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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO FACULDADE DE FARMÁCIA

ELEN FRANCIS QUEIROZ DA SILVA

Revisão de métodos para determinação de canabinoides em matrizes biológicas por

cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de espectrometria de

massas

RIO DE JANEIRO

2017

Elen Francis Queiroz da Silva

Revisão de Métodos para Determinação de Canabinoides em Matrizes

Biológicas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada ao De-

tector de Espectrometria de Massas

Trabalho de Conclusão de Curso apresenta-

do à Faculdade de Farmácia da Universida-

de Federal do Rio de Janeiro como parte dos

requisitos necessários à obtenção do grau

de farmacêutico.

Orientador: Profª. Dra.Virgínia Martins Carvalho

Rio de Janeiro

2017

AGRADECIMENTOS A Deus, por ter me dado sabedoria, coragem, resistência e perseverança. Por guiar

meus passos, por colocar seus anjos em meu caminho e por me dar a oportunidade

de realizar um sonho, e através dele ajudar tantas vidas.

Aos meus pais, que sempre acreditaram em mim, e me ensinaram a construir a vida

com honestidade, justiça, respeito, liberdade, coragem, amor e alegria. É para vocês

e por vocês que consegui este diploma, só nós sabemos o quanto lutamos por isso.

Ao meu pai e bisavó, meus maiores fãs, que partiram com a certeza que este dia

chegaria, se tornaram parte de mim e me fizeram ter forças para caminhar até aqui.

Ao meu marido, Pablo, pelo apoio constante, por me incentivar a ir em busca dos

meus sonhos, por compreender minha ausência e permanecer me amando. Te amo!

Aos meus grandes amigos Layza, Letícia, Daniele, Juliane, Paula, Diego, Inah, Kari-

na, Jacqueline e Erik, que por tantas vezes dividiram comigo o peso dos dias ruins e

merecem comemorar todas as felicidades dessa conquista.

Aos amigos que tornaram essa jornada possível: Biofísica (#bioffromhell), Farmácia-

UFF (IPCE) e Farmácia-UFRJ (galera da escadaria). A maravilhosa turma 2011.2-

noturno, em especial Estephane, Faninha, Si, Dudu, Lígia, Amanda, Erika, Pedro,

Pam, Leide, Vera, Torre e Mateus que por certo estarão ao meu lado a vida inteira.

A incrível equipe que se tornou a família SEFAR. Aos meus chefes Adelaine, Laís,

Aline e Douglas, que além de exemplos profissionais, me deram a oportunidade de

estudar e não me deixaram desistir. Cada um de vocês são parte desse sonho.

A minha orientadora Virgínia, com abraço acolhedor e alegria em dividir conheci-

mento. Você é exemplo de professora, cientista e de humanidade.

Ao povo brasileiro, o qual através de seus impostos financiaram a minha formação.

Espero retribuir o investimento trabalhando por uma saúde pública de qualidade.

“Para que serve a utopia?

Serve para isso: para que eu

não deixe de caminhar.”

Eduardo Galeano

RESUMO SILVA., E. F. Q. Revisão de métodos para determinação de canabinoides em matrizes biológicas por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de espectrometria de massas. Rio de Janeiro, 2017. Trabalho de Con-

clusão de Curso (Bacharelado em Farmácia) – Faculdade de Farmácia, Universida-

de Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

É recorrente em todo o mundo a discussão sobre a legalização e utilização da Can-

nabis sativa, popularmente conhecida como maconha, para uso medicinal. Esta

planta apresenta inúmeros metabólitos, que são compostos farmacologicamente ati-

vos denominados canabinoides, que no Brasil são substâncias proscritas. Contudo,

a realidade é que no Brasil, cresceu o número de tratamentos com canabinóides pa-

ra epilepsia refratária, por exemplo. Os pacientes fazem a terapia mesmo que de

maneira artesanal, ou até mesmo ilegal, sem segurança e comprovação da eficácia.

Por isso, faz-se necessário uma avaliação de segurança considerando que o uso

terapêutico já está sendo realizado independentemente de estudos pré-clínicos.

Desta forma o presente trabalho tem por objetivo apresentar a evolução dos estudos

sobre o emprego da Cannabis sativa e seus derivados, a fim de propor a melhor

técnica para determinação por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao

detector de espectrometria de massas em matriz biológica. Tal apresentação dar-se-

á através de pesquisas em artigos científicos, em bases de dados eletrônicas e

agências regulatórias, para avaliar as vantagens e desvantagens dos parâmetros

para seleção de matriz biológica, extração, detecção, e quantificação para desenvol-

ver metodologia simples, com baixo custo, reprodutibilidade, alta sensibilidade e es-

pecificidade, que futuramente seja empregada em estudos farmacocinéticos e moni-

torização terapêutica.

Espera-se levantar esta discussão, e elucidar a importância do uso de derivados da

Cannabis sativa como medicamento para auxiliar na construção de um acesso segu-

ro e eficaz.

Palavras-chave: “canabinoides”, “Cannabis sativa”, “maconha”, “cannabis”, “canabi-

diol”, “tetrahidrocanabinol”, “cromatografia líquida” e “farmacocinética”.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AMPc – Adenosina monofosfato cíclica

ASC – Área sob a curva

CBD – Canabidiol

CBDA – Ácido Canabidiolico

CBG – Canabigerol

CBN – Canabinol

CB1 – Receptor canabinóide 1

CB2 – Receptor canabinóide 2

CG – Cromatografia gasosa

CG/EM – Cromatografia gasosa acoplado a espectrômetro de massas

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE/EM – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a espectrômetro de

massas

CLAE- EM/EM – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a espectrômetro

de massas em tandem

Cmax – Pico da concentração plasmática

CLUE – Cromatografia líquida de ultra eficiência

DAD – Detector de arranjo de diodos

DCB – Denominações Comuns Brasileiras

DL50 – Dose letal 50%

EFS – Extração de fase sólida

ELL – Extração líquido-líquido

EM – Espectrômetro de massas

GABA – Ácido γ-aminobutírico

Gi – Proteína G inibitória

LD – Limite de detecção

LIQ – Limite de quantificação inferior

LogP – Coeficiente de partição

LQ – Limite de quantificação

LSQ – Limite de quantificação superior

MEFS – Micro extração de fase sólida

m/z – Razão massa/carga

PKA – Proteína quinase A

PKa – Constante de dissociação ácida

SNC – Sistema nervoso central

SNP – Sistema nervoso periférico

THC ou Δ9-THC – Δ9-tetrahidrocanabinol

THCA – Ácido tetrahidrocanabinolico

THC-COOH – Carboxi-THC

Tmax – Tempo em que a concentração plasmática do fármaco atinge a concentração

máxima após a administração

TRPV1 - Receptores potenciais transitórios vaniloides do tipo 1

UV – Detector ultravioleta

Δ8THC – Δ8-tetrahidrocanabinol

2- AG – 2-araquidonilglicerol

11-OH-THC – Hidroxi-THC

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 10

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................. 15

2.1. COMPONENTES DA CANNABIS ...................................................................... 15

2.1.1. Δ9-TETRAIDROCANABINOL .......................................................................... 19

2.1.2. CANABIDIOL ................................................................................................... 20

2.2. FARMACODINÂMICA ........................................................................................ 20

2.3. TOXICIDADE ..................................................................................................... 23

2.4. FARMACOCINÉTICA ......................................................................................... 25

3. OBJETIVO ............................................................................................................29

3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 29

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 29

4. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 30

5. METODOLOGIA .................................................................................................... 31

5.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 31

5.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ....................................................... 31

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 32

6.1. SELEÇÃO DOS ESTUDOS ............................................................................... 33

6.2. CANABINOIDES: DETERMINAÇÃO ................................................................. 37

6.2.1. ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA: MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA E

BIODISPONIBILIDADE ............................................................................................. 37

6.2.2. MATRIZ BIOLÓGICA ...................................................................................... 40

6.2.3. DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO ................................................................... 43

6.2.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO ............................................................................ 46

6.2.5. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO .................................................................... 47

7. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 50

8. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 51

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1. INTRODUÇÃO Diversas culturas em todo o mundo utilizam plantas em terapias baseadas em

suas propriedades medicinais. Sendo a Cannabis sativa uma das plantas de uso

medicinal mais conhecida e polêmica de todos os tempos. Pois a Cannabis sativa,

popularmente conhecida como maconha, é a droga ilícita mais consumida no mun-

do, sendo seu consumo superado apenas pelo tabaco e álcool (WATSON et al.,

2000). A Cannabis sativa L. (Figura 1) é uma planta da família Cannabaceae, nativa

da Ásia Central, descrita em 1973 pelo botânico sueco Carolus Linneaus, embora os

primeiros registros da planta datam de pelo menos 2700 anos devido as suas pro-

priedades medicinais, já reconhecidas e relatadas na China. Sua fibra conhecida

como cânhamo era utilizada pelas civilizações chinesas, gregas e romanas como

matéria-prima para confecção de velas de navios, roupas e cordas (ZUARDI, 2006;

BARRETO, 2012).

Figura 1. A planta Cannabis sativa. Fonte: BYNUM, 2014.

A cannabis possui divergência na literatura, no qual autores afirmam que há

somente uma espécie monotípica a Cannabis sativa, e algumas subespécies e vari-

edades. Enquanto outros afirmam que há duas espécies, Cannabis sati-

va e Cannabis indica, e outros ainda incluem a Cannabis ruderalis (STAMBOULI et

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al., 2005; MACEDO, 2011). As espécies de cannabis distinguem-se principalmente

pelo modo de crescimento, características morfológicas e quantidade de princípios

ativos (MATOS et al., 2017).

A cannabis é conhecida por diversos nomes como, marijuana, hashish, cha-

ras, bhang, ganja, diamba e sinsemila, e maconha no Brasil, que é um anagrama

para Cânhamo (CARLINI, 2006).

No Brasil, diversos autores relatam que a cannabis foi trazida para cá por es-

cravos africanos, para uso não médico e também como hipnótico e sedativo. Até

1917, os derivados da planta podiam ser facilmente encontrados em tabacarias e

farmácias e, até 1930, eram receitados para fins médicos, mas, também, eram con-

sumidos em rituais sociais ou cerimônias religiosas com raízes em tradições africa-

nas, indígenas e europeias (CARLINI, 2006).

Há diversas citações em compêndios médicos nacionais para seu uso tera-

pêutico até início do século XX, quando se deu início a fase repressiva por todo o

mundo, com proibição total do plantio, cultura, colheita e exploração da maconha em

todo território nacional pelo Decreto-Lei em 1938, por ser considerada uma droga

perigosa capaz de induzir seus usuários a comportamentos violentos e promíscuos,

refletindo negativamente em pesquisas sobre seu uso terapêutico até os dias atuais

(CARLINI, 2006).

Apesar da utilização terapêutica da cannabis e seus derivados serem reco-

nhecidas há muitos anos, o estudo das suas propriedades terapêuticas é muito re-

cente, ocorrendo somente a partir da década de 60 após a caracterização do Δ9-

tetraidrocanabinol (THC), uma das substâncias responsáveis pelos efeitos psicoati-

vos, pelo grupo do professor Mechoulam, que a cannabis voltou a ser estudada. E a

partir de então, diversos grupos pelo mundo pesquisaram suas propriedades farma-

cológicas e de seus compostos devido ao seu potencial (ZUARDI, 2008).

A cannabis contém mais de 400 componentes químicos, e aproximadamente

70 compostos farmacologicamente psicoativos denominados canabinoides, como

por exemplo o THC e seus isômeros. Os canabinoides são substâncias complexas

que podem ser de origem sintética ou natural e se ligam aos receptores canabinoi-

des (CB) (ZUARDI, 2008; MATOS et al., 2017). Devido ao seu alto potencial farmacológico, os canabinoides são estudados

para diversos alvos terapêuticos, como analgesia, relaxamento muscular, imunossu-

pressão, anti-inflamatórios, antialérgicos, sedativos, para melhorar o humor, como

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estimulante do apetite, antiemético, diminuidores da pressão intra-ocular, broncodila-

tação, neuroproteção e efeitos antineoplásicos (Figura 2).

Figura 2. Indicações farmacológicas dos canabinoides. Fonte: BONFÁ, 2008.

Atualmente, a cannabis é empregada como terapia auxiliar para o controle de

alguns sinais e sintomas em pacientes acometidos por diversas doenças e enfermi-

dades, como: câncer, esclerose múltipla, doença de Crohn e epilepsia refratária.

Como síndrome de Rett clássica e atípica, síndrome de Dravet, síndrome de Ohta-

hara e síndrome de West, nas quais medicamentos de primeira escolha não surtiram

efeito (KAO YIEN, 2017; MATOS et al., 2017).

No Brasil a importação de produtos à base de canabidiol ocorre principalmen-

te para o tratamento de epilepsia refratária (KAO YIEN, 2017). Mas existe um núme-

ro ainda não estimado de pacientes que utilizam produtos nacionais ainda não regu-

lamentados para diversas outras enfermidades (CARVALHO et al., 2017).

Diferentes medicamentos à base de cannabis estão disponíveis no mercado

internacional (PAMPLONA, 2014). Como:

• Marinol®: na forma de cápsula de 5 mg do ativo Dronabinol que é uma versão

sintética do THC. É autorizada para o alívio das náuseas causadas pela quimiotera-

pia no tratamento do câncer, além de amenizar a perda de apetite associada à Aids;

• Cesamet®: cápsula de 1 mg do ativo Nabilona, é uma variação estrutural do Dro-

nabinol. Possui as mesmas aplicações além de atuar como analgésico para dores

neuropáticas e ainda demonstra resultados no alívio da fibromialgia e da esrose múltipla;

• Acomplia ®: comprimido de 20 mg do ativo Ribonabanto, um antagonista sintético

que bloqueia os receptores canabinoides CB1, com aplicação antiobesidade. Foi

retirado do mercado, e pro por causar depressão.

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• Bedrocan®: planta seca e padronizada de cannabis para administração via vapo-

rização, ou usar na preparação de comestíveis de base oleosa (manteigas, por

exemplo). A escolha do medicamento com mais ou menos THC ou CBD, depende

da finalidade;

• Sativex® ou Mevatyl®: extrato hidro-alcoólico administrado na forma de spray oral

com concentrações controladas de THC (27 mg/mL) e CBD (25 mg/mL), produzido a

partir de cultivos isogênicos de THC e de CBD. Utilizado no tratamento de pacientes

não responsivos a medicamentos antiespásticos. Único com registro da ANVISA

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária).

No Brasil a Cannabis sativa encontra-se na Lista E da portaria SVS/MS nº

344/1998 como plantas proscritas que podem originar substâncias entorpecentes ou

psicotrópicas, sendo o THC incluso na lista de substâncias de uso proscrito (lista F2)

bem como seus isômeros, que inclui o canabidiol, por exemplo.

O Dronabinol (THC sintético) consta na lista A3 (mesma alocação da morfina)

desde o ano 2000, enquanto o THC da planta consta até hoje na lista F2.

A discussão sobre a retirada do canabinoide canabidol (CBD) da lista de fár-

macos proscritos teve início no Brasil em 2014 após a divulgação de que pacientes

pediátricos portadores de epilepsia refratária encontravam-se sob tratamento com

extrato de CBD com excelente resposta terapêutica. Enquanto que a cannabis e

seus componentes ainda são proibidos, e a obtenção do extrato terapêutico de CBD

é realizado de maneira ilegal, inclusive feitos a partir de plantas desconhecidas, mui-

tas vezes oriundas do tráfico (maconha prensada), que pode conter inúmeros com-

postos neurotóxicos como altos teores de metais pesados, praguicidas, e adulteran-

tes com maior potencial de abuso, como por exemplo, cocaína (MAGALHÃES, 2015;

CARVALHO et al., 2017).

Em 2014 após resolução do Conselho Regional de Medicina do Estado de

São Paulo e o Conselho Federal de Medicina publicou a resolução CFM nº

2.113/2014 que autoriza os médicos a prescreverem canabidiol em uso compassivo

para tratamento de epilepsias. Ou seja, só pode ser prescrita quando os outros me-

dicamentos conhecidos não apresentarem resultados satisfatórios.

No primeiro semestre de 2015 a ANVISA através da RDC nº 03/2015 alterou

a classificação do CBD para a Lista C1 - substâncias sujeitas ao controle especial. E

através da RDC nº 17/2015 autoriza e define os critérios de importação de extratos

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de CBD que entram em território nacional como medicamento, enquanto que os Es-

tados Unidos da América, os mesmos são comercializados como suplementos ali-

mentares. Em março de 2016 com a RDC nº 66/2016, a ANVISA autoriza a prescri-

ção e importação do THC.

Em 2017 a ANVISA aprovou o registro do primeiro medicamento à base

de Cannabis sativa no Brasil, o Mevatyl ®. E também atualizou a lista das Denomi-

nações Comuns Brasileiras (DCB) e incluiu a Cannabis Sativa L.

Considerando a regulação nacional de medicamentos à base de cannabis o

desenvolvimento de metodologias analíticas para a determinação qualitativa e quan-

titativa de canabinoides em amostras biológicas possuem enorme importância na

área clínica e no estudo e interpretação dos parâmetros farmacocinéticos e farma-

codinâmicos dessas substâncias.

Nos últimos anos, trabalhos vem sido publicados para demonstrar desenvol-

vimento de metodologias para determinação de canabinoides, por diferentes técni-

cas de extração e detecção, e em diferentes tipos de matrizes biológicas. Como por

exemplo, em 2002, Musshoff e colaboradores, determinaram canabinoides em cabe-

lo por CG-EM adotando como técnicas de extração a microextração em fase sólida

(MEFS) por. Em 2005, Nadulski e colaboradores desenvolveram metodologia de ex-

tração em fase sólida (EFS) em CG-EM para analisar canabinoides em plasma hu-

mano obtido de voluntários após a administração oral de baixas doses de extrato de

maconha. Ou ainda, Kneisel e colaboradores, em 2013, desenvolveram método por

precipitação proteica para quantificar canabinóides em fluido oral em CLAE-EM

(MUSSHOF et al., 2002; NADULSKI et al., 2005; KENEISEL et al., 2013).

Foi observado, que embora exista muitos trabalhos de determinação de ca-

nabinoides em matrizes biológicas alternativas e complexas, a maioria deles, utili-

zam extrações em fase sólida, que é uma técnica mais cara e dificulta a aplicação

da metodologia em laboratórios brasileiros.

Visando uma futura aplicação terapêutica é de grande importância o desen-

volvimento de metodologia para análise em CLAE-ES, por ser uma excelente alter-

nativa para a detecção, identificação, confirmação e quantificação simultânea de ca-

nabinoides em matrizes biológicas como plasma, sangue e urina. Pois possibilita a

monitorização do íon pseudo-molecular e de suas fragmentações, de forma a garan-

tir a sensibilidade e a especificidade necessárias para a quantificação de analitos,

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em concentrações de nível traço. E sendo aliado a um método de extração simples

como o líquido-líquido (ELL) torna-se viável por ter custo relativamente baixo.

No cenário atual, dispor de métodos analíticos para melhorar a segurança dos

pacientes que já fazem uso como terapia medicamentosa faz-se urgente. Permitindo

assim estudos sobre dose, janela terapêutica, toxicidade, farmacodinâmica, farma-

cocinética, efeitos adversos e monitorização terapêutica.

Espera-se levantar esta discussão através de bases científicas e elucidar a

importância do uso de derivados da planta como medicamento para determinados

tipos de doenças e enfermidades no Brasil. E auxiliar na construção de um acesso

seguro e eficaz já aprovados por agências regulatórias e suas evidências.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1. COMPONENTES DA CANNABIS

A cannabis é uma planta complexa, pois contém uma enorme variedade de

substâncias químicas e diversas possibilidades de interações entre elas. Sendo até

então identificadas 483 substâncias químicas diferentes, que são distribuídas em

dezoito classes químicas, como por exemplo, óleos essenciais, flavonóides, açúca-

res, aminoácidos, ácidos graxos, compostos nitrogenados e terpenofenóis (canabi-

nóides) (VOTH et al.,1997; MARKEZ et al., 2002). A atividade farmacológica da

planta está associada aos mais de 60 canabinoides exclusivos da cannabis (STAM-

BOULI et al., 2005; TAURA et al., 2007).

Os canabinoides são substâncias complexas que se ligam aos receptores ca-

nabinoides e sua estrutura química geral é constituída por 21 átomos de carbono

com três anéis, um cicloexano, um tetrahidropirano, e um benzeno (Figura 3).

Figura 3. Estrutura base do canabinoide. Fonte: MATOS, et al. 2017.

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Os canabinoides podem ser de origem sintética ou natural, sendo classificados em:

• Fitocanabinoides: são metabólitos secundários extraídos da planta Cannabis sati-

va, encontrados nas folhas e flores, principalmente na resina;

• Endocanabinoides: substâncias endógenas que se ligam aos receptores canabi-

noides que podem estar presentes no sistema nervoso central (SNC) e periférico

(SNP);

• Canabinoides sintéticos: são substâncias análogas aos supracitados, ligantes dos

receptores canabinoides que podem estar relacionados com diferentes classes quí-

micas (FOWLER et al., 2005; FONSECA et al., 2013).

O primeiro composto isolado da cannabis foi o canabinol, em 1899 por Wood,

e de maneira equivocada, foi considerado o principal composto ativo da planta capaz

de desencadear os efeitos psicoativos. Em 1940 por Adams, foi descoberto o cana-

bidiol, e posteriormente isolado por Mechoulam e colaboradores em 1963. Um ano

depois, em 1964, Mechoulam e seus colaboradores conseguiram isolar o Δ9-

Tetrahidrocannabinol (WOOD,1899; ADAMS, 1940; MECHOULAM et al.,1963; ME-

CHOULAM et al.,1964).

Devane e colaboradores em 1988 descobriram que existia um sítio específico

no cérebro, no qual o THC podia ligar-se. Em 1990, Matsuda conseguiu clonar o

primeiro receptor canabinóide e o chamaram de Sistema Receptor de Canabinoides

tipo 1, o CB1, onde o THC atuava como agonista parcial. Em 1992, Munro descobriu

um segundo receptor canabinóide, que foi nomeado como CB2. Paralelamente, De-

vane comprovava a existência do Sistema Receptor de Canabinoides a partir da ex-

tração de uma molécula, uma etanolamida de ácido aracdônico, que também liga-

vam-se a este receptor, a este agonista natural, foi dado o nome de “anandamida”,

palavra derivada de ananda, do Sânscrito, que significa “felicidade” (DEVANE et al.,

1988; MATSUDA et al., 1990; DEVANE et al., 1992; MUNRO et al., 1993; ZUARDI,

2008). É encontrada em várias regiões do cérebro humano (hipocampo, estriado e

cerebelo) onde os receptores CB1 são abundantes, o que explica o papel fisiológico

dos canabinoides endógenos nas funções cerebrais controladas por essas zonas do

cérebro, como, a memória, os padrões do sono, o alívio da dor e da fome. A molécu-

la de anandamida apresenta ação sobre o sistema nervoso central e periférico (DI

MARZO, 2000). Curiosamente, também há presença em outras regiões do corpo,

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tais como, o baço, onde existem altas concentrações de receptores CB2 (FOWLER,

2003).

Comparada com o THC, a anandamida apresenta uma afinidade de até vinte

vezes menor pelo receptor CB1, e é mais rapidamente metabolizada por hidrólise

pelas amidases (HILLIARD, 1999). Apesar destas diferenças, a anandamida apre-

senta quase todos os efeitos farmacológicos do THC (DEVANE, 1992).

Em 1995 Mechoulam e colaboradores conseguiram isolar um segundo neuro-

transmissor canabinóide, o 2-araquidonilglicerol (2-AG) e partir daí as pesquisas re-

lacionadas à interação dos compostos oriundos da Cannabis sativa alcançaram ou-

tras proporções (Figura 4)(MECHOULAM et al., 1995; ZUARDI, 2008).

Figura 4. Número de publicações referentes à cannabis em 45 anos. Fonte: ZUARDI, 2008.

Os principais canabinoides importância farmacológica são (Figura 5):

• Δ9-tetra-hidrocanabinol (THC): principal componente com efeito psicoativo. Possui

efeito antiemético e anti-inflamatório (BRENNEISEN, 2007);

• Δ8-tetra-hidrocanabinol (Δ8-THC): é um isômero do THC que difere em relação a

posição da dupla ligação na posição 8, e por isso apresenta menor efeito psicoativo

em relação ao THC (GAINZA, 2003);

• Canabidiol (CBD): não apresenta efeito psicoestimulante e alucinógeno, porém

apresenta significante efeito anticonvulsivante, sedativo, antipsicótica, analgésico e

anti-inflamatório para o sistema imune (BRENNEISEN, 2007; CARRANZA, 2009;

NETZAHUALCOYOTZI-PIETRA, 2009);

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• Canabinol (CBN): apresenta efeito psicoativo inferior ao THC, observado apenas

por via intravenosa. Possui atividade anti-inflamatória, antipsicótica, antibiótica e

analgésica. (TEIXEIRA et al., 2011; BRENNEISEN, 2007);

• Ácido Δ9-tetra-hidrocanabinolico (Δ9-THCA): precursor do THC, por isso não apre-

sentam atividade psicoativa, somente após ser queimado (descarboxilado) sendo

convertido em THC (BRENNEISEN, 2007);

• Canabigerol (CBG): efeito antibiótico e antifúngico (BRENNEISEN, 2007);

As porcentagens dos canabinoides mais abundantes variam entre 0,0014-

2,106% para o THC, 0,00002-0,035% para o CBN e 0,003-2,96 para o CBD (RIBEI-

RO, 2014). Enquanto o Δ8-THC aparece somente em algumas variedades de plantas

da cannabis.

Figura 5. Principais canabinoides presentes na Cannabis sativa. Adaptação da figura de BERGER et.

al, 2009.

Por meio de suas biossínteses, os canabinoides são primeiramente sintetiza-

dos pela planta sob a forma de ácidos carboxílicos e, somente após a influência da

luz e calor, são convertidas nos canabinoides, com a perda do grupo carboxílico sob

a forma de dióxido de carbono (FERNANDES, 2013).

Existem diversas teorias para discutir as vias da biossíntese dos canabinoi-

des. Como por exemplo, a rota explicada por Mechoulam, que propôs uma via para-

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lela entre formas ácidas e neutras dos compostos demonstrados na Figura 6 (PAGE

& NAGEL, 2006).

Figura 6. Proposta de biossíntese dos canabinoides. Adaptação da figura de PAGE & NAGEL, 2006.

E além disso, há variações no efeito, que podem ser determinados pela forma

ácida ou neutra de um mesmo canabinoide, como por exemplo, o ácido Δ9-tetra-

hidrocanabinolico que é convertido em THC através do aquecimento, sendo a con-

centração final de cada substância diretamente influenciada pela temperatura e tipo

de solvente de extração (ROMANO & HAZECAMP, 2013).

Sendo assim, é difícil estimar os efeitos farmacológicos da cannabis, conside-

rando que a planta apresenta aproximadamente 70 fitocanabinoides.

2.1.1. Δ9-TETRAIDROCANABINOL O THC é um dos principais fitocanabinoides, e principal constituinte da can-

nabis. Possui fórmula estrutural C21H30O2, peso molecular 314.469 g/mol, baixa so-

lubilidade em água (0.028 mg/L em 23°C), solubiliza 1 parte em 1 parte de álcool

etílico, acetona e n-hexano, encontrado naturalmente na forma de sólido, ponto de

fusão 155 - 157°C, constante de dissociação (pka) 10.6, logP 6.5, degrada em meio

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/#collection=compounds&query_type=mf&query=C21H30O2&sort=mw&sort_dir=asc

de 62

ácido, luz, e temperatura (armazenar a -20°C), e número de CAS 1972-08-3 (PUB-

CHEM; DRUGBANK).

2.1.2. CANABIDIOL O CBD é um fitocanabinóide da Cannabis sativa, e constitui cerca de 40% das

substâncias ativas dessa planta. Possui fórmula estrutural C21H30O2, peso molecular

314.469 g/mol, baixa solubilidade em água (0.0126 mg/mL mg/L em 23°C), pouco

solúvel em álcool etílico, solubiliza em solventes orgânicos, encontrado naturalmente

na forma de sólido, ponto de fusão 66 - 67°C, constante de dissociação (pka) 9.13,

logP 6.1, e número de CAS 13956-29-1 (PUBCHEM; DRUGBANK).

2.2. FARMACODINÂMICA Os canabinoides exercem o seu efeito pela interação com os receptores ca-

nabinoides endógenos CB1 e CB2, ou ainda mediados por subtipos ainda não identi-

ficados (GROTENHERMEN, 2004).

Os receptores CB1 encontram-se distribuídos pelo córtex cerebral, área límbi-

ca, gânglio basal, cerebelo, tálamo e tronco cerebral, nos terminais nervosos pré-

sinápticos. Estas regiões são responsáveis pela cognição, memória, recompensa,

ansiedade, dor, percepção sensorial e coordenação motora, e está relacionado com

os efeitos neurocomportamentais e psicotrópicos dos canabinoides.

Enquanto o receptor CB2 encontra-se presente nos macrófagos, no baço, es-

tando também presente em outras células do sistema imunológico (MUNRO et al.,

1993).

Os receptores CB1 e CB2 estão acoplados a proteína G inibitória que, quando

ativada, promove o bloqueio da enzima adenilatociclase, provocando a redução dos

níveis de AMP cíclico e a inibição de canais de cálcio. A ativação dos receptores

CB1 bloqueia a liberação de outros neurotransmissores, inibitórios ou excitatórios,

como o ácido gamaaminobutírico (GABA) e o glutamato (ASHTON,2001).

A falta de receptores canabinoides na base do cérebro, explica a baixa letali-

dade exibida pela cannabis, uma vez que essa porção do cérebro regula a respira-

ção e outras funções vitais (AMERI, 1999; DRUMMER, 2001).

A função fisiológica dos receptores CB1 E CB2 pode ser afetada pelo número

de modulações do sistema neuronal por outras drogas de abuso: opióides (morfina),

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/#collection=compounds&query_type=mf&query=C21H30O2&sort=mw&sort_dir=asc

de 62

GABA (benzodiazepínicos), dopamina, serotonina (anfetamina e cocaína) e recepto-

res colinérgicos (DRUMMER, 2001).

Os ligantes fisiológicos para estes receptores pertencem à família

das anandaminas, e são derivados de cadeias longas de ácidos graxos poli-

insaturados, principalmente o ácido araquidônico, e exibe seletividade variada para

os receptores CB1 e CB2 (McALLISTER, 2002). Além disto, podem existir interações

importantes com outros receptores, e também neurotransmissores, incluindo GABA,

opióides e monoaminas. E ainda o THC pode diminuir a ligação da dopamina

ao núcleo acumbens e ao córtex pré-frontal (ASHTON, 2001).

Figura 7. Estrutura química da Anandamida e do 2-AG. Fonte: HONÓRIO et al., 2006.

O 2-AG apresenta maior seletividade para os receptores CB1/CB2 em relação

a anandamida, é agonista total CB1/CB2. A anandamida é agonista parcial CB1/CB2

e agonista total, com baixa afinidade, dos receptores potenciais transitórios vaniloi-

des do tipo 1 (TRPV1). Ambos também interagem com outros receptores (COSTA et

al., 2011).

Os endocanabinoides 2-AG e anandamida são sintetizados por demanda nos

neurônios pós-sinápticos após o influxo de cálcio, seguido da ativação das fosfolipa-

ses, que transformam fosfolipídeos em endocanabinoides. E desempenham papel

importante na modulação de neurotransmissão, especialmente como transmissores

retrógrados na maioria dos processos fisiológicos, de dor, cognição, regulação do

de 62

sistema endócrino, da função metabólica, resposta emocional, efeitos no sistema

imunitário, neuroprotetores e antieméticos. (RUSSO, 2006).

Os receptores CB1 e CB2 estão acoplados a proteína G inibitória (Gi), que

quando ativada por seu ligante, endógeno ou não, ocorre a inibição da adenilatoci-

clase e, consequentemente, da adenosina monofosfato cíclica (AMPc), consequen-

temente reduzindo o processo de fosforilação dependente da ativação da proteína

quinase A (PKA), fechamento dos canais de cálcio, e abertura dos canais de potás-

sio, o que diminui a liberação de neurotransmissores. Sendo assim, há uma influên-

cia na comunicação celular (SAITO et al., 2010; COSTA et al., 2011).

Os endocanabinoides são sintetizados e liberados na membrana dos neurô-

nios pós-sinápticos, após o influxo de cálcio, ativam os receptores pré-sinápticos

CB1, e restrigem a atividade neural. A anandamida e 2-AG são removidas da fenda

sináptica. O mecanismo de internalização ainda não é totalmente elucidado, sendo

debatido se ocorre passivamente por meio da difusão ou por transportadores especí-

ficos. Em seguida, dentro dos neurônios se acopla ao TRPV1, e ocorre o catabolis-

mo, no qual os endocanabinoides sofrem hidrólise enzimática, pelas enzimas amida

hidrolase de ácidos graxos (para anandamida) e a lipase monoacilglicerol (para 2-

AG) (SAITO et al., 2010).

Receptores canabinoides e seus ligantes endógenos juntos constituem o “sis-

tema endocanabinóide” (GROTENHERMEN, 2003).

O THC se liga aos receptores CB1 e CB2 agindo como um agonista parcial e

exerce atividade neural mista, excitatória e inibitória, em diferentes áreas do cérebro,

e não somente em receptores canabinoides específicos (PERTWEE, 2008). E ainda

o THC pode diminuir a ligação da dopamina ao núcleo acumbens e ao córtex pré-frontal.

Sua natureza hidrofóbica facilita sua absorção no organismo com consequente rapi-

dez no surgimento de seus efeitos psicoativos. Existe como isômero (-) trans

(ASHTON, 2001).

O THC é responsável pelos efeitos de sedação, leve euforia e ainda apresen-

ta propriedade ansiolítica. É dose-dependente, e em doses altas podem produzir

alteração na percepção do tempo, aumento na sensitividade dos cinco sentidos e

até alucinações, o que faz da maconha próxima de alucinógenos clássicos (SPI-

NELLA, 2001). Dentre os efeitos medicinais estão o efeito analgésico, anti-

espasmótico, relaxante muscular, neuroproteção, potente antioxidante e anti-

de 62

inflamatório (20 vezes mais potente que a aspirina e 2 vezes mais potente que a hi-

drocortisona (RUSSO, 2011).

O CBD é um dos fitocanabinoides mais estudados devido aos seus efeitos te-

rapêuticos. Apesar de ser isômero do THC, responsável por suas ações psicoativas.

Os efeitos farmacológicos do canabidiol são diferentes e muitas vezes opostos ao

THC, pois minimiza os efeitos da ansiedade, taquicardia, fome e sedação causada

pelo THC (RUSSO, 2011; SCHIER et. al., 2012).

Acredita-se que o CBD e o THC atuem em sinergia em doses terapêuticas,

tendo um melhor efeito quando estão juntos do que separados.

O CBD apresenta baixa afinidade pelo CB1, e atua como agonista inverso no

receptor CB2 (ZUARDI, 2008). Embora o seu mecanismo não esteja completamente

elucidado, é provável atue na mediação da sinalização dos endocanabinoides, atra-

vés da inibição da amida hidrolase de ácidos graxos, responsável pela hidrólise en-

zimática da anandamida, ou bloqueando sua recaptação (BISOGNO et al., 2001). O

CBD também funciona como agonista dos receptores de serotonina tipo 1A promo-

vendo o efeito ansiolítico (CAMPOS & GUIMARÃES, 2008; FOGAÇA et al., 2014;

MARINHO et al., 2015). O CBD ainda é capaz de ativar o TRPV1, que integram vá-

rios estímulos nociceptivos, responsável pela dor, o que explica os seus efeitos de

analgesia e anti-inflamatório (MATOS, et al. 2017).

O CBD apresenta efeitos medicinais significantes como anticonvulsivante, nas

desordens do movimento distônico, bem como nos sintomas da doença de Hunting-

ton, como sedativo para casos de insônia crônica, como um antipsicótico e anti-

inflamatório para o sistema imune, e analgésico (CARRANZA, 2009; NETZAHUAL-

COYOTZI-PIETRA, 2009).

2.3. TOXICIDADE A toxicidade aguda do THC é baixa. Os valores da dose letal média (LD50)

para administração oral de THC em ratos é de 800-1900 mg/kg, dependendo

do sexo e da espécie (OLIVEIRA, 2005).

Não foram observados casos de mortes por alcançar a dose letal máxima oral

de THC em cães (acima dos 3000 mg/kg de THC) e macacos (acima dos 9000

mg/kg de THC) e não foram reportados casos de mortes por overdose aguda em

humanos. No entanto, há uma ligação entre casos de infarto do miocárdio e o efeito

do THC na circulação, sendo que isto não é aplicável a pessoas saudáveis, mas su-

de 62

jeitos com doença coronária, com hipotensão ortostática ou aumento da frequência

cardíaca podem correr riscos (GROTENHERMEN, 2004).

O uso a longo prazo de cannabis não está associado com o aumento

da mortalidade de animais nem de humanos. Embora existam efeitos crônicos que

afeta o sistema imunológico e endócrino, trato respiratório (quando inalado) e psico-

lógico (GROTENHERMEN, 2007).

Acima de um limiar individual, o consumo de cannabis ou de THC isolada-

mente podem causar efeitos adversos, como prejuízo temporário na memória a curto

prazo, alterações nas funções cognitivas, diminuição da concentração, da atenção e

do reflexo motor, dificuldade de expressão verbal, risos imotivados, aumento da so-

ciabilidade, podendo persistir por dias após o consumo e ainda causar prejuízo no

sistema imunológico (KALANT, 2004). Altas doses de THC exercem efeitos de imu-

nossupressão na função linfocitária, incluindo estimulação da proliferação e aumento

da produção de interleucina-2 (ADAMS & MARTIN, 1996).

A probabilidade da cannabis causar dependência é baixa quando comparada

com opióides, tabaco, álcool e benzodiazepinas. No entanto, isso vai depender de

cada indivíduo, por estar relacionada com fatores genéticos e ambientais, sendo o

último relacionado com precocidade e consumo de tabaco, álcool e outras drogas

(ASHTO, 2001).

A tolerância ou dependência química é uma característica individual, e é

definida como a resistência criada pelo organismo aos efeitos de determinada droga,

onde o organismo adquire tolerância e necessita de doses cada vez maiores para

alcançar os mesmos efeitos antes conquistados com doses menores.

A tolerância induzida pelo consumo de cannabis deve-se a alterações farma-

codinâmicas, que pode ocorrer por diminuição da regulação dos receptores canabi-

noides ou dessensibilização dos mesmos. Ou ainda se houver interrupção abrupta

após doses elevadas. Além disso, podem levar a alterações no sistema autóno-

mo e cardiovascular, podendo diminuir a pressão intraocular, náuseas, suores, sali-

vação, febre, tremores, perda de peso, e causar alterações do sono e apetite, sendo

alguns desses sintomas observados horas depois da descontinuação do consumo e

o desaparecendo em poucos dias (GROTENHERMEN, 2007).

A cannabis em uma dose pequena proporciona alívio da ansiedade, efeito

analgésico e leve sonolência. Ao aumentar a dosagem pode causar ansiedade, e

de 62

talvez desencadear ou agravar um quadro psicótico, numa personalidade que tende

a este quadro (LONGENECKER, 1998; CONRAD, 2001).

2.4. FARMACOCINÉTICA A maior parte dos estudos de farmacocinética dos canabinoides são do THC,

e o seu grau de absorção vai depender da sua via de administração.

Os produtos à base de cannabis podem ser administrados por diversas vias, como

intravenosa, parenteral, retal e dérmica sendo as mais predominantes:

• Oral: em forma de extratos, cápsulas, comprimidos, spray ou ainda incorporada a

alimentos ou bebidas. A absorção dos canabinoides ocorre de forma lenta e irregular

com início do efeito de 30 a 60 minutos, atingem concentração máxima entre 1 e 5

horas, e alcança baixa biodisponibilidade sistêmica, aproximadamente 6%, devido

ao efeito de primeira passagem. A presença de alimentos e a destruição parcial pelo

suco gástrico influenciam na concentração plasmática, aumentando sua biodisponi-

bilidade (CHIANG & RAPAKA, 1987; DRUMMER, 2001; GROTENHERMEN, 2003;

BONFÁ, 2008).

O THC, por exemplo, devido a sua alta lipossolubilidade pode ser estocado no tecido

adiposo e ser liberado aos poucos no sangue em uso crônico (GASTON & FRIED-

MAN, 2017).

• Pulmonar: através de fumo, com cigarros contendo em média de 0,5 a 1,0 grama

da planta (maneira mais popular de consumo) ou vaporizado. A velocidade de ab-

sorção por esta via é muito mais rápida quando comparada com a via oral, devido a

extensa área de superfície alveolar e o alto fluxo sanguíneo do pulmão, com pico de

concentração plasmática alcançada dentro de 3-10 minutos. A biodisponibilidade

pela via pulmonar varia em aproximadamente 23-27% para usuários regulares e 10-

14% para usuários ocasionais (GROTENHERMEN, 2003; GASTON & FRIEDMAN,

2017).

A máxima concentração de THC no plasma ocorre em poucos minutos, mas

pode variar devido a diversos fatores que ocorrem durante o ato de fumar, como por

exemplo: a potência da cannabis fumada, perdas por processo de pirólise, perda de

THC pela corrente secundária e ainda, quantidade de THC retida no trato respirató-

rio superior (CHIANG & RAPAKA, 1987; PEREZ-REYES, 1990; SOUBHIA, 1999;

DRUMMER, 2001).

de 62

A distribuição de THC e seus produtos de biotransformação para os tecidos

está relacionada com suas propriedades físico-químicas.

Cerca de 90% do THC encontrado no sangue é distribuído para o plasma, se

ligando-se a proteínas plasmáticas, e os outros 10%, para as células vermelhas do

sangue. Após a absorção, o THC é rapidamente distribuído para os tecidos, pene-

trando prontamente em tecidos vascularizados como fígado, coração, pulmão, jeju-

no, rim, baço, glândulas mamárias, placenta, córtex adrenal, músculos, glândulas

pituitária e tireóide, resultando numa queda significativa na concentração plasmática.

Devido a sua lipofilicidade ocorre uma alta ligação em tecidos e áreas gordu-

rosas. A concentração de THC no tecido adiposo é cerca de 1.000 vezes maior que

a concentração plasmática, enquanto a concentração THC no cérebro é de 3 a 10

vezes a concentração plasmática (CHIANG & RAPAKA, 1987; GROTENHERMEN,

2003). A biotransformação do THC é complexa, com cerca de 20 produtos identifi-

cados. Envolve oxidação alílica, epoxidação, oxidação alifática, descarboxilação e

conjugação (CHIANG & RAPAKA, 1987; TURNER, 1990).

Sendo os 3 metabólitos mais importantes (Figura 8):

• 11-hidroxi−∆9-tetraidrocanabinol (hidroxi-THC ou 11-OH-THC): composto leve-

mente mais psicoativo que THC;

• Ácido 11-nor−∆9-tetraidrocanabinol-9-carboxílico (carboxi-THC ou THC-COOH):

produzido pela oxidação do 11-OH−∆9 -THC. É um composto polar e inativo;

• Ácido 11-nor−∆9-tetraidrocanabinol-9-carboxílico glicuronídeo (carboxi-THC glicu-

ronídeo): produzido pela conjugação do carboxi-THC com ácido glicurônico para ser

eliminado pela urina.

de 62

Figura 8. Metabolismo do THC, e seus principais metabólitos. Fonte: ALVES et al., 2015.

O THC é completamente biotransformado e excretado como produtos polares

supracitados. Aproximadamente 20% da dose é excretada na urina e 40% nas fe-

zes. O carboxi-THC é o principal produto de biotransformação eliminado como glicu-

ronídeo conjugado, embora cerca de 2% seja excretado como 11-hidroxi-THC (AL-

VES et al., 2015).

O carboxi-THC é um biomarcador, pois após ser excretado na urina, o mesmo

é detectável por 12 dias seguidos, com consumo moderado de cannabis, enquanto

que altas doses ou uso regular promovem tempo de detecção acima de 25 dias

(DRUMMER, 2001).

A média de depuração plasmática é de cerca de 605-980mL/min. Logo suge-

re-se que a proporção da biotransformação do THC seja claramente dependente do

fluxo de sangue para o fígado, e a inibição/ indução enzimática parece ter pequeno

efeito na depuração do THC (CHIANG & RAPAKA, 1987).

O perfil plasmático do CBD após administração intravenosa é semelhante ao

observado com o THC, assim como sua depuração, sua meia-vida e seu volume de

distribuição (CHIANG & RAPAKA, 1987). Assim como o THC, o CBD é extensamen-

te biotransformado, sendo o carboxi-CBD o produto de biotransformação mais abun-

dante no plasma. Entretanto, diferente do THC, o CBD é excretado pelas fezes em

de 62

maior parte (CHIANG & RAPAKA, 1987). Semelhante ao THC, os níveis plasmáticos

de canabinol (CBN) após administração intravenosa diminuem rapidamente. O CBN

é também extensamente biotransformado, sendo o carboxi-CBN seu principal produ-

to de biotransformação. Uma maior porcentagem de CBN absorvido é excretado pe-

las fezes, e uma menor porção é encontrada na urina (CHIANG & RAPAKA, 1987).

de 62

3. OBJETIVO 3.2. OBJETIVO GERAL

Propor técnicas para determinação de canabinóides por CLAE-EM em matri-

zes biológicas que possam ser empregadas em estudos farmacocinéticos.

3.3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar um levantamento bibliográfico dos métodos analíticos para identificação

e quantificação de canabinoides em matrizes biológicas por CLAE-EM;

• Comparar as vantagens e desvantagens dos métodos considerando simplicidade,

custo e parâmetros de confiança.

de 62

4. JUSTIFICATIVA Considerando a regulação do uso medicinal dos canabinoides, geralmente na

forma de extratos de cannabis torna-se necessário desenvolver métodos voltados

aos estudos de farmacocinética e monitorização terapêutica.

Embora vários trabalhos com compostos canabinoides tenham sido publicados

ao longo dos anos, a grande maioria tem foco na finalidade/aspecto forense, apre-

sentando certas limitações de aplicação na área terapêutica devido aos tipos de ma-

trizes biológicas utilizadas.

Por isso, apresentar a evolução dos estudos sobre o emprego da Cannabis sati-

va e seus derivados a fim de desenvolver futuramente uma metodologia de determi-

nação de seus metabólitos por CLAE-ES a partir da extração em matriz biológica e

desta forma, avaliar o teor para ajuste de dose e segurança do paciente, e também

para a monitorização terapêutica, algo inovador, necessário e urgente no Brasil.

de 62

5. METODOLOGIA 5.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Trata-se de uma revisão bibliográfica acerca dos métodos analíticos para

identificação e quantificação de canabinoides em matrizes biológicas, selecionando

artigos que atendam aos objetivos do trabalho (sessão 3). Para compor a revisão,

realizou-se uma análise crítica e minuciosa dos trabalhos disponibilizados incluindo

somente os trabalhos que estão de acordo com os critérios de inclusão.

Foram realizadas buscas em bases de dados nacionais e internacionais, para

obtenção de referências e artigos científicos publicados no período de 2000 a 2017.

Nas bases de dados eletrônicas: Science Direct, Portal CAPES, PubMed e SciELO e

Google acadêmico, utilizando os seguintes descritores ou combinação: “Cannabis”,

“cannabis medicinal”, “cannabis detection” ““cannabis method”, “cannabidiol determi-

nation”, “tetrahydrocannabinol determination”, “canabidiol determination”, “cannabi-

noids determination”, “marijuana method”, “humam plasm”, “chromatography”,“CLAE-

ES”, “HPLC-MS”, “spectrometry”, “pharmacokinetics cannabis”, “THC” e “CBD”.

5.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO Para seleção dos artigos foram utilizados os seguintes critérios de inclusão:

• Seleção dos trabalhos que obedeceram aos descritores supracitados;

• Artigos que contenham todos ou maior parte dos seguintes dados: analito, matriz,

extração, coluna, instrumento, fase móvel, limite de detecção e/ou quantificação,

linearidade e recuperação;

• Os critérios de exclusão foram:

• Trabalhos que não obedeceram à pesquisa através dos descritores e critérios su-

pracitados;

• Trabalhos que utilizam cabelo, saliva, leite, unha e mecônio como matriz biológi-

ca, por serem consideradas matrizes alternativas e não apresentarem aplicabilidade

em monitoramento terapêutico e baixa exatidão em estudos farmacocinética;

• Trabalhos que utilizam CG-EM, visto que esta metodologia em estudos de farma-

cocinética não diferencia as formas ácidas dos canabinoides.

de 62

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após pesquisar trabalhos nas revistas eletrônicas descritas na sessão 5.1

com o descritor “cannabis” foram encontrados 494.000 resultados no google acadê-

mico, 133.668 resultados no Portal CAPES, 30.945 na ScienceDirect, 17.139 na Pu-

bmed, e 191 no SciELO. O google acadêmico foi a base de dados que forneceu o

maior número de resultados, sendo também pesquisados os descritores “cannabis

medicine” com 284.000 resultados e “cannabis detection” com 79.400 resultados.

Através dessa pesquisa, foi possível verificar o crescimento de publicações refe-

rentes ao termo “cannabis” nos últimos anos, fato já mostrado anteriormente na figu-

ra 4 e evidenciado mais uma vez nos gráficos 1 e 2.

Gráfico 1 – Publicações entre 1841 e 1980 , sobre o termo ‘”cannabis” na base de dados Scielo.

Gráfico 2 – Publicações entre 2010 e 2016 , sobre o termo ‘”cannabis” na base de dados Scielo.

de 62

Apesar da pesquisa indicar o ano de 1837 como início dos primeiros traba-

lhos, foi somente a partir de 1964 com o trabalho de Mechoulam que as pesquisas

sobre cananbis e seus componentes foram impulsionadas.

6.1. SELEÇÃO DOS ESTUDOS A fim de restringir somente os documentos que se referem ao tema proposto

neste trabalho, gerou-se o gráfico (Gráfico 3), cujos números dos resultados totais

foram obtidos na base de dados “Science Direct” com o descritor “cannabinoids de-

tection” foram encontrados 7.202 resultados. Sendo possível observar que o tema

proposto teve aumento no número de publicações nos últimos anos.

Gráfico 3 – Publicações entre 2010 e 2017 , sobre o termo ‘”cannabinoids detection” na base de

dados Science Direct.

O gráfico 4 apresenta o número total de artigos encontrados, considerando

todos os descritores, bases de dados e documentos repetidos, totalizando 11.288

documentos, e destes, após análise apenas 67 foram incluídos no presente trabalho,

15 incluídos nos resultados e destes, 8 foram os artigos de maior relevância.

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Gráfico 4 – Obtenção do número total de documentos encontrados, incluidos no trabalho, incluidos

nos resultados e seleção dos mais relevantes

A Tabela 1 mostra os principais trabalhos em que se determinou canabinoides por

CLAE-EM por diferentes técnicas de extração e matrizes biológicas.

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Tabela 1 – Técnicas analíticas utilizadas na determinação de canabinoides em diferentes matrizes biológicas. TABELA 1: Técnicas analíticas utilizadas na determinação de canabinóides em diferentes matrizes biológicas

ANALITO MATRIZ EXTRAÇÃO SOLV. EXTRAÇÃO COLUNA FASE MÓVEL LD LQ LINEARIDADE RECUPERAÇÃO REFERÊNCIA

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH Plasma EFS Ácido acético

Luna PhenylHe-xyl C18 (50 x 2mm - 3μm)

Acetonitrila/ água (70/ 30%) e água/ acetato

de amônio 5mM

THC e 11-OH-THC: 0.2 ng/mL THC-COOH 1.6

ng/mL

THC e 11-OH-THC: 0.8

ng/mL THC-COOH: 4.3 ng

/mL

THC e 11-OH-THC: 1 - 100

ng/mL e THC -COOH: 5 − 500

ng/mL

NI MARALIKOVA et al., 2004

THCA Sangue total EFS Água/acetonitrila (60/40%)

Luna C8 Phe-nomenex (50 x 2.0mm - 3µm)

Água/acetato de amônio 5mM e Ace-

tonitrila 2.5 ng/mL 7.5 ng/mL 0.5 - 75 ng/mL NI JUNG et al.,

2007

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD/ CBN

Plasma/ urina EFS Metanol/ ácido acético

(50/50 %)

Synergi MAX-RP C12 column (2 ×75 mm - 4μm)

Água/formiato de amônio 10mM e

Acetoitrila/formiato de amônio 10mM

NI 0.2 ng/mL 0.2–100 ng/mL 47.7% - 77.5% GRAUWILEr et al., 2007

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD/ CBN

Sangue total EFS Acetonitrila/ ácido acético

Ultra Biphenyl (100 × 2.1 mm -

5μm)

Metanol/acetonitrila (15/85%) e

Água/acetato de amônio 10mM

NI 0.5 ng/mL 1.0–100 μg/l 50.5% - 93.9% SCHWOPE et al., 2011

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH Plasma EFS Hexano/acetato de

etila (90/10 %)

XTerra MS C18 (2.1 × 150 mm -

3.5μm)

Metanol/carbonato de amônio 10 mM

THC: 0.09 ng/mL - 11-OH-

THC: 0.08 ng/mL - THC-COOH: 0.91

ng/mL

THC: 0.16 ng/mL - 11-

OH-THC: 0.15 ng/mL - THC-COOH: 3.24

ng/mL

THC e 11-OH-THC: 1 -10 ng/mL - THC-COOH: 2,5

-100 ng/mL

66% - 93% BOUCHENE et al.,2013

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD/ CBN

Urina EFS Metanol/ ácido acético (50/50 %)

Kinetex C18-XB (50 × 2.1mm -

2.6μm)

Metanol/acetato de amônio 1.25mM e Água/acetato de amônio 1.25mM

NI 10 ng/mL 250–2500 ng/mL 65% - 85% MONTESANO et al, 2014

THC/ CBD/ THCA/ CBN Sangue total EFS Acetonitrila

Acquity UPLC HSS C18 (2.1 ×

100 mm - 1.8 μm,)

Água/ ácido fórmico 0,05% e Metanol/ acetonitrila/ ácido

fórmico (50/50/0,05%)

NI

THC, CBD, CBN e THCA 0.2 μg/L - 11-

OH-THC e THC-COOH

0.5 μg/L

1–10 μg/L 90 - 101% SØRENSEN et al., 2017

Nota: CBD - Canabidol; CBN - Canabinol; LD - Limite de detecção; LQ - Limite de quantificação; EFS - Extração em fase sólida; ELL - Extração líquido-líquido; NI - Não informado; THC - Tetrahidrocanabinol; THCA - Ácido tetrahidrocanabinólico; THC-COOH - Carboxi-THC; 11-OH-THC - Hidroxi THC.

de 62

Continuação Tabela 1 – Técnicas analíticas utilizadas na determinação de canabinoides em diferentes matrizes biológicas.

TABELA 1: Técnicas analíticas utilizadas na determinação de canabinóides em diferentes matrizes biológicas ANALITO MATRIZ EXTRAÇÃO SOLV. EXTRAÇÃO COLUNA FASE MÓVEL LD LQ LINEARIDADE RECUPERAÇÃO REFERÊNCIA

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD/ CBN

Plasma/ urina ELL

Plasma: Ácido Fosfó-rico/acetonitrila Urina:

Acetato de Etila

Synergi MAX-RP

C12 column (2 ×75mm - 4μm)

Formiato de amônio 10mM e Acetonitri-

la/formiato de amônio 10mM

Plasma 0.1 ng/mL - Urina CBD, THC e

THC-COOH: 1 ng/mL, 11-OH-THC: 2 ng/mL

e CBN: 3 ng/mL

Plasma 0.2 ng/mL - Urina 0,5 ng/mL

CBD, THC e THC-COOH, 1 ng/mL

11-OH-THC e CBN

0.2 - 100 ng/mL 61,4% - 78,7% GRAUWILE et al., 2006

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH

Sangue total ELL Hexano/ Acetato de

etila (90/10 %)

Xbridge C18 (150 × 2.1mm -

3.5μm)

Metanol/água/ácido fórmico (80/20/0,1%) NI

THC: 0.5 g/L 11-OH-THC: 1 g/L e

THC-COOH: 2 g/L

THC: 0.5–40 g/L 11-OH-TC: 1 -40 g/L e THC-

COOH: 2 - 160g/L

> 105% FERNANDEZ et al., 2008

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD/ CBN

Sangue total/

plasma ELL Acetonitrila/ hidróxido

de sódio 10M

Atlantis C18 (2.1 × 150 mm -

3µm) Água/acetonitrila/ácido fórmico (50/50/0,2%) NI 0.25 ng/mL 0.25–100 ng/mL 90.9% - 112.4% LACROIX et al.,

2012

THC/ 11-OH-THC/

THC-COOH

Sangue total ELL Hexano/acetato de

etila (90/10 %)

Poroshell 120 EC-C18 (2.1 × 75mm - 2.7µm)

Água/ácido fórmico 0,1% e Acetonitri-

la/ácido fórmico 0,1%

THC e 11-OH-THC:1ng/mL

- TH-COOH:2.5ng/mL

THC e 11-OH-THC:1ng/mL - TH-COOH.5

ng/mL

THC e 11-OH-THC:1–100 ng/mL e TH-COOH:5–500

ng/mL

NI AGILENT

TECHNOLOGIES, Applicatio Note,

2013

THCA Sangue

total/ plasma

ELL Água/acetonitrila/ácido fórmico (60/40/0.1 %)

Luna C8 Phe-nomenex (100 x 2.0mm - 3µm)

Água/ácido fórmico 0,1% e Acetonitri-

la/ácido fórmico 0,1% 0.3 ng/mL 1.0 ng/mL 1.0 - 200 ng/mL > 85,4% RAIKOS et al.,

2014

CBD /THC Plasma ELL Hexano ACE C18-PFP (150 × 4.6mm -

3µm) Acetonitrila/água

(62/38%) NI 10 ng/mL 7.5 -10.000 ng/mL 86.7 % - 94.6% ZGAIR et al.,

2015

THC/ THCA/

THC-COOH

Sangue total ELL Hexano/ Acetato de

etila (80/20 %)

Raptor Biphenyl (50 × 2.1mm -

2.7μm)

Metanol/ ácido Fórmi-co 0,1%

THC e THC-COOH 0.5 ng/mL e THCA

2.5 ng/mL NI

THC e THC-COOH 1 -32

ng/mL - THCA 5 - 160 ng/mL

NI TISCIONE et al., 2016

THC /11-OH-THC/

THC-COOH/

CBD

Plasma ELL Acetonitrila/ ácido Fórmico

Aquity U-HPLC BEH C18 (2.1 × 50 mm - 1.7µm)

Água/ácido fórmico 0,1% e Metanol/ácido

fórmico 0,1% NI 1.56 ng/mL 1.56 - 100

ng/mL > 90% JAMWAL et al., 2017

Nota: CBD - Canabidol; CBN - Canabinol; LD - Limite de detecção; LQ - Limite de quantificação; EFS - Extração em fase sólida; ELL - Extração líquido-líquido; NI - Não informado; THC - Tetrahidrocanabinol; THCA - Ácido tetrahidrocanabinólico; THC-COOH - Carboxi-THC; 11-OH-THC - Hidroxi THC.

de 62

6.2. CANABINOIDES: DETERMINAÇÃO O desenvolvimento do método é a etapa mais importante nos estudos farma-

cocinéticos. O método de quantificação deve apresentar sensibilidade, especificida-

de e seletividade para cada analito, precisão e exatidão, além de ser relativamente

simples, de modo a minimizar os erros (GONÇALVES, 2005). Fatores de diversas

naturezas devem ser estudados, e por isso é necessário o acúmulo de conhecimen-

to sobre as características físico-químicas do analito, substância alvo da análise,

bem como das suas características farmacocinéticas (WONG, 1982; LACROIX et al.,

2012).

Ao planejar desenvolvimento de metodologia deve-se levar em consideração

as principais características dos canabinoides como: são substâncias apolares, com

baixa solubilidade em água (por isso maior eliminação nas fezes), biotransforma em

meio ácido e alcalino, instável à luz e aumento de temperatura (os ácidos como

THCA ou CBDA tem tendência a se descarboxilar em alta temperatura), adere aos

vidros e plásticos, apresenta baixa recuperação devido sua lipoficidade.

Os canabinoides e seus metabólitos podem ser mensurados em diferentes

matrizes biológicas e por diferentes métodos analíticos. Por isso é necessário pes-

quisar diferentes metodologias já empregadas na literatura e conhecer os parâme-

tros que envolvem o desenvolvimento

6.2.1. ESTUDOS DE FARMACOCINÉTICA: MONITORIZAÇÃO TERAPÊUTICA E BIODISPONIBILIDADE

A farmacocinética descreve a cinética da absorção de fármacos através das

diversas fases pelas quais o fármaco passa até atingir seu sítio de ação após a ad-

ministração. Pode ser definido resumidamente pelo sistema LADME que significa

liberação, absorção, distribuição, metabolização e excreção, ou seja os fenômenos

que o fármaco vai ser submetido para atingir o sítio de ação (RITSCHEL, 1980).

Os estudos de farmacocinética envolvem aspectos experimentais e teóricos.

Experimentais relacionados a técnicas de amostragem de material biológico (con-

templando coleta, manipulação e a estabilidade das amostras) e desenvolvimento de

métodos analíticos para quantificação dos fármacos e metabólitos. Os aspectos teó-

ricos envolvem os modelos farmacocinéticos que predizem a disposição (distribuição

e eliminação) do fármaco após sua administração, e ainda métodos estatísticos para

de 62

estimar os parâmetros farmacocinéticos e interpretar os dados. Trata-se de uma hi-

pótese que se utiliza de conceitos matemáticos para descrever relações quantitati-

vas, para tentar traduzir de maneira simplificada o complexo sistema de cinética do

fármaco no organismo. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados experi-

mentalmente a partir da quantificação do fármaco no plasma, em diferentes períodos

de tempo (RITSCHEL, 1980).

Os estudos servem para conhecer os modelos farmacocinéticos, que por sua

vez, são utilizados na farmacocinética clínica (na monitorização terapêutica), para

prever a concentração do fármaco nos tecidos, plasma e urina, para estimar a pos-

sibilidade de acúmulo de fármaco e/ou metabólitos, para correlacionar a concentra-

ção do fármaco com atividade farmacológica ou toxicológica, para descrever como

alterações fisiológicas ou patologias alteram a ADME do fármaco, e para calcular o

melhor esquema terapêutico (SHARGEL, 1999).

A monitorização terapêutica de fármacos é uma área da farmacocinética clíni-

ca, é um instrumento para assegurar o máximo de eficácia e o mínimo de efeitos

tóxicos da terapia medicamentosa. Avalia de maneira individual, dada a variabilidade

entre sexo, idade, raça, genética e etc.

Desta forma, deve ser realizada através da determinação de dosagem sérica

(por sangue ou plasma) de um fármaco, uma vez que os efeitos terapêuticos e tóxi-

cos são melhores relacionados à concentração plasmática do que à dose adminis-

trada. E deve ainda ser associado à avaliação clínica, a fim de otimizar a sua poso-

logia (DUARTE, 2014).

A monitorização terapêutica é utilizada principalmente nas seguintes situa-

ções: terapias a longo prazo (quando o índice terapêutico é baixo), quando não há

relação dose-resposta previsível, politerapias, para avaliar adesão do paciente, para

ajustar a dose de acordo com a resposta e efeitos colaterais, além de outras indica-

ções clínicas específicas (DUARTE, 2014).

Para monitorização terapêutica é necessário pesquisar as características far-

macocinéticas, definir a janelas terapêuticas, determinar os parâmetros analíticos e

de amostragem do material biológico em laboratório de patologia ou leito hospitalar,

validar as metodologias analíticas conforme legislação vigente, e se possível, por

ensaios clínicos controlados e randomizados. Para tal, é importante método com alta

sensibilidade, com alto coeficiente angular, para que a reta tenha uma maior inclina-

ção, e desta forma tenha maior capacidade de detectar pequenas variações de con-

de 62

centração. Pois na monitorização é de extrema necessidade detectar pequenas alte-

rações nas concentrações plasmáticas, pois podem ocasionar ineficácia clínica ou

efeitos tóxicos (CHASIN, 1998).

A biodisponibilidade é um dos parâmetros da farmacocinética. Segundo a

ANVISA é definida como: “a velocidade e a extensão de absorção de um princípio

ativo em uma forma de dosagem, a partir de sua curva concentração/tempo na circu-

lação sistêmica ou sua excreção na urina". Ou seja, determinar a quantidade de fár-

maco que deve ser administrado para se obter o efeito terapêutico (BRASIL,1999).

Os estudos de biodisponibilidade objetivam estabelecer o esquema terapêuti-

co e os parâmetros farmacocinéticos.

Um dos parâmetros avaliados é a área sob a curva (ASC), que é um gráfico

da concentração plasmática em função do tempo (do zero ao infinito), e corresponde

a quantidade de fármaco biodisponível. É o parâmetro mais importante na determi-

nação da biodisponibilidade, pois constitui a fração do fármaco absorvido após ad-

ministração de dose única do medicamento, e reflete a quantidade total de fármaco

inalterado que atinge a circulação sistêmica. Outro parâmetro é o Cmax, que é o pico

da concentração plasmática e representa a concentração plasmática máxima obtida

após administração extravascular. A importância do Cmax está relacionada à eficácia

e à segurança. E há ainda o Tmax, parâmetro que corresponde ao tempo em que a

concentração plasmática do fármaco atinge a concentração máxima após a adminis-

tração. E serve para prever a velocidade de absorção (BRASIL,1999).

Estudos de biodisponibilidade são realizados obrigatoriamente para aprova-

ção de um novo princípio ativo (registro de um novo produto) e para aprovação de

uma nova formulação, com a finalidade de estabelecer os parâmetros farmacocinéti-

cos.

O registro de novos medicamentos somente é obtido após estudos de biodis-

ponibilidade realizados no Brasil ou no exterior, por centros devidamente certificados

pela ANVISA, conforme preconizado na RDC nº 60/2014. Nestes estudos, uma mo-

nitorização médica rigorosa durante toda fase de investigação do fármaco faz-se

necessária. É realizada em 3 etapas: clínica, analítica e estatística.

Segundo o manual de boas práticas de Biodisponibilidade/Bioequivalência, para

registrar um novo medicamento, é mandatório avaliar sua eficácia e segurança atra-

vés de estudos pré-clínicos, realizados in vitro para avaliação da segurança farma-

cológica e toxicocinética, e clínicos que devem ser realizados em 4 fases:

de 62

• Fase I: É o primeiro estudo em seres humanos. Envolve cerca de 20 a 50 indiví-

duos, sendo geralmente voluntários sadios, de acordo com a classe do fármaco a

ser avaliada. São estudos de farmacologia clínica, nos quais se busca avaliar suas

características de segurança e o perfil farmacocinético.

• Fase II: Estes estudos constituem a primeira administração do medicamento a

pacientes, envolvendo cerca de 50 a 300 indivíduos. Têm como objetivo estudar o

potencial terapêutico e os efeitos colaterais do medicamento, além de estabelecer as

suas relações dose-resposta para empregá-las em ensaios terapêuticos mais defini-

tivos.

• Fase III: São estudos terapêuticos multicêntricos, envolvendo no mínimo 250 indi-

víduos, avaliando a eficácia da droga, sua segurança e comparando as com placebo

ou drogas já disponíveis no mercado com a mesma finalidade terapêutica. Explo-

ram- se nesta fase o tipo e perfil das reações adversas mais frequentes.

• Fase IV: Geralmente, são estudos de vigilância pós-comercialização, para estabe-

lecer o valor terapêutico, o surgimento de novas reações adversas e/ou confirmação

da frequência de surgimento das já conhecidas, e as estratégias de tratamento. São

realizados com base nas características com que foi autorizado o medicamento e/ou

especialidade medicinal.

Sendo os 3 primeiros realizados antes da comercialização do medicamento. Em al-

guns casos, a fase II pode apresentar dados que sejam suficientes para comprova-

ção da eficácia e segurança do medicamento, excluindo a fase III.

6.2.2. MATRIZ BIOLÓGICA Segundo a RDC nº 27/2012, matriz biológica é todo meio de origem biológica

no qual os analitos em estudo serão quantificados. Praticamente todos os fluidos

orgânicos podem ser utilizados para análise farmacocinética, como é o caso do

plasma, sangue, soro, saliva, fluido espinal e urina.

Entretanto, todas as matrizes biológicas são complexas e contêm grande

quantidade de compostos endógenos, por exemplo, proteínas presentes no soro,

lipídeos, dentre outros, que podem interferir no método analítico (GONÇALVES,

2005). O conhecimento dessas matrizes e da farmacocinética do analito é que vai

delinear o desenvolvimento das técnicas de extração e detecção utilizadas para as-

segurar a especificidade / seletividade para a determinação do limite de quantifica-

ção e da faixa linear. Para a dosagem de fármacos a partir de uma matriz complexa,

de 62

faz-se necessário um pré-tratamento das amostras, pois os componentes endóge-

nos presentes são potenciais interferentes em análises cromatográficas (QUEIROZ

et al., 2001). A escolha da matriz depende de diversos fatores que se relacionam com a

substância objeto de análise, integridade da amostra submetida à análise, tipo de

análise, facilidade de coleta, e, as considerações analíticas e de ensaio juntamente

com a interpretação dos resultados. O sangue, plasma e a urina são as matrizes

convencionais mais prevalentes e utilizadas para realização das análises com méto-

dos bioanalíticos (GOMES, 2013).

O sangue é uma matriz relativamente complexa, constituído em grande parte

de água (cerca de 80%), proteínas solúveis, gorduras, sais e células suspensas, e

por isso requer maiores gastos com extração. Fornece de forma apropriada a corre-

lação da concentração da droga no sangue com o estado clínico do indivíduo, além

disso, o uso da razão droga original/metabólito pode ser bastante útil para predizer o

período decorrido desde a administração. Possui período de detecção curto, pode

requerer baixo volume, dependendo do método. Contudo, apresenta coleta invasiva

com possibilidade de contaminação e necessidade de profissional treinado, além de

possuir janela de detecção restrita com relação às drogas de abuso, já que esta

podem ser rapidamente metabolizadas, dependendo da meia vida biológica da subs-

tância e via de administração, no caso da cannabis, e desta forma, os compostos

investigados podem ser encontrados em maiores concentrações na urina (BULCÃO

et al., 2012).

Para coleta do sangue é indispensável a adição de anticoagulante e conser-

vante, e a escolha do anticoagulante depende dos analitos a serem investigados. Os

mais utilizados são: heparina, que pode interagir com alguns fármacos, e o EDTA,

que é um agente complexante, não indicado em casos em que os analitos são me-

tais ou compostos organometálicos (BORDIN et al., 2015).

A amostra de sangue pode ser avaliada na forma de sangue total, plasma

(que constitui do sobrenadante obtido do sangue adicionado de anticoagulante, com

o conteúdo precipitado) ou o soro (que constitui o plasma sem os fatores de coagu-

lação, podendo ser obtido pela centrifugação do sangue já coagulado. Em relação à

amostra sorológica, sua obtenção inclui a etapa de coagulação sanguínea, o que

pode envolver processos de hemólise e alterar os resultados. Já o sangue total pos-

de 62

sui grande quantidade de células e proteínas que também dificultam a predição da

concentração específica do princípio ativo (TOZER & ROWLAND, 2009).

O plasma é a parte líquida do sangue, corresponde a 55% do seu total. Pos-

sui grande utilização em métodos bioanalíticos devido a sua correlação entre a dose

e concentração plasmática do fármaco/substância. Pois a maioria dos fármacos li-

gam-se as proteínas plasmáticas (BORDIN et al., 2015).

A urina é um ultrafiltrado do sangue formado continuamente pelos rins a partir

do qual foram reabsorvidas substâncias essenciais ao metabolismo do organismo,

como glicose, aminoácidos e água. Em sua composição constam substâncias quími-

cas orgânicas (como ureia, ácido úrico e creatinina) e inorgânicas (como íons cloreto

e sódio) dissolvidas em água. Como principal via de eliminação de substâncias, esta

matriz é geralmente alvo de investigação de metabólitos. Possui como pontos positi-

vos o fato de ser uma coleta não invasiva, disponibilidade de grandes volumes de

amostra, e alta concentração (BULCÃO et al., 2012).

No entanto, a urina apresenta como desvantagens a presença de muitos me-

tabólitos (muitas substâncias conjugadas já que é a via final de eliminação da maio-

ria dos fármacos e xenobióticos), período de detecção que é somente após a meta-

bolização e dependendo do método, uma etapa adicional na análise, de hidrólise,

que pode ser enzimática e que é extremamente cara, ou por hidrólise alcalina, que

apesar de mais barata apresenta maior degradação de compostos menos estáveis,

um risco para os canabinoides. E é uma opção ruim para farmacocinética pois para

fazer amostragem de vários tempos de coleta, o voluntário terá que urinar em inter-

valos muito curtos, como de 5 em 5 minutos, e se isso não ocorrer padronizado em

todos os voluntários pode inviabilizar o estudo (SPINELLI, 1995).

O fluido oral, ou saliva, é uma mistura de células da mucosa bucal, restos de

alimentos e saliva, secretada pelas glândulas presentes na mucosa bucal, as molé-

culas são transferidas do sangue para a saliva por ultrafiltração ou difusão passiva,

podendo ser detectadas nesta matriz na forma não-metabolizada. Porém, esta in-

corporação de drogas na saliva é restringida para moléculas de alto peso molecular,

drogas ionizadas ou ligadas a proteínas plasmática. Ainda apresenta desvantagens

importantes como baixo quantitativo de amostra por dia, e consequentemente, baixa

concentração o que torna difícil detecção (BORDIN et al., 2015).

O cabelo é uma matriz biológica complexa composta de 65% a 95% de prote-

ína queratina, de 15 a 35% de água, de 1 a 9% de lipídios e ainda por uma pequena

de 62

parcela de minerais. Por isso, necessita de etapa de digestão da amostra antes da

extração para liberação dos analitos da matriz. O cabelo demora a acumular subs-

tâncias, então é necessário que o cabelo tenha no mínimo um comprimento médio

para fazer coleta do primeiro terço em diante, sendo difícil haver voluntários dispos-

tos. Além de ser mais dificultosa a extração por necessitar de uma etapa de desna-

turação proteica. E de um método com alta sensibilidade devido as baixas concen-

trações (BULCÃO et al., 2012; BORDIN et al., 2015).

Estudos de farmacocinética objetivam determinar ou acompanhar a correla-

ção dose/ concentração por tempo, por isso preferencialmente são usados como

matrizes biológica o sangue total e o plasma. Sendo o plasma a melhor opção caso

o fármaco/substância esteja ao menos 90% ligado as proteínas plasmáticas, sendo

possível ainda contemplar os metabólitos. Possui vantagens como o fato do fármaco

se encontrar livre (não conjugado como no caso da urina) e apresentar alta concen-

tração pouco tempo após administração, e ainda ser uma das matrizes mais limpas,

frente as demais citadas. Somente quando o fármaco se ligar intracelularmente, e a

porcentagem de ligação plasmática for baixo, é indicado a matriz sangue porque

contempla as duas matrizes (BORDIN et al., 2015).

As demais matrizes apresentam maior aplicabilidade para estudos toxicológi-

cos ou forenses.

6.2.3. DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO Considerando os métodos analíticos que a literatura de um modo geral consi-

dera aplicáveis na identificação e quantificação, a cromatografia líquida de alta efici-

ência (CLAE) e cromatografia gasosa (CG) são as mais descritas para determinação

de canabinoides.

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas mais emprega-

das. Se baseia na separação pela afinidade dos analitos entre a coluna preenchida

de micro-partículas (fase estacionária) e o solvente empregado na fase móvel sob

alta pressão.

Apresenta vantagem de ser adequada a análise de compostos polares sem

necessidade de derivação e termolábeis, considerando que não é necessária a va-

porização dos analitos, sendo estes dissolvidos na fase móvel. A detecção pode ser

por acoplamento ao detector de arranjo de diodos (DAD) que identifica a substância

de 62

por espectroscopia na região do visível ou ultravioleta (UV), e ainda pode ser aco-

plada ao espectrômetro de massas (ES) (GIUDICE, 2017).

Na CLAE a separação é feita por colunas cromatográficas, que tem sua efici-

ência mensurada pelos pratos teóricos, no qual quanto menor a partícula, menor a

altura dos pratos teóricos, maior número de pratos teóricos e maior eficiência. Con-

tudo, além da eficiência deve-se buscar também tempo de análise ideal, e colunas

com maior comprimento aumentam o tempo de corrida, porém aumenta também a

separação, que é positiva em caso de grande quantidade de interferentes, embora

aumento o gasto de solventes e consequentemente o custo. Pode ter diversos tipos

de fase estacionária, que são obtidas pela reação dos grupos silanois da sílica com

compostos contendo grupos polares (fase normal) ou não polares (fase reversa),

sendo a última mais usada, no qual o analito mais polar elui primeiro, seguidos pelos

outros em ordem decrescente de polaridade, separando os compostos (CRQ- IV

REGIÃO, 2010).

Alguns métodos utilizam colunas menores de comprimento e partícula, que

por utilizar maior pressão diminui o consumo de solvente e aumenta a resolução.

Mas apenas podem ser utilizadas em equipamentos do tipo CLUE (cromatografia

líquida de ultra eficiência) que é uma tecnologia mais moderna e cara.

A cromatografia gasosa é uma técnica baseada na separação dos analitos de

acordo com sua afinidade entre a fase estacionária, coluna capilar, e a fase móvel,

um gás inerte. Esta técnica requer que os compostos a serem analisados sejam

termoestáveis e voláteis ou volatilizáveis para que possam ser eluídos pela fase mó-

vel e detectados adequadamente. A amostra é introduzida por injetor aquecido (com

auxílio de uma micro-seringa), onde é vaporizada e transferida com o auxílio do gás

de arraste (fase móvel) à coluna cromatográfica é colocada dentro de um forno pré-

aquecido. Os componentes são eluídos e conduzidos ao detector conectado na saí-

da da coluna. O detector emite um sinal elétrico que é registrado graficamente sob a

forma de picos, cujas áreas são proporcionais às concentrações dos analitos (PEN-

TEADO et al., 2008). Ele pode ser acoplado ao MS como detector.

É normalmente mais utilizado para compostos com alta volatilidade do analito

e termicamente estável, e em casos de fármacos sem essas características, se faz

necessária a técnica de derivatização, para aumentar a volatilidade (SPINELLI,

1995).

de 62

O espectrômetro de massas baseia-se na separação dos íons pela sua razão

massa/carga (m/z) e detecta qualitativamente e quantitativamente a abundância de

seus respectivos íons de m/z, gerando os espectros de massa com a intensidade

dos picos e a amplitude do ruído. Existem ainda outros critérios de identificação, es-

tabelecidos na legislação, que as metodologias por CLAE/EM/EM devem cumprir,

como por exemplo, variação permitida nos tempos de retenção relativos e as razões

entre os ións de m/z (CARVALHO, 2011).

O padrão ouro para detecção e quantificação em estudos farmacocinéticos é

a CLAE-EM, pois essa combinação alia a capacidade de separação da CLAE, pos-

sibilitando compostos mais limpos no espectrômetro de massas, junto a capacidade

de identificação do EM. Sendo muito vantajoso, visto que compostos com caracterís-

ticas semelhantes ou idênticas de retenção, têm espectro de massas diferentes, po-

dendo assim serem diferenciadas, sendo particularmente necessário para monitorar

mais de um analito na mesma amostra, como a proposta deste trabalho (CASSIA-

NO, 2009).

A CLAE é particularmente interessante para determinação de canabinoides,

que são compostos não voláteis e termicamente instáveis, ao contrário do CG. Ainda

apresenta boa seletividade, embora inferior ao CG, porém diminui o tempo de análi-

se, possibilita menor limite de detecção e necessidade de menor quantidade de

amostra. Não necessita de derivatização, que é uma etapa crítica, pois não é espe-

cífica, pois não tem como derivatizar apenas a substância desejada, e sim todos os

demais componentes das matrizes biológicas, bem como substâncias interferentes,

e desta forma, prejudica a especificidade e seletividade do método. Embora mesmo

em CLAE pode ser necessário utilizar a técnica para transformar o analito em um

derivado mais estável, como por exemplo, ácido carboxílico em éster. Mas de manei-

ra geral, os métodos em CLAE exigem apenas maior refinamento da etapa de extra-

ção e com isso, maior gasto com coluna e solventes (SCHWOPE et al., 2011; LA-

CROIX et al., 2012; ZGAIR et al., 2015).

Todos os métodos incluídos no resultado utilizaram coluna de fase reversa,

que é uma boa opção para canabinoides, pois garante boa separação dos analitos,

que são majoritariamente apolares. A maioria dos trabalhos utilizaram fase A com-

posta por água purificada com pH tamponado por aditivo (ex: ácido fórmico, acetato

de amônio) misturado em diferentes proporções com fase B composta por solvente

orgânico (ex: metanol ou acetonitrila) em gradiente ou não. Grande parte utilizou co-

de 62

luna C18 (octadecilsilano), que possui boa interação com partículas, boa separação,

e bom preço, visto que existe vários modelos no mercado.

6.2.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO As técnicas mais comumente utilizadas para extração e/ou pré-concentração

dos analitos presentes na matriz biológica são extração líquido-líquido (ELL), extra-

ção em fase sólida (EFS).

A ELL baseia-se na partição da amostra entre duas fases imiscíveis (orgânica

e aquosa), uma fase que contém o analito, e uma fase a qual será colocada em con-

tato com ela. Desta forma, ocorrerá uma distribuição do analito entre as duas fases,

que poderá passar por mais processos de extração ou não. A eficiência da extração

depende da afinidade do soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do

número de extrações (LANÇAS, 2008).

A EFS é a técnica mais empregada e baseia-se nos mecanismos de retenção

idênticos aos envolvidos em cromatografia líquida em coluna, pois emprega adsor-

ventes compactados em cartuchos, normalmente em forma de seringa, e são utiliza-

das para extração e pré-concentração.

O cartucho mais utilizado para canabinoides é composto por sílica como adsorvente.

O procedimento de extração é dividido em cinco etapas: ativação do adsorvente pa-

ra deixar os sítios ativos disponíveis; condicionamento do adsorvente com solvente

adequado para ajustar as forças do solvente de eluição com o solvente da amostra;

introdução da amostra, quando ocorre a retenção do analito e, eventualmente de

alguns interferentes; limpeza da coluna para retirar os interferentes menos retidos

que o analito e, por fim a eluição e coleção do analito (QUEIROZ et al., 2001). Exis-

tem ainda variações da técnica como microextração em fase sólida (MEFS) e EFS

online quando é acoplado diretamente no CLAE.

Na realidade do Brasil e de outros países em que não há tantos recursos para

pesquisa, a técnica EFS é praticamente utilizada quando não há possibilidade de

fazer por outra metodologia. Visto que o custo para extrair uma amostra por fase

sólida é em média dez vezes maior que o custo por ELL, mesmo consumindo maior

quantidade de solvente. Numa cotação atual, 50 unidades de cartucho da marca

Chromabond® custa em média 400 reais, sendo as mesmas não reutilizáveis, tor-

nando-se muito oneroso, visto que esse número corresponde a aproximadamente

10% do número total de amostras de um estudo farmacocinético.

de 62

A maioria dos trabalhos solubilizaram a solução estoque do padrão de refe-

rência em metanol. Realizaram a extração líquido-líquido com hexano, misturado ou

não com acetato de etila e éter etílico, originando um extrato limpo. Esses solventes

são de fácil aquisição e custo moderado, sendo reprodutível (SPINELLI, 1995; FER-

NANDEZ et al., 2008 LACROIX et al., 2012; ZGAIR et al., 2015; TISCIONE et al.,

2016; JAMWAL et al., 2017). Muitos trabalhos em substituição a EFS, utilizaram uma opção interessante e

viável, que é concentrar o extrato após a extração líquido-líquido, através de um

evaporador sob fluxo de Nitrogênio, e ainda apresenta como vantagem para o méto-

do a possibilidade de determinar concentrações muito baixas, além de fornecer uma

amostra mais limpa, com menor efeito matriz (CAMARGO, 2008; LACROIX et al.,

2012; RAIKOS et al., 2014; TISCIONE et al., 2016; ZGAIR et al., 2015). Uma técnica de extração pouco mencionada nos artigos revisados, e muito

interessante para se testar no desenvolvimento, é a extração por precipitação de

proteína. Trata-se de uma técnica barata, pois basicamente utiliza solvente orgânico

(como por exemplo acetonitrila) para precipitar as proteínas da matriz, e tem como

vantagem diminuir o efeito matriz. Sendo possível aliar a uma etapa sequencial de

extração por ELL, ou ainda concentrar a amostra sob fluxo de nitrogênio, caso ne-

cessário (ZGAIR et al., 2015; JAMWAL et al., 2017).

6.2.5. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO Os órgãos de regulamentação vigentes, como a RE 899/2003 da ANVISA,

preconizam que um método bioanalítico só é considerado válido quando devidamen-

te validado. A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o

método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilida-

de dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo,

precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise.

Os termos limite de quantificação (LQ) e limite de detecção (LD) são utilizados

para demonstrar a habilidade do método em quantificar/detectar baixas concentra-

ções de um analito.

O limite de detecção é definido como a menor concentração de um analito

que o método é capaz de diferenciar confiavelmente do ruído de fundo. Concentra-

ção detectada com segurança, porém, não pode ser quantificada. Confere a sensibi-

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lidade do método. A ANVISA recomenda que o LD seja de 2 a 3 vezes superior ao

ruído da linha de base.

O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito de

interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com valo-

res aceitáveis de precisão e exatidão. Alguns autores utilizam o termo limite de

quantificação, enquanto outros subdividem nos termos limite inferior de quantificação

(LIQ) e limite superior de quantificação (LSQ) (CASSIANO et al., 2009).

A curva de calibração demonstra a linearidade do método. Representa a rela-

ção entre a resposta do instrumento e a concentração conhecida do analito. O mo-

delo de calibração deve ser construído a partir da análise de 6 a 8 concentrações

conhecidas do analito adicionadas na mesma matriz biológica para a qual o método

foi desenvolvido e será aplicado (superposição de matriz). As concentrações estabe-

lecidas devem contemplar o intervalo de variação esperado, desde o LIQ até 120%

da máxima concentração que se pretende analisar, LSQ. Além disso, deve-se reali-

zar análise da amostra branco (matriz isenta da adição do analito e do padrão inter-

no, quando for o caso) e da amostra zero (matriz adicionada do padrão interno,

quando for o caso). O critério de aceitação da curva é coeficiente de variação menor

ou igual a 20% em relação à concentração nominal para o LQ e menor ou igual a

15% para as demais concentrações. Além disso, o coeficiente de correlação linear

(r) deve ser igual ou superior a 0,98 (CASSIANO et al., 2009).

O Padrão Interno é um composto, geralmente com características estruturais

similares ao analito, adicionado aos padrões de calibração e amostras em concen-

trações conhecidas e constantes, para facilitar a determinação do analito

A Recuperação mede a eficiência de extração do método analítico, ou seja, a

fração de massa do analito contido na amostra que se encontra presente no extrato

final. Embora altos valores de recuperação sejam desejáveis para maximizar a sen-

sibilidade do método, não é necessário que este valor seja de 100% e, sim, que a

recuperação seja consistente, precisa e reprodutiva.

A seletividade e/ou especificidade de um método bioanalítico é um importante

parâmetro a ser avaliado para garantir que a quantificação do analito de interesse

não seja afetada pela presença de metabólitos, produtos de degradação, fármacos

co-administrados ou compostos endógenos.

A precisão e a exatidão determinam os erros de uma medida analítica e são

os principais critérios usados para julgar a qualidade de um método bioanalítico.

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A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir

a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos.

A maior parte dos trabalhos apresentaram limites de detecção e quantificação

muito baixos, foram em média menores que 1 ng/mL, o que evidencia alta sensibili-

dade do método de detecção CLAE-EM, aliado a uma boa técnica de extração. Não

havendo discrepância entre método com extração por SPE, cujo menor valor foi de

LD foi de 0.2 ng/mL, e por ELL, com 0.1 ng/mL. As curvas de calibração apresenta-

ram boa linearidade com LSQ entre 100 – 500 ng/mL.

Também foi possível observar que os métodos que utilizaram plasma como

matriz obtiveram LD e LQ menores que as análises com sangue total e urina, res-

pectivamente.

As recuperações apresentadas variaram de 47,7% até 112,4%, provavel-

mente o valor baixo (inferior a 60%) deve-se a propriedade lipofílica e forte ligação

com proteínas que o THC e CBD apresentam, o que confere com o fato dos

metabólitos apresentarem recuperação um pouco maior, provavelmente por serem

mais hidrofílicos.

É importante ressaltar que muitos trabalhos monitoraram o CBN, que é ape-

nas um marcador de degradação do THC, não possui correlação com efeito farma-

cológico, e não haveria necessidade deste controle.

Diferentemente dos precursores ácidos como THCA e CBDA, que embora não te-

nham efeito farmacológico é interessante monitorar para assegurar a pureza dos

componentes do medicamento (RAIKOS et al., 2014).

Enquanto os dois metabólitos principais (11-OH-THC) e (THC-COOH) podem

ser monitorados, embora tenham maior aplicabilidade para exames toxicológicos.

É importante destacar que a maioria dos trabalhos utilizados, ou mesmo dis-

poníveis nas bases de dados, possuem foco em análise forense e/ou toxicológica,

ou seja em análise qualitativa, e não quantitativa, pois o objeto de interesse é moni-

torar exposição a cannabis como droga de abuso. Diferente do foco deste trabalho

que visa a utilização dos derivados da cannabis como um novo medicamento no

mercado, que produza resultados mais efetivos do que os medicamentos convenci-

onais e com menos efeitos adversos, de forma a garantir democratização do acesso

a um tratamento com segurança e eficácia.

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7. CONCLUSÃO • A maioria dos estudos e artigos monitoram os canabinoides e derivados para aná-

lises forenses e/ou toxicológicas;

• É possível monitorar mais de um canabinóide em uma única metodologia, com

seletividade e especificidade;

• A metodologia mais indicada para a determinação dos canabinoides em estudos

farmacocinéticos é a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrô-

metro de massas;

• Para realização de estudos de farmacocinética somente podem ser utilizadas as

matrizes biológica plasma e sangue total. Sendo a primeira a melhor opção;

• O método de extração líquido-líquido apresenta boa sensibilidade e melhor custo-

benefício;

• É interessante desenvolver metodologia em vidraria âmbar, silanizados e arma-

zenamento em temperaturas inferiores a - 20ºC;

• É possível desenvolver método simples, econômico e reprodutível, que permita

boa recuperação, sensibilidade e especificidade.

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universidade federal do rio de janeiro faculdade de … · espera-se levantar esta discussão, e...

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