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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC:
CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA.
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Janeiro a Julho de 2015.
( ) PARCIAL (X) FINAL
Título do Projeto de Pesquisa: Análise da genômica Funcional de Corynebacterium pseudotuberculosis Biotipos Ovis e Equi sob diferentes condições de estresse biologicamente relevantes.
Nome do Orientador: Adriana Carneiro Ribeiro
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Biotecnologia
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Centro de Genômica e Biologia de Sistemas
Título do Plano de Trabalho: Montagem e anotação funcional dos genomas de linhagens de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi e ovis. Nome do Bolsista: Diego Freire Barreto Curso do Bolsista: Biotecnologia
Tipo de Bolsa: PIBIC/ CNPq
Resumo do relatório parcial A Corynebacterium pseudotuberculosis é um microrganismo patogênico, Gram-positivo, anaeróbio facultativo, pertencente ao filo Actinobacteria que constitui o grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus). Esta bactéria é classificada em dois biovares: equi e ovis de acordo com a capacidade de redução de grupos nitrato pela enzima nitrato redutase. O patógeno é causador da doença linfadenite caseosa (LC) caracterizada por causar necrose caseosa dos linfonodos externos e internos em pequenos ruminantes como ovinos e caprinos, e linfangite ulcerativa (LU) que causa abcessos nos vasos linfáticos, principalmente do peitoral e das patas traseiras em equinos, bovinos, bubalinos e camelídeos. Este organismo gera perdas econômicas no setor do agronegócio devido à perda da qualidade de lã, leite, carne e carcaça de animais. Com isso, a realização de estudos para compreender os mecanismos de virulência contribuirá para o desenvolvimento de vacinas eficazes contra este patógeno. Com o objetivo geral de realizar a montagem, anotação funcional e análise comparativa entre de C. pseudotuberculosis biovar ovis linhagem 226 e C. pseudotuberculosis biovar equi linhagem E19 a partir de dados oriundos da plataforma Ion Torrent já foram concluídas as etapas de avaliação da qualidade das sequências pelo software FastQC com valor Phred acima de 20, montagem de novo dos genomas pelo software MIRA e SPAdes, utilização do programa Lasergene para a extensão dos contigs, fechamento de gaps in sílico pelo software CLC Genomics Workbench, anotação automática das linhagens através do software RAST e curadoria manual com o programa Genome Browser Artemis. Após a conclusão dessas etapas obteve-se um único contig para a linhagem 226 com 2.337.820 pb com o valor de N50 igual a 2.337.820 e um total de 370.840.598 leituras. Na anotação funcional foi obtido um total de 4 clusters contendo 5S, 16S e 23S totalizando 12 rRNAs, 49 tRNAs e 72 pseudogenes, e o número total de CDS foi de 2.138. Na linhagem E19 obteve-se um único contig com 2.367.956 pb, totalizando 557.925.027 leituras utilizando o montador SPAdes, e o valor de N50 de 2.367.956. A anotação funcional identificou 2.272 CDS, e foram detectados 12 rRNAs, 48 tRNAs e 10 pseudogenes.
1. Introdução
A Corynebacterium pseudotuberculosis é um microrganismo patogênico com importância na
área médico-veterinária, sendo causador de diversos prejuízos econômicos, principalmente no
agronegócio, devido à perda da qualidade de lã, leite, carne e carcaça de animais (ARSENAULT et
al., 2003). Este patógeno é uma bactéria Gram-positiva pertencente ao filo Actinobacteria, e constitui
o grupo CMNR (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia e Rhodococcus), o qual possui
características comuns, tais como: organização da parede celular caracterizada pela presença de um
grande complexo polimérico composto por peptídeoglicanos, arabinogalactanos e ácido micólico; e
46 a 74% de conteúdo G+C. É um patógeno intracelular facultativo com formas pleomórficas, não
esporulante, não capsulado, sem mobilidade e contém fímbrias. É uma bactéria anaeróbica
facultativa e que apresenta o crescimento ótimo à 37ºC e com pH entre 7,0 e 7,2 (DORELLA, 2006).
A C. pseudotuberculosis é classificada em biovares, equi e ovis. Essa classificação é
determinada pela presença da enzima nitrato redutase, o qual o biovar equi apresenta redução de
nitrato positiva e já foi isolada de cavalos (ALEMAN M, 1996), bovinos (YERUHAM, 2003) e
bubalinos (SILVA et al, 2012), e o biovar ovis apresenta redução de nitrato negativa, e pode ser
isolada de ovinos e caprinos, mas também já foram isoladas a partir de suínos (MANUELA et al,
2014) e humanos (DORELLA, 2006).
Este patógeno é causador da doença linfadenite caseosa em pequenos ruminantes como
ovinos e caprinos. Porém, pode acometer outros hospedeiros, como humanos, causando a linfadenite
subaguda a crônica (DORELLA, 2006; FONTAINE & BAIRD, 2008). A infecção em humanos é
um evento raro, e em todos os casos relatados tem sido ligada à exposição a C. pseudotuberculosis
no trabalho pecuário ou afins. Cerca de 30 casos de infecção humana já foram descritos na literatura
(D'AFONSECA, 2011). Já a linfangite ulcerativa é mais frequente em equinos, bovinos, bubalinos e
camelídeos. A linfadenite caseosa é caracterizada pela presença de necrose caseosa nos linfonodos
externos e/ou internos, e linfangite ulcerativa afeta os vasos linfáticos causando abscessos,
particularmente no peitoral e nas patas traseiras (HASSAN, 2012; DORELLA, 2006).
2. Justificativa
A C. pseudotuberculosis, agente etiológico da linfadenite caseosa e linfangite ulcerativa,
causa graves perdas econômicas no agronegócio. Devido sua importância na área da saúde e
veterinária, a realização de estudos para compreender os mecanismos de virulência contribui para a
elucidação de novos alvos terapêuticos contra este patógeno. Sendo assim, o sequenciamento,
montagem, anotação funcional e análise comparativa de diferentes biovares desta bactéria infectando
diferentes hospedeiros auxiliará a identificar possíveis novos alvos vacinais compartilhados pelas
diferentes linhagens, bem como uma melhor compreensão das bases moleculares de sua virulência.
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral
Realizar a montagem, anotação funcional e análise comparativa entre de C.
pseudotuberculosis biovar ovis linhagem 226 e C. pseudotuberculosis biovar equi linhagem E19 a
partir de dados oriundos da plataforma Ion Torrent PGM™.
3.2 Objetivos Específicos
• Montar os genomas de duas linhagens de C. pseudotuberculosis biovares ovis e equi, através
da estratégia de montagem ab initio;
• Ordenar e orientar os contigs obtidos a partir das melhores montagens;
• Realizar o fechamento de gaps in silico para obtenção da sequência final do genoma;
• Realizar a predição in silico do conteúdo gênico do genoma e identificar os elementos
estruturais que compõem o genoma (rRNA, tRNAs e pseudogenes);
• Classificar as proteínas de acordo com as categorias do Gene Ontology;
• Averiguar a conservação da ordem gênica entre as duas linhagens de C. pseudotuberculosis;
• Identificar genes ortólogos e únicos entre os genomas das duas linhagens de C.
pseudotuberculosis.
4. Materiais e Métodos
4.1 Organismo do estudo
Para este trabalho foi selecionado uma linhagem de cada biovar de C. pseudotuberculosis. A
linhagem 226 foi caracterizada bioquimicamente como nitrato redutase negativa (ovis), esta
linhagem foi a primeira isolada a partir de abscessos de um caprino na Califórnia (EUA) e foi
adquirida por meio de parcerias entre o Centro de Genômica e Biologia de Sistemas (UFPA),
Laboratório de Genética Celular e Molecular (UFMG) e a Universidade da Califórnia. E a linhagem
do biovar equi foi isolada de um equino no Chile, não tendo seu local de abcesso informado, obtida
através de parcerias entre o Centro de Genômica e Biologia de Sistemas (UFPA), Laboratório de
Genética Celular e Molecular (UFMG) e a Universidade do Chile.
4.2 Sequenciamento e Tratamento De Dados
As linhagens 226 e E19 de C. psedotuberculosis foram sequenciadas pela plataforma Ion
Torrent PGM™ (Personal Genome Machine) (www.lifetechnologies.com) com o chip 318. Utilizou-
se o software FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/) para avaliar a qualidade das
sequências, e para trimar as leituras com qualidade Phred acima de 20 foi usado o software FastX
Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html).
4.3 Montagem
A montagem de novo dos dois genomas foi realizada pelo software MIRA (CHEVREUX et
al., 2004) e SPAdes (BANKEVICH et al., 2012), e, após, utilizou-se o Lasergene
(www.dnastar.com) para a extensão dos contigs. O programa Mauve (DARLING et al., 2010)
ordenou os contigs e gerou o scaffold. Os gaps foram fechados in silico pelo software CLC
Workbench (www.clcbio.com).
4.4 Anotação
A anotação automática das linhagens 226 e E19 foram feitas através da plataforma web
RAST (AZIZ et al., 2008), sendo realizada a curadoria manual com o programa Genome Browser
Artemis. E a análise funcional foi realizada com o programa Blast2GO (Rutherford et al., 2000),
onde descreve os processos e funções biológicas.
4.5 Análise comparativa
A análise comparativa entre as linhagens 226 e E19 foi feita através do programa PGAP,
onde foram identificados os genes ortólogos e únicos, utilizado como arquivo de entrada os arquivos
no formato .nuc, .pep e .function, gerados a partir do arquivo embl, sendo os parâmetros utilizados
pelo PGAP: e-value de 0.00001, identidade de 80% e cobertura de 90%. Para a conservação da
ordem gênica com o programa Gepard foram utilizados os arquivos em formato fasta das linhagens
226 e E19 para geração do dotplot. Para a predição de ilhas de patogenicidade foi feita a análise com
o programa GIPSy (SOARES et al., 2012). Utilizou-se o programa Artemis Comparison Tool (ACT)
(CARVER et al., 2008) e o software Gepard (KRUMSIEK et al., 2007) para visualização da sintenia
entre as linhagens bem como análise das regiões gênicas entre as mesmas.
5. Resultados
O sequenciamento da linhagem 226 gerou um total de 370.840.598 leituras, e após a etapa de
montagem e extensão das leituras pelos softwares MIRA, e Lasergene (REF) obteve-se um único
contig com 2.337.820 pb com o valor de N50 igual a 2.337.820. Na anotação funcional foi obtido um
total de 4 clusters contendo 5S, 16S e 23S totalizando 12 rRNAs, 49 tRNAs e 72 pseudogenes, e o
número total de CDS foi de 2.138. Na linhagem E19, após o sequenciamento obteve-se 557.925.027
leituras utilizando o montador SPAdes, após foi gerado um contig com 2.367.956 pb e o valor de
N50 de 2.367.956. Na anotação funcional foram identificadas 2.272 CDS, e foram detectados 12
rRNAs, 48 tRNAs e 10 pseudogenes (Tabela 1).
Tabela 1. Características genômicas das linhagens 226 e E19.
Características genômicas C.pseudotuberculosis 226 C.pseudotuberculosis E19
GenBank ID CP010889 CP012136
Tamanho (pb) 2.337.820 2.367.956
% Conteúdo GC 52,18% 52,1%
% Codificante 84,7% 86,6%
Genes 2.271 2.272
Proteínas 2.138 2.112
Operons de RNA 4x 4x
Número de tRNA 49 48
Pseudogenes 72 10
Na análise comparativa entre as linhagens verificou-se a presença de 1.754 genes ortólogos,
ou seja, os genes comuns encontrados nas duas espécies. Além disso, foram identificados 186 genes
únicos da linhagem 226 e 358 genes únicos da linhagem E19 (Figura 1). Entre os genes ortólogos
destacamos o gene rpoB que é um dos genes utilizados para a identificação de espécies de Coryne-
bacterium pseudotuberculosis. De acordo com Khamis et al, 2004 foi identificada uma região dentro
da sequência do gene com alto grau de polimorfismo, delimitada por sequências conservadas que
podem ser usadas como primers universais para amplificação por PCR e sequenciamento. Dentre os
genes únicos destacamos o gnlD da linhagem E19 que codifica a PII uridilil-tranferase, sendo esse
responsável por adenilar a proteína PII, uma proteína de transdução de sinal que possui papel funda-
mental no metabolismo de nitrogênio em bactérias e archaea (MIKE MERRICK, 2014). Na linha-
gem 226 destacamos o gene Cp226_0206 o qual codifica uma proteína similar a transposase. De
acordo com Daniel et al, 2015, as transposases são enzimas que catalisam o processo de movimenta-
ção de certos elementos do DNA (transposons) de uma molécula de DNA para outra, sendo assim
passando informação genética para os cromossomos em ordem de conferir uma nova função ou subs-
tituir um gene defeituoso.
Figura 1. Diagrama de Venn dos genes ortólogos e únicos das linhagens 226 e E19.
Por meio da análise do programa Blast2GO foram identificados os processos e funções
biológicas para as linhagens, sendo que para a linhagem 226 foram identificados 43 funções
moleculares (Figura 2) e 37 processos biológicos (Figura 3), e para a linhagem E19 foram
encontrados 44 funções moleculares (Figura 4) e 37 processos biológicos (Figura 5).
Figura 2. Funções moleculares da C. pseudotuberculosis linhagem 226. A figura mostra as 14
funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).
Figura 3. Processos biológicos da C. pseudotuberculosis linhagem 226. A figura mostra as 15
funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).
0 100 200 300 400 500 600
ligação a composto orgânico cíclico ligação a composto orgânico heterocíclico
ligação a íon hidrolase
ligacão a pequenas moléculas transferase
ligação a derivados de carboidrato oxidoredutase
transportador transmembrana ligase liase
transportador de substrato específico ligação a cofator
isomerase
Número de genes
Função Biológica
Funções moleculares da C. pseudotuberculosis linhagem 226
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
processo metabólico de substâncias orgânicas processo metabólico celular
processo metabólico primário processo celular de organismo único
processo metabólico de organismo único processo metabólico de compostos de nitrogênio
processo biossintéPco estabelecimento de localização localização de organismo único
regulação de processos biológicos processo catbólico
resposta celular a esRmulo resposta a estresse
organização de componente celular mePlação
Número de genes
Processos B
iológicos
Processos biológicos da C.pseudotuberculosis linhagem 226
Figura 4. Funções moleculares da C. pseudotuberculosis linhagem E19. A figura mostra as
15 funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).
Figura 5. Processos biológicos da C. pseudotuberculosis linhagem E19. A figura mostra as 15
funções mais representadas. Dados obtidos pelo programa Blast2GO (nível 3 do Gene Ontolgy).
0 100 200 300 400 500 600
ligação a composto orgânico cíclico ligação a composto orgânico heterocíclico
ligação a íon hidrolase
ligacão a pequenas moléculas transferase
ligação a derivados de carboidrato oxidoredutase
transportador transmembrana ligase liase
transportador de substrato específico ligação a cofator
isomerase consPtuinte estrutural do ribossomo
Número de genes
Processos
Funções moleculares da C.pseudotuberculosis linhagem E19
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
processo metabólico de substância orgânica
processo metabólico primário
processo metabólico de organismo único
processo biosintéPco
localização de organismo único
resposta celular a esRmulo
resposta a estresse
mePlação
Número de genes
Processos
Processos biológicos da C.pseudotuberculosis linhagem E19
Através da análise de sintenia realizada pelo ACT, nota-se alta conservação da ordem gênica
entre as linhagens (figura 6), não havendo regiões de inversões entre os genomas. Apesar do alto
grau de sintenia, na figura 7 é possível identificar algumas regiões de quebras, isto porque os
genomas pertencerem a biovares diferentes.
Figura 6. Análise da sintenia entre as linhagens 226 e E19 de C. pseudotuberculosis gerada pelo
programa ACT.
Figura 3. Gráfico dotplot da análise da sintenia entre as linhagens 226 e E19.
Pelo programa Gipsy foi identificado oito ilhas de patogenicidade para a linhagem 226.
Os principais genes foram localizados na ilha 1, dentre estes o gene pld que é descrito na literatura
como um dos principais genes relacionados a virulência de C. pseudotuberculosis, codificador da
proteína fosfolipase-D (MANUELA et al, 2014). Também foi encontrado o operon fagABC e fagD
que estão envolvidos no sistema de absorção do ferro e está relacionado com a persistência da
bactéria durante o processo de infecção (MARIANA, 2014), e o gene cas5, que é associado à
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) e que confere resistência a
fagos e plasmídeos (DHAWAN et al, 2015).
Na C. pseudotuberculosis linhagem E19 foram identificadas nove ilhas de patogenicidade.
Assim como na linhagem 226, os principais genes relacionados a patogenicidade para a cepa E19
foram encontrados na ilha 1, contendo os mesmos genes que a cepa 226. Entretanto, houve
diversidade no número de bases que consistem cada ilha e no número de genes em cada ilha, sendo
14 na linhagem 226 e 20 na linhagem E19. Este resultado, bem como a análise de sintenia e
conservação da ordem gênica, já era esperado devido à proximidade entre as linhagens em questão.
6. Conclusão
Através da análise comparativa das linhagens 226 e E19, obteve-se novas informações que
contribuirão para a melhor compreensão dos mecanismos de virulência da bactéria Corynebacterium
pseudotuberculosis, a qual possui grande importância para as áreas da saúde, veterinária e do
agronegócio. Sendo assim, o sequenciamento, montagem e análise comparativa de diferentes
biovares infectando diferentes hospedeiros irão contribuir para uma identificação de possíveis novos
alvos vacinais.
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Carneiro, Alex Ranieri, Luis Carlos Guimarães, Amjad Ali, Syeda Marriam Bakhtiar, Ulisses de
Pádua Pereira, Anderson Rodrigues dos Santos, Siomar de Castro Soares, Fernanda Dorella, Anne
Cybelle Pinto, Dayana Ribeiro, Maria Silvanira Barbosa, Síntia Almeida, Vinícius Abreu, Flávia
Aburjaile, Karina Fiaux, Eudes Barbosa, Carlos Diniz, Flavia S. Rocha, Rashmi Saxena, Sandeep
Tiwari, Vasudeo Zambare, Preetam Ghosh, Luis G. C. Pacheco, Christopher G. Dowson, Anil
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8. Dificuldades
Após o sequenciamento das linhagens, o tratamento dos arquivos obtidos para posterior
análise na plataforma PGAP, bem como o processo de análise de dados pelo servidor para gerar os
dados necessários para a plataforma Blast2GO foram etapas que apresentaram um pouco de
dificuldade para serem superadas, visto que determinados arquivos não estavam tratados
corretamente e que, para achar esses erros específicos, foi necessária verificação manual dos
arquivos.
9. Parecer do orientador
DATA: ______/_________/______
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ASSINATURA DO ORIENTADOR
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ASSINATURA DO ALUNO