UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA

THIAGO SOARES DE LIMA

EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE DEXAMETASONA SOBRE O REPARO

ALVEOLAR EM RATOS

Rio de Janeiro

2018

THIAGO SOARES DE LIMA

EFEITO DE DIFERENTES DOSES DE DEXAMETASONA SOBRE O REPARO

ALVEOLAR EM RATOS

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós Graduação em Clínica

Odontológica (Mestrado Profissional) da

Faculdade de Odontologia da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre em Clínica

Odontológica.

Orientador: Prof. Dr. Jônatas Caldeira Esteves.

Rio de Janeiro

2018

Dedicatória

À minha família, que sempre foi o meu norte, a minha força, e a minha motivação para

encarar os desafios da vida.

Esposa, Pai, Mãe e Irmão, a vocês todo o meu amor.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo que consegui, vivi, sorri, sofri e superei. Sem a certeza da Tua

existência em meu coração nada seria possível.

Aos meus pais, Nélio e Adira, pelos exemplos, dedicação e o amor de toda uma vida.

Obrigado por apoiarem meus projetos e acreditarem sempre no meu melhor.

À minha esposa Gisele, pelo entusiasmo cotidiano que me leva à busca de melhorar a

cada dia. O companheirismo, amor e esse sorriso lindo foram fundamentais nessa conquista.

Te amo!

Ao meu irmão Mauro, pelas palavras, pela força e exemplo de disposição em viver a

vida com leveza, alegria e muito trabalho.

Às minhas sobrinhas, Alice e Caroline. Que alegria é ter vocês em minha vida

renovando minhas energias e esperanças!

Aos meus sogros Lucio e Marlene, pela convivência, carinho, almoços, docinhos e

salgadinhos que serão sempre bem-vindos!

Ao meu orientador Jônatas, por toda confiança, ensinamentos e dedicação. Mestre, sua

tranquilidade, comprometimento e disponibilidade fizeram de cada etapa uma oportunidade

única de aprendizagem. Foi um privilégio desenvolver esse trabalho com você.

À Faculdade de Odontologia da UFRJ, nas pessoas de sua diretora Profª Maria

Cynesia Medeiros de Barros e do seu vice-diretor Prof. Ednilson Porangaba Costa.

Ao Programa de pós-gradução de Mestrado Profissional em Clínica odontológica, na

pessoa da diretora adjunta de pós-gradução Profª Katia Regina Hostílio Cervantes Dias, pela

oportunidade de crescimento profissional e pessoal.

Ao Centro Universitário de Araraquara - UNIARA - pela parceria acadêmica no

desenvolvimento da cirurgia experimental deste projeto.

À professora Thallita Pereira Queiroz pela orientação e apoio na fase experimental

desta pesquisa.

Aos colegas Daniela Marques e Vinícius Porto pela colaboração auxílio nas cirurgias e

manutenção dos animais.

À professora Ana Paula de Souza Faloni, pelas sugestões muito bem-vindas ao longo

da elaboração do projeto.

À professora Rosângela Peccinni da Faculdade de Farmácia e Bioquímica de

Araraquara-Unesp pela orientação nos cálculos de equivalência utilizados no trabalho.

À professora Maria Augusta Visconti pela colaboração na análise radiográfica.

À professora Aline Corrêa Abrahão pelo auxílio na fase laboratorial do projeto.

Ao professor Bruno Augusto Benevenuto pela disponibilidade de uso dos

equipamentos do laboratório de microscopia da UFRJ.

À amiga Amanda Oliveira, por toda ajuda e comprometimento com o projeto. Sua

participação foi essencial.

Às amigas Roberta Deris, Flavia Sader, Laura Mello, e todos os demais representados

no nome de vocês, por todo apoio e incentivo.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram na elaboração deste projeto.

RESUMO

DE LIMA, Thiago Soares. Efeito de diferentes doses de dexametasona sobre o reparo

alveolar em ratos. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) –

Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

Objetivo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes doses pré-operatórias de

dexametasona sobre o processo de reparo alveolar. Métodos: Sessenta ratos foram

randomicamente divididos em 4 grupos de 15 animais cada que receberam dose única pré-

operatória de dexametasona equivalente a doses humanas de 4mg (grupo 4mg), 8mg (grupo

8mg), 12mg (grupo 12mg) e soro fisiológico 0,9% (grupo controle). Em seguida os animais

foram anestesiados e tiveram seus primeiros molares inferiores esquerdos (M1) extraídos. Os

animais foram sacrificados aos 3, 7, e 40 dias e os alvéolos dentários dissecados e reduzidos.

O alvéolo do M1 foi radiografado para mensuração da densidade radiográfica e em seguida

descalcificado para obtenção de cortes histológicos em parafina para análise histomorfológica

e estereométrica. Os dados quantitativos foram submetidos à análise estatística em um nível

de significância de 5%. Resultados: As características histomorfológicas do processo de

reparo alveolar foram similares entre os 4 grupos. Os grupos controle e 12mg mostraram

diferenças quanto à densidade radiográfica e percentual de matriz conjuntiva aos 3 dias e no

percentual de tecido ósseo aos 7 dias. Este último ocorrendo também entre grupo controle e

8mg (p<0,05). Conclusão: Nenhuma das doses testadas impediu o reparo dos alvéolos com

tecido ósseo neoformado aos 40 dias. Entretanto, a dose equivalente a 12mg diminuiu a

quantidade de tecido conjuntivo e matriz osteóide nas fases iniciais do reparo.

Palavras-chave: dexametasona, alvéolo dental, extração dentária.

ABSTRACT

DE LIMA, Thiago Soares. Effect of different doses of dexamethasone on alveolar repair

in rats. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Faculdade

de Odontologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.

Objective: The objective of this study was to evaluate the effect of different preoperative

doses of dexamethasone on the alveolar repair process. Methods: Sixty rats were randomly

divided into 4 groups of 15 animals receiving a single pre-operative dose of dexamethasone

equivalent to 4 mg (group 4mg), 8mg (group 8mg), 12mg (group 12mg) and saline 0.9 %

(group control). Then the animals were anesthetized and had their first left lower molars (M1)

extracted. The animals were euthanized at 3, 7, and 40 days and then the alveolus was

dissected and reduced. The alveolus of M1 was radiographed for radiographic density

measurement and then decalcified to obtain histological sections in paraffin for

histomorphological and stereometric analysis. The quantitative data were submitted to

statistical analysis at a significance level of 5%. Results: The histomorphologic

characteristics of the alveolar repair process were similar among the 4 groups. However, the

control and 12mg groups showed differences in radiographic density, and percentage of

conjunctive matrix at 3 days and percentage of bone tissue at 7 days. The latter occurring also

among control group and 8mg (p <0.05). Conclusion: None of the used doses prevented the

socket healing with newly formed bone at 40 days. However, the dosis equivalent to 12mg

decreased the quantity of connective tissue and osteoid matrix at the late period of repair.

Keywords: dexamethasone, tooth socket, tooth extraction .

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURAS

Figura 1: Imagem radiográfica para análise da densidade óssea. Região de interesse para

análise da densidade óssea (quadrado amarelo em detalhe). Superiormente, observa-se a

imagem da escala de alumínio para calibração da análise (imagem à esquerda). .................... 18

Figura 2: Desenho esquemático do método da análise estereométrica. O terço médio do

alvéolo distal do M1 foi enquadrado e sobre a ROI foi colocada uma grade com 200 pontos

para análise. .............................................................................................................................. 19

Figura 3: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 3 dias. Hematoxilina & Eosina

(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,

magnificação 400x). Coágulo sanguíneo permeado por células inflamatórias (setas) ocupando

o interior do alvéolo. Na porção periférica à crista alveolar (CA), observa-se tecido fibroso do

ligamento periodontal (LP), fibroblastos (f) e fibras colágenas recém- sintetizadas. .............. 21

Figura 4: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 7 dias. Hematoxilina & Eosina

(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,

magnificação 400x). Tecido de granulação (TG) ricamente celularizado com grande número

de vasos sanguíneos (VS) e fibras colágenas dispostas irregularmente. Osteoblastos (setas)

circundando pontos de matriz osteóide (MO). ......................................................................... 22

Figura 5: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 40 dias. Hematoxilina & Eosina

(Imagem esquerda: terço médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita,

magnificação 400x). Alvéolo reparado por tecido ósseo (TO) imaturo com poucos espaços

medulares (EM). ....................................................................................................................... 22

Figura 6: Análise estereométrica apresentando o percentual de matriz extracelular, vasos

sanguíneos, tecido ósseo e espaço medular nos períodos analisados. * Diferença estatística

significante (p<0,05). Referência: grupo controle...................................................................24

Figura 7: Efeito das diferentes doses pré-operatórias sobre a intensidade de inflamação nos

quatro grupos aos 3, 7 e 40 dias................................................................................................ 25

Figura 8: Fotografias do procedimento cirúgico para exodontia do M1. Abridor bucal

posicionado (A), sidesmotomia com auxílio de uma sonda exploradora (B), luxação do M1

com auxílio de uma espátula Hollenback (C) e M1 extraído (D). ............................................ 34

Figura 9: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise da escala de

alumínio. Demarcação da região central (seta vermelha) de 25x75 (circulo vermelho) sobre a

escala de degrau de alumínio. .................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 10: Histograma de distribuição dos níveis de cinza de um degrau da escala de

alumínio, gerada pelo programa ImageJ. Valor médio dos níveis de cinza (retângulo

vermelho) da região central do degrau da escala de alumínio. ................................................. 36

Figura 11: Curva de dispersão e tendência linear. Valores médios dos níveis de cinza (eixo Y)

de cada degrau da escala de alumínio (eixo X) e a fórmula gerada a partir da tendência linear

(retângulo vermelho). ............................................................................................................... 36

Figura 12: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise do alvéolo

distal do M1. Demarcação da ROI (seta vermelha) de 10 X 10 (circulo vermelho) no alvéolo

distal do M1. ............................................................................................................................. 37

Figura 13: Histograma de distribuição dos níveis de cinza do alvéolo distal do M1, gerado

pelo programa ImageJ.Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da ROI do

alvéolo distal do M1. ................................................................................................................ 38

TABELAS

Tabela 1: Média e desvio padrão da densidade radiográfica (em mmAl) dos grupos nos

diferentes períodos de análise. .................................................................................................. 20

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AINEs Anti-inflamatórios não esteroidais

CEUA Comitê de ética no uso de animais

Col1A1 Colágeno 1A1

cm Centímetro

COX Cicloxigenases

DTA Dose total do animal

EM Espaço medular

GC Glicocorticóide

HE Hematoxilina e Eosina

M1 Primeiro molar inferior esquerdo

M2 Segundo molar inferior esquerdo

MC Matriz conjuntiva

mmAl Milímetros de Alumínio

mRNA Ácido ribonucleico menssageiro

ppi Pixel por polegada

PSP Placa de fósforo fotoestimulável

ROI Região de interesse

TIFF Tagged image file format

TO Tecido ósseo

TMB Taxa metabólica basal

UNIARA Centro Universitário de Araraquara

VS Vasos sanguíneos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 14

2. OBJETIVO .................................................................................................................................. 15

3. MATERIAIS E MÉTODO .......................................................................................................... 15

3.1 Cirurgia Experimental ................................................................................................................ 16

3.2 Análise da densidade radiográfica dos alvéolos dentais ............................................................ 17

3.3 Análise histológica ..................................................................................................................... 18

3.4 Análise Estatística ...................................................................................................................... 20

4. RESULTADOS............................................................................................................................ 20

4.1 Densidade Radiográfica ............................................................................................................. 20

4.2 Características Histomorfológicas ............................................................................................. 20

4.3 Análise Estereométrica .............................................................................................................. 23

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 25

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 28

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................................... 29

8. APÊNDICE .................................................................................................................................. 33

Apêndice A - Cálculo da equivalência alométrica. ......................................................................................... 33

Apêndice B – Procedimento cirúrgico. ........................................................................................................... 34

Apêndice C – Método de Quantificação da Densidade Radiográfica ............................................................. 35

9. ANEXO........................................................................................................................................ 39

1. INTRODUÇÃO

Os anti-inflamatórios esteroidais ou glicocorticóides (GC) são medicamentos

rotineiramente utilizados em cirurgia oral e maxilofacial para o controle do edema e dos

demais sinais e sintomas da fase aguda da inflamação pós-cirúrgica, induzida pelo trauma e

manipulação tecidual (1). Diferentemente dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) que

inibem exclusivamente a ação das Cicloxigenases (COX) 1 e 2, a ação dos GCs se dá também

pela regulação de uma série de eventos celulares e moleculares do processo inflamatório

como a redução do número de leucócitos, estabilização da membrana de linfócitos, monócitos

e eosinófilos (2,3,4), diminuição da liberação local de enzimas proteolíticas e hialuronidases

(5) e a regulação negativa da expressão gênica de eicosanoides e proteínas pró-inflamatórias

como prostaglandinas, histaminas, bradicininas e adesinas (4,6).

A efetividade dos GCs no controle do edema após cirurgias orais tem sido

comprovada por estudos clínicos que demonstraram uma redução entre 42 a 69% no edema

pós-operatório (7,8,9,10,11). Tal habilidade confere a estes medicamentos uma aplicabilidade

em cirurgias na região de cabeça e pescoço, onde a formação de edema é pronunciada devido

ao grande aporte vascular da área.

Clinicamente, os GCs são administrados em doses pré-operatórias, com ou sem

seguimento pós-cirúrgico. Os regimes terapêuticos presentes na literatura são muito variados,

mas sugere-se que a redução no trismo e edema após extrações dentárias é observada com

doses a partir de 4mg de dexametasona, administradas por via oral uma a duas horas antes do

procedimento (12,13,14). Protocolos de estudos clínicos sugerem a administração de 4 a 8mg

de dexametasona ou betametasona, administrados por via oral ou intra-muscular para

cirurgias orais como extração de dentes inclusos (1,9,15,16). Em cirurgias maxilofaciais é

comum o uso de doses pré-operatórias iguais ou superiores a 10mg por via endovenosa, com

seguimento pós-cirúrgico estendido por 2 a 3 dias (1). A dexametasona é o principal GC

empregado para essa finalidade. Ele possui uma potência 25 vezes maior que o cortisol

endógeno apresenta uma meia-vida plasmática longa, de 36 a 54 horas, conferindo-lhe um

efeito residual que se estende por até 3 dias depois de administrado (17).

Apesar dos benefícios clínicos dos GCs, estes medicamentos possuem um efeito

negativo sobre o processo de cicatrização tanto do tecido ósseo como dos tecidos moles.

Estudos in vivo têm demonstrado que GCs como dexametasona ou prednisona podem levar à

diminuição na síntese de colágeno (18,19,20), redução no número de osteoclastos (18,19) e

15

fibroblastos (20), diminuição da diferenciação e função osteoblástica (18,19), na expressão de

osteocalcina (18) e prejuízo na neoformação e densidade óssea (21,22). Segundo Li et al

(2012), o efeito prejudicial da dexametasona sobre o processo de cicatrização óssea parece ser

limitado aos períodos iniciais, de forma que aos 17 dias pós-operatórios, em defeitos ósseos

produzidos em mandíbulas de ratos, os autores não encontraram diferença nos níveis de

expressão de colágeno entre os grupos dexametasona e controle. Entretanto, a densidade óssea

permaneceu significativamente menor no grupo dexametasona neste mesmo período.

Os dados presentes na literatura demonstram uma correlação entre a corticoterapia e

prejuízo no processo de reparo ósseo, entretanto, não está clara a relação dose-efeito que

potencialmente poderia levar a este prejuízo. Os trabalhos em modelo animal que

fundamentam tal correlação empregaram doses variadas de diferentes medicamentos, como

dexametasona e prednisona em concentrações que variavam desde 0,002mg/Kg a 3mg/Kg

(18,19,21,22). Somado a isso, as diferentes vias de administração, a potência dos

medicamentos e os regimes terapêuticos empregados nestes estudos dificultam ainda mais a

compreensão de como a dose dos medicamentos poderia influenciar no processo de reparo.

2. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho foi testar a hipótese de que doses usuais de dexametasona

interferem no reparo alveolar, demonstrando qualitativa e quantitativamente quais etapas do

processo foram afetadas dentro dos diferentes esquemas terapêuticos.

3. MATERIAIS E MÉTODO

O presente estudo foi aprovado pelo comitê de ética no uso de animais (CEUA) do

Centro Universitário de Araraquara (UNIARA), número do processo 020/2016.

Foram utilizados 60 ratos (Norvegicus albinus - Wistar) machos, adultos, com

aproximadamente 300g provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos no biotério central do UNIARA em ciclo

circadiano de 12 horas luz/escuridão em uma sala com temperatura controlada de 23 ± 2 °C,

água e comida ad libtum. Após um período de sete dias de aclimatação no biotério, os ratos

foram randomicamente divididos, por meio de sorteio, em quatro grupos com 15 animais

cada. Com o objetivo de simular as doses pré-operatórias de 4, 8 e 12mg, utilizadas nos

16

protocolos clínicos em humanos, a equivalência da dose animal foi calculada por meio de

cálculo de equivalência alométrica (23). O método leva em consideração a espécie, sua

temperatura, massa corporal e taxa metabólica. Estes dados equacionados fornecem a taxa

metabólica basal ou a quantidade de energia que cada organismo necessita para se manter

vivo, durante 24 horas, em posição de repouso. A partir deste parâmetro, calcula-se a dose

metabólica de humanos e ratos, estabelecendo uma proporção entre ambas e

consequentemente, a dose equivalente (Apêndice A).

3.1 Cirurgia Experimental

Após o período de aclimatação, cada animal foi pesado e recebeu uma dose única pré-

operatória de dexametasona (Decadron®, Aché Laboratórios Farmacêuticos AS, São Paulo,

SP, Brasil) por via intramuscular de acordo com os cálculos previamente realizados para cada

grupo: Grupo 4mg: 0,25mg/kg; Grupo 8mg: 0,5 mg/kg; Grupo 12mg: 0,75mg/kg e Grupo

Controle: 0,1mL de Soro Fisiológico 0,9% (Fisiológico, Laboratórios Biosintética Ltda®,

Ribeirão Preto, SP, Brasil). Quinze minutos após a administração de dexametasona, momento

em que o medicamento atinge seu pico plasmático por via intra-muscular (24), cada rato foi

anestesiado com uma combinação de Cloridrato de Xilazina (Dopaser® - Bayer S. A – Saúde

Animal, Brasil) na dosagem de 0,04mL/100g de massa corporal, para promover o

relaxamento muscular e Cloridrato de Quetamina (Quetamin® - Virbac do Brasil Ltda, Brasil)

na proporção de 0,08 mL/100g de massa corporal para anestesia.

Os animais foram estabilizados em decúbito ventral para exodontia do primeiro molar

inferior esquerdo (M1). Um abridor de boca foi mantido na região anterior da cavidade bucal

para acesso à região dos molares, e posteriormente, uma gaze embebida em solução de

clorexidina 0,12% (Periogard, Colgate, São Bernardo do Campo, São Paulo, Brasil) foi

suavemente friccionada nas superfícies mucosas e dentárias da cavidade bucal do animal.

Com o auxílio de uma sonda exploradora foi realizada a sindesmotomia do tecido gengival,

correndo a ponta do instrumento em torno do dente em questão. Em seguida, os dentes foram

luxados e extraídos com auxílio de uma espátula Hollenback nos sentidos mésio-distal e

cérvico-apical (25,26) (Apêndice B). As exodontias foram realizadas pelo mesmo operador,

previamente treinado, utilizando a mesma técnica cirúrgica em todos os grupos.

Após a extração, todos os animais receberam, por via intramuscular, dose única de

0,2mL de antibiótico (benzilpenicilinabenzatina, procaína e potássica; diestreptomicina e

17

estreptomicina - Pentabiótico® Veterinário Reforçado Wyeth S.A. Indústrias Farmacêuticas,

São Bernardo do Campo, SP, Brasil) e 5mg/kg de tramadol por via-muscular (Janssen-Cilag

Farmacêutica LTDA, São Paulo, SP, Brasil). Os animais foram mantidos com dieta à base de

ração triturada durante o período de pós-operatório.

Cinco animais de cada grupo foram sacrificados por meio de dose excessiva de

anestésico (Quetamina) de acordo com os períodos de estudo: 3, 7 e 40 dias.

3.2 Análise da densidade radiográfica dos alvéolos dentais

Após a morte dos animais, a mandíbula foi dissecada, fixada em solução de

paraformaldeído a 4% durante 48 horas e então radiografada pelo sistema de imagem digital

semidireta Express®

(Kavo, Biberach, Alemanha), o qual utiliza uma placa de fósforo

fotoestimulável (PSP) como receptor de imagem (27, 28, 29). As tomadas radiográficas foram

realizadas com os seguintes parâmetros: 70 kVp, 10 mA, tempo de exposição de 0,2

segundos, e distância focal de 40cm. Todas as imagens foram adquiridas com um

posicionador de acrílico, padronizado, onde o feixe central de raios-x incidia de forma

perpendicular à área de interesse. Uma escala de alumínio (10 degraus e espessura de um

milímetro) foi utilizada durante a aquisição da imagem para o posterior cálculo da densidade

radiográfica.

As imagens foram exportadas do programa ClinView®, em uma resolução de 640 ppi

(pixel por polegada) e importadas, em formato TIFF (Tagged Image File Format) para o

programa ImageJ® versão 1.410 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Para

estabelecer um padrão na densidade óssea avaliada para cada imagem separadamente, em

cada degrau de alumínio foi selecionada uma região de 70 x 25 e extraído o histograma com

as médias dos valores de cinza. Todos os valores foram organizados em uma tabela no

programa Microsoft Excel® 2010 (Microsoft Corporation, Redmont, Washington, USA) e

gerado o gráfico de dispersão do qual se obteve uma linha de tendência com sua respectiva

fórmula (27). Com isso, foi possível calcular as médias dos valores de cinza, em milímetro de

alumínio (mmAl) para cada degrau da escala, compensando as possíveis diferenças entre as

radiografias. A região de interesse (ROI) de 10 x 10 no alvéolo distal do M1 foi definida

como a porção central do alvéolo correspondente à região do terço médio, tomando-se como

referência o comprimento da raiz mesial do M2 (Figura 1). O valor obtido da ROI foi aplicado

à fórmula para o cálculo da densidade em mmAl. (Apêndice C)

18

Figura 1: Imagem radiográfica para análise da densidade óssea. Região de interesse para análise da densidade

óssea (quadrado amarelo em detalhe). Superiormente, observa-se a imagem da escala de alumínio para

calibração da análise (imagem à esquerda).

3.3 Análise histológica

Após um período de 48 horas em paraformaldeído, os espécimes foram

descalcificados em EDTA 14% (0,5M pH 8.0) (Proquimios, Rio de Janeiro-RJ, Brasil)

durante 8 semanas, com três trocas semanais em temperatura ambiente. Em seguida, o

material foi neutralizado em água corrente durante 24 horas, desidratado numa sequência de

álcoois em concentrações crescentes (70%, 80%, 90% e 100%), diafanizados em xilol e

embebidos em parafina. O alvéolo processado de cada animal foi cortado em micrótomo com

cortes semi-seriados de 4μm de espessura no plano sagital. Cortes histológicos foram obtidos

da porção mais central do alvéolo, em 3 regiões diferentes, distando 50μm entre si (26).

Para a análise histomorfológica, as lâminas foram desparafinizadas e reidratadas para

coloração pela técnica de Hematoxilina e Eosina (HE). Os cortes foram analisados sob

microscopia ótica de luz (Leica DM2500, Leica Microsystems, Wetzlar Hessen, Alemanha)

com lentes objetivas de diferentes aumentos (25, 50, 100, 200 e 400x) para avaliação

qualitativa descritiva das diferentes fases do processo de reparo alveolar: fase de proliferação

celular, desenvolvimento do tecido conjuntivo, maturação do tecido conjuntivo, diferenciação

óssea e maturação óssea; ao longo dos períodos de reparo entre os diferentes grupos.

A análise estereométrica foi feita por dois avaliadores “cegos” para os grupos e

previamente calibrados (correlação intraclasse 0,78). A média das porcentagens obtidas pelos

dois avaliadores foi utilizada como réplica biológica para análise estatística (25,26). As

19

quantificações foram realizadas sob microscopia ótica de luz (Leica DM2500, Leica

Microsystems, WetzlarHessen, Alemanha) no alvéolo distal do M1, tomando-se como

referência o terço médio da raiz do M2 (Figura 2), a partir de uma fotomicrografia efetuada

com uma câmera fotográfica digital DFC-300-FX (Leica Microsystems, Alemanha), com

resolução de 1,3 megapixels, acoplada ao microscópio ótico (Leica DM2500, Leica

Microsystems, WetzlarHessen, Alemanha) com um aumento de 100x. Com o auxílio de um

programa editor de imagens (Adobe Photoshop® CS6, Adobe, USA) uma grade de linhas

verticais e horizontais equidistantes, cujas intersecções das linhas totalizaram 200 pontos, foi

construída e sobreposta sobre o terço médio do alvéolo distal do M1 - ROI (Figura 2). As

estruturas analisadas quantitativamente foram: Matriz Conjuntiva (MC) – matriz de tecido

conjuntivo não mineralizada e fibroblastos, Vasos Sanguíneos (VS), Tecido Ósseo (TO) e

Espaços Medulares (EM). Pontos de intersecção fora da área do alvéolo foram

desconsiderados. A quantidade de pontos coincidentes com cada estrutura dentro do alvéolo

foi considerada como uma porcentagem da área total, calculada por regra de três simples. A

intensidade do processo inflamatório foi mensurada na região do terço médio da raiz

utilizando um sistema de escore: 0= ausência de células inflamatórias; 1= inflamação leve

(poucas células inflamatórias); 2= inflamação moderada (muitas células inflamatórias); 3=

inflamação severa (predominância de células inflamatórias) (30,31,32,33).

Figura 2: Desenho esquemático do método da análise estereométrica. O terço médio do alvéolo distal do M1

foi enquadrado e sobre a ROI foi colocada uma grade com 200 pontos para análise.

20

3.4 Análise Estatística

Os dados quantitativos obtidos nas análises estereométrica e radiográfica foram

submetidos ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov, seguidos do teste de Kruskal-

Wallis e pós-teste de Dunn. Os cálculos foram realizados por meio do programa GraphPad

Prism® 6.0 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) com nível de significância menor que 5%

(p<0,05).

4. RESULTADOS

4.1 Densidade Radiográfica

A análise das radiografias demonstrou um aumento progressivo nos valores da

densidade entre 3 e 40 dias, que ocorreu de forma semelhante nos quatro grupos analisados

(Tabela 1). Uma diferença estatisticamente significante foi detectada entre os grupos controle

e 12mg aos 3 dias (p<0,05).

Tabela 1: Média e desvio padrão da densidade radiográfica (em mmAl) dos grupos nos

diferentes períodos de análise.

Controle

(n=15)

4mg

(n=15)

8mg

(n=15)

12mg

(n=15)

3 dias (n=20) 1,35 0,30* 1,16 0,30 1,15 0,20 0,66 0,09

*

7 dias (n=20) 1,44 0,09 1,38 0,03 1,04 0,07 0,91 0,60

40 dias (n=20) 2,98 0,50 3,05 0,20 2,29 0,10 3,34 0,10

*Diferença estatisticamente significante (p<0,05).

4.2 Características Histomorfológicas

As caractéristicas histomorfológicas do processo de reparo dos alvéolos dentários

foram similares entre os 4 grupos ao longo dos períodos de análise (Figuras 3, 4 e 5). Aos 3

dias, um coágulo sanguíneo permeado por células inflamatórias mononuclerares e

polimorfonucleares era observado no interior do alvéolo de todos os grupos. Uma faixa de

tecido conjuntivo frouxo, correspondente ao ligamento periodontal se estendia ao longo das

margens do alvéolo. Nesta região, alguns fibroblastos e matriz colágena já podiam ser

observados. Aos 7 dias, o tecido de granulação ocupava a maior parte do alvéolo e uma

21

porção residual do coágulo sanguíneo cobria sua porção mais superficial. O tecido era

composto basicamente por fibras colágenas com disposição irregular envolvendo fibroblastos,

vasos sanguíneos e um infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear que se

concentrava na porção cervical do alvéolo, junto ao coágulo sanguíneo. Em alguns espécimes,

especialmente no grupo controle, era possível identificar a presença de matriz osteóide

coberta por osteoblastos com características de atividade secretória intensa. A remodelação

óssea nas margens da ferida era evidenciada pela perda de continuidade da cortical alveolar e

presença de osteoclastos e osteoblastos ao redor de um osso imaturo. Aos 40 dias, o alvéolo

era preenchido por osso denso com distribuição irregular das lacunas osteocíticas. Os espaços

medulares eram escassos e continham especialmente vasos sanguíneos com presença de

poucas células inflamatórias. Essas características eram observadas nos 4 grupos.

Figura 3: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 3 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço

médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Coágulo sanguíneo permeado por

células inflamatórias (setas) ocupando o interior do alvéolo. Na porção periférica à crista alveolar (CA), observa-

se tecido fibroso do ligamento periodontal (LP), fibroblastos (f) e fibras colágenas recém- sintetizadas.

22

Figura 4: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 7 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço

médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Tecido de granulação (TG)

ricamente celularizado com grande número de vasos sanguíneos (VS) e fibras colágenas dispostas

irregularmente. Osteoblastos (setas) circundando pontos de matriz osteóide (MO).

Figura 5: Avaliação histológica do reparo alveolar aos 40 dias. Hematoxilina & Eosina (Imagem esquerda: terço

médio do alvéolo em magnificação 100x; Imagem direita, magnificação 400x). Alvéolo reparado por tecido

ósseo (TO) imaturo com poucos espaços medulares (EM).

23

4.3 Análise Estereométrica

Todos os grupos apresentaram neoformação óssea alveolar no estágio tardio de reparo.

As estruturas vasculares observadas foram estatísticamente semelhantes entre os quatro

grupos em todos os períodos estudados (Figura 6). Aos 3 dias, a deposição de matriz

extracelular, mostrou diferença significativa entre os grupos controle e 12mg (p<0,05). Aos 7

dias pós-operatórios, os alvéolos apresentaram predomínio de matriz extracelular e formação

de trabeculado ósseo rudimentar, com diferença estatística entre o grupo controle e os grupos

8mg (p<0,01) e 12mg (p<0,01). Passados 40 dias, as estruturas de neoformação óssea

apresentaram-se de forma similar nos quatro grupos.

A análise da intensidade do processo inflamatório (Figura 7) demonstrou um

predomínio de inflamação leve a moderada no grupo controle e no grupo 4mg, aos 3 e 7 dias.

Aos 40 dias a intensidade da inflamação foi menor e semelhante entre os grupos, mostrando

um infiltrado inflamatório leve ou ausente nos 4 grupos.

24

Figura 6: Análise esteriométrica apresentando o percentual de matriz extracelular, vasos sanguíneos, tecido

ósseo e espaço medular nos períodos analisados. * Diferença estatística significante (p<0,05). Referência:

grupo controle.

25

Figura 7: Efeito das diferentes doses pré-operatórias sobre a intensidade de inflamação nos quatro grupos aos 3,

7 e 40 dias.

5. DISCUSSÃO

A interferência dos GCs no processo de reparação de feridas, tanto de tecidos moles

quanto de tecidos duros, já é bem estabelecida na literatura (18,19,20,21,22). Tendo em vista

o uso frequente destes medicamentos como terapia anti-inflamatória em cirurgias orais e

maxilofacias, a proposta do presente estudo foi mensurar, in vivo, o efeito de doses usuais de

dexametasona sobre a dinâmica do processo de reparo alveolar por meio de um modelo

experimental translacional.

O rato é um modelo tradicional em estudos de reparação alveolar por sua fácil

disponibilidade, manuseabilidade e reprodutibilidade da cirurgia de extração dentária

(25,26,34,35,36). O alvéolo pós-extração segue um padrão de reparo próprio dos tecidos

conjuntivos, com a peculiaridade da presença de remanescentes do ligamento periodontal, rico

em células-tronco indiferenciadas (37,38). Segundo Consolaro (2009), a reparação alveolar

consiste na última fase de uma inflamação local bem-sucedida, dependente da formação de

um tecido de granulação e liberação local de citocinas e fatores de crescimento ósseo que

26

estimulam a regeneração do osso alveolar. Dessa forma, alterações produzidas em eventos

inicias da fase de formação do tecido de granulação podem afetar qualitativa e

quantitativamente o osso que irá se formar no interior do alvéolo. Assim, por meio de análises

radiográfica, histomorfológica e estereométrica buscou-se avaliar o reparo alveolar não

somente nos estágios iniciais como também em um período tardio, para analisarmos se as

doses testadas poderiam afetar o osso depois de completada sua reparação.

A equivalência de dose é um método matemático que estipula a dose equivalente

aproximada de um dado medicamento entre diferentes espécies. Ela pode ser feita por meio

da proporção de massa, superfície corpórea ou extrapolação alométrica. A estimativa por peso

é um método que não leva em consideração as diferenças dos parâmetros farmacocinéticos e

metabólicos entre duas espécies e deve ser usado apenas para indivíduos da mesma espécie

(40). A extrapolação por superfície corpórea assume as diferenças na taxa de metabolismo

entre duas espécies como fator de cálculo para a equivalência de doses. Mamíferos menores

possuem um metabolismo mais acelerado e, portanto, a velocidade dos processos fisiológicos

é maior. Neste modelo, tais diferenças fisiológicas são estimadas por meio de um único

parâmetro: a superfície corporal (41). A extrapolação alométrica, o método mais preciso, leva

em consideração a espécie, sua temperatura, massa corporal e taxa metabólica; dados que

equacionados, fornecem a taxa metabólica basal, ou a quantidade de energia que cada

organismo necessita para se manter vivo, durante 24 horas, em posição de repouso

(42,43,44,45).

Nos resultados obtidos neste estudo, observou-se um maior infiltrado inflamatório no

grupo controle comparado aos demais grupos, especialmente aos 7 dias, seguido por uma

acentuada diminuição das células inflamatórias aos 40 dias. Estes dados confirmam o efeito

farmacológico da administração de dexametasona neste modelo experimental e corroboram os

achados de Li et al (2012) em um estudo que avaliou o efeito da dexametasona no reparo de

defeito ósseo em mandíbula de ratos, onde notou-se maior intensidade na expressão de

cicloxigenase 2 (COX-2) no grupo controle. Com o objetivo de não acrescentar variáveis ao

efeito anti-inflamatório da dexametasona, optou-se pela administração pós-operatória de

tramadol, um analgésico de ação central que não possui atividade em cicloxigenases.

A análise da densidade radiográfica, conforme esperado, demonstrou aumento gradual

no decorrer dos períodos do reparo, devido à gradativa substituição do coágulo sanguíneo por

tecido de granulação, matriz osteóide e osso mineralizado, conforme observado ao longo dos

40 dias pós-opertórios na análise histomorfológica. As características histológicas dos

espécimes também permitem observar que mesmo a maior dose de dexametasona

27

administrada antes da cirurgia, 12mg, não impediu que o alvéolo se reparasse completamente,

à semelhança dos demais grupos.

As alterações atribuídas ao efeito da dexametasona ocorreram especialmente nos

períodos iniciais da cicatrização, com uma maior densidade radiográfica e deposição de

matriz conjuntiva aos 3 dias no grupo controle comparado ao grupo 12mg (p=0,04). Essa

diferença na matriz colágena reflete na porcentagem de osso neoformado aos 7 dias,

significativamente maior no grupo controle comparado ao 12mg (p=0,046). Este achado é

consistente com estudos que demonstram a interferência dos GCs na formação do colágeno

(20,46,47,48) e da matriz osteóide (18,19,49,50). Advani et al (1997) demonstraram a

diminuição na síntese de colágeno em defeitos de calota de ratos 24 horas após administração

de dose única de 1mg/Kg de dexametasona. Os autores observaram a redução nos níveis de

ácido ribonucleico menssageiro (mRNA), de colágeno 1A1 (Col1A1) e osteocalcina. Tal

redução na expressão de Col1A1 foi também observada, in vitro, em cultura de osteoblastos

(51) e fibroblastos (52,53,54). Os osteoblastos parecem ser células especialmente afetadas

pelos GCs. O uso destes medicamentos diminui a expressão de integrina beta-1 por

osteoblastos, interferindo na adesão destas células às proteínas da matriz óssea extracelular de

forma dose-dependente. Esta interferência da dexametasona parece estar restrita às fases

iniciais da reparação óssea (42). No presente trabalho, o osso formado no alvéolo aos 40 dias

não apresenta diferença qualitativa ou quantitativa entre os grupos.

É importante tomar como base que as fases finais do processo inflamatório são as

precursoras do processo de reparo, e vários dos mecanismos responsáveis pelo início da

neoformação tecidual são dependentes de fatores inflamatórios outrora inibidos pelo

medicamento. Assim, o limite entre o efeito anti-inflamatório desejável e o prejuízo no

processo de reparo é uma linha tênue e ainda não compreendida. Este trabalho é o primeiro a

demonstrar como doses terapêuticas utilizadas na prática clínica poderiam afetar a dinâmica

da reparação alveolar, de forma que novos estudos devam ser desenvolvidos a fim de se

buscar uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nesse processo. Especialmente

em face aos novos tratamentos de superfície que permitem uma osseointegração precoce de

implantes dentários, é importante que se conheça cada vez mais estes mecanismos uma vez

que os eventos inicias da reparação alveolar têm sido a chave do sucesso para osseointegração

de implantes pós-exodônticos.

28

6. CONCLUSÃO

A análise conjunta dos resultados deste estudo permite sugerir que, dentro do modelo

proposto em ratos, dose única pré-operatória até 8mg de dexametasona não produziria

alterações significativas no processo de reparação alveolar. Em contrapartida, doses a partir

de 12mg produziriam alterações nas fases inicias da cicatrização do alvéolo.

29

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Dan AE, Thygesen TH, Pinholt EM. Corticosteroid administration in oral and

orthognathic surgery: a systematic review of the literature and meta-analysis. J Oral

Maxillofac Surg. 2010;68(9):2207-20.

2. Hargreaves KM, Costello A. Glucocorticoids suppress levels of immunoreactive

bradykinin in inflamed tissue as evaluated by microdialysis probes. Clin Pharmacol

Ther. 1990;48(2):168-78.

3. Blackwell GJ, Carnuccio R, Di Rosa M, Flower RJ, Langham CS, Parente L et al.

Glucocorticoids induce the formation and release of anti-inflammatory and anti-

phospholipase proteins into the peritoneal cavity of the rat. Br J

Pharmacol. 1982;76(1):185-94.

4. Yagiela JA, Dowd FJ, Johnson BS, Marioti AJ, Neidle EA. Farmacologia e

terapêutica para dentistas. São Paulo: Mosbly; 2011.

5. Melby J. Drug spotlight program: systemic corticosteroid therapy: pharmacology and

endocrinologic considerations. Ann Intern Med. 1974;81(4):505-12.

6. Webster JC, Cidlowski JA. Mechanism of glucocorticoid-receptor mediated repression

of gene expression. Trends Endocrinol Metab. 1999;10(10):396-402.

7. Hooley JR, Francis FH. Betamethasone in traumatic oral surgery. J Oral

Surg. 1969;27(6):398-403.

8. Gersema L, Baker K. Use of corticosteroids in oral surgery. J Oral Maxillofac

Surg. 1992;50(3):270-7.

9. Pedersen A. Decadronphosphate in the relief of complaints after third molar surgery.

A double-blind, controlled trial with bilateral oral surgery. Int J Oral

Surg. 1985;14(3):235-40.

10. Milles M, Desjardins PJ. Reduction of postoperative facial swelling by low-dose

methylprednisolone: an experimental study. J Oral Maxillofac Surg. 1993;51(9):987-

91.

11. Schaberg SJ, Stuller CB, Edwards SM. Effect of methylprednisolone on swelling after

orthognathic surgery. J Oral Maxillofac Surg. 1984;42(6):356-61.

12. Neupert EA, Lee JW, Philput CB, Gordon JR. Evaluation of dexamethasone for

reduction of postsurgical sequalae of third molar removal. J Oral Maxillofac

Surg. 1992;50(11):1177-82.

13. Peterson LJ. Postoperative patient management. In: Peterson LJ, Ellis E, Hupp JR,

Tucker MR, editors. Contemporary oral and maxillofacial surgery. St Louis: Mosby;

1998.

14. Andrade, E.D. Terapêutica medicamentosa em Odontologia. São Paulo:Artes

Médicas; 2006.

15. Alexander RE, Throndson RR. A review of perioperative corticosteroid use in

dentoalveolar surgery. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.

2000;90(4):406-15.

16. Laureano Filho JR, Maurette PE, Allais M, Cotinho M, Fernandes C. Clinical

comparative study of the effectiveness of two dosages of Dexamethasone to control

postoperative swelling, trismus and pain after the surgical extraction of mandibular

impacted third molars. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2008;13(2):E129-32.

17. Montgomery MT, Hogg JP, Roberts DL, Redding SW. The use of

glucocorticosteroids to lessen the inflammatory sequelae following third molar

surgery. J Oral Maxillofac Surg. 1990;48(2):179-87.

30

18. Li J, Wang X, Zhou C, Liu L, Wu Y, Wang D et al. Perioperative glucocorticosteroid

treatment delays early healing of a mandible wound byinhibiting osteogenic

differentiation. Injury. 2012;43(8):1284-9.

19. Advani S, LaFrancis D, Bogdanovic E, Taxel P, Raisz LG, Kream BE.

Dexamethasone suppresses in vivo levels of bone collagen synthesis in neonatal mice.

Bone. 1997;20(1):41-6.

20. Durmus M, Karaaslan E, Ozturk E, Gulec M, Iraz M, Edali N et al. The effects of

single-dose dexamethasone on wound healing in rats. Anesth

Analg. 2003;97(5):1377-80.

21. Waters RV, Gamradt SC, Asnis P, Vickery BH, Avnur Z, Hill E et al. Systemic

corticosteroids inhibit bone healing in a rabbit ulnar osteotomy model. Acta Orthop

Scand. 2000;71(3):316-21.

22. Aslan M, Simsek G, Yildirim U. Effects of short-term treatment with systemic

prednisone on bone healing: an experimental study in rats. Dent

Traumatol. 2005;21(4):222-5.

23. Edwards LD, Fox AW, Stonier PD. Principles and practice of pharmaceutical

medicine. Chicester: United Kingdom; 2010, p. 157-98.

24. Ma J, Zhang J, Yang T, Fan K, Gu J, Yin G. Pharmacokinetics of dexamethasone and

nefopam administered alone or in combination using a newly developed prefilled

multi-drug injector in rats. Pharmacology. 2014;93(5-6):220-4.

25. Conte-Neto N, Bastos Ade S, Spolidorio LC, Chierici Marcantonio RA, Marcantonio

E Jr. Long-term treatment with alendronate increases the surgical difficulty during

simple exodontias - an in vivo observation in Holtzman rats. Head Face

Med. 2012;8(20):1-4.

26. Conte Neto N, Spolidorio LC, Andrade CR, S Bastos A, Guimarães M, Marcantonio E

Jr. Experimental development of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws in

rodents. Int J Exp Pathol. 2013;94(1):65-73.

27. Sun Y1, De Dobbelaer B, Nackaerts O, Loubele M, Yan B, Suetens P et al.

Development of a clinically applicable tool for bone density assessment. Int J

Comput Assist Radiol Surg. 2009;4(2):163-8.

28. Dendere R1, Whiley SP, Douglas TS. Computed digital absorptiometry for

measurement of phalangeal bone mineral mass on a slot-scanning digital radiography

system. Osteoporos Int. 2014;25(11):2625-30.

29. Cruz AD, Esteves RG, Poiate IA, Portero PP, Almeida SM. Influence of radiopacity of

dental composites on the diagnosis of secondary caries: the correlation between

objective and subjective analyses. Oper Dent. 2014;39(1):90-7

30. de Molon RS, de Avila ED, Boas Nogueira AV, Chaves de Souza JA, Avila-Campos

MJ, de Andrade CR, Cirelli JA. Evaluation of the host response in various models of

induced periodontal disease in mice. J Periodontol. 2014;85(3):465-77.

31. Liu R, Desta T, He H, Graves DT. Diabetes alters the response to bacteria by

enhancing fibroblast apoptosis. Endocrinology. 2004;145(6):2997-3003.

32. Coimbra LS, Rossa C Jr, Guimarães MR, Gerlach RF, Muscará MN, Spolidorio DM,

Herrera BS, Spolidorio LC. Influence of antiplatelet drugs in the pathogenesis of

experimental periodontitis and periodontal repair in rats. J Periodontol.

2011;82(5):767-77.

33. de Souza JA, Nogueira AV, de Souza PP, Cirelli JA, Garlet GP, Rossa C Jr.

Expression of suppressor of cytokine signaling 1 and 3 in ligature-induced

periodontitis in rats. Arch Oral Biol. 2011;56(10):1120-8.

31

34. Koneski F, Popovic-Monevska D, Gjorgoski I, Krajoska J, Popovska M, Muratovska

I, Velickovski B, Petrushevska G, Popovski V. In vivo effects of geranylgeraniol on

the development of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaws. J

Craniomaxillofac Surg. 2018;46(2):230-236.

35. Soundia A, Hadaya D, Esfandi N, Gkouveris I, Christensen R, Dry SM, Bezouglaia O,

Pirih F, Nikitakis N, Aghaloo T, Tetradis S. Zoledronate Impairs Socket Healing after

Extraction of Teeth with Experimental Periodontitis. J Dent Res. 2018;97(3):312-320.

36. Naghsh N, Razavi SM, Minaiyan M, Shahabooei M, Birang R, Behfarnia P,

Hajisadeghi S. Evaluation of the effects of two different bone resorption inhibitors on

osteoclast numbers and activity: An animal study. Dent Res J (Isfahan).

2016;13(6):500-507.

37. Amler MH. Pathogenesis of disturbed extraction wounds. J Oral Surg.

1973;31(9):666-74.

38. Hupp JR. Reparação das Feridas. In: Hupp JR, Ellis lll E, Tucker MR. Cirurgia Oral

e Maxillofacial Contemporânea. Rio de Janeiro:Elsevier; 2000, p. 49-60.

39. Consolaro, A. Inflamação e reparo. Maringá-PR: Dental press editora; 2009.

40. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies

revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61.

41. Food and Drug Administration. Guidance for industry – Estimating the maximum

safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in Adult healthy

volunteers. Washigton: US Departmente of Health and Human Services. 2005

42. Gronowicz GA, McCarthy MB. Glucocorticoids inhibit the attachment of osteoblasts

to bone extracellular matrix proteins and decrease beta 1-integrin levels.

Endocrinology. 1995;136(2):598-608.

43. Cao Q, Yu J, Connell D. New allometric scaling relationships and applications for

dose and toxicity extrapolation. Int J Toxicol. 2014;33(6):482-9.

44. Sharma V, McNeill JH. To scale or not to scale: the principles of dose extrapolation.

Br J Pharmacol. 2009; 157(6): 907–921.

45. Schneider K, Oltmanns J, Hassauer M. Allometric principles for interspecies

extrapolation in toxicological risk assessment--empirical investigations. Regul

Toxicol Pharmacol. 2004;39(3):334-47.

46. Rappert P, Preier L, Korab W, Neubauer Tr. Diagnostic and therapeutic management

of esophageal and gastric caustic burns in childhood. Eur J Pediatr Surg.

1993;3(4):202–5.

47. Wasserman RL, Ginsburg CML. Caustic substance injuries. J

Pediatr. 1985;107(2):169-74.

48. Cello JP, Fogel RP, Boland CR. Liquid caustic ingestion. Spectrum of injury. Arch

ntern Med. 1980;140(4):501-4.

49. Gronowicz GA, DeRome ME, McCarthy MB. Glucocorticoids inhibit fibronectin

synthesis and messenger ribonucleic acid levels in cultured fetal rat parietal bones.

Endocrinology. 1991;128(2):1107-14.

50. Lukert B, Mador A, Raisz LG, Kream BE. The role of DNA synthesis in the responses

of fetal rat calvariae to cortisol. J Bone Miner Res. 1991;6(5):453-60.

51. Delany AM, Gabbitas BY, Canalis E. Cortisol downregulates osteoblast alpha 1 (I)

procollagen mRNA by transcriptional and posttranscriptional mechanisms. J Cell

Biochem. 1995;57(3):488-94.

32

52. Raghow R, Gossage D, Kang AH. Pretranslational regulation of type I collagen,

fibronectin, and a 50-kilodalton noncollagenous extracellular protein by

dexamethasone in rat fibroblasts. J Biol Chem. 1986;261(10):4677-84.

53. Cockayne D, Sterling KM Jr, Shull S, Mintz KP, Illeyne S, Cutroneo KR.

Glucocorticoids decrease the synthesis of type I procollagen mRNAs

Biochemistry. 1986. Jun 3;25(11):3202-9.

54. Hämäläinen L, Oikarinen J, Kivirikko KI. Synthesis and degradation of type I

procollagen mRNAs in cultured human skin fibroblasts and the effect of cortisol. J

Biol Chem. 1985;260(2):720-5.

55. Edwards LD, Fox AW, Stonier PD. Principles and practice of pharmaceutical

medicine. Oxford: UK; 2010.

33

8. APÊNDICE

Apêndice A - Cálculo da equivalência alométrica.

A equivalência de dose é um método matemático que estipula a dose equivalente

aproximada de um dado medicamento entre diferentes espécies. Ela pode ser feita por meio

da proporção de massa, superfície corpórea ou equivalência alométrica. A extrapolação

alométrica, o método mais preciso, leva em consideração a espécie, sua temperatura, massa

corporal e taxa metabólica; dados que equacionados, fornecem a taxa metabólica basal, ou a

quantidade de energia que cada organismo necessita para se manter vivo, durante 24 horas,

em posição de repouso. A partir deste parâmetro, é possível calcular a dose metabólica da

cada espécie e finalmente, ajustar as doses em miligramas por quilo (mg/Kg) para que se

tornem equivalentes (55).

Para o cálculo de equivalência alométrica entre humanos e ratos das doses propostas

no presente estudo foi, primeiramente, determinada a taxa metabólica basal (TMB) que é

expressa pela seguinte fórmula:

TMB = M0,75

x k

onde:

M0,75

: Peso metabólico basal (massa corporal elevada à potencia de 0,75)

k: Constante teórica de proporcionalidade dependente da espécie, baseada na temperatura

(para mamíferos placentários, k=70)

Assumindo um Rato de 300g, a TMB=28,35kcal.

Assumindo um Humano adulto de 60Kg, TMB=1508,5Kcal

Em seguida, as doses humanas de dexametasona testadas foram assumidas como

Doses Metabólicas. Assim:

Dose de 4mg = 4mg/1508,5kcal=0,00265mg/Kcal

Dose de 8mg = 8mg/1508,5= 0,00530mg/Kcal

Dose de 12mg = 12mg/1508,5= 0,00795mg/Kcal

Por meio de regra de três simples, a Dose Total para o Animal alvo foi estimada a

partir da dose metabólica humana:

Para 4mg: 0,00265mg -------- 1 kcal

DTA -------- 28,35 kcal (TMB do rato)

DTA = 0,075mg

Portanto, para 8mg: DTA = 0,15 mg e para 12mg:DTA = 0,225 mg.

34

Apêndice B – Procedimento cirúrgico.

Para exodontia do primeiro molar inferior esquerdo (M1) os animais foram

estabilizados em decúbito ventral e em seguida um abridor de boca foi mantido nos incisivos

centrais para acesso à região dos molares. Com uma sonda exploradora foi realizada a

sindesmotomia do tecido gengival correndo a ponta do explorador em torno do M1 e então os

dentes foram luxados com auxílio de uma espátula Hollenback nos sentidos mésio-distal e

cérvico-apical e posteriormente extraídos (Figura 8).

Figura 8: Fotografias do procedimento cirúgico para exodontia do M1. Abridor bucal posicionado (A),

sidesmotomia com auxílio de uma sonda exploradora (B), luxação do M1 com auxílio de uma espátula

Hollenback (C) e M1 extraído (D).

35

Apêndice C – Método de Quantificação da Densidade Radiográfica

Após a tomada radiográfica as imagens obtidas da mandíbula e da escala de alumínio

foram analisadas no programa Image J (Figura 9). Posteriormente, um histograma sobre todos

os 10 degraus da escala de alumínio foi gerado sobre uma região central de 25x75, para obter

seus valores médios dos níveis de cinza (Figura 10).

Figura 6: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise da escala de alumínio.

Demarcação da região central (seta vermelha) de 25x75 (circulo vermelho) sobre a escala de degrau de alumínio.

36

Figura 7: Histograma de distribuição dos níveis de cinza de um degrau da escala de alumínio, gerada pelo

programa ImageJ. Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da região central do degrau da escala de

alumínio.

Os valores gerados pelo histograma foram então organizados em uma planilha no

progama Microsoft Excel® 2010. Para correção de diferenças potenciais entre as imagens

radiográficas, a partir destes dados preliminares, foi gerado um gráfico de dispersão (Figura

11), de onde obtivemos sua tendência linear e sua fórmula, para definir em milímetros de

alumínio (mmAl), os valores dos níveis de cinza de cada imagem.

Figura 8: Curva de dispersão e tendência linear. Valores médios dos níveis de cinza (eixo Y) de cada degrau da

escala de alumínio (eixo X) e a fórmula gerada a partir da tendência linear (retângulo vermelho).

37

Em seguida, em cada imagem, foi gerado um histograma de uma área de 10x10 pixel

na região entre terços médio e apical do alvéolo distal do M1 (Figuras 12 e 13). O valor médio

do nível de cinza foi então inserido na fórmula do gráfico, para obter o valor equivalente em

mmAl dos níveis de cinza da ROI no alvéolo distal do M1.

Figura 9: Fotografia da exibição do programa ImageJ demonstrando a análise do alvéolo distal do M1.

Demarcação da ROI (seta vermelha) de 10 X 10 (circulo vermelho) no alvéolo distal do M1.

38

Figura 10: Histograma de distribuição dos níveis de cinza do alvéolo distal do M1, gerado pelo programa

ImageJ.Valor médio dos níveis de cinza (retângulo vermelho) da ROI do alvéolo distal do M1.

Os dados com os valores em mmAl da ROI do alvéolo distal do M1 de cada imagem,

foram então analisados de acordo com os grupos e períodos de estudo para realizar os testes

estatísticos.

39

9. ANEXO

Anexo A - Aprovação do comitê de ética em pesquisa em animais.