universidade federal do amazonas faculdade de … · 2020. 10. 1. · toxicity and cytotoxicity of...
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
FACULDADE DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM INOVACcedilAtildeO
FARMACEcircUTICA
AVALIACcedilAtildeO QUIacuteMICA E FARMACOLOacuteGICA DO OacuteLEO
DESTILADO DE COPAIBA (Copaifera spp - Leguminosae-
Caesalpinoideae) E APLICACcedilOtildeES BIOTECNOLOacuteGICAS
EVANDRO DE ARAUacuteJO SILVA
MANAUS
2019
2
EVANDRO DE ARAUacuteJO SILVA
AVALIACcedilAtildeO QUIacuteMICA E FARMACOLOacuteGICA DO OacuteLEO
DESTILADO DE COPAIBA (Copaifera spp - Leguminosae-
Caesalpinoideae) E APLICACcedilOtildeES BIOTECNOLOacuteGICAS
Tese apresentada ao Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica como
requisito para a obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Doutor
em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica
Orientador Prof Dr Emerson Silva Lima
Coorientador Prof Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado
MANAUS
2019
Ficha Catalograacutefica
S586a Avaliaccedilatildeo quiacutemica e farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de copaiba(Copaifera spp - LeguminosaeCaesalpinoideae) e aplicaccedilotildeesbiotecnoloacutegicas Evandro de Arauacutejo Silva 2019 137 f il color 31 cm
Orientador Emerson Silva Lima Tese (Doutorado em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica) - UniversidadeFederal do Amazonas
1 Copaiacuteba 2 -cariofileno 3 Nanoemulsatildeo 4 Atividade anti-nociceptiva 5 Antiedematogecircnica I Lima Emerson Silva IIUniversidade Federal do Amazonas III Tiacutetulo
Ficha catalograacutefica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Silva Evandro de Arauacutejo
3
4
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo gostaria de agradecer a Deus por me guiar iluminar e me dar
tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e natildeo desanimar com as
dificuldades
Agradeccedilo em especial a minha famiacutelia minha esposa Renata Barauacutena Silva (in
memorian) minhas filhas Carolina e Danielle e aos meus netos Miguel Mark Filho e
Murilo que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitoacuteria
Agradeccedilo agrave Universidade Federal do Amazonas onde iniciei minha vida
acadecircmica e pude ingressar no curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica foi
graccedilas a essa oportunidade que hoje eu cheguei ateacute aqui
Meus sinceros agradecimentos aos professores Dr Emerson Silva Lima
(orientador) Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado (coorientador) pela dedicaccedilatildeo ao
ensino agrave pesquisa e pela orientaccedilatildeo segura e paciente que possibilitou a realizaccedilatildeo desse
trabalho
Meus agradecimentos aos professores e pesquisadores Dr Hector Koolen Dr
Almir Wanderley Dr Irwin Alencar e a Dra Geane Antiques Lourenccedilo pela parceria
firmada pelo acolhimento pela disponibilidade e por me fornecer todas as ferramentas
possiacuteveis para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Obrigado a todos os companheiros de caminhada do Laboratoacuterio Biophar cada
um teve sua parcela de contribuiccedilatildeo direta ou indiretamente para a concretizaccedilatildeo deste
trabalho Aos colegas de laboratoacuterio Leonard Acho e a Maacutercia de Jesus que me
ajudaram incansavelmente na realizaccedilatildeo dos experimentos
E finalmente agradeccedilo as colegas de trabalho Giane Oliveira Diego Squinello
e a professora Dra Patriacutecia Daniele pelo apoio e solidariedade que me prestaram ao
longo dessa caminhada
Sou muito grato a todos vocecircs
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
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RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
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ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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426ndash436
134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
2
EVANDRO DE ARAUacuteJO SILVA
AVALIACcedilAtildeO QUIacuteMICA E FARMACOLOacuteGICA DO OacuteLEO
DESTILADO DE COPAIBA (Copaifera spp - Leguminosae-
Caesalpinoideae) E APLICACcedilOtildeES BIOTECNOLOacuteGICAS
Tese apresentada ao Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica como
requisito para a obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Doutor
em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica
Orientador Prof Dr Emerson Silva Lima
Coorientador Prof Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado
MANAUS
2019
Ficha Catalograacutefica
S586a Avaliaccedilatildeo quiacutemica e farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de copaiba(Copaifera spp - LeguminosaeCaesalpinoideae) e aplicaccedilotildeesbiotecnoloacutegicas Evandro de Arauacutejo Silva 2019 137 f il color 31 cm
Orientador Emerson Silva Lima Tese (Doutorado em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica) - UniversidadeFederal do Amazonas
1 Copaiacuteba 2 -cariofileno 3 Nanoemulsatildeo 4 Atividade anti-nociceptiva 5 Antiedematogecircnica I Lima Emerson Silva IIUniversidade Federal do Amazonas III Tiacutetulo
Ficha catalograacutefica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Silva Evandro de Arauacutejo
3
4
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo gostaria de agradecer a Deus por me guiar iluminar e me dar
tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e natildeo desanimar com as
dificuldades
Agradeccedilo em especial a minha famiacutelia minha esposa Renata Barauacutena Silva (in
memorian) minhas filhas Carolina e Danielle e aos meus netos Miguel Mark Filho e
Murilo que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitoacuteria
Agradeccedilo agrave Universidade Federal do Amazonas onde iniciei minha vida
acadecircmica e pude ingressar no curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica foi
graccedilas a essa oportunidade que hoje eu cheguei ateacute aqui
Meus sinceros agradecimentos aos professores Dr Emerson Silva Lima
(orientador) Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado (coorientador) pela dedicaccedilatildeo ao
ensino agrave pesquisa e pela orientaccedilatildeo segura e paciente que possibilitou a realizaccedilatildeo desse
trabalho
Meus agradecimentos aos professores e pesquisadores Dr Hector Koolen Dr
Almir Wanderley Dr Irwin Alencar e a Dra Geane Antiques Lourenccedilo pela parceria
firmada pelo acolhimento pela disponibilidade e por me fornecer todas as ferramentas
possiacuteveis para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Obrigado a todos os companheiros de caminhada do Laboratoacuterio Biophar cada
um teve sua parcela de contribuiccedilatildeo direta ou indiretamente para a concretizaccedilatildeo deste
trabalho Aos colegas de laboratoacuterio Leonard Acho e a Maacutercia de Jesus que me
ajudaram incansavelmente na realizaccedilatildeo dos experimentos
E finalmente agradeccedilo as colegas de trabalho Giane Oliveira Diego Squinello
e a professora Dra Patriacutecia Daniele pelo apoio e solidariedade que me prestaram ao
longo dessa caminhada
Sou muito grato a todos vocecircs
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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TEIXEIRA HF On the use of nanotechnology-based strategies for association of
complex matrices from plant extracts Revista Brasileira de Farmacognosia 25 (2015)
426ndash436
134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
Ficha Catalograacutefica
S586a Avaliaccedilatildeo quiacutemica e farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de copaiba(Copaifera spp - LeguminosaeCaesalpinoideae) e aplicaccedilotildeesbiotecnoloacutegicas Evandro de Arauacutejo Silva 2019 137 f il color 31 cm
Orientador Emerson Silva Lima Tese (Doutorado em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica) - UniversidadeFederal do Amazonas
1 Copaiacuteba 2 -cariofileno 3 Nanoemulsatildeo 4 Atividade anti-nociceptiva 5 Antiedematogecircnica I Lima Emerson Silva IIUniversidade Federal do Amazonas III Tiacutetulo
Ficha catalograacutefica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Silva Evandro de Arauacutejo
3
4
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo gostaria de agradecer a Deus por me guiar iluminar e me dar
tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e natildeo desanimar com as
dificuldades
Agradeccedilo em especial a minha famiacutelia minha esposa Renata Barauacutena Silva (in
memorian) minhas filhas Carolina e Danielle e aos meus netos Miguel Mark Filho e
Murilo que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitoacuteria
Agradeccedilo agrave Universidade Federal do Amazonas onde iniciei minha vida
acadecircmica e pude ingressar no curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica foi
graccedilas a essa oportunidade que hoje eu cheguei ateacute aqui
Meus sinceros agradecimentos aos professores Dr Emerson Silva Lima
(orientador) Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado (coorientador) pela dedicaccedilatildeo ao
ensino agrave pesquisa e pela orientaccedilatildeo segura e paciente que possibilitou a realizaccedilatildeo desse
trabalho
Meus agradecimentos aos professores e pesquisadores Dr Hector Koolen Dr
Almir Wanderley Dr Irwin Alencar e a Dra Geane Antiques Lourenccedilo pela parceria
firmada pelo acolhimento pela disponibilidade e por me fornecer todas as ferramentas
possiacuteveis para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Obrigado a todos os companheiros de caminhada do Laboratoacuterio Biophar cada
um teve sua parcela de contribuiccedilatildeo direta ou indiretamente para a concretizaccedilatildeo deste
trabalho Aos colegas de laboratoacuterio Leonard Acho e a Maacutercia de Jesus que me
ajudaram incansavelmente na realizaccedilatildeo dos experimentos
E finalmente agradeccedilo as colegas de trabalho Giane Oliveira Diego Squinello
e a professora Dra Patriacutecia Daniele pelo apoio e solidariedade que me prestaram ao
longo dessa caminhada
Sou muito grato a todos vocecircs
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
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nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
3
4
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo gostaria de agradecer a Deus por me guiar iluminar e me dar
tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e natildeo desanimar com as
dificuldades
Agradeccedilo em especial a minha famiacutelia minha esposa Renata Barauacutena Silva (in
memorian) minhas filhas Carolina e Danielle e aos meus netos Miguel Mark Filho e
Murilo que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitoacuteria
Agradeccedilo agrave Universidade Federal do Amazonas onde iniciei minha vida
acadecircmica e pude ingressar no curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica foi
graccedilas a essa oportunidade que hoje eu cheguei ateacute aqui
Meus sinceros agradecimentos aos professores Dr Emerson Silva Lima
(orientador) Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado (coorientador) pela dedicaccedilatildeo ao
ensino agrave pesquisa e pela orientaccedilatildeo segura e paciente que possibilitou a realizaccedilatildeo desse
trabalho
Meus agradecimentos aos professores e pesquisadores Dr Hector Koolen Dr
Almir Wanderley Dr Irwin Alencar e a Dra Geane Antiques Lourenccedilo pela parceria
firmada pelo acolhimento pela disponibilidade e por me fornecer todas as ferramentas
possiacuteveis para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Obrigado a todos os companheiros de caminhada do Laboratoacuterio Biophar cada
um teve sua parcela de contribuiccedilatildeo direta ou indiretamente para a concretizaccedilatildeo deste
trabalho Aos colegas de laboratoacuterio Leonard Acho e a Maacutercia de Jesus que me
ajudaram incansavelmente na realizaccedilatildeo dos experimentos
E finalmente agradeccedilo as colegas de trabalho Giane Oliveira Diego Squinello
e a professora Dra Patriacutecia Daniele pelo apoio e solidariedade que me prestaram ao
longo dessa caminhada
Sou muito grato a todos vocecircs
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
4
AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo gostaria de agradecer a Deus por me guiar iluminar e me dar
tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e natildeo desanimar com as
dificuldades
Agradeccedilo em especial a minha famiacutelia minha esposa Renata Barauacutena Silva (in
memorian) minhas filhas Carolina e Danielle e aos meus netos Miguel Mark Filho e
Murilo que sempre me incentivaram e torceram pela minha vitoacuteria
Agradeccedilo agrave Universidade Federal do Amazonas onde iniciei minha vida
acadecircmica e pude ingressar no curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Inovaccedilatildeo Farmacecircutica foi
graccedilas a essa oportunidade que hoje eu cheguei ateacute aqui
Meus sinceros agradecimentos aos professores Dr Emerson Silva Lima
(orientador) Dr Jesus Rafael Rodriguez Amado (coorientador) pela dedicaccedilatildeo ao
ensino agrave pesquisa e pela orientaccedilatildeo segura e paciente que possibilitou a realizaccedilatildeo desse
trabalho
Meus agradecimentos aos professores e pesquisadores Dr Hector Koolen Dr
Almir Wanderley Dr Irwin Alencar e a Dra Geane Antiques Lourenccedilo pela parceria
firmada pelo acolhimento pela disponibilidade e por me fornecer todas as ferramentas
possiacuteveis para a realizaccedilatildeo deste trabalho
Obrigado a todos os companheiros de caminhada do Laboratoacuterio Biophar cada
um teve sua parcela de contribuiccedilatildeo direta ou indiretamente para a concretizaccedilatildeo deste
trabalho Aos colegas de laboratoacuterio Leonard Acho e a Maacutercia de Jesus que me
ajudaram incansavelmente na realizaccedilatildeo dos experimentos
E finalmente agradeccedilo as colegas de trabalho Giane Oliveira Diego Squinello
e a professora Dra Patriacutecia Daniele pelo apoio e solidariedade que me prestaram ao
longo dessa caminhada
Sou muito grato a todos vocecircs
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
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134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
5
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Aβ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Beta
Aδ Fibras dos neurocircnios nociceptivos mielinizadas A Delta
AMPc adenosina monofosfato ciacuteclico
ATP Trifosfato de adenosina
β-Car Beta-cariofileno
C Fibras dos neurocircnios nociceptivos amieliacutenicas C
CB2 receptor canabinoacuteide 2
CCK colecistocinina
CGRP peptiacutedeo relacionado com o gene da calcitonina
CIATEJ Centro de Investigacioacuten y Asistencia en Tecnologiacutea y Disentildeo del Estado de
Jalisco
COX-1 Ciclo-oxigenase-1
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
De Derme
DL50 Dose Letal 50
DMSO dimetilsulfoacutexido
DPM desvio padratildeo da meacutedia
EGF fatores de crescimento epideacutermico
EHL Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
Ep epiderme
GABA Aacutecido gama-aminobutiacuterico
GRD Gacircnglio da raiz dorsal da medula espinhal
CG-EM Cromatografia gasosa com espectrocircmetro de massa
H2 receptores de histamina-2
HDC enzima histidina-descarboxilase
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
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removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
6
IASP International Association for the Study of Pain
IBP Inibidores da bomba de proacutetons
iNOS sintase induziacutevel responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NO) e ciclo-
oxigenases (COXs)
K+H
+ ATPase Adenosina TriFosfatase ou bomba de proacutetons
LPS lipopolisacariacutedeo
Me corpuacutesculos sensitivos de Meissner
MRC5 Linhagem de ceacutelula de fibroblasto humano
MTT ensaio colorimeacutetrico
NE Neurocircnio espinhal
NF-κB fator nuclear kappa B
NSRIs antidepressivos inibidores natildeo seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
OBC Oacuteleo bruto de copaiacuteba (Oacuteleo Resina)
OCM Oacuteleo de Copaifera multijuga
ODC Oacuteleo destilado de copaiacuteba (fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo resina de copaiacuteba)
Pa corpuacutesculos sensitivos de Vater-Pacini
PDGF fatores de crescimento derivados de plaquetas
PGs prostaglandinas
RD Raiz dorsal da medula espinhal
ROS espeacutecies reativas de oxigecircnio
Rpm rotaccedilotildees por minuto
RV Raiz dorsal da medula espinhal
SP Substacircncia P
SSRIs antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de serotonina
TGF-β fator transformador de crescimento beta
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNL terminaccedilotildees nervosas livres
UD Uacutelcera duodenal
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
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denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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134
ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
7
UG Uacutelcera gaacutestrica
UP Uacutelcera peacuteptica
VIP peptiacutedeo vasoativo intestinal
VPL Nuacutecleo posterior-medial-lateral do taacutelamo
VPM Nuacutecleo ventro-poacutestero-medial do taacutelamo
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e
dorsal (RD) 19
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo 55
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ 57
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC) 57
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do beta-cariofileno do ODC 73
Figura 7 - Cromatograma da presenccedila do beta-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de beta-cariofileno 74
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiba (ODC) da
Copaifera spp 74
Figura 9 - (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo
Destilado de copaiba (ODC)76
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas77
Figura 11 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de
tensoativo-oacuteleondashaacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba78
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias
de preparada79
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) sobre a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do
MTT 79
Figura 14 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico
(MRC-5) na presenccedila da NE15 e em (B) macroacutefagos J744 de camundongos na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC80
Figura 15 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC na produccedilatildeo de nitrito81
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste de
contorccedilotildees abdominais induzido pelo aacutecido aceacutetico 83
Figura 17 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) (100 mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com
formalina83
9
Figura 18 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do
oacuteleo destilado de copaiba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela
carragenina84
Figura 19 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiba
(OBC) e do oacuteleo destilado de copaiba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em
ratos87
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiba (OBC) oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) e nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15)
sobre a peritonite induzida pelo LPS em camundongos88
Figura 21 - Efeito da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o
edema de orelha induzido por fenol a 1089
Figura 22 ndash Efeitos apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS sobre a induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em camundongos89
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina da copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies de
copaiba 33
Tabela 2 - Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do
ODC60
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiba (ODC)75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina da
Copaifera spp 75
Tabela 5 - Efeito dos sistemas de surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiba (ODC)77
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante oacuteleoaacutegua (SOW) sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)79
11
RESUMO
O oacuteleo-resina bruto (OBC) da Copaifera (Copaifera spp) tem sido usado pelas
populaccedilotildees amazocircnicas para o tratamento de inflamaccedilotildees na cicatrizaccedilatildeo de feridas em
bronquites e uacutelceras da pele O OBC obtido de distintas espeacutecies possui diferenccedilas na
sua composiccedilatildeo quiacutemica tornando difiacutecil a padronizaccedilatildeo para sua utilizaccedilatildeo na induacutestria
farmacecircutica e cosmeacutetica No entanto a fraccedilatildeo volaacutetil do OBC poderia ser uma
alternativa viaacutevel para a padronizaccedilatildeo pois ainda obtida de diversas espeacutecies apresenta
uma composiccedilatildeo quiacutemica mais homogecircnea O objetivo deste estudo foi avaliar a
composiccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica e quiacutemica e atividade toacutexico-farmacoloacutegica do ODC e de
uma nanoemulsatildeo preparada com esse oacuteleo O ODC foi obtido por destilaccedilatildeo por arraste
a vapor a partir do OBC Foram avaliadas as propriedades organoleacutepticas as
propriedades fiacutesicas (aspecto densidade pH) e sua composiccedilatildeo quiacutemica por CGEM
Em seguida foi desenvolvida a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15)
Avaliou-se a atividade anti-inflamatoacuteria antiartriacutetica a toxicidade aguda oral e a
citotoxicidade do ODC e da nanoemulsatildeo O ODC possui na sua composiccedilatildeo 14
sesquiterpenos apresentando maior conteuacutedo o β-cariofileno (407) A NE15
apresentou tamanho de partiacutecula de 9947 nm iacutendice de polidispersatildeo de 0224 e
potencial zeta de -3710 mV A nanoemulsatildeo mostrou estabilidade em prateleira por ateacute
180 dias A NE15 mostrou inibiccedilatildeo de oacutexido niacutetrico maior do que o ODC e uma
potente atividade antinociceptiva em camundongos na dose de 100 mgKg que foi
similar agrave indometacina e agrave morfina O ODC e o OBC mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica em ratos em lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol (10 mgkg e
400mgkg) A NE15 mostrou atividade anti-inflamatoacuteria similar a dexametasona e
maior do que o ODC (teste de edema de orelha em camundongos) e produziu um efeito
antiartriacutetico mais potente do que ODC e o OBC Tanto a nanoemulsatildeo quanto o ODC
natildeo apresentaram citotoxicidade no teste com fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) nem toxicidade aguda na dose maacutexima de 2000 mgkg em
camundongo Balb C Os resultados do presente estudo poderatildeo permitir a introduccedilatildeo do
ODC como mateacuteria-prima para induacutestria e da NE15 como princiacutepios ativos de formas
farmacecircuticas acabadas que poderiam ser utilizados na terapecircutica anti-inflamatoacuteria
Palavras chave copaiacuteba β-cariofileno nanoemulsatildeo atividade anti-nociceptiva anti-
edematogecircnica antiartriacutetica e anti-ulcerogecircnica
12
ABSTRACT
The crude oil-resin (OBC) of Copaifera (Copaifera spp) has been used by Amazonian
populations for the treatment of inflammation wound healing bronchitis and skin
ulcers OBC obtained from different species has differences in its chemical
composition making difficult to standardize its use in the pharmaceutical and cosmetic
industry However the volatile fraction of OBC could be a viable alternative for the
standardization because even from different species it presents a more homogeneous
composition The objective of this study was to evaluate the physicochemical chemical
composition and the toxic-pharmacological activity of the ODC and the nanoemulsion
prepared with this oil ODC was obtained by steam distillation Its organoleptic
properties physical properties (aspect density and pH) and the chemical composition
by GCMS were evaluated Subsequently the nanoemulsion containing 15 of ODC
(NE15) was developed The anti-inflammatory and antiarthritic activity the acute oral
toxicity and cytotoxicity of the ODC and nanoemulsion were evaluated The ODC
contains 14 sesquiterpenes in its composition being β-caryophyllene (407) the most
abundant NE15 presented a particle size of 9947 nm a polydispersity index of
0224 and a zeta potential of -3710 mV The nanoemulsion showed stability on shelf
conditions for up to 180 days NE15 presented an inhibition on the production of NO
higher than the ODC and potent anti-nociceptive activity in mice at a dose of 100
mgkg which was similar to indomethacin and morphine ODC and OBC showed anti-
ulcerogenic activity in rats in gastric lesions induced by ethanol (doses of 10 and 400
mgkg) NE15 showed an anti-inflammatory activity similar to dexamethasone and
higher than the ODC (ear edema test in mice) and produced a potent antiarthritic effect
that was superior to the ODC and OBC Both nanoemulsion and ODC showed neither
cytotoxicity against non-neoplastic human lung fibroblasts (MRC-5) nor acute toxicity
at the maximum dose of 2000 mgkg in Balb C mice The results of this study may
allow the introduction of the ODC as raw material for industry and the use of the
NE15 as an active ingredient in finished pharmaceutical forms which could be used
in the anti-inflammatory therapy
Key words copaiba β-caryophyfillene nanoemulsion anti-nociceptive activity anti-
edematogenic activity antiarthritic activity and anti-ulcerogenic activity
13
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 15
2 REVISAtildeO DA LITERATURA 17
21 Dor e Nocicepccedilatildeo 17
22 Inflamaccedilatildeo 23
23 Uacutelcera peacuteptica 27
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba 32
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos 39
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno 41
3 - OBJETIVOS 54
31 Objetivo Geral 54
32 Objetivos Especiacuteficos 54
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 55
41 Delineamento experimental 55
42 Material vegetal 56
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor 56
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 57
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 59
47 Cultivo celular 62
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas 63
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular 63
49 Animais 64
491 Teste de toxicidade aguda oral 65
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico 65
4922 Teste da formalina a 25 66
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 66
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina 66
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 67
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10 69
410 Anaacutelise Estatiacutestica 70
5 RESULTADOS 71
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) 71
14
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) -
Anaacutelises por CG-EM 72
56 Toxicidade aguda oral 82
57 Atividade anti-nociceptiva 82
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto 86
7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 109
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute tatildeo antiga quanto a raccedila humana
(FERREIRA 2008) e tem curado ao homem em muitos dos seus problemas de sauacutede
(NEWALL et al 2002) No Brasil as plantas medicinais da flora nativa satildeo
consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo terapecircutica onde as propriedades
medicinais empiacutericas satildeo propagadas por usuaacuterios ou comerciantes (VEIGA JUacuteNIOR
PINTO 2005) Muitas plantas tecircm poder curativo e o Brasil eacute rico em espeacutecies vegetais
que podem servir como remeacutedio (WERNER 1994)
As copaiacutebeiras satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
(KOBAYASHI et al 2011) e tambeacutem da Aacutefrica Ocidental Na Ameacuterica Latina satildeo
encontradas espeacutecies na regiatildeo que se estende do Meacutexico ateacute o norte da Argentina
(DWYER 1945 VON MARTIUS BENTHAM 1870 DWYER 1951 ALENCAR
1988) O gecircnero Copaifera (Leguminosae-Caesalpinoideae) possui 72 espeacutecies
(DWYER 1951) sendo encontradas no Brasil principalmente nos estados do Paraacute e
Amazonas (WILLIS 1973) O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute obtido a partir de exsudados dos
troncos de aacutervores do gecircnero Copaifera (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et
al 2012) Na Regiatildeo Norte o oacuteleo-resina da copaibeira tem sido usado pelas populaccedilotildees
amazocircnicas devidas suas propriedades de cura de aproximadamente trinta tipos de
doenccedilas que vatildeo desde inflamaccedilotildees e cicatrizaccedilatildeo de feridas epideacutermicas (GOMES et
al 2010 GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012) ateacute o tratamento de bronquites uacutelceras
e cacircncer (LIMA et al 2003)
Oacuteleos de vaacuterias espeacutecies de Copaifera satildeo comumente encontrados em farmaacutecias
e nos mercados sendo amplamente comercializados pelo uso medicinal popular
(SOUZA BARBOSA et al 2013) e como mateacuteria-prima na induacutestria de cosmeacuteticos
(CASCON e GILBERT 2000) Tambeacutem satildeo extensivamente comercializados na forma
farmacecircutica de caacutepsulas ou liacutequida como anti-inflamatoacuterio e antisseacuteptico (GOMES et
16
al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) O oacuteleo de copaiacuteba pode ser encontrado nas
antigas farmacopeias Europeias e dos Estados Unidos (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Trabalhos anteriores comprovaram as atividades anti-inflamatoacuterias anti-
nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do oacuteleo-resina de copaiacuteba (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007 VEIGA JUNIOR et al 2007) poreacutem o oacuteleo-resina de copaiacuteba
bruto natildeo tem uma composiccedilatildeo quiacutemica homogecircnea o que torna difiacutecil a
reprodutibilidade dos resultados envolvendo esse produto (CASCON GILBERT 2000
GOMES et al 2007) No entanto nosso grupo de trabalho tem observado que no oacuteleo
destilado (a fraccedilatildeo volaacutetil) do oacuteleo-resina de diversas espeacutecies de copaiacuteba tem uma
composiccedilatildeo quiacutemica relativamente constante onde o β-cariofileno eacute a substacircncia
encontrada em maior proporccedilatildeo podendo ser o produto destilado uma forma de
padronizar esse oacuteleo como mateacuteria prima para a induacutestria farmacecircutica Por outro lado
natildeo foram achados estudos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba na terapecircutica e
nem tampouco trabalhos envolvendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba em formulaccedilotildees
nanotecnoloacutegicas
Diante do exposto este trabalho teve como finalidade a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-
quiacutemica e quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) para sua utilizaccedilatildeo como ativo
na preparaccedilatildeo de nanoemulsotildees Adicionalmente foram avaliadas as atividades anti-
inflamatoacuterias anti-nociceptiva e anti-ulcerogecircnica do ODC e anti-inflamatoacuteria da
nanoemulsatildeo contendo ODC comparadas com a atividade do ODC e do oacuteleo bruto de
copaiacuteba tanto in vitro como in vivo
17
2 REVISAtildeO DA LITERATURA
21 Dor e Nocicepccedilatildeo
O desenvolvimento de tratamentos para aliacutevio da dor tem sido o fator de
motivaccedilatildeo para muitos estudos realizados por pesquisadores acadecircmicos e pela induacutestria
farmacecircutica em resposta agrave demanda por novos analgeacutesicos mais potentes e que natildeo
promovam efeitos colaterais potenciais visto que no presente momento a morfina
continua sendo a melhor alternativa apesar dos seus efeitos colaterais (OLIVEIRA et
al 2008) Devido agrave baixa eficaacutecia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos faacutermacos para o aliacutevio da dor disponiacuteveis no mercado farmacecircutico surge
o grande interesse dos pesquisadores em investigar plantas com atividade analgeacutesica
para a descoberta de novos protoacutetipos de faacutermacos provenientes de plantas da flora
brasileira em razatildeo de que os produtos naturais encaixam-se como uma fonte
promissora na pesquisa de moleacuteculas com potencial atividade analgeacutesica (SILVA et al
2013)
A capacidade de detectar estiacutemulos nocivos eacute essencial para a sobrevivecircncia e o
bem-estar de um organismo Essa eacute dramaticamente ilustrada pelo exame de indiviacuteduos
que sofrem de analgesia congecircnita que os tornam incapazes de detectar estiacutemulos
dolorosos Essas pessoas natildeo satildeo capazes de detectarem estiacutemulos nocivos como sentir
a dor penetrante de um objeto cortante o calor de uma chama ou mesmo o desconforto
associado a lesotildees internas como um osso quebrado Como resultado elas sofrem
lesotildees devido agrave falta de reflexos protetores contra essas condiccedilotildees muitas das quais
podem ser fatais (BASBAUM et al 2009)
Mais comumente as alteraccedilotildees da via da dor levam a hipersensibilidade de
modo que mostra sua utilidade como um sistema de alerta agudo e de outra forma pode
tornar-se um problema crocircnico e debilitante Estiacutemulos inoacutecuos como o leve toque ou
18
calor podem ser percebidos como dolorosos (um fenocircmeno referido como alodinia) ou
estiacutemulos normalmente dolorosos podem provocar dor com maior intensidade (referida
como hiperalgesia) Indiviacuteduos que sofrem de artrite neuralgia poacutes-herpeacutetica ou cacircncer
oacutesseo experimentam dor intensa e muitas vezes incessante que natildeo eacute apenas fisioloacutegica
e psicologicamente debilitante mas tambeacutem pode dificultar a sua recuperaccedilatildeo A dor
crocircnica pode persistir mesmo apoacutes uma lesatildeo aguda talvez a dor lombar ou ciaacutetica
sejam as mais comumente experimentadas (BASBAUM et al 2009)
Dor e nocicepccedilatildeo diferem entre si sendo que a nocicepccedilatildeo representa o processo
de transmissatildeo aos centros envolvidos em informaccedilatildeo da percepccedilatildeo sobre um estiacutemulo
que tem potencial para causar danos nos tecidos (ORIGONI et al 2014) A dor natildeo soacute
inclui as vias envolvidas na transmissatildeo do estiacutemulo mas tambeacutem envolve uma resposta
emocional A International Association for the Study of Pain (IASP) define a dor como
uma experiecircncia sensorial e emocional desagradaacutevel associada ao dano tecidual real ou
potencial ou descrito em termos de tais danos (MERSKEY BOGDUK 1994) Pela
definiccedilatildeo torna-se claro que a dor eacute uma sensaccedilatildeo subjetiva e que o grau de ansiedade
atenccedilatildeo e distraccedilatildeo experiecircncias passadas memoacuterias e muitos outros fatores podem
aumentar ou diminuir a experiecircncia da dor o que a torna uma experiecircncia emocional e
natildeo simplesmente sensorial (OSSIPOV et al (2010 ORIGONI et al 2014)
O termo nocicepccedilatildeo refere-se ao reconhecimento do estiacutemulo doloroso
propriamente dito sem levar em consideraccedilatildeo o componente emocional ou seja
engloba as vias neuroanatocircmicas bem como os mecanismos neuroloacutegicos e os
receptores especiacuteficos que detectam o estiacutemulo lesivo (JULIUS BASBAUM 2001)
Sendo assim uma vez que os animais natildeo satildeo capazes de expressar verbalmente os
componentes subjetivos da dor pode-se dizer que neles natildeo se avalia a dor e sim
nocicepccedilatildeo (SILVA et al 2013) Os termos dor e analgesia por envolver o componente
emocional satildeo empregados para estudos em humanos (WOOLF 2004 KLAUMANN et
19
al 2008) enquanto que nocicepccedilatildeo e antinocicepccedilatildeo satildeo mais utilizados para estudos
em modelos animais (JONES 1992 KANDEL et al 2003)
Nocicepccedilatildeo eacute um processo neural pelo qual estimulos nocivos (teacutermicos
mecacircnicos ou quiacutemicos) satildeo detectados e transmitidos para o ceacuterebro usando o caminho
de dor atraveacutes de neurocircnios do sistema nervoso perifeacuterico chamado de nociceptores
(BASBAUM JESSELL 2000 LOPES 2003 WOOLF 2004) Os nociceptores satildeo
encontrados na pele muacutesculo tecidos conjuntivos vasos sanguiacuteneos e viacutesceras
(BEKTAS et al 2015) Os nociceptores como qualquer neurocircnio aferente primaacuterio
possuem um pericaacuterio ou corpo celular localizado nos gacircnglios das raiacutezes dorsais da
medula espinhal (GRD) do qual parte um prolongamento que se bifurca originando um
processo central que se dirige e termina no corno dorsal da medula espinhal e um
prolongamento perifeacuterico que percorre os nervos sensitivos e vai terminar nos diversos
oacutergatildeos perifeacutericos constituindo a fibra sensitiva (LOPES 2003 BASBAUM et al
2009) (Figura1)
Figura 1 - Esquema representando a medula espinhal com as suas raiacutezes ventral (RV) e dorsal
(RD) Nesta o gacircnglio da raiz dorsal GRD aloja os corpos celulares dos neurocircnios aferentes primaacuterios
estatildeo representados um neurocircnio sensiacutevel a estiacutemulos inoacutecuos () e outro sensiacutevel a estiacutemulo noacutexico ()
Os prolongamentos perifeacutericos dos neurocircnios constituem as fibras sensitivas e dirigem-se agrave derme (De) e
epiderme (Ep) Os neurocircnios inoacutecuos possuem fibras mielinizadas (Aβ) que terminam em corpuacutesculos
sensitivos como os de Vater-Pacini (Pa) ou Meissner (Me) As fibras dos neurocircnios nociceptivos satildeo
amieliacutenicas (C) (ou mieliacutenicas finas natildeo representadas) e terminam sem especificaccedilotildees aparente nas
chamadas terminaccedilotildees livres (TNL) Os prolongamentos centrais dos aferentes primaacuterios penetram na
medula espinhal pelas raiacutezes dorsais e enquanto os Aβ ascendem nos cordotildees dorsais para ir terminar
nos nuacutecleos gracilis e cuneatus do bolbo raquidiano os nociceptivos terminam no corno dorsal da medula
espinhal estabelecendo sinapses com neurocircnio espinhais (NE) cujos axocircnios cruzam a linha meacutedia e
ascendem na substacircncia branca contralateral para vaacuterios nuacutecleos supra espinhais FONTE LOPES 2003
20
Nociceptores satildeo excitados apenas quando as intensidades de estiacutemulo atingem o
alcance nocivo (BASBAUM et al 2009 WOOLF 2004) sugerindo que eles possuem
propriedades biofiacutesicas e moleculares que lhes permitem detectar e responder
seletivamente estiacutemulos potencialmente prejudiciais (BASBAUM et al 2009) Existem
duas grandes classes de nociceptores O primeiro inclui fibras aferentes mielinizadas de
diacircmetro meacutedio velocidade de conduccedilatildeo raacutepida (Aδ) que medeiam agrave dor aguda e
localizada eacute a primeira fase da dor Essas fibras aferentes mielinizadas diferem
consideravelmente das fibras Aβ de maior diacircmetro condutoras raacutepidas e que
respondem a estimulaccedilatildeo mecacircnica inoacutecua (isto eacute ao leve toque) A segunda classe de
nociceptores inclui fibras C de diacircmetro pequeno multimodal natildeo mielinizada e de
velocidade de conduccedilatildeo mais lenta eacute a segunda fase da dor a dor tardia e difusa
(JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006 BASBAUM et al 2009)
Em uma lesatildeo os danos dos tecidos satildeo muitas vezes acompanhados pela
acumulaccedilatildeo de fatores endoacutegenos liberados de nociceptores ativados ou por ceacutelulas natildeo
neurais que residem dentro ou que se infiltram na aacuterea lesada (incluindo mastoacutecitos
basoacutefilos plaquetas macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas endoteliais queratinoacutecitos e
fibroblastos) (BASBAUM et al 2009) Coletivamente esses fatores denominados
sopa inflamatoacuteria representam uma grande variedade de moleacuteculas de sinalizaccedilatildeo
incluindo neurotransmissores peptiacutedeos (substacircncia P-SP peptiacutedeo relacionado com o
gen da calcitonina-CGRP bradicinina) eicosinoacuteides e lipiacutedios relacionados
(prostaglandinas tromboxanos leucotrienos endocanabinoacuteides) neurotrofinas
numerosas citocinas [interleucina 1β (IL-1β) e IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-
α)] quimiocinas ATP oacutexido niacutetrico (NOmiddot) bem como proteases extracelulares e
proacutetons Notavelmente os nociceptores expressam um ou mais receptores de superfiacutecie
celular capazes de reconhecer e responder a cada um desses agentes proacute-inflamatoacuterios
ou proacute-algeacutesicos Tais interaccedilotildees aumentam a excitabilidade da fibra nervosa
21
aumentando sua sensibilidade agrave temperatura ou ao toque (BASBAUM JESSELL 2000
LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006 McMAHON et al 2008 BASBAUM et al
2009 RITNER et al 2009 BEKTAS et al 2015)
O primeiro passo na sequecircncia dos eventos que originam o fenocircmeno doloroso eacute
a transformaccedilatildeo da energia patente nos estiacutemulos agressivos em impulsos nervosos ou
seja em potenciais de accedilatildeo e conduzi-los ateacute agrave medula espinhal (LOPES 2003
ROCHA et al 2007) A ativaccedilatildeo de nociceptores gera potenciais de accedilatildeo que se
propagam centriacutepetamente ateacute o corpo do neurocircnio pseudo-bipolar que estaacute localizado
no gacircnglio da raiz dorsal (GRD) para logo ser transmitido ao corno posterior que estaacute
organizado em lacircminas de neurocircnios distintos anatocircmica e eletrofisiologicamente e que
recebem projeccedilotildees especiacuteficas de diferentes tipos de fibras (BASBAUM JESSELL
2000 CRUCIANI NIETO 2006) Os receptores especiacuteficos para dor localizado nas
terminaccedilotildees de fibras nervosas Aδ e C quando ativados sofrem alteraccedilotildees na sua
membrana permitindo a deflagraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo (ROCHA et al 2007) Eacute
assim que os neurocircnios aferentes primaacuterios localizados na lacircmina I recebem
informaccedilotildees nociceptivas diretamente usando fibras da classe C enquanto as
localizadas nas lacircminas I e IV recebem informaccedilotildees dolorosas diretas e por fibras C ou
Aδ (JULIUS BASBAUM 2001 CRUCIANI NIETO 2006)
Eacute nesse niacutevel que os axocircnios GRD fazem sinapse com os neurocircnios de projeccedilatildeo
(BASBAUM et al 2009) Em condiccedilotildees normais a ativaccedilatildeo de um oacutergatildeo por um
estiacutemulo doloroso resulta na liberaccedilatildeo de glutamato e substacircncia P os quais ativam
receptores especiacuteficos localizados nas poacutes-sinapsis A quantidade de neurotransmissor
(glutamato e substacircncia P) liberado a este niacutevel eacute regulada positivamente pelos
neuropeptiacutedeos CGRP (peptiacutedeo geneticamente relacionado com a calcitonina) CCK
(colecistocinina) VIP (peptiacutedeo vasoativo intestinal) ou negativamente por encefalinas
22
que se conectam a receptores especiacuteficos localizados na preacute e poacutes-sinapsis (CRUCIANI
NIETO 2006)
O efeito na poacutes-sinapsis eacute mais complexo A geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo eacute
o resultado da somatoacuteria de pequenas mudanccedilas no potencial da membrana que levam o
potencial de membrana para um valor menos negativo (por exemplo de -70 mV a -60)
aproximando-se do umbral da geraccedilatildeo de um potencial de accedilatildeo (CRUCIANI NIETO
2006) As encefalinas tecircm accedilatildeo anti-nociceptiva e estatildeo envolvidas no processo de
reduccedilatildeo da neuroplasticidade e hiperalgesia elas interferem com a geraccedilatildeo desses
potenciais poacutes-sinaacutepticos miniaturas e assim evitam o disparo de potencias de accedilatildeo
(CRUCIANI NIETO 2006 ROCHA et al 2007)
Aleacutem disso as encefalinas alteram a permeabilidade da membrana ao potaacutessio
(tornando o seu potencial de repouso mais negativo) afastando-se do limiar e
dificultando ainda mais a geraccedilatildeo de potenciais de accedilatildeo Esses interneurocircnios
liberadores de encefalina estatildeo regulados por vias descendentes as quais normalmente
satildeo inibidos por neurocircnios contendo GABA (o neurotransmissor inibitoacuterio mais
abundante no sistema nervoso central - SNC) e estatildeo localizados na mateacuteria cinzenta
periaquedutal (CRUCIANI NIETO 2006) Ao produzir-se um estiacutemulo doloroso satildeo
liberadas endorfinas na mateacuteria cinzenta periaqueductal as quais inibem os neurocircnios
inibitoacuterios (liberadores de GABA) (LOPES 2003 CRUCIANI NIETO 2006
BASBAUM et al 2009)
O resultado dessa dupla inibiccedilatildeo eacute a facilitaccedilatildeo das vias descendentes que
eventualmente resultaraacute em I) liberaccedilatildeo aumentada de encefalinas pelos interneurocircnios
localizados no corno posterior II) diminuiccedilatildeo da quantidade de glutamato e substacircncia
P na biofase (neurotransmissores das vias ascendentes de impulsos dolorosos) III)
consequentemente menor transmissatildeo de impulsos dolorosos para o taacutelamo e deste para
o coacutertex sensiacutevel Estas vias descendentes tecircm como mediadores os neurotransmissores
23
serotonina e norepinefrina Como esses neurotransmissores satildeo regulados por
antidepressivos triciacuteclicos os antidepressivos inibidores seletivos da recaptaccedilatildeo de
serotonina (SSRIs) e NSRIs (natildeo seletivo) especula-se que o mecanismo analgeacutesico
(independente do efeito antidepressivo) que apresentam estes constituintes seja pelo
menos em parte por desinibiccedilatildeo desta via descendente (CRUCIANI NIETO 2006)
22 Inflamaccedilatildeo
A inflamaccedilatildeo eacute um processo fisiopatoloacutegico e um mecanismo protetor
importante de resposta de defesa geralmente beneacutefica ao organismo que atua para
remover os efeitos da agressatildeo promover a sobrevivecircncia do tecido reparar e recuperar
o tecido lesado conservar a energia do organismo ou para neutralizar agentes
prejudiciais embora incialmente beneacutefica ela possa perder sua funccedilatildeo reparadora de
cicatrizar e reconstituir o tecido lesado (ALLER et al 2006 LIMA et al 2007
MEDZHITOV 2008 BEZERRA et al 2014 CRUZ 2016)
Quando o estiacutemulo desencadeante do processo inflamatoacuterio eacute autolimitado ou
controlado por tratamento a inflamaccedilatildeo eacute inibida e as repercussotildees sanadas Caso a
inflamaccedilatildeo seja extensiva prolongada e natildeo seja tratada adequadamente pode persistir
ou recidivar levando a um padratildeo de cronicidade como ocorre em neoplasias
colagenoses e infecccedilotildees crocircnicas (BALLOU KUSNHER 1993 VOLANAKIS 1993
BAUMANN GAULDIE 1994 LIMA et al 2007) Alguns desses agentes podem ser
patoacutegenos (bacteacuterias fungos e viacuterus) agentes fiacutesicos (radiaccedilatildeo trauma objetos
cortantes ou queimaduras) quiacutemicos (poluentes toxinas substacircncias caacuteusticas) necrose
tecidual bem como reaccedilotildees imunoloacutegicas (hipersensibilidade) (ROBBINS 1986
MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007 ASHLEY et al 2012)
24
A inflamaccedilatildeo pode liberar ou gerar uma populaccedilatildeo diversificada de mediadores
proacute-inflamatoacuterios como bradicininas serotonina histaminas prostaglandinas e oacutexido
niacutetrico Essas substacircncias frequentemente desencadeiam manifestaccedilotildees cliacutenicas tais
como dor calor vermelhidatildeo (rubor) tumor (edema) e o quinto sinal perda da funccedilatildeo
do tecido ou oacutergatildeo lesado e pode produzir hiperalgesia ou alodinia (ROBBINS 1986
ARSATI VEIGA 1999 BEZERRA et al 2014) O rubor e o calor satildeo o resultado de
um aumento da circulaccedilatildeo na aacuterea inflamada A dor localizada depende da migraccedilatildeo e
do acuacutemulo de leucoacutecitos inflamatoacuterios nos vasos sanguiacuteneos para dentro do tecido
formaccedilatildeo de tecido de granulaccedilatildeo e de substacircncias bioloacutegicas que atuam sobre as
terminaccedilotildees nervosas (MONTENEGRO FRANCO 1999 LIMA et al 2007) O
edema eacute a consequecircncia do aumento da permeabilidade vascular na regiatildeo afetada e
exsudaccedilatildeo de fluiacutedo local (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999)
Dependendo de sua duraccedilatildeo a inflamaccedilatildeo pode ser classificada em duas
categorias inflamaccedilatildeo aguda e inflamaccedilatildeo crocircnica A inflamaccedilatildeo aguda eacute uma reaccedilatildeo
imediata precoce e raacutepida eacute a resposta do sistema imunoloacutegico que ativa vaacuterias vias
intracelulares e intercelulares contra os patoacutegenos (RUH et al 2013 CRUZ 2016) e a
lesatildeo tecidual pode durar desde poucos minutos ateacute alguns dias eacute um processo mediado
por eicosanoacuteides e aminas vasoativas que aumentam a permeabilidade vascular levando
a exsudaccedilatildeo de proteiacutenas fluidas e plasmaacuteticas com acuacutemulo na regiatildeo inflamada de
liacutequido (edema) fibrina (que se forma no interstiacutecio pela interaccedilatildeo entre componentes
do plasma e fatores dos tecidos) e inclui a participaccedilatildeo de diferentes tipos celulares tais
como neutroacutefilos macroacutefagos mastoacutecitos linfoacutecitos plaquetas ceacutelulas dendriacuteticas
ceacutelulas endoteliais e fibroblastos entre outras para o local infectado (LIMA et al
2007 RUH et al 2013) Na inflamaccedilatildeo aguda quando o sistema imunoloacutegico elimina
com sucesso os agentes prejudiciais a reaccedilatildeo desaparece mas se a resposta natildeo
25
removecirc-los podem causar uma inflamaccedilatildeo crocircnica (ROBBINS 1986 MONTENEGRO
FRANCO 1999 KUMAR et al 2012 BEZERRA et al 2014)
A inflamaccedilatildeo crocircnica persiste por semanas e meses eacute a inflamaccedilatildeo que resulta
de um estiacutemulo agressivo pelo agente causal ocorrendo fenocircmenos produtivos no local
onde a resposta em cascata da coagulaccedilatildeo sanguiacutenea e vias inflamatoacuterias satildeo
mobilizadas e inclui a proliferaccedilatildeo de vasos fibroblastos (com consequente deposiccedilatildeo
de colaacutegeno) aumento da permeabilidade em microvasos a ligaccedilatildeo de ceacutelulas
circulantes aos vasos na proximidade do local de lesatildeo como tambeacutem proliferaccedilatildeo e
migraccedilatildeo celular na recuperaccedilatildeo tecidual como macroacutefagos linfoacutecitos e destruiccedilatildeo
tecidual (ROBBINS 1986 MONTENEGRO FRANCO 1999 KUMAR et al 2012
BEZERRA et al 2014) Esta ativaccedilatildeo ocorre por uma diversidade de mediadores
inflamatoacuterios (RUH et al 2013 BEZERRA et al 2014)
Durante a inflamaccedilatildeo algumas ceacutelulas principalmente macroacutefagos podem ser
ativadas atraveacutes do reconhecimento de uma endotoxina patogecircnica chamada
lipopolisacariacutedeo (LPS) pelo receptor de tipo pedaacutegio dos macroacutefagos (TLR) Este
evento desencadeia uma via de sinalizaccedilatildeo que libera o NF-κB (fator nuclear kappa-
cadeia leve-potenciador de ceacutelulas B ativadas) um fator de transcriccedilatildeo que eacute
responsaacutevel pela ativaccedilatildeo de genes associados agrave transcriccedilatildeo de mediadores
inflamatoacuterios tais como as interleucinas (IL) -1β IL-6 IL-8 IL-13 IL-10 que ativam
ceacutelulas inflamatoacuterias e as citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF-α) que
ativam ceacutelulas endoteliais e tissulares prostaglandinas (PGs) e enzimas inflamatoacuterias
tais como a sintase induziacutevel (iNOS) responsaacutevel pela siacutentese de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) e
ciclooxigenases (COXs) O fator transformador de crescimento beta (TGF-β) fatores de
crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e fatores de crescimento epideacutermico (EGF)
estimulam a proliferaccedilatildeo de fibroblastos secreccedilatildeo de matriz e induzem o recrutamento
de leucoacutecitos (FRIEDMAN HUGHES 2002 RUBIN et al 2006 AARABI et al
26
2007 ROCK KONO 2008 PROELL et al 2008 RIBEIRO et al 2010 KUMAR et
al 2012 RUH et al 2013)
A via de sinalizaccedilatildeo TLR tambeacutem desencadeia a geraccedilatildeo de espeacutecies reativas
de oxigecircnio (ROS) As ROS satildeo produzidas essencialmente durante a fosforilaccedilatildeo
oxidativa e por ativaccedilatildeo de ceacutelulas fagociacuteticas durante uma explosatildeo oxidativa A
produccedilatildeo excessiva de ROS e a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica podem levar ao dano em lipiacutedios
proteiacutenas membranas aacutecidos nucleicos e tambeacutem serve como um importante
sinalizador intracelular que amplifica respostas inflamatoacuterias Inuacutemeros estudos
demonstram o envolvimento de ROS nos processos inflamatoacuterios como na patogecircnese
das artropatias crocircnicas inflamatoacuterias como a artrite reumatoide Acredita-se que as
ROS possam atuar como segundos mensageiros para ativaccedilatildeo do fator de transcriccedilatildeo
NFκB que orquestra a expressatildeo de vaacuterios genes que perpetuam a resposta inflamatoacuteria
(SURH 2005 FILIPPIN et al 2008)
A superproduccedilatildeo desses mediadores como ocorre na inflamaccedilatildeo crocircnica tem
sido associada agrave ocorrecircncia de doenccedilas crocircnicas degenerativas como artrite reumatoacuteide
arteriosclerose asma doenccedila de Alzheimer luacutepus eritematoso sistecircmico doenccedilas
cardiovasculares diabetes obesidade doenccedilas pulmonares doenccedilas neuroloacutegicas e
cacircncer entre outros (LIMA et al 2007 ROCK KONO 2008 BEZERRA et al 2014)
As doenccedilas das articulaccedilotildees agudas e crocircnicas apresentam a inflamaccedilatildeo articular
como o principal sintoma cliacutenico Artrite eacute o termo geneacuterico que atinge vaacuterias doenccedilas
articulares onde envolve inflamaccedilatildeo de uma ou mais articulaccedilotildees ou do sistema
musculoesqueleacutetico A forma mais comum eacute a artrite reumatoide (AR) ou osteoartrose
(OA) tambeacutem denominada de artrose (CONTE et al 2015 CROSS et al 2014) A AR
eacute uma artropatia inflamatoacuteria sistecircmica que se manifesta como fadiga dor anorexia
astenia e atinge principalmente as articulaccedilotildees perifeacutericas de modo simeacutetrico iniciando
pelas articulaccedilotildees dos dedos matildeos e peacutes evoluindo para articulaccedilotildees maiores como
27
ombros e joelhos ateacute o aparecimento da rigidez e inflamaccedilatildeo da membrana sinovial
(sinovite) levando a destruiccedilatildeo celular (ABBAS et al 2008 HOLMQVIST et al
2010 MOTA et al 2011)
A poliartrite visualizada na AR ocorre por causa do desenvolvimento do
processo inflamatoacuterio na membrana sinovial devido agraves respostas imunoloacutegicas
reguladas por mecanismos de vias de sinalizaccedilatildeo intracelular e regulaccedilatildeo da expressatildeo
gecircnica O destaque nessa regulaccedilatildeo eacute a ativaccedilatildeo do fator nuclear de transcriccedilatildeo kappa B
(NF-κB) ndash capaz de controlar a expressatildeo de TNFα citocinas proacute-inflamatoacuterias (IL-1
IL-8 TNF-α IL-6 e IL-17) siacutentese de oacutexido niacutetrico induziacutevel (iNOS) cicloxigenase 2
(COX-2) e moleacutecula de adesatildeo intercelular-1 (ICAM-1) ativaccedilatildeo do metabolismo do
aacutecido araquidocircnico (AA) induccedilatildeo de resposta da fase aguda e ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos e
macroacutefagos que levam ao aumento na liberaccedilatildeo de mediadores como o oacutexido niacutetrico
(NOmiddot) espeacutecies reativas de oxigecircnio e nitrogecircnio (EROs e ERNs) e formaccedilatildeo de
radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a inflamaccedilatildeo e ocasiona a
destruiccedilatildeo articular dor e edema (THOMSON et al 2003 SWEENEY FIRESTEIN
2004 KUKAR et al 2009 HOLMQVIST et al 2010 PAIVA et al 2011 ABBAS et
al 2008 KOURILOVITCH et al 2014)
23 Uacutelcera peacuteptica
A uacutelcera peacuteptica (UP) ou enfermidade ulcerosa peacuteptica eacute uma afecccedilatildeo
heterogecircnea multifatorial que acomete 15 a 20 da populaccedilatildeo mundial A uacutelcera eacute
denominada peacuteptica porque ocorre em siacutetios expostos agrave secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico e
pepsina (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 ORIAacute BRITO 2016) A UP eacute uma lesatildeo
em forma de ferida mais ou menos profunda na camada mais superficial (denominada
mucosa) que recobre o tubo digestivo Quando esta lesatildeo se localiza no estocircmago se
28
denomina uacutelcera gaacutestrica e quando aparece na primeira porccedilatildeo do intestino delgado eacute
chamada de uacutelcera duodenal (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004)
Em 90 dos casos a UP eacute uma lesatildeo uacutenica raramente dupla ou muacuteltipla Na
maioria das vezes apresenta-se como lesatildeo arredondada ou ovalada com diacircmetro
variando de 05 a 20 cm e bordas regulares pouco elevadas e cortadas a pique
tendendo a se afunilar na medida em que se aprofundam na parede do oacutergatildeo O fundo eacute
geralmente limpo mas pode estar coberto por material brancacento por tecido de
granulaccedilatildeo avermelhado ou por tecido fibroso A lesatildeo pode estar restrita agrave submucosa
ou atingir a muscularis mucosae serosa ou a caacutepsula ou parecircnquima de um oacutergatildeo
vizinho De acordo com a profundidade da lesatildeo e a intensidade da reaccedilatildeo conjuntiva a
UP pode ser classificada em superficial localizada na submucosa profunda quando
atinge a lacircmina proacutepria perfurante quando ultrapassa todas as camadas da parede e se
abre na cavidade peritoneal e penetrante quando aleacutem de ultrapassar todas as camadas
fica tamponada por oacutergatildeos vizinhos (pacircncreas e fiacutegado) A uacutelcera gaacutestrica (UG) costuma
apresentar dimensotildees maiores do que a duodenal (UD) (ORIAacute BRITO 2016)
A fisiopatologia da uacutelcera peacuteptica pode ser considerada um desequiliacutebrio entre
os mecanismos de defesa e fatores agressores da mucosa (bicarbonato muco gaacutestrico o
fluxo sanguiacuteneo da mucosa os fosfolipiacutedios tensoativos as prostaglandinas (PG) oacutexido
niacutetrico (NOmiddot) os sistemas antioxidantes enzimaacuteticos e natildeo enzimaacuteticos diferentes
peptiacutedeos e fatores de crescimento) e fatores agressivos (aacutecido cloriacutedrico pepsina
radicais livres e oxidantes os leucotrienos a bile refluiacuteda e endotelinas) (KANGWAN
et al 2014 FARZAEI et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A regulaccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido pelas ceacutelulas parietais eacute especialmente
importante na patogecircnese da uacutelcera peacuteptica e constitui um alvo para a accedilatildeo de faacutermacos
A secreccedilatildeo das ceacutelulas parietais eacute uma soluccedilatildeo isotocircnica de HCl (150 mmolL) com pH
abaixo de 1 De modo bastante simplificado iacuteons cloreto (Cl-) satildeo transportados
29
ativamente do plasma para a ceacutelula parietal Esta secreccedilatildeo de iacuteons Cl- acompanhada por
iacuteons K+ que satildeo entatildeo trocados por iacuteons H+ pela K+ H+ ATPase (bomba de proacutetons)
Tem-se entatildeo a combinaccedilatildeo de iacuteons hidrogecircnio (H+) e cloreto (Cl) seguido de sua
liberaccedilatildeo pelas glacircndulas secretoras gaacutestricas (BRAGA et al 2011) Embora a doenccedila
ulcerosa peacuteptica seja multifatorial o Helicobacter pylori eacute o principal fator da uacutelcera
peacuteptica dispepsias gastrite crocircnica e cacircncer gaacutestrico (URGESI et al 2012 IIZASA et
al 2015 TEIXEIRA et al 2016)
O H pylori eacute uma bacteacuteria espiralada Gram-negativa (YAMAOKA 2010) que
pode estar presente no muco que cobre a superfiacutecie do estocircmago e que causa gastrite
crocircnica provocando erosotildees e uacutelceras no estocircmago especialmente nas pessoas de idade
avanccedilada (MOREIRA SAN ROMAacuteN 2004 MATSUDA et al 2010 BRAGA et al
2011 ORIAacute BRITO 2016) A H pilori tem a capacidade de habitar no estocircmago
devido a sua capacidade em produzir a enzima urease que converte a ureacuteia em amocircnia
que por sua vez protege a bacteacuteria no meio aacutecido do estocircmago o que leva a
alcalinizaccedilatildeo da superfiacutecie do epiteacutelio o aumento significativo do pH no luacutemen gaacutestrico
gerando o aumento da siacutentese e liberaccedilatildeo de somastatina pelas ceacutelulas D substacircncia que
inibe a secreccedilatildeo gaacutestrica por impedir a liberaccedilatildeo de histamina e gastrina responsaacuteveis
pela produccedilatildeo do aacutecido cloriacutedrico (CHAN LEUNG 2002 MALFERTHEINER et al
2009 IIZASA et al 2015 ORIAacute BRITO 2016)
A infecccedilatildeo por H pylori pode ser responsabilizada por 90-95 das UD e 70-
75 das UG A erradicaccedilatildeo do microrganismo reduz dramaticamente a taxa de
recorrecircncia da doenccedila para 5 ao ano em contraposiccedilatildeo a taxas de 70-85 observadas
nos tratamentos convencionais adotados que natildeo visam erradicaccedilatildeo do H pylori
(ORIAacute BRITO 2016) O segundo fator etioloacutegico para o desenvolvimento de uacutelcera
peacuteptica consiste no uso crocircnico de anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) natildeo
seletivos para COX-2 (RAMAKRISHNAN SALINAS 2007 ORIAacute BRITO 2016)
30
A ceacutelula parietal eacute responsaacutevel pela secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido cloriacutedrico em
decorrecircncia da ativaccedilatildeo da H+ K+ ATPase denominada bomba de proacutetons que se
localiza na membrana luminal da ceacutelula e constitui a etapa inicial da secreccedilatildeo aacutecida A
secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido eacute regulada por trecircs vias tendo como agonistas a acetilcolina
(via neuronal) a histamina (via paraacutecrina) e a gastrina (via endoacutecrina) Esses
mediadores interagem com receptores acoplados a duas importantes vias sinalizadoras
adenilato ciclase no caso da histamina e caacutelcio intracelular no caso da gastrina e
acetilcolina A acetilcolina liberada por neurocircnios poacutes-ganglionares do nervo vago esti-
mula diretamente a secreccedilatildeo do aacutecido atuando em receptores muscariacutenicos M3
localizados na membrana basolateral da ceacutelula parietal e indiretamente por inibiccedilatildeo da
secreccedilatildeo de somatostatina cuja funccedilatildeo eacute inibir a liberaccedilatildeo de histamina pelas ceacutelulas
semelhante a enterocromafina (ECL) e de gastrina pelas ceacutelulas G localizadas na regiatildeo
do antro gaacutestrico (ORIAacute BRITO 2016)
A histamina gerada pela descarboxilaccedilatildeo da L-histidina sob accedilatildeo cataliacutetica da
enzima histidina-descarboxilase (HDC) estimula a secreccedilatildeo gaacutestrica de aacutecido depois de
se ligar aos receptores de histamina-2 (H2) localizados nas ceacutelulas parietais
desencadeando uma cascata de eventos que resulta no aumento dos niacuteveis intracelulares
de adenosina monofosfato ciacuteclico (AMPc) A histamina estimula ainda a secreccedilatildeo
gaacutestrica de aacutecido de maneira indireta ao inibir a secreccedilatildeo de somatostatina pelas ceacutelulas
D localizadas no antro gaacutestrico e por estimular a liberaccedilatildeo de gastrina pelas ceacutelulas G A
gastrina eacute o principal estimulador da secreccedilatildeo aacutecida durante a ingestatildeo de alimentos e
age principalmente liberando histamina das ceacutelulas ECL localizadas no corpo e fundo
do estocircmago A gastrina liga-se a receptores de gastrinacolecistocinina do tipo 2 (CCK-
2) localizados nas ceacutelulas ECL e tambeacutem nas ceacutelulas parietais A ativaccedilatildeo dos
receptores CCK-2 localizados nas ceacutelulas ECL parece ser a principal via pela qual a
gastrina estimula a secreccedilatildeo aacutecida (ORIAacute BRITO 2016)
31
A produccedilatildeo contiacutenua de prostaglandinas (principalmente PGE2 e PGI2)
sintetizadas na mucosa gaacutestrica principalmente pela enzima ciclooxigenase-1 (COX-1)
estimula a secreccedilatildeo de muco e de bicarbonato diminuem a secreccedilatildeo de aacutecido e causam
vasodilataccedilatildeo mantendo a integridade da mucosa e proteccedilatildeo contra agentes que causam
lesatildeo epitelial (BRAGA et al 2011 ORIAacute BRITO 2016) Isto provavelmente explica
a capacidade de muitos anti-inflamatoacuterios natildeo esteroidais (AINEs) inespeciacuteficos de
causarem sangramento e erosotildees gaacutestricas visto que satildeo inibidores da COX-1 (BRAGA
et al 2011) Prostaglandinas inibem ainda a ativaccedilatildeo de mastoacutecitos e leucoacutecitos bem
como a aderecircncia de plaquetas ao endoteacutelio vascular O oacutexido niacutetrico no trato
gastrointestinal atua na manutenccedilatildeo da homeostase pelo seu papel citoprotetor e
regulador do fluxo sanguiacuteneo (ORIAacute BRITO 2016)
A terapia da uacutelcera peacuteptica alia a reduccedilatildeo da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico usando
antagonistas dos receptores H2 (cimetidina renitida histidina e famotidina) ou IBPs
bem como a neutralizaccedilatildeo do aacutecido secretado com antiaacutecidos (hidroacutexido de magneacutesio
hidroacutexido de alumiacutenio e bicarbonato de soacutedio) e protetores da mucosa como o
sucralfato Embora os antiaacutecidos tenham sido utilizados ao longo do tempo e tenham
provado ser relativamente eficazes o seu uso eacute inconveniente devido agrave necessidade de
vaacuterias doses diaacuterias e tambeacutem pela associaccedilatildeo a efeitos colaterais indesejados (BRAGA
et al 2011)
No caso de infecccedilatildeo por H pylori satildeo associados antisecretores e antibioacuteticos
(claritromicina amoxicilina metronidazol tinidazol tetraciclina e fluorquinolonas
como levofloxaxino e moxifloxacino) O tratamento conhecido como terapia triacuteplice
(combinaccedilatildeo de um IBP claritromicina e amoxicilina) comeccedilou a apresentar evidecircncias
de resistecircncia microbiana por volta do ano 2000 com taxas de cura inferiores a 80
Atualmente os estudos apontam para a eficaacutecia de terapia concomitante (associaccedilatildeo de
amoxicilina claritromicina tinidazol ou metronidazol e IBP por 14 dias) terapia
32
sequencial (amoxicilina + IBP5 dias seguida de claritromicina e tinidazol ou
metronidazol + IBP5 dias) terapia concomitante combinada (combinaccedilatildeo das duas
citadas anteriormente) ou ainda terapia com bismuto (associaccedilatildeo de bismuto
tetraciclina metronidazol + IBP) A terapia triacuteplice ainda permanece como alternativa
quando haacute evidecircncias de susceptibilidade agrave claritromicina (BRAGA et al 2011)
24 Quiacutemica e farmacologia do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo de copaiacuteba eacute um oacuteleo-resina composto de aacutecidos resiacutenicos e substacircncias
volaacuteteis (KOBAYASHI et al 2011) O oacuteleo-resina da espeacutecie Copaifera multijuga
Haynes (Leguminosae-Caesalpinoideae) eacute extensivamente comercializado no Brasil
como caacutepsulas ou oacuteleo bruto para o tratamento de vaacuterios distuacuterbios (GOMES et al
2010) Comparaccedilatildeo das composiccedilotildees de oacuteleo-resina de Copaifera guianensis Desf e
Copaifera duckei Dwyer e da mais conhecida Copaifera multijuga Hayne todos de
ocorrecircncia comum na Amazocircnia brasileira mostra uma significativa variabilidade
quiacutemica natildeo apenas entre espeacutecies mas tambeacutem dentro de uma dada espeacutecie e ateacute em
uma mesma aacutervore individual (CASCON e GILBERT 2000) Por isso a falta de
padronizaccedilatildeo desses oacuteleos constitui uma barreira agrave sua comercializaccedilatildeo mais ampla
(SOUZA BARBOSA et al 2013)
A anaacutelise quiacutemica do oacuteleo Copaifera multijuga Hayne realizada utilizando
cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria de massa mostrou que o oacuteleo eacute
composto de sesquiterpenos com predominacircncia do β-cariofileno (360) e oacutexido de
cariofileno os quais fazem parte da composiccedilatildeo quiacutemica e podem ser utilizados como
padrotildees quiacutemicos de copaiacuteba (KOBAYASHI et al 2011 SOUZA BARBOSA et al
2013) e no estudo em trecircs amostras do oacuteleo-resina os teores de β-cariofileno foram
respectivamente 575 197 e 409 (VEIGA JUNIOR et al 2007) seguido de α-
33
humuleno α-copaeno (188) β-bisaboleno (85) α-trans-bergamoteno (70) δ-
cadineno (VEIGA JUNIOR et al 2007 KOBAYASHI et al 2011) Entre os
diterpenos aacutecido copaacutelico (62) foi o principal componente da Copaifera multijuga
Hayne encontrado em todos os oacuteleo-resinas estudados (VEIGA JUNIOR et al 2007)
A atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo de copaiacuteba foi a propriedade mais estudada
(BASILE et al 1988) O oacuteleo-resina de espeacutecies de Copaifera brasileiras inibiu
significativamente o edema de pata induzida por carragenina apoacutes doses orais de 070-
269 mlkg mas foi um pouco menos eficaz do que 50 mgkg de fenilbutazona caacutelcica
A administraccedilatildeo repetida do oacuteleo-resina a uma dose de 126 mlkg por um periacuteodo de 6
dias reduziu a formaccedilatildeo de granuloma a uma resposta comparaacutevel a de 20 mgkg de
fenilbutazona caacutelcica Esta mesma dose de oacuteleo-resina igualmente reduziu a
permeabilidade vascular para histamina intercutacircnea Os valores da DL50 do oacuteleo-resina
da copaiacuteba encontram-se na Tabela 1 cujos resultados datildeo suporte experimental para
utilizaccedilatildeo na medicina popular brasileira como um produto anti-inflamatoacuterio (BASILE
et al 1988)
Tabela 1 - Valores da DL50 do oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido de diferentes espeacutecies
de copaiacuteba
Oacuteleo-resina Animal DL50 Via Oral Referecircncia
Copaiacuteba spp Rato 379 (321-4471) mlkg middot BASILE et al (1988) middot
Copaiba spp Rato 630909 mgKg
C reticulata Rato 448 mlKg middotRIO (2001) middot
Creticulata Rata gt2000 mgKg middotCAMILE et al (2009) middot
C langsdorfii Camundongo 845 mlKg middotCHEN-CHEN e SENA
(2002) middot
C multijuga Rato Ateacute 40gKg sem morte middotGONCcedilALVES e
WANDERLEY (2014) middot
C duckei Rato 375816 mgKg middotLIMA (2014) middot
Disposiccedilotildees 19101200 do tiacutetulo 29 do Coacutedigo de Regulamentos Federais dos EUA
Dose letal classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423
34
O estudo da atividade anti-inflamatoacuteria do oacuteleo em ratos utilizando o modelo de
edema induzido por carragenina mostrou inibiccedilatildeo do edema e inibiu a formaccedilatildeo de
granuloma no modelo ldquoCotton-pelletrdquo aumentando a permeabilidade vascular
mostrando resultados com indicaccedilatildeo de atividade anti-inflamatoacuteria O estudo
comparativo das atividades analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria do oacuteleo-resina de C cearensis
com os derivados isolados de oacuteleo-resina de copaiacuteba (aacutecido copaacutelico eacutester metiacutelico do
aacutecido solidago e bisabolol) e da substacircncia indometacina mostrou resultados maiores em
relaccedilatildeo aos derivados isolados poreacutem menor que a da indometacina (FERNANDES et
al 1992) A avaliaccedilatildeo das propriedades cicatrizantes de feridas e uacutelceras utilizando
oacuteleos de copaiacuteba de origem comercial em modelo de ferida aberta apresentou aumento
do tecido de granulaccedilatildeo e do nuacutemero de vasos sanguiacuteneos poreacutem diminuiccedilatildeo da
quantidade de fibras colaacutegenas (BRITO et al 1998 BRITO et al 1999a) Os oacuteleos de
Copaifera langsdorfii se mostraram no mesmo modelo bastante ativos em ratos e
apresentaram resistecircncia agrave tensatildeo e uacutelcera crocircnica de estocircmago induzida por aacutecido
aceacutetico (PAIVA et al 2000) O preacute-tratamento com oacuteleo de Copaifera langsdorfii em
doses a partir de 400 mgkg protegeu a mucosa gaacutestrica dos ratos de lesotildees induzidas
por etanol e indometacina devido provavelmente agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica e da
promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de muco gaacutestrico e bicarbonato (PAIVA et al 1998)
Amostras de oito oacuteleos de copaiacuteba comerciais usados na regiatildeo amazocircnica como
agentes anti-inflamatoacuterios e disponiacuteveis nos mercados populares foram testados in vivo
e inibiram significativamente a formaccedilatildeo de edema induzido por bradicinina e pela
carragenina em ratos Duas amostras destes oacuteleos com efeitos anti-inflamatoacuterios foram
fracionadas e detectadas vaacuterios sesquiterpenos e diterpenos Isto sugere que os
sesquiterpenos presentes nos oacuteleos de copaiacuteba podem ser responsaacuteveis pela accedilatildeo anti-
inflamatoacuteria relatada na medicina popular (VEIGA et al 2001) Duas amostras de oacuteleos
coletados da mesma aacutervore Copaifera multijuga Hayne mas em diferentes periacuteodos do
35
ano foram fracionados e as fraccedilotildees hexano diclorometano e metanol obtidos de um
desses oacuteleos-resinas foi analisado por cromatografia gasosa acoplada agrave espectrometria
de massa sendo identificados vinte e sete sesquiterpenos e seis diterpenos onde os
principais componentes foram o β-cariofileno α-copaeno e aacutecido copaacutelico As fraccedilotildees
diclorometano e metanol foram administradas por via intraperitoneal e causaram uma
inibiccedilatildeo significativa do edema da pata causada por carragenina com a inibiccedilatildeo de 49 plusmn
13 64plusmn9 respectivamente Da mesma forma a droga controle positivo
dexametasona tambeacutem inibiu significativamente a formaccedilatildeo de edema de pata induzido
por carragenina (60plusmn4 em 2 horas) A fraccedilatildeo hexano tambeacutem inibiu
significativamente (50plusmn6) a formaccedilatildeo do edema da pata causada por bradicinina
Estes resultados sugerem a presenccedila de compostos terpecircnicos ativos ainda natildeo
identificados no oacuteleo de C multijuga que exibiu propriedades anti-edematogecircnicas
Digno de nota o rendimento destes compostos e as accedilotildees farmacoloacutegicas do oacuteleo
apresentaram grandes variaccedilotildees sazonais um aspecto relevante que deve ser
cuidadosamente observado para o uso medicinal correto desta planta pela populaccedilatildeo
(VEIGA JUNIOR et al 2006)
Estudos farmacoloacutegicos comparativos entre diferentes espeacutecies de copaiacuteba satildeo
raros (GOMES et al 2007) Entre eles trecircs oacuteleo-resinas de copaiacuteba obtidos de espeacutecies
da Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera
reticulata Ducke foram avaliados os efeitos farmacoloacutegicos anti-inflamatoacuterios in vitro
atraveacutes da mediccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NOmiddot) em macroacutefagos murinos e in
vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos Os resultados
mostraram que o oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Haynes (100 mgkg) foi o mais
potente tanto inibindo a produccedilatildeo de NOmiddot quanto na pleurisia induzida pelo zimosano
Os oacuteleo-resinas de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke
36
tambeacutem foram capazes de inibir a produccedilatildeo de NOmiddot e na pleurisia mas com menor
intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007)
Ensaios preacute-cliacutenicos em ratos para avaliar os efeitos anti-inflamatoacuterios e accedilatildeo
sobre o SNC mostraram que as doses de 100 e 200 mgkg e em uma concentraccedilatildeo de
200 microlml do oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios tanto in
vivo quanto in vitro com base na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade
pleural dos ratos e a soluccedilatildeo quimiotaacutetica de lipopolissacariacutedeo respectivamente A
investigaccedilatildeo sobre os efeitos no SNC mostrou reduccedilatildeo sobre as atividades locomotoras
e exploratoacuterias e aumentou a ansiedade dos animais nas doses de 100 e 200 mgkg Os
resultados obtidos sugerem que do oacuteleo de copaiacuteba tem efeito anti-inflamatoacuterio e um
importante e interessante efeito no sistema nervoso central (KOBAYASHI et al 2011)
Estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleo-resinas de
copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando modelo perifeacuterico (contorccedilatildeo abdominal induzida
por aacutecido aceacutetico e formol) da coluna vertebral (retirada de cauda) e supra-espinhal
(placa quente) mostraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos
As doses que variaram de 30 a 150 mgkg foram suficientes para desenvolver
significativamente efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Todos os oacuteleos de copaiacuteba
demonstraram a atividade central mas com menos efeitos sobre as regiotildees supra
espinhal do ceacuterebro A administraccedilatildeo do antagonista do receptor de opioide naloxona
inibiu completamente o efeito anti-nociceptivo induzido por ambas as copaiacutebas Os
resultados indicaram que os oacuteleos-resinas de copaiacuteba possuem efeitos anti-nociceptivos
central e perifeacuterico Este novo efeito comprova que pode ser uacutetil no tratamento de
desordens algeacutesicas (GOMES et al 2007)
Estudos farmacoloacutegicos para elucidar o mecanismo de accedilatildeo central do oacuteleo
de copaiacuteba utilizando modelos para analgesia (contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e
37
de retirada da cauda) ou inflamaccedilatildeo (edema da pata de rato e aumento da
permeabilidade vascular) realizados em trecircs fraccedilotildees obtidas a partir de oacuteleo-resina
Copaifera multijuga hexano (HF) clorofoacutermio (CF) e metanol (MF) representando as
trecircs principais classes de substacircncias do geacutenero Copaiacutefera (hidrocarbonetos
sesquiterpenos sesquiterpenos oxigenados e diterpenos aziacutedicos) nas doses que
variaram entre 1 e 150 mg kg do oacuteleo-resina Copaifera multijuga (OCM 100 mg kg
po) e o faacutermaco de referecircncia morfina (5 mgkg po) Todos os animais foram preacute-
tratados com naloxona (antagonista de receptor opioacuteide 5mgkg ip) (GOMES et al
2010) As fraccedilotildees inibiram significativamente de maneira dose-dependente o nuacutemero
de contorccedilotildees induzidas por aacutecido aceacutetico e a segunda fase de resposta de lamber
induzido pela formalina Resultados similares foram observados no modelo de retirada
da cauda O efeito anti-nociceptivo central para HF e CF nas doses de 50 e 100 mgkg
foi mais elevada do que a observada com a morfina (1 mgkg) A administraccedilatildeo de
naloxona inibiu o efeito anti-nociceptivo de fraccedilotildees indicando que HF CF e MF podem
estar agindo em receptores opioacuteides Todas as trecircs fraccedilotildees inibiram o edema da pata de
rato e aumentaram a permeabilidade vascular induzida por vaacuterios agentes flogiacutesticos
(carragenina histamina e serotonina) Os resultados indicam que as fraccedilotildees obtidas a
partir de Copaifera multijuga Hayne mostraram efeito anti-nociceptivo provavelmente
mediado pelos receptores opiaacuteceos e atividade anti-inflamatoacuteria atraveacutes da inibiccedilatildeo dos
percursores histamineacutergicos e serotonineacutergicos (GOMES et al 2010)
Os possiacuteveis efeitos anti-inflamatoacuterios e neuroprotetores do copaiacuteba oacuteleo-
resina (COR) foram investigados na sequecircncia de um dano agudo apoacutes a desordem
neural provocadas em ratos adultos com relaccedilatildeo ao coacutertex motor Nos animais foi
injetada a neurotoxina N-metil-D-aspartato (NMDA) (n = 10) e tratou-se com uma
uacutenica dose de COR (400 mgkg ip) logo apoacutes a cirurgia (Grupo 1) ou com duas doses
diaacuterias (200 mgkg ip) durante trecircs dias (Grupo 2) para alterar lesatildeo Os animais de
38
controle foram tratados apenas com veiacuteculo Tratamento COR induziu a preservaccedilatildeo
tecidual e diminuiccedilatildeo do recrutamento dos neutroacutefilos e a ativaccedilatildeo da microacuteglia no local
da lesatildeo em comparaccedilatildeo aos animais controle Os resultados sugerem que o tratamento
COR induz neuroproteccedilatildeo por modulaccedilatildeo da resposta inflamatoacuteria no seguimento do
dano agudo do sistema nervoso central (GUIMARAtildeES-SANTOS et al 2012)
A copaiacuteba Copaifera langsdorfii Desf e outras espeacutecies afins por via oral
tem sido indicada no tratamento auxiliar de hemorroidas e dores localizadas no
intestino tomando-se 5 ateacute 60 gotas duas a trecircs vezes por dia misturados no leite ou no
mel de abelhas diminuindo-se o nuacutemero de gotas se aparecerem sintomas secundaacuterios
desagradaacuteveis como naacuteusea mal-estar do estocircmago e diarreia (ABREU MATOS 2002)
Ensaio cliacutenico para avaliar a seguranccedila cliacutenica do uso de uma formulaccedilatildeo
fitoteraacutepica composta da associaccedilatildeo de Mikania glomerata Spreng Mentha piperita L
Eucalyptus globulus Labill e Copaifera multijuga Hayne incorporadas agrave proacutepolis e mel
para tratar doenccedilas respiratoacuterias em estudo aberto mostrou que o xarope foi bem
tolerado e que alguns eventos adversos foram relatados sendo classificados como
possivelmente ou natildeo atribuiacutedos ao fitoteraacutepico Os iacutendices de hemoglobina TGO
TGP creatinina e leucoacutecitos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas em relaccedilatildeo ao
preacute-estudo Todos os paracircmetros laboratoriais estiveram dentro das suas respectivas
faixas de normalidade Os exames cliacutenicos eletrocardiograacuteficos e laboratoriais natildeo
evidenciaram sinais de toxicidade nos oacutergatildeos e sistemas avaliados (TAVARES et al
2006)
Em um estudo cliacutenico foi verificada a eficaacutecia cicatrizante do oacuteleo-resina de
copaiacuteba administrado por via oral e obtido da Copaifera officinalis formulada em
caacutepsulas de 80 mg e 120 mg comparado com o omeprazol 20 mg em 60 pacientes com
diagnoacutestico definitivo de uacutelcera peacuteptica Os resultados mostraram 65 a 75 cicatrizaccedilatildeo
39
da uacutelcera e sem efeitos adversos significativos (ARROYO-ACEVEDO et al 2011) no
grupo usuaacuterio de copaiacuteba
25 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica de sesquiterpenos
Os terpenoacuteides satildeo um grupo homogecircneo de moleacuteculas que podem ser
identificadas e classificadas devido ao arranjo dos esqueletos e do nuacutemero de aacutetomos de
carbono em monoterpenos (10 carbonos aacutetomos de carbono) sesquiterpenos (15
aacutetomos de carbono) diterpenos (20 aacutetomos de carbono) sesterterpenos (25 aacutetomos de
carbono) e triterpenos (30 aacutetomos de carbono) Os sesquiterpenoacuteides (C-15) formam um
grupo imenso de produtos naturais (NPs) com uma variedade estrutural extraordinaacuteria
(KLAPSCHINSKI et al 2016 BROCKSOM et al 2017)
As lactonas sesquiterpecircnicas satildeo profundamente estudadas farmacologicamente
(HERNAacuteNDEZ et al 2005) e possuem uma variedade de atividades bioloacutegicas
(FELTENSTEIN et al 2004) As atividades anti-inflamatoacuterias de algumas plantas
medicinais satildeo atribuiacutedas ao seu conteuacutedo de lactonas sesquiterpecircnicas (VALEacuteRIO et
al 2007) As lactonas sesquitecircrpenicas contendo uma porccedilatildeo alfa-metileno-gama-
lactona mostraram ser potentes inibidores do edema induzido por carragenina e da
artrite crocircnica induzida por adjuvante em roedores (HALL et al 1980) e satildeo potentes
estimuladores da degranulaccedilatildeo de mastoacutecitos Esse fenocircmeno pode ter um papel
significativo na toxicidade de algumas lactonas sesquiterpecircnicas de plantas venenosas
quando ingeridas pelo gado (ELISSALDE et al 1983) As lactonas sesquiterpecircnicas da
Neurolaena lobata planta medicinal do Caribe usada para o tratamento de vaacuterias
condiccedilotildees incluindo inflamaccedilatildeo interferiram na induccedilatildeo celular inflamatoacuteria na adesatildeo
de moleacuteculas e quimiocinas em ceacutelulas estimuladas com produtos bacterianos e
citoquinas O efeito foi confirmado in vivo o que aumenta o interesse no potencial
40
terapecircutico dos compostos para o tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (McKINNON et
al 2014)
A atividade anti-inflamatoacuteria contra granulomas em peletes de algodatildeo em ratos
foi altamente significativa pelas lactonas sesquiterpecircnicas vicoacutelide C e D isoladas a
partir da Vicoa indica e pode ser atribuiacuteda agraves suas estruturas quiacutemicas O vicolide D
possui atividade antipireacutetica (ALAM et al 1992) Verificou-se que a santonina uma
lactona sesquiterpecircnica comumente encontrada nas plantas da famiacutelia Compositae
mostra uma atividade anti-inflamatoacuteria significativa nos processos inflamatoacuterios
agudos O perfil de atividade da santonina assemelhou-se muito ao diclofenaco de
soacutedio um faacutermaco anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo A santonina causou um
efeito antipireacutetico significativo em camundongos que se verificou ser independente da
via de administraccedilatildeo do faacutermaco Tambeacutem aumentou o tempo de reaccedilatildeo da placa quente
em ratos tratados de forma similar a da morfina (AL-HARBI et al 1994)
Os produtos naturais biologicamente ativos continuam a ser uacuteteis na
exploraccedilatildeo e controle de processos de sinalizaccedilatildeo intracelular Por exemplo a
partenolida uma lactona sesquiterpecircnica da erva medicinal anti-inflamatoacuteria matricaria
(Tanacetum parthenium) parece inibir a via de sinalizaccedilatildeo proacute-inflamatoacuteria Partenolida
tem alvo molecular direto sobre o complexo da quinase que proporciona possiacutevelmente
as propriedades anti-inflamatoacuterias da substacircncia Aleacutem disso estes resultados podem ser
uacuteteis no desenvolvimento de agentes anti-inflamatoacuterios futuros (KWOK et al 2001)
Os resultados revelaram que o tratamento oral com o α-humuleno e trans-cariofileno
dois sesquiterpenoacuteides isolados do oacuteleo essencial de Cordia verbenacea exibiram
marcados efeitos inibitoacuterios em diferentes modelos experimentais inflamatoacuterios em
camundongos e ratos e que podem representar ferramentas importantes para o manejo
eou tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias (FERNANDES et al 2007)
41
26 Quiacutemica e atividade farmacoloacutegica do β-cariofileno
Alimentos inteiros agrave base de plantas fornecem milhares de metaboacutelitos bioativos
agrave dieta humana com reduccedilatildeo do risco de desenvolver doenccedilas crocircnicas (CALLEJA et al
2013) O β-cariofileno (β-Car) pertence agrave classe quiacutemica dos sesquiterpenos (PINHO et
al 2012) eacute um sesquiterpeno biciacuteclico (trans-4 1111-trimetil-8-metilenobiciclo [720]
undec-4-eno) natural com baixa toxicidade (CHANG et al 2013) amplamente
distribuiacuteda em oacuteleos essenciais de vaacuterias plantas vegetais frutas ervas medicinais
plantas comestiacuteveis especiarias e como aditivo alimentar aprovado pela FDA (Di
SOTTO et al 2010 HORVAacuteTH et al 2012 CALLEJA et al 2013 PANT et al
2014) O β-Car possui uma vasta gama de atividades bioloacutegicas e estudos cliacutenicos
mostraram que ele eacute potencialmente eficaz como antioxidante antibioacutetico anesteacutesico
local e agente anti-inflamatoacuterio (LEGAULT PICHETTE 2007 REINSVOLD et
al2011 PANT et al 2014) anticanceriacutegeno devido agrave sua capacidade para induzir
enzimas desintoxicantes in vitro e in vivo Apresentou citotoxicidade contra tumores (Di
SOTTO et al 2010) atividade neuroprotetora (OLIVEIRA et al 2016) e tem sido
usado tradicionalmente na induacutestria de cosmeacuteticos e perfumes por fornecer um aroma
amadeirado e picante (REINSVOLD et al 2011) Na induacutestria de alimentos eacute usado
desde o ano de 1930 como agente flavorizante Eacute um antioxidante natural que reduz a
fibrose hepaacutetica mediada por tetracloreto de carbono e inibe a ativaccedilatildeo das ceacutelulas
hepaacuteticas (CALLEJA et al 2013)
O oacuteleo volaacutetil dos rizomas de Zingiber nimmonii (J Graham) Dalzell eacute uma rica
fonte natural uacutenica em cariofileno tendo como seus principais constituintes os
cariofilenos isomeacutericos β-cariofileno (422) α-humuleno e α-cariofileno (277)
juntamente com vestiacutegios de isocariofileno A atividade antimicrobiana do oacuteleo foi
42
testada contra bacteacuterias e fungos patogecircnicos humanos e vegetais O oacuteleo apresentou
atividade inibitoacuteria significativa contra os fungos Candida glabrata C albicans e
Aspergillus niger e as bacteacuterias Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa Natildeo se
observou qualquer atividade contra o fungo Fusarium oxysporum (SABULAL et al
2006)
Do oacuteleo essencial das folhas de Didymocarpus tomentosa foram identificados 25
constituintes representando 816 do oacuteleo O oacuteleo essencial da folha de D tomentosa
foi extraiacutedo por hidrodestilaccedilatildeo e analisado por CGFID e CGEM conteacutem 787 de
sesquiterpenos e 29 de monoterpenos e eacute uma fonte natural rica em cariofileno
contendo β-Car oacutexido de cariofileno α-humuleno e oacutexido de humuleno A atividade
citotoacutexica do oacuteleo foi determinada pelo BSLT utilizando larva de camaratildeo e o ensaio
MTT utilizando linha celular de tumor HeLa O oacuteleo apresentou atividade citotoacutexica
significativa com valores de CL50 e IC50 de 1226 e 114 μgmL respectivamente
(GOWDA et al 2012) Aegle marmelos (Bael indiano) eacute uma aacutervore que pertence agrave
famiacutelia de Rutaceae que possui uma posiccedilatildeo de destaque tanto na medicina como na
cultura indiana A anaacutelise por citometria de fluxo revelou que a concentraccedilatildeo oacutetima (50
μgml) de fraccedilotildees de β-cariofileno e oacutexido de cariofileno do extrato de A marmelos
pode induzir a apoptose na linha celular Jurkat Assim o β-Car e o oacutexido de cariofileno
isolados de A marmelos podem atuar como potentes agentes anti-inflamatoacuterios e
moduladores de um alvo terapecircutico receacutem-estabelecido a 15-lipoxigenase (15-LOX) O
β-Car e o oacutexido de cariofileno podem induzir a apoptose em ceacutelulas de linfoma e
neuroblastoma via modulaccedilatildeo de 15-LOX (alvo ascendente) seguido pela regulaccedilatildeo
negativa de anti-apoptoacuteticos e regulaccedilatildeo positiva de genes proacute-apoptoacuteticos (SAIN et al
2014)
Evidecircncias crescentes sugerem que os extratos derivados de plantas e seus
componentes isolados satildeo uacuteteis para o tratamento de convulsotildees e portanto constituem
43
uma fonte valiosa de novos faacutermacos antiepileacutepticos com eficaacutecia melhorada e melhor
perfil de efeitos adversos Os dados sugerem que o β-Car apresenta atividade
anticonvulsiva contra as convulsotildees induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) em
camundongos Uma vez que natildeo foram observados efeitos adversos na mesma gama de
doses do efeito anticonvulsivo o β-Car deve ser avaliado no tratamento de convulsotildees
(OLIVEIRA et al 2016)
As folhas da Spiranthera odoratissima A St Hil (Manacaacute) satildeo usadas na
medicina popular para tratar doenccedilas renais e hepaacuteticas dor de estocircmago dores de
cabeccedila e reumatismo Foi descrito um efeito depressor do sistema nervoso central
(SNC) da fraccedilatildeo hexacircnica a partir do extrato etanoacutelico desta planta O β-Car eacute o
principal componente desta fraccedilatildeo hexacircnica Na avaliaccedilatildeo da atividade farmacoloacutegica
do oacuteleo essencial obtido de folhas de S odoratissima (EO) e seu principal componente
no SNC de camundongos os resultados sugerem que o oacuteleo essencial derivado de S
odoratissima produz um efeito ansioliacutetico sem alterar o desempenho motor e que esse
efeito eacute mediado por 5-HT (1A) mas natildeo por receptores de benzodiazepina Aleacutem
disso o componente principal β-Car tambeacutem tem um efeito de tipo ansioliacutetico que
pode contribuir para os efeitos de EO mas este efeito natildeo parece ser mediado via
receptores 5-HT (1A) ou benzodiazepiacutenicos (GALDINO et al 2012)
O oacuteleo essencial obtido das folhas de Bidens sulphurea (Asteraceae) apresentou
atividade moderada contra Streptococcus mutans (MIC = 250 μgmL) e atividade
significativa contra Streptococcus mitis (MIC = 3125 μgmL) Germacreno D (383)
β-Car (180) β-elemeno (139) e biciclogermacreno (131) foram identificados
como os principais componentes quiacutemicos deste oacuteleo (AGUIAR et al 2013)
O β-Car (10 mgkg) reduziu significativamente em 67 o volume do enfarte
cortical quando administrado previamente antes da oclusatildeo da arteacuteria cerebral meacutedia
(MCAO) Estas descobertas sugerem que o β-Car tem uma potente atividade
44
neuroprotetora e a sua neuroproteccedilatildeo pode estar parcialmente relacionada com a
modulaccedilatildeo de mediadores inflamatoacuterios (CHANG et al 2013)
Muitos estudos tecircm demonstrado que os agentes anti-inflamatoacuterios satildeo eficazes
no tratamento da endometriose O β-Car exerceu um potente efeito anti-inflamatoacuterio in
vivo Na investigaccedilatildeo do efeito do β-Car na endometriose e na fertilidade e reproduccedilatildeo
em ratas adultas natildeo foi observada diferenccedila estatisticamente significativa em qualquer
paracircmetro estudado entre os grupos de controle e os grupos tratados com β-Car no
estudo de fertilidade Terapia com β-Car pode apresentar uma nova opccedilatildeo terapecircutica
promissora natildeo toacutexica para pacientes com endometriose (ABBAS et al 2013)
As atividades bioloacutegicas do β-Car no musculo liso das vias aeacutereas em banho
isolado para investigar o efeito sobre o tocircnus basal demonstraram que o trans-
cariofileno possui atividade antiespasmoacutedica no muacutesculo liso traqueal do rato o qual
poderia ser explicado pelo menos em parte pelo bloqueio dos canais de Ca2 +
dependente da tensatildeo (PINHO et al 2012)
A doenccedila periodontal eacute altamente prevalente e afeta muitos catildees atingindo ateacute
85 de prevalecircncia em indiviacuteduos com idade superior a 4 anos Atualmente a
clorexidina eacute a droga de escolha para combater a formaccedilatildeo de placa dentaacuteria nestes
animais o agente etioloacutegico da doenccedila poreacutem possui relatos de vaacuterios efeitos
secundaacuterios Desta maneira em todo o mundo satildeo conduzidas pesquisas a fim de
identificar potenciais substitutos para a terapia antimicrobiana e prevenccedilatildeo da doenccedila
periodontal Os resultados da avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de β-Car contra
bacteacuterias da placa dentaacuteria do catildeo in vitro e in vivo mostraram que o β-Car tem
atividade antimicrobiana contra a proliferaccedilatildeo de bacteacuterias formadoras de placas
dentaacuterias de catildees representando uma alternativa adequada ao uso de clorexidina na
profilaxia e tratamento da doenccedila periodontal de catildees (PIERI et al 2016)
45
A doenccedila de Parkinson (DP) eacute uma doenccedila neurodegenerativa caracterizada por
neurodegeneraccedilatildeo dopamineacutergica progressiva na aacuterea da substacircncia negra compacta
(SNc) Os resultados do estudo realizado para avaliar o efeito neuroprotetor do β-Car
contra o estresse oxidativo induzido pela rotenona e a neuroinflamaccedilatildeo em um modelo
de DP em rato demonstraram que o β-Car proporciona neuroproteccedilatildeo contra a DP
induzida pela rotenona e os efeitos neuroprotetores podem ser atribuiacutedos agraves suas
potentes atividades antioxidantes e anti-inflamatoacuterias (OJHA et al 2016)
Cetoprofeno (Cet) eacute amplamente utilizado no tratamento de muitas doenccedilas
inflamatoacuterias mas pode induzir toxicidade hepaacutetica especialmente com overdose A
combinaccedilatildeo do β-Car e da silimarina (Sily) reduziu a hepatotoxicidade induzida por Cet
em ratos associaccedilatildeo considerado hepatoprotetora pela capacidade antioxidante contra
Cet-hepatotoxicidade induzida em ratos (KELANY ABDALLAH 2016) O estudo
para avaliar o efeito do β-Car na hipercolesterolemia utilizando um modelo de
hiperlipidemia induzida pelo Triton WR-1339 em ratos bem como seu possiacutevel efeito
sobre as enzimas antioxidantes hepaacuteticas mostrou que o β-Car produz efeito
hipolipideacutemico atraveacutes da inibiccedilatildeo da HMG-CoA redutase hepaacutetica tal qual o faacutermaco
padratildeo sinvastatina e esta inibiccedilatildeo sugere um possiacutevel mecanismo de accedilatildeo
hiperlipidecircmica Assim os resultados indicam que o β-Car pode ser usado no
tratamento de doenccedilas dislipidecircmicas porque exerce um efeito similar ao do
medicamento de referecircncia protegendo o fiacutegado contra lesotildees lipiacutedicas e melhorando o
sistema de defesa antioxidante hepaacutetico (BALDISSERA et al 2017) Agastache rugosa
(Labiatae) uma erva perene espalhada por todos os campos coreanos eacute amplamente
consumida como um vegetal comestiacutevel natural e usada na medicina popular O β-Car
presente na A rugosa mostrou ser hepatoprotetor contra a falecircncia hepaacutetica induzida por
D-galactosamina (GalN) e lipopolissacariacutedeo (LPS) em ratos (CHO et al 2015)
46
O β-Car eacute uma fitomoleacutecula bioativa conhecida por reduzir estresse oxidativo
em organismos vivos (BASHA SANKARANARAYANAN 2016) O estresse
oxidativo e inflamatoacuterio tem sido implicado no aparecimento e progressatildeo do diabetes
mellitus e suas complicaccedilotildees Na avaliaccedilatildeo do estresse oxidativo e inflamatoacuterio
mediado pela hiperglicemia em ratos diabeacuteticos induzidos por estreptozotocina (STZ) a
administraccedilatildeo do β-Car restaurou significativamente o estado antioxidante e diminuiu as
citocinas proacute-inflamatoacuterias em ratos diabeacuteticos A eficaacutecia do β-Car foi comparada com
a glibenclamida um faacutermaco antidiabeacutetico padratildeo (BASHA
SANKARANARAYANAN 2016) Por outro lado como a secreccedilatildeo de insulina eacute
estimulada pela glicose (GSIS) e eacute essencial para o controle do combustiacutevel da
homeostase metaboacutelica e como seu comprometimento eacute um elemento-chave na falha
das ceacutelulas β na diabetes tipo 2 e devido o β-Car ser um ativador do receptor CB2 e
como os efeitos do β-Car sobre o GSIS ainda satildeo desconhecidos os resultados
mostraram que o β-Car tem um novo papel na regulaccedilatildeo GSIS em ceacutelulas β pancreaacuteticas
(SUIJUN et al 2014) Estudo para avaliar os efeitos anti-hiperglicecircmicos do β-Car
administrado por via oral em ratos Wistar machos adultos diabeacuteticos induzidos por
estreptozotocina (STZ) de forma dose dependente e da glibenclamida um faacutermaco
padratildeo hipogliceacutemico oral durante 45 dias diminuiacuteram significativamente a glicose com
niacuteveis aumentados de insulina no plasma e melhoraram as atividades alteradas das
enzimas metaboacutelicas dos carboidratos ateacute quase normal O efeito insulinotroacutepico do β-
Car foi suportado por estudos imunohistoquiacutemicos β-Car a uma dose de 200 mgkg pc
exerceu efeitos antidiabeacuteticos significativos do que as outras duas doses (100 e 400
mgkg por via oral) assim conclui-se que a administraccedilatildeo de β-Car tem efeitos
beneacuteficos na homeostase da glicose em ratos diabeacuteticos (BASHA
SANKARANARAYANAN 2014)
47
A avaliaccedilatildeo da atividade antinociceptiva do β-Car em modelos de dor aguda
pelo teste da placa quente (nocicepccedilatildeo teacutermica) e pelo teste de formalina (dor
inflamatoacuteria) e crocircnica por lesatildeo de constriccedilatildeo crocircnica (CCI) da hipernocicepccedilatildeo
induzida pelo nervo ciaacutetico foi medida pelos testes de placa quente e von Frey em
camundongos e o envolvimento do β-Car nos sistemas opioacuteide e endocanabinoacuteide Para
elucidar o mecanismo de accedilatildeo os camundongos foram preacute-tratados com naloxona ou
AM630 30 min antes do tratamento com trans-cariofileno Posteriormente foi avaliada
a nocicepccedilatildeo teacutermica A administraccedilatildeo do β-Car minimizou significativamente a dor
nos modelos de dor aguda e crocircnica O efeito anti-nociceptivo observado durante o teste
da placa quente foi revertido pela naloxona e AM630 indicando a participaccedilatildeo tanto do
sistema opioacuteide como do sistema endocanabinoacuteide O tratamento com β-Car tambeacutem
diminuiu os niacuteveis de IL-1β Estes resultados demonstram que o β-Car reduziu a dor
aguda e croacutenica em camundongos que podem ser mediados atraveacutes dos sistemas
opioides e endocanabinoacuteide (PAULA-FREIRE et al 2013) As ceacutelulas de microglia
tecircm mediado agrave inflamaccedilatildeo induzida pela hipoacutexia atraveacutes da produccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias incluindo a interleucina-1 beta (IL-1β) o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e a IL-6
Dado que a ativaccedilatildeo do receptor CB2R proporciona resultados anti-oxidativos e
anti-inflamatoacuterios suspeita-se que o seu agonista seletivo o β-Car possa ter efeitos
protetores contra as respostas neuroinflamatoacuterias induzidas pela hipoacutexia Estas
observaccedilotildees indicam que o β-Car suprime a resposta neuroinflamatoacuteria induzida por
hipoacutexia atraveacutes da inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo de NF-kB em microacuteglia sendo portanto
beneacutefico na prevenccedilatildeo da neuroinflamaccedilatildeo induzida por hipoacutexia (GUO et al 2014)
O β-Car eacute um fitocanabinoacuteide (BENTO et al 2011) presente no oacuteleo essencial
da Cannabis sativa (PAULA-FREIRE et al 2013) No estudo que investigou a
contribuiccedilatildeo dos sistemas canabinoacuteides perifeacutericos (CB) e opioacuteides na antinocicepccedilatildeo
48
produzida pela injeccedilatildeo intraplantar (ipl) do β-Car os resultados demonstraram que a
antinocicepccedilatildeo produzida por ipl eacute mediada pela ativaccedilatildeo de receptores canabinoides
subtipo 2 (CB2) pelo β-Car por estimular a liberaccedilatildeo de endorfina endoacutegena dos
queratinoacutecitos locais As respostas sugerem que a injeccedilatildeo combinada de morfina e β-Car
pode ser uma alternativa no tratamento da dor quimogecircnica (KATSUYAMA et al
2013) Como os receptores endoacutegenos CB2 satildeo expressos em ceacutelulas imunes e medeiam
efeitos anti-inflamatoacuterios o β-Car pode ser um excelente agente terapecircutico para
prevenir a nefrotoxicidade induzida por cisplatina (droga antineoplaacutesica) atraveacutes de
uma via dependente do receptor CB2 Dado o excelente perfil de seguranccedila do β-Car em
seres humanos eacute de notar que ele possui um grande potencial terapecircutico numa
multiplicidade de doenccedilas associadas agrave inflamaccedilatildeo e estresse oxidativo (HORVAacuteTH et
al 2012)
Evidecircncias recentes sugerem que os receptores de canabinoacuteides CB2 estatildeo
implicados em distuacuterbios de ansiedade e depressatildeo embora poucos estudos sistemaacuteticos
em animais de laboratoacuterio tenham sido relatados (SANTOS et al 2017) recentemente
demonstrou-se que o β-Car se liga e ativa o receptor CB2 (BENTO et al 2011)
possuindo um potente efeito agonista seletivo do receptor CB2 e em experimentos
utilizando ratos adultos submetidos a modelos de efeitos ansioliacuteticos e antidepressivos
os resultados sugerem que os receptores CB2 podem fornecer alvos terapecircuticos
alternativos para o tratamento da ansiedade e da depressatildeo A possibilidade de que o β-
Car possa melhorar os sintomas destes transtornos de humor oferece perspectivas
emocionantes para estudos futuros (BAHI et al 2014) O β-Car possui atividade
neuroprotetora associada principalmente agrave ativaccedilatildeo seletiva dos receptores CB2
inibiccedilatildeo da ativaccedilatildeo microglial e diminuiccedilatildeo da inflamaccedilatildeo tais efeitos de β-Car e seu
papel beneacutefico em processos neurodegenerativos devem ser investigados mais a fundo
(SANTOS et al 2017) A ativaccedilatildeo do receptor CB2 eacute sugerida por desencadear a via
49
receptor-y ativada pelo proliferador de peroxissoma (PPARy) e os agonistas de ambos
os receptores melhoram a colite Recentemente demonstrou-se que o efeito anti-
inflamatoacuterio de β-Car envolve CB2 e a via PPARγ e sugerem o β-Car como uma
possiacutevel terapia para o tratamento de doenccedila inflamatoacuteria intestinal (BENTO et al
2011)
Vaacuterios estudos demonstraram que o CB2 estaacute implicado criticamente na
modulaccedilatildeo de respostas de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica No estudo sobre os efeitos
analgeacutesicos do β-Car em modelos animais de dor inflamatoacuteria e neuropaacutetica
demonstrou-se que o β-Car administrado por via oral reduziu as respostas de dor
inflamatoacuteria (fase tardia) no teste de formalina numa forma dependente do receptor
CB2 ao passo que natildeo teve qualquer efeito sobre as respostas agudas (fase inicial)
Num modelo de dor neuropaacutetica a administraccedilatildeo oral crocircnica de β-Car atenuou a
hiperalgesia teacutermica e alodinia mecacircnica e reduziu a neuroinflamaccedilatildeo espinhal Eacute
importante notar que natildeo foi encontrado sinais de toleracircncia aos efeitos anti-
hiperalgeacutesicos do β-Car apoacutes tratamento prolongado O β-Car oral foi mais eficaz do
que o agonista CB2 sinteacutetico JWH-133 injetado subcutaneamente Deste modo o
produto vegetal natural β-Car pode ser altamente eficaz no tratamento de estados de dor
prolongados e debilitantes Esses resultados tecircm importantes implicaccedilotildees para o papel
dos fatores dieteacuteticos no desenvolvimento e modulaccedilatildeo de condiccedilotildees de dor crocircnica
(KLAUKE et al 2014)
Em estudo sobre o efeito anti-hiperalgeacutesico do complexo contendo β-
cariofileno (βCP) e β-ciclodextrina (βCD) num modelo de dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria induzida por injeccedilatildeo salina pH4 em camundongos os resultados mostraram
que o tratamento oral com β-Car-βCD em todas as doses testadas produziu uma
reduccedilatildeo significativa na hiperalgesia mecacircnica e um aumento significativo nos limiares
de retirada muscular sem produzir qualquer alteraccedilatildeo na forccedila Aleacutem disso o β-Car-
50
βCD foi capaz de diminuir significativamente a expressatildeo da proteiacutena Fos no corno
dorsal superficial Deste modo o β-Car-βCD atenua a dor muscular crocircnica natildeo
inflamatoacuteria em camundongos e inibe a expressatildeo de Fos na medula espinhal lombar
(QUINTANS-JUacuteNIOR et al 2016)
27 Nanotecnologia
A nanotecnologia eacute a ciecircncia da manipulaccedilatildeo da mateacuteria para produccedilatildeo de
estruturas e dispositivos na escala nanomeacutetrica (10-9
) Eacute uma ciecircncia multidisciplinar
que tem se desenvolvido nos uacuteltimos anos encontrando aplicaccedilotildees em todas as aacutereas do
conhecimento (DIMER et al 2013) A nanotecnologia tem impactado particularmente
nas ciecircncias farmacecircuticas visando desenvolver medicamentos para os mais diversos
fins terapecircuticos (WONG et al2010 DIOP-FRIMPONG et al 2011)
O princiacutepio da nanotecnologia baseia-se em que os materiais na escala
nanomeacutetrica apresentam propriedades quiacutemicas fiacutesico-quiacutemicas e comportamentais
diferentes daquelas observadas no seu estado natural ou ainda fenocircmenos que antes
eram mascarados ou apresentavam menor influecircncia sobre a mateacuteria em escala micro ou
macro passam a predominar na escala nano O efeito eacute atribuiacutedo principalmente ao
tamanho reduzido produzindo-se um grande aumento da aacuterea de superficial (SAHOO
PARVEEN PANDA 2007 JAGDALE et al 2009 FIGUEIREDO 2009 DIMER et
al 2013)
Nas ciecircncias farmacecircuticas a nanotecnologia permitiu a criaccedilatildeo dos
ldquonanocarreadoresrdquo que satildeo diferentes formas que permitem a vetorizaccedilatildeo do faacutermaco e
a sua liberaccedilatildeo controlada conseguindo ainda melhorar a biodisponibilidade e a
potecircncia dos faacutermacos neles carregados (PIMENTEL et al 2007 SAHOO et al 2007)
As nanopartiacuteculas (nanocaacutepsulas nanoesfereas etc) satildeo capazes de proteger o faacutermaco
contra agentes no organismo como o pH estomacal promovendo o aumento da eficaacutecia
51
terapecircutica e diminuiccedilatildeo da dose terapecircutica Assim o nuacutemero de administraccedilotildees
necessaacuterias eacute menor levando a uma melhor aceitaccedilatildeo pelo paciente e a reduccedilatildeo da dose
e consequentemente menos efeitos toacutexicos eou adversos (PIMENTEL et al 2007
GOU et al 2011 CHAUDHARI 2012)
A maior parte dos estudos em nanotecnologia tem sido focada no
desenvolvimento de formulaccedilotildees para o tratamento do cacircncer de doenccedilas inflamatoacuterias
cardiovasculares neuroloacutegicas e ao combate do viacuterus da imunodeficiecircncia adquirida
(AIDS) Na atualidade existem mais de uma centena de estudos cliacutenicos com produtos
nanotecnoloacutegicos em andamento sendo que a doenccedila-alvo mais recorrente eacute o cacircncer de
mama (DIMER et al 2013)
As emulsotildees satildeo amplamente empregadas como veiacuteculos nas induacutestrias
cosmeacutetica e farmacecircutica por apresentarem vantagens como a veiculaccedilatildeo de faacutermacos
ou ativos hidrofiacutelicos e lipofiacutelicos na mesma formulaccedilatildeo Elas tambeacutem permitem o
controle de aspectos sensoriais adaptando-os agraves necessidades da via de administraccedilatildeo
(CAMARGO 2008) As emulsotildees possuem uma substancia (ex oacuteleo) dispersado em
pequenas gotiacuteculas dentro de um liacutequido imisciacutevel (ex aacutegua) com ajuda de um
tensoativo (FERNANDEZ et al 2004) As emulsotildees satildeo compostas basicamente de trecircs
fases uma fase aquosa ume fase oleosa e o tensoativo cujas propriedades fiacutesico-
quiacutemicas podem afetar o comportamento do sistema (SAJJADI et al 2003)
Existem dois tipos claacutessicos de emulsotildees simples do tipo oacuteleoaacutegua (OA) na
qual as gotiacuteculas do oacuteleo estatildeo dispersas na aacutegua e do tipo aacuteguaoacuteleo (AO) na qual as
gotiacuteculas da aacutegua estatildeo dispersas no oacuteleo (BERNARDI 2011) O tensoativo a utilizar
em cada caso depende do equiliacutebrio hidrofiacutelico-lipofiacutelico (EHL) (SOUZA et al 2009)
Trata-se de paracircmetros criados por GRIFFIM 1954 em uma escala de EHL variando
entre 0 e 20 sendo o valor de 10 o limite entre os sistemas lipoacutefilos e hidroacutefilos A
52
aplicaccedilatildeo de cada tensoativo estaacute relacionada com o valor do seu EHL sendo que os que
apresentam baixo EHL satildeo indicados para emulsotildees AO e aqueles com valores baixos
satildeo recomendados para emulsotildees de tipo OA (GRIFFIM 1954 MORRISIN ROSS
2002 BOUCEMAL et al 2004 CAMARGO 2008)
Por outra parte as nanoemulsotildees satildeo uma classe de sistema disperso multifaacutesico
(RUSSE et al 1989) As nanoemulsotildees satildeo obtidas aplicando-se altas intensidades de
agitaccedilatildeo para dispersar a fase dispersa em um dispersante frio ou quente com adiccedilatildeo de
tensoativo O posterior resfriamento permite obter a micela dispersada na fase interna
(MEYAGUSKU 2014) As nanoemulsotildees com o diacircmetro de gotiacuteculas entre 20 e 300
nm satildeo mais vantajosas em relaccedilatildeo agraves demais nanoemulsotildees por apresentarem maior
estabilidade frente agrave cremeaccedilatildeo e sedimentaccedilatildeo por utilizarem uma baixa concentraccedilatildeo
de tensoativos por serem transparentes e fluidas As nanoemulsotildees aumentam a
molhabilidade espalhabilidade e penetraccedilatildeo das substancias devido agrave sua baixa tensatildeo
interfacial (SOLANS 2005)
Satildeo sistemas considerados metaestaacuteveis ou seja estaacuteveis por longo periacuteodo de
tempo cuja estrutura depende do processo de preparo e de uma estabilizaccedilatildeo esteacuterica
quando se emprega tensoativos natildeo iocircnicos eou poliacutemeros na preparaccedilatildeo (TADROS et
al 2004) Podem apresentar aparecircncia transluacutecida quando o tamanho do gloacutebulo eacute
inferior a 200 nm ou leitosa quando o tamanho eacute de 200 a 500 nm (CAPEK 2004) As
nanoemulsotildees satildeo preparadas com uma variedade de lipiacutedeos e satildeo estabilizadas por
tensoativos biocompatiacuteveis geralmente natildeo-iocircnicos (MASON et al 2006)
A estabilidade das nanoemulsotildees estaacute relacionada ao emprego de tensoativos
natildeo-iocircnicos eou poliacutemeros que conferem estabilizaccedilatildeo esteacuterica e eleacutetrica entre as
gotiacuteculas O uso de tensoativos reduz a possibilidade de coalescecircncia favorecendo o
movimento browniano e evitando assim processos de cremagem e coalescecircncia
(TADROS et al 2004) Vaacuterios fatores podem influenciar a obtenccedilatildeo de partiacuteculas em
53
diferentes diacircmetros tais como concentraccedilatildeo de faacutermaco e poliacutemeros quantidade de
tensoativo concentraccedilatildeo de oacuteleo na fase orgacircnica e velocidade de difusatildeo da fase
orgacircnica na fase aquosa (FERREIRA 2011)
54
3 - OBJETIVOS
31 Objetivo Geral
Avaliar a composiccedilatildeo quiacutemica e a atividade toacutexico-farmacoloacutegica do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e realizar aplicaccedilotildees biotecnoloacutegicas
32 Objetivos Especiacuteficos
Avaliar as caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas e quiacutemicas do oacuteleo destilado de
copaiacuteba
Desenvolver uma nanoemulsatildeo contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba e avaliar
sua estabilidade fiacutesico-quiacutemica preliminar
Avaliar a atividade anti-nociceptiva in vivo do oacuteleo destilado de copaiacuteba
Avaliar a atividade anti-inflamatoacuteria in vitro e in vivo do oacuteleo destilado de
copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
Avaliar a citotoxicidade relativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba e da nanoemulsatildeo
em fibroblastos natildeo neoplaacutesicos de pulmatildeo humano e a toxicidade aguda oral
em camundongos
55
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 Delineamento experimental
Este trabalho foi executado conforme o delineamento experimental planejado
como mostra a figura 2
Figura 2 - Delineamento experimental do presente estudo
56
42 Material vegetal
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) utilizado neste trabalho foi coletado
em 15 de abril de 2018 na comunidade indiacutegena Dessano Oka Diakuru na
Comunidade do Tupeacute de Rio Negro (3deg03acute103acuteacute S 60deg18`234acuteacute W) com a permissatildeo
do Cacique da comunidade Jose Maria Fontes Vaz O acesso foi cadastrado na
plataforma SISGEN do Ministeacuterio do Meio Ambiente (Anexo 1) O oacuteleo-resina foi
submetido agrave destilaccedilatildeo por arrastre a vapor para obter o oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) a se utilizar neste trabalho O ODC foi mantido em frascos de plaacutestico a
temperatura ambiente ateacute sua utilizaccedilatildeo
43 Obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) por arraste a vapor
Para a obtenccedilatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi utilizado um equipamento de
destilaccedilatildeo similar ao do Centro de Investigacioacuten y Asistencia em Tecnologiacutea y Disentildeo
del Estado de Jalisco - CIATEJ (BANDONI 2003) conforme figura 3 O oacuteleo-resina foi
colocado no alambique (100 kg) e passou-se atraveacutes deste o vapor gerado agrave temperatura
de 180ordmC externamente por uma caldeira (figura 4) Os vapores arrastam a fraccedilatildeo volaacutetil
(ODC) que sofre condensaccedilatildeo por resfriamento usando aacutegua a temperatura ambiente O
processo de destilaccedilatildeo foi realizado durante 4 horas Logo apoacutes o ODC eacute separado da
aacutegua (hidrolato) pela diferenccedila de densidade rendendo por volta de 75 kg de produto
final O hidrolato de copaiacuteba foi descartado
57
Figura 3 - Equipamento piloto de extraccedilatildeo de oacuteleos essenciais tipo CIATEJ
FONTE BANDONI 2003
Figura 4 - Oacuteleo-resina de copaiacuteba (OBC)
44 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
441 Aspecto
Observou-se visualmente comparando a amostra em estudo com as
caracteriacutesticas ldquomacroscoacutepicasrdquo de uma amostra de referecircncia (padratildeo) obtida no
mercado avaliando-se se ocorreram alteraccedilotildees do tipo separaccedilatildeo de fases precipitaccedilatildeo
turvaccedilatildeo etc (BRASIL 2007)
442 Cor
A anaacutelise da cor foi realizada visualmente (colorimetria visual) comparando-se
visualmente a cor da amostra com a cor do padratildeo armazenado em frasco da mesma
58
especificaccedilatildeo A anaacutelise foi efetuada sob condiccedilotildees de luz ldquobrancardquo artificial (BRASIL
2007)
443 Odor
A amostra e o padratildeo de referecircncia foram acondicionados no mesmo material
de embalagem e o odor foi comparado diretamente atraveacutes do oacutergatildeo olfatoacuterio
444 Determinaccedilatildeo de densidade relativa em picnocircmetro de vidro
Foi realizada pelo meacutetodo picnomeacutetrico (BRASIL 2007) Pesou-se o
picnocircmetro vazio e perfeitamente limpo (M0) A seguir encheu-se completamente com
aacutegua bidestilada evitando-se a introduccedilatildeo de bolhas secou-se cuidadosamente e foi
pesado (M1) O picnocircmetro limpo e seco novamente foi cheio com a amostra e pesado
(M2) O meacutetodo fui realizado a 25plusmn1degC A densidade relativa foi calculada usando a
expressatildeo
D25
= (M2 ndash M0) M1 ndash M0
Onde D25
= densidade relativa a 25 degC
M0 = massa do picnocircmetro vazio em gramas
M1 = massa do picnocircmetro com aacutegua purificada em gramas
M2 = massa do picnocircmetro com a amostra em gramas
445 Determinaccedilatildeo de Viscosidade por viscosiacutemetro rotativo
Consistiu na mediccedilatildeo do torque requerido para rodar um fuso imerso em um
dado fluido Viscosiacutemetro rotativo de acordo com a faixa de viscosidade da amostra
selecionou-se o fuso (spindle) adequado A seguir mergulhou-se o fuso diagonalmente
na amostra com temperatura estabilizada conforme especificado isenta de bolhas ateacute a
marca (sulco) da haste do fuso e nivelou-se o aparelho Verificada a ausecircncia de bolhas
59
junto ao fuso procedeu-se agrave leitura da viscosidade de acordo com o procedimento
operacional do aparelho (BRASIL 2007)
446 Determinaccedilatildeo de pH
O pH foi avaliado diretamente usando um pHmetro (Tecnopon Brasil)
previamente calibrado com soluccedilotildees tampatildeo de pH 4 7 e 10 (Alphatec Brasil) O
produto por ser um oacuteleo a determinaccedilatildeo do pH foi realizada diretamente sobre o liacutequido
imergindo-se o eletrodo diretamente nele (BRASIL 2007)
45 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC)
As anaacutelises foram realizadas por CGEM usando um equipamento
GC2010QP2010 Plus (Shimadzu Japatildeo) Foi usada uma coluna capilar Rtx-5MS
(30mm x 025mm x 025μm) (Restek) O gaacutes heacutelio foi utilizado como gaacutes de arraste
com um fluxo de 1mLmin O volume de injeccedilatildeo foi de 1μL realizada em
modo splitless A programaccedilatildeo da temperatura da coluna foi de 50 a 290degC com
aumento gradativo de 3degCmin As temperaturas do injetor da fonte de iacuteons e linha de
transferecircncia foram de 220 260 e 280 degC respectivamente
46 Desenvolvimento da nanoemulsatildeo e determinaccedilatildeo do EHL requerido do
oacuteleo destilado de copaiacuteba
A nanoemulsatildeo do ODC foi obtida pelo meacutetodo descrito por Ostertag et al
(2012) A fase orgacircnica foi composta por 5 do sistema surfactante (Tween 80reg-Span
80reg) e 5 do ODC foi agitada a 400 rpm por 10 min em agitador magneacutetico (Ika
Suiacuteccedila) agrave temperatura ambiente A fase aquosa composta por aacutegua Mili-Q
60
(Condutividade lt5 microΩ) em quantidades suficientes para completar o 100 (50mL)
mantida agrave temperatura ambiente foi vertida sobre a fase orgacircnica a uma velocidade
aproximada de 1 mlmin mantendo a agitaccedilatildeo em 300 rpm Depois da adiccedilatildeo a mistura
foi homogeneizada durante 10 minutos em homogeneizador UltraTurrax (IKA Suiacuteccedila) a
uma velocidade de 5000 rpm A nanoemulsatildeo foi conservada em frasco acircmbar entre 20
e 25degC ateacute sua caracterizaccedilatildeo
Para a determinaccedilatildeo do valor do Equiliacutebrio Hidroacutefilo-Lipoacutefilo requerido (EHLr)
pelo ODC para formar uma emulsatildeo do tipo OA foram preparadas uma seacuterie de
nanoemulsotildees usando como tensoativos o Tween 80reg (EHL 15) e Span 80reg (EHL
43) seguindo as composiccedilotildees expressas na tabela 2 Apoacutes a caracterizaccedilatildeo o valor de
EHL daquela composiccedilatildeo de surfactantes que produziu uma nanoemulsatildeo estaacutevel com
menor tamanho de partiacutecula foi selecionado como o EHLr do ODC (GRIFFIM 1954)
Tabela 2 Composiccedilatildeo das nanoemulsotildees utilizadas para a determinaccedilatildeo do EHLr do ODC
Nordm Aacutegua Oacuteleo Tween 80reg Span 80reg EHL
1 90 5 033 467 5
2 90 5 079 421 6
3 90 5 126 374 7
4 90 5 175 325 8
5 90 5 220 280 9
6 90 5 266 234 10
7 90 5 313 187 11
8 90 5 360 140 12
9 90 5 407 093 13
10 90 5 453 047 14
11 90 5 500 000 15
461 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Com a finalidade de selecionar o sistema de surfactante que rendesse a
nanoemulsatildeo com maior estabilidade e menor tamanho de partiacuteculas foram avaliados
trecircs sistemas de surfactantes natildeo iocircnicos nas proporccedilotildees necessaacuterias para atingir o
61
EHLr do ODC (determinado anteriormente) Os sistemas avaliados foram Tween
20regSpan 20reg (EHL 167 e 86 respectivamente) Tween 60regSpan 60reg (EHL 149 e
47 respectivamente) e Tween 80regSpan 80reg (EHL 15 e 43 respectivamente) Todos
na proporccedilatildeo 11 (Surfactante ODC) Foi selecionado como sistema surfactante ideal
aquele que rendesse a nanoemulsatildeo estaacutevel com menor tamanho de partiacuteculas e maior
potencial zeta
462 Avaliaccedilatildeo do efeito da relaccedilatildeo Surfactante Oacuteleo Aacutegua (SOW)
Foi avaliado o efeito de variaccedilotildees nas quantidades relativas do sistema
surfactante (entre 7 e 15 ) e do ODC (7 a 15) e aacutegua em quantidades suficientes
para completar o 100 do volume total (50 ml) sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
preparada nas mesmas condiccedilotildees experimentais Foi selecionada para o estudo faacutermaco-
toxicoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que apresentou uma boa estabilidade contendo a
maior quantidade do ODC emulsionado e que aleacutem disto apresentasse o menor
tamanho de partiacutecula
463 Determinaccedilatildeo de tamanho de partiacutecula
O tamanho de partiacuteculas e o iacutendice de polidispersatildeo foram medidos pela teacutecnica
de Dispersatildeo Dinacircmica da Luz (DLS) usando um aparelho Zetasizer ZS (Malvern
UK) A nanoemulsatildeo foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As
mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio
padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017)
62
464 Determinaccedilatildeo de potencial zeta
A mediccedilatildeo de potencial zeta foi feita de forma indireta usando medidas de
mobilidade eletroforeacutetica num aparelho Zetasizer ZS (Malvern UK) A nanoemulsatildeo
foi diluiacuteda apropriadamente com aacutegua Mili-Q (125 vv) As mediccedilotildees foram feitas em
triplicata e os valores reportados como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al
2017)
465 Estudo de estabilidade preliminar
As nanoemulsotildees selecionadas como promissoras foram mantidas em frasco
acircmbar a temperatura entre 22-25degC durante 180 dias O tamanho de partiacutecula iacutendice
de polidispersatildeo e potencial zeta foram medidos nos dias 1 15 45 90 e 180 usando as
teacutecnicas descritas acima As mediccedilotildees foram feitas em triplicata e os valores reportados
como a meacutedia e o desvio padratildeo (RODRIGUEZ et al 2017) Foi selecionada para o
estudo farmacoloacutegico aquela nanoemulsatildeo que se manteve estaacutevel no tempo que
apresentou menor tamanho de partiacutecula e menor variabilidade no iacutendice de
polidispersatildeo
47 Cultivo celular
Neste estudo foi utilizado ceacutelulas de fibroblasto de pulmatildeo humano (MRC5) e
macroacutefagos murinos (J774) As linhagens celulares utilizadas foram mantidas em
garrafas de polipropileno contendo meio Dulbecorsquos Modified Eagle Medium (DMEM)
para MRC5 e meio RPMI-1640 para J774 suplementado com 10 de soro fetal bovino
(SBF Gibco by Life Technologies) e 50 microgmL de penicilinaestreptomicina (Gibco by
Life Technologies) em estufa umidificada a 37ordm C e 5 de CO2 O crescimento celular
foi acompanhado diariamente com auxiacutelio de microscoacutepio oacuteptico invertido e a troca do
meio de cultivo ocorreu sempre que o limite de confluecircncia das ceacutelulas fosse alcanccedilado
63
ou houvesse necessidade de repor nutrientes Para a manutenccedilatildeo das linhagens foi
utilizada uma soluccedilatildeo de tripsina EDTA a 025 (Gibco by Life Technologies) para o
desprendimento celular das garrafas de cultura
48 Ensaios em cultura de ceacutelulas
481 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular
A citotoxicidade da nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado da Copaiacutefera sp foi avaliada
em fibroblasto natildeo neoplaacutesico de pulmatildeo humano (MRC-5 ATCC-USA) segundo a
teacutecnica descrita por Lafourcade et al (2018) e em macroacutefagos murino da linhagem
J774 (ATCC USA) segundo a teacutecnica descrita por Nakayama et al (1997) No ensaio
com fibroblastos MCR-5 foi utilizado como controle negativo Doxorrubicina 5 μgmL
e como controle do crescimento celular o proacuteprio meio de cultura sem adiccedilotildees da
amostra Foram avaliadas concentraccedilotildees de 165 330 660 125 25 50 e 100 μgmL
durante um tempo de 24 h Jaacute no ensaio com macroacutefago murino J744 foi utilizado
como controle negativo a Staurosporin 25 microM e como controle de crescimento o meacutedio
de cultura Foram testadas as concentraccedilotildees 1 10 e 100 microgmL da nanoemulsatildeo Os
ensaios foram realizados em triplicata e expressos como percentagem de viabilidade
celular
482 Quantificaccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) foi mensurada pela dosagem de seus
produtos de degradaccedilatildeo nitrito utilizando o reagente de Griess Neste meacutetodo o nitrito
primeiramente reage com a sulfanilamida (Sigma-Aldrich Alemanha) em meio aacutecido
para formar um composto intermediaacuterio o sal de diazocircnio Em seguida este sal reage
64
com Naftil-1-etilenodiamina (Merck Alemanha) formando um composto azo estaacutevel de
coloraccedilatildeo puacuterpura para assim ser quantificado espectrofotometricamente a 550 nm
(GREEN et al 1982)
Para a determinaccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico 50 μL do sobrenadante
celular foi submetido agrave reaccedilatildeo com igual volume dos reagentes de Griess (sulfanilamida
+ naftil) Para o preparo destes reagentes foram utilizadas soluccedilotildees estoque de naftil-1-
etilenodiamina 01 dissolvido em aacutegua destilada H2O e de sulfanilamida a 1
dissolvida em aacutecido fosfoacuterico H3PO4 (CFQ - Quiacutemica) a 5 Anteriormente ao uso as
soluccedilotildees foram adicionadas na proporccedilatildeo 11 formando o reagente de Griess
Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo por 15 minutos as amostras foram lidas em leitor de
microplaca (DTX 800 Beckman Colter) a 560 nm O caacutelculo das concentraccedilotildees de
nitrito foi realizado com base em curva padratildeo utilizando diferentes concentraccedilotildees de
nitrato de soacutedio (NaNO3) 15μM ateacute 1000 μM
49 Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem Swiss albinos (20 a 30 g) machos
de 4 semanas de idade obtidos do Bioteacuterio Central da Universidade Federal do
Amazonas (UFAM) apoacutes liberaccedilatildeo do pela Comissatildeo de Experimentaccedilatildeo e Uso de
Animais (CEUA) da UFAM (Protocolo nordm 0392018 anexo 2) Os animais foram
aclimatados durante 7 dias em local climatizado com temperatura de 22degC e ciclo
claroescuro de 1212 horas O alimento consistiu em raccedilatildeo e aacutegua jaacute padronizadas pela
instituiccedilatildeo e foi retirado para manter os animais em jejum 12 horas antes da aplicaccedilatildeo
do teste
65
491 Teste de toxicidade aguda oral
O experimento foi feito seguindo a norma OECD 423 (2001) Foram usados dois
grupos experimentais de trecircs animais cada Um grupo controle (Grupo I) que recebeu
aacutegua destilada ao longo do experimento e um grupo experimental que recebeu uma dose
uacutenica de 2000 mgkg da nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de Copaifera sp
(Grupo II) Foram realizadas observaccedilotildees clinicas para detectar possiacuteveis sinais de
toxicidade causadas pela nanoemulsatildeo Observou-se a postura o aspecto das fezes
fechamento das paacutelpebras piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelagem salivaccedilatildeo aparecircncia
das mucosas e o comportamento motor As observaccedilotildees foram feitas as primeiras 4
horas e apoacutes esse tempo cada 12 horas ateacute completar 14 dias apoacutes esse periacuteodo os
animais foram eutanasiados (apoacutes anestesia com Xilasina 10mgkg ip e Cetamina
150mgkg ip) e foram realizadas observaccedilotildees dos oacutergatildeos internos fiacutegado coraccedilatildeo rins
pulmotildees e pacircncreas para detectar possiacuteveis sinais de toxicidade produzidas pela
nanoemulsatildeo (OECD 423 2001)
492 Atividade anti-nociceptiva do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4921 Teste de contorccedilotildees abdominais induzidas por aacutecido aceacutetico
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Koster e seus
colaboradores (1959) com modificaccedilotildees Os animais (camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H2O (01 mL10 gvo) indometacina (10
mgkgsc) e com OBC e ODC Apoacutes os tratamentos 1 hora os mesmos receberam
aacutecido aceacutetico glacial PA (06 ip) diluiacutedo em aacutegua de injeccedilatildeo Depois da
administraccedilatildeo do aacutecido aceacutetico os animais foram colocados sob funis de vidro
66
individuais transparentes durante 30 minutos sendo o nuacutemero de contorccedilotildees
abdominais quantificadas cumulativamente e caracterizadas pela contraccedilatildeo e rotaccedilatildeo do
abdocircmen seguida pela extensatildeo de uma ou ambas as patas traseiras
4922 Teste da formalina a 25
O ensaio foi realizado conforme metodologia descrita por Tjolsen e seus
colaboradores (1992) com alteraccedilotildees Os grupos de camundongos Swiss foram preacute-
tratados de acordo com os grupos controle H20 (01 mL10 gvo) morfina (5 mgkg
sc) indometacina (10 mgkg sc) e com OBC e ODC Apoacutes 1 hora os animais foram
submetidos a uma injeccedilatildeo de 20 microl de formalina (25) na pata direita (espaccedilo
suplantar) sendo logo apoacutes a aplicaccedilatildeo da formalina colocados individualmente sob
funil de vidro invertido ao lado de um espelho com a finalidade de facilitar a
observaccedilatildeo
O tempo foi registrado (segundos) em que o animal lambeu permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada (ldquolicking-timerdquo) durante a primeira fase
atribuiacuteda de caraacuteter neurogecircnica (0-5 min) e segunda fase caracterizada de inflamatoacuteria
(15-30 min)
493 Atividade anti-edematogecircnica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
4931 Teste do edema de pata induzido pela injeccedilatildeo intraplantar de carragenina
O ensaio foi realizado conforme metodologia proposta por Winter Risley e Nuss
(1962) com algumas modificaccedilotildees Foram utilizados grupos de camundongos Swiss que
67
tiveram o volume inicial (Vi) da pata posterior direito-esquerda medido por
pletismometria Logo em seguida 6 grupos de animais foram preacute-tratados de acordo
com controle H20 (01 mL10 gvo) indometacina (10 mgkgsc) controle para
carragenina prometazina (6 mgkg vo) controle para dextrana e OCP (100 mgkgvo)
e ODC (100mgkgvo) Apoacutes 1 hora os animais receberam carrageninadextrana 1
(pv) (20 μlpata) na pata posterior direita e controle basal salina 09 (20 μlpata) na
pata esquerda O volume da pata traseira direita e esquerda de cada animal foi registrado
apoacutes 1 2 3 4 h da injeccedilatildeo do agente flogiacutestico (carrageninadextrana) e controle basal
A expressatildeo dos resultados foi obtida pela diferenccedila entre o volume final e o
basal da pata de cada tempo que foram calculados na foacutermula VPe = Vf ndash Vb sendo
Vep de = volume do edema da pata direito-esquerda (em μL) Vf = volume final de
pata direita e esquerdatempo e Vb = volume basal de pata direita e esquerdatempo
Posteriormente foi calculado o Δ (delta) da seguinte foacutermula
Δ= Vep d - Ve pe
494 Teste da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
O objetivo deste estudo foi avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica
do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao estresse ao uso etanol Para avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica
induzida por etanol absoluto foi utilizada a metodologia conforme descrita por
Morimoto e seus colaboradores (1991) com modificaccedilotildees Apoacutes jejum de 18 h os ratos
(n = 6grupo) foram preacute-tratados por via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou
400 mgkg) ou OBC (100 ou 400 mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1
hora foi administrado 4 mLkg de etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via
oral Decorrida 1 hora dessa administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de
68
CO2 os estocircmagos retirados e abertos pela grande curvatura Em seguida foram
fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes de planimetria computadorizada com auxiacutelio
do Programa ImageJreg
Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo ulcerativa
(ALU) (mm2)
495 Teste de peritonite induzido por LPS
Camundongos foram preacute-tratados com injeccedilatildeo intrapleural de NE15 ou
dexametasona ambos na dose 51 microMkg Em seguida os animais foram desafiados com
LPS (E coliO111B4) 250 ngcavidade ou soluccedilatildeo salina NaCl 09 Posteriormente
as ceacutelulas foram recuperadas da cavidade pleural lavando-se esta cavidade 2 vezes com
1 mL de PBS contendo EDTA 1 mM
4951 Contagem total e diferencial de ceacutelulas
Ceacutelulas da cavidade pleural foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a
4degC em centriacutefuga (ThermoScientific) e o sedimento celular ressuspenso em 200 microL de
BSA 3 (pv) diluiacutedo em PBS 1x Uma aliacutequota das ceacutelulas foi diluiacuteda 10x na soluccedilatildeo
de lise de hemaacutecias (Soluccedilatildeo de Turk - Imbralab) e em seguida com cacircmara de
Newbauer foi realizada a contagem total de ceacutelulas A partir dessa contagem as ceacutelulas
foram citocentrifugadas a 450 rpm por 5 minutos utilizando preparaccedilotildees em lacircminas de
citospin (Shandon III) com as ceacutelulas ressuspensas em 100 microL de BSA de forma que a
lacircmina contivesse aproximadamente 100 mil ceacutelulas Apoacutes a secagem das lacircminas estas
lacircminas foram coradas com o meacutetodo de May-Grunwald-Giemsa utilizando o kit
Panoacutetico Raacutepido (LB Laborclin) para a realizaccedilatildeo da contagem diferencial de ceacutelulas
69
no microscoacutepio oacuteptico no aumento de 100 vezes As ceacutelulas foram diferenciadas em
mononucleares (macroacutefagos e linfoacutecitos) neutroacutefilos e eosinoacutefilos atraveacutes de trecircs
contagens em campos aleatoacuterios totalizando cem ceacutelulas a cada contagem
496 Teste do edema de orelha induzido pela aplicaccedilatildeo uacutenica de fenol a 10
Foram utilizados 6 grupos de camundongos Swiss (n = 6 3 machos e 3 fecircmeas)
com pesos entre 25-35g que tiveram suas orelhas direitas preacute-tratadas topicamente
com 20 μL de fenol a 10 (vv) (grupo1) em seguida e imediatamente apoacutes a aplicaccedilatildeo
do fenol a orelha direita de cada camundongo recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de 20 μL dos
agentes OBC (grupo 2) ODC (grupo 3) nanoemulsatildeo base (controle negativo) (grupo
4) Nanoemulsao de ODC a 15 (grupo5) e 0005mgsitio de dexametasona (controle
positivo) (grupo 6) Apoacutes 1 hora da aplicaccedilatildeo do fenol os animais foram eutanasiados
com dose letal da mistura de xilazina 10mgkg ip e cetamina 150mgkg ip discos de 6
mm de diacircmetro foram obtidos da orelha direita e esquerda com auxiacutelio de punch
(perfurador de couro metaacutelico) e apoacutes pesado em balanccedila analiacutetica para anaacutelise do
edema (g) (GABOR 2000 Melo et al 2006) A quantificaccedilatildeo do edema foi feita pela
diferenccedila dos pesos (g) entre a orelha direita e esquerda Neste modelo o edema na
orelha dos animais alcanccedila uma intensidade maacutexima 1 hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol
assim o aumento da espessura da orelha foi avaliado 1 hora apoacutes o desafio com este
agente irritante (GABOR 2000)
497 Teste da artrite induzida pelo zymosan na pata de camundongo
Foi realizado pelo teste de edema de pata que foi induzido na pata direita traseira
dos camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500 μgpata)
70
em soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees OBC ODC nanoemulsatildeo
base (NE) nanoemulsatildeo de ODC a 15 (NE 15) 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
Diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes
da administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
410 Anaacutelise Estatiacutestica
Os resultados foram expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia As diferenccedilas
entre os grupos foram determinadas por anaacutelise de variacircncia (ANOVA) seguido pelo
teste de Tukey A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando o software GraphPad
Prismreg
versatildeo 60 San Diego CA EUA O niacutevel de significacircncia miacutenimo foi de p˂005
71
5 RESULTADOS
51 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O oacuteleo destilado de copaiacuteba apresentou-se como um oacuteleo de aspecto liacutequido
fino odor caracteriacutestico e de coloraccedilatildeo amarelo claro mas com variaccedilotildees (Figura 5) A
densidade das amostras foi medida em um picnocircmetro previamente calibrado com
capacidade maacutexima de 1 mL agrave temperatura ambiente (25plusmn1degC) Para a determinaccedilatildeo da
viscosidade foi utilizado um viscosiacutemetro acoplado a um banho termostaacutetico a 50degC O
pH foi determinado usando um pH-metro (Tecnopon Brasil) os resultados encontrados
satildeo mostrados na Tabela 3 mostram que o oacuteleo se apresenta como um liacutequido amarelo
claro odor carateriacutestico densidade 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre
60 ndash 70
Figura 5 - Oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
Tabela 3 - Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
PROPRIEDADE RESULTADOS
ASPECTO Liacutequido liacutempido transparente e oleoso
COR Amarelo claro
ODOR Caracteriacutestico do proacuteprio oacuteleo
DENSIDADE gmL 08942
VISCOSIDADE cPS 107
pH Entre 60 ndash 70
72
52 Caracterizaccedilatildeo quiacutemica e quantificaccedilatildeo de β-cariofileno no oacuteleo destilado de
copaiacuteba (ODC) - Anaacutelises por CG-EM
O oacuteleo extraiacutedo foi colocado em frasco e analisado por cromatografia gasosa
acoplada agrave espectrometria de massa (CG-EM) Um equipamento modelo QP2010 Plus
(Shimadzu) foi utilizado para realizar a identificaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo Para as
separaccedilotildees utilizou-se uma coluna capilar Rtx-5 MS (30 m x 025 mm x 025) com
Heacutelio servindo como gaacutes carreador a um fluxo de 102 mL min As soluccedilotildees injetaacuteveis
para a anaacutelise qualitativa foram preparadas dissolvendo-se cerca de 10 mg de oacuteleo em 1
mL de diclorometano e 1 μL da soluccedilatildeo foi injetado com uma razatildeo de separaccedilatildeo de
150 O programa de temperatura da coluna foi de 60 a 280 deg C com aumento gradual de
3 deg C min As temperaturas do injetor e da fonte de iacuteons foram 220 deg C e 260 deg C
respectivamente Para obter os iacutendices de retenccedilatildeo uma seacuterie homoacuteloga de
hidrocarbonetos lineares (C7-C30) foi analisada nas mesmas condiccedilotildees e os caacutelculos
foram feitos de acordo com a equaccedilatildeo de Van den Dool e Kratz (VANN DOOL
KRATZ 1963) As identificaccedilotildees foram baseadas na comparaccedilatildeo dos espectros
adquiridos com aqueles armazenados na biblioteca da Wiley 8th edition e na
comparaccedilatildeo dos iacutendices de retenccedilatildeo com os dados da literatura (ADAMS 2007)
A quantidade relativa em percentual () da fraccedilatildeo destilada dos constituintes
do oacuteleo de copaiacuteba foi acessada por cromatografia gasosa com detecccedilatildeo por ionizaccedilatildeo
de chama (GC-FID) utilizando um equipamento QP2010 (Shimadzu) Para quantificar o
β-cariofileno construiu-se uma curva de calibraccedilatildeo com oito pontos nas concentraccedilotildees
de 5 10 25 50 100 250 500 e 1000 μg mL Construiu-se a curva de linearidade
plotando a aacuterea do pico versus concentraccedilatildeo do padratildeo de β-cariofileno O graacutefico da
figura 6 representa a linha de regresatildeo ajustada pelo meacutetodo dos miacutenimos quadrados
73
(Aacuterea do pico = 10218 x Concentraccedilatildeo - 17719) com o coeficiente de determinaccedilatildeo
(R2 = 0997) utilizada para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno
Figura 6 - Curva de calibraccedilatildeo para a quantificaccedilatildeo do β-cariofileno do ODC
Uma vez que as composiccedilotildees dos oacuteleos de copaiacuteba possuem somente
sesquiterpenos e diterpenos a anaacutelise quantitativa do oacuteleo destilado de copaiacuteba foi
investigada usando padratildeo comercial de β-cariofileno (Figura 7) O β-cariofileno foi
selecionado por ser o composto majoritaacuterio nas diferentes amostras descritas de oacuteleo
destilado de copaiacuteba e provavelmente o responsaacutevel pela atividade farmacoloacutegica deste
oacuteleo
74
Figura 7 - Cromatograma comprovando a presenccedila do β-cariofileno no oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) quando comparado ao cromatograma do padratildeo de β-cariofileno
A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba identificou 14
componentes representando 10000 das substacircncias presentes conforme figura 8 As
principais substacircncias identificadas foram os sesquiterpenos β-cariofileno (407) oacutexido
cariofileno (136) α-copaeno (108) e o (E)-α-bergamoteno (802)
1 2
3
4
5
6
7
891011
12
13
14
Figura 8 - Picos dos principais compostos no oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) da Copaiacutefera spp β-
cariofileno (5) oacutexido cariofileno (3) α-copaeno (14) α e (E)-α-bergamoteno (6)
75
Tabela 4 - Composiccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) do oacuteleo-resina
da Copaifera spp
Pico Compostos Tempo de Retenccedilatildeo
Iacutendice de Retenccedilatildeo
Quantidade Relativa ()
1 δ-Elemeno 203 1338 061 2 α-Cubebeno 208 1351 167 3 α-Copaeno 219 1376 108 4 β-Elemeno 226 1390 126
5 β-Cariofileno 237 1408 407
6 (E)-α-Bergamoteno 244 1412 802 7 α-Humuleno 251 1438 529 8 α-Amorpheno 261 1484 251 9 Germacreno D 262 1481 152
10 Ledeno 268 1496 071 11 δ-Cadineno 270 1513 060 12 β-Bisaboleno 273 1528 287 13 α-Cadineno 279 1538 131 14 Cariofileno Oacutexido 302 1583 136
Aacuterea total quantificada
915
54 Nanoemulsotildees do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
A fase orgacircnica foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico
de baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 5-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo-iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 50-15 e aacutegua Mili-Q em quantidades suficientes para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q figura 09 A nanoemulsatildeo foi conservada entre 20-25 degC em
frasco acircmbar
76
Figura 9 ndash (A) Nanoemulsatildeo branco e (B) nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC)
541 Determinaccedilatildeo do EHL requerido para o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode ser determinado por
preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de EHL e determinar
qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER 2001 LACHMAN et
al 2001) Esta etapa foi realizada usando os tensoativos Tween80reg Span80reg em
diferentes concentraccedilotildees para obter valores de EHL conhecidos e conseguir determinar
o EHL requerido pelo ODC Nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 10 20 e
30 presentaram separaccedilatildeo de fases apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo enquanto as
nanoemulsotildees obtidas com valores de EHL de 40 e 50 apresentaram leve cremagem
As emulsotildees que se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 horas foram as que possuiacuteam
EHL entre 60 e 150 Nesse caso foi estabelecido atraveacutes de experimentos realizados
que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor 110 conforme pode ser observado na
figura 10
77
Figura 10 - Valores dos EHL da nanoemulsatildeo relacionados ao tamanho de partiacuteculas
542 Seleccedilatildeo do sistema surfactante
Segundo os resultados observados na tabela 5 o par de tensoativos
Tween80reg Span80reg proporcionou uma maior estabilidade frente aos testes
preliminares de estabilidade o que sugere que a mistura de tensoativos no valor de EHL
requerido pelo ODC favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis no valor de EHL de
110 A anaacutelise macroscoacutepica mostrou ausecircncia de instabilidade fiacutesica no sistema
bem como a presenccedila de caracteriacutesticas tiacutepicas de nanoemulsotildees como
transluscecircncia e reflexo azulado
Tabela 5- Efeito dos sistemas surfactantes sobre as principais propriedades da
nanoemulsatildeo contendo oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) Surfactante tipo Partiacutecula
Tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
Condutividade
(mΩcm)
Tween20regSpan20reg 10810 plusmn 196 0329 plusmn 0009 -3500 plusmn 147 0018 plusmn 0004
Tween60regSpan60reg 20850 plusmn 301 0253 plusmn 0005 -3370 plusmn 042 0014 plusmn 0006
Tween80regSpan80reg 9947 plusmn 064 0224 + 0010 -3710 plusmn 026 009 plusmn 0000
543 Relaccedilatildeo SurfactanteOacuteleoAacutegua (SOW)
De acordo com os resultados apresentados no item 542 o par de tensoativos
selecionado para a realizaccedilatildeo do diagrama ternaacuterio a fim de encontrar a melhor
78
composiccedilatildeo das emulsotildees a serem estudadas foi composto de Tween80reg Span80reg
no valor de EHL = 110 O resultado do estudo do diagrama de fases encontra-se
descrito na figura 11
Figura 10 - Diagrama de fases do processo de avaliaccedilatildeo do efeito das proporccedilotildees de tensoativo-oacuteleondash
aacutegua nas propriedades da nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba
O estudo do efeito da variaccedilatildeo da relaccedilatildeo SOW sobre as propriedades da
nanoemulsatildeo contendo o ODC (Tabela 6) mostrou que a formulaccedilatildeo contendo 13 do
sistema surfactante foi a mais estaacutevel quando comparada agraves demais apresentando
tamanhos entre 203 nm e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo (SOW 131077) e para a
relaccedilatildeo SOW 131572 o tamanho foi de 174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo
Assim sendo foi selecionada a nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do
ODC e 72 de aacutegua como a melhor formulaccedilatildeo
79
Tabela 6 - Efeito da relaccedilatildeo surfactante- oacuteleo-aacutegua sobre as propriedades da nanoemulsatildeo
contendo o oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC)
No
SOW
(www)
Partiacutecula tamanho
(nm)
Polidispersatildeo
iacutendice
Zeta potencial
(mV)
1 101080 13590 plusmn 043 0249 plusmn 001 -2770 plusmn 049
2 101575 18470 plusmn 263 0340 plusmn 004 -2310 plusmn 043
3 131077 20350 plusmn 183 0129 plusmn 0010 -2000 plusmn 055
4 131572 17430 plusmn 101 0136 plusmn 0010 -2360 plusmn 017
5 151075 19120 plusmn 0103 0393 plusmn 0054 -1890 plusmn 061
6 151570 19620 plusmn 101 0276 plusmn 0009 -2430 plusmn 020
541 Estabilidade da Nanoemulsatildeo
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidades suficientes para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica (Figura 12) O
estudo de estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um
tamanho de partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se
constante o potencial zeta com valor de -2425 mV
Figura 12 - Estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nos primeiros 45 dias de
preparada Apoacutes 45 dias tamanho de particulas 1422 nm indice de polidispersatildeo 0126
potencial zeta -2425 mV
80
55 Ensaios em cultura de ceacutelulas
551 Ensaio de citotoxicidade ou viabilidade celular do oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e da nanoemulsatildeo
Utilizando o meacutetodo do MTT foi avaliada a capacidade do OBC e ODC em
interferir na viabilidade de fibroblastos humanos da linhagem MRC5 ou seja se estes
apresentavam potencial citotoacutexico De acordo com os dados mostrados na figura 13 foi
observado que nas concentraccedilotildees a partir de 50 microgmL o OBC demonstrou
citotoxicidade ao passo que o ODC apresentou citotoxicidade a partir da concentraccedilatildeo
de 25microgmL mostrando assim que os oacuteleos testados reduziram de forma significativa agrave
viabilidade das ceacutelulas quando comparado com o controle (ceacutelula sem tratamento com o
oacuteleo)
Figura 13 ndash (A) Efeito do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e (B) oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) sobre
a viabilidade de fibroblastos humanos MRC5 avaliado pelo meacutetodo do MTT As ceacutelulas foram
incubadas com 0 (controle) 125 25 50 e 100 μgmL de oacuteleo por 24 h Os valores
correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
A
(microgmL)
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
0 125 25 50 100 0
20
40
60
80
100
B
microgmL
Via
bil
idad
e c
elu
lar
()
81
Tambeacutem foram avaliadas as capacidades da nanoemulsatildeo contendo 15 de
ODC (NE 15) nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL em interferirem na viabilidade
celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos
J744 de camundongos em macroacutefagos J774 de camundongos conforme figura 14 Os
resultados de ambos os ensaios mostraram que a NE15 natildeo produziu citotoxicidade
Figura 11 - (A) Viabilidade celular de fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo neoplaacutesico (MRC-5) na
presenccedila da NE15 usando como controle positivo Doxorubicina 5microgmL e em (B)
macroacutefagos J744 de camundongos usando como controle positivo Staurosporin 25microM na
presenccedila da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC nas concentraccedilotildees de 1 ndash 100microgmL Os
valores correspondem agrave meacutedia plusmn EPM de trecircs experimentos independentes em duplicatas p
lt 005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltiplas Tukey
552 Efeito do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da Nanoemulsatildeo do oacuteleo
destilado de copaiacuteba sobre a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de Oacutexido Niacutetrico (NO)
A figura 15 mostra que a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC produziu uma
melhor reduccedilatildeo na produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico em 6480 maior do que o faacutermaco
padratildeo dexametasona e muito maior do que a ODC que soacute reduziu 1242
82
Figura 12 - Ensaio concentraccedilatildeo-resposta do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) e da nanoemulsatildeo
contendo 15 de ODC A quantificaccedilatildeo de nitrito foi mensurada em sobrenadantes de
macroacutefagos murino J774A 1 estimulados por 1 microgmL de LPS utilizando reagente de Griess
Oacuteleo destilado de copaiacuteba (A) Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba a 15 (B) e padratildeo
Dexametasona Testes ANOVADunnettrsquos foram utilizados para anaacutelise entre os grupos Os
valores de p lt 005 quando comparado ao controle (com LPS) Fraccedilatildeo volaacutetil F=1242
p=0000 Nanoemulsatildeo F=6490 p=0000
56 Toxicidade aguda oral
Na dose de 2000 mgkg natildeo houve a morte de nenhum animal Apoacutes 24 h de
exposiccedilatildeo natildeo foram observados sinais anormais na mobilidade dos animais nem no
aspecto e cor das membranas mucosas e olhos Os animais acessaram normalmente a
aacutegua e raccedilatildeo apresentando um comportamento normal Tambeacutem natildeo foram observados
sinais de toxicidade nos oacutergatildeos internos (coraccedilatildeo rins fiacutegado pulmotildees e pacircncreas)
apresentando cor e aspecto normal similares aos do grupo controle
57 Atividade anti-nociceptiva
A atividade anti-nociceptiva do OBC e ODC foi investigada a partir dos modelos
de contorccedilotildees abdominais e teste de formalina
A B
83
571 Teste de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico
O teste de contorccedilotildees abdominais eacute um modelo quiacutemico de nocicepccedilatildeo que se
baseia na contagem das contorccedilotildees da parede abdominal seguidas de torccedilatildeo do tronco e
extensatildeo dos membros posteriores como resposta reflexa agrave irritaccedilatildeo peritoneal e agrave
peritonite produzidas pela injeccedilatildeo intraperitoneal de uma soluccedilatildeo de aacutecido aceacutetico 09
(WHITTLE 1964)
O efeito do OBC (100mgKg) e ODC (100mgKg) no ensaio de contorccedilotildees
abdominais em camundongos induzidas pelo aacutecido aceacutetico administrado por via oral
mostrou na figura 16 que houve reduccedilatildeo significativa do nuacutemero de contorccedilotildees abdominais
nos animais tratados se comparado ao grupo controle negativo Tanto o OBC quanto o
ODC mostraram uma maior reduccedilatildeo nas contraccedilotildees abdominais quando comparado ao
grupo controle positivo tratados com indometacina um anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal
padratildeo demonstrando efeito anti-nociceptivo
0
5
10
15
20
Controle Indo
10mgmlOCB OCD
Ndeg
de c
on
torccedilotilde
es
Figura 13 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste de contorccedilotildees abdominais
induzido pelo aacutecido aceacutetico Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia)
seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
84
572 Teste da formalina a 25
O teste da formalina consiste na injeccedilatildeo intraplantar de soluccedilatildeo de formaldeiacutedo
(formalina) na pata posterior do animal o qual induz dor intensa pela estimulaccedilatildeo direta
dos nociceptores caracterizada por vigorosas lambidas mordidas e batidas na pata injetada
com o irritante (HESS 2006) Esse teste considerado de longa duraccedilatildeo permite a
verificaccedilatildeo de sinais presentes na fase de modulaccedilatildeo dos impulsos nervosos e tambeacutem
observar a participaccedilatildeo de sistemas endoacutegenos como o dos opioacuteides (MUNGUIA 2007)
No teste de formalina a administraccedilatildeo oral de OBC (100 mgKg) e ODC
(100mgKg) reduziu significativamente o tempo de lambedura da pata injetada com
formalina na primeira fase (dor neurogecircnica) assim como na segunda fase (dor
inflamatoacuteria) quando comparado ao controle negativo reforccedilando a atividade anti-
nociceptiva conforme mostra a figura 17 A morfina (5 mgKg ip) um analgeacutesico
opioacuteide foi utilizada como faacutermaco padratildeo e reduziu significativamente o tempo de
lambedura da pata nas duas fases desse teste conforme figura 18
Figura 14 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) (100
mgKg) e do ODC (100 mgKg) no teste de lambedura de pata injetada com formalina Cada barra
equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 005 quando comparado com o grupo
controle negativo por ANOVA (Anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla
Tukey
85
58 Atividade anti-edematogecircnica
581 Efeito do edema de pata induzido por carragenina
Com o intuito de avaliar o efeito anti-edematogecircnico do OBC e ODC foi utilizado
o modelo edema de pata induzido por carragenina Esse tipo de teste eacute utilizado para o
desenvolvimento de novos faacutermacos com potencial anti-inflamatoacuterio (MORRIS 2003
WILLOUGHBY 2003) A carragenina polissacariacutedeo sulfatado eacute um agente flogiacutestico
indutor de um processo inflamatoacuterio agudo que se desenvolve rapidamente devido agrave accedilatildeo
de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios associado agrave hiperalgesia e se caracteriza por
edema exacerbada sensibilidade a estiacutemulos teacutermicos e mecacircnicos (MORRIS 2003
FERREIRA et al 2004)
O efeito anti-inflamatoacuterio do OBC e ODC foi avaliado pelo meacutetodo do edema de
pata induzido por carragenina conforme mostrado na figura 18 O aumento de volume da
pata dos animais nos tempos de 1 h 2 h e 4 horas resultou da agressatildeo causada pelo agente
flogiacutestico (carragenina a 1) na pata desses animais O tratamento por via oral do OBC
reduziu significativamente o edema de pata na primeira e na quarta hora apoacutes o tratamento
quando comparado ao grupo controle enquanto que o ODC apresentou efeito de reduccedilatildeo
do edema apenas apoacutes a quarta hora de tratamento quando comparado ao controle Esse
resultado foi significativo quando comparado ao grupo tratado com indometacina
86
Controle Indometacina OCB OCD0
20
40
60
80
1h
4h
Vo
lum
e (
L)
Figura 15 - Efeito do preacute-tratamento na administraccedilatildeo oral do OBC (100 mgKg) e do oacuteleo
destilado de copaiacuteba (ODC) (100 mgKg) no teste o edema de pata induzido pela carragenina Cada
barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM da diferenccedila entre pata esquerda e direita de 5 animais p lt
005 quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 1 hora de tratamento e p lt 005
quando comparado com o grupo controle negativo apoacutes 4 horas de tratamento por ANOVA
(anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
59 Avaliaccedilatildeo da uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto
Podem-se observar pelos dados da figura 19 referentes aos efeitos do OBC e
ODC sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse que houve diferenccedila
estatisticamente significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10
mLkg) e ODC 100 (10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto
que com referecircncia aos efeitos do OBC na dose 400 mgkg e do ODC 400 mgkg sobre
as lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora
havendo diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos
apresentaram valores menores do que na forma de oacuteleo bruto
87
Figura 16 - Efeito do preacute-tratamento da administraccedilatildeo oral do oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) e do
oacuteleo destilado de copaiacuteba (ODC) em uacutelceras induzidas por etanol em ratos Cada barra equivale agrave
meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001 e p lt 0001 quando comparado com o
grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido por teste de comparaccedilatildeo
muacuteltipla Tukey
510 Teste de peritonite induzido por LPS
As preparaccedilotildees OBC ODC e a nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC natildeo
reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado pelo LPS enquanto que
a dexametasona (05 mgkg) inibiu a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos quando comparado ao
grupo de veiacuteculo negativo conforme pode ser visto na figura 20
88
Figura 20 - Efeito das preparaccedilotildees contendo oacuteleo bruto de copaiacuteba (OBC) oacuteleo destilado de copaiacuteba
(ODC) e Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre a peritonite induzida pelo LPS
em camundongos Cada barra equivale agrave meacutedia plusmn EPM realizado em 6 animais p lt 001
quando comparado com o grupo controle negativo por ANOVA (anaacutelise da variacircncia) seguido
por teste de comparaccedilatildeo muacuteltipla Tukey
511 Teste sobre edema de orelha induzido pelo fenol em camundongos
Neste estudo foi avaliada a atividade anti-edematogecircnica do ODC e da
nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC aplicados por via toacutepica utilizando o modelo in
vivo de edema de orelha O modelo de edema de orelha eacute amplamente uacutetil na avaliaccedilatildeo
da atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica de compostos bioativos em inflamaccedilotildees cutacircneas
(BLAZSO GABOR 1995 GABOR 2000) uma vez que eacute uma metodologia bastante
simples de resultados raacutepidos reprodutibilidade e baixas possibilidades de erros quando
bem aplicado aleacutem de ser um modelo que minimiza uso de animais e de substacircncias e
que permite verificar a atividade de constituintes no edema induzido por diferentes
agentes irritantes e ainda identificar compostos que tenham a capacidade de penetrar na
pele (GABOR 2000) Os agentes flogiacutesticos ativam quimicamente um processo
inflamatoacuterio diferentes substacircncias com esse potencial podem ativar vias diversas da
cascata inflamatoacuteria desencadeando os sinais caracteriacutesticos como edema aumento da
89
permeabilidade vasodilataccedilatildeo eritema Por ativar vias diversas a aplicaccedilatildeo de
diferentes agentes flogiacutesticos (oacuteleo de croacuteton aacutecido araquidocircnico capsaicina fenol
histamina) eacute justificada por seus mecanismos especiacuteficos jaacute conhecidos na induccedilatildeo do
processo inflamatoacuterio cujos resultados obtidos podem sugerir um provaacutevel mecanismo
da accedilatildeo anti-inflamatoacuteria a absorccedilatildeo e a possiacutevel accedilatildeo local da substacircncia em estudo
devido a sua aplicaccedilatildeo direta no foco inflamatoacuterio (BLAZSO GABOR 1995 GABOR
2000 VANE 2000 SURH 2005)
Os resultados apresentados na figura 21 demostraram claramente o efeito
anti-inflamatoacuterio toacutepico do ODC da nanoemulsatildeo contendo 15 de ODC (NE15) e a
dexametasona no modelo de edema de orelha induzido pelo fenol a NE 15 se mostrou
ser o anti-inflamatoacuterio mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive ao da
dexametasona natildeo soacute pelo efeito mais tambeacutem pela pequena quantidade de oacuteleo
destilado de copaiacuteba contido na nanoemulsatildeo
Figura 17 - Efeito da Nanoemulsatildeo do oacuteleo destilado de copaiacuteba (NE 15) sobre o edema de orelha
induzido por fenol a 10 Os animais receberam topicamente 20microL de Fenol a 10 e em
seguida foi aplicado 20microL de ODC ndash oacuteleo destilado de copaiacuteba bruto DEX - Dexametasona
0005sitio O efeito anti-edematogecircnico das substacircncias foi edema calculado a partir da
diferenccedila entre as massas de discos de 6 mm de diacircmetro da orelha direita e esquerdas obtidas
depois de 1 hora de aplicaccedilatildeo do fenol Cada grupo representa a meacutedia de 6 animais Analise
estatiacutestica Teste de Tukey HSD
90
512 Efeito da Nanoemulsatildeo de oacuteleo destilado de copaiacuteba sobre a artrite induzida
pelo zymosan
Os modelos experimentais para novas abordagens terapecircuticas para a artrite
reumatoide (AR) satildeo comumente utilizados para fornecerem conhecimento sobre os
mecanismos da doenccedila e estudo de novos agentes terapecircuticos (WILSON et al 2006
ROCHA et al 2008 BOLON et al 2011) A AR pode ser induzida em animais por
vaacuterios agentes arritmogecircnicos tais como o zymosan (zy) adjuvante (adjuvante
incompleto de Freund - IFA e adjuvante completo de Freund - CFA) colaacutegeno bovino
tipo II antiacutegeno e imunocomplexos A artrite induzida por zymosan eacute de faacutecil induccedilatildeo
inicio bem definido baixo custo operacional com boa reprodutibilidade e confiabilidade
da lesatildeo em 6 horas (fase aguda) podendo ser usado em protocolos experimentais por
ter paracircmetros imunoloacutegicos e de atividade capazes de serem rapidamente medidos
(OLIVER amp BRAHN 1996 MENEZES 2013)
A figura 22 mostra que apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE
NE 15 e DS antes da induccedilatildeo da artrite verificaram-se depois de 6 horas as seguintes
diferenccedilas conforme a cineacutetica do edema na pata dos animais que a NE 15 apresentou
melhor reduccedilatildeo do que a NE base ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que
o oacuteleo de copaiacuteba puro
91
Figura 18 - Efeito da NE15 apoacutes o preacute-tratamento com preparaccedilotildees OBC ODC NE NE 15 e
DS (Diclofenaco soacutedico) antes da induccedilatildeo da artrite pelo zymosan em edema de pata em
camundongos Apoacutes 6 horas a NE 15 apresentou melhor reduccedilatildeo do edema de pata que a NE
base (p=0003) ainda que a NE 15 reduziu a artrite melhor do que o oacuteleo de copaiacuteba puro
(p=0045)
92
6 DISCUSSAtildeO
No presente estudo otimizou-se a extraccedilatildeo da fraccedilatildeo volaacutetil do oacuteleo-resina de
copaiba (Copaifera spp) pelo meacutetodo de arraste a vapor O oacuteleo destilado de copaiacuteba
apresentou-se com aspecto liacutequido fino odor caracteriacutestico a madeira e coloraccedilatildeo
amarelo claro Apresentou uma densidade relativa de 0894 viscosidade de 107 cPS e
pH na faixa entre 6-7
O oacuteleo destilado de copaiacuteba eacute rico em sesquiterpenos que foram identificados
por CGEM e quantificados por cromatografia gasosa Os principais picos observados
no cromatogramas correspondem ao β-cariofileno (β-Car) (4070) oacutexido cariofileno
(136) e α-copaeno (108) Resultados semelhantes foram observados na
composiccedilatildeo do oacuteleo-resina do gecircnero Copaifera L (Leguminoseae) poreacutem com menor
intensidade e com predomiacutenio de β-cariofileno (360) seguido de α-copaeno (188)
β-bisaboleno (85) e α-trans-bergamoteno (70) (KOBAYASHI et al 2011) No
oacuteleo essencial da Copaifera langsdorffii Desf o composto maioritaacuterio foi o β-
bisaboleno (236) β-cariofileno (217) e α-bergamoteno (205) (XAVIER-
JUNIOR et al 2017) onde ambos os resultados apresentaram um teor de β-Car
predominantes o que pode tornar a fraccedilatildeo volaacutetil um insumo ser utilizado na
terapecircutica haja vista que o OBC apresenta uma grande variabilidade no teor dessa
substacircncia
Podemos observar nas composiccedilotildees quiacutemicas dos oacuteleos-resina de copaiacuteba de trecircs
espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne Copaifera cearensis Huber ex Ducke e
Copaifera reticulata Ducke que embora similares possuem composiccedilatildeo variada no teor
de β-Cariofileno (575 197 e 409 respectivamente) e o principal composto nestes
oleo-resinas foram o α-humuleno α-copaeno α-bergamoteno todos em quantidades
diferentes (VEIGA JUNIOR et al 2007 LEANDRO et al 2012) Assim a grande
93
variabilidade na composiccedilatildeo quiacutemica torna difiacutecil sua padronizaccedilatildeo para utilizaccedilatildeo
como mateacuteria-prima na induacutestria farmacecircutica (RIGAMONTE-AZEVEDO et al 2004
BIAVATTI et al 2006 HERRERO-JAacuteREGUI et al 2011)
Diferentemente do OBC o ODC em todas as espeacutecies testadas mostrou mais
homogeneidade na composiccedilatildeo quiacutemica independente da espeacutecie utilizada (VEIGA
JUNIOR et al 2007 SOUSA et al 2011) sendo o β-Car o constituinte majoritaacuterio Isso
faz com que o ODC seja uma maneira mais viaacutevel para padronizar esse produto para sua
utilizaccedilatildeo na induacutestria farmacecircutica e cosmeacutetica (SOUSA et al 2011)
Neste trabalho se propocircs uma nanoemulsatildeo contendo ODC A fase orgacircnica da
nanoemulsatildeo foi composta de quantidades entre 30-15 de tensoativo natildeo iocircnico de
baixo EHL (Span80reg) e quantidades entre 3-15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba (EHL
11) A fase aquosa foi composta por tensoativo natildeo iocircnico de alto EHL (Tween80reg)
em quantidades entre 30-15 e aacutegua Mili-Q em quantidade suficiente para 100 O
volume final da nanoemulsatildeo foi de 100 mL que foi ajustado ao final do processo
utilizando aacutegua Mili-Q Para a preparaccedilatildeo da emulsatildeo estaacutevel do tipo OA deve-se
considerar o EHL e a solubilidade da cadeia lipiacutedica do emulsificante na fase oleosa
(LACHMAN et al 2001) O valor do EHL necessaacuterio para emulsificar um oacuteleo pode
ser determinado por preparaccedilatildeo de emulsotildees com emulsificantes de vaacuterios valores de
EHL e determinar qual valor de EHL produz a emulsatildeo mais estaacutevel (BECCHER
2001 LACHMAN et al 2001) e consequentemente tem grande importacircncia na
determinaccedilatildeo das propriedades da dispersatildeo (ESQUENA SOLANS 2001 ZHANG
QUE 2008)
Para a determinaccedilatildeo do EHL requerido pelo ODC foram realizadas
nanoemulsotildees com Tween80reg Span80reg usando diferentes proporccedilotildees As emulsotildees
94
obtidas que natildeo foram estaacuteveis apoacutes 24 horas da manipulaccedilatildeo foram as preparadas com
valores de EHL 10 20 e 30 As nanoemulsotildees feitas com valores de EHL de 40 e 50
apresentaram leve cremeaccedilatildeo No entanto as nanoemulsotildees feitas com valores de EHL
entre 60 a 150 se mantiveram estaacuteveis por mais de 24 Nesse caso foi estabelecido
atraveacutes de experimentos realizados que o EHL oacutetimo para o ODC foi o EHL de valor
110
De acordo com CHANAMAI et al (2002) a estabilidade de uma nanoemulsatildeo
frente agrave cremeaccedilatildeo depende da composiccedilatildeo do oacuteleo pois a densidade da gotiacutecula
depende do tipo e da concentraccedilatildeo de moleacuteculas apolares presentes na fase interna
Aleacutem disso a taxa de transporte destas moleacuteculas apolares atraveacutes do filme interfacial
para fase aquosa depende de sua solubilidade na aacutegua e em funccedilatildeo disso o crescimento
das gotiacuteculas por Oswald ripening tambeacutem seraacute dependente da composiccedilatildeo do oacuteleo
Na seleccedilatildeo do sistema surfactante dos trecircs pares de sistemas de tensoativos
testados os resultados mostraram que o par de tensoativos Tween80reg Span80reg
proporcionou uma nanoemulsatildeo com maior estabilidade comprovando-se nos testes
preliminares de estabilidade Isso sugeriu que a mistura de tensoativos com valor de
EHL 11 favorece a formaccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis contendo ODC A anaacutelise
macroscoacutepica mostrou a boa estabilidade fiacutesica do sistema bem caracteriacutesticas tiacutepicas
de nanoemulsotildees como transluscecircncia e reflexo azulado
Com a finalidade de encontrar a melhor composiccedilatildeo das nanoemulsotildees a serem
estudadas foi avaliado o efeito da relaccedilatildeo Surfactante-Oacuteleo-Aacutegua (SOW) sobre as
propriedades da nanoemulsatildeo Usou-se o par de tensoativos Tween80reg Span80reg no
valor de EHL = 110 para a construccedilatildeo do diagrama pseudoternaacuterio O estudo mostrou
que as formulaccedilotildees contendo 13 do sistema surfactante possuiacuteam as melhores
propriedades e estabilidade fiacutesico-quiacutemica quando comparada com as demais
95
formulaccedilotildees A formulaccedilatildeo (SOW 131077) apresentou um tamanho de gota de 203 nm
e 0129 de iacutendice de polidispersatildeo e a formulaccedilatildeo SOW 131572 mostrou tamanho de
174 nm com 0136 de iacutendice de polidispersatildeo Assim sendo foi selecionada a
nanoemulsatildeo contendo 13 de surfactantes 15 do ODC e 72 de aacutegua como a
melhor nanoemulsatildeo
Segundo LACHMAN et al (2001) emulsotildees OA mais estaacuteveis satildeo formadas
com uma combinaccedilatildeo de tensoativos lipofiacutelico e hidrofiacutelico ainda que seja possiacutevel
obter formulaccedilotildees estaacuteveis utilizando um uacutenico emulsificante Eacute aconselhaacutevel a mistura
de um emulsificante de baixo valor EHL (lipofiacutelico) com outro de alto valor de EHL
(hidrofiacutelico) promovendo a formaccedilatildeo de uma interface coesa visto que cada tipo de
emulsificante se adsorveraacute a fase correspondente (PINHO STORPIRTS 1998 PRISTA
et al 1992) Estudos realizados por GULLAPALI SHEHTH (1999) demonstraram que
a similaridade estrutural entre os emulsionantes e a fase dispersa eacute mais relevante que o
valor de EHL para a obtenccedilatildeo de emulsotildees estaacuteveis
Foi avaliada a estabilidade da nanoemulsatildeo contendo 15 do ODC 13 de
surfactantes (Tween80reg Span80reg) e aacutegua em quantidade suficiente para 100
durante 45 dias antes de ser submetida aos testes de atividade bioloacutegica O estudo de
estabilidade desta preparaccedilatildeo continuou por ateacute 180 dias mostrando um tamanho de
partiacuteculas de 144 nm e um iacutendice de polidispersatildeo de 0125 e mantendo-se constante o
potencial zeta com valor de -2425mV Mostrando sua estabilidade por ateacute 180 dias
A atividade anti-inflamatoacuteria de nanoemulsotildees contendo ODC a 10 e 15 (NE
10 e NE 15 respectivamente) foi tambeacutem avaliada in vitro Assim essas
nanoemulsotildees foram testadas quanto agrave capacidade de induzir toxicidade em ceacutelulas de
macroacutefago murino e fibroblastos de pulmatildeo humano Nos experimentos as
96
nanoemulsotildees natildeo apresentaram toxicidade nas concentraccedilotildees testadas nas ceacutelulas
normais de pulmatildeo humano MRC5 e tambeacutem natildeo apresentaram qualquer influecircncia na
viabilidade dos fibroblastos Nesta anaacutelise podemos destacar que natildeo houve diferenccedila
entre os tipos de linhagem celular e natildeo houve accedilatildeo toacutexica dessas nanoemulsotildees em
ambas as linhagens celulares MRC5 e J774A1 Este resultado foi contraacuterio ao
observado na preacute-incubaccedilatildeo de monoacutecitos humanos THP-1 estimulados por LPS com
concentraccedilotildees crescentes da fraccedilatildeo purificada de oacuteleo-resina (OR-PF) contendo
diterpenos e sesquiterpenos A incubaccedilatildeo reduziu a liberaccedilatildeo de citocinas proacute-
inflamatoacuterias (IL-1β IL-6 TNFα) fornecendo fortes evidecircncias de que sua atividade
anti-inflamatoacuteria estaacute relacionada agrave inibiccedilatildeo da translocaccedilatildeo nuclear do NF-κB e
consequentemente da secreccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias (GELMINI et al 2013)
Este resultado diferente do ODC testado se deve provavelmente a associaccedilatildeo aacutecidos
diterpecircnicos diterpenos e sesquiterpenos presente na OR-PF
Neste estudo foi observado o efeito das nanoemulsotildees contendo ODC 10 e
NE15 oacuteleo destilado de copaiacuteba puro e oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera spp) sobre
a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de NO em macroacutefagos murino J774A1 ativados por LPS Em
geral pode-se observar que todos os compostos obtiveram a capacidade de inibir a
produccedilatildeo de NO em macroacutefago murino nas concentraccedilotildees testadas poreacutem o
mecanismo natildeo foi totalmente esclarecido tendo em vista que natildeo foi possiacutevel realizar a
anaacutelise da expressatildeo de mRNA da proteiacutena iNOS por Western blot eou pela teacutecnica de
reaccedilatildeo em cadeia de polimerase na linhagem de macroacutefago murinho ou outros testes
complementares A iNOS quando expressa libera maiores concentraccedilotildees de NO O
presente trabalho torna-se pioneiro neste estudo de inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido
niacutetrico NO direcionado as nanoemulsotildees contendo ODC Contudo a continuidade dos
97
ensaios se faz necessaacuterio para a elucidaccedilatildeo do mecanismo de inibiccedilatildeo de iNOS e a
sucessiva inibiccedilatildeo de NO
Resultados semelhantes foram observados na avaliaccedilatildeo dos efeitos
farmacoloacutegicos de trecircs oleo-resinas de espeacutecies diferentes Copaifera multijuga Hayne
Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke medindo a
produccedilatildeo de NO por macroacutefagos murinos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga
Hayne (100 mg kg) foi o mais potente inibindo a produccedilatildeo de NO As oleorresinas
de Copaifera cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram
a produccedilatildeo de NO mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os
resultados observados na reduccedilatildeo da ativaccedilatildeo de macroacutefagos estimulados por LPS a
partir da nanoemulsatildeo contendo ODC foram importantes para o delineamento dos
experimentos in vivo os quais investigaram alguns mecanismos da possiacutevel atividade
anti-inflamatoacuteria dessa formulaccedilatildeo
Antes do iniacutecio dos ensaios in vivo o ODC isoladamente e NE15 foram
avaliadas quando a toxidade aguda em camundongos O presente estudo foi o primeiro
que avaliou a toxicidade letal aguda do ODC e da NE 15 onde os camundongos
Swiss machos (n = 3grupo) em jejum preacutevio de 12 horas (aacutegua disponiacutevel) foram
tratadas com doses de 2000 mgkg peso corpoacutereo de ODC NE 15 e NE base (vo)
com acesso livre apenas de aacutegua com raccedilatildeo permitida 3 h apoacutes a administraccedilatildeo A
seguir foram acomodados em gaiolas e observados por um periacuteodo de 4 horas para
avaliaccedilatildeo de possiacuteveis alteraccedilotildees comportamentais ou morte Durante o periacuteodo
experimental os animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos
incluindo a postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento
da paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pelos estresse salivaccedilatildeo olhos e
98
comportamento (Moser et al 1997 a b c) Os animais foram avaliados nos tempos 24
48 e 72 horas seguidos de observaccedilatildeo por um periacuteodo total de 14 dias com o intuito de
verificar a possiacutevel ocorrecircncia de oacutebito e alteraccedilatildeo no peso corporal (OECD 2008)
Durante todo o periacuteodo de observaccedilatildeo foram disponibilizados raccedilatildeo e aacutegua ad libitum
A dose de 2000 mgKg peso corpoacutereo eacute recomendada pelo protocolo (OECD)-
4232001 onde estabelece que quando haacute trabalhos cientiacuteficos que nos datildeo informaccedilatildeo
quanto a capacidade de mortalidade de uma determinada substacircncia seja improvaacutevel no
mais alto niacutevel da dose inicial entatildeo se utilizou a dose de 2000 mgKg Nenhum dos
trecircs animais de cada grupo expostos apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras
24 h apoacutes a exposiccedilatildeo e durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste
nesta mesma dose com outros trecircs animais o que confirmou o resultado anterior As
mudanccedilas comportamentais morbidade e mortalidade as quais poderiam ser
observadas nos animais apoacutes receber o tratamento natildeo foram observadas durante 4
horas ininterruptas nas 24 horas sucessivas e nem durante os 14 dias de experimentaccedilatildeo
em nenhum dos 3 animais de cada grupo Os animais tambeacutem natildeo apresentaram
alteraccedilotildees nos pelos pele olhos e mucosas sinais de tremores convulsotildees salivaccedilatildeo
diarreia letargia sono coma dor e sofrimento esses resultados satildeo semelhantes aos
reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees no padratildeo
de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de copaiacuteba em
doses crescentes de 50 a 800 mgkg po Entretanto Brito et al (1999) observaram que
a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg po do oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias
foi capaz de promover irritabilidade nos ratos testados
Ao final dos 14 dias de acompanhamento nenhuma morte foi registrada natildeo
havendo tambeacutem diferenccedila no ganho de peso corporal em relaccedilatildeo ao grupo controle No
99
deacutecimo quarto dia os animais foram sacrificados apoacutes serem anestesiados com xilasina
10mgkg ip e Cetamina 150mgkg ip Durante a necropsia os oacutergatildeos da cavidade
corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e
timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e diafragma foram avaliados
macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo tamanho e consistecircncia natildeo havendo
qualquer alteraccedilatildeo em relaccedilatildeo ao grupo controle Os mesmos resultados foram obtidos
por Brito et al (2001) onde nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no
estudo da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Com os resultados obtidos
observamos que a toxicidade oral aguda do ODC e da NE15 foi maior que 2000
mgkg vo e classificado como categoria 5 ou seja com baixa toxicidade aguda e com
DL-50 acima de 2000 mgKg Estes resultados apresentam uma excelente toleracircncia
dando suporte para futuros estudos de longa duraccedilatildeo devido agrave baixa toxicidade na dose
avaliada
Visando avaliar tambeacutem o possiacutevel efeito anti-nociceptivo o ODC foi avaliado
in vivo por dois modelos teste de contorccedilotildees abdominais e da formalina O modelo de
edema de pata para atividade anti-inflamatoacuteria e de uacutelcera gaacutestrica tambeacutem foram
realizados in vivo Nos estudos os resultados do ODC foram comparados com o OBC
tambeacutem testado Tanto o ODC quanto o OBC mostraram uma reduccedilatildeo significativa do
nuacutemero de contorccedilotildees abdominais induzida pelo aacutecido aceacutetico quando comparado ao
grupo controle negativo e os dados obtidos sugerem que a accedilatildeo anti-nociceptiva dos
oacuteleos de copaiacuteba possa estar associada agrave inibiccedilatildeo de citocinas proacute-inflamatoacuterias bem
como mediadores inflamatoacuterios de modo a contribuir para o alivio de dores leves a
moderadas Por outro lado tambeacutem se verificou que o ODC e o OBC produziram uma
reduccedilatildeo dessas contorccedilotildees nos animais de modo superior ao do grupo controle positivo
100
tratados com indometacina um reconhecido anti-inflamatoacuterio natildeo esteroidal padratildeo que
possui potente atividade analgeacutesica e anti-inflamatoacuteria inibindo a transmissatildeo nociceptiva
aleacutem da prevenccedilatildeo do edema e da inflamaccedilatildeo (STEAGALL et al 2009) Esses
resultados corroboram com o estudo comparativo da atividade anti-nociceptiva de dois
oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae)
administrados por via oral utilizando a teacutecnica de contorccedilatildeo induzidas por aacutecido aceacutetico
cujos resultados demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba nas doses variando de 30 a 150
mgkg foram suficientes para desenvolver significativamente o efeito anti-nociceptivo
perifeacuterico e central de ambos os oacuteleos esta ultima atividade foi inibida pela naloxona
(GOMES et al 2007) Nossos dados demonstraram que as atividades anti-nociceptivas
do ODC e OBC podem estar parcialmente relacionadas agrave inibiccedilatildeo da siacutentese de
prostaglandinas ou agrave liberaccedilatildeo de outros mediadores endoacutegenos
No presente estudo demonstramos que o tempo de lambida da pata injetada com
formalina 1 foi atenuado significativamente para o ODC e OBC nas doses (100
mgkg) testadas tanto na fase neurogecircnica (0-5 min) quanto na fase inflamatoacuteria (15-30
min) do teste De acordo com Hunskaar e Hole (1987) o efeito anti-nociceptivo do
paracetamol droga de referecircncia na 1ordf fase do teste da formalina deve-se agrave sua accedilatildeo
sobre a COX-3 no sistema nervoso central que consequentemente leva agrave inibiccedilatildeo da
siacutentese de prostaglandina E2 (PGE2) (FELDBERG GUPTA 1973) aleacutem de modular o
sistema opioide (MAREK AGHAJANIAN 1998 RUGGIERI et al 2008)
canabinoacuteide (HOumlGESTAumlTT et al 2005) e serotonineacutergico (PELISSIER et al 1996
PINI et al 1996) Por outro lado o efeito perifeacuterico do paracetamol durante a 2ordf fase do
teste da formalina pode envolver inibiccedilatildeo mesmo que discreta da COX-1 e 2
(AMINOSHARIAE KHAN 2015) Estes dados corroboram com o estudo comparativo
101
da atividade anti-nociceptiva de dois oacuteleos da Copaiacuteba (Copaifera multijuga Hayne e
Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) administrados por via oral utilizando a teacutecnica de
contorccedilatildeo abdominal induzida aacutecido aceacutetico e pela formalina cujos resultados
demonstraram que os oacuteleos de copaiacuteba natildeo desenvolveram efeitos toacutexicos e que doses
variando de 30 a 150 mg kg foram suficientes para desenvolver significativamente o
efeito anti-nociceptivo perifeacuterico Portanto os resultados indicam claramente que os
oacuteleos empregados no estudo produzem efeito anti-nociceptivo que pode envolver tanto
mecanismos centrais quanto perifeacutericos Poreacutem os mecanismos da anti-nocicepccedilatildeo do
ODC testado no presente estudo somente poderatildeo ser elucidados com futuros estudos
adicionais empregando antagonistas farmacoloacutegicos dos principais neurotransmissores
envolvidos com a modulaccedilatildeo central da nocicepccedilatildeo bem como da quantificaccedilatildeo dos
principais mediadores perifeacutericos da inflamaccedilatildeo tais como TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 e
PGE2 Este novo efeito comprobatoacuterio pode ser uacutetil no tratamento de distuacuterbios
algeacutesicos (GOMES et al 2007)
Neste estudo observou-se que o OBC na dose de 100 mgkg atenuou
principalmente a primeira fase do edema de pata e foi menos intenso na terceira fase
enquanto que o ODC na dose de 100mgkg natildeo inibiu a intensidade e nem interferiu
significativamente no desenvolvimento do edema na primeira fase no entanto atenuou
somente a terceira fase de desenvolvimento do edema induzido por carragenina Portanto eacute
possiacutevel sugerir que o efeito anti-inflamatoacuterio do OBC esteja associado agrave interferecircncia da
accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da primeira e segunda fase tal como a bradicinina
enquanto que o efeito anti-inflamatoacuterio do ODC eacute possiacutevel estar associado agrave interferecircncia
da accedilatildeo de mediadores proacute-inflamatoacuterio da 3ordf fase tal como a PGE2 Esses resultados
foram significativos poreacutem menos intensos em comparaccedilatildeo ao grupo tratado com
102
indometacina a qual atenuou significativamente tanto a intensidade quanto a duraccedilatildeo do
edema induzido por carragenina
O teste de uacutelcera gaacutestrica aguda induzida por etanol absoluto teve como objetivo
avaliar qualitativamente a provaacutevel proteccedilatildeo gaacutestrica do OBC e ODC em relaccedilatildeo ao
estresse ao uso etanol Apoacutes jejum de 18 h os ratos (n = 6grupo) foram preacute-tratados por
via oral (gavagem 10mLkg) com ODC (100 ou 400 mgkg) ou OBC (100 ou 400
mgkg) ou controle negativo (NaCl 09) Apoacutes 1 hora foi administrado 4 mLkg de
etanol absoluto (agente lesivo) aos animais por via oral Decorrida 1 hora dessa
administraccedilatildeo os ratos foram eutanasiados em cacircmara de CO2 os estocircmagos retirados e
abertos pela grande curvatura Em seguida foram fotografados e as lesotildees contadas atraveacutes
de planimetria computadorizada Os resultados foram expressos em aacuterea total de lesatildeo
ulcerativa (ALU) (mm2) Os dados referentes aos efeitos do OBC e ODC sobre as lesotildees
gaacutestricas induzidas por estresse demonstraram que houve diferenccedila estatisticamente
significante entre os grupos avaliados Nas doses de OBC 100 (10 mLkg) e ODC 100
(10 mLkg) apresentaram os maiores valores de meacutedia enquanto que com referecircncia aos
efeitos do OBC na dose 400mgkg e do ODC 400mgkg diluiacutedos em NaCl 09 sobre as
lesotildees gaacutestricas induzidas por etanol em ratos foi possiacutevel verificar que embora havendo
diferenccedila estatisticamente significante entre os grupos avaliados os mesmos apresentaram
valores menores do que na dose de 100 de ambos os oacuteleos Esses resultados estatildeo de
acordo com os efeitos do oacuteleo-resina obtido da Copaifera langsdorffii em lesotildees gaacutestricas
induzidas pelo etanol indometacina e por estresse hipoteacutermico em ratos e que apoacutes
administraccedilatildeo oral das doses de 200 e 400 mgKg proporcionou proteccedilatildeo significativa
dose-dependente contra o dano gaacutestrico causado pelo etanol e estresse hipoteacutermico e na
dose de 400 mgKg tambeacutem preveniu a ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida pela indometacina
(PAIVA et al 1998)
103
A NE 15 e ODC foram testadas em modelo de pleurisia induzido por LPS in
vivo nesse experimento grupos de camundongos BalbC foram previamente tratados
com NE15 e dexametasona Apoacutes 1 h de tratamento foram desafiados com LPS 250
ngcavidade e apoacutes 8 h realizado o lavado pleural para contagem dos leucoacutecitos em
modelo de pleurisia induzido por LPS Assim foi observado que tanto o ODC quanto
NE15 administrados por via oral (100 mgkg) natildeo inibiram a migraccedilatildeo dos leucoacutecitos
totais leucoacutecitos mononucleares e neutroacutefilos consequentemente natildeo inibiram o
extravasamento de liacutequido e nem na migraccedilatildeo de leucoacutecitos quando comparado com a
dexametasona natildeo sendo portanto a via que demonstra a atividade anti-inflamatoacuteria
tanto do ODC quanto da NE15 Por outro lado os efeitos farmacoloacutegicos de trecircs oacuteleo-
resinas foram avaliados in vivo utilizando o modelo de pleurisia induzida por zymosan
em camundongos O oacuteleo de copaiacuteba de Copaifera multijuga Hayne (100 mgkg) foi o
mais potente inibindo a pleurisia induzida pelo zimosan Os oacuteleo-resinas de Copaifera
cearensis Huber ex Ducke e Copaifera reticulata Ducke tambeacutem inibiram a pleurisia
mas com menor intensidade (VEIGA JUNIOR et al 2007) Os dados demonstraram
que os oacuteleo-resinas de copaiacuteba apresentaram efeitos anti-inflamatoacuterios in vivo baseados
na reduccedilatildeo da migraccedilatildeo de leucoacutecitos para a cavidade pleural de ratos e para o agente
quimiotaacutetico soluccedilatildeo de lipopolissacariacutedeo respectivamente (KOBAYASHI et al
2011) esses efeitos dos oacuteleo-resinas se devem provavelmente a associaccedilatildeo dos terpenos
e sesquiterpenos fato o que natildeo acontece quando se usa o ODC isoladamente tendo em
vista que a proacutepria NE15 tambeacutem natildeo produziu tal efeito
Ainda com o intuito de verificar a capacidade anti-inflamatoacuteria do ODC e da
NE15 frente a diferente via de aplicaccedilatildeo foi utilizado o modelo de edema de orelha
induzido por fenol Apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol 10 (vv) grupos de camundongos
(Swiss n = 6) receberam aplicaccedilatildeo toacutepica 20μL na orelha direita de oacuteleo de copaiacuteba
104
puro (OBC) ODC NE 15 e dexametasona 0005 mgsitio (controle positivo) O
grupo controle inflamado recebeu a aplicaccedilatildeo toacutepica de nanoemulsatildeo base (veiacuteculo)
apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol na orelha direita A orelha direita ficou em condiccedilotildees normais
Uma hora apoacutes a aplicaccedilatildeo do fenol o tecido das orelhas foi seccionado e pesado para a
determinaccedilatildeo do edema (g) Os resultados mostraram o efeito anti-inflamatoacuterio toacutepico
do oacuteleo de copaiacuteba puro (OCP) ODC NE 15 e dexametasona a NE 15 se mostrou
a mais potente de todas as preparaccedilotildees inclusive em relaccedilatildeo ao da dexametasona eacute
possiacutevel que a NE15 iniba a geraccedilatildeo de radicais livres uma importante via para a
toxicidade deacutermica dos compostos fenoacutelicos uma vez que a presenccedila de ROS causa um
aumento na produccedilatildeo e liberaccedilatildeo de vaacuterios mediadores proacute-inflamatoacuterios como IL-1
IL-6 IL-8 TNF-α LTs e PGs os quais provavelmente satildeo responsaacuteveis pela resposta
inflamatoacuteria que se segue a exposiccedilatildeo ao fenol jaacute que esses mediadores amplificam a
resposta inflamatoacuteria estimulando outras citocinas e mediadores (MURRAY et al
2007)
No teste da artrite um edema de pata foi induzido na pata direita traseira dos
camundongos por injeccedilatildeo subplantar de uma suspensatildeo de zymosan (500μgpata) em
soluccedilatildeo salina esteacuteril (09) Na pata esquerda foi injetada soluccedilatildeo salina (controle
negativo) (WINTER et al 1962) As diferentes preparaccedilotildees oacuteleo de copaiacuteba puro
(OCP) ODC nanoemulsatildeo base (NE) NE 15 600mkkgdia e 100 mgkgdia de
diclofenaco de soacutedio (DS-controle positivo) foram administrados trinta minutos antes da
administraccedilatildeo do zymosan nas patas traseiras dos camundongos O grau de edema foi
medido imediatamente antes e 6 12 e 24 h depois da injeccedilatildeo de zymosan utilizando o
paquiacutemetro digital em miliacutemetros (mm) Para cada animal foi avaliada cada pata
individualmente somando-se o escore de todas as patas de cada camundongo (escore
maacuteximo 16camundongo) A diferenccedila entre o edema das patas determinada antes e
105
depois da injeccedilatildeo do agente provocador do edema indicou a gravidade do mesmo e foi
avaliada como a porcentagem da diferenccedila entre o volume da pata em cada ponto de
tempo e o volume da pata basal (controle negativo)
O efeito NE 15 demonstrou que possui melhor efeito melhor que o ODC ou o
OBC sobre a artrite induzida pelo zymosan em camundongos sobre a artrite induzida
pelo zymosan e que a mesma produziu um efeito antiartriacutetico melhor do ODC Estudos
recentes demonstraram que um dos principais componentes do oacuteleo o β-Car eacute um
potente anti-inflamatoacuterio (LUCCA et al 2015) O β-Car foi testado na inflamaccedilatildeo
sistecircmica no estado oxidativo e no metabolismo de ceacutelulas hepaacuteticas de ratos com
artrite induzida por adjuvantes um modelo para a artrite reumatoacuteide uma patologia
autoimune experimental que compartilha muitas caracteriacutesticas com a artrite reumatoacuteide
humana Essas accedilotildees beneacuteficas foram da mesma extensatildeo do oacuteleo de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) e portanto o β-Car eacute possivelmente responsaacutevel pelas accedilotildees anti-
inflamatoacuteria e antioxidante do oacuteleo que foi pontecializado quando aprensentado na
forma nanoemulsionada Esses resultados revelam que o β-Car melhora a inflamaccedilatildeo
sistecircmica e o estado oxidativo de ratos com artrite e aleacutem disso natildeo estaacute associado agrave
hepatotoxicidade (CASTRO GHIZONI et al 2017 AMES-SIBIN et al 2018)
Em resumo o presente trabalho apresenta uma caracterizaccedilatildeo quiacutemica e
bioloacutegica da fraccedilatildeo volaacutetil da resina de copaiacuteba e de forma ineacutedita desenvolveu uma
nanoformulaccedilatildeo contendo esta fraccedilatildeo e aleacutem disso apresenta uma serie de achados
farmacoloacutegicos importantes para aplicaccedilatildeo tanto do oacuteleo destilado como da
nanoformulaccedilatildeo em processos fisiopatoloacutegicos Destacando os resultados obtidos com a
NE15 em diferentes ensaios in vivo que demonstraram a atividade anti-inflamatoacuteria e
baixa toxicidade eacute possiacutevel que esse produto possa ser utilizado tanto na terapecircutica
humana quanto animal Contudo salientamos que outros estudos de abordagem sobre o
106
mecanismo de accedilatildeo na terapecircutica inflamatoacuteria devem ser realizados a fim de que o
produto seja utilizado com seguranccedila
107
6 CONCLUSOtildeES
1 O oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se como um produto liacutequido amarelo claro
odor carateriacutestico densidade de 08942 gmL com viscosidade 107 cPS e pH entre 6 e
7 contendo como principal componente quiacutemico o sesquiterpeno β-cariofileno (β-Car)
o qual pode ser utilizado como marcador quiacutemico deste produto
2 Foi possiacutevel obter uma nanoemulsatildeo contendo 15 do oacuteleo destilado de copaiacuteba
com tamanho de partiacutecula 9947 plusmn 064 nm polidispersatildeo de 0224 + 0010 potencial
zeta -3710 plusmn 026 mV e condutividade igual a 0009 plusmn 0000 mΩcm
3 O oacuteleo destilado de copaiacuteba foi mais citotoacutexico do que o oacuteleo de copaiacuteba bruto
em fibroblastos humanos MRC5
4 A nanoemulsatildeo contendo 15 de oacuteleo destilado de copaiacuteba mostrou-se de baixa
citotoxicidade no ensaio de viabilidade celular em fibroblastos de pulmatildeo humano natildeo
neoplaacutesico (MRC-5) e em macroacutefagos murinos (J744)
5 A nanoemulsatildeo foi capaz de promover a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de oacutexido niacutetrico
em macroacutefagos estimulados por LPS em concentraccedilatildeo menor do que o oacuteleo destilado ou
a resina de copaiacuteba
6 No ensaio de toxicidade aguda oral tanto a NE15 quanto o oacuteleo destilado de
copaiacuteba na dose maacutexima de 2000 mgkg natildeo levou a morte de nenhum animal
(camundongo Balb C) ateacute 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo
7 Tanto oacuteleo bruto de copaiacuteba quanto o oacuteleo destilado de copaiacuteba quando
administrados por via oral na dose de 100mgKg mostraram intensa atividade anti-
nociceptiva similar agraves substacircncias padratildeo testadas (indometacina ou morfina) em
camundongos
108
8 No teste de edema de pata de camundongos induzido por carragenina a resina
bruta produziu efeito anti-edematogecircnico na primeira e quarta hora jaacute o oacuteleo destilado
somente na quarta hora apoacutes a administraccedilatildeo por via oral
9 Tanto o oacuteleo destilado quanto a resina bruta mostraram atividade anti-
ulcerogecircnica sobre as lesotildees gaacutestricas induzidas por estresse nas doses de 10 mLkg e
400mgkg em ratos
10 Tanto a nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba quanto o oacuteleo
destilado de copaiba natildeo reduziram a migraccedilatildeo de leucoacutecitos para o peritocircnio provocado
pelo LPS em camundongos
11 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba mostrou ter
atividade anti-inflamatoacuteria toacutepica similar a dexametasona e muito maior do que o oacuteleo
destilado de copaiacuteba em modelo de edema de orelha induzido por fenol em
camundongos
12 A nanoemulsao contendo 15 de oleo destilado de copaiba produziu efeito
antiartriacutetico melhor que o oacuteleo destilado ou a resina bruta de copaiacuteba sobre a artrite
induzida pelo zymosan em camundongos
13 Os achados do presente estudo satildeo importantes para aplicaccedilatildeo do oacuteleo destilado
de copaiacuteba ou da sua formulaccedilatildeo em nanoemulsatildeo em produtos a serem utilizados tanto
na terapecircutica humana quanto animal principalmente de processos inflamatoacuterios
109
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ANEXOS
ANEXO 1
135
ANEXO 2
136
ANEXO 3
137
