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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL - REI - UFSJ

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU - CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ANDERSON FERNANDES DE MELO

MECANISMOS BIOQUÍMICOS ENVOLVIDOS NA DOENÇA

HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCÓOLICA EM RATOS

ALIMENTADOS COM A DIETA CAFETERIA

DIVINÓPOLIS - MG

ABRIL – 2016

ANDERSON FERNANDES DE MELO

MECANISMOS BIOQUÍMICOS ENVOLVIDOS NA DOENÇA

HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCÓOLICA EM RATOS

ALIMENTADOS COM A DIETA CAFETERIA

Dissertação apresentada ao Programa

Multicêntrico em Bioquímica e Biologia

Molecular da Universidade Federal de São

João Del Rei, como requisito parcial para a

obtenção do grau de Mestre.

Orientador: Valéria Ernestânia Chaves

Co-orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira

DIVINÓPOLIS – MG

ABRIL – 2016

Catalogação na fonte

Universidade Federal de São João del-Rei

Biblioteca Campus Centro Oeste – Dona Lindu

ii

Aos meus pais e irmãos que me garantiram a realização

dessa etapa importante em minha vida.

A minha esposa e companheira Danielle pela

fundamental presença em minha vida, por todos os dias

dedicados a mim, pela paciência, pela compreensão e companheirismo.

E a todos que contribuíram de alguma forma para esta conquista!

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus que se faz sempre presente em minha vida. Por ter

guiado meu caminho, sempre me iluminando e me tranquilizando para que eu

conseguisse chegar até aqui.

Agradeço por toda a vida, a minha orientadora Dra. Valéria Ernestânia Chaves por

me aceitar como seu aluno, por todos os conselhos, aprendizados, preocupações,

discussões e por não ter desistido de mim. Por sempre me escutar, sempre disposta

a me ensinar. Serei eternamente grato à você.

Agradeço a minha co-orientadora Dra.Helena Coutinho Franco de Oliveira por me

aceitar como seu aluno e me acolher em seu laboratório permitindo assim o meu

crescimento como pessoa e pesquisador. A todo pessoal da Unicamp, em especial o

Thiago Hentz e Helena Raposo pela grande oportunidade de aprendizado e

amizade, e por estarem sempre dispostos a me ensinarem.

Agradeço a todos os meus amigos do Laboratório de Fisiologia, em especial

Gleuber, Willian, Bárbara, Reysla e Thais por sempre me apoiarem e socorrerem na

hora do aperto e pela troca de conhecimento.

Agradeço em especial à professora Dra.Cristiane Queixa Tilelli pelas palavras sábias

e confortantes e por permitir o convívio e o aprendizado.

Agradeço a toda UFSJ por ter me proporcionado a realização desse sonho, em

especial agradeço ao professor Dra. Hélio Batista dos Santos e sua aluna Camila

Sales pela ajuda na histologia. Agradeço também a todos do Laboratório de

Bioquimica Celular, em especial a professora Dra.Hérica de Lima Santos e o

professor Dr.Leandro Augusto de Oliveira Barbosa, que além de ceder

equipamentos, me concederam um pouco de seus conhecimentos.

A minha amada família por entender as minhas faltas e pelo amor incondicional,

sempre apoiando minhas escolhas. Ao pai e amigo Antônio (Jiló) e a minha amada

mãe, quero agradecer por tudo, sem vocês não poderia ter chegado até aqui. Aos

meus amados irmãos Marco Antônio, Marcelo e André por me compreenderem e me

amarem do jeito que sou.

Agradeço ao grande amor da minha vida, minha companheira, amiga, cúmplice e

esposa Danielle. Deus colocou você em minha vida e ela mudou completamente.

Agradeço pela confiança e pela paciência. Somente pessoas especiais como você

iv

poderiam suportar todos os problemas que passamos juntos. Te amo pra todo o

sempre.

v

“A ignorância gera mais frequentemente confiança do que o conhecimento: são os

que sabem pouco, e não aqueles que sabem muito, que afirmam de uma forma tão

categórica que este ou aquele problema nunca será resolvido pela ciência.”.

(Charles Darwin)

vi

RESUMO

A obesidade é uma condição em que ocorre aumento na gordura corporal, podendo

prejudicar a saúde e o bem-estar. A obesidade está correlacionada com hipertensão,

resistência à insulina, dislipidemia e doença hepática gordurosa não alcóolica

(DHGNA). Embora considerada benigna por muitos estudos, a DHGNA pode evoluir

para processos inflamatórios (esteatohepatite), cirrose e carcinoma hepático. O

acúmulo de lipídios intracelulares na DHGNA é resultado de um desequilíbrio entre,

1) lipogênese de novo, 2) lipólise hepática 3) oxidação lipídica 4) captação de ácidos

graxos hepáticos e 5) exportação de lipídios via partículas de VLDL. Este estudo

teve como objetivo investigar os mecanismos bioquímicos envolvidos no

desenvolvimento da DHGNA em ratos alimentados com a dieta cafeteria. Ratos

Wistar foram alimentados com uma dieta comercial suplementada com 12 itens

hipercalóricos e água contendo 20% de sacarose (grupo cafeteria) ou com uma dieta

comercial e água ad libitum (grupo controle) por 24 dias. O peso corporal foi

monitorado a cada dois dias. Após eutanásia os órgãos e o sangue foram coletados.

A concentração de triacilglicerol (TAG), colesterol, glicose e ácido úrico séricos

foram avaliados utilizando kits comerciais. A concentração de lipídios totais, TAG e

colesterol no fígado foram avaliados pelo método Folch (1957) ou por método

colorimétrico (kit comercial). A análise histológica do tecido hepático foi realizada

através da coloração com Hematoxilina e Eosina e Oil Red. A expressão dos gênica

foi avaliada por RT-PCR. A secreção de VLDL foi calculada pela diferença de TAG

no soro antes e depois da administração de Triton WR 1339 (20%) em ratos em

jejum. A dieta cafeteria induziu um aumento no peso dos tecidos adiposo branco

epididimal e retroperitoneal sem alterar o peso corporal final, assim como um

aumento na concentração de TAG sérico. Também houve um aumento na

concentração dos lipídios totais, de TAG e o colesterol no tecido hepático. A dieta

cafeteria induziu um aumento na expressão do gene da carnitina palmitoil

transferase I (CPT-1), da proteína de transferência microssomal de triacilglicerol

(MTP), mas reduziu a expressão de ApoB apesar do aumento na secreção de VLDL.

Nossos dados demonstram que a dieta cafeteria induziu esteatose hepática e

hipertrigliceridemia, acompanhado de um aumento na secreção de VLDL, contudo

nossos estudos prévios indicam uma sensibilidade insulínica preservada neste

tecido. Desta forma, sugerimos que, apesar da dieta cafeteria induzir um acúmulo de

vii

lipídios no tecido hepático, mecanismos compensatórios parecem estar estimulados,

provavelmente minimizando o efeito desta dieta neste acúmulo lipídico.

Palavras chave: dieta cafeteria, doença hepática gordurosa não alcóolica, secreção

de VLDL, triacilglicerol.

viii

ABSTRACT

The obesity, a condition characterized by an increase in body fat, is correlated with

hypertension, insulin resistance, dyslipidemia and non-alcoholic fatty liver disease

(NAFLD). Although considered benign by many studies, NAFLD may progress to

inflammation (NASH), cirrhosis and hepatic carcinoma. The intracellular

accumulation of lipids in NAFLD results of an imbalance between, 1) lipogenesis de

novo, 2) hepatic lipolysis, 3) lipid oxidation, 4) uptake of fatty acids by liver and 5)

lipid export via VLDL particles. This study aimed to investigate the biochemical

mechanisms involved in the development of NAFLD in rats fed the cafeteria diet.

Wistar rats were fed a commercial diet supplemented with 12 hypercaloric items and

water containing 20% sucrose (cafeteria group) and a commercial diet and water ad

labitum (control group) for 24 days. Body weight was monitored every two days. After

euthanasia, organs and blood were collected. Serum concentration of triacylglycerol

(TAG), cholesterol, uric acid, and glucose were evaluated using commercial kits.

Concentration of total lipids, TAG and cholesterol in the liver were assessed by the

Folch method or by colorimetric method (commercial kit). Histological analysis of liver

tissue was performed by staining with hematoxylin & eosin and oil red. Genes

expression was assessed by RT -PCR. VLDL secretion was calculated by difference

of TAG in the serum before and after the administration of Triton WR 1339 (20%) in

fasted rats. The cafeteria diet induced an increase in the weight of epididymal and

retroperitoneal adipose tissue without to change the final body weight, as well as an

increase in serum concentrations of TAG. There was also an increase in the

concentration of total lipids, TAG and cholesterol in the liver tissue. The cafeteria diet

induced an increase in the gene expression of carnitine palmitoyl transferase (CPT-

1), microsomal triacylglycerol transfer protein (MTTP), but reduced apolipoprotein B

(ApoB) expression, despite the increased secretion of VLDL. Our data showed that

cafeteria diet induced fatty liver disease and hypertriglyceridaemia, followed by an

increase in the VLDL secretion, in addition our previous studies indicate an insulin

sensitivity preserved in this tissue. Thus, we suggest that despite the cafeteria diet

induce an accumulation of lipids in the liver tissue, compensatory mechanisms

appear to be stimulated, probably minimizing the effect of this diet in this lipid

ix

accumulation. Keywords: cafeteria diet, non-alcoholic fatty liver disease, secretion of

VLDL, triacylglycerol.

x

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................... xii

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

1.1 Geração de TAG no tecido hepático ...............................................................5

1.2 Mobilização de TAG hepático ..........................................................................7

1.3 Oxidação hepática de ácidos graxos ...............................................................7

1.4 Secreção de VLDL ..........................................................................................7

1.5 Resistência à insulina e DHGNA ....................................................................9

1.6 Dieta cafeteria................................................................................................10

2. OBJETIVOS ................................................................................................ ..........12

2.1 Objetivo geral................................................................................................12

2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 12

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 13

3.1 Animais e seu tratamento ............................................................................. 13

3.2 Histologia ...................................................................................................... 14

3.2.1 Coloração com Hematoxilina e Eosina...................................................14

3.2.2 Coloração com Oil Red...................................................................................15

3.3 Determinação do conteúdo lípidico do fígado ............................................... 15

3.4 Avaliação da secreção de VLDL-TAG pelo fígado ........................................ 16

3.5 Reação em cadeia da polimerase – transcrição reversa em tempo real (Real

Time-PCR) .............................................................................................................. 16

3.6 Determinação dos níveis séricos de glicose, triacilglicerol, colesterol, ácido

úrico, AST e ALT. ...................................................................................................... 18

3.7 Análise estatística..........................................................................................18

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 19

4.1 Parâmetros séricos ....................................................................................... 19

4.1.1 Ganho de peso corporal dos ratos.........................................................19

xi

4.1.2 Peso dos tecidos....................................................................................20

4.1.3 Parâmetros séricos.................................................................................22

4.2 Parâmetros hepáticos...................................................................................24

4.2.1 Histologia...............................................................................................24

4.2.2 Concentração de lipídios hepáticos.......................................................29

4.2.3 Prova de função hepática.......................................................................32

4.2.4 Expressão gênica no fígado...................................................................34

4.2.4.1 Expressão gênica de fatores de transcrição relacionados com a

regulação da expressão gênica de enzimas envolvidas no metabolismo

de lipídios..............................................................................................34

4.2.4.2 Expressão dos genes relacionados com a oxidação lipídica...36

4.2.4.3 Expressão dos genes relacionados com a mobilização de

lipídios no fígado...................................................................................37

4.2.4.4 Expressão dos genes relacionados com a secreção de

VLDL.....................................................................................................38

4.2.5 Velocidade de secreção de VLDL-TAG..................................................39

5. DISCUSSÃO..........................................................................................................41

5.1 Lipogênese hepática.................................................................................46

5.2 Lipólise hepática.......................................................................................49

5.3 Oxidação de Lipídios Hepáticos................................................................53

5.4 Captação de Ácidos Graxos Hepático......................................................55

5.5 Secreção de VLDL....................................................................................55

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 62

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 63

8. ANEXO...................................................................................................................81

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ACC Acetil CoA carboxilase

ACO Acil-CoA oxidade

AGL Ácido graxo livre

AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamida-ribonucleotídeo

AKT Serina/treonina quinase

ALT Alanina aminotransferase

AMP Adenosina monofosfato

AMPK 5' Adenosina monofosfato quinase

ApoB Apolipoproteina B

AST Aspartato aminotransferase

ATGL Lipase do triacilglicerol do tecido adiposo

ATP Adenosina trifosfato

CGI-58 Comparative gene identification-58

ChREBP Proteína de ligação do elemento de resposta aos carboidratos

CPT-I Carnitina palmitoil transferase I

Crtc2 CREB regulated transcription coactivator 2

DAG Diacilglicerol

DGAT Diacilglicerol aciltransferase

DHGNA Doença hepática gordurosa não alcoólica

FAS Ácido graxo sintase

FATP5 Transportador de ácido graxo 5

Foxo1 Forkhead box O1

G0S2 G0/G1 switch gene 2

G3P Glicerol 3 fosfato

HMG-CoA

redutase 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase

HNF-4α Fator nuclear de hepatócito

IDL Lipoproteína de densidade intermediária

IL10 Interleucina 10

KLF6 Kruppel-like factor 6

LDL Lipoproteína de baixa densidade

LHS Lipase hormônio sensível

xiii

L-PK Piruvato quinase do fígado

LPL Lipase lipoproteica

LXR Receptor X do fígado

MAG Monoacilglicerol

MCP1 Macrophage chemotatic protein 1

mTOR Complexo alvo da rampamicina em mamíferos 1

MTP Proteína microssomal de transferência de TAG

NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease

NASH Non-alcoholic steatohepatitis

PCR Reação em cadeia de polimerase

PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase

PGC-1α Coativador-1α do PPAR-γ

PI3K Fosfatidilinositoil-3-quinase

PKA Proteína quinase dependente de cAMP

PP2A Proteína fosfatase 2A delta

PPARα Peroxisome proliferator-activated receptors alpha

PPARγ Peroxisome proliferator-activated receptors gamma

RNA Ácido ribonucléico

SCD1 Stearol-CoA desaturase 1

SOD2 Superóxido desmutase 2

SREBP-1c Proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 1c

TAB Tecido adiposo branco

TAG Triacilglicerol

TGH Hidrolase de triacilglicerol

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

UCP2 Proteína desacopladora 2

VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade

Xu-5-P Xilulose-5-fosfato

1

1. INTRODUÇÃO

Segundo a Organização Mundial da Saúde, a obesidade é uma condição em

que ocorre o aumento na gordura corporal, podendo prejudicar a saúde e o bem-

estar (OMS, 2016). A obesidade é hoje uma pandemia e se a tendência mundial for

mantida é esperado que a obesidade atinga 10% da população mundial até 2030

(ASRIH; JORNAYVAZ, 2015). Esse quadro vem aumentando demasiadamente na

população, principalmente entre as crianças e os adolescentes de países

desenvolvidos e em desenvolvimento (PRENTICE, 2006). Mudanças nos hábitos

alimentares e atividades físicas reduzidas parecem estar relacionados com o quadro

epidêmico de obesidade (BASCIANO et al., 2005).

A maioria dos tecidos não adiposos apresenta uma pequena reserva lipídica,

funcionando como fonte imediata de energia e substrato para funções essenciais,

como manutenção estrutural, fluidez da membrana e sinalização intracelular

(RASOULI et al., 2007). Obesidade e síndrome metabólica ocasionam alterações

nesse acúmulo natural de lipídios, propiciando deposição lipídica em órgãos não

específicos, como fígado, músculo esquelético e cardíaco, pâncreas e rins

(MEDINA-GOMEZ et al., 2007). Essa deposição ectópica de lipídios leva à disfunção

destes tecidos por lipotoxicidade, e morte celular programada induzida por lipídios

(lipoapoptose) (UNGER, 2003). O acúmulo ectópico de lipídios pode ser relacionado

à limitação da capacidade de expansão do tecido adiposo para armazenar os

nutrientes em excesso. Tem sido sugerido que a expansibilidade do tecido adiposo é

limitada em cada indivíduo, e que, ao atingir seu máximo, desencadeia um aumento

do fluxo lipídico para órgãos não adiposos. Nestas condições, as células adiposas

secretam quimiocinas, por exemplo, MCP1 (macrophage chemotatic protein 1), que

atraem macrófagos, os quais por sua vez são ativados e secretam citocinas, que

prejudicam a sensibilidade à insulina na célula adiposa, aumentando a lipólise e

bloqueando o recrutamento de pré-adipócitos (Figura 1) (VIRTUE; VIDAL PUIG,

2010).

2

Figura 1 – Limitação na expansibilidade do tecido adiposo.

Fonte: VIRTUE e VIDAL PUIG (2010)

Em indivíduos obesos, o maior acúmulo de lipídios na região abdominal em

relação ao acúmulo subcutâneo está associado ao desenvolvimento de deposição

de lipídios em tecidos não adiposos e resistência à insulina (DESPRÉS, LEMIEUX,

2006; CALI et al., 2009). Tem sido sugerido que o acúmulo lipídico abdominal,

independentemente da adiposidade total do indivíduo, está relacionado à deposição

ectópica de lipídios, especialmente no fígado (ADAMS et al., 2007). Este fato tem

sido atribuído a um comportamento diferencial (região-específico) do adipócito

visceral frente aos hormônios lipolíticos e lipogênicos (FLIER; FOSTER, 1998). Tais

adipócitos são mais responsivos às catecolaminas e menos responsivos à insulina

que aqueles do tecido subcutâneo (LAFONTAN et al., 1979; BOLINDER et al.,

1983), aumentando rapidamente e localmente a oferta de ácidos graxos e

adipocinas na circulação portal hepática, resultando em supressão da ação da

insulina no fígado (LARA-CASTRO et al., 2008).

3

A partir da década de 1980, alterações morfológicas hepáticas relacionadas à

esteatose com etiologias diversas, excetuando-se o álcool, passaram a ser

denominadas Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) ou non-alcoholic

fatty liver disease (NAFLD) (SILVA; ESCANHOELA, 2009). Estudos relatam duas

categorias de DHGNA, a esteatose simples, a qual raramente progride para cirrose,

e a esteatohepatite, ou non-alcoholic steatohepatitis (NASH), processo que pode

levar ao desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC) (FARRELL et

al., 2006; CASTRO et al., 2012).

A esteatose simples, embora considerada benigna por muitos autores, não

está isenta de consequências estruturais, podendo progredir para cirrose em 4% dos

casos e levar à morte em 2% dos pacientes (MATTEONI et al., 1999). Cerca de 30%

dos pacientes com DHGNA têm esteatohepatite (TRAUNER et al., 2010), a qual é

caracterizada pela presença de esteatose macrovesicular, inflamação lobular,

degeneração dos hepatócitos e fibrose pericelular, tratando-se de uma doença

progressiva que leva à disfunção hepática grave, como a cirrose, em 20-25% dos

casos (VUPPALANCHI et al., 2009; TRAUNER et al., 2010) (Figura 2).

Figura 2 – Evolução da doença hepática gordurosa não alcóolica (DHGNA).

Fonte: TRAUNER et al. (2010)

Embora os mecanismos responsáveis pela esteatose hepática na DHGNA

não estejam inteiramente elucidados, a característica principal da esteatose hepática

é a acumulação de triacilglicerol no citoplasma dos hepatócitos. Isto resulta de um

4

desequilíbrio entre a aquisição de lipídios (isto é, a captação de ácidos graxos e a

lipogênese de novo) e de remoção (isto é, a oxidação de ácido graxo mitocondrial e

exportação como componente de partículas de VLDL) como resumido na Figura 3.

O consumo de uma dieta hipercalórica associado a um estilo de vida

sedentário são possíveis fatores de risco para o desenvolvimento de esteatose

hepática (CASTRO et al., 2012). A esteatose hepática está associada a diversos

estados patológicos, tais como, obesidade, diabetes tipo 2, síndrome metabólica,

desordens nutricionais, lipodistrofias, hiperhomocisteinemia, uso de terapia

antiretroviral, etc. (BROWNING et al., 2004; FARREL et al., 2006; GUILLÉN et al.,

2009), portanto, também é considerada um grande problema de saúde para a

sociedade ocidental (LARTER et al., 2009).

Figura 3 – Mecanismo do metabolismo hepatocelular e sua desregulação na doença

hepática gordurosa não alcóolica

Fonte: KAWANO e COHEN (2013)

A teoria atualmente mais aceita para explicar a gênese da DHGNA sugere

que dois eventos devem ocorrer (DAY et al., 1998): 1) mudanças no metabolismo

lipídico favorecendo depósito de triacilglicerol nos hepatócitos, ocasionado, por

5

exemplo, por resistência à insulina ou por defeito genético, e 2) produção excessiva

de espécies reativas de oxigênio pela mitocôndria e/ou pelo sistema do citocromo

P450 2E1 no fígado. O sistema citocromo P450 2E1 (CYP2E1) está relacionado à

peroxidação lipídica e dano hepático em modelos de esteatose hepática alcoólica, e

também tem sido relacionado com a progressão de DHGNA (DAY et al., 1998;

DUVNJAK et al., 2009, FISHER et al., 2009).

Vários processos medeiam o balanço lipídico intra-hepático, como captação

de lipoproteínas plasmáticas mediada por receptores, captação de AGL mediada por

proteínas transportadoras, velocidade de oxidação lipídica, velocidade de síntese de

novo, esterificação e secreção de lipídios e lipoproteínas. A disponibilidade

aumentada de ácidos graxos no fígado colabora para o desenvolvimento de

esteatose em pacientes com diabetes tipo 2. Como os ácidos graxos são

prontamente levados aos hepatócitos, a resistência à insulina aumenta

extremamente a quantidade de ácidos graxos disponíveis ao fígado (BEGRICH et

al., 2006).

1.1 Geração de TAG no tecido hepático

Os ácidos graxos sintetizados mais ativamente no fígado também contribuem

para o acúmulo de lipídios hepático (BEGRICH et al., 2006). Certamente, os níveis

aumentados de insulina e glicose estimulam a síntese do ácido graxo e triacilglicerol

com ativação da expressão de enzimas-chaves envolvidas na lipogênese,

promovendo a formação e deposição de triacilglicerol no fígado (MATSUSUE et al.,

2003). Na DHGNA, a lipogênese de novo contribui com o acúmulo de TAG no tecido

hepático (DONNELLY et al., 2005). As concentrações de glicose e insulina

plasmática são necessárias para a ativação da lipogênese. Em situação de excesso

de energia, a glicose é convertida em ácidos graxos através da conversão de glicose

em piruvato, que é translocado para o interior da mitocôndria, em seguida convertido

a acetil-CoA que se condensa com oxaloacetato para a formação de citrato, que

será transportado para o citosol (Figura 4). Estes ácidos graxos sintetizados de

novo são utilizados para sintetizar triglicerídeos, a principal fonte de armazenamento

e de transporte de energia (BROWNING; HORTON, 2004).

A glicose e a insulina promovem a lipogênese por ativação do ChREBP e a

SREBP1c, respectivamente. Estes são fatores de transcrição mestre, que por sua

vez, promovem a transcrição de genes lipogênicos tais como, ácido graxo sintase

6

(FAS), acetil CoA carboxilase (ACC), estearil CoA desaturase 1 (SCD1), lipin-1 e

piruvato quinase do fígado (L-PK) (KAWANO; COHEN, 2013). SREBP-1c é

considerada como o principal regulador da transcrição de genes relacionado a

síntese de ácido graxo e TAG em resposta à estimulação da insulina (XU et al.,

2013). A insulina estimula o SREBP-1c através de uma cascata de sinalização que

envolve a proteína serina/treonina quinase (AKT), o receptor X do fígado (LXR) e

mTOR (complexo alvo da rampamicina em mamíferos 1) (COHEN et al.,

2011). SREBP-1c é expresso a um nível baixo no fígado de animais em jejum, mas

sua expressão é dramaticamente induzida mediante a alimentação, situação em que

as concentrações de insulina encontram-se aumentadas. A insulina também regula

SREBP-1c a nível pós-traducional, através de um processamento proteolítico

permitindo o seu deslocamento para o núcleo (XU et al., 2013). Modificações pós-

traducionais de ChREBP são necessárias para a sua ativação. A fosforilação /

desfosforilação de ChREBP tem sido proposta ser importante para a translocação de

ChREBP e sua ativação nuclear (XU et al., 2013). No tecido hepático, a glicose é

convertida em xilulose-5-fosfato (Xu-5-P) a partir da derivação da hexose

monofosfato, e Xu-5-P ativa a proteína fosfatase 2A delta (PP2A delta) que irá

desfosforilar ChREBP permitindo assim sua migração para o núcleo seguido da sua

ativação (IIZUKA; HORIKAWA, 2008).

Figura 4 – Via metabólica da produção de TAG e a relação sobre a resistência à

insulina.

Fonte: BROWNING e HORTON (2004)

7

1.2 Mobilização de TAG hepático

A lipólise no tecido hepático é um mecanismo capaz de garantir a homeostasia

do metabolismo lipídico (REID et al., 2008). Mutações genéticas de enzimas

envolvidas na mobilização de TAG no tecido hepático podem levar a

esteatose. Mutações na ATGL ou no seu co-ativador, comparative gene

identification-58 (CGI-58), impedem a mobilização de ácidos graxos livres a partir de

gotículas lipídicas nos hepatócitos (ZIMMERMANN et al. 2004). Estudos tem

demonstrado que o tecido hepático possui uma baixa expressão das hidrolases LHS

e a ATGL, em relação aos demais tecidos (ZIMMERMANN et al. 2004). No entanto,

são as principais hidrolases capazes de hidrolisar o TAG hepático, direcionando os

ácidos graxos para oxidação ou secreção (REID et al., 2008; ONG et al., 2011). A

regulação dessas duas enzimas é bem distinta. A ativação da LHS ocorre por

modificação covalente, exigindo a presença de hormônios (glucagon, catecolaminas)

e sua translocação do citosol para a gota lipídica (ZIMMERMANN et al., 2004). No

estado basal, CGI-58, ativador da ATGL, esta associado à perilipina, e a partir do

estímulo pela PKA (proteína quinase dependente de cAMP), o co-ativador CGI-58 se

transloca para ATGL permitindo sua ativação (GRANNEMAN et al., 2007). A

deficiência no funcionamento dessas hidrolases pode levar a um aumento da massa

de gordura em diversos tecidos, incluindo o tecido hepático (REID et al., 2008; ONG

et al., 2011). Alguns trabalhos sugerem a possibilidade de haver um aumento na

expressão das hidrolases hepática, dentre elas a ATGL, com o intuito de proteger o

fígado do acúmulo de TAG (WANG et al., 2013; ZANG et al., 2014). Nesses

trabalhos, o estado nutricional interfere na expressão do G0/G1 switch gene (G0S2),

um inibidor da ATGL. Em jejum, G0S2 aumenta sua expressão no tecido hepático

inibindo a atividade de ATGL protegendo TAG da degradação. Além dessa questão,

a atividade das lipases no tecido hepático é necessária para o fornecimento de

ácidos graxos para β-oxidação ou para a geração de TAG e sua secreção via

molécula de VLDL (DOLINSKY et al., 2004; LO et al., 2010).

1.3 Oxidação hepática de ácidos graxos

Os peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) são receptores

hormonais nucleares ativados por ácidos graxos e por proliferadores de

peroxissomos, que desempenham um papel importante na homeostasia do

metabolismo de lipídios (KELLER et al., 1992; LEMBERGER et al., 1996). Existem

8

três isoformas do PPAR, sendo a isoforma α a mais comum no fígado

(LEMBERGER et al., 1996). O PPAR- α é um fator de transcrição que regula a β-

oxidação peroxissomal e mitocondrial através da ativação da transcrição de genes

importantes para esse processo, dentre eles acil-CoA oxidade (ACO) e a carnitina

palmitoil transferase I (CPT-I) no tecido hepático (KELLER et al., 1993;

LEMBERGER et al., 1996; LOUET et al., 2001; MINNICH et al., 2001). No estado

pós-prandial, a β-oxidação no fígado é suprimida. Isto ocorre, pelo menos em parte

devido ao efeito antilipolíticos da insulina. No entanto, estudos realizados em

pacientes com DHGNA tiveram resultados contraditórios no que diz respeito a

alterações nas taxas de oxidação de ácidos graxos (KAWANO; COHEN, 2013). A

redução na oxidação dos ácidos graxos, associada com a diminuição da expressão

ou atividade de CPT-1a, tem sido relatada em seres humanos e em roedores com

DHGNA (BONFLEUR et al., 2015). Mutações nas enzimas necessárias para a

oxidação de ácidos graxos livres nas mitocôndrias (as transferases de hidróxiacil-

CoA) também causam esteatose hepática (COHEN et al,. 2011). Outros estudos

relataram evidências de aumento nas taxas de oxidação de ácidos graxos em

DHGNA. Atualmente tem sido sugerido que o aumento na atividade mitocondrial em

consumir ácidos graxos pode promover o stress oxidativo no fígado e contribuir para

a evolução da esteatose para esteatohepatite (KAWANO; COHEN, 2013).

1.4 Secreção de VLDL

A redução na secreção de VLDL-TAG pode estar relacionada ao acúmulo de

TAG na DHGNA (KOO, 2013). No entanto, mesmo com DHGNA, pacientes podem

ter um aumento na secreção de VLDL, muito provavelmente por causa da taxa de

secreção não acompanhar a taxa de biossíntese de TAG (KOO, 2013). Muitos

estudos sugerem que esse aumento na secreção de VLDL-TAG é em decorrência

da resistência à insulina no tecido hepático (BARTELS et al., 2002; KAMAGATE et

al., 2008). A montagem e a secreção hepática de VLDL é um processo complexo

que envolve muitos genes e proteínas, incluindo ApoB (apolipoproteina B), MTP

(proteína microssomal de transferência de triacilglicerol) e a mobilização de lipídios

(SPARKS; DONG, 2009). A proteína MTP é responsável pela transferência de TAG

para ApoB, proteína estrutural do quilomicron, bem com das lipoproteínas VLDL, IDL

(lipoproteína de densidade intermediaria) e LDL (lipoproteína de densidade baixa).

No retículo endoplasmático dos hepatócitos é formada a molécula de pré-VLDL.

9

Posteriormente esse pré-VLDL é direcionado para o complexo de golgi onde será

completada sua lipidação e consequentemente a secreção de VLDL-TAG (HAAS et

al., 2013).

Alguns estudos sugerem que a insulina desempenha um papel fundamental

na regulação da secreção de VLDL. A insulina inibe a transcrição de MTP via

FOXO1 (forkhead box O1) (KAMAGATE et al.,2008). A fosforilação de FOXO1 por

AKT leva a exclusão de FOXO1 do núcleo impedindo sua ação transcricional

(BRUNET et al., 1999). A insulina também é capaz de diminuir a secreção de VLDL

regulando ApoB a nível traducional e pós traducional (HAAS et al., 2013). Por um

processo ainda não muito compreendido, a insulina estimula a degradação de ApoB

pelo sistema proteossomal e lisossomal (FISHER; GINSBERG, 2002). A sugestão é

que a insulina através de sua cascata de sinalização ative a proteína Akt que, por

sua vez, ativa mTORC1, suprimindo a tradução e a degradação de ApoB. No

entanto, a insulina pode suprimir sortilin, uma proteína envolvida no direcionamento

da ApoB para a degradação pelo lisossoma (HAAS et al.,2013). Assim, a insulina

pode promover secreção ApoB, protegendo-a da degradação via sortilin, embora

também iniba a tradução e a lipidação de ApoB. Corroborando com essa ideia,

vários trabalhos mostram que na DHGNA pode ocorrer um aumento na secreção de

VLDL. Possivelmente, uma excessiva produção de TAG, aumento da lipólise e uma

alteração na sinalização insulínica hepática podem contribuir para o aumento na

secreção de VLDL na DHGNA (KAWANO; COHEN, 2013; FABRINNI et al., 2008,

CHOI; GINSBERG, 2011). Recentemente alguns trabalhos sugerem que a insulina é

capaz de diminuir a secreção de VLDL somente de forma aguda e que a

disponibilidade de TAG nos hepatócitos é o regulador dominante para a secreção de

VLDL (SPARKS et al., 2011; MOON et al., 2012). Ao que parece, a taxa de

produção de lipídios hepáticos não é acompanhada pela oxidação dos ácidos graxos

intra ou extra- hepáticos, e pela secreção de VLDL.

1.5 Resistência à insulina e DHGNA

Alguns estudos relacionam a DHGNA com um estado de resistência à insulina

associado a obesidade resumido na Figura 4 (BROWNING, HORTON, 2004;

KAWANO, COHEN, 2013). Uma série de alterações moleculares e fisiológicas

ocorrem na configuração da resistência à insulina que resulta na acumulação de

triglicerídeos no fígado. A resistência à insulina manifesta-se por hiperinsulinemia,

10

aumento da produção de glicose hepática e diminuição da utilização de glicose pelo

tecido muscular e adiposo. Em adipócitos, a resistência à insulina aumenta a

atividade da lipase hormônio sensível (LHS), resultando em elevadas taxas de

lipólise de triglicérides e maior fluxo de AGL para o fígado. Os AGL podem ser

oxidados nas mitocôndrias para formar ATP ou esterificados para produzir

triglicerídeos de armazenagem ou incorporação em partículas de VLDL

(BROWNING; HORTON, 2004). Desta forma, apesar de diversos estudos

relacionarem a resistência à insulina no fígado, no tecido adiposo e no tecido

muscular esquelética com a porcentagem de gordura no fígado, hoje em dia, não se

sabe se a DHGNA é causa, ou é uma consequência da resistência à insulina, ou

possivelmente ambas (FABBRINI et al., 2010). A complexidade da relação entre a

esteatose hepática e resistência à insulina é reforçada pela observação de que a

esteatose não está sempre associada com a resistência à insulina. Uma dissociação

entre esteatose e a resistência à insulina foi relatada em modelos animais

selecionados geneticamente manipulados farmacologicamente e também em seres

humanos. A superexpressão de diacilglicerol aciltransferase (DGAT) hepática,

o bloqueio da secreção de VLDL hepática e o bloqueio farmacológico da β-

oxidação em ratos provocam esteatose hepática, mas não causam resistência

insulínica no tecido hepático ou no tecido muscular esquelético. Dessa mesma forma

a inibição hepática da síntese de TAG em camundongos obesos diminui a esteatose

hepática, mas não faz melhorar a sensibilidade à insulina. Além disso, a esteatose

hepática causada por deficiência genética da síntese de apoB e a diminuição da

secreção de VLDL hepática em pacientes com hipobetalipoproteinemia familiar não

é acompanhada pela resistência à insulina hepática ou periférica (FABBRINI et al.,

2010). Contudo, a maioria dos estudos demonstra uma relação direta entre a

esteatose hepática com diabetes e resistência à insulina causada por diabetes do

tipo 2.

1.6 Dieta cafeteria

O primeiro trabalho, disponível no PUBMED, a usar alimentos da dieta

humana, palatáveis, de alto valor energético na experimentação com animais,

permitindo aos ratos o livre acesso aos alimentos ocorreu por Sclafani e Springer

(1976). No entanto, Rothwell e Stock (1979) foram os primeiros a usar o termo

cafeteria para a dieta sugerida acima. Esse modelo de obesidade induzido por dieta

11

do tipo cafeteria é um modelo de obesidade simples e possivelmente o que tem

maior proximidade com a realidade dos humanos (SCLAFANI; SPRINGER, 1976). A

utilização deste modelo rápido e potente para indução de obesidade pode ser útil

para identificar novos caminhos para intervenção preventiva ou terapêutica da

obesidade humana (SAMPEY et al., 2011). A dieta de cafeteria induz um aumento

na síntese de ácidos graxos de novo no tecido adiposo branco, com acúmulo de

gordura corporal e hiperinsulinemia, sem alteração nas concentrações séricas de

ácidos graxos e glicose (CHAVES et al., 2006). No tecido hepático, a dieta cafeteria

induz um aumento de 120% na síntese de ácidos graxos de novo (CHAVES et al.,

2012), acompanhado de um aumento da glicólise e diminuição da gliconeogênese

(MARTINS-SANTOS, 2008), e aumento na atividade das lipases citosólicas

hepáticas (MOREIRA & BOTION, dados não publicados).

No presente projeto, os mecanismos bioquímicos envolvidos no

desenvolvimento da DHGNA serão analisados nos ratos alimentados com a dieta

hipercalórica e hiperlipídica, do tipo cafeteria diet.

12

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

Avaliar os mecanismos bioquímicos envolvidos na doença hepática gordurosa

não alcóolica de ratos alimentados com uma dieta cafeteria.

2.2 – Objetivos Específicos

Investigar o efeito da dieta cafeteria nos seguintes parâmetros

a) Séricos:

1. triacilglicerol, colesterol, glicose e ácido úrico.

b) Hepáticos:

1. conteúdo de lipídios totais, triacilglicerol e colesterol;

2. morfologia através de análise histologia por Hematoxilina & Eosina e Oil

Red;

3. expressão dos genes acil-CoA oxidade (ACO), apolipoproteina B (ApoB),

lipase do triacilglicerol do tecido adiposo (ATGL), proteína de ligação do elemento de

resposta aos carboidratos (ChREBP), carnitina palmitoil transferase I (CPT-1), lipase

hormônio sensível (LHS), proteína microssomal de transferência de triacilglicerol

(MTP), peroxisome proliferator-activated receptors alpha (PPAR-alfa), proteína de

ligação ao elemento regulador de esterol 1c (SREBP-1c);

4. velocidade de secreção de VLDL.

13

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais e seu Tratamento

Foram utilizados ratos machos Wistar com idade inicial de aproximadamente

30 dias de vida e peso inicial de aproximadamente 70g, proveniente do Biotério

Central da Universidade Federal de São João Del Rei – UFSJ. Os ratos foram

mantidos no Laboratório de Fisiologia do Campus Centro-Oeste Dona Lindu em

ambiente com ciclo claro-escuro de 12 horas. Ao grupo experimental foi oferecida

por 24 dias uma dieta hipercalórica do tipo cafeteria, obtida pela suplementação da

dieta balanceada comercial com diversos ingredientes palatáveis. A cada dia, quatro

ingredientes diferentes, entre doze itens previamente selecionados (Tabela I), foram

oferecidos aos animais, sendo que todos os itens apresentaram densidade calórica

superior à da dieta comercial (ROTHWELL et al., 1982). A água dos animais do

grupo experimental foi acrescida de sacarose 20%. Os ratos controles receberam a

dieta balanceada comercial (Nuvilab®) e água ad libitum.

A distribuição dos macronutrientes e a densidade calórica de cada um dos

itens alimentares oferecidos aos animais cafeteria foram obtidas da tabela de

informações nutricionais presente no rótulo dos alimentos (Tabela I). A distribuição

dos macronutrientes e a densidade calórica da ração comercial Nuvilab® foram

fornecidos pelo produtor (Tabela I).

Todos os experimentos foram realizados em ratos alimentados, pesando

aproximadamente de 230g, entre 8:00 e 10:00 da manhã ao final dos 24 dias de

tratamento.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Uso de

Animais da UFSJ – CEUA/UFSJ de acordo com o protocolo n° 016/2014.

14

Tabela I – Distribuição dos macronutrientes e densidade calórica dos

alimentos oferecidos aos animais alimentados com a dieta cafeteria

Carboidrato Lipídios Proteínas Densidade

Calórica

(g/100g) (g/100g) (g/100g) (kcal/g)

Bala de Caramelo 72,70 9,09 18,18 4,45

Bacon 00,00 58,0 9,00 5,69

Batata Frita 45,00 35,00 5,00 5,15

Bis® 63,13 23,3 8,10 4,95

Bolacha de Maisena 62,5 12,5 7,5 4,02

Castanha-do-Pará 7,00 67,00 17,00 6,99

Chocolate 50,00 33,30 10,00 5,40

Chocooky® 63,33 23,33 3,33 5,00

Pé de Moleque 58,82 26,47 11,76 5,29

Snack® 65,00 17,50 7,50 4,50

Torrada 73,33 6,67 13,33 4,00

Torrone 80,00 7,50 10,00 3,80

Ração Nuvilab® 55,00 4,50 22,00 2,85

Os ratos do grupo cafeteria receberam água ad libitum acrescida de sacarose 20%

3.2 Histologia

Os ratos foram eutanasiados por guilhotina e foram retiradas amostras com

aproximadamente 3mm de espessura da porção medial do maior lóbulo do fígado.

3.2.1 Coloração com Hematoxilina e Eosina

Os fragmentos do tecido hepático foram fixados no líquido Bouin por 24h, e

passaram pelas etapas de desidratação em série crescente de álcoois (70º, 80º, 90º

e 100º), diafanizada com xilóis e incluídos em parafina, seccionados com 5 μm de

15

espessura e corados com hematoxilina e eosina. A área dos hepatócitos (μm2) foram

obtidos utilizando microscópio de luz acoplado ao software Motic Imagens Plus 2.0.

Foram utilizados 6 ratos para cada grupo e 10 fotos foram retiradas em campos

aleatórios para cada animal. Em cada foto foram mensuradas as áreas de 10

hepatócitos, totalizando 600 células por grupo. Apenas hepatócitos que tiveram o

núcleo seccionado foram mensurados.

3.2.2 Coloração com Oil Red

A visualização e a quantificação de lipídios neutros foram realizadas através

da coloração com Oil Red O. As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e

posteriormente embebidas em Tissue-Tek® OCT e fatias com 20 μm de espessura

foram obtidas com auxílio do criostato. Foram confeccionadas 3 lâminas do tecido

hepático de cada rato de diferentes profundidades do tecido, sendo 6 ratos por

grupo. Os cortes foram lavados com paraformaldeído 10%, isopropanol 60% e

coradas durante 12mim na solução de Oil Red O (0,4% em isopropanol, seguida de

uma diluição para 0,24% em água destilada e uma filtração). As lâminas foram

lavadas mais duas vezes, uma em isopropanol 60% e a outra em água destilada.

Por último, as lâminas foram mergulhadas na hematoxilina de Mayer e novamente

lavadas em água destilada. A quantificação do acúmulo de lipídios foi realizada

através da mensuração da intensidade das áreas em vermelho através do software

Image J (MEHLEM et al., 2013).

3.3 Determinação do conteúdo lipídico do fígado

A extração dos lipídios foi realizada pelo método de FOLCH et al. (1957). O

fígado (1g) foi homogeneizado em 20 mL de clorofórmio:metanol (2:1). Em seguida,

o material foi filtrado utilizando papel Whatman nº1 e ao filtrado foi adicionado água

deionizada. Após separação da fase clorofórmica e aquosa, uma alíquota da fase

clorofórmica foi transferida para tubos previamente pesados para evaporação à

50ºC. A quantidade da gordura foi obtida pelo método gravimétrico. Os lipídios de

cada tubo foram solubilizados com 1mL de álcool isopropílico e as concentrações de

triacilglicerol e colesterol foram determinados utilizando kits comerciais (Bioclin®,

Belo Horizonte, MG).

16

3.4 Avaliação da secreção de VLDL-TAG pelo fígado

Para avaliar a secreção de VLDL-TAG, os animais foram deixados em jejum

por 12 horas e após esse período, a concentração plasmática de TAG foi

determinada antes e 2 horas após administração por via intravenosa (veia jugular

sob anestesia) de uma solução a 20% (v/v) de tyloxapol (Triton WR – 1339, Sigma-

Aldrich, USA) em salina na dose de 400 mg/kg de peso. A velocidade de secreção

de VLDL-TAG foi estimada pela diferença entre as concentrações plasmática de

TAG antes e após administração de tyloxapol, um inibidor da ação da lipase

lipoprotéica (BORENSZTAJN et al., 1976). As concentrações de TAG foram

determinadas por kit enzimático (Bioclin®, Belo Horizonte, MG).

3.5 Reação em cadeia da polimerase – transcrição reversa em tempo real (Real

Time-PCR)

Para determinação da expressão gênica das proteínas envolvidas no

metabolismo de lipídios, foi feita a extração de RNA e análise por RT-PCR em

Tempo Real. RNA total foi extraído de aproximadamente 50 mg de tecido congelado

em nitrogênio líquido com o reagente Trizol (Gibco-Life Technology). A integridade

do RNA foi confirmada por eletroforese em gel de agarose a 1,2% com tampão Tris-

borato 89 mM, EDTA 2 mM, e revelado com brometo de etídio (Imagem 1).

Imagem 1 – Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

28S rRNA18S rRNA

Nota: O RNA total do tecido hepático dos ratos controles estão apresentados nas

canaletas ímpares e dos ratos alimentados com a dieta cafeteria nas canaletas

pares.

A pureza e quantificação foram determinadas em espectrofotômetro

NanoVue™ Plus Spectrophotometers, (GE Healthcare, Little Chalfont,

Buckinghamshire UK). Para verificação de contaminação com DNA genômico, foi

realizado PCR simples com 1 μg de RNA total, o que não resultou em nenhum

17

produto de PCR. O cDNA foi obtido a partir de 2 μg de RNA total por transcrição

reversa usando kit da Applied biosystems (High-Capacity cDNA reverse transcription

kit) com amplímetros aleatórios (10X RT Random Primers), dNTPs 100 mM e a

transcriptase reversa (MultiScribeTM Reverse Transcriptase) em volume final de 20

μl, sendo a incubação realizada a 25°C por 10 min., seguidos de 120 min. a 37°C e 5

min. a 85ºC, conforme descrito pelo fabricante. As expressões gênicas no tecido

hepático foram determinadas por Real time PCR, sendo utilizados SYBR Green PCR

Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), sistema de detecção 7500 Fast

Real time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) e pares específicos de

primers (senso e antisenso) mostrados a baixo (Tabela II). A quantificação foi feita

pela medida do ciclo threshold normalizado pelo controle interno β-actina e expressa

em relação aos ratos controles.

Tabela II – Primers para PCR em tempo real.

GENE PRIMER

Beta actina Senso 5’-CATGAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’

Antisenso 5’-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’

ACO Senso 5’-GGCCGCTATGATGGAAATGTG-3’

Antisenso 5’-GGGCTTCAAGTGCTTGTGGTAA-3’

Apo B 100 Senso 5’-CATGCTCCATTCTCACATGTTTA-3’

Antisenso 5’-AGAGAACAAAGCAGAGATTGTGG-3’

ATGL Senso 5’- CTGTGGCCTCATTCCTCCTACC-3’

Antisenso 5’- GTGGCAAGTTGTCTGAAATGCCG-3’

ChREBP Senso 5’-AAAGGCCTCAAGTTGCTATG-3’

Antisenso 5’-AGACAACAGCCTCAGGTTTC-3’

CPT 1 Senso 5’-ACGTGAGTGACTGGTGGGAAGAAT-3’

Antisenso 5’-TCTCCATGGCGTAGTAGTTGCTGT-3’

LHS Senso 5’-CAGGAGTGCTCTTCTTTGAG-3’

Antisenso 5’-CAGCCTTTATGTAGCGTGAC-3’

MTP Senso 5’-AACCAGAAATGTCAATGGCTAGA-3’

Antisenso 5’-AGTGATTTGATGTCCAAAATGCT-3´

PPAR alfa Senso 5’-TACCACTATGGAGTCCACGCATGT-3’

Antisenso 5’-TTGCAGCTTCGATCACACTTGTCG-3’

SREBP 1c Senso 5’-GCCCACAATGCCATTGAGA-3’

Antisenso 5’-GCAGATTTATTCAGCTTTGCCTCA-3’

18

3.6 Determinação dos níveis séricos de glicose, triacilglicerol, colesterol, ácido

úrico, AST e ALT.

As concentrações de glicose, triacilglicerol, colesterol, ácido úrico, AST e ALT

séricos foram determinados utilizando kits comerciais (Bioclin®, Belo Horizonte, MG).

3.7 Análise estatística

Para os dados paramétricos, os resultados foram expressos em média ± erro

padrão e as diferenças entre grupos foram analisadas utilizando o test t de Student.

Para os dados não-paramétricos, os resultados foram expressos em percentis e as

diferenças entre os grupos analisados utilizando o teste Mann-Whitney Rank Sum.

Em todos os casos foi adotado P < 0,05 para nível de significância.

19

0 5 10 15 20 25

0

30

60

90

120

150

180

210

240

Pe

so (

g)

Tempo (dias)

Controle Cafeteria

4. RESULTADOS

4.1 Parâmetros Gerais

4.1.1 Ganho de peso corporal dos ratos

O peso corporal dos ratos foi avaliado a cada dois dias (Gráfico 1). O ganho

de peso dos ratos alimentados com a dieta cafeteria foi similar ao dos ratos controle

durante todo o período experimental.

Gráfico 1 – Efeito da dieta cafeteria no peso corporal (g) de ratos Wistar. Os valores

representam a média ± erro padrão de 8 animais. Este experimento foi repetido 3

vezes.

20

4.1.2 Peso dos tecidos

Os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram um aumento de

aproximadamente 68% e 225% no peso do TAB epididimal e retroperitoneal,

respectivamente. A dieta cafeteria não afetou o peso do fígado e coração (Tabela III

e Gráfico 2).

Tabela III – Peso relativo dos tecidos adiposos brancos (TAB) epididimal e

retroperitoneal, fígado e coração de ratos alimentados com as dietas controle e

cafeteria.

Controle Cafeteria

TAB epididimal (g/100g) 0,60 ± 0,04 (8) 1,01 ± 0,09* (8)

TAB retroperitoneal (g/100g) 0,27 ± 0,03 (8) 0,88 ± 0,10* (7)

Fígado (g/100g) 4,75 ± 0,12 (8) 4,50 ± 0,08 (8)

Coração (g/100g) 0,47 ± 0,01 (8) 0,46 ± 0,01 (8)

Os valores representam a média ± erro padrão. O valor entre parênteses representa

o número de ratos utilizados. *P < 0,05 vs. controle.

21

0,0

0,5

1,0

5

6

0,0

0,5

1,0

5

6

**

Coração FígadoRim DRim ERetroEpi

Peso

(g

/10

0g

)

Controle Cafeteria

**

Coração FígadoRetroEpi

Peso (

g/1

00g)

Controle Cafeteria

Gráfico 2 – Efeito da dieta cafeteria no peso dos tecidos adiposos branco epididimal

(Epi) e retroperitoneal (Retro), coração e fígado (g/100g) de ratos Wistar. As colunas

e barras representam a média ± erro padrão de 7-8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

22

4.1.3 Parâmetros séricos

A dieta cafeteria não alterou as concentrações séricas de glicose, ácido úrico

e colesterol, mas induziu um aumento significativo (171%) na concentração sérica

de triacilglicerol (Tabela IV e Gráfico 3).

Tabela IV – Concentração sérica de glicose, triacilglicerol, colesterol total e ácido

úrico de ratos alimentados com as dietas controle e cafeteria.

Controle Cafeteria

Glicose (mg/dL) 116 ± 5 (8) 113 ± 8 (8)

Triacilglicerol (mg/dL) 42 ± 4 (8) 114 ± 10* (7)

Colesterol (mg/dL) 68 ± 10 (8) 81 ± 14 (7)

Ácido Úrico (mg/dL) 1,74 ± 0,06 (8) 1,76 ± 0,08 (8)



23

0,0

0,5

1,0

1,5

40

60

80

100

120

Ácido úricoColesterolTriacilglicerolGlicose

*

Concentr

ações s

éricas (

mg/d

L)

Controle Cafeteria

Gráfico 3 – Efeito da dieta cafeteria nas concentrações séricas de glicose,

triacilglicerol, colesterol e ácido úrico de ratos Wistar. As colunas e barras

representam a média ± erro padrão de 7-8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

24

4.2 Parâmetros hepáticos

4.2.1 Histologia

A análise histológica do tecido hepático revelou que o grupo alimentado com

a dieta cafeteria apresentou um aumento na mediana de aproximadamente 36% na

área dos hepatócitos em relação ao grupo alimentado com a dieta controle (Tabela

V, Gráfico 4). O citoplasma dos hepatócitos dos ratos do grupo cafeteria apresentou

um aspecto vacuolar com o núcleo centralizado, sugerindo um acúmulo lipídico

microvesicular (Prancha 1).

A técnica de coloração com Oil Red O (ORO) permitiu verificar que os ratos

alimentados com a dieta cafeteria apresentaram um aumento na concentração de

lipídios neutros no tecido hepático na mediana de aproximadamente 260 vezes em

relação aos ratos alimentados com dieta controle (Tabela VI; Gráfico 5; Prancha 1).

Tabela V – Área dos hepatócitos (µm2) de ratos alimentados com as dietas controle

e cafeteria.

Controle Cafeteria

Mínimo 5,6 9,7

Percentil 25 12,3 17,6

Percentil 50 14,7 20,1*

Percentil 75 17,4 24,1

Máximo 35,8 44,7

Os valores representam a distribuição em percentis (P) da área de 600 hepatócitos.

*P<0,05 vs. controle.

25

0

10

20

30

40

50

60

CafeteriaControle

Áre

a d

os h

ep

ató

cito

s (m

2)

Gráfico 4 - Efeito da dieta cafeteria na área dos hepatócitos. As colunas

representam os percentis 25, 50 e 75 e as barras representam os valores mínimos e

máximos de 600 hepatócitos. O símbolo representa a média.

26

Tabela VI – Lipídios neutros (unidades arbitrárias) no tecido hepático de ratos

alimentados com as dietas controle e cafeteria.

Controle Cafeteria

Mínimo 0,049 0,023

Percentil 25 0,108 0,209

Percentil 50 0,190 49,156*

Percentil 75 0,427 95,270

Máximo 0,906 239,425

Os valores representam a distribuição em percentis dos lipídios neutros de 18

lâminas do tecido hepático provenientes de 6 ratos. *P<0,05 vs. controle.

27

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

50

100

150

200

250

300

CafeteriaControle

Lip

ídio

s n

eu

tro

s (

un

ida

des a

rbitrá

ria

s)

Gráfico 5 - Efeito da dieta cafeteria na concentração de lipídios neutros no tecido

hepático. As colunas representam os percentis 25, 50 e 75 e as barras representam

os valores mínimos e máximos de 18 lâminas proveniente de 6 ratos. O símbolo

representa a média.

28

Prancha 1 - Efeito da dieta cafeteria no parênquima do tecido hepático. A coloração

com hematoxilina e eosina do tecido hepático dos ratos alimentados com a dieta

controle (A, C) e cafeteria (B, D) estão apresentadas no aumento de 10x (A, B) e

40x (C, D). A coloração com Oil Red O do tecido hepático dos ratos alimentados

com a dieta controle (E) e cafeteria (F) está apresentada no aumento de 10x. As

barras representam 100 µm (A,B,E,F) e 25 µm (C,D).

29

4.2.2 Concentração de lipídios hepáticos


aproximadamente 25% na concentração hepática de lipídios totais, caracterizando

um quadro de esteatose (Gráfico 6). No grupo controle as concentrações de

triacilglicerol e colesterol hepático representaram, aproximadamente, 10% e 4% da

concentração de lipídios totais. A dieta cafeteria induziu um aumento de

aproximadamente 120% e 30% na concentração hepática de triacilglicerol e

colesterol, respectivamente (Tabela VII; Gráfico 7).

Tabela VII - Concentração hepática de lipídios totais, triacilglicerol e colesterol total

de ratos alimentados com as dietas controle e cafeteria.

Controle Cafeteria

Lipídios totais (mg/g) 44,00 ± 1,30 (8) 55,00 ± 3,50* (8)

Triacilglicerol (mg/g) 4,50 ± 0,27 (8) 9,90 ± 0,94* (7)

Colesterol (mg/g) 1,90 ± 0,04 (8) 2,45 ± 0,20* (8)



30

0

20

40

60

*

Lip

ídio

s h

epáticos t

ota

is (

mg/g

)

Controle Cafeteria

Gráfico 6 – Efeito da dieta cafeteria na concentração hepática dos lipídios totais de

ratos Wistar. As colunas e barras representam a média ± erro padrão de 8 ratos. *P

< 0,05 vs. controle.

31

0

2

4

6

8

10

12 Controle Cafeteria

*

*

ColesterolTriacilglicerol

Lip

ídio

s h

ep

áticos (

mg

/g)

Gráfico 7 – Efeito da dieta cafeteria na concentração hepática de triacilglicerol e

colesterol de ratos Wistar. As colunas e barras representam a média ± erro padrão

de 8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

32

4.2.3 Prova de função hepática

A função hepática foi determinada através da análise sérica das enzimas

aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT). Como já

evidenciado, os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram um percentual

lípidico maior do que o grupo alimentado com a dieta controle. Contudo, esse

acúmulo de lipídios foi insuficiente para causar alterações séricas das enzimas

analisadas, não evidenciando um quadro de lesão hepática (esteatohepatite)

(Tabela VIII; Gráfico 8).

Tabela VIII. Concentrações séricas de aspartato aminotransferase (AST) e alanina

aminotransferase (ALT) nos ratos alimentados com a dieta controle e cafeteria.

Controle Cafeteria

AST (U/L) 179,90 ± 12,23 (8) 194,10 ± 13,89 (8)

ALT (U/L) 286,50 ± 53,81 (7) 205,40 ± 22,05 (7)



33

0

100

200

300

Controle Cafeteria

AST ALT

Teste

de f

unção h

epática (

U/L

)

Gráfico 12 – Efeito da dieta cafeteria na concentração sérica de aspartato

aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) em ratos Wistar. As

colunas e barras representam a média ± erro padrão de 8 ratos. *P < 0,05 vs.

controle.

34

4.2.4 Expressão gênica no fígado

4.2.4.1 Expressão gênica de fatores de transcrição relacionados com a

regulação da expressão gênica de enzimas envolvidas no metabolismo de

lipídios

Como observado no Gráfico 9 e na Tabela IX a dieta cafeteria não foi capaz

de alterar a expressão do RNAm dos fatores de transcrição ChREBP e SREBP1c no

tecido hepático, quando comparado aos controle.

Tabela IX – Expressão de genes envolvidos no metabolismo de lipídios no tecido

hepático de ratos alimentados com as dietas controle e cafeteria. Valores arbitrários

de RNAm.

Gene Controle Cafeteria

ACO 1,02 ± 0,09 0,89 ± 0,06

ApoB 1,01 ± 0,06 0,74 ± 0,06*

ATGL 1,02 ± 0,09 1,24 ± 0,09

ChREBP 1,02 ± 0,07 0,86 ± 0,08

CPT1 1,01 ± 0,07 2,32 ± 0,33*

LHS 1,01 ± 0,07 0,83 ± 0,10

MTP 1,03 ± 0,10 1,34 ± 0,10*

PPAR-alfa 1,03 ± 0,10 1,36 ± 0,19

SREBP-1c 1,00 ± 0,16 1,09 ± 0,12

Todos os valores foram normalizados pela expressão do gene da β-actina e estão

expressos em unidades arbitrárias. Os valores representam a média ± erro padrão

de 8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

35

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

SREBP-1cChREBP

Ge

ne

s/

-actin

a (

un

idad

es a

rbitrá

ria

s)

Controle Cafeteria

Gráfico 9 - Efeito da dieta cafeteria na expressão do RNAm da proteína de ligação

ao elemento de resposta ao carboidrato (ChREBP) e da proteína de ligação ao

elemento regulatório de esterol 1c (SREBP-1c) no tecido hepático. As colunas e

barras representam a média ± erro padrão de 8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

36

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

*

Genes/

-actina (

Unid

ades a

rbitrá

rias)

PPAR-alfaCPT1ACO

Controle Cafeteria

4.2.4.2 Expressão dos genes relacionados com a oxidação lipídica

Em relação aos genes envolvidos na oxidação lipídica, não houve alterações

no RNAm da ACO e PPAR-α no tecido hepático dos ratos alimentados com a dieta

cafeteria quando comparado ao controle. Contudo, apesar da expressão de RNAm

do PPAR-α não estar alterada, a expressão de CPT1, seu gene alvo, está

aumentada em aproximadamente 122% no tecido hepático de ratos alimentados

com a dieta cafeteria quando comparado ao controle, sem alterar a expressão de

ACO, outro gene alvo do PPAR-α (Gráfico 10, Tabela IX).

Gráfico 10 - Efeito da dieta cafeteria na expressão de RNAm da acil CoA oxidase

(ACO), carnitina palmitoiltransferase 1 (CPT1) e peroxisome proliferator-activated

receptors alpha (PPAR-α) no tecido hepático. As colunas e barras representam a

média ± erro padrão de 8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

37

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

LHSATGL

Ge

ne

s/

-actin

a (

un

idad

es a

rbitrá

ria

s)

Controle Cafeteria

4.2.4.3 Expressão dos genes relacionados com a mobilização de lipídios no

fígado

O Gráfico 11 e a Tabela IX mostram que tanto os ratos alimentados com a

dieta cafeteria quanto a dieta controle não apresentaram alterações na expressão do

RNAm da ATGL e LHS, duas enzimas responsáveis pela hidrólise do triacilglicerol,

no tecido hepático quando comparado ao controle.

Gráfico 11 - Efeito da dieta cafeteria na expressão do RNAm da lipase do

triacilglicerol do adipócito (ATGL) e lipase hormônio sensível (LHS) no tecido

hepático. As colunas e barras representam a média ± erro padrão de 8 ratos. *P <

0,05 vs. controle.

38

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

MTPApoB

*

*

Genes/

-actina (

unid

ades a

rbitrá

rias)

Controle Cafeteria

4.2.4.4 Expressão dos genes relacionados com a secreção de VLDL

Os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram uma redução de

aproximadamente 36% na expressão de ApoB no tecido hepático quando

comparado ao controle. Para o RNAm da MTP, proteína responsável pela lipidação

de ApoB, houve um aumento de 31% no tecido hepático dos ratos alimentados com

a dieta cafeteria quando comparados com os ratos da dieta controle (Gráfico 12,

Tabela IX).

Gráfico 12 - Efeito da dieta cafeteria na expressão de RNAm da apolipoproteína B

(ApoB) e proteína de transferência microssomal de triacilglicerol (MTP) no tecido

hepático. As colunas e barras representam a média ± erro padrão de 8 ratos. *P <

0,05 vs. controle.

39

4.2.5 Velocidade de secreção de VLDL-TAG

A secreção hepática de VLDL-TAG foi verificada pela determinação da

concentração sérica de TAG após administração de tyloxapol (Triton WR – 1339). A

secreção de VLDL-TAG nos ratos alimentados com a dieta cafeteria foi 22% maior

quando comparado com os animais alimentados com a dieta controle (Tabela X,

Gráfico 13).

Tabela X – Velocidade de secreção de VLDL-TAG hepática de ratos alimentados

com as dietas controles e cafeteria.

Controle Cafeteria

VLDL-TAG (mg.dL-1.h-1) 278,8 ± 21,72 (8) 360,1 ±14,8 (7)*



40

0

70

140

210

280

350

420

Controle Cafeteria

*

Se

cre

çã

o d

e V

LD

L-T

AG

(m

g.d

L-1.h

-1)

Gráfico 13 – Efeito da dieta cafeteria na velocidade de secreção de VLDL-TAG

(mg.dL-1.h-1) pelo tecido hepático. As colunas e barras representam a média ± erro

padrão de 7-8 ratos. *P < 0,05 vs. controle.

41

5. DISCUSSÃO

O presente estudo avaliou os efeitos da dieta cafeteria no metabolismo lipídico

sérico e hepático de ratos Wistar machos após 24 dias de tratamento. Parâmetros

metabólicos decorrentes dessa dieta hipercalórica foram analisados, sendo

demostrantrado alterações na adiposidade, nos lipídios séricos e hepáticos, na

expressão dos genes CPT-1, MTP e ApoB 100 e na secreção de VLDL.

De fato, como observado por outros autores, a oferta de ração comercial

suplementada com itens de alta densidade calórica e sacarose na água de beber

(dieta cafeteria) a ratos recém-desmamados durante 24 dias promove alteração na

composição corporal sem afetar o peso corporal final (CHAVES et al., 2006). No

presente estudo, os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram um

aumento no peso dos tecidos adiposos epididimal e retroperitoneal de 68% e 225%,

respectivamente, em comparação ao grupo alimentado com a dieta controle,

estando de acordo outros estudos. A oferta de uma dieta hipercalórica na forma de

pellet durante 12 semanas a camundongos com idade inicial de 10 semanas não

altera o peso corporal final apesar de induzir um aumento no peso do tecido adiposo

retroperitoneal (126%) e epididimal (56%) (HIGA et al., 2014). Os ratos alimentados

com a dieta cafeteria apresentam um quadro de hiperinsulinemia, um aumento na

síntese de ácidos graxos de novo e um aumento (24%) na atividade da LPL no

tecido adiposo (CHAVES et al., 2006). O aumento da insulina plasmática pós-

prandial é um importante estimulador da lipogênese de novo e a atividade da LPL no

tecido adiposo. A LPL é uma lipase encontrada no endotélio do tecido adiposo,

capaz de hidrolisar o TAG circulante, permitindo a captação dos ácidos graxos pelos

adipócitos, que por sua vez serão reesterificados a TAG formando as gotas lipídicas

(PICARD et al., 1999). O outro fator observado nos ratos alimentados com a dieta

cafeteria é um aumento na geração de G3P através da via glicolítica, uma vez que

esses animais apresentam um aumento de 50% na captação na glicose sérica por

esses tecidos em comparação aos ratos alimentados com a dieta controle (CHAVES

et al., 2006). Desta forma, possivelmente, o acúmulo de lipídios nos tecido adiposo

retroperitoneal e epididimal nos ratos alimentados com a dieta cafeteria seja devido

a uma maior biossíntese de ácidos graxos e uma maior captação de ácidos graxos

das lipoproteínas circulantes pela LPL, ambos estimulados pela insulina.

42

Apesar da dieta cafeteria apresentar um acréscimo de 20% de sacarose na

água de beber, os ratos alimentados com essa dieta apresentaram um quadro de

normoglicemia. Este dado esta de acordo com nosso estudo prévio (CHAVES et al.,

2006). Os ratos alimentados com a dieta cafeteria além da maior captação de

glicose plasmática pelo tecido adiposo branco e marrom (CHAVES et al., 2006;

CHAVES et al., 2008), apresentam um aumento no fluxo glicolítico acompanhado de

uma redução na gliconeogênese, avaliada pela incorporação de piruvato em glicose

e pela atividade da PEPCK, em fatias de fígado (MARTINS-SANTOS, 2008). Todos

esses dados indicam que a normoglicemia pode ser devido ao fato da sensibilidade

tecidual à insulina estar preservada nos ratos alimentados com a dieta cafeteria.

A frutose contida nos alimentos e na água de beber (20% de sacarose) dos

ratos alimentados com a dieta cafeteria não alterou o ácido úrico sérico, apesar de

alguns estudos sugerirem que o consumo de frutose aumenta os níveis séricos e

citológicos de ácido úrico devido a maior fosforilação da frutose e consequentemente

maior formação de AMP, um subproduto para síntese de ácido úrico

(PERHEENTUPA et al., 1967; van dem BERGHE et al., 1977). No entanto, outros

estudos contradizem o papel da frutose dietética impactando na concentração de

ácido úrico. Um estudo realizado com 366 homens de 20 a 60 anos divididos em 4

grupos submetidos a dietas com diferentes fontes de açúcar no leite (grupo I- 9%

das calorias proveniente da frutose, grupo II- 18% de xarope de milho, grupo III- 18%

de sacarose e grupo IV- 9% de glicose), não apresentaram diferenças na

concentração de ácido úrico depois de 10 semanas de dieta (ANGELOPOULOS et

al., 2015). Em outro estudo, ratos Sprague-Dawley machos inicialmente com 6

semanas de vida alimentados com ração comercial e água acrescida com 10% de

frutose durante 3 meses, não apresentam aumento no ácido úrico sérico em

comparação aos ratos controle (CITIL et al., 2014). Estudos mostram que doses

elevadas de frutose na dieta contribuem para um aumento de ácido úrico na urina,

contudo, não se sabe ao certo a relação entre a frutose dietética e a concentração

de ácido úrico sérico (MOORE et al., 2014). No entanto, um trabalho de meta-

análise com 425 indivíduos diabéticos e não diabéticos mostrou que a substituição

isocalórica de amido, glicose ou sacarose por frutose, não induziu alteração no ácido

úrico sérico em ambos os indivíduos. Em contrapartida, em condições de dieta

hipercalórica, a dieta controle acrescida com excesso de energia (>30% de energia

em excesso ou >200g/dia de frutose) a partir da frutose, aumenta de forma

43

significante a concentração sérica de ácido úrico em comparação a dieta controle

nos indivíduos não diabéticos (WANG et al., 2012). A medida que a frutose fornece

substrato para a lipogênese de novo, ela fornece substrato também para a produção

de ácido úrico. (MOORE et al., 2014). Desta forma, a frutose da dieta cafeteria está

fornecendo substrato para a produção de TAG sem causar alterações nos níveis

plasmáticos do ácido úrico.

No presente estudo, a dieta cafeteria não induziu alteração no colesterol total

sérico em comparação ao grupo que recebeu a dieta controle. Ratos Wistar machos,

com idade inicial de 10 semanas, alimentados com ração comercial suplementada

com patê de fígado de galinha, bolacha, batata chips, leite achocolatado e bacon

durante 56 dias, caracterizando uma dieta cafeteria, não apresentam diferença no

colesterol total sérico quando comparado ao grupo alimentado com a ração

comercial (ANDRADE et al., 2013). No entanto, alguns trabalhos mostram que ratos

Wistar com idade inicial de 4 a 6 semanas alimentados com uma dieta do tipo

cafeteria por 6 semanas apresentam um aumento no colesterol total sérico de

aproximadamente 25% em comparação ao grupo alimentado com a dieta controle

(KUMAR et al., 2011; SHIVAPRASAD et al., 2014). Essa diferença nos resultados

pode estar relacionado ao tipo e ao tempo de tratamento, pois, apesar de todos

esses artigos estudarem os efeitos da dieta cafeteria, a composição, a ingestão

calórica e a contribuição dos grupos alimentares para esse perfil energético é

diferente da dieta cafeteria do presente estudo, além do tempo de experimentação

também ser diferente. Por outro lado, o consumo de uma dieta com elevados teores

de colesterol não resulta obrigatoriamente em elevados níveis de colesterol sérico,

devido a diversos mecanismos adaptativos como o aumento da degradação ou

transformação desse colesterol dietético em sais biliais (BOONE et al., 2011). Outro

ponto importante para a não co-existência da relação citada acima é a premissa de

que diversos tipos de animais apresentam sensibilidade ou resistência ao colesterol

dietético (BOONE et al., 2011). Coelho, hamster e camundongos C57BL/6 não são

resistentes ao colesterol dietético, podendo apresentar alterações séricas quando

submetidos a uma dieta rica em colesterol, por outro lado, ratos Sprague-Dawley,

Wistar ou Fischer apresentam pequena ou nenhuma alteração plasmática no

colesterol total se submetidos a dietas rica em colesterol, devido ao efeito protetor

que HMG-CoA redutase hepática garante (NESS; GERTZ, 2004).

44

Em nosso estudo, a dieta cafeteria induziu um aumento de aproximadamente

170% na concentração sérica de TAG em relação ao grupo controle. Considerando

que a dieta cafeteria aumentou (24%) a atividade da LPL no tecido adiposo

retroperitoneal (CHAVES et al., 2006) e a secreção de VLDL-TAG na mesma

proporção, talvez o alto conteúdo de triacilglicerol sérico nos ratos alimentados com

a dieta cafeteria seja decorrente do maior consumo de lipídios dietéticos e uma

menor excreção desses lipídios nas fezes. Ratas Wistar, inicialmente com 45 dias de

vida, submetidas à dieta cafeteria, por 42 dias, contendo itens de alta densidade

calórica (leite condensado, pão, chocolate, coco seco, biscoito, queijo, batatas)

durante 6 semanas apresentam um aumento de 322% na concentração de

triacilglicerol sérico em relação ao grupo alimentado com a dieta controle

(SHIVAPRASAD et al., 2014). Ainda nesse estudo, analisando as fezes desses

animais durante 24h, as ratas alimentadas com a dieta cafeteria apresentam uma

redução drástica de TAG em suas fezes em comparação as ratas alimentadas com a

dieta controle. Desta forma, é possível que a dieta cafeteria tenha aumentado a

absorção de gordura intestinal.

A dieta cafeteria induziu um aumento de 25% no conteúdo de lipídios totais no

tecido hepático avaliado pelo método gravimétrico. Desses lipídios hepáticos, a dieta

cafeteria induziu um aumento de 120% e 30% na concentração de TAG e colesterol

respectivamente, em comparação aos ratos da dieta controle, que apresentaram um

percentual de 10% na concentração de TAG e 4% na concentração de colesterol

dos lipídios totais. Corroborando tais resultados, a coloração com óleo vermelho

(ORO), que é capaz de estimar o teor e a distribuição tecidual de lipídios neutros

(MEHLEN et al., 2013), detectou um aumento na mediana de 260 vezes no teor de

lipídios neutros nos ratos alimentados com a dieta cafeteria em comparação aos

ratos alimentados com a dieta controle. O menor limiar sugerido para esteatose tem

sido 5% de hepatócitos contendo gotas lipídicas (PASCHOS; PALETAS, 2009),

determinado após coloração com hematoxilina-eosina (KLEINER et al., 2005;

HÜBSCHER, 2006). Em humanos através de ressonância magnética nuclear o limiar

de 5% de conteúdo lipídico intra-hepático também tem sido usado como parâmetro

para a classificação da DHGNA (PERSEGHIN et al., 2006). Desta forma, os ratos

alimentados com a dieta cafeteria apresentaram um quadro de DHGNA. Através da

coloração com hematoxilina e eosina, foi possível visualizar que os ratos

alimentados com a dieta cafeteria apresentaram esteatose simples microvesicular,

45

vacuolização e um inchaço nos hepatócitos provavelmente causado pela presença

de TAG em comparação aos ratos alimentados com a dieta controle. Nos ratos

alimentados com a dieta cafeteria apesar de caracterizado um perfil de esteatose

hepática, esse acúmulo de lipídios provavelmente não foi suficiente para causar uma

lesão hepática, pois esse grupo não apresentou diferença na concentração sérica

para as enzimas AST e ALT. Ratos Sprague Dawley com idade inicial de 5-6

semanas, quando submetidos a uma alimentação contento 10% de frutose na água

de beber por 28 dias, apresentam um quadro de esteatose hepática microvesicular

sem apresentar alterações nas enzimas séricas AST e ALT (LI et al., 2015). Os

valores séricos de AST e ALT tem sido usado como um marcador indireto de lesão

hepática (KARMEN et al., 1954), contudo, muitas vezes, os valores dessas enzimas

não correlacionam com a gravidade das lesões (MOFRAD et al., 2002).

A dieta cafeteria induziu um aumento de aproximadamente 30% no colesterol

hepático comparado à dieta controle. O fígado de ratos Sprague Dawley perfundidos

com uma solução contendo somente albumina ou com diferentes ácidos graxos

(palmítico, oleico e linoleico) ligados à albumina apresentam um aumento na

atividade da enzima HMG-CoA redutase, enzima chave para a biossíntese de

colesterol (GOH; HEIMBERG, 1976). A dieta cafeteria induziu um aumento de 30%

na atividade das hidrolases de TAG citosólicas no tecido hepático (MOREIRA;

BOTION, dados não publicados). Desta forma, a ação das hidrolases de TAG pode

estar fornecendo os ácidos graxos necessários para ativação da HMG-CoA redutase

e consequentemente contribuindo para o aumento do colesterol hepático nos ratos

alimentados com a dieta cafeteria em comparação aos ratos alimentados com a

dieta controle.

Estes animais também apresentaram um aumento de 120% na concentração

de TAG no tecido hepático em comparação aos animais alimentados com a dieta

controle. O acúmulo de lipídios intracelulares na DHGNA é resultado de um

desequilíbrio entre: 1) lipogênese de novo, 2) lipólise hepática, 3) oxidação lipídica,

4) a captação de ácidos graxos hepáticos, e 5) exportação de TAG via partículas de

VLDL (REID et al., 2008, NESS; KASER, 2016). Cada um destes processos serão

discutidos separadamente nos itens abaixo.

46

5.1 Lipogênese hepática

A dieta cafeteria induz um aumento (120%) na síntese de ácidos graxos de

novo no tecido hepático (CHAVES et al., 2012). No presente trabalho, a dieta

cafeteria não induziu alterações na expressão hepática do gene dos fatores de

transcrição SREBP-1c e ChREBP. Entretanto, vários trabalhos têm sugerido que a

insulina induz um aumento na expressão de SREBP-1c (SHIMOMURA et al. 1999,

HORTON et al., 1998, LETEXIER et al., 2005). Ratos Sprague–Dawley diabéticos

por estreptozotocina apresentam uma redução de 80% na expressão do RNAm de

SREBP-1c em comparação ao controle, enquanto a administração de insulina aos

ratos diabéticos restaura quase completamente a expressão do RNAm deste fator

de transcrição no tecido hepático (SHIMOMURA et al., 1999). Em camundongos, o

jejum (1, 3, 6, 9, 12 e 24h) induz uma redução de 60% na expressão hepática do

SREBP-1c quando comparado ao grupo não jejuado alimentado com uma dieta

balanceada (HORTON et al., 1998). O jejum de 48 horas também induz uma

redução na concentração plasmática de insulina e na expressão SREBP-1c no

tecido hepático de ratos Wistar previamente alimentados com uma dieta rica em

carboidratos (70%) ou rica em lipídios saturados (60%) (LETEXIER et al., 2005). A

realimentação com uma dieta hiperglicídica e hipolipídica, por 12 horas, aos

camundongos previamente jejuados por 24 horas, induz um aumento de

aproximadamente 4 vezes na expressão de SREBP-1c no tecido hepático

(HORTON et al., 1998). Mais recentemente foi demonstrado em hepatócitos isolados

que a adição de 10 nM de insulina no meio de incubação por 6 horas aumenta

acentuadamente (25 vezes) a expressão do RNAm deste fator de transcrição (LI et

al., 2010). Este efeito é bloqueado pela presença de wortimanina (inibidor de PI3K)

ou de Akti-1/2 (inibidor de AKT) ou de rapamicina (inibidor de mTORC1) no meio de

incubação (LI et al., 2010), identificando os intermediários da cascata de sinalização

de insulina responsáveis pelo aumento da expressão do gene de SREBP-1c. Por

outro lado, camundongos com atividade constitutiva de mTOR (LTsc1KO) ao serem

alimentados com uma dieta hiperlipídica apresentam, no tecido hepático, uma

redução na expressão do RNAm de SREBP-1c e a jusante da expressão dos genes

da ácido graxo sintase e estearoil-CoA desaturase 1, dois genes envolvidos na

lipogênese, quando comparado ao grupo controle (YECIES et al., 2011). Nos

camundongos com atividade constitutiva de AKT (Pten -/-) não ocorre alteração na

expressão gênica de SREBP-1c (KENERSON et al., 2015). Em camundongos com

47

fenótipo de ambas, mTORC e AKT, constitutivas (Tsc1 -/-; Pten -/-) ocorre um

aumento na expressão de SREBP-1c (KENERSON et al., 2015). Desta forma, são

claros os efeitos da redução plasmática de insulina e da reposição aguda deste

hormônio na regulação da expressão deste fator de transcrição. Por outro lado,

apesar da similaridade na concentração de insulina, foi demonstrado que ratos

Wistar alimentados, durante seis semanas, com uma dieta rica em carboidratos

apresentam aumento na expressão do RNAm de SREBP-1C no tecido hepático

quando comparado aos ratos alimentados com uma dieta rica em lipídios,

(LETEXIER et al., 2005). No presente estudo, os ratos foram tratados com a dieta

cafeteria por 24 dias e apresentam aumento na concentração plasmática de insulina

(CHAVES et al., 2006), sugerindo que a ausência de alteração na expressão de

SREBP-1c pode ser decorrente do tempo de exposição à hiperinsulinemia,

provavelmente devido a contínua ativação de AKT. Corroborando nossa hipótese, foi

recentemente demonstrado que a oferta de uma dieta hiperlipídica (60% das calorias

provenientes de lipídios), durante 18 semanas, a camundongos deficientes em

Crtc2-/- (coativador transcricional 2 regulado por CREB) induz um aumento

significativo na concentração plasmática de insulina e no conteúdo de SREBP-1c

nuclear, sem afetar a transcrição hepática do RNAm de SREBP-1c (HAN et al.,

2015).

Em hepatócitos HepG2, foi demonstrado que a adição de 10 ou 100 nM de

insulina durante 4 horas aumenta a expressão de ChREBP (SIREK et al., 2009).

Contudo, os pesquisadores não encontraram alteração no RNAm de ChREBP

quando estes hepatócitos foram incubados na presença de 1 nM de insulina. Nossos

dados prévios demonstram que em ratos Wistar tratados com a dieta cafeteria a

concentração plasmática de insulina é inferior a 1 nM (CHAVES et al., 2006). Ratos

Wistar alimentados, durante seis semanas, com uma dieta rica em carboidratos ou

rica em lipídios não apresentam alteração no RNAm de ChREBP no tecido hepático

e na concentração de insulina quando ambas são comparadas (LETEXIER et al.,

2005). Contudo, ao serem submetidos ao jejum de 48 horas, apesar de reduzir a

concentração de insulina para valores inferiores a 0,35 nM, também não ocorre

alteração na expressão deste fator de transcrição quando comparado aos ratos

alimentados com cada uma das dietas (LETEXIER et al., 2005). Posteriormente, foi

demonstrado que a realimentação de camundongos ob/ob por 18 horas com uma

dieta rica em carboidratos induziu um aumento de duas vezes na expressão de

48

ChREBP acompanhado de um aumento de duas vezes na concentração plasmática

de insulina, atingindo uma concentração de 2,5 nM (DENTIN et al., 2006). Além do

efeito da insulina, a glicose também pode explicar o aumento da expressão de

ChREBP nestes animais, sendo demonstrado um aumento do RNAm deste fator de

transcrição em hepatócitos isolados incubados na presença de 25 mM de glicose, no

entanto, nenhum efeito é observado na presença de 2,5 ou 5 mM de glicose (IIZUKA

et al., 2009). A realimentação dos camundongos ob/ob por 18 horas com uma dieta

rica em carboidratos também induz um aumento de aproximadamente duas vezes

na concentração plasmática de glicose, atingindo uma concentração de 25 mM

(DENTIN et al., 2006). No entanto, o jejum de 48 horas de ratos Wistar previamente

alimentados com uma dieta rica em carboidratos (70%) ou rica em lipídios saturados

(60%) apesar de reduzir a concentração plasmática de glicose de 8 mM para

aproximadamente 4 mM não altera a expressão de ChREBP no tecido hepático

(LETEXIER et al., 2005). Desta forma, estes estudos sugerem que, alterações na

concentração de insulina e glicose decorrentes do estado nutricional não controlam

a expressão de ChREBP no tecido hepático. No presente estudo, os ratos

alimentados com a dieta cafeteria apresentam 6,4 mM de glicose plasmática e 351

pmol/L de insulina plasmática (CHAVES et al., 2006), explicando a ausência de

efeito da dieta regulando ChREBP hepático.

Vários trabalhos demonstram uma correlação positiva entre a expressão de

SREBP-1c ou ChREBP e a expressão das enzimas lipogênicas, como acetil-CoA

carboxilase e ácido graxo sintase (SHIMOMURA et al., 1999; LETEXIER et al. 2005;

DENTIN et al., 2006; BENHAMED et al., 2012; KENERSON et al., 2015). Contudo,

camundongos deficientes no coativator transcricional 2 regulado pela proteína de

ligação ao elemento de resposta ao AMPc (CREB) apresentam um aumento no

RNAm das enzimas lipogênicas, sem alteração no RNAm de SREBP-1C e ChREBP

(HAN et al., 2015). A deficiência do coativator transcricional 2 regulado por CREB,

no entanto, aumentou o conteúdo da proteína SREBP1 nuclear (HAN et al., 2015),

demonstrando a importância da regulação pós-traducional de SREBP no controle da

lipogênese. Previamente, foi demonstrado que camundongos C57B1/6 nocaute para

ChREBP não apresentam modificação na expressão das enzimas acetil-CoA

carboxilase, acetil-CoA sintetase, estearoil-CoA dessaturase e glicerol-3-fosfato

aciltransferase (CHA; RAPA, 2007). Este fator de transcrição também sofre

modificação pós-traducional (ILZUKA et al., 2009; XU et al., 2013). Apesar de a dieta

49

cafeteria induzir um aumento na síntese de novo de ácidos graxos no tecido

hepático in vivo (CHAVES et al., 2012), no presente trabalho foi demonstrado que

esta dieta não altera a expressão do RNAm de SREBP-1c e ChREBP, sendo

possível um maior conteúdo nuclear destes fatores de transcrição no tecido hepático

dos ratos alimentados com a dieta cafeteria.

5.2 Lipólise hepática

A lipólise fornece ácidos graxos, di e monoglicerídeos; estes substratos são

importantes na produção de energia, assim como na síntese de outros lipídios e/ou

na sinalização celular (ZIMMERMANN et al., 2009). A mobilização de ácidos graxos

de TAG acontece principalmente nos tecidos adiposos e requer enzimas lipolíticas,

sendo que a lipase hormônio sensível (LHS) e a lipase do triacilglicerol do tecido

adiposo (ATGL) correspondem a 90% dessas enzimas nesse tecido (ZIMMERMANN

et al., 2004). Essas enzimas estão também presentes em tecidos não adiposos,

porém parece haver uma diferença na expressão dessas enzimas entre os tecidos.

A análise do RNAm da ATGL por Northen Blot em diferentes tecidos de

camundongos jejuados sugere uma expressão quase imperceptível dessa enzima

no tecido hepático quando comparado ao tecido adiposo, porém o mesmo foi

observado para a β-actina (ZIMMERMANN et al., 2004). No tecido hepático de

camundongos machos C57BL/6J com idade final de 10 semanas, a expressão da

ATGL é 70% menor quando comparado com essa enzima no tecido adiposo

mesentérico (KERSHAW et al., 2006). Se comparado ao tecido adiposo perigonodal

a expressão da ATGL é 90% menor (KERSHAW et al., 2006), demonstrando uma

baixa expressão dessa enzima no tecido hepático. O conteúdo de LHS e ATGL

quando corrigido pelo gene constitutivo GAPDH é 48 e 24 vezes respectivamente,

maior no tecido adiposo quando comparado ao tecido hepático em camundongos B6

(REID et al., 2008). Apesar dessa baixa expressão e conteúdo, autores têm sugerido

um envolvimento da ATGL no desenvolvimento do quadro de esteatose hepática. A

redução em 70% da expressão de ATGL hepática, utilizando um adenovírus, resulta

em um aumento de 30% no peso do fígado, acompanhado de um aumento de

aproximadamente 2 vezes no conteúdo de TAG no tecido hepático em

camundongos alimentados durante 7 dias com uma dieta comercial ou hiperlipídica

(ONG et al., 2011). Por outra lado, a superexpressão de ATGL no tecido hepático de

camundongos fêmeas ob/ob reduz a concentração de TAG hepático (REID et al.,

50

2008). A superexpressão da LHS em camundongos fêmeas ob/ob também reduz a

concentração de TAG hepático, sugerindo que ambas, ATGL e LHS podem

participar do desenvolvimento de esteatose hepática (REID et al., 2008). Contudo, a

redução no conteúdo de TAG hepático é maior em camundongos ob/ob

superexpressando ATGL (25 vezes) comparados com camundongos

supreexpressando LHS (100 vezes) (REID et al., 2008). Este efeito pode ser

decorrente da especificidade de cada uma destas enzimas por seus substratos. A

ATGL tem uma maior afinidade por TAG enquanto LHS tem maior por DAG e MAG

(VILLENA et al., 2004; ZIMMERMANN et al., 2004). No presente estudo, a

expressão de ATGL e LHS nos ratos alimentados com a dieta cafeteria foi similar ao

grupo alimentado com a dieta controle apesar de uma maior concentração

plasmática de insulina no grupo alimentado com a dieta cafeteria (CHAVES et al.,

2006). Em camundongos FVB machos com 8 semanas de vida quando submetidos

a um jejum de 6 à 24h, no tecido adiposo houve um aumento na expressão de ATGL

e a realimentação durante 12h ou 24h após o jejum de 24h foi seguida por uma

diminuição na expressão da mesma hidrolase, contudo, a expressão de LHS não

sofreu alteração por tais estados nutricionais (KERSHAW et al., 2006). Ainda nesse

mesmo estudo, adipócitos incubados com diferentes concentrações de insulina (10-4

a 104 ng/mL) apresentaram uma redução na expressão de ATGL num padrão dose

dependente (KERSHAW et al., 2006). Posteriormente, foi demonstrado que a

inibição da expressão de ATGL em adipócitos pela insulina se dá através da via de

sinalização mediada pelo fator de transcrição FOXO1 (CHAKRABARTI; KANDROR,

2009). No fígado de ratos Sprague-Dawley diabéticos por estreptozocina, a

concentração nuclear de FOXO1 é maior que no grupo controle não diabético,

demonstrando que essa via de sinalização esta ativa no tecido hepático (XIA et al.,

2011). Recentemente foi demonstrado que FOXO1 é capaz de estimular a

expressão de ATGL em hepatócitos primários de camundongos e inibir a expressão

do seu inativador G0S2 nessas mesmas células (ZHANG et al., 2016). Nesse

mesmo estudo, quando esses hepatócitos foram incubados na presença de 100 nM

de insulina durante 4h os resultados foram contrários aos encontrados

primeiramente, corroborando a idéia de que insulina pode regular a mobilização de

TAG via FOXO1. Os nossos dados demonstram que os ratos alimentados com a

dieta cafeteria, apesar do quadro de hiperinsulinemia plasmática, não apresentam

redução na expressão de ATGL no tecido hepático.

51

Tem sido demonstrado que o aumento na atividade de AMPK em células

HepG2 incubadas com seu ativador AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamida-

ribósido) durante 24h é seguido de um aumento na expressão de ATGL (KUO et al.,

2012). AMPK é um sensor de energia que pode ser ativado por diversos fatores tais

como jejum, estado redox (AMP/ATP) e a privação de glicose (SUCHANKOVA et al.,

2009). A adição de glicose ou piruvato regula a atividade de AMPK independente da

relação AMP/ATP (SUCHANKOVA et al., 2009). Desta forma, no presente estudo,

devido a um quadro de normoglicemia entre os grupos, podemos sugerir níveis

normais de AMPK seguido também de níveis normais do RNAm para ATGL.

Ácidos graxos livres também podem regular da expressão de ATGL e a

atividade das lipases totais do fígado (JAERGER et al., 2015). Camundongos

deficientes em CGI-58, um ativador de ATGL, apresentam uma diminuição na

concentração de ácidos graxos livres acompanhado da diminuição do RNAm de

ATGL no tecido hepático (JAERGER et al., 2015). Nesse mesmo estudo, a

administração de azeite de oliva (200 mL/camundongo) por sonda gástrica seguido

de uma injeção de heparina (10 IU/camundongo) induz aumentos de ambos analitos

(ATGL e CGI-58). Em ratos alimentados com a dieta cafeteria, a concentração de

ácidos graxos livres plasmático é similar ao dos animais alimentados com a dieta

controle (CHAVES et al., 2006), no entanto tem sido demostrado um aumento de

30% na atividade das lipases citosólicas do tecido hepático nesse mesmos animais

(MOREIRA; BOTION, dados não publicados), sugerindo uma maior mobilização de

ácidos graxos do TAG endógeno. Desta forma é possível que o efeito inibitório da

insulina reduzindo a expressão de ATGL possa ser contra-balanceado pelo efeito

estimulatório dos ácidos graxos endógenos. Apesar de ter sido demonstrado que o

estado nutricional não modifica a expressão de LHS (KERSHAW et al., 2006), tem

sido demonstrado em células HepG2 que a presença de 100 µM ATP (3µCi γ-32P-

ATP/sample) e 10 IU PKA (proteína quinase dependente de AMPc) induz um

aumento na fosforilação dessa enzima, aumentando a sua atividade (ZIMMERMANN

et al., 2004). Nesse mesmo estudo foi demonstrado que PKA não regula a atividade

de ATGL diretamente. Ainda que exista similaridade na expressão no RNAm da LHS

e ATGL no tecido hepático dos ratos alimentados com a dieta cafeteria quando

comparado aos animais da dieta controle, essas enzimas sofrem regulação pós

traducionais. É esperado que a maior concentração de insulina plasmática dos ratos

alimentados com a dieta cafeteria estimule a enzima fosfodiesterase reduzindo a

52

concentração intracelular de AMPc e atividade de PKA resultando diretamente na

inibição de LHS e indiretamente de ATGL via CGI-58 (GRANNEMAN et al., 2007;

GAIDHU et al., 2009). Contudo, a realimentação durante 6 horas induz uma redução

de G0S2, um inibidor de ATGL, no tecido hepático (ZHANG et al., 2014),

possibilitando uma maior atividade de ATGL. Camundongos fêmeas nocaute para

G0S2 (G0S2-/-) apresentam resistência ao desenvolvimento de esteatose hepática

induzida pela dieta hiperlipídica devido a um aumento na atividade da enzima ATGL

(ZHANG et al., 2014). Alguns estudos sugerem um importante papel das hidrolases

ATGL e LHS na homeostasia de lipídios hepáticos (REID et al., 2008; ONG et al.,

2011). Camundongos com alterações no funcionamento de ATGL ou seu co-ativador

CGI-58 hepático, ou na LHS, apresentam um desequilíbrio na homeostasia dos

lipídios e um quadro de esteatose hepática (REID et al., 2008; ONG et al., 2011).

Além disso, enquanto no tecido adiposo as enzimas LHS e ATGL correspondem a

90% das hidrolases totais (ZIMMERMANN et al., 2004), no tecido hepático, tem sido

estimado, que tais enzimas contribuem apenas com aproximadamente 40% desta

atividade (REID et al., 2008; ONG et al., 2011). Através da utilização de adenovírus

para ATGL (shRNAm ATGL) hepatócitos apresentam uma redução de 70% no

RNAm e 80% na concentração proteica desta enzima, porém esses hepatócitos

mantem aproximadamente 60% da atividade hidrolítica de suas lipases totais (ONG

et al., 2011). Considerando os valores normais da expressão de ATGL e LHS entre

nossos grupos analisados, o aumento de 30% na atividade das lipases citosólicas

hepáticas nos ratos alimentados com a dieta cafeteria (MOREIRA; BOTION, dados

não publicados) e a regulação pós traducional destas enzimas pela insulina,

podemos sugerir que além da redução na inibição de ATGL exercida por G0S2

(ZANG et al., 2014), outras hidrolases podem estar ativas no tecido hepático.

Em 1997, utilizando hepatócitos de porco, foi purificada uma enzima

associada a microssomas com a capacidade de hidrolisar TAG, essa enzima

recebeu o nome de hidrolase de triacilglicerol (TGH) (LEHNER; VERGER, 1997).

Esta enzima parece participar da hidrólise do pool de TAG armazenado no tecido

hepático e formação da VLDL (DOLINSKY et al., 2004; LEHNER et al., 1999; LO et

al., 2010). Tem sido demostrado que a expressão da arilacetamida deacetilase em

células RH7777 reduz a concentração de TAG e secreção de ApoB, mas aumenta a

oxidação de ácidos graxos (LO et al., 2010). Esta enzima está associada ao retículo

endoplasmático (LO et al., 2010) e compartilha homologia com a LHS (PROBST et

53

al., 1994). O aumento na atividade das lipases totais do tecido hepático dos ratos

alimentados com a dieta cafeteria pode, portanto, ser decorrente de uma maior

atividade da ATGL assim como de outras hidrolases, como TGH, uma vez que

mesmo após a centrifugação de 100.000g tem sido demostrado a presença desta

enzima na fração citosólica no adiposo branco (SONI et al. 2004; WEI et al., 2007a).

Entretanto, poucos estudos investigam a regulação da expressão e atividade de

TGH no tecido hepático. O efeito direto da insulina regulando TGH ainda não foi

demonstrado, mas a expressão de TGH está diminuída no fígado de camundongos

com resistência insulínica induzida por TNF-alfa (RUAN et al., 2002). Apesar da

regulação dessas outras hidrolases ainda requisitar de mais investigações, tem sido

sugerido que o destino do ácido graxo proveniente da lipólise depende da lipase

responsável pela hidrólise do TAG (WEI et al., 2007). Os ácidos graxos provenientes

da ação da LHS são usados preferencialmente na β-oxidação (PEASE et al., 1999).

Estudos recentes fornecem evidencias que a ATGL consegue distribuir os ácidos

graxos hidrolisados entre as vias oxidativas e a síntese de lipoproteína de muito

baixa densidade (VLDL) (ONG et al., 2011). E como já mostrado acima, TGH é

capaz de mobilizar TAG e fornecer substrato melhorando a secreção de VLDL (LO

et al., 2010).

5.3 Oxidação de lipídios hepáticos

Tem sido amplamente demonstrado que o PPAR-α regula a β-oxidação

peroxissomal e mitocondrial através da ativação da transcrição de genes

importantes para esse processo, dentre eles acil-CoA oxidase (ACO) e a carnitina

palmitoiltransferase I (CPT-I) no tecido hepático (KELLER et al., 1993; LEMBERGER

et al., 1996; MINNICH et al., 2001; EVANS et al., 2004). No presente trabalho, a

dieta cafeteria não promoveu alteração na expressão de PPAR-α e de ACO no

tecido hepático. Alguns trabalhos correlacionam o conteúdo dos RNAm desses dois

genes (ZOU et al., 2008; BONFLEUR et al., 2015). No entanto, outros estudos

sugerem uma inexistência dessa relação entre o conteúdo do RNAm PPAR-α e de

ACO (NOH et al., 2013; GARCIA-CARABALLO et al., 2013). Ratos Fisher tratados

com dexametasona (40 µg/Kg-1) apresentam um aumento na expressão de PPAR-α

sem alterar a expressão de ACO (LEMBERGER et al., 1996). No entanto, a

administração de WY-14643, um ativador de PPAR-α, e dexametasona induz um

aumento de 6,5 vezes na expressão de ACO em comparação aos animais que só

54

receberam WY-14643 (LEMBERGER et al., 1996). Portanto, a ativação do receptor

é um pré-requisito para o efeito dos glicocorticóides nos genes alvos de PPAR-α.

Alguns estudos têm demonstrado que a insulina pode controlar a β-oxidação

através da regulação da expressão da CPT-I (CHATELAIN et al., 1995; PARK et al.,

1995; AKKAOUI et al., 2009). O jejum de 24h induz uma diminuição na concentração

sérica de insulina acompanhada de um aumento na expressão de CPT-I em

camundongos quando comparado àqueles alimentados com a dieta comercial

(ESTALL et al., 2009). Este mesmo efeito é observado em camundongos

heterozigotos para PGC-1α (ESTALL et al., 2009). De fato, previamente foi

demonstrado que a adição de insulina (100 nM) em células de hepatoma de ratos

reduz a expressão desta proteína (PARK et al., 1995). Por outro lado, uma dieta rica

em proteínas (35%) induz um aumento na expressão de CPT-I sem afetar a

concentração sérica de insulina no tecido hepático de camundongos C57BL/6J

(GARCIA-CARABALLO et al., 2013), demonstrando que a regulação desse gene

pode ocorrer de forma independente da insulina. De fato, a adição de ácido linoléico

(0,5 mM) no meio de incubação de hepatócitos estimula a transcrição de CPT-I

(CHANTELAIN et al., 1995). No presente estudo, no tecido hepático dos ratos

alimentados com a dieta cafeteria foi observado um aumento de CPT-I, mesmo na

presença de altas concentrações séricas de insulina, sem alteração na expressão de

PPAR-α. Em hepatomas de ratos foi demonstrado que o ácido linoléico (18:2, ω-6)

estimula a transcrição do gene da CPT-I independente de PPAR-α (LE MAY et al.,

2005). Por outro lado, a adição de insulina (1, 10 e 100 nM) no meio de incubação

inibe o efeito estimulatório do ácido linoléico (0,5 mM) na expressão de CPT-I em

hepatócito de ratos (CHANTELAIN et al., 1995). Entretanto, este efeito não é

observado na concentração de 0,1 nM de insulina (CHANTELAIN et al., 1995).

Considerando que a dieta cafeteria induz um aumento de 62% na concentração

sérica de insulina atingindo 351 pmol/L (CHAVES et al., 2006), acompanhado de

30% de aumento na atividade das lipases citosólicas no tecido hepático (MOREIRA;

BOTION, dados não publicados), podemos sugerir que o aumento na mobilização de

ácidos graxos estimulando a expressão de CPT-I prevalece ao efeito inibitório da

insulina.

55

5.4 Captação de ácidos graxos hepáticos

A captação hepática de ácidos graxos contribui para o equilíbrio constante de

triacilglicerol nesses hepatócitos, bem como para a DHGNA (KAWANO; COHEN,

2013). A taxa de absorção de ácidos graxos plasmático pelo fígado depende da

concentração de ácidos graxos no sangue e proteínas transportadoras como, FATP2

e CD36 (BRADBURY, 2006). Camundongos C57BL/6 submetidos a uma dieta rica

em lipídios durante 6 semanas, apresentam um quadro de esteatose hepática em

comparação aos camundongos alimentados com a dieta controle (FALCON et al.,

2006). Estes camundongos transfectados com adenovírus shRNA FATP2 (nocaute)

e tratados com a dieta rica em lipídios por mais 6 semanas apresentam uma

redução de TAG hepático quando comparado aos camundongos que receberam

somente o veículo. Os ácidos graxos captados pelo fígado podem ser provenientes

da dieta ou da lipólise do tecido adiposo (BRADBURY, 2006). Os ratos alimentados

com a dieta cafeteria não apresentam alterações nos ácidos graxos livres,

comparado aos ratos alimentados com a dieta controle (CHAVES et al.,2006). No

entanto, os adipócitos dos ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentam um

aumento de 29% na lipólise basal, avaliada pela liberação de glicerol in situ,

utilizando a técnica de microdiálise (CARVALHO, 2010). A administração de ácidos

graxos marcados com isótopos estáveis a indivíduos obesos por via oral durante 4

dias demonstrou que aproximadamente 60% dos ácidos graxos incorporado à

molécula de TAG no tecido hepático foram provenientes da captação plasmática

(DONNELLY et al., 2005). Portanto, nos ratos alimentados com a dieta cafeteria,

possivelmente os ácidos graxos provenientes da lipólise do TAB pode esta sendo

esterificado no fígado, contribuindo para o aumento de TAG nesse tecido.

5.5 Secreção de VLDL

A montagem e a secreção de VLDL pelo fígado é um processo complexo que

necessita da proteína ApoB (apolipoproteina B) e da sua lipidação pela proteína

microssomal de transferência de triacilglicerol (MTP) (HUSSAIN et al., 2003). Vários

estudos têm demostrado que a insulina é capaz de regular de forma negativa a

expressão de MTP (HAGAN et al., 1994; LIN et al., 1995; AU et al., 2003). Nestes

trabalhos hepatócitos incubados com diferentes doses de insulina (1nM à 100nM)

por até 6h apresentam uma redução de 20 à 80% no RNAm de MTP de uma forma

dose-dependente. Tem sido sugerido que FOXO1 regula a expressão de MTP

56

(KAMAGATE et al., 2008). Neste estudo, células HepG2 foram transfectadas com

um vetor para FOXO1 e incubadas por 24h na ausência ou na presença de insulina

(100nM), sendo observado que a presença da insulina reduz a expressão de MTP.

Ainda nesse mesmo estudo, camundongos expressando de forma constitutiva

FOXO1 no tecido hepático apresentam um aumento na expressão de MTP seguido

de um aumento na produção de VLDL quando comparados ao controle.

Previamente, foi observado que camundongos ob/ob resistentes à insulina

apresentam um aumento na expressão de MTP (BARTELS et al., 2002), e o jejum

de 24h em camundongos machos C57BL/6J aumentam a presença nuclear (ativa)

de FOXO1 no tecido hepático (QU et al., 2006). No entanto, o presente estudo

mostrou que os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram uma maior

expressão de MTP em relação aos ratos alimentados com a dieta controle, apesar

da hiperinsulinemia. Nesses animais, a sensibilidade hepática a insulina é

evidenciada pelo aumento no fluxo glicolítico e pela diminuição da gliconeogênese

em fatias de fígado (MARTINS-SANTOS, 2008). Além disso, os ratos alimentados

com a dieta cafeteria por 5, 6, 8 e 12 semanas não apresentam alteração na curva

de tolerância à glicose (CARVALHO, 2010). Tais achados sugerem que os altos

níveis plasmáticos da insulina foram suficientes para superar alguma possível

resistência de sua ação tecidual. Vários estudos veem sugerindo que a insulina não

é o principal regulador capaz de alterar a expressão de MTP (BARTELS et al., 2002;

SPARKS et al., 2011; SHI et al., 2013). Em camundongos C57BL/6 diabéticos

induzidos por estreptozotocina não houve alteração na expressão da proteína MTP

em comparação aos camundongos não diabéticos (BARTELS et al., 2002). Em

camundongos nocaute para apoB (apobec-1-/-), a administração de insulina

(10µL/kg) após um jejum de 12h não induz alteração no RNAm da MTP em

comparação ao grupo salina (SPARKS et al., 2011). Em outro estudo, ratos Wistar

resistentes à insulina alimentados com uma dieta rica em frutose por 8 semanas

apresentaram um redução no RNAm de MTP quando comparados aos ratos

alimentados com a dieta controle (SHI et al., 2013). Sendo assim, a insulina é capaz

de regular a expressão de MTP negativamente talvez em situação mais intensa e de

pouca duração. Na região promotora do gene MTP existem regiões de

reconhecimento para o fator nuclear de hepatócito (HNF) 1 e 4α (HAGAN et al.,

1994). O fator de transcrição HNF-4α demostrou ser um regulador positivo para a

expressão de MTP. Camundongos nocaute para HNF-4α apresentam uma redução

57

quase que total na expressão de MTP seguido de uma diminuição na secreção de

VLDL (HAYHURST et al., 2001). A atividade transcricional de HNF-4α pode ser

regulada por diferentes tipos de ácidos graxos, com variações no tamanho da cadeia

de carbono e também no seu nível de saturação (HERTZ et al., 1998). Neste

trabalho, células COS-7 co-transfectadas com um vetor de expressão HNF4-α CAT

(cloranfenicol-acetiltransferase) e incubadas com diferentes tipos de ácidos graxos,

por uma hora, apresentam um aumento na atividade de HNF4-α na presença de

ácidos graxos de cadeia com 14 e 16 carbonos saturados. Nos ratos alimentados

com a dieta cafeteria o aumento na atividade das hidrolases citosólicas (MOREIRA;

BOTION, dados não publicados) e um aumento na síntese de ácidos graxos de novo

no tecido hepático (CHAVES et al., 2012) podem estar fornecendo substrato para

maior ativação de HNF4-α e consequentemente aumentando a expressão de MTP

nesse grupo, superando um possível efeito inibitório exercido pela insulina. Outro

trabalho sugere que o colesterol pode regular a expressão de MTP. Na região

promotora de MTP foi identificado um elemento de resposta ao esterol

possibilitando assim que o colesterol pudesse regular a expressão de MTP. Células

HepG2 transfectadas com o gene para MTP humano e incubados por 48h na

presença de 1,0µg/mL de 25-OH colesterol e 10µg/mL colesterol apresentam um

aumento na expressão de MTP comparado as células incubadas com etanol

(controle) (HAGAN et al., 1994). Os ratos alimentados com a dieta cafeteria

apresentaram um aumento de 30% no colesterol hepático quando comparado aos

ratos alimentados com a dieta controle. Portanto, a diferença na expressão de MTP

entre os grupos analisados também pode ter sido devido a maior concentração de

colesterol no tecido hepático nos ratos alimentados com a dieta cafeteria.

No presente estudo, os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentaram

um redução na expressão da ApoB 100 (apolipoproteina B) em relação aos ratos

alimentados com a dieta controle. A regulação na expressão de ApoB ainda não é

totalmente compreendida, no entanto, muitos estudos sugerem que o gene ApoB é

expresso constitutivamente (DASHTI et al., 1989; PULLINGER et al., 1989; FISHER

et al., 2001; SPARKS et al., 2006). Células HepG2 submetidas a diversos fatores

regulatórios para a secreção de ApoB tais como a insulina (1, 10 e 100nM), ácido

oleico (0,8mM) não apresentam alteração no RNAm de ApoB quando comparado a

β-actina (DASHTI et al., 1989; PULLINGER et al., 1989). No entanto, outros estudos

sugerem que em determinadas circunstâncias, tais como: animais diabéticos por

58

estreptozotocina, ações farmacológicas e alguns tipos de dieta (rica em colesterol ou

alguns aminoácidos), a expressão de ApoB pode sofrer regulação ainda não

totalmente compreendida (SPARKS et al., 1992; DASHTI 1992; CIANFLONE et al.,

1996; SINGH et al., 2002; SPARKS et al., 2006; ASHUR-FABIAN et al., 2010). Ratos

Sprague Dawley diabéticos por estreptozotocina não apresentam alteração na

expressão de ApoB comparado aos ratos não diabéticos, no entanto, os ratos

diabéticos quando tratados com insulina durante 7 dias (dose única e diária

200µL/Kg) apresentam um aumento na expressão da proteína ApoB no tecido

hepático comparado aos ratos diabéticos que não receberam insulina (SPARKS et

al., 1992). Células HepG2 incubadas com colesterol (10-40µg/mL) de 16 a 20h

apresentam um aumento na expressão de ApoB (55%) comparado ao grupo

controle (DASHTI 1992). Alguns estudos demonstram que tanto in vitro quanto in

vivo, alguns aminoácidos como, por exemplo, asparagina, glutamina e a metionina,

podem interferir na expressão de ApoB (CIANFLONE et al., 1996; SPARKS et al.,

2006). Mais recentemente, foi identificado na região promotora do gene da ApoB um

elemento de resposta a p53 (p53RE), um gene supressor de tumor capaz de ativar a

transcrição de vários genes (ASHUR-FABIAN et al., 2010). Nesse trabalho,

camundongos C57BL/6 tratados durante 5 dias com adriamicina, um potente

ativador de p53, apresentam um aumento na expressão de ApoB no tecido hepático

em comparação ao controle. Camundongos C57BL/6J com idade inicial de 5

semanas, tratados com um silenciador do gene ApoB durante 6 semanas ( 2 vezes

por semana) apresentam um redução de aproximadamente 90% no RNAm de ApoB,

sem causar alteração no conteúdo da proteína (CROOKE et al., 2005). De fato os

estudos prévios tem sugerido que a expressão de ApoB pode interferir na secreção

de VLDL, no entanto, esses mesmos trabalhos demostram que as alterações na

transcrição de ApoB não é acompanhada na mesma proporção das alterações na

produção dessa proteína, sugerindo a existência de mecanismos regulatórios co e

pós transcricionais/traducionais (DASHTI, 1992; SPARKS et al., 1992; FISHER et al.,

2001; SINGH et al., 2002; CROOKE et al., 2005). Embora as alterações nos níveis

de transcrição e tradução de ApoB possam desempenhar um papel na produção da

proteína, a secreção de ApoB é regulada principalmente a nível de degradação

proteica (FISHER et al., 2014). A falta de co-relação entre a concentração de RNAm

e da proteína ApoB demonstra uma necessidade de mais estudos, no entanto, tem

sido fortemente sugerido que os fatores envolvidos na regulação da taxa de

59

secreção de VLDL são: a) a quantidade de proteina ApoB que escapa das diversas

formas de degradação, b) a disponibilidade de lipídios a serem secretados e c) a

expressão de MTP ( DAVIS, 1999; FISHER et al., 2001; SPARKS et al., 2006).


aproximadamente 20% na taxa de secreção de VLDL-TAG quando comparados aos

ratos alimentados com a dieta controle. Apesar de um quadro de hiperinsulinemia e

normoglicemia (CHAVES et al., 2006), a sinalização da insulina no tecido hepático,

avaliada pelo fluxo da glicólise e da gliconeogênese esta preservada nos ratos

alimentados com a dieta cafeteria (citado acima) sugerindo que a secreção de VLDL

deveria estar reduzida. Tem sido sugerido que a insulina reduz a expressão de MTP

através de FOXO1, altera a tradução do RNAm e estimula de várias formas a

degradação da proteína ApoB (HAAS et al., 2013). Desta forma, ratos ob/ob

resistentes à insulina apresentam maior secreção de VLDL-TAG (BARTELS et al.,

2002). Contudo, células HepG2 incubadas a uma concentração de 100nM de

insulina apresentam uma redução na tradução do RNAm da proteína ApoB no

período entre 4 e 16h, mas entre 15 mim e 1h de incubação, a insulina aumenta a

tradução de ApoB (KARIMIAN POUR; ADELI, 2011). Em outro trabalho, células

HepG2 transfectadas com plasmídeos contendo as regiões 5’ UTR ou 3’UTR no

gene para ApoB e incubadas na ausência ou na presença de 1µg/mL de insulina

durante 16h demostram que células contendo a região 5’UTR incubadas na

presença de insulina apresentam uma redução na tradução desta proteína

(SIDIROPOULOS et al., 2005). Este estudo sugere que a insulina diminui a ligação

da proteína a região 5’ UTR que conduz o RNAm para a tradução. A insulina diminui

a ligação da proteína a região 5’UTR através da sua cascata de sinalização

envolvendo PI3K e mTOR (SIDIROPOULOS et al., 2007). Grande parte da ApoB

produzida é degradada por diversos mecanismos, sendo as que escapam desse

processo utilizadas para a secreção de VLDL (FISHER et al., 2001). A degradação

de apoB pode acontecer pela via proteassômica ou não proteassômica, como por

exemplo estimulada por ácido graxo omega 3 ou insulina (LIANG et al., 2001;

FISHER; GINSBERG, 2002). A insulina é capaz de diminuir a secreção de VLDL

induzindo a proteína ApoB para uma degradação (SPARKS et al., 1990). Em

hepatócitos de ratos incubados com 10nM de insulina durante 12 à 14h, foi

demonstrado uma redução na secreção de ApoB quando comparados aos controles

(0,1nM de insulina) devido a uma menor concentração de ApoB (SPARKS et al.,

60

1990). Por outro lado, humanos alimentados com uma dieta rica em carboidratos

apresentam aumento na velocidade de secreção da fração TAG de VLDL, sem

alterar a velocidade de secreção da fração apoB de VLDL (MELISH et al., 1980),

indicando que alterações na produção de VLDL-TAG não são acompanhadas pela

produção de VLDL-apoB. Em acordo com essa ideia, hepatócitos cultivados na

presença de 1mM de ácido oleico, um potente estimulador da síntese de TAG,

apresentam um aumento na secreção de VLDL-TAG sem alterar a síntese proteica

de ApoB (DAVIS; BOOGAERTS, 1982). Ainda nesse estudo, a inibição da síntese

proteica de ApoB por cicloheximida induz uma redução na secreção de VLDL

mesmo na presença do ácido oleico, sugerindo que a ApoB desempenha um papel

importante na determinação da capacidade do hepatócito em aumentar a secreção

de TAG. A disponibilidade de lipídios e o nível de expressão e atividade de MTP

protegem ApoB da degradação e consequentemente pode melhorar a secreção de

VLDL (FISHER et al., 2001). Células HepG2 incubadas na presença de RTV, um

inibidor de proteassoma, apresentam um acúmulo de ApoB intracelular, no entanto,

essas células apresentam uma redução na secreção de ApoB (LIANG et al., 2001).

Entretanto, ao serem incubadas na presença do RTV e 0,4 mM de ácido oleico

ocorre um aumento de 65% na taxa de secreção de ApoB em comparação as

células que receberam somente o acido oleico, demonstrando que o fornecimento

de lipídios melhora secreção de ApoB protegendo da degradação proteassômica,

assim esses mecanismos são capazes de controlar a secreção de lipídios hepáticos.

Em outro trabalho, hepatócitos de ratos incubados com diferentes ácidos graxos

(concentração de 1mM) apresentaram um aumento na secreção de VLDL- [³H]TAG

visualizado através da incorporação de [³H]glicerol (DAVIS; BOOGAERTS, 1982).

Nesse trabalho, o ácido oleico estimulou um aumento de 2 a 3 vezes na secreção de

VLDL-TAG. Outro passo limitante para a secreção de VLDL é a transferência de

lipídios para ApoB pela proteína MTP, sendo que alterações tanto na expressão

quanto na atividade de MTP são capazes de prejudicar a secreção de VLDL

(WETTERAUL et al., 1992). Em camundongos machos nocaute para ApoB

(apobec-1-/-), a insulina (10µ/Kg) não é capaz de alterar a expressão e a atividade de

MTP no tecido hepático quando comparado aos camundongos salina (SPARKS et

al., 2011). Ainda nesse trabalho, hepatócitos que receberam um adenovírus para

superexpressarem MTP (HMTP) apresentam maior secreção de ApoB em relação

ao controle. No entanto, os hepatócitos HMTP na presença de 100nM de insulina

61

tiveram uma redução na secreção de ApoB quando comparado aos hepatócitos

HMTP que receberam doses basais de insulina (1nM). Desta forma, mesmo em

situações em que a secreção de ApoB está aumentada pela maior atividade de

MTP, parte da ApoB produzida ainda esta sujeita a degradação pela insulina.

Portanto, os ratos alimentados com a dieta cafeteria apresentam um aumento na

secreção de VLDL-TAG possivelmente devido a um maior fornecimento de lipídios

para a secreção proveniente do aumento da lipogênese de novo (CHAVES et al.,

2012), do aumento na atividade das hidrolases citosólicas hepáticas (MOREIRA;

BOTION, dados não publicados), e de um possível aumento na captação pelo tecido

hepático de ácidos graxos livres provenientes da maior lipólise nos TAB

(CARVALHO, 2010), conciliado com uma maior expressão de MTP quando

comparado aos ratos alimentados com a dieta controle, superando um efeito da

insulina na tentativa de diminuir a secreção de VLDL. Desta forma, mesmo com um

aumento na secreção de VLDL-TAG, a dieta cafeteria foi capaz de induzir um

quadro de esteatose hepática.

62

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Nossos dados demonstram que a dieta cafeteria induziu um aumento na

adiposidade, na concentração hepática de lipídios e na concentração sérica de

triacilglicerol. O aumento acentuado na síntese de ácidos graxos de novo hepática

(CHAVES et al., 2012), não compensada pelo aumento na secreção de VLDL e na

degradação de lipídios contribuem para o desenvolvimento da esteatose hepática. A

dieta cafeteria foi capaz de causar um desequilíbrio na concentração e na secreção

de triacilglicerol revelando uma incapacidade do tecido hepático em reestabelecer

esse equilíbrio lipídico. Um efeito oposto na expressão dos genes envolvidos na

montagem da VLDL, que são, aumento na expressão do RNAm de MTP e

diminuição do RNAm da apoB, podem representar uma alteração na capacidade

secretora de triacilglicerol via VLDL nos ratos alimentados com a dieta cafeteria,

provavelmente sobre ação da insulina, hormônio esse, importante na homeostasia

dos lipídios hepáticos. O aumento da atividade das lipases hepáticas (MOREIRA,

BOTION, dados não publicados) e um aumento acentuado do RNAm de CPT1

sugerem a ativação de processos de degradação, podendo representar uma

resposta adaptativa ao excesso de lípidos intracelulares. No entanto, mesmo com

um pequeno aumento da secreção de VLDL, a ativação do catabolismo de lipídios

intracelulares e a sensibilidade insulínica preservada no tecido hepático, esse tecido

permanece com teor de lipídios em excesso nos animais alimentados com a dieta

cafeteria. Portanto, o aumento acentuado na síntese dos ácidos graxos parece ser

determinante em induzir esteatose hepática nos ratos alimentados com a dieta

cafeteria ainda que mecanismos compensatórios possam estar estimulados,

provavelmente minimizando o efeito desta dieta neste acúmulo lipídico.

63

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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80

8. ANEXO

Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSJ – CEUA/UFSJ

CERTIFICADO

Certificamos que o protocolo para uso de animais em experimentação 016/2014 “Mecanismos

bioquímicos envolvidos na esteatose hepática nos ratos alimentados com dieta cafeteria”,

coordenado pela Prof.ª Valéria Ernestânia Chaves, está de acordo com os Princípios Éticos na

Experimentação Animal, dispostos na Lei Federal no 11.794, de 08.10.2008 e foi aprovado pela

Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFSJ em reunião do dia 12 de dezembro de 2014.

São João del-Rei, 12 de dezembro de 2014.

Prof.ª Leila de Genova Gaya

Coordenadora da Comissão de Ética no Uso de Animais

CEUA-UFSJ

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