causado

intoxicação e morte de organismos aquáticos e outros animais que utilizam a

água como fonte de alimentação. (CARMICHAEL, 1992; MAIN et al., 1977;

VASCONCELOS et al., 2001). Vários autores mostram que cianobactérias

tóxicas tem efeitos adversos nas comunidades zooplanctônica e nos demais

níveis tróficos, devido à letalidade e/ou diminuição da sua taxa de crescimento e

de reprodução. (LAMPERT, 1982; VASCONCELOS, 1991; 1993; 1999;

CHRISTOFFERSEN, 1996; TRABEAU et al., 2004). Efeitos de extratos de

cianobactérias em camundongos, embriões e ovos de peixes e anfíbios,

invertebrados, microalgas, macrófitas e plantas superiores têm também sido

investigados (FASTNER et al., 1995; OBEREMM et al., 1999; PIETSCH et al.,

2001; MARSÁLEK & BLÁHA, 2004; SAVENAS et al., 2006).

É uma preocupação marcante a possibilidade de bioacumulação e

transferências de cianotoxinas através da ingestão de animais, como peixes e

moluscos, que se alimentaram continuamente de cianobactérias acumulando as

toxinas em seus tecidos, oferecendo sérios riscos à saúde humana.

5


(FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994; MAGALHÃES et al., 2001). A

bioacumulação de cianotoxinas nos tecidos e órgãos de animais aquáticos,

principalmente em peixes, moluscos e zooplâncton, tem sido estudada por

Tencala et al. (1994), Amorim & Vasconcelos (1999), Magalhães et al. (2003). No

Brasil, a bioacumilação de microcistinas já foi evidenciada no zooplâncton

(FERRÃO et al., 2000) e em peixes e crustáceos (MAGALHÃES et al., 2001 e

2003).

Intoxicação de populações humanas pelo consumo de água contaminada

por cianotoxinas já foi descrita em muitos países como Austrália, China, África do

Sul e Inglaterra (FALCONER et al., 1994). O primeiro caso confirmado de mortes

humanas causadas por uma toxina produzida por cianobactérias foi em

Caruaru/Pernambuco/Brasil (JOCHIMSEN et al., 1998; CHAMICHAEL et al.,

2001; AZEVEDO et al., 2002) onde 116 (89%) de 131 pacientes que se

submeteram a um tratamento rotineiro de diálise renal, apresentaram distúrbios

visuais, náuseas, vômitos e fraqueza muscular, sintomas chamados de

“Síndrome de Caruaru”, e destes, 52 vieram à óbito por causa confirmada de

cianotoxinas existentes na água usada no tratamento. Além disso, há evidências

que populações abastecidas por reservatórios que apresentam extensas

florações podem estar expostas a baixos níveis de toxinas por longo período

(CARMICHAEL, 1994), levando a uma maior incidência de câncer hepático

nessa população (YU, 1995; FLEMING et al., 2002).

A presença de cianotoxinas em águas para consumo humano implica em

sérios riscos à saúde pública e por isso é importante o monitoramento ambiental

da densidade de cianobactérias e dos níveis de cianotoxinas nas águas. A

Portaria nº 518/2004, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2005), estabelece como

padrões para potabilidade de água, 1 µg/L para microcistinas, recomendando os

valores de 3 µg/L para saxitoxinas (STX), e 15 µg/L para cilindrospermopsina.

Diversos relatos de florações tóxicas de cianobactérias são registrados

nos diferentes continentes. No Brasil, já foram descritos eventos de florações

tóxicas de cianobactérias em corpos d’água dos Estados de São Paulo, Rio de

Janeiro, Minas Gerais, Pará, Paraná, Bahia, Pernambuco e do Distrito Federal

(AZEVEDO, 1998). No entanto, é sensato se conhecer que essa informação não

6


reflete a ocorrência de cepas tóxicas de cianobactérias apenas nesses Estados,

mas sim uma maior representação de estudos sobre esse tema concentrados na

região centro-sul do Brasil.

A Região Nordeste do Brasil é caracterizado por intensos períodos de

seca e, por isso, é comum a construção de barragens ou “açudes”, como são

popularmente conhecidas, para estocar a água nesses períodos, a qual é

utilizada para fins de consumo humano, irrigação, aqüicultura e pecuária.

Incidências de florações tóxicas de cianobactérias nestes ambientes têm sido

relatadas por Porfirio et al. (1999), Lazzaro et al. (2003), Bouvy et al. (2000) e

Costa et al. (2006). Em reservatórios do Rio Grande do Norte, há registros

freqüentes de florações de cianobactérias tóxicas (COSTA, 2003; COSTA et al.,

2003a, 2003b; COSTA et al., 2006), representando riscos potenciais à população

norte-riograndense.

1.3 Testes Ecotoxicológicos como Instrumento de Avaliação de Cianotoxinas

Testes toxicológicos são considerados uma das metodologias mais

apropriadas para se estimar os efeitos tóxicos de contaminantes sobre os

organismos aquáticos. Nos estudos de avaliação, controle e monitoramento da

qualidade de ambientes aquáticos são, em geral, aplicados juntamente com

análises físico-químicas da água e levantamentos de espécie bioindicadoras da

qualidade da água.

A metodologia utilizada na ecotoxicologia avalia as concentrações de

substâncias tóxicas e o período de exposição necessário para produzir um efeito

deletério, a nível agudo ou crônico, em organismos sensíveis a esses agentes,

revelando o risco potencial resultante da descarga de efluentes domésticos e

industriais, e também o efeito de derrames acidentais de produtos tóxicos no

ambiente aquático (RAND & PETROCELLI, 1985). O uso dos testes

ecotoxicológicos para avaliar o efeito de florações tóxicas em organismos

aquáticos também vem sendo empregado nos últimos anos (SOTERO-SANTOS

et al., 2005; MONTAGNOLLI et al., 2004; PÉREZ-LINARES et al., 2002).

7


A estimativa dos impactos causados por agentes tóxicos sobre a

comunidade biológica exige o uso de testes seguros e sensíveis, que utilizem

espécies nativas ecologicamente importantes para as áreas impactadas. Como

existe uma variação na tolerância das espécies e na resposta mais sensível, para

poder se avaliar corretamente a toxicidade, são necessários testes que utilizem

espécies pertencentes a grupos filogeneticamente diferentes (ANDERSON et al.,

1988).

O efeito das cianotoxinas tem sido avaliado em diversos organismos-

alvos, tais como insetos, copépodos, tanaidáceos, artêmias, lagostins, peixes e

camarão (SMITH, 1996; BEST et al., 2000; METCALF et al., 2002;

MONTAGNOLLI et al., 2004; CHEN & XIE, 2005; PÉREZ-LINARES et al., 2002).

Espécies zooplanctônicas, especialmente os cladóceros também têm sido

largamente estudados para avaliar a toxicidade de cianobactérias (SOTERO-

SANTOS et al., 2005; FERRÃO-FILHO et al., 2000, FERRÃO-FILHO&

AZEVEDO, 2003; ROHRLACK, et al., 2001; NOGUEIRA et al., 2004; GUO & XIE,

2005). Impactos negativos em cladóceros podem indicar efeitos adversos em

outros elos da cadeia trófica, assim como demonstrar o poder tóxico das

florações de cianobactérias.

Espécies zooplanctônicas são consideradas de extrema importância

dentro da comunidade aquática, por representar um elo de passagem de fluxo de

matéria e energia dos produtores primários aos consumidores do topo da cadeia

alimentar (ABRANTES & GONÇALVES, 2003). Cladóceros (Crustácea) são

constituintes comuns da comunidade zooplanctônica de ambientes de água

doce, logo, é de grande interesse o estudo do comportamento dos cladóceros na

presença de cianotoxinas. Algumas espécies de cladóceras, mais

especificamente o Ceriodaphnia silvestrii, são normatizadas por entidades

ambientais brasileiras para testes ecotoxicológicos (CETESB, 1991; ABNT,

2003), por se apresentarem como organismos sensíveis a substâncias tóxicas.

8


2. OBJETIVOS

Visando contribuir com o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos de

cianobactérias no RN, nos propomos avaliar a toxicidade de cianobactérias isoladas

de importantes ambientes de águas doces e verificar o efeito de células em

condições de cultivo moespecífico e florações naturais ocorridas em reservatórios

para abastecimento humano, no crustáceo cladócero Ceriodaphnia silvestrii, através

dos seguintes objetivos específicos:

Identificar e quantificar cianobactérias em florações ocorridas em

reservatórios e viveiros do Rio Grande do Norte;

Isolar, identificar e cultivar cepas de cianobactérias;

Testar a toxicidade de florações e das cepas isoladas, através de

bioensaios em camundongos;

Avaliar o efeito de microcistinas de florações naturais e de saxitoxinas

produzidas por cultura de Cylindrospermopsis raciborskii (cepa ITEP 018)

sobre o microcrustáceo C. silvestrii;

Avaliar o efeito de culturas de C. raciborskii não produtora de cianotoxinas

sobre o microcrustáceo C. silvestrii.

9


3. ÁREA DE ESTUDO

O estudo foi conduzido em importantes reservatórios e fazendas comerciais

de cultivo de camarão (Litopenaeus vannamei), localizados em ambientes de água

doce do Estado do Rio Grande do Norte (6o 58’ S e 38o 36’ W). Os viveiros de

camarão investigados neste estudo captam e despejam a água de cultivo em dois

rios do estado - o rio Ceára-Mirim e o rio Piranhas-Assu, os quais exercem influência

nos estuários do Potengi (Natal/RN) e Cavalos (Pendênicas/RN). Apesar de sua

grande relevância ecológica e sócio-econômica, os ecossistemas aquáticos do

Estado encontram-se ameaçados por atividades da agroindústria e pela aqüicultura,

as quais têm grande importância econômica na região.

O Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves (06o S e 37o W) e o

Reservatório Marechal Dutral (08º L e 39º W), mais conhecido como Gargalheiras,

localizam-se na bacia hidrográfica Piranhas-Assu, inserida na meso-região Centro-

oeste do Estado do Rio Grande do Norte/Brasil (figura 01). Esta bacia é localizada

no semi-árido potiguar e têm grande importância econômica para o estado do Rio

Grande do Norte. Totaliza 17.498,50 km² de superfície entre os estados do Rio

Grande do Norte e da Paraíba. No Estado do Rio Grande do Norte, a bacia do Rio

Piranhas-Assu corresponde a cerca de 30% do território estadual, abrangendo 33

municípios e uma população de aproximadamente 415.000 habitantes (SERHID/RN,

2000). A região é caracterizada por apresentar irregularidade e escassez de chuvas,

alcançando precipitações pouco superiores a 100 mm durante os meses de janeiro a

abril. Esta região também é caracterizada por elevadas taxas de evaporação e

evapotranspiração decorrentes dos elevados coeficientes térmicos locais.

10


Lagoa Do Piató

Macau

RioPira

nhas

-Ass

u

Gargalheiras

Passagem dasTraíras

Sabugi

Armando RibeiroGonçalves

Boqueirão de Parelhas

Itans

Figura 01 – Localização geográfica do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves e Gargalheiras no Rio Grande do Norte. Fonte: LEGEA/UFRN.

Representando o maior e mais importante reservatório do Estado, o

Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves (figura 02) possui

profundidade máxima de 40m e uma capacidade volumétrica de 2,4 x 109 m3, o que

corresponde à cerca de 50% de toda a água acumulada nas bacias do Estado.

Abastece uma população de 400 mil habitantes distribuídos em 20 municípios e

mais de 90 comunidades rurais (IDEMA, 2004). As águas deste reservatório

destinam-se ao abastecimento humano e ao sustento de importantes atividades

econômicas da região, como a irrigação de fruticulturas, pesca e aqüicultura, além

de ser uma área recreativa para a população local.

11


A Barragem Marechal Dutra, mais conhecida como Gargalheiras (figura 03),

possui uma capacidade volumétrica máxima de 4,0 x 107 m3 (IDEMA, 2004). O

reservatório é utilizado para abastecimento público de dois importantes municípios

da região do Seridó (Currais Novos e Acari), além de ser destinado a cultura de

vazantes, irrigação, atividades pesqueiras e também área recreativa para a

população.

Figura 02 – Imagem fotográfica do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves/RN.

Figura 03 – Imagem fotográfica do Reservatório Gargalheiras/RN.

12


Embora não haja registros sobre as fontes pontuais de poluição da bacia

hidrográfica desses reservatórios, suspeita-se de diversas fontes difusas de

contaminação. São típicos os atos de lançamento ao rio Piranhas-Assu de despejos

orgânicos domésticos, industriais e esgotos em geral. A maioria das cidades que

circunvizinham a bacia do rio Piranhas-Assu, se caracteriza por possuir saneamento

básico insatisfatório, atributo comum em cidades pouco desenvolvidas, o que

contribui para a poluição ao transportarem diretamente para a água, o componente

fecal e urinário e os resíduos de detergentes sintéticos. As águas que retornam dos

sistemas de irrigação ou que escoam superficialmente dos solos agricultados da

região, são ricas em poluentes como pesticidas (principalmente o DDT), herbicidas,

fertilizantes (especialmente nitrogênio e fósforo), produtos químicos complexos e

substâncias tóxicas.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Procedimento de amostragens

Amostras de florações de cianobactérias foram coletadas com rede de

plâncton (20µm) no Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves/RN

(ARG) no mês de julho de 2004, e na Barragem de Gargalheiras (GARG), nos

meses de março e outubro de 2005. As amostras dos viveiros foram coletadas

em abril, julho e agosto de 2005. O material fitoplanctônico concentrado em rede

foi liofilizado e congelado a - 20OC.

Nas amostragens de florações, também foram medidos in situ a temperatura,

oxigênio dissolvido, pH e condutividade, através uma sonda multiparâmetros

HORIBA (US-22). A transparência da água foi medida através do disco de

Secchi. Análise de fósforo total foi realizada de acordo com a metodologia de

Valderrama (1995) e a clorofila-a foi extraída com etanol e determinada por

fluorimetria, de acordo com Marker (1980) e Jespersen & Christoffersen (1988).

13


4.2 Identificação e quantificação de cianobactérias

As espécies de cianobactérias foram identificadas utilizando o sistema de

Komárek & Anagnostidis (1998) para o gênero Chroococcales, Komárek &

Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek & Anagnostidis (1989)

para as Nostocales.

Para a quantificação, amostras (300ml) foram fixadas com lugol acético e

quantificadas pelo método de Ütermol (1958) em microscópia invertida. As

amostras eram contadas após, no mínimo 3 horas de sedimentação, para cada

centímetro de altura da câmara (MARGALEF, 1983). Os indivíduos (células,

colônias e filamentos) foram enumerados em campos aleatórios como proposto

por Uhelinger (1964), sendo o erro menor que 20%, a um coeficiente de

confiança de 95% (LUND et al., 1958). Espécies componentes de outros grupos

do fitoplâncton foram contabilizadas a fim de se estabelecer proporções de

dominância entre cianobactérias e demais populações fitoplanctônicas.

4.3 Isolamento e cultivo de cianobactérias

Para obtenção das culturas monoespecíficas de cianobactérias foi usada a

técnica de isolamento com o uso de pipetas de ponta capilar, do tipo Pasteur,

para separação de uma única célula ou colônia, observando-se através de um

microscópio óptico 400X (ROSOWSKI, 1973). Em complementação foram

também usadas as técnicas de semeadura em meio sólido e em meio líquido

(PRINGSHEIM, 1951; GUILARD, 1995).

14


Figura 04 – Desenho esquemático das técnicas de isolamento de cianobactérias. Amostra ambiental (A); plaqueamento em meio sólido (B); diluição em meio líquido (C); isolamento com micropipetas de Pateur (D).

Após identificadas, as cepas isoladas foram catalogadas pelas iniciais

maiúsculas da sigla do Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos

Aquáticos (LETMA), seguidas por um número de acordo com a ordem de

isolamento. Também foram feitas fichas individuais indicando o local de coleta,

nome do responsável pelo isolamento e as características morfológicas e

toxicológicas das cepas.

As cepas de cianobactérias isoladas foram cultivadas em meio ASM-1

(GORHAM et al., 1964), sob condições de temperatura média de 25°C,

ilumnidadas com 2 lâmpadas fluorescentes, fotoperíodo de 12h e mantidas no

Banco de Cultivo do Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos

Aquáticos (LETMA) da UFRN, para obtenção de biomassa.

As cepas tóxicas e não tóxicas de Cylindrospermopsis raciborskii utilizadas no

experimento com C. silvestrii (item 4.8) foram gentilmente cedidas pelo Prf. Dr.

Renato Molica da Universidade Federal Rural de Pernambuco, e também

cultivadas em meio ASM-1.

Todo o material utilizado foi esterilizado em autoclave para se evitar a

contaminação por bactérias e outros microrganismos. As culturas eram repicadas

a cada 20 dias aproximadamente. Todos os repiques e retiradas de amostras das

culturas eram realizados em capela de fluxo laminar estéril.

15


4.4 Preparação do extrato bruto de cianobactérias

O material liofilizado foi dissolvido em água destilada e agitado por 01 hora

em um agitador magnético. Em seguida, foi congelado e descongelado

repetidamente por 03 ciclos e sonicado. Finalmente, o sobrenadante foi retirado,

após centrifugação a 4.500 rpm por 20 minutos.

4.5 Bioensaios com camundongos

Foram realizados bioensaios em camundongos Swiss (machos e com peso

corpóreo variando de 15 a 20 gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1

mL do extrato bruto de cianobactérias. A inoculação do material foi feito em 3

animais. Os conseqüentes sintomas e o tempo de morte foram anotados e o

peso do fígado de cada animal foi verificado logo após a morte (FALCONER

1993). A classificação da toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).

4.6 Organismo – teste

Para o teste de toxicidade utilizamos o microcrustáceo zooplanctônico

tropical, Ceriodaphinia silvestrii, Daday, 1902 pertencente à família Daphniidae

(figura 05). Esta espécie mede de 0.8mm a 0.9mm de comprimento. As principais

características que definem essa espécie são carapaça arredondada, cabeça

anteriormente arredondada, olhos grandes preenchendo quase toda parte

anterior da cabeça, antênula muito curta e inchada medianamente (EL MOOR-

LOUREIRO, 1997). Habitam águas limnéticas e os fortes movimentos produzidos

pelas antenas, causam movimentos de saltos, que constituem o principal meio de

locomoção. Grande parte da população desses cladóceros é constituída apenas

por fêmeas partenogênica, porém, modificações ambientais desfavoráveis

induzem a produção de alguns ovos partenogênicos que originam machos e

fêmeas sexuais. Alimentam-se por filtração do fitoplâncton, bactérias e detritos

orgânicos, podendo ser esta, uma importante via de entrada de toxinas no

organismo.

16


A escolha dessa espécie como organismo-teste para o presente trabalho, foi

devido ao fácil cultivo em laboratório, possuir curto ciclo de vida com rápida

reprodução e ser normatizado pela Associação de Normas Técnicas Brasileiras,

ABNT. Além disso, o gênero Ceriodaphnia está representado nas águas do Rio

Grande do Norte, relacionando-se com as cianobactérias encontradas nos

reservatórios em estudo (ESKINAZI-SANT’ANA, 2005).

Figura 05 - Aspecto do cladócero Ceriodaphnia silvestrii (Fonte:SANTOS, 2004).

4.7 Cultivo dos Cladóceros

Uma cultura da espécie tropical Ceriodaphnia silvestrii foi gentilmente cedida

pela Profa. Dra. Odete Rocha da Universidade Federal de São Carlos/SP e

mantida no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos

(LETMA) da UFRN. A espécie foi cultivada em Beckers de vidro sob condições

de temperatura média de 25ºC, fotoperíodo de 12h, com água filtrada em filtro de

0,45µm e autoclavada à 1atm por 20 min, oriunda de uma lagoa natural que

estava apresentando na ocasião das coletas, grau de dureza média de 24 mg.L-1

CaCO3 (CAERN, 2006). Para cada lote de água usado no cultivo, foi feito teste

de viabilidade colocando-se 10 organismos neonatos na nova água, observando-

17


se a sua sobrevivência. A água do cultivo foi renovada uma vez por semana,

sendo os organismos transferidos com pipeta de Pasteur de ponta arredondada.

Os cladóceros foram alimentados diariamente com suspensão da alga

Selenastrum capricornatum, as quais foram cultivadas em meio ASM-1.

4.8 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii

Para avaliar a sensibilidade do lote dos organismos usados para o teste

definitivo, foram feitos séries de 15 testes com a substância tóxica de referência

Cloreto de Sódio (NaCl) nas concentrações 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 e 2.2 g.mL-1. Os

procedimentos são idênticos aos descritos no experimento definitivo. Os lotes

dos organismos-testes só foram validados quando os resultados das CE50-24h

dos testes de referência permaneceram numa faixa ideal de sensibilidade (0,70 e

1,09 g.mL-1 ).

Os testes foram realizados com neonatos de C. silvestrii com idade de no

mínimo 6h e no máximo 24h, conforme Norma da ABNT (2003).

Um dia antes do início de cada teste, um lote de fêmeas ovígeras de C.

silvestrii, era separado das culturas utilizando-se pipeta com bordas

arredondadas, colocadas em um recipiente de vidro limpo com água de cultivo e

alimentados com Selenastrum capricornatum. Após 18h, os neonatos eram

separados das fêmeas e aguardava-se mais 6h para serem usados nos testes,

garantindo com esse procedimento o uso de filhotes com idade de no mínimo 6h

e no máximo 24h (figura 06).

Figura 06 – Desenho esquemático para obtenção dos C. silvestrii neonatos

18


Os testes foram realizados em tubos de ensaios de 10mL (figura 07),

utilizando tréplicas por tratamento. Os organismos não eram alimentados nem foi

fornecido suplemento alimentar durante os experimentos. As concentrações do

extrato de cianobactérias utilizadas nos testes foram definidas através de testes

preliminares. Para as amostras dos reservatórios Barragem Engenheiro Armando

Ribeiro Gonçalves de julho de 2004 e Barragem de Gargalheiras de outubro de

2005, e para as culturas de C. raciborskii tóxica (ITEP 018) e não tóxica, os

testes definitivos foram realizados em concentrações de 0 (Grupo-Controle), 25

(A), 50 (B), 100 (C), 200 (D), 300 (E), 400 (F), 600 (G) e 800 (H) mg.L-1. Apenas

para a amostra de Gargalheiras de março de 2005, foi necessário diminuir as

concentrações do extrato bruto utilizado nos testes preliminares, devido a sua

alta toxicidade. Sendo assim, para os testes definitivos, as concentrações

estabelecidas foram 0 (Grupo-Controle), 8 (A), 16,5 (B), 25 (C), 33,5 (D), 41,5 (E)

e 50 (F) mg.L-1. Após 24 e 48h, foi contada a taxa de sobrevivência para cada

tréplica. Aqueles organismos que não eram capazes de realizar nenhum

movimento natatório dentro de um intervalo de 15 segundos, após agitação

suave do tubo, eram considerados imóveis.

No grupo controle o pH, temperatura e o oxigênio dissolvido foram medidos

no início, com 24h e com 48h de experimento e o desvio padrão foi calculado.

Nos grupos testes (A a H), as medidas foram tomadas no início, com 24h para as

concentrações com 100% de mortalidade, e com 48h de experimento para todos

os grupos.

Figura 07 – Desenho experimental com C. silvestrii

19


4.9 Análise Estatística

Os dados dos testes de toxicidade com C. silvestrii foram analisados para se

estimar a concentração letal que causa letalidade (imobilidade) a 50% dos

organismos (CL50) em 24h e 48h e seu intervalo de confiança, através do método

estatístico Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON et al, 1977). Os testes foram

considerados válidos quando a mortalidade dos organismos no controle não

excedeu 10%.

20


5. RESULTADOS

Artigo 1 - EFEITO DE FLORAÇÕES NATURAIS HEPATOTÓXICAS E DE

CEPAS NEUROTÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii SOBRE

Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea, Cladocera) – Página 22.

Artigo 2 - IDENTIFICAÇÃO E TOXICIDADE DE CEPAS DE

CIANOBACTÉRIAS ISOLADAS DE AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO

GRANDE DO NORTE – Página 49.

21


EFEITO DE FLORAÇÕES NATURAIS HEPATOTÓXICAS E

DE CEPAS NEUROTÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii SOBRE

Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea, Cladocera)

Juska Milena dos Santos Mendonça¹, Ivaneide Alves Soares da Costa², Amanda

Palhares dos Santos², Layse Aranha Marinho², Marquele Cardoso Martins².

(ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO)

______________________________ ¹Departamento de Oceanografia e Limnologia, Centro de Biociências, Universidade Federal dos Rio Grande do Norte. Via Costeira, s/n – Mãe Luíza, CEP – Natal/RN. [email protected]

²Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, Universidade Federal dos Rio Grande do Norte. BR -Lagoa Nova, CEP – Natal/RN. [email protected]

22


RESUMO

Incidências de florações tóxicas de cianobactérias vêm sendo observadas em

reservatórios de água para abastecimento humano no Estado do Rio Grande do

Norte, Brasil. Amostras de florações naturais hepatotóxicas ocorridas em março e

outubro de 2004 na Barragem Gargalheiras (08º L e 39º W), e em julho de 2004 na

Barragem Armando Ribeiro Gonçalves (06o S e 37o W), juntamente com amostras de

cepas de Cylindrospermopsis raciborski neurotóxica produtora de saxitoxinas e não

tóxica foram testadas em Ceriodaphnia silvestrii, de acordo com norma da ABNT

(2001). Cinco neonatos com idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes

concentrações (0-800 mg.L-1) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48

horas. Três replicatas por tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH,

temperatura e oxigênio dissolvido no início, com 24 e 48 horas do teste. Através do

método Trimmed Spearman-Karber foi estimado a CL50. As florações eram mistas e

compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis,

Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii, registrando potencial

toxigênico para o C. silvestrii, com valores de CL50-24h de 47.48 mg.L-1 e CL50-48h

de 38.15 mg.L-1 para a amostra de GARG mar/05; CL50-24h de 113,13 mg.L-1 e

CL50-48h de 88,24 mg.L-1 para ARG jul/04; CL50-24h de 300.39 mg.L-1 e CL50-48h

de 149.89 mg.L-1 para GARG 10/05. Valores de CL50-24h e CL50-48h para a cepa

tóxica de C. raciborskii foram de 228.05 e 120.28 mg.L-1, respectivamente. A

toxicidade das amostras também foi confirmada por análise de HPLC. Não houve

letalidade dos C. silvestrii nos testes com a cepa de C. raciborskii não-tóxica. Ficou

demonstrado que a espécie C. silvestrii apresenta alto grau de sensibilidade às

cianotoxinas.

23


1. INTRODUÇÃO

Florações de cianobactérias freqüentemente observadas em ambientes

estuarinos e lacrustes têm sido registradas em várias partes do mundo (SCOTT,

1991; VASCONCELOS, 1994; VASCONCELOS, 1999; FLEMING et al., 2002). As

causas das florações de cianobactérias são motivos de estudos, onde muitos

casos relatados denunciam a adição de nutrientes pelas atividades humanas,

tornando as águas propícias a tais florações (CARMICHAEL, 2001).

No Brasil, tem sido comum a ocorrência de florações de cianobactérias em

reservatórios próximos aos centros urbanos, devido ao rápido processo de

urbanização e ao crescimento da agroindústria (AZEVEDO et al., 1994; AZEVEDO,

1998), onde os gêneros mais comuns de cianobactérias encontrados em águas

doce eutrofizadas são Microcystis, Anabaena, Anabaenopsis, e

Cylindrospermopsis (DOMINGOS et al., 1999; SANT’ANNA et al., 2004).

A Região Nordeste do Brasil é caracterizada por intensos períodos de

seca e por isso é comum a construção de barragens para estocar a água, a qual é

utilizada para fins de consumo humano, irrigação, aqüicultura e pecuária.

Incidências de florações tóxicas de cianobactérias são comuns nestes ambientes e

também têm sido freqüentemente relatadas (BOUVY et al., 2004; COSTA et al.,

2006; PORFIRIO et al., 1999; LAZZARO et al., 2003).

No Rio Grande do Norte, florações de cianobactérias tóxicas já foram

observadas em importantes reservatórios como as Barragens Engenheiro

Armando Ribeiro Gonçalves, Gargalheiras, Passagem das Traíras, Itãns, Poço

Branco e Trairí (COSTA, 1999; COSTA et al., 2003; COSTA et al., 2006;

MORALES, 2003).

Florações de cianobactérias produtoras de cianotoxinas, em particular,

hepatoxinas e neurotoxinas, têm causado intoxicação e morte de organismos

aquáticos e outros animais que utilizam a água como fonte de alimentação

(VASCONCELOS et al., 2001; CARMICHAEL, 1992). O tipo mais frequente de

intoxicação é ocasionado por hepatotoxinas, principalmente microcistina, que é

amplamente distribuída e produzida principalmente pela Microcystis aeruginosa, e

também por outras espécies de Microcystis e outros gêneros como Anabaena,

24


Oscillatoria e Nostoc (DAWSON, 1998). Outro tipo de cianotoxina freqüentemente

produzida em florações é a saxitoxina neurotóxica, que dentre as várias espécies

produtoras, tem sido detectada em Cylindrospermopsis raciborskii em ambientes

aquáticos brasileiros (LAGOS et al., 1998; MOLICA et al., 2002).

Vários autores mostram que cianobactérias tóxicas têm efeitos adversos

nas comunidades zooplanctônica, acarretando a morte e/ou diminuição da taxa de

crescimento e de reprodução (VASCONCELOS, 1991; VASCONCELOS, 1999;

PORTER e McDOUGH, 1998; CHRISTOFFERSEN, 1996), e nos demais elos da

cadeia trófica, devido à possibilidade de bioacumulação e transferências das

cianotoxinas através da cadeia alimentar, podendo chegar ao homem, oferecendo

sérios riscos à saúde da população (FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994).

Os efeitos tóxicos de florações de cianobactérias sobre organismos

aquáticos têm sido estudados por vários autores em diversas partes do mundo

(FALCONER, 2001; HAWKINS et al., 1997; VASCONCELOS, 1999). Muitos

organismos têm sido usados como organismos-testes para avaliar o efeito das

cianotoxinas, tais como insetos, camarões, copépodos, tanaidáceos, artêmias,

lagostins, peixes e outros (DeMOTT et al., 1991; MONTAGNOLLI et al., 2004;

METCALF et al., 2002; PÉREZ-LINARES et al., 2002; BEST et al., 2000; CHEN &

XIE, 2005).

Testes de ecotoxicidade podem ser eficientes instrumentos de avaliação

da qualidade de água e/ou sedimento. Algumas espécies de Cladocera

(Crustacea) são normatizadas por instituições oficiais (CETESB, 1991; ABNT,

2003) para testes ecotoxicológicos. Ceriodaphinia silvestrii, Daday, 1902

(Cladocera, Crustacea), é um microcrustáceo zooplanctônico tropical, com

ocorrência nas águas de lagos e de reservatórios brasileiros (FONSECA, 1998). O

gênero Ceriodaphnia é de ocorrência comum nos reservatórios do Rio Grande do

Norte (ESKINAZI-SANT’ANNA et al., 2005). Impactos nesses cladóceros podem

indicar efeitos adversos em todos os outros elos da cadeia trófica.

Em vista da importância de conhecer os impactos que as cianotoxinas

causam nos organismos aquáticos, o presente trabalho tem como propósito avaliar

a sensibilidade de Ceriodaphnia silvestrii a florações hepatotóxicas de

25


cianobactérias, ocorridas em reservatórios de água do Estado do Rio Grande do

Norte e de cepas neurotóxicas e não tóxicas de Cilyndrospermopsis raciborskii.

2.0 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Área de estudo e procedimentos amostrais

As coletas foram realizadas em dois importantes reservatórios utilizados para

abastecimento público, nos quais desenvolvem freqüentes florações tóxicas de

cinobactérias, situados no estado do Rio Grande do Norte, região tropical semi-

árida do Brasil. São os reservatórios denominados Barragem Engenheiro

Armando Ribeiro Gonçalves (06o S e 37o W) com capacidade total de

armazenamento de 2.400.000.000 m3 de água, e o Barragem Marechal Dutra

(08º L e 39º W), também chamado Gargalheiras, com capacidade para

armazenar 40.000.000 m3 de água.

Amostras de florações de cianobactérias foram coletadas com rede de

plâncton (20 m) em julho de 2004 e em março e outubro de 2005. O material

fitoplanctônico concentrado foi liofilizado e congelado a -20OC.

Também foram medidos parâmetros de qualidade da água “in situ” tais como

temperatura, oxigênio dissolvido, pH e condutividade utilizando-se uma sonda

multiparâmetros HORIBA (U-22). A transparência da água foi medida através do

disco de Secchi. Análise de fósforo total foi realizada de acordo com a

metodologia de Valderrama (1995) e a clorofila-a foi extraída com etanol e

determinada por fluorimetria, de acordo com Marker (1980) e Jespersen &

Christoffersen (1998).

26


2.2 Identificação e quantificação de cianobactérias

As espécies de cianobactérias foram identificadas utilizando o sistema de

Komárek & Anagnostidis (1998) para o gênero Chroococcales, Komárek &

Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek & Anagnostidis (1989)

para as Nostocales. Para a quantificação, amostras (300ml) foram fixadas com

lugol acético e quantificadas pelo método de Ütermol (1958) em microscópia

invertida.

2.3 Cultivo de cepas isoladas

Uma cultura monoespecífica de Cylindrospermopsis raciborskii neurotóxica

produtora de saxitoxina (ITEP 018) e outra não tóxica, foram gentilmente cedidas

pelo Prf. Dr. Renato Molica da Universidade Federal Rural de Pernambuco. As

culturas foram cultivadas em meio ASM-1 (GORHAM et al., 1964) e mantidas sob

condições de temperatura média de 25°C, iluminadas com 2 lâmpadas

fluorescentes, fotoperíodo de 12h, no Banco de Cultivo do Laboratório de

Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA) da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

2.4 Preparação do extrato bruto de cianobactérias

A biomassa fitoplanctônica foi liofilizada, dissolvida em água destilada e

agitada por 01 hora em um agitador magnético. Em seguida, foi congelada e

descongelada repetidamente por 03 ciclos e sonicada. Finalmente, o

sobrenadante foi retirado, após centrifugação a 4.500 rpm por 20 minutos.


Foram realizados bioensaios em camundongos Swiss (machos e com peso

corpóreo variando de 15 a 20 gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1

mL do extrato bruto de cianobactérias. A inoculação do material foi feito em 3

27


animais. Os conseqüentes sintomas e o tempo de morte foram anotados e o

peso do fígado de cada animal foi verificado logo após a morte (FALCONER

1993). A classificação da toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).

2.6 Cultivo dos Cladóceros

Uma cultura da espécie tropical Ceriodaphnia silvestrii foi gentilmente cedida

pela Profa. Dra. Odete Rocha da Universidade Federal de São Carlos/SP e

mantida no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos

(LETMA) da UFRN. As espécies foram cultivadas em Beckers de vidro sob

condições de temperatura média de 25ºC, fotoperíodo de 12h com água filtrada

em filtro de fibra de vidro de 0,45µm e autoclavada à 1atm por 20min, oriunda de

uma lagoa natural que estava apresentando na ocasião dos testes, grau de

dureza média de 24 mg/L CaCO3 (CAERN, 2006). Para cada lote de água usado

no cultivo, teste de viabilidade foi feito, colocando-se 10 organismos neonatos na

nova água, observando-se a sua sobrevivência. A água do cultivo foi renovada

uma vez por semana, sendo os organismos transferidos com pipeta de Pasteur

de ponta arredondada. Os cladóceros foram alimentados diariamente com

suspensão da alga Selenastrum capricornatum, que foram cultivadas em meio

ASM-1.

2.7 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii

Os testes foram realizados com neonatos de C. silvestrii com idade de no

mínimo 6h e no máximo 24h, conforme Norma da ABNT (2003). Tréplicas de

tubos de ensaios de 10 mL contendo 5 neonatos cada, foram utilizados por

tratamento. Os organismos foram expostos sem alimentos ou suplemento

alimentar.

Para avaliar a sensibilidade do lote dos organismos usados para o teste

definitivo, foram feitos séries de 15 testes com a substância tóxica de referência

Cloreto de Sódio (NaCl) nas concentrações 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 e 2.2 g.mL-1. Os

28


lotes dos organismos-testes só foram validados quando os testes de referência

permaneceram na faixa ideal de sensibilidade.

As concentrações do extrato bruto de cianobactérias utilizadas nos testes

foram definidas previamente através de testes preliminares. Para as amostras do

ambiente Barragem Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves de julho de 2004 e

Barragem de Gargalheiras de outubro de 2005, e para as culturas neurotóxica

(ITEP 018) e não tóxica de Cylindrospermopsis raciborskii, os testes foram

realizados em concentrações de 0 (Grupo-Controle), 25 (A), 50 (B), 100 (C), 200

(D), 300 (E), 400 (F), 600 (G) e 800 (H) mg.L-1. Para a amostra de Gargalheiras

de março de 2005, as concentrações estabelecidas foram 0 (Grupo-Controle), 8

(A), 16,5 (B), 25 (C), 33,5 (D), 41,5 (E) e 50 (F) mg.L-1.

Após 24 e 48h, foi contada a taxa de imobilidade para cada tréplica. Aqueles

organismos que não eram capazes de realizar nenhum movimento natatório

dentro de um intervalo de 15 segundos após agitação suave do tubo, eram

considerados imóveis.

No grupo controle, o pH, temperatura e o oxigênio dissolvido foram medidos

no início, com 24h e com 48h de experimento e o desvio padrão foi calculado.

Nos grupos testes (A a H), as medidas foram tomadas no início e no final do

experimento.

2.8 Análise Estatística

Os dados foram analisados para se estimar a concentração letal que causa

letalidade a 50% dos organismos (CL50) em 24h e 48h e seu intervalo de

confiança, através do método estatístico Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON

et al., 1977). Os testes foram considerados válidos quando a imobilidade dos

organismos no controle não excedeu 10%.

29


3. RESULTADOS

3.1 Qualidade da água dos Reservatórios

Os reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras (GARG)

apresentaram alto grau de eutrofização de acordo com as concentrações de

clorofila-a (38,2 a 321,0 .L-1), fósforo total (69,9 a 133,0 .L-1) e da transparência

da água (0,45 a 0,50 m), conforme tabela 01.

Tabela 1 – Parâmetros de qualidade da água monitorados durante as coletas nos reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras (GARG).

Local DataClorofila-a

( .L-1)

Fósforo Total ( .L-1)

Secchi(m)

pHCondutividade

elétrica( S.cm-1)

OD(mg.L-1)

Temperatura(°C)

ARG jul/04 321,0 133,0 0,50 9,4 277,0 14,0 32,0GARG mar/05 44,7 69,9 0,47 8,8 819,6 7,3 29,8GARG out/05 38,2 103,9 0,45 8,4 897,2 8,4 27,0(OD= oxigênio dissolvido)

3.2 Identificação e quantificação das cianobactérias

As florações de cianobactérias eram mistas e compostas pelas espécies

Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis

raciborskii e Planktothrix agardhii em elevadas densidades, variando de 106 a 109

cel.mL-1 (Tabela 2). As cianobactérias representaram mais de 90% da

comunidade fitoplanctônica.

30


Tabela 2 – Densidade de cianobactérias e espécies dominantes nas amostras dos reservatórios.

Local Data Cianobactérias (Cel. mL-1)

Espécies dominantes

ARG jul/04 1091a- Microcystis panniformis 2ª- Microcystis aeruginosa3ª- Anabaena circinalis

GARG mar/05107

1ª- Cylindrospermopsis raciborskii 2ª- Microcystis panniformis 3ª- Microcystis aeruginosa4ª- Planktothrix agardhii

GARG out/05106

1ª- Cylindrospermopsins raciborskii 2ª- Microcystis aeruginosa3ª- Microcystis panniformis4ª- Planktothrix agardhii

(ARG= Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves, GARG= Reservatório Gargalheiras)

3.3 Bioensaios com camundongos em amostras de florações

Os camundongos testados nos bioensaios com as amostras dos

reservatórios ARG jul/04 2004 e GARG de mar/05, apresentaram sintomas

típicos de hepatotoxicidade, como contração abdominal frotes dificultando a

locomoção e palidez nas extremidades (orelhas, patas, olhos e fucinho). O peso

do fígado dos camundongos após os bioensaios variou entre 7 à 10% do peso

corpóreo. A dose letal testada no bioensaio para a floração da Armando Ribeiro

Gonçalves de julho de 2004 foi de 1000 mg.kg-1 de peso corpóreo com morte em

1 hora e de 600 mg.kg-1 de peso corpóreo com morte em 3 horas. Na amostra

de floração de Gargalheiras de março de 2005 foi de 1000 mg.kg-1 de peso

corpóreo com morte em 2 horas. Na floração de Gargalheiras de outubro de

2005, não houve morte dos camundongos quando injetado uma dose de 1111

mg.kg-1 de peso corpóreo, embora os animais tenham apresentado leves sinais

de hepatotoxicidade na primeira hora do teste, recuperando-se em seguida.

31


3.4 – Teste de Referência

Os resultados dos testes de referências oscilaram dentro de um faixa de

CL50-24h entre 1,09 e 0,70 g.L-1 com média de 0,93 g.L-1 a um intervalo de

confiança de 95% (Figura 1).

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Série dos Testes de Referência

CL

50-2

4h (

g.L

-1)

Figura 1 – Controle da sensibilidade de C. silvestrii para a substância de referência NaCl.

3.5 Toxicidade aguda do extrato bruto de florações mistas hepatotóxicas

e de cepas neurotóxicas e não tóxicas de Cylindrospermopsis

raciborskii sobre Ceriodaphnia silvestrii

Tanto as amostras de florações naturais, quanto a cultura neurotóxica

monoespecífica de Cylindrospermopsis raciborskii produtora de saxitoxinas (ITEP

018) apresentaram toxicidade para indivíduos de C. silvestrii. A cepa não tóxica

de C. raciborskii não apresentou nenhuma letalidade nas diferentes

concentrações testadas, tanto com 24h, quanto para 48h. Os valores da CL50-

48h para todas as amostras que se apresentaram tóxicas para os cladóceros

foram maiores do que as CL50-24h. A amostra de Gargalheiras (GARG) de março

de 2005 foi sete vezes mais tóxica do que a amostra de outubro de 2005 e três

32


vezes mais para a amostra de Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) de julho de

2004. Os valores de CL50-24h e CL50-48h e seus respectivos intervalos de

confiança de cada teste são mostrados na tabela 3.

A taxa média de mortalidade (%) da C. silvestrii aumentou gradativamente

com as variações crescentes das concentrações do extrato bruto de florações

naturais e de culturas cianobactérias após a exposição de 24 e 48 horas. Os

valores de mortalidade para os grupos controles nos experimentos foram abaixo

de 10%, validando todos os testes, conforme norma da ABNT.

A concentração letal para 50% dos cladóceros da amostra de floração

natural ARG de jul/04 foi 113,13 mg.L-1 para 24 horas e de 88,24 mg.L-1 para 48

horas. Com 24 e 48 horas, nenhuma mortalidade foi visualizada até a

concentração 50 mg.L-1 e a mortalidade de 100% dos organismos ocorreu a partir

de 300 mg.L-1 (figura 2).

Já para a amostra de floração natural ocorrida em Gargalheiras mar/05 a

CL50-24h foi 47,48 mg.L-1 e CL50-48h 38,15 mg.L-1 , significativamente menor do

que as outras amostras analisadas. A mortalidade dos organismos ocorreu a

partir de concentrações acima de 33,5 mg.L-1 e 100% de mortalidade foi

observada com 48 horas na concentração de 50 mg.L-1. Nesta concentração foi

observada 70% de mortalidade dos organismos com 24 horas (figura 3).

Na outra amostra de floração natural ocorrida em Gargalheiras out/05 a

CL50-24h foi 300,39 mg.L-1 e para CL50-48h foi 149,89 mg.L-1. A concentração

letal para 100% dos organismos foi de 800 mg.L-1 (Figura 4).

No teste de toxicidade com amostras de culturas neurotóxicas produtoras

de saxitoxina (Cylindrospermopsis raciborskii - ITEP 018) a taxa (%) de

mortalidade do C. silvestrii também aumentou gradativamente com as variações

crescentes das concentrações do extrato após a exposição de 24 e 48 horas,

exceto para a concentração de 300 mg.L-1. A CL50 24 e 48h foi 228,05 mg.L-1 e

120,28 mg.L-1 respectivamente, sendo 600 mg.L-1 a concentração letal para

100% dos cladóceros. (figura 5). O teste realizado com a cultura não tóxica de

Cylindrospermopsis raciborskii não apresentou nenhuma sensibilidade nem

mortalidade quando submetidas às mesmas concentrações do extrato bruto da

cultura tóxica. Diferentemente dos testes com amostra ambientais, os testes com

33


cepas tóxicas e não tóxicas de C. raciborskii não apresentaram diminuição de

oxigênio dissolvido com aumento das concentrações, permanecendo bastante

satisfatório até o final do experimento (60% a 90% de saturação).

Os parâmetros ambientais da água de cultivo apresentaram valores

compatíveis para a sobrevivência dos organismos. A água de diluição utilizada

nos testes apresentou grau de dureza média de 24 mg/L CaCO3. Durante os

experimentos, os grupos controles apresentaram pH médio de 7,4 (± 0,5). O pH

foi mais baixo (5,7- 6,5) nas últimas concentrações do teste realizado com a

amostra de GARG 03/05. No entanto, esses mesmos valores de pH foram

evidenciados nos testes feitos com a amostra não tóxica de C.raciborskii

(ITEP18), no qual não apresentou mortalidade dos organismos mesmo nesta

faixa de pH, mostrando que tais valores não interferiram na sobrevivência dos

organismos. A temperatura média foi de 23°C (± 0,4) durante os experimentos.

O oxigênio dissolvido medido no início do experimento, apresentou variação de

65 a 96% de saturação, mantendo estas condições nas concentrações mais

baixas do extrato até o final do experimento (48 horas). Porém, observou-se

diminuição na concentração de oxigênio com o aumento das concentrações do

extrato tóxico das amostras de florações, apresentando de 29 a 35% de

saturação nas duas mais altas concentrações ao final do teste. Na amostra

Gargalheiras de out/2005, os tratamentos com maiores concentrações do extrato

tóxico apresentaram de 20 a 25% no final do experimento.

Tabela 3 – Estimativa da CL50-24h e CL50-48h (intervalo de confiança 95%) de C. silvestrii expostos ao extrato bruto de florações e culturas de cianobactérias

Amostra Tipo CL50-24h (mg.L-1) CL50-48h (mg.L-1)ARG 07/04 Floração 113,13 (88,32 – 144,91) 88,24 (69,44 – 112,13) GARG 03/05 Floração 47,48 (44,9 – 50,20) 38,15 (36,55 – 39,83) GARG 10/05 Floração 300,39 (258,39 – 349,21) 149,89 (92,70 – 242,36) C. raciborskiineurotóxica

Cultura 228,05 (175,65 – 296,07) 120,28 (85,09 – 170,02)

C. raciborskii não-tóxica

Cultura NM NM

(NM= nenhuma mortalidade)

34


0102030405060708090

100

0 25 50 100 200 300 400 600 800

Concentração (mg.L-1)

Mor

talid

ade

(%)

24h

48h

CL50-48h = 88,24 mg.L-1

CL50-24h = 113,13 mg.L-1

Figura 02 – Taxa média de mortalidade (%) de C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de cianobactérias do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves em julho de 2004.

0102030405060708090

100

0 8 16,5 25 33,5 41,5 50


Mo

rta

lida

de

(%

)

24h

48h

CL50-48h = 38,15 mg.L-1

CL50-24h = 47,48 mg.L-1

Figura 03 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de cianobactérias do Reservatório de Gargalheiras em março de 2005.

35


0102030405060708090

100

0 25 50 100 200 300 400 600 800


Mo

rta

lida

de

(%

)

24h

48h

CL50-48h = 149,89 mg.L-1

Figura 04 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de cianobactérias do Reservatório de Gargalheiras em outubro de 2005.

0102030405060708090

100

0 25 50 100 200 300 400 600 800


Mo

rta

lida

de

(%

)

24h

48h

CL50-24h = 300,39 mg.L-1

CL50-24h = 228,05 mg.L-1

CL50-48h = 120,28 mg.L-1

Figura 05 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de cultura monoespecífica neurotóxica de C. raciborskii (ITEP 018), produtora de saxitoxina.

36


4. DISCUSSÃO

Cianobactérias são bastante representativas no fitoplâncton de águas doces

do Brasil. Matsumura-Tundisi & Tundisi (2005) descreveram uma dominância de

cianobactérias de ordem de 99,4% do total do fitoplâncton no Estado de São Paulo

na década de 80. Em diversos reservatórios do semi-árido potiguar, as

cianobactérias vêm representando mais de 90% da população do fitoplâncton e vêm

desenvolvendo florações mistas tóxicas periodicamente, compostas por espécies de

Microcystis panniformis, Microcystis aeruginosa, Anabaena circinalis, C. raciborskii,

Aphanizomenon sp. e Planktothrix agardhii (COSTA et al., 2003a e 2003b).

Os reservatórios estudados nesse trabalho apresentaram também alto grau

de eutrofização e ocorrência de floração mista hepatotóxica composta por

Cylindrospermopsis raciborskii, Planktothrix agardhii, Microcystis panniformis e M.

aeruginosa. Sotero-Santos (2005) também encontrou florações de M. aeruginosa em

um reservatório eutrofizado no Estado de São Paulo.

A presença de microcistina e saxitoxina já foi confirmada em florações nos

Reservatórios Armando Ribeiro (COSTA, et al 2006a) e Gargalheiras (COSTA et al.,

2006b). Outros reservatórios do semi-árido brasileiro também têm mostrado

freqüentes florações de cianobactéria (BOUVY et al., 1999; BOUVY et al., 2000;

HUSZAR et al., 2000). Segundo Bouvy (1999) e Tucci & Sant’anna (2003), diversos

fatores, tais como, alta temperatura, altos valores de pH, baixos valores de O2,

ausência de predadores eficientes e, principalmente, altos níveis de nutrientes,

promovem intenso crescimento de cianobactérias. Boon et al. (1994) acrescentam

que as cianobactérias não são palatáveis para muitos organismos zooplanctônicos

por causa do tamanho de sua colônia ou filamento, seus efeitos tóxicos e baixos

valores nutricionais, contribuindo para o fenômeno das florações.

Por serem comumente encontrados e por fazerem parte da comunidade

natural de água doce, os cladóceros têm sido estudados para avaliar a toxicidade de

cianobactérias (SOTERO-SANTOS et al., 2005; FERRÃO-FILHO et al., 2000;

FERRÃO-FILHO& AZEVEDO, 2002; ROHRLACK et al., 2001; LAWTON et al., 1994;

NOGUEIRA et al., 2004; GUO & XIE, 2005). Ferrão-Filho et al. (2000, 2002) e

Rohrlack et al. (2001) avaliaram o efeito tóxico em cladóceros alimentados com

37


células intactas de Microyistis aeruginosa e constataram diferentes respostas entre

espécies de cladóceros, tipos de cepas de Microcystis e tamanho das células

oferecidas. Guo & Xie (2005) mostram ainda que há influencia negativa na

sobrevivência, crescimento e reprodução de três espécies de cladóceros filtradores

de Microcystis produtoras de microcistina-LR, mas que eles podem desenvolver

tolerância quando expostos previamente a Microcystis aeruginosa.

Esses estudos, no entanto, são realizados com células tóxicas intactas ou

toxinas purificas, e seus efeitos podem ser menores quando comparados aos efeitos

observados em estudos utilizando-se extrato bruto de cianobactéria (OBEREMM et

al., 1999; TÖRÖKNE et al., 2000 PIETSCH et al., 2001; WIEGAND et al., 2002). Isso

porque na fase de senescência das cianobactérias, a lise da parede celular libera os

agentes tóxicos que permanecem dissolvidos na água, expondo a comunidade

trófica aquática através da exposição aguda ou a longo prazo.

No presente estudo, Ceriodaphnia silvestrii mostrou sensibilidade tanto para

microcistina de florações naturais quanto para saxitoxina de cepas cultivadas de C.

raciborskii na qual foram expostas. A toxicidade destas amostras também foi testada

por análise em HPLC, e seus valores juntamente com as comparações com os

bioensaios com camundongos e os testes de toxicidade realizados neste trabalho

são ilustradas na tabela 5.

Embora a amostra da floração de GARG out/2005 não tenha sido tóxica para

camundongos, foi letal nas dosagens de 300,39 mg.L-1 em 24 horas, e 149,89 mg.L-1

em 48 horas para C. silvestrii. Apesar do bioensaio com camundongos ter sido

negativo, foi observado leves sintomas de hepatoxicidade nas primeiras horas,

desaparecendo após 24 horas, mesmo tendo sido utilizada a dose máxima conforme

recomendado por Lawton et al. (1994). Os leves sintomas apresentados pelos

camundongos podem ter ocorrido possivelmente pela metabolização das

cianotoxinas nos camundongos, pela presença de outros componentes bioativos na

amostra, como bactérias e lipopolisacarídeos, ou ainda, devido à baixa concentração

de toxinas na amostra. Por outro lado, a análise por HPLC também não detectou a

presença de Microcistina-LR nesta mesma amostra, isso pode indicar baixos níveis

da toxina, ou, ainda, quantidade de biomassa liofilizada insuficiente para atingir o

limite de detecção do método. Em seus estudos, Gilbert (1990) não observou

38


sintomas tóxicos nos camundongos quando 500 mg.kg-1 de extrato liofilizado da

cepa de Anabaena affinis foi injetado intraperitonealmente, porém esse material se

mostrou tóxico para comunidades de cladóceros. Segundo ele, os resultados obtidos

com bioensaios com camundongos não devem ser extrapolados para comunidades

zooplanctônicas.

Já a amostra da floração ocorrida em GARG mar/05 apresentou o maior grau

de toxicidade para os C. silvestrii – 47,48 mg.L-1 para 24 horas e 38,15 mg.L-1 para

48 horas, cerca de sete vezes maior do que a de GARG out/05 e três vezes maior

do que ARG jul/04. A alta toxicidade dessa amostra também foi comprovada por

HPLC, tendo sido detectada 519,20 mol/g de microcistina-LR, valor três vezes

maior do que a amostra de ARG jul/04, que foi de 171,8 mol/g, e, os bioensaios

com camundongos foram positivos para estas amostras (tabela 5).

O C. silvestrii testado nessa dissertação, também demonstrou sensibilidade

para a cultura de C. raciborskii (ITEP 018). Essa cepa foi estudada por Molica et al.

(2002), que confirmaram a presença de sintomas característicos da “Toxina

Paralisante de Molusco” (Paralytic Shellfish Poisons - PSP) em cobaias inoculadas,

e, através de análise de HPLC, verificaram a produção de 3,3 mol% do conteúdo de

saxitoxina total (tabela 5). A primeira evidência de produção de saxitoxina por C.

raciborskii no Brasil foi descrita por Lagos et al. (1998). Acumulação de PSP’s em

tecido de Daphnia magna foi relatado por Nogueira et al. (2004) ao serem mantidas

em meio contendo células vivas e células liofilizadas da cianobactéria

Aphanizomenon issatschenkoi.

Em recentes estudos, Ferrão-Filho et al. (2006) submeteram os cladóceros

Daphnia pulex e Moina micrura a doses agudas de saxitoxinas produzidas por

Cylindrospermopsis raciborskii isoladas de um Reservatório do Rio de Janeiro,

Brasil, e os resultados evidenciaram que não ocorria mortalidade dos cladóceros,

mas apenas uma paralisia nos movimentos natatórios seguida de recuperação da

natação ao serem transferidos para água não contaminada (efeito reversível),

indicando a compatibilidade do mescanismo de ação dessas saxitoxinas. Apesar

dessa recente constatação, a denominação “mortalidade” dos cladóceros após 24 e

48h adotado nesta pesquisa, foi considerada pela falta de capacidade natatória dos

organismos após agitação suave do tubo-teste por 15 segundos, conforme

39


instruções das normas técnicas da CETESB (1991) e ABNT (2003). No entanto,

estes resultados apontam a necessidade de realização de bioensaios para testar

sensibilidades (comportamento e/ou mortalidade) entre diferentes espécies de

zooplâncton em relação às cepas de cianobactérias e às suas toxinas.

Os resultados dos testes realizados com amostras ambientais hepatotóxicas e

culturas neurotóxicas de C. raciborskii (ITEP 018), nas mesmas concentrações,

evidenciaram o efeito danoso de microcistinas e saxitoxinas na sobrevivência dos

cladóceros. Como o teste realizado com a cultura não tóxica de C. raciborskii não

apresentou nenhuma mortalidade para os cladóceros, demonstra tanto a toxicidade

de saxitoxina produzida pela (ITEP 018) quanto uma boa sensibilidade do teste de

C. silvestrii sobre esta toxina.

O potencial toxigênico tanto das amostras de florações ocorridas em ARG

jul/04, quanto em GARG mar/05 foi comprovado por análise através de HPLC e

bioensaios com camundongos, e, embora estas análises não tenham comprovado a

toxicidade da amostra de GARG out/05, conforme já discutido nesse trabalho, ela

mostrou-se tóxica quando testada com C. silvestrii. Isso indica que o teste com C.

silvestrii poderia ser mais sensível e melhor aplicado para amostras com baixo

potencial toxigênico, embora seja necessário realizar mais experimentos com

amostras tóxicas e não tóxicas para validar esta afirmação.

Em todos os testes com amostras de florações naturais, exceto para as

amostras de cultura, o oxigênio dissolvido decresceu com o tempo e aumento das

concentrações do extratro bruto de cianobactérias. É possível que microcistinas, ou

outros compostos bioativos, produzidos por estas florações, tenha promovido

interferências e efeitos sinergéticos levando a redução de oxigênio dissolvido, já que

não ocorreu o mesmo nos testes realizados com culturas monoespecíficas tóxicas

(saxitoxinas) e não tóxicas. As amostras de culturas apresentaram elevados níveis

de saturação de oxigênio dissolvido (74 – 96%) durante todo o experimento. Apesar

da diminuição das concentrações de oxigênio nas maiores concentração do extrato

bruto de florações hepatotóxicas foi descartada a possibilidade de um falso positivo,

causado pelo efeito indireto de oxigênio, uma vez que suas concentrações, mesmo

em niveis mínimos, foram suficientes para a sobrevivência dos cladóceros (ABNT,

2003; CETESB, 1991; KNIE & LOPES 2004).

40


Tabela 4 – Resultados comparativos entre bioensaios com camundongos, quantificação de cianotoxinas, e as respectivas LC50-24h e LC50-48h (mg.L-1), para as amostras de florações naturais e cepas cultivadas.

AmostraBioensaio

CamundongosSwiss

Cianotoxinas

LC50-24hC.

silvestrii(mg.L-1)

LC50-48hC. silvestrii

(mg.L-1)

ARG 07/04 Pos171,8

(Mc-LR mol.g-1) 113,13 88,24

GARG 03/05 Pos519,2

(Mc-LR mol.g-1) 47,48 38,15

GARG 10/05 Neg* ND 300,39 149,89

ITEP 018 Pos3,3

(Saxitoxina mol%) 228,05 120,28

(* Apresentou leves sintomas de hepatoxicidade, mas nenhuma morte; ND = não detectado; COSTA et al., 2006c; MOLICA et al., 2002)

Apesar da complexidade e inconsistência entre os dados sobre efeitos de

cianotoxinas em microcrustáceos devido a diferenças na instrumentação e

metodologia usada por cada autor, fica evidenciado que as cianobactérias podem

causar efeitos deletérios na comunidade zooplanctônica. Isso também foi

demonstrado por Marsáled & Bláha (2004) que encontraram valores de CL50-48h

variando de 6000 a 99000 µg.mL-1 para Daphnia magna e CL50-24h de 1100 a

12300 e de 6600 a 8900 µg.mL-1 para Daphnia pulex e Ceriodaphnia dúbia,

respectivamente. Para Artemia salina, os autores encontraram o valor de CL50-24h

variando de 6800 a 7100 µg.mL-1 e CL50-48h de 3500 a 31900 µg.mL-1. Com valores

semelhantes para A. salina, Sabour et al. (2002) encontraram CL50-24h numa faixa

de 6000 a 40600 µg.mL-1 e CL50-48h de 2800 a 18200 µg.mL-1. Para Daphnia similis,

Sotero-Santos et al. (2005) avaliou a CL50-24h numa faixa de 186,61 a 229,84 mg.L-1

e CL50-48h de 162,45 a 194,75 mg.L-1. O resultado encontrado por Montagnolli et al.

(2003) da CL50-96h para o microcrustáceo Kalliapseudes schubartii teve média de

1,44 mg.ml-1. A sensibilidade varia entre os diferentes grupos estudados. Valores

semelhantes aos obtidos nesse estudo para ambientes situados no nordeste

brasileiro (Barragem Armando Ribeiro Gonçalves e Gargalheiras/RN), utilizando

41


extrato bruto de cianobactérias, foram encontrados por Sotero-Santos et al. (2005)

no Reservatório de Barra Bonita, localizado na região sudeste do Brasil, com CL50-

24h e CL50-48h para os C. silvestrii na faixa de 155,11 a 160,62 mg.L-1 e 107,17 a

100,39 mg.L-1, respectivamente.

Os resultados aqui obtidos sumarizam apenas uma situação de análise de

laboratório, tendo em vista de que florações naturais de cianobactérias expõem por

mais tempo os organismos aquáticos às toxinas ou a outros componentes bioativos

produzidos pelas cianobactérias, os quais poderiam influenciar a toxicidade destes

organismos promovendo também efeitos nas comunidades aquáticas. Já é bem

documentado que cianobactérias também produzem, além de toxinas, diversas

substâncias danosas aos organismos, tais como metabólicos secundários e

lipopolissacarídeos-LPS (CARMICHAEL, 1997; BEST et al., 2000). Oberemm et al.

(1999) mostraram que extrato bruto de cepa de Mycrocystis aeruginosa contendo

baixa concentração de microcistina não causou sozinho efeitos nos organismos

testados. Ao contrário, nossas amostras de florações naturais evidenciaram

elevadas concentrações de microcistinas, e as amostras de culturas, uma

quantidade considerável de saxitoxinas, sugerindo ter exercido forte influência nos

organismos testados. Por outro lado, a não sensibilidade de C. silvestrii confirmada

no teste realizado com cultura de C. raciborskii não produtora de saxitoxina, poderia

indicar uma insignificante influência de outros compostos bioativos sobre C. silvestrii,

sugerindo importante influência de cianotoxinas sobre estes organismos mesmo

tendo havido participação de outros metabóltios secundários naturais.

Ensaios ecotoxicológicos advertem para a contaminação dos ambientes

aquáticos por agentes tóxicos naturais e antropogênicos, com o comprometimento

da manutenção da vida aquática. O uso do C. silvestrii como organismo-teste mostra

ter potencial efetividade, por se apresentar sob forma metodológica simples, rápida,

com pouco custo financeiro, e principalmente pela alta sensibilidade apresentada por

esses organismos, mostrando resultados precisos. No Brasil, esses cladóceros

também vêm sendo utilizados para avaliar efeitos tóxicos de efluentes industriais e

domésticos (COSTA & ESPÍNDOLA, 2002) e também da qualidade da água de

estações de tratamento (TAKENAKA et al., 2005). A realização desses tipos de

42


testes com organismos nativos é mais criteriosa para a preservação das

comunidades aquáticas.

5. CONCLUSÃO

A toxicidade das amostras de florações naturais hepatotóxicas (microcistinas) e

culturas neurotóxicas produtoras de saxitoxinas verificadas neste estudo fornece

forte indicativos da influência dessas toxinas sobre a estrutura da comunidade

zooplanctônica em ambientes aquáticos tropicais. Os cladóceros são importantes

organismos da cadeia trófica de ecossistemas de água doce tropicais, e se essa e

outras espécies similares são comprometidas por cianotoxinas, outros organismos

como peixes de importância econômica para o local, também podem ser afetados.

Nossos resultados demonstraram que C. silvestrii apresentou um bom grau de

sensibilidade podendo ser considerado um método promissor e eficaz para detecção

de toxicidade da água com florações de cianobactérias. Portanto, a utilização desse

organismo indica uma ferramenta potencial em programas de biomonitoramento na

gestão de recursos hídricos, por requerer pouco investimento com tempo de

resposta rápido e fornecer uma informação real dos efeitos das cianotoxinas sobre

os organismos aquáticos.

Os reservatórios do Rio Grande do Norte devem merecer maior atenção perante

os órgãos responsáveis, tendo em vista os constantes florescimentos tóxicos de

cianobactérias em águas utilizadas para consumo humano.

43


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50


IDENTIFICAÇÃO E TOXICIDADE DE CEPAS DE CIANOBACTÉRIAS ISOLADAS DE

AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO GRANDE DO NORTE.

Juska Milena dos Santos Mendonça¹, Ivaneide Alves Soares da Costa², Amanda dos Santos Palhares², Layse Aranha Marinho²,

Marquele Cardoso Martins².

(ARTIGO A SER SUBMETRIDO PARA PUBLICAÇÃO)

______________________________ ¹Departamento de Oceanografia e Limnologia, Centro de Biociências, Universidade Federal dos Rio Grande do Norte. Via Costeira, s/n – Mãe Luíza, CEP – Natal/RN. [email protected]

²Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. BR -Lagoa Nova, CEP – Natal/RN

51


RESUMO

Incidências de florações tóxicas de cianobactérias são muito comuns em

reservatórios do nordeste do Brasil. Cianobactérias são organismos produtores

naturais de cianotoxinas, que frequentemente dominam corpos aquáticos

eutrofizados. A produção dessas toxinas tem importantes conseqüências para a

qualidade da água e freqüentemente causa alta mortalidade entre organismos

aquáticos, podendo atingir a população público. Neste trabalho, objetivamos

isolar, cultivar, identificar e avaliar a toxicidade de cianobactérias presentes em

reservatórios de abastecimento humano e viveiros de camarão (Litopenaeus

vannamei) localizados em ambientes de água doce do Estado do Rio Grande do

Norte (6o 58’ S e 38o 36’ W). As amostras foram coletadas com rede de plâncton

(20µm) e a toxicidade foi testada através de bioensaios com camundongos

Swiss. Para obtenção das culturas específicas foram usadas técnicas de

semeadura em meio sólido e líquido, isolamento com micropipetas e diluições

sucessivas. A identificação das espécies foi realizada com o auxílio de um

microscópio óptico (400X) utilizando o novo sistema de Komárek & Anagnostidis.

As cepas isoladas foram cultivadas em meio de cultura ASM-1, sob condições de

temperatura média de 25°C, intensidade luminosa de 1.000 Lux, fotoperíodo de

12h. Foram isoladas 11 cepas de cianobactérias representadas por 6 espécies:

Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis

panniformis, Geitlerinema unigranulatum e Planktothrix agardhii. Nenhuma cepa

apresentou toxicidade em camundongos Swiss. As cepas foram catalogadas e

depositadas no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos

(LETMA) da UFRN e serão utilizadas em estudos ecotoxicológicos e

ecofisiológicos visando esclarecer as causas e controle de florações de

cianobactérias nos ambientes aquáticos do Estado.

52


1. INTRODUÇÃO

Cianobactérias são importantes organismos autotróficos fotossintetizantes,

amplamente adaptados e muito tolerantes a ambientes extremos (BROCK, 1972).

Elas são produtoras naturais de toxinas (cianotoxinas), tendo efeito inibidor a

predador, algas competidoras e macrófitas, mas podem também afetar outros

organismos aquáticos e terrestres, bem como o homem (DUY et al., 2000).

Ambientes de água doce com águas neutro alcalinas (pH 6-9), temperatura entre

15 a 30°C e altas concentrações de nutrientes, principalmente de fósforo e

nitrogênio, propiciam condições ideais para o desenvolvimento das cianobactérias

(AZEVEDO, 1998). No entanto, a descarga excessiva de efluentes antropogênicos,

principalmente em reservatórios próximos aos centros urbanos (BELL & CODD,

1994) promove a formação de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas

nessas águas (PEARL & TUCKER, 1995). Essas florações têm importantes

conseqüências para a qualidade da água e o seu colapso freqüentemente causa alta

mortandade entre populações de animais aquáticos (VASCONCELOS et al., 2001).

É uma preocupação marcante a possibilidade da bioacumulação e transferências de

cianotoxinas através da cadeia alimentar para o homem, oferecendo sérios riscos à

saúde humana (FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994).

No Brasil, os gêneros mais comuns de cianobactérias encontradas em águas

doce eutrofizadas são Microcystis, Anabaena e Cylindrospermopsis (TUNDISI &

MATSUMURA-TUNDISI, 1992; DOMINGOS et al., 1999). Incidências de florações

tóxicas de cianobactérias são também muito comuns em ecossistemas aquáticos

nordestinos, principalmente nos reservatórios d’água construídos artificialmente para

usos múltiplos, principalmente para sobrevivência humana aos intensos períodos de

seca (BOUVY et al., 2004; COSTA et al., 2006a e 2006b; PORFIRIO et al., 1999;

LAZZARO et al., 2003).

No Rio Grande do Norte, as florações de cianobactérias tóxicas têm sido

observadas na Barragem Armando Ribeiro Gonçalves, nos reservatórios Passagem

das Traíras, Itãns, Poço Branco e Trairí (COSTA, 2003; COSTA et al., 2003a e

2003b; MORALES, 2003). Também têm sido encontradas quantidades consideradas

53


de cianobactérias tóxicas em viveiros de cultivo de camarão no Estado (COSTA, et

al. 2005), atividade aqüícola de grande importância econômica no RN.

Atualmente o controle de cianobactérias e de suas toxinas em água de

abastecimento e em cultivos de pescado para alimentação humana é um dos

grandes problemas no monitoramento de qualidade de água. Por isso a implantação

de um banco de culturas de cianobactérias no Departamento de Microbiologia e

Parasitologia da UFRN foi a primeira iniciativa tomada para desenvolver estudos

sobre esses organismos e contribuir para a resolução de problemas. Este trabalho

tem como objetivo isolar, cultivar, identificar e avaliar a toxicidade de cianobactérias

presentes em reservatórios de abastecimento humano e viveiros de camarão do

Estado do Rio Grande do Norte, visando subsidiar estudos ecotoxicológicos e

ecofisiológicos que possam elucidar fatores controladores de florações de

cianobactérias e responder questões ligadas à presença potencial de toxinas e seus

efeitos nas comunidades aquáticas e no homem.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Procedimento de amostragens

Foram realizadas coletas de fitoplâncton em importantes reservatórios para

abastecimento humano e fazendas comerciais de cultivo de camarão (Litopenaeus

vannamei ) localizados em ambientes de água doce do Estado do Rio Grande do

Norte (6o 58’ S e 38o 36’ W). Os viveiros de camarão investigados neste estudo

captam e despejam a água de cultivo em dois importantes rios do estado - o rio

Ceára-Mirim e o rio Piranhas-Assu, os quais exercem influência nos estuários do

Potengi (Natal/RN) e Cavalos (Pendênicas/RN). Apesar de sua grande diversidade,

os ecossistemas aquáticos do Estado encontram-se ameaçados por atividades da

agroindústria e pela aqüicultura, as quais têm grande importância econômica na

região.

Amostras foram obtidas através de arrastos verticais e horizontais utilizando-se

uma rede de plâncton (20µm) na coluna d’água. Amostras vivas e fixadas com

54


formol a 4% foram utilizadas para identificação das espécies. O material vivo foi

conservado em meio ASM-1 para posterior isolamento.

2.2 Isolamento e cultivo de cianobactérias

Para obtenção das culturas específicas foram usadas técnicas de semeadura

em meio sólido, em meio líquido e a técnica de isolamento com micropipetas do

tipo Pasteur e também através de diluições sucessivas (PRINGSHEIM, 1951;

GUILARD, 1995), com o auxílio de um microscópio óptico (400X).

As cepas isoladas eram cultivadas em meio de cultura ASM-1 (GORHAM

et al., 1964), sob condições de temperatura média de 25°C, iluminadas com 2

lâmpadas fluorescentes, fotoperíodo de 12h e mantidas no Banco de Cultivo do

Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA) da

Universidade Federal do Rio grande do Norte.

2.3 Identificação das espécies de cianobactérias

Para o estudo taxonômico foi utilizado microscópio óptico, ocular de medição

e fotografias, técnicas de microscopia para identificação das espécies naturais e

isoladas. Foram calculadas médias de 30 medidas de cada característica

métrica de interesse taxonômico. A identificação das espécies foi feita seguindo-

se o sistema de Komárek & Anagnostidis (1998) para a Chroococcales,

Komárek & Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek &

Anagnostidis (1989) para as Nostocales.

As cepas foram catalogadas pelas iniciais maiúsculas da sigla do Laboratório

de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA), seguidas por

um número de acordo com a ordem de isolamento. Também foram feitas fichas

individuais indicando o local de coleta, nome do responsável pelo isolamento e

as características morfológicas e toxicológicas das cepas.

55



Para verificar a toxicidade das cepas isoladas, foram realizados bioensaios

em camundongos Swiss (machos e com peso corpóreo variando de 15 a 20

gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1 mL do extrato bruto de

cianobactérias, ressuspenso em água ultra-purificada. Foram feitas inoculações

do material em 3 animais e os sintomas foram observados. A classificação da

toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Cultivo e Identificação das Cepas Isoladas

Foram isoladas 11 cepas de cianobactérias representadas por 6 espécies.

(tabela 1). As descrições das espécies identificadas e cultivadas são descritas a

seguir:

Ordem Nostocales

Anabaenopsis sp.

Tricomas moderadamente curtos e espiralados, 16 µm de comprimento,

células retângulo-arredondadas, 8,6 µm de comprimento, 5,5 µm de largura;

heterocitos esféricos-arredondados localizados em cada extremidade, 5,8 µm de

diâmetro; acinetos grandes, 11 µm de comprimento, 6 µm de largura, localizados na

extremidade apical ou distando 2-3 células dela. A cultura apresenta característica

verde-azulada com intensa sedimentação dos filamentos. (Prancha 1: figs. 1-2)

56


Cylindrospermopsis raciborskii

Tricomas retos ligeiramente curvados, solitários, cilíndricos e estreitos,145 µm

de comprimento, 2,1 µm de largura; células cerca de 2 vezes mais longas que

largas, 4,5 µm de comprimento; heterocito terminal solitário, 7-9 µm de comprimento;

células apicais cônico-arredondados, conteúdo celular verde azulado, numerosos

aerotópos. A cultura apresenta crescimento lento e grandes filamentos

heterocitados. (Prancha 1: fig. 5)

Ordem Oscillatoriales

Planktothrix agardhii

Tricomas retos, estreitos, não constritos e solitários; 315.46 µm de

comprimento, 3,1 µm de diâmetro; células mais curtas do que largas, 4,8 µm de

comprimento, com célula apical capitada ou não; conteúdo celular verde-azulada

com inúmeros aerótipos; motilidade presente. O cultivo apresenta rápido

crescimento com aglomerados de tricomas em suspensão. (Prancha 1: fig. 3-4)

Geitlerinema unigranulatum

Filamentos retos, não constrictus, solitários ou formando feixes; 80,4 µm de

comprimeento, 2 µm de largura; células retangulares, 5,46 µm de comprimento;

conteúdo celular verde-azulado, septos indistintos, granuloso (1 grânulo), células

apicais cilindro-arredondadas; motilidade presente. A cultura apresenta um aspecto

característico de filamentos emaranhados que se agregam firmemente à superfície

da parede do recipiente. (Prancha 1: fig. 6-7)

57


Ordem Croocrocalles

Microcystis panniformis

Colônias sub-esféricas quando jovens e irregulares quando adultas;

mucilagem estreita, difluente e inconspícua; células densamente dispostas em toda

mucilagem, 3,5 µm de diâmetro; conteúdo celular verde-amarronzado e com

aerótipos. Em culturas, assim como no ambiente natural, as colônias formam

densos agregados verdes em suspensão e sedimentados. (Prancha 2: fig. 8-11)

Chroococcus sp.

Células grandes ovaladas, arredondadas, envoltos por uma fina camada de

mucilagem, 11 µm de diâmetro, 17 de comprimento; conteúdo celular verde-azulada,

sem grânulos ou aerótipos. A cultura se apresenta na forma de partículas verdes-

azuladas que se sedimentam no fundo do recipiente. (Prancha 2: fig. 12-13)

3.2 Toxicidade das cepas

Os bioensaios realizados com as cepas isoladas de cianobactérias não

mostraram toxicidade quando testadas em doses 1000 mg.kg-1 de peso corpóreo.

58


Tabela 1 – Caracterização das cepas de cianobactérias mantidas no banco de cultura LETMA\UFRN

CEPA ESPÉCIE LOCAL DA

COLETA

DATA DA

COLETA BIOENSAIO

LETMA 001 Planktothrix agardhii ARG 30/10/2004 Negativo

LETMA 002 Anabaenopsis sp VIVEIRO 09/07/2005 Negativo

LETMA 004 Geitlerinema unigranulatum VIVEIRO 08/08/2005 Negativo

LETMA 005 Geitlerinema unigranulatum VIVEIRO 26/07/2005 Negativo

LETMA 006 Planktothrix agardhii ARG 30/05/2005 Negativo

LETMA 007 Geitlerinema unigranulatum GARG 26/01/2005 Negativo

LETMA 008 Geitlerinema unigranulatum GARG 22/03/2005 Negativo

LETMA 009 Cylindrospermopsis raciborskii VIVEIRO 27/04/2005 Negativo

LETMA 010 Planktothrix agardhii GARG 22/03/2005 Negativo

LETMA 011 Chroococcus sp. VIVEIRO 21/07/2005 Negativo

LETMA 013 Microcystis panniformis GARG 18/10/2005 Negativo

(ARG = Barragem Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves; GARG = Gargalheiras; VIVEIRO= viveiro destinado à criação de camarão aclimatado).

Neste trabalho, a técnica de isolamento por pipetagem foi mais eficiente para

o isolamento, tanto das espécies filamentosas quanto coloniais. Para espécies

coloniais, como Microcystis spp, o sucesso do isolamento só foi obtido realizando-se

uma pré-lavagem sucessiva gota a gota, em média 10 vezes, das células ou

colônias isoladas por pipetagem. As culturas monoespecíficas foram obtidas através

do plaqueamento em meio sólido ASM-1. Tal procedimento torna-se necessário

principalmente para evitar contaminação das culturas por espécies de Geitlerinema

spp, que ficam geralmente aderidas a mucilagem das colônias. Todas as culturas

apresentaram bom crescimento em meio ASM-1.

A técnica de isolamento e manutenção de cianobactérias potencialmente

tóxicas em laboratórios permite que estudos contínuos acerca de muitas espécies

desses procariotos possam ser explorados em várias linhas de pesquisa (ficologia,

fisiologia e toxicologia), por comunidades científicas do mundo todo.

Com o intuito de solucionar problemas causados pelos efeitos deletérios de

florações de cianobactérias em várias partes do mundo, estudos vêm sendo

realizados com espécies isoladas de cianobactérias, como por exemplo, Hawkins, et

al. (1997), que avaliaram o efeito tóxico de Cylindrospermopsis raciborskii isolado de

59


um pequeno lago da Austrália. No Brasil, Bittencourt-Oliveira et al. (2004) isolaram

Microcystis panniformis de um reservatório eutrofizado do Estado de São Paulo e

verificaram o ritmo circadiano na biosíntese de microcistina. Molica et al. (2002)

avaliaram a toxicidade de Cylindrospermopsis raciborskii isolados de águas de

Caruaru/PE.

No presente trabalho, as cepas isoladas de reservatórios do semi-árido

potiguar e viveiros de camarão do Estado não foram tóxicas quando testadas em

camundongos. No entando, Costa & Azevedo (1994) relatam que cerca de 75% das

espécies isoladas no Brasil, apresentam toxicidade. Além disso, COSTA et al.

(2003a e 2003b) observaram que cianobactérias representam mais de 90% da

população do fitoplâncton em reservatórios do Rio Grande do Norte, e desenvolvem

freqüentes florações mistas tóxicas, compostas por Microcystis panniformis, M.

aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Plankitothrix

agardhii. Assim, faz-se necessária a realização de análises químicas mais sensíveis,

como por exemplo, o método “HPLC” para confirmar a toxicidade das cepas. Por

outro lado, não devemos desconsiderar a possibilidade de ter sido isolado apenas

espécies não tóxicas, uma vez que florações de cianobactérias apresentam-se

compostas por uma mistura de espécies produtoras e não produtoras de toxinas

(SIVONEN & JONES, 1999).

A presença de cianobactérias tóxicas em reservatórios de abastecimento

públicode e viveiros de cultivo e camarão representa um problema tanto econômico,

devido às mortalidades de camarões pelas cianotoxinas (SMITH, 1996), e também

de saúde pública pela probabilidade de ocorrer bioacumulação de toxinas nos

músculos e vísceras do pescado (peixe e camarão) e transferência até o homem

(FALCONER et al., 1994). É essencial, portanto, a continuidade deste trabalho, na

tentativa de isolar cepas tóxicas, bem como investigar fatores que estimulam a

produção de toxinas por cianobactérias nestes ambientes. As espécies isoladas

neste trabalho serão utilizadas em experimentos científicos na tentativa de

esclarecer as causas e conseqüências das florações de cianobactérias nos

ambientes aquáticos do Estado, contribuindo com o desenvolvimento científico do

Rio Grande do Norte.

60


5. REFERÊNCIAS

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63


21

(20X)(100X)

(40X)

(100X)(20X)

(40X)

(100X)

4

76

53

Prancha 1. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Anabaenopis sp.(1-2) Planktothrix agardhii (3-4); Cylindrospermopsis raciborskii (5); Geitlerinema unigranulatum (6-7).

Prancha 1. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Anabaenopis sp.(1-2) Planktothrix agardhii (3-4); Cylindrospermopsis raciborskii (5); Geitlerinema unigranulatum (6-7).

64


98

(100X) (40X)

10 11

(100X) (40X)

12 13

(40X) (40X)

Prancha 2. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Microcystis panniformis (8-11): 8 e 9 = colônias jovens com e sem nanquim respectivamente, 10 e 11 = colônias senescentes; Chroococcus sp (12-13).

65


6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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– ANEXOS –

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01 - Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da UFRN, Natal/2005.

ISOLAMENTO E CULTIVO DE CIANOBACTÉRIAS POTENCIALMENTE TÓXICAS DE AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO GRANDE DO NORTE

Amanda Palhares dos Santos, Juska Milena dos Santos Mendonça, Sheylla Weil Ramos Marques, Sheila Gomes de Melo e Ivaneide Alves Soares da Costa

Universidade federal do Rio grande do Norte Departamento de microbiologia e Parasitologia

Laboratório de Ecologia e toxicologia de micrganismos aquáticas

No Rio Grande do Norte, florações de cianobactérias potencialmente produtoras de toxinas são decorrentes do processo de eutrofização em ecossistemas de água doce e estuarina. Isto constitui um problema ambiental e de saúde pública, visto que as cianotoxinas podem contaminar o homem através da ingestão de água, peixe e camarão contendo a toxina. O isolamento e cultivo desses organismos são de extrema importância para o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos e fisiológicos os quais servirão para apontar possíveis soluções para esse problema. Este trabalho tem como objetivo o isolamento e cultivo das cianobactérias de ambientes aquáticos do Rio Grande do Norte. Amostras de água foram coletadas com rede de plâncton (20µ) no Açude Gargalheiras, Barragem Armando Ribeiro Gonçalves e em viveiros de camarão de água doce. As espécies foram isoladas e cultivadas em meio ASM-1 líquido e mantidas sob fotoperíodo de 12:12 horas para o ciclo claro: escuro, temperatura de 24oC a 27oC e intensidade luminosa de 80 – 1700 LUX. Foram isoladas quatro cepas potencialmente tóxicas: Geitlerinemaamphibium, Plankthotrix agardhii, Cylindrospermopis raciborskii e Anabaenacircinalis. Alíquotas dessas culturas foram liofilizadas e serão utilizadas para testar a toxicidade das cepas através de bioensaios com camundongos.

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02 - Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da UFRN, Natal/2005

OCORRÊNCIA DE FLORAÇÃO TÓXICA DE CIANOBACTÉRIA (Microcystis aeruginosa) NO RESERVATÓRIO ARMANDO RIBEIRO GONÇALVES,

ASSU/RN

Sheila Gomes de Melo, Ivaneide Alves Soares da Costa, Amanda Palhares dos Santos, Juska Milena dos Santos Mendonça, Sheylla Weil Ramos Marques


Laboratório de Ecologia e toxicologia de micrganismos aquáticas

Florações de cianobactérias são caracterizadas pelo crescimento exagerado desses microrganismos e são geralmente decorrentes do processo de eutrofização dos ambientes aquáticos. Isto representa um grave problema de saúde pública, principalmente em reservatórios de abastecimento doméstico, pelo fato de várias espécies serem capazes de produzir e liberar cianotoxinas na água, as quais também podem se acumular na cadeia trófica. As pessoas são contaminadas bebendo a água, comendo peixes ou camarão contendo a toxina ou através de atividades de recreação. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de uma floração de cianobactéria ocorrida em julho de 2004 no reservatório Armando Ribeiro Gonçalves, no município de Assu/RN. O teste de toxicidade foi realizado com camundongos “Swiss”. A quantificação das espécies foi feita pelo método de Utermöhl. A floração foi composta unicamente pela espécie Microcystis aeruginosa e apresentou densidade 2 x108 cél.mL-1.Esses valores estão acima do limite permitido para o consumo humano segundo a Portaria 518 de março de 2004 do Ministério da Saúde. Os camundongos testados no bioensaio apresentaram sintomas de hepatoxicidade e morte após 1h e 30 com uma dose de 1052mg.kg de peso corpóreo. A concentração de clorofila-a foi 449 g.L-1 e do fósforo total 21 g.L-1. Os resultados evidenciam a necessidade urgente da implantação de um programa de monitoramento de cianobactérias nos reservatórios de abastecimento público do RN.

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03- Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da UFRN, Natal/2005

CARACTERIZAÇÃO E VARIAÇÃO SAZONAL DO FITOPLÂNCTON, COM ÊNFASE EM CIANOBACTÉRIAS, EM VIVEIROS DE CARCINICULTURA NO

ESTUÁRIO DO RIO CAVALOS/MACAU/RN.

Sheylla Weil Ramos Marques, Amanda Palhares dos Santos, Sheila Gomes de Melo, Juska Milena dos Santos Mendonça e Ivaneide Alves Soares da Costa


Laboratório de Ecologia e toxicologia de microrganismos aquáticas

A ocorrência de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas em viveiros de camarão no Rio Grande do Norte tem se tornado um tema de crescente interesse, não só para pesquisadores, mas, também para a população, isso porque as toxinas produzidas por algumas espécies podem provocar redução na produtividade e mortalidade dos camarões e até atingir a saúde humana pela bioacumulação. O objetivo deste trabalho é identificar e quantificar as espécies de fitoplâncton, em viveiros de camarão (Litopenaeus vannamei) de uma fazenda localizada no estuário do Rio Cavalos, Macau/RN. Foram realizadas duas coletas uma no período de estiagem (28/10/2004) e outra no período chuvoso (05/04/2005). Amostras de água integrada foram coletadas nos pontos de captação e viveiros, fixadas com lugol acético e os organismos quantificados pelo método de Utermöhl. Variáveis ambientais também foram analisadas com a finalidade de avaliar as condições tróficas do ambiente. No ponto de captação a densidade do fitoplâncton variou de 47000 a 64500 ind.mL-1 e nos viveiros de 36271 ind.mL-1 a 347375 ind.mL-1.Cianobactérias representaram >80% da população do fitoplâncton, com dominância das espécies Pseudoanabaena sp, Aphanocapsa sp e Cylindrospermopsis raciborskii. A clorofila-a variou de 23-193 g. L-1, o pH de 8,5-9,0, o oxigênio dissolvido de 5,0-17 mg.L-1, a transparência da água de 0,2-0,4m, as concentrações de fósforo total de 117-628 g.L-1 e de amônia 10,44 -303 g.L-1.

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04 – Resumo publicado no XI Congresso Brasileiro de Ficologia, Itajaí/SC,

MONITORAMENTO DE FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS NO AÇUDE GARGALHEIRAS, ACARI/RN.

Amanda Palhares dos Santos, Adriano Augusto da Silva, Sheila Gomes de Melo, Elinez da Silva Rocha, Wanessa Sousa, Juska Milena dos Santos Mendonça e

Ivaneide Alves Soares da Costa


Laboratório de Ecologia e toxicologia de microrganismos aquáticas

O açude Gargalheiras, localizado no semi-árido potiguar, é utilizado para fins de abastecimento humano, aqüicultura e lazer, mas apresenta contínuas florações de cianobactérias. Com a finalidade de investigar a periodicidade, intensidade e toxicidade das florações, amostras mensais foram analisadas entre janeiro e dezembro de 2005. Para identificação das espécies, amostras foram coletadas com rede de plâncton (20µm) e preservadas com formol a 4%. As espécies foram quantificadas de acordo com Ütermol e fixadas com lugol-acético. Parâmetros ambientais (oxigênio dissolvido, temperatura, pH, condutividade, transparência, fósforo total e clorofila) foram medidos. Elevados níveis de fósforo total (M=84 µg.L-1; DP= 17), clorofila-a (M=43,6 µg.L-1; DP= 18,1) e baixa transparência (M=0,8 m; DP= 0,9) confirmaram o estado de eutrofização do reservatório. Florações mistas de cianobactérias (Microcystisaeruginosa, M. protocystis, M. panniformis, Planktothrix agardhi eCylindrospermopsis raciborskii) ocorreram durante todo o ano, atingindo densidades máximas entre 104 e 105 céls./mL. A população de Cylindrospermopsis raciborskii apresentou tricomas retos, espiralados e encurvados. Foi comprovada hepatoxicidade, através de bioensaios em camundongos, nas florações ocorridas em janeiro e março de 2005.

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05 - Artigo Científico Publicado na Revista FAPERN, v. 1, n. 03 de abr/mai de 2006.

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06 – Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.

INCIDÊNCIA DE HEPATOTOXINAS EM RESERVATÓRIOS ABASTECIMENTO HUMANO NO SEMI-ÁRIDO POTIGUAR (RN,BRASIL)

Costa, I. A. S.¹, Santos, A. P1., Mendonça, J. M. S.¹, Kujbida, P., Anjos, F.M. & Pinto, E.

1 Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil 2 Departamento Anal. Clin. Tox.,FCFUSP, São Paulo /SP, Brasil

([email protected])

Importantes reservatórios do semi-árido potiguar que são destinados ao abastecimento humano, frequentemente apresentam florações de cianobactérias, denunciando o elevado grau de eutrofização destes ambientes. Cianobactérias podem produzir hepatotoxinas, tais como microcistinas, que contaminam a água e o pescado comprometendo sua qualidade e oferecendo riscos à saúde humana. Avaliamos a toxidade de 7 florações ocorridas em 4 reservatórios no Estado do Rio Grande do Norte entre julho de 2004 e abril de 2005 através de bioensaios com camundongos e análise por HPLC. Amostras de florações foram coletadas com rede de plâncton (20µm) e liofilizadas para os testes de toxicidade e uma alíquota foi preservada com formol a 4 % para identificação das espécies. A quantificação seguiu o método de Ütermol sendo as amostras fixadas com lugol-acético. As florações eram compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii, com densidades entre 105 a 109 células/mL. Os camundongos testados apresentaram sinais de hepatoxicidade e morte entre 1 e 3 horas. A análise de HPLC constatou a presença de microcistina-LR nas 7 amostras testadas: Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves jul/2004 (34,21 µg.g-1) e out/2004 (172,60 µg.g-1);Gargalheiras, jan/2005 (123,31 µg.g-1),mar/2005 (101,58 µg.g-1),abr/2005(30,64 µg.g-1); Itans, abr/2005 (149,74 µg.g-1) e Passagem das Traíras (86,08 µg.g-1). A quantidade de células e microcistina-LR encontrada na água dos reservatórios estão acima do limite máximo aceitável para consumo humano segundo a OMS e a Portaria 518 de março/2004 do Ministério da Saúde do Brasil. Microcistina-LR é potente produtora de tumores no fígado e sua presença na água coloca em risco à saúde da população. É necessário e emergencial o monitoramento e o tratamento de cianotoxinas nos mananciais de abastecimento de água no estado do Rio Grande do Norte.

APOIO: FAPERN/CNPq

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07- Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.

EFEITO DE CULTURAS TÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii E Anabaena spiroides SOBRE Litopenaeus vannamei (Crustacea,

Decapoda)

Mendonça, J. M. S.¹, Costa, I. A. S.², Santos, A.P. 3; Marinho, L. A. 3

& Martins, M. C.3

¹ PPG em Bioecologia Aquática (DOL/UFRN), Natal/RN, Brasil ² DMP/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil

3 Graduação em Ciências Biológicas (UFRN), Natal/RN, Brasil ([email protected])

O camarão cultivado Litopenaeus vannamei representa o principal produto de exportação do Rio Grande do Norte. No entanto, esta atividade tem contribuído com a eutrofização de rios e reservatórios do estado, favorecendo o aumento na incidência de florações tóxicas de cianobactérias nestes ambientes e, consequentemente, nos viveiros de produção do camarão. Cianotoxinas compromete a qualidade da água e afeta a biota aquática. Também podem ser bioacumuladas na cadeia trófica e atingir a saúde humana através da ingestão do camarão. Nesse estudo, foram realizados testes de toxicidade com cepas tóxicas de Cylindrospermopsis raciborskii (ITEP 028) e Anabaena spiroides (ITEP 026), espécies formadoras de florações em viveiros de água doce do estado, em pós-larvas de camarão marinho aclimatado Litopenaeus vannamei(Pl15). As cepas foram cultivadas em meio ASM-1 e o teste foi realizado utilizando extrato bruto centrifugado, obtido a partir das culturas liofiliozadas. As cepas tóxicas C. raciborskii e A. spiroides causaram efeito letal com 100% de morte das pós-larvas do camarão em 36 horas, com a concentração de 0,5 mg.mL-1 de extrato bruto das culturas tóxicas. Estes resultados evidenciam que cianotoxinas são letais para as pós-larvas do camarão L. vannamei. Portanto, a liberação de cianotoxinas das células de cianobactérias durante a senescência natural das florações no viveiro pode diminuir drasticamente a produção de camarão acarretando grandes prejuízos financeiros.

APOIO: FAPERN/CNPq

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08 - Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.

EFEITO DE MICROCISTINAS DE FLORAÇÕES NATURAIS E SAXITOXINAS DE CULTURAS DE CIANOBACTÉRIAS, SOBRE Ceriodaphnia silvestrii

(Crustácea, Cladocera)

Mendonça, J. M. S.¹, Santos, A. P. ², Marinho, L. A. ² &Martins, M. C. ² & Costa, I. A. S. 3

¹ PPG em Bioecologia Aquática (DOL/UFRN), Natal/RN, Brasil ² Ciências Biológicas (UFRN), Natal/RN, Brasil

3 Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil ([email protected])

No Rio Grande do Norte, é comum a ocorrência de florações tóxicas de cianobactérias em reservatórios de abastecimento humano. Foram investigados os efeitos ecotoxicológicos de florações naturais de cianobactérias ocorridas em reservatórios de água para abastecimento humano do RN e de cepas tóxicas e não tóxicas de Cylindrospermopsis raciborski sobre Ceriodaphnia silvestrii. Amostras de florações naturais foram coletadas com rede de plâncton (20 m) nos reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (06o S e 37o W) em julho de 2004 e Gargalheiras (08º L e 39º W) em março e outubro de 2005. Cepas C. raciborskiinão tóxicas e produtoras de saxitoxinas foram gentilmente cedidas pelo Dr. Renato Molica da UFRPE. A toxicidade das florações foi confirmada por bioensaios com camundongos e análise em HPLC. Os testes de toxicidade com Ceriodaphnia silvestrii seguiram a norma da ABNT, 2001. Cinco neonatos com idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes concentrações (0-800 mg.L-

1) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48 horas. Três replicatas por tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH, temperatura e oxigênio dissolvido no início, com 24 e 48 horas. Os dados dos testes foram sumarizados e analisados usando o método Trimmed Spearman-Karber para estimação da CL50.As florações eram compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii. Todas as amostras de floração investigadas registraram toxicidade para C. silvestrii, comvalores de CL50-24h de 47.48 mg.L-1 e CL50-48h de 38.15 mg.L-1 para GARG mar/05; CL50-24h de 127.71 mg.L-1 e CL50-48h de 105.79 mg.L-1 para ARG jul/04; CL50-24h de 300.39 mg.L-1 e CL50-48h de 149.89 mg.L-1 para GARG 10/05. Valores de CL50-24h e CL50-48h para ITEP018 foram de 228.05 e 120.28 mg.L-1,respectivamente. Não houve mortalidade dos C. silvestrii nos testes com a cepa de C. raciborskii não-tóxica. O teste de toxicidade com C. silvestrii se mostrou eficiente para detecção de microcistinas e saxitoxinas dissolvidas na água.

APOIO: FAPERN/CNPq

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09 – Artigo Científico Submetido a Revista FAPERN, v.1, n.04, jul/ago, 2006.

FLORAÇÕES DE ALGAS NOCIVAS: AMEAÇA ÀS ÁGUAS POTIGUARES

Ivaneide Alves Soares da Costa, Amanda Palhares dos Santos, Adriano Augusto Silva, Sheila Gomes de Melo, Juska Milena dos Santos Mendonça, Renata de Fátima Panosso e Magnólia Fernandes Florêncio Araújo

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, [email protected]

RESUMO

Estudos realizados em diferentes e importantes ambientes aquáticos do Estado do Rio Grande do Norte (reservatórios, rios, lagoa costeira, estuários e viveiros de camarão), no período de 2003 a 2005, diagnosticaram intenso processo de eutrofização artificial. Como conseqüência, reservatórios do semi-árido vêm desenvolvendo freqüentes florações de cianobactérias tóxicas, o que compromete sua utilização para o abastecimento humano. Os resultados aqui apresentados mostram a presença excessiva de cianobactérias nos reservatórios, o que representa uma ameaça constante. Por isso, o monitoramento desses organismos deve ser permanente, visando à proteção da saúde humana e dos recursos hídricos.Palavras-chave (Key words): eutrofização, cianobactérias, cianotoxinas.

INTRODUÇÃO

No Rio Grande do Norte, apesar da grande diversidade, os ecossistemas aquáticos encontram-se ameaçados por atividades da agroindústria pela aqüicultura, as quais são de grande importância econômica na região. A perda da qualidade da água prejudica o seu uso para diversos fins, dentre eles o doméstico, irrigação, lazer, aquicultura e outros, promovendo graves conseqüências para biota aquática e à saúde pública. Neste panorama, investigações voltadas à qualidade da água são de importância vital para o desenvolvimento sócio-econômico do Estado.

Importantes reservatórios do semi-árido potiguar, denominados regionalmente como açudes ou barragens, apresentam frequentemente uma cor verde, parecida com uma “sopa de ervilha”, na superfície da água. A cor verde é típica de Florações de Cianobactérias, formadas pela proliferação exagerada desses microrganismos (Figuras 1 e 2). Esse fatodenuncia o alto nível de Eutrofização Artificial, que é um tipo de poluição das águas causada pelo excesso de nutrientes, principalmente nitrogênio e fósforo. Esses

nutrientes estão contidos na matéria orgânica lançada por despejos de esgotos domésticos e industriais e são acumulados nos corpos d’água. Agro-fertilizantes oriundos da fruticultura e o excesso de nutrientes provenientes das rações utilizadas nas atividades de piscicultura e carcinicultura parecem contribuir significativamente para a eutrofização desses ambientes (COSTA et al., 2005 a e b, 2006). A oferta de nutrientes, associada à maior intensidade de luz e calor, águas alcalinas e elevado tempo de residência da água, como é o caso das águas do semi-árido potiguar, favorecem a dominância de cianobactérias nesses ambientes,

As Florações de cianobactérias figuram como uma das sérias conseqüências da eutrofização, por causarem grande impacto ambiental, social e econômico. Também comprometem a qualidade da água e do pescado, afetando o equilíbrio dos corpos d`água, a sobrevivência dos animais aquáticos e a saúde humana, além de aumentar o custo de tratamento da água. Os principais efeitos observados na água são alterações na cor, sabor e odor, tornando-a imprópria para o consumo humano. A decomposição

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das florações de cianobactérias leva à desoxigenação da água promovendo a morte de organismos aquáticos.

Entretanto, o efeito mais grave é o fato de várias espécies serem capazes de produzir e liberar toxinas (cianotoxinas)na água, as quais podem se acumular na musculatura de peixes ou camarões e produzir diferentes sintomas de intoxicação (hepatotóxicos e neurotóxicos). As pessoas podem se intoxicar bebendo a água, comendo peixes ou camarão contendo a toxina ou através de atividades de recreação. O tipo mais comum de intoxicação é causado por hepatoxinas (microcistinas) cujos sintomas são os mesmos de uma gastroenterite, tais como vômitos, dor abdominal e diarréia. A microcistina é potencial produtora de tumores no fígado, quando ocorre ingestão de água contendo a toxina, mesmo em baixas concentrações, por longos períodos (ver quadro 1).

Os ambientes que apresentam florações tóxicas devem ser monitorados e interditados para o banho, pesca e abastecimento doméstico, caso excedam os limites máximos permitidos pela legislação que regulamenta os padrões de potabilidade da água (Portaria no

518/março/2004 do Ministério da Saúde e da resolução no 357/2005 o CONAMA).O máximo tolerável para banho e para consumo humano, por exemplo, é a presença de cem e vinte mil células de cianobactérias em cada mililitro d’água, respectivamente. Quando a água atinge a cor verde, encontramos pelo menos um milhão de células de cianobactérias por mililitro de água.

A presente pesquisa tem como objetivo diagnosticar e avaliar as condições ecotoxicológicas, com base na incidência de cianobactérias e cianotoxinas, de importantes ambientes aquáticos (reservatórios artificiais, rios, lagoas costeiras e viveiros de camarão) do Estado do Rio grande do Norte.

SÍNTESE DOS RESULTADOS

A maioria dos ambientes investigados (70%) foram classificados como eutróficos, de acordo com os níveis de nutrientes (fósforo total), clorofila-a,turbidez da água e incidência de cianobactérias e cianotoxinas. Foram investigados 19 reservatórios, 11 fazendas de cultivo de camarão Litopenaeus

vannamei de água doce e salgada, 4 rios e a lagoa costeira de Guaraíra.

Freqüentes e duradouras florações tóxicas de cianobactérias ocorreram principalmente em reservatórios do semi-árido, os quais são utilizados principalmente para abastecimento humano. Eles estão localizados nas bacias Apodi-Mossoró (Lucrécia, Pau dos Ferros, Tenente Ananias e Pilões), Piranhas-Assu(Armando Ribeiro, Gargalheiras e Passagem das Traíras) e Trairi (Açude Traíri).

Em diversos ambientes foram encontradas elevadas concentrações de clorofila-a e fósforo total, respectivamente,

800 g/L e 350 µg/L. A dominância de cianobactérias na maioria dos ambientes foi superior a 90% da biomassa total do fitoplâncton.

Florações hepatotóxicas foram observadas em 60% dos reservatórios. Elevados níveis de microcistinas ( 30

172 µg/L) foram encontrados nos reservatórios Itans, Passagem das Trairas, Sabugi, Pilões, Lucrécia, Tenente Ananias, Pau dos Ferros, Gargalheiras, Armando Ribeiro e no rio Assu. Esses valores estão muito acima do limite máximo permitido para consumo humano, que é de 1µg/L. Apesar da ocorrência de florações em viveiros de camarão de água doce e estuarina, a toxicidade foi comprovada apenas em um cultivo que capta água do rio Assu. A densidade de cianobactérias é extremamente alta nos pontos de captação dos cultivos (rios, estuários e lagoas) em alguns períodos, evidenciando o efeito poluente das descargas dos viveiros nesses ambientes.

CARMICHAEL, W. W. Health effects of toxin-producing cyanobacteria: The CyanoHABs. Human and Ecological Risk Assessment: 75 1393-1407pp., 2001.

ba

COSTA, I. A. S.; Azevedo, S. M.O. ; CHELLAPPA, N. T. ; Senna, P.A.C. ; Bernardo, R. R. ; Costa, S. M. The occurence of toxic-producing cyanobacterial blooms in a semi-arid reservoir in the northeast Brazil. Brazilian Journal of Biology,São Paulo, 66(1b):29-41, 2006 (in press).

Figura 1. Aspecto de uma floração hepatotóxica (microcistina) na Barragem Armando Ribeiro Gonçalves em julho/2004 (a); Visualização microscópica das espécies potencialmente tóxicas contidas na amostra, Microcystis aeruginosa e Microcystis panniformis (b).

COSTA,I.A.S.; SILVA, P.F.; SANTOS,A,P.; SILVA,R.S.; MELO,S.M.; SAMPAIO, T.B.M. Ocorrência de florações tóxicas de cianobactérias em reservatórios de abastecimento humano no Estado Do Rio Grande Do Norte. In: X Congresso Brasileiro de Limnologia, 2005, Ilhéus/BA. Resumos do X Congresso Brasileiro de Limnologia, 2005.

ca b

Figura 2. Cianobactérias em viveiros de camarão de água doce: (a) Anabaena circinalis; (b) Cylindrospermopsis raciborskii; (c) Anabaenopsis

sp.

COSTA,I.A.S.; SILVA, P.F.; SANTOS,A,P.; SILVA,R.S.; MELO,S.M.; SAMPAIO, T.B.M..AVALIAÇÃO DO FITOPLÂNCTON COM ÊNFASE EM CIANOBACTÉRIAS EM VIVEIROS DE CAMARÃO NO RIO GRANDE DO NORTE. In: X Congresso Brasileiro de Limnologia, 2005, Ilhéus. Resumos do X Congresso Brasileiro de Limnologia, 2005.

CONCLUSÕES

Os índices de cianobactérias e cianotoxinas diagnosticados neste estudo são preocupantes e, por isso, autoridades e população devem ser alertadas sobre o problema. A implementação de uma proposta de manejo que tenha como objetivo a minimização dos efeitos da poluição e a concepção de mecanismos de gestão mais eficientes, voltados à conservação de mananciais do Rio Grande do Norte, além de emergenciais, devem ser seriamente considerados no planejamento ambiental e sócio-econômico do estado.

ABSTRACT Recent studies in different and important reservoirs in aquatic environments of Rio Grande do Norte (reservoirs, lakes, estuaries and shrimps farms) have diagnosed an intense process of artificial eutrophication. In consequence, some reservoirs in the semi-arid region have developed frequent blooms of toxic cyanobacteria. The results presented here shows a permanent risk of cyanotoxins in supply waters, and need for monitoring.

REFERÊNCIAS

AZEVEDO, S.M.F.O. Toxinas de cianobactérias: Causas e conseqüências para a saúde pública. Medicina on line, 1 (3): 1-22, 1998.

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QUADRO 1: O QUE SÃO CIANOBACTÉRIAS E CIANOTOXINAS?

Cianotoxinas são toxinas produzidas pelas Cianobactérias. Estes microrganismos também são denominados de algas azuis ou cianofíceas pelo fato de possuírem um pigmento verde-azulado, a ficocianina, além da clorofila-a e carotenos. São procariontes como as bactérias (não possuem material nuclear envolvido por membranas) e fotossintetizantes aeróbicos como vegetais e algas (modo de produzir energia utilizando a luz solar, liberando oxigênio). Surgiram no planeta há 3,5 bilhões de anos, sendo, portanto foram os primeiros organismos a produzirem oxigênio na atmosfera. Podem ocorrer em ambientes marinhos e estuarinos, mas predominam em água doce. Nestes ambientes, apresentam ampla diversidade de formas devido às suas adaptações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas adquiridas durante a sua história evolutiva. As cianotoxinas são produtos naturais tóxicos produzidos por esses microrganismos, cujas causas ainda não foram devidamente esclarecidas, sendo sua síntese geneticamente determinada. Os principais mecanismos de toxicidade das cianotoxinas são: neurotóxicos (produzem danos ao sistema nervoso), hepatotóxicos (danos ao fígado, aparecimento de tumores) e dermatotóxicos(irritantes ao contato com a pele). As cianotoxinas de maior ocorrência no semi-árido potiguar sãomicrocistinas, seguidas de saxitoxinas. As microcistinas responsáveis por intoxicações agudas ou crônicas, podendo causar hepatotoxidade (diarréia, cólicas e hemorragia no fígado) e câncer hepático. As saxitoxinas são um grupo de neurotoxinas cujos sintomas de intoxicação humana incluem tontura, adormecimento da boca e extremidades, fraqueza muscular, náusea, vômito e taquicardia. Cianotoxinas não são inativadas pela fervura e quando suas células são quebradas por ação de algicidas e/ou cloro (substâncias químicas que matam algas), liberam a toxina na água. Por este motivo, a legislação brasileira proíbe o uso de algicidas em águas de abastecimento humano com florações. (VEJA MAIS EM: CARMICHAEL 2001 e AZEVEDO 1998).

Agradecimentos: FAPERN/CNPq pela bolsa de pesquisa. A UFRN pelo apoio concedido. A UNP pela realização dos bioensaios em camundongos. A Dra. Sandra Azevedo/UFRJ e ao Dr. Ernani Pinto/ USP pelo apoio e realização das análises de cianotoxinas e a CAERN pelo apoio em algumas coletas.

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