universidade federal do rio de janeiro campus macaé ... · israelle netto freitas efeitos da...

Israelle Netto Freitas

Efeitos da suplementação com taurina sobre a obesidade e morfofunção pancreática

endócrina de camundongos machos alimentados com dieta hiperlipídica e em sua

prole de primeira geração

Macaé

2017

Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Prof.ª Drª Rosane Aparecida Ribeiro

Macaé

2017

Universidade Federal do Rio de Janeiro Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira

Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências





Banca de defesa de dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientadora: Prof.ª Drª. Rosane Aparecida Ribeiro

Apresentada em 30 de agosto de 2017

Comissão Examinadora:

____________________________________________

Prof. Drª. Cintia Monteiro de Barros

____________________________________________

Prof. Dra. Helene Nara Henriques Blanc

_____________________________________________

Prof. Drª. Kelse Tibau de Albuquerque

____________________________________________

Orientadora: Prof. Drª. Rosane Aparecida Ribeiro

Macaé

2017

Dedico esse trabalho a Deus, minha família, amigos e os professores que me auxiliaram nessa caminhada.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradecer a Deus pela saúde e força para suportar os

momentos difíceis aos quais não me deixou desistir.

Aos meus pais, meus heróis e incentivadores por todo amor, carinho e por

acreditarem nos meus sonhos e fazerem dele, os próprios sonhos.

A Isabella, Isadora e Pedro pela amizade, cumplicidade, companheirismo e

amor.

Ao meu Nico, meu anjo, por toda fidelidade e alegria a qual me proporcionou

nesses lindos anos de convívio, saudade eterna.

A Liebe, por ser uma grande companheira nos meus piores momentos.

A minha família, em especial meus avós Antônio e Maria, por estarem sempre

dispostos a me ouvir e ajudar no que for necessário pra me fazer feliz.

Aos meus amigos pela paciência e ausência, e em especial Thiago, Valéria e

Renato pelo apoio, amizade, ajuda e ensinamentos durante todos esses anos.

A minha orientadora, Prof. Dra. Rosane Aparecida Ribeiro, por acreditar em

mim e por todo conhecimento proporcionado, confiança e paciência. O seu sucesso

profissional ultrapassa a falta de recursos, a minha eterna gratidão.

Aos meus colegas, em especial do Laboratório Integrado de Morfologia e

Laboratório Integrado de Bioquímica e os demais do NUPEM pelo convívio e ajuda

que foram fundamentais nessa caminhada.

Aos integrantes do Laboratório de Pâncreas Endócrino e Metabolismo da

UNICAMP e também à Prof. Dra. Maria Lucia Bonfleur da UNIOESTE- Cascavel, os

quais foram de grande importância no desenvolvimento das pesquisas.

À instituição UFRJ, pela oportunidade e todo aprendizado.

A FUNEMAC e FAPERJ, pela concessão da bolsa de estudos e por apoio nos

demais projetos do laboratório.

Aos animais minha gratidão, respeito e amor.

A todos que de alguma forma fizeram parte dessa trajetória, foram essenciais

para o meu crescimento pessoal e profissional.

Ninguém vence sozinho, nem no campo, nem na vida.

(Papa Francisco)

Os dias prósperos não vêm por acaso; nascem de muito trabalho e persistência.

(Henry Ford)

RESUMO

A condição metabólica paternal tem papel importante em predispor sua prole

a comorbidades como obesidade, intolerância à glicose e Diabetes mellitus. A prole

de fêmeas obesas suplementadas com o aminoácido L-taurina (Tau) não

desenvolveu obesidade, contudo tal relação ainda não foi evidenciada sobre o

impacto da obesidade paternal e a Tau sobre a indução da obesidade e

comorbidades na prole. Avaliamos a adiposidade, tolerância à glicose e a

morfofunção do pâncreas endócrino em camundongos machos tratados com dieta

hiperlipídica (HFD) e suplementados com Tau, bem como em sua

prole. Camundongos C57Bl/6 dos 30 aos 150 dias foram distribuídos nos grupos:

controle (CTL); CTL suplementado com 5% de Tau na água filtrada (CTAU); tratado

com dieta contendo 36% gordura (HFD); ou dieta HFD e Tau (HTAU). Aos 150 dias

foram acasalados com fêmeas CTL para obtenção da prole designada conforme o

tratamento dos pais. O consumo de dieta HFD aumentou o peso corporal, os

estoques de gordura abdominais, induziu intolerância à glicose e hipersecreção de

insulina. Pela primeira vez evidenciamos que o consumo de dieta HFD pelos pais foi

associado à redução na secreção de insulina em ilhotas pancreáticas de filhotes

HFD F1 quando incubadas com glicose. Ainda, o pâncreas desses filhotes teve

redução do número das células α, δ e do tamanho das células β. A suplementação

dada ao grupo paternal HTAU normalizou o número e o tamanho das células δ e β, e

aumentou o tamanho das células α no pâncreas da prole HTAU F1. O consumo de

HFD pelos pais promoveu ações deletérias sobre a secreção de insulina que estão

associadas a hipotrofia das células β e redução da proliferação das células α e δ.

Porém a suplementação com Tau atenuou as alterações funcionais no pâncreas

endócrino da prole macho F1.

Palavras-chave: aminoácido, epigenética, obesidade, pâncreas endócrino, secreção

de insulina.

ABSTRACT

The paternal metabolic condition plays an important role in predisposing their

offspring to comorbidities such as obesity, glucose intolerance and Diabetes mellitus.

Offspring of obese females supplemented with the amino acid L-taurine (Tau) did not

develop obesity, yet such a relationship has not yet been evidenced on and the

impact of paternal obesity and Tau on the induction of obesity and offspring

comorbidities. We evaluated the adiposity, glucose tolerance and morphofunction of

the endocrine pancreas in male mice treated with hyperlipidic diet (HFD) and

supplemented with Tau as well as in their offspring. C57Bl/6 mice from 30 to 150

days were divided into groups: control (CTL); CTL supplemented with 5% Tau in

filtered water (CTAU); Treated with diet containing 36% fat (HFD); Or HFD and Tau

(HTAU) diet. At 150 days, they were mated with CTL females to obtain offspring

designated according to the parents' treatment. The consumption of HFD diet

increased body weight, abdominal fat stores, induced glucose intolerance and insulin

hypersecretion. For the first time we showed that HFD dietary intake by parents was

associated with a reduction in insulin secretion in HFD F1 islets when incubated with

glucose. Moreover, the pancreas of these pups had a reduction in the number of α, δ

cells and the size of β cells. Supplementation in the HTAU paternal group normalized

the number and size of δ and β cells, and increased the size of the α cells in the

pancreas of HTAU offspring. The ingestion of HFD by parents promoted deleterious

actions on insulin secretion that are associated with β-cell hypotrophy and reduced

proliferation of α and δ cells. However, Tau given to parents which attenuated the

functional alterations in the endocrine pancreas of the male offspring F1.

Key words: amino acid, endocrine pancreas, epigenetics, insulin secretion and obesity.

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática dos grupos experimentais. ........................... 33

Figura 2: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração

nos camundongos dos grupos paternais. .................................................................. 40

Figura 3: Avaliação dos parâmetros da obesidade nos camundongos dos grupos

paternais.................................................................................................................... 41


nos camundongos dos grupos de prole macho F1. ................................................... 42

Figura 5: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole macho F1. .................... 43


nos camundongos dos grupos da prole fêmea F1. ................................................... 44

Figura 7: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole fêmea. .......................... 45

Figura 8: Avaliação da glicemia nos camundongos grupos

paternais.....................................................................................................................45

Figura 10: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos da prole fêmea F1.

.................................................................................................................................. 50

Figura 11: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de

glicose em ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos dos grupos paternais. ... 52


glicose em ilhotas pancreáticas isoladas na prole macho F1. ................................... 53


glicose em ilhotas pancreáticas isoladas na prole fêmea F1.................................... 54

Figura 14: Imuno-histoquimica para insulina, ou glucagon ou somatostatina no

pâncreas coletado da prole macho F1 ...................................................................... 56

Figura 15: Quantificação dos principais hormônios das ilhotas pancreáticas da prole

macho F1 .................................................................................................................. 57

LISTAS DE TABELAS

Tabela 1: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado

avaliados em camundongos dos grupos paternais ................................................... 47


avaliados na prole macho F1 .................................................................................... 49


avaliados na prole fêmea F1 ..................................................................................... 51

Tabela 4: Morfometria do pâncreas endócrino aos 90 dias de vida da prole macho F1

.................................................................................................................................. 58

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Composição das dietas............................................................................34

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABESO – Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e da Síndrome

Metabólica

Acetil-coA – Acetilcoenzima A

Akt – Proteína quinase B

AMPc – Adenosina Monofosfato Cíclica

ATP – Adenosina trifosfato

ATP/ADP – Adenosina trifosfato/ adenosina difosfato

AUC – Área abaixo da curva

Ca2+– Cálcio

[(Ca2+)i] – Cálcio intracelular

Cav – Canal de cálcio dependente da voltagem

CNA – Comprimento nasoanal

CHOL – Colesterol

CTL – Ração normoproteica

CTAU – Ração normoproteica e 5% de Tau

ACP – proteína carreadora de grupos acil

DAG – Diacilglicerol

DM – Diabetes mellitus

DM1 – Diabetes mellitus do tipo 1

DM2 – Diabetes mellitus do tipo 2

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

EPM – Média erro padrão da média

GCK– Enzima glicoquinase

GHRH – Hormônio do crescimento

GIP – Peptídeo insulinotrópico dependente de glicose

GLP-1 – Peptídeo semelhante ao glucagon 1

GLUT 2– Transportador de glicose

GMPc – Guanosina-monofosfato cíclico

HAS – Hipertensão arterial sistêmica

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

HFD- Dieta hiperlipídica

HTAU- Dieta hiperlipídica e 5% de Tau

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e estatística

Icv – Intracerebroventricular

IDF- Federação internacional de diabetes

IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1

IMC – Índice de massa corporal

Ip – Injeção intraperitoneal

ipGTT – Teste de tolerância à glicose intraperitoneal

ipITT– Teste de tolerância à insulina intraperitoneal

IR– Receptor de insulina

IRS – Substrato receptor de insulina

Irβ –Subunidade beta do receptor de insulina

JAK2/STAT3 – Proteína Janus quinase 2/transdutor de sinal e ativador de

transcrição 3

KATP – Canal de potássio dependente de ATP

KCAL– Quilocalorias

KCl – Cloreto de potássio

Il13rα2 – Gene receptor alfa 2 de interleucina 13

Malonil-coA – Malonil coenzima A

MTP – Proteína de transferência de triglicerídios microssomal

Na+ – Sódio

NADPH – Dinucleotídeo de adenina e nicotinamida fosfato

NOD – Camundongos não obesos diabéticos

OMS – Organização Mundial da Saúde

PAKT – Proteína quinase β fosforilada

PDX-1 – Pancreático e duodenal homeobox 1

PI – Fosfatidilinositol

PPARα- Receptor activado por proliferador de peroxissoma gama

RIA – Radioimunoensaio

RNAm – Ácido ribonucleico mensageiro

ROS – Espécies reativas de oxigênio

Tau – L-taurina , 2-aminoetanossulfônico

Toll- Receptores do tipo toll

TBS – Tampão tris-salina

TNFα – Fator de necrose tumoral

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 16 1.1 Obesidade ................................................................................................... 16

1.2 Modelos experimentais de obesidade ...................................................... 18

1.3 Secreção de insulina .................................................................................. 19

1.4 Obesidade e programação metabólica ..................................................... 22

1.5 L-taurina ...................................................................................................... 24

2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 28 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 30

3.1 Objetivo geral ............................................................................................. 30

3.2 Objetivos específicos ................................................................................ 30

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 31 4.1 Grupos experimentais ............................................................................... 31

4.2 Avaliação da ingestão de ração e de água e avaliação da obesidade ... 33

4.3 Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipgtt) ................................ 34

4.4 Parâmetros bioquímicos plasmáticos ...................................................... 34

4.5 Isolamento de ilhotas pancreáticas e secreção estática de insulina .... 35

4.6 Morfologia do pâncreas ............................................................................. 36

4.7 Imuno-histoquímica para insulina, glucagon e somatostatina .............. 36

4.8 Análise estatística ...................................................................................... 37

5. RESULTADOS ................................................................................................... 39

5.1 Ingestão de ração e água e avaliação da obesidade nos grupos paternais e em sua respectiva prole .................................................................. 39

5.2 Avaliação da tolerância à glicose e dos parâmetros bioquímicos plasmáticos nos grupos paternais e em sua respectiva prole ........................ 45

5.3 Secreção estática de insulina nos grupos paternais e em sua respectiva prole.................................................................................................... 51

5.4 Morfologia e imuno-histoquímica no pâncreas da prole macho ........... 54

6. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 59 6.1 Ações da suplementação com Tau no desenvolvimento da obesidade nos grupos paternais e na sua respectiva prole ............................................... 59

6.2 Ações da suplementação com Tau na homeostase glicêmica e nos parâmetros bioquímicos plasmáticos dos grupos paternais e de sua respectiva prole.................................................................................................... 64

6.3 Ações da suplementação com Tau na morfofunção pancreática endócrina tanto no grupo paternal quanto na sua prole .................................. 67

7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 73 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 74 ANEXOS ................................................................................................................... 82

16

1. INTRODUÇÃO

1.1 Obesidade

A obesidade é uma doença de abrangência mundial, atualmente é uma

epidemia global (Organização Mundial de Saúde- OMS, 2016). É considerada

problema de saúde pública em diversos países do mundo, principalmente nas

sociedades ocidentais e industrializadas, atingindo diversas faixas etárias, em

ambos os sexos e níveis sociais (OMS, 2016), sendo caracterizada pelo grande

acúmulo de gordura corporal, resultante principalmente da combinação entre a

ingestão excessiva de alimentos e o sedentarismo (CHAVES et al., 2010; SOUZA et

al., 2010; TATEYA, KIM, TAMORI, 2013).

O excesso de peso pode ser medido pelo índice de massa corporal (IMC), o

qual é obtido entre a razão do peso e altura [peso (kg)/ altura2 (m2)], caso essa

relação dê valores acima ou igual a 25 e ≥ 30 kg/m2 indica que o indivíduo apresenta

sobrepeso ou obesidade, respectivamente (OMS, 2017), apesar das limitações

fornece uma medida útil para a população relativa ao excesso de peso ou

obesidade, uma vez que os valores de referências são os mesmos para ambos os

sexos e para adultos de todas as idades. No Brasil em 2015, cerca de 82 milhões de

pessoas adultas apresentaram o IMC 25 e ≥ 30 kg/m2. Em homens o sobrepeso ou

obesidade foram evidenciados em maior prevalência na faixa etária entre 25 e 29

anos perfazendo 50,4%. Contudo, as mulheres na faixa etária entre 35 e 44 anos

prevaleceram sobrepeso e obesidade equivalendo a 63,6% ultrapassando a

percentagem dos homens nessa mesma idade que foi 62,3% (Associação Brasileira

para o Estudo da Obesidade e da Síndrome Metabólica - ABESO, 2015). A literatura

sugere a hipótese de que a obesidade gera um ciclo vicioso, já que filhos de pais

obesos têm 80 a 90% de probabilidade de serem adultos obesos (JAMES et al.,

2001; SHANKAR et al., 2008).

Um fato ainda mais preocupante tem sido o aumento alarmante da obesidade

infantil. De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em

2015, 16,6% dos meninos, e 11,8% das meninas na faixa etária de 5 e 9 anos foram

considerados obesos. Na mesma faixa etária citada a prevalência de sobrepeso foi

de 34,8% e 32% em meninos e meninas, respectivamente (IBGE, 2015).

Mudanças nos hábitos e na rotina são os caminhos para evitar o aumento da

obesidade (OMS, 2016). Atualmente, as estimativas não são animadoras, de acordo

com o Ministério da Saúde, se o Brasil continuar nessa crescente estimativa de

17

sobrepeso e obesidade será o país mais obeso do mundo em 15 anos (VIGITEL,

2015). No mundo as estimativas também demonstram que pelo menos 2,8 milhões

de pessoas incluindo crianças e adultos morrem a cada ano, como resultado de

excesso de peso ou obesidade (OMS, 2014). A projeção é que, em 2025, cerca de

2,3 bilhões de adultos estejam com sobrepeso; e mais de 700 milhões, obesos. E o

número de crianças com sobrepeso e obesidade no mundo pode chegar a 75

milhões, caso nada seja feito para prevenir ou reverter esse quadro (OMS, 2016).

Na obesidade os fatores genéticos, metabólicos, endócrinos, neurais,

ambientais e comportamentais estão inter-relacionados para a sua manifestação e

manutenção (CHAVEY et al., 2014; SOMINSKY e SPENCER 2014; SOUBRYET et

al., 2015). Além de problemas sociais e psicológicos, a preocupação em torno do

crescimento da obesidade está relacionada a sua associação com diversas

condições mórbidas como; hipertensão arterial sistêmica (HAS), dislipidemias,

problemas ortopédicos, doenças cardiovasculares e diabetes mellitus (DM) do tipo 2

(DM2) (ENES et al., 2010, MALIK et al., 2013).

O DM é caracterizado por hiperglicemia, podendo ocorrer devido a defeitos

na secreção e/ou ação da insulina. Diversas condições podem levar ao DM, porém a

grande maioria dos casos está dividida em dois grupos, DM do tipo 1 (DM1),

resultante da destruição das células β que pode ocorrer por processo imunológico,

ou seja, pela formação de anticorpos pelo próprio organismo contra as células β

resultando na ausência da produção endógena de insulina (GLASTRAS et al.,

2016). Atualmente 90% dos pacientes diabéticos apresentam o DM2 (IDF,2017).

Este é caracterizado pela resistência à ação da insulina e disfunção ou falência das

células β (SPELLMAN, 2007; WONG et al., 2017).

Dados da OMS mostraram que o número de pessoas com DM no mundo

aumentou de 108 milhões em 1980, para 422 milhões em 2014, e estima que esse

número possa dobrar até 2030 (OMS, 2016). Anualmente mais de 1,5 milhões de

pessoas morre de DM, ocupando o quarto lugar no número de mortes no mundo,

ficando atrás das doenças cardiovasculares, do câncer e das doenças respiratórias

(OMS, 2016). De acordo com a Pesquisa Nacional de Saúde, realizada com parceria

entre IBGE e o Ministério da Saúde divulgada em 2015, foi mostrado que o DM

atingiu 6,2% da população adulta entre 18 e 74 anos, o que corresponde a 9 milhões

de brasileiros. As mulheres apresentaram maior proporção da doença do que os

homens, atingindo 7% o que corresponde a 5,4 milhões de mulheres e 5,4%,

18

correspondendo a 3,6 milhões de homens apresentando DM (IBGE, 2015; Ministério

da Saúde, 2015). Quanto maior a idade, maior a ocorrência dessa doença, por

exemplo, na faixa etária dos 65 a 74 anos, foi constatado que 19,9% dos brasileiros

eram diabéticos (IBGE, 2015).

A idade é um fator de risco maior para o desenvolvimento de DM2, porém, o

consumo de alimentos industrializados de alto valor calórico somados ao

sedentarismo, são atualmente determinantes para o aumento do número de

indivíduos com sobrepeso e obesidade diagnosticados com DM2 (ESPELAND et al.,

2014). Estima-se que entre 80 e 90% dos indivíduos acometidos por DM2 são

obesos, e o risco de desenvolver esta doença está diretamente associado ao

aumento do IMC (SARTORELLI, 2003; SCHIMIDT et al., 2009). O DM pode

acarretar em comorbidades tais como: insuficiência renal, doenças cardiovasculares,

acidente vascular cerebral, prejuízos visuais e neuropatia diabética (MORAIS et al.,

2009). Portanto, a associação obesidade e DM só tende a aumentar a

morbimortalidade da população.

1.2 Modelos experimentais de obesidade

Para melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no

desenvolvimento da obesidade diversos modelos experimentais são utilizados.

Dentre os modelos estudados têm-se os que apresentam prejuízos genéticos como,

ratos Zucker fa/fa, camundongos ob/ob, que não expressam o gene da leptina;

modelos de obesidade por lesões eletrolíticas em regiões hipotalâmicas envolvidas

no controle da saciedade, como o núcleo ventromedial (SHIMIZUT et al., 2003). Mas

os mais utilizados para análises fisiopatológicas da obesidade são os modelos que

consomem dietas hipercalóricas, podendo ser a dieta de cafeteria ou dieta

hiperlipídica (HFD) devido à sua grande semelhança com a gênese e com as

respostas metabólicas decorrentes da obesidade em humanos (DESPRÉS et al.,

1994). A dieta HFD promove obesidade em roedores pelo alto consumo energético

(SHAFAT et al., 2009; KENNEDY et al., 2011). Conforme maior for o percentual de

gordura na dieta HFD, maior é o aumento do ganho de peso corporal devido à

quantidade de calorias fornecida pela dieta (DUARTE et al., 2006; WHITE et al.,

2013).

É descrito que na primeira semana de ingestão de dieta HFD os

camundongos apresentam elevação da glicemia (WINZELL et al., 2007). Ainda,

após oito semanas de ingestão da dieta HFD os camundongos desenvolvem

19

obesidade, resistência à insulina, intolerância à glicose, hiperleptinemia,

hiperinsulinemia, hipercolesterolemia, aumento de ácidos graxos circulantes e

hipersecreção de insulina (DUARTE et al., 2006; ESTADELA, 2004; MCLELLAN et

al., 2007). Essa hiperfunção acarreta em alterações plásticas do pâncreas (DUARTE

et al., 2006). Camundongos que ingeriram por três meses a dieta HFD apresentaram

aumento da massa das células β que foi principalmente relacionado a hiperplasia,

pois o tamanho das células β pancreáticas era significativamente maior (AHREN et

al., 2010). Outro estudo já demonstrou que a dieta HFD consumida durante seis

semanas levou a hiperplasia e hipertrofia das células β pancreáticas (RIBEIRO et al.,

2012). Sugere-se que esta resposta do pâncreas endócrino é uma tentativa de

normalizar o quadro de hiperglicemia e contrabalancear a resistência à insulina dos

tecidos periféricos, principalmente do músculo esquelético, tecido adiposo e fígado

(KAHN et al., 2006; PRENTKI e NOLAN, 2006, SOUZA-MELLO et al., 2014).

1.3 Secreção de insulina

O pâncreas é uma glândula mista, com função tanto endócrina quanto

exócrina. Em humanos, é um órgão achatado que mede aproximadamente 12,5 a 15

cm de comprimento, pesando aproximadamente 60 gramas, está situado na

curvatura do duodeno, retroperitoneal e transversalmente ao estômago e vai até o

baço (TORTORA e BRYAN et al., 2014). Nos roedores, entretanto o pâncreas

localiza-se difusamente aderido às alças intestinais de forma alongada estendendo-

se entre o duodeno e uma pequena parte encontra-se junto ao estômago e o baço

(COVELLI et al., 2006).

Aproximadamente 99% das células pancreáticas estão dispostas em

aglomerações chamadas ácinos. Estas células produzem enzimas digestivas que

fluem para o trato gastrointestinal pela rede de ductos e compõem a parte exócrina

do pâncreas. A porção endócrina representa 1 a 2% do peso total do órgão,

compreendendo 1 a 2 milhões de minúsculas aglomerações arredondadas de

células endócrinas que são denominadas de ilhotas pancreáticas ou ilhotas de

Langerhans e encontram-se distribuídas por todo o tecido (TORTORA e BRYAN et

al., 2014).

Histologicamente, a ilhota pancreática é revestida por uma delicada cápsula

de tecido conjuntivo, e seu parênquima é constituído por cordões das células

endócrinas entremeados por uma rica rede de capilares sanguíneos do tipo

fenestrado (ANDRALOJC et al., 2009).

20

Cada ilhota pancreática é constituída principalmente por quatro tipos

celulares: as células β que sintetizam e secretam insulina; as células α que são

responsáveis pela secreção do glucagon; as células δ que liberam somatostatina; e

as células PP que são responsáveis por secretar o polipeptídeo pancreático

(KANNO et al., 2002; ANDRALOJC et al., 2009; SUNDLER e HELLER, 2014). Com

relação à disposição ou ao arranjo das células endócrinas na ilhota, em humanos, as

células β, são as mais abundantes totalizando aproximadamente 48% a 59% do

número total de células, as células α em média representam 33% a 46% do total das

células da ilhota; as células δ, compõem em torno de 8% a 12% da massa celular; e

as células PP ocupam aproximadamente 5% da ilhota (CABRERA et al., 2006;

ABDULREDA et al., 2016). Nos roedores a organização das células endócrinas

difere das citadas acima em humanos. As células β ocupam a região central

perfazendo aproximadamente de 60-80% do volume total da ilhota, e as células α e

δ localizam-se na periferia da ilhota e representam de 15-20% e 10%,

respectivamente, do total de células. As células PP ocupam aproximadamente 1%, e

estão preferencialmente, dispostas na periferia da ilhota (ANDRALOJC et al., 2009;

ABDULREDA et al., 2016).

A secreção de insulina pelas células β pancreáticas é controlada

continuamente de acordo com as flutuações da concentração de nutrientes

circulantes, em especial, a glicose (HENQUIN et al., 2009). Os mecanismos

responsáveis pela secreção de insulina estimulada pela glicose iniciam-se com o

transporte deste açúcar para as células β, através do transportador de glicose

(GLUT)-2; a glicose é fosforilada à glicose-6-fosfato pela enzima glicoquinase (GCK)

e metabolizada gerando ATP. O resultado é o aumento da relação ATP/ADP

intracelular, que provoca o fechamento de canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP),

reduzindo o efluxo de K+ e promovendo a despolarização da membrana, que resulta

na abertura de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem e influxo deste cátion (PRENTKI

et al., 2013). A metabolização da glicose nas células β e a subsequente elevação da

concentração intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) podem ativar enzimas que produzirão

adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPC), diacilglicerol (DAG) e guanosina 3’,5’ -

monofosfato cíclico (GMPc) que contribuem para a amplificação do sinal iniciado

pela glicose (HENQUIN et al., 2009; TENGHOLM et al., 2009; PRENTKI et al.,

2013). Essa resposta potencializadora também pode ser desencadeada pela

liberação de neurotransmissores como acetilcolina e hormônios gastrointestinais

21

como GLP-1 (Peptídeo semelhante ao glucagon 1) e o peptídeo insulinotrópico

dependente de glicose (GIP) (HIRIART e AGUILAR-BRYAN, 2008; FUJITA et al.,

2016). Mas, ainda há neurotransmissores e hormônios que podem reduzir a

concentração de AMPC, como por exemplo, a noradrenalina e a somatostatina

(NESHER et al., 2002; MCCLENAGHAN, 2007; CALLAWAY et al., 2014).

Além da glicose, os ácidos graxos e aminoácidos também aumentam a

secreção de insulina (PESSIN et al., 2000; SHULMAN et al., 2009). Os aminoácidos

estimulam a secreção de insulina via geração de ATP derivado do seu metabolismo,

ou pela geração de compostos que ao serem degradados aumentam o fluxo de

intermediários para o ciclo de Krebs, como é o caso da L-glutamina (KOMATSU et

al., 2013). A transaminação da glutamina pela enzima glutaminase leva a geração

de amônio e glutamato. O glutamato por sua vez leva a síntese de outros

aminoácidos e de antioxidantes (TIRAPEGUI et al., 2009). Ainda, a glutamina pode

aumentar a síntese de proteínas de choque térmico em células β pancreáticas, fato

que regula a secreção de insulina (WU e MORRIS, 1998; BRENNAN et al., 2003;

CRUZAT, 2013). Outros aminoácidos também podem gerar intermediários para o

ciclo de Krebs, como é o caso da metabolização da L-alanina e L-arginina. Esses

aminoácidos aumentam a probabilidade da despolarização da célula β porque são

cotransportados com os íons Na+ (SENER et al., 2000). Estudos já evidenciaram

que esses aminoácidos ativam reguladores da síntese proteica e contribuem para

reconstrução de proteínas (SENER et al., 2000; NEWSHOLME et al., 2007). Na

obesidade a suplementação com L-arginina e L-alanina já mostrou ter ação na

redução significativa dos estoques de gordura abdominais e gordura corporal, além

de melhorar o controle da glicemia e liberação de adiponectina em indivíduos com

DM2 (LUCOTTI et al., 2006; ARAUJO et al., 2016). Segundo, ARAUJO e

colaboradores (2016) a suplementação com L-alanina foi eficaz para restaurar a

secreção de insulina em camundongos obesos.

Benefícios semelhantes já foram descritos em roedores suplementados com o

aminoácido L-taurina, ainda outro fato referenciado na literatura quanto à L-taurina é

o aumento da sensibilidade à insulina (CARNEIRO et al., 2009; RIBEIRO et al.,

2012; VETORAZZI, 2013). A L-taurina já mostrou controlar a homeostase da glicose

através da regulação da expressão de genes necessários para estimular a secreção

de insulina pelas células β, e assim melhora a sensibilidade periférica à insulina

(CARNEIRO et al., 2009). Foi visto também que a suplementação com L-taurina

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Callaway%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27512424

22

dada a camundongos obesos restaura a secreção nesses roedores (RIBEIRO et al.,

2012).

Estudos também já mostraram que a suplementação com aminoácidos pode

ser uma forma eficaz para tratar ou prevenir a obesidade (RIBEIRO et al., 2012,

VETORAZZI, 2013; ARAUJO et al., 2016). Portanto a utilização de suplementos

nutricionais parece ser uma linha promissora para a prevenção e tratamento dessa

síndrome e de suas comorbidades.

1.4 Obesidade e programação metabólica

Atualmente, os estudos indicam um importante envolvimento biológico dos

pais na determinação do desenvolvimento da obesidade e programação metabólica

da prole, sendo que o meio nutricional ao qual os pais são expostos afeta o fenótipo

metabólico de seus descendentes (REUSENS et al., 2008; DUNN et al., 2009;

VICKERS, 2014). Conforme a hipótese de Barker as doenças evidenciadas na vida

adulta teriam origem fetal. A adaptação do feto ao meio interno maternal adverso

resultaria em mudanças permanentes na fisiologia e metabolismo do indivíduo

(HALES e BARKER, 2001). Esta hipótese é confirmada pelas evidências de que o

baixo peso ao nascer está associado com aumento do risco de desenvolvimento de

doenças como hipertensão, doença cardiovascular e DM2 (SARTORI et al., 1999;

LAL et al., 2003). A exposição a condições adversas como, a desnutrição, obesidade

e DM aumenta a ocorrência do desenvolvimento da obesidade e suas comorbidades

na vida adulta (LEVIN, 2008; METGES, 2009).

Estudos com roedores mostraram que o excesso de peso materno durante os

períodos de desenvolvimento da prole pode aumentar o risco de obesidade, nas

diferentes fases da vida (HOWIE, 2009). O consumo de dieta HFD materna por

camundongos a longo prazo, predispõe para elevações na pressão arterial e na

concentração de colesterol total em sua prole (ELAHI et al., 2009). Além disso, o

consumo de alimentos ricos em gordura apenas durante a gravidez e lactação já

predispõe a prole à resistência a insulina e esteatose hepática (GREGORIO et al.,

2010; ASHINO et al., 2012). Ainda, alterações no metabolismo da glicose induzidas

por ambiente intrauterino adverso podem se propagar não somente a primeira

geração mais para as próximas descendências (PINHEIRO et al., 2008).

O feto de ratas que foram alimentadas com dieta HFD durante a gestação não

demonstraram alteração do peso corporal ao nascimento, porém aos dez dias de

vida esses roedores apresentaram aumento do peso corporal, hiperleptinemia,

23

hiperinsulinemia, acompanhado de resistência à ação da leptina e insulina (TAYLOR

et al., 2005; CERF et al., 2008; GUPTA et al., 2009).

A dieta HFD consumida por fêmeas no período pré-acasalamento e período

gestacional, pode programar a fisiologia e o metabolismo da prole precocemente. Na

prole de ratos neonatos oriundos de mães alimentadas com dieta HFD evidenciou-

se hiperglicemia e prejuízos no desenvolvimento das células β (GNIULI et al., 2008).

Também já foi relatado alterações precoces no pâncreas da prole, incluindo um

remodelamento estrutural do pâncreas associadas ao aumento da massa de células

β, prejudicando o metabolismo da glicose, esses prejuízos podem levar a mudanças

adaptativas nas células β como hipertrofia, hiperplasia, aumento da síntese e

secreção de insulina na prole (GNIULI et al., 2008).

Em contrapartida, também já foi observado que em camundongos

provenientes de mães que comeram dieta HFD tiveram redução na massa de célula

β, e apresentaram adaptação compensatória nas células β remanescentes, levando

a hipertrofia e aumento da secreção de insulina nessas células β, o que está

relacionado à superestimulação ou efeitos diretos da hiperglicemia e hiperlipidemia

devido à exposição a um ambiente metabolicamente alterado durante seu

desenvolvimento (MASIELLO, 2006).

A prole de camundongos fêmea alimentadas com dieta HFD, durante a

gestação, apresentou redução da sensibilidade periférica à insulina e maior

crescimento linear, devido ao aumento da concentração plasmática do fator de

crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) associada ao aumento da

expressão gênica do hormônio de liberação do hormônio do crescimento (GHRH).

Este efeito foi decorrente da menor expressão gênica de repressores transcricionais

e redução da metilação da sequência codificadora do GHRH (DUNN et al., 2009).

Contudo, também já é estabelecido que não somente a condição maternal e

intrauterina pode levar à alterações importantes na condição fisiológica do novo

indivíduo (ZAMBRANO et al., 2006; NG et al., 2010). A influência paternal sobre o

desenvolvimento e aptidão da prole pode ser independente de qualquer interação

direta com descendência (CREAN e BONDURIANSKY, 2014). Recentemente,

considera-se que o meio interno ao qual os gametas são expostos durante sua

formação exerce influência no fenótipo da prole, sabe-se que tal programação ocorre

pela ativação de mecanismos epigenéticos, cujas alterações podem não ser visíveis

24

no fenótipo logo após o nascimento, mas que muitas vezes vêm a se manifestar na

forma de doenças na vida adulta (HOCHERA et al., 2016).

Os mecanismos epigenéticos que controlam essas alterações são

caracterizados por interferirem no padrão de metilação, fosforilação e acetilação do

DNA e das histonas, correlacionam-se com a conformação da cromatina, permitindo

que determinados genes sejam expressos ou silenciados, resultando na propagação

da alteração da atividade gênica de uma geração de células para a próxima

(HOWELL et al., 2009). Portanto o tipo de dieta consumida pelo pai exerce

implicações no desenvolvimento da adiposidade e prejuízo no metabolismo da

glicose na prole (MORRIS et al., 2014).

Em camundongos machos foi observado que o consumo da dieta HFD altera

a expressão gênica testicular (GHANAYEM et al., 2009). Já em humanos sabe-se

que o desenvolvimento da obesidade afeta os componentes do esperma, motilidade,

morfologia e aumenta o dano ao DNA dos espermatozoides (KASTURI et al., 2008).

Roedores que foram alimentados com HFD e acasalados com ratas

alimentadas com dieta CTL tiveram a prole fêmea com intolerância à glicose

associada a prejuízos na secreção de insulina, porém não houve diferença na

adiposidade (MORRIS et al., 2014).

A prole macho provenientes de pais que consumiram dieta HFD mostraram

redução do crescimento, apresentando menor peso corporal que a prole CTL, o que

foi relacionado com a menor concentração de IGF-1 nos pais obesos. Ainda, foram

observadas disfunção das células β no pâncreas endócrino da prole fêmea de pais

HFD, sendo as modificações acompanhadas por alteração na expressão de 77

genes relacionados ao transporte iônico, citoesqueleto, proliferação e apoptose nas

ilhotas pancreáticas (NG et al., 2010; YOUNGSON et al., 2011).

1.5 L-taurina

A L-taurina (Tau, 2-aminoetanossulfônico) é um aminoácido que está presente

em altas concentrações tanto no interior das células como no plasma de mamíferos

(HUXTABLE, 1992). Sua biossíntese ocorre principalmente nos hepatócitos e

adipócitos de humanos e roedores a partir dos aminoácidos metionina e cisteína

(TAPPAZ et al., 2004). A Tau também pode ser obtida através da ingestão de

alimentos, tais como leite e carne, principalmente de peixe e frutos do mar, e em

menor quantidade nos vegetais (TAPPAZ et al., 2004). É um aminoácido importante

em processos biológicos, tais como: desenvolvimento do sistema nervoso e retina,

25

modulação do Ca2+, estabilização de membranas, reprodução e imunidade

(ASSCHE et al., 2002). Evidências indicam que o mecanismo de ação da Tau possa

ocorrer pela combinação do aminoácido com vários tipos de canais iônicos,

transportadores e enzimas (HUXTABLE et al., 1992; SATOH e SPERELAKIS, 1998;

TRICARICO et al., 2000).

Além das várias funções já atribuídas à Tau, estudos têm mostrado que o

aminoácido possui um papel regulador sobre a secreção de insulina e homeostase

glicêmica. A sua concentração encontra-se reduzida no DM, como em ratos com

DM induzido por estreptozotocina (AERTS e VAN ASSCHE, 2001; COLIVICCHI et

al., 2004), e em roedores com resistência à insulina (ANURADHA e

BALAKRISHNAN, 1999; TSUBOYAMA-KASAOKA et al., 2006). Em pacientes

diabéticos as concentrações plasmáticas e plaquetárias de Tau apresentam

reduzidas, correlacionando-se com hiperglicemia e distúrbios na osmorregulação

celular (HANSEN et al., 2001). A deficiência de Tau também já foi relacionada com

algumas anormalidades, tais como a degeneração da retina, retardamento do

crescimento e disfunção cardíaca (HUXTABLE, 1992; AZUMA et al., 2012). Vários

estudos demonstraram que o tratamento com Tau é benéfico para a prevenção do

DM1 (ARANY et al., 2004), disfunção da célula β (KANUIK et al., 2007; OPRESCU

et al., 2007; XIAO et al., 2007) e DM2 (NAKAYA et al., 2000; NANDHINI et al., 2005;

TSUBOYAMA-KASAOKA et al., 2006).

No pâncreas, a Tau encontra-se acumulada cerca de cinco vezes mais nas

ilhotas pancreáticas em relação à porção exócrina do pâncreas, dentro da ilhota fica

estocado primariamente nas células α e δ do pâncreas endócrino, sugerindo que a

liberação de Tau possa ser necessária para que ocorra uma eficiente modulação do

processo de secreção de insulina em células β (BUSTAMANTE et al., 2001). O

aminoácido possui um papel regulador sobre a secreção de insulina e homeostase

glicêmica (CARNEIRO et al., 2009). Em situações de hiperglicemia a Tau aumenta a

secreção de insulina (KAPLAN et al., 2004) e a sensibilidade à insulina (NAKAYA et

al., 2000; TSUBOYAMA-KASAOKA et al., 2006). Em camundongos alimentados com

dieta HFD a suplementação com Tau preveniu a hiperfagia (CAMARGO et al.,

2013), o acúmulo de gordura (NARDELLI et al., 2011; BATISTA et al., 2013;

VETTORAZZI et al., 2014), aumentou a tolerância à glicose, melhorou a

sensibilidade à insulina e impediu a hipersecreção, hiperplasia e hipertrofia no

pâncreas endócrino de machos e fêmeas (RIBEIRO et al., 2009 e 2012). Em

26

roedores com resistência à insulina, a suplementação com Tau normalizou não

somente a concentração plasmática de insulina e glicose, mas também a

sensibilidade à insulina e hiperlipidemia (ANURADHA e BALAKRISHNAN, 1999;

NAKAYA et al., 2000; NANDHINI e ANURADHA, 2002).

Em ratos obesos e com resistência a insulina induzido pelo consumo de dieta

HFD por oito meses, a concentração plasmática de Tau também se encontrou

reduzida e a suplementação com Tau reduziu o ganho de peso corpóreo e de tecido

adiposo (TSUBOYAMA-KASAOKA et al., 2006). Dados clínicos mostraram que o

tratamento preventivo com Tau impediu a redução da secreção de insulina em

homens obesos e submetidos à infusão contínua com ácidos graxos por 48h (XIAO,

GIACCA e LEWIS, 2008). Foi observado também que indivíduos com sobrepeso

quando suplementados com Tau reduziram o peso corporal, e apresentaram menor

concentração de triglicerídeos comparados com o grupo não suplementado,

mostrando efeitos benéficos da Tau no metabolismo lipídico (ZHANG et al., 2004).

Contudo, não se sabe qual mecanismo que a Tau previne as alterações funcionais

no pâncreas endócrino, mas o tratamento in vivo com Tau mostrou que aumenta a

tolerância à glicose e sensibilidade à insulina além de aumentar a captação de cálcio

e expressão da subunidade β2 do canal de cálcio voltagem-dependente em ilhotas

pancreáticas (RIBEIRO et al., 2009), e este aumento da capacidade secretória da

célula β está relacionado com a regulação da expressão de genes e proteínas

importantes para o acoplamento estímulo/secreção da insulina, bem como, melhora

do manejo do pool extracelular e intracelular de íons Ca2+ (CARNEIRO et al., 2009;

RIBEIRO et al., 2010).Uma das ações mediadas pela Tau nas células β pancreáticas

é a de inibir a atividade dos canais de KATP resultando em aumento da [Ca2+]i, e

consequentemente da secreção de insulina (PARK et al., 2004).

Ainda no pâncreas, a Tau tem a capacidade de reduzir a taxa de apoptose

(EL IDRISSI, BOUKARROU e L'AMOREAUX, 2009; LIN et al., 2013) e atuar na

síntese de DNA, propiciando o desenvolvimento adequado do pâncreas endócrino

(BOUJENDAR et al., 2002). Experimentos in vitro e in vivo com ilhotas pancreáticas

de roedores suplementados com Tau apresentaram maior expressão da forma ativa

da proteína PDX-1 (essencial para síntese e expressão do GLUT-2 e da insulina),

modulando a homeostase da glicose e a sensibilidade à insulina, resultando na

regulação do número de genes envolvidos na função das células β pancreáticas,

ainda a Tau mostrou aumentar a fosforilação do IRβ no fígado e músculo

27

(CARNEIRO et al., 2009). Além disso, camundongos suplementados com Tau

apresentaram aumento da ativação da proteína quinase β (Akt) nos tecidos-alvo da

insulina (RIBEIRO et al., 2012). Essas ações da Tau podem estar relacionadas à

ativação de vias de sinalização relacionadas à sobrevivência e proliferação das

células β. Portanto, a Tau poderia manter a função pancreática endócrina

normalizada em filhotes de pais que ingerem dieta HFD por preservar a ativação de

vias reguladoras de diferenciação e sobrevivência celular como a Akt (BENES et al.,

1999; LAWRENCE et al., 2008).

É importante ressaltar que a Tau também mostrou efeitos sobre a regulação

da reprodução em machos, tendo envolvimento no controle da espermatogênese e

regulação da concentração plasmática de gonadotrofinas e testosterona (YANG et

al., 2006). A Tau já demonstrou regular os efeitos epigenéticos modulados pela

condição metabólica dos pais, e desta forma, impedir a transmissão desta para as

gerações posteriores. Neste sentido, CHERIF e colaboradores (1998) verificaram

que a secreção de insulina nas ilhotas pancreáticas apresentou-se reduzida em

fetos de ratas que foram submetidas à restrição proteica em resposta a nutrientes. E

que a suplementação com Tau durante a prenhez normaliza a secreção de insulina

e a proliferação celular, restaurando a síntese de DNA, a expressão de genes

envolvidos com o metabolismo e proliferação celular, reduzindo a apoptose e

normalizando a massa de células β nas ilhotas pancreáticas destes fetos e neonatos

de mães desnutridas (CHERIF et al., 1996 e 1998; MEREZAK et al., 2001 e 2004;

BOUJENDAR et al., 2002; KALBE et al., 2005; REUSENS et al., 2008). Em modelos

de restrição proteica que pré-dispõem ao DM2 quando administrado Tau in útero

observou-se a restauração da função como um todo da ilhota pancreática da prole

via regulação da expressão de fatores de crescimento, regulação da proliferação e

apoptose. Em relação ao DM1, a suplementação com Tau durante a gestação em

camundongos não obesos diabéticos (NOD) conferiu à prole destes animais, retardo

no aparecimento do DM, aumento da taxa de sobrevida e alteração na taxa de

proliferação e apoptose nas células (ARANY et al., 2004).

28

2. JUSTIFICATIVA

A obesidade é uma doença que pode trazer sérias consequências não

apenas para quem é obeso, mas também pode acarretar prejuízos à sua

descendência. O avanço do conhecimento acerca da obesidade tem sido

acompanhado de diferentes alternativas para o seu tratamento ou prevenção, dentre

essas alternativas existem as farmacológicas, suplementares ou até mesmo

cirúrgicas (JOHNSON et al., 2017). Mas pouco ainda se conhece sobre o aspecto

hereditário da obesidade e suas comorbidades, e como ela atua na propagação

dessas características para as próximas gerações.

Atualmente está bem estabelecido que além da condição maternal, a

condição paternal tem um papel importante em predispor sua descendência a

comorbidades como; intolerância a glicose, hiperglicemia, hiperlipidemia e prejuízos

funcionais no pâncreas endócrino (GUPTA et al., 2009; MORRIS et al., 2014). As

alternativas preventivas para obesidade devem contribuir não somente com a perda

de peso, mas prevenir ou evitar alterações morfofuncionais que são desencadeadas

por essa síndrome (SBEM, 2016). Evidências experimentais demonstram que a

obesidade desencadeia uma série de prejuízos que podem ser transmitidos para

gerações posteriores. Com isto, as buscas por estratégias terapêuticas para essas

alterações são importantes na prevenção e/ou tratamento da obesidade e suas

comorbidades, principalmente a sua propagação.

A suplementação com aminoácidos apresenta ações benéficas tanto para

quem o ingere, quanto na propagação para sua descendência. Dentre esses

aminoácidos temos a Tau, no qual já é descrito que a suplementação promove

aumento da secreção da insulina em resposta a nutrientes via melhora do influxo de

Ca2+ para as células β. A suplementação com Tau também mostrou prevenir

alterações morfológicas no pâncreas de camundongos HFD, impedindo a hipertrofia

e a hipersecreção induzidas pelo ambiente de resistência à insulina (RIBEIRO et al.,

2009; RIBEIRO et al., 2012). Contudo, ainda é pouco estudado o possível papel

preventivo da suplementação com a Tau ofertada aos pais na prevenção da

propagação de alterações para os seus filhotes. Porém, já foi demonstrado que em

ratos obesos a suplementação com Tau preveniu a reatividade vascular na sua prole

(LEÃO et al., 2015). Mas em relação ao aspecto metabólico e a secreção de

insulina nada ainda foi descrito acerca da influência paternal obesa sobre sua

descendência. Mas já se sabe dos prejuízos que obesidade acarreta na sua prole,

29

dentre eles foi evidenciado que ratos obesos acasalados com fêmeas alimentadas

com dieta CTL predispuseram a sua prole a intolerância à glicose (MORRIS et al.,

2014). Diante dos diversos efeitos benéficos apresentados, a Tau tornou-se alvo de

muitos estudos, visando esclarecer os seus mecanismos de ação e as suas

diferentes funções no organismo como agente protetor na propagação dos prejuízos

na secreção de insulina e na morfologia do pâncreas endócrino na prole de pais

obesos. Portanto, é necessário aumentar as investigações acerca do possível papel

preventivo da Tau sobre a morfofunção pancreática endócrina de descendentes de

camundongos machos obesos, pois não se sabe os efeitos da associação de dieta

HFD e Tau na prole, além disso, não se conhece qual é o papel regulador da Tau

nesses processos. Por isso nesse trabalho os possíveis ações do aminoácido na

prevenção da propagação de alterações da obesidade paternal para sua prole esta

sendo investigado.

30

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral:

Investigar os mecanismos da Tau que influenciam na propagação de

alterações morfofuncionais do pâncreas endócrino da prole de primeira geração de

camundongos machos que ingeriram dieta HFD.

3.2 Objetivos específicos:

Avaliar o desenvolvimento da obesidade em camundongos dos grupos

paternais alimentados com dieta HFD e suplementados ou não com Tau e em

sua primeira geração;

Verificar a tolerância à glicose nos grupos paternais e na sua prole fêmea e

macho;

Avaliar a secreção de insulina estimulada por glicose nos grupos paternais e

na sua prole macho e fêmea;

Avaliar a morfometria do pâncreas de camundongos machos provenientes de

pai obeso por dieta HFD suplementados ou não com Tau.

31

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Grupos experimentais:

Camundongos machos C57Bl/6 foram mantidos no Biotério de

Experimentação de Roedores, localizado no Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento

Socioambiental de Macaé (NUPEM), Polo Barreto, Campus UFRJ-Macaé sob

condições de luminosidade (8h-20h) e temperatura (21 ± 2o C) controladas. Todos os

procedimentos experimentais desse estudo foram aprovados pela Comissão de

Ética em Uso de Animais para a experimentação do Campus UFRJ-Macaé

(Certificado nº.: MAC031; Anexo 1). Dos 30 aos 150 dias de vida os camundongos

foram distribuídos nos grupos:

1) Controle (CTL): camundongos alimentados com ração CTL (PragSoluções

Serviços e Comércio Ltda., Jaú, SP, BRA) e água filtrada ad libitum;

2) CTL suplementado com Tau (CTAU): camundongos alimentados com ração

CTL e suplementados com 5%* (g/V) de Tau adicionada à água filtrada ad

libitum;

*Os camundongos foram suplementados com 5% de Tau adicionado a água filtrada

pois essa concentração de Tau foi utilizada em outros trabalhos e foi eficaz em

apresentar benefícios quando associada ao consumo de dieta HFD (RIBEIRO et al.,

2012).

3) Dieta Hiperlipídica (HFD): camundongos alimentados com ração contendo

36g% de gordura (PragSoluções Serviços e Comércio Ltda., Jaú, SP, BRA) e

água filtrada ad libitum;

4) HTAU: camundongos alimentados com dieta HFD e suplementados com 5%

de Tau adicionado à água filtrada ad libitum.

Aos 150 dias de vida os camundongos machos dos grupos anteriormente

relacionados foram submetidos ao acasalamento com fêmeas CTL de 150 dias para

obtenção da prole.

Os grupos de prole foram denominados conforme o tratamento dos pais em:

1) CTL-F1; 2) CTAU-F1; 3) HFD-F1 e 4) HTAU-F1 (representação dos grupos

experimentais na Fig. 1). Ao nascer, a prole de todos os grupos foi pesada e o

número de camundongos por ninhada foi registrado.

Os grupos de prole dos 30 aos 90 dias de vida foram alimentados com ração

padrão (Nuvital, Colombo, PR, Brasil) e água filtrada ad libitum. Por todo o período

32

experimental tanto o grupo paternal, quanto os grupos de prole tiveram livre acesso

à água e às respectivas dietas (composição detalhada abaixo no Quadro 1).

Obs: * Ração padrão e água ad libitum. Figura 1: Representação esquemática dos grupos experimentais. Grupos paternais CTL

(camundongos alimentados com ração CTL e água filtrada ad libitum), CTAU

(camundongos alimentados com ração CTL e suplementados com 5% (g/V) de Tau adicionada à água filtrada), HFD (camundongos alimentados com ração contendo 36g% de

33

gordura e água filtrada ad libitum) e HTAU (alimentados com a mesma ração do grupo HFD

e suplementados com 5% de Tau), aos 150 dias de vida foram acasalados com fêmeas CTL. Os grupos de prole foram designados de acordo com o tratamento dos pais: CTL-F1, CTAU-F1, HFD-F1 e HTAU-F1. Estes foram alimentados com ração padrão e água filtrada

ad libitum dos 30 aos 90 dias de vida.

Figura 1: Representação esquemática dos grupos experimentais.

Quadro 1: Composição das dietas

Ingredientes dieta AIN-93M CTL HFD

Caseína (84% de proteína)* 140 140 Amido 465,7 208,7 Dextrina 155 100 Sacarose 100 100 L-cistina 1,8 1,8 Fibra (microcelulose) 50 50 Óleo de soja 40 40 Banha - 312 Mistura de sais AIN93G** 35 35 Mistura de vitaminas AIN93G**

10 10

Cloridrato de colina 2,5 2,5

*Valores corrigidos em função do conteúdo de proteína na caseína.

** Composição detalhada dada por REEVES et al., 1993.

4.2 Avaliação da ingestão de ração e de água e avaliação da obesidade

Os camundongos dos grupos paternais, dos 30 aos 150 dias de vida, e dos

grupos de prole, dos 30 aos 90 dias, foram pesados uma vez por semana. O

consumo de ração foi medido semanalmente sendo a ração colocada menos a ração

restante dividida pelo número de camundongos por gaiola, e a ingestão de água foi

medida a cada dois dias e então, realizada a média do consumo hídrico diário.

Obteve-se a eficiência alimentar pela razão entre o total de ganho de peso corporal

(diferença entre o peso corporal final e o peso corporal inicial) dividido pelo consumo

total de ração durante todo o período experimental (DUIVENVOORDEN et al., 2005).

Ao final do período experimental, tanto nos camundongos dos grupos

paternais, quanto nos camundongos dos grupos de prole F1, foi feita as medidas

para avaliação da obesidade pelo peso corporal final e o comprimento nasoanal

(CNA) foram medidos para obtenção do índice de Lee [calculado por meio da raiz

cúbica do peso corporal (g) dividido pelo CNA (cm) x 1000] (BERNARDIS e

PATTERSON, 1968) que é o índice de massa corpórea utilizado em roedores. Em

34

seguida, os camundongos foram eutanasiados por decapitação. As gorduras

perigonadal e retroperitoneal foram dissecadas e pesadas para avaliação da

obesidade nos camundongos. Para análise dos dados da ingestão hídrica, de ração

e eficiência alimentar foi utilizado (n= 4) camundongos no grupo paternal por grupo

experimental, e na prole fêmea e macho F1 variou o (n= 4-16) camundongos por

grupo, o número de roedores da prole dependia do sucesso do nascimento no

mesmo período para realizar as medidas. Para os parâmetros da avaliação da

obesidade nos grupos paternais os registros esteve entre (n= 8-9) camundongos, e

para os grupos de prole macho e fêmea F1 (n= 9-16), valores similares aos citados

pela literatura que indica o número de amostras necessário para a adequada análise

estatística (NARDELLI et al., 2011).

4.3 Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipgtt)

Aos 150 dias de vida dos camundongos dos grupos paternais, e aos 90 dias

dos camundongos dos grupos de prole fêmea e macho, foi realizado o ipGTT. Nos

roedores após 12h de jejum, o sangue foi coletado via caudal e então a glicemia

(tempo 0) medida utilizando-se um glicosímetro (Accu-Chek Advantage, Roche

Diagnostic, Suiça). Em seguida, os camundongos receberam uma injeção

intraperitoneal (ip) de glicose na concentração de 2g/kg de peso corporal. A glicemia

foi novamente verificada aos 15, 30, 60, 120 e 180 minutos após a administração da

glicose. Para adequada análise estatística desses dados obtidos no ipGTT foram

utilizados para o grupo paternal (n= 7-8) camundongos, e para os grupos da prole

fêmea F1 (n= 8-12) e para a prole macho F1 (n= 6-12) camundongos

correlacionando com outros estudos (RIBEIRO et al., 2009).

4.4 Parâmetros bioquímicos plasmáticos

Para a dosagem dos parâmetros bioquímicos plasmáticos, os experimentos

foram realizados aos 150 dias de vida dos grupos paternais e aos 90 dias de vida

dos grupos de prole. Na condição de alimentado, foram coletados 50 µL de sangue

via caudal e após dois dias foi realizada nova coleta de sangue, contudo após 12 h

de jejum dos mesmos camundongos. O sangue coletado foi centrifugado a 15204 x

g a 4°C, por 15 minutos, então o plasma separado foi armazenado a -20ºC e

posteriormente, direcionado à dosagem de insulina por radioimunoensaio (RIA)

(SCOTT et al., 1981), triglicerídeos, colesterol total usando kits colorimétricos

35

(Boehringer Mannhein®, Alemanha; Merck®, Alemanha; Laborclin, Pinhais, PR,

BRA) (NARDELLI et al., 2011). Para análise dos parâmetros bioquímicos foram

utilizados (n= 4) amostras por grupo experimental paternal e para os grupos de prole

variou (n= 5-19) na prole fêmea F1 e para a prole macho F1 foram usadas (n= 9-15)

amostras por grupo.

4.5 Isolamento de ilhotas pancreáticas e secreção estática de insulina

Após a eutanásia dos camundongos, tanto dos grupos paternais quanto dos

grupos de prole, foi realizada laparotomia para acesso ao ducto pancreático e sua

obstrução. Na porção distal do ducto colédoco foi introduzida uma agulha de insulina

(26 G 1/2) pela qual foi injetado no pâncreas 3 mL de solução de Hank’s (136 mM de

NaCl; 5,3 mM de KCl; 0,9 mM de MgSO4.7H2O; 0,3 mM de Na2HPO4.12H2O; 4,4

mM de KH2PO4; 1,2 mM de CaCl2.2H2O gaseificadas com 95% O2/5% CO2 , após

foi colocado 4,1 mM de NaHCO3 e em seguida acrescentado 1mM de glicose e

0,1% de albumina bovina (g/v), pH 7,4) contendo colagenase do tipo V (0,8 mg/mL),

para facilitar a retirada e iniciar a digestão do tecido exócrino. O pâncreas dissecado

foi transferido para um tubo de 15 mL e incubado a 37ºC por 18 minutos. As ilhotas

pancreáticas, completamente separadas do tecido acinar, foram coletadas uma a

uma, com auxílio de microscópio estereoscópico (Olympus Corporation model SZ2-

ILST,Tokyo,Japan). Grupos de 4 ilhotas pancreáticas de cada grupo experimental,

tanto paternal quanto da prole, foram transferidas para placas de cultura com 24

poços contendo 0,5 mL de solução de Kreb’s (115 mM de NaCl; 5 mM de KCl; 2,56

mM de CaCl2; 1 mM de MgCl2; 15 mM de HEPES suplementado com 5,6 mM de

glicose, gaseificado com 95% O2/5%, e após acrescentado 10 mM de NaHCO3 e

0,3% de albumina bovina (g/v), pH 7,4). A seguir as ilhotas pancreáticas foram

incubadas por 30 minutos em banho-maria, 37°C e continuamente gaseificadas com

95% O2/5% CO2. Após, a solução foi rapidamente removida e substituída por nova

solução de incubação contendo 2,8, 11,1 e 22,2 mM de glicose. Depois de 1h de

incubação, o sobrenadante foi removido, transferido para tubos de ensaio e

armazenado a –20°C. A dosagem de insulina foi posteriormente realizada por RIA,

utilizando-se anticorpo específico anti-insulina produzido em rato (doado gentilmente

por Dr. Leclerq-Meyer, Free University, Brussels, BEL), insulina de rato para traçar a

curva padrão (Crystal Chem. Inc., Downers Grove, IL, USA) e insulina recombinante

humana marcada com 125I (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Bucks, UK). Para

36

separação da insulina livre da porção antígeno-anticorpo formada foi utilizado o

método do carvão ativado e dextran (SCOTT et al., 1981). Para dosagem de insulina

nos grupos paternais foi utilizado para cada condição de glicose avaliada o (n= 17-

40), e nos grupos da prole fêmea F1 (n= 24-47) e na prole macho F1 (n= 19-32)

amostras por condição de glicose em cada grupo experimental conforme a literatura

sugere (RIBEIRO et al., 2012).

4.6 Morfologia do pâncreas da prole macho F1

Após a eutanásia o pâncreas de cada camundongo da prole macho F1 foi

dissecado, pesado e então fixado em solução de Bouin (25% de formaldeído, 75%

de ácido pícrico saturado e 5% de ácido acético) por 16h, e depois lavado 1 vez com

cloreto de amônia e armazenado em solução de 70% de etanol. Para análise

morfométrica dos principais tipos celulares das ilhotas pancreáticas. Posteriormente,

o pâncreas foi desidratado em concentrações crescentes de etanol (80% de etanol

20min,90% de etanol 20min e 3 diferentes banhos de 15min cada com álcool 100%

e colocados em uma solução de álcool + xilol por 15min) diafanizado em 3 diferentes

soluções de xilol por 20min cada e posteriormente incluídos em 3 diferentes banhos

Paraplast® por 30min cada (Sigma-aldrich, St. Louis, MA, USA). Em sequência,

foram obtidas secções semi-seriadas de 5 μm, com espaçamento de 100 μm entre

os cortes, até esgotamento total do tecido.

4.7 Morfometria e imuno-histoquímica para insulina, glucagon e

somatostatina

Para realização da imuno-histoquímica, as secções seriadas das mesmas

porções do pâncreas foram selecionadas, desparafinizadas, hidratadas e, após

bloqueio da peroxidase endógena [tampão tris-salina (TBS) contendo 3% de H2O2] e

dos sítios inespecíficos (0,1% Tween 20 e 5% leite desnatado em TBS), foram

incubadas com anticorpo para insulina (1:100; Dako North America, Inc., CA, USA),

ou glucagon (1:50; Dako North America, Inc., CA, USA) ou somatostatina [(1:50,

Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA (sc-7819)], todos diluídos em

solução de TBS com 3% de leite, overnight à 4ºC. Após, as secções foram lavadas

com TBS e incubadas por 1h e 30 min com anticorpo secundário conjugado com

peroxidase [anti-cobaia, ou anti-coelho ou anti-cabra, respectivamente (1:1500;

Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA, USA) diluidos em TBS com 1% de

37

leite]. A detecção da imunorreação foi realizada utilizando-se a solução 10% de DAB

(diaminobenzidina) e 0,2% de H2O2 em TBS (DAB; Sigma-aldrich, St. Louis, MA,

USA). Subsequentemente, as lâminas foram contra-coradas com solução de

hematoxilina Harris, e montadas com bálsamo sintético. Foram utilizadas 12 lâminas

por grupo de camundongos da prole macho F1 para cada tipo celular das ilhotas

pancreáticas (com mais de 5 células cada) avaliado, e então foram fotografadas nos

aumentos de 20x ou 40x em microscópio de luz Olympus BX51, acoplado a sistema

de captura de imagem (Olympus DP71, Olympus Optical do Brasil, São Paulo, SP,

BRA). A morfometria foi realizada utilizando-se o software Image J 1.50b

(http://imagej.nih.gov/ij/) calibrado com a régua conforme o aumento utilizado para

fazer as imagens, e os parâmetros avaliados foram: 1) área absoluta das ilhotas

pancreáticas, ou área absoluta das células β, ou α ou δ; 2) número de células β, ou

α ou δ; 3) massa (mg) de ilhotas pancreáticas e de células β, ou α ou δ [calculada

pelo total da área da ilhota ou das células β, ou α ou δ (µm2) dividido pela área da

secção do pâncreas (µm2), e após multiplicado pelo peso do pâncreas (mg)]; após

essas medidas estimamos a razão área de células β, ou α ou δ (µm2) dividido pelo

número das respectivas células (RIBEIRO et al., 2012). A quantificação das áreas foi

feita utilizando o recurso manual do Image J. O software foi calibrado com régua

micrométrica (1 mm) possibilitando a conversão dos valores obtidos em pixels para

um2. As medidas foram realizadas com a ferramenta de seleção a mão livre do

Image J, através da qual foi demarcada toda extensão da ilhota pancreática ou das

células que apresentaram marcação positiva para insulina, ou glucagon ou

somatostatina. Os números de células foram contados um a um. Para realização da

imuno-histoquímica foi utilizado (n= 3-4) pâncreas por grupo de prole macho F1, e os

mesmos pâncreas não foram utilizados para o experimento de secreção estática de

insulina.

4.8 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média erro padrão da média (EPM).

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Prism 5.0

(GraphPad Software, USA). Todos os resultados foram submetidos a teste de

normalidade Shapiro-Wilk e então direcionados para testes paramétricos (ANOVA

de uma via seguido de pós-teste Newman Keuls) ou não paramétricos (Kruskal-

http://imagej.nih.gov/ij/

38

Wallis seguido de pós-teste Dunns). P < 0,05 foi adotado como critério de

significância.

39

5. RESULTADOS

5.1 Ingestão de ração e água e avaliação da obesidade nos grupos paternais

e em sua respectiva prole

Na figura 2A observa-se a evolução do peso corporal ao longo de doze

semanas em camundongos dos grupos paternais alimentados com dieta HFD

suplementados ou não com Tau. Camundongos HFD começaram a apresentar

maior peso corporal a partir da nona semana de ingestão de dieta HFD em relação

ao grupo CTL (P < 0,01; Fig. 2A). Porém, a partir da quinta semana, já tínhamos

observado que o grupo alimentado com dieta HFD apresentava maior peso corporal

em relação aos CTAU se mantendo até o final do tratamento (P < 0,01; Fig. 2A).

O ganho de peso corporal total dos camundongos dos grupos paternais foi

maior no grupo HFD comparado ao CTL (P < 0,05; Fig. 2B). A suplementação com

Tau não modificou esse parâmetro (Fig. 2B).

A ingestão hídrica do grupo paternal HFD não apresentou diferença em

relação ao grupo CTL (Fig. 2C), no entanto, observou-se redução do consumo de

água nos camundongos HFD e HTAU quando comparados ao grupo CTAU (P <

0,01; Fig. 2C). Não foram verificadas diferenças no consumo total em kcal de ração

ao longo do período experimental nos grupos paternais estudados (Fig. 2C). Ainda,

a eficiência alimentar foi similar no grupo HFD, quando comparado aos CTL (Fig.

2E). O tratamento com Tau não alterou a eficiência alimentar nos grupos estudados

(Fig. 2E).

40

(A) (B)

0 2 4 6 8 10 120

10

20

30

40CTLCTAUHFDHTAU *

#

*

#

*

#

**

***

#

Semanas

Pes

o C

orp

ora

l (g

)

CTL CTAU HFD HTAU0

5

10

15

20

aa

b

a,b

Ga

nh

o d

e p

eso

co

rpo

ral

(g)

CTL CTAU HFD HTAU0

500

1000

1500

a,ba

b b

Inges

tão H

ídri

ca

AU

C (

mL

.dia

-1)

CTL CTAU HFD HTAU0

500

1000

1500

2000

Ingest

ão d

e R

ação

AU

C (

Kcal.

sem

an

as

-1)

CTL CTAU HFD HTAU0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

Efi

ciê

ncia

ali

men

tar

[Gan

ho d

e p

eso c

orp

ora

l (g

)/ i

ng

estã

o d

e ra

ção

(g)]

(C) (D) (E)

Figura 2: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos paternais. (A) Evolução do peso corporal de camundongos dos grupos paternais CTL (n = 4), CTAU (n = 4), HFD (n = 4) e HTAU (n = 4). * indica diferença estatística do grupo CTAU em relação aos HFD; # indica HFD diferente do CTL (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05). (B) Ganho de peso corporal total [peso corporal final (g) subtraído do peso corporal inicial (g) de cada camundongo]. Média ± EPM (C) da ingestão hídrica e (D) de ração, e (E) da eficiência alimentar [ganho de peso corporal total (g) divido pela ingestão de ração total durante todo período experimental (g)] ao longo do período experimental. Letras diferentes representam diferenças estatísticas. Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 2: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos paternais.

Camundongos do grupo paternal HFD desenvolveram obesidade como

comprovado pelo maior peso corporal final, índice de Lee e estoques de gordura

retroperitoneal e perigonadal em relação ao grupo CTL (P < 0,001, P < 0,001, P <

0,0001 e P < 0,0001 respectivamente; Fig. 3). No entanto, não foi observada

diferença no CNA dos grupos paternais (Fig. 3B). O consumo em gramas de Tau

diariamente nos grupos HTAU e CTAU durante o período experimental não diferiu

entre os grupos suplementados (0,256 ± 0,004 e 0,148 ± 0,028; respectivamente). A

suplementação com Tau não modificou o índice de Lee no grupo HTAU (Fig. 3C).

41

CTL CTAU HFD HTAU0

10

20

30

40

50

a a b

bb

Pes

o C

orp

ora

l F

ina

l (g

)

CTL CTAU HFD HTAU0

100

200

300

400

a

b

aa,b

Índ

ice d

e L

ee

CTL CTAU HFD HTAU0

20

40

60

aa

bb

Go

rdu

ra p

erig

on

ad

al

(mg

/g p

eso

co

rpo

ral)

CTL CTAU HFD HTAU0

5

10

15

20

25

aa

b b

Gord

ura

ret

rop

erit

on

ial

(mg

/g p

eso c

orp

ora

l)

(A) (B)

CTL CTAU HFD HTAU0

5

10

15

CN

A (

cm)

(C)

(D) (E)

Figura 3: Avaliação dos parâmetros da obesidade nos camundongos dos grupos paternais.

(A) Peso corporal final, (B) CNA, (C) índice de Lee, (D) gordura retroperitoneal e (E) gordura

perigonadal de camundongos dos grupos paternais CTL (n = 9), CTAU (n = 8), HFD (n = 9)

e HTAU (n = 8). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas. Dados de peso corporal e

gordura retroperitoneal analisados por ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, e os

demais parâmetros analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05.

Figura 3: Avaliação dos parâmetros da obesidade nos camundongos dos grupos paternais.

Os camundongos dos grupos paternais foram acasalados com fêmeas CTL

como já descrito em materiais e métodos (item 4.1). A prole obtida desses

cruzamentos não apresentou diferença no número de camundongos por ninhada

nos diferentes grupos experimentais (CTL 5,75 ± 0,45; CTAU 4,60 ± 0,60; HFD 6,33

± 0,42 e HTAU 5,20 ± 0,66). Ainda, não foram observadas alterações no peso médio

da ninhada dos grupos de prole F1 obtidos tanto de pai que ingeriu dieta HFD (2,76

± 0,10 g) ou que foi suplementado com Tau (HTAU 3,30 ± 0,30 e CTAU 3,10 ± 0,24

g), quando comparados à prole CTL (2,75 ± 0,14 g).

Na figura 4A e 4B não foram observadas diferenças na evolução ou ganho

total de peso corporal na prole macho F1 provenientes de pais HFD suplementados

ou não com Tau (Fig. 4A e 4B).

42

Ainda, na prole macho HFD-F1 o consumo hídrico (Fig. 4C), de ração (Fig.

4D), bem como eficiência alimentar (Fig. 5E) foi similar à prole CTL-F1 (Fig. 4C, 4D e

4E). Filhotes de pais suplementados com Tau também não apresentaram

modificações nesses parâmetros (Fig. 4C, 4D e 4E).

Figura 4: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos de prole macho F1. (A) Evolução do peso corporal dos 30 aos 90 dias no grupo de prole macho F1 descendentes de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau. (B) Média ± EPM do ganho de peso corporal total, (C) da ingestão hídrica (D) e de ração, e (E) da eficiência alimentar ao longo de todo período experimental da prole macho CTL (n = 9), CTAU (n = 11), HFD (n = 16) e HTAU (n = 6). Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 4: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos de prole macho.

Não foram evidenciadas alterações no peso corporal final, CNA, índice de Lee

e nos estoques de gorduras retroperitoneal e perigonadal entre os grupos de prole

macho F1 estudado (Fig. 5).

0 2 4 6 815

20

25

30CTL-F1CTAU-F1HFD-F1HTAU-F1

Semanas

Peso

Corp

ora

l (g

)

CTL-F1 CTAU-F1 HFD-F1 HTAU-F10

5

10

15

Gan

ho d

e p

eso c

orp

ora

l (g

)


100

200

300

400

500

Ing

est

ão H

ídri

ca

AU

C (

mL

.dia

-1)


500

1000

1500

Ing

estã

o d

e R

açã

o

AU

C (

Kca

l.se

ma

na

s-1

)

CTL-F1 CTAU-F1 HFD-F1 HTAU-F10.000

0.003

0.006

0.009

0.012

Efi

ciên

cia a

lim

enta

r

[Gan

ho d

e p

eso c

orp

ora

l (g

)/

inges

tão d

e ra

ção (

g)]

(A) (B)

(C) (D) (E)

43


10

20

30

Pes

o C

orp

ora

l(g)


100

200

300

400

Índ

ice

de

Lee

CTL-F1 CTAU-F1HFD-F1 HTAU-F10

5

10

15

Gord

ura

per

igon

ad

al

(m

g/g

pes

o c

orp

ora

l)CTL-F1 CTAU-F1HFD-F1 HTAU-F1

0

1

2

3

4

5

Gord

ura

ret

rop

erit

on

eal

(mg/g

pes

o c

orp

oral)

(A) (B)

(D) (E)

CTL-F1 CTAU-F1HFD-F1 HTAU-F10

2

4

6

8

10

CN

A (

cm)

(C)

Figura 5: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole macho F1. Média EPM do peso corporal final (A), CNA (B), índice de Lee (C), peso das gorduras retroperitoneal (D) e perigonadal (E) da prole macho F1 CTL (n = 9), CTAU (n = 9), HFD (n= 11) e HTAU (n= 14). Dados analisados através de ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, exceto gordura perigonadal analisado por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 5: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole macho.

Pode ser observado na figura 6A e 6B que nos grupos de prole fêmea F1, não

foram evidenciadas alterações na evolução do peso corporal e no ganho total de

peso corporal ao longo do período experimental. Entretanto, nos grupos de prole

fêmea HFD-F1 foi observado maior consumo hídrico quando comparado à prole

fêmea CTL-F1 (P < 0, 0001; Fig. 6C). O grupo CTAU-F1 também apresentou maior

ingestão hídrica em relação aos CTL F1 (P < 0,001; Fig. 6C). O grupo proveniente

de pais HTAU não apresentou diferença da ingestão hídrica (P < 0,0001; Fig. 6C)

comparado aos demais. O grupo HFD-F1 não apresentou modificação no consumo

de ração se comparado aos demais grupos F1 (Fig. 6D). A suplementação dada aos

pais promoveu aumento da ingestão de ração nos grupos HTAU-F1 e CTAU-F1, se

comparados ao grupo CTL-F1 (P < 0,0001; Fig. 6D). Porém, não foram observadas

alterações na eficiência alimentar entre os grupos de prole fêmea F1 provenientes

de pais HFD suplementados ou não com Tau (Fig. 6E).

44

(A) (B)

0 2 4 6 812

14

16

18

20

22

24CTL-F1CTAU-F1HFD-F1HTAU-F1

Semanas

Pes

o C

orp

ora

l (g

)


2

4

6

8

Gan

ho d

e p

eso c

orp

ora

l (g

)


100

200

300

400

500

a

b ba,b

Ing

estã

o H

ídri

ca

AU

C (

mL

.dia

-1)


400

800

1200

aa,b

bb

Inges

tão d

e R

açã

o

AU

C (

Kca

l.se

man

as

-1)

CTL-F1 CTAU-F1 HFD-F1 HTAU-F10.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Efi

ciên

cia

ali

men

tar

[Ga

nh

o d

e p

eso

co

rpo

ral

(g)/

ing

estã

o d

e ra

ção

(g

)]

(C) (D) (E)

Figura 6: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos de prole fêmea F1. (A) Evolução do peso corporal no grupo de prole fêmea F1 descendentes de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau. (B) Média ± EPM do ganho de peso corporal total, (C) da ingestão hídrica (D) e de ração, e (E) da eficiência alimentar ao longo de todo período experimental da prole macho CTL (n = 16), CTAU (n = 10), HFD (n = 6) e HTAU (n = 4). Dados da evolução do peso corporal analisados através de ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, e os demais dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 6: Avaliação dos parâmetros de peso corporal e ingestão hídrica e de ração nos camundongos dos grupos de prole fêmea.

Nos grupos de prole fêmea F1 não foram observadas alterações no peso

corporal final, CNA, índice de Lee e nos estoques de gordura retroperitoneal e

perigonadal (Fig. 7).

45


10

20

30

Peso

Corp

ora

l(g)


100

200

300

400

Índ

ice d

e L

ee


5

10

15

Gord

ura

per

igon

ad

al

(m

g/g

pes

o c

orp

ora

l)


1

2

3

4

5

Gord

ura

ret

rop

erit

on

eal

(mg/g

pes

o c

orp

ora

l)

(A) (B)

(D) (E)


2

4

6

8

10

CN

A (

cm)

(C)

Figura 7: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole fêmea F1. Média EPM do peso corporal final (A), CNA (B), índice de Lee (C), peso das gorduras retroperitoneal (D) e perigonadal (E) aos 90 dias de vida da prole fêmea F1 CTL (n = 12), CTAU (n = 16), HFD (n= 11) e HTAU (n= 12). Dados analisados através de ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, exceto gordura perigonadal analisado por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 7: Avaliação dos parâmetros da obesidade na prole fêmea.

5.2 Avaliação da tolerância à glicose e dos parâmetros bioquímicos

plasmáticos nos grupos paternais e em sua respectiva prole

Os camundongos dos grupos paternais foram submetidos ao ipGTT. Na figura

8A é possível observar que após a administração ip de glicose, a concentração

plasmática do açúcar atingiu maior perfil nos grupos HFD e HTAU aos 30 minutos, e

nos grupos CTL e CTAU aos 15 minutos do ipGTT (Fig. 8A). Durante o teste,

camundongos HFD apresentaram maiores valores de glicose plasmática aos 30 e 60

minutos em relação ao grupo CTL (P < 0,001 e P < 0,05; Fig. 8A). Ainda,

camundongos HFD apresentaram maior total da glicemia durante o ipGTT, quando

comparado ao grupo CTL (P < 0,001; Fig. 8B). A suplementação com Tau não

modificou os valores da glicemia no grupo HTAU em relação aos demais grupos

(Fig. 8A). O total da glicemia expresso pela área abaixo da curva, não apresentou

diferença no grupo HTAU em relação aos demais (Fig. 8B).

46

0 30 60 90 120 150 1800

200

400

600

CTAUHFDHTAU

CTL

Gli

cem

ia

(mg/d

L)

*

*

Tempo (min)

(A) (B)

CTL CTAU HFD HTAU0

20000

40000

60000

a

a

ba,b

Gli

cem

ia

AU

C (

mg/d

L.m

in-1

)

Figura 8: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos paternais durante o ipGTT. (A) Evolução da glicemia durante o teste ipGTT em camundongos dos grupos paternais CTL (n = 7), CTAU (n = 6), HFD (n = 7) e HTAU (n = 7). Os dados representam a glicemia antes e após a aplicação ip de glicose (2 g/kg de peso corporal). *Indica diferença do grupo HFD em relação ao CTL (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05). (B) Média ± EPM da AUC da glicemia durante o ipGTT dos grupos paternais. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05).

Figura 8: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos paternais durante o ipGTT.

Com relação aos parâmetros bioquímicos, nos grupos paternais as

concentrações plasmáticas de colesterol em jejum e alimentado no grupo HFD não

diferiram do grupo CTL (Tab. 1). Ainda, não foram observadas alterações nas

concentrações plasmáticas de glicose, insulina, lipídeos e triglicerídeos nos grupos

HFD tratados ou não com Tau em relação aos CTL (Tab. 1). A suplementação

aumentou a colesterolemia em jejum no grupo HTAU em relação ao grupo HFD (P <

0,05; Tab. 1). Ainda, o grupo HTAU no estado alimentado apresentou aumento da

concentração de colesterol quando comparada aos CTL e CTAU (P < 0,05; Tab. 1).

47

Tabela 1: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliados em camundongos dos grupos paternais CTL, CTAU, HFD e HTAU.

Dados representam a média EPM [CTL (n = 4), CTAU (n = 4), HFD (n = 4), HTAU (n = 4)]. Letras diferentes indicam diferença estatística. Dados analisados através de Kruskal-Wallis seguido de pós-teste Dunns, P < 0,05. Tabela 1: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliados em

camundongos aos 150 dias dos grupos paternais CTL, CTAU, HFD e HTAU.

Aos 90 dias de vida os grupos da prole macho F1 foram submetidos ao

ipGTT. Após a injeção de glicose, todos os grupos da prole macho F1 apresentaram

aumento da glicemia, atingindo os maiores valores aos 30 minutos e retornaram aos

valores basais aos 120 minutos depois da administração de glicose (Fig. 9A).

Durante o ipGTT os camundongos da prole macho HFD-F1 não apresentaram

alteração na tolerância à glicose quando comparados à prole CTL-F1 (Fig. 9A e 9B).

A suplementação com Tau dada aos pais HTAU não alterou esse parâmetro em sua

respectiva prole F1 (Fig. 9B).

CTL CTAU HFD HTAU

Glicemia (mg/dL)

Jejum 109 ±11 127 ± 8 140 ± 8 122 ± 10

Alimentado 154 ± 7 133 ± 6 165 ± 8 178 ± 12

Insulinemia (ng/mL)

Jejum 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,2 1,1 ± 0,5 0,3 ± 0,1

Alimentado

0,5 ± 0,1

1,4 ± 0,7 1,1 ± 0,3 0,8 ± 0,3

Triglicerídeos (mg/dL)

Jejum 53 ± 9 35 ± 3 36 ± 4 45 ± 2

Alimentado 75 ± 15 101 ±12 64 ± 9 93 ± 7

Colesterol (mg/dL)

Jejum 119 ± 5a, b 111 ± 11a, b 111 ± 4a 139 ± 5b

Alimentado 88 ± 6ª 72 ± 14ª 148 ±11a, b 223 ± 16b

48

(A) (B)

0 30 60 90 120 150 1800

100

200

300

400

500

CTL-F1CTAU-F1HFD-F1HTAU-F1

Tempo (min)

Gli

cem

ia (

mg/d

L)


10000

20000

30000

40000

50000

Gli

cem

ia

AU

C (

mg

/dL

.min

-1)

Figura 9: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos da prole macho F1 durante o ipGTT. (A) Perfil da concentração plasmática de glicose durante o ipGTT do grupo de prole macho F1 provenientes de camundongos paternais HFD suplementados ou não com Tau CTL (n = 6), CTAU (n = 7), HFD (n = 7) e HTAU (n= 10). Os dados demonstram a glicemia antes e após a aplicação ip de glicose (2 g/kg de peso corporal). (B) Média ± EPM da AUC da glicemia durante o ipGTT. Dados analisados através de Kruskal-Wallis seguido de pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 8: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos da prole macho durante o ipGTT.

Na tabela 2, podem ser observados os parâmetros bioquímicos plasmáticos

avaliados na prole macho F1 descendente de pais HFD suplementados ou não com

Tau. A concentração plasmática de triglicerídeos em jejum no grupo HFD-F1 não

apresentou diferença em relação aos filhotes CTL (P < 0,01; Tab. 2). A

suplementação com Tau, não modificou os valores da trigliceridemia no grupo

HTAU-F1 em relação aos demais grupos (Tab. 2). Não foram evidenciadas

alterações tanto, no estado jejum quanto em alimentado na glicemia, insulinemia, e

colesterolemia entre os grupos de prole macho F1 estudados (Tab. 2). No estado

alimentado, também não foi observada diferença nos valores de triglicerídeos entre

os grupos experimentais da prole macho F1 (Tab. 2).

49

Tabela 2: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliados na prole macho F1 descendentes de camundongos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

Dados representam a média EPM [CTL (n = 9), CTAU (n = 9), HFD (n = 11), HTAU (n = 15)]. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas. Dados analisados através de ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, P < 0,05. Tabela 2: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliados aos 90 dias de vida da prole macho descendentes de camundongos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

Os camundongos da prole fêmea F1 com 90 dias de vida foram submetidos

ao ipGTT. Após a injeção de glicose todos os grupos da prole fêmea F1

apresentaram aumento da glicemia, atingindo os maiores valores aos 30 minutos e

retornando aos valores basais aos 120 minutos após administração do açúcar (Fig.

10A). O total da glicemia, expresso pela AUC durante o teste, não diferiu entre os

grupos de prole fêmea F1 provenientes de pais HFD suplementados ou não com

Tau (Fig. 10A e 10B).


Glicemia (mg/dL)

Jejum 106 ± 8 112 ± 8 111 ± 6 118 ± 6

Alimentado 156 ± 7 135 ± 4 151 ± 6 141 ± 5

Insulinemia (ng/mL)

Jejum 0,2 ± 0,03 0,2 ± 0,07 0,2 ± 0,06 0,2 ± 0,1

Alimentado 0,2 ± 0,07 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1


Jejum 83 ± 5a,b 67 ± 5a 90 ± 5b 77 ± 3a,b

Alimentado 84 ± 7 93 ± 5 77 ± 5 91 ± 7

Colesterol (mg/dL)

Jejum 78 ± 7 67 ± 9 79 ± 7 74 ± 7

Alimentado 88 ± 4 87 ± 10 95 ± 4 89 ± 8

50

0 30 60 90 120 150 1800

100

200

300

400

500

CTL-F1CTAU-F1HFD-F1HTAU-F1

Tempo (min)

Gli

cem

ia (

mg/d

L)


10000

20000

30000

40000

Gli

cem

ia

AU

C (

mg/d

L.m

in-1

)

(A) (B)

Figura 10: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos da prole fêmea F1 durante o ipGTT. (A) Perfil da concentração plasmática de glicose durante o ipGTT na prole fêmea F1 proveniente de camundongos machos HFD suplementados ou não com Tau CTL (n = 8), CTAU (n = 11), HFD (n = 12) e HTAU (n= 12). Os dados demonstram a glicemia antes e após a aplicação ip de glicose (2 g/kg de peso corporal). (B) Média ± EPM da AUC da glicemia durante o ipGTT. Dados analisados através de Kruskal-Wallis seguido de pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 9: Avaliação da glicemia nos camundongos dos grupos da prole fêmea durante o ipGTT.

Podem ser observados os parâmetros bioquímicos plasmáticos avaliados na

prole fêmea na tabela 3. A concentração de triglicerídeos no estado alimentado não

apresentou diferença entre os grupos HFD e CTL (Tab. 3). A suplementação dada

ao grupo paternal não modificou esse parâmetro em relação ao grupo HFD. No

entanto, a trigliceridemia em alimentado do grupo HTAU reduziu quando comparada

aos filhotes CTL (P < 0,05; Tab. 3).

Nos parâmetros da glicemia, insulinemia e colesterolemia nos estados jejum

e, em alimentado não foram evidenciadas alterações (Tab. 3). Nos grupos de prole

fêmea no estado de jejum também não foi observada diferença na trigliceridemia

(Tab. 3).

51

Tabela 3: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliado na prole fêmea F1 descendente de camundongos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

Dados representam a média EPM [CTL (n = 8-17), CTAU (n = 7-15), HFD (n = 10-19), HTAU (n = 5-13)]. Letras diferentes indicam diferenças estatísticas. Dados analisados através de ANOVA de uma via seguida de Newman-Keuls, P < 0,05. Tabela 3: Parâmetros bioquímicos plasmáticos no estado de jejum e alimentado avaliado aos 90 dias de vida da prole fêmea descendente de camundongos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

5.3 Secreção estática de insulina nos grupos paternais e em sua respectiva

prole

A figura 11 mostra a secreção estática de insulina de ilhotas pancreáticas

isoladas de camundongos dos grupos paternais. Ilhotas pancreáticas de

camundongos HFD secretaram mais insulina na presença de 2,8 mM de glicose,

quando comparadas às ilhotas de Langerhans dos CTL (P < 0,0001; Fig.11). A

suplementação com Tau não modificou a secreção de insulina em resposta a 2,8

mM de glicose no grupo HTAU (Fig. 11). Quando estimuladas com 11,1 mM de

glicose as ilhotas pancreáticas de camundongos HFD hipersecretaram insulina

quando comparados aos CTL. A suplementação com Tau não modificou os a

secreção de insulina no grupo HTAU (P < 0,0001; Fig.11).

Ilhotas pancreáticas isoladas dos grupos paternais HFD quando estimuladas

com glicose 22,2 mM secretaram insulina semelhantes às ilhotas pancreáticas do

grupo CTL. Ainda, ilhotas de Langerhans dos HFD hipersecretaram insulina se


Glicemia (mg/dL)

Jejum 90 ± 5 99 ± 5 101 ± 4 100 ± 4

Alimentado 140 ± 5 132 ± 5 122 ± 4 138 ± 7

Insulinemia (ng/mL)

Jejum 0,2 ± 0,03 0,2 ± 0,07 0,2 ± 0,06 0,2 ± 0,1

Alimentado 0,2 ± 0,07 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1


Jejum 76 ± 4 79 ± 5 82 ± 6 68 ± 5

Alimentado 80 ± 7a 67 ± 4a, b 66 ± 5a, b 59 ± 3b

Colesterol (mg/dL)

Jejum 85 ± 5 82 ± 7 85 ± 7 82 ± 6

Alimentado 91 ± 7 86 ± 5 74 ± 4 77 ± 5

52

comparadas ao grupo CTAU (P < 0,05; Fig.11). A suplementação com Tau não

modificou a secreção de insulina no grupo HTAU paternal (Fig. 11).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0CTL

CTAU

HFD

HTAU

G2,8 G11,1 G22,2

a a

b a,b

a,b

a

b

a,b

aa

b

a,b

Insu

lin

a

(ng

/ilh

ota

.h)

Figura 11: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos dos grupos paternais. Grupos de 4 ilhotas pancreáticas foram incubadas por 1h em diferentes concentrações de G mM como indicado pelas barras horizontais. Dados são a média ± EPM (n=31-38 grupos de 4 ilhotas isoladas de três camundongos por grupo experimental em três experimentos independentes). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os grupos na mesma condição de G avaliada. Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 10: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos dos grupos paternais.

Pode-se observar na figura 12, a secreção estática de insulina de ilhotas

pancreáticas isoladas dos grupos de prole macho. Ilhotas de Langerhans dos

camundongos descendentes de pais HFD secretaram menos insulina na presença

de 11,1 e 22,2 mM de glicose, quando comparado às ilhotas pancreáticas da prole

CTL (P < 0,0001 e P < 0,05, respectivamente; Fig. 12). A suplementação com Tau

dada aos pais não modificou a secreção de insulina da prole macho (Fig.12).

53

0

1

2

3

4CTL-F1

CTAU-F1

HTAU-F1

HFD-F1

G2,8 G11,1 G22,2

a

a,b

b b

a

a,b

b

a,b

Insu

lin

a

(ng

/ilh

ota

.h)

Figura 12: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas na prole macho F1 proveniente de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau. Grupos de 4 ilhotas pancreáticas foram incubadas por 1h em diferentes concentrações de G mM como indicado pelas barras horizontais. Dados são média ± EPM (n=21-29 grupos de 4 ilhotas isoladas de quatro camundongos por grupo experimental em três experimentos independentes). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os grupos na mesma condição de G

avaliada. Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 11: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas na prole macho proveniente de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

Na figura 13 pode ser observada a secreção estática de insulina de ilhotas

pancreáticas isoladas da prole fêmea descendentes de pais HFD suplementados ou

não com Tau. As ilhotas de Langerhans da prole fêmea HFD-F1 na presença de 2,8

mM de glicose secretaram insulina semelhante ao grupo CTL-F1 (P < 0,05; Fig. 13).

Porém as ilhotas pancreáticas do grupo CTAU-F1 apresentaram aumento na

secreção de insulina se comparada aos filhotes HFD e CTL (P < 0,05; Fig. 13). A

Tau dada aos pais não modificou a secreção de insulina em resposta a 2,8 mM de

glicose no grupo HTAU (P < 0,05; Fig. 13). Ilhotas pancreáticas de fêmeas

descendentes de pais HFD-F1 secretaram menos insulina na presença de 11,1 mM

de glicose quando comparados aos filhotes CTL (P < 0,01; Fig. 13). No grupo de

54

fêmeas HTAU, a suplementação dada aos pais não apresentou diferença em

resposta a 11,1 mM de glicose (Fig. 13).

A secreção de insulina nas ilhotas pancreáticas da prole fêmea quando

estimuladas com 22,2 mM de glicose não apresentaram diferença entre os grupos

estudados (Fig.13).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 CTL-F1

CTAU-F1

HFD-F1

HTAU-F1

G 2,8 G 11,1 G 22,2

a

a,bb

a,b

ab a

a,b

Insu

lin

a

(ng/i

lhota

.h)

Figura 13: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas na prole fêmea F1 provenientes de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau. Grupos de 4 ilhotas de Langerhans foram incubadas por 1h em diferentes concentrações de G mM como indicado pelas barras horizontais. Dados são média ± EPM (n=21-29 grupos de 4 ilhotas isoladas de quatro camundongos por grupo experimental em três experimentos independentes). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os grupos na mesma condição de G avaliada. Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Figura 12: Secreção estática de insulina estimulada por diferentes concentrações de glicose (G) em ilhotas pancreáticas isoladas na prole fêmea provenientes de camundongos dos grupos paternais HFD suplementados ou não com Tau.

5.4 Morfologia e imuno-histoquímica no pâncreas da prole macho

Na figura 14, pode-se observar que foi realizada a imuno-histoquímica para

insulina, ou glucagon ou somatostatina somente no pâncreas endócrino da prole

macho F1. Evidenciamos que o efeito da programação pela dieta HFD e da Tau no

55

pai foi similar sobre a secreção de insulina de ambas as proles então prosseguimos

avaliando o pâncreas da prole macho F1.

A análise morfométrica mostrou que o número de células β por ilhota foi

similar entre os diferentes pâncreas coletados dos grupos de prole macho estudados

(P < 0,01, Fig. 15A). Contudo, foi observado que o grupo de prole macho HFD-F1

apresentou redução do número de células α e δ por ilhota quando comparado à

prole CTL-F1 (P < 0,0001; Fig. 15B e 15C). A suplementação dada aos pais HTAU

não modificou o número de células β entre os grupos estudados de filhotes machos

(Fig. 15A). Porém, a suplementação reduziu o número de células α no grupo HTAU,

quando comparado ao CTL. Ainda, a Tau preveniu a redução do número de células

δ no pâncreas dos filhotes machos HTAU-F1 quando comparado ao grupo de prole

HFD (P < 0,0001; Fig. 15C). No entanto, os valores do número de células δ dos

filhotes HTAU-F1 foram similares aos do grupo de prole CTL-F1 (Fig. 15C).

Com relação ao tamanho das células endócrinas pancreáticas, o grupo HFD

apresentou células β menores em relação às CTL-F1 (P < 0,0001; Fig. 15D).

Contudo, o tamanho das células α e δ no grupo HFD não diferiram quando

comparadas ao dos filhotes CTL (Fig. 15E e 15F). A suplementação com Tau dada

ao grupo paternal impediu a redução do tamanho das células β na prole HTAU

quando comparada com os filhotes HFD (P < 0,0001; Fig. 15D), sendo similar ao

tamanho das células CTL (Fig. 15D). A Tau dada aos pais aumentou o tamanho das

células α em relação ao grupo de prole macho CTL-F1 (P < 0,01; Fig. 15E). Ainda, a

Tau dada aos pais reduziu o tamanho das células δ quando comparado aos filhotes

HFD (P < 0,01; Fig. 15F).

Na tabela 4, pode-se observar que as alterações celulares relatadas acima

não foram acompanhadas por modificações no peso do pâncreas, no número de

ilhotas pancreáticas por secção e o número de ilhotas pancreáticas analisadas entre

os grupos estudados (Tab. 4). No entanto, não foram observadas alterações na área

absoluta e massa das ilhotas pancreáticas, ou área de células β, ou α ou δ nos

grupos de filhotes machos estudados (Tab. 4).

56

Figura 14: Imuno-histoquímica para insulina, ou glucagon ou somatostatina no pâncreas coletado da prole macho F1 proveniente de pais HFD suplementados ou não suplementados com Tau. Insulina (A, D, G e J), glucagon (B, E, H e K) e somatostatina (C, F, I e L). (Barra de escala 100 μm). Figura 13: Imuno-histoquimica para insulina, ou glucagon ou somatostatina no pâncreas coletado da prole macho proveniente de pais HFD suplementados ou não com Tau.

INSULINA GLUCAGON SOMATOSTATINA

(A) (B) (C)

(F)

(I)

(L) (K)

(E)

(H) (G)

(D)

(J)

57


10

20

30

Nú

mero

de c

élu

las


5

10

15

20

25

a

b,c

c

a,b

Nú

mero

de c

élu

las


5

10

15

20

25

a

b b

a

Nú

mero

de c

élu

las


100

200

300

a

bb a

Áre

a d

e cé

lula

(

m2

)/n

º d

e cé

lula


100

200

300

400

500

a a,b

a,b

b

Áre

a d

e cé

lula

(

m2)/

nº

de

célu

la


50

100

150

200

250

a,b

a

b

a

Áre

a d

e cé

lula

(

m2)/

nº

de

célu

la

(A) (B) (C)

(F)(E)(D)

Figura 15: Quantificação dos principais tipos celulares das ilhotas pancreáticas da prole macho F1 provenientes de pais HFD suplementados ou não com Tau. Média ± EPM (n =3-4 pâncreas) (A e D) do número de células β e a razão da área de células β pelo número de células β, (B e E) do número de células α e razão da área de células α pelo número de células α, (C e F) do número de células δ e a razão da área de células δ pelo número de células δ. Dados analisados através de Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P <

0,05. Figura 14: Quantificação dos principais tipos celulares das ilhotas pancreáticas da prole macho proveniente de pais HFD suplementados ou não suplementados com Tau.

58

Tabela 4: Morfometria do pâncreas endócrino da prole macho F1 proveniente de pais HFD suplementados ou não suplementados com Tau.

CTL-F1 CTAU-F1 HFD-F1 HTAU-F1 Peso do pâncreas (g)

144 ± 10

189 ± 2 162 ± 13 164 ± 9

Área das ilhotas pancreáticas (μm2)

6943 ± 468

6341 ± 562

7247 ± 371

6241 ± 385

Área das células β (μm2)

4198 ± 348 4519 ± 439 5168 ± 354 4222 ± 444

Área das células α (μm2)

1424 ± 197 1176 ± 163 875 ± 97 982 ± 129

Área das células δ (μm2)

841 ± 348 644 ± 93 660 ± 59 737 ± 137

Massa da ilhota (mg)

3,26 ± 0,43 4,13 ± 0,8 4,57 ± 0,54 3,49 ± 0,64

Massa das células β (mg)

2,65 ± 0,46 3,27 ± 1,02 4,21 ± 0,61 2,54 ± 0,63

Massa das células α (mg)

0,42 ± 0,11 0,52 ± 0,25 0,46 ± 0,09 0,47 ± 0,13

Massa das células δ (mg)

0,35 ± 0,08 0,35 ± 0,09 0,32 ± 0,05 0,33 ± 0,11

lhotas/secção

18 ± 3 21 ± 4 20 ± 3 16 ± 2

Número de ilhotas pancreáticas analisadas

373

351

562

427

Dados são a média ± EPM do pâncreas coletado da prole macho F1 CTL (n = 4), CTAU (n = 4), HFD (n = 4) e HTAU (n = 3). Dados analisados por Kruskal-Wallis seguido do pós-teste Dunns, P < 0,05. Tabela 4: Morfometria do pâncreas endócrino da prole macho proveniente de pais HFD suplementados ou não suplementados com Tau.

59

6. DISCUSSÃO

Nesse estudo, observamos que o consumo de dieta HFD pelos pais foi eficaz

em induzir a obesidade, prejuízos na tolerância à glicose e hipersecreção de

insulina.

Pela primeira vez evidenciamos que a obesidade dos pais apesar de não

interferir na adiposidade e na tolerância a glicose em sua prole, promoveu prejuízos

na secreção de insulina. A prole fêmea e macho proveniente de pais HFD secretou

menos insulina em resposta a diferentes estímulos de glicose. Ainda, foi verificado

que os filhotes machos HFD apresentaram redução no número das células α e δ no

pâncreas, sem alterações no número de células β pancreáticas. Porém, os filhotes

machos HFD tiveram redução do tamanho das células β, mas essa alteração não foi

acompanhada de modificações no tamanho das células α e δ.

A suplementação com Tau não impediu a obesidade, a intolerância à glicose,

porém reduziu parcialmente a hipersecreção de insulina no grupo paternal HTAU.

Na prole proveniente de pais que consumiram dieta HFD e Tau, evidenciamos que a

Tau melhorou parcialmente a secreção de insulina, além disso, o número de células

δ e o tamanho das células β no pâncreas endócrino dos filhotes machos HTAU

foram similares ao da prole CTL. Ainda, o tamanho das células α na prole macho

HTAU foi maior. Sugerindo possível ação preventiva da Tau contra alterações

morfofuncionais no pâncreas endócrino que podem ser propagadas dos pais para

sua descendência.

Para melhor abordagem, os resultados dos grupos paternais e de suas proles

serão discutidos em tópicos.

6.1 Ações da suplementação com Tau no desenvolvimento da obesidade

nos grupos paternais e na sua respectiva prole

A dieta HFD tem sido amplamente utilizada na literatura para induzir a

obesidade em roedores, pois o consumo desse tipo de dieta retrata o atual cenário

mundial em que o excesso de lipídios presente na alimentação vem sendo

considerado um dos principais fatores que contribuem para a expansão da

obesidade na população (BRINGHENTI et al., 2016). Dessa forma a utilização da

dieta HFD pode contribuir para desvendar os mecanismos envolvidos na

fisiopatologia dessa doença e na propagação de prejuízos metabólicos para próxima

60

geração. Em nosso estudo, os camundongos machos C57Bl/6 foram alimentados

com dieta HFD por 16 semanas. A partir da nona semana de ingestão de dieta HFD,

os camundongos do grupo paternal começaram a apresentar aumento do peso

corporal e isso permaneceu até o final do tratamento. Ainda, de acordo com estudos

prévios (AHREN e PACINI, 2002; DE SOUZA et al., 2007; TSUBOYAMA-KASAOKA

et al., 2006; WINZELL et al., 2007; ARAUJO et al., 2007), a dieta HFD aumentou o

peso corporal final, o índice de Lee e os estoques de gordura. Esse tempo de

consumo da dieta HFD, foi usado em nosso estudo, por ter sido previamente

demonstrado pela literatura que além de induzir obesidade é tempo suficiente para

serem desencadeados prejuízos como a intolerância à glicose e a hiperfunção do

pâncreas endócrino (BOSE et al., 2008).

Apesar dos camundongos desenvolverem obesidade, nossos dados não

demonstraram modificações no consumo de ração e eficiência alimentar pela dieta

HFD. De acordo com SANTOS e VIANA (2007) camundongos HFD consomem

menor quantidade de ração devido ao maior aporte energético da dieta. Contudo,

como a ingestão de energia cronicamente excede o gasto energético, o resultado é

ganho de peso corporal e, consequentemente, obesidade (SANTOS e VIANA,

2007). Porém este dado ainda é discutido, DUARTE e colaboradores (2006),

mostraram que camundongos alimentados com dieta HFD apresentaram consumo

energético maior, mas sem modificação no consumo diário em gramas. Apesar dos

relatos contraditórios, tanto nos trabalhos que fazem correlação da dieta HFD com a

hiperfagia quanto nos que não correlacionam com essa condição, o consumo de

dieta HFD pode promover o aumento da adiposidade e apresentar maior propensão

de danos na tolerância à glicose (VELLOSO, 2009; ORNELLAS et al., 2015). Um

dos mecanismos pelos quais a dieta HFD contribui para esse prejuízo seria pelo

maior aporte de ácidos graxos saturados que podem mediar ações inflamatórias por

interagirem com os receptores do tipo Toll (TLR). Foi demonstrado que a interação

desses lipídeos com receptores TLR nas micróglias no hipotálamo estimula a

produção de citocinas pró-inflamatórias que promovem a destruição dos neurônios

responsáveis pelo controle do apetite e da termogênese (MILANSKI et al., 2009).

Os camundongos do grupo paternal HFD apresentaram redução do consumo

hídrico que pode estar relacionada ao aumento do consumo de lipídeos. Nesses

roedores a maior ativação da via lipogênica, pode contribuir para a produção pelo

metabolismo de água. A lipogênese ocorre principalmente quando a razão ATP/ADP

61

é alta, ou seja, o aumento de substratos para formação de ATP resulta em excesso

de acetil-CoA. Este é o precursor da biossíntese de ácido graxo, e a enzima acetil-

CoA carboxilase é uma das principais responsáveis por essa síntese, e age nesse

processo transferindo o grupo carboxila do bicarbonato para o acetil-CoA formando

assim, o malonil-CoA. A via lipogênica é composta por quatro etapas, na primeira

acontece à condensação do grupo malonil e acetil por ação da β-cetoacil-ACP

sintase formando acetoacetil-CoA e liberando CO2; em sequência há redução dos

grupos carbonila, onde o doador de elétron para acetoacetil-CoA é o NADPH,

formando assim o β-hidrobutiril-ACP; na terceira etapa ocorre a desidratação do β-

hidrobutiril-ACP pela β-hidroxiacil-ACP desidratase desencadeando a liberação de

água e formação de uma dupla ligação entre os carbonos (KHAN et al., 2016).

Ainda, na via lipogênica a última etapa tem a redução da dupla ligação, tendo

novamente o NADPH que é utilizado como doador de elétrons, o qual serve para

romper a dupla ligação da cadeia de ácidos graxos recém-formada para formar o acil

graxo. A cadeia acil-graxo cresce pela adição de grupos de dois átomos de carbono

doados pelo malonato e com perda de CO2. Sete ciclos de condensação e redução

produzem o grupo palmitoil saturado com 16 carbonos, liberando sete moléculas de

água (KHAN et al., 2016). Portanto, sugere-se que a ingestão de dieta HFD por

aumentar a lipogênese (IMAI et al., 2016), também promova maior produção

endógena de água reduzindo o consumo hídrico.

A suplementação com Tau em modelos experimentais de obesidade já

mostrou reduzir a síntese de lipídeos por diminuir a expressão da ácido graxo

sintase e acetil-CoA carboxilase no fígado (FUKUDA et al., 2011). A Tau demonstrou

também aumentar a expressão da carnitina palmitoil-transferase (CPT)-1α no fígado,

enzima envolvida com a primeira etapa do transporte dos ácidos graxos para a β-

oxidação (RUTHERFORD et al., 2010; CHANG et al., 2011; GENTILE et al., 2011;

VAVROVA et al., 2016). Segundo TSUBOYAMA-KASAOKA e colaboradores (2006),

em camundongos que não expressam leptina (ob/ob) ou que foram alimentados com

dieta HFD, à obesidade está associada à redução da concentração plasmática de

Tau. Em humanos com sobrepeso, ZHANG e colaboradores (2004) observaram que

a suplementação com o aminoácido reduz o peso corporal. Contudo, apesar dessas

diferentes observações da Tau contra a adiposidade, em nosso estudo, o

aminoácido não preveniu a obesidade no grupo paternal HTAU. Esses achados são

similares aos evidenciados em camundongos fêmeas Swiss alimentadas com HFD e

62

suplementadas com Tau que apresentaram melhora da homeostase da glicose sem

prevenção da obesidade (RIBEIRO et al., 2012).

Atualmente, sabe-se que a obesidade tanto maternal quanto paternal tem

forte influência sobre o desenvolvimento da obesidade na sua descendência. A

literatura tem muitos dados sobre os efeitos da obesidade materna e a programação

da adiposidade e prejuízos em sua prole. Porém os conhecimentos acerca da

influência da obesidade paterna sobre sua descendência ainda são escassos e

muitas vezes controversos. Foi demonstrado que a prole de primeira geração de

camundongos machos obesos por ingestão de dieta HFD apresentou elevado peso

corporal ao nascer (HIRAMATSU et al., 2016). Porém, já foi relatado que na idade

adulta, a prole de pais HFD não apresentou aumento do peso corporal

(HIRAMATSU et al., 2016). Ratas descendentes de roedores machos alimentados

com dieta HFD também não apresentaram alterações na adiposidade (NG et al.,

2010). Nossos resultados vão de encontro com esses últimos relatos, visto que a

prole macho e fêmea de pais HFD não apresentaram alteração no peso corporal ao

nascer e na adiposidade na vida adulta.

Os dados acerca da contribuição da obesidade paternal sobre as

modificações no padrão de ingestão alimentar e hídrica da prole também são

escassos. AKYOL e colaborados (2011) não evidenciaram diferença na ingestão de

ração e consumo de água na prole de ratos machos alimentados com dieta HFD.

NG e colaboradores (2010) também observaram que a ingestão paterna de dieta

HFD não alterou a eficiência energética na prole fêmea. O que é diferente do

observado na programação materna, na qual é frequente o aumento do consumo

energético em filhotes provenientes de fêmeas alimentadas com dieta HFD

(SAMUELSSON et al., 2008; NIVOIT et al., 2009). Em nosso estudo, em ambas as

proles não foram observadas diferenças no consumo de ração e eficiência alimentar

nos filhotes provenientes de pais HFD, porém na prole fêmea HFD foi observada

maior ingestão hídrica.

A literatura carece de dados acerca das alterações na ingestão hídrica em

filhotes de pais obesos. Porém, de acordo com achados em prenhas que passaram

por privação nutricional durante a gestação, o organismo do feto se adaptou a esse

ambiente intrauterino adverso. Ocorreu reprogramação na expressão dos genes

através de mecanismos epigenéticos que fazem com que o metabolismo da sua

prole se torne poupador e isso se mantém após o nascimento (CASTRO et al.,

63

2009). Portanto, é possível que tais modificações epigenéticas no metabolismo

possam modificar o consumo de água na prole, contudo, maiores estudos são

necessários para desvendar quais etapas do metabolismo em filhotes de pais

obesos por dieta HFD são modificados e promovem alterações no consumo hídrico.

Também não evidenciamos alterações no peso corporal e na adiposidade dos

filhotes provenientes de pais HTAU. Não há estudos prévios que abordem as ações

da Tau dada aos pais sobre a obesidade na prole. Contudo, existem informações

relatadas sobre os efeitos da suplementação materna com Tau sobre a prole. A

prole proveniente de camundongos CTL fêmeas suplementadas com Tau durante a

gestação apresentou prejuízos como maior mortalidade, hipoglicemia ao

nascimento, maior ganho de peso corporal, aumento dos estoques de gordura e

redução do peso do pâncreas (HULTMAN et al., 2007). Efeitos similares foram

observados na prole de ratas suplementadas com Tau durante a gestação

(BOUJENDAR et al., 2002; LI et., 2013). Portanto, a suplementação com Tau em

modelos experimentais CTL parece ser prejudicial para sua prole.

A suplementação com Tau tem ação direta sobre o hipotálamo. Segundo,

SOLON e colaboradores (2012) a administração intracerebroventricular (icv) de Tau

em ratos reduziu a expressão de peptídeos orexigênicos sem modificar a quantidade

de peptídeos anorexígenos, diminuindo a ingestão de alimentos. Este efeito foi

acompanhado por aumento da expressão da pAkt no hipotálamo. A Tau também

modificou a atividade hipotalâmica por ativar vias como da proteína Janus quinase 2

(JAK2)/STAT3 (Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3) e o alvo da

rapamicina em mamíferos (mTOR)/proteína quinase dependente de AMP (AMPK)

(SOLON et al., 2012). Contraditoriamente a esses achados, em nosso estudo a prole

fêmea HTAU e CTAU apresentou aumento do consumo de ração, demonstrando

que alterações dependentes do gênero no consumo alimentar podem programar a

hiperfagia, o que merece mais estudos para compreender os mecanismos

epigenéticos que a Tau estaria modificando nesses roedores.

64

6.2 Ações da suplementação com Tau na homeostase glicêmica e nos

parâmetros bioquímicos plasmáticos dos grupos paternais e de sua

respectiva prole

Estudos demonstraram que o aumento da ingestão de gordura está associado

à redução da sensibilidade a insulina e ao aumento do risco de desenvolver DM

(CURI et al., 2002; KOWALSKI et al., 2017). O consumo de gorduras saturadas em

excesso pode modificar o funcionamento das células β pancreáticas reduzindo a

síntese e a secreção de insulina (LIN e SUN, 2010). O aumento da utilização de

ácidos graxos ao invés de glicose nos tecidos-alvo da insulina seria responsável

pela diminuição da oxidação de carboidratos e do transporte de glicose (WANG et

al., 2015). Isso ocorre porque a elevada β-oxidação com consequente aumento da

produção de acetil-CoA, resulta em inibição da piruvato desidrogenase e oxidação

do piruvato. Ao mesmo tempo, o aumento de citrato e ATP inibem a

fosfofrutoquinase e a glicólise, resultando em acúmulo da glicose-6-fosfato, a qual

inibe a atividade da hexoquinase, com redução no transporte e fosforilação da

glicose. Tais ações podem estar sendo desencadeadas nos camundongos do grupo

paternal HFD e contribuir para o prejuízo na homeostase da glicose nesses

roedores, visto que esse desvio no metabolismo desencadeia a intolerância à

glicose (SMERECZYŃSKI et al., 2016).

De acordo com CHEIK et al. (2006) os mecanismos que relacionam elevada

adiposidade à dislipidemias não estão completamente esclarecidos. Ainda, conforme

o tempo de ingestão da dieta HFD esses parâmetros diferem entre os estudos

(CHEIK et al., 2006; AKAMINE et al., 2010). Em nosso estudo os camundongos

paternais HFD não apresentaram modificações nas concentrações plasmáticas de

glicose, insulina, triglicerídeos e colesterol. ESTADELLA e colaboradores (2004)

também não observaram diferença na glicemia em roedores alimentados com dieta

HFD. Contudo, outros estudos registraram hiperglicemia no estado alimentado em

camundongos HFD (DUARTE et al., 2001; BERNARDES et al., 2004; CHEIK et al.,

2005). Em relação à insulina, os estudos também demonstraram que a

concentrações plasmáticas de insulina podem variar conforme o tempo de ingestão

da dieta HFD (CHEN e NYOMBA., 2003; ESTADELLA et al., 2004; CHEIK et al.,

2006; AKAMINE et al., 2010). Alguns autores registraram em ratos hiperinsulinemia

como efeito agudo da administração de dieta HFD, porém após dois meses desse

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kowalski%20GM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28360081

65

regime a insulinemia se normalizou (CHEN e NYOMBA., 2003; CHEIK et al., 2006).

Também foi visto hiperinsulinemia em ratas que consumiram a dieta HFD durante

quatro e seis meses (AKAMINE et al., 2010). Porém, a administração da dieta HFD

por período de um ano demonstrou reduzir as concentrações de insulina circulantes

(ESTADELLA et al., 2004).

As dislipidemias são desordens plasmáticas encontradas tanto em modelos

de obesidade experimental, quanto em humanos obesos (NARDELLI et al., 2011;

GÓMEZ-HERNÁNDEZ et al., 2016; CHOI et al., 2017). Porém, camundongos não

são modelos ideais para estudar dislipidemias, pois eles só expressam esse prejuízo

se houver algum tipo de modificação genética devido a elevada distribuição de

transportadores teciduais para ácidos graxos e colesterol, que promove a rápida

internalização desses compostos, bem como a utilização ou armazenamento

(CESARETTI et al., 2006; KIMURA et al., 2017, YANG et al., 2017). Possivelmente

por esse motivo em nosso estudo os camundongos dos grupos paternais HFD não

apresentaram diferença nas concentrações plasmáticas de lipídeos que foram

analisados.

Foi demonstrado que o aminoácido Tau regula a homeostase da glicose por

melhorar a secreção de insulina pelas células β e também aumentar a sensibilidade

periférica à insulina (CARNEIRO et al., 2009). A Tau aumenta as ações da insulina,

provavelmente, por interagir com o receptor de insulina (MATURO e KULAKOWSKI,

1988). Camundongos CTL que receberam injeção ip de 165 µM de Tau

apresentaram aumento da fosforilação do IRβ no fígado e músculo em valores

similares aos observados quando insulina foi administrada (CARNEIRO et al., 2009).

Mas, em nosso estudo a suplementação com Tau nos camundongos machos HTAU

não impediu a intolerância a glicose. De fato, as ações benéficas da Tau nem

sempre são acompanhadas por modificações na tolerância a glicose. NARDELLI e

colaboradores (2011) evidenciaram que ratos com obesidade hipotalâmica e

suplementados com Tau também demonstraram melhora no perfil lipídico

plasmático, porém sem modificação na intolerância à glicose.

A Tau pode aumentar a atividade da colesterol 7α-hidroxilase, enzima

limitante para síntese do ácido biliar, estimulando a conversão de colesterol para

ácido biliar, e essa ação demonstrou reduzir as concentrações plasmáticas e

hepáticas de colesterol em camundongos e ratos (MURAKAMI et al., 2002; CHEN et

al., 2016). Mas em nosso estudo os grupos suplementados com Tau apresentaram

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Choi%20JY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=28368312

66

aumento da colesterolemia. Esses dados se assemelham aos de SANTOS e

colaboradores (2015), que observaram em fêmeas ovariectomizadas alimentadas

com dieta HFD e suplementadas com Tau aumento nas concentrações plasmáticas

de colesterol, porém o mecanismo envolvido em tal efeito não foi relatado. Talvez a

suplementação prolongada com Tau desencadeie ações prejudiciais no metabolismo

do colesterol, porém é necessário mais estudo para investigar esse mecanismo.

Pouco se sabe sobre o papel da condição metabólica paternal influenciando

nas concentrações plasmáticas de insulina, glicose e triglicerídeos de sua prole (NG

et al., 2010; SOUBRY et al., 2013; FULLSTON et al., 2013). Estudo utilizando a

prole fêmea proveniente de ratos machos Sprague-Dawley que consumiram HFD,

não evidenciou alterações na adiposidade e concentrações plasmáticas de

triglicerídeos, insulina e glicose. SOUBRY, FULLSTON e colaboradores (2013)

também não observaram alterações nesses mesmos parâmetros em filhos de pais

obesos. Porém, ratas descendentes de pais HFD foram intolerantes à glicose devido

à redução na secreção de insulina (NG et al., 2010). Nossos dados se aproximam

dos previamente relatados, pois apesar de não evidenciarmos alterações na

tolerância à glicose, a prole de pais HFD apresentou redução da secreção de

insulina sem modificação nos parâmetros bioquímicos plasmáticos.

Em nosso trabalho também não evidenciamos alterações na tolerância à

glicose e nos parâmetros bioquímicos plasmáticos estudados dos grupos de proles

provenientes de pais suplementados com Tau. Porém, são escassos na literatura

estudos sobre os efeitos da suplementação com Tau dada aos pais sobre a

tolerância a glicose, e nas concentrações de insulina, glicose, colesterol e

triglicerídeos de sua prole. Contudo, foi observado que fetos provenientes de ratas

prenhas submetidas à restrição proteica, mas suplementadas com Tau tiveram

normalização da secreção de insulina e da proliferação das células β pancreáticas

(BOUJENDAR et al., 2002; KALBE et al., 2005; REUSENS et al., 2008). Esses

dados são indícios que o aminoácido Tau pode regular mecanismos epigenéticos

que previnem as ações deletérias propagadas dos pais para a sua prole.

67

6.3 Ações da suplementação com Tau na morfofunção pancreática

endócrina tanto no grupo paternal quanto na sua prole

Os prejuízos na ação da insulina estão associados ao acúmulo de lipídeos, à

inflamação tecidual, ativação de vias como do estresse de retículo endoplasmático,

entre outros, que comprometem a sensibilidade à insulina nos tecidos-alvo

(SAMUEL e SHULMAN, 2012). Em paralelo a resistência à insulina, alterações

morfológicas e funcionais acontecem nas ilhotas pancreáticas, resultando em

aumento na massa de células β e na secreção de insulina, o que ocasiona a

hiperinsulinemia (SEINO, SHIBASAKI e MINAMI, 2011).

A obesidade está fortemente associada à hipersecreção de insulina e

resistência à insulina. Alguns estudos já evidenciaram que o consumo da dieta HFD

por ratos e camundongos pode predispor à intolerância à glicose e hiperinsulinemia,

condições essas podendo estar associadas ao consumo de ácidos graxos oriundos

da dieta HFD (GREENBERG et al., 2006; BENOIT et al., 2013; ŠEFČÍKOVÁ et al.,

2016). Os mecanismos pelos quais os ácidos graxos plasmáticos podem promover

esses efeitos incluem o aumento da geração de metabolitos lipídicos, das espécies

reativas de oxigênio (ROS) e das citocinas pró-inflamatórias (BODEN et al., 2011).

A hiperinsulinemia compensatória devido à redução na ação do hormônio foi

comprovada em experimentos com ilhotas pancreáticas isoladas de roedores que

consumiram dieta HFD (MCLELLAN et al., 2007; GRAY et al., 2010). A hiperfunção

resulta em modificações morfológicas no pâncreas endócrino, na primeira semana

de ingestão da dieta HFD tanto por ratos, quanto por camundongos foi observado

aumento da proliferação e da massa das células β (ALONSO et al., 2007;

STAMATERIS et al., 2013). Após três meses de consumo da dieta HFD ainda foi

observado aumento da massa das células β, mas tal efeito foi relacionado à

hiperplasia das células insulares (AHRÉN et al., 2010). Há evidências de que a

proliferação da célula β declina com a idade, roedores apresentaram redução da

taxa de proliferação em dez vezes no quarto mês de vida quando comparada ao

primeiro mês de ingestão da dieta HFD (GOLSON et al., 2010; ROAT et al., 2014).

Em seis meses de consumo de dieta HFD, apesar de também ser evidenciado

aumento do tamanho das células β foram relatados danos estruturais relacionados à

menor expressão de genes envolvidos na resposta imune e na composição da

matriz extracelular (ROAT et al., 2014). Porém, quando o consumo da dieta HFD foi

68

de um ano foi evidenciada redução na apoptose das células β, o que possivelmente

pode contribuir para o aumento do volume (AHRÉN et al., 2010). Aos quatorzes

meses de administração da dieta HFD, foi obeservado ausência na capacidade de

proliferação da célula β em camundongos, condição que contribui para o declínio

funcional do pâncreas e predispõe ao DM (GOLSON et al., 2010; ROAT et al.,

2014). Portanto, o consumo da dieta HFD pode levar a prejuízos morfofuncionais

que são tempo dependentes para que ocorra declínio na função pancreática

endócrina no pâncreas endócrino e estabeleça o DM2.

Em nosso estudo, como previamente relatado por RIBEIRO et al. (2012) as

ilhotas pancreáticas de camundongos do grupo paternal HFD hipersecretaram

insulina em todas as concentrações estimulatórias de glicose estudadas. Contudo,

evidenciamos pela primeira vez que a ingestão de dieta HFD pelos pais promoveu

redução da secreção de insulina em sua prole. Apesar de poucos estudos

evidenciarem os efeitos da obesidade paternal sobre a fisiologia do pâncreas

endócrino de seus filhotes, estudo realizado por NG e colaboradores mostrou que o

consumo de dieta HFD pelos pais promoveu redução na secreção de insulina nos

filhotes fêmeas durante o ipGTT. Foi observado que a menor liberação da insulina

nesses filhotes está associada à redução da metilação do gene da subunidade alfa

2 do receptor para interleucina 13 (Il13rα2) que normalmente não é expresso nas

ilhotas de Langherans, este foi o primeiro achado de que há propagação

intergeracional de prejuízos metabólicos pelo consumo de dieta HFD pelos pais para

a sua prole (NG et al., 2010). O gene Il13rα2 quando expresso modula o

crescimento e invasão de várias linhas celulares de câncer de pâncreas e é

estimulado pela citocina pró-inflamatória TNF-α. Na obesidade é evidenciado que

essa citocina está aumentada em vários tecidos-alvo da insulina (GUIMARÃES et

al., 2007). Além disso, em roedores e humanos a concentração de leptina no plasma

está elevada devido ao aumento da adiposidade. Essa adipocitocina aumenta a

expressão do gene Il13rα2 no tecido adiposo (KAWAKITA et al., 2001; PINTO et al.,

2014) e em conjunto, a leptina e o Il13rα2, reduzem a expressão do gene da pró-

insulina e a secreção da insulina (MENDONÇA et al., 2015). Tanto a deficiência

quanto a resistência à leptina em ratos obesos estão acompanhadas de severa

resistência insulínica. Segundo GUIMARÃES et al. (2007), estudos realizados em

ratos evidenciaram que esse efeito parece ser mediado indiretamente pelo sistema

nervoso central. A leptina inibe a secreção de insulina por ativar canais de KATP o

69

que hiperpolariza a célula, além disso ativar a proteína quinase dependente de AMP,

e também promove a oxidação de triglicerídeos do tecido adiposo reduzindo o

acúmulo de gordura, condição que inibe a lipogênese e estimula a lipólise

(GUIMARÃES et al., 2007). Portanto, a condição metabólica do pai tem forte

propensão em propagar modificações epigenéticas que comprometem a função

pancreática endócrina da prole.

Nossos achados no pâncreas endócrino da prole HFD se assemelham

também aos mostrados na prole proveniente de fêmeas que foram submetidas à

restrição proteica durante a gestação e que apresentaram redução da secreção de

insulina (CHERIF et al.,1998 e 2001). Nesses filhotes foi observado menor massa de

células β devido à maior apoptose (BOUJENDAR et al., 2002). A origem molecular

dessas alterações, transmitidas da mãe para o feto, ainda não são totalmente

compreendidas, mas estudos recentes tem também apontado a epigenética como

uma possível explicação para esses fenômenos.

Com relação à suplementação com Tau, foi previamente demonstrado que

camundongos que ingeriram o aminoácido por 30 dias apresentaram aumento da

secreção de insulina em resposta à glicose (RIBEIRO et al., 2009). Mas, quando a

Tau foi administrada em fêmeas que consomem dieta HFD, foi evidenciado que o

aminoácido impediu a hiperfunção das células β (RIBEIRO et al., 2012). Evidências

da literatura mostraram, ainda, que o tratamento preventivo com Tau reestabelece a

secreção de insulina em homens obesos e submetidos à infusão contínua com

ácidos graxos por 48h (XIAO et al., 2008). Foi sugerido que o efeito preventivo da

Tau na disfunção da célula β, na presença de glicose ou ácidos graxos, é devido às

suas propriedades antioxidantes (KANIUK et al., 2007; OPRESCU et al., 2007; XIAO

et al., 2008). Como anteriormente citado, a Tau pode interagir com o IR, e em

camundongos obesos suplementados com Tau foi evidenciada maior relação

pAkt/Akt no fígado (RIBEIRO et al., 2012), sugerindo que a preservação da função

das células β induzida pela Tau também pode ser associada à melhora na

sensibilidade à insulina nos tecidos-alvo e possivelmente nas células β (ZAWALICH

et al., 2000 e 2002), pois a insulina autocrinamente aumenta a transcrição do seu

próprio gene (PERSAUD et al., 2008) e estimula a proliferação, mas inibe a

secreção do hormônio e a apoptose de células β pancreáticas (ELGHAZI et al.,

2006; LAWRENCE et al., 2008). Tal efeito pode estar associado com a ação

benéfica da Tau em prevenir a hipersecreção nas ilhotas pancreáticas de

70

camundongos alimentados com dieta HFD que foi relatado por RIBEIRO et al.,

(2012) e aqui observamos também tendência à normalização.

Ainda não se sabe os efeitos da obesidade paternal e a suplementação com

Tau sobre a condição metabólica da prole. Nosso estudo, portanto, pela primeira vez

demonstrou que a suplementação com Tau dada aos pais obesos HFD pode

atenuar a redução da secreção de insulina da prole HTAU. Previamente em estudos

com programação metabólica maternal foi observado que os fetos de ratas

submetidas à restrição proteica e suplementadas com Tau durante a gestação,

mostraram que o aminoácido normalizou a secreção de insulina e a proliferação

celular, reduzindo a apoptose e normalizando a massa de células β nas ilhotas

pancreáticas destes fetos e neonatos de mães desnutridas (MEREZAK et al., 2001 e

2004; BOUJENDAR et al., 2002; KALBE et al., 2005; REUSENS et al., 2008).

Em nosso estudo na prole, o consumo de dieta HFD pelos pais acarretou em

danos estruturais no pâncreas endócrino, promovendo redução no tamanho das

células β, e do número de células α e δ podendo estar associado a redução da

secreção de insulina na prole macho. Previamente, NG e colaboradores (2010)

evidenciaram que o pâncreas da prole proveniente de pais que comeram dieta HFD

apresentou redução da área das ilhotas pancreáticas e das células β, indicando que

esse regime nos pais prejudica a replicação das células β em seus descendentes.

Porém, esses pesquisadores também observaram aumento das ilhotas de

Langerhans pequenas na prole HFD, indicando uma resposta compensatória para

manter a massa de células β normal, e propuseram que essas células β são

suficientes para manter a normoglicemia e insulinemia em jejum, porém não foram

adequadas para a secreção de insulina estimulada por glicose (NG et al., 2010).

A literatura apresenta mais informações sobre o impacto da obesidade

maternal acarretando prejuízos na estrutura do pâncreas endócrino de sua prole.

Estudos evidenciaram que o pâncreas endócrino de filhotes machos provenientes de

mães que consumiram dieta HFD na gestação e lactação, apresentou maior área da

ilhota e hipertrofia das células β (GREGÓRIO et al., 2013). Segundo FETITA e

colaboradores (2006), o ambiente intrauterino rico em glicose induz hiperplasia nas

células β pancreáticas de camundongos neonatos, bem como promove o aumento

das concentrações de insulina no plasma. Também foram relatadas alterações

precoces no pâncreas da prole, incluindo remodelamento estrutural do pâncreas

associado ao aumento da massa de células β, prejudicando o metabolismo da

71

glicose, o que pode levar a mudanças adaptativas nas células β como hipertrofia,

hiperplasia, aumento da síntese e secreção de insulina na prole (GNIULI et al.,

2008). Portanto, com os nossos dados e as informações previamente relatadas

podemos observar que tanto o consumo de dieta HFD por mães quanto pelos pais

predispõe ao remodelamento estrutural do pâncreas endócrino da sua prole.

A suplementação com Tau mostrou evitar alterações ou restaurar a massa

pancreática endócrina na desnutrição (BOUJENDAR et al., 2002), obesidade

(RIBEIRO et al., 2012), DM1 (ARANY et al., 2004) e DM2 (LEE et al., 2011). Foi

evidenciado em camundongos NOD que a Tau reverteu a perda de massa de

células β por aumentar a proliferação celular (ARANY et al., 2004). O cultivo de

células de ratos com Tau promoveu aumento no número e tamanho das ilhotas

pancreáticas, por aumentar a área das células β, α e δ (L’AMOREAUX et al., 2010).

Outro estudo evidenciou que em camundongos ob/ob a suplementação com Tau

impede hipertrofia, o aumento da massa das ilhotas de Langerhans e das células β

no pâncreas, porém aumenta a massa das células δ e a sensibilidade da célula β à

somatostatina, essas descobertas sustentam a ideia de que a suplementação com

Tau modula o controle parácrino dos hormônios pancreáticos (SANTOS-SILVA et

al., 2015). RIBEIRO e colaboradores (2009) demonstraram que camundongos

suplementados com Tau apresentaram maior concentração plasmática e secreção

de glucagon. Como em nosso estudo observamos aumento do tamanho das células

α pancreáticas na prole HTAU, é possível que o aminoácido possa por efeitos

intergeracionais modificar também o funcionamento da célula α pancreática. Ainda, a

Tau parece exercer efeito parácrino aumentando o transporte, utilização e/ou

armazenamento de glicose e impedindo a hipersecreção de insulina. A literatura

sugere que o aumento da concentração de Tau no microambiente das ilhotas

pancreáticas, induzida pela suplementação, juntamente com a secreção de insulina

podem contribuir para a prevenção da hipertrofia e a hipersecreção das células β

que já foi relatada em camundongos fêmeas alimentadas com dieta HFD e

suplementadas com Tau (RIBEIRO et al., 2012). Em nosso estudo a suplementação

com Tau pelos pais normalizou o tamanho das células β e o número de células δ no

pâncreas da prole associando com a melhora na redução da secreção de insulina, o

que podemos sugerir que o aminoácido exerce ações intergeracionais, prevenindo

as alterações causadas pela obesidade paternal na sua prole.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=L%26%23x02019%3BAmoreaux%20WJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20804585

72

Foi evidenciado que a suplementação com Tau dada a prenhas com restrição

proteica foi eficaz em propagar modificações para seus descendentes, como

aumento da secreção de insulina das ilhotas pancreáticas do feto (CHERIF et al.,

1998). Ainda, quando fêmeas foram suplementadas com Tau impediu a redução da

massa de células β e também foi visto que a Tau melhora a vascularização das

ilhotas pancreáticas do feto (BOUJENDAR et al., 2002 e 2003). A suplementação

com Tau, tanto em fêmeas com restrição proteica quanto em machos alimentados

com dieta HFD parece ser eficaz em propagar efeitos benéficos na morfofunção

pancreática endócrina de seus descendentes.

Portanto, a obesidade pode estar associada a modificações programadas do

genoma, que regulam a atividade dos genes sem alteração da sequência primária

de DNA, sendo herdáveis ao longo das divisões celulares levando a alterações na

viabilidade dos espermatozóides, expressão genes como o Il13rα2 e a metilação do

DNA (GHANAYEM et al., 2010; FULLSTON et al., 2013). Na literatura foi mostrado

que as modificações epigenéticas em recém-nascidos filhos de pais obesos no

período da concepção e essas características podem propagar durante o

desenvolvimento e a gametogênese (SOUBRY et al., 2013). Consequentemente,

como o aminoácido Tau regula o estresse oxidativo, motilidade e sobrevivência dos

espermatozóides (YANG et al., 2010), sugere-se que o consumo de Tau pelo pais

pode estar prevenindo alterações epignéticas no pâncreas endócrino propagadas

pelos gametas como evidenciadas em nosso estudo. Porém mais estudos são

necessários para identificar quais genes podem estar modificados, e como a Tau

estaria prevenindo essas modificações propagadas a prole.

73

7. CONCLUSÕES

O consumo de dieta HFD pelos camundongos machos C57Bl/6 do grupo

paternal foi eficaz em desencadear a obesidade. Esses roedores apresentaram

aumento do peso corporal, dos estoques de gordura, e do índice de Lee.

Os camundongos HFD paternais foram intolerantes à glicose e

hipersecretaram insulina em resposta à glicose.

A suplementação com Tau não preveniu a obesidade, a intolerância à glicose,

e a hipersecreção de insulina no grupo paternal HTAU.

Nosso estudo demonstrou pela primeira vez que a ingestão de HFD pelo

grupo paternal reduziu a liberação da insulina frente à glicose em sua prole, sem

alterar a área e massa das células endócrinas, contudo reduziu o número das

células α, δ e o tamanho das células β por ilhota.

A suplementação com Tau dada aos pais foi eficaz normalizou o número de

células δ e o tamanho das células β nas ilhotas pancreáticas da prole HTAU.

74

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABESO – Associação Brasileira para Estudo da Obesidade e Síndrome Metabólica. Disponível em: <http://www.abeso.org.br/atitude-saudavel/mapa-obesidade>. Acessado em 15 de fevereiro 2017.

AHREN B (2000). Autonomic regulation of islet hormone secretion implications for health and disease. Diabetologia 43(4):393–410. AHREN B, PACINI G (2002). Insufficient islet compensation to insulin resistance vs. reduced glucose effectiveness in glucose-intolerant mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 283: E738–744. AHRÉN J, AHRÉN B & WIERUP N (2010). Increased β-cell volume in mice fed a high-fat diet: A dynamic study over 12 months, Islets, 2:6, 353-356 ANURADHA, C. V. and S. D. BALAKRISHNAN (1999). Taurine attenuates hypertension and improves insulin sensitivity in the fructose-fed rat, an animal model of insulin resistance. Can J Physiol Pharmacol,v.77, n.10, Oct, p.749-54. ARANY E, STRUTT B, ROMANUS P, REMACLE C, REUSENS B & HILL DJ (2004) Taurine supplement in early life altered islet morphology, decreased insulitis and delayed the onset of diabetes in non-obese diabetic mice. Diabetologia 47, 1831-1837. ASHINO NG, SAITO KN, SOUZA FD, NAKUTZ FS, ROMAN EA, VELLOSO LA, TORSONI AS, TORSONI MA (2012). Maternal high-fat feeding through pregnancy and lactation predisposes mouse offspring to molecular insulin resistance and fatty liver. J Nutr Biochem 23(4):341-8.

BATISTA TM, RIBEIRO RA, AMARAL AG, DE OLIVEIRA CA, BOSCHERO AC & CARNEIRO EM (2012). Taurine supplementation restores glucose and carbachol-induced insulin secretion in islets from low-protein diet rats: involvement of Ach-M3R, Synt 1 and SNAP-25 proteins. J Nutr Biochem 23, 306-312. BENOIT B, PLAISANCIÉ P, AWADA M, GÉLOEN A, ESTIENNE M, CAPEL F. High-fat diet action on adiposity, inflammation, and insulin sensitivity depends on the control low-fat diet. Nutr.Res. v.33, p.952-960, 2013. BERNARDIS, L.L., PATTERSON, B.D. (1968). Correlation between 'Lee index' and carcass fat content in weanling and adult female rats with hypothalamic lesions. The Journal of endocrinology 40, 527-528. BOUJENDAR S, REUSENS B, MEREZAK S, AHN MT, ARANY E, HILL D & REMACLE C (2002) Taurine supplementation to a low protein diet during foetal and early postnatal life restores a normal proliferation and apoptosis of rat pancreatic islets. Diabetologia 45, 856-866.

75

BOUJENDAR S, ARANY E, HILL D, REMACLE C, REUSENS B (2003) Taurine supplementation of a lowprotein diet fed to rat dams normalizes the vascularization of the fetal endocrine pancreas. J Nutr 133(9):2820–2825. BUSTAMANTE J, LOBO MV, ALONSO FJ, MUKALA NT, GINE E, SOLIS JM, TAMARIT RODRIGUEZ J & MARTIN DEL RIO R (2001) An osmotic-sensitive taurine pool is localized in rat pancreatic islet cells containing glucagon and somatostatin. Am J Physiol Endocrinol Metab 281, E1275-1285. CABRERA, O., BERMAN, D.M., KENYON, N.S., RICORDI, C., BERGGREN, P.O., CAICEDO, A., (2006). The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2334-2339. CARNEIRO EM, LATORRACA MQ, ARAUJO E, BELTRA M, OLIVERAS MJ, NAVARRO M, BERNA G, BEDOYA FJ, VELLOSO LA, SORIA B & MARTIN F (2009) Taurine supplementation modulates glucose homeostasis and islet function. J Nutr Biochem 20, 503- 511. CHAVEY, A., AH KIOON, M. D., BAILBE, D., MOVASSAT, J., AND PORTHA, B. (2014). Maternal diabetes, programming of beta-cell disorders and intergenerational risk of type 2 diabetes. Diabetes Metab 40 (5): 323-30. CHEIK, NÁDIA CARLA; GUERRA, RICARDO LUÍS FERNANDES; VIANA, FABIANA PAVAN; ROSSI, ELIZEU ANTONIO; CARLOS, IRACILDA ZEPONNE; VENDRAMINI, REGINA; DUARTE, ANA CLÁUDIA GARCIA DE OLIVEIRA; DÂMASO, ANA RAIMUNDA. Efeito de Diferentes Frequências de Exercícios Físico na Dislipidemia e da Obesidade em Ratos Normo e Hipercolesterolêmicos. Revista Brasileira de Educação Física, 2006. CHERIF H, REUSENS B, AHN MT, HOET JJ & REMACLE C (1998) Effects of taurine on the insulin secretion of rat fetal islets from dams fed a low-protein diet. J Endocrinol 159, 341-348. CHERIF, H., B. REUSENS, S. DAHRI, C. REMACLE AND J. J. HOET(1996) Stimulatory effects of taurine on insulin secretion by fetal rat islets cultured in vitro. J Endocrinol, v.151, n.3, Dec, p.501-6. CNOP, M., N. WELSH, J. C. JONAS, A. JORNS, S. LENZEN E D. L. EIZIRIK (2005) Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes: many differences, few similarities. Diabetes, v.54 Suppl 2, Dec, p.S97-107. DE SOUZA CT, ARAUJO EP, STOPPIGLIA LF, PAULI JR, ROPELLE E, ROCCO SA, MARIN RM, FRANCHINI KG, CARVALHEIRA JB, SAAD MJ, BOSCHERO AC, CARNEIRO EM, VELLOSO LA (2007). Inhibition of UCP2 expression reverses diet-induced diabetes mellitus by effects on both insulin secretion and action. FASEB J. 221:1153–1163. DUNN GA; BALE TL. (2009). Maternal high-fat diet promotes body length increases and insulin insensitivity in second-generation mice. Endocrinology 150: 4999-5009.

76

ENES, CARLA CRISTINA; SLATER, BETZABETH. Obesidade na adolescência e seus principais fatores determinados. Rev. bras. Epidemiol, v.13, n.1, p. 163-171, 2010.

ESPELAND MARK A., HENRY A. GLICK, ALAIN BERTONI, FREDERICK L. BRANCAT. Impact of an Intensive Lifestyle Intervention on Use and Cost of Medical Services Among Overweight and Obese Adults With Type 2 Diabetes: The Action for Health in Diabetes. Diabetes Care 2014 Sep; 37(9): 2548-2556. ESTADELLA D, OYAMA LM, DÂMASO AR, RIBEIRO EB, OLLER DO NASCIMENTO CM. Effect of palatable hyperlipidic diet on lipid metabolism of sedentary and exercised rats. Nutrition. 2004;20(2):218-24.

GHANAYEM BI, BAI R, KISSLING GE, TRAVLOS G, AND HOFFLER U. Biol Reprod 82: 96-104, 2009. GLASTRAS SJ, TSANG M, TEH R. Maternal Obesity Promotes Diabetic Nephropathy in Rodent Offspring. Scientific Reports. 2016;6:27769. GREENBERG AS, OBIN MS. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. The American journal of clinical nutrition. 2006 Feb;83(2):461S-5S. PubMed PMID: 16470013. GNIULI D, CALCAGNO A, CARISTO ME (2008). Effects of high-fat diet exposure during fetal life on type 2 diabetes development in the progeny. J Lipid Res 49(09): 1936-1945. GUIMARAES, DE; SARDINHA, FLC; MIZURINI, DM, CARMO, MGT.Adipocitocinas: uma nova visão do tecido adiposo. Rev. Nutr. 2007, vol.20, n.5, pp.549-559. HENQUIN JC (2011).The dual control of insulin secretion by glucose involves triggering and amplifying pathways in beta cells. Diabetes Res Clin Pract 93 Suppl 1, S27-31. HIRIART M & AGUILAR-BRYAN L (2008) Channel regulation of glucose sensing in the pancreatic beta cell. Am J Physiol Endocrinol Metab 295, E1298- 1306. HOWELL, P. M. JR, LIU, S.; REN, S.; BEHLEN, C.; FODSTAD, O.; RIKER, A. I. (2009). Epigenetics in human melanoma. Cancer Control: Journal of the Moffitt Cancer Center, Tampa, v. 16, n. 6, p. 200- 218. HUXTABLE, R.J. (1992). Physiological actions of taurine. Physiological reviews 72, 101-163. Ito, T., Pastukh, V., Solodushko, V., Azuma, J., Schaffer, S.W., 2009. Effect of taurine on protein kinase C isoforms: role in taurine's actions? Advances in experimental medicine and biology 643, 3-11. INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE) 2014 e 2015.

77

JAMES PT, LEACH R, KALAMARA E, SHAYEGHI M (2001). “The worldwide obesity epidemic”. Obes Res 9 (Suppl 4):S228-33. KAHN, S.E., HULL, R.L., UTZSCHNEIDER, K.M., (2006). Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 444, 840-846. KALBE, L., A. LEUNDA, T. SPARRE, C. MEULEMANS, M. T. AHN, T. ORNTOFT, M. KRUHOFFER, B. REUSENS, J. NERUP E C. REMACLE (2005). Nutritional regulation of proteases involved in fetal rat insulin secretion and islet cell proliferation. Br J Nutr v.93, n.3, Mar, p.309-16. KANIUK, N. A., M. KIRALY, H. BATES, M. VRANIC, A. VOLCHUK AND J. H. BRUMELL (2007). Ubiquitinated-protein aggregates form in pancreatic beta cells during diabetes-induced oxidative stress and are regulated by autophagy. Diabetes v.56, n.4, Apr, p.930-9. KANNO, T., GOPEL, S.O., RORSMAN, P., WAKUI, M., (2002). Cellular function in multicellular system for hormone-secretion: electrophysiological aspect of studies on alpha-, beta- and delta-cells of the pancreatic islet. Neurosci Res 42, 79-90. L’AMOREAUX WJ, CUTTITTA C, SANTORA A, BLAIZE JF, TACHJADI J, EL IDRISSI A. Taurine regulates insulin release from pancreatic beta cell lines. Journal of Biomedical Science. 2010. LAWRENCE, M., C. SHAO, L. DUAN, K. MCGLYNN E M. H. COBB (2008). The protein kinases ERK1/2 and their roles in pancreatic beta cells. Acta Physiol (Oxf), v.192, n.1, Jan, p.11-7.

LI M, REYNOLDS CM, SLOBODA DM, GRAY C, VICKERS MH (2013) Effects of

Taurine Supplementation on Hepatic Markers of Inflammation and Lipid Metabolism in Mothers and Offspring in the Setting of Maternal Obesity. PLoS ONE 8(10): e76961. LUCAS, A. (1991). Programming by early nutrition in man. Ciba Found Symp 156:38-50. MALIK. VASANTI S., BARRY M. POPKIN, GEORGE A. BRAY, JEAN-PIERRE DESPRÉS, WALTER C. WILLETT and FRANK B. HU (2013). Sugar-Sweetened Beverages and Risk of Metabolic Syndrome and Type 2 Diabetes. American Diabetes Association 33(11): 2477-2483. MCLELLAN, KÁTIA CRISTINA PORTERO; BARBALHO, SANDRA MARIA; CATTALINI, MARINO and LERARIO, ANTONIO CARLOS (2007). Diabetes mellitus do tipo 2, síndrome metabólica e modificação no estilo de vida. Rev. Nutr. vol.20, n.5. MEIGS, J. B (2010). Epidemiology of Type 2 Diabetes and Cardiovascular Disease: Translation from Population to Prevention The Kelly West Award Lecture 2009. Diabetes care, 33(8), 1865-1871.

78

MEREZAK, S., A. A. HARDIKAR, C. S. YAJNIK, C. REMACLE E B. REUSENS (2001). Intrauterine low protein diet increases fetal beta-cell sensitivity to NO and IL-1 beta: the protective role of taurine. J Endocrinol,v.171, n.2, Nov, p.299-308. MEREZAK, S., B. REUSENS, A. RENARD, K. GOOSSE, L. KALBE, M. T. AHN, J. TAMARIT-RODRIGUEZ E C. REMACLE (2004). Effect of maternal low-protein diet and taurine on the vulnerability of adult Wistar rat islets to cytokines. Diabetologia, v.47, n.4, Apr, p.669-75. MINISTÉRIO DA SAÚDE (BR), Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância de Doenças e Agravos não Transmissíveis e promoção de Saúde. Vigitel Brasil 2015: vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas por inquérito telefônico. Brasília: Ministério da Saúde, 2015. NAKAYA Y, MINAMI A, HARADA N, SAKAMOTO S, NIWA Y & OHNAKA M (2000) Taurine improves insulin sensitivity in the Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rat, a model of spontaneous type 2 diabetes. Am J Clin Nutr 71, 54-58. NANDHINI, A. T., V. THIRUNAVUKKARASU, M. K. RAVICHANDRAN AND C. V. ANURADHA (2005). Effect of taurine on biomarkers of oxidative stress in tissues of fructose-fed insulin-resistant rats. Singapore Med J, v.46, n.2, Feb, p.82-7. NESHER, R., E. ANTEBY, M. YEDOVIZKY, N. WARWAR, N. KAISER E E. CERASI (2002). Beta-cell protein kinases and the dynamics of the insulin response to glucose. Diabetes, v.51 Suppl 1, p.S68-73. NG SF, LIN RC, LAYBUTT DR, BARRES R, OWENS JA, MORRIS MJ (2010). Chronic high-fat diet in fathers programs β-cell dysfunction in female rat offspring. Nature 467:963–966. OPRESCU, A. I., G. BIKOPOULOS, A. NAASSAN, E. M. ALLISTER, C. TANG, E. PARK, H. UCHINO, G. F. LEWIS,I. G. FANTUS, M. ROZAKIS-ADCOCK, M. B. WHEELER E A. GIACCA (2007). Free fatty acid-induced reduction in glucose-stimulated insulin secretion: evidence for a role of oxidative stress in vitro and in vivo. Diabetes, v.56, n.12, Dec, p.2927-37. PARK, E. J. , J. H. BAE, S. Y. KIM, J. G. LIM, W. K. BAEK, T. K. KWON, S. I. SUH, J. W. PARK, I. K. LEE, F. M. ASHCROFT AND D. K. SONG (2004). Inhibition of ATP-sensitive K+ channels by taurine through a benzamido-binding site on sulfonylurea receptor 1. Biochem Pharmacol, v.67, n.6, Mar 15, p.1089-96. PESSIN JE, SALTIEL AR (2000). Signaling pathways in insulin action: molecular targets of insulin resistance. J Clin Invest 106: 165-169. PRENTKI and NOLAN CJ (2006) Islet beta cell failure in type 2 diabetes. J Clin Invest 116, 1802-1812. REUSENS, B., T. SPARRE, L. KALBE, T. BOUCKENOOGHE, N. THEYS, M. KRUHOFFER, T. F. ORNTOFT, J. NERUP E C. REMACLE (2008). The intrauterine metabolic environment modulates the gene expression pattern in fetal rat islets:

79

prevention by maternal taurine supplementation. Diabetologia, v.51, n.5, May, p.836-45. RIBEIRO RA, BONFLEUR ML, AMARAL AG, VANZELA EC, ROCCO SA, BOSCHERO AC & CARNEIRO EM (2009). Taurine supplementation enhances nutrient-induced insulin secretion in pancreatic mice islets. Diabetes Metab Res Rev 25, 370- 379. RIBEIRO RA, VANZELA EC, OLIVEIRA CA, BONFLEUR ML, BOSCHERO AC, CARNEIRO EM (2010). Taurine supplementation: involvement of cholinergic/phospholipase C and protein kinase a pathways in potentiation of insulin secretion and Ca2+ handling in mouse pancreatic islets. The British journal of nutrition 104, 1148-1155. RIBEIRO RA, SANTOS-SILVA JC, VETTORAZZI JF, COTRIM BB, MOBIOLLI DD, BOSCHERO AC & CARNEIRO EM (2012). Taurine supplementation prevents morphophysiological alterations in high-fat diet mice pancreatic beta cells. Amino Acids 43(4):1791-801. SARTORELLI, DANIELA SAES AND FRANCO, LAÉRCIO JOEL. Tendências do diabetes mellitus no Brasil: o papel da transição nutricional. Cad. Saúde Pública [online]. 2003, vol.19, suppl.1, pp.S29-S36. SCHMIDT, M. I. et al. Doenças Crônicas não transmissíveis no Brasil: mortalidade, morbidade e fatores de risco. In: BRASIL. Ministério da Saúde. Departamento de Analise de Situação de Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Saúde Brasil 2009: Uma analise da situação de saúde e da Agenda Nacional e Internacional de Prioridades em Saúde. Brasília, 2010. SHAFAT, A.; MURRAY, B.; RUMSEY, D. Energy density in cafeteria diet induced hyperphagia in the rat. Appetite, v. 52, p. 34–38, 2009. SHANKAR K, ZHONG Y, KANG P (2011) Maternal obesity promotes a pro-inflammatory signature in rat uterus and blastocyst. Endocrinology 152, 4158-4170. SENER, A., L. C. BEST, A. P. YATES, M. M. KADIATA, E. OLIVARES, K. LOUCHAMI, H. JIJAKLI, L. LADRIERE E W. J. MALAISSE (2000). Stimulus-secretion coupling of arginine-induced insulin release: comparison between the cationic amino acid and its methyl ester. Endocrine, v.13, n.3, Dec, p.329-40. SHULMAN GI (2000) Cellular mechanisms of insulin resistance. J Clin Invest 106: 171- 176. SOLON CS, FRANCI D, IGNACIO-SOUZA LM, ROMANATTO T, ROMAN EA, ARRUDA AP (2012) Taurine enhances the anorexigenic effects of insulin in the hypothalamus of rats. Amino Acids 42:2403–2410. SOMINSKY, L., AND SPENCER, S. J. (2014) Eating behavior and stress: a pathway to obesity. Front Psychol 5, 434.

http://www.scielo.br/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5Edlibrary&format=iso.pft&lang=i&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=SARTORELLI,+DANIELA+SAES

http://www.scielo.br/cgi-bin/wxis.exe/iah/?IsisScript=iah/iah.xis&base=article%5Edlibrary&format=iso.pft&lang=i&nextAction=lnk&indexSearch=AU&exprSearch=FRANCO,+LAERCIO+JOEL

80

SOUBRY, A., MURPHY, S. K., WANG, F., HUANG, Z., VIDAL, A. C., FUEMMELER, B. F., KURTZBERG, J., MURTHA, A., JIRTLE, R. L., SCHILDKRAUT, J. M., AND HOYO, C. (2015). Newborns of obese parents have altered DNA methylation patterns at imprinted genes. Int J Obes (Lond) 39(4): 650–657. SOUZA, M. G., RIVERA, I. R., SILVA, M. A., CARVALHO, A. C. Relationship of obesity with high blood pressure in children and adolescents. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, São Paulo, v. 94, n. 6, p. 714-9, 2010. STRAUB SG & SHARP GW (2002). Glucose-stimulated signaling pathways in biphasic insulin secretion. Diabetes Metab Res Rev 18, 451-463. TAPPAZ ML. (2004). Taurine biosynthetic enzymes and taurine transporter: molecular identification and regulations. Neurochem Res 29(1):83-96. TATEYA S, KIM F, TAMORI Y. (2013). Recent advances in obesity-induced inflammation and insulin resistance. Front Endocrinol 8; 4:93. TORTORA, Gerard, e BRYAN, Derrickson. Princípios de Anatomia e Fisiologia. 12ª edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara, 2014). TSUBOYAMA-KASAOKA N, SHOZAWA C, SANO K, KAMEI Y, KASAOKA S, HOSOKAWA Y & EZAKI O (2006). Taurine (2-aminoethanesulfonic acid) deficiency creates a vicious circle promoting obesity. Endocrinology 147, 3276-3284. VETTORAZZI JF, RIBEIRO RA, SANTOS-SILVA JC, BORCK PC, BATISTA TM, NARDELLI TR, BOSCHERO AC, CARNEIRO EM (2014). Taurine supplementation increases K channel protein content, improving Ca handling and insulin secretion in islets from malnourished mice fed on a high-fat diet. Amino acids 10.1007/s00726-014-1763-6.

VIGITEL MINISTÉRIO DA SAÚDE. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/images/pdf/2014/abril/30/Lancamento-Vigitel-28-04-ok.pdf 2014. Acessado em 15 de abril 2017.

WHITE CL, PURPERA MN, MORRISON CD. (2009). Maternal obesity is necessary for programming effect of high-fat diet on offspring. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. May; 296(5):R1464-72. WHITEMAN, E. L., H. CHO E M. J. BIRNBAUM (2002). Role of Akt/protein kinase B in metabolism. Trends Endocrinol Metab, v.13, n.10, Dec, p.444-51. WONG ET, QIU B, SHI X, LIM J, BEZZI M, LOW D, ET AL.NUCKS is a positive transcriptional regulator of insulin signaling. Cell Rep. 2014:7:1876-86

WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/en/. Acessado em 27 de outubro 2016. Acessado em 19 de fevereiro 2017.

81

XIAO, C., A. GIACCA E G. F. LEWIS (2007). Oral taurine but not N-acetylcysteine ameliorates NEFA-induced impairment in insulin sensitivity and beta cell function in obese and overweight, non-diabetic men. Diabetologia, v.51, n.1, Jan, p.139-46. XU XF, and Du LZ. Chin Med J (Engl) 123: 2948-2954. YANG, SN.,BERGGREN (2006). The role of voltage-gated calcium channels in pancreatic beta-cell physiology and pathophysiology. Endocr Rev, v.27, n.6, Oct, p.621-76.

82

ANEXOS

Anexo 1 – Autorização da Comissão de Ética em Experimentação Animal da

Universidade Federal do Rio de Janeiro – Campus URJ – Macaé Prof. Aloísio

Teixeira em que consta protocolo com utilização de animais.

universidade federal do rio de janeiro campus macaé ... · israelle netto freitas efeitos da...

Documents