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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
THIAGO FERNANDES MARTINS
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UM INIBI DOR TIPO BOWMAN-BIRK DE SEMENTES DE Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke
FORTALEZA-CE
2015
THIAGO FERNANDES MARTINS
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UM INIBI DOR TIPO BOWMAN-BIRK DE SEMENTES DE Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira.
FORTALEZA-CE
2015
THIAGO FERNANDES MARTINS
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UM INIBI DOR TIPO BOWMAN-BIRK DE SEMENTES DE Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Dissertação aprovada em: _09_/_Março_/ 2015.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
Profª. Drª. Ilka Maria Vasconcelos
Universidade Federal do Ceará (UFC)
Drª. Hévila Oliveira Salles
Embrapa Caprinos e Ovinos
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar (sempre), agradeço a Deus por TUDO que tem feito por
mim, uma vez que, sem Ele à frente na minha vida, não estaria tornando meus sonhos
em realidade. Faço minhas palavras as do salmista: “Louvai ao Senhor, porque Ele é
bom, porque sua benignidade é para sempre” SL 118:1.
A minha mãe Roselia Fernandes Martins, por estar SEMPRE ao meu lado
cuidando de mim, por não medir esforços para me ajudar, como por exemplo, deixar
seu conforto em casa para dormir algumas noites no laboratório. TE AMO!
A minha namorada Kamilinha, por estar comigo nessa caminhada, me dando
forças, me incentivando a seguir. Agradeço por tornar mais agradável essa minha
jornada. Já foram concluídos dois TCC nos quais tive o prazer de agradecê-la por ser
essa coisa linda em minha vida, e vamos ao terceiro! “Em alguns momentos, trocaria
uma proteína pura por um abraço e um beijo seu”.
Agradeço novamente a Deus por ter me dado essas duas criaturas citadas
acima.
A minha irmã Marcela Vieira, por me abrigar com muito prazer em sua casa,
me dando um quarto e um de seus ventiladores, apesar de ter esquecido e me deixar
no calor uma noite. Pelos ótimos momentos juntos, conversas, brigas e tudo mais. Te
amo!
Aos GRANDES amigos da UERN pelo carinho, incentivo e por acreditarem
que eu seria capaz. Agradeço especialmente ao chefe Hélio, por ter me guiado até
aqui. À Raquel Queiroz, por ser essa louca por bioquímica, sempre me instigando a
estudar mais e querer saber mais, pelas valiosas conversas e correções sempre
oportunas. Muito obrigado!
Ao professor Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, exemplo de ética e
profissionalismo dentro do DBBM. Meu muito obrigado por ter me aceitado em seu
laboratório no qual pude realizar esta pesquisa, pelos ensinamentos e pelos esforços
realizados nessa reta final para que esta dissertação fosse concluída.
À professora Dra. Ilka Maria Vasconcelos, pelo apoio científico que me foi
dado, sendo de grande contribuição para a conclusão dessa dissertação.
Aos colegas de laboratório, aqui vão meus agradecimentos. Fredy, MUITO
obrigado pela orientação em grande parte dessa minha caminhada no lab. 1085,
cresci muito cientificamente e como pessoa com vc. Obrigado pelas caronas. Ao
grande Pedro, por me acolher como um irmão no lab. 1085 (mesmo que em troca eu
lavasse suas vidrarias), pelas raivas, por nunca deixar organizada sua bancada, pelas
perturbações, pelos abraços bestas, pelas valiosas dicas em minhas pesquisas e por
todo incentivo e carinho. Ao colega Rodolpho BBD Guedes, pela sugestão, MAIS QUE
OPORTUNA, de mudar o foco de minha pesquisa, pelas ligações atendidas e por todo
o apoio que me tem dado. A minha IC favorita Louise Magalhães, carinhosamente
apelidada de Loló, pela confiança carinho e respeito que tens por mim e pela ajuda
(braçal) que me foi dada para que esse trabalho fosse concluído. A Ana Lú, pelos
momentos agradabilíssimos no lab 1085, tu és muito massa ó! A Anna Lídia, pelas
caronas, pelo convívio agradável no lab. Ao chapa Handerson, por ser caixa eletrônico
do 1085. A Ivna dôida, pelas risadas, caronas, raivas, PERTURBAÇÕES, só! A Laris
linda, pela disposição em sempre me ajudar no que for preciso, ou seja, lavar tubos.
Ao chico Manel, por estar sempre sorrindo por nada, por não fazer as coisas quando
lhe é pedido (à exemplo descartar as vidrarias quebradas do isopor). Ao Luca, por
querer a cada me matar de raiva, porque é isso que você quer! Obrigado pelo convívio
agradável no lab. 1085. A Viviane (ovelha perdida) pelo período em que me auxiliou
(lavando tubos) em meus experimentos. A Jordanya (Jojó) pelo auxílio quando lhe é
pedido e pelo carinho.
Aos colegas do LABTOX, pela disponibilidade em ajudar sempre que
precisei.
Aos demais colegas do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
meu muito obrigado por tornar menos estressante essa etapa de minha vida.
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições:
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da
Universidade Federal do Ceará (DBBM-UFC );
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
bolsa de Pós-Graduação concedida ao autor, por meio de convênio com o Programa
de Pós-Graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará.
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), por
meio de convênio com o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica do
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular do Centro de Ciências da
Universidade Federal do Ceará.
“Tudo o que temos de decidir é o que fazer
com o tempo que nos é dado.”
J. R. R. Tolkien
RESUMO
Inibidores de proteases vegetais são proteínas de baixa massa molecular, geralmente
presentes em altas concentrações nos tecidos de armazenamento, particularmente
em sementes de plantas pertencentes à família Fabaceae. Neste estudo, um inibidor
de proteases pertencente à família Bowman-Birk (LzaBBI) foi purificado a partir do
extrato salino de sementes de Luetzelburgia auriculata. Após fervura desse extrato
salino, o inibidor foi purificado por cromatografia de afinidade em matriz de
anidrotripsina-Sepharose® 4B, seguido de cromatografia em matriz de troca iônica
(DEAE Sepharose) e cromatografia em fase reversa. Em condições redutoras, ou não,
o LzaBBI apresentou massa molecular aparente de 17,3 kDa, e uma única cadeia
polipeptídica. Sua sequência NH2-terminal possui alta similaridade com inibidores do
tipo Bowman-Birk de leguminosas. O LzaBBI permaneceu estável após fervura a 98
°C por 120 min, bem como após incubado na faixa de pHs entre 2 a 11. Além de
possuir relevante estabilidade estrutural, de importância para futuras aplicações
biotecnológicas, apresentou efeito negativo no crescimento da bactéria
Staphylococcus aureus, quando em baixas concentrações.
Palavras-chave: Inibidor de protease do tipo Bowman-Birk, Luetzelburgia auriculata,
Staphylococcus aureus.
ABSTRACT
Plant protease inhibitors are proteins of low molecular weight, usually present in high
concentrations in storage tissues, particularly in seeds of species belong to the
Fabaceae family. In this study, a Bowman-Birk protease inhibitor (LzaBBI) was purified
from the saline extract of the Luetzelburgia auriculata seeds After boiling of this saline
extract, the inhibitor was purified by affinity chromatography on Sepharose® 4B-
anhydrotrypsin, followed by ion exchange chromatography on DEAE Sepharose and
reverse phase chromatography. Under reducing conditions or not, LzaBBI showed an
apparent molecular mass of 17.3 kDa and a single polypeptide chain. The NH2-terminal
sequencing of the LzaBBI showed high similarity with other Bowman-Birk inhibitors of
legumes. LzaBBI remained stable after boiling at 98 °C for 120 min and also remained
stable with trypsin inhibitory activity after incubation in pH buffers with pHs varying from
2 to 11. In addition to its relevant structural stability, of importance in future
biotechnological applications, LzaBBI showed negative impact on the Staphylococcus
aureus development when at low doses.
Keywords: Bowman-Birk inhibitor, Luetzelburgia auriculata, Staphylococcus aureus.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – DISTRIBUIÇÃO E PARTES DA PLANTA ............................................................. 22
FIGURA 2 – ESQUEMA DA INTERAÇÃO ENTRE AS CADEIAS LATERAIS DOS RESÍDUOS DE
AMINOÁCIDOS DE UM PEPTÍDEO SUBSTRATO OU INIBIDOR E OS RESÍDUOS DO SÍTIO
CATALÍTICO DA ENZIMA .......................................................................................... 30
FIGURA 3 – ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE INIBIDORES PROTEICOS DE PROTEASES
SERÍNICAS ............................................................................................................ 32
FIGURA 4 – ESQUEMA DE OBTENÇÃO DO EXTRATO FERVIDO (EF) DE PROTEÍNAS EXTRAÍDAS
DA FARINHA DE SEMENTES DE L. AURICULATA ......................................................... 42
FIGURA 5 – ESQUEMA DA ANIDROTRIPSINA ACOPLADA A SEPHAROSE® 4B ....................... 44
FIGURA 6 – ESQUEMA DE PURIFICAÇÃO DO INIBIDOR DE PROTEASE A PARTIR DO EXTRATO
AQUOSO PROTEICO DE SEMENTES DE L. AURICULATA, PREVIAMENTE FERVIDO (98 °C)
POR 20 MIN .......................................................................................................... 47
FIGURA 7 – EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DO
EXTRATO TOTAL (ET) OBTIDO DE SEMENTES DE L. AURICULATA, APÓS SER FERVIDO (98
°C) POR 0, 10, 20, 30, 40, 50 E 60 MIN .................................................................. 59
FIGURA 8 – PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE, 12,5% V/V;) DO EXTRATO PROTEICO
TOTAL DA FARINHA DE SEMENTES DE L. AURICULATA APÓS TER SIDO FERVIDO (98 °C)
DURANTE DIFERENTES TEMPOS .............................................................................. 60
FIGURA 9 – EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO NA ATIVIDADE INIBITÓRIA DE TRIPSINA E
QUIMOTRIPSINA .................................................................................................... 61
FIGURA 10 – PERFIL TÍPICO DA CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE, EM COLUNA DE
ANIDROTRIPSINA-SEPHAROSE® 4B, DO EXTRATO TOTAL PREVIAMENTE FERVIDO (98 °C)
POR 20 MIN .......................................................................................................... 62
FIGURA 11 – PERFIL CROMATOGRÁFICO OBTIDO EM COLUNA DE TROCA ANIÔNICA (HITRAPTM
DEAE FF) ACOPLADA A UM SISTEMA DE CROMATOGRAFIA ÄKTAPRIME PLUS (GE
HEALTHCARE, UPPSALA, SUÉCIA) .......................................................................... 64
FIGURA 12 – PERFIL CROMATOGRÁFICO DO FNR-DEAE, ORIUNDO DA CROMATOGRAFIA DE
TROCA ANIÔNICA, EM COLUNA DE FASE REVERSA C-18 ............................................ 65
FIGURA 13 – PERFIL ELETROFORÉTICO (SDS-PAGE, 15%) DAS FRAÇÕES OBTIDAS
DURANTE OS PASSOS DE PURIFICAÇÃO DO LZABBI DE SEMENTES DE L. AURICULATA ... 68
FIGURA 14 – ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (12,5% V/V) DO INIBIDOR
PURIFICADO NA PRESENÇA E AUSÊNCIA DE AGENTE REDUTOR ................................... 69
FIGURA 15 – ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (15%) PARA DETECÇÃO DE
GLICOPROTEÍNA PELO MÉTODO DO ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF ............................... 71
FIGURA 16 – ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA NH2-TERMINAL DO LZABBI COM SEQUÊNCIAS DE
OUTROS INIBIDORES DA FAMÍLIA BOWMAN-BIRK, DE ESPÉCIES DE LEGUMINOSAS,
DEPOSITADAS NO NCBI, OBTIDA UTILIZANDO A FERRAMENTA DE ALINHAMENTO
CLUSTAW .......................................................................................................... 72
FIGURA 17 – DETERMINAÇÃO DA IC50 .......................................................................... 74
FIGURA 18 – ESTABILIDADE TÉRMICA DO LZABBI ............................................................. 75
FIGURA 19 – ESTABILIDADE DO LZABBI EM DIFERENTES PHS. ........................................... 76
FIGURA 20 – FOTOMICROGRAFIA DA GERMINAÇÃO DE ESPOROS DE T. MENTAGROPHYTES 78
FIGURA 21 – CURVA DE CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS .................................................. 79
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – CLASSES DAS ENZIMAS PROTEOLÍTICAS E SUAS RESPECTIVAS FAMÍLIAS .......... 25
TABELA 2 – FAMÍLIAS DE INIBIDORES PROTEICOS DE PROTEASES SERÍNICAS ..................... 27
TABELA 3 – CLASSES DE INIBIDORES PROTEICOS VEGETAIS DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS ... 28
TABELA 4 – PROGRAMAÇÃO DA CROMATOGRAFIA EM FASE REVERSA ............................... 46
TABELA 5 – ETAPAS DE PURIFICAÇÃO* DO INIBIDOR DE PROTEASE BOWMAN-BIRK DE
SEMENTES DE L. AURICULATA ................................................................................ 66
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC – American Type Culture Collection
BApNA – N-benzoil-DL-arginina p-nitroanilide
BSA – Albumina sérica bovina
CHAPS – 3-[(3-Colamidopropil) dimetilamonio]-1-propano sulfonato
DEAE – Dietilaminoetil
DMSO – Dimetil sufóxido
DTT – Ditiotreitol
IEF – Focalização isoelétrica
IPG – Gradientes de pH imobilizados em géis de poliacrilamida
NCBI – National Center for Biotechnology Information
PAS – Ácido Periódico de Schiff
PMSF – Fenilmetanosulfonilfluoridro
SBTI – Inibidor de Tripsina da Soja
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo SDS
TCA – Ácido tricloroacético
TEMED – Tetrametiletilenodiamina
TFA – Ácido trifluoroacético
UI – Unidade de Inibição
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 18
1.1. O bioma Caatinga .................................. ....................................................... 19
1.2. Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke .................................. ............... 20
1.3. Proteases ......................................... ............................................................. 23
1.4. Inibidores proteicos de proteases ................. ............................................. 26 1.4.1. Mecanismo geral de inibição de proteases por inibid ores de natureza proteica ................................................................................................................. 28 1.4.2. Inibidores proteicos de proteases serínicas ................................................ 31
1.5. Hipótese e pergunta biológica ..................... ............................................... 33
2. OBJETIVOS ......................................... .............................................................. 34
2.1. Objetivo Geral .................................... ........................................................... 35
2.2. Objetivos Específicos ............................. ..................................................... 35
3. MATERIAIS ......................................... .............................................................. 36
3.1. Reagentes químicos ................................ ..................................................... 37
3.2. Material biológico ................................ ......................................................... 37 3.2.1. Material Vegetal .......................................................................................... 37 3.2.2. Fungo .......................................................................................................... 37 3.2.3. Bactérias ..................................................................................................... 38
4. METODOLOGIA ....................................... ......................................................... 39
4.1. Extração de proteínas e purificação do inibidor de sementes de L. auriculata ................................................................................................................. 40
4.1.1. Obtenção da farinha .................................................................................... 40 4.1.2. Extração das proteínas solúveis totais ........................................................ 40 4.1.3. Obtenção do Extrato Fervido (EF) .............................................................. 40 4.1.4. Cromatografia de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose® 4B .. 43
4.1.4.1. Preparo da matriz ................................................................................ 43 4.1.4.2. Acoplamento da anidrotripsina em Sepharose® 4B ............................ 43
4.1.5. Cromatografia de troca iônica ..................................................................... 45 4.1.6. Cromatografia em fase reversa ................................................................... 45
4.2. Caracterização bioquímica do LzaBBI ............................................... ......... 48 4.2.1. Dosagem de proteínas solúveis totais ........................................................ 48 4.2.2. Determinação da atividade inibitória de tripsina .......................................... 48 4.2.3. Avaliação da atividade inibitória de quimotripsina ....................................... 49 4.2.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida ........................................................ 49 4.2.5. Métodos de revelação de proteínas após corrida eletroforética .................. 50
4.2.5.1. Revelação com azul brilliante de Coomassie ...................................... 50 4.2.5.2. Revelação por nitrato de prata ............................................................. 51
4.2.6. Avaliação da possível existência de carboidrato covalentemente ligado à cadeia polipeptídica do LzaBBI .............................................................................. 51 4.2.7. Determinação da sequência NH2-terminal .................................................. 52 4.2.8. Determinação da IC50 ................................................................................. 52 4.2.9. Estabilidade térmica do LzaBBI .................................................................. 53 4.2.10. Estabilidade do LzaBBI em diferentes pHs ............................................. 53
4.3. Atividades biológicas ............................. ...................................................... 54 4.3.1. Avaliação da atividade antifúngica .............................................................. 54
4.3.1.1. Cultivo do Fungo .................................................................................. 54 4.3.1.2. Obtenção dos esporos ......................................................................... 54 4.3.1.3. Ensaio de inibição da germinação de esporos .................................... 55
4.3.2. Avaliação da atividade antibacteriana ......................................................... 55 4.3.2.1. Cultivo das Bactérias ........................................................................... 55 4.3.2.2. Ensaio de inibição do crescimento bacteriano ..................................... 56
4.4. Análise estatística ............................... ......................................................... 56
5. RESULTADOS ........................................ .......................................................... 57
5.1. Purificação do LzaBBI ............................................... ................................... 58 5.1.1. Extrato fervido ............................................................................................. 58 5.1.2. Cromatografia de afinidade ......................................................................... 62 5.1.3. Cromatografia de troca iônica ..................................................................... 63 5.1.4. Cromatografia em fase reversa ................................................................... 63
5.2. Caracterização do LzaBBI ............................................... ............................. 67 5.2.1. Grau de pureza do inibidor por SDS-PAGE ................................................ 67 5.2.2. Avaliação da existência de carboidrato covalentemente ligado à cadeia polipeptídica do LzaBBI ......................................................................................... 70 5.2.3. Sequenciamento e alinhamento NH2-terminal do LzaBBI ............................ 70 5.2.4. Determinação da IC50 .................................................................................. 73 5.2.5. Estabilidade térmica do LzaBBI .................................................................. 73 5.2.6. Estabilidade do LzaBBI em diferentes valores de pH .................................. 73
5.3. Atividades biológicas do LzaBBI ............................................... ................. 77 5.3.1. Atividade antifúngica ................................................................................... 77
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 80
7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 85
8. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 87
1 INTRODUÇÃO
19
1.1. O bioma Caatinga
Dentre os sete biomas distribuídos em todo território brasileiro, a Caatinga é o
único exclusivo do Brasil. Portanto, grande parte do patrimônio biológico existente na
região não é encontrado em nenhum outro lugar do mundo, apresentando uma das
maiores biodiversidades vegetal e animal, quando comparado a outras regiões
semiáridas do mundo (SEMACE, 2015). Este bioma está presente na maior parte dos
estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Maranhão, Pernambuco, Paraíba, Rio Grande do
Norte, Piauí, Sergipe e parte do nordeste de Minas Gerais, ocupando uma área de,
aproximadamente, 844.453 Km², correspondendo 11% de todo o território nacional.
Apesar da grande relevância no cenário nacional, este bioma tem sido desmatado de
forma acelerada e aproximadamente 46% da sua área já foi desmatada devido à
retirada de lenha ilegal para fins domésticos e industriais, ao sobrepastoreio e a
conversão para pastagens e agricultura (GIULIETTI et al., 2004; MMA, 2015).
Dados apresentados por Giulietti e colaboradores (2004) demonstram um total
de 932 espécies de plantas vasculares presentes na Caatinga e citam que há
endemismo de 18 gêneros e 318 espécies (34% do total das espécies descritas). Hauff
(2010) cita em seu trabalho que o mesmo pesquisador (apud GIULIETTI et al., 2006)
considera tais dados como incompletos, sendo o número de plantas superiores
(angiospermas e gimnospermas) maior que 1.500 espécies. É observado que nos
últimos anos tem crescido o interesse e preocupação com a Caatinga, fatos esses
relacionados aos estudos realizados na região e as novas espécies endêmicas de
animais e vegetais que são catalogadas (SILVA; OREN, 1997; HAUFF, 2010).
Portanto, estudos que ressaltem a importância de plantas exclusivas do Brasil são de
grande relevância, tendo em vista que existe uma escassez de referenciais teóricos
oriundos de tais espécies.
20
1.2. Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke
A espécie Luetzelburgia auriculata (Allemão) Ducke, conhecida popularmente
como pau-mocó, pau-de-chapada, pau-ripa, pau-serrote, apresenta quatro sinônimos
botânicos: Bowdichia freirei Ducke, Luetzelburgia brasiliensis Yakovlev, Luetzelburgia
pterocarpoides Harms e Tipuana auriculata Allemão (MAIA, 2004; LORENZI, 2008).
Sua classificação científica, segundo Cardoso (2012) é:
Família: Fabaceae � Subfamília: Papilinoideae
� Gênero: Luetzelburgia
� Espécie: Luetzelburgia auriculata
A L. auriculata é uma árvore de pequeno ou médio porte, podendo atingir 22
m de altura. Seu tronco possui casca de coloração marrom-acinzentada de aspecto
liso à rugoso. As folhas apresentam formas variáveis, coriáceas e de coloração verde
brilhante. O fruto, de aproximadamente 6 cm de comprimento e 2-2,5 cm de largura,
é achatado. Quando maduro, o fruto apresenta cor marrom e aspecto “aveludado”,
contendo apenas uma semente (MAIA, 2004; CARDOSO, 2015) (FIGURA 1).
A distribuição geográfica de L. auriculata compreende os estados da Bahia,
Ceará, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Minas Gerais, Pará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte e Tocantins,
sendo uma planta endêmica do Brasil. Sua amplitude ecológica varia desde a
Caatinga, especialmente a Caatinga arbustiva e pé de serra, cerrado e floresta
latifoliada semidecídua (CARDOSO, 2015). É amplamente utilizada na fabricação de
móveis de luxo, mas alguns trabalhos destacam a utilização de suas raízes como fonte
de nutrientes para alimentação de emergência (KIRMSE, 1983; MAIA, 2004;
LORENZI, 2008).
Pesquisas envolvendo a espécie têm sido realizadas com foco na ocorrência
da planta na Caatinga (KIRMSE, 1983) e análise filogenética (CARDOSO, 2012).
Porém, como ocorre com inúmeras espécies de plantas endêmicas do Brasil, pouco
21
se sabe a respeito do potencial biotecnológico da L. auriculata. Alguns trabalhos, no
entanto, relatam algumas potencialidades dessa planta. Oliveira e colaboradores
(2002) purificaram uma lectina a partir das sementes de L. auriculata e, depois, Melo
e colaboradores (2005) demonstraram o potencial inibitório dessa lectina sobre o
crescimento de fungos fitopatogênicos (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium
solani e Aspegillus niger). Soares e colaboradores (2007) descreveram a
caracterização e propriedade inseticida de globulinas e albuminas de sementes de L.
auriculata frente ao gorgulho que ataca o feijão-de-corda [Vigna unguiculata L.
(Walpers)], Callosobruchus maculatus, tendo sido observada nas mesmas frações
proteicas a presença de atividade inibitória de protease serínica.
Entretanto, não há relatos, na literatura, de estudos referentes à purificação
de proteínas com atividade biológica contra microrganismos patogênicos a humanos,
como, bactérias e dermatófitos.
22
Figura 1 – Distribuição e partes da planta
Fonte: www.cnip.org.br. Distribuição geográfica (A) (Cardoso, 2015) e imagens da L. auriculata, mostrando: galho com folhas (B); fruto alado (C); flor (D) e planta adulta (E).
23
1.3. Proteases
Proteases, também denominadas de peptídeos hidrolases ou, simplesmente,
peptidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas, resultando
na formação de peptídeos e/ou aminoácidos livres (BARRETT, 1994; BARRETT et al.,
2001; BERG et al., 2002; NELSON; COX, 2011).
As proteases são ubíquas na natureza, uma vez que são encontradas em todas
as formas de vida, perfazendo, aproximadamente, 2% do total de proteínas (VIEIRA,
2013). Desempenham papeis importantíssimos nos organismos, estando envolvidas
em inúmeros processos biológicos, como, por exemplo, processamento de proteínas,
digestão, sinalização celular, coagulação sanguínea, diferenciação e crescimento
celular, resposta imune, apoptose, envolvimento na replicação de vírus e
estabelecimento de processos infecciosos por microrganismos (POWERS, 2002;
CHOU, 2006).
As proteases vegetais possuem papel importante na interação
planta/patógeno, pois, em alguns casos, durante o ataque de patógenos, ocorre a
secreção destas enzimas no espaço apoplástico e os patógenos na tentativa de
ultrapassar esse mecanismo de defesa, sintetizam inibidores correspondentes às
proteases, sendo a ausência destes, por parte do patógeno, fator que reduz,
consideravelmente, sua virulência (HÖRGER; HOORN, 2013). De acordo com
Kaschani (2010), plantas que não expressam proteases durante o processo infeccioso
são altamente susceptíveis ao patógeno.
Os sítios catalíticos de cada família de proteases são formados por um grupo
específico de resíduos de aminoácidos funcionais bastante conservados entre os
organismos, indicando que os membros de uma mesma família possuem ancestral
comum (NEURATH, 1986). De acordo com a natureza química do sítio catalítico, as
proteases podem ser classificadas em quatro classes: proteases serínicas,
cisteínicas, aspárticas ou metaloproteases (TABELA 1) (TREMACOLDI, 2009;
POWERS, 2002; HEDSTROM, 2002). Outra classificação é dada quanto à posição da
clivagem de seus substratos. Enzimas que clivam na posição amino ou
carboxiterminal são classificadas como exopeptidases (aminopeptidases e
24
caboxipeptidades) e enzimas que catalisam a hidrólise no meio da cadeia
polipeptídica, são classificadas como endopeptidases (TURK, 2006).
Atualmente, uma das classificações aceitas pela comunidade científica tem
sido realizada pelo MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) que é um banco de dados
especializado em armazenar informações de proteases e inibidores de proteases.
Esse banco de dados agrupa as proteases e seus inibidores em famílias que possuam
sequências homólogas, ou seja, similaridades estatisticamente significantes em suas
sequências de aminoácidos.
25
Tabela 1 – Classes das enzimas proteolíticas e suas respectivas famílias
Fonte: Adaptado de Neurath (1990) e CORNISH-BOWDEN (2014). E.C., Código dado às enzimas pelo Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular, onde: 3, represente a classe das hidrolases; 4, sub-classe das enzimas que hidrolisam ligações peptídicas, peptidases; 21, sub sub-classe das proteinases serínicas; 22, proteinases cisteínicas; 23, proteinases aspárticas; 24, metaloproteases.
26
1.4. Inibidores proteicos de proteases
Essa classe de inibidores são proteínas ou peptídeos capazes de formar
complexos com enzimas proteolíticas, levando à inibição da hidrólise de ligações
peptídicas (FAN; WU, 2005). Os inibidores de proteases são moléculas ubíquas na
natureza (BIJINA et al., 2011) e, em plantas, são encontrados em diversos tecidos,
mas predominam, em altas concentrações (5-15% das proteínas solúveis totais), e
estão presentes especialmente nas sementes de leguminosas (BHATTACHARYYA et
al., 2006). Dependendo do órgão em que estejam presentes, desempenham as
funções fisiológicas endógenas de proteínas de reserva e no controle da quebra de
proteínas de reserva no período de dormência da semente, mas, também, atuam na
defesa vegetal contra ataques de fungos, nematoides e insetos (MANDAL et al., 2002;
RASHED; MACDONALD; MATTHEWS, 2008; KIM, 2009; ZHANG; MAO; ZENG,
2012).Os inibidores proteicos de proteases têm recebido grande atenção devido às
suas diversas aplicações biotecnológicas na agricultura e farmacologia (COPELAND,
2005; TRIPATHI; SAHASRABUDDHE; KUMAR, 2014). Estudos recentes têm
demonstrado que essas proteínas possuem atividade inibitória da proliferação de
células cancerígenas, agem interferindo no desenvolvimento de bactérias patogênicas
a humanos e, também, como agente leishmanicidas (SAVOIA; ALLICE; TOVO, 2005;
RAKASHANDA et al, 2013; COSTA et al., 2014; FEREIDUNIAN et al., 2014).
De acordo com as classes de proteases que inibem, são classificados em
inibidores de proteases serínicas, cisteínicas, aspárticas e inibidor de metaloproteases
(LASKOWSKI; KATO, 1980; RICHARDSON, 1991). Dentre os inibidores proteicos de
proteases conhecidos, os mais estudados são aqueles que inibem proteases
serínicas, sendo estes agrupados em 18 famílias, baseado em sua sequência
primária, estrutura tridimensional e mecanismo de inibição (LASKOWSKI; QASIM,
2000) (TABELA 2). Para os inibidores de proteases vegetais, esse agrupamento se
deu de acordo com a estrutura primária do inibidor (RICHARDSON, 1991), sendo as
principais famílias: Kunitz, Bowman-Birk, Batata I, Batata II e abóbora (TABELA 3).
27
Tabela 2 – Famílias de inibidores proteicos de proteases serínicas
Fonte: Modificado de Laskowski; Qasim, 2000.
28
Tabela 3 – Classes de inibidores proteicos vegetais de enzimas proteolíticas
Fonte: Adaptado de Silva (2012).
1.4.1. Mecanismo geral de inibição de proteases por inibidores de natureza proteica
A inibição das proteases ocorre pela formação de um complexo entre a enzima
e sua molécula inibitória, essa última podendo ser de origem proteica ou não. Após o
estabelecimento do complexo enzima-inibidor, ocorre a inibição, que pode ser total ou
parcial, impedindo a hidrólise do substrato, ou seja, da proteína alvo. O inibidor de
protease se liga ao sítio catalítico da enzima por meio de seu domínio ou sítio reativo
inibitório. Quando essa inibição é competitiva, o sítio catalítico da enzima é bloqueado,
29
impedindo ligação da enzima ao substrato, sendo esse efeito revertido aumentando a
concentração de substrato (BODE, 1992; OLIVA, 2010). Quando o inibidor se liga à
enzima em um sítio independente daquele de seu substrato, o mecanismo de inibição
é classificado como inibição não-competitiva, depender apenas da concentração do
inibidor (VIEIRA, 2013). Ao haver o contato enzima-inibidor, diversas interações
ocorrem entre o sítio reativo inibitório da cadeia polipeptídica e o sítio catalítico da
enzima, sendo comum alterações na estrutura da molécula inibidora, incluindo rotação
de cadeias laterais e pequenos movimentos na cadeia principal da enzima (LU, 1997;
LASKOWSKI, 2000). A Figura 2 apresenta um esquema geral desse tipo de interação,
Enzima-Inibidor, onde “S” e “P” representam os resíduos presentes no sítio catalítico
da enzima e sítio reativo inibitório, respectivamente. As interações das regiões P2’ e
P3’ às regiões S2’ e S3’ do sítio catalítico da enzima são fundamentais para a
formação do complexo Enzima-Inibidor (KROWARSCH et al., 1999). Geralmente, a
especificidade da protease pelo inibidor ocorre pela associação do resíduo S1 da
enzima ao P1 do inibidor (SCHECHTER; BERGER, 1967), sendo P1 o sítio que sofre
o ataque enzimático (FIGURA 2).
30
Figura 2 – Esquema da interação entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos de um peptídeo substrato ou inibidor e os resíduos do sítio catalítico da enzima
Fonte: Elaborado pelo autor. Peptídeo substrato ou inibidor (P), resíduos do sítio catalítico da enzima (S). O P1 é o resíduo que, geralmente, confere a especificidade da enzima.
31
1.4.2. Inibidores proteicos de proteases serínicas
Dentre as famílias de inibidores proteicos de proteases serínicas, as mais
estudadas são as famílias Kunitz e Bowman-Birk (OLIVEIRA et al., 2007). O primeiro
inibidor de planta a ser isolado e caracterizado foi o de tripsina em sementes de soja,
da família Fabaceae (BOWMAN, 1946; KUNITZ, 1947; BIRK et al., 1963), sendo o
primeiro modelo clássico metodológico para a bioquímica de inibição de proteases.
As diferenças básicas entre essas duas famílias de inibidores estão nas
diferenças de massa molecular, conteúdo de cisteína, consequentemente número de
pontes dissulfeto, e número de sítios reativos. Os inibidores da família Kunitz possuem
massa molecular entre 18 e 24 kDa, composto por aproximadamente 180
aminoácidos, possuindo quatro resíduos de cisteína, podendo formar duas pontes
dissulfeto e um único sítio reativo para a tripsina (GATEHOUSE et al., 1999; EE, 2011;
OLIVEIRA et al., 2012). Todavia, estudos recentes têm mostrado que outros sítios
reativos estão presentes nessas proteínas (FRANCO et al., 2002; GOMES et al.,
2005), possuindo atividade inibitória para papaína (OLIVEIRA et al., 2007; MIGLIOLO
et al., 2010) e α-amilase (KOIWA et al., 1997; BELITZ; GROSCH, 1997), indicando
dupla atividade.
Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) possuem massa molecular entre oito
e 10 kDa, cadeia única, e apresentam um padrão característico de 14 resíduos de
cisteínas, formando sete pontes dissulfeto intracadeia (PRAKASH et al., 1996;
ODDEPALLY, 2013), que desempenham papel importante na estabilização da
estrutura tridimensional da proteína (QI et al., 2005). Outra característica marcante da
família é a presença de dois sítios reativos, possuindo assim, capacidade de inibir a
tripsina e a quimotripsina simultaneamente. Tal propriedade rendeu a proteína o
“apelido” de inibidor de duas-cabeças (BIRK, 1985) (FIGURA 3).
32
Figura 3 – Estrutura tridimensional de inibidores proteicos de proteases serínicas
Fonte: www.rcsb.org/pdb/. Inibidor da família Kunitz (A). Inibidor da família Bowman-Birk (B).
Como já mencionado, estudos com plantas endêmicas do Brasil, que
possuam ampla distribuição na Caatinga, são de grande relevância, sendo fontes de
moléculas com atividades biológicas relevantes e com potencial de utilização como
ferramentas biotecnológicas. Embora, estudos recentes tenham relatado o efeito de
inibidores tipo Bowman-Birk (BBI) na supressão do crescimento de adenocarcinoma
(FEREIDUNIAN et al., 2014), efeito no tratamento de doenças autoimune (SAFAVI;
ROSTAMI, 2012) e com potencial inseticida (PRASAD et al., 2010), trabalhos que
relatam sua presença, purificação e caracterização a partir de plantas endêmicas do
Brasil são escassos, bem como avaliação da atividade antimicrobiana desses
inibidores.
Desse modo, levando em consideração dados que apontam inibidores de
proteases como moléculas potencialmente antimicrobianas, é que este estudo se
propõe a purificar, caracterizar e avaliar o potencial antimicrobiano de um BBI de
sementes de L. auriculata. Outro fato que reafirma a importância de purificar,
33
caracterizar e elucidar mecanismo de ação de novas proteínas com atividade
antimicrobiana é a substituição do uso de insumos que possam ser danosos ao meio
ambiente (aplicação agrícola) e seu uso como alternativa no tratamento de doenças
humanas.
1.5. Hipótese e pergunta biológica
Com base em estudos prévios que demonstraram elevada atividade inibitória
de proteases na fração globulínica do extrato proteico da farinha das sementes de L.
auriculata, é que, moléculas com atividade de inibidor de protease podem ser
purificadas e indicadas para uso biotecnológico no controle de microrganismo
patogênicos para o homem.
Assim:
• Dentre a miríade de proteínas presentes nas sementes de L. auriculata,
existem proteínas com atividades relevantes que possam ter aplicação
biotecnológica?
34
2. OBJETIVOS
35
2.1. Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo purificar e determinar alguns parâmetros
bioquímicos e biológicos de um inibidor proteico de proteases serínicas extraído de
sementes de Luetzelburgia auriculata, como premissa para seu emprego como
ferramenta biotecnológica.
2.2. Objetivos Específicos
o Estabelecer um protocolo de purificação de um inibidor proteico de proteases
serínicas do tipo Bowman-Birk presente nas sementes de L. auriculata;
o Determinar alguns parâmetros bioquímicos (massa molecular, ponto
isoelétrico, NH2-terminal, estabilidade térmica e em diferentes pHs e
determinação da IC50 frente a atividade anti-tríptica e anti-quimotríptica) do
inibidor purificado de sementes de L. auriculata;
o Avaliar o potencial antifúngico do inibidor purificado de sementes de L.
auriculata sobre a germinação de esporos de Trichophyton mentagrophytes;
o Avaliar o efeito do inibidor Bowman-Birk no crescimento de bactérias
patogênicas a humanos Gram-positiva (Staphylococcus aureus) e Gram-
negativa (Enterobacter aerogenes).
36
3. MATERIAIS
37
3.1. Reagentes químicos
Acrilamida, N,N’-metilieno bisacrilamida, tetrametiletilenodiamina (TEMED),
persulfato de amônio, azul brilhante de Coomassie G-250, azul de bromofenol, nitrato
de prata, β-mercaptoetanol, dodecil sulfato de sódio (SDS), uréia, tiouréia, CHAPS,
tampão IPG, marcadores de massa molecular, fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF),
tripsina (Trypsin from bovine pancreas, Type I, ~10,000 BAEE units/mg protein), SBTI
(Soyben Trypsin Inhibitor), N-benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide (BApNA), albumina
sérica bovina e marcadores proteicos de massa molecular foram obtidos da Sigma
Chemical Co. A matriz e coluna cromatográfica (Sepharose® 4B Ativada com Brometo
de Cianogênio e HiTrap DEAE FF respectivamente), fitas de gradientes de pH
imobilizados em géis foram obtidas da GE Healthcare®. Demais reagentes de grau
analítico como: cloreto de sódio, ácido clorídrico, hidróxido de sódio e meios de cultura
para crescimento bacteriano foram obtidos comercialmente.
3.2. Material biológico
3.2.1. Material Vegetal
Sementes maduras de Luetzelburgia auriculata (Allemao) Ducke foram
coletadas do solo, em sítios do município de Itapiúna, localizado na região do Maciço
de Baturité, estado do Ceará, Brasil.
3.2.2. Fungo
O fungo patogênico ao homem Trichophyton mentagrophytes foi obtido da
micoteca do Laboratório de Toxinas Vegetais do Departamento de Bioquímica e
38
Biologia Molecular (UFC). O fungo foi mantido em meio de cultura estéril e apropriado
(Batata Dextrose Agar -BDA) para crescimento in vitro.
3.2.3. Bactérias
Bactérias patogênicas Gram-positiva (Staphylococcus aureus – ATCC 25923)
e Gram-negativa (Enterobacter aerogenes – ATCC 13048) foram fornecidas pelo
Laboratório de Toxinas Vegetais (DBBM/UFC), sendo mantidas em meio de cultura
(Ágar nutriente - HIMEDIA®) estéril e acondicionadas em geladeira a 4 °C, no
Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa (DBBM/UFC) até o momento do ensaio.
39
4. METODOLOGIA
40
4.1. Extração de proteínas e purificação do inibidor de sementes de L.
auriculata
4.1.1. Obtenção da farinha
Sementes quiescentes de L. auriculata, foram descascadas e moídas em
moinho de lâminas do tipo Wiley. Para a delipidação da farinha foi utilizado n-hexano,
na proporção 1:3 (m/v) por 72 horas em temperatura ambiente (25 °C). Em seguida,
o solvente foi evaporado em capela de exaustão e a farinha delipidada estocada em
frasco hermeticamente fechado e conservada em temperatura ambiente.
4.1.2. Extração das proteínas solúveis totais
Anteriormente foi verificada que a fração globulínica das proteínas obtidas da
farinha da semente de L. auriculata apresenta elevada atividade inibitória de proteases
serínicas (SOARES, 2007), assim, as proteínas solúveis da farinha das sementes de
L. auriculata foram extraídas com solução salina de NaCl 150 mM, na proporção de
1:40 (m/v). A farinha foi deixada em contato, sob agitação suave por 30 minutos a 4
°C. Posteriormente, a suspenção foi filtrada em pano de trama fina e o filtrado
centrifugado a 18 000 x g por 20 min, 4 °C. O precipitado foi descartado e o
sobrenadante, denominado Extrato Total (ET), coletado para dar prosseguimento à
purificação do inibidor.
4.1.3. Obtenção do Extrato Fervido (EF)
Alíquotas do ET foram submetidas à fervura (98 °C) por 10, 20, 30, 40, 50 e 60
min para obtenção de uma fração com menor variedade de proteínas, mas que
41
mantivesse alta atividade inibitória de tripsina. Após fervura, as amostras foram
centrifugadas a 12 000 x g por 20 min, os sobrenadantes coletados e avaliados quanto
à capacidade de inibir tripsina e quimotripsina, seguido de análise do perfil proteico
por SDS-PAGE (FIGURA 4).
42
Figura 4 – Esquema de obtenção do Extrato Fervido (EF) de proteínas extraídas da farinha de sementes de L. auriculata
Fonte: Elaborada pelo autor.
43
4.1.4. Cromatografia de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose® 4B
4.1.4.1. Preparo da matriz
O preparo da matriz foi realizado por Silva (2012) de acordo com os
procedimentos descridos abaixo.
A anidrotripsina é um derivado inativo da tripsina cujo resíduo de serina do sítio
catalítico da enzima foi convertido em dehidroalanina (AKO; FOSTER; RYAN, 1974).
Nesse trabalho, anidrotripsina foi preparada segundo Fahrney e Gold (1963). Tripsina
bovina (187,5 mg) foi dissolvida em 187,5 mL de tampão Tris-HCl 75 mM, pH 7,2,
contendo CaCl2 3 mM. Essa solução foi misturada com 187,5 mL de uma solução de
PMSF (46,87 mg) e 2-propanol (18,75 mL), e incubada por 30 min a 25 °C.
Subsequentemente, essa mistura foi dialisada contra água ultrapura (Milli-Q, 5 L),
trocada cinco vezes, sendo mantida à temperatura de aproximadamente 4 °C. Após
diálise, a solução foi liofilizada. O liofilizado (PMSF-tripsina) foi tratado com KOH 50
mM gelado na relação de 50 mg para 20 mL por 12 min. A reação foi parada ajustando
o pH para 7,0 com solução de HCl (2 M). A mistura foi novamente dialisada e
posteriormente liofilizada.
4.1.4.2. Acoplamento da anidrotripsina em Sepharose® 4B
A anidrotripsina foi acoplada à matriz Sepharose® 4B ativada com brometo de
cianogênio seguindo as recomendações do fabricante (GE Healthcare®) (FIGURA 5).
Aproximadamente, 7,5 g da matriz foram lavados com 1500 mL de HCl 1 mM durante
15 min, sendo, essa solução ácida, adicionada em seis alíquotas de 250 mL, cada.
Posteriormente, a suspensão foi lavada com tampão bicarbonato de sódio 100 mM,
pH 8,0, contendo NaCl 500 mM (tampão de acoplamento). A anidrotripsina (cerca de
187,5 mg), previamente dissolvida em 37,5 mL do tampão de acoplamento, foi
misturada com a suspensão e incubada sob agitação rotatória branda, por 12 h, a 4
°C. Decorrido o tempo de acoplamento, o excesso de ligante foi removido por lavagem
44
com tampão de acoplamento (5 vezes o volume da suspensão). Os grupos reativos
remanescentes na matriz ativada foram bloqueados por meio de incubação da
suspensão com Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, por 16 h, a 4 °C. Subsequentemente, a
suspensão foi lavada (com 5 vezes o volume da suspensão), em três ciclos alternando
o pH, com os tampões acetato de sódio 100 mM, pH 4,0 contendo NaCl 500 mM e
Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 contendo NaCl 500 mM. Após esse procedimento, a matriz
agora acoplada à anidrotripsina (anidrotripsina-Sepharose® 4B) foi acondicionada em
uma coluna de vidro (6,5 x 2,1 cm).
Figura 5 – Esquema da anidrotripsina acoplada a Sepharose® 4B
Fonte: Adaptada de Silva, 2012.
Para cromatografia de afinidade em anidrotripsina-Sepharose® 4B, o extrato
fervido (98 °C) por 20 min (10 mg de proteína) foi aplicada na coluna previamente
equilibrada com Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo NaCl 500 mM (para evitar
interações inespecíficas). O material não retido à matriz (FNR-A) foi eluído com o
tampão de equilíbrio e o material retido (FR-A) eluído com tampão Glicina-HCl 50 mM,
pH 2,2, contendo NaCl 500 mM. As proteínas eluídas da coluna foram detectadas por
meio de leituras de absorbância a 280 nm em espectrofotômetro (Thermo Scientific
Genesys 10S UV-Vis).
45
4.1.5. Cromatografia de troca iônica
A matriz DEAE-Sepharose (HiTrap™ DEAE FF, aniônica fraca, 5 mL, da GE
Healthcare, Uppsala, Suécia) acoplada a um sistema de cromatografia ÄKTAprime
plus (GE Healthcare©) foi utilizada como como trocadora iônica, sendo previamente
equilibrada com tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. A fração de proteína (denominada
FR-A) retida na coluna de anidrotripsina-Sepharose® 4B e eluída com tampão Glicina-
HCl 50 mM, pH 2,2, contendo NaCl 500 mM, previamente dialisada, liofilizada e
ressuspendida em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 foi posteriormente aplicada à
coluna (4 mg de proteína) de troca iônica. O material não retido (FNR-DEAE) foi eluído
com o mesmo tampão de equilíbrio. As proteínas retidas foram eluídas com 1000 mM
de NaCl adicionado ao tampão de equilíbrio. A cromatografia foi realizada com fluxo
constante de 1 mL/minuto, sendo coletados 5 mL por tubo. A eluição de proteínas foi
monitorada pela leitura das absorbâncias a 280 nm, pelo próprio sistema de
cromatografia.
4.1.6. Cromatografia em fase reversa
O último passo cromatográfico (FIGURA 6) para purificar o inibidor de protease
(PFR-1 e posteriormente denominado LzaBBI) foi realizado a partir da fração não
retida na coluna de DEAE-Sepharose, previamente liofilizada, denominada FNR. A
FNR foi solubilizada em uma solução contendo 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) e
2% de acetonitrila (grau HPLC) em água grau Milli-Q, ultrapura (eluente A) e aplicada
em uma coluna de fase reversa (µRPC C2/C18 ST 4.6/100, GE Healthcare, Uppsala,
Suécia) acoplada a um sistema de HPLC (Waters©), com um fluxo de 0,5 mL/min,
sendo eluída com um gradiente de acetonitrila cuja programação está mostrada na
Tabela 4. As proteínas retidas na matriz foram eluídas com eluente B (0,1% de TFA e
80% de acetonitrila em água ultrapura). O material foi monitorado a 230 nm e as
frações individuais contendo proteínas foram coletadas e imediatamente congeladas
(-80 °C), liofilizadas e armazenadas a -20 °C para análises posteriores.
46
Tabela 4 – Programação da cromatografia em fase reversa
47
Figura 6 – Esquema de purificação do inibidor de protease a partir do extrato aquoso
proteico de sementes de L. auriculata, previamente fervido (98 °C) por 20 min
Fonte: Elaborada pelo autor.
48
4.2. Caracterização bioquímica do LzaBBI
4.2.1. Dosagem de proteínas solúveis totais
A dosagem de proteínas solúveis foi feita segundo metodologia descrita por
Bradford (1976). A uma alíquota de 0,1 mL do extrato total ou das frações proteicas
obtidas, 2,5 mL do reagente de Bradford foram adicionados. A mistura foi deixada em
repouso por 10 minutos e, a seguir, leituras de absorbância a 595 nm foram obtidas,
em espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Scientific, EUA). Usando o fator
de correção de uma curva pré-estabelecida com valores de concentrações conhecidas
de albumina sérica bovina (BSA), a quantidade de proteínas solúveis existente nas
amostras foi determinada.
4.2.2. Determinação da atividade inibitória de tripsina
A atividade inibitória de tripsina do ET e das demais frações proteicas foi
determinada como descrito por Erlanger, Kokowsky e Cohen (1961). Alíquotas (7 µL)
de tripsina bovina (0,3 mg/mL), solubilizadas em HCl 1 mM, foram, pré-incubadas com
685 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo CaCl2 20 mM + 100 µL da
amostra por 10 min a 37 °C. A reação foi iniciada pela adição de 500 µL de BApNA
(Nα-Benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride) 1,5 mM, previamente
solubilizado em DMSO na proporção de 1:25 (m/v) e no mesmo tampão anteriormente
descrito, sendo a reação incubada a 37 °C. Após 15 min, a reação foi parada pela
adição de 120 µL de ácido acético 30% (v/v), preparado em água grau Milli-Q. As
provas em branco foram feitas pela adição do substrato após a adição do ácido
acético. A atividade proteolítica residual da tripsina bovina foi mensurada em triplicata
no espectrofotômetro (Genesys 10S UV-Vis, Thermo Scientific, EUA) pela
absorbância a 410 nm, indicando a hidrólise do BApNA. Uma unidade de inibição (UI)
foi definida como a diminuição de 0,01 na absorbância em relação ao controle positivo
49
(100% de atividade da tripsina na ausência do inibidor) e expressa como unidade de
inibição por miligrama de proteína (UI/mgP).
4.2.3. Avaliação da atividade inibitória de quimotripsina
A atividade inibitória de quimotripsina foi determinada de acordo com Erlanger,
Kokowsky e Cohen (1961), com modificações. Vinte microlitros de solução de
quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 contendo CaCl2
20 mM) foram pré-incubados, por 15 min a 37 °C, com 0,320 mL do mesmo tampão
anteriormente descrito e 0,02 mL da amostra a ser ensaiada. Após esse período, a
reação foi iniciada pela adição de 0,5 mL de azocaseína 2% (SIGMA) (v/v), preparada
em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Decorridos 30 min, a reação foi interrompida pela
adição de 0,150 mL de solução de ácido tricloroacético (TCA) 20% (v/v), preparada
em água grau Milli-Q. A mistura reacional foi centrifugada a 10.000 x g, por 10 min, e
0,5 mL dos sobrenadantes foram aliquotados e alcalinizados com 0,5 mL de NaOH 2
M, a fim de intensificar a cor do produto de clivagem da azocaseína pela enzima. A
leitura das absorbâncias foi realizada a 440 nm e os resultados expressos em
Percentual de Inibição (%) e Unidade de Inibição (UI), definida como o decréscimo em
0,01 da absorbância a 440 nm.
4.2.4. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
A pureza das frações proteicas obtidas, e que exibiram atividade inibitória de
tripsina/quimotripsina, foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, na
presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), de acordo com a metodologia de
Laemmli (1970), mas sendo adaptado para ser desenvolvida num sistema mini vertical
50
(Hoefer® miniVE Vertical Electrophoresis System, Amersham Pharmacia Biotech, San
Francisco CA, EUA), à temperatura ambiente (23 ± 2 °C). As amostras foram
preparadas por diluição (1:3, v/v) em tampão de amostra (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8,
contendo 1% [m/v] de SDS e 0,1% [m/v] de azul de bromofenol) na presença ou
ausência de ditiotreitol (DTT) a 3,8% (m/v), sendo fervidas a 98 °C, por 5 min. Após
centrifugação (12 000 x g, 10 min, 4 °C), as amostras foram aplicadas no gel (10 x
10,5 cm) de poliacrilamida (empilhamento, 3,5% [m/v]; separação, 12,5% ou 15%
[m/v]) e a corrida realizada aplicando uma corrente de 20 mA por gel. A massa
molecular do inibidor de tripsina/quimotripsina purificado foi determinada por
comparação com padrões de proteínas de massa molecular conhecida, vendidos
comercialmente (fosforilase b, 97,0 kDa; albumina de soro bovino, 66,0 kDa;
ovalbumina, 45,0 kDa; anidrase carbônica, 30,0 kDa; inibidor de tripsina de soja, 20,1
kDa; e α-lactalbumina kDa, 14,4 kDa) com a utilização do software E-capt version 12.7
for Windows 2004-2005 (Viber Lourmat, Deutschland).
4.2.5. Métodos de revelação de proteínas após corrida eletroforética
4.2.5.1. Revelação com azul brilliante de Coomassie
Após as corridas eletroforéticas, as proteínas presentes no gel foram
reveladas seguindo a metodologia descrita por Weber e Osborn (1969), pela
incubação, por um período mínimo de 2 h, à temperatura ambiente (23 ± 2 °C), sob
agitação branda do gel em solução de azul brilhante de Coomassie R-250 a 1% (m/v),
dissolvido em metanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v) e água grau Milli-Q,
ultrapura. Após incubação, o gel foi transferido para a solução descorante composta
por ácido acético 10% (v/v) e metanol 30% (v/v) diluídos em água grau Milli-Q.
51
4.2.5.2. Revelação por nitrato de prata
Para aumentar a resolução visual das bandas proteicas, o gel foi submetido à
revelação com nitrato de prata (BLUM; BEIER; GROSS, 1987). Inicialmente, o gel foi
deixado em contato por 2 h, à temperatura ambiente (23 ± 2 °C), com solução fixadora
composta por etanol a 40% (v/v) e ácido acético 10% (v/v) em grau Milli-Q. Após
incubação, o gel foi desidratado com etanol 30% (v/v), em 2 ciclos de 20 min cada e,
ao final, uma lavagem de 20 min com água grau Milli-Q. Em seguida, solução
sensibilizadora de tiossulfato de sódio 0,1 N foi adicionada e mantida por 1 min sob
agitação branda. Decorrido esse tempo, 3 lavagens de 20 s, cada, com água grau
Milli-Q foram feitas, sendo, então, adicionada a solução de nitrato de prata (125 mg
de AgNO³ + 18,75 µL de formaldeído [37%, v/v] em 62,5 mL de água grau Milli-Q), e
a incubação mantida sob agitação branda por 20 min na ausência de luminosidade.
Após esse tempo, o gel foi submetido a 3 lavagens de 20 s cada com água grau Milli-
Q e, em seguida, incubado com a solução reveladora (1,875 g de carbonato de cálcio
+ 31,75 µL de formaldeído [37%, v/v] + 1 mL da solução sensibilizadora referida acima
em 62,5 mL de água grau Milli-Q) até o aparecimento das bandas proteicas. A reação
de revelação foi interrompida pela adição de glicina 0,5% (v/v).
4.2.6. Avaliação da possível existência de carboidrato covalentemente ligado à cadeia
polipeptídica do LzaBBI
A detecção da possível presença de carboidrato covalentemente ligado na
estrutura do inibidor purificado (LzaBBI) foi realizada por meio de SDS-PAGE, cujo
gel, após corrida eletroforética, foi revelado pelo método do Ácido Periódico de Schiff
(PAS, Sigma), como previamente descrito (ZACHARIUS et al., 1969). O gel e as
amostras foram preparados como descrito no item 4.2.4, bem como as condições de
corrida utilizadas. Ao término da corrida, o gel foi imerso em solução fixadora
consistindo de ácido acético a 7,5% (v/v) e, após 1 h, foi transferido para a solução de
52
ácido periódico a 0,2% (v/v), na qual permaneceu por 45 min, a 4 °C. Posteriormente,
o gel foi incubado com o reagente de Schiff por 45 min, a 4 °C, no escuro. Em seguida,
o gel foi lavado para remover a coloração de fundo, por meio de lavagem do gel,
repetidas vezes, com solução de metabissulfito de sódio 0,5% (v/v) em HCl 50 mM.
4.2.7. Determinação da sequência NH2-terminal
A sequência dos resíduos de aminoácidos situados na região NH2-terminal do
LzaBBI purificado foi obtida em sequenciador automático “PPSQ-23A Sequencer” da
Shimadzu Co®, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (UFC),
seguindo o método de degradação de Edman (EDMAN, 1950). Derivados PHT dos
aminoácidos foram detectados a 269 nm, após separação em coluna C18 (4.6 x 2.5
mm), eluída em condições isocráticas, de acordo com as instruções do fornecedor. A
sequência NH2-terminal do LzaBBI foi submetida a buscas por sequências
semelhantes no banco de dados do National Center for Biotecnology Information
(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), usando a ferramenta de busca BLASTP (ALTSCHUL
et al.,1990). Aquelas que apresentaram maior percentual de identidade foram
escolhidas e alinhadas utilizando a ferramenta ClustalW.
4.2.8. Determinação da IC50
A concentração de LzaBBI capaz de reduzir em 50% a atividade da tripsina e
quimotripsina (IC50) foi determinada através da construção individual de uma curva de
titulação que relaciona o percentual de inibição para cada protease e a concentração
do inibidor. Para a construção da curva, foram utilizadas concentrações do inibidor
que variam de 0,02 a 0,1 µg para a tripsina e 0,2 a 1 µg para a quimotripsina. Os
ensaios procederam como descritos nos itens 4.2.2 e 4.2.3.
53
4.2.9. Estabilidade térmica do LzaBBI
Alíquotas de 0,5 mL do inibidor foram incubadas a 98 °C (temperatura de
fervura) durante 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90 e 120 min, em banho-maria. Decorrido cada
tempo de incubação, as amostras foram resfriadas a 4 °C. Subsequentemente, 100
µL (0,1 e 0,8 µg) do inibidor foram utilizados no ensaio de atividade inibitória de tripsina
e quimotripsina, respectivamente, que foram realizados em triplicata, como descrito
nos itens 4.2.2 e 4.2.3.
4.2.10. Estabilidade do LzaBBI em diferentes pHs
O efeito do pH na estabilidade do LzaBBI foi avaliado de acordo com Gomes et
al., (2005), com modificações. Alíquotas de 1 mL do inibidor (1 e 8 µg/mL) foram
dialisadas a 4 °C contra os seguintes tampões, todos na concentração de 50 mM:
glicina-HCl, pHs 2 e 3; acetato de sódio, pHs 4 e 5; fosfato de potássio, pH 6; Tris-
HCl, pHs 7 e 8; e glicina-NaOH, pHs 9, 10 e 11 por, 1 h a 37 °C. O ensaio de inibição
da tripsina e quimotripsina foram realizados como descritos nos itens 4.2.2 e 4.2.3
utilizando 100 µL do inibidor (0,1 e 0,8 µg), respectivamente.
54
4.3. Atividades biológicas
4.3.1. Avaliação da atividade antifúngica
4.3.1.1. Cultivo do Fungo
O cultivo do fungo Trichophyton mentagrophytes foi realizado em 25 mL de
meio agar batata dextrose (BDA), distribuídos em placas de Petri (10 cm de diâmetro),
em condições estéreis, ficando mantidas em câmara de germinação do tipo B.O.D., a
27 °C, umidade de aproximadamente 70% e fotoperíodo de 12 horas (escuro x claro).
O meio de cultura foi preparado adicionando 39 g de BDA (HIMEDIA®), dissolvidos
em 1 L de água grau Milli-Q, sendo a mistura homogeneizada, fervida em banho-maria
e, posteriormente, autoclavada por 15 min, 121 °C, 1.5 x 105 Pa. Em capela de fluxo
laminar, sob condições estéreis, círculos de cerca de 1 cm de diâmetro do meio
gelificado contendo o fungo de colônias pré-existentes foram retirados e repicados
para o centro de placas de Petri contendo BDA e, em seguida, fechadas e deixadas
em BOD, nas condições descritas acima, para posterior obtenção dos esporos.
4.3.1.2. Obtenção dos esporos
A suspensão de esporos de T. mentagrophytes foi obtida após 15 dias de
crescimento do fungo. As placas de Petri foram abertas em câmara de fluxo laminar,
sob condições estéreis, e 10 mL de água estéril foram adicionados sobre a colônia
(micélio) e, com o auxílio de uma alça de Drigalski, e manuseio suave, os esporos
foram liberados. Os resquícios de hifas foram removidos por filtração dessa
suspensão em pano de trama fina, dobrado em dupla camada. A suspensão foi
ajustada para a concentração de 2,0 x 105 esporos/mL, para serem utilizados no
ensaio de inibição da germinação.
55
4.3.1.3. Ensaio de inibição da germinação de esporos
O ensaio para avaliar o efeito inibitório do LzaBBI na germinação do
dermatófito T. mentagrophytes foi realizado em placa de germinação apropriada
(polietileno), onde uma alíquota de 10 μL da suspensão de esporos (2,0 x 105
esporos/mL) + 10 μL (10 μg) do LzaBBI purificado foram incubados. Tampão Tris-HCl
50 mM, pH 7,5, contendo 20 mM de CaCl2 foi usado como controle negativo e peróxido
de hidrogênio 100 mM como controle positivo, ambos substituindo o inibidor. A placa
utilizada no ensaio foi mantida a 37 °C por 24 h em recipiente contendo papéis de filtro
umedecidos (umidade cerca de 100%) com água estéril. Decorrido o tempo de
germinação, a placa foi analisada por microscopia óptica (Olympus System
Microscope BX 60’), sendo considerado como tendo germinado o esporo que
apresentou hifa de germinação com tamanho correspondendo ao dobro do seu maior
diâmetro. Para a realização do ensaio, o LzaBBI e as soluções do controle positivo e
negativo foram previamente filtradas (TPP syringe filter, 0,22 µm, Suíça).
4.3.2. Avaliação da atividade antibacteriana
4.3.2.1. Cultivo das Bactérias
A avaliação do efeito do LzaBBI sobre o crescimento de bactérias foi realizada
seguindo a método de inibição de crescimento em meio líquido (HANCOCK, 2000).
As bactérias patogênicas S. aureus (ATCC 25923) e E. aerogenes (ATCC 13048)
foram previamente repicadas em meio de cultura agar nutriente (HIMEDIA®) 48 h
antes do ensaio. Passado o período de crescimento de 24 h, as bactérias foram
transferidas para frascos estéreis do tipo penicilina contendo caldo Mueller-Hinton (5
mL) e incubadas sob agitação suave em estufa a 37 °C por 16 horas. Em seguida, as
absorbâncias das suspensões de células foram avaliadas a 600 nm em
espectrofotômetro (Genesys 10S UV – Vis, Thermo Scientific, EUA), sendo o valor de
absorbância entre 0,08 e 0,1 (105 – 106 UFC/mL) utilizada no ensaio.
56
4.3.2.2. Ensaio de inibição do crescimento bacteriano
O ensaio foi conduzido em placas de microtitulação (TPP tissue culture
testplate, 96 poços, Suíça) em meio líquido (Mueller-Hinton, HIMEDIA®) de acordo
com o método já descrito (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003). Como controle negativo,
100 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo 20 mM de CaCl2 foram incubados
com 100 µL da suspensão de células. O controle positivo foi obtido pela incubação de
100 µL de formaldeído (10%, v/v) em 100 µL da suspensão de células. O ensaio com
o LzaBBI foi realizado pela adição de 100 µL da proteína pura (2,5, 5 e 10 µgP)
incubada em 100 µL da suspensão de células. Todos os ensaios foram realizados
com 5 repetições. A avaliação do efeito do LzaBBI sobre o crescimento bacteriano foi
monitorado pela leitura de absorbância a 630 nm em leitor de ELISA (ELx800™, Bio-
Tek instruments), realizada nos tempos 0 (controle), 1, 2, 3, 4 e 5 horas após
incubação.
4.4. Análise estatística
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e significância
das diferenças entre as médias determinadas pelo software Assistat (versão 7.7 beta)
e submetidos ao teste de Tukey (p< 0,05) (SILVA; AZEVEDO, 2009).
57
5. RESULTADOS
58
5.1. Purificação do LzaBBI
5.1.1. Extrato fervido
Devido à presença de proteínas de alta massa molecular no extrato obtido a
partir da farinha de sementes de L. auriculata, que dificultava o processo de
purificação do inibidor, o extrato foi tratado termicamente a 98 °C por diversos tempos.
Independentemente do tempo em que a amostra permaneceu a 98 °C, a concentração
de proteínas solúveis foi diminuída em, aproximadamente, 48% (FIGURA 7). Essa
diminuição se deu mais por conta de proteínas tendo massa molecular relativa entre
45 e 97 kDa (FIGURA 8), sendo similar entre os tempos de tratamento térmico
imposto. Assim, por segurança, o tempo de 20 min, a 98 °C, foi escolhido como
tratamento padrão para eliminação dessas proteínas e enriquecimento da fração
contendo o inibidor proteico de interesse.
Efeitos aditivos na atividade específica para inibição da tripsina e quimotripsina
foram observados. Após o tratamento térmico∗, foram observados aumentos de
aproximadamente 114% e 74% para inibição das atividades tríptica e quimotríptica,
respectivamente (FIGURA 9).
∗ Tratamento térmico de 20 minutos. O mesmo usado para prosseguir com o processo de purificação.
59
Figura 7 – Efeito do tratamento térmico sobre a concentração de proteínas do extrato
total (ET) obtido de sementes de L. auriculata, após ser fervido (98 °C) por 0, 10, 20,
30, 40, 50 e 60 min
Fonte: Elaborada pelo autor. Barras indicam desvio padrão da determinação em triplicata. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Tukey, p ≥ 0,05).
60
Figura 8 – Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 12,5% v/v;) do extrato proteico total da
farinha de sementes de L. auriculata após ter sido fervido (98 °C) durante diferentes
tempos
Fonte: Elaborada pelo autor. Raia M: marcadores de massa molecular; Raia 1: controle (sem aquecimento); Raias 2-7: tempos de aquecimento de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 min, respectivamente. Em cada raia foram aplicados 15 μg de proteína.
.
61
Figura 9 – Efeito do tratamento térmico na atividade inibitória de tripsina e
quimotripsina
Fonte: Elaborada pelo autor. Atividade inibitória de tripsina (A) e quimotripsina (B) do extrato total em função do tempo. Extrato total da farinha das sementes fervida (98 °C) por 0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos. Barras indicam desvio padrão da determinação em triplicata. As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Tukey, p ≥ 0,05).
62
5.1.2. Cromatografia de afinidade
A fração oriunda do extrato fervido por 20 min, a 98 °C, após dialisada contra
tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo 500 mM de NaCl, seguido de centrifugação,
foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose®
4B, previamente equilibrada com o mesmo tampão da diálise. O perfil cromatográfico
resultante (FIGURA 10) mostrou haver material não retido, sendo eluído com o próprio
tampão de equilíbrio, e destituído de atividade inibitória de tripsina e uma fração retida
na matriz, eluída percolando a coluna com tampão glicina-HCl 50 mM, pH 2,2,
contendo 500 mM de NaCl, possuindo atividade inibitória de tripsina.
Figura 10 – Perfil típico da cromatografia de afinidade, em coluna de anidrotripsina-
Sepharose® 4B, do extrato total previamente fervido (98 °C) por 20 min
Fonte: Elaborada pelo autor. A coluna foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo 500 mM de NaCl e 10 mg de proteína/10 mL foram aplicados na matriz de afinidade para separação do inibidor de tripsina. A eluição das proteínas não retidas foi feita com o tampão de equilíbrio e as proteínas retidas com tampão Glicina-HCl 50 mM, pH 2,2, contendo NaCl 500 mM, a um fluxo de 1 mL/min. Frações: 5 mL por tubo.
63
5.1.3. Cromatografia de troca iônica
A fração retida na matriz anidrotripsina-Sepharose® 4B, dialisada, liofilizada e
ressuspendida em tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, foi aplicada em coluna de troca
aniônica (HiTrapTM DEAE FF). A fração não retida na coluna (FNR-DEAE) foi eluída
com o tampão de equilíbrio (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0) e a fração retida (FR-DEAE)
com tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, contendo NaCl 1 M (FIGURA 11). As duas
frações proteicas (não retida e retida) apresentaram atividade inibitória de tripsina,
tendo a fração não retida, um menor número de bandas proteicas, quando avaliada
por SDS-PAGE.
5.1.4. Cromatografia em fase reversa
Para refinamento da purificação do inibidor de protease serínica, família
Bowman-Birk, a fração não retida na coluna de troca aniônica (HiTrapTM DEAE FF),
foi aplicada (15 µgP/mL) em coluna de fase reversa C-18 para a eliminação de
contaminantes. Testes preliminares (dados não mostrados), com vários tempos de
cromatografia e diferentes programações de gradientes de acetonitrila, foram
realizados até a obtenção da proteína LzaBBI purificada (FIGURA 12). LzaBBI foi
eluído da coluna no tempo de, aproximadamente, 15 min, sendo o material indesejado
posteriormente eluído.
64
Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido em coluna de troca aniônica (HiTrapTM DEAE
FF) acoplada a um sistema de cromatografia ÄKTAprime plus (GE Healthcare, Uppsala, Suécia)
Fonte: Elaborada pelo autor. A fração proteica, que havia sido retida em anidrotripsina-Sepharose® 4B, foi aplicada (4 mg proteina/5 mL) na coluna previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8. Para remoção do material retido, foi utilizado tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, contendo NaCl 1 M. (Fluxo: 1 mL/min; Frações coletadas: 5 mL por tubo).
65
Figura 12 – Perfil cromatográfico do FNR-DEAE, oriundo da cromatografia de troca
aniônica, em coluna de fase reversa C-18
Fonte: Elaborada pelo autor. A amostra foi aplicada em volumes de 50 µL, encerrando 15 µg de proteína. A eluição foi feita seguindo a programação descrita na tabela 4.
66
Tabela 5 – Etapas de purificação* do inibidor de protease Bowman-Birk de sementes de L. auriculata
*Purificação a partir de 5 g da farinha de sementes de L. auriculata. ** UI refere-se à unidade de inibição, onde 1 UI representa a diminuição da atividade da tripsina em 0,01 unidade de absorbância, lida em 410 nm. *** O índice de purificação obtido em cada etapa foi calculado como sendo a razão entre a sua atividade específica e aquela do extrato total. **** Calculado com base na proteína recuperada.
67
5.2. Caracterização do LzaBBI
5.2.1. Grau de pureza do inibidor por SDS-PAGE
A eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) foi realizada em condições
redutoras, sendo observado que o extrato total possui inúmeras bandas proteicas com
massas moleculares aparentes variando entre 14 a 97 kDa (FIGURA 13). A presença
de uma única banda proteica visualizada por SDS-PAGE (raia 5) indica que os passos
de purificação foram eficientes, permitindo a obtenção do LzaBBI de forma
homogênea, com massa molecular aparente estimada em 17,3 kDa.
A análise da proteína purificada em gel de poliacrilamida na presença de agente
redutor (DTT) revelou a presença de uma única banda proteica com massa molecular
aparente de 17,3 kDa, sugerindo que o inibidor purificado de sementes de L. auriculata
é uma proteína constituída por uma única cadeia polipeptídica (FIGURA 14).
68
Figura 13 – Perfil eletroforético (SDS-PAGE, 15%) das frações obtidas durante os
passos de purificação do LzaBBI de sementes de L. auriculata
Fonte: Elaborada pelo autor. Raia M: Marcadores de massa molecular; Raia 1: extrato total (ET); Raia 2: ET após fervura (98 °C) por 20 min; Raia 3: fração proteica retida na cromatografia de afinidade (anidrotripsina-Sepharose® 4B); Raia 4: fração não retida (FNR) na coluna de troca iônica; Raia 5: LzaBBI. Em cada raia foram aplicados 15 μg de proteína.
69
Figura 14 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5% v/v) do inibidor purificado na presença e ausência de agente redutor
Fonte: Elaborada pelo autor. Raia M: marcador de massas moleculares; Raia 1: LzaBBI na presença de DTT; Raia 2: LzaBBI na ausência de DTT. Foram aplicados 5 µg de proteínas em cada raia.
70
5.2.2. Avaliação da existência de carboidrato covalentemente ligado à cadeia
polipeptídica do LzaBBI
Como demonstrado pela SDS-PAGE (15%) revelada com reagente de Schiff, a
banda proteica referente ao LzaBBI não possui, aparentemente, polissacarídeos
covalentemente ligados à sua estrutura, não sendo, portanto, uma glicoproteína
(FIGURA 15).
5.2.3. Sequenciamento e alinhamento NH2-terminal do LzaBBI
A sequência NH2-terminal do inibidor purificado gerou 23 resíduos de
aminoácidos (SIPPQCHCADIRLNSCHSAQCQC) (FIGURA 16). Destaca-se a
presença de 5 resíduos de cisteína na porção NH2-terminal da cadeia polipeptídica do
LzaBBI. A análise comparativa com outras proteínas depositadas em banco de dados
(NCBI) mostrou que a sequência NH2-terminal do LzaBBI possui similaridade de 100,
91, 76, 63, 60 e 54% com sequências internas dos inibidores de protease Bowman-
Birk de Cicer arietinum, Amburana acreana, Lablab purpureus, Amburana cearensis,
Glycine max e Phaseolus vulgaris, respectivamente.
71
Figura 15 – Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) para detecção de
glicoproteína pelo método do ácido periódico de Schiff
Fonte: Elaborada pelo autor. Raia M: marcador de massa molecular revelado por nitrato de prata; Raia 1: SBTI (controle negativo); Raia 2: fetuína (controle positivo); Raia 3: LzaBBI. Foram aplicadas 10 µg de proteína em cada raia.
72
Figura 16 – Alinhamento da sequência NH2-terminal do LzaBBI com sequências de
outros inibidores da família Bowman-Birk, de espécies de leguminosas, depositadas
no NCBI, obtida utilizando a ferramenta de alinhamento CLUSTAW
Fonte: Elaborada pelo autor. Os números de acesso das sequências utilizadas na análise comparativa com o LzaBBI são: AEW50186.1 (Bowman-Birk-type protease inhibitor [Cicer arietinum]); P83284.1 (Bowman-birk type proteinase inhibitor); P83283.1 (Bowman-birk type proteinase inhibitor 2); AAK97769.1 (double-headed Bowman-Birk inhibitor, partial [Lablab purpureus]); NP_001238409.1 (Bowman-Birk type proteinase inhibitor C-II [Glycine max]) e CAE77682.1 (double-headed trypsin inhibitor, partial [Phaseolus vulgaris]). (*) indica aminoácidos idênticos e (:) indica aminoácidos conservados.
73
5.2.4. Determinação da IC50
Para determinação da IC50 do LzaBBI, as atividades inibitórias de tripsina e
quimotripsina foram avaliadas em diferentes concentrações do inibidor (ver item
4.2.9). O LzaBBI apresentou IC50 de, aproximadamente, 0,07 µg para tripsina,
enquanto que, para a inibição da quimotripsina, o LzaBBI necessitou de concentração,
aproximadamente, 11 vezes maior (0,8 µg) (FIGURA 17).
5.2.5. Estabilidade térmica do LzaBBI
Para a avaliação da estabilidade térmica, amostras do LzaBBI foram fervidas a
98 °C durante 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 120 min e sua atividade comparada com a
amostra não aquecida. Nesse ensaio, o LzaBBI mostrou ser altamente estável, pois,
mesmo com 120 min de fervura, a proteína não teve diminuição em sua atividade
inibitória para a tripsina e quimotripsina (FIGURA 18).
5.2.6. Estabilidade do LzaBBI em diferentes valores de pH
A incubação do LzaBBI em diferentes soluções tampões com valores de pH
que variaram de 2 a 11 não resultou na perda da atividade inibitória de tripsina e
quimotripsina, mesmo nos pHs extremos (2 e 11) (FIGURA 19).
74
Figura 17 – Determinação da IC50
Fonte: Elaborada pelo autor. Curva de inibição da atividade de tripsina (A) e quimotripsina (B) construída com concentrações crescentes do inibidor LzaBBI para determinação da IC50.
75
Figura 18 – Estabilidade térmica do LzaBBI
Fonte: Elaborada pelo autor. Estabilidade térmica após incubação do LzaBBI a 98 °C em diferentes tempos e posteriormente, a atividade anti-tríptica (A) e anti-quimotríptica (B) foram mensuradas. Barras indicam o desvio padrão da determinação em triplicata.
76
Figura 19 – Estabilidade do LzaBBI em diferentes pHs.
Fonte: Elaborada pelo autor. O LzaBBI foi pré-incubado por 1 h a 37 °C em diferentes intervalos de pHs e posteriormente, as atividades anti-tríptica (A) e anti-quimotríptica (B) foram mensuradas em pH 7,5. Barras indicam o desvio padrão da determinação em triplicata.
77
5.3. Atividades biológicas do LzaBBI
5.3.1. Atividade antifúngica
O LzaBBI (10 μg) não foi capaz de inibir a germinação de esporos do fungo
dermatófito Trichophyton mentagrophytes (FIGURA 20).
5.3.2. Atividade antibacteriana
Quando testado o efeito do LzaBBI sobra a bactéria E. aerogenes, este não
foi capaz de inibir ou retardar seu desenvolvimento. A avaliação do efeito do LzaBBI
frente ao desenvolvimento de S. aureus, mostrou ser o mesmo efetivo em retardar, o
desenvolvimento dessa bactéria nas concentrações de 5 e 10 µg/100 µL após 3, 4, 5
h e 2, 3, 4 e 5 h de incubação, respectivamente (FIGURA 21).
78
Figura 20 – Fotomicrografia da germinação de esporos de T. mentagrophytes
Fonte: Elaborada pelo autor. Fotomicrografia em microscópio óptico (Olympus BX60) da germinação de esporos de T. mentagrophytes incubados com: (A), 10 μg de LzaBBI em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo 20 mM de CaCl2; (B), tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo 20 mM de CaCl2; (C) peróxido de hidrogênio 100 mM (controle positivo, 100% inibição). Fotomicrografias obtidas após 24 h de incubação do fungo com as amostras indicadas. Aumento: 40x.
79
Figura 21 – Curva de crescimento das bactérias
Fonte: Elaborada pelo autor. S. aureus (A) e E. aerogenes (B) na presença e ausência (controle) do LzaBBI em diferentes concentrações.
80
6. DISCUSSÃO
81
Considerando a possibilidade de sementes de L. auriculata serem uma fonte
promissora de moléculas com importância biotecnológica, esse trabalho apresenta a
purificação e caracterização bioquímica parcial de um inibidor de proteases
pertencente à família Bowman-Birk capaz de inibir o crescimento da bactéria
Staphylococcus aureus. Uma vez que plantas da Caatinga são subexploradas e
poucas de suas moléculas conhecidas pela comunidade científica, é que pesquisas
desenvolvidas com a finalidade de detectá-las e avaliar atividades biológicas
relevantes, não somente podem fornecer novos insumos para aplicações
biotecnológicas, mas, também, evocam estudos para uso racional dessas espécies
vegetais, visando práticas de conservação da biodiversidade dos biomas brasileiros,
em especial a Caatinga.
O extrato total da farinha de sementes de L. auriculata, obtido em solução
salina (NaCl 150 mM) foi submetido a tratamento térmico, objetivando eliminar
proteínas de alta massa molecular, uma vez que, já é descrito na literatura que
inibidores proteicos de proteases são termoestáveis (FANG; WONG; NG, 2010;
KLOMKLAO et al., 2010, KLOMKLAO et al., 2011). Mesmo após 120 min de fervura
(98 °C), as atividades inibitórias específicas de tripsina e quimotripsina do LazBBI se
mantiveram estáveis (FIGURA 9), sendo o aquecimento um passo eficiente na
purificação deste inibidor. Em protocolos estabelecidos para purificação de inibidores
proteicos de proteases de duas leguminosas do gênero Vigna (Vigna unguiculata e
Vigna angularis), a primeira etapa de purificação consistiu no tratamento térmico do
extrato total a 90 °C durante 10 min, o que fez a atividade inibitória específica de
tripsina aumentar cerca de 6 e 3 vezes em relação aos controles, respectivamente
(KLOMKLAO et al., 2010; KLOMKLAO et al., 2011). De modo semelhante, essa etapa
foi realizada para a purificação do inibidor Bowman-Birk de Dolichos biflorus (KUHAR
et al., 2013).
Neste trabalho, o tratamento térmico do extrato total por 20 min foi escolhido
para dar continuidade ao processo de purificação, seguido com a aplicação do extrato
fervido em cromatografia de afinidade. Sendo um dos objetivos deste estudo purificar
um inibidor de proteases, optou-se por utilizar a cromatografia de afinidade. Já é bem
descrito na literatura o uso de cromatografia de afinidade (matriz de tripsina) para a
purificação de proteínas com atividade inibitória de tripsina (OLIVEIRA et al., 2007;
82
YOSHIZAKI et al. 2007; GU et al., 2014; KUHAR et al., 2013). Sendo a matriz
contendo tripsina, altamente seletiva às proteínas, é que o ligante escolhido para ser
acoplado em matriz Sepharose® 4B para purificação do LzaBBI, foi a anidrotripsina,
uma molécula derivada da tripsina, mas catalíticamente inativa, ou seja, não ocorre a
quebra do inibidor no momento da interação, fato esse observado por Ako e
colaboradores (1974).
O passo cromatográfico que precede ao da obtenção da proteína pura foi a
cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE Sepharose, na qual foi aplicada as
proteínas retidas na cromatografia de afinidade. A fração não retida em coluna de
troca iônica (FNR-DEAE) apresentou quatro bandas proteicas, sendo duas de alta
massa molecular e duas entre os marcadores moleculares de 20 e 14 kDa. A FNR-
DEAE após ser cromatografada em coluna de fase reversa gerou 2 picos, sendo o
primeiro referente ao LzaBBI purificado (FIGURA 12), tendo rendimento de 0,677 mg
de proteína pura a partir de 426,24 mg das proteínas solúveis total de sementes de L.
auriculata (TABELA 5). Rendimento que pode ser melhorado em uma possível
adaptação para produção em sistemas recombinantes.
A análise do perfil eletroforético desse primeiro pico oriundo da cromatografia
em fase reversa revelou a presença de uma única banda proteica com massa
molecular aparente de 17,3 kDa (FIGURA 13), estando condizente com massas
moleculares de diferentes inibidores proteicos de proteases já descritos: 22 kDa
(GUERRA et al., 2015); 19 kDa (LI et al., 2015); e 20 kDa (ODDEPALLY et al., 2013),
por exemplo.
Há relatos na literatura da presença de carboidratos ligados covalentemente à
estrutura de inibidores proteicos de proteases (EE et al., 2011; PAIVA et al., 2003).
Entretanto, a julgar pelo resultado da revelação específica (ZACHARIUS et al., 1969)
para detectar carboidratos covalentemente ligados à estrutura proteica (FIGURA 15),
o LzaBBI não se trata, aparentemente, de uma glicoproteína.
A alta similaridade da sequência NH2-terminal do LzaBBI, com inibidores de
proteases tipo Bowman-Birk de leguminosas, chegando a 100% para algumas
espécies, indica que LzaBBI pertence a essa classe de inibidores, fato esse fortalecido
pela presença de 5 resíduos (em destaque amarelo C na figura 16) de cisteína que,
83
possivelmente, fazem parte na formação de um número grande de pontes dissulfeto,
como ocorre para outros inibidores pertencentes a essa família (GU et al., 2014).
Quando o LzaBBI foi submetido a eletroforese utilizando DTT como agente
redutor, uma única banda proteica foi revelada, indicando que o inibidor não possui
subunidades ligadas por pontes dissulfeto e sugerindo que os resíduos de cisteina
detectados na sua estrutura primária podem fazer parte de pontes dissulfeto
intracadeias, como ocorre para outros inibidores dessa classe (KUMAR; GODWA,
2013). A presença de pontes dissulfeto em inibidores de proteases conferem
estabilidade funcional a essas proteínas na presença de agentes físicos
desnaturantes como, por exemplo, altas temperaturas, extremos de pH (GARCIA et
al., 2004) e agentes químicos (DTT e β-mercaptoetanol) (BIJINA et al., 2011). Nesse
contexto,o LzaBBI foi ensaiado quanto à estabilidade de sua atividade inibitória para
a tripsina e quimotripsina em diferentes tempos de fervura (98 °C), bem como,
estabilidade em diferentes pHs, mostrando-se altamente estável (FIGURAS 18 e 19).
Essa resistência a extremos de temperatura e pH é particularmente importante para
futuras aplicações biotecnológicas e destaca o LzaBBI como um dos inibidores mais
estáveis dos já descritos. Por exemplo, LzaBBI se mostrou mais resistente que o
inibidor de Enterolobium contortisiliquum (EcTI), que perde sua atividade inibitória da
quimotripsina após 10 min a 100 °C (BATISTA et al., 1996), também demonstrou maior
eficácia quando comparado ao inibidor de Acacia confusa, o qual perde sua atividade
inibitória com 60 min de incubação a 100 °C (LAM; NG, 2010). Outros inibidores com
atividade ainti-tríptica também exibem termoestabilidades inferiores ao LzaBBI, como
os inibidores de fava, amendoim e cereais (LINER; KAKADE, 1969).
Quanto a estabilidade da atividade anti-quimotríptica em valores diferentes de
pHs, resultados semelhantes foram obtidos com inibidores de Enterolobium
contortisiliquum (BATISTA et al., 1996), Poecilantha parviflora (GARCIA et al., 2004)
e Inga laurina (MACEDO et al., 2007), exibindo alta estabilidade. Além de serem
influenciados pela presença ou não de pontes dissulfeto, a estabilidade à variação de
pH pode estar relacionada com o tamanho da molécula. Pesquisadores relatam sem
discutir que a susceptibilidade de um determinado inibidor (dímero) de quimotripsina
pode estar atrelada a sua massa molecular elevada de 70 kDa (LAM; NG, 2010).
84
Já é bastante relatada na literatura a ocorrência de inibidores de proteases
capazes de inibir a atividade catalítica de tripsina e/ou quimotripsina com ação
antimicrobiana (KIM et al., 2013; COSTA et al., 2014; KUMARESAN et al., 2015).
Porém, trabalhos com inibidores pertencentes à família Bowman-Birk que avaliem sua
ação antibacteriana são escassos, sendo de altíssima relevância estudos que
busquem efeitos negativos dessas biomoléculas sobre o crescimento de
microrganismos patogênicos a humanos, uma vez que muitos desses adquirem
resistência aos antibióticos comerciais. Segundo Chambers e DeLeo (2010), a S.
aureus possui grande capacidade de adquirir resistência a antibióticos. No presente
trabalho, foi possível observar atividade inibitória do crescimento de uma bactéria
patogênica a humanos (S. aureus), onde, em 5 e 10 µg do inibidor foi verificado efeito
negativo sobre o crescimento bacteriano (FIGURA 21A). Muitos inibidores de
proteases apresentam ação semelhante, à exemplo, Kim e colaboradores (2009)
demonstraram que um inibidor de tripsina e quimotripsina de Solanum tuberosum (PT-
1) apresentou atividade contra uma bactéria Gram-positiva Clavibacter michiganensis.
85
7. CONCLUSÕES
86
O presente trabalho descreve as etapas de purificação do primeiro inibidor de
proteases de sementes de Luetzelburgia auriculata, uma espécie de leguminosa
endêmica do Brasil e pertencente ao bioma Caatinga. Em adição, caracteriza-o como
um inibidor pertencente à família Bowman-Birk, sendo denominado LzaBBI
(Luetzelburgia auticulata Bowman-Birk Inhibitor), e determina parâmetros bioquímicos
e biológicos desse inibidor, habilitando-o para futura aplicação biotecnológica. Com
isso, evidencia-se a importância dos vegetais da Caatinga como repositórios de
moléculas bioativas, ainda pouco exploradas, e que devem ser mais cuidadosamente
estudadas para geração de drogas novas e alternativas contendo, como princípio
ativo, esse agente bacteriano para tratamento de patógenos humanos como, por
exemplo, de Staphylococcus aureus.
87
8. REFERÊNCIAS
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