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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ
POTENCIAL ANTICÂNCER DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE)
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013
ii
ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ POTENCIAL ANTICÂNCER DO ÓLEO ESSENCIAL DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE) 2013
iii
ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ
POTENCIAL ANTICÂNCER DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas. Orientador: Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra
SÃO CRISTÓVÃO-SE 2013
iv
v
ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ
POTENCIAL ANTICÂNCER DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra
1º Examinador: Profa. Dra. Sandra Lauton Santos
2º Examinador: Prof. Dr. Josemar Sena Batista
vi
A Deus
vii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me presenteado com a oportunidade de cursar o mestrado e por ter sido minha
companhia diária ao longo destes meses, me fortalecendo nas dificuldades, me orientando nas
incertezas e me guiando pelos melhores caminhos. Agradeço, sobretudo, por ter me ouvido e
feito por mim e pelos meus, aquilo que sozinha eu jamais conseguiria.
Á minha amada Mãe do Perpétuo Socorro, pelas bênçãos que todos os dias recebi de suas
mãos.
Aos meus pais, por tanto amor e dedicação, por serem meus maiores incentivadores e por
todas as renúncias que fizeram em meu favor ao longo destes tantos anos de luta fora de casa.
Vocês são o meu exemplo de vida. Obrigada por acreditarem em mim.
Aos meus irmãos, por toda paciência, carinho e pela presença constante na minha vida.
Agradeço a Deus diariamente pelo privilégio de desfrutar desse amor fraterno.
Ao meu namorado, por ter sido meu grande amigo, meu companheiro de momentos tristes e
felizes, por ter entendido a importância desse momento da minha vida e me apoiado
incondicionalmente, mesmo separados por quilômetros de distância.
A todos os meus familiares pelas palavras de carinho, pela alegria de verem realizar esse
sonho, pelos ensinamentos de vida e por me incluírem nas suas orações diárias.
Aos companheiros de apartamento Camila, Lívia, Renan e Katty pela generosidade,
companheirismo e amizade.
Ao Professor Dr. Daniel Pereira Bezerra, meu orientador, por ter acreditado em mim, me
capacitado e possibilitado todos os meios necessários para a realização de todas as etapas do
projeto de mestrado. Agradeço também, pela paciência, pelo tempo dedicado, pela boa
vontade de sempre e pelas oportunidades que me deu de crescimento profissional.
viii
Ao Professor Dr. Paulo César L. Nogueira pela contribuição fundamental na parte química
deste trabalho e pela gentileza que sempre apresentou em esclarecer as minhas dúvidas.
Aos Docentes do PROCFIS pelo acolhimento, pelos ensinamentos e pela amizade. Em
especial aos Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior e ao Prof. Dr. Enilton Aparecido Camargo
pelo apoio em todos os momentos.
A Prof. Dra. Milena P. B. Soares pela parceria firmada e pelas importantes contribuições.
A Allan, Anny Caroline, Gabriella e Raissa, alunos de iniciação científica cuja ajuda durante a
execução dos experimentos foi fundamental. Obrigada pelo compromisso assumido e pelo
profissionalismo nos trabalhos realizados. Também agradeço a Diogo, Grace Anne,
Nanashara, Liu e todos os outros que contribuíram de alguma forma para a realização do
presente trabalho.
Aos colegas de mestrado por todas as experiências vivenciadas e compartilhadas, pelos
momentos de seriedade e também pelos momentos de diversão. Agradeço especialmente, a
Patrícia, Ana Carla, Robervan e Fabíula, por terem feito os meus dias em Aracaju mais
felizes. São amigos que ficarão para a vida inteira.
Aos funcionários “Galego” e Sr. Osvaldo responsáveis pelo Biotério Central da UFS e pelo
Biotério Seterial, do Departamento de Fisiologia, respectivamente, pelos cuidados com os
animais utilizados na parte in vivo do trabalho.
Aos professores Charles Estevam, Josemar Batista e Daniel Bezerra, bem como, as
professoras Cristiane Bani e Sandra Lauton pela participação nas bancas de qualificação e/ou
defesa da minha dissertação de mestrado.
A Universidade Federal de Sergipe-UFS e ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Fisiológicas – PROCFIS, por terem me possibilitado um ambiente de estudo e trabalho tão
acolhedor, por terem disponibilizado, na medida do possível, tudo o que foi necessário para
que as atividades do mestrado pudessem ser desenvolvidas com o máximo de êxito, como a
infraestrutura, o corpo docente, funcionários em geral e recursos financeiros.
ix
Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz (FIOCRUZ-Salvador-BA) e ao LETI – Laboratório
de Engenharia Tecidual e Imunologia, da referida instituição de pesquisa, por ter
disponibilizado o espaço, material de trabalho, profissionais e alunos, para a execução da
parte in vitro deste trabalho.
A FAPITEC-SE, a Capes/CNPq e a Fapesp pelo apoio financeiro, extremamente importante
para a realização do presente trabalho, em especial a FAPITEC-SE pela bolsa de mestrado
que me foi concedida.
x
“A humildade é o primeiro degrau da sabedoria.”
São Tomás de Aquino
xi
RESUMO
POTENCIAL ANTICÂNCER DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE), ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ, SÃO CRISTÓVÃO-SE, 2013.
As plantas medicinais são uma das mais importantes fontes de medicamentos para a indústria farmacêutica. Entre as plantas utilizadas na medicina popular no nordeste do Brasil, a Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae) é uma das mais tradicionais e tem sido usada para diversos propósitos. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo geral avaliar o potencial anticâncer do óleo essencial (OE) das folhas de L. gracilis em modelos experimentais in vitro e in vivo. O OE foi extraído por hidrodestilação e a análise química foi feita por CG/EM. Os efeitos citotóxicos do OE e dos seus componentes, timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno, foram avaliados em células tumorais das linhagens HepG2, B16-F10 e K562, bem como em células não-tumorais (PBMCs). O efeito do OE na proliferação celular e na indução de apoptose foram investigados nas células HepG2. Além disso, camundongos transplantados com células do tumor Sarcoma 180 foram usados para confirmar sua eficácia in vivo. Os resultados mostraram que o OE apresentou o timol como composto químico majoritário e demonstrou promissora citotoxidade contra todas as células tumorais testadas. Por outro lado, os seus componentes investigados, apresentaram efeito citotóxico pouco potente. Além disso, o tratamento com o OE acarretou parada do ciclo celular das células HepG2 na fase G1, acompanhada por indução de fragmentação do DNA, sem afetar a integridade da membrana. Morfologia celular consistente com apoptose e uma notável ativação de caspase-3, também foram observadas, sugerindo indução de morte celular por apoptose dependente de caspase. O estudo da atividade antitumoral in vivo mostrou inibição do crescimento tumoral com taxas de 38,5% – 41,9%. Assim, o OE apresentou o timol como principal constituinte e demonstrou significativa atividade antitumoral in vitro e in vivo. Os resultados obtidos sugerem que o OE das folhas de L. gracilis é um potencial recurso medicinal, que pode vir a ser empregado no tratamento do câncer.
Descritores: Lippia gracilis; óleo essencial, citotoxicidade, apoptose, antitumor
xii
ABSTRACT
ANTICANCER POTENTIAL OF LEAF ESSENTIAL OIL OF Lippia gracilis SCHAUER (VERBENACEAE), ROSANA PAULA CRUZ FERRAZ, SÃO CRISTÓVÃO-SE, 2013.
Medicinal plants are one of the most important sources of drugs used in the pharmaceutical industry. Among traditional medicinal plants of the Brazilian northeastern, Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae) had been used for several medicinal purposes. Therefore, the present study aimed to determine the chemical composition of the leaf essential oil (EO) of L. gracilis, as such to evaluate it in vitro and in vivo anticancer potential. For that, the leaf essential oil (EO) of L. gracilis was prepared using hydrodistillation followed by GC–MS analysis. The cytotoxic effects of EO and its components (thymol, p-cymene, γ-terpinene and myrcene) have been assessed in HepG2, K562 and B16-F10 tumor cells as such in non- tumoral (PBMC). The effects of EO on cell proliferation and apoptosis induction were investigated in HepG2 cells. Furthermore, mice bearing Sarcoma 180 tumor cells were used to confirm its in vivo effectiveness. The results showed that the EO composition was characterized by the presence of thymol as major constituent which exhibited promising cytotoxicity against the all tumor cells tested, whereas its investigated components presented low cytotoxic potential. Moreover, EO treatment caused G1 arrest in HepG2 cells accompanied by the induction of DNA fragmentation without affecting cell membrane integrity. Cell morphology consistent with apoptosis and a remarkable activation of caspase-3 were also observed, suggesting induction of caspase-dependent apoptotic cell death. In vivo antitumor study showed tumor growth inhibition rates of 38.5–41.9%. In conclusion, the EO, which has thymol as its major constituent, possesses significant in vitro and in vivo antitumor activity. These data suggest that leaf essential oil of L. gracilis is a potential medicinal resource, which may ultimately be used in cancer treatment. Key words: Lippia gracilis; essential oil; cytotoxicity; apoptosis; antitumor
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Checkpoints e ciclo celular………………...……………………………… 6
Figura 2 Fases do ciclo celular e sítios de atividade regulatória dos complexos
ciclinas-CDKs............................................................................................... 7
Figura 3 Ação dos agentes quimioterápicos antineoplásicos dependendo da fase do
ciclo celular................................................................................................... 9
Figura 4 Fotografia de um exemplar de Lippia gracilis Schauer……….................... 18
Figura 5 Estruturas químicas do timol (1), p-cimeno (2), γ-terpineno (3) e mirceno
(4)................................................................................................................. 36
Figura 6 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na viabilidade de células
HepG2, avaliada pelo método de exclusão do corante azul de tripan após
de 24 h de incubação..................................................................................... 38
Figura 7 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na morfologia das
células HepG2............................................................................................... 40
Figura 8 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na viabilidade de células
HepG2 após 24 h de incubação, avaliada por microscópio de
fluorescência usando os corantes brometo de étidio/laranja de
acridina.......................................................................................................... 41
Figura 9 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre a integridade da
membrana de células HepG2, avaliada por citometria de fluxo usando
iodeto de propídio......................................................................................... 42
Figura 10 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre a fragmentação do
DNA internucleossomal em células HepG2, avaliada por citometria de
fluxo usando iodeto de propídio e triton X-100...................................... 43
Figura 11 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre a ativação de
caspase-3 em células HepG2, após 24h de incubação, avaliada em ensaio
colorimétrico...............................................................................................
44
Figura 12 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre o crescimento
tumoral em camundongos transplantados com células do tumor Sarcoma
180............................................................................................................ 45
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de L. gracilis............ 35
Tabela 2 Atividade citotóxica do óleo essencial das folhas de L. gracilis e dos seus
constituintes (timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno) em células
tumorais e em células não-tumorais............................................................
37
Tabela 3 Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na distribuição do ciclo
celular após 24 h de incubação................................................................... 39
Tabela 4 Toxicidade sistêmica do óleo essencial das folhas de L. gracilis em
camundongos swiss transplantados com o tumor Sarcoma
180................................................................................................................
47
Tabela 5 Resumo dos resultados encontrados com relação à atividade citotóxica do
óleo essencial de L. gracilis e dos componentes timol, p-cimeno, γ-
terpineno e mirceno, bem como dos mecanismos de ação do
óleo...............................................................................................................
48
xv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANOVA Analisys of Variance (Análise de variância)
Asp Aspartato
BE/LA Brometo de etídio / laranja de acridina
CEPA Comitê de ética em Pesquisa com animais
CI50 Concentração inibitória média
CG Cromatografia em fase gasosa
CO2 Dióxido de carbono (gás carbônico)
ConA Concanavalina A
DMSO Dimetilsulfóxido
Dox Doxorrubicina
D.P.M. Desvio padrão da média
EM Espectrometria de massa
E.P.M. Erro padrão da média
5-FU 5-Fluourouracil
Glu Glutamato
H/E Hematoxilina/Eosina
IC Intervalo de confiança
IT Índice de inibição
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H brometo de tetrazolium
OE Óleo essencial
pNA Cromóforo p-nitroanilina
xvi
PBS Phosphate buffer solution (Tampão fosfato)
PBMCs Peripheral blood mononuclear cells (Células mononucleares de sangue
periférico)
RPMI Roswell park memorial institute-1640 (Meio completo)
rpm Rotações por minuto
Val Valina
xvii
SUMÁRIO
RESUMO………………………………………………………………………………... x
ABSTRACT……………………………………………………………………………... xi
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………... xii
LISTA DE TABELAS…………………………………………………………………... xiii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS................................................ xiv
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 2
1.1 Câncer........................................................................................................................ 2
1.2 Ciclo celular e Câncer............................................................................................... 5
1.3 Apoptose e Câncer.................................................................................................... 9
1.4 Produtos naturais na terapia anticâncer..................................................................... 12
1.5 Lippia gracilis Schauer............................................................................................. 16
2. OBJETIVOS............................................................................................................ 21
2.1 Objetivo geral............................................................................................................ 21
2.2 Objetivos específicos................................................................................................. 21
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 23
3.1 Materiais utilizados………………………………………………………………. 23
3.1.1 Reagentes, soluções e fármacos………………………………………............... 23
3.1.2 Equipamentos……………………………………………………………........... 23
3.1.3 Células………………………………………………………………………..... 24
3.1.3.1 Manutenção das células em cultura..................................................................... 24
3.1.3.2 Obtenção de células não-tumorais (PBMCs)………………………………….. 24
3.1.3.3 Manutenção do tumor Sarcoma 180 em camundongos....................................... 25
3.1.4 Animais……………………………………………………………………........ 25
3.1.5 Compostos puros………………………………………………………………. 26
3.1.6 Planta………………………………………………………………………....... 26
3.2 Procedimentos experimentais…………………………………………………….. 27
3.2.1 Obtenção e caracterização química do óleo essencial das folhas de Lippia
xviii
gracilis................................................................................................................. 27
3.2.2 Estudo da atividade citotóxica in vitro................................................................ 27
3.2.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais e em linfócitos humanos.... 27
3.2.2.2 Estudo do mecanismo de ação citotóxico do óleo essencial em células
HepG2........................................................................................................... 28
3.2.2.2.1 Viabilidade celular por exclusão do corante azul de tripan......................... 28
3.2.2.2.2 Distribuição do ciclo celular……………………………………………... 29
3.2.2.2.3 Análise morfológica - coloração diferencial por hematoxilina/eosina
(H/E).............................................................................................................. 29
3.2.2.2.4 Análise morfológica- brometo de etídio/laranja de acridina
(BE/LA)......................................................................................................... 29
3.2.2.2.5 Integridade da membrana celular………………………………………… 30
3.2.2.2.6 Ensaio de ativação de Caspase-3................................................................... 30
3.2.3 Estudo da atividade antitumoral in vivo............................................................... 31
3.2.3.1 Protocolo experimental……………………………………………………….. 31
3.2.4 Parâmetros toxicológicos……………………………………………………... 32
3.5 Análise estatística…………………………………………………………………. 32
4. RESULTADOS………………………………………………………………........ 34
4.1 Obtenção e caracterização química do óleo essencial das folhas de L. gracilis...... 34
4.2 Atividade citotóxica in vitro………………………………………………….......... 36
4.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxico do óleo essencial das folhas de L.
gracilis...................................................................................................................... 38
4.3.1 Viabilidade celular por exclusão do corante azul de tripan................................ 38
4.3.2 Análise do ciclo celular……………………………………………………….. 39
4.3.3 Análise morfológica em coloração diferencial por hematoxilina/eosina............ 40
4.3.4 Análise morfológica - brometo de etídio/laranja de acridina.............................. 41
4.3.5 Integridade da membrana e fragmentação do DNA internucleossomal por
iodeto de propídio................................................................................................ 42
4.3.6 Ativação de Caspase-3………………………………………………………... 44
4.4 Atividade antitumoral in vivo…………………………………………………… 45
4.4.1 Ánalise toxicológica…………………………………………………………... 46
4.5 Resumo dos resultados obtidos com o óleo essencial de L.gracilis................... 48
xix
5. DISCUSSÃO…………………………………………………………………….. 50
6. CONCLUSÃO…………………………………………………………………..... 56
REFERÊNCIAS…………................................................................................................. 57
APÊNDICE ……………………………………………………………………………… 71
APÊNDICE A: Artigo publicado...……………………………..………………………... 71
ANEXOS…………………………………………………………………………………. 73
ANEXO A: Declaração do Comitê de Ética e Pesquisa com Animais para a Manutenção
do Sarcoma 180………........................................................................................................ 73
ANEXO B: Declaração de aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa com Animais......... 74
INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER
O câncer é um conjunto de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de
células anormais, capazes de se espalharem e invadir tecidos e órgãos vizinhos. A proliferação
excessiva e autônoma das células acarreta a formação de massas anormais de tecido, na
prática, denominados tumores, que exercem um efeito extremamente lesivo sobre a saúde,
podendo acarretar a morte do hospedeiro (INCA, 2011a; American Cancer Society, 2013).
A carcinogênese envolve diversas etapas, mas tem início pela exposição celular a
agentes cancerígenos ou carcinogênicos capazes de induzir alterações no material genético
das células normais. O processo de malignização ocorre mediante a transformação de genes
específicos, denominados proto-oncogenes, que normalmente atuam no controle da divisão
celular, apoptose e diferenciação celular, em oncogenes, os quais são capazes de promover
modificações que determinam o caráter de malignidade às células neoplásicas (INCA, 2011a;
RANG et al., 2012).
No câncer, as modificações genéticas determinam o ganho de função dos oncogenes
no controle positivo do crescimento celular, enquanto que os genes com capacidade de
suprimir o crescimento tumoral passam a ter sua função inibida. Esse desequilíbrio favorece a
proliferação desordenada, acarretando o surgimento de neoplasias malignas, de modo geral,
dotadas de elevada agressividade (HANAHAN & WEINGERG, 2000).
Estudos realizados na última década têm demonstrado que os tumores malignos
funcionam como órgãos cuja complexidade pode até exceder a dos tecidos normais, tendo em
vista as particularidades das diferentes populações de células que os constituem e a influência
do microambiente estromal no qual estão inseridos para a tumorigênese (HANAHAN &
WEINGERG, 2011).
Por serem alteradas genética e morfologicamente, as células cancerígenas, apresentam
diversas características que as diferenciam das células normais. De acordo com Katzung,
(2010) elas podem apresentar antígenos de superfície do tipo fetal normal, e outros sinais de
imaturidade, bem como, anormalidades na quantidade e/ou na qualidade cromossômica,
incluindo translocações e sequências de genes amplificados.
Além disso, outras importantes características dos tumores malignos são à auto-
suficiência da sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade a inibidores do
3
crescimento, inibição da morte celular programada (apoptose), potencial replicativo ilimitado,
angiogênese, poder de invasão e capacidade de gerar metástase (HANAHAN & WEINGERG,
2000; HANAHAN & WEINGERG, 2011).
As metástases correspondem à migração das células tumorais do sítio de origem para
outros órgãos e tecidos do corpo. Os mecanismos celulares e moleculares envolvidos nesse
processo ainda não são totalmente esclarecidos, no entanto, estudos têm mostrado que uma
população de células-tronco tumorais parece ser responsável pelo processo. As células-tronco
do tumor compõem uma pequena subpopulação de células presentes no seu interior, que
apresentam a capacidade de sofrer ciclos repetidos de divisão, podendo migrar para locais
distantes do corpo e colonizar outros órgãos (Li et al., 2007; CROKER & ALLAN, 2008
SAMPIERI E FODDE, 2012).
Acredita-se que a disseminação ocorra com base nas seguintes etapas: invasão e
infiltração de tecidos subjacentes por células tumorais, tendo em vista a permeação de vasos
linfáticos e sanguíneos; liberação na circulação de células neoplásicas, isoladas ou em
pequenos grupos; sobrevivência das células na circulação; retenção destas nos leitos capilares
de órgãos distantes e seu extravasamento a partir dos vasos linfáticos ou sanguíneos, seguido
do desenvolvimento de novos tumores (INCA, 2006). A disseminação das células tumorais
depende das propriedades intrínsecas das células tumorais e das respostas do hospedeiro
(TALMADGE & FILDLER, 2010).
Mais de 100 diferentes tipos de câncer já foram identificados em distintas partes do
corpo. Nos países desenvolvidos predominam os casos de câncer de pulmão, mama, próstata e
cólon, enquanto que nos países em desenvolvimento destaca-se a ocorrência dos cânceres de
estômago, fígado, cavidade oral e colo de útero. No Brasil, o câncer de mama é o que mais
afeta as mulheres, e o câncer de próstata é o mais incidente em homens, quando não são
considerados os casos de câncer de pele do tipo não-melanoma, que é o mais incidente na
população brasileira (INCA, 2011b).
O tratamento do câncer envolve três principais abordagens terapêuticas, que são a
quimioterapia, a radioterapia e a excisão cirúrgica, porém outras modalidades como a
imunoterapia e a hormonioterapia também vem sendo bastante utilizadas na clínica (INCA,
2011a). Além disso, a American Cancer Society (2012) destaca a importância da terapia-alvo,
uma recente estratégia terapêutica que emergiu na década de 90 com os avanços tecnológicos
e o melhor conhecimento da biologia do câncer, visando atingir alvos moleculares
4
específicos, que atuam no controle da proliferação celular e nos mecanismos de morte celular,
especialmente por apoptose.
Atualmente, o uso de quimioterápicos anticâncer constitui uma das mais relevantes
modalidades terapêuticas empregadas na clínica oncológica. No entanto, por ser um tipo de
tratamento sistêmico, as drogas não são seletivas contra as células neoplásicas e agridem
também células normais, especialmente aquelas com grande capacidade de renovação, como
as da medula óssea, pêlos e mucosa gastrointestinal. Por isso, uma série de efeitos colaterais
está associada a essa modalidade terapêutica, a exemplo de alopecia, náuseas, diarreias e
mielossupressão. Porém, o nível de toxicidade e seletividade varia entre os fármacos
antineoplásicos (RANG et al, 2012; INCA, 2013).
É importante ressaltar que apesar dos esquemas terapêuticos serem individualizados,
na maior parte dos casos tem-se prevalecido o uso da chamada terapia combinada, em que
várias modalidades terapêuticas são utilizadas em associação, visando à obtenção de melhores
resultados. Dentre os objetivos da terapia anticâncer estão: proporcionar a cura, prolongar a
vida ativa e melhorar a qualidade de vida dos pacientes portadores da doença (INCA, 2011a).
Entretanto, apesar de todos os avanços científicos e terapêuticos na oncologia, e dos
elevados investimentos na área, o câncer é atualmente considerado um grave problema de
saúde pública mundial, uma vez que, os índices de mortalidade associados à doença são
considerados alarmantes. A Organização Mundial de Saúde – OMS mostrou que no ano de
2008 ocorreram 7,6 milhões de mortes em todo o mundo causadas pelo câncer, representando
cerca de 13% do total de mortes (WHO, 2011). As estimativas da OMS para o ano de 2030
apontam para 27 milhões de novos casos de câncer, 17 milhões de mortes por câncer e 75
milhões de indivíduos vivos com essa doença por ano (INCA, 2011b). Além disso, o aumento
percentual no número de novos casos será maior em países de baixa renda (82%) e de média-
baixa renda (70%) em comparação com os países de média-alta (58%) e alta renda (40%)
(WHO, 2010).
Nos Estados Unidos o câncer é a segunda maior causa de morte, superado apenas
pelas doenças cardíacas. As estimativas para o ano de 2013 apontam a ocorrência de
1.660.290 novos casos, bem como, para cerca de 580.350 mortes por câncer no país
(American Cancer Society, 2013).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2012, válidas também para 2013, indicam a
ocorrência de 518.510 novos casos de câncer incluindo os casos de câncer de pele do tipo
não-melanoma (representa 25% de todos os casos). É esperado um total de 257.870 casos
5
novos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo feminino. Confirma-se a estimativa que o
câncer da pele do tipo não-melanoma (134 mil casos novos) será o mais incidente na
população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (60 mil), mama feminina (53 mil),
cólon e reto (30 mil), pulmão (27 mil), estômago (20 mil) e colo do útero (18 mil) (INCA,
2011b).
1.2 CICLO CELULAR E CÂNCER
As bases moleculares do câncer são alvo de diversos estudos na área de oncologia e
muitos detalhes dos mecanismos envolvidos no processo de transformação de uma célula
normal em outra com características malignas, ainda não são totalmente compreendidos. No
entanto, se sabe que o câncer decorre do desajuste dos mecanismos que atuam no controle da
multiplicação e da morte celular, eventos cuja perfeita harmonia é necessária para a
manutenção da homeostase (VERMEULEN, BERNEMAN & BOCKSTAELE, 2003).
As células eucarióticas são capazes de sofrer ciclos de divisão, dando origem a
células-filhas idênticas. O conjunto ordenado de eventos que caracteriza o ciclo de divisão
celular é didaticamente dividido em duas fases: a interfase, período no qual as células
replicam seu material genético e sintetizam produtos necessários para a divisão e a mitose,
que constitui a divisão celular propriamente dita. Porém, tradicionalmente divide-se em quatro
fases sequenciais: intervalo G1, fase S ou de síntese do DNA, intervalo G2 e mitose (fase M)
(NORBURY & NURSE, 1992). Além disso, algumas células permanecem em um quinto
estágio denominado G0, ou período de quiescência, a partir do qual a célula pode
reversivelmente entrar ou não em G1, conforme os estímulos (GARRETT, 2001).
As duas etapas mais importantes do ciclo são a fase S, que se caracteriza pela
replicação do DNA celular e a fase M, a qual é composta por eventos que incluem o
alinhamento cromossômico, segregação de cromátides-irmãs e divisão do conteúdo celular
(McDONALD & EL-DEIRY, 2000). No início do ciclo, situa-se o intervalo G1, cujos eventos
característicos acarretam a preparação da célula para a duplicação do DNA, enquanto que o
intervalo G2 sucede a fase S e precede a fase M, de modo que, nesta fase, podem ser reparados
possíveis erros no DNA replicado, o que previne a propagação dos mesmos para as células-
filhas (SENDEROVICZ, 2002; SENDEROVICZ, 2004).
A passagem sequencial de uma fase para outra, ocorre apenas após rigorosos
mecanismos reguladores serem ativados em pontos estratégicos do ciclo chamados de “pontos
6
de verificação” ou “Checkpoints” (Figura 1). Os pontos de verificação ocorrem
predominantemente em G1, na transição G1/S, na transição G2/M e na mitose, na transição
metáfase/anáfase. A checagem é necessária para a verificação da integridade do genoma ao
longo do ciclo, bem como, para supervisionar a segregação das informações genéticas durante
a mitose (GARRETT, 2001; MEERAN & KATIYER, 2008; GALLORINI; CATALDI & DI
GIACOMO, 2012).
Figura 1: Checkpoints e ciclo celular. A figura representa as fases do ciclo de divisão celular, o intervalo G0, o intervalo G1, a fase S, o intervalo G2 e a mitose, além dos respectivos pontos de verificação (checkpoints) presentes em cada uma delas. Fonte: Adaptada de Garrett, 2001.
A regulação é exercida por diversas moléculas, dentre as quais se destacam as ciclinas,
as quinase dependentes de ciclinas - CDK e os inibidores das CDKs. A família das proteínas
quinases dependentes de ciclinas – CDKs são as principais reguladoras do ciclo. São enzimas
cuja atividade catalítica dependente da sua interação com as ciclinas, que são proteínas
reguladoras cujos níveis variam de acordo com o estágio do ciclo. Complexos ciclinas -
CDKs diferentes atuam em estágios específicos do ciclo, conforme pode ser observado na
Ponto de verificação
mitótico
Ponto de restrição em G1
Ponto de verificação de
danos no DNA em G2
Ponto de verificação de
danos no DNA na fase S
Ponto de verificação de
danos no DNA entre as
fases G1/S
7
Figura 2 (EKHOLM & REED, 2000; VERMEULEN, BERNEMAN & BOCKSTAELE,
2003; GALLORINI, CATALDI & DI GIACOMO, 2012).
Figura 2: Fases do ciclo celular e sítios de atividade regulatória dos complexos ciclinas-CDKs. Fonte: Vermeulen, Berneman e Bockstaele, 2003.
As CDKs atuam no controle positivo da proliferação mediante a fosforilação de
substratos necessários para a progressão do ciclo celular, a exemplo da proteína pRb
(retinoblastoma), expressa a partir do gene supressor de tumor Rb, cuja fosforilação induz a
progressão do ciclo a partir de G1 (MORGAN, 1997; SENDEROVICZ, 2002;
SENDEROVICZ, 2004).
Nas células de mamíferos a CDK1 é responsável pela regulação da mitose, enquanto
que as CDK2, CDK4 e a CDK6 constituem as principais CDKs ativadas durante a interfase.
Diversos sinais de crescimento atuam durante a fase G1 e induzem a expressão da ciclina D,
que forma complexos com as CDKs 4 e 6, os quais apresentam elevada afinidade pela pRb. A
ativação de pRb acarreta a liberação do fator transcricional E2F, que por sua vez, libera
8
fatores que induzem a expressão das ciclinas E e A, cuja atividade favorece a progressão do
ciclo (ENDERS, 2012).
Entretanto, outras proteínas exercem um controle inibitório sobre a progressão do ciclo
de divisão celular, como as duas famílias de proteínas inibidoras de CDKs, que são a família
INK4 composta pelas proteínas p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C e p19INK4D e a família
CIP/KIP cujos membros são a p21CIP1/WAF1, p27KIP1 e p57KIP2 (VIALLARD et al.,
2001). Estas moléculas atuam prevenindo ou limitando a fosforilação dos substratos-alvo
pelas CDKs (ABUKHDEIR & PARK, 2008).
Alterações na função dos complexos moleculares regulatórios tem um importante
papel no desenvolvimento do câncer (MEERAN & KATIYER, 2008; MORIN &
BELLAICHE, 2011; WARFEL & EL-DEIRY, 2013). Algumas dessas alterações são a
superexpressão de ciclinas e CDKs, mutações nessas proteínas, tornando-as resistentes à ação
dos inibidores, além da inativação de inibidores, por mutação, deleção ou metilação
(JOHNSON & WALKER, 1999). A desregulação das ciclinas do tipo D, mas
expressivamente, da ciclina D1 e a superativação das CDKs 4 e 6 são apontados como os
principais mecanismos documentados de ação oncogênica dessas proteínas (MUSGROVE et
al, 2011).
Por outro lado, a possibilidade de modular a progressão do ciclo de divisão celular
através de agentes terapêuticos tem sido importante no tratamento do câncer. O maior
conhecimento dos fatores bioquímicos e genéticos implicados na regulação do ciclo constitui
um aspecto essencial para definição de novos possíveis alvos terapêuticos (MALUMBRES,
2007).
Numerosas pesquisas têm buscado e demonstrado o potencial terapêutico de pequenas-
moléculas inibidoras de CDKs (CICENAS & VALIUS, 2011). No entanto, apesar dos
avançados estudos pré-clínicos relacionados ao desenvolvimento de agentes farmacológicos
inibidores de CDKs, nos ensaios clínicos ainda não foi atingida a eficácia esperada para esses
compostos (STONE, SUTHERLAND & MUSGROVE, 2012).
Vale ressaltar também, que algumas das mais importantes classes de quimioterápicos
antineoplásicos atuam durante o ciclo celular. Estes apresentam mecanismos de ação variados
e exibem especificidade em termos da fase do ciclo em que têm atividade (JOHNSON &
WALKER, 1999). Os fármacos que atuam exclusivamente contra células em proliferação são
classificados como ciclo celular específicos, enquanto aqueles cuja ação ocorre em pontos ou
fases determinadas, são considerados fase-específicos (INCA, 2013).
9
De modo geral, estes quimioterápicos induzem alterações no DNA celular e acabam
por determinar a parada do ciclo em momentos pré-determinados, seguida de morte celular
por apoptose (JOHNSON & WALKER, 1999; ALMEIDA et al., 2005). A Figura 3 mostra a
correlação aproximada das classes de quimioterápicos anticâncer mais comuns e a fase do
ciclo em que atuam.
Figura 3. Ação dos agentes quimioterápicos antineoplásicos dependendo da fase do ciclo celular. Fonte: Almeida et al., 2005.
1.3 APOPTOSE E CÂNCER
O termo apoptose foi utilizado primeiramente em 1972 por Kerr, Wyllie e Currie,
para denominar um tipo de morte celular programada com características morfológicas
distintas, que já havia sido previamente descrita em estudos histológicos realizados entre 1962
e 1964 (KERR, WILLIE e CURRIE, 1972; KERR, 2002).
A apoptose trata-se, portanto, de um tipo de morte celular que ocorre por um processo
coordenado e dependente de energia, envolvendo uma família de cisteína-proteases,
denominadas caspases e uma complexa cascata de eventos que tem inicio com o estímulo
deflagrador e termina com a morte celular. Os fatores desencadeadores desse mecanismo
envolvem estímulos e condições diversas, tanto fisiológicas, quanto patológicas (ELMORE,
2007).
10
É um mecanismo essencial para o desenvolvimento embrionário, funcionamento do
sistema imunológico e manutenção da homeostase dos tecidos nos organismos multicelulares
(KERR, WILLIE e CURRIE, 1972). Falhas na regulação da apoptose estão associadas ao
desenvolvimento de diversas patologias como o câncer, infarto agudo do miocárdio e doenças
neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, doença de Huntington, doença de
Parkinson e esclerose múltipla (SANTOS, 2011).
Uma sequência orquestrada de eventos bem definidos caracteriza a morte celular por
apoptose. Inicialmente, a célula diminui de tamanho e isso acarreta a perda da aderência com
a matriz extracelular e com os tecidos vizinhos. As organelas permanecem intactas, não
alterando sua morfologia. O núcleo se torna picnótico, ou seja, há condensação da cromatina e
esta se concentra em torno da membrana nuclear, que se mantém sem alterações.
Seguidamente, há a formação de blebbings, ou prolongamentos na membrana citoplasmática e
o núcleo desintegra-se. Estes aumentam de tamanho e número, englobam o conteúdo presente
no citoplasma, e se rompem, formando os corpos apoptóticos. Estes expressam ligantes que
facilitam o reconhecimento e a captação pelas células fagocitárias, não havendo, portanto,
extravasamento de conteúdo e reação inflamatória associada (KERR, WILLIE & CURRIE,
1972; ELMORE, 2007; GRIVICICH, REGNER & ROCHA, 2007; KUMMAR et al., 2010).
Um conjunto de proteínas catalíticas, as caspases, são as principais orquestradoras do
processo apoptótico. Pertencem à família das cisteína-proteases e suas atividades estão
relacionadas à capacidade de reconhecer e clivar os seus substratos nos resíduos de ácido
aspártico (DEGTEREV, BOYCE & YUAN, 2003; GRIVICICH, REGNER & ROCHA,
2007). Em humanos foram identificadas 12 subtipos de caspases, das quais sete parecem estar
diretamente envolvidas com a transdução dos sinais apoptóticos durante a morte celular
programada (WÜRSTLE, LAUSSMANN & REHM, 2012). De acordo com a função que
exercem na via apoptótica as caspases são classificadas em iniciadoras (2, 8, 9 e 10) e efetoras
(3, 6 e 7). As caspases iniciadoras transmitem o primeiro sinal apoptótico da cascata
proteolítica e as caspases efetoras são responsáveis pela clivagem dos substratos que
acarretam as alterações fisiológicas e morfológicas características da morte celular
programada. Ativam endonucleases e proteínas citoplasmáticas que degradam as proteínas
nucleares e citoesqueléticas (ELMORE, 2007; KUMMAR et al., 2010).
A apoptose pode ser desencadeada por duas vias principais, a via intrínseca ou
mitocondrial e a via extrínseca ou mediada por receptor de morte. (ELMORE, 2007;
MAREK, 2013).
11
A via intrínseca ou mitocondrial é ativada por sinais de estresse, capazes de alterar a
homeostase da mitocôndria. Os estímulos causam alterações na membrana interna desta
organela, com transição da permeabilidade e abertura de poros, além de perda do potencial
transmembrânico e liberação de proteínas apoptogênicas, como: o citocromo c, a AIF (fator
de indução de apoptose), a proteína Smac/DIABLO (segundo ativador de caspase derivado de
mitocôndria/proteína de ligação-IAP direta com baixo pl) e o Omi/HtrA2 ou endonuclease G
(SAELENS et al., 2004; FULDA & DEBATIN, 2006). Entretanto, o mecanismo mais
importante é o que envolve o citocromo c, pois este interage com a protease de ativação
apoptótica - Apaf-1 e com a pró-caspase-9, formando um complexo chamado apoptossomo, a
qual ativa a caspase-9, que seguidamente induz a ativação das caspases efetoras (OKADA,
2004; BRUIN & MEDEMA, 2008).
De acordo com Marek (2013), desordens na formação do apoptossomo têm relevante
importância na patogênese do câncer e na resistência à quimioterapia. No entanto, estudos tem
identificado compostos capazes de induzir ou de inibir a formação do apoptossomo, de modo
que, podem constituir importantes estratégias para o tratamento do câncer, bem como de
outras doenças que apresentam prolongamento do processo apoptótico.
A ativação da via intrínseca é regulada por membros pró e anti-apoptóticos da família
de proteínas Bcl-2. Essas proteínas são determinantes para o início ou a interrupção da morte
por apoptose por esta via, uma vez que, governam a permeabilidade da membrana
mitocondrial. Durante a morte celular por via intrínseca, os membros pró-apoptóticos
prevalecem, em detrimento aos não-apoptóticos (ELMORE, 2007).
A via de ativação extrínseca envolve receptores transmembrânicos, também chamados
receptores de morte, que pertencem à superfamília do gene do receptor do fator de necrose
tumoral – rTNF. Estes receptores apresentam um domínio extracelular, que se liga aos
ligantes específicos e um domínio intracelular chamado domínio de morte, que é responsável
pelo acoplamento do receptor de morte com a via das caspases. A ativação dos receptores de
morte resulta na rápida formação de um de um complexo intracelular de sinalização de morte
(DISC), que induz a ativação da via das caspases iniciadoras, que por sua vez, ativam as
capazes efetoras (ZIMMERMANN & GREEN, 2001; THONEL & ERIKSSON, 2005).
No entanto, alterações nos mecanismos apoptóticos estão implicadas na patogênese do
câncer. Uma série de falhas na maquinaria molecular envolvida nesse processo determina a
supressão da morte celular programada nas células malignas. Dentre os erros comumente
observados estão: modificações na expressão de proteínas da família Bcl-2, marcadas pela
12
superexpressão de membros anti-apoptóticos e pela baixa expressão e perda funcional de
proteínas pró-apoptóticas, como o Bax e o Bak; redução da expressão de receptores de morte,
a exemplo do receptor FasR que está reduzido em alguns tipos de cânceres, como o carcinoma
de colo do útero; superexpressão da proteína cFLIC (anti-apoptótica) e mutações no gene da
proteína p53, um fator de ativação transcricional para membros pró-apoptóticos da família
Bcl-2 (BRUIN & MEDEMA, 2008).
O fato das células malignas apresentarem resistência à morte celular por apoptose
constitui um dos aspectos etiológicos envolvidos na patogênese da doença (HANAHAN &
WEINGERG, 2011). No entanto, a capacidade de interferir nos mecanismos apoptóticos e
induzir a morte das células cancerígenas, constitui uma alternativa importante na terapêutica
da doença. Assim, a maior parte das estratégias anticâncer utilizadas clinicamente, incluindo a
quimioterapia, têm suas ações relacionadas à ativação das vias de sinalização envolvidas na
apoptose (FULDA & DEBATIN, 2006).
Logo, a apoptose como alvo-terapêutico para o tratamento do câncer tem sido
extensivamente estudada e os conhecimentos mais detalhados das vias moleculares
implicadas nesse processo tem possibilitado o desenvolvimento de estratégias mais diretas de
intervenção. Algumas das alternativas se baseiam em promover a morte celular programada
através do uso de fármacos orgânicos clássicos que interferem na ativação das caspases, bem
como no uso de agentes biológicos recombinantes e no bloqueio de genes com
oligonucleotídeos antisense para a proteína Bcl-2 (NICHOLSON, 2000). Outras importantes
estratégias descritas são o desenvolvimento de pequenas moléculas que tem como alvo
membros da família Bcl-2, as IAPs (proteínas inibidoras de apoptose) e ligantes dos
receptores da família do fator de necrose tumoral (TRAIL) cujos estudos encontram-se em
fase I / II (LHEUREUX , LE MOULEC, 2011).
1.4 PRODUTOS NATURAIS NA TERAPIA ANTICÂNCER
A natureza é uma importante fonte para a descoberta de novos agentes terapêuticos,
uma vez que possui uma ampla variedade de compostos químicos distribuídos em milhares de
espécies de animais, vegetais, organismos marinhos e microorganismos (ROCHA, LOPES E
SCHWARTSMANN, 2001).
O uso popular de produtos extraídos da natureza para o tratamento de doenças
acompanha o homem ao longo da sua história. No entanto, apesar de ser uma prática muito
13
antiga, os primeiros registros escritos de substâncias derivadas de plantas com propriedades
medicinais datam de aproximadamente 2600 a.C. e têm origem mesopotâmica. Dentre as
substâncias descritas estavam óleos de espécies de cedro (Cedrus sp., Pináceas), cipreste
(Cupressus sempervirens L., Cupressaceae), alcaçuz (Glycyrrhiza glabra L., Fabaceae) e
papoula (Papaver somniferum L., Papaveraceae), todos utilizados ainda hoje para o
tratamento de enfermidades como tosses, resfriados, infecções parasitárias e inflamações
(NEWMAN et al., 2000; CRAGG & NEWMAN, 2002; CRAGG & NEWMAN, 2013).
Com o advento da química a partir do século XVIII diversos compostos orgânicos
foram isolados de produtos naturais, bem como, foram realizadas as primeiras sínteses. No
entanto, a introdução dos métodos cromatográficos e espectrométricos na fitoquímica,
facilitou a identificação de moléculas e a elucidação de estruturas químicas complexas, a
partir de menores amostras de material e com maior eficiência (PINTO et al., 2002).
Assim, uma grande quantidade de novas moléculas obtidas das diversas fontes
naturais, têm sido identificadas e introduzidas na indústria farmacêutica. Dados publicados
recentemente mostram que, de todos os novos medicamentos introduzidos no mercado,
também referidos como “novas entidades químicas”, no período de 01/1981 a 12/2010, 66%
são considerados formalmente sintéticos. No entanto, 17% destas moléculas sintéticas contêm
grupos farmacofóricos derivados diretamente de produtos naturais e 14% são modelados a
partir de produtos naturais, de modo que, apenas cerca de 36% podem ser considerados
totalmente sintéticos (NEWMAN & CRAGG, 2012; CRAGG & NEWMAN, 2013).
Sabe-se, no entanto, que as plantas são as principais fontes de novos medicamentos,
tendo em vista a ampla e diversificada variedade de compostos orgânicos, denominados
metabólitos secundários, que são capazes de sintetizar (COTREAU, KUTCHAN & LEWIS,
2000). Estes representam cerca de 1% de todas as moléculas contendo átomos de carbono da
natureza e seu potencial etno-botânico-farmacológico acumulado ao longo das gerações tem
sido fundamental para o desenvolvimento de novos fármacos (BOURGAUD et al., 2001;
VERPOORT & MARASCHIN, 2001).
Segundo Newman (2003) os medicamentos derivados de produtos naturais são
capazes de tratar 87% de todas as enfermidades categorizadas, dentre elas as classificadas
como antibacterianas, anticoagulantes, antiparasitárias, imunossupressoras e anticancerígenas.
Diversos medicamentos derivados de produtos naturais são usados para o tratamento
do câncer. Entre 01/1981 e 12/2010 foram introduzidas no mercado 173 novas moléculas
14
anticâncer e destas, 75% são derivadas ou inspiradas em produtos naturais (NEWMAN &
CRAGG, 2012; CRAGG & NEWMAN, 2013).
Estes fármacos ocupam um importante espaço na indústria de medicamentos e
movimentam cerca de 50 bilhões de dólares anualmente. Em 2002, apenas dois grupos de
quimioterápicos de origem natural, os taxanos e os derivados da camptotecina, movimentaram
aproximadamente 3 bilhões de dólares (PINTO et al., 2002; BRANDÃO et al., 2010).
Quatro classes de quimioterápicos anticâncer derivados de plantas se destacam: os
alcaloides da vinca, vimblastina (Velban®) e a vincristina (Oncovin®) e os análogos vindesina
(Eldisine®) e vinorelbina (Navelbine®); os taxanos, paclitaxel (Taxol®) e o análogo docetaxel
(Taxotere®); a podofilotoxina e os análogos, etoposídeo (Etopophos®) e tenoposídeo
(Vumon®); e a camptotecina e os análogos, topotecano (Hycamtin®) e irinotecano
(Camptosar®) (CRAGG & NEWMAN, 2000; PINTO et al., 2002).
Os chamados alcalóides da vinca, vimblastina e vincristina, são compostos isolados da
espécie Catharantus roseus (L.) G. Don (Apocinaceae), popularmente conhecida como vinca
e a vindesina e vinorelbina são derivados semi-sintéticos. Essa classe de fármacos atua através
da interação com proteínas chamadas tubulinas, mais especificamente às β-tubulinas, inibindo
a polimerização dos microtúbulos, o que induz parada do ciclo celular na metáfase durante a
mitose. Os microtúbulos são estruturas que exercem um importante papel na formação do
citoesqueleto e do fuso mitótico durante a divisão celular, sendo, portanto, alvos relevantes
para a terapia anticâncer. Os alcalóides da vinca tem sido utilizados para o tratamento de
linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e testículos e leucemia linfoblástica
(ROWINSKY, 2003; BRANDÃO et al., 2010).
Outra classe de quimioterápicos que interage com os microtúbulos para exercer sua
atividade, são os taxanos. O paclitaxel foi isolado em 1962 a partir de extratos da casca da
árvore Taxus brevifolia Nutt. (Taxaceae), uma fonte finita do composto, e isso constituiu um
grande problema com relação a sua utilização como fármaco anticâncer. No entanto, a
descoberta de um composto, a 10-desacetilbaccatina III, a partir das folhas da espécie Taxus
baccata , proporcionou a sua conversão no paclitaxel e no seu análogo docetaxel
(KINGSTON, 2000; ROCHA, LOPES & SCHWARTSMANN, 2001; BRANDÃO et al.,
2010). Além disso, em 2010 foi aprovado nos Estados Unidos (EUA) um terceiro taxano, o
cabazitaxel (Jevtana®) (CRAGG & NEWMAN, 2013).
Os taxanos promovem a estabilização dos microtúbulos e assim, inibem a
despolimerização dos mesmos, provocando a morte celular (CRAGG & NEWMAN, 2002;
15
BALUNAS & KINGHORN, 2005; CRAGG & NEWMAN, 2013). São ativos contra os
cânceres de mama, ovário, pulmão, gastroesofágico, próstata, bexiga e cabeça e pescoço
(KATZUNG, 2010).
A captotecina é um alcalóide extraído de uma árvore ornamental chinesa, a
Camptotheca acuminata Decne. (Cornaceae), e seus derivados semi-sintéticos, o irinotecano e
topotecano, agem promovendo a inibição da enzima topoisomerase I (BALUNAS &
KINGHORN, 2005; BRANDÃO et al., 2010).
O uso clínico do topotecano está indicado para o tratamento do câncer de ovário
avançado e para o câncer de pulmão de pequenas células. Já o irinotecano é utilizado para o
tratamento do carcinoma colorretal metastático (KATZUNG, 2010; RANG et al., 2012).
Já a podofilotoxina é uma resina isolada da Podophyllum peltatum L. (Berberidaceae)
e é a base para seus derivados semi-sintéticos etoposídeo e teniposídeo. O mecanismo de ação
desta substância está ligado à inibição irreversível da enzima topoisomerase II, induzindo o
bloqueio do ciclo celular antes da mitose, no final da fase S ou durante o intervalo G2
(BALUNAS & KINGHORN, 2005; BRANDÃO et al., 2010; RANG et al., 2012).
O etoposídeo tem sido utilizado clinicamente no tratamento do câncer de células
germinativas, tumores pulmonares de pequenas células e de não-pequenas células, nos
linfomas do tipo Hodgkin e não-Hodgkin e no câncer gástrico. O tenoposídeo possui atividade
contra diversos linfomas (CRAGG & NEWMAN, 2005; KATZUNG, 2010; BRANDÃO et
al., 2010).
Outra importante fonte de moléculas anticâncer têm sido os microorganismos. Os
fármacos derivados dessa fonte são categorizados como antibióticos antitumorais e estão entre
os principais grupos de quimioterápicos antineoplásicos, incluindo, entre outras, a bleomicina
(Blenoxane®), a mitomicina C (Mutamycin®) e as antraciclinas, como a daunorrubicina
(Daunoblastina®) e doxorrubicina (Adriamycin®). Os mecanismos de ação implicados na
atividade destes fármacos estão relacionados à ligação das moléculas entre bases específicas
do DNA, bloqueando a síntese de RNA, DNA ou de ambos, acarretando a ruptura dos
filamentos e interferindo na replicação (KATZUNG, 2010; CRAGG & NEWMAN, 2013).
Além disso, moléculas ativas obtidas de organismos marinhos estão sendo muito
estudadas. Diversos compostos com propriedades anticâncer derivados destas fontes já foram
identificados e encontram-se em fases avançadas de triagem para possível incorporação à
clínica. Destacam-se a halicondrina B, briostatina 1, citarabina, dolastatina 10, aplidina,
discodermolina, criptoticina e a ecteinascidina 743. Esta última foi aprovada em setembro de
16
2007, na Europa e EUA para o tratamento do sarcoma de tecidos moles, com o nome
comercial de Yondelis®. No ano de 2009 foi aprovada a sua utilização para o tratamento de
câncer de ovário nos EUA (ROCHA, LOPES & SCHWARTSMANN, 2001; CRAGG &
NEWMAN, 2013).
No Brasil, diversos grupos de pesquisadores atuam na busca de novos agentes com
potencial terapêutico para o tratamento do câncer a partir de produtos naturais, especialmente
de plantas. Isto se justifica pelo fato do país apresentar a maior biodiversidade do planeta e
abrigar cerca de 22% das espécies de plantas superiores, sendo grande parte delas endêmicas
(ELISABETSKY & COSTA-CAMPOS, 1996). Além disso, a utilização de plantas
medicinais é culturalmente muito difundida no país, inclusive para o tratamento do câncer.
Um dos biomas brasileiros cuja triagem de compostos de plantas endêmicas que tem
apresentado surpreendente número de moléculas ativas contra o câncer, é a caatinga.
Numerosos estudos relatam atividade citotóxica significativa de diversas espécies utilizadas
pela medicina popular dessa região, como Tabebuia avellandae que foi o primeiro extrato
com atividade antitumoral comprovada experimentalmente (MORAES et al., 1997; PESSOA
et al., 2006).
No entanto, é importante destacar que embora sejam significativos os avanços
tecnológicos e investimentos voltados para a triagem de novos compostos bioativos, menos de
10% de todas as plantas superiores foram estudadas com relação ao seu potencial anticâncer
(ZHANG, 2002; PESSOA et al., 2006).
1.5 LIPPIA GRACILIS SCHAUER (VERBENACEAE)
A família Verbenaceae é composta por cerca de 36 gêneros e 1000 espécies
distribuídas mundialmente, mas predominantemente nas regiões tropicais e subtropicais. O
Brasil abriga aproximadamente 17 gêneros e 250 espécies dessa família (SANTOS et al.,
2009). Em número de espécies se destacam os gêneros: Verbena, Lippia, Citharexylum,
Stachytarpheta, Glandularia e Duranta (GOMES, 2009).
O gênero Lippia é o segundo maior da família Verbenaceae, possuindo
aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores, que estão distribuídas
pela América Central e do Sul (TERBANCHÉ et al., 1996; PASCUAL et al., 2001; GOMES,
2009). No Brasil, são encontradas cerca de 120 espécies de Lippia , especialmente distribuídas
no Cerrado e na Caatinga (GOMES, 2009). A maior quantidade de espécies desse gênero é
17
encontrada na Cadeia do Espinhaço, localizada nos estados de Minas Gerais, Bahia e Goiás
(OLIVEIRA et al., 2007).
Segundo Pascual et al.,(2001) as plantas do gênero Lippia tem sido amplamente
utilizadas na medicina popular, para o tratamento de diversos tipos de doenças, sendo mais
comum o uso nas patologias relacionadas ao sistema respiratório, como gripes, resfriados,
bronquite, tosse e asma. No entanto, outros usos são no tratamento de distúrbios
gastrointestinais, a exemplo de indigestão e dores estomacais, doenças hepáticas, doenças
cutâneas e algumas doenças sexualmente transmissíveis, como a sífilis e gonorreia.
Uma das espécies mais popularmente utilizada na região nordeste do Brasil com
finalidades medicinais é a Lippia gracilis (Figura 4), uma planta aromática, típica da região
semiárida, conhecida popularmente como alecrim da chapada, alecrim de serrote ou ainda,
candeia de queimar. Caracteriza-se como um arbusto com altura entre 1 - 2,5 metros, bastante
ramificado, com flores brancas e folhas pequenas (GOMES, 2009; SANTOS et al., 2009).
No Brasil, pode ser encontrado nas regiões norte, nordeste, centro-oeste e sudeste,
especialmente em matas de encosta, na caatinga e cerrado, em solos arenosos e afloramentos
rochosos (SANTOS et al., 2009). No nordeste é encontrada predominantemente nos estados
de Sergipe, Bahia e Piauí (LORENZI & MATOS, 2008).
O uso popular dessa espécie de Lippia tem sido reportado para o tratamento de
doenças cutâneas, queimaduras, feridas, úlceras, gripes, tosses, sinusite, bronquite, congestão
nasal, dores de cabeça, icterícia e até para a paralisia (PASCUAL et al., 2001;
ALBUQUERQUE et al., 2007). Suas folhas são comumente preparadas por infusão ou
decocção e usadas como chás. Além de também ser usada como um macerado em álcool para
a aplicação tópica (AGRA et al., 2007; LORENZI & MATOS, 2008).
Numerosos estudos têm sido realizados com o objetivo de elucidar as características
farmacológicas desta planta. Grande parte deles destina-se a avaliação das propriedades
terapêuticas do óleo essencial extraído da planta, especialmente das suas folhas. Os óleos
essenciais são naturalmente produzidos pelas plantas aromáticas e constituem uma mistura
complexa de metabólitos secundários. Diversos efeitos farmacológicos já foram atribuídos a
distintos óleos essenciais (BAKKALI et al., 2008).
18
Figura 4. Fotografia de um exemplar de Lippia gracilis Schauer Fotografado por: P.C.L. NOGUEIRA
Sendo assim, Pessoa et al., (2005); Albuquerque et al., (2006); Oliveira et al.; (2008)
e Bitu et al., (2012) demonstraram, em seus estudos, que o óleo essencial das folhas de L.
gracilis apresenta potente atividade antimicrobiana contra diversas bactérias e fungos. Os
efeitos anti-inflamatório e antinoceptivo do óleo essencial também já foram bem elucidados
(MENDES et al., 2010; GUILHON et al., 2011). Resultados semelhantes foram obtidos para
o extrato metanólico de L. gracilis (GUIMARÃES et al., 2011). Além disso, potente atividade
larvicida e inseticida do óleo essencial também foram verificadas, inclusive com relação ao
19
Aedes aegypti, vetor da dengue e febre amarela (PEREIRA et al., 2008; SILVA et al., 2008;
CRUZ et al., 2013).
Somado a isso, recente publicação do nosso grupo de pesquisa mostrou que o óleo
essencial das folhas de L. gracilis apresenta potente atividade citotóxica (CI50 < 30 µg/ml),
quando testado in vitro contra quatro linhagens de células tumorais humanas (RIBEIRO et al.,
2012).
Considerando-se que estes resultados sugerem um possível efeito anticâncer para esse
óleo e diante da necessidade de novas substâncias ativas contra o câncer, este trabalho teve
por objetivo avaliar o potencial anticâncer do óleo essencial das folhas de Lippia gracilis
através de estudos in vitro, bem como em um modelo de experimentação in vivo, utilizando o
tumor Sarcoma 180.
20
OBJETIVOS
21
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial anticâncer do óleo essencial
(OE) das folhas de Lippia gracilis Schauer (Verbenaceae), em modelos experimentais in vitro
e in vivo.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar quimicamente o OE de L. gracilis;
Avaliar a atividade citotóxica do OE de L. gracilis e de alguns dos seus principais
constituintes (timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno) frente a células tumorais e não-
tumorais (PBMCs);
Avaliar o mecanismo de ação citotóxico do OE de L. gracilis em células HepG2:
o Avaliar o efeito do OE sobre a viabilidade celular por exclusão do corante azul
de tripan;
o Avaliar o efeito do OE sobre o ciclo celular;
o Avaliar o efeito do OE sobre a morfologia das células coradas com H/E;
o Avaliar o efeito do OE sobre a morfologia das células coradas com BE/LA;
o Avaliar o efeito do OE sobre a integridade da membrana celular;
o Avaliar o efeito do OE sobre a ativação de caspase-3;
Avaliar o efeito do OE sobre o crescimento tumoral em animais transplantados com o
tumor Sarcoma 180;
Avaliar o efeito do OE sobre parâmetros toxicológicos de animais transplantados com
o tumor Sarcoma 180.
22
MATERIAL E MÉTODOS
23
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS UTILIZADOS
3.1.1 Reagentes, soluções e fármacos
Brometo de etídio (EB, Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA);
Concanavalina A (ConA, Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA);
Coquetel líquido de cintilação hidex maxilight (PerkinElmer Life Sciences, Groningen,
GE, Holanda);
Dimetilsulfóxido (DMSO, LGC Biotechnology, São Paulo, SP, Brasil);
Doxorrubicina (doxorubicin hydrochloride, Eurofarma, São Paulo, SP);
Ficoll-Paque plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suécia);
5-Fluoruoracil (5-FU, Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA)
Gentamicina (Novafarma, Anápolis, GO, Brasil);
Iodeto de propídio (BioSource, EUA);
Kit colorimétrico Caspase-3/CPP32 (BioVision Incorporated, CA, EUA);
Laranja de acridina (LA, Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA);
L-glutamina (Vetec Química Fina, Duque de Caxias, RJ, Brasil);
Metil-[3H]-timidina (PerkinElmer, EUA);
Roswell park memorial institute-1640 (RPMI-1640, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD,
EUA), meio suplementado com 10% de soro bovino fetal (Cultilab, Campinas, SP,
Brasil);
Solução de tripsina/ EDTA (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EUA);
Timol (pureza ≥99.5%), p-cimeno (pureza 99%), γ-terpineno (pureza ≥97.0%) and
mirceno (pureza ≥90%) (Figura 5) todos obtidos a partir do Sigma Chemical Co. St
Louis, MO, EUA);
Triton X-100 (Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA).
3.1.2 Equipamentos
Aparato tipo clevenger (Amitel, São Paulo, Brasil);
Coletor de células (Brandel, Inc. Gaithersburg, MD, EUA);
24
Contador de Placas multilabel CHAMELEON V (Mustionkatu 2, TURKU, Finlândia)
com software MikroWin Hidex 2000 v. 4.38 (Microtek Laborsysteme GmbH,
Overath, Alemanha);
Citômetro FACSCalibur (Bencton Dickinson, San Diego, CA, EUA) com software
CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA);
Microscópio de luz (Olympus BX41, Toquio, Japão) acoplado ao software Image-pro
express (Media Cybernetics, Inc. Silver Spring, EUA);
Microscópio de fluorescência (Olympus BX41, Tóquio, Japão).
3.1.3 Células
3.1.3.1 Manutenção das células em cultura
Para a determinação da citotoxicidade foram utilizadas células tumorais das linhagens
HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), K562 (leucemia mielocítica crônica) e B16-F10
(melanoma murino), todas doadas pelo Hospital A.C. Camargo, São Paulo, Brasil. As células
foram mantidas em RPMI-1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-
glutamina e 50 µg/ml de gentamicina. Todas as linhagens celulares foram cultivadas em
garrafas de cultura e alojadas em estufa, a 37°com 5% de CO2 e subcultivadas por 3-4 dias
para obter crescimento exponencial. O crescimento celular foi acompanhado diariamente,
através da observação das culturas em microscópio invertido. A troca do meio foi feita sempre
que o crescimento celular atingia confluência necessária para renovação de nutrientes. O
processo de manutenção do cultivo das células aderentes foi realizado por meio do uso de
tripsina/EDTA (0,25%) visando o desprendimento das células das paredes das garrafas de
cultivo (PESSOA, 2000). Os experimentos de citotoxicidade foram realizados com células em
fase exponencial de crescimento. Para os demais protocolos experimentais utilizou-se apenas
células da linhagem HepG2 cultivadas nas mesmas condições expressas acima.
3.1.3.2 Obtenção de células não-tumorais (PBMCs)
As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram obtidas a partir de
amostras de sangue de voluntários saudáveis, não tabagistas e que não fizeram uso de
qualquer tipo de droga nos 15 dias que antecederam o experimento. A coleta de sangue foi
25
feita nas dependências do LETI (Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunologia) da
Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) - Salvador/Bahia, por profissionais capacitados para a
função. O sangue foi coletado em frascos heparinizados, utilizando-se seringas esterilizadas e
descartáveis com volume de 5 ml. As células mononucleares foram isoladas seguindo o
protocolo de separação por gradiente de densidade em Ficoll.
O isolamento das PBMCs foi realizado a partir de uma amostra de 3 ml de sangue,
acrescida de 5 ml de PBS. As etapas até o isolamento incluíram a adição de 3 ml de Ficoll,
seguida por 30 minutos de centrifugação a 1.000 rpm. Em seguida, foi realizada a aspiração
das PBMCs, presentes na região intermediária entre as hemácias e o plasma. A suspensão das
PBMCs foi transferida para outro tubo, onde se acrescentou PBS até o volume de 11 ml. O
material foi centrifugado por 20 minutos a 1.000 rpm.
As PBMCs foram lavadas e ressuspendidas a concentração de 0,3 x 106 células/ml em
RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino, 2 mM de glutamina e 50 µg/ml de
gentamicina, e mantidas a 37°C com 5% CO2. A ConA (10 µg/ml) foi adicionada após o
plaqueamento das células e foi usada como mitógeno para ativar o processo mitótico em
linfócitos T. Depois de 24 h em cultura estas células foram tratadas com as drogas testes
(BERTHOL, 1981; BROWN & LAWCE, 1997).
3.1.3.3 Manutenção do tumor Sarcoma 180 em camundongos
Os animais doadores foram anestesiados com éter etílico e eutanasiados por meio de
deslocamento cervical. Realizou-se o procedimento asséptico com álcool iodado e, em
seguida, coletou-se o líquido ascítico da cavidade abdominal dos animais, tendo sido
preparada uma suspensão de células com 5,0 ml de ringer lactato e 0,5 ml do líquido ascítico,
para posterior contagem das células. Os animais receptores foram inoculados com 2 x 106
células/0,5 ml na região intraperitoneal. Este procedimento foi realizado a cada 10 dias,
conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas com Animais da Universidade Federal
de Sergipe (CEPA), sob o protocolo de número 34/2010.
3.1.4 Animais
Foram utilizados 36 camundongos Swiss, machos, adultos, saudáveis e não submetidos
anteriormente a nenhum processo experimental, pesando entre (25-30g), provenientes do
Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe, Brasil.
26
Os animais foram alojados dentro de caixas de polipropileno fechadas com grades
metálicas apropriadas, em pequenos grupos, não excedendo 15 animais por caixa. Manteve-se
no local a temperatura de 22°C ± 3°C, além de iluminação artificial, com ciclos de claro e
escuro 12:12 h (luz a partir das 6 h da manhã). Os animais tiveram livre acesso a alimentação
(ração especifica) e água.
A dor e o sofrimento dos animais no decurso dos ensaios foram minimizados. Os
animais que mostraram sinais intensos e persistentes de dor e sofrimento foram sacrificados
por intervenção humana. Estes sinais incluíram: agressividade anormal, reação anormal à
manipulação, movimentos anormais, indução de auto-trauma, feridas abertas ou ulceração da
pele, dificuldades respiratórias, fraturas ósseas, dificuldade de movimentação, alteração da
aparência externa, desidratação, perda de peso ou emagrecimento rápido ou grave
sangramento - OECD (2000), de acordo com os princípios éticos de experimentação animal
da SBCAL (Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório). O Comitê de Ética
em Pesquisas com Animais da UFS aprovou o projeto submetido para a realização desse
trabalho, sob o protocolo de número 60/2010.
3.1.5 Compostos puros
O timol (pureza ≥99.5%), p-cimeno (pureza 99%), γ-terpineno (pureza ≥97.0%) e o
mirceno (pureza ≥90%) foram todos obtidos da Sigma Chemical Co. St Louis, MO, EUA.
3.1.6 Planta
As folhas da L. gracilis foram coletadas nas proximidades da “Serra da Guia”
[coordenadas: 09°58’09”S, 37°51’52”O], Poço Redondo, Estado de Sergipe, em novembro de
2006. As amostras foram identificadas de acordo com o protocolo padrão (MORI et al.,
1989), sendo depositadas no herbário da Universidade Federal de Sergipe, sob o número
18740. A espécie foi identificada pelo Dr. Raymond Mervyn Harley, Royal Botanic Gardens,
Kew, Inglaterra.
27
3.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
3.2.1 Obtenção e caracterização química do óleo essencial das folhas de Lippia gracilis
As folhas frescas da planta (50 g) foram submetidas à hidrodestilação por 2 h usando
um aparato do tipo clevenger (SANTOS et al., 2004). O OE obtido foi seco com sulfato de
sódio anídrico e a porcentagem do conteúdo foi calculada com base no peso seco do material
da planta. O OE foi armazenado a – 4oC em um frasco de vidro hermeticamente fechado, até
as análises químicas serem realizadas. A extração foi realizada em triplicata.
As análises químicas foram realizadas por Cromatografia em fase
gasosa/Espectrometria de massa (CG/EM), utilizando um Shimadzu QP5050A CG/EM
equipado com um auto-injetor AOC-20i. Uma coluna DB-5MS (30 m X 0,25 mm X 0,25
espessura de filme), revestida com 5% de fenil e 95% de metilpolissiloxano, foi utilizada
como fase estacionária. O hélio foi o gás de transporte com taxa de fluxo 1,0 ml/minutos. A
temperatura foi programada para 40oC/4 minutos, subindo para 220oC a 4oC/minutos, e em
seguida aqueceu-se a 240oC a 20oC/minutos. Os espectros de massa foram feitos em 70 eV
com um intervalo de varredura de 0,5s e fragmentos de 40-350 Da.
Os índices de retenção foram obtidos por co-injeção da amostra de óleo com uma
mistura de hidrocarboneto linear C8-C18 (VAN DEN DOOL & KRATZ, 1963). Os
compostos voláteis foram analisados por CG/EM, e a identificação foi feita comparando os
índices de retenção e o espetro de massa com outros dados da literatura (ADAMS, 2007),
bem como pela correspondência do espectro de massa adquirido com aqueles armazenados
nas bibliotecas NIST e Wiley e outros espectros de massa publicados. A composição
percentual de cada componente foi determinada dividindo-se a área do componente, pela
área total de todos os compostos isolados, sob estas condições e sem correção de fator de
resposta.
3.2.2 Estudo da atividade citotóxica in vitro
3.2.2.1 Ensaio de citotoxicidade em células tumorais e em linfócitos humanos
A proliferação celular foi quantificada através do ensaio de incorporação da metil-
[3H]-timidina, conforme descrito por Griffiths & Sundaram (2011) com algumas poucas
28
adaptações. A metil-[3H]-timidina é um precursor de DNA marcado radioativamente que é
incorporado ao DNA durante a fase de síntese do ciclo celular, de modo que a quantidade de
metil-[3H]-timidina incorporada é um indicativo direto da taxa de proliferação. Para todos os
experimentos, 100 μl de uma solução de células (0,7 x 105 células/ml para as células aderentes
ou 0,3 × 106 células/ml para as células em suspensão) foram semeadas em placas de 96 poços.
Depois de 24h, as drogas dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), nas concentrações de
1,56 – 50 μg/ml foram adicionadas em cada poço e incubadas por 72 h. A doxorrubicina foi
utilizada como controle positivo. Seis horas antes do término do tempo de incubação, 1 µCi
de metil-[3H]-timidina foi adicionado em cada poço. Depois deste período, as culturas foram
coletadas, usando um coletor de células Filtermate 196, para posterior determinação da
incorporação da metil-[3H]-timidina usando um coquetel líquido de cintilação Hidex
Maxiligth e um contador de placas multilabel CHAMELEON V acoplado ao software
MikroWin Hidex 2000 v. 4.38. O efeito das drogas foi quantificado como a porcentagem da
radiatividade em relação ao controle.
3.2.2.2 Estudo do mecanismo de ação citotóxico do óleo essencial em células HepG2
Para todos os experimentos realizados com finalidade de elucidar os mecanismos
envolvidos na ação citotóxica do óleo essencial, foram utilizadas células HepG2, plaqueadas a
uma densidade de 0,7 x 105 células/ml e incubadas por overnight para permitir que as células
aderissem a superfície da placa. Em seguida, as células foram tratadas por 24 h com o OE nas
concentrações finais de 2,5 e 5,0 µg/ml. O controle negativo foi tratado com o veículo
(DMSO 0,1%) usado para diluir a droga-teste. A doxorrubicina foi usada como controle
positivo.
3.2.2.2.1 Viabilidade celular por exclusão do corante azul de tripan
A viabilidade celular foi avaliada por meio do teste de exclusão do corante azul de
tripan, uma vez que essa substância permite a quantificação e diferenciação entre células
vivas (viáveis) e mortas (não-viáveis). O azul de tripan penetra em ambos os tipos de células,
mas somente as células viáveis conseguem expulsá-lo do seu interior, e, portanto, apenas as
células não-viáveis adquirem coloração azulada.
29
As células HepG2 foram plaqueadas e tratadas ou não, com o OE. Após 24 h de
incubação, o número de células viáveis foi mensurado através da câmara de Neubauer.
3.2.2.2.2 Distribuição do ciclo celular
A interrupção do ciclo de divisão celular constitui um importante mecanismo de ação
de diversos medicamentos antineoplásicos, uma vez que causam parada do ciclo de divisão
celular e interrompem a proliferação. Sendo assim, para este ensaio as células foram coletadas
a partir das placas de cultura e receberam uma solução contendo triton X-100 0,1%, utilizado
para promover a permeabilização das células e o corante fluorescente, iodeto de propídio (2
µg/ml), que é um marcador do material genético celular (NICOLETTI et al., 1991). A
fluorescência foi determinada por citometria de fluxo em um citômetro FACSCalibur com
software CellQuest. Dez mil eventos foram analisados por experimento e os debris foram
omitidos para as análises.
3.2.2.2.3 Análise morfológica - coloração diferencial por hematoxilina/eosina (H/E)
Os corantes hematoxilina e eosina coram diferentemente o núcleo e o citoplasma das
células, respectivamente, o que ocorre devido as diferentes propriedades químicas existentes
entre eles. A hematoxilina é um corante básico com elevada afinidade pelas proteínas
nucleares, conferindo uma coloração azul para essa região, enquanto que a eosina tem
características ácidas e tende a se ligar a componentes do citoplasma, corando-o em tons de
rósea. A coloração por esses corantes possibilita a realização de análises morfológicas e a
identificação de alterações nas estruturas observadas.
Nesse estudo, as células em suspensão foram coletadas a partir da cultura e
transferidas para lâminas de centrifugação, sendo posteriormente fixadas com metanol por 30
segundos e coradas com hematoxilina e eosina. As características morfológicas foram
examinadas por microscópio óptico, usando o Image-Pro Express software.
3.2.2.2.4 Análise morfológica - brometo de etídio/laranja de acridina (BE/LA)
Este método de análise morfológica possibilita a diferenciação das células em três
categorias: viáveis, apoptóticas e necróticas. O laranja de acridina consegue atravessar
30
membranas íntegras e ligar-se ao DNA, conferindo uma coloração esverdeada para a região
do núcleo de células viáveis. Além disso, também marca as células que se encontram na fase
inicial da apoptose, de modo que são observadas manchas verdes nos núcleos das células,
marcando a cromatina condensada. Entretanto, o brometo de etídio atravessa apenas
membranas não íntegras e coram preferencialmente células necróticas, que são visualizadas
em uma cor laranja-avermelhada (BEZERRA, 2005).
Assim, as células foram coletadas e ressuspendidas em 25 µl de salina. Em seguida,1
µl da solução aquosa do brometo de etídio e do laranja de acridina (BE/LA 100 µg/ml) foram
adicionados e as células foram observadas através de microscópio de fluorescência. Trezentas
células foram contadas por lâmina e classificadas como viáveis, apoptóticas ou necróticas
(MCGAHON et al., 1995).
3.2.2.2.5 Integridade da membrana celular
A integridade da membrana celular foi avaliada por exclusão do iodeto de propídio,
que é um corante fluorescente que penetra apenas em células cuja membrana plasmática não
se apresente íntegra. A fluorescência foi determinada por citometria de fluxo, conforme
descrito para a análise do ciclo celular.
3.2.2.2.6 Ensaio de Ativação de Caspase-3
A ativação de caspase-3 nas células tratadas foi avaliada através do kit colorimétrico
caspase-3/CPP32, que tem como base a detecção do cromóforo p-nitroanilina (pNA), após a
clivagem dos resíduos de Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-pNA. As células foram lisadas pela
incubação com tampão de lise no gelo por 10 minutos e centrifugadas a 10.000 rpm por
1minuto. Para cada reação de mistura, 50 µl de lisado de células (100–200 µg de proteína
total) foi adicionado. As reações enzimáticas foram realizadas em uma microplaca de 96
poços de fundo plano. A leitura foi feita por espectrofotometria no comprimento de onda de
405 nm.
31
3.2.3 Estudo da atividade antitumoral in vivo
A avaliação da atividade antitumoral in vivo foi realizada utilizando o tumor
experimental Sarcoma 180, oriundo do Laboratório de Oncologia Experimental/LOE, da
Universidade Federal do Ceará.
Esse tumor foi identificado primeiramente em 1914 no Crocker Laboratory (Columbia
University, New York) e é originalmente um tumor sólido, que surgiu de forma espontânea na
região axilar de um camundongo. Inicialmente, foi classificado como carcinoma mamário,
mas em 1919 após vários transplantes subcutâneos, assumiu a forma sarcomatosa.
É mantido na forma ascítica em camundongos swiss a cada 10 dias e as células
tumorais podem ser transplantadas por inoculação subcutânea, intramuscular ou
intraperitoneal e apresenta um rápido índice de crescimento em 90 a 100% dos animais
inoculados, com uma taxa de regressão natural de 8 a 10% (ZUCKERBERG, 1973). Além
disso, uma característica importante desse tumor é que ele não gera metástases (KURASHIGE
& MITSUHASHI, 1982).
3.2.3.1 Protocolo experimental
Os animais doadores foram eutanasiados por deslocamento cervical e foi realizada
assepsia do local de coleta das células tumorais. Em seguida, foi retirado o líquido ascítico da
cavidade abdominal, tendo sido preparado uma suspensão de células com 5,0 ml de ringer
lactato e 0,5 ml do líquido ascítico, para posterior contagem de células (BEZERRA et al.,
2006).
Seguidamente, os animais receptores foram inoculados por via subcutânea com 2 x 106
células/0,5ml/camundongo, na região axilar esquerda. Vinte e quatro horas após a inoculação
iniciou-se o tratamento, por via intraperitoneal, por 7 dias consecutivos. No oitavo dia, os
animais foram anestesiados com éter etílico e seu sangue periférico foi coletado através do
plexo orbital para análise hematológica. Logo depois, os animais foram eutanasiados por
deslocamento cervical e os tumores, rins, fígados e baços retirados para pesagem. Além disso,
todos os animais foram pesados no início e no final do tratamento (BEZERRA et al., 2008;
BRITTO et al., 2012).
Nesse experimento, os animais foram subdivididos em quatro grupos experimentais,
sendo um grupo controle negativo (n = 12), os quais foram tratados com o veículo
32
(dimetilsulfóxido - DMSO 5%), um grupo controle positivo (n = 8), tratado com o 5-
fluourouracil (5-FU) na dose de 25 mg/kg/dia, e dois grupos (n = 8/cada) tratados com o OE,
nas doses de 40 mg/kg/dia e 80 mg/kg/dia, respectivamente.
O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula: IT
(%) = [(A-B)/A] x 100, onde: A = média dos pesos dos tumores no grupo controle e B =
média dos pesos dos tumores nos animais tratados.
3.2.4 Parâmetros toxicológicos
A avaliação da toxicidade sistêmica associada ao tratamento foi realizada com base
nos seguintes aspectos:
1. Diferença de peso dos animais antes do início e ao final do tratamento;
2. Alteração na massa bruta dos órgãos retirados (fígado, baço e rim), normalizada
para cada 100g de peso dos animais, realizada por comparação entre os grupos
tratados e o controle negativo,
3. Contagem total e diferencial de leucócitos (linfócitos, neutrófilos, monócitos e
eosinófilos), por microscopia óptica.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para todos os experimentos os dados foram expressos pela média ± E.P.M., com
exceção da citotoxicidade in vitro, cujos resultados foram apresentados pelos valores de CI50
(concentração inibitória média), dentro de um intervalo de confiança de 95%, obtidos por
regressão não-linear. As diferenças entre os grupos experimentais foram comparadas pela
análise de variância de uma via (ANOVA), seguida do teste Newman-Keuls, considerando (p
< 0,05). Todas as análises foram realizadas através do programa GRAPHPAD Prism (Intuitive
Software for Science, San Diego, CA, EUA).
33
RESULTADOS
34
4. RESULTADOS
4.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE L.
GRACILIS
O OE foi obtido por hidrodestilação, apresentando coloração amarelo-pálida e
rendimento de 4% (massa/volume). Foram identificados 35 compostos, que são
predominantemente pertencentes à classe dos monoterpenos (95,76%). Os compostos
majoritários identificados foram timol (55,50%), p-cimeno (10,80%), timol metil-éter
(10,53%), γ-terpineno (5,53%), mirceno (4,03%) e timol acetato (3,30%). Entretanto, o
carvacrol representou apenas 0,20% da composição total do óleo e (E)-cariofileno (1,43%).
Os componentes químicos e suas respectivas proporções na composição do OE estão
apresentados na tabela 1.
35
Tabela 1. Constituintes químicos do óleo essencial das folhas de L. gracilis
aIR = índices de retenção na coluna DB-5MS calculado de acordo com Van Den Dool and Kratz (1963); b IR = índices de retenção de acordo com Adams (2007). c Dados apresentados como a média ± D.P.M. a partir de três análises. dIR = índex de retenção de acordo com Tret'yakov (2008). tr = traço (valor médio < 0,10%).
IRa IRb Componentes % área de picoc
1 884 880 3-metil-3-buten-1-ol acetato tr 2 924 924 α-tujeno 1,23 ± 0,12 3 930 932 α-pineno 0,40 ± 0,00 4 973 974 β-pineno tr 5 988 988 mirceno 4,03 ± 0,29 6 1003 1002 α-felandreno 0,10 ± 0,00 7 1005 1008 δ-3-careno 0,27 ± 0,06 8 1014 1014 α-terpineno 1,47 ± 0,15 9 1022 1020 p-cymeno 10,80 ± 1,35 10 1026 1024 limoneno 0,57 ± 0,06 11 1035 1032 (Z)-β-ocimeno 0,20 ± 0,00 12 1045 1044 (E)-β-ocimeno 0,20 ± 0,00 13 1056 1054 γ-terpineno 5,53 ± 0,57 14 1067 1065 cis-sabinene hydrato tr 15 1082 1086 terpinoleno 0,10 ± 0,00 16 1097 1095 linalol 0,13 ± 0,06 17 1169 1167 umbelulona 0,30 ± 0,18 18 1176 1174 terpinen-4-ol 0,90 ± 0,00 19 1226 1232 timol metil éter 10,53 ± 1,40 20 1290 1289 timol 55,50 ± 4,21 21 1294 1298 carvacrol 0,20 ± 0,00 22 1343 1349 timol acetato 3,30 ± 0,44 23 1362 1369 ciclosativeno 0,20 ± 0,00 24 1369 1374 α-copaeno 0,10 ± 0,00 25 1377 1376 (E)-metil cinamato 0,30 ± 0,10 26 1416 1417 (E)-cariofileno 1,43 ± 0,06 27 1435 1439 aromadendreno 0,20 ± 0,00 28 1452 1452 α-humuleno 0,20 ± 0,00 29 1469 1469d 2,6-dimetoxiacetofenona 0,23 ± 0,06 30 1487 1496 viridifloreno 0,20 ± 0,00 31 1491 1500 biciclogermacreno 0,17 ± 0,06 32 1504 1505 β-bisaboleno 0,27 ± 0,06 33 1511 1511 δ-amorfeno tr 34 1578 1582 Óxido de cariofileno 0,20 ± 0,00 35 1581 1590 globulol 0,10 ± 0,01
TOTAL 99,36
36
4.2 ATIVIDADE CITOTÓXICA IN VITRO
A citotoxicidade foi avaliada utilizando três diferentes linhagens de células tumorais,
que foram tratadas com concentrações crescentes do OE e dos seus constituintes timol (1), p-
cimeno (2), γ-terpineno (3) e mirceno (4) (Figura 5), por 72h e analisados através do ensaio de
incorporação da metil-[3H]-timidina. Os resultados foram expressos pelos valores de CI50
obtidos, conforme apresentado na tabela 2.
O OE apresentou valores de CI50 de 4,93 e 22,92 µg/ml para as linhagens HepG2 e
K562, respectivamente. Entre os constituintes avaliados o mirceno apresentou valores de CI50
entre 9,23 e 12,27 µg/ml para as linhagens HepG2 e B16-F10, respectivamente, de modo que,
quando comparado aos demais compostos investigados, foi o que apresentou melhor atividade
citotóxica. O timol, o p-cimeno e o γ-terpineno mostraram atividade citotóxica apenas para a
linhagem B16-F10, com valores de CI50 de 18,23 µg/ml, 20,06 µg/ml e 9,28 µg/ml,
respectivamente. A doxorrubicina usada como controle positivo, apresentou valores de CI50
entre 0,03 e 2,92 µg/ml para as linhagens B16-F10 e K562, respectivamente. Além disso,para
avaliar a seletividade citotóxica do OE e dos seus compostos, foram utilizadas células não-
tumorais (linfócitos humanos). Os resultados apresentados na tabela 2 mostram que o OE
também foi citotóxico nessas células (CI50 = 16,64 µg/ml), enquanto que nenhum dos seus
constituintes testados apresentou citotoxicidade nas concentrações testadas (CI50 > 25 µg/ml).
Figura 5. Estruturas químicas do timol (1), p-cimeno (2), γ-terpineno (3) e mirceno (4).
Timol (1) p-Cimeno (2)
γ-Terpineno (3) Mirceno(4)
37
Tabela 2. Atividade citotóxica do óleo essencial das folhas de L. gracilis e dos seus constituintes (timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno) em células tumorais e em células não-tumorais.
Os dados estão expressos pelos valores de CI50 (µg/ml), no intervalo de confiança de 95%, obtido por regressão não-linear, a partir de dois experimentos realizados em duplicata ou triplicata, pelo método de incorporação da metil[3H]timidina após 72 h de incubação. A doxorrubicina foi usada como controle positivo. N.d = não determinado.
Células Histotipo OE Timol p-Cimeno γ-Terpineno Mirceno Doxorrubicina
HepG2 Carcinoma
hepatocelular
4,93
(3,09 – 7,85) >25 >25 >25
9,23
(4,03 – 21,11)
0,62
(0,46 – 0,83)
K562 Leucemia
mielóide crônica
22,92
(19,17 – 27,41) N.d N.d N.d N.d
2,92
(2,28 – 3,73)
B16-F10 Melanoma 7,01
(2,63 – 18,73)
18,23
(13,87 – 23,95)
20,06
(10,47 – 38,41)
9,28
(7,38 – 11,68)
12,27
(5,13 – 29,37)
0,03
(0,01 – 0,09)
PBMCs Linfócitos
humanos
16,64
(7,42 – 37,32) >25 >25 >25 >25
4,17
(3,19 – 5,46)
38
4.3 ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO CITOTÓXICO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE
L. GRACILIS
Uma vez que as células da linhagem HepG2 foram as mais sensíveis à atividade
citotóxica do OE, outros estudos in vitro visando avaliar o efeito do óleo sobre a proliferação
celular e na indução de apoptose, foram realizados nesta linhagem. As concentrações do óleo
essencial testadas foram de 2,5 µg/ml e 5 µg/ml, definidas de acordo com os valores de CI50
para essa linhagem que foi de 4,93 µg/ml.
4.3.1 Viabilidade celular por exclusão do corante azul de tripan
O OE reduziu significativamente (p < 0,05) a viabilidade das células HepG2, após 24h
de incubação. A doxorrubicina que foi usada como controle positivo, também reduziu a
proliferação de modo significativo.
Figura 6. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na viabilidade de células HepG2, avaliada pelo método de exclusão do corante azul de tripan após de 24 h de incubação. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo. Os dados estão apresentados como a média ± E.P.M. a partir de dois ou três experimentos realizados em duplicata. *p < 0,05 comparado ao controle negativo por ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
Controle Dox 2,5 5,00
5
10
15
20
25
30
35
40
**
*
Óleo essencial
(g/ml)
Núm
ero
de c
élul
as(x
104 c
el/m
l)
39
4.3.2 Análise do ciclo celular
Os resultados referentes aos efeitos do OE na distribuição do ciclo celular mostraram
que o número total de células na fase G1 aumentou, indicando interrupção do ciclo celular
durante esta fase. A porcentagem de células em G1 foi de 62,49% nas células tratadas com o
controle negativo (DMSO 0,1%), enquanto que nas células tratadas com o OE esta
porcentagem aumentou significativamente (p < 0,05), alcançando 72,08% na concentração de
2,5 µg/ml e de 74,61% na concentração de 5 µg/ml. Além disso, na análise dos dados, todo o
DNA com tamanho subdiplóide (fase sub-G1) foi considerado como DNA fragmentado, de
modo que, foi observado um aumento significativo da fragmentação do DNA
internucleossomal nos grupos tratatos com o OE (p < 0,05).
O efeito da doxorrubicina, usada como controle positivo, sobre o ciclo celular indicou
aumento significativo do número de células no intervalo G2/M. Os resultados estão
apresentados na tabela 3.
Tabela 3. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na distribuição do ciclo celular após 24 h de incubação
Os dados estão apresentados como a média ± E.P.M. a partir de dois experimentos independentes realizados em duplicata. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina foi usada como controle positivo. Dez mil eventos foram analisados em cada experimento. * p < 0,05 comparado ao controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
Drogas Concentração
(µg/ml)
Fases do ciclo celular (%)
G1 S G2/M
Controle - 62,49 ± 2,12 10,76 ± 1,57 17,63 ± 1,86
Doxorrubicina 1 39,31 ± 5,06* 9,64 ± 1,73 54,07 ± 7,90*
OELG 2,5 72,08 ± 1,10* 9,23 ± 1,32 13,26 ± 0,88
5,0 74,61 ± 1,31* 8,87 ± 0,85 12,48 ± 0,78
40
4.3.3 Análise morfológica em coloração diferencial por hematoxilina/eosina
As alterações morfológicas foram investigadas usando os corantes hematoxilina e
eosina. Na presença de 5 µg/ml do OE, as células apresentaram morfologia consistente com
apoptose, incluindo redução do volume, condensação da cromatina, fragmentação do núcleo
condensado e formação de corpos apoptóticos. No entanto, na menor concentração 2,5 µg/ml
do óleo, não foram observadas. A figura 7 evidencia estas alterações.
Figura 7. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na morfologia das células HepG2. As células foram coradas com hematoxilina-eosina e foram analisadas por microscópio óptico após 24 h de incubação com o óleo essencial nas concentrações de 2,5 (C) e 5 µg/ml (D). O controle negativo (A) foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo (B). As setas pretas apontam para a cromatina condensada ou fragmentação do DNA no núcleo.
25 µm
DMSO 0,1% DOX
OE 2,5 µg/ml OE 5 µg/ml
41
4.3.4 Análise morfológica - brometo de etídio/laranja de acridina
A morfologia das células também foi investigada através do uso dos corantes brometo
de etídio e laranja de acridina (BE/LA), em microscópio de fluorescência, onde a
porcentagem de células viáveis, apoptóticas e necróticas foi calculada. Após 24h de
exposição, o tratamento com OE induziu um aumento significativo do número de células
apoptóticas na concentração de 5 µg/ml (p < 0,05). As células tratadas com a doxorrubicina,
usada como controle positivo, também apresentaram consistência morfológica de apoptose.
Controle Dox 2,5 5,00
10
20
80
90
100
Óleo essencial
**
*
*
(g/ml)
Viáveis Apoptose Necrose
Núm
ero
de c
élul
as (
%)
Figura 8. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis na viabilidade de células HepG2 após 24 h de incubação, analisada por microscópio de fluorescência usando os corantes brometo de étidio/ laranja de acridina. As barras brancas representam as células viáveis, as barras cinza as células apoptóticas e as barras pretas células em necrose. Os dados estão expressos como a média ± E.P.M. de dois ou três experimentos independentes realizados em duplicata. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo. Dez mil eventos foram analisados em cada experimento. * p < 0,05 comparado ao controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
42
4.3.5 Integridade da membrana e fragmentação do DNA internucleossomal por iodeto
de propídio
O OE não foi capaz de modificar a integridade da membrana em nenhuma das
concentrações testadas. Porém, a fragmentação do DNA aumentou significativamente nas
células tratadas (p < 0,05). Ambas as modificações são compatíveis com as alterações
características de células apoptóticas. As figuras 9 e 10 mostram os resultados acima
descritos.
Controle Dox 2,5 5,00
20
40
60
80
100
Óleo essencial
g/ml
Inte
grid
ade
da m
embr
ana
celu
lar(
%)
Figura 9. Efeito do oléo essencial das folhas de L. gracilis sobre a integridade da membrana de células HepG2, avaliada por citometria de fluxo usando iodeto de propídio. Os dados estão apresentados como a média ± E.P.M. a partir de dois ou três experimentos independentes realizados em duplicata. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo. Dez mil eventos foram analisados em cada experimento. Os dados foram comparados por ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
43
Controle Dox 2,5 5,00
5
10
15
20
*
Óleo essencial
(g/ml)
*
*
Fra
gmen
taçã
o do
DN
Ain
tern
ucle
osso
mal
(%)
Figura 10. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre a fragmentação do DNA internucleossomal em células HepG2, avaliadas por citometria de fluxo usando iodeto de propídio e triton X-100. Os dados estão apresentados como a média ± E.P.M. a partir de dois ou três experimentos independentes realizados em duplicata. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo. Dez mil eventos foram analisados em cada experimento. *p < 0,05 comparado ao controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
44
4.3.6 Ativação de caspase-3
Observou-se uma significativa ativação de caspase-3 no lisado das células HepG2
tratadas com o OE, em ambas as concentrações testadas, 2,5 e 5 µg/ml. A doxorrubicina,
usada como controle positivo, também mostrou mecanismo de indução de morte celular por
apoptose (p < 0,05).
Controle Dox 2,5 5,00.0
0.2
0.4
0.6
Óleo essencial
* *
*
(g/ml)
Ativ
ação
de
casp
ase
3(O
D 4
05nm
)
Figura 11. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre a ativação de caspase-3 em células HepG2 após 24 h de incubação, avaliada em ensaio colorimétrico. Os dados estão apresentados como a média ± E.P.M. a partir de dois ou três experimentos independentes realizados em duplicata. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 0,1%) usado para diluir a substância teste. A doxorrubicina (1 g/ml) foi usada como controle positivo. * p < 0,05 comparado ao controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
45
4.4 ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO
A atividade antitumoral in vivo do OE foi investigada em camundongos swiss
transplantados com células do tumor experimental Sarcoma 180. Esses animais foram tratados
uma vez ao dia por 7 dias consecutivos com o OE, por via intraperitoneal. Os efeitos do OE
sobre o crescimento tumoral estão apresentados na figura 12.
No oitavo dia, a média do peso dos tumores do grupo controle foi de 1.99 ± 0.17 g. Na
presença do óleo nas doses de 40 e 80 mg/kg/dia, a média dos pesos dos tumores foram 1,22 ±
0,19 e 1,16 ± 0,10 g, respectivamente. O percentual de inibição do crescimento tumoral para
ambos os grupos, respectivamente, foi de 38,5% e 41,9%. A inibição foi significativa para
ambas as doses, quando comparados ao controle negativo (p < 0,05). O 5-FU reduziu o peso
do tumor em 69,7% na dose de 25 mg/kg/dia.
Controle 5-FU 40 800.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0
20
40
60
80
100
Peso do tumor Inibição
(mg/kg/dia)Óleo essencial
*
**
Pes
o do
tum
or (
g) Inibição (%)
Figura 12. Efeito do óleo essencial das folhas de L. gracilis sobre o crescimento tumoral em camundongos transplantados com células do tumor Sarcoma 180. O gráfico mostra o peso dos tumores (g) e o percentual de inibição do crescimento tumoral. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 5%), usado para diluir a substância teste. O 5-Fluorouracil (5-FU) foi usado como controle positivo na dose de 25 mg/kg/dia. Os dados estão expressos pelos valores da média ± E.P.M. de 8-12 animals. * p < 0,05 comparado com o grupo controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
46
4.4.1 Análise toxicológica
A toxicidade sistêmica do OE foi avaliada com base nos seguintes aspectos: perda de
peso, alterações no peso dos órgãos (fígado, baço e rim) e através da contagem total e
diferencial dos leucócitos. Não foram detectadas alterações significativas nos camundongos
tratados com o OE, para nenhum dos parâmetros analisados. Em contraste, o 5-FU, usado
como controle positivo, diminuiu significativamente o peso corporal e o peso do baço dos
animais tratados (p < 0,05). Todos os dados estão apresentados na tabela 4.
47
Tabela 4. Toxicidade sistêmica do óleo essencial das folhas de L. gracilis em camundongos swiss transplantados com o tumor Sarcoma 180.
Os camundongos foram inoculados com (2.0 × 106 células/animal, s.c.). Os animais foram tratados por via intraperitoneal por 7 dias, começando um dia após a implantação do tumor. O 5-FU (25mg/kg/dia) foi usado como controle positivo. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO 5%), usado para diluir a substância teste. Os dados estão expressos pelos valores da média ± E.P.M. * p < 0,05 comparando com o grupo controle negativo pela ANOVA de uma via, seguida do teste Newman-Keuls.
Parâmetros Tratamentos
DMSO 5% 5-FU Óleo essencial (mg/kg/dia)
40 80
variação do peso corporal (g) 2,58 ± 0,77 -0,87 ± 0,69* 0,55 ± 1,08 1,30 ± 0,71
fígado (g/100g de peso corpóreo) 6,57 ± 0,42 5,17 ± 0,27 5,70 ± 0,48 5,25 ± 0,42
baço (g/100g de peso corpóreo) 0,70 ± 0,01 0,40 ± 0,05* 0,58 ± 0,05 0,60 ± 0,05
rim (g/100g de peso corpóreo) 1,51 ± 0,09 1,48 ± 0,07 1,53 ± 0,09 1,58 ± 0,09
leucócitos totais (x103 cels/µl) 10,9 ± 0,96 6,72 ± 0,84 14,5 ± 1,99 9,84 ± 1,67
neutrófilos (%) 38,6 25,8 45,2 34,6
linfócitos (%) 52,4 68,2 48,4 60,4
eosinófilos (%) 1,00 1,80 0,80 0,40
monócitos (%) 8,00 4,20 5,60 4,60
48
4.5 Resumo dos resultados obtidos com o óleo essencial de L. gracilis Tabela 5. Resumo dos resultados encontrados com relação à atividade citotóxica do óleo essencial de L. gracilis e dos componentes timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno, bem como dos mecanismos de ação do óleo.
ESTUDO RESULTADOS
1. Estudo da atividade citotóxica sobre células
tumorais e PBMC
1.1 Efeito citotóxico do OE Potente
1.2 Efeito citotóxico do timol, p-cimeno, γ-terpineno e
mirceno
Pouco potente
2. Estudo dos mecanismos de ação citotóxicos do OE
em célular HepG2
2.1 Efeito sobre a viabilidade celular Reduziu o número de
células viáveis
2.2 Efeito sobre o ciclo celular Parada em G1
2.3 Análise morfológica Compatível com
morte celular por
apoptose
2.4 Fragmentação do DNA internucleossomal Aumentada
2.5 Integridade da membrana Preservada
2.6 Ativação de caspase-3 Aumentada
3. Estudo antitumoral in vivo (Sarcoma 180) Inibição do
crescimento tumoral
3.1 Toxicologia sistêmica
3.1.1 Aspectos hematológicos Não alterados
3.1.2 Peso dos animais tratados e dos órgãos (fígado,
rim e baço)
Não alterados
49
DISCUSSÃO
50
5. DISCUSSÃO
O presente trabalho investigou as propriedades fitoquímicas e citotóxicas do OE da L.
gracilis. A caracterização química do óleo foi feita por CG/EM e o potencial citotóxico do OE
e de quatro dos seus principais componentes (timol, p-cimeno, γ-terpineno e mirceno) foi
avaliado em células de três linhagens tumorais e em células não-tumorais (PBMCs). Os
efeitos do OE na proliferação e na indução de apoptose foi investigado em células HepG2.
Para confirmar a eficácia in vivo da atividade antitumoral desse óleo, a inibição do
crescimento tumoral foi avaliada em camundongos transplantados com células do tumor
experimental Sarcoma 180.
Na análise química do OE foram identificados 35 compostos, sendo a maior parte
deles monoterpenos (95,76%). Estudos prévios de caracterização química do OE da L.
gracilis realizados nos estados de Pernambuco, Ceará e Bahia, reportam a ocorrência
majoritária de monoterpenos na sua composição, principalmente do p-cimeno, γ-terpineno e
variadas concentrações de carvacrol e timol, como principais componentes (PESSOA et al.,
2005; SILVA et al., 2008; NEVES et al., 2008; MENDES et al., 2010; TELES et al., 2010).
Entretanto, devido ao elevado percentual de timol (55,50%) e a presença de outros
componentes como o p-cimeno (10,80%), timol metil éter (10,53%), γ-terpineno (5,53%),
mirceno (4,03%) e o timol acetato (3,30%), a composição química desta espécie é diferente de
outras coletadas em Sergipe e em outras localidades brasileiras (PESSOA et al., 2005; SILVA
et al., 2008; NEVES et al., 2008; MENDES et al., 2010; TELES et al., 2010). Vale ressaltar,
que o timol foi referido como composto majoritário nos estudos de Teles et al. (2010) e
Mendes et al. (2010), porém em proporções bem inferiores, variando entre 24% e 32,68%
respectivamente. Por outro lado, os trabalhos de Pessoa et al. (2005); Silva, et al. (2008);
Neto et al. (2010); Guilhon et al. (2011) apontam o carvacrol como composto químico
majoritário do OE da L. gracilis.
Sendo assim, o baixo conteúdo de carvacrol (0,2%) e (E)-cariofileno (1,43%)
identificados no perfil fitoquímico do OE neste trabalho, sugere que este possa ser outro
quimiotipo que é uma nova fonte de timol.
A atividade citotóxica do OE e dos seus componentes (timol, p-cimeno, γ-terpineno e
mirceno), foi avaliada em três linhagens de células tumorais (HepG2, B16-F10 e K562) e em
células não-tumorais (PBMCs). Os resultados mostraram que o OE apresentou potencial
efeito citotóxico contra todas as linhagens testadas, incluindo os linfócitos humanos. Seus
51
valores de CI50 variaram entre 4,93 e 22,92 µg/ml, nas linhagens HepG2 e K562,
respectivamente, e foi de 16,64 µg/ml nas células não-tumorais. No entanto, os compostos
isolados não apresentaram citotoxicidade promissora contra as linhagens testadas e não foram
citotóxicos contra os linfócitos humanos (CI50 > 25 µg/ml).
Segundo nosso programa de triagem de drogas citotóxicas, óleos essenciais que
apresentam valores de CI50 < 30 µg/ml e compostos isolados com valores de CI50 < 1 µg/ml,
são considerados promissores (SUFFNESS & PEZZUTO, 1990; BEZERRA et al., 2008).
Assim, o OE da L.gracilis pode ser considerado um potente agente citotóxico, enquanto que o
timol, p-cimeno, γ-terpineno e o mirceno são considerados apenas citotóxicos fracos.
Em um estudo do nosso grupo de pesquisa, recentemente publicado, a citotoxicidade
do OE da L.gracilis foi avaliada pelo método MTT contra quatro linhagens de células
tumorais humanas, HL-60 (leucemia promielocítica), HCT-8 (carcinoma de cólon) MDM-
MB-435 (melanoma) e SF-295 (glioblastoma) e os resultados mostraram que o OE foi ativo
em todas as linhagens, com valores de CI50 variando entre 3,6 e 6,1 µg/ml, para as linhagens
HL-60 e SF-295 (RIBEIRO et al., 2012).
Além disso, a citotoxicidade do timol e do γ-terpineno foi avaliada em estudos
anteriores. Em seus resultados, Deb et al. (2011) demonstrou que o timol apresentou valores
de CI50 de aproximadamente 60 µg/ml para células da linhagem HL-60, após 24h de
incubação e não foi citotóxico contra linfócitos humanos (PBMC). Já o γ-terpineno mostrou
valores de CI50 de 156,92 µg/ml quando testado contra células da linhagem Jurkat, após 72 h
de exposição (DÖLL- BOSCARDIN et al., 2012). Vale ressaltar, que nesses estudos foram
utilizadas concentrações mais elevadas de ambos os compostos, em comparação ao nosso
estudo, o que reafirma a baixa citotoxicidade dos isolados.
Desta forma, é provável que a atividade citotóxica potente do óleo essencial possa ser
atribuída à mistura dos seus componentes majoritários e minoritários. Zoubiri & Baaliouamer
(2011), ressaltam que os efeitos biológicos dos óleos essenciais podem resultar da atividade
dos seus compostos principais, ou ser um efeito sinérgico, resultante da mistura de todas as
moléculas componentes.
Além disso, a literatura mostra que duas outras espécies desse gênero, a Lippia alba
(Miller) N. E. Brown e a Lippia sidoides Cham, demonstraram efeito citotóxico quando
testadas contra linhagens tumorais (Costa et al., 2001; MESA-ARANGO et al., 2009).
Tendo em vista o elevado potencial citotóxico apresentado pelo OE no presente
trabalho, também foram avaliados os seus efeitos sobre a proliferação celular e sobre a
52
indução de apoptose. Para tanto, foram utilizadas células da linhagem HepG2 expostas as
concentrações de 2,5 e 5 µg/ml por 24 h, em todos os experimentos realizados.
O OE promoveu uma significativa redução do número de células viáveis, em ambas as
concentrações, de forma concentração dependente, o que corroborou com a elevada
citotoxicidade demonstrada pelos baixos valores de CI50 obtidos no ensaio da metil-[3H]-
timidina.
Visando estudar alguns possíveis mecanismos de ação implicados na atividade
citotóxica do OE, incluiu-se neste estudo a análise da distribuição do ciclo de divisão celular
por citometria de fluxo, uma vez que, a interrupção ou “parada” do ciclo celular é uma causa
comum de inibição da proliferação celular. Os resultados indicaram que o OE foi capaz de
alterar a progressão do ciclo celular, acarretando sua interrupção na fase G1.
O intervalo G1 é a fase na qual as células se preparam para replicação do material
genético. É nesse período que são integrados estímulos mitogênicos e inibitórios, e cuja
decisão sobre que caminho seguir, pode levar a célula a progredir, parar ou sair do ciclo
celular (JOHNSON & WALKER, 1999). A parada do ciclo em G1 cria uma oportunidade
para as células repararem erros ou entrarem em apoptose para manter a homeostase tecidual e
eliminar células neoplásicas mutantes e hiperproliferativas do sistema (PUCCI et al., 2000).
É importante ressaltar, que muitos quimioterápicos antineoplásicos têm seus
mecanismos de ação associados à interrupção do ciclo celular, dentre os quais muitos
pertencentes à classe dos produtos naturais, como os alcaloides da vinca, os taxanos,
podofilotoxinas e as campotecinas (ALMEIDA et al., 2005; RANG et al., 2012).
Outro possível mecanismo de ação investigado foi à capacidade do OE induzir
apoptose como mecanismo citotóxico. Os resultados dos experimentos realizados com esse
fim, mostraram que as células tratadas com a maior concentração do OE (5 µg/ml)
apresentaram alterações morfológicas compatíveis com apoptose por ambos os métodos
empregados, coloração diferencial por H/E e análise por BE/LA em microscópio de
fluorescência. Também se observou um aumento significativo da fragmentação do DNA
internucleossomal. Além disso, o OE não acarretou ruptura da membrana celular das células
tratadas e foi capaz de promover relevante ativação de caspase-3, em ambas as concentrações.
Diante disso, neste trabalho foi demonstrado que o OE foi hábil para induzir morte
celular por apoptose através de uma via dependente de caspase nas células HepG2, sendo seus
efeitos mais notáveis observados nas células tratadas com a maior concentração do óleo.
53
Ressalta-se, portanto, que a apoptose é um importante mecanismo utilizado pelo
organismo para eliminar células danificadas e mal-funcionantes, sendo marcado por uma
sequência ordenada de eventos, bem regulados, determinantes de características morfológicas
específicas. De modo geral, caracteriza-se pela exposição da fosfatidilserina, perda do
potencial de membrana mitocondrial, ativação de caspase, condensação da cromatina,
fragmentação nuclear, formação de corpos apoptóticos e fagocitose (WALSH & EDINGER,
2010).
Nos últimos anos têm-se demonstrado que a apoptose parece ser um mecanismo de
ação comum na mediação dos efeitos citotóxicos da maioria dos fármacos antineoplásicos e
este fato evidencia a importância da morte celular programada por apoptose, como alvo-
terapêutico para o câncer (NICHOLSON, 2000; FERREIRA et al., 2002).
Interessantemente, Deb et al. (2011) reportou que o timol, o principal constituinte
deste óleo, foi capaz de induzir morte celular por apoptose em células HL-60, através de um
mecanismo associado a produção de espécies reativas de oxigênio, alteração do potencial de
membrana mitocondrial, aumento da produção de H2O2 pelas mitocôndrias, redução dos
níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2, aumento nos níveis da proteína pró-apoptótica Bax e
ativação das caspases 8, 9 e 3. No entanto, o timol também foi capaz de induzir apoptose
independente de caspase.
Embora não tenham sido avaliadas as possíveis vias envolvidas no efeito apoptótico
do OE, a significativa ativação de caspase-3 indica que os efeitos do OE na indução de morte
programada tenha a participação da ativação de caspase.
Levando-se em conta a capacidade que o OE demonstrou de reduzir a proliferação
celular in vitro, os seus efeitos sobre o crescimento tumoral em camundongos transplantados
com células do tumor experimental Sarcoma 180 foram avaliados.
O tratamento com o OE nas doses de 40 e 80 mg/kg/dia foi capaz de inibir o
crescimento tumoral a taxas de 38,5% e 41,9%, respectivamente. A inibição foi significativa
para ambas às doses testadas. Sendo assim, esses resultados demonstram que o OE também
foi capaz de limitar expressivamente o crescimento tumoral in vivo.
Corroborando com tais achados, Moraes et al. (1997) descreveram a atividade
antitumoral do extrato hidroalcoolico da L. gracilis Schauer, utilizando o tumor de ehrlich
como modelo experimental e mostraram que o tratamento por via intraperitoneal com a dose
de 88 mg/kg/dia acarretou uma inibição do crescimento tumoral de 33%. No mesmo estudo,
os autores reportam que a espécie Lippia thymoides Mart et Schau, Lippia microphylla Cham
54
e Lippia sidoides Cham não apresentaram atividade anticâncer expressiva nos modelos e
doses testadas.
No que se referem aos parâmetros toxicológicos sistêmicos avaliados nos animais
tratados, os resultados obtidos demonstram não haver alterações significativas, para nenhuma
das doses. A importância desse achado reside no fato da grande toxicidade associada aos
quimioterápicos antineoplásicos, ser causa comum de uma série de efeitos colaterais que
dificultam à terapêutica e afetam a qualidade de vida dos pacientes com câncer.
Sendo assim, os dados do presente estudo mostram que o OE das folhas de L. gracilis
caracterizou-se quimicamente pela presença do timol como composto majoritário e
demonstrou atividade anticâncer in vitro e in vivo. Além disso, verificou-se que os
mecanismos de ação envolvidos na sua atividade citotóxica abrangem a interrupção do ciclo
de divisão celular na fase G1 e indução de apoptose envolvendo a ativação de caspases.
55
CONCLUSÃO
56
6. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que o OE apresenta
relevante atividade anticâncer in vitro e in vivo, sendo que os mecanismos implicados nos
seus efeitos citotóxicos incluem a interrupção do ciclo celular na fase G1 e a indução de morte
celular por apoptose, com participação da ativação de caspases.
57
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APÊNDICE APÊNDICE A – Artigo publicado
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ANEXOS
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ANEXO A- Declaração do Comitê de Ética e Pesquisa com Animais para a Manutenção do Sarcoma 180
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ANEXO B- Declaração do Comitê de Ética e Pesquisa com Animais