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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Mairim Russo Serafini

Morinda citrifolia COMO AGENTE FOTOPROTETOR

SÃO CRISTÓVÃO - SE

2013

1

Mairim Russo Serafini

Morinda citrifolia COMO AGENTE FOTOPROTETOR

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo

Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Junior

SÃO CRISTÓVÃO - SE

2013

2

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S481m

Serafini, Mairim Russo Morinda citrifolia como agente fotoprotetor / Mairim Russo

Serafini ; orientador Adriano Antunes de Souza Araújo. – São Cristóvão, 2013. 97 f. : il.

Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) – Universidade

Federal de Sergipe, 2013.

1. Medicina alternativa. 2. Plantas medicinais. 3. Noni (Planta). 4. Antioxidantes. 5. Pele – envelhecimento. I. Araújo, Adriano Antunes de Souza, orient. II. Título.

CDU 615.89:633.89

2

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, primeiros mestres, os quais

formaram os fundamentos do meu caráter e por

serem minhas primeiras referências.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço toda a minha vida e este trabalho a Deus, que me deu sabedoria e força para

concluir mais uma etapa da minha caminhada e que me privilegia a cada amanhecer, com

saúde, espírito de luta e de otimismo, permitindo que eu viva todos os momentos

intensamente;

Agradeço ao Professor Dr. Adriano Antunes de Souza Araújo pela confiança em mim

depositada e pela oportunidade concedida de trabalhar ao seu lado. Por ter comigo partilhado

seus conhecimentos e experiências profissionais desde o meu mestrado. Por ser o formador da

minha vida profissional, o qual soube me guiar para além das teorias e técnicas. Minha eterna

gratidão por ter me tornado uma pesquisadora! Obrigada por tudo.

Um agradecimento muito especial aos meus pais pelo dom da vida, pelas

oportunidades que me proporcionaram, pela preocupação, por estarem sempre presentes, por

me incentivarem a ir mais longe e pelo apoio incondicional;

À toda a minha família, pelo constante apoio e entendimento pela minha distância e,

por muitas vezes, ausência;

Às minhas queridas amigas em especial Amanda, Rosana, Tiana e todas que mesmo

distante continuavam presentes, pelo compreender da minha ausência e constante incentivo,

também aos amigos que fiz e mantive no decorrer deste trabalho;

Aos Professores do curso que me incentivaram e me ajudaram a progredir, pela

competência, em especial Prof. Lucindo Quintans-Junior, Leonardo Rigoldi Bonjardim,

Marcio Viana, por terem contribuído com parcerias, sugestões e orientações para o

enriquecimento do meu futuro profissional;

Ao Professor, ex-chefe, amigo e quase pai Gabriel Francisco da Silva, por toda a

ajuda, amizade, ensinamentos, orientações, viagens, descontrações e muitas brigas no decorrer

do meu doutorado, o meu profundo agradecimento;

Aos professores Silvia Guterres, Daniel Gelain, José Cláudio Fonseca da UFRGS, o

professor Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Junior da UNIT e a professora Maria José

Fonseca Vieira da USP-Ribeirão Preto por terem proporcionado a realização dos

experimentos em seus laboratórios.

Aos colegas do Laboratório de Ensaios Farmacêuticos e Toxicidade, pelo

companheirismo, pelo aprendizado, pelas boas risadas no decorrer do Doutorado, em especial

ii

às alunas sempre presentes Paula Menezes e Yohanna, também pela dedicação nessa

pesquisa;

Às colegas de curso, pelo auxílio e companheirismo;

Meu agradecimento ao CNPq e FAPITEC-SE pelo auxílio financeiro que possibilitou

a realização deste trabalho;

Às pessoas que lembro com carinho, que não pouparam palavras de incentivo durante

a realização desta pós-graduação.

A todos, o meu profundo agradecimento pela inestimável colaboração, pois só com os

vossos ensinamentos e incentivos foi possível a realização do presente trabalho.

iii

"Aqueles que se sentem satisfeitos

sentam-se e nada fazem. Os insatisfeitos são os

únicos benfeitores do mundo."

Walter S. Landor

iv

Mairim Russo Serafini, 2013. Morinda citrifolia como agente fotoprotetor. Tese do Núcleo de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Sergipe-UFS, Aracaju-SE, p.90.

RESUMO

A exposição à radiação solar, particularmente a radiação ultravioleta (UV), tem uma variedade de efeitos nocivos à saúde humana. Alguns destes efeitos incluem formações de queimaduras solares, eritema, edema, melanoma, fotoenvelhecimento da pele e da supressão imune. Uma planta medicinal que tem sido vastamente utilizada para as mais variadas formas de manutenção da saúde, tem sido a Morinda citrifolia Linn. (Rubiaceae), comumente conhecida como noni. Os efeitos fotoprotetores de formulações para uso tópico com o extrato aquoso das folhas da Morinda citrifolia não foram investigados previamente. Assim, o presente estudo teve como objetivo estudar os benefícios potenciais da M. citrifolia em aplicação tópica na pele dorsal de camundongos expostos à radiação UVA-UVB. Primeiramente, o espectro de absorção das formulações com extrato (10% e 15%) foi avaliada por espectroscopia. O espectro mostrou bandas a 200 nm e em 240 nm e em regiões de absorção no UVA e UVB. In vivo, após 7 dias de tratamento e exposição à radição UVA-UVB, a espessura, perda transepidérmica de água (TEWL), eritema e alterações histológicas foram avaliadas. Os resultados de eficácia in vivo mostraram que os valores de espessura, TEWL e índices de eritema foram significativamente reduzidos pelo tratamento com as formulações contendo o extrato, comparados aos grupos controle irradiado e veículo irradiado. As medições histológicas em hematoxilina eosina mostraram que no grupo não irradiado a epiderme foi representada por uma superfície delgada e contínua. Não foram encontrados infiltrados inflamatórios nos tecidos dérmicos. Ambos os grupos irradiados e veículo apresentaram aumento da espessura da epiderme e hiperortoqueratose. A derme papilar apresentou intenso infiltrado inflamatório, composto principalmente de linfócitos, edema intersticial leve e hiperemia capilar e venular proeminente. Os grupos tratados apresentaram redução notável no conteúdo inflamatório e da hiperemia. Na coloração picrossírius, nos grupos controle irradiado e veículo irradiado, a derme papilar mostrou a presença de feixe de fibras colágenas espessas, grosseiras, de comprimento variável e disposição paralela. Ambos os grupos tratados (formulações de 10% e 15%) apresentaram características semelhantes quanto ao padrão de colagenização, mostrando uma mistura de fibras de colágeno tipo I e fibras de colágeno tipo III. Os espaços interfibrilares nos grupos tratados foram mais evidentes que nos grupos irradiados e do veículo. Tais aspectos morfológicos foram semelhantes às observadas no grupo não irradiado. Ficou evidente, através da morfologia e histologia, que as áreas tratadas com a formulação contendo Morinda citrifolia (10% e 15%) tiveram uma maior proteção contra a radiação UV Finalmente, o extrato foi avaliado em melanoma (linha de células B16F10), a fim de examinar os seus efeitos citotóxicos em células malígnas. O extrato com concentrações de 0,05 a 12,8 mg/mL não mostrou quaisquer efeitos citotóxicos na linhagem de células B16F10. Estes podem sugerir que o extrato não combate danos já estabelecidos em células, tendos efeitos apenas de fotoproteção, dos quais os mecanismos ainda precisam de estudo mais aprofundado. Em conclusão, os resultados demonstraram que as formulações contendo o extrato protegem a pele contra danos induzidos por radiação UV.

Palavras chave: radiação UV, Morinda citrifolia , folhas, extrato, fotoproteção.

v

Mairim Russo Serafini, 2013. Morinda citrifolia como agente fotoprotetor. Tese do Núcleo de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Sergipe-UFS, Aracaju-SE, p.90.

ABSTRACT

Exposure to solar radiation, particularly its ultraviolet (UV), has a variety of harmful effects on human health. Some of these effects include sunburn cell formations, erythema, edema, melanoma, photoaging of the skin, and immune suppression. A plant that has been widely used in tropical folk medicine for a number of conditions is the Morinda citrifolia Linn. (Rubiaceae), commonly known as noni. The beneficial photoprotective effects of topical formulations based on extract from Morinda citrifolia leaves, have not yet been investigated. Thus, the present study aims to investigate the potential benefits of M. citrifolia topical application on the dorsal skin of mice, exposed to UVA-UVB light. Firstly, the absorption spectrum of the formulations extracts (10 and 15%) was evaluated by spectroscopy. The spectrum showed peaks at 200 nm and at 240 nm and absorption in the UVA and UVB regions. After 7 days of treatment and exposition to UVA-UVB light, the thickness, transepidermal water loss (TEWL), erythema and histological alterations were evaluated. The results from in vivo effectiveness showed that the thickness, TEWL values and erythema indexes were significantly decreased by treatment with formulations containing the extract. The histological measurements in hematoxilina eosin showed that in the non-irradiated group showed that the epidermis was represented by a thin, and continuous surface. No inflammatory infiltrate were found in the dermal tissues. Both irradiated and vehicle groups presented increased epidermal thickness associated to hyperorthokeratosis. The papillary dermis exhibited intense inflammatory infiltrate, mainly composed of lymphocytes, mild interstitial edema and prominent capillary and venular hyperemia. The treated groups presented remarkable reduction in the inflammatory content, as well as less expressive hyperemia. In the Sirius Red, the irradiated and vehicle groups, papillary dermis showed the presence of a gross, thick, parallel-arranged, collagen fibers. Both treated groups (10 and 15% formulations) presented similar features regarding the collagenization pattern, showing a mixture of yellowish type I and greenish type III collagen fibers. The interfibrillary spaces were more evident than in irradiated and vehicle groups. Such morphological appearances were very similar to that observed in non irradiated group. Areas treated with the formulation containing Morinda citrifolia extract (10% and 15%) have enhanced protection against UV radiation. Finally, the extract was evaluated on murine malignant melanoma (cell line B16F10) in order to examine their cytotoxic effects on malignany cells. The extract at concentrations of 0.05 to 12.8 mg/mL did not show any cytotoxic effects in the B16F10 cell line. These can suggest that the extract showed no potential anti cancer in melanoma cells, and the extract have only photoprotection effects. In conclusion, the results showed that the formulations containing the extract protected the skin against UV-induced damage.

Key-words: UV radiation, topical formulations, Morinda citrifolia , extract, photoprotective.

vi

SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .............................................................................................. i

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................. ii

LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... iii

CAPÍTULO I ........................................................................................................................................... 1

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 2

2. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 5

2.1 Objetivo Geral .......................................................................................................................... 5

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................... 5

CAPÍTULO II ......................................................................................................................................... 6

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................................. 7

3.1 PELE ......................................................................................................................................... 7

3.2 EXPOSIÇÃO À RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA ................................................................... 9

3.3 FOTOPROTEÇÃO ................................................................................................................. 11

3.4 PRODUTOS NATURAIS ....................................................................................................... 12

3.5 Morinda citrifolia .................................................................................................................... 14

3.6 PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS OBTIDOS DE PLANTAS MEDICINAIS ................. 16

CAPÍTULO III ...................................................................................................................................... 18

Prospecção tecnológica: Morinda citrifolia e indústria farmacêutica ............................................... 18

CAPÍTULO IV ...................................................................................................................................... 30

UVA-UVB photoprotective activity of topical formulations containing Morinda citrifolia extract 30

CAPÍTULO V ....................................................................................................................................... 58

4. DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 59

5. CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 60

6. PERSPECTIVAS .......................................................................................................................... 60

7. REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 61

CAPÍTULO VI ...................................................................................................................................... 69

ANEXO I - PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO .................................... 70

vii

ANEXO II – APROVAÇÃO NO COMITE DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS (CEPA-UFS) ................................................................................................................................. 77

ANEXO III – NORMAS DA REVISTA OXIDATIVE MEDICINE AND CELLULAR LONGEVITY ................................................................................................................................ 78

i

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

M. citrifolia Morinda Citrifolia

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC American Type Culture Collection

CIP Classificação Internacional de Patentes

CLAE / HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco / Dulbecco`s modification of Eagle`s medium

DNA Ácido Desoxirribonucleico

EROs Espécies Reativas ao Oxigênio

HE Hematoxilina-Eosina

IC Grupo Irradiado Controle

INPI Instituto Nacional de Propriedade Intelectual

IV Grupo Irradiado Veículo

MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil )-2,5-difenil-2H-tetrazólio

NIC Grupo não Irradiado Controle

P&D Pesquisa e Desenvolvimento

PBS Tampão fosfato-salino / phosphate buffered saline

RNA Ácido Ribonucleico

RUV / UVR Radiação Ultravioleta

SD Standard Deviation

SDS Dodecil sulfato de sódio / sodium dodecyl sulfate

SEM Standard error of the mean

SOD Superóxido Dismutase

SR Sirius-Red/ picrossírius

TEWL Perda Transepidérmica de Água / Transepidermal Water Loss

WIPO Organização Mundial de Propriedade Intelectual / World Intellectual Property Organization

http://www.wipo.int/

http://www.wipo.int/

ii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II

Figura1. As três camadas da pele 07

CAPÍTULO III

Figura1. Evolução anual de depósitos de patentes no banco europeu. 23

Figura 2. Patentes depositadas por país. 24

Figura 3. Patentes por código de classificação internacional no espacenet. 25

Figura 4. Uso de cosméticos ou preparações similares para higiene pessoal: A61Q. 25

Figura 5. Pedidos internacionais por ano de publicação no banco mundial. 26

Figura 6. Patentes depositadas por país. 27

Figura 7. Distribuição por CIP dos depósitos encontrados no banco de dados mundial. 27

Figura 8. Distribuição por CIP A61K dos depósitos encontrados no banco de dados mundial.

28

Figura 9. Distribuição por CIP A61K dos depósitos encontrados no banco de dados americano.

29

CAPÍTULO IV

Figure 1. UV absorbance spectra of a blank formulation (0% extract), formulation extract 10% and formulation extract 15%.

41

Figure 2. Skin biophysical techniques. A) Thickness values (mm), B) Transepidermal water loss, C) Erythema obtained for the dorsal areas.

41

Figure 3. Photoprotective effects of formulations on UVA-UVB-induced pathological changes in the skin surface on different groups after 7 days of treatment.

42

Figure 4. Hematoxylin-eosin stained histological sections. (A) Non irradiated group (B) Irradiated-IC, (C) vehicle, (D) Elastotic change of the collagen. (E) 10% and (F) 15% formulations (Hematoxylin Eosin, 400 x magnification).

44

Figure 5. Sirius Red stained histological sections. (A) Irradiated-IC and (B) vehicle groups-IV (C) 10% and (D) 15% formulations, and (E) non irradiated-NIC groups presenting interlaced less compacted type I and III collagen fibers (Sirius Red/Polarization Light, 400 x magnification).

46

Figure 6. Cytotoxic effect of the Morinda citrifolia extract in B16F10 (murine malignant melanoma) cell line.

47

iii

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO III

Tabela 1. Pesquisa por Palavras-Chave. 22

Tabela 2. Pesquisa por Classificação Internacional. 23

CAPÍTULO IV

Table 1. Measurement of spreadability of formulations containing Morinda citrifolia extract (10% or 15% w/w).

40

1

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

2

1. INTRODUÇÃO

A pele constitui o maior órgão do corpo humano, possuindo a função de barreira

protetora do nosso organismo, sendo formada por diferentes estruturas, consequentemente por

diversos tipos de células. Enquanto exerce a função de proteção dos órgãos internos ao

ambiente, mantém o balanço entre proliferação e descamação celular (GUARATINI et al.,

2009). Nesse sentido, mais do que qualquer outro órgão ou tecido, a pele é exposta

constantemente a inúmeros agentes químicos, físicos e microbiológicos, tais como poluição,

radiação ionizante, radiação ultravioleta (RUV) e visível, ozônio, dentre outras fontes

geradoras de radicais livres (FUCHS et al.,1989; THIELE et al.,1997; GUARATINI et al.,

2009). Esses fatores ambientais em adição à fatores extrínsecos (estresse, alcoolismo,

tabagismo, nutrição) e fatores intrínsecos (fatores cronológicos e DNA) levam a uma perda

progressiva da integridade da estrutura da pele, bem como alterações nas funções fisiológicas,

caracterizando, assim, o envelhecimento cutâneo (GUARATINI et al., 2009).

A exposição da pele à RUV tem se mostrado capaz de induzir lesão clínica e

histológica (KANG et al., 2009), levando à alterações agudas inflamatórias (eritema, edema)

e alterações crônicas (fotoenvelhecimento, imunossupressão, ou fotocarcinogênese) (GAO et

al., 2008). Assim, dependendo da intensidade, tempo de exposição, comprimento de onda e

região exposta, a RUV pode causar desde queimaduras na pele e envelhecimento cutâneo

precoce até danos ao DNA celular cutâneo e câncer de pele (ALMEIDA et al., 2008).

Estima-se que 80% dos sinais visíveis causados no envelhecimento cutâneo são

provocados pelos raios ultravioletas e pelos radicais livres formados em consequência à

exposição RUV (SCOTTI et al., 2007). Assim, compostos capazes de inibir a ação e a

formação destas espécies reativas ao oxigênio (EROs), podem ser capazes de proteger a pele

dos danos induzidos pela RUV.

Os efeitos dos radicais livres sobre os sistemas biológicos têm se mostrado em

evidência nos últimos anos, especialmente nas doenças relacionadas com o aumento destas

espécies reativas no organismo e ao envelhecimento precoce. Tem sido demonstrada a

participação dos radicais livres na etiologia de algumas doenças de elevada prevalência na

população ocidental, principalmente o câncer (WEIJL et al., 1997; HALLIWELL,

GUTTERIDGE, 2007). Assim, substâncias que demonstrem ter a capacidade de neutralização

destes radicais tornam-se um componente importante, já que podem prevenir ou amenizar os

problemas causados pelo excesso de espécies reativas (caracterizado pelo estresse oxidativo)

no organismo (PAYÁ et al., 1994). Estudos têm encontrado uma associação inversamente

proporcional entre a ingestão de dietas ricas em polifenóis (tais como frutas, verduras e grãos)

3

e do risco de doenças relacionadas à estresse oxidativo nos seres humanos. Esta associação é

frequentemente atribuída às atividades antioxidantes dos flavonóides e outros polifenóis

encontrados em produtos naturais (TANG, HALLIWELL, 2010).

Paralelamente, cresce o interesse em se utilizar e validar o uso das plantas medicinais

não só brasileiras, assim como as espécies amplamente cultivadas no país, já que o Brasil é o

país detentor de grande biodiversidade, das quais somente cerca de 10% foram estudadas

segundo os aspectos químicos e farmacológicos (SIMÕES et al., 2007). Com o interesse em

se utilizar plantas medicinais, surge o esforço em empregar antioxidantes dessa natureza,

aplicados topicamente ou oralmente, apresentando, assim, uma perspectiva promissora na

prevenção de doenças originadas por EROS, por enriquecer o sistema de proteção cutâneo

endógeno (AFAQ et al., 2005, ALMEIDA et al., 2008).

Acompanhando a tendência do mercado, os extratos de plantas com ação antioxidante

estão sendo incorporados aos produtos existentes e aos que poderão surgir. Esses extratos são

obtidos de folhas, raízes, frutos, sementes, bagas, caules, galhos, cascas e flores de plantas, e

podem ser facilmente adicionados a produtos como sabonetes, hidratantes, cremes,

cosméticos e máscaras faciais e podem ser utilizados a fim de prevenir danos que

desencadeiam o foto envelhecimento ou câncer de pele, por exemplo (DRAELOS, 2006;

CUNHA et al., 2004).

Dentre as plantas que poderiam ser utilizadas com essa finalidade medicinal ou

cosmética, encontra-se a Morinda citrifolia Linn, popularmente conhecida como “noni”. Suas

folhas, raízes, caule e frutos são empregados com diversas funções, dentre essas, anti-

infeccioso tópico (SU et al., 2005), inibidor de eritema (WEST et al., 2009), anti-

inflamatório, antimicrobiano (CHAN-BLANCO et al., 2006), antioxidante (SU et al., 2005;

CHAN-HONG et al., 2007; YANG et al., 2007; PALU et al., 2008; SERAFINI et al., 2011) e

cicatrizante (RASAL et al., 2008). WANG et al., (2002) relataram que o suco de Morinda

citrifolia pode melhorar a função imune, mostrando efeitos antienvelhecimento e anticâncer.

As atividades farmacológicas descritas até o presente momento para o extrato de

diversas partes da referida planta, aliado à gama de constituintes fitoquímicos de interesse

dermatológico, tais como flavonoides, e a falta de relatos na literatura sobre o

desenvolvimento de produtos tecnologicamente obtidos a partir dessa espécie, a torna uma

matéria-prima promissora para elaboração de um produto de interesse dermatológico. Estudos

recentes realizados pelo nosso grupo mostraram que o extrato das folhas do noni tem alto

potencial antioxidante (SERAFINI et al., 2011a) e não mostrou citotoxicidade nas

concentrações usuais (SERAFINI et al., 2011b). Sendo assim, esse trabalho objetivou avaliar

4

os efeitos de formulações cosméticas contendo Morinda citrifolia Linn como alternativa à

fotoquimioproteção.

A presente tese foi dividida em capítulos, sendo o primeiro deles destinado à introdução

e objetivos, cuja finalidade foi fazer uma abordagem geral do tema e determinar os objetivos a

serem alcançados; no segundo é apresentada uma fundamentação teórica, no qual abordou-se

mais detalhadamente o tema da tese; o terceiro e quarto capítulos apresentam os artigos

gerados no decorrer da pesquisa; e por fim, no quinto capítulo, encontra-se uma discussão

geral, conclusão, as perspectivas e as referências utilizadas.

5

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

- Avaliar os efeitos de uma formulação contendo o extrato das folhas da Morinda citrifolia

Linn como alternativa na fotoproteção à pele.

2.2 Objetivos Específicos

- Realizar um levantamento dos principais produtos patenteados com a Morinda citrifolia;

- Incorporar o extrato em formulação gel para uso tópico;

- Verificar a espalhabilidade das formulações obtidas;

- Avaliar o efeito fotoprotetor da formulação em camundongos irradiados por UVA-UVB;

- Avaliar a citotoxicidade da formulação em células de melanoma maligno (B16F10).

6

CAPÍTULO II

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

7

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 PELE

A pele corresponde a cerca de 5,5% da massa corporal de um indivíduo adulto,

apresentando uma área de superfície de aproximadamente 1,7 m2, sendo o maior órgão do

corpo humano (GOLDSMITH, 1990). Além de recobrir o nosso corpo, a pele é uma barreira

de proteção entre o organismo e o meio ambiente. A fim de exercer essa função, esse órgão

possui uma estrutura complexa apresentando múltiplas e precisas funções. Constitui, antes de

tudo, a primeira linha de defesa contra agressões do meio ambiente, não sendo de maneira

nenhuma uma barreira intransponível (BOUWSTRA et al., 2003; PEREIRA, 2008).

A estrutura da pele é formada por três camadas de tecido (Figura 1): a epiderme, a

derme e a hipoderme. A epiderme é formada por um conjunto de células vivas (epiderme

viável) e um conjunto de células mortas (estrato córneo). A epiderme viável é constituída de

células metabolicamente ativas que formam outras três camadas distintas: granulosa,

espinhosa e basal (PRISTA et al., 1992).

Figura 1: As três camadas da pele. Disponível em: http://ltc.nutes.ufrj.br/toxicologia/mII.pele.htm

8

Abaixo da camada basal, fortemente ligada à epiderme, situa-se a camada

intermediária da pele, denominada derme. A derme é constituída por tecido conjuntivo denso

e por diferentes células, elementos extracelular, vasos sanguíneos e linfáticos, fibras nervosas

sensitivas, fibroblastos, macromoléculas tais como o colágeno e a elastina e anexos cutâneos

(glândulas sebáceas, glândulas sudoríparas e folículos pilosos) (PRISTA et al., 1992;

BARATA, 2002). A derme é a camada que proporciona resistência, extensibilidade e

elasticidade à pele. Assim, o envelhecimento cutâneo gera, principalmente na derme,

modificações morfológicas e funcionais, que resultam, consequentemente, em alterações na

proliferação e na capacidade de reparo das células.

A camada mais profunda da pele é a hipoderme, também denominada como camada

subcutânea de gordura. A hipoderme é constituída por tecido adiposo e exerce as funções de

armazenamento de nutrientes e energia, proteção mecânica, atuando como amortecedor na

suavização de traumas e isolante térmico, conservando a temperatura corporal

(VIGLIOGLIA, 1989).

Quando a RUV incide sobre a pele, esta pode ser absorvida, refletida ou dispersa.

Somente a parte absorvida produz alterações nas moléculas que a absorve, as quais são

denominadas de cromóforos (PINNELL, 2003). Esses cromóforos podem ser a melanina,

DNA, RNA, proteínas, lipídeos, água, aminoácidos aromáticos (como a tirosina e triptofano),

ácido trans-urocânico, etc (GONZÁLEZ et al., 2008). As alterações sofridas pelos cromóforos

da pele são denominadas reações fotoquímicas, as quais desencadeiam todas as demais

reações bioquímicas que resultam em danos como: queimadura, elastose solar,

fotoenvelhecimento e até mesmo, câncer de pele (PINNELL, 2003).

As modificações histológicas do fotoenvelhecimento incluem a diminuição dos

fibroblastos; hiperplasia do tecido elástico, com fibras elásticas aumentadas, espessas,

enroladas, emaranhadas e fibras colágenas afinadas e achatadas. Como consequência há

também uma diminuição dos precursores do colágeno tipo I e III e aumento de

glicosaminoglicanos que serão depositados anormalmente no tecido elastótico em vez de

serem depositados entre as fibras colágenas e elásticas, fenômeno denominado de elastose ou

degeneração basofílica do colágeno (FITZPATRICK, 2005; DRAELOS, 2006).

Ainda nesse sentido, a pele é provida de um grande número de mecanismos de defesa

antioxidante (KOHEN & GATI, 2000), que podem ser tanto enzimáticos (catalase,

superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase) ou não enzimáticos

(glutationa, α-tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno), que estão em maior concentração na

epiderme, indicando ser esta mais susceptível que a derme ao estresse oxidativo (SHINDO et

9

al., 1994; VICENTINI et al., 2008). Em condições normais de temperatura e ambiente, esses

mecanismos são suficientes para manter um equilíbrio na pele, removendo os radicais livres

produzidos. Entretanto, esses mecanismos são insuficientes quando há uma exposição solar

excessiva, resultando em uma elevada produção de radicais livres pela RUV (VICENTINI et

al., 2008).

3.2 EXPOSIÇÃO À RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

O sol emite um amplo espectro de radiação eletromagnética que é desviado ou

atenuado pelas camadas atmosféricas da Terra (ROY et al., 1998). As radiações que chegam à

superfície são classificadas como não-ionizantes e subdivididas em infravermelho, visível e

ultravioleta (KIRCHOFF, 1995). A exposição excessiva à RUV resulta em severo dano

oxidativo no tecido cutâneo através de interações com cromóforos intracelulares e

fotossensibilizadores, resultando em danos transitórios ou permanentes; e pela ativação de

sinalizadores citoplasmáticos de vias de transdução de sinais relacionados com o crescimento,

a diferenciação, o envelhecimento e a degradação do tecido conjuntivo (PEREIRA, 2008).

A porção UV da luz solar é subdividida de acordo com o comprimento de onda.

Embora a camada de ozônio seja capaz de bloquear a radiação UVC (abaixo de 280 nm) e

parte da radiação UVB (280-290 nm), outra parte da radiação UVB (290-315 nm) e a radiação

UVA (315-400 nm) atingem a superfície terrestre. A radiação UVB corresponde de 1% a 10%

da radiação que chega à superfície terrestre, enquanto a radiação UVA, de 90% a 99%

(SILVA et al., 2009; HECK et al., 2004).

O comprimento de onda mais associado à indução de alterações eritematosas cutâneas

é a região do UVB, principal responsável pelas queimaduras solares (HECK et al., 2004). As

bases do DNA absorvem diretamente os fótons incidentes neste intervalo de comprimento de

onda. O efeito fototóxico da radiação UVA é muito menor que da radiação UVB. A radiação

UVA é a responsável pelo bronzeamento direto. Porém, seu uso crônico provoca alterações

das fibras colágenas e elásticas, caracterizando o envelhecimento cutâneo (SILVA et al.,

2009). Já a porção UVC é a germicida, por sua ação esterilizante, sendo prejudicial ao tecido

cutâneo, porém é bloqueada pela camada de ozônio (HECK et al., 2004).

Os efeitos da radiação na pele, em curto prazo, ocorrem principalmente devido à

radiação UVB e incluem o eritema, edemas e o escurecimento dos pigmentos seguidos de

bronzeamento (mais relacionado à radiação UVA) e espessamento da epiderme e da derme

(KULLAVANIJAYA & LIM, 2005; HECK et al., 2004). Dentre as alterações por exposição

10

crônica, destacam-se os vários tipos de câncer de pele, dentre eles o melanoma que é

considerado o mais agressivo. Um dos mecanismos de danos causados à pele é a absorção da

radiação UVB pelas bases de DNA e das proteínas. Quando os ácidos nucleicos absorvem

essa radiação ionizante mutagênica são formados subprodutos, como dímeros de pirimidina.

Esses subprodutos podem ser carcinogênicos ou citotóxicos se não forem reparados

(MONTEIRO, 2008).

O eritema é a alteração fisiológica mais comum provocada pela exposição ao sol,

sendo resultado da inflamação ocorrida na pele. A intensidade do eritema é proporcional à

quantidade de radiação absorvida na pele, sendo também proporcional ao tipo de pele do

indivíduo, do comprimento e da intensidade da onda incidente (DAL’BELO et al., 2011).

Além disso, a RUV causa anormalidades em estruturas relacionadas à adesão dos corneócitos

resultando em danos na função de barreira da pele, o que provoca ressecamento e acelera o

processo de descamação (DAL’BELO et al., 2011; MEGURO et al., 1999), também pode

provocar uma hiperplasia da epiderme para repor as células danificadas, o que resulta no

aumento da espessura da epiderme devido ao aumento do número de camadas celulares (EL-

ABASERI et al., 2006; DAL’BELO et al., 2011).

As alterações histológicas que ocorrem após a irradiação por UV, incluem o

espessamento do estrato córneo, formação de edema intercelular e perivascular na derme,

assim como a presença de infiltrados perivasculares. A derme é preenchida com uma massa

desordenada de fibras elásticas e de fibras de colágeno (LOWE et al., 1995; DAL’BELO et

al., 2011).

Estudos clínicos têm demonstrado que a exposição da pele à RUV é responsável por

alterações cutâneas relacionadas com o envelhecimento precoce, sendo que a maioria destas é

resultante da ação das EROs (DAMIANI et al., 2006). Está bem estabelecido que a resposta

inflamatória causada pela exposição à RUV na pele e os processos degenerativos relacionados

com a exposição crônica da pele à RUV são largamente medidas pela superprodução de

EROS e pela insuficiência dos sistemas antioxidantes (AQUINO et al., 2002). Desta maneira,

os antioxidantes, tais como as vitaminas e outros compostos naturais, tem sido amplamente

empregados em formulações fotoprotetoras e em produtos cosméticos de uso diário para

proteger a pele contra danos causados pelas EROs (DAL’BELO et al., 2009).

A crescente incidência de câncer de pele tornou-se um problema de saúde pública em

escala mundial, inclusive no Brasil (BRASIL, 2009). Paralelamente, estudos epidemiológicos

demonstram que o uso de protetores ou bloqueadores solares não é completamente efetivo na

prevenção do câncer de pele induzido pela exposição à RUV e assim, o uso de antioxidantes

11

aparece como importante alternativa nos mecanismos de fotoproteção e prevenção do câncer

de pele e demais patologias cutâneas, além de agregar valor ao produto pelo apelo comercial

(GONZÁLES et al., 2008; RIVELLI et al., 2008; VICENTINI et al., 2008).

3.3 FOTOPROTEÇÃO

No contexto medicinal, fotoproteção é caracterizada por um conjunto de ações de

natureza química e física, ambiental ou comportamental, responsável pela diminuição dos

danos gerados pela exposição à RUV no organismo com o objetivo de reduzir os índices de

câncer de pele na população humana e outras doenças dermatológicas relacionadas à RUV

(AFAQ & MUKHTAR, 2006).

Entre as alternativas de fotoproteção, naturalmente há um aumento da espessura do

estrato córneo e da epiderme viável, estimulando a melanogênese (bronzeamento). A barreira

formada pelo estrato córneo também impede a penetração da radiação e de 5 a 10% da luz é

refletida (SILVA et al., 2009). Com a absorção de fótons, o ácido trans-urocânico é

isomerizado a cis-urocânico, que está envolvido com os efeitos imunossupressor e

carcinogênico (KULLAVANIJAYA & LIM, 2005).

Outra forma natural de proteção é a melanina, um pigmento encontrado naturalmente

nos seres humanos. É capaz de absorver em uma ampla faixa de comprimento de onda, desde

o ultravioleta até o infravermelho, neutralizando também os radicais livres presentes nas

células. Nas células, a melanina tende a cobrir o núcleo para proteger o DNA celular do dano

que possa ser causado pela RUV (LÉPORI, 2002).

A eficácia de uma formulação contendo filtro solar é comumente determinada através

da maior ou menor proteção proporcionada contra a queimadura. Assim, a Agência Nacional

de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL 2006; BRASIL 2012) estabelece que a eficácia

das formulações fotoprotetoras pode ser avaliada empregando metodologias in vivo, em

voluntários sadios (10 a 20) com diferentes tipos de pele (I, II, III e IV), de ambos os sexos,

com sensibilidade mediana à radiação ultravioleta. Devido ao alto custo e complexidade de

pesquisas envolvendo humanos, e pela fácil reprodutibilidade de técnicas, métodos in vitro,

ou métodos com animais, são utilizados primeiramente para avaliação da eficácia

fotoprotetora de formulações.

A ANVISA (BRASIL 2006) disponibiliza a listagem das substâncias químicas

orgânicas e inorgânicas que podem ser utilizadas como filtros solares, dentre eles destacam-

se: 1 -(4 – terc – butilfenil) – 3 – (4 –metoxifenil) propano – 1, 3 – diona (Butyl methoxy

12

dibenzoil methane); 2, 2’ – dihidroxi – 4 – metoxibenzofenona (benzophenone-8); Salicilato

de trietanolamina (tea salicilate); Ácido 4 – aminobenzóico (PABA); Dióxido de titânio

(titanium dioxide); Óxido de zinco (zinc oxide). Esses filtros solares utilizados no mercado

são classificados conforme sua química e seu modo de ação em filtros orgânicos e

inorgânicos, uma vez que nos filtros orgânicos temos a presença de compostos orgânicos e

nos inorgânicos temos a presença de óxidos metálicos. Geralmente, os compostos orgânicos

protegem a pele pela absorção da radiação e os inorgânicos, pela reflexão da radiação (FLOR

et al., 2007)

Atualmente há um grande número de pesquisas desenvolvidas a partir de uma

variedade de compostos que poderiam ser usados em produtos tópicos para o tratamento e/ou

prevenção do fotoenvelhecimento e do câncer de pele. Dentre estes compostos estão a

vitamina E, o ácido ascórbico, o β-caroteno, o licopeno, a superóxido dismutase (SOD) e os

compostos fenólicos antioxidantes como epigalocatequina galato, genistéina, quercetina,

resveratrol, rutina (CASAGRANDE et al., 2006; FONSECA et al., 2010; MORAES, 2011).

3.4 PRODUTOS NATURAIS

Levando-se em consideração o aumento da expectativa do tempo de vida observado

nos últimos tempos e a constante busca pela qualidade de vida durante o processo de

envelhecimento, torna-se notório os investimentos de grandes empresas e centros de pesquisa

voltados a realização de estudos das propriedades antienvelhecimento de substâncias ativas

(IBGE, 2009).

Sabendo-se do potencial biológico de plantas medicinais, bem como do elevado

número de casos de uso popular dessas espécies, cresce o interesse em se utilizar e validar o

uso de produtos derivados das mesmas, tais como extratos, óleos essenciais e substâncias

isoladas, como alternativa para o tratamento de diversas doenças e problemas de saúde. Por

outro lado, embora o Brasil seja o país com a maior biodiversidade no mundo, apenas cerca

de 10% dessa variedade foi estudada segundo os aspectos químicos e farmacológicos

(SIMÕES et al., 2007).

Essas substâncias extraídas das plantas medicinais, produzidas como um mecanismo

de defesa natural contra agressões ambientais e sendo muito estudadas pelas suas

propriedades biológicas, são denominadas metabólitos secundários. Também chamados de

produtos naturais, esses metabólitos compreendem uma ampla variedade de substâncias das

mais diversas estruturas e de diferentes origens metabólicas (CALIXTO, 2005). De forma

resumida, os metabólitos secundários vegetais podem ser divididos em três grandes grupos: os

13

compostos fenólicos, os terpenóides e os compostos secundários nitrogenados. O grupo de

maior interesse medicinal são os compostos fenólicos, como os flavonóides, presentes na

grande maioria das espécies vegetais, sendo o grupo mais estudado e com grande impacto na

prevenção de várias doenças devido à sua comprovada atividade antioxidante. Em termos de

antioxidantes com potencial fotoprotetor destacam-se os tocoferóis, o ascorbato e os beta-

carotenos (STEENVOORDEN & VAN-HENEGOUWEN, 1997).

Muitos extratos de origem natural, que contêm grande quantidade de compostos

fenólicos, vêm sendo estudados e tem demonstrado uma pronunciada atividade antioxidante e

anti-inflamatória. Sugere-se que estes extratos de origem natural, podem ser eficazes na

prevenção dos danos solares (CASAGRANDE et al., 2006; FONSECA et al., 2010;

SERAFINI et al., 2011a; SERAFINI et al., 2011b).

Os compostos fenólicos, preferencialmente os flavonóides, de uma forma geral, vêm

sendo amplamente estudados por apresentarem atividades antioxidantes que oferecem a estes

compostos a capacidade de diminuir a incidência de doenças coronarianas e câncer. Além

disso, são conhecidos e estudados por apresentarem propriedades antineoplásicas,

antimicrobianas, antivirais, anti-inflamatórias, anti-ulcerogênicas, anti-hipertensivas, entre

outras (GUARDIA et al., 2001; SERAFINI et al., 2011a).

A utilização de antioxidantes protege as células de danos celulares, sendo uma

estratégia adequada para o desenvolvimento de agentes de fotoproteção de interesse

cosmético (FINKEL and HOLBROOK, 2000; MARTINDALE and HOLBROOK, 2002;

KIM et al., 2008). Antioxidantes de origem natural, especialmente os polifenóis, tais como

flavonóides, tem demonstrado bom potencial como agente fotoprotetor (BONINA et al.,

1996; SAIJA et al., 1998; F’GUYER et al., 2003).

A cada dia surgem novos produtos dermatológicos, cada vez mais inovadores,

eficientes e capazes não só de prevenir, mas também de amenizar os efeitos do tempo sobre a

pele, tanto esteticamente, minimizando rugas e linhas de expressão, como minimizando a

geração de câncer de pele. Por isso, extratos de plantas medicinais com ação antioxidante são

cada vez mais procurados para o desenvolvimento de novos cosméticos, principalmente

dermocosméticos de ação contra o envelhecimento cutâneo (RODRIGUES et al., 2003).

14

3.5 Morinda citrifolia

Nesse contexto, encontra-se a Morinda citrifolia Linn, popularmente conhecida como

“noni”. Cerca de 160 compostos fitoquímicos já foram identificados na planta de noni, e os

micronutrientes importantes são compostos fenólicos, ácidos orgânicos e alcalóides. Dos

compostos fenólicos, os mais importantes relatados são: antraquinonas e os principais ácidos

orgânicos são ácidos capróico e caprílico, enquanto o principal alcalóide é relatado xeronina

(CHAN-BLANCO et al., 2006). Todavia, a composição química difere grandemente de

acordo com a parte da planta analisada. A composição fitoquímica completa do fruto da M.

citrifolia ainda não foi descrita e apenas informação parcial do suco do noni está disponível

(WANG et al., 2002; CHAN-BLANCO et al., 2006). Os alcalóides xeronina e proxeronina

são relatados por HEINICKE (1985) e SOLOMON (1999) como constituintes responsáveis

pelas atividades biológicas do suco do noni (LAVAUT & LAVAUT, 2003).

Estudos fitoquímicos revelam que as folhas do noni contêm uma variedade de

componentes químicos, incluindo terpenóides, fitoesteróis, ácidos graxos, iridóides

glicosídicos, flavonóides glicosídeos, entre outros. Flavonóides glicosídeos parecem

predominar nas folhas do noni (DENG et al., 2008; SERAFINI et al., 2011a).

As diversas partes da planta são empregadas popularmente com variadas funções.

Estudos científicos recentes demonstram o uso do suco do noni para melhora de perfis de

marcadores de risco em fumantes, tais como colesterol e triglicerídeos (WANG et al., 2012);

agente anti-psicótico (PANDY et al., 2012); antioxidante e regulador de colesterol (LIN et al.,

2012); inibição da Enterococcus faecalis (BHARDWAJ et al., 2012); redução de células de

câncer mamário (CLAFSHENKEL et al., 2012); propriedade anti-câncer (JANG 2012) e

metabolismo da glicose (NERURKAR et al., 2012).

Para a planta como um todo, nos últimos anos, é demonstrado cientificamente o uso

para melhorar a cólica menstrual (FLETCHER et al., 2013); atividade citotóxica para

linhagem de câncer cervical, sendo coadjuvante na quimioterapia (GUPTA et al., 2013); uso

para os mais variados tipos de câncer (BROWN, 2012) e função antiangiogênica (BEH et al.,

2012). O uso do fruto demonstra potencial antidiabético (LEE et al., 2012), citotoxicidade

para células cancerígenas (AKIHISA et al., 2012); efeito gastro protetor (NIMA et al., 2012);

conservante de alimentos (TAPP et al., 2012); inibição da melanogênese (MASUDA et al.,

2012). A citotoxicidade também é relatada para as raízes do noni (SUMAN et al., 2013). O

caule apresenta atividade contra leishmaniose (SATTAR et al., 2012); antioxidante e

antiangiogênico (PIARU et al., 2012). Para a semente é relatada a inibição da matriz

15

metaloproteinase (MMP)-1 (MASUDA et al., 2012); a antraquinona isolada no noni apresenta

atividade anti-inflamatória e anti-tumoral (NUALSANIT et al., 2012); e as folhas apresentam

potencial de regeneração do osso e tecido periodontal (BOONANANTANASARN et al.,

2012); atividade larvicida (KOVENDAN et al., 2012) e antibacteriana (SATHISHKUMAR et

al., 2012).

Dentre as atividades biológicas citadas para o noni, que sugerem uma evidência do uso

como agente fotoprotetor, destaca-se: agente anti-infeccioso tópico (SU et al., 2005), anti-

inflamatório (CHAN-BLANCO et al., 2006; SERAFINI et al., 2011a), antioxidante (SU et

al., 2005; CHAN-HONG et al., 2007; YANG et al., 2007; PALU et al., 2008; SERAFINI et

al., 2011a) e cicatrizante (RASAL et al., 2008). O uso do suco de Morinda citrifolia foi

relatado por melhorar a função imune, mostrando efeitos antienvelhecimento e anticâncer

(WANG et al., 2002).

West et al., (2009) publicaram um estudo com voluntários sadios, concluindo que as

folhas da Morinda citrifolia , por meio de um extrato etanólico incorporado a um gel de

aplicação tópica, reduzem o eritema causado pela radiação UVB, proporcionando alguma

medida de defesa contra a inflamação localizada. O mecanismo de ação envolvido seria em

relação à atividade anti-inflamatória através de receptores anti-histamínicos H-1, e por

atenuação de radicais livres.

Estudos realizados por SERAFINI et al., (2011a e 2011b) demonstram, através da

triagem fitoquímica, a presença de alcalóides, cumarinas, flavonóides, taninos, esteróides e

triterpenóides no extrato aquoso das folhas do noni. O doseamento de fenóis totais mostrou a

presença de 196,8 mg/g de ácido gálico, e a caracterização por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) identificou a presença do flavonóide rutina e de glicosídeos kaempferol.

De maneira geral, os resultados deste estudo indicam que o noni apresenta importante

atividade antioxidante in vitro e em relação à atividade antibacteriana mostrou-se efetivo

apenas contra Aeromonas hydrophila. No que tange à atividade anti-inflamatória e

antinociceptiva, observou-se eficácia na redução de contorções abdominais induzida por ácido

acético (na dose de 400 mg/kg) e diminuição da migração de leucócitos pelo ensaio de

peritonite (nas doses de 200 e 400 mg/kg). O extrato do noni não apresentou alteração quanto

aos parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos no estudo de toxicidade aguda.

Além disso, o extrato apresentou citotoxicidade apenas na maior concentração testada (25

mg/mL).

16

3.6 PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS OBTIDOS DE PLANTAS MEDICINAIS

Os compostos derivados de plantas são atualmente empregados na medicina, além de

terem um papel relevante para a síntese de moléculas mais complexas (CALIXTO &

SIQUEIRA, 2008). Cerca de 30% dos medicamentos disponíveis são derivados direta e

indiretamente de produtos naturais, notadamente plantas. Em algumas doenças como câncer,

os medicamentos derivados de plantas chegam a 60% (CALIXTO & SIQUEIRA, 2008).

Em virtude da grande biodiversidade brasileira, o Brasil é o país líder em publicações

com plantas medicinais. Em função desse progresso nas pesquisas realizadas na área de

produtos naturais no Brasil, observa-se um crescente interesse pelas indústrias farmacêuticas

nacionais em estabelecer parcerias, Universidade-Empresa, com o objetivo de desenvolver

produtos farmacêuticos com qualidade, eficácia e segurança comprovadas em testes pré-

clínicos e clínicos, conforme as resoluções da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) (CALIXTO & SIQUEIRA, 2008).

Em um levantamento realizado no banco de patentes do Instituto Nacional de

Propriedade Intelectual (INPI), no período de janeiro de 2013, utilizando como ferramenta de

busca a classificação internacional de patentes (CIP) A61K (referente a preparações para

finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas) e com a palavra-chave “plantas and

medicinais” encontrou-se apenas 11 documentos de depósitos de patentes, sendo o primeiro

em 1997 e o último em 2010. O período corresponde ao momento em que o governo

brasileiro, em 1997, aderiu ao Acordo de Propriedade Intelectual (Trips) e passou a

reconhecer a lei de patentes (Lei 9.279) (CALIXTO & SIQUEIRA, 2008).

Dentre os 11 documentos encontrados nessa busca específica, encontra-se em 2010,

um sabonete ginecológico com nanopartículas elaborado a partir de extrato de plantas

medicinais e do óleo essencial do alecrim-pimenta para o tratamento de infecções bacterianas

e fúngicas (PI1003300-9). No ano de 2009 foi depositado o processo PI0904361-6 relativo a

um produto formulado a base de plantas medicinais para tratamento de congestão nasal

causada pela sinusite, inflamações na garganta, tosses, aftas, verrugas e frieiras, tendo também

ações antissépticas bucal, repelentes contra insetos e favorecer a cicatrização de feridas. Esse

produto é formulado com alecrim (Rosmarinus officinalis l.), losna (Artemisia absinthium l.),

arruda (Ruta graveolens l.), melissa (Melissa officinalis l.), eucalipto-limao (Eucalyptus

globulus labili), sabugueiro (Sambucus australis cham & schltdl), salvia-comum (Salvia

officinalis l.) e aroeira (Schinus molle l.). Em 2008, observou-se o depósito de dois processos:

PI0806023-1 e PI0803306-4, relativos, respectivamente a um produto formulado com óleos

http://formulario.inpi.gov.br/MarcaPatente/servlet/PatenteServletController?Action=detail&CodPedido=828708&PesquisaPorTitulo=&PesquisaPorResumo=plantas%20and%20medicinais&PesquisaPorDepositante=&PesquisaPorInventor=&PesquisaPorProcurador=null



17

essenciais que são clinicamente eficazes para atenuar os sintomas nasais de rinite alérgica e

um gel com nano partículas elaborado a partir de extrato de plantas medicinais (extrato de

aroeira) e do óleo essencial do alecrim-pimenta, para o tratamento de gengivite e aftas bucais

bem como outras doenças bucais de origem bacteriana e fúngica.

Anteriormente a 2008, observa-se em 2007 dois documentos (MU8702237-0 e

PI0701735-9) relativos a uma formulação de sabão obtido partir de misturas de óleos

vegetais, polpa de frutas e plantas medicinais, com propriedades cosméticas que promovem o

crescimento e fortalecimento dos cabelos e um gel dental com plantas medicinais para

tratamento de gengivite. Em 2006, o processo PI0604107-8 refere-se a um fitomedicamento

para tratamento de vitiligo e o processo PI0602388-6 refere-se a um processo de síntese de

elementos manipulados nutricionais, medicinais e cosméticos diversos, na forma de mel. No

ano de 2001 há registro de um composto fitoterápico para tratamento de ulcera venosa, em

1998 uma substância capilar para ressecamento e queda e em 1997 há um processo com

plantas medicinais para tratar uma infecção viral.

Vale aqui destacar que o primeiro fitomedicamento totalmente brasileiro, o Acheflan

(pomada anti-inflamatória produzida a partir da planta Cordia verbenacea), lançado no

mercado em 2005 pelo Aché Laboratórios Farmacêuticos, em parceria com pesquisadores de

Universidades, marca o início de um novo capítulo da história da indústria farmacêutica

brasileira (CALIXTO & SIQUEIRA, 2008). Esse fato vem estimulando outras indústrias e

universidades brasileiras a seguirem o mesmo caminho. O trabalho envolvendo a parceria de

laboratórios de institutos de pesquisa e de universidades constitui uma alternativa à instalação

e à manutenção de custosas estruturas de Pesquisa e Desenvolvimento (P&D). Assim, a

palavra-chave para que esse setor tome o impulso desejado é parceria. Para haver inovação

radical, é preciso haver infusão de recursos privados (NATÉRCIA, 2005).




18

CAPÍTULO III

Prospecção tecnológica: Morinda citrifolia e indústria farmacêutica

Artigo publicado na revista Gestão, Inovação e Tecnologias- GEINTEC

ISSN: 2237-0722. São Cristóvão/SE – 2011. Vol .1/n. 1/ p. 22-31

19

PROSPECÇÃO TECNOLÓGICA: Morinda citrifolia E INDÚSTRIA FARMACÊUTICA

TECHNOLOGICAL FORECASTING: Morinda citrifolia AND PHARMACEUTICAL INDUSTRY

Mairim Russo Serafini1; Gabriel Francisco da Silva2; Adriano Antunes de Souza Araujo 1Universidade Federal de Sergipe – UFS – São Cristóvão/SE – Brasil

[email protected] 2Universidade Federal de Sergipe – UFS – São Cristóvão/SE – Brasil

[email protected] 3Universidade Federal de Sergipe – UFS – São Cristóvão/SE – Brasil

[email protected]

Resumo

As plantas medicinais têm sido utilizadas desde a antiguidade para o tratamento de diversas doenças. Morinda citrifolia L. (“Noni”) é uma planta vastamente empregada pelos povos polinésios há mais de 2000 anos, devido a sua ampla variedade de efeitos terapêuticos, incluindo relatos para dor de cabeça, febre, artrite, gengivite, distúrbios respiratórios, infecções, tuberculose e diabetes, utilizada geralmente em fitoterápicos e cosméticos. O presente trabalho teve como objetivo fazer um mapeamento das pesquisas já desenvolvidas, analisando as potencialidades e a evolução das competências tecnológicas traduzidas através dos depósitos de patentes no que se refere à Morinda citrifolia. A prospecção foi realizada no Banco Europeu de Patentes, no Banco da Organização Mundial de Propriedade Intelectual, no Banco Americano de Marcas e Patentes e no Banco de dados do Instituto Nacional de Propriedade Industrial do Brasil. A classificação internacional mais abundante nessa prospecção foi a Subseção A61 e principalmente na Subclasse A61K, seguido de A61Q e A61P. Dentre os maiores depositantes estão Estados Unidos e Japão. Os dados demonstram uma área promissora, com crescimento relevante de patentes depositadas.

Palavras-chave: Morinda citrifolia L.; prospecção tecnológica; indústria farmacêutica.

mailto:[email protected]


20

Abstract

Medicinal plants have been used since ancient times as medicines for the treatment of a wide range of diseases. Morinda citrifolia L (Noni) has been used in folk remedies by Polynesians for over 2000 years, and is reported to have a broad range of therapeutic effects, including effects against headache, fever, arthritis, gingivitis, respiratory disorders, infections, tuberculosis and diabetes, it is commonly used as herbal medicines and cosmetics. This study aimed to map the research undertaken, analyzing the potential and the evolution of technological capabilities through the translated patent applications with regard to the Moringa. Prospecting was carried out in the European Patent Office, in the database of World Intellectual Property Organization, in the database of United States Patent and Trademark Office and in the database of Instituto Nacional de Propriedade Intelectual of the Brazil. The international classification most abundant is the subsection A61 and especially in subclass A61K, followed by A61P and A61Q. Among the main depositors are the United States and Japain. The data show a promising area, with growth of relevant patents

Key-words: Morinda citrifolia L.; technological forecasting; pharmaceutical industry.

1. Introdução

A Morinda citrifolia Linn, popularmente conhecida como “Noni”, é uma espécie

nativa do Sudeste da Ásia à Austrália, sendo cultivada na Polinésia, Índia, Américas Central e

Sul (WANG et al., 2002).

Morinda citrifolia é uma fruta de extraordinárias propriedades curativas da qual a

maioria das pessoas nunca ouviu falar. Há mais de 2.000 anos tem sido usada com sucesso na

Polinésia, China, Índia e outros países. O Noni migrou com os habitantes dessas regiões para

as ilhas do Pacífico Sul, Taiti, Havai e Malásia. Ficou demonstrado que assim como a babosa

(aloe vera), as algas marinhas, o mamão e outros agentes botânicos, o extrato de Noni auxilia

na melhora de uma enorme gama de enfermidades (SOLOMON, 1999). Além disso,

pesquisas apontam uma proteção do noni contra danos causados por radicais livres, sendo

assim, uma justificativa para o uso desse produto em cosméticos (SOLOMON, 1999; WANG

et al., 2002).

Quando se fala em antecipação de futuro, não se fala de precisão, mas sim de

perspectivas. As metodologias de prospecção são ferramentas que buscam entender as forças

que orientam o futuro, de modo a ‘construir conhecimento’. Os estudos prospectivos buscam

agregar valor às informações do presente, transformando-as em conhecimento de modo a

subsidiar a construção de estratégias e identificação de rumos e oportunidades futuras para

subsidiar a tomada de decisão (SANTOS et al., 2004).

21

A prospecção tecnológica pode ser definida como um meio sistemático de mapear

desenvolvimentos científicos e tecnológicos futuros capazes de influenciar de forma

significativa uma indústria, a economia ou a sociedade como um todo. Diferentemente das

atividades de previsão clássica, que se dedicam a antecipar um futuro suposto como único, os

exercícios de prospecção são construídos a partir da premissa de que são vários os futuros

possíveis. Esses são tipicamente os casos em que as ações presentes alteram o futuro, como

ocorre com a inovação tecnológica. Avanços tecnológicos futuros dependem de modo

complexo e imprevisível de decisões alocativas tomadas no presente por um conjunto

relativamente grande de agentes (KUPFER & TIGRE, 2004).

Esse trabalho teve por finalidade mapear as pesquisas já desenvolvidas e patenteadas,

referentes às formulações cosméticas que possuem a Morinda citrifolia como componente.

2. Metodologia

A prospecção foi realizada tendo como base os pedidos de patente depositados no

European Patent Office (Espacenet), na World Intellectual Property Organization (WIPO),

no United States Patent and Trademark Office (USPTO) e no Banco de dados do Instituto

Nacional de Propriedade Industrial (INPI) do Brasil. O foco da pesquisa foi a Morinda

citrifolia e sua utilização em produtos de uso tópico (cosméticos, antioxidantes e

dermatológicos).

As palavras-chave levadas em consideração foram o nome científico da espécie

(Morinda citrifolia) acrescida de alguns substantivos de interesse: pele (skin), cosmético

(cosmetic), antioxidante (antioxidant) e dermatológico (dermatological). Utilizaram-se os

campos de pesquisa “título” e “resumo” e posteriormente também foi utilizado o campo

“classificação internacional de patentes” (CIP) com o código A61K, referente a preparações

para finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas. A pesquisa foi realizada no mês de

junho de 2011.

22

3. Resultados e discussão

Inicialmente a pesquisa encontrou 06 patentes na base do INPI (no campo resumo e

com palavras-chave em português), 269 patentes na base européia- Espacenet (no campo

título e resumo), 23 na base dos Estados Unidos- USPTO (no campo resumo), 44 na base

mundial- WIPO (na campo folha de rosto), totalizando 342 patentes selecionadas em junho de

2011 (conforme Tabela 1).

Tabela 1. Pesquisa por Palavras-Chave

Palavras-chave INPI EP USPTO WIPO morinda and citrifolia 6 269 23 44 morinda and citrifolia and skin 1 24 0 3 morinda and citrifolia and cosmetic 0 15 0 0 morinda and citrifolia and antioxidant 2 1 0 2 morinda and citrifolia and dermatological 0 1 0 0

Quando se utilizou a palavra central Morinda citrifolia acrescida de alguns

substantivos pode-se verificar uma menor quantidade de patentes. Foi possível a seleção de

patentes referentes ao contexto das palavras: skin (pele) no qual se encontrou um total de 28

patentes, sendo 24 do Espacenet, 01 do INPI e 03 da WIPO; cosmetic (cosmético) que

totalizou 15 patentes (do Espacenet); antioxidant (antioxidante) o qual totalizou 5 patentes: 02

do INPI, 01 do Espacenet e 02 da WIPO; e dermatological (dermatológico) que totalizou 01

patente no Espacenet.

Utilizou-se a pesquisa por classificação internacional na base de dados Espacenet.

Restringindo a pesquisa à palavra-chave Morinda citrifolia e os códigos A61K (referentes a

preparações para finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas) e A61Q (referentes a uso

específico de cosméticos ou preparações similares para higiene pessoal), obtiveram-se 29

patentes, estas que tinham em seu contexto ambos os códigos (conforme Tabela 2). No

entanto verificou-se a presença de 231 patentes com o código A61K e 29 com o código

A61Q, concluindo assim que todas as patentes com código A61Q, também possuíam código

A61K.

23

Tabela 2. Pesquisa por Classificação Internacional

Palavras-chave A61K A61Q EP morinda and citrifolia X 231 morinda and citrifolia X 29 morinda and citrifolia X X 29

3.1 Evolução anual de depósitos de patentes no Espacenet

Ainda no Espacenet, a pesquisa procedeu-se no sentido de verificar a evolução anual

de depósitos de patentes. Utilizando-se os 231 depósitos de pedidos de patentes com a

palavra-chave morinda and citrifolia e com a classificação A61K, verificou-se um aumento do

número de patentes a partir do ano de 2000, destacando-se os anos de 2003, 2006 e 2007. Por

outro lado, constatou-se que houve um decréscimo considerável no ano de 2010, que

apresentou apenas seis patentes e no ano de 2011 com 03 patentes (importante destacar que a

pesquisa foi realizada em junho, sendo computados os dados anteriores a esse mês). O ano de

2007 foi o ano que maior deteve patentes com 23 patentes, seguido pelos anos de 2003 e 2006

que apresentaram cada um 14 patentes (Figura 1).

Figura1. Evolução anual de depósitos de patentes no banco europeu.

24

3.2 Patentes depositadas por país no espacenet

Ainda com os mesmos depósitos de patentes, verificou-se a freqüência de depósitos

por país de origem. De acordo com a Figura 2, o Japão e os Estados Unidos são claramente os

maiores detentores das patentes acerca da Morinda citrifolia, sendo que os Estados Unidos

lideram com 59 patentes, seguido pelo Japão com 58 patentes.

Figura 2. Patentes depositadas por país. Sendo AU (Austrália), CH (Suíça), DE (Alemanha), FR (França), HU (Hungria), JP (Japão), KR (República da Coréia), SE (Suécia), US (Estados Unidos da

América). 3.3 Patentes por código de classificação internacional no espacenet

Preparações para finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas (A61K): De acordo

com o a Figura 3, e seguindo a pesquisa no Espacenet com palavra-chave morinda and

citrifolia e CIP A61K, tem-se maior presença de patentes que apresentam o código A61K36,

representando as preparações farmacêuticas caracterizadas por ingredientes ativos orgânicos.

25

Figura 3. Preparações para finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas – A61K. Sendo A61K8

(Cosméticos, perfumes), A61K9 (Preparações caracterizadas pela forma), A61K31-35-36 (Preparações farmacêuticas caracterizadas por ingredientes ativos orgânicos).

Uso de cosméticos ou preparações similares para higiene pessoal (A61Q): Conforme a

Figura 4, pode-se verificar que dentre os códigos A61Q, uma subdivisão nas preparações para

finalidades médicas odontológicas ou higiênicas, o que apresentou o maior número de

patentes encontra-se no código de A61Q1, representando as preparações para limpeza da pele.

Figura 4. Uso de cosméticos ou preparações similares para higiene pessoal – A61Q. Sendo A61Q1 (Preparações para maquiagem), A61Q5(Preparações para tratamento dos cabelos), A61Q17

(Preparações de barreira), A61Q19 (Preparações para tratamento da pele).

26

Analisando os depósitos de pedidos de patentes no banco mundial – WIPO, com a

palavra-chave morinda and citrifolia, verificamos a seguir os depósitos por ano de publicação,

por país de origem e por CIP.

3.4 Evolução anual de depósitos de patentes na WIPO

A partir da Figura 5, pode-se verificar maior presença de pedidos internacionais por

ano de publicação no ano de 2005, seguido pelo ano de 2007. Verificando-se também que

esses valores tiveram início considerável no ano 2001. A figura abaixo analisa somente os

dados recorrentes do site da World Intellectual Property Organization (WIPO).

Figura 5. Pedidos internacionais por ano de publicação no banco mundial.

3.5 Patentes depositadas por país na WIPO

Dentre os países que mais depositaram patentes via Tratado de Cooperação de

Patentes (PCT), pelo banco mundial, os EUA lideraram o ranking, depositando 40, dos 44

depósitos registrados (Figura 6).

27

Figura 6. Patentes depositadas por país. Sendo EUA (Estados Unidos da América), TW (Taiwan); SE (Suécia), HU (Hungria), CH (Suíça).

3.6 Patentes por código de classificação internacional na WIPO

Dentre os 44 depósitos de pedidos de patente na WIPO, observamos através da Figura

7, que a classificação internacional mais citada é a A61K, que representa preparações para

finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas (29 dos 44 pedidos).

Figura 7. Distribuição por CIP dos depósitos encontrados no banco de dados mundial - WIPO. A61K= preparações para finalidades médicas, odontológicas ou higiênicas; A23L= alimentos, produtos

alimentícios ou bebidas não alcoólicas; A01N= conservação de corpos de seres humanos ou animais ou plantas ou partes dos mesmos; A61P= atividade terapêutica específica de compostos químicos ou preparações medicinais; A61Q= uso específico de cosméticos ou preparações similares para higiene

pessoal; A23K= produtos alimentícios especialmente adaptados para animais; métodos especialmente adaptados para a produção dos mesmos.

28

Dentre os 29 depósitos de pedidos de patente encontrados na subclasse A61K,

podemos observar que estão subdivididos, a maioria, na classificação A61K36= Preparações

medicinais contendo materiais de constituição indeterminadas derivados de algas, líquenes,

fungos ou plantas, ou derivados dos mesmos, por ex., medicamentos tradicionais à base de

ervas (conforme Figura 8).

Figura 8. Distribuição por CIP A61K dos depósitos encontrados no banco de dados mundial. A61K36= Preparações medicinais contendo materiais de constituição indeterminadas derivados de algas, líquenes, fungos ou plantas, ou derivados dos mesmos, por ex., medicamentos tradicionais à

base de ervas; A61K31 = Preparações medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos; A61K35 = Preparações medicinais contendo materiais de constituição indeterminada ou seus produtos de reação;

A61K33 = Preparações medicinais contendo substâncias ativas inorgânicas.

Já no banco Nacional, dentre os seis depósitos de pedidos no INPI, 5 são da A61K,

sendo 4 da A61K35. Um documento é de 2007, 5 de 2004 e um de 2003. Referente ao país de

origem do depósito, todos os documentos tem como país de origem os Estados Unidos.

Dentre os 23 depósitos nos Estados Unidos (base USPTO), 13 são do ano de 2001, 3

de 1999, 4 de 2002, 1 documento de 2004 e um de 2006. Com esse fato podemos inferir que a

partir de 2001, os Estados Unidos começaram a realizar depósitos via PCT, o que explica o

grande número de depósitos quando analisado o banco da WIPO. Ainda sobre esse depósitos,

20 são da classificação A61K, 3 da A23L e 1 da A01N. As subdivisões da A61K são

verificadas na Figura 9.

29

Figura 9. Distribuição por CIP A61K dos depósitos encontrados no banco de dados americano. A61K36= Preparações medicinais contendo materiais de constituição indeterminadas derivados de algas, líquenes, fungos ou plantas, ou derivados dos mesmos, por ex., medicamentos tradicionais à

base de ervas; A61K31 = Preparações medicinais contendo ingredientes ativos orgânicos.

4. Conclusões

Os dados estatísticos demonstraram que a área relacionada a trabalhos com a Morinda

citrifolia é promissora, sendo que a partir do ano 2000 houve um crescente aumento no

número de patentes, principalmente nos anos de 2005 e 2007. Os Estados Unidos lideram o

ranking de patentes por países, porém o Japão apresenta-se com uma quantidade de patentes,

muito próxima à dos Estados Unidos (dado verificado pelo escritório europeu). A maior

tecnologia está aplicada na obtenção de cosméticos para cuidados da pele, sendo mais

explorada na produção de maquiagens e também em preparações medicinais.

Referências

SANTOS, M.M.; COELHO, G.M.; SANTOS, D.M.; FELLOWS, L. Prospecção de tecnologias de futuro: métodos, técnicas e abordagens. Parc Estrat [periódico na internet]. [Acesso em 28/11/2010];19:189,2004). Disponível em: <http://www.cgee.org.br/parcerias/p19.php>].

KUPFER, D.; TIGRE, P.B. Modelo SENAI de Prospecção: Documento Metodológico. Capítulo 2: Prospecção Tecnológica. In: Organizacion Internacional Del Trabajo CINTERFOR Papeles de La Oficina Técnica no.14, Montevideo, 2004.

SOLOMON, N. NONI - O fruto tropical de 101 Aplicações medicinais SUMO DE NONI (Morinda Citrifolia). 1ª edição. Geneva RD Vineyard, Utah, 1999.

WANG, M.Y., OESTE, B.J.; JENSEN, C.J.; NOWICKI, D.; SU, C.; PALU, A.K.; ANDERSON, G. Morinda citrifolia (Noni): uma revisão da literatura e os recentes avanços na pesquisa Noni. Acta Sin Pharmacol. (12): 1127-41, 2002.

30

CAPÍTULO IV

UVA-UVB photoprotective activity of topical formulations containing Morinda citrifolia extract

Artigo enviado à Oxidative Medicine and Cellular Longevity Fator de Impacto 2.841

31

Dear Dr. Serafini,

The Research Article titled "UVA-UVB photoprotective activity of topical

formulations containing Morinda citrifolia extract," by Mairim Russo

Serafini, Cassia Britto Detoni, Paula dos Passos Menezes, Rose Nely

Pereira, Vanessa Silveira Fortes, Fonseca, Maria Jose V., Silvia S.

Guterres, Ricardo L.C. Albuquerque-Júnior and Adriano A. S. Araújo has been

received and assigned the number 705649.

An editor will be assigned to handle the review process of your manuscript,

and he/she will inform you as soon as a decision is reached.

All authors will receive a copy of all the correspondences regarding this

manuscript. However, only the submitting author will be able to upload any

revisions to the journal's Manuscript Tracking System.

Thank you for submitting your work to Oxidative Medicine and Cellular

Longevity.

Best regards,

Nahla Mostafa

Editorial Office

Hindawi Publishing Corporation

http://www.hindawi.com

32

UVA-UVB photoprotective activity of topical formulations containing

Morinda citrifolia extract

Mairim Russo Serafini1; Cassia Britto Detoni2; Paula dos Passos Menezes1; Rose Nely Pereira Filho3; Vanessa Silveira Fortes4; Maria José Fonseca Vieira4; Sílvia Stanisçuaski Guterres2;

Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Junior3; Adriano Antunes de Souza Araújo1

1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão, SE,

Brazil.

2Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre,RS, Brazil.

3Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP), Aracaju, SE, Brazil.

4Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP), Ribeirão Preto, SP,

Brazil.

Correspondence should be addressed to Mairim Russo Serafini, [email protected].

ABSTRACT

Exposure to solar radiation, particularly its ultraviolet (UV) component, has a variety of harmful effects on human health. Some of these effects include sunburn cell formations, basal and squamous cell cancers, melanoma, cataracts, photoaging of the skin, and immune suppression. The beneficial photoprotective effects of topical formulations with the extract, Morinda citrifolia, have not been investigated. This present study aims to investigate the potential benefits of M. citrifolia topical application on the dorsal skin of mice, exposed to UVA-UVB light. Using 7 days of treatment, [before (baseline values) and 20 h after UV-exposure], the thickness, skin barrier damage (TEWL), erythema and histological alterations were evaluated. The results showed that the formulations containing the extract protected the skin against UV-induced damage.

Key-words: UV radiation, topical formulations, Morinda citrifolia , leaves, extract, photoprotective.

33

1. INTRODUCTION

Ultraviolet radiation (UVR) from the sun is divided into UVC (200-290 nm), UVB

(290-320 nm) and UVA (320-400 nm) [1]. Skin is the body organ that is most exposed to

UVR. Human skin is constantly exposed to potentially harmful compounds and radiation

because it serves as a protective barrier between the environment and its internal organs, thus

making it liable to aging [2].

Photoaging is a long-term process that results from chronic exposure of the skin to

solar UV radiation. UV radiation has been shown to cause a variety of lesions in DNA

including pyrimidine dimmers of cyclobutane type, photoadducts of the pyrimidine,

pyrimidine type and other nucleic acid base photoproducts such a single-strand breaks and

DNA-protein cross-links. These photoproducts are implicated in cellular lethality, mutation

and other biological effects [3]. Photoaging is characterized by thickening, roughness, coarse

wrinkles, mottled pigmentation, and histologic changes, including damage to collagen fibers,

the excessive deposition of abnormal elastic fibers, and an increase in glycosaminoglycans [4-

6]. This phenotype is caused by alterations in cellular function, as well as deterioration of the

extracellular matrix of skin connective tissue (dermis). The dermis provides structural support

for the skin, and chronic solar UV exposure leads to fragmentation and disorganization of the

primary structural protein elastin and collagen [7].

Several studies have evaluated the protective effect of natural products against damage

induced by UVR in cells, tissues, animals and humans. Photochemoprevention is the use of

synthetic or natural substances that prevent, delay or reverse the damage caused by UVR [8-

9]. Within this concept we can find a variety of polyphenolic compounds with antioxidant,

anti-inflammatory, immunomodulatory and antimutagenic properties. In general,

photochemopreventive agents act on two levels: a) prevention of the damage caused by UVR

34

and b) modulation of different cellular responses to UVR that can prevent, stop or correct

tumor promotion and progression [1,9,10].

Free radicals and reactive oxygen species can be generated not only in metabolic

reactions but also by UV radiation, especially by UVA (320-400 nm) radiation involving

sensitized reactions. There are many endogenous chromophores in human skin which in the

presence of UVA radiation can generate reactive oxygen species in the connective tissue of

skin [3]. A decrease in the reactive oxygen species (ROS) load by efficient sunscreens andor

other protective agents may represent a promising strategy in preventing or at least

minimizing ROS-induced cutaneous pathological states [11-13]. It has been suggested that the

beneficial effects of topical antioxidants might be a successful strategy for diminishing UV

radiation-mediated oxidative damage of the skin [14]. Thus, botanical antioxidants have

shown good potential as photoprotective agents [15].

The tropical plant Morinda citrifolia , commonly known as 'Noni', is widely distributed

in areas of Micronesia, Hawaii, Australia, and Southeast Asia. The genus Morinda , belongs to

the family Rubiaceae, is indigenous to tropical countries, and is considered an important

traditional folk medicine [16-17].

The fruits, roots, barks, and leaves of M. citrifolia have been used as folk medicine for

the treatment of various illnesses, including burns, cancer, cold sores, skin inflammation and

wounds, among other [18-20].

In previous study, we demonstrated that the aqueous extract from M. citrifolia leaves,

contains alkaloids, coumarins, flavonoids, tannins, saponins, steroids, triterpenoids, and

showed relevant in vitro antioxidant activity against different radicals [20]. A carbomer gel

base, containing the ethanol extract and juice pressed from the leaves, was evaluated in a

UVB-induced erythema, and the UVB dose required to induce erythema was almost 3.5 times

greater than with untreated skin [21]. Based on this data, we decided to investigate the

35

potential benefits of topical application of aqueous extract from Morinda citrifolia in on skin

exposed to UVA-UVB light.

2. MATERIAL AND METHODS

2.1 Preparation of Morinda citrifolia extract

M. citrifolia leaves were collected in São Cristóvão, Sergipe, Brazil

[10º18´20.7”(S);36´39’7.2” (W)]. Herbarium voucher specimens (registry number 13503)

were prepared and deposited at the Department of Biology, Federal University of Sergipe.

The extract was prepared by boiling dry leaves in distilled water (7.5%; w/v) for 15 minutes;

the solvent evaporated under reduced pressure and lyophilized.

2.2 Preparation of Morinda citrifolia formulations

The Morinda citrifolia extract (0%, 10% or 15% w/w) was dissolved in water (2.5

mL) and in ethanol (0.5 mL). Then, the formulation was suspended in Hydroxyethylcellulose

(2%). Imidazolnidil ureia (20 µL) was added at the end. The controlled formulations did not

contain the Morinda citrifolia extract (0%). The formulations were stored at 4 ºC.

2.3 Measurement of spreadability

The spreadability of the formulations was determined by compressing the sample

under several glass plates of known weight [22]. Twenty plates were subsequently placed

over the sample at 1-min intervals. The spreading areas reached by the sample were measured

in millimeters on vertical and horizontal axes. The results were expressed in terms of the

spreading area as a function of the applied mass according to the following equation (1):

36

Equation (1)

in which Si is the spreading area (mm2) resulting from the applied mass i (g), and d is the

mean diameter (mm) reached by the sample. The spreading area was plotted against the plate

weight to obtain the spreading profiles. The experiment was repeated three times and the

mean time was taken for calculation.

2.4 in vitro effectiveness

The formulations were scanned under UV light (200 to 400 nm) using a UV -1 800 PC

spectrophotometer. Samples were placed in a quartz cuvette (model 4-Q, Hellma, Germany),

presenting a capacity of 3 mL and an optical path length of 1 cm. To subtract the scattering of

the gel matrix, a blank formulation (0% extract) prepared exclusively with

Hydroxyethylcellulose and ethanol/water was used as the baseline [23].

2.5 In vivo effectiveness

Male CF1 mice, weighing 20–30 g (n=10 per group), were housed in a temperature-

controlled room, with access to water and food ad libitum until use. They were housed within

cages with a 12 h light and 12 h dark cycle. All experiments were conducted in accordance

with National Institutes of Health guidelines for the welfare of experimental animals and with

the approval of the Ethics Committee of the Faculty of Pharmaceutical Science, Porto Alegre,

Rio Grande do Sul (Number 21804).

The animals were divided into five groups (n = 10): Group 1 = non irradiated control-

NIC (the group was not irradiated and did not receive any topical treatment), Group 2 =

irradiated control-IC (the group was irradiated but did not receive any topical treatment),

Group 3 = irradiated and treated with the formulation 10% , Group 4 = irradiated and treated

37

with the formulation 15%, and Group 5 = irradiated and treated with the vehicle-IV

(formulation 0%).

Animals were anesthetized before formulation administration using intraperitoneal

ketamine (80 mg/kg) and xylasin (10 mg/kg).

2.6 Formulation administration

CF1 mice were randomly designed to different groups with 10 mice in each group.

After the removal of dorsal hair (by trichotomy followed by 2 min exposure of the surface to

Veet® cream) the mice were topically treated on the dorsal surface (2x2 cm) with 0.1 g of

formulations daily. The formulations were administrated 30 min before the dorsal surface

irradiation. The untreated control groups irradiated and non-irradiated were included in the

experiments.

2.7 Irradiation

The UVA-UVB source of irradiation consisted of a Repti Glo 10.0 lamp (Exo Terra)

emitting a continuous spectrum between 270 and 400 nm 33% UVA and 10% UVB. The

lamp was mounted 20 cm above the support where the mice were placed on. The UVA-UVB

output was measured using a model UV-400 Research Radiometer (I cel) with a radiometer

sensor for UVA and UVB. The majority of the resulting wavelengths were in the UVB (290–

320 nm; above 90%) and UVA (less than 10%) range and the peak emission was recorded at

314 nm. The mice were irradiated for 7 days, 2 h/day, with a dialy dose of 1.9 J /cm2.

38

2.8 Skin biophysical techniques

The thickness of irradiated skin was measured by 7 days of treatment by dial thickness

gage (Mytutoyo®).

Transepidermal water loss (TEWL) was measured using a Tewameter R TM 210

(Courage & Khazaka Electronic GmbH, Germany) before (baseline values) and 20 h after

UV-exposure with 7 days of treatment. Readings of TEWL were registered in g/m2.h during 2

min after 30 s probe equilibration on the skin. The UV-induced skin barrier damage, assessed

by TEWL measurements, is due to abnormalities in the structures related to corneocytes

adhesion and to disruption of the epidermal permeability barrier function [24].

Erythema was measured photometrically using a Mexameter R MX16 (Couragem &

Khazaka Eletronic GmbH, Cologne, Germany) before (baseline values) and 20 h after UV-

exposure over 7 days. Six readings of the erythema index were recorded at each area at both

points in time. The degree of erythema, quantified as an erythema index, is related to the

hemoglobin content.

2.9 Animal sacrifice

After treatment over 7 days, the mice were sacrificed by cervical dislocation 2 h after

the ultimate UVA-UVB exposure. The full thickness of the dorsal skins were removed and

fixed in 10% formalin until histological measurements.

2.10 Histological measurements

Skin biopsies were fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, according to routine

protocol of histological procedures. Five micrometer thin sections of the paraffin-embedded

skin were obtained and stained by means of hematoxilin eosin (HE) and Sirius red (SR)

histochemical methods. Morphological analysis of the histological sections was performed by

39

light microscopy followed by a closed numerical protocol in such a manner as the pathologist

was not aware of what group was being evaluated until the end of the experiment.

2.11 Measurement of Cytotoxicity Activity

The B16F10 (murine malignant melanoma ATCC® CRL- 6475) cells were obtained

from the Rio de Janeiro Cell Bank, Brazil. They were routinely grown in 150 cm2 tissue

culture flasks in DMEM, supplemented with 1% (v/v) of an antibiotic solution containing 5

mg of penicillin, 5 mg of streptomycin and 10 mg of neomycin per mL, and 7.5% or 10.0%

(v/v) heat-inactivated Fetal Bovine Serum at 37 °C under 5% CO2.

The sensitivity of the cells to the Morinda citrifolia extract was determined by a

standard spectrophotometric 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

(MTT) assay [25]. Cells were seeded at a density of 105 cells/well into 96 well plates and

incubated for 24 h at 37 °C in an atmosphere of 95% air and 5% CO2. Then, 20 μL of extract

at different concentrations in a phosphate buffer saline (PBS) was added to the culture plates

for 24 h. After treatment, cells were rinsed once with PBS and a serum-free culture medium

without phenol red and were replaced in all wells. Cells were then incubated for 4 h with

MTT solution (5 mg/mL).

The yellow tetrazolium salt was metabolized by viable cells to form purple crystals of

formazan. The crystals were solubilized overnight (12 h) in a mixture consisting of 20%

sodium dodecyl sulfate (SDS) in HCl (0.01 M). The product was quantified

spectrophotometrically by measuring the absorbency at 570 nm using a microplate reader

(μQuantTM, BioTek Instruments Inc., USA). The cellular viability was expressed as a

percentage of viable cells compared to the control group.

The percentage of viable cells was calculated as follows:

%Viability = (Total number of viable cells/Total number of viable and nonviable cells) × 100

40

2.12 Statistical analysis

Data were expressed as mean ± Standard error of the mean (SEM) or ± Standard

Deviation (SD) . The data obtained was evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA)

followed by Tukey’s test. Data analyses were performed using the GraphPad Prism 5.0

software. In all cases differences were considered significant if p < 0.05.

3. RESULTS

3.1 Measurement of spreadability

The spreadability is an essential characteristic of semisolid pharmaceutical dosage

forms for dermal application. Thus, the spreadability factor was measured (Table 1). The

formulation containing the extract at 10% presented the higher spreadability (1.144 g.cm-1)

against the formulation containing the extract at 15% (0.916 g.cm-1).

Table 1. Measurement of spreadability of formulations containing Morinda citrifolia

extract (10% or 15% w/w)

Formulations *SP1 *SP2 *SP3 *SP Mean

Extract 10% 1.136 1.044 1.253 1.144

Extract 15% 0.955 0.824 0.969 0.916

* spreadability factor (g.cm-1)

3.2 in vitro effectiveness

The absorbance spectrum of the formulations extracts (10% and 15%) (Figure 1)

showed bands at 200 nm and at 240 nm and it showed absorbance in the UVA and UVB

regions. The blank formulation (0% extract) did not show absorbance in this spectra.

41

Figure 1. UV absorbance spectra of a blank formulation (0% extract), formulation extract

10% and formulation extract 15%. The formulations were scanned under UV light (200 to 400

nm).

3.3 Skin biophysical techniques

The results showed that the thickness, TEWL values and erythema indexes were

significantly increased by treatment with formulations containing the extract (Figs 2A, 2B and

2C, respectively).

Figure 2. A) Thickness values (mm), B) Transepidermal water loss, C) Erythema obtained for

the dorsal areas. IV=irradiated and treated with the vehicle (formulation 0%). IC= irradiated

control (the group was irradiated but did not receive any topical treatment). NIC= non

irradiated control (the group was not irradiated and did not receive any topical treatment).

10%= group irradiated and treated with the formulation 10%. 15%= group irradiated and

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

(a.u

.)

IV ICNIC

10%

15%

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

#***

Groups n=10

Th

ickn

ess (

mm

)

*** ***# #

IV ICNIC

10%

15%

0

10

20

30

40

##***

*** **

Groups n=10

TE

WL

(g

/hm

2)

#

IV ICNIC

10%

15%

0

100

200

300

400

## #****

Groups n=10

Ery

them

a in

dex

*

A B C

42

treated with the formulation 15%. The values was obtained before (baseline values) and 20 h

after UV-exposure during 7 days of treatment. (n=10 mice). # P < 0.05 versus IC. *P <0.05,

**P <0.01, and ***P <0.001 versus IV. ANOVA, followed by Tukey’s test. Data represents

mean ± SEM)

3.4 Pathological changes in the skin surface

Treated areas with the formulation containing Morinda citrifolia extract (10 and 15%)

have enhanced protection against UV radiation (Figure 3).

Figure 3. Skin biophysical techniques. Photoprotective effects of formulations on UVA-UVB-

induced pathological changes in the skin surface on different groups after 7 days of treatment.

IV=irradiated and treated with the vehicle (formulation 0%). IC= irradiated control (the group

was irradiated but did not receive any topical treatment). NIC= non irradiated control (the

group was not irradiated and did not receive any topical treatment). 10%= group irradiated

and treated with the formulation 10%. 15%= group irradiated and treated with the formulation

15%.

3.5 Histological measurements

Hematoxilin Eosin (HE)

As demonstrated in Figure 4A, the non-irradiated group showed that the epidermis

was represented by a thin, continuous, squamous, epithelial lining with an orthokeratotic

surface. The connective tissue showed interlaced collagen fibers associated with spindle and

round shaped stromal cells, consistent with fibroblasts. Some few capillary vessels and

NIC IC

10%

15%

IV

43

venules could also be seen, as well as numerous cutaneous appendages. No inflammatory

infiltrate were found in the dermal tissues. Both irradiated and vehicle groups (Figure 4B and

4C) presented increased epidermal thickness associated to hyperorthokeratosis. The papillary

dermis exhibited intense inflammatory infiltrate, mainly composed of lymphocytes, mild

interstitial edema and prominent capillary and venular hyperemia. Extensive areas of elastotic

alterations of the collagen bundles (basophilic degeneration) were also observed throughout

the connective tissue (Figure 4D). The treated groups presented remarkable reduction in the

inflammatory content, as well as less expressive hyperemia. However, epidermal thickening

was more evident in 10% than in 15% formulation (Figure 4E and 4F). Such similar

histological features were quite similar to those verified in the normal dermal/epidermal

tissues.

44

Figure 4. Hematoxylin-eosin stained histological sections. (A) Non irradiated group-NIC

showing thin epidermal lining and absence of dermal inflammation. (B) Irradiated-IC and (C)

vehicle groups-IV presenting epidermal thickening and intense lymphocytic infiltration in the

dermal tissue. (D) Elastotic change of the collagen. (E) 10% and (F) 15% formulations

showing marked reduction of the inflammatory response. Note the thin epidermis in 15%

formulation. Short thick arrows: epidermis. Long thin arrows: Dermal connective tissues

(Hematoxylin Eosin, 400 x magnification).

45

Sirius Red (SR)

The Non irradiated-NIC groups presented interlaced less compacted type I and III

collagen fibers (Figure 5A and 5B). In irradiated and vehicle groups, the papillary dermis

showed the presence of a gross, thick, parallel-arranged, collagen fibers, exhibiting intense

yellow birefringence (type I collagen), which were associated to shorter and thinner reddish

fibrils, perpendicularly disposed in relation to the surface. Such collagen bundles were

densely compacted, showing sparse interfibrillar spaces (Figure 5C and 5D). Both treated

groups (10 and 15% formulations) presented similar features regarding the collagenization

pattern, showing a mixture of yellowish type I (predominant) and greenish type III collagen

fibers. These fibers were more delicate, slightly wavy with variable thicknesses, lengths, and

exhibited interlaced arrangements (Figure 5E and 5F). The interfibrillary spaces were more

evident than in irradiated and vehicle groups. Such morphological appearances were very

similar to that observed in non irradiated group (Figure 5A and 5B).

46

A B

C D

E F

70 цm 70 цm

70 цm 70 цm

70 цm 70 цm

Figure 5. Sirius Red stained histological sections. (A – B) Non irradiated-NIC groups

presenting interlaced less compacted type I and III collagen fibers. (C) Irradiated-IC and (D)

vehicle groups-IV showing dense disposition of parallel-arranged type I collagen fibers. (E)

10% and (F) 15% formulations presenting morphological and architectural collagen

deposition pattern resembling that observed in the normal dermis (Sirius Red/Polarization

Light, 400 x magnification).

47

3.6 Measurement of cytotoxicity activity

The extract was evaluated on murine malignant melanoma (cell line B16F10) in order

to examine their cytotoxic effects on malignany cells. Cytotoxicity of the extract on the

growth of the B16F10 cell line is shown in Figure 6. Cell proliferation was analyzed 24 h

after B16F10 cells had been cultured with the extract at different concentrations (0.05, 0.1,

0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8 and 25 mg/mL) using the MTT assay. The extract at

concentrations of 0.05 to 12.8 mg/mL did not show any cytotoxic effects in the B16F10 cell

line (showed no potential anti cancer). A reduction in cell viability at high concentrations was

observed (25 mg/mL).

0.05 0.

10.

20.

40.

81.

63.

26.

412

.825

.0

0

50

100

150

Morinda citrifolia extract (mg/mL)

Cell

via

bilit

y (

%)

Figure 6. Cytotoxic effect of the Morinda citrifolia extract in B16F10 (murine malignant

melanoma) cell line pretreated with the extracts at concentrations (0.05 to 25 mg/mL) for 24

h. Each value represents the mean ± SD.

4. DISCUSSION

The most distinguished harmful effect of solar exposure is premature skin aging,

especially UV irradiation. In recent years, thinning of the ozone layer has caused increased

48

UV exposure. Detrimental effects of UV on the skin involve the generation of reactive oxygen

species (ROS) [26]. Components of the skin, including DNA, lipids, and proteins, can be

impaired by ROS, which is the cause of erythema, sunburn, immune suppression, and skin

cancer [27]. Most of the disorders were formerly regarded as having been caused by UVB.

Nevertheless, recent studies showed that UVA is also an essential factor [28].

Accordingly, use of antioxidants, capable of scavenging and quenching ROS is an

another important approach to prevent UVB induced photo-aging [29]. Other studies have

shown that botanical compounds with an anti-oxidative activity are potential agents capable

of reducing skin diseases including photo-aging [30-31].

The extract used in this work was the same studied by Serafini et al. 2011 [21] and

showed relevant in vitro antioxidant activity against different radicals. The extract was

chemically analyzed (qualitative method). The phytochemical screening of extract showed the

presence of alkaloids, coumarins, flavonoids, tannins, saponins, steroids, and triterpenoids.

Total phenolic content of the extract was 196.8 mg of phenolic equivalents (gallic acid) per

gram of extract. Furthemore qualitative analysis of extract was performed by HPLC, revealing

the presence of 3 major compounds, all showing ultraviolet spectra typical of flavonols

(quercetin-3-O-rutinoside or rutin, and kaempferol glycosides). According to Deng et al.,

[32] flavonol glycosides, mainly rutin, are the major compounds in M. citrifolia leaves.

The presence of rutin in the formulation could also be secondarily involved in this

process of collagenization. It has been demonstrated that the rutin is able to impair the

glycation of collagen [33] a biochemical event involved in the pathogenesis of cell damaging

in UV-irradiated tissue [34].

The use of botanical supplements to protect the human skin from the adverse

biological effects of solar radiation has received great interest in recent years [35]. However,

most tests have been conducted by oral ingestion or topical application of these ingredients in

49

inappropriate vehicles, which can alter the skin barrier. To be of practical use to

dermatologists and to be safe and efficient, extracts must have physicochemical

characteristics that permit their incorporation in adequate concentrations in a skin-compatible

vehicle (e.g. gels, moisturizing creams, etc.) [36]. In this study, the capacity of the Morinda

citrifolia extract, added to topical formulations (gels), to prevent or to treat UVA-UVB

irradiation-induced skin damage in mice was evaluated.

First, three formulations presenting different concentrations (0%, 10% and 15%) were

evaluated in vitro by spectrophotometer. UV absorbance spectra showed peaks at 200 nm and

at 240 nm (UVC region) and absorbance in the UVA (320-400 nm) and UVB (290-320 nm)

regions. The blank formulation (0% extract) did not show absorbance in this spectra. These

data are compared to commercial organic filters. Thus, this result suggests a photoprotetive

effect of the extract. The concentration of formulation (10% and 15% w/w) used in this assay

was selected based on a pilot study.

Second, the gel formulation efficacy against UVA-UVB induced skin damage was

evaluated in vivo by measuring the following parameters: thickness values (mm),

transepidermal water loss (TEWL), and erythema.

Moisturizing, anti-free radicals and sunscreen products have been used largely to

prevent skin disorders resulting from UV damage. However, other aspects of skin damage

should be considered, such as: erythema, sunburn cell formation, epidermal hyperplasia, also

impairment of the skin barrier integrity, which in turn is related to skin dryness, skin aging

and increased incidence of irritant contact dermatitis [37].

UV radiation damages the structures responsible for corneocyte adhesion and the

functioning of the permeability barrier, which in turn alter thicknesses and TEWL

measurements and accelerate the desquamation process [36].

50

The thickness, TEWL and erythema were observed in our study and only the

formulations containing M. citrifolia extract protected mouse skin against the UV-induced

damages. The pronounced protective effects provided by both formulations (10 and 15%) in

the three parameters measured were not due to any extraneous raw material, but was shown

by the unprotected groups treated by vehicle only (VI). Furthermore, the damage to these

parameters were considered relevant, showing that areas treated with this extract (10 and

15%) were statistically equivalent to the unirradiated control ones (NIC), which represented

the intact skin areas.

TEWL is an important parameter to be evaluated in studies of skin photoprotective

effects, considering that UV irradiation of mammalian skin disrupts the epidermal

permeability barrier function, accompanied by an increase in transepidermal water loss

(TEWL) and alterations in the stratum corneum lipid profile [36].

In the TEWL measurement, the group 10% was different from IC, and the 15% was

not. As well as, in the thickness and TEWL, the protective effect of 10% was most

pronounced. It can also be seen in the photos of the dorsal’s animals. This observation can be

explained by differences in the spreadability. Formulations containing extract at 10%

presented the higher spreadability.

The spreadability is represented by the thickness of the film that the preparation leaves

on the skin, an important feature in cosmetics [38]. Those producing thinner films, that is,

higher spreadability, are naturally of greater interest [39].

Formulations containing extracts were shown to be effective also in the presence of

erythema, another parameter often used to evaluate photoprotection. Extract formulations

reduced erythema formation when compared with the irradiated control (IC). This statement

corroborates West et al. [21], which demonstrated that the M. citrifolia leaf extracts mitigate

51

the effects of UV light and provide some measure of defense against localized inflammation

(topical microswelling).

Third, histological parameters were analyzed. Epidermal thickening and inflammatory

changes are common histological changes observed in mice skin after short-term UV

exposure [40-41]. Such an increase in the epidermal thickness is supposed to occur in

response to cell proliferation in attempt to regenerate the tissue, leading to a compensatory

type of hyperplasia. Although the thickened epidermis as well as the thickened keratin layer

(hyperkeratosis) could be observed in this study.

The presence of intense inflammatory infiltrate, elastosis and the accumulation of

parallel-arranged type I collagen fibers observed in IC and vehicle groups have also been

described as UV-induced dermal changes [34]. Inflammation is one the major histological

signs of tissue damage, and has been reported in other studies as an early change of the

connective tissue after UV exposute [40-41]. On the other hand, elastosis represents an

actinic-induced accumulation of amorphous elastin material replacing the normal dermis,

unrelated to preexisting or newly synthesized collagen [42]. Moreover, it has been proposed

that UV irradiation impairs ongoing collagen synthesis, primarily through the down-

regulation of types I and III procollagen expression [43]. Therefore, such impairment could

likely promote delay in the collagen remodeling, leading to the typical immature parallel-

arranged disposition of the fibers [34].

In this study, only 15% formulation avoided compensatory epidermal thickening.

However, the reduction of the major deleterious effects associated with the UV-exposure on

the animals treated with both 10 and 15% formulations is strongly suggestive of

photoprotective effect, regardless the extract concentration.

Lastly, the extract was evaluated on murine malignant melanoma in order to examine

their cytotoxic effects on malignany cells. It was observed a reduction in cell viability only at

52

the highest concentration (25 mg/mL). These can suggest that the extract (in low

concentrations) have only photoprotection effects and does not anti-melanoma activities.

5. CONCLUSION

In conclusion, present results strongly suggest the photoprotective effect of M.

citrifolia. The results indicate that photoprotective effects are not due only to UV absorbance,

like the UV filters, but to biological effects, which happened mainly with the application of

the formulation containing the Morinda citrifolia extract. Further studies are necessary to

clarify the precise nature of this photoprotective effect.

Acknowledgments

This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Sergipe

(FAPITEC-SE) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) of Brazil.

53

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58

CAPÍTULO V

DISCUSSÃO, CONCLUSÃO, PERSPECTIVAS E REFERÊNCIAS

59

4. DISCUSSÃO

Tratando-se de inovação, a Morinda citrifolia com aplicação dermatológica tem um

futuro promissor, uma vez que muitas pesquisas e patentes são realizadas com a espécie em

questão. Porém, no quesito de proteção à radiação ultravioleta o campo é escasso.

Paralelamente, já está bem documentado que a radiação ultravioleta causa danos ao

organismo, principalmente pela geração de radicais livres. Os componentes da pele, incluindo

DNA, lipídeos e proteínas podem ser danificados pelos radicais livres, gerando eritemas,

queimaduras solares, imunossupressão e câncer de pele. Assim, produtos naturais com

propriedade antioxidantes (que combatam radicais livres) são muito úteis em formulações

para fotoproteção da pele. Dentre os produtos naturais com propriedades antioxidantes

encontram-se os flavonoides, tendo como representantes rutina e quercetina.

Trabalhos anteriores já mostraram a capacidade antioxidante do extrato aquoso da

Morinda citrifolia , a qual pode estar relacionada com a presença da rutina, flavonoide

encontrado no extrato. Assim, essa propriedade pode ser uma justificativa para a fotoproteção

no presente estudo.

O gel obtido com a incorporação do extrato a 10% e 15% em um veículo, mostrou

absorção no espectro no comprimento de onda de raios UVA (320-400 nm) e UVB (290-320

nm), sendo comparadas as absorções decorrentes de filtros orgânicos de proteção.

No ensaio in vivo, os animais foram monitorados no decorrer dos sete dias de

experimento, sendo avaliados padrões morfológicos tais como espessura da pele, perda

transepidérmica de água e eritema. Uma vez que a radiação ultravioleta leva a alterações

estruturais da epiderme, tornando a pele mais espessa, até mesmo por um mecanismo de

proteção natural, e eleva a perda transepidérmica de água, tornando a pele mais ressecada.

Também torna-se visível o aparecimento de eritema, causado pela vasodilatação dos vasos

sanguíneos da pele, em razão do calor. Todos esses parâmetros foram melhorados nos animais

tratados com as formulações obtidas com extrato a 10% e 15%, especialmente a formulação

10%, o que pode ser justificado pelo seu fator de espalhabilidade ser melhor quando

comparado com o da formulação a 15%. Ficou visível também a perda da integridade

estrutural no dorso dos animais ou que não receberam formulação, ou que receberam apenas o

veículo da formulação.

Os resultados dos parâmetros morfológicos são corroborados com os parâmetros

histológicos, uma vez que os animais tratados com as formulações apresentaram uma camada

mais delgada de epiderme e não foram encontrados infiltrados inflamatórios nos tecidos da

derme, ao contrário dos grupos irradiados sem formulação ou com apenas o veículo, que

60

apresentaram aumento da epiderme, associada à hiperortoqueratose e infiltrados

inflamatórios, composto principalmente de linfócitos, edema intersticial e hiperemia. Em

relação ao colágeno, os animais tratados com extrato incorporado a 10% e 15% apresentaram

características semelhantes ao grupo não irradiado, mostrando uma mistura de fibras de

colágeno tipo I e tipo III. Em geral a integridade da pele ficou mais evidente nos animais

tratados com concentração de 15%.

Por fim, foi verificado o comportamento de células de melanoma maligno incubadas

com concentrações crescentes de extrato. Mesmo em concentrações maiores, o extrato não

mostrou-se eficaz na diminuição da viabilidade celular dessa linhagem. Assim, fica evidente

que as formulações podem ser utilizadas, num primeiro momento, apenas como tratamento

preventivo dos danos causados pela radiação ultravioleta. Novos estudos serão úteis na

tentativa de elucidação desses mecanismos.

5. CONCLUSÃO

Quanto ao efeito de fotoproteção, no parâmetro espessura, eritema, perda

transepidérmica de água e análise histológica, pode-se sugerir que o extrato exerceu uma

proteção aos danos causados pela radiação ultravioleta. Diante do resultado apresentado,

pode-se observar que o extrato aquoso das folhas de Morinda citrifolia não apresentou efeito

anti-melanoma mesmo nas maiores concentrações, mantendo dessa forma, os percentuais de

viabilidade celular inalterados estatisticamente.

6. PERSPECTIVAS

Atingindo-se o objetivo da pesquisa, o qual foi avaliar se o extrato das folhas da

Morinda citrifolia teria ação na fotoproteção à pele, e atingindo bons resultados, espera-se

agora fazer uma adequação da formulação para melhor aceitação e aplicabilidade. Com o

desenvolvimento da formulação mais adequada, poderá ser avaliado o fator de proteção da

formulação, bem como estudos de permeação cutânea, caracterização físico-química e

controle de qualidade da mesma. Outro passo seria ensaios clínicos em humanos para oferecer

ao usuário o máximo de segurança com o menor risco, consequentemente ensaios de

compatibilidade cutânea a fim de que o produto torne-se “dermatologicamente testado”, com

seu uso validado, e posteriormente possa vir a ser comercializado e constantemente

aprimorado. Paralelamente às perspectivas experimentais, almeja-se realizar uma revisão

sistemática dos trabalhos já publicados com a Morinda citrifolia .

61

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68

VICENTINI FTMC, SIMI TRM, CIAMPO JOD, WOLGA NO, PITOL KL, IYOMASA MM, BENTLEY MVLB, FONSECA MJV. Quercetin in w/o microemulsion: in vitro and in vivo skin penetration and efficacy against UVB-induced skin damages evaluated in vivo. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 69: 948-957, 2008.

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69

CAPÍTULO VI

ANEXOS

70

ANEXO I - PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO

ARTIGOS PUBLICADOS

1. LIMA GM; QUINTANS-JÚNIOR LJ; THOMAZZI SM; ALMEIDA EMS; MELO MS;

SERAFINI MR; CAVALCANTI SCH; GELAIN DP; SANTOS JPA; BLANK AF; ALVES

PB; LIMA JT; ROCHA RF; MOREIRA JCF; ARAÚJO AAS. Phytochemical screening,

antinociceptive and anti-inflammatory activities of Chrysopogon zizanioides essential oil.

Revista Brasileira de Farmacognosia (Impresso), v. 22, p. 443-450, 2012.

2. FONTES-JR UR; RAMOS CS; SERAFINI MR; CAVALCANTI SCH; ALVES PB; LIMA

GM; ANDRADE PHS; BONJARDIM LR; QUINTANS-JÚNIOR LJ; ARAÚJO AAS.

Evaluation of the lethality of Porophyllum ruderale essential oil against Biomphalaria

glabrata. African Journal of Biotechnology, v. 11, p. 3169-3172, 2012.

3. BONJARDIM LR; CUNHA ES; GUIMARÃES AG; SANTANA M; OLIVEIRA MG;

SERAFINI MR; ARAÚJO AAS; ANTONIOLLI AR; CAVALCANTI SCH; SANTOS

MRV; QUINTANS-JÚNIOR LJ. Evaluation of the Anti-Inflammatory and Antinociceptive

Properties of p-Cymene in Mice. Zeitschrift für Naturforschung. C, A Journal of

Biosciences, v. 67, p. 15-21, 2012.

4. SERAFINI MR; VERGNE DMC; RABELO TK; MENEZES PP; ROCHA RF; MOREIRA

JCF; SILVA FA; JESUS HCR; ARAÚJO AAS; GELAIN DP. Determination of chemical

and physical properties of Hyptis pectinata essential oil and their redox active profile.

JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY AND PHARMACEUTICAL RESEARCH, v. 3, p. 1-

9, 2012.

5. SERAFINI MR; PAIXÃO AE; OLIVEIRA JUNIOR AM; SANTOS JAB; SILVA GF.

Assessment of Desalination Technology in Water From the Analysis. Geintec, v. 2, p. 42-51,

2012.

6. JULLYANA SS; ANTONIOLLI AR; SILVESTRE CC; SILVA DT; SERAFINI MR;

OLIVEIRA-FILHO AD; LYRA-JUNIOR DP. Rational drug prescribing for elderly

inpatients in a Brazilian hospital: A pilot study. AFR J PHARM PHARMACO, v. 6, p. 877-

882, 2012.






















71

7. DIAS AS; LIMA ACB; SANTOS ALLM; RABELO TK; SERAFINI MR; ANDRADE CR;

FERNANDES XA; MOREIRA JCF; GELAIN DP; ESTEVAN CS; ARAUJO BS. Redox

properties of (Gomes) Barneby & Grime (Fabaceae) stem bark ethanol extract and fractions.

Natural Product Research (Print), v. 1, p. 1-5, 2012.

8. SERAFINI MR; MENEZES PP; COSTA LP; LIMA CM; QUINTANS-JUNIOR LJ;

CARDOSO JC; MATOS J; SOBRINHO JLS; GRANGEIRO JUNIOR S; NUNES PS;

BONJARDIM LR; ARAUJO AAS. Interaction of p-cymene with β-cyclodextrin. Journal of

Thermal Analysis and Calorimetry, v. 109, p. 951-955, 2012.

9. MENEZES PP; SERAFINI MR; SANTANA BV; NUNES RS; QUINTANS-JUNIOR LJ;

SILVA GF; MEDEIROS IA; MARCHIORO M; FRAGA BP; SANTOS MRV; ARAÚJO

AAS. Solid-state β-cyclodextrin complexes containing geraniol. Thermochimica Acta

(Print), v. 548, p. 45-50, 2012.

10. BRITO RG; SANTOS MRV; QUINTANS-JÚNIOR LJ; SERAFINI MR. Prospecção

tecnológica da utilização do citronelol. Revista Gestão Inovação e Tecnologia, v. 2, p. 166-

173, 2012.

11. SERAFINI MR; LEITE NS; LOPES DFC; SILVA GF; SANT’ANNA MCS.

Monitoramento das tecnologias de briquetes através da análise de pedidos de patente.

Revista Gestão Inovação e Tecnologia, v. 2, p. 100-107, 2012.

12. SERAFINI MR; QUINTANS JSS; ANTONIOLLI AR; SANTOS MRV; QUINTANS LJ.

Mapeamento de tecnologias patenteáveis com o uso da hecogenina. Revista Gestão,

Inovação e Tecnologias, v. 2, p. 427-435, 2012.

13. NUNES PS; ALBUQUERQUE-JÚNIOR RLC; CAVALCANTE DRR; DANTAS MDM;

CARDOSO JC; BEZERRA MS; SOUZA JCC; SERAFINI MR; QUITANS-JR LJ;

BONJARDIM LR; ARAÚJO AAS. Collagen-Based Films Containing Liposome-Loaded

Usnic Acid as Dressing for Dermal Burn Healing. Journal of Biomedicine and

Biotechnology (Print), v. 2011, p. 1-9, 2011.

14. MELO MGD; DOS SANTOS JPA; SERAFINI MR; CAREGNATO FF; PASQUALI MAB;

RABELO TK; DA ROCHA RF; QUINTANS JR. LJ; ARAUJO AAS; DA SILVA FA.

Redox properties and cytoprotective actions of atranorin, a lichen secondary metabolite.

Toxicology in vitro, v. 25, p. 462-468, 2011.








72

15. BONJARDIM LR; SILVA AM; OLIVEIRA MGB; GUIMARÃES AG; ANTONIOLLI AR;

SANTANA MF; SERAFINI MR; SANTOS RC; ARAÚJO AAS; ESTEVAM CS; SANTOS

MRV; LYRA A; CARVALHO R; QUINTANS-JÚNIOR LJ; AZEVEDO EG; BOTELHO

MA. Sida cordifolia Leaf Extract Reduces the Orofacial Nociceptive Response in Mice.

PTR. Phytotherapy Research, v. 25(8), p. 1236-1241, 2011.

16. MELO MGD; ARAÚJO AAS; SERAFINI MR; CARVALHO LF; BEZERRA MS;

RAMOS CS; BONJARDIM LR; ALBUQUERQUE-JÚNIOR RLC; FORTES VS;

FONSECA MJV; QUINTANS-JUNIOR LJ. Anti-inflammatory and toxicity studies of

atranorin extracted from Cladina kalbii Athi in rodents. RBCF. Revista Brasileira de

Ciências Farmacêuticas (Cessou em 2008. Cont. ISSN 1984-8250 Brazilian Journal of

Pharmaceutical Sciences), v. 47, p. 861-872, 2011.

17. SERAFINI MR; SANTOS RC; GUIMARÃES AG; DOS SANTOS JPA; SANTOS ADC;

ALVES IA; GELAIN DP; NOGUEIRA PCL; QUINTANS-JÚNIOR LJ; BONJARDIM LR;

ARAUJO AAS. Morinda citrifolia Linn Leaf Extract Possesses Antioxidant Activities and

Reduces Nociceptive Behavior and Leukocyte Migration. Journal of Medicinal Food, v.

14(10), p. 1159-1166, 2011.

18. AZEVEDO JR; SIZILIO RH; BRITO MB; COSTA AMB; SERAFINI MR; ARAÚJO AAS;

SANTOS MRV; LIRA AAM; NUNES RS. Physical and chemical characterization insulin-

loaded chitosan-TPP nanoparticles. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, v. 106, p.

685-689, 2011.

19. SERAFINI MR; LIMA CM; SANTOS RC; DORIA GAA; JESUS JY; MELO MGD;

SANTOS JPA; RABELO TK; FORTES VS; FONSECA MJV; ALBUQUERQUE-JR RLC;

QUINTANS-JÚNIOR LJ; ARAÚJO AAS. Pre-clinical toxicity of Morinda citrifolia Linn.

leaf extract. African Journal of Biotechnology, v. 10, p. 14566-14572, 2011.

20. MELO MGD; DORIA GAA; SERAFINI MR; ARAÚJO AAS. Valores de referência

hematológicos e bioquímicos de ratos (rattus novergicus linhagem wistar) provenientes do

biotério central da universidade federal de sergipe.. Scientia Plena, v. 8, p. 1-6, 2011.


















73

21. SERAFINI MR; RUSSO SL; PAIXÃO AE; SILVA GF. Technological Forecasting in

Brazil: Characteristics of Intellectual Property in the Northeast. GEINTEC, v. 1, p. 001-011,

2011.

22. SERAFINI MR; SILVA GF; ARAÚJO AAS . Technological Forecasting: Morinda citrifolia

and Pharmaceutical Industry. geintec, v. 1, p. 022-031, 2011.

23. ALMEIDA EDP ; COSTA AA; SERAFINI MR; ROSSETTI FC ; MARCHETTI JM;

SARMENTO VHV; NUNES RS; VALERIO MRG; ARAUJO AAS; LIRA AAM.

Preparation and characterization of chloroaluminum phthalocyanine-loaded solid lipid

nanoparticles by thermal analysis and powder X-ray diffraction techniques. Journal of

Thermal Analysis and Calorimetry, v. 108, p. 191-196, 2011.

PATENTES DEPOSITADAS

1. QUINTANS-JÚNIOR LJ ; ESTEVAN CS; ARAÚJO AAS; SILVA FA; SERAFINI MR.

Formulação tópica de sambacaitá (Hytis pectinata L. Poit) para o tratamento de doença

periodontal e o processo de obtenção da mesma. INPI 104-2011. 2011, Brasil. Patente:

Privilégio de Inovação. Número do registro: PI1106544, data de depósito: 16/08/2011, título:

"Formulação tópica de sambacaitá (Hytis pectinata L. Poit) para o tratamento de doença

periodontal e o processo de obtenção da mesma. INPI 104-2011" , Instituição de registro:INPI

- Instituto Nacional da Propriedade Industrial.

2. SANTOS MRV; ARAÚJO AAS; BARRETO AS; FRAGA BP; SERAFINI MR;

MARCHIORO M; MENEZES PP; NUNES RS. . Complexos de Inclusão de Geraniol e Beta-

Ciclodextrina, Método de Obtenção e Atividade Antihipertensiva do Geraniol e seus

Complexos. Protocolo 105-2011. 2011, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do

registro: PI1106543, data de depósito: 15/08/2011, título: "Complexos de Inclusão de

Geraniol e Beta-Ciclodextrina, Método de Obtenção e Atividade Antihipertensiva do Geraniol

e seus Complexos. Protocolo 105-2011" , Instituição de registro:INPI - Instituto Nacional da

Propriedade Industrial.









74

3. ALBUQUERQUE-JR RLC; ARAÚJO AAS; SERAFINI MR; PADILHA FF; MELO MS;

CARDOSO JC. Desenvolvimento de filmes para reparo cicatricial a partir de polissacarídeos

de frutas tropicais. Protocolo INPI 221110452424. 2011, Brasil. Patente: Privilégio de

Inovação. Número do registro: 221110452424, data de depósito: 04/11/2011, título:

"Desenvolvimento de filmes para reparo cicatricial a partir de polissacarídeos de frutas

tropicais. Protocolo INPI 221110452424" .

4. MELO MGD; ARAÚJO AAS; SERAFINI MR; QUINTANS-JÚNIOR LJ ; BONJARDIM,

LR ; GELAIN DP. Método de obtenção e atividade antioxidante, antinociceptiva e anti-

inflamatoria de uma substância extraída da Cladina Kalbii. PI 1106053-0. 2011, Brasil.

Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI1106053-0, data de depósito:

10/11/2011, título: "Metodo de obtenção e atividade antioxidante, antinociceptiva e anti-

inflamatoria de uma substância extraída da Cladina Kalbii. PI 1106053-0" .

5. SERAFINI MR; ARAÚJO AAS; QUINTANS-JÚNIOR LJ; SANTOS RC; GELAIN DP;

MENEZES PP. Método de obtenção de um extrato aquoso, extrato obtido e suas propriedades

antioxidante, antinociceptiva e anti-inflamatoria. PI 1106052-2. 2011, Brasil. Patente:

Privilégio de Inovação. Número do registro: PI1106052, data de depósito: 10/11/2011, título:

"Metodo de obtenção de um extrato aquoso, extrato obtido e suas propriedades antioxidante,

antinociceptiva e anti-inflamatoria. PI 1106052-2" , Instituição de registro:INPI - Instituto

Nacional da Propriedade Industrial.

6. BONJARDIM LR ; ARAÚJO AAS; QUINTANS-JÚNIOR LJ; QUINTANS JSS; OLIVEIRA

MG; MENEZES PP; SERAFINI MR. Método de obtenção de complexos de inclusao p-

cimeno/b ciclodextrina, bem como atividade anti-inflamatoria e antinociceptiva dos mesmos e

do p-cimeno INPI 221109629383. 2011, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do

registro: PI1107295, data de depósito: 30/11/2011, título: "Metodo de obtenção de complexos

de inclusao p-cimeno/b ciclodextrina, bem como atividade anti-inflamatoria e antinociceptiva

dos mesmos e do p-cimeno INPI 221109629383" , Instituição de registro:INPI - Instituto

Nacional da Propriedade Industrial.













75

7. ARAÚJO AAS; ALVES PB; SILVA FA; QUINTANS-JÚNIOR LJ; SERAFINI MR;

VERGNE DMC. Método de obtenção e atividade antioxidante de uma substância isolada PI

1106003-4. 2011, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI1106003-4,

data de depósito: 09/12/2011, título: "Metodo de obtenção e atividade antioxidante de uma

substância isolada PI 1106003-4" .

8. RODRIGUES-JUNIOR JJ; OLIVEIRA HP; QUINTANS-JUNIOR LJ ; OLIVEIRA ID;

SERAFINI MR. Sistema de purificação de água por uso de filmes poliméricos com

nanopartículas de prata BR 1020120059460. 2012, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação.

Número do registro: BR 102012005946, data de depósito: 16/03/2012, título: "Sistema de

purificação de água por uso de filmes poliméricos com nanopartículas de prata BR

1020120059460" .

9. SANTOS MRV; QUINTANS-JUNIOR LJ; BONJARDIM LR; ARAUJO AAS; SERAFINI

MR; BARBOSA APO; MENEZES IAC. Preparação farmacêutica contendo Chrisobalanus

icaco para o tratamento de diabetes. BR1020120187345. 2012, Brasil. Patente: Privilégio de

Inovação. Número do registro: PI1020120187345, data de depósito: 27/09/2012, título:

"Preparação farmacêutica contendo Chrisobalanus icaco para o tratamento de diabetes.

BR1020120187345" , Instituição de registro:INPI - Instituto Nacional da Propriedade

Industrial.

10. TRINDADE RC; ALMEIDA FTC; ALVES JAB; BARBOSA JUNIOR AM; PAIXAO MS;

ALVES MV; PAIXAO DRC; ANJOS AC; LIMA ACB; DAMASCENA NP; SERAFINI

MR. Xarope contendo óleo essencial de sacatinga para tratamento de Tuberculose PI 10 2010

030897 5. 2012, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro:

PI102012030897, data de depósito: 04/12/2012, título: "Xarope contendo óleo essencial de

sacatinga para tratamento de Tuberculose PI 10 2010 030897 5" , Instituição de registro:INPI

- Instituto Nacional da Propriedade Industrial.

11. ARAUJO AAS, SERAFINI MR, GUTERRES SS, DETONI CB, CAVALCANTI-JUNIOR

RLA, MENEZES PP. Formulação contendo extrato de Morinda citrifolia na prevenção de

danos associados ao envelhecimento cutâneo e queimaduras solares PI 10 2013 008200 7.

2013, Brasil. Patente: Privilégio de Inovação. Número do registro: PI1020130082007, data de

depósito: 04/04/2013, título: "Formulação contendo extrato de Morinda citrifolia na




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prevenção de danos associados ao envelhecimento cutâneo e queimaduras solares” PI 10 2013

008200 7" , Instituição de registro:INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial.

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ANEXO II – APROVAÇÃO NO COMITE DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS (CEPA-UFS)

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ANEXO III – NORMAS DA REVISTA OXIDATIVE MEDICINE AND CELLULAR LONGEVITY

AUTHOR GUIDELINES

Submission

Manuscripts should be submitted by one of the authors of the manuscript through the

online Manuscript Tracking System. Regardless of the source of the word-processing tool,

only electronic PDF (.pdf) or Word (.doc, .docx, .rtf) files can be submitted through the MTS.

There is no page limit. Only online submissions are accepted to facilitate rapid publication

and minimize administrative costs. Submissions by anyone other than one of the authors will

not be accepted. The submitting author takes responsibility for the paper during submission

and peer review. If for some technical reason submission through the MTS is not possible, the

author can contact [email protected] for support.

Terms of Submission

Papers must be submitted on the understanding that they have not been published

elsewhere and are not currently under consideration by another journal published by Hindawi

or any other publisher. The submitting author is responsible for ensuring that the article's

publication has been approved by all the other coauthors. It is also the authors' responsibility

to ensure that the articles emanating from a particular institution are submitted with the

approval of the necessary institution. Only an acknowledgment from the editorial office

officially establishes the date of receipt. Further correspondence and proofs will be sent to the

author(s) before publication unless otherwise indicated. It is a condition of submission of a

paper that the authors permit editing of the paper for readability. All enquiries concerning the

publication of accepted papers should be addressed to [email protected].

Peer Review

All manuscripts are subject to peer review and are expected to meet standards of

academic excellence. Submissions will be considered by an editor and “if not rejected right

away” by peer-reviewers, whose identities will remain anonymous to the authors.

Article Processing Charges

Oxidative Medicine and Cellular Longevity is an open access journal. Open access

charges allow publishers to make the published material available for free to all interested


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online visitors. For more details about the article processing charges of Oxidative Medicine

and Cellular Longevity, please visit the Article Processing Charges information page.

Units of Measurement

Units of measurement should be presented simply and concisely using System

International (SI) units.

Title and Authorship Information

The following information should be included

Paper title

Full author names

Full institutional mailing addresses

Email addresses

Abstract

The manuscript should contain an abstract. The abstract should be self-contained and

citation-free and should not exceed 200 words.

Introduction

This section should be succinct, with no subheadings.

Materials and Methods

This part should contain sufficient detail so that all procedures can be repeated. It can

be divided into subsections if several methods are described.

Results and Discussion

This section may each be divided by subheadings or may be combined.

Conclusions

This should clearly explain the main conclusions of the work highlighting its

importance and relevance.

Acknowledgments

All acknowledgments (if any) should be included at the very end of the paper before

the references and may include supporting grants, presentations, and so forth.

80

References

Authors are responsible for ensuring that the information in each reference is complete

and accurate. All references must be numbered consecutively and citations of references in

text should be identified using numbers in square brackets (e.g., “as discussed by Smith [9]”;

“as discussed elsewhere [9, 10]”). All references should be cited within the text; otherwise,

these references will be automatically removed.

Preparation of Figures

Upon submission of an article, authors are supposed to include all figures and tables in

the PDF file of the manuscript. Figures and tables should not be submitted in separate files. If

the article is accepted, authors will be asked to provide the source files of the figures. Each

figure should be supplied in a separate electronic file. All figures should be cited in the paper

in a consecutive order. Figures should be supplied in either vector art formats (Illustrator,

EPS, WMF, FreeHand, CorelDraw, PowerPoint, Excel, etc.) or bitmap formats (Photoshop,

TIFF, GIF, JPEG, etc.). Bitmap images should be of 300 dpi resolution at least unless the

resolution is intentionally set to a lower level for scientific reasons. If a bitmap image has

labels, the image and labels should be embedded in separate layers.

Preparation of Tables

Tables should be cited consecutively in the text. Every table must have a descriptive

title and if numerical measurements are given, the units should be included in the column

heading. Vertical rules should not be used.

Proofs

Corrected proofs must be returned to the publisher within 2-3 days of receipt. The

publisher will do everything possible to ensure prompt publication. It will therefore be

appreciated if the manuscripts and figures conform from the outset to the style of the journal.

Copyright

Open Access authors retain the copyrights of their papers, and all open access articles

are distributed under the terms of the Creative Commons Attribution license, which permits

unrestricted use, distribution and reproduction in any medium, provided that the original work

is properly cited.

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The use of general descriptive names, trade names, trademarks, and so forth in this

publication, even if not specifically identified, does not imply that these names are not

protected by the relevant laws and regulations.

While the advice and information in this journal are believed to be true and accurate

on the date of its going to press, neither the authors, the editors, nor the publisher can accept

any legal responsibility for any errors or omissions that may be made. The publisher makes no

warranty, express or implied, with respect to the material contained herein.

universidade federal de sergipe prÓ-reitoria de … · iv mairim russo serafini, 2013. morinda...

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