universidade federal de sergipe prÓ-reitoria de pÓs-graduaÇÃo e … · 2017-11-25 · comitê...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
ALAN BRUNO SILVA VASCONCELOS
EFEITO FOTOBIOMODULADOR DA TERAPIA COM DIODO
EMISSOR DE LUZ DE BAIXA INTENSIDADE NA INFLAMAÇÃO
MUSCULAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO EM RATOS
SÃO CRISTÓVÃO
2017
ii
Vasconcelos, Alan Bruno Silva
V331e Efeito fotobiomodulador da terapia com diodo emissor de luz de baixa intensidade na inflamação muscular induzida por exercício em ratos / Alan Bruno Silva Vasconcelos ; orientador Enilton A. Camargo. – São Cristovão, 2017.
64 f. : il.
Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) –
Universidade Federal de Sergipe, 2017.
1. Inflamação. 2. Músculo esquelético. 3. Fototerapia. 4. Exercício físico. 5. Diodo emissor de luz. I. Camargo, Enilton A., orient. II. Título.
CDU 612.7:615.831
iii
ALAN BRUNO SILVA VASCONCELOS
EFEITO FOTOBIOMODULADOR DA TERAPIA COM DIODO
EMISSOR DE LUZ DE BAIXA INTENSIDADE NA INFLAMAÇÃO
MUSCULAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como
requisito à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo
Co-orientador: Prof. Dr. Fernando K. Nampo
SÃO CRISTÓVÃO
2017
ALAN BRUNO SILVA VASCONCELOS
EFEITO FOTOBIOMODULADOR DA TERAPIA COM DIODO
EMISSOR DE LUZ DE BAIXA INTENSIDADE NA INFLAMAÇÃO
MUSCULAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal de Sergipe como
requisito à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo
1º Examinador: Cristiane Bani Correa
2º Examinador: Karina Laurenti Sato
i
“Embora estreito o portão, sigo
adiante,
Mesmo tendo ao lado o castigo e o
desatino.
Eu sou o senhor do meu destino,
Eu sou o capitão da minha alma.”
William Ernest Henley
ii
AGRADECIMENTOS
Ao professor Enilton A. Camargo que aceitou o desafio de me ajudar a trilhar o caminho
até aqui e com sua serenidade me trouxe clareza nos momentos em que as luzes pareciam
apagadas. Agradeço a confiança que depositas em todos os seus alunos, isso certamente nos
engradece. Agradeço também por toda preocupação em me fazer projetar um passo à frente e a
pensar com mais sabedoria sobre minhas decisões. Encerro essa etapa imensamente feliz por
tê-lo como orientador.
Ao professor Fernando Nampo pela co-orientação e à professora Solange de Paula
Ramos pela excelente colaboração, tenham certeza da importância do aprendizado obtido para
a minha formação acadêmica e pessoal.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Farmacologia do Processo Inflamatório
(LAFAPI) por me receberem tão bem. Todos os momentos com vocês, sejam bons ou ruins,
foram de extrema importância para meu crescimento pessoal. Faço questão de agradecer
nominalmente à todos que tornaram esses cada dia dos dois últimos anos mais leves e alegres:
Luana Cercato, Fabíula Abreu, Daiane Franco, Laíza Biano, Rangel Bonfim, Miriam Barboza,
Vanessa Almeida, Lúcio Diniz e Augusto. Em especial, agradeço à Janaíne Prata e Alan
Oliveira que me ensinaram pacientemente a realizar os procedimentos no laboratório e acima
de tudo me integraram em suas vidas como um bom amigo. Às sábias Danielle Gomes e Marília
Trindade que me ajudaram a construir parte considerável do meu conhecimento sobre diversas
questões em nosso laboratório, não sei o que seria dos meus cálculos sem vocês.
Aos colegas da Universidade Estadual de Londrina que me ajudaram no
desenvolvimento do meu projeto de pesquisa, mas, principalmente, fizeram sentir-me em casa.
Ao professor Fábio Nakamura pelo auxílio com os equipamentos LED e aos colaboradores Zé
e Amanda do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da UEL pelas
participação nas análises. Em especial, gostaria de agradecer aos colegas e amigos Victor
Freitas, Júlio César, Roberta Gava, Raissa Fernandes, Lucas Rossi e Lúcio Caldeira pelo bom
convívio dia após dia no laboratório. À Talyta Duarte, Camila Salvador e Lorena Scudeller por
todas as conversas e bons conselhos que, mesmo indiretamente, deram-me suporte durante toda
essa trajetória. À tantos outros que me acolheram de forma excelente.
iii
Aos meus grandes amigos que fizeram parte dessa imensa trajetória e contribuíram em
grande parte da minha vida para o meu crescimento pessoal. Em especial à Priscila Soares,
Marcos Melo e Carlos Oliveira por estarem presentes nos momentos mais difíceis... muito bom
poder contar com vocês. À Paula Brandão, amiga que a UFS me proporcionou e que, de forma
sensacional, contribuiu com bons conselhos durante o final do mestrado.
À todos os mestres e colegas que passaram por minha vida deixando enormes
contribuições, principalmente, aos queridos professores do curso de Educação Física (UNIT) e
à todo corpo docente e administrativo do PROCFIS. Em especial, às professoras Marilene
Batista e Ada Augusta por, desde o início da graduação, me incentivarem à pesquisa e
ensinarem a seguir por esse caminho sempre com muita humildade e ética. Ao professor Ângelo
Paz, grande amigo e companheiro de estudos. Saibam que seus ensinamentos me conduziram
até esse momento.
À minha mãe Ivanilde Maria Silva que lutou por mim e me guiou em cada passo meu.
A senhora é uma guerreira! À toda minha família, em especial a minha tia Ana Maria, meu tio
Fernando Morais (in memoriam) e aos meus primos/irmãos Felipe, Fabiana e Junior... vocês
foram e continuam sendo importantíssimos para meu crescimento.
Por fim, mas não menos importante, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do
Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado
de Sergipe (FAPITEC/SE) pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento desse projeto.
iv
RESUMO EFEITO FOTOBIOMODULADOR DA TERAPIA COM DIODO EMISSOR DE LUZ
NA INFLAMAÇÃO MUSCULAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO EM RATOS. Alan
Bruno Silva Vasconcelos, Mestrado em Ciências Fisiológicas, UFS, São Cristóvão/SE,
2016.
INTRODUÇÃO - Os efeitos biológicos de fontes de luz de baixa intensidade, como a terapia
com diodo emissor de luz (LEDT), indicam que a fototerapia induz efeitos ergogênicos e
recuperativos do músculo esquelético. No entanto, ensaios clínicos e pesquisas experimentais
apresentam divergências no que diz respeito aos parâmetros a serem utilizados. OBJETIVO -
Comparar o efeito de diferentes doses da LEDT (630 nm) na inflamação do músculo estriado
esquelético induzida por exercício em ratos. MÉTODOS - Ratos Wistar foram divididos em
cinco grupos experimentais (n=8/grupo): controle (CON), animais não submetidos ao protocolo
de exercício; recuperação passiva (RP), animais que não receberam tratamento após a indução
da inflamação; LEDT (1,2 J; 4,2 J ou 10,0 J), animais tratados com fototerapia após indução da
inflamação. A inflamação muscular esquelética foi induzida por protocolo de 100 minutos de
nado. Após o exercício, os animais dos grupos LEDT foram expostos à fototerapia nas doses
de 1,2 J, 4,2 J ou 10,0 J sobre os músculos tríceps sural (gastrocnêmios e sóleo). Para avaliação
da hiperalgesia mecânica com o von Frey eletrônico, os animais foram submetidos a avaliação
antes e 24 horas após o procedimento de nado. Após 24 horas do nado, amostras sanguíneas
foram coletadas para análise da atividade de creatina quinase (CK). O músculo sóleo foi retirado
para análise histológica. Os dados foram expressos como média± erro padrão da média (EPM).
Foi utilizado análise de variância seguido pelo Tukey post hoc. Para os dados histológicos foi
realizada análise com Qui-quadrado seguido de correção de Yates. O estudo foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (Universidade Federal de Sergipe) sob nº 15/2013
e pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (Universidade Estadual de Londrina) sob nº
124/2014. RESULTADOS - No grupo RP houve um aumento (p<0,0001) da atividade
plasmática de CK (2.071±346 U/L) quando comparado ao grupo CON (683±103 U/L) e houve
atenuação (p<0,0001) da resposta nos grupos tratados com LEDT (630 nm) com doses de 1,2 J
(379±71 U/L), 4,2 J (599±131 U/L) ou 10,0 J (544±86 U/L). Em relação à hiperalgesia
mecânica, o grupo RP apresentou redução (p<0,05) no limiar de retirada da pata (-11,9±1,9 g)
quando comparado ao grupo CON (2,2±1,5 g) e apenas o grupo LEDT 4,2 J (-3,3±2,4 g) alterou
esse limiar (p<0,05) quando comparado ao grupo RP. Na análise histológica, foi observada
infiltração de leucócitos no músculo do grupo RP, além de áreas edemaciadas e necrosadas.
Porém, menor infiltração foi observada nos animais tratados com as doses de 4,2 e 10,0 J.
CONCLUSÃO - A aplicação de LEDT (630 nm) reduz a lesão inflamatória nas fibras
musculares de ratos submetidos ao exercício. A dose de 4,2 J induziu melhor efeito anti-
inflamatório e antinociceptivo do que as doses de 1,2 e 10,0 J.
DESCRITORES - Inflamação. Músculo Esquelético. Exercício Físico. Diodo Emissor de Luz.
Fototerapia.
v
ABSTRACT PHOTOBIOMODULATOR EFFECT OF LIGHT EMITTING DIODE THERAPY ON
POST-EXERCISE MUSCULAR INFLAMMATION IN RATS. Alan Bruno Silva
Vasconcelos. UFS, São Cristóvão/ SE, 2016.
INTRODUCTION - The biological effects of low intensity light sources, such as light emitting
diode therapy (LEDT), indicate that phototherapy is a method for obtaining ergogenic and
recuperative effects of skeletal muscle. However, clinical trials and experimental researches
differ in respect to the parameters to be used. OBJECTIVE - To compare different doses of
the LED (630 nm) in the inflammation of striated skeletal muscle induced by exercise in rats.
METHODS - Wistar rats were divided in five experimental groups (n=8/group): control
(CON), the animals were not submitted to exercise protocol; passive recovery (RP), the animals
received no treatment after induction of inflammation; LEDT (1.2 J, 4.2 J or 10.0 J), the animals
were submitted to phototherapy after induction of inflammation. Skeletal muscle inflammation
was induced by a protocol of 100 minutes of swimming. After exercise, the animals in the
LEDT groups were exposed to phototherapy at the doses of 1.2 J, 4.2 J or 10.0 J on the triceps
sural muscles (gastrocnemius and soleus). For evaluation of mechanical hyperalgesia by
electronic von Frey, the animals were submitted to evaluation before and at 24 hours after
swimming procedure. After 24 hours of swimming, blood samples were collected to measure
creatine kinase (CK) activity. The soleus muscle was removed for histological analysis. Data
were expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M). Analysis of variance was used
followed by Tukey post hoc. The histological data were performed with chi-square analysis
followed by correction of Yates. This study was approved by the Ethics Committee on Research
with Animals (Federal University of Sergipe) under n°. 15/2013 and by the Ethics Committe in
the Use of Animals (State University of Londrina) under nº 124/2014. RESULTS - The plasma
activity of CK was increased (p <0.0001) in the PR group (2071 ± 346 U / L) when compared
to the CON group (683 ± 103 U / L) and attenuation (p <0.0001) of this response was observed
in the LEDT (630 nm)-treated groups at the doses of 1.2 J (379 ± 71 U / L), 4.2 J (599 ± 131 U
/ L) or 10.0 J (544 ± 86 U / L). Regarding mechanical hyperalgesia, the PR group presented a
reduction (p <0.005) in the paw withdrawal threshold (-11.9 ± 1.9 g) when compared to the
CON group (2.2 ± 1.5 g). Only LEDT 4.2 J (-3.3 ± 2.4 g) altered this threshold (p <0.05) when
compared to the PR group. In the histological analysis, leukocyte infiltration was observed in
the muscle of animals from the PR group, in addition to areas of edema and necrosis. However,
lower infiltration was observed in the animals treated with doses of 4.2 and 10.0 J.
CONCLUSION: The application of LEDT (630 nm) reduces the inflammatory lesion in
muscle fibers of rats submitted to exercise. The dose of 4.2 J induced better anti-inflammatory
and antinociceptive effects than doses of 1.2 and 10.0 J
DESCRIPTORS: Inflammation; Skeletal Muscle; Physical Exercise; Light Emitting Diode;
Phototherapy.
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
AINES anti-inflamatórios não esteroides
ANOVA análise de variância
ATP trifosfato de adenosina
CEPA/UFS Comitê de Ética em Pesquisa com Animais/Universidade Federal de Sergipe
CFA adjuvante de Freund
CK creatina quinase
CON controle
COX ciclo-oxigenase
DMIE dano muscular induzido por exercício
DMIT dor muscular de início tardio
EUA Estados Unidos da América
GDNF fator neurotrófico derivado de linhagem de célula glial
HE hematoxilina eosina
hNPCs células progenitoras neurais humanas
IASP Associação Internacional para o Estudo da Dor
IL interleucina
J joules
LASER luz amplificada por emissão estimulada de radiação
LDH lactato desidrogenase
LED diodo emissor de luz
LEDT terapia com diodo emissor de luz
MDA malondialdeído
MPO mieloperoxidase
mTOR alvo da rapamicina em mamíferos
MuRF-1 do inglês, muscle ring-finger protein-1
NADPH do inglês, reduced nicotinamide adenine phosphate
NGF fator de crescimento neuronal
NO óxido nítrico
ROS espécies reativas de oxigênio
RNS espécies reativas de nitrogênio
RP recuperação passiva
vii
RS espécies reativas
SBCAL Sociedade Brasileira de Cuidados com Animais de Laboratório
TBA ácido tiobarbitúrico
TNF-α fator de necrose tumoral alfa
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura do músculo estriado esquelético...................................................................19
Figura 2. Fase inicial do dano muscular induzido por exercício.................................................22
Figura 3. Ação da fototerapia......................................................................................................30
Figura 4. Delineamento experimental do nado e da avaliação de hiperalgesia mecânica...........36
Figura 5. Local de aplicação da fototerapia sobre o conjunto muscular.....................................38
Figura 6. Concentração sanguínea de creatina quinase...............................................................42
Figura 7. Imagens representativas da análise histológica............................................................43
Figura 8. Análise de peroxidação lipídica...................................................................................45
Figura 9. Análise de hiperalgesia mecânica................................................................................46
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros da LEDT...................................................................................................36
Tabela 2. Análise histológica......................................................................................................44
Tabela 3. Contagem de leucócitos...............................................................................................45
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 15
2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................. 18
2.1. O TECIDO MUSCULAR ESQUELÉTICO .............................................................. 18
2.2. DANO MUSCULAR INDUZIDO POR EXERCÍCIO ............................................. 20
2.3. DOR MUSCULAR DE INÍCIO TARDIO ................................................................ 22
2.4. PROCESSO INFLAMATÓRIO PÓS-EXERCÍCIO ................................................. 24
2.5. ESTRESSE OXIDATIVO ......................................................................................... 26
2.6. TERAPIA COM DIODOS EMISSORES DE LUZ .................................................. 28
2.7. FOTOTERAPIA NA LESÃO MUSCULAR ESQUELÉTICA ................................ 31
3. OBJETIVOS...................................................................................................................... 34
3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 34
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 34
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 35
4.1. ANIMAIS .................................................................................................................. 35
4.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................................................................... 35
4.3. PROTOCOLO DE ESFORÇO FÍSICO .................................................................... 36
4.4. APLICAÇÃO DA LEDT ........................................................................................... 37
4.5. CONTAGEM DE LEUCÓCITOS E ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE CK . 38
4.6. SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS) ............ 39
4.7. PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS .................................................................... 39
4.8. MEDIDA DE HIPERALGESIA MECÂNICA NA PATA ....................................... 40
4.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 41
5. RESULTADOS ................................................................................................................. 42
6. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 47
7. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 52
8. PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................................................................... 53
9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 54
10. ANEXOS ....................................................................................................................... 65
10.1. ANEXO 1 ............................................................................................................... 65
10.2. ANEXO 2 ............................................................................................................... 66
15
1. INTRODUÇÃO
A ampla divulgação dos efeitos benéficos do exercício fez com que o número de
praticantes de exercício físico aumentasse nas últimas décadas. A atividade física, seja
sistematizada e com acompanhamento profissional ou não, está diretamente relacionada à
qualidade de vida e prevenção de doenças (HASKELL et al., 2007). Porém, acompanhado desse
crescimento, aumentou-se também o quantitativo de lesões musculares (KIRKENDALL;
GARRETT, 2002; MAFFULLI et al., 2011).
As lesões musculares podem desencadear dor e incapacidade motora que comprometem
o trabalho mecânico do músculo e consequentemente outras atividades diárias
(KIRKENDALL; GARRETT, 2002). Essas lesões são apontadas como responsáveis por
aproximadamente 1/3 nas faltas ao trabalho relacionadas a doenças, as quais podem gerar
consequências econômicas (IASP, 2009).
As lesões musculares também são comuns na prática esportiva de alto rendimento, e o
monitoramento do sistema imune de atletas, bem como o treinamento, recuperação e nutrição
tem evidenciado grande importância na preparação para uma competição (KAKANIS et al.,
2010; MORGADO et al., 2016).
Indivíduos que realizam exercício contínuo ou intermitente podem sofrer danos
musculares acompanhados por processo inflamatório (AOI et al., 2004; ASCENSÃO et al.,
2008; FELISMINO et al., 2014; DE PAIVA et al., 2016). Os danos musculares induzidos pelo
exercício físico podem gerar alterações agudas nas células do sistema imune, fadiga, perda de
força, aumento de creatina quinase (CK) e citocinas inflamatórias na corrente sanguínea tais
como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e as interleucinas-6 e 1-β (IL-6 e IL 1-β), além
de causar dor muscular de início tardio (DMIT) (ENOKA; DUCHATEAU, 2008; ELY et al.,
2016; MORGADO et al., 2016; SILVEIRA COSWIG et al., 2016).
Os marcadores bioquímicos de lesão muscular e os sintomas do processo inflamatório
apresentam pico entre 24 e 48 horas e podem causar fibrose deletéria ao tecido acompanhada
de redução da função muscular e perda de performance física por um período de 5 a 7 dias
16
(ABDELMAGID et al., 2012; ASCENSÃO et al., 2008; CHATZINIKOLAOU et al., 2010;
ELY et al., 2016; MORGADO et al., 2016; PAULSEN et al., 2010).
Uma consideração importante para a recuperação do exercício é prevenir o dano
muscular e melhorar o reparo tecidual após a lesão do músculo (CAMARGO et al., 2012; DE
PAIVA et al., 2016; FERRARESI et al., 2015a). Existem diferentes estratégias para prevenção
ou recuperação da função muscular, como os anti-inflamatórios não esteroides (AINES),
massagem, acupuntura, crioterapia e fototerapia (URSO, 2013; ANDRZEJEWSKI et al., 2015;
COTLER, 2015; FERRARESI et al., 2016; FONSECA et al., 2016; VIEIRA et al., 2016). A
crioterapia permanece como o método mais comumente utilizado em lesões
musculoesqueléticas relacionadas ao exercício físico, porém, uma meta-análise publicada em
2015 apontou a baixa qualidade metodológica das pesquisas avaliadas (HOHENAUER et al.,
2015).
Os efeitos biológicos obtidos a partir da aplicação de fontes de luz de baixa intensidade,
tais como amplificação de luz por radiação estimulada (LASER, Amplification by Stimulated
Emission of Radiation) ou terapia com diodo emissor de luz (LEDT, Light emitting diode
therapy), antes ou após a lesão, sugerem a fototerapia como um método de obter efeitos
ergogênicos e recuperativos (BARONI et al., 2010; DE PAIVA et al., 2016; FERRARESI et
al., 2016; VANIN et al., 2016).
Recentes revisões sistemáticas e meta-análises mostraram que a fototerapia apresentam
resultados mais consistentes quando aplicada antes do exercício, utilizando comprimentos de
onda entre vermelho e infravermelho, com potência de saída entre 50 mW e 200 mW e doses
de 5 J e 6 J por ponto, porém, as evidências são moderadas e estudos adicionais com maior
qualidade metodológica precisam ser realizados (BORSA; LARKIN; TRUE, 2013; LEAL-
JUNIOR et al., 2015; NAMPO et al., 2016a, 2016b).
Ainda, ensaios clínicos e experimentais apresentam divergências no que diz respeito aos
parâmetros a serem utilizados, além de apresentar diferentes efeitos dose-resposta, o que mostra
a necessidade de uma melhor parametrização para esse tratamento (DE ALMEIDA et al., 2012;
CIDRAL-FILHO et al., 2013, 2014; BARONI et al., 2015; MARTINS et al., 2016; PIGATTO
et al., 2016; VANIN et al., 2016). Nessa perspectiva, torna-se interessante comparar o efeito de
17
diferentes doses da LEDT (630 nm) na inflamação do músculo estriado esquelético de animais
experimentais submetidos ao exercício.
18
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. O TECIDO MUSCULAR ESQUELÉTICO
O músculo esquelético constitui, aproximadamente, 40% da massa corpórea e é o tecido
com maior conteúdo de proteínas do corpo (GUTIERREZ et al., 1999; MOORE et al., 2015).
Além das células musculares, estão distribuídos juntos a sua estrutura, uma rede de vasos
sanguíneos, nervos e a matriz extracelular (HUARD et al., 2002; MOORE et al., 2015; NARICI
et al., 2016). O músculo esquelético é responsável pela geração de força para locomoção,
respiração e sustentação postural, além de aumentar a produção de calor e fornecer aminoácidos
para diversos processos metabólicos (KETTELHUT, 1988).
O músculo esquelético (figura 1) está envolto por uma camada de tecido conjuntivo
denominada epimísio, e constitui-se de milhares de fibras contráteis, individuais e cilíndricas,
chamadas fibras musculares, as quais apresentam células longas, finas e multinucleadas, com
uma membrana chamada sarcolema (MOORE et al., 2015; NARICI et al., 2016). O perimísio,
uma bainha de tecido conjuntivo, agrupa até centenas de fibras musculares em fascículos.
Enquanto recobrindo o sarcolema há outra bainha de tecido conjuntivo que se chama endomísio,
que dá à fibra muscular consistência e proteção. Dentro do sarcolema há uma região aquosa
denominada sarcoplasma, que contém proteínas contráteis, enzimas, substratos energéticos,
núcleos e organelas especializadas (MOORE et al., 2015; NARICI et al., 2016).
19
Figura 1. Estrutura do músculo estriado esquelético. Adaptado de: Moore et al. (2015).
O sarcômero (figura 1) é a unidade funcional da fibra muscular e é a estrutura que
confere aspecto estriado ao músculo pela existência de faixas claras e escuras alternadas. Os
filamentos grossos são compostos de miosina, enquanto os filamentos finos são compostos, em
sua maioria por actina (BOTTINELLI; REGGIANI, 2000).
As fibras musculares recebem diferentes denominações de acordo com suas
características morfofuncionais. As fibras glicolíticas são caracterizadas pela alta atividade
ATPásica da miosina, desenvolvem contrações rápidas e vigorosas e dependem das vias de
transferências anaeróbica para ressíntese de ATP; são também chamadas do tipo II B, brancas,
de contração rápida ou fásicas (TALBOT; MAVES, 2016). As fibras oxidativas são altamente
resistentes à fadiga e seu potencial de ATP é reposto a partir da transferência de energia obtida
em aerobiose; também são chamadas de fibras do tipo I, vermelhas (devido à grande quantidade
de mitocôndrias), de contração lenta, ou tônicas. Além disso, existe um subtipo de fibra
glicolítica conhecido por ser lenta, o tipo II A ou glicolítica oxidativa, que contém
características intermediárias (TALBOT; MAVES, 2016).
Cada fibra muscular recebe uma terminação nervosa proveniente de fibras motoras
(motoneurônios), formando uma estrutura denominada unidade motora. Existem dois tipos de
motoneurônios, os fásicos, que disparam impulsos rapidamente com alta velocidade de
20
condução e os tônicos, os quais disparam impulsos lenta e continuamente e com menor
velocidade de condução (MOORE et al., 2015; NARICI et al., 2016). A contração muscular é
iniciada por impulsos nervosos transmitidos por motoneurônios à fibra na junção
neuromuscular e desencadeia um processo molecular resultando na formação do complexo
actinomiosina que na presença do trifosfato de adenosina (ATP) é capaz de reduzir o
comprimento do sarcômero (BOTTINELLI; REGGIANI, 2000).
Todo esse arranjo estrutural do tecido muscular esquelético está vulnerável diante de
traumas. Lesões musculares são comuns e podem ocorrer por uma série de mecanismos, que
incluem trauma direto: laceração, contusão, estiramento e intensa atividade física; além das
causas indiretas: isquemia, doenças genéticas inatas e disfunção neurológica. Todos esses
mecanismos de lesão desencadeiam dor e incapacidade motora que comprometem o trabalho
muscular, entre outras atividades (KIRKENDALL; GARRETT, 2002).
As lesões musculares são recorrentes em inúmeras modalidades esportivas, chegando a
constituir, por exemplo, cerca de 31% das lesões no futebol profissional (WOHLFAHRT et al.,
2012). Segundo Astur et al. (2014), médicos ortopedistas entrevistados em 2013 no Brasil
apontam que os membros inferiores são acometidos em 97% dos casos de lesão muscular,
principalmente quadríceps, adutor e tríceps sural. Para 62% dos entrevistados, a lesão ocorre
principalmente na fase excêntrica da contração, sendo que para o diagnóstico 39% apontam o
uso do ultrassom e 37% usam ressonância magnética. Dentre as opções de tratamento na fase
aguda (87,5%), medicação, repouso e crioterapia são as mais prevalentes. Quando necessário
tratamento prolongado (56%), são comumente utilizados medicacão, repouso e fisioterapia
(ASTUR et al., 2014).
2.2. DANO MUSCULAR INDUZIDO POR EXERCÍCIO
A lesão muscular pode ser induzida pelo exercício físico intermitente ou contínuo
(AOI et al., 2004; ASCENSÃO et al., 2008; FELISMINO et al., 2014). Essa resposta ao
exercício é classicamente referida como dano muscular induzido pelo exercício (DMIE)
(MCHUGH et al., 1999; NOSAKA et al., 2001; PEAKE et al., 2005; DOUGLAS et al., 2016).
21
A execução de contrações concêntricas e excêntricas ou isométricas durante uma
sessão de exercício físico geralmente são associadas a danos ao músculo esquelético os quais
consistem em ruptura estrutural do sarcômero, falha no acoplamento excitação-contração e na
sinalização ao cálcio, além de iniciar uma resposta inflamatória e ativação de vias de
degradação proteica (BAUMERT et al., 2016). O estresse mecânico também pode provocar
necrose celular. Durante as contrações concêntricas e, especialmente, excêntricas vigorosas ou
contínuas, as pontes de actina e miosina e as linhas Z dos sarcômeros do músculo estriado
esquelético sofrem rupturas (CRAMERI et al., 2007; LAURITZEN et al., 2009).
Os marcadores bioquímicos de lesão muscular e os sintomas do processo inflamatório
apresentam pico entre 24 e 48 horas e podem provocar dor muscular de início tardio (DMIT),
redução da função muscular e do desempenho físico por um período de 5 a 7 dias (ASCENSÃO
et al., 2008; CHATZINIKOLAOU et al., 2010; PAULSEN et al., 2010).
A falência da bomba de cálcio causa a quebra de homeostase desse íon. Este acúmulo
de cálcio ativa as ações das enzimas ATPase, fosfolipase, proteases e endonuclease, as quais
degradam o ATP, fosfolipídios, proteínas (da membrana e do citoesqueleto) e a cromatina
celular, respectivamente. Por fim, ocorre lesão da membrana celular e necrose (PILEGAARD;
SALTIN; NEUFER, 2003; CERMAK et al., 2012).
Morgan (1990) apontou que cada sarcômero tem resistência diferente ao exercício
excêntrico, alguns alongam-se além da sobreposição ideal dos filamentos de actina e miosina,
levando ao rompimento e desorganização da estrutura miofibrilar (figura 2). Além disso, o dano
no sarcolema permite o aumento da permeabilidade ao Ca2+ (figura 2) que leva ao influxo
exacerbado deste íon do meio extracelular. A partir deste influxo ocorre ativação de proteases
dependentes de Ca2+, denominadas calpaínas (figura 2), responsáveis pela proteólise do
citoesqueleto causando morte celular por necrose ou apoptose (NEUBAUER et al., 2008; S.
THIEBAUD, 2012; UCHIYAMA et al., 2006).
22
Figura 2. Fase inicial do dano muscular induzido por exercício. Alguns sarcômeros
alongam-se além da sobreposição ideal dos filamentos de actina e miosina, levando ao
rompimento e desorganização da estrutura miofibrilar (A). O dano no sarcolema permite o
aumento da permeabilidade ao Ca2+ (B). Esse influxo leva a ativação de proteases dependentes
de Ca2+, denominadas calpaínas (C). Adaptado de: Baumert et al. (2016).
A necrose celular secundária a inflamação pode provocar lesão adicional ao músculo
e atrasar o processo de recuperação. Este processo provoca a liberação de CK e outras enzimas
musculares, detectadas no sangue periférico, como resultado da perda da integridade das
membranas das células musculares após o exercício físico (OVERGAARD et al., 2002;
FREDSTED et al., 2007; BAUMERT et al., 2016; DOUGLAS et al., 2016).
2.3. DOR MUSCULAR DE INÍCIO TARDIO
O estudo da dor passou a ser desenvolvido sob o conceito interdisciplinar,
principalmente a partir da criação da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP, do
inglês, International Association for the Study of Pain) ainda no século XX (IASP, 2009;
LIPMAN, 2010). A IASP define dor como “uma experiência sensorial e emocional
desagradável associada a um dano real ou potencial dos tecidos, ou descrita em termos de tais
lesões” (IASP, 2009).
23
Quando ocorre um estímulo nociceptivo, terminações livres de neurônios sensoriais
primários são ativadas e podem transformá-lo em potenciais de ação que seguirão para
estruturas centrais que integralizarão esse estímulo como a sensação dolorosa (TREEDE, 2001).
A essas estruturas neuronais é dado o nome de nociceptores, os quais possuem limiares de
ativação inferiores a intensidade necessária para causar dano, constituindo um sistema sensível
para sinalizar o dano tecidual iminente antes que ele ocorra, ou seja, nem todo estímulo é
detectado pelo sistema sensorial que medeia a sensação da dor (TREEDE, 2001; BASBAUM
e BUSHNELL, 2009). Dessa forma, um evento capaz de causar dano tecidual real ou potencial
é considerado um estímulo nocivo, podendo pertencer à modalidade térmica, mecânica,
química ou biológica (TREEDE, 2001).
A dor proveniente do exercício físico é classicamente conhecida como Dor Muscular de
Início Tardio (DMIT) (HOUGH, 1902). A DMIT é uma resposta comum ao exercício físico
extenuante, principalmente exercícios contendo contrações excêntricas que, diferentemente da
dor sentida no momento ou em curtos períodos após o exercício, surge 24 horas e se mantém
nos primeiros 3 dias após a realização do exercício (MIZUMURA; TAGUCHI, 2016).
Geralmente a DMIT é reportada como subclínica, já que após a realização do exercício,
os indivíduos se recuperam da dor sem a necessidade de tratamento (MIZUMURA; TAGUCHI,
2016). Entretanto, a dor sustentada por longos períodos pode ser acompanhada de lesões e
sintomas crônicos (HAYASHI et al., 2011) associadas à possíveis alterações plásticas no
sistema nervoso central (SLUKA et al., 2012), o que por vezes leva a necessidade de um
tratamento.
Os mecanismos pelos quais a DMIT atua e o porquê do seu surgimento horas ou dias
após a realização do exercício físico ainda não são bem esclarecidos. Existem hipóteses de que
esta estaria integralmente associada ao dano muscular (HOUGH, 1902), ao extravasamento da
enzima muscular CK (ARMSTRONG et al., 1983) ao processo inflamatório (SMITH, 1991) e
ao aumento na concentração do ácido lático (SCHWANE et al., 1983). Porém, as evidências
mais recentes apontam que a DMIT envolve outros mecanismos que não apenas o dano
muscular e a inflamação, além de já ser descartada a relação com o ácido lático (MIZUMURA;
TAGUCHI, 2016).
24
Atualmente sugere-se ainda o envolvimento de fatores neurotróficos na DMIT como,
por exemplo, a via dos receptores de Bradicinina (B2)-fator de crescimento neural (NGF, do
inglês nerve growth factor) (MURASE et al., 2010) e do fator neurotrófico GDNF (do inglês,
glial cell line-derived neurotrophic factor) por meio de ativação da ciclo-oxigenase-2 (COX-2)
(MURASE et al., 2013).
As diferentes hipóteses de mecanismos envolvidos na DMIT permitem que diferentes
tratamentos fossem avaliados para essa condição, a fim de aliviar os sintomas e
consequentemente restaurar a função muscular (CHEUNG et al., 2003). Dentre os tratamentos
possíveis, a crioterapia, alongamento, massagem, ultrassom, AINES, correntes elétricas e
homeopatia são os principais utilizados, porém, CHEUNG et al. (2003), em trabalho de revisão,
apontaram resultados controversos que demonstram pouca ou nenhuma atenuação da dor
quando utilizados esses tratamentos, assim como a escassez de estudos que possam comprovar
suas eficácias terapêuticas.
A fototerapia com luz de baixa potência, seja terapia com LED ou LASER também foi
apontada como abordagem terapêutica para redução da DMIT (BARONI et al., 2010; BORGES
et al., 2014). Entretanto, Nampo et al. (2016a) afirmaram em trabalho de meta-análise que,
embora com poucos estudos incluídos, percebeu-se baixa eficácia da fototerapia para
tratamento da DMIT, sendo necessária a realização de novos ensaios clínicos randomizados
com maior controle em possíveis vieses.
2.4. PROCESSO INFLAMATÓRIO PÓS-EXERCÍCIO
Classicamente a inflamação pode ser entendida como um estresse ou quebra da
homeostase orgânica por um agente irritante, seja exógeno ou endógeno, que estimula sensores
especializados a produzirem uma série de moléculas mediadoras para combatê-los e evitar
maiores danos (SERHAN et al., 2010). Durante essa resposta, há alteração nos calibres
vasculares e mudanças estruturais na microvasculatura que permitem, respectivamente, o
aumento do fluxo sanguíneo e o extravasamento de líquidos e leucócitos para o foco da lesão
para a devida eliminação do agente irritante (SERHAN et al., 2010).
25
No exercício, o agente irritante é o próprio estresse mecânico produzido sobre o
citoesqueleto celular que inicia uma resposta inflamatória aguda, local e sistêmica,
caracterizada por concentrações séricas aumentadas de IL-6, IL-1β, TNF-α, proteína C reativa,
além de quimiotaxia de leucócitos (NEUBAUER et al., 2008; CHATZINIKOLAOU et al.,
2010; PAULSEN et al., 2010). No músculo esquelético, a IL-6 atua reduzindo as concentrações
das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e TNF-α, ao passo que aumenta as concentrações da IL-
10, uma citocina anti-inflamatória (DE SALLES et al., 2010).
As células inflamatórias como, por exemplo, os neutrófilos, macrófagos, células
natural killer, entre outras, infiltram no tecido muscular e preparam-no para a regeneração por
meio da fagocitose de detritos, liberação de fatores de crescimento e fatores quimiotáxicos
(BONDESEN et al., 2004). As primeiras células fagocíticas a chegarem no sítio da lesão são
os neutrófilos, que constituem a primeira linha de defesa no processo inflamatório (URSO,
2013). Os neutrófilos são responsáveis pela fagocitose de detritos celulares provenientes da
lesão muscular, além de liberarem proteases que são necessárias para degradação desses detritos
(BOSURGI et al., 2011; TIDBALL; WEHLING-HENRICKS, 2007). Além disso, essas células
podem liberar uma enzima denominada mieloperoxidase (MPO), presente em seus grânulos
azurófilos, responsável pela conversão de peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso,
contribuindo para a eliminação de patógenos, mas também, extremamente deletéria às células
musculares não danificadas (PETERSON et al., 2006).
A partir das primeiras horas após a lesão muscular, percebe-se a presença de monócitos
que ao longo das próximas 24-48 horas se diferenciarão em macrófagos para continuar a
fagocitose e remover o tecido necrótico (CHAZAUD et al., 2009). Macrófagos, juntamente aos
fibroblastos e a matriz extracelular, produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas
que, por sua vez, ativarão mecanismos regenerativos tais como fatores miogênicos e células
satélite (MCCROSKERY et al., 2005; TOUMI; F’GUYER; BEST, 2006; PELOSI et al., 2007;
TIDBALL; WEHLING-HENRICKS, 2007)
O processo inflamatório é importante para a regeneração muscular, porém, por vezes,
a inflamação pode causar fibrose (ABDELMAGID et al., 2012) seguida de uma possível perda
de função da região muscular danificada (STAUBER, 2004). Dessa forma, a prática comum
tem sido a tentativa de redução dessa inflamação com a utilização de estratégias terapêuticas
26
como ultrassom (STAY et al., 1998), massagem (ZHU et al., 2016), suplementação nutricional
(MARQUES et al., 2015), dentre outras abordagens que permanecem pouco elucidadas. A
crioterapia, por exemplo, é bastante utilizada, mas parece apenas reduzir os sintomas
inflamatórios, sem acelerar o processo de recuperação tecidual (BLEAKLEY et al., 2012;
CAMARGO et al., 2012; DA COSTA SANTOS et al., 2014a).
Outra estratégia amplamente empregada no tratamento de lesões musculares é a
utilização dos AINES (URSO, 2013). Porém, além dos possíveis efeitos indesejados, estudos
demostraram desvantagens quando utilizado ibuprofeno após o exercício como, por exemplo,
não redução da dor (KRENTZ et al., 2008; KRAEMER et al., 2010), mas quando administrado
profilaticamente, houve atenuação dessa resposta (HASSON et al., 1993; PAOLONI;
ORCHARD, 2005). Ainda, foi demonstrado que os AINES não atenuaram a perda de força
muscular e amplitude de movimento após exercício excêntrico ou de resistência (DONNELLY
et al., 1990; PIZZA et al., 1999; KRENTZ et al., 2008; CANDOW et al., 2013) mas reduziram
a atividade das células satélites, importantes para reconstrução muscular, dias após o exercício
(MACKEY et al., 2007; MIKKELSEN et al., 2009). Dessa forma, estudos com AINES na lesão
muscular induzida por exercício parecem não ter uniformidade em seus desfechos, não
comprovando sua eficácia.
2.5. ESTRESSE OXIDATIVO
Os organismos aeróbicos geram concentrações basais de espécies reativas (RS, do
inglês, reactive species) como resultado ao processo de respiração celular para produção de
ATP. A produção dessas moléculas podem ser aumentadas em situações de estresse como, por
exemplo, no processo inflamatório e apresentam importante função biológica, principalmente
atuando na fagocitose de agentes agressores (HALLIWELL, 2007). Além disso, as RS podem
ativar fatores de transcrição, tais como o fator nuclear κB (NF-κB) que modulam a expressão
gênica de moléculas envolvidas no processo inflamatório. Embora essas moléculas sejam
importantes para a defesa do organismo, quando sua produção é exacerbada pode causar danos
à estrutura celular, lipídios membranares e DNA de células adjacentes a inflamação (GOMEZ-
CABRERA; VIÑA; JI, 2016).
27
Nessa perspectiva, devido ao potencial patogênico apresentado pelas RS, suas
produções são aproximadamente balanceadas pelo sistema de defesa antioxidante do organismo
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Um agente antioxidante pode ser definido como
qualquer substância que retarde, previna ou remova o dano oxidativo a uma molécula alvo
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). A defesa antioxidante pode ocorrer por ação
enzimática, pela qual atuam enzimas como a superóxido dismutase, a catalase e a glutationa
peroxidase, ou ação não enzimática, como a causada por substâncias como vitamina C,
flavanóides, carotenoides, dentre outros (HALLIWELL, 2014).
Entretanto, por vezes, ocorre um desbalanço entre a produção de moléculas pro-
oxidantes, como as ROS e as espécies reativas de nitrogênio (RNS, do inglês, Reactive Nitrogen
Species) no tecido e a capacidade de defesa antioxidante da célula. Esse desequilíbrio é
conceituado como extresse oxidativo (HALLIWELL, 2007; LAMOU et al., 2016). No
processo inflamatório, parte desse desequilíbrio deve-se ao fato de que os leucócitos, antes
circulantes na corrente sanguínea, chegam ao sítio da inflamação para defender as células do
agente agressor. Tanto nos neutrófilos, quanto nas células residentes que estão submetidas a um
maior metabolismo por conta da resposta inflamatório, há produção de moléculas como o ânion
superóxido (O2•) pela ativação da NADPH (do inglês, reduced nicotinamide adenine
phosphate) oxidase. A produção de RS pelos neutrófilos tem o objetivo de aniquilar os agentes
agressores, mas podem agredir alvos inespecíficos presentes nos locais onde são produzidos
(GOMEZ-CABRERA; VIÑA; JI, 2016). Além disso, assim como as citocinas inflamatórias
TNF-α e IL 1-β, o ânion superóxido pode diretamente ativar neurônios nociceptivos para
induzir hiperalgesia, como também contribuir para o dano tecidual (JIN, 2006; SALVEMINI
et al., 2011).
Ainda, o estresse oxidativo causa dano oxidativo, que pode ser definido como o
dano biomolecular causado pelo ataque de RS aos constituintes do organismo vivo
(HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). A membrana celular é um dos constituintes que pode ser
alvo deste dano. Neste contexto, as ROS podem causar peroxidação lipídica, processo pelo qual
fosfolipídios de membrana são sujeitos a reação com as RS, o que compromete suas
propriedades físico-químicas, alterando sua permeabilidade, fluidez e, por vezes, causando
morte celular (HALLIWELL, 2014).
28
Em linhas gerais, o músculo esquelético é um tecido de alta demanda energética
que produz RS constantemente em situação basal, porém, durante o exercício físico o consumo
de oxigênio por aumentar cerca de cem vezes e, proporcionalmente, há o aumento agudo na
quantidade de ROS e RNS (ASTRAND; RODAHL, 1986; SEM, 1995). De fato, a realização
do exercício físico pode gerar um estresse oxidativo principalmente quando utilizada
intensidade ou duração do exercício as quais o indivíduo não esteja habituado (BLOOMER et
al., 2005; SUREDA et al., 2005). O dano oxidativo, principalmente indicado pela concentração
de malondialdeído (MDA), acontece de maneira dependente de intensidade, ou seja, exercícios
mais intensos causam mais peroxidação lipídica comparado a exercícios moderados e de baixa
intensidade (LOVLIN et al., 1987; SEIFI-SKISHAHR et al., 2008).
A utilização da fototerapia para o tratamento da inflamação parece atuar também
na modulação de moléculas diretamente relacionadas ao estresse oxidativo. A aplicação da
LEDT infravermelha com dose de 2 J/cm² (950 nm e 80 mW/cm²) reduziu a concentração
tecidual de MDA 24 horas injeção de adjuvante de Freund (CFA) na pata de camundongos
Swiss, além de aumentar a atividade da superóxido dismutase e catalase, portanto, sugerindo
efeito antioxidante (MARTINS et al., 2016).
2.6. TERAPIA COM DIODOS EMISSORES DE LUZ
A luz é uma forma de energia que se comporta como uma onda e também como uma
corrente de partículas chamadas fótons (COTLER, 2015). Seu uso terapêutico é datado desde
antes dos anos 60 com a criação da técnica de LASER. Essa fonte de luz monocromática e de
alta intensidade é geralmente utilizada em procedimentos de cirurgias plásticas, dermatológicas
ou estéticas (KIM; CALDERHEAD, 2011; COTLER, 2015).
No fim dos anos 60, o professor Endrè Mester, da Universidade de Semmelweis em
Budapeste, movido pelo questionamento sobre a exposição ao LASER cirúrgico poder induzir
oncogênese, conduziu um experimento que foi publicado em 1968 (KIM; CALDERHEAD,
2011; COTLER, 2015). Ao aplicar doses de baixa intensidade de luz com um LASER rubi,
Mester percebeu que além de não causar oncogênese, o pelo dos animais submetidos ao
procedimento crescia mais rápido que dos demais, sugerindo que, de alguma forma, os fótons
29
teriam a capacidade de modular a atividade celular. Desde então, começaram a surgir relatos de
pacientes que tiveram redução da inflamação, diminuição da dor pós-operatória e melhor
cicatrização de feridas após cirurgias em que foram utilizadas o LASER, surgindo o termo
fotobiomodulação (KIM; CALDERHEAD, 2011; COTLER, 2015).
Luzes monocromáticas com diferentes comprimentos de onda poderiam então ser
utilizadas para diversos fins. Um comprimento de onda é o intervalo entre duas ondas e, no caso
da luz, define sua cor. Por exemplo, luzes azuis, vermelhas e infravermelhas possuem
comprimentos de ondas diferentes. Os comprimentos de onda entre 600 nm (luz visível,
vermelha) e 1.000 nm (luz não visível, infravermelho próximo) são utilizados na prática
terapêutica (KIM; CALDERHEAD, 2011)
Há diferenças entre as luzes visíveis e não visíveis no que diz respeito ao seus efeitos,
já que possuem diferentes penetrabilidades sobre o tecido (PARRISH; WILSON, 1991).
Quando emitida sobre a região do tecido alvo a luz pode ser absorvida por barreiras estruturais
antes de atingi-lo, das quais a pele é a principal limitante, diminuindo a penetração dos fótons.
Porém, luzes vermelhas e infravermelhas são pouco absorvidas por essas estruturas e podem
atingir camadas mais profundas do tecido, sendo que as luzes visíveis apresentam menor
penetrabilidade quando comparadas as infravermelhas (PARRISH; WILSON, 1991).
A terapia com lasers de baixa potência passou então a ser utilizada por fisioterapeutas
(no tratamento de ampla variedade de dor aguda e crônica), por dentistas (para tratar
inflamações e úlceras), por reumatologistas (para aliviar a dor e tratar inflamações crônicas e
doenças autoimunes), além de ser utilizada também na medicina veterinária, em centros de
reabilitação e medicina esportiva (na diminuição do inchaço, alívio da dor e melhoramento da
mobilidade (KARU, 2003).
Em 1998, a agência de Administração Nacional de Aeronáutica e do Espaço (NASA)
desenvolveu os Diodos Emissores de Luz (LED). Embora a luz emitida pelo LED seja a mesmo
que a do LASER, o primeiro apresenta algumas vantagens como menor divergência da luz,
potência de saída maior e mais estável, maior intensidade, além de ser mais econômico (KIM;
CALDERHEAD, 2011).
30
As estruturas estimuladas pela fototerapia são chamadas de fotoceptores, das quais as
mais elucidadas são os cobres de valência mista (CuA e CuB) na enzima mitrocondrial da cadeia
respiratória, a citocromo c oxidase (KARU, 2010). A fototerapia promove a aceleração da
síntese de ATP via respiração celular por atuar na dissociação do óxido nítrico (NO) ligado a
citocromo c oxidase, o que permite maior passagem de oxigênio necessário para síntese dessa
molécula além de produzir pequena quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS, do
inglês, reactive oxygen species) como representado na figura 3 (WONG-RILEY et al., 2005;
LIANG et al., 2008; KARU, 2010).
Figura 3. Ação da fototerapia. O principal alvo da luz é enzima mitrocondrial da cadeia
respiratória, a citocromo c oxidase. A fototerapia promove a aceleração da síntese de ATP
via respiração celular. Moléculas sinalizadoras, tais como as ROS e o NO também são
produzidas. Adaptado de: Agrawal et al. (2014).
As moléculas de ATP geradas a partir da estimulação não atuam apenas com função
energética, o que pode estar relacionada a versatilidade nos efeitos gerados pela fototerapia
(KARU, 2010). O ATP não é apenas uma molécula energética, mas também uma importante
molécula sinalizadora que permite a modulação de células em diversos sistemas do corpo
(BURNSTOCK, 2009). Por exemplo, células nervosas liberam ATP em músculos, intestino e
bexiga, de modo que ligam-se a receptores purinérgicos P2 (subtipos P2X e P2Y), produzindo
diferentes efeitos (BURNSTOCK, 2009; KHAKH; BURNSTOCK, 2009). Foi demonstrando
por Anders et al. (2008) que os subtipos P2Y2 e P2Y11 foram expressos em células
progenitoras neurais humanas (hNPCs, do inglês, Human Neural Progenitor Cells) in vitro,
quando irradiadas com luz infravermelha (810 nm) (ANDERS et al., 2008).
31
Embora os mecanismos pelos quais a fototerapia pode agir careçam de elucidação,
estudos experimentais têm mostrado que a fototerapia promove angiogênese, proliferação de
fibroblastos, síntese de colágeno e proteínas da matriz, inibição da dor, redução do estresse
oxidativo e infiltração leucocitária, além do aumento nas concentrações de IL-10, o que
demonstra o amplo espectro de respostas envolvendo esse tratamento (WHELAN et al., 2001;
VINCK et al., 2003; LIM et al., 2007; LIANG et al., 2008; KOMINE et al., 2010; XAVIER et
al., 2010; DE SOUZA et al., 2011; MANTINEO; PINHEIRO; MORGADO, 2014; MACEDO
et al., 2015; MARTINS et al., 2016). Assim, o emprego de fontes de luz utilizando LED parece
ser uma alternativa aos tratamentos convencionais apresentando vantagens em relação a
variedade de respostas, o que pode ampliar sua utilização terapêutica, além da praticidade do
uso e economia se comparado ao LASER.
2.7. FOTOTERAPIA NA LESÃO MUSCULAR ESQUELÉTICA
A fototerapia empregando fontes de luz de baixa intensidade tem recebido interesse
como estratégia preventiva e de recuperação de lesões induzidas por exercício físico por
apresentar efeitos anti-inflamatórios, antálgicos e favorecer o reparo tecidual (CASALECHI et
al., 2009; SERAFIM et al., 2012).
O músculo estriado esquelético parece ser particularmente sensível à atividade
biomoduladora da luz, devido ao grande número de mitocôndrias e alta taxa de metabolismo
energético aeróbico (HAYWORTH et al., 2010). A irradiação do tecido muscular pode
aumentar em mais de 50% a atividade da citocromo c oxidase, sendo os efeitos mais
pronunciados nas fibras oxidatixas do tipo I, em relação às fibras intermediárias IIa (36%) e
glicolíticas (18%) (HAYWORTH et al., 2010).
Devido a particularidade da fototerapia em agir sobre a cadeia respiratória aumentando
a demanda energética, sua utilização como recurso ergogênico tem sido investigada em
humanos, sugerindo melhora no desempenho contrátil e tempo de tolerância ao exercício,
associados a redução das concentrações de CK, lactato desidrogenase (LDH), lactato sérico e
produtos do estresse oxidativo, quando utilizadas fontes de luz Laser e LED (660 nm a 850 nm)
32
em doses entre 0,3 e 30 J por ponto de aplicação (LEAL JUNIOR et al., 2009a, 2009b; BARONI
et al., 2010; FERRARESI et al., 2011; DE ALMEIDA et al., 2012; DE MARCHI et al., 2017).
Associada ao exercício físico a fototerapia também parece modular importantes
funções nas células musculares humanas, tais como o aumento da expressão gênica do co-
ativador-1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPARGC1-α), que exerce
importante função no metabolismo oxidativo, biogênese mitocondrial e gliconeogênese
hepática; o aumento na síntese proteica através da expressão da serina/treonina quinase mTOR;
e a participação no desenvolvimento vascular através da síntese do VEGF, principal regulador
de angiogênese e permeabilidade vascular. Além disso, a fototerapia diminui a expressão gênica
de proteínas relacionadas à degradação proteica (MuRF1) e inflamação (IL-1β), sugerindo
melhorias no reparo muscular e performance (FERRARESI et al., 2012).
Em modelos animais de exercício físico foi demonstrado que a fototerapia reduziu
concentrações plasmáticas de CK e áreas de necrose e infiltrado celular no músculo sóleo de
ratos Wistar submetidos a exercício intermitente, além de demonstrar efeitos ergogênicos
quando utilizado LED (940 nm) na dose de 4 J/cm² (CAMARGO et al., 2012; DA COSTA
SANTOS et al., 2014a). Os efeitos da fototerapia sobre o músculo estriado esquelético não se
restringem ao dano muscular induzido por exercício. Por exemplo, outros estudos
experimentais mostram sua atuação na redução da concentração tecidual de TNF-α e melhora
da disfunção contrátil do diafragma de ratos Wistar induzida por lipopolisacarídeo (LPS), após
4 irradiações de laser de luz vermelha (650 nm) com dose de 1,3 J/cm² cada (AIMBIRE et al.,
2006). Além disso, prevenção da sarcopenia e aumento da IL-6 foi causada em ratas
ovariectomizadas pela associação do exercício físico à terapia com LED, luz infravermelha
próxima (850 nm), durante 12 semanas, totalizando dose de 120 J/cm² (CORAZZA et al., 2013).
Ainda, a fibrose tecidual decorrente de trauma muscular induzido por impacto foi
prevenida por doses de 4,5 J/cm² da Laser terapia (785 nm), causando a aceleração da
regeneração de proteínas contráteis e colágeno (DAWOOD et al., 2013). Além destes, a
aplicação de fototerapia com LASER à 780 nm e doses de 10 J/cm² e 50 J/cm² induziu efeitos
benéficos na regeneração muscular após criolesão em ratos Wistar (BRUNELLI et al., 2014).
33
A irradiação utilizando luz vermelha ou infravermelha próxima produziu efeitos
interessantes na prevenção e recuperação do dano muscular induzido por exercício e essa
resposta pareceu depender da dose utilizada, sugerindo efeitos melhores quando utilizados 5 e
6 J/cm² (BORSA et al., 2013; LEAL-JUNIOR et al., 2015). Foi sugerido que pequenas doses
de energia não possuem efeito, doses intermediárias gerem efeitos e doses mais elevadas
possam inibir a atividade celular (HUANG et al., 2011). Entretanto, em revisão sistemática
recente, Leal-Junior et al. (2015) apontaram por meio de meta-análise que, embora doses de 5
e 6 J sejam consideradas ótimas para tratamento dos desfechos do dano muscular esquelético,
existem resultados quando utilizadas doses anteriormente consideradas de efeitos desprezíveis
(0,3 J por ponto de aplicação) quanto doses aparentemente exacerbadas (41,7 J por ponto de
aplicação), porém ainda são necessários estudos com melhor controle metodológico para que
se confirmem esses dados (LEAL-JUNIOR et al., 2015).
O conhecimento dos mecanismos de ação da fototerapia, bem como a elucidação dos
efeitos da variação dos parâmetros de aplicação, sobre a recuperação muscular e seu impacto
sobre a funcionalidade pode promover o avanço do conhecimento na área. Não obstante, a
pesquisa experimental pode oferecer subsídios à realização de futuros ensaios clínicos com
melhor controle metodológico para produzir prescrições terapêuticas e adequadas a técnica,
além de possibilitar o desenvolvimento de novas tecnologias aplicadas à reabilitação.
34
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Comparar o efeito de diferentes doses da terapia com diodo emissor de luz (630 nm) na
inflamação do músculo solear induzida por exercício físico em ratos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito de diferentes doses de LED sobre os parâmetros inflamatórios agudos
após a indução da inflamação muscular por exercício físico;
Avaliar o efeito de diferentes doses de LED sobre a contagem de leucócitos no sangue
após a indução da inflamação muscular por exercício físico;
Investigar o efeito de diferentes doses de LED sobre a hiperalgesia mecânica após a
indução da inflamação muscular por exercício físico;
Investigar o efeito de diferentes doses de LED sobre a peroxidação lipídica após a
indução da inflamação muscular por exercício físico.
35
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. ANIMAIS
Neste estudo foram utilizados 80 ratos Wistar machos (250-300 g), dos quais 40 foram
provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de
Sergipe (UFS) e 40 do Biotério Central da Universidade Estadual de Londrina, que foram
acondicionados em caixas apropriadas e mantidos a 20-22° C com livre acesso a água e ração
(NUVILAB® CR1, Nuvital, Colombo, Brasil) em um ciclo claro-escuro de 12 h. Os
procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas da Sociedade
Brasileira de Cuidados com Animais de Laboratório (SBCAL) e foram aprovados pelo Comitê
de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA/UFS) sob número de protocolo 15/2013 e pelo
Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UEL) sob número de protocolo 124/2014 (Anexos
1 e 2).
4.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
No primeiro set experimental realizado nesse estudo, os animais foram divididos em 5
grupos (n=5-8) para análise do dano muscular e inflamação.
Grupo controle: os animais permaneceram em repouso durante todo o protocolo
experimental;
Grupo recuperação passiva (RP): os animais foram ambientados e submetidos ao
protocolo de nado por 100 minutos;
Grupo LED 1,2 J: os animais foram ambientados e submetidos ao protocolo de nado
por 100 minutos e imediatamente após receberam a dose de 1,2 J da LEDT 630 nm
sobre o tríceps sural;
36
Grupo LED 4,2 J: os animais foram ambientados e submetidos ao protocolo de nado
por 100 minutos e imediatamente após receberam a dose de 4,2 J da LEDT 630 nm
sobre o tríceps sural;
Grupo LED 10,0 J: os animais foram ambientados e submetidos ao protocolo de nado
por 100 minutos e imediatamente após receberam a dose de 10,0 J da LEDT 630 nm
sobre o tríceps sural;
Para análise da hiperalgesia mecânica pelo von Frey eletrônico, um novo set
experimental foi realizado utilizando os mesmos grupos (n=8). Neste, as medidas ocorreram
anteriormente a realização do protocolo de natação (dia 6) e 24 horas após (dia 7), conforme
esquematizado na figura 4. Todo protocolo experimental foi realizado durante o ciclo claro dos
animais. E todos os animais foram submetidos a eutanásia 24 horas após a realização do
protocolo de exercício.
Figura 4: Delineamento experimental do protocolo para indução da lesão muscular e
avaliação de hiperalgesia mecânica.
4.3. PROTOCOLO DE ESFORÇO FÍSICO
Os animais dos grupos de treinamento (RP e LED 1,2 J; 4,2 J e 10,0 J) foram submetidos
ao exercício físico por meio da natação no 1o dia do experimento, sendo que a sessão foi
realizada em um tanque coletivo com diâmetro de 52 cm e 40 cm de profundidade (3 animais
37
por tanque). A temperatura da água foi mantida em aproximadamente 30°C, e os animais
nadaram durante 100 minutos (CAMARGO et al., 2012).
Antes da aplicação do esforço físico agudo, os animais passaram por um período de
familiarização ao ambiente aquático durante cinco dias, sendo mantidos nos tanques por um
período de cinco minutos no decorrer da adaptação. No primeiro dia a profundidade do tanque
era de 10 cm e a cada dia foi realizado um incremento de aproximadamente 10 cm.
4.4. APLICAÇÃO DA LEDT
A aplicação da LEDT foi realizada utilizando-se o método pontual com contato direto
do equipamento sobre o tríceps sural direito e esquerdo (CAMARGO et al., 2012), como
observado na figura 5. Os parâmetros do equipamento utilizado, da marca Bios® (modelo
BTPYII, São José dos Campos, Brasil) estão apresentados na tabela 1.
Tabela 1: Parâmetros da LEDT.
Variável Descrição e unidades da variável
Comprimento da onda 630 ± 20 nm
Potência óptica total 500 mW
Potência óptica média 300 mW
Área por ponto de aplicação 1 cm2
Densidade da potência 300 mW/s
Ponto de aplicação Tríceps sural
Tempo de aplicação 4, 14 e 35 s
Forma de emissão Contínua
Energia emitida por ponto de aplicação 1,2 J/4 s; 4,2 J/ 14 s; 10,0 J/ 35 s
Comprimento de onda em nanômetros (nm), potência em miliwatts (mW), tempo em segundos (s),
energia irradiada em Joules (J), área de irradiação em centímetros quadrados (cm2).
38
Figura 5: Local de aplicação da fototerapia sobre o conjunto muscular (tríceps sural) formado
por gastrocnêmio e sóleo. Fonte: Bender (2007).
A aplicação da LEDT foi realizada diretamente sobre o complexo muscular tríceps sural,
tendo em vista que são agonistas no momento realizado durante o exercício físico utilizado. A
dose de 4,2 J aproxima-se da previamente utilizada nesse modelo de exercício (4 J em
CAMARGO et al., 2012). A partir desta dose, foram escolhidas uma dose maior e outra menor
considerando-se o amplo espectro reportado em outros modelos para o tratamento da
inflamação e dor muscular (LEAL-JUNIOR et al., 2015).
4.5. CONTAGEM DE LEUCÓCITOS E ANÁLISE DA ATIVIDADE DE CK
Amostras sanguíneas foram coletadas por punção cardíaca utilizando agulha com
sistema a vácuo na presença do anticoagulante EDTA. O sangue coletado foi aliquotado para a
contagem de leucócitos e análise da atividade de CK-NAC.
A contagem de leucócitos foi realizada com Analisador Hematológico Automatizado
(BC 2800 veterinary, Mindray Medical, Nanshan, China), no Laboratório de Patologia Clínica
do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina. Foram expressos valores
absolutos dos leucócitos totais e percentual de células polimorfonucleares e mononucleares.
Para análise de CK, o sangue foi centrifugado a 8.000 x g e o plasma foi coletado para
análise automatizada no equipamento Dimension Xpand Plus Integrated Chemistry System
39
(Siemens, Erlagen, Alemanha) proveniente do Laboratório de Patologia Clínica do Hospital
Veterinário da Universidade Estadual de Londrina. Os valores de CK foram expressos como
unidades da enzima por litro de soro (U/L).
4.6. SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)
A determinação dos produtos de reação do ácido tiobarbitúrico (TBA) envolve a
quantificação de aldeídos formados durante a peroxidação lipídica, incluindo o MDA, que são
resultantes da degradação de hidroperóxidos (BOSE et al., 1989).
Amostras de músculo sóleo esquerdo foram pesadas e homogenizadas em 10 vezes o
volume em solução fosfato de potássio (50 mmol/L, pH 7,4) contendo butil-hidroxitoluol (12,6
mmol/L). A seguir as alíquotas do homogenato em duplicata, foram incubadas a 90°C por 45
min com solução contendo TBA a 0,37%, em meio ácido (15% de ácido tricloroacético e 0,25
mol/L de ácido clorídrico). Ao final da incubação, e após centrifugação durante 5 minutos a
8000 x g, alíquotas dos sobrenadantes foram submetidas a extração do produto de reação com
igual volume de n-butanol e solução saturada de NaCl, seguida por agitação em vórtex por 30
segundos e centrifugação por 2 min a 8000 x g. Alíquotas dos sobrenadantes (fase orgânica)
foram pipetadas em placas de 96 poços para leitura dos valores de absorbância em leitor de
microplaca (Synergy MX®, Biotek, Winooski, USA) a 535 nm (corrigidos pelos valores de
absorbância a 572 nm). Os resultados foram expressos em nmol de MDA por mg de tecido
(BOSE et al, 1989), utilizando-se para o cálculo, um coeficiente de extinção molar de 1,55 x
105 L. mol-1.cm-1.
4.7. PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS
O músculo sóleo direito foi removido e fixado em solução Bouin aquosa durante
24 horas e desidratado em solução de álcool etílico a 70%, 90% e 100%. Na sequência, o
material foi diafanizado em Xilol e embebido em parafina histológica.
Cortes de sete micrometros foram obtidos utilizando micrótomo RM2255 (Leica
Biosystems, California, Estados Unidos) fixados em lâminas de vidro para coloração por
40
hematoxilina e eosina (Newprov, Paraná, Brasil) e analisados em microscopia de luz. Foram
aleatoriamente capturadas imagens de cada corte utilizando sistema de captura de imagens
Motican 3.0 (Motic Company, Xiamen, China) e analisadas com software Motic Image PLus
2.0 (Motic, Xiamen, China). Cada imagem foi seccionada em 20 campos (50 x 50 µm). No total
foram avaliados números diferentes de campos por grupo, a saber: grupo controle, 5962
campos; RP, 10173 campos; 1,2 J, 10097 campos; 4,2 J, 7403 campos; e 10,0 J, 8019 campos,
distribuídos entre os animais de cada grupo. O número de campos com sinais de fibras
necróticas, infiltrado celular e edema foi registrado (DA COSTA SANTOS et al., 2014a). Os
dados foram expressos como total absoluto de campos analisados por grupo e o percentual para
cada desfecho analisado (NUNES et al., 2013).
4.8. MEDIDA DE HIPERALGESIA MECÂNICA NA PATA
Para o teste de hiperalgesia mecânica foi utilizado o von Frey eletrônico (Insight,
Ribeirão Preto/Brasil). No dia do teste, os animais foram transferidos para gaiolas individuais
(Insight, Ribeirão Preto) nas quais permaneceram em ambientação por 30 minutos. Após esse
período, foram aplicados estímulos mecânicos nas duas patas, em triplicata, antes e 24 horas
após o protocolo de natação (figura 4). A avaliação foi realizada de maneira encoberta, de modo
que o avaliador não teve conhecimento a respeito dos grupos experimentais.
O transdutor de pressão foi aplicado na superfície plantar das patas do animal e foi
realizada uma força crescente até que o animal respondesse com a retirada. A força necessária
para evocar o comportamento de retirada foi registrada como limiar de retirada da pata (em g).
Para a análise, considerou-se a média aritmética de três medidas consecutivas realizadas em
cada uma das patas do animal com intervalo mínimo de 1 minuto (CUNHA et al., 2004). Os
dados foram expressos como a diferença entre os valores de intensidade do estímulo inicial e
final (Δ, em g).
41
4.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A distribuição de normalidade foi observada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Dados
paramétricos foram apresentados em média ± erro padrão (S.E.M.) e comparados por ANOVA
de uma via seguido de pós teste de Tukey.
Para os dados histológicos foi realizada análise com Qui-quadrado seguido de correção
de Yates. Os dados foram analisados no programa estatístico GraphPad Prism 5.0.
42
5. RESULTADOS
Vinte e quatro horas após a realização do exercício físico foi observado aumento na
atividade da CK no grupo RP (p<0,0001) quando comparado ao grupo controle, como mostrado
na figura 6. O tratamento com LEDT, imediatamente após a sessão de exercício, atenuou essa
resposta em todas as doses utilizadas (p<0,0001).
Controle RP 1,2 J 4,2 J 10,0 J0
1000
2000
3000
bb
b
a
CK
(U
/L)
Figura 6. Atividade plasmática de creatina quinase (CK) em animais não exercitados
(controle), exercitados e submetidos à recuperação passiva (RP) e exercitados e tratados
imediatamente após com as diferentes doses de LED terapia (1,2 J, 4,2 J, 10,0 J). a p<0,0001
comparado ao grupo controle. b p<0,0001 em comparação ao grupo RP. ANOVA seguido de
teste de Tukey.
No grupo controle (figura 7a) está mostrada a arquitetura normal do tecido em animais
que permaneceram em repouso, na qual não são apontadas áreas de necrose, edema ou infiltrado
de leucócitos. No tecido dos animais do grupo RP foram observadas áreas com necrose e
infiltração leucocitária (seta) e edema (*, figura 7b). Também foram observadas áreas com esses
desfechos nos tecidos dos animais do grupo tratado com 1,2 J (figura 7c). Nos grupos tratados
com 4,2 J (figura 7d) e 10,0 J (figura 7e) foram observadas poucas áreas com presença de
necrose, edema e infiltração de leucócitos.
43
Figura 7. Imagens representativas de fotomicrografias referentes à análise histológica (x 10).
No grupo controle (a) está mostrada a arquitetura normal do tecido em animais que permaneceram
em repouso. Em animais que foram submetidos ao protocolo de nado e passaram pela recuperação
passiva (b) ou foram tratados com terapia com o diodo emissor de luz (LEDT), imediatamente após
o nado, na dose de 1,2 J (c) podem ser observadas áreas de fibras necrosadas com a presença de
infiltrado de leucócitos (seta), além de áreas de edema (*). Nos grupos tratados com LEDT nas doses
de 4,2 J (d) ou 10,0 J (e) após o protocolo de nado, foram encontradas poucas áreas com fibras
necrosadas, infiltrado de leucócitos e edema. As imagens foram obtidas utilizando software Motic
Image PLus 2.0.
44
Nesses grupos também foi feita análise quantitativa para presença de necrose, edema e
infiltrado leucocitário por método histológico. Na tabela 2, pode-se observar aumento
significativo nos três parâmetros avaliados quando comparado o grupo RP ao grupo controle.
As doses de 4,2 J (p<0,001) e 10,0 J (p<0,05) diminuíram todos esses parâmetros, enquanto 1,2
J (p<0,05) apresentou redução apenas no infiltrado celular. Além disso, o grupo 4,2 J apresentou
maior redução das variáveis analisadas quando comparada às outras doses (p<0,001).
Tabela 2. Frequência de necrose, edema e inflamação.
Controle
(n = 5962)
RP
(n = 10173)
1,2 J
(n = 10097)
4,2 J
(n = 7403)
10 J
(n = 8019)
Necrose
02(0,03%)
95(0,93%) a
81(0,80%) a
10(0,13%) b, c,
d
50(0,62%) a, b
Edema
415(6,96%)
936(9,20%) a
925(9,16%) a
356(4,80%) a,
b, c, d
635(8,59%) a,
b, c
Infiltrado celular
83(1,39%)
357(3,50%) a
278(2,75%) a, b
41(0,55%) a, b,
c, d
133(1,65%) b, c
A frequência de necrose, edema e infiltrado celular está relacionada como número absoluto de
campos (percentual relativo), sendo considerado um campo (n) a área de 50 x 50 µm do músculo
sóleo de animais não exercitados (controle), exercitados + recuperação passiva (RP) e
exercitados + diferentes doses de LED terapia (1,2 J, 4,2 J, 10,0 J). a p<0,05 comparado ao
grupo controle. b p<0,05 comparado ao grupo RP. c p<0,05 comparado ao grupo 1,2 J. d p<0,05
comparado ao grupo 10,0 J; Qui-quadrado e correção de Yates.
A figura 8 indica que não foi observada alteração da peroxidação lipídica no músculo
sóleo dos grupos avaliados.
45
Controle RP 1,2 J 4,2 J 10,0 J0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
nm
ol d
e M
DA
/mg d
e tecid
o
Figura 8. Avaliação da peroxidação lipídica no músculo sóleo de animais não exercitados
(controle), animais submetidos ao protoloco de nado (RP) e animais tratados com diferentes
doses de LED terapia pós exercício (LED 1,2 J, 4,2 J e 10,0 J); ANOVA seguido de teste de
Tukey.
Na tabela 3 é relacionada a contagem de leucócitos polimorfonucleares, mononucleares
e leucócitos totais no sangue dos animais após 24 horas da indução da inflamação muscular.
Não houve diferença nas contagens destas células entre os grupos avaliados.
Tabela 3. Contagem de leucócitos no sangue.
Os leucócitos (106 células/mm³) foram quantificados nos animais não exercitados (Controle),
animais submetidos ao protocolo de nado (RP) e animais tratados com diferentes doses de LED
terapia pós exercício (LED 1,2 J; 4,2 J e 10,0 J); ANOVA seguido de teste de Tukey.
Os valores obtidos antes do protocolo exercício físico não apontaram diferenças na
intensidade de estímulo basal entre os grupos: controle (35,0±0,8 g); RP (37,4±0,8 g); 1,2 J
(37,2±0,6 g); 4,2 J (36,0±0,5 g); e 10,0 J (36,3±0,7 g). Vinte a quatro horas após o protocolo de
Controle
(n=8)
RP
(n=7)
1,2 J
(n=5)
4,2 J
(n=5)
10,0 J
(n=7)
Leucócitos Totais
5,75±0,37
7,97±0,11
8,86±0,11
7,36±0,18
8,75±0,86
Polimorfonucleares
0,90±0,15
1,16±0,28
1,33±0,40
1,24±0,45
1,78±0,28
Mononucleares
4,48±0,20
6,70±0,98
7,08±0,10
5,99±0,13
6,86±0,69
46
nado, houve redução no limiar de retirada da pata ao estímulo mecânico nos animais que
passaram por exercício físico (RP), quando comparados ao grupo controle (p<0,05) e a
aplicação das doses de 1,2 J ou 10,0 J não alterou este efeito. Entretanto, apenas a dose de 4,2
J reduziu a alteração do limiar de retirada da pata quando comparada ao grupo RP (p<0,05)
(Figura 9).
Controle RP 1,2 J 4,2 J 10,0 J
-20
-15
-10
-5
0
5
a
a a
b
in
ten
sid
ad
e d
o e
stí
mu
lo (
g)
Figura 9. Variação da intensidade do estímulo mecânico (em g) nas patas dos animais não
exercitados (controle), animais submetidos ao protocolo de nado (RP) e animais tratados com
diferentes doses de LED terapia pós exercício (LED 1,2 J, 4,2 J e 10,0 J). a p<0,05 comparado
ao grupo controle. b p<0,05 em comparação ao grupo RP; ANOVA seguido de teste de Tukey.
47
6. DISCUSSÃO
Existem diversos modelos animais de exercícios físicos que possibilitam o estudo da
inflamação, estresse oxidativo e dor causados agudamente (BALCI et al., 2012; BECK;
GOBATTO, 2013; DA COSTA SANTOS et al., 2014a; ISANEJAD et al., 2015; LAMOU et
al., 2016). Para mimetizar uma sessão extenuante de exercício físico, foi utilizado no presente
estudo o protocolo de natação por 100 minutos em ratos, no qual os parâmetros inflamatórios
agudos podem ser desenvolvidos e bem caracterizados como, por exemplo, a lesão no músculo
esquelético acompanhada de infiltrado de células, necrose e edema 24 horas após o exercício
(CAMARGO et al., 2012). Neste protocolo, os dados apresentados no presente estudo
confirmam demonstrações prévias de que o LED reduz a inflamação muscular (CAMARGO et
al., 2012; DA COSTA SANTOS et al., 2014a), ao mesmo tempo em que agregam informações
importantes sobre a dose (em J) utilizada do LED.
A CK é comumente utilizada para indicar essa resposta danosa ao músculo, de modo
que após o protocolo de natação utilizado no presente estudo, houve aumento da atividade dessa
enzima na corrente sanguínea dos animais do grupo RP. Proteínas circulantes específicas ao
músculo esquelético como a CK, α-actinina 1 ou mioglobina são utilizadas como marcadoras
do DMIE, pois o aumento de sua atividade no sangue está associado a lesão muscular (TEE;
BOSCH; LAMBERT, 2007). Estes resultados corroboram aqueles previamente publicados por
Warhol et al. (1985), que demonstraram, utilizando biopsias em músculo humano, que o
exercício físico contínuo tem como respostas iniciais a ruptura de miofibrilas e do citoesqueleto,
contribuindo para o extravasamento da CK. O tratamento pós-exercício com LEDT atenuou o
aumento na atividade de CK de forma independente da dose aplicada, sugerindo que este
tratamento pode ter contribuído para preservar a estrutura do músculo esquelético. Este
resultado concorda com a demonstração de que a LEDT reduziu a atividade de CK nesse mesmo
modelo de exercício, utilizando um aparelho com comprimento de onda de 940 nm, dose de 4
J e potência de 160 mW (CAMARGO et al., 2012).
Utilizando a LEDT com estes mesmos parâmetros, mas em um modelo experimental de
90 min (45 + 45 min) de nado com intervalo de 25 minutos, Da Costa Santos et al. (2014a)
demonstraram a ação da LEDT na redução da atividade de CK 24 h após exercício. Em humanos
saudáveis submetidos a um protocolo de contrações excêntricas isocinéticas em cadeira
48
extensora (5 séries de 15 repetições), a combinação de Lasers (904 nm) e Leds (604 nm e 875
nm) e doses entre 0,83-5,83 J/cm² (cada diodo), atenuou o aumento da atividade da CK de 24 a
96 horas (DE PAIVA et al., 2016). A aplicação da LEDT (850 nm, 7,5 J/cm² e 500 mW),
imediatamente após protocolo de contrações excêntricas em leg press e cadeira extensora por
12 semanas consecutivas (36 sessões de treinamento), reduziu a atividade de CK 24 horas após
cada sessão (FERRARESI et al., 2016). Conjuntamente, estes estudos parecem sugerir que a
concentração/atividade dessa enzima, que é considerada o principal indicador de DMIE, são
alteradas com comprimentos de onda, doses e potências diferentes dos utilizados nesse estudo,
o que denota uma alta sensibilidade desta enzima à fototerapia. Assim, sugere-se ser plausível
a falta de diferença com as variações das doses de LEDT encontradas no presente estudo.
O efeito protetor da LEDT, evidenciado pela redução da atividade de CK, pode estar
relacionado a menor resposta inflamatória tecidual, uma vez que a lesão do musculo esquelético
geralmente é acompanhada de um processo inflamatório com formação de edema, infiltrado de
células inflamatórias e necrose de fibras musculares (CAMARGO et al., 2012). No presente
estudo, as doses de 4,2 J e 10,0 J reduziram todos esses parâmetros, enquanto a dose de 1,2 J
apresentou redução apenas no infiltrado celular. De fato, as mesmas alterações histológicas no
músculo foram demonstradas experimentalmente após exercício contínuo (CAMARGO et al.,
2012) ou intermitente (DA COSTA SANTOS et al., 2014a). Nesses estudos, a LEDT reduziu
os parâmetros de necrose e infiltrado leucocitário (ambos utilizaram dose de 4 J e potência de
160 mW, com LED 940 nm), porém apenas no modelo de exercício intermitente houve redução
do edema após o tratamento. Ainda, a fototerapia com laser infravermelho (830 nm, 50 J/cm²)
também reduziu a necrose, edema e infiltrado celular em músculos criolesionados de ratos
Wistar (RENNÓ et al., 2011).
As controvérsias na redução ou não do edema, podem estar relacionadas às citocinas
pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β, já que há correlação dessas com a formação de edema no
tecido inflamado (BRADLEY, 2008; SANDERS et al., 2001; SERHAN et al., 2010). Em
modelo de inflamação induzida por CFA na pata de camundongos Swiss não houve redução do
edema (24 horas após indução) quando utilizada LEDT com 950 nm, doses de 1, 2 e 4 J/cm² e
potência de 80 mW, acompanhada de ausência de alteração nas concentrações teciduais de
TNF-α e IL-1β (MARTINS et al., 2016). Em contrapartida, Belém et al. (2016) mostraram que
houve redução do edema em camundongos Swiss com colite induzida por ácido acético, como
49
também redução de TNF-α, quando tratados com LEDT a 940 nm, dose de 4,05 J/cm² e potência
de 270 mW. Dessa forma, é possível que as diferenças nos parâmetros dos aparelhos utilizados
no mesmo modelo de nado (CAMARGO et al., 2012) e no presente estudo possam estar
relacionadas com a possível modulação de citocinas inflamatórias e consequente redução do
edema aqui demonstradas.
O processo inflamatório causado pelo exercício físico pode vir acompanhado de dano
oxidativo, o qual pode ser inferido pela concentração das TBARS, como o MDA presente no
tecido muscular (BALCI et al., 2012; LAMOU et al., 2016). Porém, no presente estudo não
houve alteração na concentração das TBARS, o que denota que ou o esforço físico não foi
suficiente para causar esse tipo de lesão ou o dano oxidativo ocorreu em tempo anterior ao
mensurado neste estudo (anterior a 24 horas pós-exercício). A hipótese de que a peroxidação
lipídica ocorreu anteriormente as 24 horas é amparada pelo fato de existirem modelos animais
de exercício físico que podem causar dano oxidativo e o consequente aumento de MDA. É o
caso do modelo utilizado no estudo de Balci et al. (2012), no qual os animais foram expostos
ao nado e, diferente do protocolo aqui utilizado, eles permaneciam até a exaustão, com tempo
médio de nado entre 120 e 270 minutos. Além disso, a peroxidação lipídica foi avaliada
imediatamente após o exercício físico (BALCI et al., 2012). De forma similar, no estudo de
Lamou et al. (2016), a quantificação da MDA ocorreu 1 hora após o término do protocolo de
nado com os animais tendo acréscimo na carga de 10% relativos ao seu peso, além de
permaneceram nadando até a exaustão. Em contrapartida, 5 horas após realização do teste de 3
repetições (3 RM) por protocolo de escalada, não houve aumento na concentração de MDA na
musculatura do quadríceps de camundongos Swiss submetidos a 6 treinamentos físicos (50
repetições) anterior ao teste (FERRARESI et al., 2015b). Isso também pode denotar possível
adaptação a carga (volume e intensidade) de exercício relacionado ao tipo de dano.
Um método de avaliar as consequências do exercício sobre o organismo envolve a
mensuração de parâmetros hematológicos, os quais estão sendo amplamente utilizados na
determinação de status de saúde e também no campo da medicina esportiva para fins
terapêuticos (BANFI et al., 2004; LIPPI et al., 2010). No presente estudo não foi percebida
alteração na contagem das células após o exercício físico. Curiosamente, 24 horas após o
exercício físico a quantidade de leucócitos presentes na corrente sanguínea pode estar alterada,
seja por aumento (DA COSTA SANTOS et al., 2014a) ou redução (CAMARGO et al., 2012)
50
no número dessas células, ou, por vezes, não haver alteração desse número neste período
(MCCARTHY; DALE, 1988), o que mostra a variabilidade da resposta imunológica ao
exercício.
Uma hipótese para essas controvérsias reside no fato de que o desempenho e as respostas
hematológicas são alteradas de acordo com o horário de realização do exercício, como
mostrado por Beck e Gobatto (2013) que demonstraram, imediatamente após protocolo de nado
até exaustão, o aumento na quantidade de leucócitos na corrente sanguínea de ratos Wistar
submetidos ao exercício durante o ciclo claro (12h00) foi maior em comparação aos animais
exercitados durante o ciclo escuro (20h00) e isso pode estar relacionado a alterações hormonais,
demonstrando que a contagem de células é amplamente variável (BECK & GOBATTO, 2013).
Já Camargo et al. (2012), diferentemente dos resultados obtidos nesse estudo,
mostraram uma diminuição na contagem dessas células 24 horas após o protocolo de nado e
atribuíram esse acontecimento a teoria da “janela aberta” (do termo original, open window), na
qual afirma que o exercício físico suprime agudamente o sistema imunológico.
No presente trabalho, o exercício resultou em redução do limiar de retirada da pata nos
animais submetidos ao nado, o que indica o desenvolvimento de hiperalgesia e essa resposta
apenas foi diminuída nos animais que receberam a dose intermediária de 4,2 J, o que sugere
que a redução das alterações histológicas no tecido não é o único fator que determina a redução
da hiperalgesia, pois na dose de 10 J há redução das alterações histológicas sem alteração da
hiperalgesia.
Hough (1902) primeiramente propôs que a dor aparece nas primeiras horas (12-24
horas) e estaria relacionada com a ruptura das fibras musculares ou do tecido conectivo. Porém,
sabe-se atualmente que a DMIT pode apresentar-se após exercício de forma independente dos
marcadores de DMIE, como a diminuição na contração voluntária máxima e amplitude de
movimento e o aumento de CK no plasma (DOUGLAS et al., 2016; MIZUMURA; TAGUCHI,
2016). Foi sugerido que fatores neurotróficos na DMIT como, por exemplo, a via dos receptores
B2/NGF (MURASE et al., 2010) e do GDNF por meio de ativação da COX-2 (MURASE et al.,
2013) podem colaborar para o efeito anti-hiperalgésico. Nessa perspectiva, estudos prévios
demonstraram a atuação da fototerapia na inibição da despolarização de fibras nervosas
51
aferentes e na inibição da ação da bradicinina (YAN; CHOW; ARMATI, 2011), além da
redução na expressão das COX e consequentemente da produção de prostaglandina E2 (LIM et
al., 2007; RENNÓ et al., 2011).
Mais recentemente, foi demonstrado que a LEDT também (890 nm, 390 mW e 20,8
J/cm²) atenuou a nocicepção induzida por mediadores endógenos (glutamato, bradicinina e
prostaglandina E2) pela ativação de canais envolvidos na aferência nociceptiva (TRPV1,
TRPA1, TRPM8 e ASIC), pelo aumento das concentrações de PKA e PKC, enzimas
responsáveis pela fosforilação desses canais, o que provavelmente diminuiu seus limiares de
ativação, consequentemente potencializando a resposta nociceptiva. Neste estudo também foi
demonstrada a participação das fibras C na redução dessas respostas (PIGATTO et al., 2016).
Além disso, a pré-administração de antagonista opióide (naloxona) ou inibidor de L e P
selectinas (fucoidina) inibiu o efeito antinociceptivo da LEDT (950 nm, 2 J/cm²) (MARTINS
et al., 2016). Desta forma, é possível que estes mecanismos possam mediar os efeitos da LEDT
encontrados no presente estudo.
De forma geral, pode-se afirmar que as diferentes doses de LEDT utilizadas causaram
diferentes efeitos no músculo esquelético, sendo a dose de 4,2 J a que produziu melhores efeitos,
uma vez que promoveu redução da CK, inflamação e necrose muscular e da hiperalgesia. Os
dados apresentados nesse estudo corroboram com o estudo de Camargo et al. (2012), no tocante
ao efeito do LEDT sobre a DMIE e o processo inflamatório gerado pelo protocolo de natação,
porém, acrescenta informações importantes no que diz respeito ao efeito de diferentes doses,
um problema discutido de forma incipiente na utilização clínica da LEDT.
52
7. CONCLUSÃO
O presente estudo indica que a LEDT na dose de 4,2 J e comprimento de onda 630 nm
apresenta efeitos anti-inflamatório e anti-nociceptivo no modelo de lesão muscular induzida por
exercício em ratos. Além disso, dentre as três doses testadas, a de 1,2 J mostrou-se insuficiente
para o tratamento da inflamação e nocicepção, ao passo que a de 10 J apresentou ação anti-
inflamatória mas não antinociceptiva.
53
8. PERSPECTIVAS FUTURAS
Os resultados desse estudo agregam importante contribuição para o entendimento das
variações das propriedades (dose) da LEDT na lesão muscular esquelética e apontam
controvérsias que trarão novas perspectivas nesta discussão.
Nesse contexto, experimentos estão sendo realizados para análise da modulação da
LEDT sobre as citocinas inflamatórias TNF-α e IL-1β por método de imuno-histoquímica com
o objetivo de relacionar os dados obtidos aos melhores efeitos sobre o tratamento e a melhor
resposta causada pela dose intermediária de 4,2 J. Porém, estudos futuros poderão melhor
delinear o efeito da variação de outros parâmetros da LEDT e elucidar os mecanismos
subjacentes ao efeito anti-inflamatório e antinociceptivo.
54
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10. ANEXOS
10.1. ANEXO 1
66
10.2. ANEXO 2