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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

EMILIANO RICARDO VASCONCELOS RIOS

EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO ACETATO DE CITRONELILA:

ESTUDO DOS POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO

FORTALEZA

2014


EFEITOS ANTINOCICEPTIVOS DO ACETATO DE CITRONELILA:

EM MODELOS DE NOCICEPÇÃO AGUDA EM CAMUNDONGOS

Tese apresentada à Coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles

FORTALEZA

2014


EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO ACETATO DE CITRONELILA:

ESTUDO DOS POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO.

Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.

Aprovada em 18 / 03 / 2014

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________

Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

___________________________________________

Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa


__________________________________________

Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Junior


__________________________________________

Prof. Dr. Francisco Washington Araújo Barros Nepomuceno

Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira (UNILAB)

__________________________________________

Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida

Universidade Federal do Piauí (UFPI)

AGRADECIMENTOS

Este ponto, para mim, parece ser o mais difícil de escrever de toda a tese. A

possibilidade de esquecer um nome pode me deixar constrangido. Agradecer a tudo e a todos,

com certeza seria um grande equívoco e demonstraria que todos tiveram igual participação no

desenrolar deste trabalho. Portanto, embora possa parecer que há alguma falta de consideração

por determinadas pessoas que foram ou são fundamentais na minha vida, os agradecimentos

descritos a seguir são destinados somente àqueles que tiveram efetiva participação na

elaboração deste trabalho ou que, de alguma forma colaboraram para que eu tivesse condições

de realizá-lo. Sendo assim, não seguirei qualquer ordem de importância aqui, e sim a ordem

que me vem à cabeça neste momento, a grandeza de cada agradecimento será perceptível aos

olhos dos atentos leitores desta página.

À minha família, meus pais, José Ricardo Rios e Maria Selma Vasconcelos Rios,

pelo esforço tremendo, muitas vezes não reconhecido, que fizeram para eu chagar até aqui.

Também à minha irmã, Amanda, e meu cunhado, David, a pequena Alice (a coisa mais fofa

desse planeta) e ao trio canino Tina, Pucca e Garu.

À minha esposa, Aline, eterna companheira. Por compartilhar todos os momentos

e sempre ter a frieza de achar soluções quando tudo parecia perdido, pelo menos para mim.

À minha 2ª família que me adotou com muito carinho como se fosse um filho: Seu

Eudemberg, Dona Magda, Careca (Alexandre) e o quarteto felino fantástico Pretinha, Bola,

Pequena e Botinha.

A minha orientadora, Profª. Drª. Marta Maria de França Fonteles, por todos esses

anos me ajudando e ensinando, por acreditar em mim e ter confiado no meu potencial, mesmo

diante das diversas mudanças nos planos.

À todas outras professoras do Laboratório de Neurofarmacologia, Profª. Drª.

Glauce Socorro de Barros Viana (nossa grande avó científica), Profª. Drª. Francisca Cléa

Florenço de Sousa (por ter cedido a substância em estudo e aceitado participar da minha banca

de Doutorado), Profª. Drª. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos (pelos momentos de

descontração e por ter disponibilizado uma cafeteira para o laboratório), Profª. Drª. Danielle

Macêdo Gaspar (pelos vários momentos de conversas, tirada de dúvidas e por ter participado

da minha banca de qualificação).

Aos professores doutores Roberto César Pereira Lima Júnior (por, também, ter

participado da minha banca de qualificação) e Francisco Washington Araújo Barros

Nepomuceno, os quais tenho profunda admiração científica, por estarem à disposição para

participar da banca de doutorado mesmo diante das diversas mudanças de data.

À Profª. Drª. Fernanda Regina de Castro Almeida por ter se deslocado até nossa

cidade para participar da banca de doutorado.

Aos demais professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC por

ajudarem na minha formação, principalmente, à Profª. Drª. Letícia Veras Costa-Lotufo, pelo

brilhante trabalho frente à coordenação do PPG em Farmacologia.

Tenho muito a agradecer ao fraterno e vitorioso grupo auto-intitulado “NeuroDor”.

Nayrton, grande pesquisador, pela “co-orientação” deste trabalho, pelos inúmeros bons

momentos que nossa amizade nos proporciona, e mesmo distante ela nunca vai deixar de existir.

Leonardo e Alyne Mara, casal forte e decidido, obrigado pela fundamental ajuda do desenrolar

deste trabalho e, principalmente, pela amizade, é muito ter vocês como amigos e vizinhos.

Marília , bela pesquisadora, esforçada, inteligente e acima de tudo amiga. E por último, mas

não menos importante, Laura , nossa IC sempre disponível, esforçada e trabalhadora. Ninguém

decidiu formar esse grupo, ele foi se moldando com o tempo. Parabéns a todos pelos resultados,

que são frutos do nosso trabalho, dedicação, compromisso e responsabilidade. Alguns, talvez

com inveja dessas virtudes, tentaram enfraquecê-lo, mas em nada fomos afetados. “Hoje somos

mais fortes do que ontem e mais fracos do que amanhã.”

Aos amigos do laboratório Edith, Giuliana, Mariana, Camila, Belzinha,

Thiciane, Fernando, Cerqueira, Rafaelly, Helvira, Danilo, Caca, Luciana, Taciana,

Vládia, Patrícia, Eduardo, Sarah, Valdécio e todos os estagiários, pela companhia e

cooperação.

Aos demais amigos da pós-graduação: Galera da Profª. Geanne, Claudênio,

Natália, Talita, Delvane, Natacha e todos os outros que não lembrei aqui.

Aos funcionários e amigos do laboratório Vilani, Lena e Arnaldo , sempre presente

e dispostos a ajudar.

Às secretarias e amigas Aura , Márcia e Célia, pela fundamental ajuda em diversos

problemas que nesses quatro anos foram aparecendo.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e farmacologia: Alana, Fernando,

Haroldo e Seu Adauto.

À CAPES (PROEX) e CNPq pelo apoio financeiro importantíssimo no

desenvolvimento deste trabalho.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho

Muito obrigado!

RESUMO

Esse trabalho, até onde se sabe, mostra pela primeira vez o efeito antinociceptivo

do acetato de citronelila (CAT) e teve como objetivo caracterizar o perfil do efeito e identificar

possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em

camundongos. O CAT foi testado em modelos animais padronizados de dor utilizando

camundongos Swiss (24-32g). O CAT foi administrado nas doses de 25, 50, 75, 100 ou 200

mg/kg, por via oral. Foram utilizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido

acético; placa quente; teste da formalina; nocicepção mecânica, hipernocicepção inflamatória

induzida pela carragenina; teste da nocicepção induzida por capsaicina, cinamaldeído, mentol,

salina ácida, PMA, 8-Br-cAMP, bradicinina ou glutamato, bem como em modelos

comportamentais (testes do campo aberto e rota Rod) que permitiram excluir a possibilidade de

uma atividade relaxante muscular ou induzir resultados falso-positivos nos modelos anteriores.

Os resultados mostraram que o CAT possui efeito antinociceptivo no modelo de nocicepção

visceral induzida por ácido acético (nas doses de 100 ou 200 mg/kg, com DE50 de 74,42 mg/kg),

esse efeito foi verificado após 30 minutos da aplicação e persistiu por até 240 minutos (200

mg/kg). O pré-tratamento com o CAT mostrou efeito antinociceptivo no modelo de lambedura

induzida pela aplicação intraplantar de formalina e no modelo de nocicepção térmica (placa

quente). O CAT mostrou diminuição da sensibilidade mecânica utilizando o filamento de von

Frey. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, o CAT mostrou efeito relacionado com

os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgicos, receptores de bradicinina,

PKA e PKC. Na investigação das vias de neurotransmissão envolvidas no efeito antinociceptivo

do CAT, podemos sugerir o envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos, sistema

serotonérgico (receptores 5-HT1A, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos. Com

os resultados mostrados, podemos concluir que o CAT possui efeito antinociceptivo em

camundongos, e como possíveis mecanismos a modulação de mediadores intracelulares PKA

e/ou PKC, relacionados com os mecanismos moleculares dos canais K+ATP, TRPV1, TRPM8,

ASIC, receptores glutamatérgico, receptores de bradicinina, receptores α2-adrenérgico, sistema

serotonérgico (receptores 5-HT1, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos.

Palavras-chave: Acetato de Citronelila, Nocicepção, hipernocicepção inflamatória, PKC e

PKA.

ABSTRACT

This work shows for the first time the antinociceptive effect of the CAT and aimed

to characterize the profile of effect and identify possible antinociceptive mechanisms of the cat,

in models of acute nociception in mice. The CAT was testeed standardized animal models of

pain using mice Swiss (24-32g). The CAT was administered at doses of 25, 50, 75, 100 or 200

mg/kg, by gavage. Was used in the tests of abdominal writhings by acetic acid; hot plate;

formalin test; mechanic nociception; inflamatory hipernociception induced by carrageennan;

Nociception test induced by capsaicin, cinnamaldeide, menthol, acid saline, PMA, 8-Br-cAMP,

bradykinin or glutamate, as well as in behavioural models (open field and rota rod tests) that

allowed to exclude the possibility of a muscle relaxant action or to induce false-positive result

in the earlier models. The results showed that the CAT have antinociceptive effect in the

visceral nociception model induced by acetic acid (in the 100 or 200 mg/kg doses, with ED50

of 74.42 mg/kg), this effect was verified after 30 minutes of aplication and continued until 240

minutes (200 mg/kg). Pretreatment with CAT showed antinociceptive effect in licking model

induced by intraplantar formalin application and in the thermal nociception model (hot plate).

CAT showed the decreasing of mechanical sencibility using the von Frey hair. In the

antinociceptive mechanism investigation, CAT showed effect related with K+ATP channels,

TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, PKA and PKC. IN the

investigation of neurotramitters pathways involved in antinociceptive effect of CAT, we can

suggest the involvement of serotonergics system (5-HT1A, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic,

dopaminergic and α2-adrenergics receptors. With the results showed, we can conclude the CAT

have antinociceptive effect in mice, and as possible mechanism the modulation of intracellular

mediators PKC and/or PKA, relacted with moleculars mechanisms of K+ATP channels, TRPV1,

TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, serotonergics system (5-HT1,

5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors.

Keywords: Citronellyl acetate, Nociception, inflammatory hypernociception, PKC e PKA.

FIGURAS

1 Percepções sensitivas.......................................................................................... 23

2 Corno dorsal da medula no qual ocorre a primeira sinapse da via nociceptiva.. 25

3 Esquema ilustrando os neurônios envolvidos na teoria do “Portão”.................. 27

4 Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor...................... 28

5 Vias ascendentes dorso-laterais de transmissão da dor. ..................................... 29

6 Vias descendentes analgésicas que regulam a atividade dos neurônios de transmissão nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal............................. 30

7 Estrutura química plana do acetato de citronelila............................................... 33

8 Efeito do CAT no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. ................................................................................................................ 49

9 Efeito do CAT no teste da placa quente.............................................................. 51

10 Efeito do CAT no teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção inflamatória.............................................................................. 52

11 Envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético........... 53

12 Envolvimento do sistema serotonérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 54

13 Quantificação de serotonina e seu metabólito no fluido peritoneal após modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 55

14 Envolvimento dos receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3) no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................................................................................

56

15 Envolvimento do sistema colinérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 57

16 Envolvimento do sistema dopaminérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................... 58

17 Envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 59

18 Envolvimento do sistema oxidonitrérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................... 60

19 Envolvimento do sistema glutamatérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por glutamato.................................. 61

20 Envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético........................................................................................................ 62

21 Envolvimento dos TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por capsaicina........................................................ 63

22 Envolvimento dos TRPA1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por cinamaldeído................................................... 64

23 Envolvimento dos TRPM8 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por mentol.............................................................. 65

24 Envolvimento dos ASIC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por salina acidificada.............................................. 66

25 Envolvimento do PKA no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por PMA................................................................. 67

26 Envolvimento do PKC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por 8-Bromo-cAMP............................................... 68

27 Envolvimento da bradicinina no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida................................................................................ 69

28 Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do rota rod........... 70

29 Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do campo aberto. 71

30 Ilustração mostrando os possíveis canais e receptores, com alguns de seus segundos mensageiros, envolvidos, e discutidos até o momento, no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila.......................................... 87

LISTA DE TABELAS

1 Substâncias usadas no trablaho..................................................................... 36

2 Efeitos do CAT no modelo de lambedura da pata induzida por formalina... 50

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 18

1.1 Fisiopatologia da dor ................................................................................................................... 19

1.1.1 Estruturas de transdução da nocicepção (Nociceptores) ...................................................... 20

1.1.2 Neurobiologia da nocicepção ............................................................................................... 23

1.1.3 Modulação endógena da dor ................................................................................................ 30

1.2 Modelos animais de nocicepção e dor ........................................................................................ 32

1.3 Acetato de Citronelila.................................................................................................................. 33

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .................................................................................... 35

3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 36

3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................................ 36

3.2. Objetivos específicos.................................................................................................................. 36

4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 37

4.1 Animais ....................................................................................................................................... 37

4.2 Princípios éticos .......................................................................................................................... 37

4.3. Drogas e substâncias utilizadas .................................................................................................. 37

4.4. Atividade antinociceptiva ........................................................................................................... 39

4.4.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ............................................ 39

4.4.2. Teste da formalina ............................................................................................................... 40

4.4.3. Teste da placa quente .......................................................................................................... 40

4.4.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) ........................................................................ 40

4.4.5 Hipernocicepção inflamatória .............................................................................................. 41

4.5. Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do CAT ................................................... 41

4.5.1. α2-adrenérgico ..................................................................................................................... 41

4.5.2 Serotonégico ......................................................................................................................... 42

4.5.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio .................................................................................................................................... 42

4.5.2.2 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2 e 5-HT3) ......................... 43

4.5.3. Colinérgico .......................................................................................................................... 43

4.5.4. Dopaminérgico .................................................................................................................... 43

4.5.5 Opióide ................................................................................................................................. 44

4.5.7 Oxidonitrérgico .................................................................................................................... 44

4.5.8 Glutamatérgico ..................................................................................................................... 44

4.6. Canais e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT .......................................... 45

4.6.1 Canais de potássio dependentes de ATP .............................................................................. 45

4.6.2 TRPV1 .................................................................................................................................. 45

4.6.3 TRPA1 .................................................................................................................................. 45

4.6.4 TRPM8 ................................................................................................................................. 46

4.6.5 ASICs ................................................................................................................................... 46

4.6.6 PKC ...................................................................................................................................... 46

4.6.7 PKA ...................................................................................................................................... 46

4.6.8 Bradicinina ........................................................................................................................... 47

4.7 Avaliação da Atividade Locomotora ........................................................................................... 47

4.7.1 Teste do Rota rod ................................................................................................................. 47

4.7.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto) .................................................. 47

4.7 Análises estatísticas ..................................................................................................................... 48

5 RESULTADOS ..................................................................................................................... 49

5.1 Atividade antinociceptiva ............................................................................................................ 49

5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ........................................... 49

5.1.2. Teste da formalina ............................................................................................................... 51

5.1.3. Teste da placa quente .......................................................................................................... 52

5.1.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção mecânica .......................... 53

5.2 Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila ........................... 54

5.2.1. α2-adrenérgico ..................................................................................................................... 54

5.2.2. Serotonérgico ...................................................................................................................... 55

5.2.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritôneo .................................................................................................................................... 56

5.2.2.2. Receptores serotonérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3) ............................................... 57

5.2.3. Colinérgico .......................................................................................................................... 58

5.2.4. Dopaminérgico .................................................................................................................... 59

5.2.5. Opióide ................................................................................................................................ 60

5.2.6. Oxidonitrérgico ................................................................................................................... 61

5.2.7 Receptores glutamatérgicos .................................................................................................. 62

5.3 Canais envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT ................................................................. 63

5.3.1 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP .................................................... 63

5.3.2 Receptores TRPV1 ............................................................................................................... 64

5.3.3 Receptores TRPA1 ............................................................................................................... 65

5.3.4 Receptores TRPM8 .............................................................................................................. 66

5.3.5 ASICs ................................................................................................................................... 67

5.3.6 PKA ...................................................................................................................................... 68

5.3.7 PKC ...................................................................................................................................... 69

5.3.8 Bradicinina ........................................................................................................................... 70

5.4 Avaliação da atividade locomotora ............................................................................................. 71

5.4.1 Teste do rota-rod .................................................................................................................. 71

5.4.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto) .................................................. 72

6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 73

7 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 99

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 100

ANEXO A – DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DESTE PROJETO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL - UFC ................................................. 113

ANEXO B – TRABALHO PUBLICADO EM PERIÓDICO COM ALGUNS RESULTADOS DESTA TESE ......................................................................................................................... 114

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

5-HT 5-hidroxitriptamina (serotonina)

ALE Atividade locomotora espontânea

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

ASICs Canais iônicos sensíveis ao ácido

ASIC 1 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 1

ASIC 4 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 4

BK Bradicinina

CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX Ciclooxigenase

DZP Diazepam

E.P.M. Erro Padrão da Média

GDNF Células gliais derivadas de fator neurotrófico

Il Interleucina

i.p. Intraperitonial

NGF Fator de crescimento neural

NK1 Neuroquinina 1

NMDA N-metil D-Aspartato

NMR Núcleo magno da rafe

NO Óxido nítrico

NOS Óxido nítrico sintase

P Nível de significância

P2X3 Receptor purinérgico 3

PAG Substância cinzenta periaquedutal

pCPA p-clorofenilalanina

PGs Prostaglandinas

PGE2 Prostaglandina tipo E2

PGF2 Prostaglandina tipo F2

PKC Proteína quinase C

RPM Rotações por minuto

s.c. Subcutâneo

SP Substância P

SMT Trato espinomesencefálico

SNC Sistema nervoso central

SRT Trato espinoreticular

STT Trato espinotalâmico

TNF-α Fator de necrose tumoral alfa

TRKA Receptor de Tirosina Quinase tipo A

TRPA Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina

TRPA 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina 1

TRPC Receptor de Potencial Transitório do tipo Canônico

TRPM Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina

TRPM 8 Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina 8

TRPML Receptor de Potencial Transitório do tipo Mucolipina

TRPP Receptor de Potencial Transitório do tipo Policistina

TRPV Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide

TRPV 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 1




VLF Funículo ventrolateral

v.o. Via oral

VR1 Receptor do tipo vanilóide 1

Vs. Versus

18

1. INTRODUÇÃO

A dor foi conceituada pela primeira vez em 1986, pela Associação Internacional

para o Estudo da Dor (IASP), como uma experiência sensorial e emocional desagradável que

está associada a lesões reais ou potenciais. Em 1994 os membros e colaboradores desta

associação reformularam esta definição para “uma experiência sensorial e emocional

desagradável associada a dano tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal dano”

(IASP, 1994). Em 2012, os membros desta associação mantiveram esta última como conceito

atual de dor. Em nota a IASP contempla também aspectos gerais mais íntimos à dor:

“A incapacidade de se comunicar verbalmente não nega a possibilidade de que um indivíduo está sentindo dor e está na necessidade de tratamento de alívio da dor adequado. A dor é sempre subjetiva. Cada indivíduo aprende a aplicação da palavra através de experiências relacionadas com a lesão no início da vida. Biólogos reconhecem que os estímulos que causam dor são susceptíveis a dano tecidual. Assim, a dor é aquela experiência que associamos com lesão tecidual real ou potencial. É, sem dúvida, uma sensação em uma parte ou partes do corpo, mas também é sempre desagradável e, portanto, também uma experiência emocional. Experiências que se assemelham a dor, mas não são desagradáveis, formigamento, por exemplo, não deve ser chamado de dor. Desagradáveis experiências anormais (disestesia) podem também ser dor, mas não são necessariamente assim porque, subjetivamente, eles podem não ter as qualidades habituais sensoriais da dor. Muitas pessoas relatam dor na ausência de danos nos tecidos ou qualquer outra causa fisiopatológico; geralmente isto acontece por razões psicológicas. Normalmente não há maneira de distinguir a uma experiência, devido à lesão tecidual, se tomarmos o relato subjetivo. Se eles consideram a sua experiência como dor, e se eles relatam que da mesma forma como a dor causada por lesão tecidual, ela deve ser aceita como dor. Esta definição evita a dor como subordinação ao estímulo. Atividade induzida nas vias nociceptoras por um estímulo nocivo não é dor, que é sempre um estado psicológico, apesar de bem podermos apreciar que a dor na maioria das vezes tem uma causa próxima física.”

Fonte: http://www.iasp-pain.org/Content/NavigationMenu/GeneralResourceLinks/PainDefinitions/default.htm

A dor aguda ou fisiológica é um alerta fundamental para a preservação da

integridade dos tecidos em animais, evitando ou diminuindo a extensão da ocorrência de lesões,

a dor crônica não tem este valor biológico e é uma importante causa de incapacidade física

(TEIXEIRA, 1990). A dor visceral e a dor somática profunda são causadas por estímulos

inevitáveis e apresentam respostas adaptativas específicas, geralmente são subagudas e podem

19

vir acompanhadas de respostas autonômicas ou comportamentais específicas (KLAUMANN,

et al., 2008).

O excesso de estímulos nociceptivos, a diminuição do limiar de disparo sensitivo ou

a hipoatividade do sistema supressor podem gerar dor. Nas condições normais, o estímulo

sensorial é captado pelas estruturas do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e transmitida para o

Sistema Nervoso Central (SNC), onde é decodificada e interpretada. Mecanismos modulatórios

sensibilizam ou suprimem a nocicepção em todas as etapas em que ela é processada.

O termo nocicepção está relacionado com o reconhecimento de sinais dolorosos pelo

sistema nervoso, que interpretam informações relacionadas à lesão. Baseado nestes conceitos,

o termo dor seria melhor aplicado a seres humanos do que aos animais, pelo fato deste termo

envolver um componente emocional. Mesmo assim tornou-se uma convenção o uso do termo

“dor” para pacientes humanos e animais (HELLEBREKERS, 2002).

1.1 Fisiopatologia da dor

Nocicepção consiste nos processos de transdução, transmissão e modulação de

sinais neurais gerados em resposta a um estímulo nocivo externo. De forma simplificada, pode

ser considerado como uma cadeia de três etapas, com o neurônio de primeira ordem originado

na periferia (transdução) e projetando-se para a medula espinhal, o neurônio de segunda ordem

ascende pela medula espinhal (transmissão) e o neurônio de terceira ordem projeta-se para o

córtex cerebral (modulação) (MESSLINGER, 1997; TRANQUILLI, 2004).

Descrevendo melhor, a nocicepção é o processo de percepção de estímulos nocivos

diversos (térmicos, mecânicos ou químicos). Estes estímulos são detectados por uma

subpopulação de fibras nervosas periféricas, chamadas nociceptores (BASBAUM et al., 2009).

Os nociceptores são extremamente heterogêneos diferindo quanto aos tipos de

neurotransmissores que contêm, receptores e canais iônicos que expressam, velocidade de

condução, propriedades de resposta ao estímulo nocivo e sua capacidade de serem

sensibilizados durante a inflamação, lesão e/ou doenças (STUCKY, GOLD, ZHANG, 2001).

20

Apesar das limitações dos trabalhos laboratoriais, evidenciaram-se, em condições

agudas, a participação de grande número de centros, vias nervosas e neurotransmissores nos

mecanismos centrais e periféricos relacionados com o processamento da nocicepção.

Há uma considerável integração entre os tecidos periféricos e o SNC no

processamento da dor. À medida que ascende no neuroeixo, por um estímulo capaz de deflagrar

um potencial de ação, a redundância anatômica das vias sensitivas aumenta de modo

significativo e a especificidade reduz-se (TEIXEIRA, 1999). A ação dos neurotransmissores

excitatórios liberados na medula espinal pelos aferentes primários nociceptivos sofre influência

de sistemas neuronais excitatórios e inibitórios em várias regiões do sistema nervoso. É

provável que, dependendo da modulação do impulso na medula espinhal, a informação

nociceptiva seja ou não transferida pelos neurônios de segunda ordem para os centros rostrais

do neuroeixo. O encéfalo não é passivo às mensagens coletadas no meio exterior e interior.

Sistemas neuronais supra-espinhais permitem ao organismo utilizar a experiência passada para

controlar a sensibilidade nas várias estruturas do neuroeixo e reagir de modo variado e

autodeterminado (BRUSCATTO, 2006).

Mas para que tudo isso ocorra, primeiro é preciso haver a transdução do estímulo

nociceptivo em potencial de ação. Para isso existem estruturas especializadas descritas abaixo.

1.1.1 Estruturas de transdução da nocicepção (Nociceptores)

Muitas estruturas de transdução da nocicepção foram identificadas nas últimas

décadas. Hoje se sabe que existem quatro classes de nociceptores: mecânicos, térmicos,

polimodais e silenciosos.

Os nociceptores mecânicos respondem a pressão intensa enquanto os térmicos

respondem às temperaturas extremas, quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C). Os nociceptores

polimodais respondem aos estímulos nocivos mecânicos, térmicos ou químicos e os silenciosos

são ativados por estímulos químicos, mecânicos, térmicos e mediadores inflamatórios somente

depois de serem ativados (JULIUS E BASBAUM, 2001).

O principal grupo de detectores de estímulos nocivos é a família dos receptores de

potencial transitório (TRP) (Baggio, 2010). Esses receptores participam na geração de

21

sensações dolorosas evocadas por estímulos químicos, térmicos e mecânicos (LEVINE,

ALESSANDRI-HABER, 2007). São receptores polimodais acoplados a canais iônicos

permeáveis a cátions.

Baseando-se na homologia, foram identificados numerosos membros da família do

TRP, nos vertebrados. Em mamíferos, os membros dessa família foram classificados em seis

subfamílias:

a) TRPC (canônico)

b) TRPV (vaniloide)

c) TRPA (anquirina)

d) TRPM (melastatina)

e) TRPP (policistina)

f) TRPML (mucolipina)

O receptor de potencial transitório vanilóide 1 (TRPV1), originalmente chamado de

receptor vanilóide 1 (VR1) e comumente referido como receptor da capsaicina, foi o primeiro

descrito como receptor polimodal ativado por três estímulos dolorosos; compostos vanilóides

(capsaicina, resiniferatoxina), calor nocivo (>43°C) e pH baixo (<5,9) (CATERINA et al.,

1997; TOMINAGA et al., 1998). Após a identificação do canal TRPV1 em nociceptores, uma

variedade de outros tipos de células, incluindo: os queratinócitos, as células β pancreáticas, as

células endoteliais, os linfócitos, os macrófagos e as células de diferentes regiões do cérebro,

também expressam o TRPV1. Sua presença, em todos esses tipos de células e em diferentes

partes do corpo, sugere que o TRPV1 é estimulado normalmente por um ligante endógeno –

um endovaniloide – e não apenas por estimulação térmica (FEIN, 2011).

Outro membro importante da grande família TRP que foi abordado neste estudo é o

TRPA1. De expressão heteróloga e ativados por compostos irritantes, como sementes de

mostarda, raiz-forte, canela, alho e gás lacrimogêneo, os quais despertam a sensação dolorosa

em queimação ou em picada. Interessantemente, os camundongos nocautes para NaV1.8 também

exibiram uma significativa redução na expressão para TRPA1 em neurônios do gânglio da raiz

dorsal (GRD) e a falta de uma resposta nociceptiva mediada ao TRPA1 para o teste da

formalina. O papel do TRPA1 como sensor de frio nocivo se mostrou controverso, porém são

22

ativados a temperaturas próximas de 17 °C, o que está perto do limiar ao frio nocivo de 15 °C

para seres humanos. Em contraste ao debate sobre o papel do canal de cátion do TRPA1 como

um sensor de frio nocivo, o papel na excitação do nociceptor evocado pela bradicinina (BK) e

hipersensibilidade à dor, não ficou controverso. As injeções de BK em camundongos nocautes

para TRPA1 foram muito menos dolorosas, que mostraram pouca ou nenhuma

hipersensibilidade térmica ou mecânica frente a esse mediador (JULIUS E BASBAUM, 2001).

O canal TRPM8 é ativado por agentes de esfriamento, como mentol ou temperaturas

abaixo de 26 °C. Os camundongos nocautes para TRPM8 ainda apresentam neurônios

sensibilizáveis, indicando que o TRPM8 não é o único receptor ativado pelo frio. A combinação

de nocautes para TRPA1 e TRPM8 pode ajudar a esclarecer a função relativa do TRPA1 e do

TRPM8 na detecção do frio (JULIUS E BASBAUM, 2001).

Outra família de canais importantes na transdução da nocicepção são os canais de

íons sensíveis ao ácido (ASICs). Eles são codificados por quatro genes, produzindo

subunidades designadas de ASIC1 a ASIC4, diversas variantes do ASIC também foram

descobertas. Os ASICs são trímeros de proteínas e podem ser compostos de diferentes

combinações de subunidades. Após a descoberta e clonagem, os ASICs tornaram-se os

principais candidatos a sensor de prótons extracelulares. Os ASICs são ativados por prótons

extracelulares e modulados pela PKC (KRISHTAL, PIDOPLICHKO, 1980; BARON et al.,

2002).

Ainda em relação aos receptores e canais envolvidos na nocicepção, foi

demonstrado que a glibenclamida – um hipoglicemiante oral – bloqueador dos canais de

potássio sensível ao ATP [K+ATP], antagoniza a analgesia induzida por morfina em

camundongos, sugerindo que a morfina atuaria ativando esses canais. Os canais K+ATP são

compostos por quatro subunidades regulatórias dos receptores para sulfonilureia e quatro poros

sensíveis ao ATP que geram as correntes de retificação internas do potássio. Os canais K+ATP

atuam como sensores metabólicos e quando os níveis do ATP intracelular são elevados, os

canais se fecham.

Após essa etapa de transformação da energia física ou química (estímulo nóxico)

em neuroquímica (potencial de ação) diversas estruturas atuam como ponte no caminho desse

impulso gerado. Essas estruturas determinam a velocidade e o local onde esse impulso vai

chegar, existindo, então, diferentes interpretações e resposta para os diferentes estímulos.

23

1.1.2 Neurobiologia da nocicepção

Todos os sistemas sensoriais devem converter estímulos ambientais em sinais

eletroquímicos. No caso da visão ou olfato, neurônios sensoriais primários precisam apenas

detectar um tipo de estímulo (luz ou substância odoríferas) e usando mecanismos bioquímicos

redundantes e convergentes alcançam esse objetivo (Figura 1a). No entanto, a nocicepção é

única porque os neurônios sensoriais primários da “via da dor” têm a capacidade notável para

detectar uma grande variedade de estímulos, incluindo os de natureza física e química (Figura

1b).

Figura 1. Percepções

sensitivas. (a) Ilustra o

mecanismo bioquímico

redundante e convergente

para a percepção sensitiva

luminosa e olfativa. (b)

Ilustra os diversos

estímulos envolvidos na

percepção do nociceptor.

Fonte: Adaptado de

JULIUS E BASBAUM

(2001).

Em comparação com neurônios sensoriais dos outros sistemas, os nociceptores

devem, portanto, ser amplamente equipados com dispositivos de transdução. Ao mesmo tempo,

os estímulos muito diferentes de um produto químico (de capsaicina e ácidos) ou físicos (calor)

podem excitar nociceptores por ativação de um único receptor, permitindo que a célula integre

a informação e responda a alterações complexas no ambiente fisiológico.

Segundo Pisera (2005) o primeiro processo da nocicepção é a decodificação de

sensações mecânica, térmica ou química em impulsos elétricos por terminais nervosos

24

especializados denominados nociceptores. Os nociceptores são terminações nervosas livres dos

neurônios de primeira ordem, cuja função é preservar a integridade tecidual, assinalando uma

injúria potencial ou real. As fibras nervosas responsáveis pela condução do sinal nociceptivo

da periferia ao SNC podem ser classificadas como (JULIUS & BASBAUM, 2001):

a) Fibras Aβ: bastante mielinizada, constituindo a fibra de mais rápida condução

nervosa (30 – 100 m/s) dentre as envolvidas com o processo nociceptivo, diâmetro grande

(10μm). Detectam estímulos inócuos aplicados à pele, músculos e articulações.

b) Fibras Aδ: pouca mielinização, tendo por isso uma condução nervosa mais lenta que

as fibras Aδ (1,2 – 30 m/s). Apresentam diâmetro intermediário (2 – 6 μm) e são ativadas através

de nocicepção mecânica e térmica. Existem duas principais subclasses de nociceptores Aδ;

ambas respondem a estímulos mecânicos intensos, mas podem ser diferenciadas pelas suas

responsividades ao calor intenso (tipo I são ativadas a ~ 53 °C; e tipo II ativadas a ~ 43°C)

(JULIUS, BASBAUM, 2001).

c) Fibras C: não apresenta mielinização, sendo dos três tipos, a fibra de condução mais

lenta (0,5 – 2 m/s). Apresentam o menor diâmetro (0,4 – 1,2 mm) e são ativadas por vários tipos

de estímulos (mecânica, térmica e química).

Na ausência de dano tecidual ou nervoso as fibras Aβ somente transmitem

informação referente a estímulos inócuos, como tato, vibração e pressão. Normalmente, a

informação nociceptiva é transmitida por fibras do tipo C e Aδ localizadas na pele, vísceras,

vasos sanguíneos, peritônio, pleura, periósteo, tendão, fáscia, cápsula articular e fibras do

músculo esquelético; sua distribuição depende da localização anatômica, podendo aparecer a

cada 2 a 10 mm² de área corporal (MESSLINGER, 1997; LAMONT e TRANQUILLI, 2000;

MUIR III et al., 2001). As fibras Aδ são responsáveis pela primeira fase da dor, rápida e forte,

do tipo picada ou ferroada e são sensíveis a estímulos mecânicos intensos (mecanorreceptores

de alto limiar). As fibras C produzem uma segunda fase de dor mais difusa e persistente e

apresentam, na periferia, receptores de alto limiar para estímulos térmicos e/ou mecânicos. As

fibras C polimodais respondem a estímulos mecânicos, térmicos e químicos. Os campos

receptivos destes neurônios oscilam entre 2 e 10 mm² de área corporal (TRANQUILLI, 2004;

PISERA, 2005; KLAUMANN, et al., 2008).

25

Todos os neurônios nociceptivos primários convergem e efetuam sinapses

excitatórias com neurônios de transmissão de segunda ordem situados no corno dorsal da

medula espinhal e no corno dorsal trigeminal bulbar. Os neurônios de segunda ordem podem

ser classificados em dois tipos fisiológicos: neurônio nociceptivo específico (NS), recebe

exclusivamente impulsos de aferentes nociceptivos primários dos tipos Aδ e C, respondendo

apenas a impulsos provenientes de estimulação somática e visceral de alta intensidade. O

segundo tipo, chamado de neurônio de ampla faixa dinâmica (WDR), pode efetuar sinapses

com os aferentes primários mecanorreceptivos de baixo limiar (fibras do tipo Aβ, relacionadas

com o tato) e com aferentes nociceptivos de alto limiar (fibras Aδ e C).

As fibras aferentes nociceptivas terminam na substância cinzenta da medula

espinhal, que possui estrutura morfofuncional heterogênea, sendo dividida em 12 lâminas e o

corno dorsal formado pelas seis primeiras.

Na lâmina marginal (lâmina I) existe uma alta proporção de neurônios nociceptivos

específicos (NS), enquanto os neurônios ampla faixa dinâmica (WDR) são encontrados

predominantemente na lâmina V, e se projetam ao tronco encefálico e certas regiões do tálamo.

A substância gelatinosa (lâmina II) é rica em interneurônios inibitórios e excitatórios que

possuem funções moduladoras na transmissão da informação nociceptiva (TRANQUILLI,

2004; PISERA, 2005; DREWES, 2006; KLAUMANN, et al., 2008). Tanto a lâmina I quanto a

II são ricamente inervadas por fibras Aδ e C. As lâminas III e IV possuem neurônios que se

conectam diretamente com as fibras Aβ e que respondem predominantemente a estímulos

inócuos. Os neurônios da lâmina VI estão conectados de forma monossináptica com aferentes

Aβ de músculos e articulações e respondem a estímulos inócuos. Outras lâminas, VII, VIII e

IX estão situadas no corno ventral da medula espinhal e abrigam neurônios com funções

principalmente motoras, enquanto que a lâmina X, situada ao redor do canal central, possui

neurônios envolvidos na transmissão nociceptiva. (PISERA, 2005; KLAUMANN, et al., 2008).

26

Figura 2. Corno dorsal da medula no qual ocorre a primeira sinapse da via nociceptiva. Fonte: MENESCAL-DE-

OLIVEIRA, 2008.

As fibras aferentes de primeira ordem formam conexões diretas ou indiretas com

uma das três populações de neurônios do corno dorsal da medula:

a) interneurônios excitatórios ou inibitórios;

b) neurônios proprioespinhais que estendem-se por múltiplos segmentos espinhais

e estão envolvidos com a atividade reflexa;

c) neurônios de projeção (WDR) que participam na transmissão rostral através da

medula espinhal até centros supraespinhais como o mesencéfalo e córtex.

Esses componentes são interativos e essenciais para o processamento da informação

nociceptiva, o que facilita a geração de uma resposta à dor apropriada e organizada (MILLAN,

1999; LAMONT e TRANQUILLI, 2000; DREWES, 2006; KLAUMANN, et al., 2008).

As principais vias ascendentes ântero-laterais de transmissão da dor têm origem nos

axônios dos neurônios de segunda ordem das lâminas I e V, principalmente, e ascendem pelo

27

funículo ântero-lateral para estruturas supra-espinhais. Este complexo sistema de vias diretas e

indiretas conduz a transmissão das informações nociceptivas para neurônios que se projetam

através de quatro vias ascendentes principais:

a) trato espinotalâmico: Têm origem nos neurônios de segunda ordem das lâminas

I e V que decussam dentro da medula espinhal e ascendem pelo funículo ântero-

lateral para estruturas supra-espinhais. Atualmente é dividido em Trato

Paleoespinotalâmico (medial), que transmitem a informação em baixa

velocidade (dor lenta), efetuando várias sinapses com estruturas bulbares e

mesencefálicas antes de alcançar estruturas talâmicas e daí projetar-se para o

córtex e insula, e Trato neoespinotalâmico (lateral), conduz a informação

nociceptiva em alta velocidade (dor rápida) e com poucas sinapses ao longo do

seu trajeto;

b) trato espinorreticular: Compreende axônios de neurônios das lâminas VII e

VIII que terminam na formação reticular (bulbar e pontina), para logo ascender

até o tálamo;

c) trato espinomesencefálico: É formado por axônios de neurônios de projeção das

lâminas I e IV que se projetam contralateralmente até a formação reticular

mesencefálica e a substância cinzenta periaquedutal até os núcleos

parabraquiais da formação reticular. Os neurônios parabraquiais projetam-se até

a amigdala, um dos principais componentes do sistema límbico, o que sugere

que o trato espinomesencefálico contribui com os componentes afetivos da dor;

d) trato espino-hipotalâmico: Compreende axônios principalmente provenientes

das lâminas I e V, que se projetam diretamente para núcleos do hipotálamo.

Essas conexões participam nas respostas neuroendócrinas e autonômicas

induzidas pela dor (LAMONT, TRANQUILLI, 2000; PISERA, 2005).

Existem outras vias de transmissão da dor que trafegam contralateralmente pelo

funículo dorsolateral da medula espinhal. São elas, trato espinoparabranquio-amigdalóide e

trato espinoparabranquio-hipotalâmico. Ambos originam-se nos neurônios nociceptivos

específicos da lâmina I, cujos axônios cruzam para o lado contralateral e ascendem pelo

funículo dorsolateral. Eles estão envolvidos nas respostas relativas ao componente afetivo-

28

motivacional da dor e na elaboração das respostas autonômicas e endócrinas que acompanham

o processo doloroso.

Teoria do “portão” de Paul Melzack e Patrick Wall

Essa teoria postula que colaterais de fibras Aβ, associadas à sensibilidade tátil, produzem, via interneurônios

inibitórios da lâmina II, um decréscimo na atividade dos neurônios de segunda ordem (lâmina V), que provoca a

diminuição da dor. Inversamente, quando a atividadedas fibras Aδ e C suplantam a das fibras Aβ, estes

interneurônios são inibidos, conseqüentemente há ativação dos neurônios de segunda ordem e, portanto, aumento

da dor. Assim, os interneurônios inibitórios localizados na substância gelatinosa atuam como um “portão”

modulando a informação nociceptiva. Uma aplicação para esta teoria é o ato de massagear uma área lesionada por

pancada, por exemplo, e assim reduzir a dor.

Figura 3. Esquema ilustrando os neurônios envolvidos na teoria do “Portão”. Interneurônio inibitório (Inb) e Substância gelatinosa (SB). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.

29

Figura 4. Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor. Funículo antero-lateral (FAL);

Substância cinzenta periaquedutal (SCP); Complexo ventral posteriordo tálamo (VPL/VPM); Córtex

somatossensorial primário (SI). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.

As características fisiológicas e o destino das diferentes vias ascendentes de

transmissão da dor definem o processamento diferencial dos componentes e as respostas

relacionadas com a dor que incluem:

a) reflexo somático (medula espinhal);

b) resposta autonômica e neuroendócrina (conexões com núcleos parabraquial,

substância cinzenta periaquedutal e hipotálamo);

c) alerta (conexões espinorreticulares);

30

d) discriminação sensorial da intensidade, localização e qualidade associadas ao

estímulo evocado (conexões espinotalâmicas);

e) dimensões afetivo-motivacionais (conexões espinotalâmica, espino-

hipotalâmica, espinopontoamigdalóide, espinomesencefálica e suas subseqüentes

projeções mais rostrais).

Figura 5. Vias ascendentes dorso-laterais de transmissão da dor. Funículo dorso-lateral (FDL); Gânglio da raiz

dorsal (GRD); Núcleo parabraquial (NPB); Amígdala (AM); Hipotálamo (HT). Fonte: MENESCAL-DE-

OLIVEIRA, 2008.

1.1.3 Modulação endógena da dor

O sistema glutamatérgico, principalmente receptores NMDA (N-Metil-D-

Aspartato), distribuídos por toda extensão do sistema nervoso central, são muito importantes na

modulação da resposta nociceptiva. O sistema opióide também pode modular o sistema

31

glutamatérgico através dos receptores μ e δ, que podem inibir ou potencializar eventos

mediados pelos receptores NMDA, enquanto o receptor κ antagoniza a atividade mediada por

tais receptores (RIEDEL e NEECK, 2001).

Figura 6. Vias descendentes analgésicas que regulam a atividade dos neurônios de transmissão nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal. Hipotálamo (HT); Amídala (AM); Substância cinzenta periaquedutal (SCP); Núcleo Magno da rafe (NMR); Fundículo dorso-lateral (FDL). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.

Estruturas no tronco encefálico são muito importantes na modulação das

informações nociceptivas. Quando ativadas, enviam impulsos descendentes que inibem a

transmissão dos sinais de dor nos neurônios do corno dorsal da medula espinhal. As principais

estruturas envolvidas nesse sistema descendente inibitório são a substância cinzenta

32

periaquedutal (SCP), bulbo rostroventromedial (RVM), que inclui o núcleo magno da rafe

(NMR) e locus coeruleus (LC). A SCP, quando ativada, produz seu efeito por meio de projeções

excitatórias para o RVM ou o LC. Os axônios dos neurônios RVM têm projeção descendente,

via funículo dorsolateral, e terminam formando sinapses inibitórias com neurônios nociceptivos

de segunda ordem no corno dorsal da medula espinhal, causando uma inibição da informação

nociceptiva (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).

As projeções provenientes do NMR liberam serotonina (5-HT) no corno dorsal da

medula espinhal, enquanto que as projeções provenientes do LC liberam noradrenalina, ambas

resultando em efeito analgésico endógeno. Existem evidências de que interneurônios

encefalinérgicos e GABAérgicos também participam na modulação nociceptiva, não tanto no

corno dorsal mas também em outros locais (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).

Os conhecimentos dos processos envolvidos na dor são provenientes, em grande

parte, de estudos com animais. Diversos modelos de nocicepção são aplicados a diferentes

estruturas anatômicas dos animais e assim poder existir uma relação mais próxima da dor.

1.2 Modelos animais de nocicepção e dor

No campo da pesquisa em animais, a dor não pode ser medida diretamente e

dessa forma os efeitos da administração de drogas também não. Assim, os parâmetros

comportamentais utilizados para quantificar respostas a estímulos dolorosos em animais são

apenas indicativos e na realidade medem a resposta nociceptiva a um dado estímulo

(SCHOUENBORG, SJÖLUND, 1983; SANDKÜHLE, 2009).

Os modelos tradicionalmente utilizados para teste de substâncias com potencial

atividade antinociceptiva envolvem a observação comportamental de animais após a exposição

a um estímulo nóxico. O local da exposição e as propriedades químicas e físicas desses

estímulos geram modelos de estudo com características e aplicabilidades diferentes, e dessa

forma, fornecem possibilidades de estudo de vários ângulos do processo nociceptivo.

A literatura descreve vários modelos consagrados para a triagem de moléculas no

campo da dor, são exemplos: Teste de nocicepção visceral induzida por ácido acético, Teste da

nocicepção química induzida pela aplicação subcutânea de formalina na pata, teste de

33

nocicepção térmica (placa quente e retirada da cauda), teste de sensibilidade mecânica e

hipernocicepção inflamatória (teste do von Frey).

Hoje milhares de trabalhos são publicados anualmente utilizando alguns desses

métodos, destes, muitos investigam moléculas de origem natural quanto ao seus efeitos

antinociceptivos. Nosso grupo já contribuiu com algumas publicações nesse sentido com as

seguintes moléculas: Carvacrol (MELO et al, 2012), Bisabolol (ROCHA et al., 2011), Riparina

I (ARAÚJO et al., 2009), Riparina II (CARVALHO et al., 2013) e Acetato de Citronelila (RIOS

et al., 2013).

1.3 Acetato de Citronelila

Já foram identificadas mais de 730 espécies do gênero Eucalyptus, mas menos de

vinte espécies são exploradas comercialmente e clinicamente. Do ponto de vista da composição

química, qualitativa e quantitativamente, os óleos essenciais de Eucalyptus spp. são misturas

moderadamente complexas, e variam com as espécies. A estrutura gênica, tipo e idade da folha,

condições ambientais (clima, solo, luz, calor, umidade) e processo de extração, são variantes

fundamentais na composição dos óleos essenciais. Os constituintes mais importantes são os

álcoois, os aldeídos, os ésteres e os éteres. Dentre eles, destacam-se os álcoois porque

constituem uma das frações mais aromáticas, entre eles o citronelol. Brito et al, (2012)

mostraram que o citronelol é um efetivo analgésico em vários modelos de dor em animais,

atuando, provavelmente, via inibição de mediadores periféricos (como TNFα e síntese de NO)

bem como via mecanismo central (via receptores opióides).

Outro componente muito importante é o citronelal, um aldeído que, juntamente com

os álcoois, forma a fração mais perfumada das essências. Quintas-Junior et al., (2011)

mostraram que o citronelal possui propriedades antioxidantes e modulatórias na dor neuropática

e inflamatória em modelos de dor orofacial induzida por formalina através de mecanismos

envolvendo receptores opióides, TRPV1 e Glutamato.

O acetato de citronelila é um éster muito utilizado em perfumes e é conhecido pelo

agradável odor. Ele está presente, principalmente, no Eucalyptus citriodora, 1-3,8% no extrato

de folhas (BETTS, 2000) e 15,33% da fração oleosa do extrato das folhas (TIAN et al., 2005),

que Shen, et al., 2012 mostraram ser um potente agente antihepatoma devido a uma ação pró-

34

apoptótica em células HepG2 (hepatoma humano). Também a ele são atribuídas diversas outras

atividades biológicas, como: fungicida (RAMEZANI, 2006), larvicida (SINGH, et al., 2007),

bactericida (MULYANINGSIH, et al., 2011) e repelente/inseticida (PHASOMKUSOLSIL;

SOONWERA, 2011).

O acetato de citronelila também está presente, dessa vez em quantidade menos

significativas, no extrato volátil de pericarpo de frutos de Zanthoxylum schinifolium que Paik,

et al., 2005, demonstraram induzir apoptose em células HepG2 caspase-3 independente e que

também inibiu o crescimento do tumor Huh-7 (células de hepatoma humano) em camundongos.

Fang, et al., 1989 já tinham demonstrado uma atividade antitumoral para o acetato de citronelila.

Ham, et al., 2011, mostraram o potencial efeito acaricida do acetato de citronelila contra T.

urticae resistente a acaricidas.

Figura 7. Estruturas químicas plana e espacial do acetato de citronelila.

Fonte: http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

Até o presente momento não existem publicações de outros grupos de pesquisa que

relacionem o acetato de citronelila com atividade antinociceptiva ou, mesmo, anti-inflamatória.

35

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

A dor constitui a principal causa de perda de trabalho, como também gera conseqüências

nocivas psicossociais e econômicas. Como consequência de tal processo, 50 a 60% dos que

sofrem qualquer tipo de dor ficam parcialmente ou totalmente incapacitados para exercer suas

atividades, de maneira transitória ou permanente, contribuindo negativamente para sua

qualidade de vida (SBED, 2005).

O manejo da dor é um aspecto essencial da medicina moderna e para a qualidade de

vida. No entanto as terapias atuais são frequentemente insuficientes devido a severos efeitos

indesejados ou eficácia limitada. Por essa razão, que o desenvolvimento de novas terapias para

o tratamento da dor é necessária, especialmente para tratar o grande número de pacientes que

não respondem aos analgésicos disponíveis (BRENNAN; CARR; COUSINS, 2005).

Então, tendo o conhecimento prévio que o acetato de citronelila possui algumas

atividades biológicas e que moléculas quimicamente semelhantes (citronelol e citronelal),

efeitos citados anteriormente, apresentaram uma boa atividade antinociceptiva em animais,

decidiu-se investigar a existência desse efeito com o acetato de citronelila em nossos

camundongos.

36

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Caracterizar o perfil do efeito e identificar possíveis mecanismos antinociceptivos do

CAT, em modelos de nocicepção aguda em camundongos.

3.2. Objetivos específicos

1) Mostrar o perfil do efeito antinociceptivo (início e duração do efeito) do CAT no modelo

animal de contorções abdominais induzidas por ácido acético;

2) Verificar o efeito antinociceptivo nos modelos da formalina, placa quente, hipernocicepção

inflamatória e sensibilidade mecânica em camundongos;

3) Pesquisar o envolvimento de receptores de potencial transitório (TRPV1, TRPM8 e TRP

A1), canais de potássio dependentes de ATP (K+ATP), Canais iônicos sensíveis a ácido

(ASIC), receptores de bradicinina, assim como, PKC e PKA, no efeito antinociceptivo do

CAT em modelos de nocicepção aguda;

4) Investigar o envolvimento dos sistemas serotonérgico, muscarínico, dopaminérgico, α-

adrenérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico e opióide no mecanismo de ação

antinociceptiva do CAT;

5) Avaliar os efeitos do CAT sobre a atividade motora e comportamental dos camundongos;

37

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss, machos

adultos, pesando entre 25-32 g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia e do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, mantidos em caixas de

propileno a 26 ± 2ºC, com ciclos claro/escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão (Purina

Chow) e água “ad libitum”. Os animais foram colocados em jejum de sólidos por 4 horas antes

da realização de cada experimento em que a via oral foi utilizada para a absorção do fármaco

(RIOS, et al., 2010; ROCHA, et al., 2011; MELO, et al., 2012).

4.2 Princípios éticos

Os experimentos foram realizados após a aprovação do projeto (Nº de protocolo:

31/2012, ANEXO A) pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal do

Ceará e foram realizadas em conformidade com as diretrizes atuais para o cuidado de animais

de laboratório e as normas éticas para investigações de dor experimental em animais

conscientes. (ZIMMERMANN, 1983)

4.3. Drogas e substâncias utilizadas

TABELA 1. Substâncias usadas no estudo.

Substância Origem Doses (mg/kg) Via

8-Br-cAMP Sigma-Aldrich® 10 nmol/pata i.pl.

Acetato de Citronelila Sigma-Aldrich® 25, 50, 75, 100,

200, 400, 2000 v.o.

38

Ácido acético Sigma-Aldrich® 0,6 % i.p.

Atropina Sigma-Aldrich® 1 i.p.

Bradicinina Sigma-Aldrich® 10 µg/pata i.pl.

Cânfora Sigma-Aldrich® 7,6 s.c.

Capsaicina Sigma-Aldrich® 2.2 μg/pata i.pl.

Capsazepina Sigma-Aldrich® 5 i.p.

Captopril Teuto® 5 i.p.

Carboximetilcelulose Vetec® 0,5 % (veículo) v.o.

Carragenina Sigma-Aldrich® 0,11 mg/kg i.pl.

Cinamaldeído Sigma-Aldrich® 10 nMol/pata i.pl.

Diazóxido Sigma-Aldrich® 3 i.p.

Formalina Vetec® 1 % i.pl.

Glibenclamida Sigma-Aldrich® 2 i.p.

Glutamato Sigma-Aldrich® 10 μMol/pata i.pl.

Haloperidol Sigma-Aldrich® 0.2 i.p.

Indometacina Sigma-Aldrich® 10 v.o.

L-arginina Sigma-Aldrich® 150 i.p.

L-NAME Sigma-Aldrich® 10 i.p.

Mentol Sigma-Aldrich® 1,2 μMol/pata i.pl.

MK-801 Sigma-Aldrich® 3 i.p.

Morfina Cristália® 7,5 e 5 i.p.

Naloxona Cristália® 1 i.p.

39

Nan-190 Sigma-Aldrich® 0.5 i.p.

Ondasentrona GlaxoSmithKline® 0,5 i.p.

pCPA Sigma-Aldrich® 4x100 i.p.

PMA Sigma-Aldrich® 500 pmol/pata i.pl.

Ritanserina Sigma-Aldrich® 1 i.p.

Tween 80 Sigma-Aldrich® 2 % (Veículo) v.o.

Vermelho de Rutênio Sigma-Aldrich® 3 i.p.

Ioimbina Sigma-Aldrich® 2,5 i.p.

4.4. Atividade antinociceptiva

4.4.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Os animais foram divididos em grupos de 8 animais cada, tratados com veículo (2%

Tween 80 em água destilada), Acetato de Citronelila (CAT - 25, 50, 75, 100 ou 200 mg/kg) ou

Indometacina (5 mg/kg), usada como droga analgésica padrão. Os tratamentos foram realizados

por via oral (v.o.). Após 60 minutos, os animais receberam uma injeção intraperitonial (i.p.) de

ácido acético 0,6% (10 mL/Kg). Decorridos 10 minutos da administração do ácido acético, o

número de contorções abdominais foi registrado durante 20 minutos, para cada animal. Uma

contorção foi identificada como uma extensão das patas traseiras, acompanhada de contração

do abdômen (KOSTER et al., 1959).

Foi realizado o curso de tempo do efeito antinociceptivo do CAT (200 mg/kg). Em

5 grupos de animais (n=8) foram induzidas contorções abdominais com ácido acético, conforme

descrito acima, após 30, 60, 120, 240 e 360 minutos da aplicação do CAT.

A curva dose x resposta foi construída com os dados acima e a DE50 estimada.

40

4.4.2. Teste da formalina

Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo), e tratados com

veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg; v.o.) ou

morfina (7,5 mg/kg; i.p.), que foi usada como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos em relação

a estes tratamentos, os animais receberam uma injeção intraplantar de formalina 1% na pata

direita traseira (20 µL). O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, durante

duas fases: a primeira 0-5 min (logo após a aplicação), dando um intervalo na observação, e 20-

25 min (2a Fase) após a administração da formalina (HUNSKAAR, HOLE, 1987).

4.4.3. Teste da placa quente

Esse teste foi realizada duas vezes, tendo como a temperatura da placa o diferencial,

esta variando entre 51 ± 0,5ºC ou 55 ± 0,5ºC. Os animais foram divididos em 8 grupos (8

animais por grupo), sendo pré-selecionados pela passagem individual na placa quente mantida

nas duas temperaturas, de modo isolada 4 grupos para cada temperatura. Aqueles que

mostrarem tempo de reação superior a 35 (51ºC) ou 30 (55ºC) segundos, respectivamente, não

serão utilizados no experimento. O tempo de reação será registrado antes (tempo 0) e 30, 60,

90 e 120 minutos após a administração de acetato de citronelila (100 e 200 mg/Kg, v.o.),

morfina (7,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o.) (EDDY &

LEIMBACH, 1953).

4.4.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey)

Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e pré-tratados com

veículo (2% Tween 80 em água destilada), CAT (100 ou 200 mg/kg) ou morfina (7,5 mg/kg;

i.p.). As respostas comportamentais para o estímulo mecânico foram realizadas com o auxílio

do filamento de vonFrey (diâmetro de 0,8 mm) e foi feita antes (tempo 0) e 30 e 60 minutos

após o pré-tratamento. Os camundongos foram colocados em uma caixa elevada com uma trama

41

de arame no assoalho. Os filamentos de von Frey foram aplicados embaixo da superfície plantar

da pata direita traseira (em triplicata com menos de 1 minuto de intervalo) em ordem ascendente

de estímulo de força até um valor máximo de 50 g (para evitar lesão na pata). No limiar, o

camundongo retira a pata do filamento (FERREIRA et al 1978a, 1978b; 1988; CUNHA et al.,

1992).

4.4.5 Hipernocicepção inflamatória

Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e pré-tratados com

veículo (2% Tween 80 em água destilada), CAT (100 ou 200 mg/kg) ou indometacina (10

mg/kg, v.o.). Os animais foram submetidos ao filamento de von Frey, conforme descrito acima.

Todos os grupos de animais receberam 20 µL de carragenina 0,1 mg/kg na pata a ser testada

logo após a leitura do tempo zero e o restante do experimento se deu conforme descrito acima.

Nesse protocolo foi utilizada a indometacina como droga padrão anti-inflamatória. Nesse caso

os resultados são apresentados em termos de Variação (Δ) da Intensidade da Hipernocicepção,

ou seja, foram calculados pela diferença dos valores das leituras nos tempos (30, 60 e 180

minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação do indutor da hipernocicepção -

carragenina) (CUNHA et al., 1992).

4.5. Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do CAT

4.5.1. α2-adrenérgico

O papel dos receptores α2-adrenérgicos sobre o possível efeito antinociceptivo do

CAT foi determinado pela administração de ioimbina (2,5 mg/kg; i.p.) 15 minutos antes dos

animais receberem CAT na dose que apresentou melhor efeito analgésico (200 mg/kg) ou

veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Outros dois grupos receberam clonidina (0,15

mg/kg, i.p.) e em um desses após 15 minutos recebeu ioimbina (2,5 mg/kg). Após 30 minutos

do último tratamento (CAT, ioimbina ou clonidina), os animais foram submetidos ao teste das

contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

42

4.5.2 Serotonégico

Os animais foram tratados durante 4 dias consecutivos com pCPA (4x100 mg/kg;

i.p.), afim de depletar as reservas de serotonina do animal. No 4º dia, 30 minutos após o

tratamento com pCPA, os animais receberam a dose de CAT que apresentou melhor efeito

analgésico (200mg/kg) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Após 30 minutos do

último tratamento, os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas

por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

4.5.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio

Após o experimento anterior os animais foram eutanasiados por deslocamento

cervical e em seguida injetados 1 mL de solução salina estéril no peritônio, feita uma leve

massagem e depois a coleta do 0,5 mL do lavado para a investigação da serotonina (5-HT) e o

ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) seu metabólito.

A análise da serotonina e seu metabólito no lavado peritoneal foi realizada através

da utilização de HPLC (High Performance Liquid Chromatograph) com detecção

eletroquímica. O equipamento consiste de um detector eletroquímico com eletrodo de carbono

vitreado, bomba e injetor. Para a análise de monoaminas, uma coluna Shimadzu CLC-ODS (M)

foi utilizada. A fase móvel foi preparada com ácido cítrico (0.163 M), em um pH 3.0 contendo

0.02 mM EDTA, com 0.69 mM de ácido octanesulfônico sódio (SOS), como parte de reagentes

iônicos, 4 % v/v acetonitrila e 1,7 % v/v tetrahidrofurano. 5-HT e 5-HIAA são eletronicamente

detectados usando um detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A; Shimadzu Corp., Japan)

por oxidação do eletrodo de vidro de carbono de 0,85 V relativo para um eletrodo de referências

Ag-AgCl. Os cromatogramas são registrados e quantificados por um integrador. A quantidade

do neurotransmissor e seu metabólito são calculados por comparação da altura dos picos com

a média dos padrões injetados anteriormente.

43

4.5.2.2 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3)

O papel dos receptores serotoninérgicos sobre o efeito antinociceptivo do acetato

de citronelila foi determinado pela administração de NAN-190, antagonista 5-HT1A, (1 mg/kg,

i.p.), Ritanserina, antagonista 5-HT2A/C, (1 mg/kg, i.p) e Ondansetrona, antagonista 5-HT3, (0,5

mg/kg, i.p.) 15 minutos antes dos animais receberem CAT na dose que apresentou melhor efeito

analgésico (200mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Após 30 minutos,

os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

como descrito anteriormente (HESS, 2006).

4.5.3. Colinérgico

Com o objetivo de evidenciar a participação do sistema colinérgico sobre a

atividade antinociceptiva do acetato de citronelila, os animais foram pré-tratados com o

antagonista colinérgico muscarínico não-seletivo atropina (1 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes da

administração do acetato de citronelila (200 mg/kg, v.o.). Após 30 minutos do tratamento, os

animais foram analisados no modelo de contorções induzidas por ácido acético como descrito

anteriormente (HESS, 2006).

4.5.4. Dopaminérgico

Para verificara participação dos receptores dopaminérgicos no efeito

antinociceptivo do acetato de citronelila, os camundongos foram pré-tratados com haloperidol

(0,2 mg/kg, i.p., antagonista não-seletivo dos receptores dopaminérgicos), e após 25 minutos,

receberam o acetato de citronelila (200 mg/kg) ou veículo. Após 30 minutos, os animais foram

analisados no modelo de contorções induzidas por ácido acético como descrito anteriormente

(HESS, 2006).

44

4.5.5 Opióide

Com o objetivo de avaliar a participação do sistema opióide sobre o efeito

antinociceptivo do acetato de citronelila, grupos distintos de animais foram pré-tratados com

naloxona (1 mg/kg, i.p., antagonista opióide não seletivo) 15 minutos antes da adiministração

do acetato de citronelila (200 mg/kg) ou morfina (5 mg/kg, i.p., agonista opióide). Após um

período de 30 minutos os animais foram analisados no modelo de contorções induzidas por

ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

4.5.7 Oxidonitrérgico

O papel do NO sobre o possível efeito antinociceptivo do CAT foi determinado pela

administração de L-NAME (10 mg/kg; i.p.) e L-arginina (150 mg/kg; i.p.). Os animais

receberam L-NAME 15 minutos antes de receber L-arginina e foram submetidos ao teste após

mais 15 minutos. Outro grupo de animais recebeu acetato de citronelila na dose que apresentou

melhor efeito analgésico e após 30 min receberam L-arginina (150 mg/kg; i.p.). Após 30

minutos do tratamento os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais

induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).

4.5.8 Glutamatérgico

Os animais foram tratados com acetato de citronelila nas doses de 100 e 200 mg/kg,

MK801 (3 mg/kg, i.p.) ou veículo (2 % de Tween 80 em água destilada). Após 30 ou 60 min,

os animais receberam por via intraplantar 20 µl de solução de glutamato (10 µmol/pata) -

preparada em solução salina com pH ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio - na pata

posterior direita. O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada,

considerado como resposta nociceptiva, foi cronometrado por um período de 15 min (BEIRITH

et al., 2002).

45

4.6. Canais e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT

4.6.1 Canais de potássio dependentes de ATP

O papel dos canais de potássio dependentes de ATP sobre o possível efeito

antinociceptivo do CAT foi determinado com a administração de glibenclamida (2 mg/kg, i.p.)

15 minutos antes dos animais receberem CAT (200 mg/kg, v.o.), diazóxido (3 mg/kg, i.p.) ou

veículo (2 % de Tween 80 em água destilada). Após 30 ou 15 minutos do tratamento, os animais

foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito

anteriormente.

4.6.2 TRPV1

Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e tratados com

veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou

vermelho de rutênio (3 mg/kg, i.p.), como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos, os animais

receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de capsaicina (2,2 μg/pata) na pata

direita traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e

considerado como um índice de nocicepção (SANTOS, CALIXTO, 1997).

4.6.3 TRPA1


veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 e 200 mg/kg) ou cânfora

(7,6 mg/kg, s.c.), essa como padrão positivo. Após 30 ou 60 minutos, os animais receberam

uma injeção intraplantar de 20 l da solução de cinamaldeído (10 nmol/pata) na pata direita

traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e considerado

como um índice de nocicepção (ANDRADE et al., 2008).

46

4.6.4 TRPM8


veículo (2 % Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 e 200 mg/kg) ou

vermelho de rutênio (3 mg/kg, i.p.), essa como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos, os animais

receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de mentol (1,2 μmol/pata) na pata

direita traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e

considerado como um índice de nocicepção (ANDRADE et al., 2008)

4.6.5 ASICs

Os animais foram tratados com CAT (100, 200 mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de

Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20 μl de

solução de salina ácida (ácido acético 2 %, pH 1,98) na pata posterior direita. O tempo que o

animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada, considerado como resposta

nociceptiva, foi mensurado por um período de 20 min (MEOTTI, et al., 2010).

4.6.6 PKC

Os animais foram tratados por via oral com CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo

(2% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar

20 μl de PMA (500 pmol/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a

pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado no período de 15-45

minutos (FERREIRA et al., 2005).

4.6.7 PKA

Os animais foram tratados com CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo (2 % de

Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20 μl de

47

8-Bromo-cAMP (10 nmol/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a

pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado por um período de 30

minutos (PAVIN et al., 2011).

4.6.8 Bradicinina

Os animais foram pré-tratados com captopril (5 mg/kg, i.p.), para diminuir a

degradação da bradicinina, e após 30 min receberam CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo

(2% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar

20 μl de Bradicinina (10 µg/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo

a pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado por um período 15

minutos (FERREIRA et al., 2004).

4.7 Avaliação da Atividade Locomotora

4.7.1 Teste do Rota rod

O teste do rota rod mede o efeito do relaxamento muscular ou incoordenação

motora produzidos por drogas nos animais (CARLINI, BURGOS, 1979). Para este teste, os

camundongos foram divididos em 3 grupos (8 animais por grupo), em que foram administrados

acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada)

e 60 minutos depois foram colocados com as quatro patas sobre uma barra de 2,5cm de

diâmetro, elevada a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm, por um período de 1 minuto.

Foi registrado o tempo de permanência na barra giratória, em segundos (s), e o número de

quedas, com três reconduções, no máximo (DUNHAM, MIYA, 1957).

4.7.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto)

Um campo aberto feito em acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x

48

15 cm) dividido em nove quadrantes iguais, foi usado para avaliar a atividade exploratória do

animal (Archer, 1973). Após cada período de tratamento da administração do acetato de

citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou veículo, cada animal foi colocado no centro do campo

e o parâmetro observado foi o número de cruzamentos com as quatro patas (movimentação

espontânea) registrados durante 5 minutos.

4.7 Análises estatísticas

Para os testes com mais de três grupos foi feita a análise estatística empregando o

teste de análise de variância (ANOVA). Para verificar se houve diferença significativa entre os

grupos, foi realizado o teste de comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls ou

Bonferroni. Para a análise dos testes com apenas dois grupos, foi utilizado o teste não

paramétrico de Mann-Whitney (t test). Foi realizada a regressão não-linear para a determinação

da DE50 na curva dose x resposta. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M

(variáveis com distribuição normal) ou mediana com máximo e mínimo, sendo as diferenças

consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

49

5 RESULTADOS

5.1 Atividade antinociceptiva

5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Apenas os grupos pré-tratados com doses mais elevadas do CAT (100 ou 200

mg/kg) ou indometacina exibiram uma significante diminuição do número de contorções

abdominais quando comparado com os animais tratados apenas com o veículo (Figura 8).

De acordo com a curva dose x resposta, uma DE50 estimada em 74,42 mg/kg (67,65

– 81,88 mg/kg, p<0,05) foi necessária para conseguir a resposta antinociceptiva no teste de

contorções induzidas por ácido acético, sendo esses resultados após 60 minutos da

administração do CAT. (Figura 8)

Na curva de tempo o CAT 200 mg/kg apresentou efeito antinociceptivo logo após

30 minutos da administração e esse efeito se manteve por até 4 horas após a aplicação. Não

sendo mais significativo após 6 horas da administração do CAT (Figura 8).

50

0

20

40

60

Linha controle47.88

30 60 120 240 360

Con

torç

ões

******

***

Tempo (min)

FIGURA 8. Efeito do CAT no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. A. Efeito antinociceptivo do CAT. B. Curva Log [dose] x resposta do CAT. C. Curva de tempo do efeito antinociceptivo do CAT 200mg/kg. Os valores representam a média ± E.P.M. ou Mediana com máximo e mínimo do número de contorções. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls ou Bonferroni, post hoc). Regressão não-linear foi utilizada para estimar a DE50 com intervalo de confiança de 95%.

Veículo 25 50 75 100 200 Indo0

10

20

30

40

CAT, mg/kg, p.o.

*Con

torç

ões

1.3 1.6 1.9 2.2 2.50

20

40

60

80

100

DE50=74,42 mg/kg (67.65 - 81.88)

log[dose]

Res

post

a an

tinoc

icep

tiva

(%)

A

B

C

51

5.1.2. Teste da formalina

Os pré-tratamentos com as duas doses de CAT (100 ou 200 mg/kg) foram capazes de

reduzir o tempo de lambedura da pata, comportamento sugestivo de nocicepção, durante ambas as fases

do teste, quando comparados com o grupo pré-tratado apenas com veículo. Similarmente, a morfina foi

efetiva em reduzir esse comportamento em ambas fases, também quando comparado com o veículo.

TABELA 2. Efeitos do CAT no modelo de lambedura da pata induzida por formalina.

*Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e

Student-Newman-Keuls, post hoc).

Grupos de Tratamentos Tempo de lambedura da pata

1ª Fase 2ª Fase

Veículo 62,50 ± 3,723 26,88 ± 4,933

CAT 100 44,63 ± 4,910 * 11,63 ± 2,976 *

CAT 200 44,38 ± 3,836 * 9,875 ± 2,083 *

Morfina 28,57 ± 1,152 * 1,0 ± 0,7237 *

52

5.1.3. Teste da placa quente

Quando o teste foi realizado à temperatura de 51ºC, apenas após o pré-tratamento com a dose

de 200 mg/kg o CAT mostrou efeito antinociceptivo significante nos tempos 30-90 minutos, quando

comparado com o grupo controle. Já quando o teste foi realizado à temperatura de 55ºC, ambas as doses

(100 ou 200 mg/kg) foram efetivas após 60 minutos da aplicação, mas apenas a dose maior foi efetiva,

também, após 90 minutos da administração do CAT (Figura 9).

0 30 60 90 12010

15

20

25

30

35

Veículo

CAT 100

CAT 200

Morfina 7,5

**** *

*** *** *** ***

51ºC

Tempo (min)

Tem

po d

e re

tirad

a (s

)

0 30 60 90 1205

10

15

20

25

30

CAT 100

CAT 200

Veículo

Morfina 7,5***

******

***

*

****

55ºC

Tempo (min)

Tem

po d

e re

tirad

a (s

)

FIGURA 9. Efeito do CAT no teste da placa quente. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de retirada. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

53

5.1.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção mecânica

No protocolo com hipernocicepção, o CAT mostrou efeito antihipernociceptivo logo após

30 minutos de aplicação com a dose de 200 mg/kg, e nos tempos seguintes, ambas as doses apresentaram

efeito. De forma semelhante, o grupo que recebeu indometacina apresentou efeito no intervalo 60-180

minutos após a aplicação (Figura 10, A).

No protocolo de sensibilidade mecânica, os grupos que receberam as duas doses testadas

do CAT apresentaram efeito antinociceptivo após 60 minutos da aplicação da droga. Efeito similar,

porém mais intenso, foi observado no grupo que recebeu morfina, que apresentou esse efeito nos tempos

30-60 minutos após a aplicação (Figura 10).

FIGURA 10. Efeito do CAT no teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção inflamatória. A. Mostra o efeito do CAT quando os animais foram hipersensibilizados com carragenina. B. Mostra o efeito do CAT sem a carragenina. Os pontos representam a média ± E.P.M. da variação da intensidade do estímulo (A) ou intensidade do estímulo (B). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

-5

0

5

10

15

Veículo

CAT 200

CAT 100

Indo

30 60 180

****

**

Tempo (min)

* **

Inte

nsid

ade

da h

iper

noci

cepç

ão(∆

lim

iar

de r

etira

da, g

)

0 30 603

4

5

6

7

8

9

10

Veículo

CAT 100CAT 200

a Morfina***

***

***

***

Tempo (min)

Est

ímul

o m

ecân

ico

(g)

A

B

54

5.2 Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila

5.2.1. α2-adrenérgico

O bloqueio dos receptores α2-adrenérgico após o pré-tratamento com ioimbina não alterou

o efeito antinociceptivo do CAT. De forma contrária a ioimbina diminuiu significativamente o efeito

antinociceptivo da clonidina (Figura 11).

FIGURA 11. Envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs clonidina (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo Veículo 200 2000

10

20

30

40

50

Ioim 2,5 mg/kg, p.o.

CAT, mg/kg, p.o. Clonidina 0,15 mg/kg, p.o.

Ioim 2,5 mg/kg, p.o.

a

b

a

Con

torç

ões

55

5.2.2. Serotonérgico

A diminuição da síntese de serotonina após as aplicações de pCPA não alterou

significativamente o padrão de contorções quando comparado com o grupo que não recebeu pCPA. Por

outro lado, o tratamento com pCPA foi capaz de reverter parcialmente o efeito antinociceptivo do CAT

(Figura 12).

Vehicle Vehicle 200 2000

10

20

30

40

pCPA, 4x100mg/kg, i.p.

CAT, mg/kg, p.o.

a

a,b

Con

torç

ões

FIGURA 12 Envolvimento do sistema serotonérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT + pCPA (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

56

5.2.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio

Os resultados foram extrapolados para lavado coletado. A análise do fluido peritoneal

mostrou que a administração de ácido acético aumentou as quantidades de serotonina quando comparado

com o grupo que não recebeu o ácido acético. O tratamento com pCPA reduziu o nível de serotonina e

nos animais tratados com pCPA que receberam CAT foi observado uma diminuição ainda maior na

quantidade de serotonina, quando comparado com os animais tratados com pCPA e veículo. O 5-HIAA

não foi detectado em nenhum dos grupos (Figura 13).

FIGURA 13. Quantificação de serotonina e seu metabólito no fluido peritoneal após modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. das quantidades em nmol/grama de tecido. ap<0,05 vs Veículo, bp<0,05 vs pCPA e cp<0,05 vs sadio (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc). Sadio é o grupo que não recebeu nenhum tratamento e Controle é o grupo que recebeu apenas o ácido acético e não recebeu pCPA nem CAT.

0

1

2

3

150

200

250

Ácido acético 0,6 %

pCPA

CAT 200 CAT 200

Serotonina 5-HIAA

Controle Controle

nmol

/mL

de la

vado

57

5.2.2.2. Receptores serotonérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3)

Os grupos que receberam ritanserina ou NAN-190 promoveram a reversão do efeito

antinociceptivo do CAT. Porém, esse efeito não foi visualizado no grupo que recebeu ondansentrona

(Figura 14).

FIGURA 14. Envolvimento dos receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2 e 5-HT3) no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

58

5.2.3. Colinérgico

O pré-tratamento dos animais com atropina foi capaz de reverter parcialmente o efeito

antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. A atropina sozinha

não foi capaz de alterar o padrão de contorções quando comparada com o grupo que recebeu apenas

veículo (Figura 15).


10

20

30

40

b

a

CAT, mg/kg, p.o.

Atropina, 1 mg/kg, i.p.

Con

torç

ões

FIGURA 15. Envolvimento do sistema colinérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

59

5.2.4. Dopaminérgico

O pré-tratamento dos animais com haloperidol foi capaz de reverter parcialmente o efeito

antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. O haloperidol

sozinho não foi capaz de alterar o padrão de contorções quando comparado com o grupo que recebeu

apenas veículo (Figura 16).


10

20

30

40

CAT, mg/kg, p.o.

Haloperidol, 0.2 mg/kg, i.p.

b

a

Con

torç

ões

FIGURA 16. Envolvimento do sistema dopaminérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

60

5.2.5. Opióide

O pré-tratamento dos animais com naloxona não foi capaz de alterar o efeito

antinociceptivo do CAT, quando comparado com o controle. A naloxona sozinha não interferiu no

padrão das contorções quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 17).

FIGURA 17. Envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

0

5

10

15

20

Veículo Naloxone 1mg/kg

CAT, 200 mg/kg

a aCon

torç

ões

61

5.2.6. Oxidonitrérgico

O pré-tratamento com L-arginina não mostrou diferença significativa na quantidade de

contorções, quando comparado com o veículo e, também, não alterou o efeito antinociceptivo do CAT.

Por outro lado, o pré-tratamento com L-arginina reverteu o efeito antinociceptivo do L-NAME. (Figura

18)

FIGURA 18. Envolvimento do sistema oxidonitrérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs L-NAME (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo 10 10 200 2000

10

20

30

40

50

CAT, mg/kg, p.o.

L-Arginina 150 mg/kg, i.p.

L-NAME,mg/kg, i.p.

aa

a

b

Con

torç

ões

62

5.2.7 Receptores glutamatérgicos

Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição do tempo de

lambedura após receberem glutamato na pata. O mesmo efeito foi observado em outro grupo de animais

quando estes receberam MK-801 e depois glutamato na pata. (Figura 19).

FIGURA 19. Envolvimento dos receptores glutamatérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por glutamato. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo 100 200 30

10

20

30

40

50

a

CAT., mg/kg, p.o.

Glutamato 10µmol/paw, i.pl.

a

a

MK 801,mg/kg,i.p.

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

63

5.3 Canais envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT

5.3.1 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP

O pré-tratamento com glibenclamida no grupo que recebeu CAT promoveu a reversão

parcial do efeito antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. O

mesmo efeito foi observado quando foi administrado glibenclamida no grupo que recebeu diazóxido,

quando comparado com o grupo que recebeu apenas diazóxido (Figura 20).

Veículo Diaz. Diaz.0

10

20

30

40

Glibenclamida, 2 mg/kg, i.p.

b

a

a

a,c

CAT, mg/kg, p.o.

Con

torç

ões

FIGURA 20. Envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo, bp<0,05 vs DIAZ e cp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc). Diaz = Diazóxido 3 mg/kg, i.p.

64

5.3.2 Receptores TRPV1

Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição dose dependente

do tempo de lambedura após receberem capsaicina na pata. O mesmo efeito foi observado em outro

grupo de animais quando estes receberam vermelho de rutênio e depois capsaicina na pata (Figura 21).

FIGURA 21. Envolvimento dos TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por capsaicina. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo 100 200 Verm Rut.0

15

30

45

60

Capsaicina 2.2 µg/pata, i.pl.

CAT, mg/kg, p.o.

a

a

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

65

5.3.3 Receptores TRPA1

Os grupos tratados com ambas as doses do CAT não mostraram alterações no tempo de

lambedura após receberem cinamaldeído na pata. De forma contrária, o grupo que recebeu cânfora antes

da cinamaldeído na pata mostrou diminuição significativa no tempo de lambedura da pata (Figura 22).

Veículo 100 200 Cânfora0

15

30

45

60

75

CAT, mg/kg, p.o.

Cinamaldeído, 10nmol/pata, i.pl.

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

FIGURA 22. Envolvimento dos TRPA1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por cinamaldeído. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

66

5.3.4 Receptores TRPM8

Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição do tempo de

lambedura após receberem mentol na pata. O mesmo efeito foi observado em outro grupo de animais

quando estes receberam vermelho de rutênio e depois mentol na pata (Figura 23)..

FIGURA 23. Envolvimento dos TRPM8 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por mentol. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo 100 200 Verm Rut.0

20

40

60

80

CAT, mg/kg, p.o.

Mentol, 1.2 µmol/pata, i.pl.

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

67

5.3.5 ASICs

Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição dose dependente

do tempo de lambedura após receberem a salina ácida na pata. O mesmo efeito foi observado quando

houve o bloqueio dos receptores TRPV1 (capsazepina), pois estes também podem ser ativados pela

salina ácida (Figura 24).

FIGURA 24. Envolvimento dos ASIC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por salina acidificada. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT + capsazepina (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo 100 200 2000

50

100

150

200

CAT, mg/kg, p.o.

Ácido acético 2%, pH 2.04, 20µL/pata

a

Capsazepina, 5mg/kg, i.p.

b

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

68

5.3.6 PKA

O grupo tratado com a dose de 200 mg/kg do CAT mostrou diminuição do tempo de

lambedura após receber PMA na pata em relação ao grupo que não recebeu CAT (Figura 25).

FIGURA 25. Envolvimento do PKC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por PMA. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo CAT 2000

5

10

15

20

25

PMA, 500 pmol/pata

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

69

5.3.7 PKC


lambedura após receber 8-Bromo-cAMP na pata em relação ao grupo que não recebeu CAT (Figura 26).

FIGURA 26. Envolvimento do PKA no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por 8-Bromo-cAMP. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo CAT 2000

5

10

15

20

25

8-Bromo-cAMP (10nmol/pata)

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

70

5.3.8 Bradicinina


lambedura após receber bradicinina na pata em relação ao grupo que recebeu apenas o veículo (Figura

27).

FIGURA 27. Envolvimento da bradicinina no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Vehicle CAT 2000

10

20

30

40

50

Bradicinina (10µg/pata)

a

Tem

po d

e La

mbe

dura

(s)

71

5.4 Avaliação da atividade locomotora

5.4.1 Teste do rota-rod

Nesse teste o tratamento com CAT não alterou o tempo de permanência na barra giratória

e nem o número de quedas desta, quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura

28).

veículo CAT 100 CAT 2000

20

40

60

80

Tem

po d

e P

erm

anên

cia

(s)

FIGURA 28. Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do rota rod. A. Tempo de permanência. B. Número de quedas. Os valores representam a média ± E.P.M. (ANOVA e Student-Newman-Keuls ou bonferroni, post hoc).

Veículo CAT 100 CAT 2000

1

2

3

4

Núm

ero

de q

ueda

s

A

B

72

5.4.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto)

Nesse teste o tratamento com CAT não alterou a atividade locomotora, verificada através

do número de cruzamentos, quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 29).

FIGURA 29. Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do campo aberto. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de cruzamentos. (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).

Veículo CAT 100 CAT 2000

10

20

30

40

50

Núm

ero

de tr

aves

sias

73

6 DISCUSSÃO

O alívio da dor é um direito humano básico, não sendo apenas uma questão clínica,

mas também algo ético que envolve todos os profissionais de saúde (COUSINS, 2000). Uma

série de avanços foram alcançados no que se refere ao controle da dor, porém apesar do

desenvolvimento de numerosos medicamentos analgésicos, muitos pacientes medicados ainda

vivenciam episódios de dores severas (YATES et al., 1998). Dessa forma, estudos com objetivo

de apresentar novas moléculas com potencial analgésico são fundamentais no incremento de

novos recursos terapêuticos que auxiliem no manejo desta enfermidade.

Diante disto e levando em consideração que vários efeitos biológicos são atribuídos

ao CAT como fungicida, larvicida, bactericida, acaricida, repelente/inseticida e antitumoral,

este trabalho foi desenvolvido com objetivo de caracterizar o perfil do efeito e identificar

possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em

camundongos, ou seja, modelos em que uma única aplicação do estímulo é capaz de

desenvolver um comportamento nociceptivo.

Até o que se sabe este presente trabalho mostra pela primeira vez a relação do CAT

com efeito antinociceptivo.

A princípio, quando se trabalha com modelos comportamentais, a observação dos

efeitos da molécula em estudo no organismo do animal é importante para a interpretação e

aceitação dos resultados posteriores. Nesse contexto, foi relatado que várias drogas analgésicas

com ação depressora sobre o sistema nervoso central e muscular podem reduzir a coordenação

motora em animais bem como a expressão de comportamentos nociceptivos (SOJA et al.,

2002). Logo, sabendo disso, foram realizados ensaios comportamentais pré-tratando os animais

74

com o CAT e nenhuma alteração de atividade locomotora, coordenação motora e/ou força

muscular foi observada. Com isso, nos resultados discutidos a seguir, provavelmente os efeitos

observados foram exclusivamente do CAT atuando em seus sítios de ação.

No estudo da atividade antinociceptiva do CAT, o primeiro teste realizado foi a

indução de contorções abdominais por ácido acético. Este é um modelo amplamente utilizado

e aceito como modelo de nocicepção visceral e também muito empregado na pesquisa de novas

moléculas antinociceptivas, principalmente de origem natural. O mecanismo da gênese dessas

contorções envolve a liberação de diversos mediadores, como, por exemplo, as prostaglandinas

E2 e F2 (BERKENKOPF, WEICHMAN, 1988) histamina, bradicinina, serotonina (GUO et al.,

2008) e interleucinas 1β e 8 (RIBEIRO et al., 2000). Além disso, a nocicepção promovida pelo

ácido acético também pode ser mediada pela dissociação dos prótons presentes no ácido acético,

que estimulam os canais TRPV1 e ASIC localizados nos neurônios aferentes primários

(RIBEIRO et al., 2000). Algumas substâncias, como por exemplo, drogas anti-inflamatórias

não esteroidais, narcóticos, agonistas simpaticomiméticos como a clonidina e produtos naturais

são capazes, via diferentes mecanismos, de inibir as contorções induzidas pelo ácido acético

(ROCHA et al., 2011).

Os benefícios da utilização do modelo de contorções abdominais induzidas pelo

ácido acético se devem pelo fato deste envolver diferentes vias de mediação assim como

condições dolorosas inflamatórias clinicamente importantes similares às encontradas na

osteoartrite, artrite reumatoide ou mucosite induzida por quimioterápico (RAAP et al., 2000,

LOGAN et al., 2009; SOARES et al., 2011). Diante disto, o bloqueio de um dos mediadores

envolvidos nas patologias supracitadas por uma determinada substância, por exemplo, interfere

também no teste de contorções abdominais, diminuindo em alguma extensão o número de

contorções, podendo, assim, ser detectado um possível efeito. Desse ponto de vista, o teste de

75

contorções constitui-se em um teste sensível e, apesar da sua primeira descrição ter sido feita

em 1968 (COLLIER, 1968), até os dias atuais é bastante utilizado em estudos de nocicepção e

faz-se referências desse método em revistas de alta qualidade na área (ROCHA et al., 2013).

Os primeiros resultados desse trabalho mostraram que o CAT, nas maiores doses

testadas (100 ou 200 mg/kg), reduziu o número de contorções abdominais induzidas por ácido

acético, com uma DE50 de 74,4 mg/kg. Esse fato nos levou a acreditar no potencial efeito

antinociceptivo desta molécula.

Na ocasião acima, o efeito em ambas as doses foi similar ao encontrado para o

grupo pré-tratado com indometacina, anti-inflamatórios não-esteroidais que foi amplamente

utilizado para fins analgésicos de diversas origens, mas que hoje está entrando em desuso

devido a seus fortes efeitos adversos. Quando o CAT foi testado novamente, mas agora só na

dose de 200 mg/kg, o efeito antinociceptivo foi observado logo após 30 minutos da

administração e se manteve por até 240 minutos.

A fim de aumentar o conhecimento sobre a ação antinociceptiva do CAT, foi

realizado o ensaio de nocicepção induzida pela aplicação intraplantar de formalina. O teste da

formalina é constituído por duas fases distintas. A nocicepção neurogênica (fase inicial) resulta

do efeito irritante direto sobre os nociceptores ativando as fibras aferentes primárias,

acarretando na liberação de neuropeptídeos, como SP e CGRP, em terminais periféricos e

centrais. Por fim, a nocicepção inflamatória (fase tardia) que é mediada pela combinação de

estímulos periféricos e sensibilização da medula espinhal (HUNSKAAR, HOLE, 1987). Vários

trabalhos têm demonstrado que a injeção de formalina libera diferentes mediadores, como

PGE2, NO, glutamato, cininas, entre outros peptídeos, sendo que foi relatado que a formalina

também ativa os canais TRPA1 (HUNSKAAR, HOLE, 1987; SANTOS, CALIXTO, 1997;

MCNAMARA et al., 2007). Também há trabalhos que correlacionam o efeito de inibidores

76

inespecíficos de PKC com a atenuação da nocicepção na fase tardia deste teste (YASHPAL et

al., 1995). Os resultados mostraram que o CAT foi capaz de promover a redução do tempo de

lambedura da pata, parâmetro utilizado como sinal de dor, nas duas doses testadas (100 ou 200

mg/kg) em ambas as fases, sem distinção de diferença de potência de efeito entre os

tratamentos. De forma similar a morfina testada, também, foi capaz de promover esse efeito.

Esses dados aumentam os indícios de que o CAT possui uma ação antinociceptiva. A

modulação de terminais periféricos ou centrais, assim como, a liberação de mediadores

inflamatórios podem estar envolvidos nessa atividade.

Seguindo na investigação do efeito antinociceptivo do CAT, a nocicepção térmica

foi avaliada utilizando-se o teste da placa quente. Historicamente, o teste da placa quente é

descrito como ‘selecionador’ para drogas analgésicas, ou candidatas a analgésicas, de ação

central, tanto em nível espinhal como supra-espinhal. Assim, morfina, codeína, dentre outras

como a dexmedetomidina e citalopram são efetivas nesse teste (GUNELI et al., 2007;

PRAVETONI et al., 2012). Um estímulo térmico ativa os nociceptores que transmitem a

informação nociceptiva aguda a regiões específicas do SNC, produzindo uma resposta

nociceptiva organizada (HESS, 2006; HESS et al., 2010). Nesse teste, o CAT foi capaz de

promover com que animal suportasse por mais tempo o estímulo térmico nóxico. Considerando

que o CAT diminuiu o comportamento sugestivo de dor na primeira fase do teste da formalina

e que nesta fase o envolvimento de estruturas centrais é importante, os resultados do teste da

placa quente nos levam a acreditar no envolvimento central no mecanismo antinociceptivo do

CAT. Esse efeito central pode estar relacionado com a modulação de alguma via de

neurotransmissão.

Os nociceptores também podem ser ativados por estímulos mecânicos resultantes

de pressão direta, deformação do tecido ou mudanças na osmolaridade, possibilitando a

77

detecção do toque, pressão profunda, distensão de órgão visceral, destruição de ossos ou

inchaço.

A pele sem pêlos possui várias classes de receptores somestésicos especializados,

que transduzem informações do meio ambiente mesmo sem termos consciência da maioria

destas. Eles estão ligados a fibras nervosas mielinizadas de grande calibre que são dendritos de

neurônios situados nos gânglios somestésicos, com diferentes sensibilidades a estímulos

mecânicos (MENESCAL DE OLIVEIRA, 2008).

Como os receptores somestésicos são diversos em sua forma de estimulação, é de

se esperar que os mecanismos de transdução sejam igualmente diversos. Os canais iônicos da

família TRP estão envolvidos em uma série de mecanismos celulares de transdução, incluindo

a somestesia. Eles podem funcionar diretamente como a molécula transdutora, sobre a qual o

estímulo sensorial incide, ou podem atuar em um dos passos da transdução, como a molécula

efetora. Por outro lado, pouco se conhece sobre a diversidade e a identidade das moléculas que

realizam a mecanotransdução nos receptores somestésicos (MENESCAL DE OLIVEIRA,

2008).

A modulação genética de organismos como vermes e moscas tem incrementado o

conhecimento da transdução mecanosensorial em mamíferos. Um canal iônico da família da

degenerina (MDEG/ENaC), alternativamente do canal iônico sensível a ácido 2 – ASIC2, tem

chamado particular interesse no campo da dor, pois seu RNA mensageiro é expresso no

neurônio sensorial primário. Respostas de fibras sensoriais primárias de camundongos

deficientes de ASIC2 para uma faixa de estímulos mecânicos identificaram uma classe

específica de mecanorreceptores que mostrou redução da sensitividade do movimento do

cabelo. Outro tipo de aferente, incluindo fibras C, mostraram respostas normais nesses

camundongos mutantes, indicando que o ASIC2 está envolvido em alguns aspectos da sensação

78

inócua (toque), mas não na detecção de estímulos mecânicos nóxicos (MENESCAL DE

OLIVEIRA, 2008).

No teste de mecanocepção, no qual foi utilizado um transdutor de pressão,

conhecido com teste de von Frey, o CAT foi capaz de aumentar o limiar de mecanocepção dos

animais, ou seja, foi preciso uma pressão maior para os animais tratados com CAT retirarem a

pata do filamento. Esse efeito foi similar ao observado nos animais que receberam morfina,

porém com menor intensidade. Com esses dados podemos sugerir que a participação dos

receptores TRP ou ASIC, ou a transmissão da mensagem mecanosensitiva no mecanismo de

ação antinociceptiva do CAT.

A suposição de que o CAT é uma substância analgésica com ação sobre a

nocicepção de origem inflamatória tornou-se mais clara quando foi realizado o teste de

hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina, que, quando comparado ao teste de

nocicepção induzida por agentes químicos, apresenta uma importante vantagem, pois permite

uma dissociação entre a sensibilização dos nociceptores (pela injeção de um flogógeno ou de

um mediador inflamatório específico, como uma citocina) induzida por um estímulo químico

(LE BARS et al., 2001).

O evento inflamatório subseqüente à aplicação intraplantar de carragenina tem pico

edematogênico máximo ao redor de 3h, e parece ser mais bem caracterizado em três fases de

acordo com Di Rosa et al., (1971), onde a primeira fase seria mediada principalmente pela

liberação local de histamina e serotonina (1 - 90 minutos após a aplicação de carragenina). A

segunda estaria relacionada à liberação de bradicinina, que parece não apenas ativar

nociceptores e induzir respostas nociceptivas. Ferreira et al., (1993) sugeriram que a bradicinina

é o mediador inicial pró-nociceptivo que leva a liberação de TNF-α e então IL-1β, IL-6, IL-8,

o que pode levar à produção/liberação de prostanóides ou aminas simpatomiméticas. Esta

79

última ação configura como a terceira fase deste teste (2,5 – 6 horas após a aplicação de

carragenina) estaria relacionada às ações das prostaglandinas. Além desses mediadores, existe

importante participação de substância P, óxido nítrico, infiltração de neutrófilos e produção de

radicais livres como hidroxil e superóxido, estando todos ligados à formação de edema pela

carragenina (DAWSON et al., 1991; GILLIGAN et al., 1994; SALVEMINI et al., 1996).

Dessa forma, a aplicação intraplantar de carragenina é o agente central utilizado em

modelo de inflamação e nocicepção empregado em “screening” de moléculas com ação anti-

inflamatória e analgésica (CUNHA et al., 2005). Empregamos, então, a carragenina como

agente indutor de hiperalgesia inflamatória para testar o tratamento dos animais com o CAT, e

nossos resultados mostraram que ambas as doses inibiram a hipernocicepção induzida por

carragenina. Esse efeito anti-hiperalgésico pode ocorrer devido ao bloqueio da produção de

citocinas e corrobora com os resultados do teste de contorções induzidas por ácido acético,

reforçando uma ação antinociceptiva periférica.

Diante dos resultados mostrados, podemos sugerir que o CAT proporciona

atividade antinociceptiva em camundongos. Sabendo disso, prosseguimos a investigação

pelo(s) possível(is) mecanismo(s) envolvido(s) nesse efeito. Inicialmente foi avaliado como o

CAT atua perifericamente.

A ação antinociceptiva ou antihipernociceptiva pode ocorrer em diversos pontos da

cascata de produção/liberação dos mediadores pró-inflamatórios ou ainda sobre receptores de

mediadores plasmáticos ou neurotransmissores, como é o caso do glutamato (principal

neurotransmissor excitatório envolvido na transmissão do sinal nociceptivo) (BEIRITH et al.,

2002). O glutamato induz uma resposta nociceptiva através da sua atuação em receptores

glutamatérgicos que estão presentes em sítios de ação periférica, espinhal e supra-espinhal

(BEIRITH et al., 2002).

80

Diversos estudos de moléculas com ação antinociceptiva, tanto central como

periférica, sugerem o envolvimento dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos ou

metabotrópicos como mecanismo antinociceptivo (BATISTA et al., 2008; FREITAS et al.,

2009; MELO et al., 2012), indicando a participação de vários receptores glutamatérgicos no

processo nociceptivo. O estudo de Fisher e Coderre (1996) sugere uma interação dos receptores

metabotrópicos com os NMDA na nocicepção induzida pela formalina. A injeção intraplantar

de glutamato libera aminoácidos excitatórios, PGE2, NO, cininas, prótons, glutamato e SP no

corno dorsal (MILLAN, 1999; BEIRITH et al.,2002; SAKURADA et al., 2003).

Nossos resultados demonstram que o CAT é capaz de reduzir o comportamento

sugestivo de dor provocado pela aplicação intraplantar de glutamato. Esse mesmo efeito, mas

de forma mais acentuada, foi encontrado quando outro grupo de animais foi tratado com MK-

801, antagonista de receptores NMDA.

Tomando esses resultados com as observações de Zanh e Breenan (1998) e Zanh et

al., (1998), que demonstraram que a administração de antagonistas NMDA é capaz de bloquear

a hiperalgesia induzida por carragenina, e que não é observado com o bloqueio dos receptores

AMPA/cainato. Podemos sugerir que o CAT atue em algum nível da resposta desencadeada

pela ativação do receptor NMDA. Na verdade, os receptores NMDA estão envolvidos em

respostas sinápticas relativamente lentas, enquanto que os receptores AMPA/cainato

contribuem substancialmente para a neurotransmissão e o processamento medular

somatossensorial de estímulos cutâneos inócuos e nocivos (KING & LOPEZ-GARCIA, 1993;

RUSCHEWEYH & SANDKÜHLER, 2002).

Os membros da família dos canais iônicos TRP são moléculas fundamentais na

detecção de estímulos nóxicos, e são capazes de transduzir respostas a estímulos mecânicos e

químicos (STUCKY et al., 2009). Estes receptores estão localizados heterogeneamente em uma

81

população de fibras aferentes primárias de pequeno calibre, e em terminais de fibras aferentes

que se projetam para as lâminas superficiais do corno dorsal, principalmente I e II (CATERINA

et al., 1997; FEIN 2011).

Vários estudos têm estabelecido a importância dos receptores TRPV1 sobre a

hipernocicepção térmica (CATERINA et al., 2000; AMAYA et al., 2004), incluindo a ação de

antagonistas desses receptores em fortalecer a antinocicepção induzida por morfina no teste da

placa quente (NGUYEN et al., 2010). Durante muito tempo se pensou que os H+ eram ligantes

endógenos dos TRPV1. Entretanto, parece que o estímulo específico para esses receptores são

temperaturas maiores de 43ºC. Notavelmente, a resposta de TRPV1 à temperatura ou à

capsaicina (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida - ingrediente ativo da pimenta e ativador mais

conhecido desses receptores) é facilitada pelos H+, mas não ativada por eles (PREMKUMAR,

2001). O aumento da concentração de íons H+, também, ativa canais catiônicos (permeáveis a

Na+, K+ e Ca++) que induzem despolarização prolongada na membrana celular. As principais

fontes de H+ são os exsudatos, os leucócitos, o músculo isquêmico, os hematomas e o tecido

que rodeia os tumores.

Estudos tem mostrado que a ativação dos TRPV1, pela capsaicina, no neurônio

sensitivo primário leva ao influxo de cálcio e sódio. Por sua vez, esses aferentes ativados

liberam glutamato, substância P, neurocinina A, peptídio relacionado ao gene da calcitonina,

óxido nítrico e mediadores pró-inflamatórios nos nervos periféricos e que esta informação

nociceptiva é transmitida para o corno dorsal da medula espinhal (SORKIN et al., 1992;

SAKURADA et al., 1996; SANTOS, CALIXTO, 1997; SZALLASI, BLUMBERG, 1999). A

ativação do TRPV1 pode ser potencializada por agentes pró-inflamatórios (activina, ATP,

bradicinina, glutamato, histamina, PAR2, serotonina, tripsina) ou fatores tróficos (fator de

82

crescimento de nervos, fator neurotrófico derivado de células da glia) (PREMKUMAR,

ABOOJ, 2012).

Nosso trabalho mostra que o pré-tretamento com CAT em ambas as doses diminuiu

o comportamento sugestivo de dor após a aplicação da capsaicina. Esse resultado nos oferece

uma suspeita do possível envolvimento do TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT, embora,

apenas este teste, não seja suficiente para confirmar esse efeito.

Su et al., (2011), relataram que a ativação dos TRPM8 pode provocar uma

hipersensibilidade aos estímulos frios pois exibe um limiar de ativação na faixa de 22 a 27 °C

(PEIER et al, 2002; MCKEMY et al., 2005), corroborando com os achados de Proudfoot, et al.,

(2006), de que o mentol, um agonista desses receptores, pode apresentar propriedades pró-

nociceptivas quando administrado em altas doses.

O TRPM8 é ativado por várias substancias sintéticas responsáveis por sensações de

frio moderado ou “frescor”, como por exemplo icilina e eucaliptol (PEIER et al., 2002;

BEHRENDT et al., 2004; MCKEMY et al., 2005), e parece ser inibida pelo ácido, etanol e

ativação de PKC (BEHRENDT et al., 2004; WEIL et al., 2005; PREMKUMAR et al., 2005).

Esse canal é fundamental na analgesia experimentada por pequenas doses de compostos

refrescantes (PROUDFOOT et al., 2006; DHAKA et al., 2007).

Outro receptor responsável pela detecção de estímulos de frio é o TRPA1. Na

alodínia fria e hiperalgesia mecânica têm sido demonstrado seu envolvimento usando modelos

comportamentais (BAUTISTA et al., 2007). No entanto, seu papel no frio nóxico e sensações

mecânicas ainda é controverso (PREMKUMAR, ABOOJ, 2013). Um estudo mostrou que a

formalina age no neurônio sensorial primário através de ativação específica e direta dos TRPA1,

que são altamente expressos no nociceptor em um subconjunto de fibras C positivas para

TRPV1 (MCNAMARA et al. 2005). Em nossa pesquisa, encontramos que o TRPA1 não exerce

83

um papel importante no mecanismo antinociceptivo do CAT. Isso indica que embora o CAT

tenha efeito antinociceptivo no teste da formalina, esse efeito não está relacionado com TRPA1,

mas sim com outras moléculas disparadas na cascata da formalina, como PGE2, NO, glutamato

ou cininas.

Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que o tratamento oral com CAT

em ambas as doses foi capaz de reduzir a ação nociceptiva provocada pela aplicação de mentol

nas patas dos animais, porém não de cinamaldeído – agonista dos receptores TRPA1. Dessa

forma, a droga em estudo apresenta uma atividade antinociceptiva relacionada aos receptores

TRPM8, mas não aos TRPA1.

Alguns estudos tem demonstrado que a expressão de ASIC é aumentada por

mediadores pró-inflamatórios (MAMET et al., 2002; DEVAL et al., 2010). Eles são ativados

por prótons extracelulares e modulados pelo PKC (BARON et al., 2002). Em nível periférico,

ASIC3 é importante na dor inflamatória. Sua expressão e atividade é potencializada por

diversos mediadores presentes na “sopa inflamatória” (DEVAL et al., 2010). Algumas

evidências sugerem que ASIC e TRPV1 têm papeis complementares na detecção de prótons no

neurônio sensitivo (BAGGIO et al., 2012). Nesse teste, foi feito o bloqueio do TRPV1 com a

capsazepina para se excluir os efeitos dos H+ nesse receptor e mostrar de forma mais clara o

efeito antinociceptivo do CAT (melhor dose) frente a um estímulo nóxico ácido. Dessa forma,

os resultados mostram que o CAT reduz o comportamento sugestivo de dor quando o único

estímulo doloroso era a ativação dos ASIC por íons H+.

TRPV1 e TRPM8 são modulados por PIP2, mas de maneiras opostas. A depleção

de PIP2 causada pela ativação de PLC diminui a atividade do TRPM8 (BENEDIKT et al.,

2007), enquanto que o aumento de PIP2 bloqueia TRPV1, aumentando a atividade do TRPM8

(CHUANG et al., 2001). Quando comparados aos receptores TRPA1, os TRPM8 apresentam

84

uma temperatura de ativação significativamente maior, resposta mais rápida ao frio e menor

sensibilidade, em geral, à capsaicina (KARASHIMA et al., 2009). Tem sido mostrado que o

TRPM8 é expresso no conjunto de fibras C e Aδ negativas para o TRPV1, enquanto que o

TRPA1 é expresso em fibras C positivas para o TRPV1 de camundongos e gânglio da raiz

dorsal (GRD) de ratos (STORY et al., 2003; KOBAYASHI et al., 2005). Alguns estudos

demonstraram que uma proporção apreciável dos neurônios sensoriais do GRD que expressam

canais ASIC e todos aqueles que expressam TRPM8 não expressam canais TRPV1 (e também

TRPA1) (MAMET et al., 2002). Logo, o CAT deve estar interferindo em processos

intracelulares, ou mesmo diretamente no canal, após ativação dos receptores em fibras positivas

para TRPV1, TRPM8 ou ASIC.

A ativação de PKC por ésteres de forbol é capaz de despolarizar e sensibilizar

profundamente a resposta mediada por calor no neurônio sensorial (DRAY et al., 1988 e 1992),

que pode ser mimetizada por bradicinina ou atenuada por inibidores de PKC (PREMKUMAR

et al., 2005; PREMKUMAR, ABBOOJ, 2013). O limiar de temperatura para ativação do

TRPV1 é reduzido para a temperatura corporal quando o receptor está em estado fosforilado

(SIKAND, PREMKUMAR, 2007). O PKC exerce um papel importante na patologia da dor

somática, suas fosforilações não apenas sensibilizam o TRPV1, mas, também, promove a

translocação do citosol para a membrana plasmática (MORENILLA-PALAO et al., 2004; VAN

BUREN et al., 2005).

A ativação de PKC tanto potencia como prolonga a resposta mediada por TRPV1

quando comparada com a ativação por PKA, que apenas potencia a resposta transientemente.

No entanto, a estimulação de PKC resulta em infraregulação do TRPM8 (PREMKUMAR et

al., 2005). Há muitas evidências de que o AMPc e PKA sensibilizam o TRP, indicando que os

AINES aliviam a dor bloqueando a COX e reduzindo a produção de prostaglandinas com

85

consequente redução de AMPc e com isso reduzindo a ativação de TRP (PREMKUMAR,

ABOOJ, 2013). Com isso PKC, PKA e outras kinases podem modular os canais TRP.

No presente trabalho, observou-se que o CAT efetivamente diminuiu a resposta

nociceptiva da injeção intraplantar de PMA ou 8-bromo-cAMP. Dadas evidências da

implicação do PKC e PKA na sinalização do mecanismo que leva a nocicepção e hiperalgesia

(SOUZA et al., 2002), e como no trabalho de Baggio et al., (2012) com os mesmos métodos

concluiram sugerindo o envolvimento do PKC e PKA no efeito antinocieptivo da molécula

estudada, nós hipotetizamos que esses poderiam constituir os principais alvos da ação

antinociceptiva do CAT. Como essas cinases são moléculas sinalizadoras/efetoras de vários

mecanismos diferentes, a amplitude dos mecanismos observados referentes ao CAT, pode ser

devido ao envolvimento desses mediadores intracelulares.

Durante a inflamação, PG são liberadas dentro da corrente sanguínea e aumentam

os níveis intracelulares de AMPc no neurônio sensorial (HINGTGEN et al., 1995). Esse efeito

pode ser mimetizado pela adição de análogos de AMPc permeáveis a membrana (TODOROKI

et al., 1995). DAINEs e opióides diminuem o nível de AMPc. Há evidências substanciais que

a presença de AMPc e PKA sensibilizam os canais TRP, sugerindo que esses analgésicos

trabalhem reduzirem a sensibilização de TRP. DAINEs aliviam a dor por bloquearem a

cicloxigenase e reduzindo a produção de prostaglandinas. PGE2 e Forskolin aumentam o fluxo

causado pela capsaicina (LOPSHIRE, NICOL, 1998; VOILLEY et al., 2001)

A injeção subcutânea de NO em humanos induz sensação dolorosa (Ignarro, 2002),

devido à alta concentração local do gás. Experimentos em animais tem sugerido que a geração

de NO e subsequente aumento dos níveis de GMPc estão envolvidos no mecanismo de

nocicepção periférica, particularmente em tecidos inflamados (TORIYABE et al., 2004). Um

estudo realizado por Kawabata et al. (1994) demonstrou que a L-arginina, substrato da enzima

86

óxido nítrico sintase (NOS), aumenta significativamente o comportamento nociceptivo

induzido pela formalina, sugerindo que o NO possui uma atividade pró-nociceptiva, visto que

o mesmo é o produto final da interação entre L-arginina e a enzima NOS. Outros autores

provaram que a ação de inibidores da NOS é capaz de produzir um comportamento

antinociceptivo em modelos animais, corroborando com a hipótese de que o NO desempenha

um papel na nocicepção (MOORE et al., 1991; 1993).

É bem estabelecido que o aumento na produção de NO leva a um aumento na

síntese/liberação de vários mediadores pró-inflamatórios que resulta na promoção da reação

inflamatória e desenvolvimento de nocicepção, bem como hiperalgesia (RIVOT et al., 2002;

JESSE et al., 2009).

Assim, a administração de um precursor metabólico do NO, L-arginina, nos foi útil

para avaliar o envolvimento desta via no mecanismo antinociceptivo do CAT. Com o bloqueio

da NOS pelo L-NAME foi possível observar o efeito antinocieptivo, e a reversão desse efeito

quando a L-Arginina foi administrada primeiro. Esse efeito não foi observado quando foram

feitos os tratamentos com o CAT. Nossos resultados não sugerem que o CAT atue na síntese

de NO, pois nenhuma alteração no padrão de comportamento sugestivo de dor, no caso as

contorções induzidas por ácido acético, foi observada após os tratamentos (L-arginina + CAT).

Os canais de potássio ATP-dependentes estão distribuídos em uma variedade de

tipos de tecidos e células, onde acoplam alterações metabólicas intracelulares com a atividade

elétrica da membrana plasmática, desempenhando assim um papel importante tanto nas células

normais quanto em processos patológicos (AGUILAR-BRYAN et al, 1998). Estudos

demonstraram que o efeito de alguns receptores, como os α2-adrenérgicos, μ e δ opióides e os

receptores 5-HT1A,está envolvido com os canais de potássio ATP-dependentes, e que a abertura

desses canais está relacionada com o efeito antinociceptivo dos agonistas daqueles receptores

87

(OCAÑA, BAEYENS, 1993; ROBLES et al., 1996; GALEOTTI et al., 1999; RODRIGUES,

DUARTE, 2000).

Destaca-se, ainda, a relação entre os canais de potássio ATP-dependentes e a via do

óxido nítrico, como proposto por Soares et al. (2000). Segundo esses autores, a liberação do

óxido nítrico pode promover a abertura dos canais de potássio no terminal nociceptivo,

induzindo a hiperpolarização da membrana celular, que resulta na diminuição da excitabilidade

celular, dessa forma, promovendo analgesia (LAZARO-IBANEZ et al., 2001; ORTIZ, et al.,

2006).

Então, seguiu-se a investigação pré-tratando os animais com glibenclamida, um

bloqueador de K+ATP. Esse pré-tratamento parcialmente reverteu o efeito antinociceptivo do

CAT no teste das contorções induzidas por ácido acético, sugerindo o possível envolvimento

desses canais no mecanismo antinociceptivo do CAT.

88

FIGURA 30. Ilustração mostrando os possíveis canais e receptores, com alguns de seus segundos mensageiros, envolvidos, e discutidos até o momento, no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila. DAG: Diacilglicerol; IP3: Trifosfato d e inositol; PLC: Fosfolipase C; cGMP: guanosil monofosfato cíclico; sGC: guanilciclase solúvel; cAMP: adenosina monofosfato cíclica; ATP: adenosina trifosfato

Outra parte do nosso estudo foi avaliar o possível envolvimento de algumas vias de

neurotransmissão no mecanismo antinociceptivo do CAT. Várias moléculas induzem

antinocicepção por interferirem com vias neuronais na recepção ou transmissão da informação

nociceptiva da periferia para SNC (FURST, 1999). Como o CAT mostrou bons resultados na

primeira fase do teste da formalina e no teste da placa quente, assim como, no teste da

nocicepção mecânica, nós avaliamos a possibilidade do envolvimento de vias de

neurotransmissão no seu mecanismo antinociceptivo. Levando em consideração que possam

89

haver componentes antinociceptivos centrais nesse mecanismo, além dos periféricos já

discutidos.

Embora a serotonina (5-HT) seja conhecida por desempenhar um papel importante

na nocicepção, existe apenas uma avaliação limitada dos subtipos do receptor da 5-HT

envolvidos no processo e que ainda interagem entre si e com outros mediadores químicos da

nocicepção. Segundo Millan (1999), a 5-HT pode exercer tanto ações anti- quanto pró-

nociceptiva, dependendo do tipo de receptor ativado.

No SNC a 5-HT está associada com o processamento e a modulação da dor. Sua

ação analgésica se dá quando liberada no corno dorsal da medula espinhal por estimulação da

PAG (substância cinzenta periaquedutal), por meio da excitação dos interneurônios inibitórios

resultando na inibição dos neurônios do corno dorsal (SOMMER, 2004). As ações periféricas

da 5-HT são distintas das ações centrais. Na periferia, a 5-HT é considerada um mediador

inflamatório e é liberada por plaquetas e mastócitos. Seus níveis periféricos aumentam após a

injúria de um nervo e em pacientes com alodínia. A injeção intraplantar de 5-HT em ratos reduz

significativamente a latência de retirada da pata à estimulação ao calor radiante.

Os dados reportados aqui mostram que o perfil antinociceptivo do CAT parece estar

relacionado com a via serotoninérgica. Essa hipótese está claramente suportada pelo fato de que

a supressão da síntese de serotonina, com a inibição da triptofano hidroxilase pelo pCPA,

diminuiu o poder antinociceptivo do CAT. Esse resultado sugere que parte do efeito

antinociceptivo do CAT depende da presença da serotonina, no terminal nociceptivo ou em

nível de SNC.

Em seguida, para acrescentar informações sobre o efeito periférico do CAT, foi

realizada a coleta do líquido de lavagem do peritônio dos animais e quantificado a serotonina,

90

por HPLC. Na periferia, a serotonina é um mediador pró-inflamatório (CARVALHO et al.,

2013)

Os resultados mostraram que o tratamento com pCPA antes do ácido acético

reduziu o nível de serotonina (como esperado). Nos animais que receberam pCPA e CAT foi

observado a diminuição ainda maior na quantidade de serotonina. Com esses resultados

podemos destacar a importância da serotonina no mecanismo antinociceptivo do CAT e que o

CAT aumentou a degradação desta durante esse processo, assim como, esse resultado corrobora

com a suspeita de efeito anti-inflamatório levantado com os resultados do modelo de

hipernocicepção inflamatória. Nossos resultados são semelhantes aos de Hess et al., (2010), que

sugeriram que a modulação da dor pela molécula em estudo parece ser mediada, em parte, pela

indução da liberação de serotonina. Mas, no nosso caso, esse possível aumento na indução da

liberação da serotonina está acompanhado de uma diminuição na disponibilidade da serotonina,

ou por uma ligação mais forte com seus receptores ou por degradação metabólica.

É sabido que a inibição da transmissão dolorosa pela 5-HT no corno dorsal da

medula é mediada pelos receptores 5-HT2, embora o efeito, também, seja atribuído aos

receptores 5-HT1. Além disso, o pré-tratamento com cetanserina – um antagonista do receptor

5-HT2A – atenua a resposta comportamental à dor após a injeção da 5-HT. Estes resultados

sugerem que o receptor 5-HT2A está envolvido na hiperalgesia induzida pela 5-HT em

ferimentos agudos ou na inflamação. A injeção local de cetanserina produziu inibição dose

dependente da hiperalgesia evocada pela carragenina. Juntos estes resultados sugerem que a 5-

HT tem um papel importante na hiperalgesia resultante do ferimento tecidual, por ativação dos

receptores 5-HT2A nos terminais nervosos do nociceptor (SAWYNOK, REID, 1996).

Outro receptor serotoninérgico envolvido no processamento da dor são os 5-HT3.

No SNC, os 5-HT3 estão localizados principalmente na área postrema, nucleus accumbens,

91

amigdala, hipocampo e nos gânglios do corno dorsal, modulando a liberação de

neurotransmissores e neuropeptídios como a dopamina, acetilcolina, GABA e a substância P.

Os terminais periféricos de fibras C e Aδ expressam receptores ionotrópicos 5-HT3, cuja

ativação medeia uma despolarização rápida desses neurônios (FABER et al., 2004).

Vários trabalhos têm mostrado diferentes efeitos para antagonistas 5-HT1A, não

alterando (CRISP et al., 1991) ou produzindo bloqueio dose-dependente (XU et al., 1994) da

antinocicepção induzida por 5-HT no teste do “tail-flick”. A administração intratecal de

agonistas 5-HT1A facilitam (ALHAIDER, WILCOX, 1993), inibem (XU et al., 1994) ou não

modificam a reação de dor (MILLAN, 1994). Grau similar de controvérsia existe sobre o

possível papel exercido pelos receptores 5-HT2 e 5-HT3. A ativação de receptores 5-HT2 foi

reportado facilitar (EIDE et al., 1990) ou inibir (SOLOMON, GEBHART, 1988) a transmissão

do impulso nociceptivo.

O CAT parece exercer seu efeito antinociceptivo, em parte, modulando a ligação

da serotonina nos receptores 5-HT1 e 5-HT2, mas não interferindo com a ligação no 5-HT3.

Essa hipótese é claramente suportada pelo fato de que o pré-tratamento dos animais com NAN-

190 ou Ritanserina diminuiu o efeito antinociceptivo do CAT, no caso do NAN-190, esse efeito

foi abolido. Esses achados estão de acordo com trabalhos anteriores, em que, o envolvimento

da via serotonérgica parece estar relacionada com a antinocicepção induzida por várias drogas

(DE WITTE et al., 2001; ALLOUI et al., 2002).

A via noradrenérgica é ativada pela noradrenalina liberada das projeções bulbo-

espinhais para os neurônios do corno dorsal da medula espinhal (NICHOLSON et al., 2005) e,

uma vez liberada, modula a excitabilidade desses neurônios através da ativação dos α1 e α2-

adrenoceptores.

92

Butelman et al. (1998) demonstraram que a aplicação sistêmica dos agonistas α1

(fenilefrina) ou α2 (clonidina) causa efeitos analgésicos em diversos modelos animais de dor e

que são antagonizados pela prazosina e ioimbina, respectivamente. Imbelloni (2001) reporta a

utilização da fenilefrina em anestesia raquidiana sugerindo aumento do efeito analgésico,

vasoconstrição no local da administração e diminuição dos efeitos tóxicos sistêmicos do

anestésico. Agonistas α2-adrenérgicos possuem efeito potencializador da analgesia

subaracnóide através da liberação de β-endorfinas, porém acentuam o quadro hipotensivo

provocado pelo anestésico local espinhal. A clonidina aumenta a liberação de noradrenalina em

resposta à estimulação neural (UMEDA et al., 1996) e potencializa o seu efeito inibitório sobre

as fibras Aδ e C, responsáveis pela condução do estímulo doloroso (KAWASAKI et al, 2003).

Um dos mais significativos papéis dos neurônios noradrenérgicos na modulação da

dor é observado em pacientes durante a retirada do tratamento com opióides. A interrupção

abrupta da administração de opióides ou a aplicação aguda de antagonistas opióides induzem

uma série de respostas aversivas e sintomas que incluem um aumento anormal da hiperalgesia

A retirada dos opióides pode causar hiperatividade dos neurônios noradrenérgicos centrais e

aumento dos níveis de noradrenalina no cérebro. Assim, o aumento das sinapses

noradrenérgicas no Núcleo Magno da Rafe (NRM) pode mediar a hiperalgesia observada como

efeito da abstinência opióides (HEISHMAN et al., 1989; McNALLY, AKIL, 2002;

RAGHAVENDRA, RUTKOWSKI, 2002).

Os resultados do presente trabalho indicam que o efeito antinociceptivo do CAT

provavelmente não é mediado pelo sistema α2-adrenérgico. O tratamento com ioimbina não

alterou o comportamento antinociceptivo mediado pelo CAT frente à aplicação intraperitoneal

de ácido acético. Umeda et al., (1997), demonstraram que a liberação não-sináptica de

norepinefrina para medula espinhal é modulada via auto-receptor α2-adrenérgico. Foi

93

observado que o agonista α2-adrenérgico, clonidina, inibe essa via, enquanto que a ioimbina

aumenta a liberação de norepinefrina em resposta à estimulação neural (VIZI et al., 1986). É

possível que a clonidina exerça efeito antinociceptivo, pelo menos parcialmente, através da

modulação pré-sináptica das fibras aferentes primárias que transmitem a mensagem nociceptiva

para a medula.

Vários estudos têm demonstrado a participação da via colinérgica nos mecanismos

de antinocicepção (HERZ, 1993; ABELSON et al., 2004; HABERBERGER et al., 2004). A

acetilcolina praticamente não tem aplicações terapêuticas por causa de sua ação difusa e

hidrólise rápida pela acetilcolinesterase sináptica e butirilcolinesterase plasmática. Os níveis

endógenos de acetilcolina podem ser mediados por diversas substâncias envolvidas na

transmissão do processo doloroso (TAGUCHI et al., 1999; ABELSON, et al., 2004; OBATA

et al. 2004). Sua liberação é aumentada nos neurônios do SNC a partir da ativação de receptores

opióides pré-sinápticos pela morfina, causando potencialização do efeito antinociceptivo. Esse

trabalho também demonstrou que a antinocicepção induzida pela administração sistêmica de

morfina pode ser antagonizada pela administração intratecal de antagonistas muscarínicos,

reforçando a idéia de sinergismo entre os sistemas opióide e colinérgico (TAGUCHI et al.,

1999).

O aumento dos níveis de acetilcolina intraespinhal durante a analgesia induzida por

AINEs, como a aspirina, também é conhecido (ABELSON et al., 2004). Na interação das vias

α-adrenérgica e colinérgica na modulação do processo doloroso, é reportado que a clonidina

(agonista adrenérgico) é capaz de aumentar a liberação de acetilcolina na medula espinhal

(OBATA et al. 2004). A via colinérgica também participa do controle exercido pela medula

rostral ventrolateral (RVLM) sobre as funções fisiológicas cardiovasculares e mecanismos

antinociceptivos (TAGUCHI et al., 1999).

94

Os resultados após o pré-tratamento com atropina fundamentam a hipótese da

efetiva participação da acetilcolina neste processo de analgesia. Pois o bloqueio muscarínico

reverteu parcialmente o efeito antinociceptivo do CAT.

Paradoxalmente, existem também evidências de que se pode esperar um efeito

antinociceptivo quando o sistema colinérgico é bloqueado pelo antagonista atropina em doses

muito pequenas, entre 1 e 100µg/kg, através do bloqueio seletivo dos receptores muscarínicos

pré-sinápticos, o que induz um aumento dos níveis de acetilcolina extracelular (BANNON et

al., 1998).

A dopamina é uma catecolamina sintetizada nos terminais dos neurônios

dopaminérgicos a partir da tirosina. Os receptores dopaminérgicos encontram-se amplamente

distribuídos no SNC e estão envolvidos nos controles da atividade motora, do comportamento

emocional e em circuitos neuroendrócrinos. Os circuitos dopaminérgicos do mesencéfalo (área

tegmental ventral, sistema mesolímbico) por sua vez, estão envolvidos no processo de adição a

certos fármacos e de substâncias como o álcool, a cocaína e os opióides formando a chamada

zona de recompensa (BLACK et al., 2002).

Mecanismos Dopaminérgicos parecem estar envolvidos na modulação da

nocicepção (ROBERTSON et al., 1981; TRICKLEBANK et al., 1984), como na mediação da

analgesia no teste da formalina (MORGAN, FRANKLIN, 1991). Vários trabalhos indicam que

ambos agonistas D2 e estimulantes indiretos de receptor dopaminérgico produzem analgesia

em diferentes modelos animais de dor (KOSTRZEWA et al., 1991; MORGAN, FRANKLIN,

1991; FRUSSA-FILHO et al., 1996). Outro estudo confirma o envolvimento da dopamina na

nocicepção e sugere o envolvimento do receptor D2, mas não o D1, no estriato dorso-lateral na

modulação da percepção nociceptiva (MAGNUSSON, FISHER, 2000). Antagonistas

95

preferenciais para receptor D2 atenuam os efeitos antinociceptivos do mazindol e cocaína no

teste da formalina (BITTENCOURT, TAKAHASHI, 1997).

Mansikka et al. (2005) demonstraram, que animais “knock-out” para receptor

dopaminérgico D2 apresentam maior sensibilidade à dor produzida por estímulos mecânicos do

que animais que possuem o receptor, reportando assim a participação modulatória da dopamina

no processo de nocicepção. A presença de receptores D2 em áreas do corno dorsal da medula

espinhal, especialmente nas lâminas I, II e VI também evidenciam atuação dopaminérgica no

controle da dor (VAN DIJKEN et al., 1996).

O efeito antinociceptivo do CAT foi testado em animais pré-tratados com

haloperidol, um antagonista dopaminérgico não-seletivo, para a verificação da participação da

via dopaminérgica na ação antinociceptiva do composto. Os resultados sugerem a possível

participação desta via no mecanismo do CAT.

Slaoui et al. (2007) mostraram que a levodopa aumenta o limiar para a dor por calor

ou frio e a tolerância à dor por calor em pacientes com Parkinson. Isso sugere que drogas que

atuem na via dopaminérgica poderiam ter efeito analgésico na dor relacionada com Parkinson.

Um dos sistemas mais estudados quando pesquisa-se o efeito antinociceptivo e/ou

analgésico de fármacos é a via opióide. Continua a ser um dos principais objetivos para quem

estuda a dor chegar a um fármaco com as propriedades terapêuticas do grupo, porém sem os

seus efeitos colaterais, principalmente aqueles observados no uso da droga em processos

dolorosos crônicos, ou seja, a dependência e a tolerância.

O termo opióide é mais abrangente, aplicado a todos os agonistas e antagonistas

com atividade morfino-símile, bem como aos peptídeos opióides naturais e sintéticos

(FILIZOLA et al., 2001). Os ligantes opióides possuem uma variedade de atividades

96

fisiológicas e têm sido extensamente utilizados na medicina, predominantemente no tratamento

da dor. Entretanto, mesmo em doses terapêuticas, os agonistas totais ou parciais dos receptores

opióides podem induzir diversos efeitos adversos como depressão respiratória e o

desenvolvimento de tolerância e dependência (GHARAGOZLOU et al., 2003).

Os principais receptores têm sido rebatizados com as seguintes siglas: OP1 (δ), OP2

(κ) e OP3 (µ), todos pertencentes à família de receptores acoplados à proteína G (STEFANO et

al., 2005). A ativação desses receptores produz diminuição nos níveis de AMPc, aumento da

condutividade do K+, diminuição da condutividade do Ca2+ e inibição da liberação de

neurotransmissores. O principal efeito da ativação dos receptores opióides pela ligação de

drogas agonistas nas lâminas II e V do corno dorsal da medula é a diminuição da liberação dos

neurotransmissores excitatórios (acetilcolina e substância P). A ocupação dos receptores

opióides por um agonista determina alterações na bioquímica intracelular do neurônio, levando

a uma hiperpolarização da membrana com aumento da condutância ao potássio e a inativação

dos canais de cálcio, determinando a diminuição dos neurotransmissores excitatórios

(IMBELLONI, 2001).

As ações antinociceptivas dos agonistas opióides são exercidas tanto no corno

dorsal da medula quanto no tronco encefálico. Na medula espinhal esses peptídeos inibem a

liberação de taquicininas e glutamato nos terminais centrais de aferentes nociceptivos

primários, enquanto que no tronco encefálico estimulam as vias descendentes modulatórias

(noradrenérgicas e serotoninérgicas) na substância cinzenta periaquedutal, pela inibição de

neurônios GABAérgicos inibitórios (ZAKI, BILSKY, 1996).

A morfina, protótipo das drogas opióides, é um agonista µ puro com moderada ação

sobre os receptores κ e δ. O seu uso crônico pode ser acompanhado de vários efeitos adversos,

entre eles, náuseas, vômitos, retenção urinária, miose. Essas manifestações se relacionam com

97

um aumento da atividade catecolaminérgica central e são reduzidas quando seu uso é associado

com antagonistas dopaminérgicos e agonistas α2-pré-sinápticos. Já a naloxona é um potente

antagonista µ, δ e κ. É utilizada principalmente para reverter o efeito tanto de agonistas puros

quanto de agonistas-antagonistas (BARNHART; HUBBEL; MUIR, 2000).

No entanto, ainda não foi encontrado um agente terapêutico que tenha efeitos

parecidos com a morfina, mas que possua menos efeitos adversos. Em nossos resultados

podemos ver que a ativação da via opióide sensível à naloxona provavelmente não está

envolvida na antinocicepção produzida pelo CAT, pois o pré-tratamento com o antagonista não

alterou o padrão comportamental do CAT em modelo de contorções por ácido acético.

Com estes últimos resultados podemos inferir que o CAT além de atuar na via

aferente da nocicepção, provavelmente no terminal nervoso sensitivo, também modula a

informação dolorosa em nível central, através das vias serotonérgica, colinérgica e/ou

dopaminérgica, possivelmente na modulação de mediadores intracelulares (PKC e/ou PKA) em

comum.

Algumas limitações existiram nesse trabalho. Como o tempo de ação da droga, que

é relativamente curto (com efeito até por 4 horas após a aplicação), isso aumentaria o número

de administrações diárias em um tratamento prolongado. E outra limitação foi o fato do

conteúdo gástrico dos animais poderem estar interferindo na absorção da droga. Sabe-se que

entre 12-14 horas de jejum são necessárias para o completo esvaziamento gástrico. Porém, para

evitar estresse excessivo, que poderia interferir no comportamento dos animais, decidiu-se dar

um jejum de apenas 3-4 horas.

Por fim, de acordo com os resultados discutidos, podemos considerar que a melhor

dose para o uso antinociceptivo em camundongos fica na faixa entre 100 e 200 mg/kg, esse

efeito parece ser suficientemente potente para uma administração sozinha diante de um estímulo

98

nociceptivo agudo. Mas não descartamos o efeito benéfico da associação do CAT com outra

drogas antinociceptivas, com a finalidade da diminuição da dose destas.

99

7 CONCLUSÃO

O Acetato de Citronelila foi testado em relação a sua atividade farmacológica em

modelos de nocicepção aguda. Os resultados obtidos neste estudo nos permitem levantar as

seguintes considerações:

• O Acetato de Citronelila possui uma ótima atividade antinociceptiva com

curto período de latência e tempo de ação intermediário, sem interferências

comportamentais nesse efeito;

• É improvável que o Acetato de citronelila atue diretamente sobre TRPV1,

TRPM8, ASIC, K+ATP ou receptores da Bradicinina, provavelmente ele atue

em alguma etapa, a nível intracelular, comum entre eles, possivelmente

através de PKC e PKA;

• O efeito antinociceptivo do Acetato de Citronelila a nível central é

dependente de serotonina, possivelmente na transmissão ou modulação do

impulso nóxico, através de receptores 5-HT1a, 5-HT2, possivelmente na via

modulatória nociceptiva;

• Também, foi apresentado que o Acetato de Citronelila pode agir interferindo

nas vias de neurotransmissão muscarínica ou dopaminérgica;

• O Acetato de Citronelila pode atuar interferindo na cascata inflamatória,

possivelmente diminuindo a sensibilização do nociceptor.

100

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ANEXO A – DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DESTE PROJETO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL - UFC

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ANEXO B – TRABALHO PUBLICADO EM PERIÓDICO COM ALGUN S RESULTADOS DESTA TESE

universidade federal do cearÁ faculdade de … · leonardo e alyne mara , casal forte e decidido,...

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