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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS RENAIS E VASCULARES DAS LECTINAS DAS ALGAS

Caulerpa cupressoides E Pterocladiella capillacea

MARTA MARIA CAETANO DE SOUZA

FORTALEZA 2013

MARTA MARIA CAETANO DE SOUZA

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS RENAIS E VASCULARES DAS LECTINAS DAS

ALGAS

Caulerpa cupressoides E Pterocladiella capillacea

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito para

obtenção do título de Doutor em farmacologia.

Orientadora: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro.

FORTALEZA 2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

S716a Souza,Marta Maria Caetano de. Avaliação dos efeitos renais e vasculares das lectinas das algas caulerpa

cupressoides E pterocladiella capillacea./ Marta Maria Caetano de Souza. – 2013. 119f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da

Saúde,Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia,Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia,Doutorado em Farmacologia,Fortaleza, 2013. Área de Concentração: Farmatologia

Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro.

1. Ricina. 2.Perfusão. 3. Rim.I. Título.

CDD612.463

Marta Maria Caetano de Souza

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS RENAIS E VASCULARES DAS LECTINAS DAS ALGAS

Caulerpa cupressoides E Pterocladiela capillacea

Banca Examinadora

______________________________________________

Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro (orientadora) Universidade Federal do Ceará

______________________________________________

Profa. Dra. Inêz Liberato Evangelista Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia da Paraíba

______________________________________________

Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista Universidade Estadual do Ceará

______________________________________________

Prof. Dr Jairo Diniz Filho Universidade Federal do Ceará

______________________________________________

Profa. Dra. Arlândia Cristina Lima Nobre de Morais Universidade de Fortaleza

Fortaleza

2013

Aos meus Pais

Dedico este trabalho a vocês que me deram a vida, não

somente uma vida, mas um viver de alegrias, de descobertas,

de conquistas e sucessos. Tudo isso exigiu muita renúncia,

dedicação, paciência, sabedoria e acima de tudo muito amor.

Aos meus pais o meu mais profundo obrigada, a minha mãe

Edineuza pela MARAVILHOSA MÃE que sempre foi e ao meu

Pai, Francisco, que me proporcionou tudo aquilo que um

GRANDE HOMEM pode dar a um filho.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela dádiva da vida e pela honra de alcançar dentre muitos esse

patamar de conhecimento.

À minha família, meus grandes amores, meu esposo Renato e minha filha Maitê

(tetê), que muitas vezes “ deixei”, me privando dos bons momentos e estando

ausente em outros nos quais precisavam de mim.

À minha mãe de forma especial, pois ela sempre foi meu alicerce em todos os

momentos de minha vida.

À minha orientadora, Profa. Helena Serra Azul Monteiro, por me aceitar em seu

laboratório e por toda sua compreensão e orientação, sempre mostrando ser uma

grande amiga de todos os alunos.

À meus irmãos, Ana Clédina, Ana Célia e Francisco José que me acompanham e

zelam por mim, me ajudando sempre em todos os momentos que preciso.

À minha segunda família, minha sogra Marlene, meu sogro Renato, minhas

cunhadas Regiane e Riviane, que estiveram comigo me dando apoio em todos os

momentos que precisei.

Às minha grandes amigas, Ana Karine, que esteve comigo ao longo dessa

caminhada e ás vezes mesmo distante torcia por mim e à Lucilma Gurgel, pela sua

verdadeira amizade ao longo desses 16 anos de convivência sempre com muita

compreensão e companheirismo.

À Profa. Renata Sousa, por sua amizade, e enorme ajuda contribuindo para meu

crescimento ao longo do doutorado.

À todos os alunos, mestrandos e doutorandos do LAFAVET e em especial aos

meus amigos Rafael Jorge e Roberta Jorge, pela enorme colaboração em todos

momentos que precisei, e pela amizade.

Ao Prof. Pedro Magalhaes pela contribuição e a todos dos LAFAMULI, em especial

a Patricia Magalhaes pela sua disponibilidade e ajuda na realização desse trabalho.

À Profa. Alice Martins e às alunas do laboratório LCC, Danya e Ticiana , pela

colaboração com esse trabalho.

À Profa. Norma Benevides por sua enorme colaboração e acessibilidade sempre

que precisei e em especial aos seus alunos Ismael Nilo e Luana Silva por sua

amizade e enorme ajuda.

À Márcia e Aura, secretárias do Programa de Pós-graduação em Farmacologia, por

estarem sempre dispostas a me ajudar.

À Dra. Cícera Machado, por seu carinhoso acolhimento e enorme compreensão me

ajudando em etapas muito difíceis.

À todos que participaram desse trabalho, colaborando para a concretização do

mesmo, meus agradecimentos.

Aos meus amigos peludos, que por amor a eles trilhei meu caminho como Médica

Veterinária, sempre na busca do saber, mas também voltada ao cuidar e bem estar

de todos eles. A todos os animais que me proporcionaram momento de muitas

realizações e felicidade, minha enorme gratidão.

RESUMO

As macroalgas são encontradas em todo o mundo, desempenhando um importante papel na manutenção do equilibrio marinho e na preservação da biodiversidade marinha. Estudos com espécies de macroalgas presentes no litoral do Ceará, como a Caulerpa cupressoide e Pterocladiella capillacea tem despertado interesse por diversos efeitos biológicos. A Caulerpa cupressoides é uma alga verde da família Caulerpaceae e a Pterocladiella capillacea trata-se de uma alga vermelha da familia Pterocladiacea. Diante do potencial destas espécies e de seus componentes como as lectinas, bem como de poucos relatos sobre efeitos tóxicos renais objetivou-se estudar os efeitos das lectinas das algas citadas em modelo de perfusão renal, efeitos citotóxicos em células MDCK e efeitos na Pressão Arterial (PA) e Frequencia Cardiaca (FC). Utilizou-se ratos wistar machos, pesando entre 250 e 300g. Na perfusão de rins isolados utilizou-se as lectinas na concentração de 10µg/mL. Os efeitos das lectinas foram avaliados na Pressão de Perfusão(PP), Resistência Vascular Renal(RVR), Fluxo Urinário(FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual do transporte tubular de sódio (%TNa+), de potássio (%TK

+) e de cloreto (%TCl-). O ensaio com artéria mesentérica foi realizado

com a lectina da Caulerpa cupressoides (Lcc) nas concentrações de 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; 60; 100; 200; 300 e 400 µg/mL e o tecido foi pre-contraído com fenilefrina(PHE) (0,3µmol e 1µmol). A PA e FC foram obtidas por canulação da carótida e os registros realizados através de um software de aquisição de dados. A LCc aumentou a PP e RVR aos 90 e 120 minutos, reduziu o RFG aos 60 minutos e reduziu o %TNa+, %TK

+ e

%TCl- aos 60, 90 e 120 minutos. A lectina da Pterocladiela capillacea (LPc) reduziu o FU aos 120 minutos e reduziu o %TNa+, aos 90 e 120 minutos. No estudo de citotoxidade, a LCc e LPc não alteraram a viabilidade de células MDCK. A LCc promoveu relaxamento em artéria mesentérica nas concentrações de 100, 200, 300 e 400 µg/mL em tecido pré-contraido com PHE 1 µmol, mas não o fez em tecido pré-contraido com PHE 0,3 µmol abaixo de 200 µg/mL. A LCc promoveu deposição de material protéico nos espaços tubular e urinário e expansão do intersticio. A LPc causou minima desposição de material protéico, sem alterações a nivel de intersticio. A LCc causou leve redução na PA nas concentrações de 100 e 200µg/mL e não alterou a FC e a LPc não causou alterações da PA e FC. Observou-se que a LCc promoveu efeitos hemodinâmicos renais, aumentando PP e RVR o que pode ser em decorrência de ativação de α-adrenoreceptores. A LCc reduziu a PA a partir de100 µg/mL, sugerindo possível liberação de agentes vasodiltadores, o que ocasionaria também acúmulo de líquido no intersticio (edema) como mostrou a histologia dos rins. A LPc não promoveu alterações na PP e RVR. A FC e PA não foram alteradas com a LPc sugerindo que a mesma não promove liberação de substâncias que agem diretamente como vasoconstritores. Palavras-chave: Lectinas, Caulerpa cupressoides, Pterocladiela capillacea, Perfusão Renal.

ABSTRACT

Macroalgae are found worldwide, playing an important role in maintaining the balance marine and conservation of marine biodiversity. Studies with seaweeds present in the coast of Ceará, such as Caulerpa cupressoides and Pterocladiella capillacea has aroused interest in many biological effects. The Caulerpa cupressoides is a green algae belonging to the family Caulerpaceae and Pterocladiella capillacea is a red seaweed of the family Pterocladiacea. Given the potential of these species and their components such as lectins, as well as a few reports of kidneys toxic effects aimed to study effects of lectins cited algae on renal perfusion model, cytotoxic effects on MDCK cells, effects on Blood Pressure (BP) and Heart Rate(HR). Male Wistar rats weighing between 250 and 300g were used in the experiments. Lectins was utilized in perfusion of isolated kidneys at concentration of 10μg/mL. The effects of lectins were evaluated in Pressure Perfusion (PP), Renal Vascular Resistance (RVR), Urinary Flow (FU), Glomerular Filtration Rate (GFR), Percentage of Tubular Transport of Sodium (% TNa+), Potassium (% TK +) and Chloride (%TCl-). The mesenteric artery assay was realized with the lectin Caulerpa cupressoide- LCc at concentrations of 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30; 60, 100, 200, 300 and 400μg/mL., and the tissue was pre-contracted with phenylephrine (PHE) (0.3μmol and 1μmol). The BP and HR were obtained by cannulation of the carotid artery and registers performed by a data acquisition software. The LCc increased RVR and PP at 90 and 120 min, reduced GFR at 60 minutes and reduced the % TNa+, % TK+ and %TCl- at 60, 90 and 120 minutes. The lectin Pterocladiella capillaceae -LPc reduced the FU at 120 minutes and reduction % TNa+, at 90 and 120 minutes. In the study of cytotoxicity, LCc and LPc did not affect viability of MDCK cells. LCc promoted relaxation in mesenteric artery in concentrations of 100, 200, 300 and 400 µg/mL in tissue pre-contracted with PHE to 1.0 micromol, but did not it in tissue pre-contracted with PHE a 0.3 micromol, in concentrations below to 200 µg/mL. LCc promoted deposition of protein material in the tubule and expansion interstice. The LPc caused deposition protein material in the tubule, without changes at the level of interstice. LCc caused slight reduction in blood pressure at concentrations of 100 and 200μg/mL and did not change the Cardiac Frequency (CF) and LPc caused no changes in CF nor the Heart Rate (HR). It was noted that the LCc promoted renal hemodynamic effects, raising PP and RVR, which may be due to α-adrenoceptor activation. LCc reduced the BP from the concentration of 100 μgmL, suggesting possible release of agents vessel dilators, which also would cause fluid accumulation in the interstice as shown kidney histology. LPc did not change the PP and RVR. The HR and BP were not changed with the LPc, suggesting that it does not promote the release of substances that act directly as a vasoconstrictor.

Keywords: Lectins, Caulerpa cupressoides, Pterocladiela capillacea, Renal Perfusion.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Ilustração do habitat das macroalgas

28

Figura 2- Exemplares do gênero Caulerpa: A-C.taxiofolia; B-C.racemosa

36

Figura 3- Ramos da Caulerpa cupressoides

38

Figura 4- Exemplar da Pterocladiela capillacea

42

Figura 5-A-Pinulas da alga P.capillacea ;7 B- Ramos da alga P.capillaceae

43

Figura 6- Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado

56

Figura 7- Sistema de perfusão do rim isolado .

57

Figura 8- A-Identificação e dessecação do ureter ; B- ureter canulado .

59

Figura 9- A: visualização da artéria renal; 11B: canulação da artéria renal pela

artéria mesentérica.

59

Figura 10-. Esquema do protocolo experimental da Perfusão Renal

60

Figura 11-. Esquema do protocolo experimental do Ensaio com Artéria Mesentérica.

67

Figura 12- Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10

µg/mL, p<0,05.

69

Figura 13- Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração

de 10 µg/mL, p<0,05.

70

Figura 14- Fluxo Urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL,

p<0,05.

71

Figura 15- Ritmo de Filtração Glomerular nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10

72

µg/mL, p<0,05.

Figura 16- Percentual de Transporte de Sódio (%TNa+) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na

concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

73

Figura 17- Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos

controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na

concentração de 10 µg/mL.

74

Figura 18- Percentual de Transporte de Cloreto ( %TCl-) nos grupos controle



75

Figura 19- Fotomicrografia de rim direito perfundido apenas com solução de

Krebs-Hanseleit modificada. Glomérulos (seta preta), Túbulos (seta branca).

Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento 400x. Coloração Hematoxilina-Eosina(HE).

Grupo controle, n=6.

76

Figura 20- Fotomicrografia de rim direito perfundido com a lectina isolada de

Caulerpa cupressoides (LCc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se deposição

de material protéico (seta preta), e expansão do interstício (seta

branca)./Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento de 400X. Coloração

Haematoxilina-Eosina (HE).

77

Figura 21-Viabilidade celular do grupo controle (C) e tratado com lectina da

Caulerpa cupressoides (LCc) em diferentes concentrações. Dados expressos

em média ± desvio padrão, p < 0,05.

78

Figura 22- Pressão arterial média em ratos. Lectina extraída da alga marinha

Caulerpa cupressoides (LCc) utilizada nas doses de 1, 3, 10, 30,100 e

300g/mL. p<0.05, (n=6).

79

Figura 23 - Frequência cardíaca em ratos. Lectina extraída da alga marinha

Caulerpa cupressoides (LCc) utilizada nas doses de 1, 3, 10, 30, 100 e

300g/mL.p<0.05, (n=6).

80

Figura 24- Efeitos da lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) em contrações de

segmento de artéria mesentérica induzidas por fenilefrina (PHE) na

concentração de 0,3 µM, p<0,05.

81

Figura 25- Efeitos da lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) em contrações de

artéria mesentérica induzidas por fenilefrina (PHE) na concentração de 861µM,

p<0,05.

82

Figura 26- Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)

89com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10

µg/m90L, p<0,05.

84

Figura 27- Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração

de 10 µg/mL, p<0,05.

85

Figura 28- Fluxo Urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL,

p<0,05.

86

Figura 29- Ritmo de Filtração Glomerular nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10

µg/mL, p<0,05.

87

Figura 30- Percentual de Transporte de Sódio (%TNa+) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na

concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

88

Figura 31- Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos

controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na


89

Figura 32: Percentual de Transporte de Cloreto (%TCl-) nos grupos controle



90

Figura 33- Fotomicrografia de rim perfundido apenas com solução de Krebs-

Hanseleit modificada. Glomérulo (seta preta), Túbulos (setas brancas).

Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento 400x. Coloração Hematoxilina-Eosina

(HE). Grupo controle, n=6

91


Hanseleit modificada. Luz tubular (setas pretas). Microscópio Óptico

(Nikon)/Aumento 400x. Coloração Hematoxilina-Eosina (HE). Grupo controle,

n=6.

92

Figura 35- Fotomicrografia de rim perfundido com a lectina isolada de

Pterocladiela capillacea (LPc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se mínima

deposição de material protéico nos espaços tubulares (seta preta),/ Microscópio

Óptico (Nikon)/Aumento de 400X. Coloração Haematoxilina-eosina (HE).

93

Figura 36- Fotomicrografia de rim perfundido com a lectina isolada de

Pterocladiela capillacea (LPc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se

deposição de material protéico nos espaços tubulares (seta preta), / Microscópio

Óptico (Nikon)/Aumento de 400X. Coloração Haematoxilina-eosina (HE).

94

Figura 37- Viabilidade celular do grupo controle (C) e tratado com lectina da

Pterocladiela capillacea (LPc) em diferentes concentrações. Dados expressos

em média ± desvio padrão, p < 0,05.

95

Figura 38- Pressão arterial média nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)

com lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) em difentes concentrações,

p<0.05.

96

Figura 39- Frequência cardíaca nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) em diferentes concentrações, p<0.05.

97

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Resumo das Atividades Biológicas de Algas Verdes

(Clorophyta)

36

Quadro 2- Classificação taxonômica da Alga Caulerpa cupressoides

39

Quadro 3- Resumo das Atividades Biológicas de Algas Vermelhas

(Rodophytas)

41

Quadro 4- Classificação taxonômica da Alga Pterocladiella capillacea 43

LISTA DE TABELAS

Tabela 1-. Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na


69

Tabela 2- Resistência Vascular Renal (R.V.R.) nos grupos controle



70

Tabela 3- Fluxo urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração

de 10 µg/mL.

71

Tabela 4- Ritmo de Filtração Glomerular (R.F.G.) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc)

na concentração de 10 µg/mL.

72

Tabela 5- Percentual do Transporte Tubular de Sodio (%TNa+) nos

grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa

cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL.

73

Tabela 6- Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos



74

Tabela 7- Percentual do Transporte Tubular de Cloreto (%TCl-) nos



75

Tabela 8- Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na


84

Tabela 9- Resistência Vascular Renal (R.V.R.) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc)


85

Tabela 10- Fluxo urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração

de 10 µg/mL.

86

Tabela 11- Ritmo de Filtração Glomerular (R.F.G.) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com a Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc)


87

Tabela 12- Percentual do Transporte de Sodio (%TNa+) nos grupos

controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina Pterocladiella capillacea

(LPc) na concentração de 10 µg/mL.

88

Tabela 13- Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos

grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina Pterocladiella

capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL.

89

Tabela 14- Percentual do Transporte Tubular de Cloreto (%TCl-) nos

grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella

capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL.

90

LISTA DE ABREVIATURAS

ACh Acetilcolina

ANOVA Análise de Variância

Ca+ Íon Cálcio

CaCl Cloreto de Cálcio

CaCl2.2H2O Carbonato de cloreto

CARBOLEC Laboratório de Carboidratos e Lectinas

CH3HgCl Metilmercurio

CL Concentração de Letalidade

CRD Carbohydrate Recognition Domain

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FC Frequência Cardiaca

FSR Fluxo Sanguineo Renal

FU Fluxo Urinário

GSH Glutationa Reduzida

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

FAO Organização de Agricultura e Alimentos

HE Haematoxilina- Eosina

IC Concentração Inibitória

K+ Íon Potássio

KCl Cloreto de Potássio

KH2PO4 Fosfato de Potássio

LAFAVET Laboratório de Farmacologia em Venenos e Toxinas

LCc Lectina da Caulerpa cupressoides

L-NAME Nitro- L- argenine Methyl Ester

LPc Lectina da Pterocladiella capillacea

HMPV Human Metapneumovirus

MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells

MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio

MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo

NaCl Cloreto de sódio

NaH2PO4 Fosfato de sódio monobásico

NaHCO3 Bicarbonato de sódio

NO Nitric Oxide

PA Pressão Arterial

PBS Phosphate Buffered Saline

PHE Fenilefrina

PP Pressão de Perfusão

RFG Ritmo de Filtração Glomerular

RVR Resistência Vascular Renal

SBF Soro Bovino Fetal

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SNA Sistema Nervoso Autônomo

SNC Sistema Nervoso Central

SPR Sistema de Perfusão Renal

TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética

TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica

TNF Fator de Necrose Tumoral

UH Unidades de Hemaglutinação

UFC Universidade Federal do Ceará

%T Cl- Percentual do Transporte Tubular de Cloreto

%T K+ Percentual do Transporte Tubular de Potássio

%T Na+ Percentual do Transporte Tubular de Sódio

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO................................................................................

23

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................

2.1.Componentes das Algas...............................................................

26

28

2.2. Efeitos Biológicos das Algas........................................................ 31

2.2.1 Atividade antiinflamatória........................................................... 31

2.2.2 Atividade Antinociceptiva........................................................... 32

2.2.3 Atividade Antioxidante................................................................ 32

2.2.4 Fonte Nutricional........................................................................ 33

2.2.5 Efeitos Renais............................................................................ 33

2.3 Algas Verdes................................................................................. 34

2.3.1 Caulerpa cupressoides.............................................................. 37

2.4. Algas vermelhas........................................................................... 39

2.4.1 Pterocladiella capillaceae........................................................... 41

2.5 Lectinas......................................................................................... 44

3 JUSTIFICATIVA............................................................................... 48

4 OBJETIVOS..................................................................................... 50

4.1 OBJETIVO GERAL....................................................................... 50

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................... 50

5. MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 51

5.1 MATERIAL.................................................................................... 51

5.1.1 Algas Marinhas........................................................................... 51

5.1.2 Células sanguineas.................................................................... 51

5.1.3 Animais e grupos experimentais................................................ 51

5.1.4 Células MDCK............................................................................ 52

5.1.5 Substâncias e Reagentes.......................................................... 52

5.2 MÉTODOS.................................................................................... 53

Obtenção e Purificação das lectinas das algas Caulerpa

cupressoides e Pterocladiella capillacea............................................

53

5.2.1 Preparação do Extrato Bruto das algas Caulerpa cupressoides

e Pterocladiella capillacea...................................................................

53

5.2.2 Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose.... 53

5.2.3 Cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-100..... 54

5.2.4 Cromatografia de afinidade em coluna de Goma de Guar......... 54

5.2.5 Atividade Hemaglutinante........................................................... 54

5.2.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida das Lectinas das algas

C. cupressoides e P.capillacea .....................................................................

55

5.3 Sistema de perfusão renal............................................................. 55

5.3.1 Calibração do Sistema................................................................ 57

5.3.2 Solução Perfusora....................................................................... 57

5.3.3 Técnica Cirúrgica........................................................................ 58

5.3.4 Protocolo Experimental............................................................... 60

5.3.5 Análises Bioquímicas................................................................... 61

5.3.6 Cálculo dos Parâmetros Renais.................................................. 62

5.3.7 Análise Histológica....................................................................... 63

5.3.8 Análise Estatística....................................................................... 63

5.3.9 Aspectos Éticos........................................................................... 63

5.4 Estudo da Atividade Citotóxica in vitro........................................... 63

5.4.1 Cultivo das células MDCK........................................................... 63

5.4.2 Ensaio com MTT.......................................................................... 64

5.4.5 Tratamento das células MDCK.................................................... 64


5.5 Avaliação de Pressão Arterial e Frequência Cardíaca................... 65

5.5.1 Experimento de Pressão Arterial............................................... 65

5.5.1.1 Procedimento cirúrgico............................................................. 65

5.5.2 Avaliação da Frequência Cardíaca.............................................. 66


5.6. Avaliação do efeito da lectina Caulerpa cupressoides em Ensaio

de Artéria Mesentérica.........................................................................

66

5.6.1 Grupos Experimentais....................................................... 66

5.6.2 Ensaio com Artéria Mesentérica................................................. 66

5.6.3 Análise Estatistica 68

6-RESULTADOS

69

6.1 LECTINA DA CAULERPA CUPRESSOIDES (LCC) 69

6.1.1Perfusão Renal............................................................................ 69

6.1.2 Análise Histológica...................................................................... 77

6.1.3 Células MDCK............................................................................. 79

6.1.4 Efeitos Vasculares ...................................................................... 80

6.1.4.1 Pressão Arterial e Frequência Cardíaca.................................. 80

6.1.5 Ensaio de Lectina da Caulerpa cupressoides em Artéria

Mesentérica..........................................................................................

81

6.2 LECTINA DA PTEROCLADIELLA CAPILLACEA (LPC)............. 84

6.2.1 Perfusão Renal........................................................................... 84

6.2.2 Análise Histológica...................................................................... 92

6.2.3 Células MDCK............................................................................. 96

6.2.4 Efeitos Vasculares ...................................................................... 97

6.2.4.1 Pressão Arterial e Frequência Cardíaca..................................

97

7 DISCUSSÃO..................................................................................... 99

8 CONCLUSÕES ................................................................................ 106

9 REFERËNCIAS ................................................................................ 107

23

1.INTRODUÇÃO

A utilização de organismos marinhos pelo homem é antiga e os primeiros

registros datam de 1600 a.C., quando os fenícios utilizavam a secreção dos

moluscos para produzir corantes de roupas (FAUKNER, 1992). No ambiente marinho

as algas representam um dos maiores grupos em termos de diversidade de espécies

(MARINHO-SORIANO et al., 2011).

As algas constituem um diversificado grupo de organismos autotróficos que

podem ser encontrados em ambientes aquáticos e terrestres úmidos (SZE,1997), e

que aliadas a um pequeno grupo de angiospermas marinhas, constituem os

produtores primários que sustentam a vida nos mares e oceanos e, portanto,

desempenham um papel ecológico fundamental na manutenção destes

ecossistemas. Estão entres os organismos que têm suas origens há mais de 3

bilhões de anos os quais, devido ao processo da fotossíntese, são responsáveis

pela estruturação da atmosfera terrestre, possibilitando a vida de todos os seres

vivos aeróbicos, pela produção de oxigênio molecular e consequente formação da

camada de ozônio (SCHOPF, 1993; KASTING, 1993; ALLÈGRE, C. J., SCHNEIDER,

1994, DUVE, 1996).

As macroalgas são encontradas em todo o mundo, constituindo-se como base

da cadeia alimentar, sendo fonte de nutrientes para uma grande variedade de

organismos aquáticos. Desta forma as algas desempenham um importante papel na

manutenção do equilíbrio marinho, e na preservação da biodiversidade marinha

(MARINHO-SORIANO et al., 2011).

Nas últimas décadas a descoberta de metabólitos primários e secundários

com estruturas químicas elucidadas e com atividades biológicas a partir de

macroalgas cresceu substancialmente, contribuindo para expandir o conhecimento

na área de produtos naturais bioativos (SMIT et al., 2004; (BLUNT et al., 2006;

PLAZA et al., 2010).

Algas e seus derivados possuem um grande impacto econômico em vários

setores, como na aquicultura, indústria farmacêutica, nutracêuticos, biomedicina,

medicina veterinária, indústria de cosméticos e saúde pública (MARINHO-SORIANO

et al., 2011).

De modo geral as macroalgas marinhas encontram-se divididas em três

classes: Ulvophyceae (algas verdes), Phaeophyceae (algas pardas) e Rhodophyta

24

(algas vermelhas) (TEIXEIRA, 2012a). As algas verdes estão presentes em aguas

tropicais e vivem em diferentes habitats como tronco de árvores, solo, em

associações simbióticas com fungo. Esta classe de algas possui cerca de 17000

espécies e seus exemplares são constituídos por clorofila a e b, terpenos, dentre

outros (RAVEN et al., 2007; TEIXEIRA, 2012a). A classe das algas pardas incluem

as algas presentes em águas temperadas e polares, com cerca de 1500 espécies

descritas e apresentam em sua constituição clorofilas a e c e carotenóides (RAVEN

et al., 2007). As algas vermelhas podem ser encontradas em águas tropicais e

também em águas frias, possuem em sua constituição clorofila ʺa e d ʺe diversos

carotenóides e a classe dessas algas tem cerca de 6000 espécies (RAVEN et al.,

2007).

No que se refere à distribuição das algas bentônicas, de acordo com

levantamento realizado sobre ficoflora marinha brasileira, a zona nordeste-oriental,

que tem como limites a costa oeste do Ceará e norte do Rio de Janeiro, abriga a

flora mais diversificada do país. Embora as macroalgas existam ao longo de toda a

costa brasileira, são mais abundantes e diversificadas em áreas com substrato

rochoso e águas mais transparentes, como é o caso da costa nordeste do país, onde

ocorre menor aporte de sedimentos e água doce devido à ausência de grandes rios.

Regiões de costões rochosos e recifes abrigam uma flora rica em macroalgas e

dentre estas estão as algas vermelhas como Pterocladiella capillacea, e algas

verdes como as do gênero Caulerpa (LIMA-FILHO et al., 2002).

De acordo com Farias et al. (2004), o estado do Ceará apresenta ampla

variedade de macroalgas marinhas com maior ocorrência de algas vermelhas, da

divisão Rhodophyta (205 espécies), seguida das algas verdes, divisão Chlorophyta

(77 espécies) e das algas pardas ou marrons, divisão Phaeophyta (31 espécies).

Diversas espécies dessas algas encontradas no litoral cearense vem sendo

amplamente estudadas em relação ao seus componentes e suas atividades

biológicas, como exemplo pode-se citar trabalho de Alencar et al. (2011), que

avaliaram a composição de treze algas coletadas na praia do Pacheco/

Caucaia/Ceará; Carneiro et al. (2012), que avaliaram potencial nutricional de algas

vermelhas oriundas da praia de Flecheiras; Rodrigues et al. (2011), avaliaram

potencial de polissacarídios sulfatados da alga Caulerpa cupressoides coletada da

praia do Pacheco, dentre outros.

25

Diante de toda a diversidade da bioflora brasileira a utilização das algas como

fonte de origem de componentes com potencial atividade biológica desperta a

necessidade de ampliar os estudos sobre espécies de ocorrência natural na região

nordeste e especificamente no estado do Ceará. A especulação sobre os diversos

efeitos biológicos tem despertado o interesse por algas verdes e vermelhas como a

Caulerpa cupressoide e Pterocladiela capillacea, de modo que é necessário ampliar

os estudos destas espécies na busca por componentes como possíveis ferramentas

farmacológicas.

26

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

As algas são organismos que apresentam a capacidade de ocupar diversos

ambientes desde que ofereçam luz e umidade suficientes, e são encontradas em

água doce, do mar e sobre solos úmidos. Estes organismos são considerados em

três diferentes reinos: Monera, Protista e Plantae. As algas pertencentes ao Reino

Monera compreendem bactérias e algas azuis, as algas do reino Protista

apresentam pigmento (clorofila, carotenos e xantofilas), e são dividas em

Euglenophyta, Pyrrophyta e Chrysophyta. No Reino Plantae encontram-se os

organismos pluricelulares, eucariontes e autótrofos pertencentes a divisão

Rhodophyta, Phaeophyta e Chlorophyta (VIDOTTI et al., 2004).

De uma forma geral tem-se a divisão das algas em macroalgas, fitoplancton e

microalgas. As macroalgas são organismos bênticos, que vivem quase toda sua vida

fixas à um substrato sólido. As únicas fases em que se apresentam livres e integram

o plâncton por períodos muito curtos de tempo são os esporos e gametas. A grande

maioria das macroalgas vive fixa a rochas ou corais mortos, embora algumas

espécies apresentem adaptações para crescerem sobre substrato não consolidado

como fundos areno-lodosos (OLIVEIRA FILHO, 1999).

As macroalgas marinhas ocorrem principalmente fixas às rochas, porém

podem crescer na areia, recifes de coral, raízes de mangue, cascos de barcos, mas

sempre em ambientes com a presença de luz e nutrientes. São muito abundantes na

zona entre-marés, onde formam densas faixas nos costões rochosos. Estas algas

são representadas pelas algas verdes, pardas e vermelhas, podendo apresentar

formas variadas como foliáceas, arborescentes, filamentosas e ramificadas (SOUZA

, 2010) Figura 1.

A classificação de espécie de macroalgas de acordo com a pigmentação foi

feita por Harvey em 1836, sendo utilizada até os dias atuais, designando as

Chlorophytas (algas verdes), Rodophytas (algas vermelhas) e Phaeophyta (algas

pardas).

A importância das macroalgas vai além do fato destas servirem como abrigo

para outros organismos aquáticos, (MARINHO-SORIANO et al., 2011); também são

importantes indicadores do estado trófico, por serem a comunidade que melhor

expressa os efeitos do enriquecimento nas águas abertas, além do que a tolerância

das algas à poluição orgânica está bem documentada (HELAWELL, 1989; ROCHA,

1992). Associado a isto produtos de origem marinha tem sido alvo de constantes

27

descobertas de novos produtos com interesse farmacológico (CABRITA et al., 2010;

ZHANG, et al., 2010).

Estudos de atividades biológicas vem sendo realizados com as três classes

de macroalgas e os resultados ja apontam efeitos como: ação antiinflamatória

(BITENCOURT et al., 2011) antifúngica (BALLESTEROS et al., 1992; STEIN et al.,

2011) e antinociceptiva (SOUZA et al., 2009) .

Dentre muitos trabalhos realizados com componentes isolados de algas pode-

se citar Machado et al. (2010), que realizaram levantamento de diversos

componentes de algas do gênero Laurencia, que apresentaram atividade

antitumoral, antiparasitária, antifúngica, antibacteriana, analgésica e antiviral.

Genoseve et al. (2009), demonstraram atividade leishmanicida de compostos

isolados de algas vermelhas do gênero Asparagopsis e Cavalcante-Silva et al.,

(2012) demonstraram atividade antinociceptiva e antiinflamatória de extrato

metanólico da alga vermelha Bryothamnion triquetrum, dentre outros.

A flora ficológica brasileira começou a ser detalhadamente estudada a partir

de Joly em 1957 no seu trabalho sobre a Baía de Santos, que mantém o principio

taxonômico, mas traz também uma importante contribuição à ecologia descritiva

desse ambiente (OLIVEIRA FILHO, 1977).

Os estudos sobre as comunidades bentônicas iniciaram-se com Oliveira em

1947, descrevendo a distribuição geográfica da fauna e flora de substrato

consolidado na Baía de Guanabara (FILHO et al., 1999).

No ambiente marinho, as algas representam um dos maiores grupos em

termos de diversidade. Do total de 32.000 espécies conhecidas, pelo menos 820

táxons foram identificados ao longo da costa brasileira (MARINHO-SORIANO et al.,

2011).

28

Figura 1- Ilustração do habitat das macroalgas

Fonte: www.algabase.org

2.1.Componentes das Algas

De forma geral as algas sintetizam diversos metabólitos secundários, como

por exemplo Terpenóides (PACHECO et al., 2010), Alcalóides (GUVEN et al., 2010),

Taninos (SERRANO et al., 2009) e Acetogeninas (NARKOWICZ et al.,2006).

As macroalgas marinhas usualmente possuem grandes quantidades de

carboidratos e proteínas, desta forma podem ser consideradas como uma fonte

potencial de nutrientes (RAMOS et al., 1998). Os teores de lipídeos das algas de um

modo geral ficam em torno de 4%, no entanto estas são ricas em ácidos graxos

As algas verdes são abundantes nas proximidades da superfície e também apresentam distribuição mais ampla.

As algas pardas vivem em áreas rochosas afetadas pelas marés e também em profundidades. .

As algas vermelhas vivem em

profundidades que variam de 20 a 100

metros ou mais.

29

insaturados e poli-insaturados que apresentam efeitos benéficos ao homem, como

ácido palmítico, mirístico, oléico, palmitoléico e omega 3 (TABARSA et al., 2012).

Estudos das algas in natura tem demonstrado que elas são fontes de

polissacarídeos e fibras, minerais, proteínas e aminoácidos, lipídios e ácidos graxos,

vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis (MABEAU; FLEURENCE, 1993;

FLEURENCE, 1999). Desta forma, as algas fornecem grande variedade de

compostos com valor nutricional apresentando-se como fonte alternativa para

alimentação humana (FLEURENCE, 2012), são úteis para a fertilização do solo

(BLUNDEN,1991), são usadas em áreas biotecnológicas (LIMA et al., 2004), bem

como, as algas despertam grande interesse por suas potenciais atividades

farmacológicas (MAYER et al., 2011).

A utilização de componentes químicos provenientes de algas é bastante

ampla. Desde 1975, três áreas de pesquisa de produtos naturais aquáticos têm

emergido: toxinas, bioprodutos e ecologia química. Cerca de 15.000 novos

componentes já foram quimicamente determinados e, dentre os bioprodutos,

pesquisas de drogas de fontes naturais sugerem que as algas são um grupo

promissor para descoberta de novas substâncias bioquimicamente ativas ( SINGH et

al., 2005; BLUNT et al.,2006).

Compostos como os polissacarídeos sulfatados-PS são encontrados nas

algas e tem despertado interesse na área de biotecnologia de produtos naturais,

ressaltando os efeito biológicos de tais compostos como: atividade anti-viral

(TALARICO et al., 2005), anti-oxidante, anti-tumoral e anti-inflamatória (CUMASHI et

al., 2007) e ainda na bioprospecção de novos agentes farmacológicos (FONSECA et

al., 2008). As propriedades anticoagulantes dos polissacarídeos tem sido largamente

estudadas, expressando-se nos mais diferentes organismos aquáticos, incluindo as

macroalgas (SOUZA, 2007). Polissacarídeos sulfatados obtidos da alga vermelha

Gelidiella acerosa demonstraram atividade anti-trombótica em modelo de trombose

venosa em ratos (QUEIROZ, 2011).

De acordo com estudos de Beyruth (1996), as algas são também

fundamentais no equilíbrio do ecossistema, uma vez que as avaliações ambientais

em geral são realizadas com objetivo de preservar a qualidade de vida; os seres

vivos são indicadores excelentes da saúde dos ecossistemas. As macroalgas

servem como fonte de nutrientes para uma grande variedade de organismos

30

aquáticos, constituindo-se nos principais consumidores de nitrato e CO2 e liberando

uma grande quantidade de oxigênio para a atmosfera via fotossíntese.

De acordo com Freitas (1994), o problema do bócio endêmico, que atinge

determinadas populações no mundo, poderia ser grandemente diminuído pela

exploração das algas, as quais são portadoras de alto teor de iodo, da ordem de 100

a 40.000 vezes maior que a quantidade existente na água do mar.

No entanto as algas podem apresentar componentes que são tóxicos e

impróprios para o consumo. A presença de toxinas em diversas algas tem interesse

para a saúde pública, pois as mesmas podem provocar envenenamentos em

populações que utilizam algas em sua dieta (OLIANI et al., 2010).

Algumas espécies de algas são naturalmente tóxicas, mas, em condições

normais, não chegam a afetar o ambiente em que vivem. No entanto, quando as

águas em que repousam são envenenadas por dejetos industriais lançados por

fábricas e fertilizantes químicos elas absorvem essas substâncias, e podem se

multiplicar rapidamente, se transformando em uma grande ameaça (SANT'ANA;

AZEVEDO, 2000).

As algas azuis (cianofíceas) são conhecidas por alguns exemplares que ao

liberar um tipo de toxina na água pode contaminar o homem e outros animais. A

eutrofização dos ambientes hídricos, ocasionada principalmente pelo lançamento de

compostos na água (esgoto, fertilizantes), de forma excessiva, aumentam a

população dessas algas e dão origem ao fenômeno chamado floração ou bloom

(SANT'ANA ;AZEVEDO, 2000).

De modo geral as algas apresentam em sua composição aminas

biogênicas, que consistem em compostos orgânicos nitrogenados, alcalinos e de

baixo peso molecular. As aminas podem ser formadas por hidrólise de compostos

nitrogenados, decomposição térmica ou através da descarboxilação de aminoácidos

em resultado do metabolismo normal de vegetais e microorganismos (MAINTZ;

NOVAK, 2007). Após ingestão de alimentos com presença de histaminas e/ou

tiramina efeitos tóxicos e farmacológicos podem ser desencadeados devido as

propriedades vasoativas e psicoativas. A determinação de aminas biogênicas está

relacionada com o potencial tóxico da alga (LARQUÉ et al., 2007).

31

2.2. Efeitos Biológicos das Algas

2.2.1 Atividade anti-inflamatória

A inflamação é definida como a resposta dos tecidos vascularizados a

diferentes estímulos, correspondendo a um mecanismo de defesa que envolve

também o processo de reparo tecidual. Os sinais e sintomas da inflamação

decorrem de alterações microscópicas que ocorrem na microcirculação, como

vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, sensibilização de terminações

nervosas e migração leucocitária para o foco inflamatório (YAMANE et al., 2000). A

auto-regulação do processo inflamatório é um processo dinâmico e controlado,

porém em alguns casos os mecanismos reguladores são alterados podendo

acarretar a destruição tecidual excessiva (MÜLLER, 2002).

Na fase inicial da inflamação as células predominantes são neutrófilo e

macrófago, e em fases mais tardias os monócitos e linfócitos também migram para o

local, amplificando o processo inflamatório. As citocinas, como Interleucinas 1 e 6 e

TNF-alfa e oncostatina M são produzidas no local de inflamação e desempenham

papel crucial na resposta de fase aguda, induzindo a produção de proteínas de fase

aguda pelos hepatócitos (BILATE, 2007).

Algas com comprovado efeito anti-inflamatório podem contribuir positivamente

em todo o processo inflamatório. Dentre estes estudos pode-se citar os

experimentos realizados com algas vermelhas, como a Lithothamnion calcareum

que demonstrou ação inibitória sobre o rolamento de leucóticos, etapa fundamental

para o desencadeamento da fase aguda da inflamação (SOARES, 2009).

Albuquerque (2005) verificou atividade anti-inflamatória de polissacarideos da alga

marrom Dictyota mentrualis, através da inibição da migração de neutrófilos para

cavidade peritoneal em camundongos. Efeito anti-inflamatório e cicatrizante foi

observado por Silva et al. (2010), que avaliaram compostos isolados da alga

vermelha Pterocladiela capillacea em feridas de ratos. Matta et al. (2011), verificaram

ação anti-inflamatória dos extratos hexânico e metanólico, inibindo a migração

celular na cavidade peritoneal, em modelo de inflamação causada por carregenina,

de duas algas do gênero caulerpa, a C. Mexicana e C. sertularioides. Bittencourt et

al (2011), avaliaram extratos aquoso e metanólico da alga verde Caulerpa mexicana

in vitro e in vivo verificando inibição da liberação de citocinas a partir de macrófagos

e redução na migração de leucócitos peritoneais.

32

2.2.2. Atividade anti-nociceptiva

O Sistema nervoso sensorial é responsável pela análise dos estímulos

desencadeados no organismo, tendo a função de informar o SNC sobre o estado

dos ambientes externo e interno do corpo. A sensação de dor consiste em sistema

de alarme cuja função é proteger o organismo de uma lesão tecidual, através da

ativação de mecanismos que envolvem vias reflexas medulares e supramedulares

(JULIUS, BASBAUM, 2001). Dessa forma o sistema nervoso sensorial capacita o

organismo à nocicepção e à dor propriamente dita (TREEDER et al., 2008). A

nocicepção é um termo neurofisiológico que se refere somente à percepção

sensorial do sistema nervoso central (SNC), evocada pela ativação de receptores

sensoriais especializados, que são os nociceptores existentes no local do estímulo.

A dor, por sua vez envolve funções cerebrocorticais com ativação dos componentes

discriminativo, afetivo-emocional, cognitivo e locomotor (RIEDEL; NEECK, 2001).

Diversos estudos realizados com algas in natura e com seus componentes

isolados tem demonstrado atividade anti-nociceptiva. Abreu, (2012) verificou

atividade anti-nociceptiva da lectina da alga vermelha Solieria filiformis em

camundongos observando controle da dor através de mecanismos periféricos.

Cavalcante-Silva et al. (2012), verificaram ação antinociceptiva do extrato metanólico

da alga vermelha Bryothamnion triquetrum. Matta et al. (2011), verificaram ação anti

nociceptiva de extratos obtidos de algas do gênero Caulerpa, dentre elas a

C.Mexican e C. sertularioides. Souza et al. (2009), avaliaram a atividade

antinociceptiva da caulerpina, uma alcalóide isolado da Caulerpa racemosa,

verificando que a mesma inibiu as contrações abdominais induzidas por ácido

acético com IC50 de 0,0945µmL, não mostrando diferença significativa para a droga

controle que foi a dipirona.

2.2.3. Atividade Anti-oxidante

O estresse oxidativo tem sido implicado em mecanismos fisiopatológicos

relacionados com a continuidade e as complicações de diversos estados patológicos

como diabetes, o câncer, a artrite reumatóide dentre outros, de modo que uma

terapia antioxidante preveniria o desenvolvimento e a progressão dessas

complicações (NORDBERG ;ARNER, 2001).

33

Diversos componentes fisiológicos são conhecidos pela capacidade de

neutralizar radicais livres, tais como o α-tocoferol, β –caroteno, ácido úrico, dentre

outros (MATKOVICS, 2003). Substâncias de origem natural que apresentam

atividade inibidora e neutralizadora de radicais livre são muito utilizadas como

agentes antioxidantes exógenos (NORDBERG e ARNER, 2001).

As algas marinhas representam uma importante fonte de substâncias

antioxidantes naturais. Diversas espécies de algas já demonstraram essa atividade

(ROCHA et al., 2007). Novoa et al. (2001), mostraram os resultados da avaliação da

atividade inibidora da peroxidação lipídica do extrato aquoso da alga marinha

vermelha Bryothamnion triquetrum.

As algas pertencentes ao filo Clorophyta, em particular, apresentam maior

quantidade de carotenóides e clorofila a que são conhecidos por atuar como

antioxidantes in vitro (NAGUIB, 2000).

2.2.4. Fonte Nutricional

Algas são fonte de proteínas, vitaminas e sais minerais importantes na

alimentação humana. Devido ao alto teor de proteínas e fibras e reduzido valor

calórico as algas podem ser uma fonte alternativa como nutriente para alimentação

humana (FLEURENCE et al., 2012).

Carneiro et al., (2012) avaliaram o potencial nutricional de algas vermelhas(

Rodophytas) verificando valores de proteína entre 17 e 20%. Estes valores são

comparáveis aos de espécimes de sementes de leguminosas comestíveis no Brasil

como feijão-preto (23,2%) (VASCONCELOS et al., 2010).

2.2.5. Efeitos Renais

Os rins realizam grande variedade de funções para o organismo, sendo a

maioria delas essencial para a vida. Dentre estas funções pode-se citar: regulação

do equilíbrio hídrico e eletrolítico, excreção de restos metabólicos, excreção de

substâncias vasoativas (hormônios), regulação da pressão arterial, regulação da

produção de células vermelhas sanguíneas, regulação da produção da vitamina D e

gliconeogênese. Na estrutura do rim existem mais de 1 milhão de néfrons e cada

néfron apresenta um componente esférico chamada corpúsculo renal ( CR) e um

34

túbulo que se estende a partir deste. O corpúsculo consiste do glomérulo envolto

pela cápsula de Bowman. O fluxo sanguíneo no rim inicia-se pela artéria renal que

se ramifica em artérias interlobares, arqueadas e corticais. Nos capilares

glomerulares o sangue flui através das arteríolas aferentes e deixa o rim através das

arteríolas eferentes (EATON, 2005). O principal mecanismo de alterações no fluxo

sanguíneo renal é através de modificações na resistência das arteríolas aferente e

eferente (CONSTANZO, 2004).

O rim possui uma função muito importante para o organismo que é a

excreção. A excreção renal consiste em retirar do sangue restos metabólicos e

excesso de substâncias ingeridas, dentre estas, resíduos nitrogenados como a uréia

e creatinina. A taxa média de excreção destes compostos reflete a taxa em que são

lançadas no sangue a partir de processos metabólicos.

Estudo de toxicidade aguda com a macroalga vermelha Solieria filiformis não

evidenciou alterações do peso do rim ou dos níveis de uréia avaliados após 7 dias

da administração do extrato da alga em camundongos por via intravenosa (ABREU,

2012). Resultados semelhantes foram obtidos com os testes de toxicidade aguda da

Pterocladiella capillacea, não verificando alterações nos níveis de uréia. No entanto

trabalhos com microalgas tem demonstrado efeito tóxico renal expressivo. Nobre et

al, 2003, ao estudar efeitos renais de uma cianotoxina produzida por microalga,

chamada Microcistina –LR, observaram deposição de material proteináceo nos

espaços urinários e alterações glomerulares.

2.3. ALGAS VERDES (Chlorophytas)

A divisão Chlorophyta, representa de um modo geral o grupo mais

diversificado dentre todas as algas (morfologia e ciclo de vida), com

aproximadamente 17.000 espécies que estão distribuídas em diversos ambientes

costeiros do mundo. As algas Chlorophytas são denominadas de algas verdes por

apresentarem maior intensidade da clorofila em relação aos outros pigmentos.

Embora a grande maioria seja aquática, elas também podem ser encontradas em

outros ambientes (neve, tronco de árvores, solos etc), sobrevivendo em condições

adversas como ambientes sujeitos a variações extremas de salinidade (RAVEN et

al., 2001).

35

De acordo com critérios ultraestruturais modernos as algas verdes estão

subdivididas em quatro classes: Prasynophyceae, Charophyceae, Ulvophyceae e

Clorophyceae (LEE, 2008).

Diversos estudos apontam diferentes atividades biológicas com algas verdes

(Quadro 1). O filo Chlorophyta por apresentar clorofilas a e b, xantofilas e carotenos

(principalmente, o β-caroteno), são implicadas na inibição de radicais livres em

testes in vitro (NAGUIB, 2000).

Raymundo et al. (2004), avaliaram extratos metanólicos de algas verdes

(Clorophytas) verificando nestas algas a presença de compostos carotenóides,

fenólicos e clorofilas. Os extratos metanólicos inibiram a peroxidação lípidica (cerca

de 70 % ou mais), embora o percentual de inibição tenha sido inferior ao

antioxidante sintético. As espécies de algas estudadas foram Codium decorticatum,

Enteromorpha intestinalis, Ulva fasciata e Chaetomorpha antenina, e o maior

percentual de inibição (75,75%) foi obtido com o extrato metanólico da espécie E.

intestinalis.

OLIANI et al. (2010), avaliaram a ação da fração polar da Bryopsis pennata

em coração de rãs da espécie Rana Catesbeiana. Essa espécie de alga produz uma

defesa química tóxica para organismos herbívoros e tem potencial de se tornar

invasiva e dominante em condições ambientais favoráveis. Os resultados desse

trabalho demonstraram um efeito inotrópico positivo reversível pelo propanolol, um

beta-bloqueador não seletivo, indicando uma ação indireta da fração polar da alga,

ou seja, atuando via receptores noradrenérgicos.

Mendes et al. (2010), avaliaram a atividade antiviral de extratos da alga

verde Ulva fasciata em replicação do metapneumovirus humano (HMPV). O HMPV é

um virus da familia paramyxoviridae, e está implicado na gênese da infecção

respiratória em crianças. Os resultados mostraram que os extratos metanólico,

clorofórmico e aquoso foram eficazes em inibir o virus por um ou mais mecanismos

de ação: impossibilitando a atividade viral, bloqueando receptores celulares,

evitando a entrada do virus na celula ou inibindo diretamente a atividade intracelular.

Dentres as espécies de algas verdes as do gênero Caulerpa possuem

grande facilidade de adaptação às variações ambientais e apresentam crescimento

e propagação rápida, sendo considerada por muitos pesquisadores como algas

invasoras, provocando desequilibrio ecológico, principalmente na costa da Ásia e

Mediterrâneo (BULLERI et al., 2010).

36

Estudos vem demonstrando grande diversidade de efeitos biológicos de

algas do gênero Caulerpa. Matta et al. (2011), verificaram ação antiinflamatória e

antinociceptiva de extratos metanólico, hexânico e cloroformio da Caulerpa

mexicana e C. sertularioides.

Quadro 1 . Resumo das Atividades Biológicas de Algas Verdes (Clorophyta)

Espécie avaliada Atividade biológica Referências

-Codium decorticatum,

Enteromorpha intestinalis, Ulva

fasciata e Chaetomorpha

anteninha.

-Antioxidante -(Raymundo et al., 2004)

-Caulerpa mexicana e

C. sertularioides.

-Antiinflamatória e anti-

nociceptiva

-(Matta et al., 2011).

-Ulva pertusa. -Antioxidante -(Kang et al, 2004)

-Caulerpa cupressoides. -Antibacteriana (S.epidermidis) -(Lima-Filho et al. ,2002)

-Caulerpa cupressoides. -Antibacteriana (E.coli) -(Ravikumar et al., 2002).

-Ulva fasciata -Anti viral (Metapneumovirus

Humano)

-(Mendes et al., 2010).

Figura 2-Exemplares do gênero Caulerpa: A- C. taxiofolia; B- C. racemosa

A B

Caulerpa taxifolia Caulerpa racemosa

Fonte-http://www.monmaraquarium.cl/algas/index.htm

37

2.3.1.Caulerpa cupressoides

A Caulerpa cupressoides trata-se de uma alga pertencente ao filo

Chlorophyta, classe Ulvophyceae, família Caulerpaceae, e ocorre principalmente em

mares tropicais (NIELSEN et al., 2001). A classificação taxonômica da C.

cupressoides está demonstrada no Quadro 2. As espécies da família Caulerpaceae

são algas verdes e que apresentam grande variedade em sua forma, podendo

assumir aspecto de salsichas, guarda-chuvas, dentre outros (Figura 2A e 2B). As

algas verdes são abundantes em ambientes aquáticos, sendo um dos mais

importantes componentes do fitoplâncton, responsáveis pela produção da maior

parte de oxigênio disponível a partir da fotossíntese e contém pigmentos clorofilas a

e b, carotenos e xantofilas (LORENZO, 2010).

A Caulerpa cupressoides como exemplar de um grupo de algas marinhas

bentônicas possui características gerais como a presença de um talo rastejante

formado por uma porção rizomatosa que se espalha ao longo da superfície do

substrato, fixando-se através de tufos de rizóides. Ao longo da porção rizomatosa

são encontrados ramos eretos, também chamados de assimiladores que são

ramificados (Figura 3). A diferenciação entre espécies de Caulerpa encontra-se na

morfologia característica dos assimiladores (JOLY, 1965; SZE, 1997).

Espécies do gênero Caulerpa, são conhecidas por sua capacidade de

colonizar grandes áreas em diversas costas do mundo (TEIXEIRA., 2012a). Estas

algas podem se desenvolver em qualquer tipo de substrato e sua multiplicação é

favorecida pela capacidade de sintetizar toxinas como a caulerpina (GALGANI et al.,

1996).

Estudo de composição centesimal da C. cupressoide revelou umidade

(12,21%), cinzas (11,28%), proteinas (20,79%), lipideos (2%), e carboidratos

(53,72%) (CARNEIRO et al., 2012).

Em estudo prévio com um grupo de algas brasileiras demonstrou-se que

extratos da Caulerpa cupressoides (Vahl), exibiam atividade hemaglutinante e

atividade enzimática em eritrócitos de coelhos (AINOUZ et al.,1991).

Ravikumar et al. (2002), testando extratos de algas contra patógenos

resistentes a antibicoterapia em infecções no pós-operatório, verificaram a ação do

extrato acetônico da alga Caulerpa cupressoides demonstrando atividade inibitória

contra Escherichia coli.

38

Lima-Filho et al. (2002), avaliaram o efeito antibacteriano de algas

pertencentes ao filo Clorophyta, dentre elas da alga Caulerpa cupressoides,

verificando um efeito expressivo do extrato hexânico contra bactérias gram positiva.

Nos estudos de toxicidade com algas verdes, a espécie Caulerpa

cupressoides foi avaliada com mais doze especies de algas verdes com relação a

quantidade de aminas biogênicas, que podem ter efeitos tóxicos no organismo. Os

resultados mostraram presença de histamina, em pequena quantidade e ausência

de tiramina. De acordo com os autores a quantidade de histamina presente não é

suficiente para provocar sintomas de intoxicação pelo seu consumo (ALENCAR et

al., 2011).

Figura 3. Ramos da Caulerpa cupressoides

Fonte :www.algabase.org

39

Quadro 2. Classificação taxonômica da Alga Caulerpa cupressoides

Reino: Plantae

Filo: Chlorophyta (alga verde) Classe: Ulvophyceae

Ordem: Bryopsidales

Família: Caulerpaceae

Gênero: Caulerpa (Weber-Van Bosse, 1898)

Epíteto específico: cupressoides

Espécie: Caulerpa cupressoides var. Lycopodium

(Weber-Van Bosse, 1898)

Fonte:(www.itis.gov/2012).

2.4 ALGAS VERMELHAS (Rhodophyta)

Em muitos países, principalmente nos asiáticos as macroalgas tem sido

utlizadas na alimentação tradicional. Atualmente cerca de 140 espécies de

macroalgas são utilizadas na alimentação humana. As características associadas

aos benefícios do seu consumo tem sido alvo de investigação científica

(FLUERENCE et al., 2012).

Carneiro et al. (2012), avaliaram o potencial nutricional de duas algas

vermelhas, a Hypnea musciformis e Solieira filiformis, verificando teores elevados

de cinza, altos níveis de minerais, boas quantidades de fibras e de proteína bruta, e

baixos índices de lipídios totais, demonstrando que ambas tem composições

nutricionais favoráveis para uma alimentação humana adequada.

Diversos estudos já foram realizados com espécimes de algas vermelhas

verificando diferentes efeitos biológicos (Quadro 3).

MACHADO et al. (2008), testaram o extrato bruto e metabólitos secundários

de uma alga vermelha do gênero Laurência contra a forma promastigota da

Leishmania amazonensis, obtendo uma IC50 de 24,09 ± 1,6 μg/ml. Estudos de

triagem com o gênero Laurencia evidenciou diversas atividades biológicas de seus

40

metabólitos secundários, entre eles ação citotóxica, antitumoral, antibacteriana,

antifúngica, antiparasitária e antiviral (MACHADO et al., 2008).

Estudos tem demonstrado atividade anti-parasitária contra Leishmania e

Trypanossomo com utilização de extratos e compostos isolados de algas vermelhas

(NARKAWICZ et al., 2004; FELICIO et al., 2010). Felicio et al., (2010), verificaram

atividade tripanocida e antifúngica de frações não polares da alga vermelha

Bostrychia tenella.

Rocha et al. ( 2011), verificaram atividade da fração diclorometano da alga

vermelha Centroceras clavulatum contra formas epimastigota (IC50 = 19.1 μg.mL−1)

e trypomastigota de T. cruzi (IC50 = 76.2 μg.mL−1). As frações dos extratos hexânico

e acetato de etila dessa mesma alga mostraram atividade antifúngica sobre as

espécies Cladosporium cladosporiodes e C. sphaerospermum.

A formação de radicais livres e outros derivados ativos do oxigênio são

eventos inevitavelmente decorrentes de algumas reações biológicas e embora

exerçam papel fisiológico importante estão envolvidos em vários processos

deletérios ao organismo humano como o câncer, a aterosclerose, a artrite

reumatóide, a distrofia muscular, a catarata, as desordens neurológicas e o processo

de envelhecimento (NORDBERG ; ARNÉR, 2001).

Fallarero et al. (2003), avaliaram a capacidade dos extratos aquosos de

Bryothamnion triquetrum, uma alga vermelha, e de Halimeda incrassata, alga verde,

coletadas em Havana/Cuba, em reduzir a formação de espécies reativas de

oxigênio-EROs intracelular sob condições oxidativas basais, usando uma linhagem

de células de hipotálamo de camundongo GT1-7. Avaliou-se ainda o efeito protetor

dos extratos destas duas algas contra estímulos químicos (H2O2 e CH3HgCl) que

induzem morte neuronal através de mecanismos envolvendo formação de EROs e

depleção de glutationa reduzida (GSH). Ambos os extratos, em concentrações

superiores a 0,20 mg/mL, exerceram proteção contra os efeitos deletérios e morte

celular induzidos por H2O2.

As algas marinhas representam uma importante fonte de substâncias

antioxidantes naturais. Diversas espécies de algas já demonstraram atividade

antioxidante e dentre estas as algas vermelhas: Gelidium amansii, Gloisiphonia

capillaris, Polysiphonia urceolata e Rhodomela teres (ROCHA et al, 2007).

41

Quadro 3. Resumo das Atividades Biológicas de Algas Vermelhas (Rodophytas)

Espécie avaliada Atividade biológica Referências

-Laurência -Leishmanicida, citotóxica, antitumoral,

antibacteriana, antifúngica,

antiparasitária e antiviral

-(Machado et al, 2008)

-Bostrychia tenella . -Anti parasitária e leishmanicida -(Felicio, 2010).

-Centroceras clavulatum -Anti parasitária (T.cruzi) e anti fúngica -(Rocha et al, 2011).

-Bryothamnion triquetrum

e Halimeda incrassata

-Antioxidante e Neuroprotetora -(Fallarero et al 2003).

-Gelidiella acerosa

-Anti -trombótica - (Queiroz,2011).

-Pterocladiela capillacea

-Anti-inflamatória e Anti-nociceptiva -(Silva et al 2010).

-Bryothamnion triquetrum -Antioxidante -(Novoa et al, 2001).

2. 4.1. Pterocladiella capillacea

A. Pterocladiela capillaceae é uma alga pertencente ao Filo Rhodophyta,

Classe Florideophyceae, Ordem Gelidiales, Familia Gelidiaceae, Gênero

Pterocladiella (Figura 4) A classificação Taxonômica da P. capillacea esta

demonstrada no quadro 4.

A Pterocladiela capillacea pertence a uma família de algas vermelhas, de

crescimento ereto, que medem em torno de 15-21cm de altura e vivem fixas a

rochas por meio de uma porção rizomatosa cilíndrica, da qual saem ramos eretos,

que na região da base tem formato cilíndrico e se achatam para o ápice (Figura 5A).

Os ramos eretos principais são ramificados sendo que estas ramificações tornam-se

mais curtas em direção ao ápice, de forma que a fronde adquire aparência triangular

(Figura 5B). Nos eixos principais os segmentos achatados do talo apresentam 0,5 a

1,2 mm de largura; em eixos laterais esta largura é de 0,3 a 1 mm. No que diz

respeito ao habitat, são gregárias, habitam especialmente costões rochosos virados

para o mar aberto, ficando expostas durante a maré baixa (JOLY,1965).

Em trabalho realizado por Oliveira et al (2002), isolou-se uma lectina da

Pterocladiela capillaceae, verificando efeito coagulante da mesma sobre eritrócitos

de coelhos.

Diversos estudos utilizam extratos das algas como método de avaliação de

efeitos tóxicos em outros organismos, sendo esta metodologia utilizada amplamente

42

em pesquisas para detectar toxicidade preliminar de algas marinhas (ARA et al.,

1999), realizar triagem de toxinas fúngicas (HARWIG e SCOTT, 1971), e avaliar

efeitos de exposição a metais pesados (MARTINEZ et al., 1999) e pesticidas (

LHULLIER et al., 2006).

Em estudo realizado por Lhullier et al. (2006), os extratos etanólicos foram

submetidos ao teste de letalidade para larvas de Artemia salina com objetivo de

realizar uma triagem das espécies de algas e dentre as algas avaliadas, as pardas

mostraram mais toxicidade. Dentre as algas vermelhas (Rhodophytas), a espécie

Pterocladiella capillacea mostrou menor efeito tóxico, com CL50 inferior a 50 μg/mL.

Silva et al. (2010), verificaram atividade anti-inflamatória e anti-nociceptiva de

lectina isolada da Pterocladiella capillacea.

Figura 4 .Exemplar da Pterocladiela capillacea

Fonte http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/algas/algas-2.php.

43

Figura 5. A-Pinulas da alga P.capillacea B- Ramos da alga P.capillaceae

A B

Fonte http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/algas/algas-2.php

Quadro 4. Classificação Taxonômica da Alga Pterocladiella capillacea

Reino: Plantae

Filo: Rhodophyta

Classe: Florideophyceae

Ordem: Gelidiales

Família: Pterocladiaceae

Gênero: Pterocladiella (S.G.Gmelin) Santelices & Hommersand 1997

Epíteto específico: capillacea

Nome botânico: Pterocladiella capillacea

(S.G.Gmelin) Santelices & Hommersand

Fonte:-www.algaebase.org search/species/detail/?species_id=106

http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=97240






44

2.5. LECTINAS

Dentre as diferentes classes de componentes com atividade bioquímica

encontradas nas algas marinhas, as lectinas ou aglutininas tem se destacado por

diversas atividades biológicas. O termo lectina (originado do latim “lectus”, que

significa selecionado) refere-se à habilidade dessas proteínas ligarem-se

seletivamente e reversivelmente a carboidratos (LIS; SHARON 1998).

Estas proteínas foram descritas inicialmente por Stillmark em 1888, que ao

estudar o efeito tóxico de extratos de semente de mamona (Ricinus communis)

verificou efeito hemaglutinante, sendo confirmado posteriormente que este efeito era

causado por uma proteína chamada ricina. Atualmente, sabe-se que a ricina é na

verdade uma complexa mistura de moléculas tóxicas e lectinas não-tóxicas. Boyd,

em 1954, definiu as lectinas como aglutinadoras de grupos sanguíneos específicos.

As lectinas são encontradas em ampla gama de organismos, sendo

vastamente distribuídas na natureza, podendo ser encontradas em animais, insetos,

plantas e microorganismos (SHARON & LIS,1989). Apesar disso, elas dividem em

comum a propriedade de ligar-se a estruturas definidas de açúcares, mas

apresentam diferentes funções. A especificidade de ligar-se a carboidratos de forma

reversível tem sido de muito interesse para as diversas aplicações em estudos de

imunologia e histoquímica, assim como a caracterização de estruturas de

glicoconjugados ou de açúcares da superfície celular (ANDRADE et al., 2004). A

característica das lectinas de se ligarem a carboidratos específicos permite utilizá-las

para tipagem de grupos sanguíneos e como marcadores celulares com o intuito de

diagnosticar agentes infecciosos como os vírus, bactérias e fungos (RUDIGER;

GABIUS, 2001). As lectinas por se ligaram à superfície de mucosas podem ser

utlizadas como bioadesivos, além de outras utilidades farmacêuticas (JEPSON et al.,

2004). Estas estão implicadas no reconhecimento de células tumorais, na

localização e adesão celular, estimulação mitogênica, citotoxicidade e apoptose

(WANG et al., 2000).

As lectinas são tidas como proteínas não imunológicas, capazes de ligar-se

a diversos tipos de carboidratos de membranas celulares (WEIS et al.,1996). A

capacidade de aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados deve-se a

propriedade específica de reconhecimento e ligação sem, entretanto, alterar a

estrutura de nenhum glicosil ligante (GOLDSTEIN et al., 1978). Sabe-se que cada

45

lectina possui pelo menos um sítio de ligação a carboidratos, também chamado de

domínio de reconhecimento de carboidratos, ou CRD (“carbohydrate recognition

domain”) (BUZZO, 2007).

As lectinas mais amplamente estudadas possuem duas origens: as obtidas das

plantas e as obtidas de algas. As lectinas obtidas das algas diferem de outras

lectinas, como por exemplo a obtida de plantas, não somente em suas propriedades

como também quanto ao domínio (PEUMANS; VAN DAMME,1995).

De acordo com a estrutura geral das proteínas, as lectinas são subdivididas em

Merolectinas, Hololectinas, Quimerolectinas e Superlectinas. As Merolectinas

possuem um sítio de ligação para carboidratos, são pequenas e de único peptídeo, e

não possuem a capacidade de aglutinar células devido à sua natureza monovalente.

Exemplo é a lectina de orquídea. As Hololectinas por sua vez apresentam múltiplos

sítios de ligação a carboidratos, são capazes de aglutinar células ou precipitar

glicoconjugados, estão em sua maioria, presentes em plantas e são também

conhecidas como hemaglutininas ou fitohemaglutininas. As Quimerolectinas

possuem um ou mais sítios de ligação à carboidratos e possuem atividade catalítica

e as Superlectinas apresentam dois ou mais domínios carboidratos-ligantes, porém,

com diferentes especificidades. A maior parte dessas lectinas é encontrada em dois

grandes grupos: os grupos das plantas e animais superiores, mas algumas ainda

não foram encontradas em algas marinhas (PEUMANS ; VAN DAMME,1995).

Lectinas de Plantas

São proteínas ou substâncias glicoprotéicas de origem vegetal que se ligam

as porções de açúcar das paredes ou membranas celulares. Algumas proteínas

metabolizadoras de carboidratos (enzimas) de plantas, também se ligam aos

carboidratos, entretanto não são consideradas lectinas. Várias lectinas de plantas

alteram a fisiologia da membrana das células sanguíneas por causar aglutinação,

mitose ou outras mudanças bioquímicas. Elas podem desempenhar um papel no

mecanismo de defesa da planta (Descritores em ciências da saúde- Biblioteca virtual

em saúde/2012).

Lectinas de Algas

As lectinas de algas diferem de lectinas de plantas em diversas propriedades.

No geral, as lectinas de algas tem baixa massa molecular, tornando-se menos

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46

antigênica, e não apresentam afinidade por açúcar simples, mas são mais

especificas para complexos oligossacarídeos, em geral proteínas (HORI et al.,

2000). As lectinas de algas não necessitam de cátions divalentes para exercerem

suas atividades biológicas (ROGERS; HORI, 1993), além do que ocorrem

principalmente na sua forma monomérica e tem elevada proporção de aminoácidos

(HORI et al., 1990).

A capacidade de hemaglutinação é uma característica largamente estudadas

das lectinas de algas. A presença de hemaglutininas em extratos de algas marinhas

foi descrita pela primeira vez por Boyd et al. (1966). No estudo verificaram que seis

algas pardas (Phaeophyceae) e uma verde-azul (Cyanophyceae) aglutinaram

eritrócitos dos grupos A e O, uma alga verde (Chlorophyceae) e duas algas pardas

aglutinaram eritrócitos de todos os grupos, uma alga vermelha (Rhodophyceae)

aglutinou apenas eritrócitos humanos do grupo A e as demais estudadas não

apresentaram atividade (SAMPAIO et al., 1993).

Em estudo realizado por Benevides et al (2001), verificou-se que a lectina

obtida da Caulerpa cupressoides demonstrou capacidade de aglutinação de

eritrócitos de humanos e outros animais, sendo mais ativa contra eritrócitos de

humanos com sangue tipo A. No referido estudo a lectina isolada mostrou alta

concentração de glicina e serina, e com 11,05% de carboidrato, sugerindo tratar-se

de uma glicoproteína.

Pesquisas vem demonstrando que as algas são organismos promissores em

compostos bioativos. Dentre as diferentes classes de compostos com notáveis

atividades biológicas, as lectinas de algas surgem como uma classe importante de

produtos naturais (CARDOZO et al., 2007).

O trabalho de Ziółkowska e Wlodawer (2006), demonstrou a atividade antiviral

da lectina obtida da alga vermelha Griffithsia sp. Observou-se nesta lectina a

presença de múltiplos açúcares, sendo estes responsáveis pela ligação a moléculas

de carboidratos complexas presentes nos envelopes virais.

Estudos com a lectina da alga vermelha Eucheuma serra induziu a morte

celular em células cancerígenas humanas através da fragmentação do DNA em

adenocarcinoma de colo (células colo 201) (SUGAHARA et al., 2001).

Holanda et al. (2005), verificaram que a lectina obtida da alga vermelha

Solieria filiformis inibiu o crescimento de bactérias gram negativa, como Salmonella

typhi, Klebisiela pneumoniae, Enterobacter aorogenes, Proteus sp. e Pseudomonas

47

aeruginosa. Os resultados apontam que a ação da lectina sobre bactérias gram

negativa deva-se a interação desta com glicoconjugados presentes na parede da

célula bacteriana.

Neves et al. (2007), avaliaram a atividade antinociceptiva da lectina obtida da

alga vermelha Amansia multifida, verificando potente ação antinociceptiva central e

periférica, indicando a lectina como possível droga com potencial ação analgésica.

Vanderlei et al. (2010), a partir de estudos utilizando um modelo de indução

da inflamação em camundongos, verificaram efeito antinociceptivo e antiinflamatório

da lectina isolada da Caulerpa cupressoides.

48

3. JUSTIFICATIVA

O Reino Plantae é responsável por uma grande diversidade de compostos

catalogados na literatura que tem contribuído significativamente para a pesquisa e

descobertas de novos fármacos de origem natural bem como fornecendo suprimento

de substâncias úteis para tratamento de doenças (VUORELLA, 2004; AGRA, 2008).

Dentre estes exemplares, as algas vem sendo amplamente estudadas despertando

interesse na área de biotecnologia de produtos naturais, indústria de alimentos

(MAMATHA et al., 2007), área de cosméticos e na bioprospecção de novos agentes

farmacológicos (FONSECA et al., 2008).

Diferentes atividades farmacológicas das macroalgas tem sido relatadas tais

como: atividade antibacteriana (LIMA-FILHO et al., 2002; LI, 2009), antitumoral

(MACHADO et al., 2010; TASKIN et al., 2010), antiangiogênica (DIAS et al., 2005;

MATSUBARA et al., 2005), antiviral (MAYER et al., 2009; ROMANOS et al.,2005),

antioxidante (ROCHA et al., 2007) e leishmanicida (GENOVESE et al., 2008) dentre

outras.

De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) a produção

mundial de plantas aquáticas provenientes da aquicultura foi de 15.781.159

toneladas em 2008, gerando US$ 7.425.929. Dessa produção cerca de 84% foram

de algas, sendo que as algas pardas contribuíram com 6.626.440 toneladas, as

vermelhas com 6.588.144 toneladas e as verdes com 26.017 toneladas (FAO, 2010).

O Brasil possui uma enorme biodiversidade aquática e terrestre e as algas

marinhas representam um dos maiores grupos em termos de diversidade. Do total

de 32.000 espécies conhecidas, pelo menos 820 táxons foram identificados ao longo

da costa brasileira (MARINHO-SORIANO et al., 2011). Na ficoflora brasileira tem-se

diversos exemplares de algas com interesse na indústria alimentícia e farmacêutica,

visto que estudos já demonstraram que elas são fontes de polissacarídeos e fibras,

minerais, proteínas e aminoácidos, lipídios e ácidos graxos, vitaminas

hidrossolúveis, lipossolúveis (FLEURENCE,1999) e α, β-carotenos (SOUSA, 2008)

No litoral nordestino há uma grande diversidade de espécies de macroalgas,

isto se dá em decorrência da presença de costões rochosos e recifes, onde elas

crescem presas a um substrato. A maior diversidade destas macroalgas encontra-se

em uma região que vai desde a costa do estado do Ceará até parte do litoral do Rio

de janeiro (LIMA-FILHO, 2002).

49

Os estudos que cercam as macroalgas verificaram que alguns exemplares da

região nordeste apresentam compostos com diversas atividades biológicas, dentre

elas as espécies do gênero Caulerpa e Pterocladiella, que são abundantes na costa

cearense e que já demonstrou-se em estudos prévios conter lectina com atividade

hemaglutinante. Entre as espécies do gênero Caulerpa, estudos mostraram alguns

efeitos biológicos, como ação anti-inflamatória e anti-nociceptiva da espécie

Caulerpa cupressoides (VANDERLEI, 2010). Atividade cicatrizante e anti-edematosa

foram verificadas com a lectina da Pterocladiella capillacea (SILVA, 2012).

No entanto, no Brasil as pesquisas com macroalgas ainda são pouco

exploradas diante de toda a diversidade da flora marinha brasileira. Embora estudos

com algas tenha demonstrado o amplo papel biológico de vários componentes das

mesmas, bem como, a utilização destes em larga escala na indústria farmacêutica e

alimentícia, ressalta-se a importância do estudo de toxicidade destas espécimes,

que constitui-se um problema de saúde pública. É necessário maior estudo sobre

componentes específicos com atividades biológicas, e dentre eles proteínas como

as lectinas, que possam ser utilizadas como verdadeiras ferramentas

farmacológicas.

50

4. OBJETIVOS

4.1 GERAL:

Estudar os efeitos renais e vasculares das lectinas das algas Caulerpa

cupressoides e Pterocladiella capillacea.

4.2 ESPECÍFICOS

Avaliar os efeitos renais das lectinas das algas Caulerpa cupressoides e

Pterocladiela capillacea.

Avaliar atividade citotóxica in vitro das lectinas das algas Caulerpa

cupressoides e Pterocladiela capillacea

Avaliar os efeitos das lectinas das algas Caulerpa cupressoides e

Pterocladiela capillacea na Pressão Arterial Média e Frequência Cardíaca.

Avaliar efeito da lectina da alga Caulerpa cupressoides em Ensaio de Artéria

Mesentérica.

51

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1.MATERIAL

5.1.1 Algas Marinhas

Os exemplares das algas Caulerpa cupressoides e da Pterocladiella

capillacea foram coletados da costa atlântica do Brasil, das praias de Pacheco,

município de Caucaia e Flecheiras no município de Trairi, no estado do Ceará. As

exsicatas das algas Caulerpa cupressoides e da Pterocladiella capillacea foram

depositadas no Herbário Prisco Bezerra, da Universidade Federal do Ceará sob o

número 4979 e 35140, respectivamente.

As amostras das algas foram encaminhadas ao laboratório de Carboidratos e

Lectinas (CARBOLEC) do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Ceará. No laboratório, as algas foram higienizadas, ou seja,

foram retirados epífitas e/ou organismos incrustantes, posteriormente foram lavadas

com água destilada e armazenadas em frascos fechados a 20º C para posterior

extração das lectinas.

As lectinas foram purificadas no CARBOLEC sob supervisão da Profa. Dra.

Norma Benevides.

5.1.2 Células Sanguíneas

A coleta de sangue foi realizada em coelho albino, adulto, macho sadio,

mantido no biotério do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Ceará.

5.1.3 Animais e Grupos Experimentais

Utilizou-se ratos Wistar, adultos machos, pesando entre 250 e 300g, oriundos

do biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal

do Ceará. Os animais foram mantidos em jejum alimentar de 24 horas antes dos

experimentos e com fornecimento de água “ad libitum”.

Nos experimentos de perfusão renal com as lectinas da Caulerpa cupressoides

(LCc) e Pterocladiella capillacea (LPc) foram utilizados dois grupos de seis animais e

o controle externo (n=6) foi realizado somente com a solução perfusora de Krebs-

Henseleit modificada.

52

Nos experimentos de pressão arterial com as lectinas da Caulerpa

cupressoides (LCc) e Pterocladiela capillacea (LPc) utilizou-se dois grupos de

animais com n=4.

No ensaio de artéria mesentérica com a lectina da Caulerpa cupressoides

(LCc) os experimentos foram realizados em duplicata utilizando-se dois animais

(n=4).

5.1.4 Células MDCK

As células utilizadas foram Células Tubulares Epitelias Renais de Cães (Madin-

Darby Canine Kidney Cells) cedidas pelo Laboratório de Bioquímica do Instituto de

Química da Universidade de São Paulo - USP.

5.1.5 Substâncias e Reagentes

As substâncias utilizadas foram:

Na extração e purificação das lectinas: Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 (TB), Nitrogênio

líquido, NaCl (Synth) 0.5 M; NaCl a 0,15M.Glicose -0,1M (Squib), glicina 0,1M .

Na perfusão renal: NaCl (Synth), NaH2PO4 (Synth), NaHCO3 (Synth),

MgSO4.7H2O(Reagen), CaCl2.2H2O(Reagen), Manitol(Reagen),Uréia (Reagen), KCl

(Merck), glicose (Squib), penicilina G Potássica Cristalina (Squib), Inulina (Sigma),

Pentobarbital sódico (Cristália).

Na Citotoxicidade in vitro: [3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo] MTT; (

Sigma),SBF, Penicilina/estreptomicina (Squib), tripsina-EDTA, dodecil sulfato de

sódio –SDS, tampão fosfato.

Ensaio de Arteria mesentérica: NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4·7H2O, CaCl2 NaHCO3.

Soro Bovino fetal (SBF) (Sigma) .

Pressão Arterial e Frequência Cardíaca: NaCl, Pentobarbital sódico (Cristália).

53

5.2 MÉTODOS

Obtenção e Purificação das lectinas das algas Caulerpa cupressoides e

Pterocladiella capillacea

As etapas de obtenção da lectina da alga Caulerpa cupressoides (LCc)

seguiu o protocolo previamente descrito por Benevides et al (2001) e modificado por

Vanderlei et al ( 2010). A lectina da alga Pterocladiella capillacea (LPc) foi obtida

seguindo o protocolo previamente descrito por Oliveira et al, (2002) modificado por

Silva (2008). As etapas de obtenção e purificação das lectinas foram realizadas em

colaboração com o laboratório de Carboidratos e Lectinas –CARBOLEC, sob a

orientação da prof. Dra. Norma Benevides.

5.2.1 Preparação do Extrato Bruto das algas Caulerpa cupressoides e

Pterocladiella capillacea

Amostras de 500 g das algas frescas foram trituradas em almofariz de

porcelana na presença de nitrogênio líquido e submetidas a extração das proteínas

solúveis com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 (TB), na proporção de1:4 (m/v;

alga:tampão). Após agitação constante por 4 horas, o homogenato foi filtrado em

tecido de nylon e em seguida centrifugado a 6.000 x g por 30 minutos a 4ºC. O

precipitado foi desprezado e o sobrenadante obtido, sendo denominado de extrato

total.

5.2.2 Cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose

O extrato total obtido foi submetido à cromatografia de troca iônica em

coluna de DEAE-celulose. Inicialmente a alga foi coberta por uma fina camada de

nitrogênio líquido e agitada continuamente durante 4 horas com dois volumes de

solução 0.25 mM Tris-HCl pH 7.5 (TB). A mistura foi filtrada e centrifugada a 6.000×g

for 20 min at 4 °C. O extrato bruto extraído foi aplicado a coluna de DEAE-celulose

(13.5×1.6 cm), e eluido com TB. Após eluição de proteínas livre e pigmentos, as

proteínas adsorvidas foram eluídas em gel TB usando 0.5 M NaCl. O fluxo

constante de 30 mL/ hora foi mantido, coletando-se frações de 3 ml por tubo e as

absorbâncias lidas a 280 nm. As frações obtidas foram concentradas por liofilização

parcial. Esta etapa da extração seguiu a mesma metodologia para as duas algas.

54

5.2.3 Cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-100

A coluna de SephadexG-100 foi utlizada para obtenção da lectina da C.

cupressoides (LCc). As frações que apresentaram atividade hemaglutinante foram

submetidas a coluna de cromatografia (13.5×1.6 cm) de Sephadex G-100 e eluidas

com TB. Após remoção do material não absorvido, as bandas de proteínas foram

eluídas da coluna com glicose(0,1M). Durante os procedimentos cromatográficos foi

mantido um fluxo constante de 30 mL/hora, coletando frações de 3 mL/tubo e a

absorbância determinada a 280 nm. A proteína obtida foi dialisada com água

destilada, liofilizada e armazenada a -2ºC para posterior realização dos ensaios

biológicos.

5.2.4 Cromatografia de afinidade em coluna de Goma de Guar

A coluna de Goma de Guar foi utilizada para obtenção da lectina da

P.capillacea (LPc). As frações ativas, isto é, que apresentaram atividade

hemaglutinante foram dialisadas com água destilada e aplicadas em cromatografia

de coluna de Goma de Guar, sendo o pico ativo de proteínas eluido com glicina 0,1M

pH2,6 contendo NaCl a 0,15M.

5.2.5 Atividade Hemaglutinante

O ensaio da atividade hemaglutinante das lectinas foi realizado através de

diluições seriadas em tubos de ensaio. Nos tubos foram adicionados 100 μL de NaCl

0,15 mMol. No primeiro tubo foram adicionados 100 μL da amostra de LCc e LPc e

uma série de diluições duplas foram feitas (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, etc.),

homogeneizando-se completamente antes de cada transferência. A cada diluição

foram adicionados 100 μL de uma suspensão de eritrócitos de coelho tratados com

tripsina (2%) e a reação foi incubada à temperatura ambiente por 60 minutos,

conforme descrito por Ainouz et al, (1992). Posteriormente, os tubos foram

centrifugados a 2.000 x g por 30 segundos e os resultados vistos

macroscopicamente, sendo o título expresso em unidades de hemaglutinação

(UH/mL), que é o inverso da maior diluição da amostra que apresentou nítida

aglutinação.

55

5.2.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida das Lectinas das algas C. cupressoides e P.capillacea

O grau de pureza da LCc e da LPc foi acompanhado por procedimento de

eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% na forma nativa (PAGE) e desnaturante

(PAGE-SDS) na ausência e presença do agente redutor β-mercaptoetanol, segundo

o método de Laemilli descrito por Hames & Rickwood, (1983). No processo de

montagem das placas foi utilizado um gel de concentração (3,95% de acrilamida em

tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8) e um gel de separação (acrilamida 12% dissolvida em

tampão Tris-HCl 3 M, pH 8,8). A fração protéica ativa foi dissolvida no tampão da

amostra e incubada a 1000C por 10 minutos. Alíquotas contendo 1 mg/mL de

proteínas foram colocadas nos poços do gel de concentração. A corrida

eletroforética foi realizada a uma corrente constante de 40 mA. As bandas protéicas

obtidas foram reveladas mediante coramento com uma solução de Coomassie R-

250 a 2% dissolvido em ácido acético, metanol e água na proporção de 10:45:45,

v/v/v contendo ácido pícrico 0,2 M (Stephano et al., 1986). No procedimento de

SDS-PAGE, foram utilizados como padrões protéicos de massas moleculares

conhecidas: Albumina sérica bovina 66,0 kDa; Ovoalbumina 45,0 kDa; Gliceraldeído-

3-Fosfato Desidrogenase 36,0; Tripsinogênio 29,0; inibidor de tripsina 20,1 kDa

(Sigma-Aldrich®, USA).

5.3 Sistema de Perfusão Renal

O sistema de perfusão renal (SPR) foi inicialmente baseado nos estudos

desenvolvidos por Bowman e Mack (1974) e Ross (1978). O desenvolvimento de tal

sistema surgiu da necessidade de conhecer os mecanimos de controle de função

renal. O SPR consiste na perfusão de rim isolado com recirculação (FONTELLES et

al, 1983 MONTEIRO et al , 1990), contendo dois subsistemas, um in situ e outro in

vitro, ambos mantidos a temperatura de 37º C. No SPR a manutenção dos

parâmetros normais do rim é realizada com utilização de albumina na solução

perfusora e com condições adequadas de oxigenação. O SPR é composto por:

condensador, bomba perfusora, filtro de millipore (5µm), banho-maria, oxigenador ou

pulmão artificial, fluxômetro, manômetro e cata-bolhas. Nesse sistema coloca-se

56

ainda m frasco coletor para realização das coletas de urina e uma seringa é

acoplada ao sistema para realização da coleta do perfusato (Figura 6 e 7).

Figura 6. Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado.

Fonte: LAFAVET -2013.

Coletor de urina

Cânula

arterial

Manômetro

Fluxômetro

Banho-maria

oxigenador

Filtro seringa

Condensador

Rim

Bomba perfusora

Cata bolhas

(O 2/CO

2)

57

Figura 7. Sistema de perfusão do rim isolado. Fonte: LAFAVET-UFC /2013.

Fonte: LAFAVET-UFC /2013.

5.3.1 Calibração do Sistema

O sistema de perfusão renal foi calibrado antes do início dos experimentos,

avaliando-se em cada bomba:

a pressão de perfusão (PP) mmHg, o fluxo urinário (FU)L/h e o volume de

urina por minuto -ml/min.

5.3.2 Solução Perfusora

A solução utilizada no circuito de perfusão foi a de Krebs-Henseleit

modificada, acrescida de albumina bovina 6g%, no intuito de preservar as funções

renais. A solução de Krebs-Henseleit modificada, concentrada 20 vezes, contém

NaCl (138g), KCl (7,0g), NaH2PO4 , H2O (3,2g), MgSO4. 7H2O (5,8g), e Uréia (l0g).

58

No tempo de 48 horas antes do experimento, 100 mL desta solução foi separada e

acrescida de NaHCO3 (4,2g), CaCl2 . 2H2O (0,74g), glicose (2,0g), e penicilina G

Potássica Cristalina (0,050g). Em seguida, o volume foi completado para 2000mL

com água bidestilada e adicionado albumina bovina (6g%). A seguir foi feita a diálise

desta solução, auxiliada por um homogeneizador, e a mesma foi mantida a 20ºC,

fazendo-se a troca da agua bidestilada a cada 24 horas. Após 48 horas de diálise,

acrescentou-se 0,15g de inulina. O pH da solução perfusora foi ajustado entre os

valores de 7.3 e 7.4, utilizando equipamento PH LabMeter, Model pH2.

A diálise da solução foi realizada com a finalidade de retirar substâncias

contaminantes como piruvato, citrato e lactato (HANSON; BALLARD, 1968).

5.3.3 Técnica Cirúrgica

Inicialmente os animais foram anestesiados, via intraperitoneal, com

pentobarbital sódico na concentração de 50mg/mL de peso corporal. A seguir fez-se

uma pequena incisão na face ventral da coxa do animal para isolar a veia femural

com o intuito de injetar manitol, 3mL a 20%, objetivando facilitar o acesso e a

canulação do ureter. ( Figura 8A e 8B)

Após assepsia da região ventral do abdômen inicou-se a cirurgia com uma

incisão longitudinal e duas perpendiculares à linha alba, seguida do afastamento das

vísceras abdominais para localização do rim direito. Em seguida identificou-se a

artéria mesentérica superior, depois o ureter direito e glândula supra-renal.

No intuito de evitar interferência fisiológica da glândula supra-renal direita a

mesma foi identificada e seccionada. O rim direito foi localizado e descapsulado. A

cânula arterial foi introduzida na artéria mesentérica superior até a artéria renal,

onde foi feita a fixação desta (Figua 9A e 9B). Durante o procedimento cirúrgico

cerca de 40mL da solução perfusora foi utilizada para fazer o banho do órgão, in

vivo, evitando assim isquemia do mesmo. A seguir o rim foi retirado e transportado

para o sistema in vitro.

59

Figura 8 A- Identificação e dessecação do ureter, B.- Ureter canulado

Fonte: LAFAVET – UFC.

Figura 9 A: visualização da artéria renal; B- canulação da artéria renal pela artéria mesentérica.

. Fonte: LAFAVET – UFC

60

5.3.4 Protocolo Experimental

Após canulação do rim ao sistema de perfusão, os primeiros 20 minutos

foram utilizados para a estabilização e adaptação do rim às novas condições. Após

esse período, iniciou-se o tempo zero, determinando os 30 primeiros minutos de

controle interno. Após este período a lectina de cada alga foi adicionada ao sistema

na dose de 10µg/mL (n= 6). A cada intervalo de 5 minutos registrou-se a pressão de

perfusão e o fluxo de perfusão em manômetro e fluxômetro, no total de 120 minutos.

A cada intervalo de 10 minutos, de forma intercalada, coletou-se a urina e o

perfusato (Figura 10). As amostras de urina e de perfusato, foram mantidas em

temperatura de -20°C para posterior dosagens de potássio, sódio, cloro, inulina e

osmolaridade, importantes na determinação dos parâmetros de função renal

Com o rim direito montado no sistema, o rim esquerdo foi coletado para

controle, pesado e dele retirado um fragmento para posterior exame histopatológico.

Terminado o experimento um fragmento do rim direito foi também retirado para

exame histopatológico.

Figura 10. Esquema do protocolo experimental da perfusão renal.

61

5.3.5. Análises Bioquímicas

Os testes bioquímicos foram realizados na Unidade de Pesquisas Clínicas

da Universidade Federal do Ceará. As amostras de urina e perfusato coletados em

intervalos de 10 minutos, foram utilizadas para dosagens de sódio e potássio. As

dosagens de cloro foram realizadas seguindo o método descrito pelo kit do

fabricante Labtest. A inulina foi dosada a partir do mesmo material, através de

hidrólise direta descrita por Fontelles e Leibach (1982). A osmolaridade das amostras

foi medidas com um osmômetro (Vapor pressure osmometer - modelo 5100c

ESCOR).

62

5.3.6 Cálculo dos Parâmetros Renais

Os cálculos abaixo foram utilizados para determinação de parâmetros

funcionais renais (MARTINEZ-MALDONADO et al., 1978).

1.FU (mL.g-1.min-1) = Fluxo Urinário

FU = Peso do volume urinário/ Peso do rim esquerdo x 10

2.PP (mmHg) = Pressão de perfusão/ leitura em manômetro

3.FPR (mL.g-1.min-1) = Fluxo plasmático renal ou fluxo de perfusão

4.RVR (mmHg/mL.g-1.min-1) = Resistência Vascular Renal

RVR = PP (mmHg) / FPR

5.Cosm (mL.g-1.min-1) = Clearance osmótico

Cosm = (Uosm / Posm ) x FU

Uosm = Osmolaridade Urinária

Posm = Osmolaridade do perfusato

6.CH2O (mL.g-1.min-1) = Clearance de água livre

CH2O = FU – Cosm

7. FNa+ (µEq.g-1 . min-1 ) - Sódio filtrado

FNa+= RFG x PNa+ (concentração de sódio no perfusato)

8. ENa+ (µEq.g-1 . min-1 ) -Sódio excretado

ENa+=FU x UNa+ (concentração de sódio na urina)

9.TNa+ (µEq.g-1 . min-1 ) - Sódio transportado

TNa+= FNa+ - ENa+

10.%TNa+ - Percentual de sódio transportado

%TNa+ =TNa+ x 100/FNa+

11. dTNa+ (mL.g-1.min-1) = Transporte distal de sódio

dTNa+ = CH2O x PNa+

12. AdNa+ (µEq.g-1.min-1) = Aporte distal de sódio

AdNa+ = dTNa+ + ENa+

13. pTNa+ (µEq.g-1.min-1) = Transporte proximal de sódio

pTNa+ = FNa+ - AdNa+

Todos os cálculos que foram realizados para a determinação dos parâmetros

do sódio, acima citados, foram repetidos para o potássio e para o cloro.

63

5.3.7 Análise Histológica

Após cada experimento de perfusão renal, foram retirados fragmentos

longitudinais do rim perfundido (direito) e do não perfundido (esquerdo), os quais

foram mantidos em frascos com formol a 10%, durante 24 a 48 horas, para exame

histológico. Os fragmentos foram preparados para a análise histológica, pelo

processo de diafanização seguido de desidratação e depois cortados com 3-5 m de

espessura. O material foi corado por hematoxilina-eosina e as lâminas foram

analisadas por microscópio óptico (Nikon).

As lâminas foram confeccionadas e avaliadas no Departamento de

Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará sob a orientação do

Prof. Dalgimar Beserra de Menezes. Realizou-se também o estudo histológico dos

rins perfundidos somente com solução de Krebs-Henseleit modificada servindo

como controle.

5.3.8 Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão dos

experimentos de cada grupo. Diferenças entre os grupos foram comparadas utilizado

teste t de Student ou Análise de Variância (ANOVA) seguida do pós-teste de

Bonferroni com significância de 5%.

5.3.9 Aspectos Éticos

A metodologia utilizada foi submetida ao Comitê de Ética e Pesquisa com

Animais (CEPA) do departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade

Federal do Ceará e aprovado sob o número 107/07.

5.4. Estudo da Atividade Citotóxica in vitro

5.4.1 Cultivo das células MDCK

As células MDCK foram cultivadas em frascos com meio RPMI 1640,

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos

(penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em estufa a 37°C com

atmosfera de 95% O2, 5% de CO2. O crescimento celular foi observado com ajuda

de microscópio de inversão a cada 24 horas (BUTLER; DAWSON, 1992). As células

64

MDCK foram cultivadas no laboratório de Cultivo Celular sob orientação da Profa.

Dra. Alice Martins.

5.4.2 Ensaio com MTT

O ensaio com MTT [3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H brometo] baseia-se

na redução de sais amarelos de tetrazólio por redutases mitocondriais de células

metabolicamente ativas, formando um produto de cor púrpura, insolúvel em água, o

sal formazan (MOSMANN, 1983). Os cristais de formazan são solubilizados e a

intensidade da coloração formada é diretamente proporcional ao número de células

viáveis presentes na amostra. A medição da densidade óptica é feita em

espectrofotômetro a

570 nm de absorbância (HEINRICH et al., 2005).

5.4.5 Tratamento das células MDCK

Antes de cada experimento as células foram armazenadas em meio de

cultura RPMI 1640 sem SBF por 24h para a obtenção de células entre as fases G0 e

G1 do ciclo celular. No intuito de promover o deslocamento das células aderidas às

garrafas de cultura as mesmas foram expostas a tripsina-EDTA (Ethylenediamine

tetraacetic acid) (0,25/0,02% v/v) em estufa de CO2 a 37ºC por aproximadamente

5min. Em seguida as células foram suspensas em meio de cultura com SBF e

centrifugadas por 5 min a 4000 rpm.

A seguir o sobrenadante foi descartado e as células MDCK foram re-

suspensas em meio de cultura e quantificadas em câmara de Neubauer e

plaqueadas na concentração 1x105céls/mL em placas de 96 poços. Após 24 horas

foram adicionadas aos poços diferentes concentrações de LCc e LPc (6,125; 12,5;

25; 50; 100g/mL). Após 24 horas do tratamento com as lectinas, retirou-se 100µL

do sobrenadante do meio de cultura e adicionou-se 10µL da solução do sal de

tetrazolium (MTT; 2,5mg/mL; Sigma) dissolvido em PBS. Após incubação por 4 horas

em estufa com 5% de CO2 à 37ºC, adicionou-se 90µL da solução de dodecil sulfato

de sódio 10% (SDS) dissolvido em HCL 0,01N para solubilizar os cristais de

formazan formados. As placas foram mantidas em estufa com 5% de CO2 à 37ºC e

após 17 horas foi realizada a leitura em espectrofotômetro com comprimento de

onda de 570nm.

65

O controle negativo consistiu de células MDCK vivas tratadas somente com

veículo (tampão–fosfato) e meio de cultura e a viabilidade celular foi determinada por

comparação entre os percentuais médios de células viáveis neste grupo e nos

demais grupos tratados com a LCc e LPc (MOSMANN, 1983).

Os experimentos com células MDCK foram realizados em colaboração com

laboratório de Cultivo Celular (LCC) sob orientação da Profa. Dra. Alice Martins.


Os dados foram expressos como percentagem de viabilidade celular versus

concentração da LCc e LPc e foram comparados por análise de variância ANOVA,

pós-teste de Bonferroni com probabilidade de 5%.

5.5. Avaliação da Pressão Arterial Média e Frequência Cardíaca

5.5.1 Experimento de Pressão Arterial Média

Este ensaio foi utilizado para teste de alterações vasculares e pressóricas

induzidas pelas LCc e LPc em comparação ao grupo controle. As substâncias

utilizadas nos experimentos foram injetadas lentamente pela veia jugular em

diferentes concentrações.

5.5.1.1 Procedimento Cirúrgico

Inicialmente os animais foram anestesiados, via intraperitoneal, com

pentobarbital sódico na concentração de 50mg/mL de peso corporal. O

procedimento iniciou-se seccionando a linha mediana da região cervical, isolando as

glândulas parótidas direita e esquerda, a seguir aprofundando a incisão até a

traquéia. A traquéia foi isolada e uma curta cânula de polietileno (PE120) foi inserida

nos animais por meio de traqueostomia, permitindo um fluxo respiratório espontâneo

e a fácil aspiração de eventuais secreções brônquicas. Após a identificação do feixe

vásculo nervoso isolou-se a artéria carótida esquerda, preservando o nervo vago.

Em seguida a carótida foi canulada para registro da pressão arterial média.

Procedimento semelhante foi realizado no intuito de canular a veia jugular com o

propósito de injetar as substâncias (NASCIMENTO et al., 2006). Os registros das

66

experiências foram realizados com um transdutor de pressão piezo-elétrico (Braile

BXSN) acoplado ao sistema de amplificação de sinal com interface USB (DATAQ DI-

148U) utilizando o software de aquisição de dados WinDaq/Lite. A Pressão arterial

média (PAM) foi diretamente calculada pelo software. Antes do início dos

experimentos foi realizada a calibração do equipamento utilizando como padrão um

manômetro de mercúrio em uma escala de 50 a 250mmHg. Posteriormente as

soluções contendo a LCc e LPc nas concentrações de 1, 3,10,30,100 e 300 g/mL

foram injetadas lentamente na veia jugular com intervalos mínimos de 10 minutos.

5.5.2. Avaliação da Frequência Cardíaca

A frequência cardíaca foi registrada no mesmo equipamento onde foi avaliada a

medição da pressão arterial média sendo utilizada a média de valores de frequência

em cada intervalo de tempo.


Os resultados dos experimentos de pressão arterial e frequência cardíaca

foram apresentados como média ± desvio padrão. Diferenças entre os grupos foram

comparadas utilizado teste t de Student com significância de 5%.

5.6. Avaliação do efeito da Lectina da Caulerpa cupressoides em Ensaio de

Artéria Mesentérica.

5.6.1 Grupos experimentais

Os experimentos foram realizados em duplicata com n=4. O ensaio da artéria

mesentérica foi realizado somente com a lectina da alga Caulerpa cupressoides nas

concentrações de 0,1; 0,3, 1; 3;10; 30; 60; 100, 200, 300 e 400µg/mL.

5.6.2 Ensaio com Artéria Mesentérica

Após eutanásia dos animais, o ramo maior da artéria mesentérica foi

rapidamente removido e imerso em solução oxigenada de Krebs-Henseleit

modificada. Após remoção de tecido adiposo e conjuntivo segmentos de

aproximadamente 3mm de comprimento da artéria mesentérica foram suspensos por

ganchos dispostos horizontalmente e mantidos em banho, para registro

67

isovolumétrico de 5mL de capacidade, em solução de Krebs-Henseleit composta por

mmol/L de: NaCl 120; KCl 4,7; CaCl 1,8; MgCl2 1,43; NaHCO3 25; KH2PO4 1,17 e

Glicose 11; mantidos em oxigenação (95% O2–5% CO2) a 37ºC. Os registros das

alterações de tensão foram obtidos por intermédio de transdutores isométricos

(ML870B60/C-V, AD Instruments, Sydney, Australia) acoplados a polígrafos. A tensão

imposta às preparações foi de 0,5g e as mesmas ficaram no sistema por 60 minutos

para equilíbrio do mesmo.

No intuito de avaliar a integridade do endotélio dos segmentos da artéria

mesentérica os mesmos foram inicialmente expostos a KCl (60 mM). Posteriormente

o tecido foi lavado e acrescentado Fenilefrina (0,3 e 1µM). As contrações iniciais

observadas serviram como controle e após 30 minutos observou-se a ocorrência de

duas contrações sucessivas de amplitudes semelhantes. Após ser atingido o platô

de contração adequado a LCc foi acrescida cumulativamente para construir a curva

concentração-resposta (Figura 11).

Figura 11. Esquema do Protocolo Experimental do Ensaio com Artéria Mesentérica

68


Os dados foram expressos em média ± desvio padrão, com n

representando o número de experimentos. Os efeitos máximos da fenilefrina nas

concentrações de 0,3µm e 1µm e da lectina da Caulerpa cupressoides em diferentes

concentrações foram utilizados para construir a curva concentração- resposta, a qual

expressava a força de contração. O teste estatístico utilizado foi o holm-sidak, com

p< 0,05.

69

6- RESULTADOS

6.1 Lectina da Caulerpa cupressoides 6.1.1Perfusão Renal

Os experimentos de avaliação dos parâmetros renais foram avaliados em 30,

60, 90 e 120 minutos, sendo os 30 minutos iniciais utilizados como controle interno

do experimento.

A LCc na concentração de 10µg/mL apresentou alterações nos parâmetros de

função renal. Houve aumento na Pressão de Perfusão (PP) em 90 e 120 minutos

(tabela 1/figura 12), aumento na Resistência Vascular Renal (RVR) em 90 e 120

minutos (tabela 2/figura 13), aumento no Fluxo Urinário (FU) aos 120 minutos (tabela

3/figura 14). A LCc promoveu redução do Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) no

tempo de 60 minutos (tabela 4/figura 15). Houve redução no percentual de Transporte

Tubular de Sódio (%TNa+) (tabela 5/figura16), redução no percentual de Transporte

Tubular de Potássio (%TK+) (tabela 6/figura 17), e redução no percentual de

Transporte Tubular de Cloreto (%TCl-) nos tempos de 60, 90 e 120 minutos ( tabela

7/figura 18).

70

Tabela 1. Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

106,62 ± 2,22

104,17 ± 3,72

104,73 ± 4,23

107,62 ± 3,15

LCc

105,0 ± 1.4

110,8 ± 2,4

0126,6± 3,2*

145,6 ± 2,0*

Dados expressos por Média ± E.P.M. (n = 6). Teste t de Student com * p<0,05.

Figura 12: Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0

50

100

150

200 Controle

LCc

**

Tempo (min)

PP

(m

mH

g)

71

Tabela 2. Resistência Vascular Renal (R.V.R.) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

4,85 ± 0,15

4,9 ± 0,16

4,47 ± 0,20

4,71 ± 0,18

LCc

4,6 ± 0,21*

4,87± 0,25

5,57± 0,30*

6,37 ± 0,27*


Figura 13. Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL,

p<0,05.

30 60 90 120

0

2

4

6

8

Controle

LCc

Tempo (min)

RV

R (

mm

Hg

/mL

.g-1

.min

-1)

*

*

72

Tabela 3. Fluxo urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

0,139 ± 0,009

0,158± 0,015

0,164 ± 0,024

0,161 ± 0,02

LCc

0,118 ± 0,008

0,135± 0,009*

0,192± 0,009

0,311 ± 0,025*


Figura 14: Fluxo Urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4Controle

LCc*

Tempo (min)

Flu

xo

uri

nári

o

( mL

/min

/g)

73

Tabela 4. Ritmo de Filtração Glomerular (R.F.G.) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

0,701 ± 0,073

0,707± 0,051

0,633 ± 0,051

0,697 ± 0,084

LCc

0,723 ± 0,090

0,468± 0,061*

0,507± 0,048

0,643 ± 0,067


Figura 15.Ritmo de Filtração Glomerular nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)

com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0Controle

LCc

Tempo (min)

RF

G (

mL

.g-1

.min

-1)

*

74

Tabela 5. Percentual do Transporte Tubular de Sodio (%TNa+) nos grupos controle



Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

81,94 ± 1,24

81,11± 1,52

79,26 ± 0,9

79,76 ± 0,56

LCc

83,08 ± 2,14

69,02± 3,81*

59,41± 4,73*

53,57 ± 4,25*


Figura 16: Percentual de Transporte de Sódio (%TNa+) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de 10

µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LCc*

**

Tempo (min)

%T

Na

+

75

Tabela 6. Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos controle



Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

69,13 ± 4,14

69,04± 5,68

71,84 ± 4,21

69,94 ± 6,86

LCc

74,87 ± 3,02

51,78± 5,11*

39,48± 7,94*

34,97 ± 6,97*


Figura 17: Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos controle



30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LCc

**

*

Tempo (min)

%T

K+

76

Tabela 7. Percentual do Transporte Tubular de Cloreto (%TCl -) nos grupos controle



Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

79,9 ± 0,98

81,25± 1,06

77,32 ± 1,12

78,53 ± 0,89

LCc

82,40 ± 2,34

70,48± 2,75*

58,89± 4,09*

51,33 ± 3,45*


Figura 18: Percentual de Transporte de Cloreto ( %TCl-) +) nos grupos controle (n=6)

e tratados (n=6) com Lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) na concentração de

10 µg/mL.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LCc*

**

Tempo (min)

%T

Cl-

77

6.1.2. Análise Histológica

A análise das lâminas histológicas do rim perfundido com a lectina da

Caulerpa cupressoides na concentração de 10 µg/mL, evidenciou discreta deposição

de material protéico na luz tubular, sem alterações a nível vascular. A LCc promoveu

alteração da arquitetura do parênquima renal com características de edema e

afastamento dos túbulos (Figura 20).

A Figura 19 mostra a fotomicrografia de um rim perfundido apenas com

solução de Krebs-Hanseleit modificada, comprovando que não houve nenhuma

alteração causada pela solução perfusora.

Figura 19. Fotomicrografia de rim direito perfundido apenas com solução de Krebs-

Hanseleit modificada. Glomérulo normal (seta preta), Túbulo Contorcido Distal

normal (seta branca). Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento 400x. Coloração

Hematoxilina-Eosina(HE). Grupo controle, n=6.

78

Figura 20. Fotomicrografia de rim direito perfundido com a lectina isolada de

Caulerpa cupressoides (LCc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se deposição de

material proteináceo (seta preta), e afastamento do interstício (seta branca). /

Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento de 400X. Coloração Haematoxilina-Eosina

(HE).

79

6.1.3 CÉLULAS MDCK

A citotoxidade da LCc foi avaliada em células tubulares renais de cães

(MDCK) após 24 horas de exposição a diferentes concentrações da mesma. No

ensaio com o MTT, o qual detecta viabilidade celular com base no metabolismo

oxidativo, não observou-se morte celular, não havendo portanto cálculo da IC50. Nas

concentrações avaliadas a LCc não alterou a viabilidade de células MDCK (Figura

21) quando comparada ao controle, cuja absorbância foi considerada 100%.

Figura 21. Percentual de viabilidade celular do grupo controle (C) e tratado com

lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) em diferentes concentrações. Dados

expressos em média ± desvio padrão, p < 0,05.

0

6,12

512

,5 25 50 100

0

50

100

150

Concentração (g/ml)

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

80

6.1.4 EFEITOS VASCULARES 6.1.4.1 Pressão Arterial Média e Frequência Cardíaca.

A LCc foi utilizada nas concentrações de 1, 3,10,30,100 e 300 g/mL.

Demonstrou-se uma diminuição da pressão arterial média (PAM) nas concentrações

de 100 e 300g/mL (figura 22 ).

Nas mesmas concentrações não houve alterações significativas da freqüência

cardíaca (figura 23 ) .

Figura 22- Pressão arterial média em ratos. Lectina extraída da alga marinha

Caulerpa cupressoides (LCc) utilizada nas concentrações de 1,3,10,30,100 e 300

g/mL.*p<0.05, (n=6).

1 3 10 30 100

300

0

20

40

60

80

100

120C.c

salina* *


PA

M %

(mm

Hg

)

81

Figura 23 - Frequência cardíaca em ratos. Lectina extraída da alga marinha Caulerpa

cupressoides (C.c) utilizada nas doses de 1, 3, 10, 30, 100 e

300g/mL.*p<0.05, (n=6).

1 3 10 30 100

300

0

20

40

60

80

100

120C.c

salina


Fre

qu

ên

cia

card

iaca%

(b.p

.m)

6.1.5. –Ensaio de Lectina da Caulerpa cupressoides em Artéria Mesentérica.

A lectina da Caulerpa cupressoides (LCc) não promoveu ação de relaxamento

nas concentrações avaliadas (0,1; 0,3; 1; 10; 30; 60; 100 e 200µg/mL), quando o

tecido foi pre-contraído com fenilefrina na concentração de 0,3µM (figura 24). A LCc

utilizada nas concentrações de 100, 200, 300, 400 µg/mL promoveu relaxamento de

segmento de artéria mesentérica quando o tecido foi pré-contraido com fenilefrina na

concentração de 1µM (figura 25 ).

82

Figura 24. Efeitos da lectina da Caulerpa cupressoides em contrações de artéria

mesentérica induzidas por fenilefrina (PHE) na concentração de 0,3 µM.p<0,05.

Caulerpa (g/mL)

0,1 0,3 1 3 10 30 60 100 200

% C

ontr

açã

o P

HE

(0

,3

M)

40

60

80

100

120

140

83

Figura 25. Efeitos da lectina da Caulerpa cupressoides em contrações de segmento

de artéria mesentérica induzidas por fenilefrina (PHE) na concentração de 1µM,

p<0,05.

CAULERPA (g/mL)

0 100 200 300 400 500

% C

ON

TR

AÇ

ÃO

PH

E (

1

M)

40

60

80

100

120

140

* ** *

84

6.2 Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc)

6.2.1 Perfusão Renal

Os experimentos de avaliação dos parâmetros renais foram avaliados em 30,

60, 90 e 120 minutos, sendo os 30 minutos iniciais o controle interno do

experimento.

A lectina da Pterocladiela capillacea na concentração de 10µg/mL apresentou

alterações nos parâmetros de função renal: Reduziu o Fluxo urinário aos 120

minutos (tabela 10, figura 28) e aumentou o percentual de Transporte Tubular de

Sódio (%TNa+) aos 90 e 120 minutos (tabela12, figura 30). Os parâmetros de

Pressão de Perfusão (PP) (tabela 8, figura 26), Resistência Vascular Renal (RVR)

(tabela 9, figura 27) e Ritmo de Filtração Glomerular (RFG) (tabela11, figura 29) não

sofreram alterações . Da mesma forma o percentual de Transporte de Potássio

(%TK+) ( tabela 13/figura 31) e percentual de Transporte Tubular de Cloreto (%TCl -)

(tabela14/ figura 32) não sofreram alterações nos tempos avaliados.

85

Tabela 8. Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

106,62 ± 2,22

104,17 ± 3,72

104,73 ± 4,23

107,62 ± 3,15

LPc

107,0 ± 1.6

105,3 ± 1,5

106,0± 1,5

101,8 ± 1,7


Figura 26: Pressão de Perfusão (P.P) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0

50

100

150Controle

LPc

Tempo (min)

PP

(m

mH

g)

86

Tabela 9. Resistência Vascular Renal (R.V.R.) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

4,85 ± 0,15

4,9 ± 0,16

4,47 ± 0,20

4,71 ± 0,18

LPc

5,11 ± 0,27

5,0± 0,26

5,03± 0,25

4,85 ± 0,27


Figura 27. Resistência Vascular Renal (RVR) nos grupos controle (n=6) e tratados

(n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL,

p<0,05.

30 60 90 120

0

2

4

6Controle

LPc

Tempo (min)

RV

R (

mm

Hg

/mL

.g-1

.min

-1)

87

Tabela 10. Fluxo urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

0,139 ± 0,009

0,158± 0,015

0,164 ± 0,024

0,161 ± 0,02

LPc

0,142 ± 0,005

0,143 0,003

0,129± 0,003

0,107 ± 0,03*


Figura 28: Fluxo Urinário (F.U.) nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20Controle

LPc

*

Tempo (min)

Flu

xo

uri

nári

o

( mL

.g-1

. m

in-1

)

88

Tabela 11. Ritmo de Filtração Glomerular (R.F.G.) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com a Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de

10 µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

0,701 ± 0,073

0,707± 0,051

0,633 ± 0,051

0,697 ± 0,084

LPc

0,698 ± 0,061

0,608± 0,027

0,543± 0,032

0,523 ± 0,042


Figura 29. Ritmo de Filtração Glomerular nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6)

com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL,

p<0,05.

30 60 90 120

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0Controle

LPc

Tempo (min)

RF

G (

mL

.g-1

.min

-1)

89

Tabela 12. Percentual do Transporte de Sodio (%TNa+) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10

µg/mL.

Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

81,94 ± 1,24

81,11± 1,52

79,26 ± 0,9

79,76 ± 0,56

LPc

85,24 ± 1,31

84,14± 1,06

83,77± 0,95*

85,04 ± 1,46*


Figura 30: Percentual de Transporte de Sódio (%TNa+) nos grupos controle (n=6) e

tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de 10

µg/mL, p<0,05.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LPc* *

Tempo (min)

%T

Na

+

90

Tabela 13. Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos controle

(n=6) e tratados (n=6) com Lectina Pterocladiella capillacea (LPc)


Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

69,13 ± 4,14

69,04± 5,68

71,84 ± 4,21

69,94 ± 6,86

LPc

68,54 ± 2,21

63,97± 1,99

64,56± 1,25

68,57 ± 2,70


Figura 31: Percentual do Transporte Tubular de Potássio (%TK+) nos grupos controle



30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LPc

Tempo (min)

%T

K+

91

Tabela 14. Percentual do Transporte Tubular de Cloreto (%TCl -) nos grupos controle



Tempo

(minutos)

30’

60’

90’

120’

Controle

79,9 ± 0,98

81,25± 1,06

77,32 ± 1,12

78,53 ± 0,89

LPc

83,16 ± 1,51

81,35± 1,47

80,43± 1,47

80,78 ± 2,59


Figura 32: Percentual de Transporte de Cloreto ( %TCl-) +) nos grupos controle (n=6)

e tratados (n=6) com Lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) na concentração de

10 µg/mL.

30 60 90 120

0

20

40

60

80

100Controle

LPc

Tempo (min)

%T

Cl-

92

6.2.2 Análise Histológica

A análise das lâminas histológicas do rim perfundido com lectina da

Pterocladiela capillacea (LPc) na concentração de 10 µg/mL não evidenciou

alterações renais a nível vascular, porém identificou-se discreta deposição de

material proteináceo na luz tubular e degeneração do epitélio tubular.

As Figuras 33 e 34 mostram as fotomicrografias do rim perfundido apenas

com solução de Krebs-Hanseleit modificada, comprovando que não houve nenhuma

alteração causada pela solução perfusora. As Figuras 35 e 36 mostram o rim

perfundido com LPc.


Hanseleit modificada. Glomérulo normal (seta preta), Túbulos normais (setas

brancas). Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento 400x. Coloração Hematoxilina-Eosina

(HE). Grupo controle, n=6.

93


Hanseleit modificada. Túbulos Contorcidos Distais- normais (setas pretas).

Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento 400x. Coloração Hematoxilina-Eosina (HE).

Grupo controle, n=6.

94

Figura 35- Fotomicrografia de rim perfundido com a lectina isolada de Pterocladiela

capillacea (LPc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se discreta deposição de

material proteináceo na luz tubular (seta preta) e degeneração do epitélio tubular

(seta branca) / Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento de 400X. Coloração

Haematoxilina-eosina (HE).

95

Figura 36- Fotomicrografia de rim perfundido com a lectina isolada de Pterocladiela

capillacea (LPc) na dose de 10µg/mL (n=6). Observa-se deposição de material

proteináceo na luz dos túbulos (seta preta), / Microscópio Óptico (Nikon)/Aumento de

400X. Coloração Haematoxilina-eosina (HE).

96

6.2.3 CÉLULAS MDCK

A citotoxidade da LPc foi avaliada em células tubulares renais (MDCK) após

24 horas de exposição a diferentes concentrações da mesma. No ensaio com o

MTT, o qual detecta viabilidade celular com base no metabolismo oxidativo, não

observou-se morte celular, não havendo portanto cálculo da IC50. Nas concentrações

avaliadas a LPc não alterou a viabilidade de células MDCK (figura 37) quando

comparada ao controle, cuja absorbância foi considerada 100%.

Figura 37. Percentual de viabilidade celular do grupo controle (C) e tratado com

lectina da Pterocladiela capillacea (LPc) em diferentes concentrações. Dados

expressos em média ± desvio padrão, p < 0,05.

0

6,12

512

,5 25 50 100

0

50

100

150


Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)

C

(µg/mL)

97

6.2.4 EFEITOS VASCULARES 6.2.4.1 Pressão Arterial Média e Frequência Cardíaca.

A Pterocladiella capillacea foi utilizada nas concentrações de 1,3,10,30,100 e

300g/mL. Demonstrou-se que não houve alterações significativas na pressão

arterial média (figura 38 ) ou na frequência cardíaca ( figura 39 ) .

Figura 38 – Pressão arterial média nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

lectina da Pterocladiella capillacea ( LPc) em diferentes concentrações, *p<0.05.

1 3 10 30 100

300

0

20

40

60

80

100

120P.c

salina


PA

M %

(mm

Hg

)

LPc

(µg/mL)

98

Figura 39 - Frequência cardíaca nos grupos controle (n=6) e tratados (n=6) com

lectina da Pterocladiella capillacea (LPc) em diferentes concentrações, *p<0.05.

1 3 10 30 100

300

0

20

40

60

80

100

120P.c

salina


Fre

qu

ên

cia

card

iaca%

(b.p

.m)

LPc

(µg/mL)

99

7 DISCUSSÃO

Diversas substâncias oriundas de produtos naturais já tem demonstrado

ampla e importante contribuição como ferramentas farmacológicas, por

apresentarem os mais variados efeitos biológicos (ZHANG, et al, 2010). As

macroalgas marinhas são exemplo dessa fonte de susbstâncias com efeitos

biológicos ja comprovados, como ação anti-inflamatória (Souza et al, 2009), anti-viral

(Mendes et al, 2010), antifúngica, antibacteriana (Holanda et al, 2005), dentre outros.

Embora diversas pesquisas apontem para descobertas de novos compostos

oriundos das algas efeitos renais das mesmas ainda precisam ser melhor

investigados.

As lectinas e polissacarideos constituem-se como alguns dos componentes

mais explorados nas macroalgas por sua ampla utilização em diversas áreas, como

a indústria alimenticia e a indústria bioquimica farmacêutica. No entanto, de acordo

com Teixeira et al, (2012) ainda são poucos os estudos sobre a aplicabilidade

biotecnólogica das lectinas de algas marinhas, o que pode ser em decorrência da

baixa rentabilidade do processo de purificação das lectinas.

As lectinas apresentam características específicas, uma delas é a capacidade

de ligação específica a carboidratos e dessa forma podem se combinar com glico

componentes da superfície celular. A maioria das lectinas de algas apresentam

baixas massas moleculares quando comparadas às derivadas de plantas terrestres,

e essa característica pode tornar tais proteínas moléculas mais apropriadas para o

uso em ensaios biológicos (ROGERS, HORI, 1993; WIEIS et al, 1996).

Perfusão renal

Os rins são orgãos expostos a ação de toxinas e diversas substâncias em

consequência de sua funções de absorção, filtração, secreção, excreção e intenso

fluxo através dos tecidos (RYMUSZKA et al, 2009). Os rins recebem grande

quantidade de sangue, mais de 1L/min, correspondendo a cerca de 20% do débito

cardíaco (EATON et al, 2006). Nos rins podem ser verificadas mudanças provocadas

por toxinas oriundas de drogas ou de susbtâncias naturais, por que muitas dessas

toxinas e de seus metabólitos são filtrados nesse orgão. Células do túbulo contorcido

proximal podem com frequência concentrar e absorver nefrotoxinas e assim permitir

maior efeito tóxico das mesmas (RYMUSZKA et al, 2009).

100

Os resultados obtidos com a lectina da alga Caulerpa cupressoides em sistema

de rim isolado demonstraram alterações nos parâmetros renais. Observou-se

aumento na Pressão de Perfusão(PP) e Resistência Vascular Renal(RVR) aos 90 e

120 minutos. Os efeitos de aumento de PP e RVR podem ser decorrentes de uma

ativação de α1 -adrenoreceptores presentes nas arteríolas aferentes (STRASEER et

al., 1992). O aumento da RVR também pode ter decorrido de ação secundária à

redução do Fluxo de Perfusão Renal (FPR). A ativação renal do receptor adenosina

tipo A1-R na arteríola aferente promove vasoconstricção que reduz a taxa de

filtração glomerular e fluxo sanguíneo renal (MODLINGER e WELCH, 2003). As

resistências das arteríolas aferentes e eferentes correspondem a maior parte da

Resistência Vascular Renal (RVR). O aumento da resistência em arteríolas renais,

ocasiona redução do FSR, isto por que o FSR é determinado pela pressão na artéria

renal e pelo estado contrátil do músculo liso das arteríolas renais, arteríolas

aferentes e eferentes (EATON; POOLER, 2005). No entanto, um posterior aumento

na resitência a nivel de arteríola eferente explicaria o aumento do Fluxo Urinário por

aumentar a Taxa de Filtração Glomerular (EATON; POOLER, 2005).

O Ritmo de filtração glomerular com a LCc reduziu no tempo de 60 minutos,

voltando ao valor próximo do controle aos 90 e 120 minutos. A liberação de

substâncias vasoconstritoras atuando a nivel de arteríolas aferentes reduzem o fluxo

sanguineo renal e o ritmo de filtração glomerular. O rim através do aparelho justa

glomerular reajusta o RFG à valores normais por meio de um mecanismo auto

regulatório (CONSTANZO, 2004).

A LCc promoveu redução do percentual de transporte do sódio, potássio e

cloreto aos 60, 90 e 120 minutos. O processo de reabsorção do sódio, em grande

parte, se dá por um processo transcelular ativo, proporcionado pela sódio-potássio-

adenosina-trifosfatase (NA-K-ATPase), e a reabsorção de cloreto, é parte por

transporte ativo e parte por passivo, mas depende muito do transporte de sódio. A

reabsorção do potássio é realizada em parte por transportador Na-K-2Cl da

membrana luminal e parcialmente por difusão paracelular. No entanto, como o

transporte acoplado Na-K-2Cl depende da Na-K-ATPase a reabsorção do potássio

depende parcialmente da reabsorção do sódio. Em trabalhos realizados por Nobre et

al, (2003) demonstrou-se que a toxina de microalgas, Microcistina (MC-LR)

estimulou ação de mediadores pró-inflamatórios pelos macrófagos o que promoveu

uma nefrotoxicidade em rins de ratos perfundidos. A presença de agentes pró-

101

inflamatórios no sobrenadante de macrófagos poderia justificar o aumento da

excreção de água e eletrólitos sódio, potássio e cloreto. Experimento inicial foi

realizado com a LCc com cultura de macrófagos peritoneais verificando aumento na

expressão de agentes pró-inflamatórios como IL1 e IL4 e TNFα. A LCc da mesma

maneira que MC-LR reduziu o transporte de Na+ (%TNa), K+ (%TK+) e Cl-(%TCl-). No

entanto estudos adicionais ainda precisam ser realizados para elucidação do

mecanismo celular da LCc a nível de macrófagos e dos mediadores pró-

inflamatórios.

A LPc promoveu redução do Fluxo urinário aos 120 minutos, sem alterações da

pressão de perfusão e de resistência vascular renal. Observou-se aumento no

percentual de transporte tubular de sódio aos 60 e 120 minutos, sem alterações

significativas no percentual de transporte de potássio (%TK+) e cloreto (%TCl-),

indicando que a LPc interfere nos parâmetros de transporte do sódio mas não altera

a fisiologia renal do potássio e cloreto. O aumento no percentual do transporte

tubular de sódio pode ter sido responsável pelo menor aporte de agua ao túbulo, o

que foi verificado pelo redução do fluxo urinário em tempos semelhantes, isto é aos

60 e 120 minutos, isto por que a reabsorção da água e de solutos, principalmente o

sódio, em alguns segmentos do néfron ocorrem na mesma medida, havendo menor

excreção de solutos acompanhado de menor excreção de água (EATON et al, 2006).

O exame histológico dos rins perfundidos com LCc mostrou deposição de

material proteináceo na luz dos túbulos. De acordo com os resultados de perfusão

renal que mostrou aumento na PP e RVR, o aumento da pressão pode promover

passagem de proteinas para os túbulos. O aumento na pressão hidrostática também

pode levar a extravazamento de líquidos explicando a expansão do espaço

intersticial (edema). A LCc não promoveu alterações vasculares renais. Vanderlei

(2008) avaliou a toxicidade aguda da LCc em camundongos (9mg/Kg/ via i.v.),

verificando o peso do orgãos e dosagens bioquimicas, de uréia, TGP e TGO.

Nenhum dos parâmetros avaliados apresentou aumento quando comparados ao

grupo controle, sugerindo que a LCc mesmo em dose mais alta que a usada no

presente trabalho não causou alterações no perfil renal. A uréia e a creatinina são

metabólitos que avaliam a função do rim e a medida da uréia e creatinina

plasmáticas revelam a concentração destas na urina, avaliando com fidelidade a

taxa de filtração glomerular (EATON et al, 2006).

102

O exame histológico da LPc evidenciou discreta deposição de material

proteináceo no interior dos túbulos contorcidos distais e alterações na arquitetura

renal. Resultados de toxicidade aguda com lectina de uma alga vermelha Solieria

filiformis (9mg/kg/i.v./7 dias) mostraram que o peso do rim /massa corpórea não

alterou após tratamento com lectina, assim como a dosagem de uréia e a análise

histológica (ABREU , 2012). Silva et al ( 2012), obtiveram resultados semelhantes ao

avaliar a lectina da Pterocladiella capillacea (mg/Kg/i.v/14 dias) em camundongos,

não observando alterações na dosagem de úreia e nem no peso do rim /massa

corpórea.

Algumas toxinas produzidas por microalgas apresentam maior potencial de

nefrotoxicidade quando comparadas à macroalgas. RYMUSZKA et al, (2009),

relataram estudos de nefrotoxicidade de cianotoxinas, produzidas por microalgas,

onde verificou-se a toxicidade renal da Microcistina –LR (MC-LR). Nobre et al.

(2003), realizaram série de estudos com MC-LR observando intensa deposição de

material proteináceo nos espaços urinários além de promover alterações nos

parâmetros vascular, glomerulares e urinários.

Citotoxicidade

O estudo de citotoxicidade da LCc e LPc com células renais MDCK mostrou

que ambas não alteraram a viabilidade celular, isto é não apresentam efeito

citotóxico in vitro.

Ensaio com Artéria Mesentérica

O Estudo da LCc em modelo de artéria mesentérica foi realizado com o intuito

de verificar algum efeito relaxante vascular. Este método de investigação tem sido

uma importante ferramenta em buscar componentes vasoativos e substâncias

vasorelaxantes. A partir de tecido pre-contraído com K+ e fenilefrina as substâncias

são a princípio avaliadas quanto ao possivel mecanismo de ação envolvido. O K+

age a nível de membrana e causa a abertura dos canais de Ca+ voltagem

dependente, retornando a membrana para o seu potencial de repouso uma vez que

ele não atua via receptores. A fenilefrina é uma droga simpatomimética, age a nível

de receptores, sendo agonista alfa, e promove aumento da resistência arterial e em

consequência aumento da pressão arterial. O ensaio da LCc em artéria mesentérica

visava inicalmente pesquisar algum efeito vascular semelhante a de outras lectinas

103

de algas. Lima et al (2004), utilizaram lectina da alga vermelha Bryothamnion

triquetrum em anéis de aorta de ratos, verificando a inibição de efeito relaxante da

lectina pela L-NAME, indicando envolvimento do NO. Os resultados com LCc

mostraram efeito relaxante em concentrações acima de 100µg/mL, considerada alta

quando comparado a outros estudos, e foi mais expressivo quando o tecido foi pré-

contraído com fenilefrina a 1µmol. Trabalho de Magalhães et al (2011), avaliaram o

efeito relaxante da Sertralina, susbtância que atua como antidepressivo, em

segmentos de arteria mesentérica em concentrações de 0.3–100 µmol. Os autores

verificaram inibição da contração promovida pelo K+ 60 mM com IC50 de 23,3. No

estudo com a LCc o efeito relaxante obtido após o uso da fenilefrina sugere a via de

ação através de receptores acoplados a membranas. Em células musculares lisas a

ativação de receptores adrenérgicos alfa 1, através da via de fosfolipase-IP3,

proteina G, promove o influxo de cálcio pela membrana. O aumento do cálcio

citoplasmático promove a ligação deste à calmodulina que ativa uma quinase de

cadeia leve de miosina, a qual fosforila a cadeia de miosina, promovendo a interação

da actina com miosina levando à contração. A redução do cálcio citoplasmático faz

com que haja desacoplamento do complexo cálcio-calmodulina, com inativação da

quinase de cadeia leve da miosina e desfoforilação da cadeia leve de miosina

promovendo o relaxamento muscular. Dessa forma a provável via de ação da LCc se

dá com a abertura de canais de Ca+ operados por receptor via fosfolipase C e

proteina Gq. As lectinas apresentam capacidade de ligação a carboidratos de

membranas, e isto é um dos mecanismos que explicam a maior parte dos efeitos

biológicos das mesmas (JEPSON et al, 2004). De acordo com Lima et al (2004), a

inibição de efeito relaxante da lectina da B. Triquetrum pela L-NAME, indicou

envolvimento da via do NO, sugerindo a hipótese de mecanismo semelhante para a

LCc, porém os resultados com a LCc mostraram efeito de relaxamento vascular bem

mais discreto do que os apresentados por Lima et al, (2004). Trabalhos que utilizam

a via de canais de potássio para verificar atividade de relaxamento vascular com

lectinas de algas ainda são escassos, não podendo extrapolar os resultados obtidos

por Lima et al, (2004) para a LCc, sendo necessária a realização de outros estudos

para verificar o mecanismo de ação dessa lectina em ensaio com artéria

mesentérica.

104

Pressão Arterial e Frequência cardíaca

A LCc promoveu redução da Pressão Arterial Média (P.A.M.) nas

concentrações de 100 e 300 µg/mL sugerindo que este efeito pode ser dose-

dependente. O sistema Nervoso Autônomo (SNA) controla muitas funçôes do

organismo como a redistribuição do fluxo sanguíneo para diferentes partes do corpo.

Esse controle se dá pelo aumento da pulsação cardíaca promovendo assim controle

rápido da P.A.M. Sabe-se que estimulos do SNA eleva P.A. rapidamente, por isso os

mecanismos de controle operam constantemente para manter a P.A. dentro dos

valores normais (GUYTON, 2002). A LCc não promoveu pico ou redução brusca de

pressão arterial e provavelmente a lectina tenha atuado através de liberação de

componentes vasodilatadores. Diversas substâncias são formadas a partir do

endotélio e liberadas na corrente sanguínea e dentre estas encontram-se as cininas

que são potentes vasodilatadores. As cininas são rapidamente geradas por ação das

enzima proteolíticas, sendo a calicreína uma das mais importantes. A calicreína

encontra-se no sangue sob sua forma inativa e é ativada por injúrias químicas ou

físicas em células sanguíneas ou tecidos. A calicreina ativada atua na alfa2- globulina

para liberar calidina que é rapidamente convertida em bradicinina, que por sua vez é

uma cinina que promove dilatação arteriolar. Sabe-se que as prostaglandinas

também possuem importante efeitos celulares e algumas podem causar

vasodilatação (GUYTON; HALL, 2002).

A LCc não promoveu alteração na frequência cardíaca (F.C.) nas

concentrações avaliadas. No entanto mesmo sob influências do SNA, de acordo com

a lei de Frank-Starling, que afirma que as fibras cardíacas se adaptam a uma nova

condição, mudanças discretas na P.A. não irão alterar a F.C.

A LPc não alterou a Pressão Arterial Média e nem a Frequência Cardíaca nas

concentrações avaliadas. Esses resultados são coerentes com os de perfusão renal,

pois não houve alteração nos parâmetros de pressão de perfusão e resistência

vascular renal. A LPc provavelmente não promove liberação de agentes

vasoconstritores.

Resultados diferentes obtidos com lectinas das algas C. cupressoides e P.

capillacea são esperados, pois embora o componente utilizado tenha a mesma

origem protéica, ou seja a lectina, sabe-se que diferenças no habitat, temperatura

das águas, salinidade, dentre outros, podem afetar não somente os componentes

das algas como também os níveis de cada componente. Condições de adaptação

105

das algas ao meio ambiente como intensidade luminosa, raios UV, extremos de

temperatura, poluentes, dentre outros foram responsáveis por grande diversidade de

estrutural de metabólitos secundários nos organimos marinhos (MAYER et al., 2005).

A pigmentação e portanto, a composição geral das algas está relacionada a seus

efeitos biológicos. Sabe-se que algas pardas apresentam maior atividade

antioxidante que as verdes e vermelhas (LE TUTOUR et al., 1998). Pesquisas

revelaram que a utilização de diferentes metodologias na extração de

polissacarídeos sulfatados, que são carboidratos presentes na algas, pode ocasionar

variação no rendimento de proteínas, alterações nas características físico-químicas

e nas atividades biológicas (CAMPO et al., 2009). Dessa forma os resultados neste

trabalho obtidos com algas e componentes protéicos das mesmas não podem ser

extrapolados para exemplares diferentes.

A lectina da alga Caulerpa cupressoides foi capaz de promover alterações

hemodinâmicas renais, com aumento da pressão de perfusão e resistência vascular

renal. Observou-se redução do percentual de transporte de sódio, potássio e cloreto

aos 60, 90 e 120 minutos. A deposição de material proteináceo foi observada nas luz

dos túbulos renais e glomérulos. A LCc promoveu redução da pressão arterial média

em concentrações igual ou maior que 100µg/mL, não alterando a frequência

cardíaca. A LCc não alterou a viabilidade de células renais de cães -MDCK e

promoveu o relaxamento do músculo liso em tecido pré-contraído com fenilefrina 1

µmol.

A lectina da alga Pterocladiela capillacea reduziu o fluxo urinario, não

verificando alterações na pressão de perfusão, resistência vascular renal e ritmo de

filtração glomerular. Houve aumento no percentual do transporte tubular de sódio

aos 90 e 120 minutos. A LPc não alterou a viabilidade de células renais de cães

MDCK, e não promoveu alterações na pressão arterial média e frequência cardíaca.

106

8. Conclusões

A lectina da alga Caulerpa cupressoides causou alterações hemodinâmicas

renais, com aumento da Pressão de Perfusão e Resistência Vascular Renal, com

provável ação em alfa-adrenoreceptores em arteríolas renais.

Na análise histológica do rim observou-se deposição de material proteináceo

na luz tubular e desarranjo da arquitetura renal, o que pode ser explicado em

decorrência do aumento da Pressão de Perfusão renal promovendo extravazamento

de proteínas e edema.

O efeito relaxante demonstrado em artéria mesentérica sugere o acoplamento

farmacomecânico, envolvendo a abertura dos canais de Ca+ operados por

receptores, como possível via de ação da lectina da Caulerpa cupressoides.

A lectina da Caulerpa cupressoides promoveu redução da Pressão Arterial

Média o que ser em decorrência da liberação de susbtâncias relaxantes a partir do

endotélio.

A lectina da Pterocladiella capillacea causou alterações hemodinâmicas

renais, com aumento do transporte tubular de sódio e redução do fluxo urinário, não

alterando a Pressão de perfusão e Resistência Vascular Renal.

A lectina da Pterocladiella capillacea promoveu deposição de material

proteináceo nos túbulos renais e degeneração do epitélio tubular.

As lectinas da algas Caulerpa cupressoides e Pterocladiella capillacea não

apresentaram efeitos citotóxicos em células tubulares renais -MDCK.

107

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