universidade federal do rio grande do …...alguém mais ético, honesto e inocente. você sempre...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LUCIANA MARIA ARAÚJO RABÊLO
INDUÇÃO DE MORTE CELULAR EM CÉLULAS DE
ADENOCARCINOMA CERVICAL HUMANO (HeLa) PELA LECTINA DA
ESPONJA Cinachyrella apion (CaL)
NATAL 2011
LUCIANA MARIA ARAÚJO RABÊLO
INDUÇÃO DE MORTE CELULAR EM CÉLULAS DE
ADENOCARCINOMA CERVICAL HUMANO (HeLa) PELA LECTINA DA
ESPONJA Cinachyrella apion (CaL)
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Elizeu Antunes dos Santos.
NATAL 2011
Dedico esta obra a meu filho Lucas Gabriel. Peço desculpas por todos os momentos em que não
estive presente e agradeço por todos os abraços, as brincadeiras e as declarações de amor que trocamos
todos os dias. Te amo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado forças para seguir meu sonho e por ter me
guiado, mesmo nos momentos em que eu achava que estava tudo perdido.
Ao meu filho, o menino mais bonito do mundo, quem me dá forças para levantar todos os dias, o
mais charmoso e mais querido. Agradeço a Deus a cada momento por ter me iluminado, me permitindo
ser mãe de uma pessoa tão especial. Te amo demais, gordinho.
A minha família, em especial aos meus pais João e Lúcia Rabêlo, pelo apoio em vários momentos da
minha vida, principalmente por me ajudarem cuidando de Lucas quando eu estava no laboratótio,
sempre preocupados com o seu bem-estar. Obrigado por suportarem comigo todas as dificuldades que
surgiram pelo caminho.
Ao meu namorado Thiago Cardozo, por ter ido além de seus limites para ficar comigo,
principalmente nos últimos meses, em que eu estava tão ocupada que mal tinha tempo para vê-lo. Te
amo muito e agradeço pela paciência e carinho. Sei que foi difícil, mas conseguimos superar mais essa
etapa.
A Gabriela Queiroz, a pincesa... Você pode estar a milhares de quilômetros de distância, mas vai
sempre parecer que está aqui do meu lado, escutando meus desabafos, rindo, me chamando pra ir fazer
exercícios na praia... Os anos podem passar... a impressão que dá é que você nunca foi embora. E nunca
foi mesmo. Você sempre esteve comigo, aqui no meu coração. Te amo, incondicionalmente.
Ao meu compadre André Vianna e sua ilustríssima mulher grávida Christiane Medeiros. Não
poderia ter escolhido melhor os padrinhos de Lucas. Tenho muito orgulho de vocês e agradeço todos os
dias a Deus pela nossa amizade; também agradeço a vocês pelo meu segundo filho, até que enfim Lucas
ganhou companhia! Amo muito os dois, ou melhor... os três!
A Marcela Ohana, por tudo o que nós passamos, por ter sido tão companheira por todos esses anos.
Muito obrigada por deixar que eu fizesse parte da sua vida e por ter “emprestado” sua família. Agradeço
a Patrícia, Dona Ítala, Seu Leão, Guilherme... Vocês são muito importantes para mim. Amo vocês.
Aos meus amigos da graduação, Marília, Aline, Tanágara, Kaline, Cleysyvan, Tiara, Tieme,
Anderson, Luíza Barros, Luísa, Marcela, Amanda, André, Chris, Duda, Virgínia, Denis, Raphael, Breno,
Ludovico, Rodrigo... Só tenho a agradecer todos os momentos em que passamos juntos. Vocês são muito
especiais para mim.
Aos meus amigos da turma de mestrado, em especial a Ruth, Rafael, Leonardo, Jana Dara, Dayse
Caroline, Dayse Santos, Marcos, Angélica e Roberta. Obrigada por tudo, sem a ajuda de vocês tudo seria
mais difícil.
A Adeliana de Oliveira, minha mãe no laboratório. Uma das maiores pesquisadoras que já conheci,
muito determinada e preocupada com todos. Muitas pessoas devem a maior parte do conhecimento
adquirido em bancada a ela, inclusive eu. Não importa o quanto eu fale o quanto você é importante para
mim, nunca será o suficiente. Estarei sempre com você, em tudo o que precisar. Te amo.
A Norberto Monteiro, meu Best Friend Forever (risos). Sou uma das poucas pessoas que te conhece
de verdade. Você foi meu ponto de apoio em vários momentos (bons e ruins) da minha vida, sempre serei
grata pela sua amizade.
A Raphael Russi, uma das pessoas mais curtas e grossas que já conheci, acho que é por isso que nos
damos tão bem! Gosto demais de você. Não vou ser melosa, sei que você não gosta. Te adoro.
A Raphael Serquiz, meu aluno de Iniciação Científica mais guerreiro. Só você mesmo pra aturar
todas as minhas implicâncias. É o aluno de iniciação mais competente do laboratório, sei que você vai
longe. Mamãe ama.
A todos os meus amigos do LQFPB, Paula, Richele, Vanessa, Jonalson, Anderson, Ticiana, Roberta,
Dayse, Patrícia, Phelippe, Júlia, Marie, Joyce, Vanessa Lima, Fabiana, Fabíola, Jonas, Lorena e Alexandre
Serquiz, sem vocês o dia de trabalho seria muito chato. Obrigada por todos os momentos que
compartilhamos dentro e fora do laboratório.
Às professoras Adriana Uchôa e Ana Heloneida, por todos os conselhos, broncas e momentos de
descontração. Vocês foram uma parte essencial para o desenvolvimento deste trabalho e de muitos
outros. Obrigada.
Ao Dr. Elizeu Antunes dos Santos, por ter sido mais que um orientador para mim. Não tenho como
agradecer todo o tempo que eu fiz você perder com minhas sessões desabafo, minhas choradeiras e
reclamações. Considero-te como um pai, com o mesmo respeito e amor. Para mim, não existe no mundo
alguém mais ético, honesto e inocente. Você sempre será o meu modelo, em tudo. Muito obrigada e me
desculpe por ter sido tão chata com você.
Ao Dr. Maurício Pereira de Sales (in memmorian), pela amizade, confiança e por ter me aceitado
em seu laboratório da primeira vez em que fui trabalhar no Departamento de Bioquímica. Nunca vou
esquecer nossas briguinhas, os gritos que você me dava e as vezes que você me fazia parar um
experimento para ir comer salgado na cantina. Obrigada.
Aos meus grandes amigos do BIOPOL, em especial Ruth, Rafael, Nednaldo, Leonardo, e Jailma. Sem
vocês meu dia não fica completo. Agradeço toda a ajuda, as brincadeiras, até as brigas com Ruth (a única
pessoa que brigou com todo mundo do departamento). Vocês, com certeza, contribuem para que eu seja
uma pessoa muito mais feliz. Adoro vocês.
Ao Dr. Hugo Rocha, por todos os conselhos na minha qualificação e por todos os momentos de
descontração. Obrigada por sempre permitir meu acesso em seu laboratório e por contribuir fortemente
para a conclusão deste trabalho. Só não vou agradecer o fato de você sempre roubar minha comida
(brincadeira)! Obrigada.
Aos professores do Departamento de Bioquímica, que de alguma forma, contribuíram para a minha
formação. Obrigada.
Aos integrantes dos demais laboratórios do Departamento de Bioquímica, em especial a Raquel, por
ter me acompanhado em meus experimentos finais. Muito obrigada pela sua ajuda!
Ao pessoal da limpeza, principalmente Jonas e Angela, pelo café e por sempre manter o
departamento em ordem. Muito obrigada.
Ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
pelas condições necessárias para o desenvolvimento deste trabalho.
Á Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento desta pesquisa.
Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas
usadas, que já tem a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares.
É o tempo da travessia: e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, à margem de nós mesmos.
Fernando Pessoa.
RESUMO
O câncer é um termo utilizado para representar um conjunto de mais de 100 patologias, incluindo tumores malignos de diferentes localizações. As neoplasias malignas constituem a segunda causa de morte na população brasileira, representando aproximadamente 17% dos óbitos de causa conhecida. Estratégias que induzem à diferenciação têm tido sucesso limitado no tratamento de cânceres estabelecidos. Neste trabalho, uma lectina purificada da esponja marinha Cinachyrella apion (CaL) foi avaliada quanto às suas atividades hemolítica, citotóxica, antiproliferativa e quanto à capacidade de indução de morte celular pela via de apoptose em células tumorais. A atividade antiproliferativa de CaL foi testada contra linhagens celulares, com maior taxa de inibição do crescimento para a linhagem tumoral HeLa, induzindo a inibição de maneira dose dependente na concentração de 10 µg/mL. A atividade hemolítica e a toxicidade contra células do sangue periférico foram testadas utilizando a concentração de IC50 para ambos os ensaios e o dobro da IC50 para a análise em citometria de fluxo, indicando que CaL não é tóxica para estes tipos celulares. Para avaliar o mecanismo de morte celular induzida por CaL nas células HeLa, foi realizada a citometria de fluxo e western blotting. Os resultados mostraram que a lectina induz morte celular por apoptose através da ativação da proteína pró-apoptótica Bax, além de promover a parada do ciclo celular na fase S, com acúmulo de células de aproximadamente 57% nesta fase, agindo tanto de maneira dependente como independente de caspases. Estes resultados sugerem que a CaL possui potencial para ser utilizado como fármaco no tratamento contra o câncer. Palavras-chave: HeLa. Lectina. Antitumoral. Esponja marinha. Cinachyrella apion.
ABSTRACT
Cancer is a term used to represent a set of more than 100 diseases, including malignant tumors from different locations. The malignancies are the second leading cause of death in the population, representing approximately 17% of deaths of known cause. Strategies that induce differentiation have had limited success in the treatment of established cancers. In this work, a lectin purified from the marine sponge Cinachyrella apion (CaL) was evaluated due to its hemolytic, cytotoxic and antiproliferative properties, besides the ability to induce cell death via apoptosis in tumor cells. The antiproliferative activity of CaL was tested against cell lines, with the highest inhibition of tumor growth for HeLa, reducing cell growth at a dose dependent manner, with a concentration of 10 µg/mL. The hemolytic activity and toxicity against peripheral blood cells were tested using the concentration of IC50 for both trials and twice the IC50 for analysis in flow cytometry, indicating that CaL is not toxic to these cells. To assess the mechanism of cell death caused by CaL in HeLa cells, we performed flow cytometry and western blotting. The results showed the lectin probably induces cell death by apoptosis activation by pro-apoptotic protein Bax, promoting mitochondrial membrane permeabilization, cell cycle arrest in S phase, with accumulation of cells of approximately 57% in this phase, and acting as both dependent and/or independent of caspases pathway. These results suggest that CaL has the potential to be used as drug treatment against cancer.
Keywords: HeLa. Lectin. Antitumor. Marine Sponge. Cinachyrella apion.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Capacidades adquiridas por uma célula para que se torne cancerígena. . 18
Figura 2 – Esquema mostrando as alterações progressivas na célula em apoptose.20
Figura 3 - Ilustração esquemática das vias de morte celular por apoptose. .............. 22
Figura 4 - Figura esquemática dos órgãos reprodutores femininos. ......................... 26
Figura 5 - Interação célula-célula mediada por lectinas. ........................................... 29
Figura 6 - Estrutura das esponjas. ............................................................................ 34
Figura 7 - Esponja marinha Cinachyrella apion. ........................................................ 43
Figura 8 - Desenho esquemático dos passos de purificação da lectina de esponja Cinachyrella
apion (CaL). ...................................................................................................... 46
Figura 9 - Perfil cromatográfico de CaL em coluna de exclusão molecular e determinação da
massa molecular. .............................................................................................. 55
Figura 10 - Eletroforese (SDS-PAGE) da CaL, em presença do agente redutor DTT.55
Figura 11 – Inibição da hemaglutinação de CaL. ...................................................... 56
Figura 12 – Curva de termoestabilidade de CaL. ...................................................... 57
Figura 13 – Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina (CaL). ........... 57
Figura 14 – Efeito da CaL sobre a viabilidade das linhagens celulares PC3, HeLa e 3T3. 59
Figura 15 – Avaliação da citotoxicidade de CaL sobre a linhagem tumoral HeLa. .... 60
Figura 16 - Citometria de fluxo do sangue periférico humano na presença e ausência de CaL.
.......................................................................................................................... 60
Figura 17 - Avaliação do efeito hemolítico de CaL sobre hemácias humanas. ......... 61
Figura 18 – Micrografia de células HeLa tratadas com CaL. ..................................... 62
Figura 19 – Citometria de fluxo de células HeLa tratadas com Anexina V/PI e CaL (em presença
e ausência de Z-VAD-FMK). ............................................................................. 64
Figura 20 – Avaliação de parada de ciclo celular após exposição à CaL. ................. 65
Figura 21 – Immunoblotting de proteínas envolvidas em morte celular por apoptose.67
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultados da purificação da lectina da esponja Cinachyrella apion em diferentes
etapas. .............................................................................................................. 56
Tabela 2 - Análise do efeito citotóxico de CaL sobre sangue periférico total. ........... 61
LISTA DE ABREVIAÇÕES/SIGLAS
AIF – Fator de indução para apoptose
Apaf-1 - Fator de ativação para apoptose-1 ATCC – American Type Culture Collection
ATP – Adenosina trifosfato
BSA – Albumina sérica bovina
CaL – Lectina da esponja marinha Cinachyrella apion
CvL – Lectina da esponja marinha Cliona varians
DAPI – 4',6-diamidino-2-fenilindol
DISC – Complexo de sinalização indutor de morte
DMEM – Dulbecco's modified Eagle's medium
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
DRC – Domínio Reconhecedor de Carboidratos
DTT – Ditiotreitol
EGF – Fator de crescimento epidermal
ELISA – Ensaio de Ligação Imunoenzimática
EndoG – Endonuclease G
FITC – Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocyanate)
HPV – Papilomavirus Humano
IAPS – Proteínas inibidoras de apoptose
INCA – Instituto Nacional do Câncer JNK – c-Jun N-terminal quinase
MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NF-Ƙb – Fator nuclear kappa B
Omi – Regulador negativo de IAPS
PBS – Tampão Fosfato Salino
PCR – Proteína C reativa
PI – Iodeto de Propídio
PVDF – Fluoreto de Polivinilideno
RPM – Rotações por minuto
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SFB – Soro Fetal Bovino
Smac - Ativador secundário mitcondrial de caspases
TBS – Tampão Tris Salino
TBST – Tampão Tris Salino com Tween 20
TEMED – N’,N’,N’,N’-Tetrametil-1-2-diaminometano
UH – Unidades de Hemaglutinação
Z-VAD-FMK - Carbobenzóxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]fluorometilcetona
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 17
1.1. CÂNCER ............................................................................................ 17
1.2. APOPTOSE ........................................................................................ 20
1.3. ADENOCARCINOMA CERVICAL HUMANO ..................................... 26
1.4. LECTINAS .......................................................................................... 28
1.5. CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS .................................................... 29
1.6. DISTRIBUIÇÃO NOS ORGANISMOS ................................................ 31
1.7. LECTINAS EM INVERTEBRADOS .................................................... 32
1.8. ESPONJAS MARINHAS E LECTINAS ............................................... 33
1.9. LECTINAS DE ORIGEM MARINHA NO COMBATE DO CÂNCER .... 37
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 40
2.1. OBJETIVO GERAL............................................................................. 40
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................. 40
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 41
3.1. MATERIAIS ........................................................................................ 41
3.1.1. Equipamentos ................................................................................ 41
3.1.2. Reagentes ...................................................................................... 42
3.1.3. Material Biológico ........................................................................... 42
3.2. MÉTODOS ......................................................................................... 44
3.2.1. Preparação da lectina de esponja marinha Cinachyrella apion (CaL) 44
3.2.2. Dosagem proteica .......................................................................... 46
3.2.3. Dosagem de açúcares totais .......................................................... 46
3.2.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturante (SDS-PAGE)
46
3.2.5. Citotoxicidade sobre células do sangue periférico humano e Atividade
Hemolítica in vitro ............................................................................................... 47
3.2.6. Cultura de células .......................................................................... 48
3.2.7. Ensaio de Proliferação Celular ....................................................... 48
3.2.8. Ensaio de Inibição da Atividade Lectínica em Cultura de Células . 49
3.2.9. Avaliação dos indicadores de apoptose por incubação com DAPI 49
3.2.10. Citometria de Fluxo ...................................................................... 50
3.2.11. Western Blotting ........................................................................... 51
3.2.12. Análises Estatísticas .................................................................... 52
4. RESULTADOS .......................................................................................... 54
4.1. Isolamento, purificação e caracterização de CaL ............................... 54
4.2. Ensaios em cultura de células ............................................................ 58
4.2.1. Efeitos de CaL sobre a Proliferação Celular .................................. 58
4.2.2. Avaliação da citotoxicidade sobre células do sangue periférico humano e da
atividade hemolítica de CaL ............................................................................... 60
4.2.3. Determinação de efeito apoptótico de CaL sobre células HeLa por incubação
com DAPI 61
4.2.4. Indução de morte celular em linhagem tumoral HeLa pela ação de CaL
62
5. DISCUSSÃO ............................................................................................. 68
6. CONCLUSÃO ........................................................................................... 77
7. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 78
INTRODUÇÃO - 17
1. INTRODUÇÃO
1.1. CÂNCER
Câncer é um termo utilizado para designar o conjunto de mais de 150 doenças que têm em
comum o crescimento desordenado de células, causadas por alterações nos programas de
crescimento celular. Portanto, o tumor é resultante do desenvolvimento anormal das células, pois
mesmo que o organismo possua mecanismos de defesa para evitar seu surgimento, as células
cancerosas encontram uma maneira de se desviar destes mecanismos e sobreviver, enquanto
células normais seguem programadas para manter o funcionamento do organismo (WEINBERG,
2008). Os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer podem ser hereditários ou
encontrados no meio ambiente, como o meio ambiente em geral (água, terra e ar), ambiente
ocupacional (quando insalubre), o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida) e o
ambiente de consumo (alimentos, medicamentos). As mudanças provocadas no meio ambiente
pelo próprio homem podem determinar os diferentes tipos de câncer (ALMEIDA, 2005).
Durante o desenvolvimento normal, intrincados sistemas de controle genético regulam o
balanço entre o surgimento de novas células e sua morte em resposta a determinados
mecanismos de sinalização, dentre eles os sinais estimulantes e inibitórios de crescimento e
sinais direcionados à morte celular. Em tecidos específicos, a proliferação celular ocorre de
forma contínua, como uma estratégia de renovação tecidual. Contudo, em alguns determinados
tecidos, as células não proliferam exceto durante processo de regeneração. O câncer se
desenvolve devido a falhas nos mecanismos que geralmente controlam o crescimento e
proliferação celular (Figura 1) (WEINBERG; HANAHAN, 2000).
INTRODUÇÃO - 18
Figura 1 - Capacidades adquiridas por uma célula para que se torne cancerígena. (WEINBERG; HANAHAN, 2000).
Mutações em duas grandes classes de genes estão envolvidas nos estágios iniciais do
câncer: proto-oncogenes e genes supressores de tumor. Os proto-oncogenes são ativados e
convertidos a oncogenes por mutações que causam ativação excessiva na promoção do
crescimento celular, enquanto os genes supressores de tumor geralmente suprimem o
crescimento da célula, portanto, danos a esses genes possibilitam o crescimento celular
inapropriado.
O câncer geralmente resulta de mutações que surgem durante certo período de exposição
à carcinógenos, dentre estes alguns reagentes químicos e radiação ultravioleta. Está claro agora
que milhões de mutações pontuais, translocações, amplificações e deleções contribuem para o
desenvolvimento do câncer, e que o alcance mutacional pode diferir mesmo dentro de tumores
histopatologicamente idênticos (STRATTON; CAMPBELL; FUTREAL, 2009). Essas mutações
induzidas que desencadeiam câncer ocorrem principalmente em células somáticas, não em
linhagens germinativas, e essas mutações não são transferidas para a próxima geração. Em
contraste, certas mutações herdadas, as quais são passadas para a linhagem germinativa,
aumentam a probabilidade do desenvolvimento de tumores em algum momento. Numa parceria
destrutiva, as mutações somáticas podem se combinar com as mutações herdadas, resultando
na iniciação e progressão de tumores. Mesmo que os danos genéticos apareçam em apenas
uma célula somática, a divisão desta célula irá transmitir o dano às células filhas, originando
clones de células alteradas. Raramente, a mutação em apenas um gene culmina do
desenvolvimento de câncer; séries de mutações em múltiplos genes geram uma proliferação
INTRODUÇÃO - 19
celular acelerada que difere da proliferação normal celular, dando oportunidade ao aparecimento
de mutações adicionais. Os clones dessas células se desenvolvem em tumores, porém para que
estes tumores se expandam, é necessária a obtenção de um suprimento de sangue, proveniente
do crescimento de novos vasos capilares a partir de veias sanguíneas preexistentes
(angiogênese); este processo depende da ativação, migração e proliferação de células
endoteliais, rompimento da membrana basal vascular e a subsequente maturação de veias
sanguíneas. A angiogênese é fortemente controlada por fatores pró-angiogênicos (VEGF, Ang1
e Tie2, FGF, HGF, MCP-1, NOS, COX-2, quimiocinas) e anti-angiogênicos (VEGFR-1, Ang2,
TSP-1, -2, angiostatina, endostatina, VEGI, IL-4, IL-12, IL-18, maspina) que são acionados por
uma gama de fatores de crescimento e citocinas. O fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) é um dos fatores mais estudados que apresenta a capacidade de regular tanto
angiogênese fisiológica quanto patológica (DELGADO et al, 2011; CARMELIET; JAIN, 2000). De
acordo com os estágios de progressão do câncer, o tumor se torna um órgão anormal,
incrivelmente adaptado ao crescimento e à invasão de tecidos adjacentes, processo denominado
metástase. Muitas mutações oncogênicas, tais como as que previnem a apoptose ou geram
sinais promotores de crescimento inapropriados podem também ocorrer em células progenitoras
mais diferenciadas, porém que ainda possuem a capacidade de se replicar.
De acordo com o INCA (Instituto Nacional do Câncer), o tratamento do câncer pode ser
feito de várias formas: através de intervenções cirúrgicas, removendo o tumor de sua área
afetada; radioterapia, utilizando feixes de radiações ionizantes, gerando raios gama que
interagem com os tecidos criando efeitos químicos, como a hidrólise da água e a ruptura das
cadeias de DNA, levando á morte celular por vários mecanismos; fotorradiação, método que
permite a localização e destruição de tumores com maior seletividade, devido à radiação
específica com fluorescência (620-640 nm) com uso de fibras óticas; transplante de medula
óssea, que consiste na substituição de uma medula óssea doente, ou deficitária, por células
normais, com o objetivo de reconstituição de uma nova medula; ou quimioterapia, utilizando
medicamentos para o combate ao câncer, com aplicação dos medicamentos, em sua maioria, de
forma intravenosa. Em alguns casos, é necessário combinar mais de uma modalidade para o
tratamento do câncer.
Os tratamentos antineoplásicos citados são capazes de curar cerca de um terço dos
pacientes através de medidas locais (cirurgia e radioterapia) com sucesso quando o tumor ainda
não sofreu metástase. Porém, quando se faz necessário o uso de abordagens sistêmicas, a
INTRODUÇÃO - 20
quimioterapia é a técnica mais empregada para o tratamento de tumores, induzindo a morte
celular via apoptose (ALMEIDA, 2005). O objetivo primário da quimioterapia é destruir células
neoplásicas, porém a maioria dos agentes quimioterápicos não atua de forma específica,
provocando lesão tanto de células malignas quanto células normais. Tal fato explica a maioria
dos efeitos colaterais relacionados a esse tratamento, como náuseas, perda de cabelo e maior
susceptibilidade a infecções.
1.2. APOPTOSE
Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas características
morfológicas e bioquímicas em: apoptose, autofagia, necrose e cornificação, além dos tipos de
morte celular atípicos, como a mitose catastrófica, anoikis, excitotoxicidade, degeneração
Waleriana, paraptose, piroptose, pironecrose e entose (KROEMER, 2009; OKADA; MAK, 2004;
DIMRI, 2005; CASTEDO et al., 2004). Alterações na coordenação desses tipos de morte celular
estão implicadas na tumorogênese (RICCI; ZONG, 2006).
KEER et al.(1972), em um estudo pioneiro, observou um novo tipo de morte celular,
denominado “apoptose”, que parecia ser diferente da morte celular necrótica de hepatócitos
induzida por toxinas. De fato, a apoptose pode ser vista como um processo que elimina células
que sofreram mutações, supérfluas, ectópicas ou com danos. Como mostrado por microscopia
eletrônica, células apoptóticas formam pequenos corpos arredondados, cercados por
membranas, contendo organelas citoplasmáticas intactas ou partes do núcleo. Estes corpos
resultam da progressiva condensação celular, as quais são eventualmente englobadas por
células fagocíticas (Figura 2) (KROEMER; GALLUZZI; BRENNER, 2007).
Figura 2 – Esquema mostrando as alterações progressivas na célula em apoptose. A apoptose em células animais inicia morfologicamente com a condensação e fragmentação da cromatina. Após isso, há a retração da membrana e formação de corpos apoptóticos, seguido de engolfamento por
INTRODUÇÃO - 21
macrófagos ou células vizinhas. Fonte: Adaptado de: Nature Reviews Molecular Cell Biology, v.5, p. 305-315, 2004.
As mudanças morfológicas que caracterizam a morte celular por apoptose são a retração
celular, formação de núcleos picnóticos (condensação da cromatina), cariorréxis (fragmentação
nuclear), formação de “bolhas” e destruição da membrana, fagocitose por células vizinhas e
formação de corpos apoptóticos (KROEMER; GALLUZZI; BRENNER, 2007) (LIU et al., 2011).
Além das mudanças morfológicas, mudanças bioquímicas das células destinadas à morte celular
por apoptose são também observadas, como modificações no citoesqueleto e na membrana
celular para a retração das células, alterações na distribuição dos carboidratos na superfície
celular e a perda da simetria fosfolipídica, resultando na externalização de fosfatidilserina,
facilitando o reconhecimento das células por macrófagos e promovendo ligação diferencial dos
macrófagos às células apoptóticas (HANAYAMA et al., 2004).
Diversos fatores podem desencadear a apoptose, como a ligação de moléculas a
receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, danos no DNA, choque
térmico, privação de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e níveis aumentados
de espécies reativas de oxigênio (EROS) (HENGARTNER, 2000).
Após o estímulo inicial, uma intricada cascata de sinalização pode ativar várias vias para
apoptose em células de mamíferos, destacando dentre estas vias duas principais, a via
extrínseca e a intrínseca (Figura 3).
INTRODUÇÃO - 22
Figura 3 - Ilustração esquemática das vias de morte celular por apoptose. ORRENIUS; NICOTERA; ZHIVOTOVSKY, 2010) (ver descrição no texto).
Ambas as vias de morte apoptótica podem ser divididas em pelo menos três fases distintas:
iniciação, integração/decisão e execução/degradação.
A ativação de uma classe específica de proteases, as caspases, são requeridas para a
execução da apoptose. Contudo, nem todas as caspases são requeridas para a apoptose e o
processo geralmente resulta da ativação de um número limitado de caspases, particularmente as
caspases-3, -6 e -7 (KROEMER, 2007).
Na via extrínseca, receptores de superfície formam um complexo de sinalização de morte
induzida (DISC), resultando na ativação da procaspase-8. Em células tipo I, a caspase-8 ativa a
INTRODUÇÃO - 23
procaspase-3, a qual cliva proteínas alvo, levando a apoptose. Em células tipo II, a caspase-8
cliva Bid, a qual induz a translocação, oligomerização e inserção de Bax e/ou Bak no interior da
membrana externa mitocondrial. A partir desta translocação, há uma liberação de várias
proteínas que pertencem ao espaço intermembrana da mitocôndria, incluindo citocromo c,
formando um complexo citosólico com Apaf-1 (fator de ativação para apoptose-1) e procaspase-
9 (apoptossomo), na presença de dATP. Isto resulta na ativação da procaspase-9, que tem como
alvo a procaspase-3, que age na cascata de sinalização da apoptose na via extrínseca.
Na via intrínseca, os sinais de morte agem direta ou indiretamente na mitocôndria,
causando a liberação de proteínas proapoptóticas de seu espaço intermembrana. Esta via de
morte celular é controlada pela família de proteínas Bcl-2 (regulação da liberação de citocromo
c), proteínas inibidoras de apopotose (IAPs) (inibição de caspases), ativador secundário
mitocondrial de caspases (Smac), e Omi (regulador negativo de IAPs). Bcl-2 é o protótipo da
família de proteínas que contêm pelo menos um domínio de homologia Bcl-2 (BH). Por medidas
de classificação, a família pode ser dividida em proteínas de multidomínio anti-apoptótico
(protótipos: Bcl-2, Bcl-XL), as quais contêm quatro domínios BH (BH1234); proteínas
multidomínio pró-apoptótico (protótipos: Bax, Bak), as quais contêm três domínios BH (BH123); e
proteínas pró-apoptóticas de apenas um domínio, BH3 (Bid, Bad) (LETAI et al., 2002). O sítio
principal de ação das proteínas Bcl-2-like é provavelmente a membrana mitocondrial
(KROEMER; REED, 2000). Como regra, as proteínas BH1234 residem principalmente na
membrana externa da mitocôndria, onde protegem a mitocôndria contra a permeabilização de
membrana, presumivelmente através da ligação e neutralização de outras proteínas pró-
apoptóticas da família Bcl-2, que, ao contrário, induzem a permeabilização da membrana da
mitocôndria.
Em condições fisiológicas, Bax é uma proteína citosólica. Contudo, sob indução de
apoptose, Bax se insere na membrana externa da mitocôndria (WOLTER et al., 1997), onde é
capaz de formar aberturas supramoleculares, sozinha ou em associação com outros membros
pró-apoptóticos como Bak e tBid (Bid truncada) (KUWANA et al., 2002). Tais aberturas devem
resultar da formação de poros a partir da oligomerização de Bax ou da desestabilização da
bicamada lipídica, resultando em descontinuidades transientes dentro da membrana externa da
mitocôndria. A relocalização de Bax é requerida para sua função pró-apoptótica. Se Bax fica
retida no citosol pela interação com autoantígeno Ku de 70 kDa (Ku70), assim como com os
peptídeos derivados de Ku70, o dano mitocondrial e a apoptose é eficientemente prevenida
INTRODUÇÃO - 24
(SAWADA; HAYES; MATSUYAMA, 2003). Apesar das discussões a respeito dos mecanismos
de permeabilização de membrana (ZAMZAMI; KROEMER, 2003), a permeabilização de
membrana pode resultar de uma mudança conformacional de Bax ou Bak (com exposição de
seus terminais NH2), suas completas inserções na membrana mitocondrial como multímeros
homooligoméricos e a formação de poros permeáveis a proteínas. A formação destes complexos
ocorre de maneira independente de caspases e são inibidos completamente e especificamente
por Bcl-XL (NECHUSHTAN et al., 2001).
NF-κB, um fator de transcrição pró-sobrevivência, desempenha um papel essencial na
supressão de apoptose, influenciando na expressão de membros anti-apoptóticos da família Bcl-
2 e IAPS (proteínas inibidoras de apoptose) (PAHL,1999), promoção da proliferação celular e
inflamação, e está intimamente associada ao desenvolvimento do câncer. Em condições
normais, NF-κB se encontra no citoplasma como heterodímero composto por subunidades p50 e
p65, complexadas a IκB. A fosforilação de IκB por IKKβ, seguida pela ubiquitinização e
degradação proteassômica ativa NF-κB, liberando suas subunidades e com consequente
translocação nuclear e ativação de genes anti-apoptóticos (SHEN; TERGAONKAR, 2009).
A proteína treonina/serina quinase AKT, quando ativa, desempenha papel fundamental na
mediação de sinais para o crescimento celular, sobrevivência celular (anti-apoptótica),
progressão do ciclo celular, diferenciação, transcrição, tradução e metabolismo da glicose
(BRAZIL et al., 2004). A ativação de AKT leva a fosforilação de várias proteínas envolvidas na
sobrevivência celular e inibição da apoptose. Por exemplo, a fosforilação da subunidade inibitória
de NF-ƙB (IƙB) por AKT resulta na ativação da via de sobrevivência de NF-ƙB (OZES et al.,
1999). Além disso, a fosforilação dependente de AKT da caspase-9 bloqueia a indução de
apoptose (CARDONE et al., 1998). A fosforilação também implica em proteínas que afetam
diretamente a permeabilização da membrana mitocondrial. Um exemplo é Bad, que é
translocado do citosol para a mitocôndria, onde se liga e inibe Bcl-2 e Bcl-XL, de forma modulada
por seu estágio fosforilado. AKT também pode mediar a inibição de GSK-3β, que em sua forma
ativa (desfosforilada) é capaz de fosforilar a proteína anti-apoptótica da família Bcl-2 Mcl-1,
levando-a a ubiquitinização e destruição por proteassomos (MAURER et al., 2006). AKT pode
inibir apoptose promovendo a ligação de HKII à mitocôndria, que por sua vez pode prevenir Bax
de se ligar a VDAC, que favoreceria a permeabilização de membrana mitocondrial
(PASTORINO; SHULGA; HOEK, 2002).
INTRODUÇÃO - 25
Dentre as inúmeras proteínas que são translocadas para a membrana externa da
mitocôndria, proteínas quinases pertencentes às quinases reguladoras de sinalização para
apoptose (ASK)/cascata de proteínas quinase mitogênio-ativadas (MAPK) podem desempenhar
papel primordial na permeabilização de membrana da mitocôndria. Por exemplo, a subfamília de
quinases c-Jun NH2-terminal (JNKs) são consideradas moléculas sinalizadoras essenciais nos
processos degenerativos do cérebro de mamíferos (HERDEGEN; WAETZIG, 2001). Sob
estresse celular, várias JNKs se associam com a mitocôndria (KHARBANDA et al., 2000;
KURINNA et al., 2004). JNKs inativam proteínas anti-apoptóticas e ativam proteínas pró-
apoptóticas da família Bcl-2 como Bcl-2, Bcl-XL, Bad, Bim ou Dp5 (SCHROETER et al., 2003;
YIN et al., 2005) e podem, desta forma, influenciar na permeabilização da membrana
mitocondrial. A via intrínseca também pode operar por mecanismos independentes de caspases,
os quais envolvem a liberação e translocação de pelo menos duas proteínas da mitocôndria para
o núcleo: o fator de indução para apoptose (AIF) e a endonuclease G (EndoG). Os efeitos
nucleares de AIF incluem a condensação de cromatina e a formação de fragmentos de DNA de
alto peso molecular. O papel de EndoG na morte celular é ainda desconhecido. Quando o dano
ao DNA é o gatilho para a resposta apoptótica, a primeira caspase a ser ativada é a procaspase-
2. Sua ativação também leva à liberação de citocromo c e a formação do apoptossomo, apesar
do mecanismo preciso deste processo ser desconhecido (ORRENIUS; ZHIVOTOVSKY;
NICOTERA, 2003; DIENER, 2010).
Em inúmeros modelos, a mitocôndria é um ponto de checagem crucial para o controle da
apoptose, devido a integração de vários sinais, incluindo fatores endógenos (concentrações de
prótons do citosol e organelas, Ca2+, Mg2+, K+ e Na+, metabólitos como ATP, ADP, NAD(P),
glutationa, segundos mensageiros lipídicos e múltiplas proteínas incluindo quinases e fosfatases)
assim como fatores exógenos (proteínas específicas virais ou xenobióticos). As organelas
mitocondriais reúnem os sinais que induzem e protegem de morte celular a nível de membrana
e, a partir do momento que os sinais de indução de morte superam os de sobrevivência, ocorre a
permeabilização de membrana mitocondrial.
A apoptose na prática clínica é alvo para um potencial uso terapêutico da morte celular por
apoptose ou para a compreensão dos mecanismos de resistência à radioterapia e a
quimioterapia (NICHOLSON, 2000; KIM et al., 2003). A elucidação de alguns dos mecanismos
moleculares da apoptose abririam perspectivas de modulação desses processos. As estratégias
se baseiam em induzir a morte nas células tumorais através do bloqueio de genes com
INTRODUÇÃO - 26
oligonucleotídeos antisense e fármacos convencionais, ou ainda a substituição de função desses
genes com o uso de moléculas recombinantes (NICHOLSON, 2000).
1.3. ADENOCARCINOMA CERVICAL HUMANO
O carcinoma é definido como o conjunto de tumores formados a partir de células epiteliais.
Cânceres derivados de tecidos não-epiteliais são denominados sarcomas, que representam
apenas 1% dos tumores encontrados em clínicas oncológicas.
O cérvix corresponde à parte inferior do útero, também chamado de cérvix uterino,
conectando o corpo do útero à vagina. A parte do cérvix próximo ao corpo do útero é chamada
endocervix, enquanto a parte próxima a vagina é denominada exocervix. Os dois tipos principais
de células que recobrem o cérvix são as células
escamosas (na exocervix) e as células glandulares (na endocervix). O local onde estes dois tipos
celulares se encontram é denominado zona de transformação. A maioria dos cânceres se inicia
nesta zona (Figura 4).
Figura 4 - Figura esquemática dos órgãos reprodutores femininos. (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2010).
INTRODUÇÃO - 27
Os cânceres e pré-cânceres cervicais são classificados de acordo com uma análise
histológica em microscópio. Existem dois tipos principais de cânceres cervicais: o carcinoma
escamoso cervical e o adenocarcinoma, derivados de células epiteliais secretoras (AMERICAN
CANCER SOCIETY, 2010).
Em 2008, a IARC/OMS estimou 12,4 milhões de casos novos e 7,6 milhões de óbitos por
câncer no mundo. No Brasil, as estimativas, para o ano de 2010, serão válidas também para o
ano de 2011, e apontam para a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer. Os tipos mais
incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e
de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). Com aproximadamente 500 mil novos casos por ano no
mundo, o câncer cervical é responsável pelo óbito de, aproximadamente, 230 mil mulheres por
ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), o número de casos novos deste tipo
de câncer esperados para o Brasil é de cerca de 18.000 novos casos.
A incidência de câncer do colo do útero torna-se evidente na faixa etária entre 20 a 29 anos
e o risco aumenta gradualmente com a idade. A etiologia deste tipo de câncer está associada à
infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV), transmitido sexualmente, e à interação entre
diversos fatores de risco, tais como fatores genéticos, ambientais, reprodutivos, uso prolongado
de anticoncepcionais, hormônios, tabagismo, etilismo, má higiene pessoal, deficiências
nutricionais, agentes infecciosos, processo inflamatório de diversas etiologias, agentes
imunossupressores, exposição a carcinógenos químicos e à radiação ionizante e condições
socioeconômicas (BAUER et al., 1993; INCA, 2000; MENDES; SILVEIRA; PAREDES, 2004;
LEAL et al., 2003; SCHIFFMAN, 1995; TABORDA et al., 2000).
Na década de cinquenta, George Gey, um cientista que trabalhou vários anos em
colaboração com Warren Lewis, recebeu uma amostra de células tumorais provenientes de
câncer cervical de uma mulher negra, chamada Henrietta Lacks (MASTERS, 2002). As células
de câncer cervical geralmente apresentam crescimento lento, mas de acordo com os médicos da
época, este tumor apresentava várias características que o diferia dos cânceres comuns: ele era
macio e roxo, não respondia a radioterapia e se mostrava, sem dúvidas, ser um adenocarcinoma
raro – um câncer glandular. A linhagem celular foi denominada HeLa, devido às iniciais do nome
de Henrietta Lacks e se tornou um modelo na pesquisa do câncer.
A cada ano, desde o ano de 1980 até 2000, o número de citações relacionadas à linhagem
HeLa quadruplica. Apenas no ano de 2011, mais de 8.500 trabalhos foram publicados
INTRODUÇÃO - 28
envolvendo esta linhagem celular. Determinação de vias de morte celular através da indução de
biomoléculas como peptídeos (HSU et al., 2011), carboidratos (COSTA et al., 2011), lectinas
(LIU et al., 2008) e inibidores (ZHANG et al., 1999) tem sido pesquisada.
Em virtude sua alta especificidade de interações com carboidratos, as lectinas podem servir
como moléculas marcadoras de glicoconjugados específicos de células tumorais. Além disso,
elas podem ser conjugadas a uma gama de agentes transportadores, agindo especificamente
em células malignas. Atualmente, os efeitos citotóxicos das lectinas estão sendo rigorosamente
estudados para o estabelecimento da eficácia farmacológica destas biomoléculas.
1.4. LECTINAS
Atualmente, o termo lectina é amplamente empregado para designar todas as proteínas
e/ou glicoproteínas que possuem ao menos um domínio não-catalítico, que se liga
reversivelmente e especificamente a mono ou oligossacarídeos (PEUMANS; VAN DAMME,
1995; VIJAYAN; CHANDRA, 1999). Alternativamente, lectinas também são definidas como
proteínas de origem não-imune, com um ou mais sítios por subunidade, que podem se ligar
reversivelmente a segmentos glicídicos específicos, através de pontes de hidrogênio e
interações Van der Waals (LIS; SHARON, 1998). Elas interagem com os segmentos glicídicos
através de uma região chamada domínio reconhecedor de carboidratos (DRC) que é altamente
conservada em cada tipo de lectina (NI; TIZARD, 1996).
Ao interagirem com glicoconjugados de superfície celular, as lectinas podem promover a
formação de ligações cruzadas entre células adjacentes, desencadeando o processo
denominado aglutinação (Figura 5) (ALONSO, et al., 2001; PEUMANS; VAN DAMME, 1995).
Ensaios de inibição de aglutinação, em que as lectinas são incubadas com diversos tipos de
carboidratos ou glicoproteínas antes da adição das células modelo, constituem um meio de
estabelecer a especificidade das lectinas (MARQUES; BARRACO, 2000).
Devido à interação específica das lectinas com glicoconjugados, seja em solução ou em
superfície celular, essas proteínas encontram-se envolvidas em uma variedade de atividades
biológicas, como: adesão celular, interações célula-matriz, apoptose e citotoxicidade em células
e organismos (AKAHANI et al., 1997; DANGUY; CAMBY; KISS, 2002; SALES et al., 2000).
Propriedades como atividade mitogênica, efeitos antibacterianos e antitumorais também foram
relatadas (ENGERING; GEIJTENBEEK; VAN KOOYK, 2002; HAJTO et al., 2005; MOURA et al.,
INTRODUÇÃO - 29
2006; SHARON; LIS, 2004; TATENO et al., 2002). Essas propriedades tornam tais moléculas
poderosas ferramentas nas pesquisas biomédicas e biotecnológicas, com aplicações nos
processos de isolamento, caracterização e tipagem de macromoléculas, como por exemplo a
imobilização de lectinas em matrizes de cromatografias de afinidade para o isolamento de
carboidratos, diferenciação de células normais e tumorais e identificação de microrganismos; na
utilização em procedimentos de diagnóstico e estudo das funções do sistema imune, tais como
indução da proliferação de linfócitos e produção de interferons e outras citocinas (TURNER,
2003); na diferenciação de células malignas e benignas e no nível de glicosilação associado à
metástase (ARENAS et al., 1999; GORELIK et al., 2001). Além de todas essas citadas, muitas
lectinas têm sido capazes de induzir apoptose em diferentes linhagens de células, dessa
maneira destacando mais uma importante propriedade, a citotoxicidade (KIM et al., 1993;
MIYOSHI et al., 2001; OHBA et al., 2004; PAJIC et al., 2002; RAO et al., 2005; YOON et al.,
1999).
Figura 5 - Interação célula-célula mediada por lectinas.
1.5. CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS
INTRODUÇÃO - 30
As lectinas estão posicionadas, por comparação do seu domínio reconhecedor de
carboidratos (DRC), dentro de, no mínimo, seis famílias: lectinas de legumes, lectinas de cereais,
lectinas do tipo C, P, S e Pentraxinas. Dentre as famílias mencionadas somente as quatro
últimas podem ser encontradas no Reino animal (SHARON, 1993; DRICKAMER; TAYLOR,
1993), identificadas em vários sistemas de identificação.
Lectinas do tipo C constituem o grupo mais diversificado com relação à estrutura,
localização e especificidade de ligação com o açúcar. Elas incluem subfamílias como colectinas,
selectinas, receptor de manose de macrófagos, receptores transmembrana do grupo NK (do
inglês Natural Killer cells) e receptores de asialoglicoproteínas (NI; TIZARD, 1996; KILPATRICK,
2002), requerendo a presença do íon cálcio para exercerem suas atividades (NI, 1996). As
colectinas são encontradas no plasma e outros fluidos do corpo (HOLMSKOV et al., 1994; REID;
TURNER, 1994) e desempenham um importante papel no sistema imune, participando na
agregação, ativação do sistema complemento, opsonização e ativação da fagocitose, além de
inibir o crescimento microbiano. Além disso, as colectinas podem modular respostas
inflamatórias e alérgicas, induzir a morte celular por apoptose e modular o sistema imune
adaptativo (VAN DE WETERING, 2004). Essas moléculas são constituídas por subunidades
triméricas ligadas por pontes de sulfeto ou interações não covalentes. A porção N-terminal
consiste de um domínio que se liga a colágeno e permite que as três moléculas fiquem unidas
entre si (NI; TIZARD, 1996) As selectinas são encontradas na superfície das células e o seu
DRC está separado da região de ligação à membrana por um domínio semelhante ao fator de
crescimento epidermal (EGF) e uma sequência consenso ou domínio de proteínas regulatórias
do complemento (ARASON, 1996). Existem três tipos de selectinas: as L-selectinas, encontradas
nos leucócitos, E-selectinas, em células endoteliais e P-selectinas, nas plaquetas e células
endoteliais (NI; TIZARD, 1996). As selectinas medeiam a adesão inicial dos leucócitos ao
endotélio vascular durante o movimento leucocitário, processo conhecido como rolamento
(ARASON, 1996). Lectinas do tipo S consistem nas proteínas que se ligam à beta-galactosídeos,
portanto, agora chamadas de galectinas (BARONDES et al., 1994). Essas lectinas dependem da
redução do grupo tiol para o desenvolvimento de suas atividades e são classificadas, com base
na estrutura de suas subunidades, em três tipos: tipo proto (com um único domínio), tandem-
repeat (dois domínios homólogos) ou quimera (dois domínios diferentes). As galectinas vêm
sendo estudadas intensamente e a elas têm sido atribuídos importantes papéis, tais como
adesão celular, regulação do crescimento e diferenciação (KILPATRICK, 2002). Pentraxinas são
INTRODUÇÃO - 31
um grupo de proteínas plasmáticas que incluem a proteína C reativa (PCR), componente P
amilóides do soro e possivelmente outros membros (STEEL; WHITEHEAD, 1994). Constituem
moléculas compostas por subunidades proteicas, arranjadas em ciclo, em uma simetria
pentamérica, que se ligam a múltiplos ligantes de uma maneira cálcio dependente. Segundo NI e
TIZARD (1996), as pentraxinas possuem múltiplas funções biológicas, incluindo ativação do
sistema complemento e estimulação da fagocitose pelos macrófagos (NI; TIZARD, 1996).
1.6. DISTRIBUIÇÃO NOS ORGANISMOS
As lectinas estão presentes em quase todos os organismos vivos, ou seja, microrganismos,
animais e plantas. Entretanto essas substâncias são encontradas em maior quantidade em grãos
de leguminosas e gramíneas (PUSZTAI, 1989). O fato das lectinas terem larga distribuição em
plantas sugere alguma importância fisiológica para estas moléculas (LIENER, 1976; ETZLER,
1985). As funções das lectinas podem ser variadas e parecem ter relação com os estágios de
maturação e germinação das sementes (HOWARD et al., 1972), assim como parecem estar
relacionadas com os mecanismos de defesa da planta contra o ataque de fungos (LIENER,
1976).
Em bactérias, protozoários e vírus, há indícios que as lectinas podem promover adesão
destes microrganismos a estruturas celulares de seus hospedeiros, um pré-requisito para que
ocorra a infecção (LIS; SHARON, 1998; CARMOLLI et al., 2009; CAMBI et al., 2004; SAIFUDDIN
et al., 2000).
Peumans e Van Damme (1995) estudaram os relatos de ocorrência de lectinas em plantas
superiores e observaram que estas proteínas já haviam sido detectadas em cerca de 500
espécies. Muitas das lectinas vegetais são encontradas nas sementes, embora sua presença já
tenha sido observada em todos os tipos de tecidos vegetais, como casca, folha, caule, fruto e
raízes (PEUMANS; VAN DAMME, 1995). As funções destas lectinas provavelmente estão
relacionadas à defesa contra microrganismos patogênicos, insetos fitófagos e animais
herbívoros, além de atuarem como proteínas de reserva, uma vez que, em algumas sementes
de plantas, as lectinas representam a principal função de proteínas solúveis, sendo degradadas
durante a germinação (PEUMANS; VAN DAMME, 1995).
Com relação às lectinas de origem animal, a primeira delas foi provavelmente identificada
em cobras, por FLEXNER e NOGUCHI, no ano de 1902, quando estudando veneno de
INTRODUÇÃO - 32
cascavéis, observou que o mesmo era capaz de aglutinar células vermelhas do sangue. Alguns
anos depois, outras lectinas de animal foram descobertas, tais como: aglutininas de caranguejo
ferradura, conglutinina (primeira lectina animal associada com o sistema imune); aglutininas de
enguia, que teve sua aplicação na determinação de tipo sanguíneo; lectina hepática de coelho
(primeira lectina de mamífero); eletrolectina (de peixe elétrico); selectinas e outras.
Nos animais vertebrados, distinguem-se duas categorias de lectinas: as citoplasmáticas,
que são extraídas em soluções aquosas ou salinas, e as lectinas de membrana, que requerem o
uso de detergentes para sua solubilização. Muitas das lectinas ligadas à membrana são
receptores para ligantes fisiológicos, como o receptor manose-6-fosfato que se liga a enzimas
lisossomais (KORNFELD, 1987), e receptores para asialoglicoproteínas, que ligam-se a
asialoglicoproteínas do soro (ASHWELL; HARDFORD, 1982). Embora as lectinas presentes nos
animais apresentem uma incontestável variedade de funções, a maioria delas é considerada
molécula de reconhecimento, uma vez que age no processo de defesa contra patógenos e
participa do tráfego celular, da regulação imunológica e na prevenção de doenças auto-imunes
(KILPATRICK, 2002), além de promover estimulação mitogênica de linfócitos e aglutinação de
células cancerosas (LIS; SHARON, 1973; LIENER, 1981). O papel biológico destas proteínas
tem sido alvo de estudos já há muitas décadas. Esta situação é totalmente compreensível devido
à enorme quantidade de interações nas quais as lectinas podem engajar-se. É muito improvável
que um papel fisiológico geral para todas as lectinas possa ser encontrado. Mesmo lectinas que
são muito similares em suas estruturas primárias e conformações podem servir a diferentes
propósitos. Provavelmente, as lectinas encontram-se empregadas pela natureza em diferentes
funções, dependentes de sua localização, especificidade e do momento de sua síntese.
1.7. LECTINAS EM INVERTEBRADOS
Muitas pesquisas têm dado ênfase ao possível papel das lectinas no reconhecimento de
moléculas não-próprias nos organismos invertebrados e vertebrados (RENWRANTZ, 1986;
ARASON, 1996; MATSUSHITA, 1996; VASTA et al., 1999; WILSON et al., 1999). Os
invertebrados não possuem um sistema imune adaptativo baseado na magnitude de anticorpos
altamente específicos e receptores de antígenos como aqueles que ocorrem nos vertebrados.
Devido ao fato das lectinas terem a habilidade de ligar-se a carboidratos e promover a
aglutinação de diferentes células, tais como bactérias e outros patógenos invasores, é razoável
INTRODUÇÃO - 33
assumir que essas moléculas possuem um considerável e potente papel nas reações de
reconhecimento do não-próprio nos invertebrados. Assim como as imunoglobulinas dos
vertebrados, as lectinas podem aglutinar microrganismos e favorecer sua fagocitose, por mediar
a ligação entre a superfície do hemócito e o corpo estranho (papel de opsonização). Existem três
diferentes rotas para o reconhecimento de partículas estranhas, nas quais as lectinas podem
interagir: a primeira é através da interação da lectina da membrana do invertebrado com o
carboidrato da membrana do microrganismo; a segunda ocorre pela ligação entre a lectina da
membrana do patógeno e o açúcar presente na membrana das células do invertebrado; e a
terceira rota ocorre através de lectinas humorais com glicoconjugados presentes nos
microrganismos, formando um complexo que se une ao receptor de opsonina da célula de
defesa dos invertebrados (RENWRANTZ, 1983).
Nos invertebrados marinhos, a maioria das lectinas encontradas pertence à família de
lectinas do tipo-C. Essas lectinas foram obtidas de organismos de diferentes filos: arthropoda
(Tachypleus tridentatus), echinodermata (Anthocidaris crassispina, Cucumaria echinata) e
outros. Lectinas com atividade hemolítica têm sido recentemente encontradas no caranguejo
ferradura, que se liga ao ácido siálico, e outra com especificidade à galactose, isolada de
Cucumaria echinata. Esse processo de lise celular ocorre após ligação da lectina com a cadeia
de carboidrato presente na superfície dos eritrócitos. Lectinas com atividades mitogênica e
quimiotática têm sido identificadas em veneno do ouriço do mar (Toxopneustes pileolus),
sugerindo seu envolvimento na toxicidade. Outras funções atribuídas às lectinas de
invertebrados são: cristalização de carbonato de cálcio (Megabalanus rosa), morfogênese
(Polyandrocarpa misakiensis) e lise da membrana vitelínica (espermatozóide de Mytilus edulis).
Esses exemplos demonstram que é grande a variedade de lectinas encontradas nos
invertebrados e que, portanto, podem ser inúmeros os papéis fisiológicos desempenhados por
essas moléculas nesses referidos organismos (HATAKEYAMA et al., 1995; TAKAGI T., 1994;
MUTA et al., 1991).
1.8. ESPONJAS MARINHAS E LECTINAS
Com origem no período cambriano, o filo Porifera contém atualmente descritas cerca de
6.000 espécies de esponjas. As esponjas são organismos aquáticos primitivos, em sua maioria
marinhos, que não possuem tecidos bem definidos, nem órgãos estabelecidos. Sua organização
INTRODUÇÃO - 34
é muito simples e apresentam um crescimento assimétrico, com grande diversidade de cores e
tamanhos. São animais filtradores, que realizam digestão intracelular, e cuja respiração e
excreção ocorrem por difusão direta entre células e a água circulante através dos canais do
corpo (BELL; BARNES, 2001).
A parede do seu corpo é formada pela epiderme, pelo mesênquima e pelo revestimento
interno de células flageladas, chamadas coanócitos, que realizam a digestão do alimento que
chega ao interior do animal. No mesênquima, encontram-se os amebócitos que distribuem o
alimento pelas diversas células do corpo. Existem poros inalantes (óstios), por onde a água entra
no porífero; e um poro exalante (ósculo), por onde a água sai do porífero. A cavidade central,
forrada de coanócitos, é denominada de átrio. No mesênquima, podem ser encontradas
espículas calcárias ou silicosas que fazem parte da sustentação do corpo do animal (Figura 6).
Há, contudo, esponjas sem espículas (esponjas córneas), com esqueleto de fibras de espongina
(BELL; BARNES, 2001).
Figura 6 - Estrutura das esponjas. Adaptada do site: http://fossil.uc.pt/pags/fbm_porifera.dwt (acesso em: 19 de Junho de 2011).
INTRODUÇÃO - 35
Esponjas marinhas apresentam-se como um reservatório biológico de moléculas bioativas.
Possivelmente este fato decorre do longo período evolucionário que esses animais percorreram,
ao longo de seus 800 milhões de anos de existência, convivendo com uma ampla diversidade de
ambientes e outros seres vivos, numa luta incessante pela conquista do habitat. As esponjas
produzem uma ampla variedade de toxinas e outros componentes moleculares com o objetivo de
repelir predadores (PAWLIK; MCFALL; ZEA, 2002), competir por espaço com outros organismos
sésseis e para a comunicação e proteção contra infecções (BECERRO; TURON; URIZ, 1997). O
interesse em estudar esponjas marinhas foi intensificado após o isolamento e caracterização de
um componente anti-HIV chamado niphatevirin presente na esponja Ninphates erecta (O’KEEFE
et al., 1997).
Historicamente, o primeiro registro de lectinas isoladas de esponja foi feito por Dodd e
colaboradores em 1968 (DODD et al., 1968). No ano de 2000, Miarons e Fresno investigaram 22
espécies de 12 famílias de esponjas tropicais. Dentre elas, 10 apresentaram atividade
hemaglutinante para eritrócitos de vários animais, inclusive quando estes foram submetidos a
variados tratamentos enzimáticos (MIARONS; FRESNO, 2000). Em esponjas do gênero
Suberites domuncula foi encontrada uma lectina de 27 kDa, com atividade bactericida
(SCHRODER et al., 2003). Na espécie Aphrocallistes vastus foram encontradas duas lectinas do
tipo-C com afinidade para galactose e com atividade de adesão celular (GUNDACKER et al.,
2001). Xiong e colaboradores isolaram da esponja Craniella australiensis uma lectina com massa
molecular de 54 kDa (nativa), trimérica, com subunidades de 18 kDa unidas por pontes
dissulfeto, especificidade para a glicoproteína mucina e independência de íons bivalentes para a
aglutinação de eritrócitos (XIONG et al., 2006).
De outra esponja, Haliclona cratera, foi isolada uma lectina de 29 kDa, dependente de íons
metálicos sem pontes dissulfeto e com afinidade para galactose. Essa lectina apresentou
atividade citotóxica sobre células tumorais HeLa (câncer cervical) e FemX (melanoma), e
atividade mitogênica em linfócitos (PAJIC et al., 2002). Efeitos mitogênicos em leucócitos foram
observados para lectinas de esponjas de várias espécies como Pellina semitubulosa (ENGEL;
BACHMAN; SCHROEDER, 1992), Cinachyrella alloclada (ATTA et al., 1989), Craniella
australiensis (XIONG et al., 2006) e Geodia cydonium (BRETTING et al., 1981b).
INTRODUÇÃO - 36
Da espécie Axinella polypoide foram isoladas quatro lectinas com especificidade para
galactose (lectinas – I, II, III e V) e uma com afinidade para ácido hexurônico (lectina IV) (BUCK
et al., 1992). Posteriormente BUCK e colaboradores (1998), observaram que as lectinas I e II
dessa espécie apresentavam 65% de homologia em sua região N-terminal, massa molecular
muito similar, pontes dissulfeto entre os resíduos 4 e 46 e ausência de glicosilações (BUCK et
al., 1998).
Na esponja Aaptos papillata já foram isoladas três lectinas, conhecidas como Aaptos lectina I, II
e III, respectivamente. A primeira delas apresentou uma especificidade para N-Acetil-
glicosamina, enquanto as outras duas foram inibidas por N-Acetil-galactosamina, N-Acetil-
glicosamina e ácido siálico (BRETTING; SCHOTTELIUS, 1978). Uma lectina purificada da
espécie Suberites domuncula possuía uma massa molecular de 27 kDa e atividade bactericida
(SCHRODER et al., 2003). Na espécie Aphrocallistes vastus foram encontradas duas lectinas do
tipo C com afinidade para galactose e com atividade de adesão celular (GUNDACKER et al.,
2001). XIONG e colaboradores (2006) isolaram da esponja Craniella australiensis uma lectina
com massa molecular de 54 kDa (nativa), a qual apresentava três subunidades de 18 kDa unidas
por pontes dissulfeto, especificidade para a glicoproteína mucina e independência dos íons Ca+2
e Mg+2 para a aglutinação de diferentes eritrócitos.
MOURA e colaboradores, em 2006, mostraram a purificação e caracterização de uma
lectina da esponja marinha Cliona varians, denominada CvL (MOURA et al., 2006). Esta
apresentou dependência pelo íon cálcio, especificidade pelo monossacarídeo galactose, efeito
citotóxico sobre bactérias Gram-positivas e a capacidade de aglutinar formas promastigotas de
Leishmania chagasi coradas com Coomassie blue. Em 2008, QUEIROZ e colaboradores
mostraram que a CvL apresentou atividade pró-inflamatória, induzindo a migração de neutrófilos
em camundongos. Baseado no potencial dessa lectina, anticorpos IgG anti-CvL foram gerados
com a finalidade de pesquisar lectinas similares em esponjas diferentes, através da técnica de
imunodifusão radial (MEDEIROS et al, 2010). A variedade de lectinas presentes em esponjas
marinhas e que apresentam características diversificadas intensifica o interesse pela descoberta
dessas moléculas em novas espécies de esponjas. A espécie Cinachyrella apion utilizada neste
trabalho é comumente encontrada no litoral brasileiro, principalmente fixada a substratos
rochosos e arenosos. Além da abundância de sua ocorrência no nosso litoral, a seleção da
esponja está relacionada ao fato de haver poucos relatos na literatura sobre a descrição de
INTRODUÇÃO - 37
lectinas nesta espécie, além do fato desta lectina já ter sido trabalhada anteriormente por nosso
grupo de pesquisa.
1.9. LECTINAS NO COMBATE DO CÂNCER
A morte celular é uma estratégia essencial para o controle do equilíbrio dinâmico em seres
vivos, removendo células com os mais diversos problemas. Ela pode ter papel destacado na
patogênese de muitas doenças. Existem doenças ligadas à supressão de morte celular como o
câncer, aterosclerose e desordens autoimunes. Outras, ligadas ao aumento do índice de morte
celular como infecções virais, infecções bacterianas, desordens neurodegenerativas, desordens
autoimunes, desordens hematológicas e ainda doenças induzidas por toxinas (FADEEL et al.,
1999).
Tratamentos bem-sucedidos contra o câncer, utilizando quimioterápicos, são dependentes
de sua habilidade em desencadear a morte celular nas células transformadas. Muitos dos
agentes citotóxicos disparam o mecanismo de morte celular pela indução de apoptose. A
susceptibilidade celular para estes agentes pode ser influenciada por fatores genéticos que
regulam a apoptose, pelo aumento da expressão ou atividade de proteínas anti-apoptóticas,
assim como pela expressão insuficiente dos membros pró-apoptóticos (AMARANTE-MENDES et
al., 1998; BRIMMELL et al., 1998; EVAN; VOUSDEN, 2001; RAMPINO et al., 1997).
O entendimento aperfeiçoado dos diversos mecanismos de morte celular e da resistência a
esses processos ainda parece ser a peça chave para o desenvolvimento de novos agentes
terapêuticos, mais ativos e/ou menos tóxicos que os usados atualmente no tratamento de
diversas doenças, incluindo o câncer.
Existem poucos trabalhos na literatura que relacionam propriedades de lectinas de
organismos marinhos com efeitos citotóxicos o com a indução de apoptose em linhagem de
células malignas para o combate do câncer. Em trabalhos realizados por Wang e colaboradores
(2000), uma lectina da alga marinha Ptilota plumosa (PPL), com especificidade para resíduos de
D-galactose, mostrou fraca atividade citotóxica contra linhagens de células de hepatocarcinoma,
coriocarcinoma (tumores das vilosidades coriônicas da placenta), osteosarcoma (WANG et al.,
2000). Da esponja marinha Haliclona cratera foi isolada uma lectina de 29 kDa, dependente de
íons metálicos, sem pontes dissulfeto e com especificidade para galactose. Esta lectina
apresentou atividade citotóxica sobre linhagens de células tumorais de câncer cervical (HeLa) e
INTRODUÇÃO - 38
melanoma (FemX). Concentrações de 9 µg/mL e 11 µg/mL causaram 50% de diminuição da
sobrevivência celular (IC50) em HeLa e FmX, respectivamente. Porém, o mecanismo do efeito
citotóxico causado nessas células ainda não foi desvendado (PAJIC et al., 2002). A lectina
extraída da alga marinha vermelha Euchema serra (ESA), com especificidade para resíduos de
manose, induziu morte celular e apoptose em muitos tipos de células cancerosas humanas
(SUGAHARA et al., 2001). Estudos têm mostrado que ESA inibiu o crescimento e induziu a
morte celular em células de adenocarcinoma de cólon em camundongos, pela expressão de
caspase-3 e translocação de fosfatidilserina, sugerindo a indução de morte celular através da via
de apoptose dependente de caspases, demonstrando que esta lectina foi efetiva in vitro e in vivo,
podendo ser potencialmente utilizada como um fármaco contra o câncer (FUKUDA et al., 2006).
Recentemente, nosso grupo de pesquisa purificou e caracterizou uma lectina da esponja
marinha Cliona varians, que possui atividade hemaglutinante dependente de Ca2+ contra
eritrócitos do tipo A, tratados com papaína. Esta lectina, chamada CvL, é uma glicoproteína com
massa molecular de 106 kDa, formada por quatro subunidades de 28 kDa ligadas por pontes
dissulfeto. CvL mostrou especificidade preferencial para D-galactose, efeitos antibacterianos
contra bactérias patogênicas gram positivas e atividade aglutinante sobre promastigotas de
Leishmania chagasi (MOURA et al., 2006). Além destes efeitos, Queiroz e colaboradores (2009)
comprovaram o potencial antitumoral de CvL sobre as linhagens K562 (leucemia mielogênica
crônica) com a IC50 de 70 µg/mL, porém não afetou a viabilidade celular de linfócitos normais de
sangue periférico humano nas mesmas concentrações testadas (1 – 80 µg/mL). As células K562
tratadas com CvL na concentração de 70 µg/mL mostraram núcleos com diferentes níveis de
condensação de cromatina e fragmentação nuclear, sinais típicos de morte celular por apoptose
e a quantificação do índice apoptótico mostrou aumento significativo do número de células
apoptóticas, alcançando o valor de 43 ± 5% do total da população celular (p<0,05). Finalmente,
CvL, na concentração de 70 µg/mL, desencadeou a liberação de catepsina B dos
compartimentos vesiculares dentro do citoplasma com subsequente translocação para o interior
do núcleo. Dentro deste contexto, recentemente foi purificada e caracterizada uma lectina de C.
apion, denominada CaL. CaL mantém sua atividade lectínica a amplas faixas de pH e
temperatura e apresentou atividade hemaglutinante preferencial para eritrócitos do tipo A, sem
dependência por íons bivalentes para exercer sua atividade. O dissacarídeo lactose foi
identificado como inibidor da atividade lectínica de CaL. Esta lectina apresentou capacidade de
aglutinar formas promastigotas do protozoário Leishmania chagasi, quando testada isoladamente
INTRODUÇÃO - 39
(sem a presença de seu inibidor específico). Após incubação com seu inibidor específico, CaL
perde a capacidade de aglutinação de L. chagasi, indicando que receptores compostos por
lactose estariam presentes nesse estágio de vida do protozoário, sugerindo possíveis aplicações
biotecnológicas de CaL como ferramenta para diagnóstico da forma patogênica de L. chagasi
(MEDEIROS et al., 2010). Contudo, até o presente momento, outras possíveis atividades
relacionadas a lectina não foram investigadas.
Levando em consideração a grande incidência de adenocarcinomas cervicais na
população feminina brasileira e as condições agressivas às quais os pacientes estão expostos
ao serem submetidos a tratamentos tradicionais do combate ao câncer, novas terapias estão
sendo adotadas como agentes adjuvantes para esta doença. Devido à especificidade de
reconhecimento e ação das lectinas sobre células tumorais, estas biomoléculas devem oferecer
boas oportunidades para o desenvolvimento de novos agentes no tratamento do
adenocarcinoma cervical humano.
OBJETIVOS - 40
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da lectina purificada (CaL) da esponja marinha Cinachyrella apion sobre
linhagens celulares normais e tumorais.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtenção de CaL purificada, de acordo com metodologia descrita por MEDEIROS et al
(2009);
Avaliar citotoxicidade de CaL contra células do sangue periférico, utilizando IC50 como
concentração teste;
Avaliar efeito hemolítico de CaL;
Avaliar a capacidade de CaL em influenciar a proliferação de diferentes linhagens de células
tumorais;
Analisar o processo de morte celular utilizando marcação com anticorpos anti-anexina V
(marcador de fosfatidilserina externalizada) e iodeto de propídio (marcador de DNA
fragmentado);
Propor um mecanismo de ação desta lectina no tratamento do adenocarcinoma cervical
humano.
METODOLOGIA - 41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS
3.1.1. Equipamentos
Além dos aparelhos usuais do laboratório, pode-se destacar:
Banho Maria (Tecnal – Te 056)
Balança analítica eletrônica - BEL Engineering
Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200)
Centrífuga refrigerada HITACHI CR G
Cuba de eletroforese BIORAD
Espectrofotômetro Pharmacia Biotec (mod, ultrospec 2100 – pro)
Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.)
PowerPacTM Power Supply; MiniPROTEAN® Tetra Cell; Mini Trans-blot Cell®
(BIORAD, mod. Power PAC 300)
FPLC AKTA Purifier (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)
Bancada de Fluxo Laminar (PACHANE Pa300)
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110
Liofilizador TERRONI FAUVEL – LB 1500 TT
Microcentrífuga para eppendorf 5410
Microcentrífuga para hematócrito (Modelo spin 1000)
Microscópio invertido NIKON Eclipse TE300
Peagâmetro Analyser (pH 300)
Citômetro de Fluxo modelo FACSCANTO II, BD Bioscience
Microscópio de Fluorescência OLYMPUS BX41
METODOLOGIA - 42
3.1.2. Reagentes
Meios de cultura DMEM (Dulbecco MEM), RPMI-1640, Estreptomicina, Penicilina,
Soro fetal bovino e solução de tripsina/EDTA da Cultilab (Campinas, SP, Brasil);
D-glucose, D-galactose, D-frutose, L-fucose, D-manose, D-arabinose, D-xilose, N-
acetil-D-glicosamina, D-glucosamina, D-galactosamina; os dissacarídeos melibiose,
lactose, sacarose, glicoproteína mucina e Triton X-100 da Sigma (Sigma-Aldrich Co.
LLC);
TEMED da Amersham Biosciences (São Paulo, Brasil);
Ditiotreitol e Nitrato de prata da GE Healthcare (Bio-Sciences São Paulo, Brasil);
Acrilamida/bisacrilamida da Bio-rad (NY, USA);
Tris-(hidroximetil)-aminometano, acetona, glicina, ácido clorídrico, cloreto de sódio,
cloreto de magnésio, cloreto de manganês, ácido fosfórico, álcool etílico, álcool
metílico, ácido acético da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil)
DAPI (4´,6´-diamidino-2-phenylindole), MTT e FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis
Kit with FITC Annexin and PI, for Flow Cytometry da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
Anticorpos policlonais produzidos em coelho (Bax e Bcl-2) e anticorpo secundário
conjugado com peroxidase produzido em cabra anti-coelho foram obtidos da Cell
Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Os anticorpos policlonais produzidos
em coelho (JNK, p-Akt, NF-ƙB) e conjugados com peroxidase e anticorpos
secundários obtidos a partir de cabra anti-coelho da Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA).
Membrana de PVDF da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA);
3.1.3. Material Biológico
3.1.3.1. Esponja marinha Cinachyrella apion
A esponja marinha Cinachyrella apion foi coletada na praia de Santa Rita, localizada no
litoral norte da região metropolitana de Natal, estado do Rio Grande do Norte. Os animais
coletados foram armazenados em caixas de isopor devidamente refrigeradas, contendo água do
mar para preservação do material biológico, sendo em seguida transportadas para o Laboratório
de Química e Função de Proteínas Bioativas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
METODOLOGIA - 43
onde foram armazenadas sob uma temperatura inferior a 4˚C. A identificação da espécie de
esponja marinha foi realizada anteriormente pelo professor Dr. Eduardo Hadju, do Museu
Nacional do Rio de Janeiro, sendo mantida nas coleções com o número MNRJ 10142 (Figura 7).
FILO: PORIFERA
CLASSE: DEMOSPONGIAE
SUBCLASSE: Tetractinomorpha
ORDEM: Spirophorida
FAMÍLIA: Tetillidae
GÊNERO: Cinachyrella
ESPÉCIE: Cinachyrella apion
Figura 7 - Esponja marinha Cinachyrella apion. Detalhe apresenta a esponja em corte transversal
3.1.3.2. Eritrócitos humanos
Os eritrócitos humanos foram obtidos através de doações de bolsas de sangue pelo
HEMOCENTRO – RN. As bolsas fornecidas encontravam-se fora do prazo de validade para
transfusões.
METODOLOGIA - 44
3.1.3.3. Linhagens celulares
HeLa, uma linhagem de células tumorais humanas de cólon uterino (ATCC número CCL-
2), 3T3, uma linhagem fibroblástica normal de camundongo (ATCC número CL-173) e PC3, um
adenocarcinoma de próstata humano (ATCC número CRL-1435) foram obtidas da American
Type Culture Colletion (ATCC, Rockville, MD, USA). As linhagens celulares HeLa e 3T3 foram
cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium), suplementadas com 10% de
soro fetal bovino. Ao meio DMEM foram adicionados Estreptomicina (5000 µg/mL) / Penicilina
(5000 UI). As células da linhagem PC3 foram cultivadas em meio RPMI-1640, suplementadas
com 10% de soro fetal bovino e tratadas com Estreptomicina (5000 µg/mL) / Penicilina (5000 UI).
As células foram mantidas em ambiente estéril com 5% de CO2.
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Preparação da lectina de esponja marinha Cinachyrella apion (CaL)
A lectina da esponja Cinachyrella apion foi purificada de acordo com a metodologia de
Medeiros et al. (2010). A esponja Cinachyrella apion foi triturada em liquidificador com tampão
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, na proporção de 1:2 (p/v), onde a extração foi realizada em banho de
gelo. O material foi mantido sob agitação por quatro horas e, em seguida, centrifugado a 8000 x
g por 30 minutos a 4 ˚C. Os sobrenadantes foram descartados e o sobrenadante obtido foi
designado de Extrato Bruto. O Extrato Bruto foi submetido a fracionamento em três etapas de
precipitação com acetona: 0,5 volumes, 1,0 volume e 2,0 volume. Em cada etapa, após a adição
da acetona, a solução permaneceu em repouso a 4˚C por, no mínimo, quatro horas. Após esse
período, as frações foram centrifugadas a 8000 x g por 30 minutos a 4˚C. O sobrenadante foi
descartado e os precipitados foram recolhidos, solubilizados em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5
após a retirada completa da acetona, e armazenados a 4 ˚C. As frações obtidas foram
denominadas F 0,5, F 1,0 e F 2,0, respectivamente. A fração F 1,0 apresentou maior atividade
hemaglutinante específica e foi submetida a cromatografia de afinidade de Imunoglobulina G
anti-CvL desglicosilada Sepharose 4B (2,0 x 1,5 cm). A coluna foi equilibrada com tampão Tris-
HCl 50 mM pH 7,5 e o pico correspondente à CaL foi eluído com tampão Tris-Glicina 50 mM, pH
METODOLOGIA - 45
11,5. Os eluatos foram monitorados por espectrofotometria a 280 nm, onde a lectina reunida foi
dialisada contra água, liofilizada e sua atividade hemaglutinante foi analisada (Figura 8).
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em microplacas com fundo em
“V” por meio de diluição seriada das amostras testes (1/2, ¼, 1/8...) (DEBRAY, et al., 1981). Em
cada poço foram adicionados 25 µL de NaCl 0,15 M, 25 µL da amostra teste e 25 µL da
suspensão de eritrócitos tipo A a 4%, tratados enzimaticamente com papaína (BENEVIDES et
al., 1998). A reação foi incubada a temperatura ambiente. Após uma hora a aglutinação foi
observada, e o título expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido como o
inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação (MOREIRA &
PERRONE, 1997).
Os ensaios de inibição da hemaglutinação foram realizados da mesma forma que descrito
anteriormente para os ensaios de atividade hemaglutinante, no entanto, após a diluição seriada
da amostra foram adicionados 25 µL do inibidor teste, na concentração de 0,1 M, e deixados em
contato por uma hora, à temperatura ambiente, antes da adição dos eritrócitos. Os inibidores
testados foram os monossacarídeos: D-glucose, D-galactose, D-frutose, L-fucose, D-manose, D-
arabinose, D-xilose, N-acetil-D-glicosamina, D-glucosamina, D-galactosamina; os dissacarídeos
melibiose, lactose e sacarose; e a glicoproteína mucina. Os resultados foram avaliados através
da observação da inibição da hemaglutinação, devido à ligação específica da lectina ao seu
inibidor.
METODOLOGIA - 46
Figura 8 - Desenho esquemático dos passos de purificação da lectina de esponja Cinachyrella apion (CaL).
3.2.2. Dosagem proteica
A determinação da concentração de proteínas das amostras foi realizada pelo método
colorimétrico de BRADFORD (1976), utilizando albumina sérica bovina (BSA) como padrão. O
ensaio foi feito à temperatura ambiente por 10 minutos e a leitura das amostras foi verificada em
leitor de ELISA à absorbância de 595 nm. A concentração proteica da amostra foi calculada a
partir da equação da curva previamente construída com o padrão.
3.2.3. Dosagem de açúcares totais
Açúcares totais foram quantificados pelo método de fenol/ácido sulfúrico, utilizando como
padrão o monossacarídeo glicose (1 mg/mL) (DUBOIS et al., 1956). O ensaio foi realizado em
tubos de ensaio, com 10 µL de CaL e 990 µL de água destilada, seguidos de 25 µL de fenol 80%
e 2,5 mL de ácido sulfúrico P. A. A solução foi deixada em repouso por 10 minutos, onde cada
tubo teste foi agitado, com auxílio de vortex, e deixados por 30 minutos em banho-maria a 37 ˚C.
A leitura foi realizada em espectrofotômetro no comprimento de onda de 490 nm.
3.2.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturante (SDS-PAGE)
Com o intuito de avaliar o grau de pureza das amostras proteicas, as mesmas foram
submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em presença de SDS, de acordo com
a metodologia descrita por Laemmli (1970). O gel de separação foi preparado com 1,25 mL de
acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; 2,425 mL de água
destilada; 50 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED concentrado e 25 µL de persulfato de amônio
30%. O gel de concentração continha 0,33 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 625 µL de
tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 1,5 mL de água destilada; 25 µL de SDS 10%; 5 µL de TEMED e
12,5 µL de persulfato de amônio. O tampão de corrida consistia de Tris 25 mM; glicina 192 mM e
SDS 10%. Uma vez diluída em tampão de amostra Tris-HCl 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10% v/v,
METODOLOGIA - 47
0,01% de azul de bromofenol e 1 mM de DTT, num volume de 20 µL, a alíquota foi aplicada no
gel (10 x 14 cm, com espaçadores de 0,75 mm), o qual foi submetido a uma amperagem
constante de 30 mA por, aproximadamente, 2 horas. O gel foi corado em solução de nitrato de
prata. As bandas proteicas foram descoradas após a imersão do gel em solução descorante
(etanol 30% e ácido acético 10%). Após a eletroforese, o gel foi desidratado gradativamente, por
três lavagens consecutivas com a solução de etanol 50%, tendo cada lavagem a duração de 20
minutos. Uma solução de tiossulfato de sódio (0,2 mg/mL) foi adicionada em seguida e mantida
sob agitação por 1 minuto. Posteriormente, foram feitas três lavagens rápidas com água
destilada, adicionando logo em seguida uma solução de nitrato de prata (200 mg de nitrato de
prata + 74 µL de formaldeído em 100 mL de água destilada), mantendo sob agitação por 20
minutos. O gel foi lavado rapidamente em água destilada (três vezes), e imerso em solução
reveladora (6 g de carbonato de sódio, 50 µL de formaldeído e 2 mL de tiossulfato de sódio 0,2
mg/mL para um total de 100 mL de água destilada). Para cessar a revelação, foi utilizado ácido
acético 13% logo após o aparecimento das bandas protéicas. Para determinar a massa
molecular da proteína isolada, foram utilizados marcadores padrão de proteínas (PageRulerTM
Plus Prestained Protein Ladder, Ferramentas Life Science).
3.2.5. Citotoxicidade sobre células do sangue periférico humano e Atividade Hemolítica in vitro
Os efeitos de CaL sobre a viabilidade celular foram avaliados sobre células do sangue
periférico humano. Cerca de 1 mL de sangue total foi incubado com CaL, nas concentrações de
10 µg/mL e 20 µg/mL; BSA foi utilizado como controle, em diferentes concentrações (5 a 50
µg/mL), por 15 minutos a 37 ºC para avaliar possíveis alterações hematológicas. A viabilidade
das células foi analisada por contador de células sanguíneas (CHCELL 6019 – LABORLAB).
Com o intuito de avaliar o efeito hemolítico de CaL sobre eritrócitos humanos, hemácias
humanas foram separadas do plasma por sedimentação e lavadas três vezes com Tampão Tris-
HCl 0,01M pH 7,4 contendo NaCl 0,15M. O mesmo tampão foi utilizado para preparar uma
suspensão 1% (v/v) de hemácias e solubilizar as amostras. Em tubos de 1,5 mL, 100 µL da
suspensão de hemácias foram incubados com 100 µL da amostra por 60 minutos, à temperatura
ambiente. As referências de 100% e de 0% de hemólise foram feitas incubando-se 100 µL da
suspensão de hemácias com 100 µL Triton X-100 1% (v/v) ou com 100 µL do Tampão Tris,
METODOLOGIA - 48
respectivamente. Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 3000 x g por 2 minutos e
alíquotas de 100 µL dos sobrenadantes foram transferidas para placas de microtitulação de 96
poços, analisadas em leitura de 405 nm.
3.2.6. Cultura de células
As linhagens de células HeLa, 3T3 e PC3 foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Médium) e RPMI-1640, respectivamente, suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB), em atmosfera úmida de 5% de CO2. As células foram semeadas (5 x 103
células/mL) em microplacas de cultivo de 96 poços com fundo chato, carenciadas por 24 horas e
estimuladas a sair do estágio de ciclo celular G0 pela adição de meio com SFB 10% na ausência
(controle) e presença de CaL, em concentrações que variaram de 0,5 µg/mL a 10 µg/mL em
dois diferentes tempos: 24 e 48 horas. Além dos poços correspondentes ao tratamento com a
lectina, poços controle foram semeados, sem a presença de CaL, para avaliação da viabilidade
celular.
3.2.7. Ensaio de Proliferação Celular
A proliferação celular foi determinada pelo teste de redução do brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (MOSMANN, 1983). O teste de MTT avalia a
integridade da membrana mitocondrial das células testadas baseada na redução enzimática do
corante até o produto chamado formazan, pela ação das desidrogenases mitocondriais em
células viáveis. Após os períodos de tratamento de 24 e 48 horas com as diferentes
concentrações de CaL (0,5 µg/mL a 10 µg/mL), as células foram incubadas em meio de cultura
sem soro fetal bovino contendo 1 mg/mL de MTT por 4 horas. Posteriormente, o meio foi
aspirado, adicionando 100 µL de etanol P.A. para a dissolução dos cristais de formazan
formados e precipitados, mantendo as células sob agitação moderada por 10 minutos, mantendo
a placa teste protegida da incidência da luz. A quantificação em absorbância foi realizada em
leitor de microplacas, em comprimento de onda de 570 nm. O ensaio foi realizado em triplicata.
O cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação com o controle
contendo células não tratadas com a lectina isolada, da seguinte forma:
METODOLOGIA - 49
% de Inibição = Abs 570 nm Controle – Abs 570 nm amostra x 100
Abs 570 nm Controle
3.2.8. Ensaio de Inibição da Atividade Lectínica em Cultura de Células
Para avaliação do efeito da presença de carboidratos na inibição da proliferação celular
induzida por CaL, o ensaio de MTT foi realizado como descrito anteriormente, exceto que a
concentração correspondente a IC50 de CaL foi incubada previamente com uma concentração
fixa do respectivo inibidor específico (lactose, 0,1M) por uma hora, à temperatura ambiente, de
acordo com a metodologia descrita por POHLEVEN et al. (2009). Após o período de incubação,
as células então foram tratadas com a lectina ligada ao inibidor nos diferentes tempos testados,
onde a porcentagem de inibição de viabilidade celular foi monitorada em comprimento de onda
de 570 nm, em leitor de microplacas. O ensaio foi realizado em triplicata.
3.2.9. Avaliação dos indicadores de apoptose por incubação com DAPI
Mudanças na morfologia celular indicativas de apoptose (condensação de cromatina e
fragmentação nuclear) foram avaliadas utilizando o corante DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol)
(DE CARVALHO et al., 2006; GUICCIARDI et al., 2000). A linhagem celular HeLa foi semeada
em lamínulas circulares de 13 mm, em uma placa de 24 poços (35,55 x 104 células/poço). Após
45 minutos a 37 ºC, tempo necessário para as células sedimentarem, adicionou-se meio de
cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium) suplementado com 10% de SFB, em
atmosfera úmida de 5% de CO2, para o volume final de 1 mL. 24 horas depois, o meio foi
removido e as células foram carenciadas por mais 24 horas com meio sem soro. Após o
tratamento com CaL solubilizada com meio suplementado, na concentração de 10 µg/mL (80,65
nM), concentração correspondente a IC50, as células foram lavadas com tampão fosfato gelado
(PBS), fixadas com 4% de paraformaldeído por 20 minutos e permeabilizadas em Triton X-100
0,1% por cerca de 20 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas novamente com PBS e
incubadas com DAPI na concentração de 1 µg/mL por 30 minutos, protegidas da luz, em
temperatura ambiente. Após a incubação com o DAPI, as células foram colocadas sobre lâminas
e mantidas em Fluoromount-G/PBS na proporção de 2:1 v/v, com intuito de preservar a
METODOLOGIA - 50
morfologia das células. As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência utilizando
o filtro de fluorescência 330-380 nm. O experimento foi realizado em duplicata.
3.2.10. Citometria de Fluxo
3.2.10.1. Avaliação da Viabilidade Celular e Morte Celular por Anexina V-FITC/
Iodeto de Propídeo
Para a avaliação dos efeitos de CaL sobre a morte celular, foi utilizado o kit FITC/Annexin
V Dead Cell Apoptosis Kit with FITC Annexin and PI, for Flow Cytometry (Invitrogen, Catalog no
V13242). O marcador anexina V-FITC permite detectar os estágios iniciais de apoptose, devido
ao fato de se ligar preferencialmente a fosfolipídios negativamente carregados (fosfatidilserina)
expostos no início do processo apoptótico, enquanto o iodeto de propídeo permite avaliar os
momentos finais deste processo de morte celular, por ser um marcador que interage com o DNA,
mas não é capaz de atravessar a membrana plasmática, devido ao seu alto peso molecular.
Assim, a marcação positiva para PI indica que há poros na membrana, fenômeno característico
de processos de necrose ou estágio final de apoptose. As células foram cultivadas em placas de
6 poços até atingirem a confluência de 2 x 105 células/mL, carenciadas com meio sem soro e
estimuladas a sair de G0 na presença da lectina purificada por 24 horas. Além da incubação das
células com a lectina teste, um controle negativo foi preparado, sem a presença de CaL, e
também foi testada a ação da CaL incubada com o inibidor geral de caspases Z-VAD-FMK
(carbobenzóxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona) (0,02 mM), para a confirmação do
mecanismo de ação pelo qual a lectina induz a morte celular, sendo este mecanismo
dependente ou não de caspases. Após a exposição a 10 µg/mL (80,65 nM) de lectina por 24
horas, as células HeLa foram tripsinizadas, coletadas e lavadas com tampão PBS gelado. O
sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200 µL de Binding Buffer 1X.
Adicionou-se 5 µL de Annexin V – FITC e 1 µL da solução de PI a 100 µg/mL a cada 100 µL de
suspensão celular. As células ficaram sob incubação por 15 minutos, a temperatura ambiente,
mantidas sob proteção de luz. Após o período de incubação, foram adicionados 400 µL de
tampão de ligação para anexina V 1X e as células foram analisadas em citômetro de fluxo,
medindo a emissão de fluorescência para anexina V (530-575 nm) e PI (630-22 nm). A
METODOLOGIA - 51
população foi separada em 4 grupos: células viáveis (baixos níveis de fluorescência), células em
estágio inicial de apoptose (fluorescência verde), células em estágio final de apoptose
(fluorescência em verde e vermelho) e células em necrose (fluorescência vermelha). A
porcentagem de células em apoptose foi determinada a cada 20 mil eventos e os gráficos
obtidos no experimento representam dados oriundos de três experimentos independentes. Para
análise dos dados, o software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc., CA, USA) foi utilizado.
3.2.10.2. Análise do Ciclo Celular
Para a avaliação dos efeitos da lectina sobre o ciclo celular, os tubos de citometria
utilizados no ensaio anterior foram utilizados. As células HeLa foram lavadas com tampão PBS
gelado e o sobrenadante foi descartado. O pellet com as células foi então incubado com
paraformaldeído 2%, lavado com PBS gelado e permeabilizado com saponina 0,01% por 15
minutos. Após este procedimento, as células foram incubadas com 10 µL de RNAse (4 mg/mL) a
37ºC por 30 minutos. Foram adicionados 5 µL de Iodeto de Propídeo (25 mg/mL), juntamente
com 200 µL de PBS gelado às células e levadas ao citômetro de fluxo para análise de parada de
ciclo celular (630/22 nm). A porcentagem de células em apoptose foi determinada a cada 20 mil
eventos e os gráficos obtidos no experimento representam dados oriundos de três experimentos
independentes. Para análise dos dados, o software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc.) foi utilizado.
3.2.11. Western Blotting
As células HeLa em cultura foram plaqueadas numa concentração de 9,6x105 células em
discos estéreis de 100 mm e incubadas por 24 horas para adesão. Após esse período, o meio foi
removido e as células foram carenciadas por mais 24h com meio sem soro. Posteriormente,
esse meio foi removido e as células foram estimuladas a sair do estado G0 pela adição de meio
suplementado com 10% SFB na ausência (controle) ou presença de 10 µg/mL de CaL, em
tempos diferentes de incubação (0h, 6h, 12h, 18h e 24h), foram lavadas em gelo com PBS e
removidas com 200 µL de tampão de lise [50 mM Tris-HCl (pH 7,4); 1% Tween 20; 0,25%
METODOLOGIA - 52
desoxicolato de sódio; 150 mM NaCl; 1 mM EGTA; 1 mM Na3VO4; 1 mM NaF e inibidores de
proteases: 1 µg/mL de aprotinina, 10 µg/mL de leupeptina e 1 mM de fluoreto de
fenilmetanosulfonila] por 2 horas em gelo. Os extratos proteicos totais foram obtidos por
centrifugação e sonicação, onde a concentração de proteínas foi determinada usando o método
de BRADFORD (1976). Alíquotas equivalentes (30 µg) dos extratos protéicos dos diferentes
tratamentos foram adicionados separadamente a um volume igual de tampão de amostra
concentrado 2x com dodecil sulfato de sódio (SDS) (100 mM Tris-HCl (pH 6,8), 200 mM DTT, 4%
de SDS, 0,1% azul de bromofenol e 20% de glicerol) que foram, em seguida, fervidas por cerca
de 5 minutos. O gel de poliacrilamida, na presença de SDS, foi produzido seguindo metodologia
já estabelecida (LAEMMLI, 1970). O gel de separação foi preparado a 12%, enquanto que o gel
de concentração a 4% de acrilamida. A eletroforese foi processada em uma amperagem
constante de 20 mA durante 2 horas.
Os extratos proteicos resolvidos eletroforeticamente foram transferidos para a membrana
de PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA) (PLUSKAL et al., 1986). Após a transferência, as
membranas foram submetidas a bloqueio de seus sítios inespecíficos com Tampão de Bloqueio
[1% de leite desnatado ou 2% de soro fetal bovino (BSA) em tampão salino Tris (TBS) com
0,05% Tween 20 (TBST)], permanecendo nesta solução por uma hora; e então, foram incubados
por cerca de 12 horas a 4 ˚C com apropriado anticorpo primário diluído em tampão bloqueador
na proporção de 1:1000. Após lavagem em TBST, as membranas foram incubadas com
anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase, em diluição 1:2000, em tampão de
bloqueio por 1 hora. A detecção foi realizada usando quimioluminescência (FERREIRA, C. V. et
al., 2004).
Para construção do gráfico da expressão relativa, as bandas obtidas foram quantificadas
por densitometria e, posteriormente, foi feita uma razão entre o valor obtido no tempo zero
(controle) para todas as proteínas e o valor obtido para a β-actina também no tempo zero. Este
cálculo foi feito sucessivamente para todos os tempos. Para a construção do gráfico, cada valor
encontrado entre a razão proteína/ β-actina foi dividido por sua razão no tempo de 0 horas
(controle).
3.2.12. Análises Estatísticas
METODOLOGIA - 53
Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes e foram
expressos com média ±DP (Desvio Padrão), exceto fosse indicado de outra maneira. As
diferenças entre os grupos foram comparadas pelo teste Student-Newman-Keuls ou pelo teste
de Tukey, utilizados para comprovar algumas similaridades encontradas pela ANOVA. Foram
consideradas diferenças significativas quando o valor de p foi inferior a 0,05. Os dados
estatísticos foram analisados pelo software GraphPad InStat 3.05 (GraphPad Software Inc.,
2000).
RESULTADOS - 54
4. RESULTADOS
4.1. Isolamento, purificação e caracterização de CaL
A lectina da esponja marinha Cinachyrella apion foi extraída em tampão Tris-HCl, 0,05M, pH
7,5 por 4 horas, sendo subsequentemente fracionada pela adição de volumes crescentes de
acetona. Este fracionamento resultou na obtenção de três frações proteicas, F 0,5, F 1,0 e F 2,0,
correspondentes aos volumes adicionados de acetona. Todas as frações foram testadas com
eritrócitos humanos nativos, tratados enzimaticamente com as proteases papaína e tripsina, na
presença ou não de íons bivalentes. Dentre elas, a fração F 1,0 se destacou por apresentar
maior atividade hemaglutinante contra eritrócitos humanos do tipo A papainizados. A F 1,0 foi
submetida a uma cromatografia de afinidade de IgG anti-CvL desglicosilada Sepharose 4B e
posteriormente a uma Superose 12 10/300, utilizando o sistema FPLC/AKTA Purifier (Figura 9).
A atividade hemaglutinante coincidiu com único pico obtido em perfil cromatográfico pós-
FPLC/AKTA e a pureza da amostra foi confirmada em eletroforese SDS-PAGE, em presença de
agente redutor DTT (Figura 10). A lectina apresentou atividade específica de aproximadamente
1211 UH/µg e foi purificada 871 vezes, conforme mostra a tabela de purificação (Tabela 1).
Monossacarídeos (D-glucose, D-galactose, D-frutose, L-fucose, D-manose, D-arabinose,
D-xilose, N-acetil-D-glucosamina, D-glucosamina, D-galactosamina), dissacarídeos (melibiose,
lactose e sacarose) e uma glicoproteína (mucina) foram utilizados objetivando identificar a
especificidade da lectina purificada CaL. Dentre os inibidores testados o dissacarídeo lactose se
destacou por reduzir 100% da atividade hemaglutinante. Os demais carboidratos apresentaram
pouco ou nenhum efeito sobre a lectina purificada utilizada (Figura 11).
A lectina CaL apresentou-se estável até a temperatura de 60 ˚C, perdendo sua atividade
total em temperaturas superiores a 90 ˚C. Temperaturas inferiores à temperatura ambiente (25
˚C) não afetaram a sua atividade (Figura 12).
A Figura 13 mostra o efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante após diálise da lectina
em diferentes tampões e retorno ao seu tampão inicial. Observa-se uma atividade constante
independentemente do pH ao qual a mesma foi submetida.
RESULTADOS - 55
Figura 9 - Perfil cromatográfico de CaL em coluna de exclusão molecular e determinação da massa molecular. (A) Perfil cromatográfico de CaL em coluna de gel filtração Superose 12 10/300 (FPLC/AKTA). A coluna foi previamente estabilizada em tampão Tris-HCl, 0,05M, pH 7,5. As frações (0,5mL/tubo) foram monitoradas a 280 nm e 215 nm. A atividade hemaglutinante foi detectada na presença de 4% de eritrócitos humanos do tipo A. (B) Determinação da massa molecular de CaL (~124 kDa). Os marcadores de massa molecular padrão foram: (a) β-amilase (200 kDa), (b) álcool desidrogenase (150 kDa) e (c) anidrase carbônica (29 kDa). Log Mr, logaritmo da massa molecular; Ve/V0, razão entre volume de eluição e volume total da coluna.
Figura 10 - Eletroforese (SDS-PAGE) da CaL, em presença do agente redutor DTT. Linha 1 – Extrato Bruto; Linha 2 – F0,5; Linha 3 – F1,0; Linha 4 – CaL; M – Marcador de peso molecular (KDa): β-galactosidase (116,0), BSA (66,2),ovoalbumina (45,0), lactato desidrogenase (35,0), enzima de restrição Bsp981 (25,0), β-lactoglobulina (18,4) e lisozima (14,4). As proteínas foram visualizadas através da revelação com nitrato de prata.
A B
RESULTADOS - 56
Fração Total de
proteína (µg) x 103
Atividade total (UH) x
103
Atividade específica (UH/µg)
Purificação (vezes)
Rendimento (%)
Extrato Bruto 475,49 660,93 1,39 1 100
F1 (Precipitação por acetona) 28,26 786,19 27,82 20 5,944
CaL (Cromatografia de afinidade) 0,05 40,26 805,22 579 0,011
CaL (Superose 6 10 300 GL) 0,02 30,93 1211,18 871 0,005
UH: Unidade de Hemaglutinação.
Tabela 1 - Resultados da purificação da lectina da esponja Cinachyrella apion em diferentes etapas.
Figura 11 – Inibição da hemaglutinação de CaL. Após a diluição seriada da amostra, foram adicionado 25 µL do inibidor teste, na concentração de 100 mM, e deixados em contato por 1 hora antes da adição dos eritrócitos.
RESULTADOS - 57
Figura 12 – Curva de termoestabilidade de CaL. A lectina foi submetida a temperaturas de 4, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100 ˚C durante 1 hora. Após a incubação, ensaios de hemaglutinação com a lectina foram realizados à temperatura ambiente.
Figura 13 – Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina (CaL). A lectina purificada da esponja Cinachyrella apion foi submetida aos diferentes tampões: Glicina-HCl 50 mM pH 2 e 3; Acetato de sódio 50 mM pH 5; Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 8 e 9; Glicina-NaOH 50 mM pH 11. Seguida de uma nova diálise contra o tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 a 4 ˚C durante 24 horas. Terminando esse tratamento, ensaios de hemaglutinação foram realizados.
A análise da presença de carboidratos totais na estrutura protéica de CaL foi avaliada pelo
ensaio de DUBOIS et al. (1956). Não foi observada a presença de carboidratos ligados a
estrutura da lectina purificada, utilizando como curva padrão o monossacarídeo glicose (1
mg/mL).
RESULTADOS - 58
4.2. Ensaios em cultura de células
4.2.1. Efeitos de CaL sobre a Proliferação Celular
A proliferação celular das linhagens PC3 (adenocarcinoma de próstata humano - ATCC
número CRL-1435), 3T3 (linhagem fibroblástica normal de camundongo - ATCC número CL-173)
e HeLa (linhagem de células tumorais humanas de cólon uterino - ATCC número CCL-2) foram
analisadas após incubação por 24 e 48 horas com concentrações crescentes de CaL (0,5 µg/mL
a 10 µg/mL). O tempo de 48 horas foi utilizado no ensaio para avaliar se o efeito da lectina sobre
as linhagens celulares testadas estava relacionado ao tempo de exposição de CaL às células ou
se o efeito antiproliferativo era dose dependente. Após este período, foi possível observar uma
considerável redução da taxa de proliferação celular das linhagens tumorais PC3 e HeLa, em
resposta a aumentos na concentração de CaL, sem alteração significativa com relação ao tempo
de exposição da lectina às células, contudo houve uma pequena alteração na taxa de
proliferação das células normais de camundongo 3T3 (Figura 14), no mesmo intervalo de
concentrações testadas e sob as mesmas condições experimentais. O valor da IC50 (a IC50
corresponde a concentração de CaL que diminui a proliferação celular em 50%) foi obtida com a
concentração de 10 µg/mL de CaL para as células HeLa, que apresentaram maior taxa de
inibição da proliferação pela incubação com CaL visualizado pelo ensaio de MTT, e esta
linhagem foi escolhida para os ensaios posteriores, indicando a presença de uma atividade
seletiva da lectina contra células de adenocarcinoma cervical humano.
Para investigar a influência da associação da lectina a seu inibidor específico na viabilidade
das células testadas, a concentração correspondente a IC50 de CaL (10 µg/mL) foi incubada
previamente com uma concentração fixa do seu inibidor específico (lactose 0,1 M) por uma hora.
O dissacarídeo lactose (0,1 M) também foi utilizado como composto teste (sem a presença de
CaL associada) na análise da proliferação celular, com intuito de investigar a capacidade deste
carboidrato em reduzir a proliferação das células. A molaridade da lactose escolhida para o
ensaio antiproliferativo foi determinada de acordo com a molaridade padronizada em nosso
laboratório para ensaios de inibição de hemaglutinação. Após o período do ensaio, observou-se
que a lactose reduz de forma significativa a proliferação celular. A lectina associada ao
dissacarídeo foi incubada nas células teste nos diferentes tempos de ensaio (Figura 14). Neste
resultado se observa que, quando a lectina está associada à lactose, há uma redução na inibição
RESULTADOS - 59
da proliferação das células testadas, reduzindo o efeito antiproliferativo de CaL e lactose
observados quando testados isoladamente.
Figura 14 – Efeito da CaL sobre a viabilidade das linhagens celulares PC3, HeLa e 3T3. A avaliação da citotoxicidade de CaL sobre as linhagens tumorais PC3 e HeLa e sobre a linhagem fibroblástica normal de camundongo 3T3 foi feita pelo ensaio de redução de MTT. As células teste foram tratadas com diferentes concentrações de CaL (0,5 µg/mL – 10 µg/mL) por 24 e 48 horas em microplacas de cultura. CaL (10 µg/mL) incubada com o inibidor específico lactose (0,1 M) foi utilizada como controle. A viabilidade das células tratadas com CaL foi expressa como porcentagem da viabilidade das células controle não tratadas. ***p<0,001 em relação ao controle (Student-Newman-Keuls test).
A concentração de 20 µg/mL de CaL, correspondente ao dobro da IC50, foi incubada para
confirmar a ação inibitória da proliferação de CaL contra a linhagem HeLa. Após o período de
incubação de 48 horas, foi possível observar que, aplicando 20 µg/mL da CaL, a viabilidade das
células tumorais é reduzida em quase 100% (Figura 15). A incubação da lectina na concentração
de 20 µg/mL com lactose 0,1M reduziu em quase 100% a atividade antiproliferativa tanto da
lectina quanto do dissacarídeo, mostrando que, após a associação da lectina ao inibidor, ambos
reduzem a citotoxicidade frente à linhagem tumoral.
RESULTADOS - 60
Figura 15 – Avaliação da citotoxicidade de CaL sobre a linhagem tumoral HeLa. Após o período de 48 horas de incubação, em diferentes concentrações, avaliou-se o efeito citotóxico da lectina ao incubar as células com o dobro da IC50 (20 µg/mL) (***p<0,001 em relação ao controle (Student-Newman-Keuls test).
4.2.2. Avaliação da citotoxicidade sobre células do sangue periférico humano e da atividade hemolítica de CaL
A toxicidade da lectina purificada CaL foi avaliada contra células do sangue periférico
humano, nas concentrações de 10 µg/mL e 20 µg/mL. CaL não apresentou citotoxicidade contra
células do sangue periférico humano quando avaliadas em contador de células sanguíneas e
citometria de fluxo (Figura 16 e Tabela 2).
Figura 16 - Citometria de fluxo do sangue periférico humano na presença e ausência de CaL. (A) Sangue periférico humano na ausência de CaL; (B) Sangue periférico humano na presença de CaL, 10 µg/mL (80,65 nM); (C) Sangue periférico humano na presença de CaL, 20 µg/mL (161,29 nM).
RESULTADOS - 61
Tabela 2 - Análise do efeito citotóxico de CaL sobre sangue periférico total. BSA, Albumina sérica bovina; Controle, ausência da lectina. Leucócitos (x 103/µL), Eritrócitos (x 10
6/µL) e
Plaquetas (x 103/µL). Não houve diferença estatística significativa com relação ao controle.
Também não foi observada a atividade hemolítica para CaL a 10 µg/mL como visto em
ensaio hemolítico em placa de 96 poços (Figura 17).
Figura 17 - Avaliação do efeito hemolítico de CaL sobre hemácias humanas. Como controle negativo e positivo foram utilizados tampão fosfato salino (PBS) e Triton X-100 1%, respectivamente. ***p<0,001 em relação ao controle positivo (ANOVA; teste de Tukey).
4.2.3. Determinação de efeito apoptótico de CaL sobre células HeLa por incubação com DAPI
Controle BSA (µg/mL) CaL (µg/mL)
5 25 50 10 20
Eritrócitos 5,45±0,070 5,1±0 5,35±0,07 5,05±0,07 5,8±0,11 5,6±0,11
Linfócitos 39,35± 0,49 38,95±0,49 40,1±1,69 39,95±0,35 40,5±0,62 39,83±0,94
Leucócitos 4,825±0,007 4,44±0,09 4,50±0,02 4,54±0,16 4,46±0,04 4,58±0,07
Plaquetas 131±4,24 113,5±2,12 128±8,48 112,5±3,53 129,33±10,06 134,0±5,29
-50%
0%
50%
100%
150%
200%
CaL (10 µg/mL) Controle negativo Triton X-100 1%
% A
tivi
dade
Hem
olít
ica
***
***
RESULTADOS - 62
Para avaliar se o efeito de CaL sobre a redução da viabilidade celular da linhagem celular
HeLa determinaria a indução de apoptose, mudanças morfológicas nucleares foram monitoradas
pela coloração com DAPI (Figura 18). Como pode ser visto na Figura 18 (A), as células do grupo
controle exibem organização nuclear normal com a cromatina dispersa e íntegra. Em
contrapartida, as células tratadas com 10 µg/mL (80,65 nM) de CaL por 24 horas mostraram
núcleos com diferentes alterações morfológicas, como núcleos picnóticos, condensação do
material nuclear e fragmentação nuclear, indicadas pela fluorescência com DAPI (Figuras 18 B-
D).
Figura 18 – Micrografia de células HeLa tratadas com CaL. Células da linhagem HeLa (2 x 105/mL) foram incubadas com 10 µg/mL (80,65 nM) de CaL por 24 horas e marcadas com DAPI para evidenciar sua morfologia nuclear. (A) Controle, células HeLa sem CaL; (B, C e D) células HeLa tratadas com CaL, mostrando alterações morfológicas nucleares, como picnose e fragmentação (setas).
4.2.4. Indução de morte celular em linhagem tumoral HeLa pela ação de CaL
4.2.4.1. Detecção e quantificação de células apoptóticas induzidas por CaL
RESULTADOS - 63
Os resultados obtidos com células HeLa submetidas à marcação com a solução Anexina
V/PI após a exposição à concentração de 10 µg/mL de CaL podem ser observados na Figura 19.
A detecção da marcação positiva de 23,2% das células para Anexina V foi observada e o fato de
esta marcação ter-se dado apenas para o fluoróforo FITC-AnexinaV (sem ser positivo para o
iodeto de propídio), é indicativo de fase inicial de apoptose.
Muitos indutores de apoptose podem disparar a morte celular pela ativação de caspases.
Por essa razão, foi examinado o efeito de CaL sobre a ativação da via de caspases, quando as
células foram incubadas com a lectina na presença de 20 mM de Z-VAD-FMK, um inibidor geral
de proteases cisteínicas. Após um período de 24 horas de tratamento, o bloqueio do efeito
indutor de CaL sobre a morte celular pela via das caspases foi avaliado através de citometria de
fluxo, com indicações de marcação positiva para anexina V de 15,5%. A redução da marcação
para anexina V em 7,7% após a incubação com Z-VAD-FMK sugere a participação de ambas as
vias de ativação de apoptose, ou seja, CaL pode induzir a morte celular tanto por uma via
dependente da ativação de caspases como por uma via independente da ação destas proteases.
RESULTADOS - 64
Figura 19 – Citometria de fluxo de células HeLa tratadas com Anexina V/PI e CaL (em presença e ausência de Z-VAD-FMK). As células foram mantidas na presença de 10 µg/mL de lectina (com ou sem Z-VAD-FMK) por 24 horas, coradas com FITC-Anexina V e Iodeto de propídio e analisadas em citômetro de fluxo FACScanto II com marcação para apoptose/necrose. Q1:Anexina V negativo/PI positivo; Q2: Anexina V/PI positivos; Q3:Anexina V positivo/PI negativo; Q4: Anexina V/PI negativos. (A) Células controle, sem a presença de CaL; (B) Células
(A)
(B)
(C)
RESULTADOS - 65
incubadas com 80,65 nM de CaL; (C) Células incubadas com 80,65 nM de CaL, juntamente com ZVAD-fmk, inibidor de caspases. A análise dos dados de citometria de fluxo foram realizados utilizando o software FlowJo v. 7.6.3.
4.2.4.2. Avaliação da parada de ciclo celular induzida pela atividade lectínica de
CaL
Para conseguir minimizar os efeitos adversos de situações fisiológicas estressantes à
célula, uma parada da progressão do ciclo celular pode ser rapidamente providenciada após a
exposição a estresse. Assim, foi analisado o efeito da lectina sobre a distribuição das células nas
diferentes fases do ciclo celular. Após incubação por 24 horas com CaL (em presença ou não de
Z-VAD-FMK), numa concentração fixa de 80,65 nM, observou-se um acúmulo de células
aprisionadas na fase S do ciclo celular, um indicativo de direcionamento das células tumorais a
iniciarem o processo de morte celular por apoptose, já que uma das características marcantes da
formação de tumores é justamente a proliferação incontrolada de células malignas (Figura 20).
Figura 20 – Avaliação de parada de ciclo celular após exposição à CaL. Após 24 horas de tratamento com a CaL, as células HeLa foram fixadas, tratadas com RNAse, coradas com Iodeto de Propídeo e analisadas em citometria de fluxo para avaliação da distribição do ciclo celular. A análise dos dados para parada de ciclo celular foram realizados utilizando o software FlowJo v. 7.6.3.
RESULTADOS - 66
4.2.4.1. Efeitos de CaL na modulação da atividade de Bax, Bcl-2, JNK, p-NFƙB e
da proteína de regulação do ciclo celular p-AKT em células HeLa
Os resultados obtidos para os ensaios de viabilidade celular, citometria de fluxo, análise
da parada de ciclo celular e das mudanças morfológicas na estrutura nuclear das células
tumorais sugerem morte celular por apoptose. Para determinar as proteínas-chave envolvidas na
indução de morte celular, a técnica de Western Blotting foi utilizada. Uma concentração fixa de
CaL (80,65 nM) foi incubada juntamente com as células HeLa, em diferentes tempos de
incubação (controle, 6 horas, 12 horas, 18 horas e 24 horas).
Como pode ser observado na Figura 21, houve um considerável aumento na ativação da
proteína BAX (proteína pró-apoptótica pertencente à família Bcl-2) até o tempo de 18 horas,
onde esse aumento foi gradual, de maneira tempo dependente; outro aumento considerável se
dá na proteína NF-ƙB (fatores de transcrição do fator nuclear ƙB), sob a forma precursora de 105
kDa. A forma ativa de NF- ƙB (50 kDa) reduziu proporcionalmente ao aumento de sua forma
inativa, de 105 kDa. A proteína anti-apoptótica Bcl-2 apresentou redução considerável em sua
ativação, exceto no tempo de 24 horas, com aumento pouco significativo em sua ativação se
comparado ao controle. Western Blotting de outras proteínas relacionadas à morte celular por
apoptose também foram avaliadas, como a JNK e p-AKT, onde não houve aumento considerável
na expressão de JNK, exceto para o tempo de 24 horas; um pequeno aumento na ativação de p-
AKT foi observado na presença da lectina, porém este aumento não é significativo em relação ao
controle (Figura 21). Estes dados, juntamente com os resultados obtidos na citometria de fluxo,
indicam o efeito tóxico de CaL frente a linhagem de células tumorais HeLa, sugerindo indução de
morte celular por apoptose através da ativação de Bax, uma proteína pró-apoptótica, tanto por
via dependente quanto independente da ação de caspases.
RESULTADOS - 67
Figura 21 – Immunoblotting de proteínas envolvidas em morte celular por apoptose. (A) Bandeamento de proteínas oriundas do Western Blotting; (B) Gráfico da expressão de BAX, Bcl-2, JNK, p-NFƙB (105 kDa e 50 kDa) e p-AKT. ***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05, em relação ao controle (Student-Newman-Keuls test).
(B)
(A)
DISCUSSÃO - 68
5. DISCUSSÃO
Após um quarto de século de avanços, a pesquisa sobre o câncer gerou uma complexa e
rica fonte de conhecimento, mostrando o câncer como uma doença que envolve mudanças
dinâmicas no genoma. A base foi estabelecida na descoberta de mutações que produziam
oncogenes com ganho dominante de função e genes supressores de tumor com perda recessiva
de função; ambas as classes de genes relacionados ao câncer foram identificados através de
sua alteração em células tumorais de animais e humanos e pela elicitação de seus fenótipos,
utilizando modelos experimentais (BISHOP; WEINBERG, 1996). Várias linhas de evidências
indicam que a tumorogênese em humanos é um processo de várias etapas, e que estas etapas
refletem alterações genéticas que levam a transformações progressivas de células normais
humanas a derivativos altamente malignos. Análises patológicas de um número de regiões de
órgãos revelam lesões num processo o qual as células evoluem progressivamente da
normalidade via uma série de estágios pré-malignos em cânceres invasivos (CARDIFF;
BOROWSKY, 2010).
Nas últimas décadas, um grande número de pesquisas tem desvendado os caminhos da
transdução de sinais no controle da morte celular e da maquinaria molecular responsável por
estes processos, conduzindo a numerosas possibilidades de intervenção farmacológica e
delineamento de fármacos (GREEN; KROEMER, 2005). Entre os novos fármacos utilizados na
terapia contra o câncer com potencialidade para interferir no mecanismo de regulação do
crescimento de tumores celulares, os produtos naturais têm chamado devida atenção como
importantes fontes de agentes quimioterápicos e/ou de modelos químicos e estruturais para o
desenvolvimento de uma infinidade de compostos (CLARDY; WALSH, 2004; CRAGG et al.,
2006; FERREIRA et al., 2006; JUSTO; FERREIRA, 2005; STROHL, 2000). As lectinas
constituem uma classe de proteínas largamente distribuída entre os organismos vivos, e
algumas têm atraído atenção como potenciais ativadores de morte celular em tecidos tumorais
por desencadear cascatas de sinalização apoptótica (BANTEL et al., 1999; HAJTO et al., 2005;
KIM et al., 2003; LAVASTRE et al., 2002; MIYOSHI et al., 2001; OHBA et al., 2004; PARK et al.,
2000; RAO et al., 2005).
Nosso grupo de pesquisa há vários anos tem dado ênfase na purificação, caracterização e
determinação de atividades heterólogas de proteínas bioativas, principalmente as encontradas
em organismos marinhos (MEDEIROS et al, 2010; QUEIROZ et al, 2009; QUEIROZ et al, 2008;
DISCUSSÃO - 69
MOURA et al, 2006). Recentemente, em nosso grupo de pesquisa, uma lectina da esponja
marinha C. apion (CaL) foi purificada, caracterizada e sua atividade lectínica foi testada contra
formas promastigotas de L. chagasi. Tendo em vista a potente atividade aglutinante desta lectina
ao protozoário, novos estudos em busca de outras atividades heterólogas de CaL foram
necessários. O presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade citotóxica de CaL
frente a linhagens celulares, avaliando a capacidade desta lectina em induzir morte em células
tumorais.
Primeiramente, o procedimento de purificação de CaL foi reproduzido de acordo com
Medeiros et al. (2010). A lectina foi purificada seguindo os mesmos passos de purificação e
apresentou atividade hemaglutinante preferencial para eritrócitos do tipo A papainizados, sem
dependência de íons bivalentes e manteve estável sua atividade lectínica a alterações de pH e
temperatura; após ensaios de inibição, foi possível comprovar a especificidade seletiva de CaL
para o dissacarídeo lactose, como observado por Medeiros et al. (2010). Análises de peso
molecular em sistema FPLC-AKTA e eletroforese SDS-PAGE em condições redutoras também
comprovam que se trata da mesma lectina purificada anteriormente.
Atualmente, o número de trabalhos publicados avaliando a atividade antiproliferativa de
lectinas de esponjas marinhas tem aumentado consideravelmente (PAJIC et al, 2002; QUEIROZ
et al, 2009; Ye, X. J.; Ng; T. B., 2010), contudo ainda são poucos os relatos de lectinas
purificadas de esponjas marinhas com essa atividade se comparado aos achados em lectinas de
outros organismos, como os vegetais. Por este motivo, a atividade antiproliferativa de CaL sobre
linhagens celulares foi testada. CaL foi capaz de induzir a inibição da proliferação em todas as
linhagens testadas, principalmente na linhagem HeLa, de forma dose dependente, com IC50 de
10 µg/mL. Além da incubação de CaL com as células, seu inibidor específico (lactose 0,1 M) foi
testado, tanto isoladamente quanto em associação com a lectina, para avaliação de sua
atividade antiproliferativa. Não há relatos de atividade antiproliferativa induzida pelo dissacarídeo
lactose, portanto este dado é particularmente importante, já que a lactose foi capaz de reduzir
em aproximadamente 40% a proliferação de células tumorais, além de estimular a proliferação
de células fibroblásticas normais de camundongo (3T3), o que a torna uma forte candidata a
estudos mais aprofundados sobre seu mecanismo de ação. Ainda mais interessante é a redução
de ambas as atividades antiproliferativas, tanto de CaL quanto da lactose, ao se associarem
previamente à incubação com as células. O efeito citotóxico de CaL é comprovado ao dobrar a
concentração da IC50 no ensaio antiproliferativo, alcançando aproximadamente 100% de inibição
DISCUSSÃO - 70
do crescimento celular, quando testada isoladamente. Da mesma forma, ao incubar a lectina (20
µg/mL) com a concentração fixa de seu inibidor específico (lactose 0,1 M), há uma redução de
94% da inibição da proliferação, comprovando o efeito antiproliferativo de CaL frente a linhagem
HeLa, já que, ao estar associada ao carboidrato, o efeito citotóxico de ambas as biomoléculas se
anulam. Resultados semelhantes foram encontrados para a lectina do fungo Agrocybe aegerita
(AAL), que apresentou citotoxicidade contra várias linhagens tumorais, dentre elas a linhagem
HeLa, com IC50 de 10 µg/mL (ZHAO et al, 2003); a lectina purificada da angiosperma Sophora
flavescens apresentou citotoxicidade contra as células de adenocarcinoma humano com IC50 de
1 µg/mL, induzindo a apoptose pela via das caspases (LIU et al., 2008); outra lectina com
atividade antitumoral foi purificada da esponja Haliclona cratera e exibiu um efeito citotóxico
contra células HeLa e FmX (melanoma), com IC50 de 9 µg/mL e 11 µg/mL, respectivamente
(PAJIC et al., 2002). A atividade antiproliferativa da lectina purificada da raiz de Astragalus
mongholicus (AMML) foi determinada, com uma IC50 de 40 µg/mL para a linhagem tumoral HeLa,
concentração superior à utilizada com CaL (YAN, et al., 2009).
Células do sangue periférico humano e suspensão de eritrócitos humanos a 1% foram
utilizadas para avaliação da toxicidade de CaL. Através da contagem diferencial de células do
sangue periférico por citometria de fluxo e ensaios de atividade hemolítica com eritrócitos do
sangue humano, foi possível comprovar que CaL não apresenta toxicidade em células
sanguíneas humanas quando incubada até o dobro da sua IC50 (20 µg/mL ou 161,3 nM). A
toxicidade de lectinas contra eritrócitos já foi observada para outras espécies de esponjas
marinhas. Dresh et al. (2005), em seu trabalho, analisou extratos aquosos de vinte espécies de
esponjas da costa Atlântica brasileira para a verificação da presença de atividade lectínica e
hemolítica. Através desta varredura, foi possível observar que, dentre as vinte espécies testadas,
apenas duas apresentaram atividade hemolítica contra eritrócitos de diversos organismos.
Ambos os resultados são importantes, já que muitos dos agentes quimioterápicos tradicionais
exibem toxicidade severa contra células normais, causando efeitos colaterais indesejáveis e
dessa forma limitando sua aplicação no campo clínico. Além disso, muitos dos agentes
terapêuticos ministrados na prática clínica ou não conduzem à cura, ou possibilitam a
sobrevivência, em longo prazo, de muitos tipos de câncer, provavelmente permitindo o
desenvolvimento de mecanismos de resistência à doença. Por essa razão, fica clara a
necessidade de novos agentes com diferentes mecanismos de ação que possam ser utilizados
DISCUSSÃO - 71
no tratamento direto dessas doenças e/ou como adjuvantes no aperfeiçoamento da terapia do
câncer (CRAGG et al., 2006; REN, 2005).
A análise da morfologia nuclear das células é uma ferramenta rápida e importante na
diferenciação dos diversos tipos de morte celular (YAN et al., 2009; PRIYADARSINI et al., 2010;
OGDEN et al., 2001; HADARI et al., 2000; SCHWARZ et al., 1999; KROEMER et al., 2009). A
visualização das alterações morfológicas de células da linhagem HeLa, após a exposição à CaL,
foi observada por microscopia de fluorescência, marcadas com o corante DAPI. Os resultados
mostraram que a atividade antiproliferativa de CaL sobre a linhagem HeLa se dá provavelmente
por indução de morte destas células. Apesar de as alterações nucleares observadas
(fragmentação nuclear, formação de núcleos picnóticos, presença de corpos apoptóticos e outras
alterações morfológicas nucleares) serem indicadoras de morte celular por apoptose, outros
ensaios para a análise de caracteres moleculares foram necessários para corroborar os
resultados obtidos em microscopia.
A apoptose é um processo de morte celular altamente regulado, ocorrendo como um
componente normal do desenvolvimento. A distinção entre as fases iniciais e finais da apoptose
está relacionada a mudanças morfológicas e bioquímicas, incluindo a compactação e
fragmentação nuclear da cromatina, retraimento do citoplasma e perda da assimetria da
membrana. Este último evento pode ser evidenciado pelo emprego combinado da anexina V e o
iodeto de propídio. A anexina V é uma proteína de 35-36 kDa, dependente de Ca2+ e que se liga
a fosfolipídios, com alta especificidade para fosfatidilserina. Ela é marcada com um fluoróforo ou
biotina e pode identificar células apoptóticas, já que nestas a fosfatidilserina é translocada da
face interna da membrana plasmática para a externa. Por outro lado, o iodeto de propídeo é um
marcador nuclear que penetra exclusivamente em células que apresentam a membrana celular
danificada, permitindo a identificação de células em estágio final de apoptose/necrose. A
capacidade de CaL em induzir a apoptose foi visualizada através de citometria de fluxo, com
marcação para anexina V-FITC/PI. Após o período de 24 horas, foi possível comprovar a
indução de apoptose inicial em células tumorais HeLa pela ação da lectina purificada, com
aproximadamente 23% das células marcadas exclusivamente para anexina V. As células foram
também tratadas com CaL na presença de Z-VAD-FMK, um inibidor geral de caspases, no intuito
de revelar detalhes acerca da via de indução de morte celular promovida pela lectina. A
citometria de fluxo mostrou que a presença do inibidor reduziu em 7,7% a porcentagem de
células em apoptose inicial, indicando que a lectina promove a morte celular de HeLa por
DISCUSSÃO - 72
apoptose, tanto dependente quanto independente da via das caspases. Estes dados podem ser
comparados aos de Miyoshy e colaboradores (2001), que observaram o efeito das aglutininas de
farelo de arroz (RBA), gérmen de trigo (WGA) e aglutinina de Viscum album (VAA) na indução de
apoptose em células U937, comprovando a indução da condensação de cromatina,
externalização de fosfatidilserina (visualizada em citometria de fluxo) e fragmentação de DNA,
além de sugerir que o mecanismo de morte celular com parada de ciclo em G2/M promovido por
RBA é semelhante ao de WGA, porém diferente para VAA.
Outro aspecto importante a ser observado é a influência da CaL sobre a progressão do
ciclo celular, já que o aprisionamento das células em determinadas fases do ciclo celular é um
dos pontos que caracterizam a morte das células. A divisão celular consiste de dois processos
consecutivos, caracterizados principalmente pela replicação do DNA e segregação dos
cromossomos replicados, em duas células distintas. Originalmente, a divisão celular foi dividida
em dois estágios: Mitose (M), isto é, o processo de divisão nuclear; e interfase, o interlúdio entre
as duas fases M. Os estágios da mitose incluem: prófase, metáfase, anáfase e telófase. Pela
observação no microscópio, as células em interfase apenas aumentam de tamanho, porém
diferentes técnicas revelaram que a interfase inclui as fases G1, S e G2 (NORBURY; NURSE,
1992). A replicação do DNA ocorre em uma parte específica da interfase chamada fase S. A fase
S é precedida de um intervalo chamado G1, durante o qual a célula é preparada para a síntese
de DNA e é seguido de outro intervalo chamado G2, no qual a célula se prepara para a mitose.
As fases G1, S, G2 e M são subdivisões tradicionais do padrão de ciclo celular. Células em G1
podem, antes de se comprometer com a replicação do DNA, entrar em um estágio chamado G0.
Células em G0 contabilizam a maior parte das células não-proliferativas e que não estão em
crescimento no corpo humano. A regulação da dinâmica das diferentes fases do ciclo celular
está relacionada a diferentes fatores e mecanismos. Muitos agentes anti-câncer e agentes
modificadores do DNA aprisionam as células nas fases G0/G1, S ou G2/M, induzindo a morte
celular por apoptose (KESSEL; LUO, 2000).
A análise das células por citometria de fluxo indicou que as células HeLa, após incubação
com CaL por 24 horas, foram aprisionadas (aproximadamente 57% das células) na fase S do
ciclo celular, tanto na presença quanto na ausência do inibidor de proteases cisteínicas Z-VAD-
FMK. A citometria de fluxo indica que a lectina do fungo Volvariella volvacea (VVL) aprisiona a
proliferação celular pelo bloqueio da progressão do ciclo celular na fase G2/M (LIU et al., 2001).
Contudo, várias lectinas são capazes de induzir mecanismos de acumulação em G1 e G2/M sem
DISCUSSÃO - 73
causar apoptose (LYU et al., 2001; SIEGLE et al., 2001). A aglutinina-I de Viscum album (VAA-I)
induziu a acumulação de células de câncer de pulmão A549 em G1 sem causar apoptose
(SIEGLE et al., 2001).
A parada de ciclo celular em fase S não é um evento comum nos estudos com lectinas.
Uma rara referência a esse efeito foi relatada para a lectina extraída das raízes de Astragalus
mongholicus (AMML), que ocasionou o aprisionamento de células HeLa em fase S, após 24
horas de exposição, num grau menor (34-39%) que a CaL e em uma faixa de concentração
maior (20-40 µg/mL) que o dobro da usada com CaL (YAN, et al., 2009). Parada da progressão
do ciclo celular em fase S foi observada em algumas linhagens celulares tratadas com ascorbato
de sódio (LIN et al., 2006) e com um inibidor de tirosino-quinase Jak em células AG490 (FUKE et
al., 2007). Contudo, o mecanismo responsável por esse efeito permanece obscuro. Os
mecanismos de pontos de checagem para danos no DNA na fase S são pouco conhecidos,
porém alguns estudos demonstram a supressão de ambas as fases de iniciação e elongação da
replicação do DNA (PAINTER, R. B. 1986; PAULOVICH, A. G.; HARTWELL, L. H., 1995).
Existem evidências que a fosforilação mediada por ATM (síndrome de quebra de Nijmegen
1(NBS1) é requerida para indução de parada do ciclo celular em fase S, durante a checagem
desta fase (LIM, D. S. et al., 2000).
O fato de CaL agir por mais de um mecanismo de indução de morte celular levanta a
possibilidade do envolvimento de outras proteases, diferentes das caspases, na indução de
apoptose em células HeLa. Embora as caspases estejam bem estabelecidas como principal via
de ativação da apoptose, outras proteínas devem ser necessárias para o desencadear de tipos
alternativos de morte celular programada (BROKER et al., 2005). A liberação de proteínas que
compõem o espaço intermembranar da mitocôndria desencadeada por permeabilização da
membrana mitocondrial externa constitui o ponto sem retorno de muitos casos da morte celular.
Membros da família Bcl-2 controlam este processo fortemente (GREEN; KROEMER, 2004). Sob
sinais apoptóticos, proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 como Bax e Bak são ativadas,
resultando na permeabilização da membrana externa da mitocôndria. Em contraste, membros
anti-apoptóticos da família Bcl-2, como Bcl-2 e Bcl-XL podem prevenir essa ocorrência pela
heterodimerização com proteínas Bax-like. Outras proteínas pró-apoptóticas Bcl-2 que contêm
apenas o domínio BH3 (Bad, Bim, Bid, Bmf e Noxa) agem tanto em oposição ao efeito inibitório
de Bcl-2 e Bcl-XL quanto pela ativação de proteínas Bax-like por ligação direta. Um segundo
mecanismo de permeabilização da membrana externa mitocondrial seria a abertura de um poro
DISCUSSÃO - 74
de permeabilidade de transição na membrana interna mitocondrial, de acordo com uma
variedade de estímulos. Isto permitiria a passagem de água e pequenas moléculas, causando o
inchaço do espaço intermembrana e, consequentemente, a ruptura da membrana mitocondrial
externa (GREEN; KROEMER, 2004).
Neste trabalho também foi analisada, por Western Blotting, a ativação de proteínas
relacionadas às vias de indução de apoptose pela incubação com CaL. Os resultados indicaram
uma mudança na permeabilidade da membrana mitocondrial provocada por CaL, já que foi esta
foi capaz de induzir o aumento crescente dos níveis de Bax até 18 horas, diminuindo
posteriormente em 24 horas, enquanto os níveis de Bcl-2 não sofreram alteração. Estes dados
sugerem que, provavelmente, CaL induziu permeabilização da membrana mitocondrial em
células HeLa, ativando a via intrínseca de apoptose.
Os níveis da proteína anti-apoptótica NF-ƙB, em sua forma inativa, ou seja, ligada ao seu
inibidor IƙB, aumentaram progressivamente de acordo com o tempo de exposição à CaL,
enquanto a expressão de Akt permaneceu praticamente inalterada. Esses eventos favorecem a
ativação da apoptose, já que estas proteínas estão envolvidas na ativação de membros anti-
apoptóticos da família Bcl-2 e IAPS, dentre outras moléculas que favorecem a sobrevivência
celular. A via de indução de morte celular pela ação de JNK não foi descartada, apesar da
alteração nos níveis de ativação desta proteína ser percebida apenas no tempo de 24 horas.
Estudos futuros poderão esclarecer o papel desta proteína no mecanismo antiproliferativo de
CaL.
Estudos sistemáticos mostram que a mitocôndria libera para o citoplasma as proteínas
solúveis presentes no espaço intermembranar a partir da formação de poros em sua membrana
externa. Várias dessas proteínas apresentam atividade pró-apoptótica, contudo, dentre estas
proteínas, apenas o fator indutor de apoptose (AIF) e a endonuclease G (EndoG) são capazes
de atuar em via independente de caspases (KROEMER, 2007). Tanto AIF como EndoG induzem
condensação nuclear e fragmentação do DNA, com possibilidade de atuarem de forma conjunta
para potencializar seus efeitos. Contudo, o processo de liberação dessas proteínas da
mitocôndria para o citosol e consequente translocação do citosol para o núcleo permanece
obscuro, com trabalhos mostrando tanto dependência (ARNOULT et al., 2002; ARNOULT et al.,
2003) quanto independência de mecanismos relacionados à atividade de caspases (ARNOULT
et al., 2003; CANDE et al., 2002). A endonuclease G é evolucionariamente conservada em
ortólogos conhecidos de bactérias e fungos e é capaz de induzir fragmentação do DNA em
DISCUSSÃO - 75
núcleos isolados, independente de caspases (LI; LUO; WANG, 2001). É provável que a
endonuclease G coopere com exonucleases ativadas por caspases e DNase I para gerar
fragmentos de DNA internucleossomal, sob condições fisiológicas (WIDLAK et al., 2001),
permanecendo desconhecido se a endonuclease G define uma via de fragmentação de DNA
mitocondrial em células de mamíferos (JAATTELA, 2004). AIF foi primeiramente descrito por
Susin et al. (1996) e está normalmente retido no espaço intermembranar mitocondrial, onde
desempenha função de oxidorredutase (MIRAMAR et al., 2001). Similar à atividade bifuncional
do citocromo c, AIF torna-se uma assassina de células ativa quando é liberada para o citosol; ela
então é translocada para o núcleo e desencadeia, possivelmente em conjunto com a
endonuclease G (WANG et al., 2002) a condensação periférica da cromatina e perda de DNA de
alto peso molecular (50 kDa) (LOEFFLER et al., 2001; SUSIN et al., 1999; YU et al., 2002).
Curiosamente, a protease lisossomal catepsina D foi relatada por desencadear a liberação de
AIF de maneira independente de caspases (BIDERE et al., 2003). Este fato é reforçado por YU e
colaboradores, que mostraram que a liberação de AIF e subsequente morte celular pode ser
desencadeada independente de caspases pelo influxo excessivo de Ca2+, resultando na
superativação de poli(ADP-ribose) polimerase-1 (YU et al., 2002). De fato, atualmente existem
evidências tanto in vitro como in vivo sugerindo que AIF pode atuar como um executor de morte
garantido em células tumorais, sem necessidade da ativação de caspases (ALONSO et al.,
2003; JOSEPH et al., 2002; LIAO; DICKSON, 2003; BROKER et al., 2005). Whiteman e
colaboradores desenvolveram um trabalho, utilizando marcadores de morte celular (análise de
SubG1, condensação de cromatina, TUNEL, ligação de Anexina V, retração do corpo celular,
extravasamento de LDH e estudos de viabilidade), onde foi observado que a morte celular
mediada por ácido hipocloroso (HOCl) induzia uma rápida ativação de Bax, colapso da
permeabilidade de membrana mitocondrial e liberação de proteínas intra-mitocondriais, AIF,
EndoG e citocromo c, o que resultou em morte celular sem ativação de caspases, porém o
mecanismo responsável pela rápida ativação de Bax e os mecanismos precisos de inibição das
caspases ainda estão sendo investigados (WHITEMAN et al., 2007).
Sendo assim, pode-se sugerir que CaL atua nas células HeLa induzindo a morte celular
por apoptose através da ativação (não exclusiva) da via intrínseca mitocondrial, atuando tanto de
forma dependente como independente de caspases, estimulando a permeabilização da
membrana mitocondrial e, consequentemente, a liberação de proteínas como AIF, EndoG e
citocromo c (ativa o apoptossomo, composto pelo complexo Apaf-1, procaspase-9 e ATP/dATP
DISCUSSÃO - 76
e, consequentemente, as caspases -9 e -3, induzindo a apoptose). Vários modelos de morte
celular por apoptose envolvendo a participação de caspases iniciadoras e executoras, além de
mecanismos independentes da participação de caspases para apoptose foram estabelecidos,
porém estudos mais aprofundados com relação à participação de outras proteínas relacionadas
a este tipo de morte celular são necessários para a determinação do mecanismo de ação de CaL
na apoptose de células de adenocarcinoma humano (HeLa).
CONCLUSÃO - 77
6. CONCLUSÃO
Uma lectina (CaL) foi purificada da esponja Cinachyrella apion (CaL), de acordo com a
metodologia descrita por Medeiros e colaboradores (2010). CaL apresentou potencial
antiproliferativo frente as linhagens de células tumorais testadas, em especial a linhagem tumoral
HeLa, agindo de forma dose dependente, não apresentando atividade hemolítica ou toxicidade
contra células do sangue periférico, nas concentrações de IC50. Além do efeito antiproliferativo
induzido por CaL, seu inibidor específico, o dissacarídeo Lactose (0,1 M) também apresentou
citotoxicidade frente as linhagens tumorais testadas, estimulando a proliferação de células
fibroblásticas de camundongo. CaL induz a morte celular de HeLa pela ativação da apoptose por
mais de um mecanismo de morte celular por apoptose, tanto dependente quanto independente
da via das caspases, pela ativação das proteínas pró-apoptóticas BAX e JNK, que atuam de
forma conjunta para a progressão do estímulo apoptótico, como também pela inibição da
proteína pró-sobrevivência celular NF-ƙB (105 kDa), porém estudos mais aprofundados dos
componentes destas vias de apoptose dependentes e/ou independente de caspases serão
realizados futuramente.
REFERÊNCIAS - 78
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