universidade federal de santa...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

Angélica Cavalett

INTERAÇÃO E CLIVAGEM DE DNA POR COMPLEXOS

METÁLICOS DE Cu(II) E Tb(III)

Dissertação submetida ao

Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica da Universidade

Federal de Santa Catarina para a

obtenção do Grau de Mestre em

Bioquímica

Orientador: Prof. Dr. Hernán

Terenzi

Florianópolis

2011

Angélica Cavalett

INTERAÇÃO E CLIVAGEM DE DNA POR COMPLEXOS

METÁLICOS DE Cu(II) E Tb(III)

Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de

“Mestre em Bioquímica”, e aprovada em sua forma final pelo Programa

de Pós-Graduação em Bioquímica.

Florianópolis, 02 de dezembro de 2011.

________________________

Prof., Dr. Marcelo Farina

Coordenador do Curso

Banca Examinadora:

________________________

Prof., Dr. Hernán Terenzi,

Orientador

Universidade Federal de Santa Catarina

________________________

Prof.ª, Dr.ª Elene Cristina Pereira Mais,

Universidade Federal de Minas Gerais

________________________

Prof., Dr. Claus Tröger Pich,


________________________

Prof., Dr. Nelson H. Gabilan,


________________________

Prof., Dr. Marcelo Farina

Coordenador do Curso

Dedico este trabalho aos meus pais,

Alcidir e Ivete, ao meu irmão,

Gabriel, e à minha afilhada, Luiza.

i

AGRADECIMENTOS

Ao professor Hernán Terenzi pela oportunidade de estudo,

confiança e por disponibilizar todos os recursos para o desenvolvimento

deste trabalho.

Aos professores Adaílton Bortoluzzi e Hugo Gallardo pela

colaboração na realização deste trabalho. Ao professor Ademir Neves e

aos alunos do Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia do

departamento de Química da Universidade do Federal de Santa

Catarina, pela colaboração em outros projetos. Ao, agora mestre,

Everton Policarpi pela colaboração e ajuda neste trabalho.

Aos colegas do Centro de Biologia Molecular Estrutural: Angela,

Cami, Carol, Deise, Guilherme, Gabi Ecco, Gabi Müller, Gisa, Javier,

Jean, Louise, Manuel, Ricardo, Pri, Pati, Paty (minha IC favorita!) e

Tiago pela convivência, troca de conhecimento, ajuda nos experimentos,

pelas festinhas, comilanças e brincadeiras! Agradeço, em especial, o

Lab. 03, pela parceria e pelas risadas, o querido colega Tiago, por todos

os ensinamentos e todas as ajudinhas e a “crrrrazy” Gabrielle, por não

ser apenas uma colega de trabalho.

Aos meus pais, Alcidir e Ivete, pelo amor, zelo, paciência e

sabedoria em todos os momentos da minha vida. Por terem feito tudo

certo sempre! Pelo apoio e confiança sem cobranças! Muito, muito

obrigada!

Ao meu irmão Gabriel, minha amiga e cunhada e Cristiane, meu

segundo irmão Gabriel e minha amiga e concunhada Fernanda, à Stela e

ao Joaquim e à minha Best Friend Forever, Rafaela, por me aguentarem

nos meus dias insuportáveis e por serem responsáveis por momentos de

imensa alegria! À Luiza, por sempre ser um estímulo e me deixar

extremamente feliz simplesmente por existir!

Ao meu namorado Filipe, por todas as viagens nos finais de

semana, por toda a paciência e todo o amor nos meus melhores e piores

dias!

À UFSC e ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo e ao CNPQ, MCTI,

FINEP, FAPESC e Instituto de Ciência e Tecnologia em Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB).

iii

"Não se pode contar com

nada. O único caminho viável é

viver e correr o sagrado risco do

acaso. E substituir o destino pela

probabilidade."

“Uma estrutura tão bonita

simplesmente tinha de existir.”

James Watson

v

RESUMO

O ácido desoxirribonucléico (DNA) é alvo constante de estudo nas áreas

de bioquímica, biotecnologia e biologia molecular por sua importância

biológica, por isso a busca por novas ferramentas para sua manipulação

torna-se necessária. Com este objetivo foram estudadas a interação e

clivagem de DNA por complexos metálicos de Cu(II),

Cu(acac)dppz](ClO4), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O,

[Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O e Tb(III), [Tb(tdzp)(acac)3]. Para avaliar a

capacidade de clivagem dos complexos foram realizados testes com

diferentes concentrações destas moléculas e na presença e ausência de

luz UV-A. O mecanismo de clivagem foi avaliado pelo aumento de

força iônica, adição de sequestradores de radicais livres e ligantes do

sulco maior e menor do DNA às reações. Testes na presença e ausência

de oxigênio também foram realizados. Os ensaios cinéticos ocorreram

no abrigo e na presença de luz UV-A. Os complexos de Cu(II) foram

avaliados quanto à sua interação ao CT-DNA, para tanto foram

realizadas titulações espectrofotométricas do complexo na presença e

ausência de CT-DNA, desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e

presença dos complexos e avaliação de alterações na estrutura do DNA

na presença dos complexos por espectroscopia de dicroísmo circular. Os

quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial em

concentrações micromolares em cinco minutos de reação quando

fotoativados por luz UV-A. O aumento de força iônica reduziu a

atividade dos complexos e o mecanismo de clivagem ocorre pela

formação de espécies reativas de oxigênio e carbono-centrados. Os

ensaios cinéticos revelaram tempos de meia-vida do DNA abaixo dos

cinco minutos quando as reações foram fotoativadas. Os complexos de

Cu(II) com ligantes dppz forneceram Kb de ~105 M

-1 e o Kb para o

complexo de Cu(II) com ligante dpq foi de ~104 M

-1. Os três complexos

de Cu(II) promoveram aumento da Tm do DNA e alterações na estrutura

do CT-DNA foram observadas pelos espectros de dicroísmo circular.

Palavras-chave: complexos de Cu(II), complexo de Tb(III),

fotoclivagem de DNA, interação com DNA.

vii

ABSTRACT Deoxyribonucleic acid (DNA) is a constant target of study in

biochemistry, biotechnology and molecular biology, for this reason new

molecules capable of interaction and DNA cleavage are designed for

DNA manipulation. Herein we studied the DNA interaction and

cleavage by metal complexes of Cu(II), Cu(acac)dppz](ClO4),

[Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O , [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O, and

Tb(III), [Tb(tdzp)(acac)3]. To assess the ability of DNA cleavage by the

Cu(II) and Tb(III) complexes tests were performed at different

concentrations of the complexes and in the presence and absence of UV-

A light. The cleavage mechanism was studied by the increase of ionic

strength, addition of free radical scavengers and DNA groove binders to

the reactions. Tests in oxygen presence and absence were also

conducted. The kinetic assays were performed at dark and in UV-A light

presence. The Cu(II) complexes were evaluated for their interaction to

CT-DNA by spectrophotometric titrations of the complexes in DNA

presence and absence, CT-DNA thermal denaturation in the absence and

presence of complexes and changes evaluations in DNA structure by

circular dichroism technique. The four complexes were able to cleave

the plasmid DNA at micromolar concentrations in five minutes of

reaction under UV-A light. The complexes activity was reduced by ionic

strength increase and the cleavage mechanism occurs by the generation

of oxygen and carbon reactive species. The kinetics analysis revealed

DNA half-life times under five minutes when the reactions were

photoactive. The Cu(II) complexes with dppz ligands provided a Kb of

~105 M

-1 and the complex with dpq ligand provide a Kb of ~10

4 M

-1.

The three Cu(II) complexes increased the CT-DNA Tm and changes in

CT-DNA structure.

Keywords: Cu(II) complexes; Tb(III) complex; DNA photocleavage;

DNA interactions.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Formas de interação entre pequenas moléculas e a dupla hélice

de DNA…………………………………………………………………3

Figura 2. Mecanismo de clivagem de DNA por via hidrolítica. Etapa 1:

ataque nucleofílico do oxigênio de uma molécula de hidroxila ao fosfato

ligado à pentose do ácido nucléico, gerando um fosfato intermediário

penta-coordenado. Etapa 2: ruptura da ligação fosfodiéster em P-O5’ ou

P-O3’ (MANCIN et al., 2005) adaptado por Bortolotto (2011)……….4

Figura 3: Diagrama de Jablonski demonstrando os processos químicos

envolvidos na fotoexcitação de elétrons. Adaptado de Szaci łowski e

colaboradores (2005)…………………………………………………..5

Figura 4: Esquema de ação de um fármaco utilizado na terapia-

fotodinâmica. (A): Administração do fármaco; (B): concentração do

fármaco na região do tumor; (C): fotoativação do fármaco pela luz e

(D): destruição seletiva do tumor………………………………………6

Figura 5: Estrutura da fenantrolina (1) e seus derivados dpq (2) e dppz

(3) (ROY et al., 2010)………………………………………………….7

Figura 6: Estrutura do complexo [Cu(acac)(dpq)Cl] (1) e

[Cu(acac)(dppz)Cl] (2) (CHEN et al., 2011)…………………………..8

Figura 7: Exemplos de complexos de lantanídeos: [Tb(H2L)-

(NO3)(H2O)3]2+

(A), [Eu(H2L)(NO3)(H2O)3]2+

(B) e

[Gd(C34H41N6O8)]2+

(C) (CAMARGO et al., 2008; CAMARGO et al.,

2010b)………………………………………………………………….9

Figura 8: Ilustração esquemática da hibridização de oligonucleotídeos

dirigida pela complexação do íon e a sonda. A: sem a hibridização dos

oligonucleotídeos as sondas não são luminescentes. B: Formação do

complexo pela hibridização ao oligonucleotídeo alvo, o complexo é

excitado em 340 nm e emite luminescência de longa-vida em 615 nm,

modificado de Karhunem e colegas (2009)……………………………11

Figura 9: (A) Estrutura cristalina do complexo [Cu(bpma)(dppz)]

(ClO4).0,67H2O. (B) Estrutura cristalina do complexo

[Cu(acac)(dppz)](ClO4). (C) Estrutura cristalina do cátion do complexo,

[Cu(diaza)(dpq)]+. As figuras das estruturas foram gentilmente cedidas

pelo Mestre Everton de Britto Policarpi sob orientação do prof. Dr.

Adaílton J. Bortoluzzi………………………………………………….14

Figura 10: Estrutura cristalina do complexo [Tb(tdzp)(acac)3]

(GALLARDO et al., 2011)…………………………………………….15

Figura 11: Ilustração e micrografia das três formas do DNA plasmidial

(acima) e a sua diferenciação após eletroforese em gel de agarose

(abaixo) (BORTOLOTTO, 2011)……………………………………..16

Figura 12: Clivagem de DNA plasmidial pelo complexo 1 em diferentes

concentrações. Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-

HCl, pH 7,4; [complexo]: 0 a 20 µM. Tempo de reação: 5 minutos em

luz UV-A………………………………………………………………23




luz UV-A………………………………………………………………24




luz UV-A………………………………………………………………25


concentrações. Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 25 mM de

PIPES pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 0 a 100 µM. Tempo de reação: 5

minutos em luz UV-A…………………………………………………26



HCl, pH 7,4; [complexo]: 0 a 20 µM. Tempo de reação: 8h na ausência

de luz a 37°C…………………………………………………………27




de luz a 37°C…………………………………………………………..28




de luz a 37°C…………………………………………………………..29


concentrações. Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 25 mM de

PIPES pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 0 a 100 µM. Tempo de reação:

24h na ausência de luz a 37°C………………………………………...30

Figura 20: Atividade do CuCl2 nas mesmas condições testadas para os

complexos 1, 2 e 3. [DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4;

[CuCl2]: 2,5 a 20 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A…..32

Figura 21: Atividade do TbCl3 nas mesmas condições testadas para o

complexo 4. [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH ; [TbCl3]: 100 µM.

Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A…………………………..33

Figura 22: Atividade do ligante tdzp nas mesmas condições testadas

para o complexo 4. [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH ; [tdzp]: 50

e 100 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A e 24 horas no

escuro a 37°C………………………………………………………….34

Figura 23: Clivagem de DNA plasmidial pelo complexo 1 na ausência e

presença de diferentes concentrações de NaCl. Condições reacionais:

[DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 5 µM;

[NaCl]: 0 a 300 mM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A…..35




[NaCl]: 0 a 300 mM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A……36



[DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 7,5 µM;

[NaCl]: 0 a 300 mM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A……37



[DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7; [complexo]: 25 µM; [NaCl]:

0 a 300 mM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A……………38


presença de diferentes sequestradores de radicais livres e D2O.

Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4;

[complexo]: 5 µM; [DMSO]: 10% (v/v); [KI]: 10 mM; [SOD]: 15 U;

[D2O]: 70% (v/v); [NaN3]: 10 mM.Tempo de reação: 5 minutos em luz

UV-A………………………………………………………………….39





[D2O]: 70% (v/v); [NaN3]: 10 mM Tempo de reação: 5 minutos em luz

UV-A…………………………………………………………………..40




[complexo]: 7,5 µM; [DMSO]: 10% (v/v); [KI]: 10 mM; [SOD]: 15 U;


UV-A………………………………………………………………….41

Figura 30: Clivagem de DNA plasmidial pelos complexos 1, 2 e 3 na

ausência e presença de TEMPO. Condições reacionais: [DNA] = 400

ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 5; 20 e 7,5 µM; TEMPO:

500 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A…………………42


presença de diferentes sequestradores de radicais livres. Condições

reacionais: [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7; [complexo]: 25

µM; [DMSO]: 10% (v/v); [KI]: 10 mM; [NaN3]: 10 mM; [TEMPO]:

500 µM Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A………………….44

Figura 32: Clivagem de DNA plasmidial por Fe-EDTA e pelos

complexos 1, 2 e 3 na ausência de oxigênio, em atmosfera de argônio.


[complexos]: 5; 20 e 7,5 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-

A. ……………………………………………………………………..45


complexos 1, 2 e 3 na presença de oxigênio. Condições reacionais:

[DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 5; 20 e 7,5

µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A………………………46

Figura 34: Clivagem de DNA plasmidial por CuCl2 + MPA e pelo

complexo 4 na ausência de oxigênio. Condições reacionais: [DNA] =

400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 25 µM.

Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A……………………………47


complexo 4 na presença de oxigênio. Condições reacionais: [DNA] =


Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A……………………………48


presenças dos ligantes dos sulcos de DNA. Condições reacionais:

[DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 25

µM; [distamicina]: 50 µM; [verde de metila]: 50 µM. Tempo de reação:

5 minutos em luz UV-A……………………………………………….50

Figura 37: Gráfico do logaritmo neperiano do DNA plasmidial

superenovelado versus tempo (segundos) de reação após o tratamento

com o complexo 1. Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 10 mM de

Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 100 µM. Tempo de reação: 75 segundos

em luz UV-A………………………………………………………….51





em luz UV-A…………………………………………………………..52





em luz UV-A………………………………………………………….53




PIPES, pH 7; [complexo]: 100 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz

UV-A………………………………………………………………….54




Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 100 µM. Tempo de reação: 9 horas no

escuro a 37°C………………………………………………………….55





escuro a 37°C………………………………………………………….56





escuro a 37°C………………………………………………………….57




PIPES, pH 7; [complexo]: 100 µM. Tempo de reação: 48h no escuro a

37°C……………………………………………………………………58

Figura 45: Titulação espectrofotométrica do complexo 1 na presença de

diferentes concentrações de CT-DNA. Condições reacionais: [CT-

DNA]: 0,8 a 7,8 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 10 µM;

temperatura: 37°C……………………………………………………..59



DNA]: 1 a 9,8 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 10 µM;

temperatura: 37°C……………………………………………………..60



DNA]: 1,6 a 14 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 25 µM;

temperatura: 37°C……………………………………………………..61

Figura 48: Desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e presença

dos complexos 1, 2 e 3. Condições reacionais: [CT-DNA]: 100 µM; 1

mM tampão fosfato pH 7,2; [complexo]: 10 µM. Temperatura: 40 a

90°C, um grau por minuto……………………………………………63

Figura 49: Espectro de dicroísmo circular de CT-DNA na ausência e

presença do complexo 1. Condições reacionais: [CT-DNA]: 100 µM;

5mM de Tris-HCl pH 7,4; [complexo]: 5 a 16 µM……………………64



5mM de Tris-HCl pH 7,4; [complexo]: 5 a 20 µM…………………..64



5mM de Tris-HCl pH 7,4; [complexo]: 5 a 20 µM…………………..65

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

acac: acetilacetonato

bpma: N-bis-(2-piridilmetil)-amina

CD: dicroísmo circular (do inglês, circular dichroism)

CT-DNA: DNA de timo de bezerro (do inglês, calf thymus

deoxyribonucleic acid)

diaza: 6-amino-6-metilperhidro-1,4-diazepina

DNA: ácido desoxirribonucléico (do inglês, deoxyribonucleic acid)

dppz: dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina

dpq: dipirido[3,2-f:2',3'-h]quinoxalina

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, ethylenediamine

tetraacetic acid)

ERO: espécie reativa de oxigênio

F I: forma superenovelada do DNA plasmidial, forma I

F II : forma circular aberta do DNA plasmidial, forma II

F III: forma linear do DNA plasmidial, forma III

pb: par de base

pH: potencial hidrogêniônico

phen: fenantrolina

PIPES: Piperazina-1,4-bis(ácido 2-etanosulfónico)

UV: ultravioleta

UV-Vis: ultravioleta - visível

tdzp: [1,2,5]thiadiazol[3,4-f][1,10]fenantrolina

Tris-HCl: hidrocloreto de tris(hidroximetil)aminometano

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS ............................................................ I

RESUMO ................................................................................ V

ABSTRACT ......................................................................... VII

LISTA DE FIGURAS ............................................................. 1

SUMÁRIO ................................................................................ 1

1. INTRODUÇÃO ................................................................... 1

1.1 ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO ............................................ 1

1.2 COMPLEXOS METÁLICOS E A MOLÉCULA DE DNA ................ 2 1.2.2 Fotoclivagem de DNA por complexos metálicos ..... 5 1.2.3 Clivagem de DNA por complexos de cobre

derivados de fenantrolina .................................................. 6 1.2.4 Complexos de lantanídeos ........................................ 8

1.3 APLICAÇÕES DOS COMPLEXOS METÁLICOS ......................... 10

2. OBJETIVOS ...................................................................... 12

2.1. OBJETIVO GERAL ............................................................... 12 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................... 12

3. MATERIAL E MÉTODOS .............................................. 13

3.1. COMPLEXOS METÁLICOS ................................................... 13

3.2. EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL PBSK II ........................ 15 3.3. CLIVAGEM DE DNA PLASMIDIAL ...................................... 16

3.3.1. Efeito da concentração do complexo .................... 17 3.3.2. Atividade do sal de cobre(II) e dos ligantes .......... 17

3.3.3. Atividade do sal de térbio(III) e dos ligantes ........ 18 3.3.4. Efeito da força iônica ............................................ 18

3.3.5. Efeito dos sequestradores de radicais livres e D2O

......................................................................................... 18 3.3.6. Efeito da presença e ausência de oxigênio ........... 18 3.3.7. Efeito dos ligantes dos sulcos do DNA .................. 19

3.3.8. Cinética de clivagem do DNA ............................... 19 3.4. INTERAÇÃO DOS COMPLEXOS COM CT-DNA .................... 20

3.4.1. Titulação espectrofotométrica (UV-Vis) ................ 20 3.4.2. Desnaturação térmica do DNA ............................. 21 3.4.3. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) .......... 22

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................... 23

4.1. CLIVAGEM DE DNA PLASMIDIAL ....................................... 23

4.1.1. Efeito da concentração do complexo ..................... 23 4.1.2. Atividade do sal de cobre(II) e dos ligantes dpq e

dppz .................................................................................. 31

4.1.3 Atividade do sal de térbio(III) ................................ 32

4.1.3. Efeito da força iônica ............................................ 35


......................................................................................... 39 4.1.5. Efeito da presença e ausência de oxigênio ............ 45

4.1.6. Efeito dos ligantes dos sulcos do DNA .................. 49 4.3.7. Cinética de clivagem do DNA ................................ 51

4.2. INTERAÇÃO DOS COMPLEXOS COM CT-DNA .................... 59 4.2.1. Titulação espectrofotométrica (UV-Vis) ................ 59 4.2.2. Desnaturação térmica do DNA ............................. 62

4.2.3. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) .......... 63

5. CONCLUSÕES .................................................................. 66

6. PERSPECTIVAS ............................................................... 68

7. REFERÊNCIAS ................................................................. 69

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Ácido desoxirribonucléico

O ácido desoxirribonucléico (DNA) é formado por uma

sequência de nucleotídeos capaz de armazenar e transmitir a informação

genética de uma geração para outra. Os nucleotídeos são formados por

uma base nitrogenada (adenina, guanina, citosina ou timina), uma

desoxirribose e um fosfato, estes são ligados covalentemente por uma

ligação fosfodiéster, na qual o grupo 5´-fosfato de um nucleotídeo está

ligado ao grupo 3´-hidroxila do nucleotídeo seguinte. Em 1953, Watson

e Crick publicaram a estrutura tridimensional do DNA: duas cadeias

laterais de nucleotídeos torcidos na forma de uma dupla hélice, as duas

cadeias são unidas por associações fracas entre as bases, sendo duas

ligações de hidrogênio entre adenina e timina e três ligações de

hidrogênio entre guanina e citosina. O esqueleto hidrofílico dos grupos

fosfato e desoxirribose estão do lado de fora da dupla hélice

(GRIFFITHS et al., 2006; NELSON; COX, 2006).

A estrutura covalente das bases nitrogenadas da molécula de

DNA pode sofrer alterações espontâneas. Essas alterações ocorrem de

forma muito lenta, no entanto são extremamente importantes pela baixa

tolerância das células a estas modificações na informação genética. A

molécula de DNA pode sofrer desaminação dos grupos aminos

exocíclicos nas bases nucleotídicas, hidrólise da ligação N-ł-glicosídica

entre a base e a pentose e outras reações promovidas por radiação.

Químicos reativos desaminantes (ácido nitroso) e agentes alquilantes (S-

adenosilmetionina) também podem causar modificações no DNA, no

entanto a lesão oxidativa parece ser a maior causa de alterações na

molécula, sendo o radical hidroxila o principal responsável pelas lesões

oxidativas do DNA (NELSON; COX, 2006).

A constante de degradação espontânea do DNA em pH 7,0 a

25ºC é de ~10-11

s-1

(SREEDHARA; FREED; COWAN, 2000), a

estabilidade encontrada na molécula refere-se principalmente a

resistência à degradação das ligações fosfodiéster que fazem parte da

estrutura do DNA. A molécula de DNA é alvo de estudo em técnicas

bioquímicas, biotecnológicas e de biologia molecular e por isso torna-se importante o estudo de novas ferramentas de manipulação do DNA com

diferentes finalidades (COWAN, 2001; SREEDHARA; COWAN, 2001;

GRIFFITHS et al., 2006; NELSON; COX, 2006).

2

As nucleases catalisam a hidrólise do DNA e aceleram a reação

de 1012

a 1016

vezes em relação à hidrólise espontânea do DNA

(SIGMAN; MAZUMDER; PERRIN, 1993; KRÄMER, 1999;

NELSON; COX, 2006). O mecanismo mais aceito para hidrólise do

DNA catalisado pelas endonucleases ocorre pelo ataque nucleofílico do

oxigênio da água para formar um fosfato intermediário penta-

coordenado. Em seguida, a clivagem de P-O3´ ou P-O5´ fornece a cisão

da fita, liberando os terminais R-OH e R-O-PO3(H2), (LIU et al., 2004;

MANCIN et al., 2005). As nucleases promovem um ataque nucleofílico

à molécula de DNA preferencialmente pela coordenação de uma

molécula de água por um centro metálico da enzima. A presença de

metais nas nucleases está relacionada com o aumento de afinidade da

enzima pelos sítios de ligação e ao favorecimento cinético da reação

(DUPUREUR, 2008, XIE; et al, 2008). As nucleases são seletivas,

atuam em sequências específicas conservadas no DNA e estão presentes

em processos de reparação, degradação, recombinação e modificação da

estrutura de ácidos nucléicos (NICHOLSON, 1999; NELSON; COX,

2006).

1.2 Complexos metálicos e a molécula de DNA

Após a determinação da estrutura tridimensional do DNA e a sua

importância nos sistemas biológicos, o interesse no estudo da interação

entre pequenas moléculas e sequências específicas do DNA para o

controle da expressão gênica, sondas para diagnósticos e uso terapêutico

aumentou significativamente (PATRA, 2007). Pequenas moléculas,

como complexos metálicos, ligam-se ao DNA preferencialmente de três

formas identificáveis (DERVAN, 2001; ZEGLIS; PIERRE; BARTON,

2007) (figura 1). Uma das formas é interação eletrostática não específica

dos complexos com metais carregados positivamente e o esqueleto

carbono-fosfato do DNA carregado negativamente, esta forma de

ligação é a mais fraca. Outra forma é a ligação aos sulcos do DNA por

interações covalentes, eletrostáticas, ligações de hidrogênio, van der

Walls e hidrofóbicas. Os antibióticos antivirais distamicina e netropsina

são conhecidos como ligantes de sulco específicos em regiões A-T

(BAILLY; CHAIRS, 1998; NEIDLE, 2001). A terceira forma de

interação é a intercalação de moléculas planares entre os pares de base

do DNA. O brometo de etídio, a acridina e o azul de metileno são

agentes intercalantes de DNA devido às suas estruturas planares.

3

Figura 1: Formas de interação entre pequenas moléculas e a dupla

hélice de DNA.

O desenvolvimento de diversos complexos metálicos de transição

e de lantanídeos, baseados primeiramente em nucleases biológicas, com

capacidade de interação e/ou clivagem de DNA já foram reportados na

literatura (SIGMAN; CHEN, 1990; SIGMAN; MAZUMDER; PERRIN,

1993; HEGG; BURSTYN, 1998; ZHU et al., 1998; BRANUM; QUE

JR, 1999; KRÄMER, 1999; OTT; KRÄMER, 1999; BRANUM et al.,

2001a; COWAN, 2001; FRANKLIN, 2001; SREEDHARA; COWAN,

2001; LIU et al., 2004; JIANG et al., 2007; CAMARGO et al., 2008;

LIU; WANG, 2009).

A clivagem do DNA pode ocorrer pela fragmentação de seus

constituintes como as bases nitrogenadas, a desoxirribose ou as ligações

fosfodiéster. Os danos às estruturas do DNA ocorrem geralmente pela

oxidação da desoxirribose ou das bases, as quais possuem várias

posições susceptíveis a espécies reativas de oxigênio (EROs)(BREEN;

MURPHY, 1995; VALKO et al., 2007; CHEN et al., 2008a). A

hidrólise da ligação fosfodiéster, mecanismo pelo quais as nucleases

biológicas clivam o DNA, é outra forma de fragmentação da molécula.

De acordo com as características químicas dos complexos, estes

podem promover a clivagem do DNA por mecanismo hidrolítico,

4

oxidativo ou ambos. Quando a clivagem é hidrolítica (figura 2), os

centros metálicos podem coordenar moléculas de água facilitando a

interação com a ligação fosfodiéster do DNA e o ataque nucleofílico ao

átomo de fósforo (OTT; KRÄMER, 1999; LIU et al., 2004; LIU;

WANG, 2009). No mecanismo oxidativo ocorre a produção de espécies

radicalares a partir de uma reação de oxi-redução entre o núcleo

metálico e um co-reagente como o oxigênio ou o nitrogênio. As espécies

reativas produzidas podem se difundir e atacar preferencialmente as

bases nitrogenadas e a desoxirribose do DNA (SIGMAN;

MAZUMDER; PERRIN, 1993; ARMITAGE, 1998; POGOZELSKI;

TULLIUS, 1998), a quebra da fita do DNA ocorre pela abstração de um

átomo de hidrogênio da desoxirribose, a qual produz um radical

centrado no carbono do açúcar que pode sofrer rearranjo

(POGOZELSKI; TULLIUS, 1998).

Figura 2. Mecanismo de clivagem de DNA por via hidrolítica. Etapa 1:

ataque nucleofílico do oxigênio de uma molécula de hidroxila ao fosfato

ligado à pentose do ácido nucléico, gerando um fosfato intermediário

penta-coordenado. Etapa 2: ruptura da ligação fosfodiéster em P-O5’ ou

P-O3’ (MANCIN et al., 2005) adaptado por Bortolotto (2011).

5

1.2.2 Fotoclivagem de DNA por complexos metálicos

A fotoclivagem de DNA é realizada por complexos metálicos que

apresentem ligantes heterocíclicos capazes de absorver luz. Os

processos possíveis após a fotoativação de um agente estão

demonstrados no diagrama de Jablonski (figura 3) (SZACIłOWSKI et

al., 2005).

Figura 3: Diagrama de Jablonski demonstrando os processos químicos

envolvidos na fotoexcitação de elétrons. Adaptado de Szaci łowski e

colaboradores (2005).

Quando uma molécula absorve um fóton de luz, o elétron

presente nesta transição ganha energia e passa a ocupar um orbital mais

energético. A molécula neste momento encontra-se em um estado

excitado (singlete). Este estado tem uma meia-vida muito curta e pode

decair para o estado não ativado com a emissão de um fóton

(fluorescência). O estado singlete também pode sofrer uma conversão

interna inter-sistema para o estado triplete. O estado triplete possui uma

meia-vida maior e tende a ser importante em várias reações de

fosforescência (OCHSNER, 1997). O estado triplete pode reagir com o

oxigênio molecular para produzir EROs por duas reações diferentes.

Reação Tipo 1: O oxigênio molecular é reduzido e forma o radical

superóxido (O2ł-

), o qual dismuta para peróxido de hidrogênio (H2O2) e

pode formar o radical hidroxila (OHł) na presença de metais de

transição por reações de Fenton. Reação Tipo 2: envolve a excitação do

oxigênio molecular gerando o oxigênio singlete (1O2).

A fotoclivagem de ácidos nucléicos é vantajosa em relação à

hidrólise ou oxidação dependente de um co-fator, pois a reação só será

iniciada quando as amostras forem irradiadas. Esta característica é

essencial para moléculas utilizadas na terapia fotodinâmica (PDT, do

6

inglês, Photodynamic Therapy) (figura 4), a qual é utilizada contra

diversos tipos de tumores e apresenta menos efeitos colaterais por ter

ação apenas na região fotoativada e não ser funcional na ausência de luz

(CHAKRAVARTY, 2006; PATRA, 2007).

Figura 4: Esquema de ação de um fármaco utilizado na terapia-

fotodinâmica. (A): Administração do fármaco; (B): concentração do

fármaco na região do tumor; (C): fotoativação do fármaco pela luz e

(D): destruição seletiva do tumor.

1.2.3 Clivagem de DNA por complexos de cobre derivados de

fenantrolina

Diversos estudos relatam o uso de complexos de cobre(II) com

fenantrolina ou seus derivados (figura 5) como ligantes. A utilização de

7

bases heterocíclicas planares em complexos metálicos sempre foi

investigada por suas propriedades eletrônicas, reatividade química

diversificada e uma estrutura peculiar que resulta em interações não

covalentes com o DNA. A fenantrolina e suas bases são conhecidas por

apresentarem motivos de quinoxalina fotoativados por luz UV gerando

estados excitados na molécula que poderão reagir com o oxigênio

molecular e causar dano oxidativo ao DNA (TOSHIMA et al., 2002;

DHAR; NETHAJI; CHAKRAVARTY, 2005b; MUKHERJEE et al.,

2005; SASMAL et al., 2007; ROY et al., 2008a; ROY et al., 2010).

Figura 5: Estrutura da fenantrolina (1) e seus derivados dpq (2) e dppz

(3) (ROY et al., 2010).

O primeiro complexo de cobre, bis(phen)Cu(I), relatado como

“nuclease química” apresentou clivagem de DNA na presença de H2O2 e

um grupo tiol (SIGMAN et al., 1979). Complexos fotoativados possuem

a vantagem de não precisarem de co-reagentes redutores como H2O2

para sua ativação (CHAKRAVARTY, 2006), além desta característica

apresentam benefícios, já descritos no item anterior, em aplicações

terapêuticas. Neste sentindo, a busca por novos complexos de cobre (II)

com ligantes fotoativados é contínua. Roy e colaboradores (2010)

descreveram a fotoclivagem de DNA e atividade antitumoral por

complexos de cobre(II) com bases de fenantrolina. Chen e colegas

(2011) também demonstraram a clivagem de DNA fotoinduzida em luz

UV por dois complexos de cobre(II) com ligantes dpq e dppz:

[Cu(acac)(dpq)Cl] e [Cu acac)(dppz)Cl] (figura 6). Nosso grupo relatou

a fotoclivagem de DNA por quatro complexos de cobre(II) e

fenantrolina ou seus derivados em luz UV e laser vermelho ( ł = 635

nm) (SOUZA et al., 2010a).

8

Figura 6: Estrutura do complexo [Cu (acac) (dpq)Cl] (1) e [Cu (acac)

(dppz)Cl] (2) (CHEN et al., 2011).

1.2.4 Complexos de lantanídeos

Íons de lantanídeos e complexos dos mesmos são conhecidos por

sua capacidade de hidrólise de dinucleotídeos e DNA, algumas das

características que conferem esta atividade são: forte acidez de Lewis,

altas densidades de carga, altos números de coordenação, ausência de

química redox e fortes labilidades (FRANKLIN, 2001). Grandes

quantidades do íon de Ce(IV) hidrolisam de forma eficiente

didesoxirribonucleotídeos e promovem quebra simples do DNA

(KOMIYAMA et al., 1993; TAKASAKI; CHIN, 1994; RAMMO et al.,

1996; SUMAOKA et al., 1997; SUMAOKA; AZUMA; KOMIYAMA,

1998). Alguns complexos de Ce (IV), como o Ce2(HXTA) (HXTA = 5-

metil-2-hidroxi-1,3-xilano-ł,ł-diamino-N,N,N’,N’-ácido tetra-acético)

pode clivar a dupla fita de DNA na constante de aproximadamente 0,5h-

1, correspondendo a uma meia vida 1,4 horas para o DNA com apenas

10 µM do complexo (BRANUM et al., 2001b). Curiosamente, o íon de

Ce(III) promove a fragmentação do DNA por geração de radicais livres

na presença de H2O2, esse mecanismo diverge da característica

hidrolítica atribuída para o íon de Ce(IV)(HECKERT; SEAL; SELF,

2008).

Após esse estudo, vários outros reportam o uso de Ce(IV)

conjugado a oligonucleotídeos ou ácido nucléico peptídico (PNA) para

se obter a hidrólise específica do DNA (YAMAMOTO; TSUBOI;

KOMIYAMA, 2003; CHEN et al., 2004; YAMAMOTO et al., 2004;

CHEN; KOMIYAMA, 2005; KOMIYAMA et al., 2005; YAMAMOTO

et al., 2007; LÖNNBERG; SUZUKI; KOMIYAMA, 2008). Neste

contexto, foram realizados alguns estudos utilizando peptídeos com

sítios de ligação a íons de Eu(III) e Ce(IV) para se criar metalopeptídeos

com atividade de nuclease (SIRISH; FRANKLIN, 2002; KOVACIC;

9

WELCH; FRANKLIN, 2003; LIM; FRANKLIN, 2006; WONG-

DEYRUP; KIM; FRANKLIN, 2006). Complexos de outros lantanídeos

como Eu(III), La(III), Nd(III), Pr(III) e Gd(III) são capazes de hidrolisar

o DNA (RITTICH et al., 2004; CAMARGO et al., 2008; CAMARGO et

al., 2010a; CAMARGO et al., 2010b). No entanto novos aspectos do

mecanismo de clivagem dos lantanídeos foram recentemente

destacados. Novos complexos de La(III) e Gd(III) (HUSSAIN et al.,

2010) assim como de Eu(III) contendo derivados de fenantrolina

demonstraram fotoclivagem de DNA quando irradiados com luz UV-A

(CHEN et al., 2010). Nos dois estudos sequestradores de radicais livres

inibiram a atividade do complexo sugerindo a participação de EROs no

evento de clivagem do DNA. Esses estudos assinalam os complexos de

lantanídeos como agentes de clivagem oxidativa do DNA e não apenas

como agentes hidrolíticos.

Figura 7: Exemplos de complexos de lantanídeos: [Tb(H2L)-

(NO3)(H2O)3]2+ (A), [Eu(H2L)(NO3)(H2O)3]2

+ (B) e [Gd(C34H41N6O8)]

2+ (C) (CAMARGO et al., 2008; CAMARGO et al., 2010b).

10

1.3 Aplicações dos complexos metálicos

Complexos metálicos que interagem e/ou clivam o DNA podem

ser utilizados como ferramentas em várias metodologias:

desenvolvimento de DNA recombinante, modelagem de enzimas de

restrição, aplicações terapêuticas, sequenciamento de DNA,

mapeamento genético e footprinting (BASHKIN, 1999; OTT;

KRÄMER, 1999; CHAKRAVARTY, 2006).

A técnica de footprinting ou photo-footprinting pode ser

melhorada pelo uso de complexos metálicos que produzem fragmentos

de clivagem muito menores e menos específicos que os gerados pela

enzima DNAse I utilizada tradicionalmente, o que promove um padrão

de DNA clivado de melhor resolução (ARMITAGE, 1998).

Complexos metálicos que apresentam mecanismo oxidativo

podem ser utilizados para investigar o processo de reparação do DNA

quando este é danificado por EROS (KIMURA; SAKAGUCHI, 2006;

SCHLACHER et al., 2006), assim como os que apresentam atividade

antimicrobiana podem ser aprimorados para utilização como fármacos

(EFTHIMIADOU et al., 2007; PATIL et al., 2011; RAMAN;

POTHIRAJ; BASKARAN, 2011).

Também são encontrados complexos com atividade antitumoral

(COLLINS et al., 2000; AFRASIABI et al., 2004), Fernandes e

colaboradores (2006), relatam a clivagem de DNA e ação antitumoral in

vitro para um complexo de cobre(II). Além disso, complexos com

atividade de fotoclivagem de DNA, atóxicos na ausência de luz, são

conhecidos por apresentarem efeitos localizados em aplicações

terapêuticas tornando-se úteis na terapia fotodinâmica (PDT)

(CHAKRAVARTY, 2006). Complexos de cobre(II) com atividade de

clivagem de DNA em luz vermelha, faixa de ação da PDT, também já

foram reportados (DHAR; NETHAJI; CHAKRAVARTY, 2005a;

PATRA et al., 2009; LAHIRI et al., 2010).

Complexos metálicos com capacidade de interação com o DNA,

porém sem atividade de clivagem, podem ser utilizados como sondas

(ZEGLIS; PIERRE; BARTON, 2007). Os mais cotados para essa

finalidade são os complexos de lantanídeos, devido à característica

luminescente pertencente aos íons desse grupo (MARUYAMA et al.,

2002). Karhunem e colegas (2009) descreveram a formação de um

complexo misto de Eu(III) com forte emissão de sinal luminescente

apenas quando os oligonucleotídeos eram hibridizados. Essa

metodologia pode ser empregada com eficiência para o estudo de DNA

11

complementar (figura 8). Complexos de Eu(III) e Tb(III) promoveram a

coloração seletiva de cromossomos em células mitóticas o que permite a

visualização dos cromossomos mitóticos de forma não invasiva. A baixa

toxicidade química e a capacidade de corar o DNA mitótico fazem

desses complexos excelentes sondas para estudos em células vivas

(LAW et al., 2010).

Figura 8: Ilustração esquemática da hibridização de oligonucleotídeos

dirigida pela complexação do íon e a sonda. A: sem a hibridização dos

oligonucleotídeos as sondas não são luminescentes. B: Formação do

complexo pela hibridização ao oligonucleotídeo alvo. O complexo é

excitado em 340 nm e emite luminescência de longa-vida em 615 nm,

modificado de Karhunem e colegas (2009).

12

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Analisar a interação de CT-DNA e clivagem de DNA

plasmidial por três complexos metálicos de cobre(II) e um

complexo de térbio(III).

2.2. Objetivos específicos

Analisar a clivagem de DNA pelos complexos de cobre(II) e

Tb(III) sob diferentes condições reacionais: concentração dos

complexos, presença e ausência de luz UV-A e influência da

força iônica.

Determinar o mecanismo de ação dos complexos na clivagem

de DNA por meio da adição de sequestradores de radicais livres

e D2O às reações e testes na ausência de oxigênio.

Analisar o modo de clivagem de DNA pelos complexos de

cobre(II) e térbio(III) na presença de inibidores específicos do

sulco menor e maior do DNA.

Determinar a cinética das reações de clivagem de DNA

plasmidial pelos complexos de cobre(II) e térbio(III).

Analisar a interação dos complexos de cobre(II) com DNA por

meio de titulação espectrofotométrica, desnaturação térmica de

DNA e espectroscopia de dicroísmo circular (CD).

13

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Complexos metálicos

Três complexos ternários mononucleares de cobre(II) foram

analisados para interação e clivagem de DNA: [Cu(acac)dppz](ClO4)

(1), publicado por Chen e colaboradores (2011),

[Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O (2) e [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O (3),

nos quais “bpma” corresponde ao ligante N-bis-(2-piridilmetil)-amina,

“acac” a acetilacetonato, “dppz” a dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina,

“diaza” a 6-amino-6-metilperhidro-1,4-diazepina e “dpq” a dipirido[3,2-

f:2',3'-h]quinoxalina. Estes complexos foram sintetizados pelo Mestre

Everton de Britto Policarpi sob orientação do prof. Dr. Adaílton J.

Bortoluzzi do Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia do

departamento de Química da Universidade do Federal de Santa

Catarina. Um complexo mononuclear de térbio(III) também foi utilizado

para os testes de clivagem de DNA: [Tb(tdzp)(acac)3] (4), no qual tdzp:

[1,2,5]thiadiazol[3,4-f][1,10]fenantrolina e acac: acetilacetona

(GALLARDO et al., 2011). Esse complexo foi sintetizado por Hugo

Gallardo e Gilmar Conte no INCT-Catálise, Departamento de Química

da Universidade Federal de Santa Catarina.

14

Figura 9: (A) Estrutura cristalina do complexo [Cu(bpma)(dppz)]

(ClO4).0,67H2O. (B) Estrutura cristalina do complexo [Cu(acac)(dppz)](ClO4). (C) Estrutura cristalina do cátion do complexo,

[Cu(diaza)(dpq)]+. As figuras das estruturas foram gentilmente cedidas

pelo Mestre Everton de Britto Policarpi sob orientação do prof. Dr.

Adaílton J. Bortoluzzi.

15

Figura 10: Estrutura cristalina do complexo [Tb(tdzp)(acac)3]

(GALLARDO et al., 2011).

3.2. Extração do DNA plasmidial pBSK II

O substrato utilizado para os testes de clivagem de DNA

plasmidial foi o plasmídeo pBSK-II (Stratagene, USA) de 1961 pares de

base (pb). O DNA plasmidial pode apresentar três conformações

distintas em gel de agarose. A forma superenovelada do DNA

plasmidial (forma I, F I) é altamente tensionada, quando sofre uma

quebra simples (em apenas umas das fitas) ocorre o afrouxamento da

estrutura superenovelada e o DNA plasmidial assume a forma circular

aberta (forma II, F II). Se houver uma segunda quebra na fita oposta,

próxima à primeira quebra, há a formação de uma quebra dupla e o

DNA plasmidial fica na sua forma linear (forma III, F III). As três formas possuem mobilidade eletroforéticas diferentes (figura 3),

portanto podem ser separadas por eletroforese em gel de agarose e então

analisada a quantidade e a forma de DNA clivado.

16

Figura 11: Ilustração e micrografia das três formas do DNA plasmidial

(acima) e a sua diferenciação após eletroforese em gel de agarose

(abaixo) (BORTOLOTTO, 2011).

Para obtenção de quantidades suficiente do plasmídeo pBSK-II

para realização dos testes de clivagem de DNA este foi inserido em

Escherichia coli DH5ł por transformação utilizando o método de

CaCl2/choque térmico. Uma colônia transformante foi cultivada em 10

mL de meio LB suplementado com ampicilina (100 µg/mL) por 8 horas,

37°C a 200 rpm. Foram transferidos 500 µL deste pré-cultivo para 250

mL de meio LB suplementado com ampicilina, o qual foi cultivado por

16 horas, 37°C a 200 rpm. Após a multiplicação celular, a cultura foi

centrifugada a 3500 rpm por 15 minutos a 4°C e o DNA foi purificado

segundo o kit de extração e purificação de DNA plasmidial HiSpeed TM

Plasmid Maxi Kit (Qiagen). A quantificação de DNA plasmidial

extraído foi feita por espectrofotometria UV-Vis (A260 = 1 = 50 µg mL-1

de DNA).

3.3. Clivagem de DNA plasmidial

Neste trabalho foram realizados testes de clivagem de DNA em

reações de 20 µL contendo: 400 ng do plasmídeo pBSKII

17

superenovelado (~30 µM de DNA em pb); tampão Tris-HCl (10

mM, pH 7,4); e os complexos 1, 2 e 3 em diferentes concentrações. Para

o complexo 4 o tampão utilizado nas reações foi PIPES (pH 7 a 25 mM)

e NaCl (5 mM). A concentração final de acetonitrila (CH3CN), solvente

dos complexos, foi de 25%. O período de reação foi de 5 minutos sob

irradiação de luz UV-A ( ł = 365 nm) de um transluminador (UVP

USA). Essa condição foi determinada como padrão reacional após testes

em presença e ausência de luz UV-A.

As reações de clivagem do DNA plasmidial foram interrompidas

pela adição de tampão de corrida 6X concentrado (EDTA 0,25 M,

glicerol 50% e azul de bromofenol 0,01% - pH 8,0). As amostras foram

armazenadas a -20°C e posteriormente submetidas à eletroforese em gel

de agarose. (1%) contendo brometo de etídio (0,3 łg mL-1

) por 1 hora e

20 minutos a 90 V em tampão TBE 0,5x (Tris 44,5 mM, ácido bórico

44,5 mM, EDTA 1 mM - pH 8,0).

Os géis foram fotografados utilizando-se um sistema de foto-

documentação DigiDoc-It (UVP, USA) e as frações de cada forma de

DNA foram quantificadas por densitometria utilizando o software

KODAK Molecular Imaging Software 5.0 (Carestream Health,

USA). Como o intercalamento do brometo de etídio com a forma

superenovelada do DNA plasmidial é mais difícil, há uma menor

emissão de fluorescência pela forma I em relação às formas II e III. A

quantidade real de DNA superenovelado é corrigida multiplicando-se o

valor encontrado por 1,42, a proporcionalidade dos valores obtidos para

as demais formas também foi corrigido (BERNADOU et al., 1989).

3.3.1. Efeito da concentração do complexo

A atividade dos complexos foi analisada primeiramente quanto à

concentração dos mesmos nas reações, tanto na presença de luz UV-A

como no escuro. Reações controles, na ausência dos complexos, nas

mesmas condições reacionais também foram realizadas para observar a

degradação espontânea do DNA. A partir destes resultados foram

escolhidos os tempos reacionais e concentrações de complexos,

adequados para observação da clivagem do DNA, utilizados nos

próximos testes.

3.3.2. Atividade do sal de cobre(II) e dos ligantes

Ensaios de clivagem substituindo os complexos de Cu(II) por

seus ligantes isolados, dpq e dppz, e pelo sal de Cu(II) foram realizados

como controle para os experimentos padrão de clivagem. Os ensaios

18

foram realizados na presença e ausência de luz UV-A nas mesmas

condições reacionais padrão. Controles livres de ligantes ou CuCl2

também foram realizados.

3.3.3. Atividade do sal de térbio(III) e dos ligantes

Ensaios de clivagem substituindo o complexo de Tb(III) por seu

ligante isolado, tdzp, e pelo sal de Tb(III) também foram realizados

como controle para os experimentos padrão de clivagem. Os ensaios

foram realizados na presença e ausência de luz UV-A nas mesmas

condições reacionais padrão. Controles livres dos ligantes ou do sal de

Tb(III) também foram realizados.

3.3.4. Efeito da força iônica

O efeito da força iônica na clivagem de DNA plasmidial pelos

complexos foi verificado pela adição de concentrações crescentes (50,

100, 200 e 300 mM) de cloreto de sódio (NaCl) às misturas reacionais.

As reações foram testadas na presença de luz UV-A nas condições

padrão já citadas no item 3.3.


Para compreensão do mecanismo de clivagem do DNA (se por

via hidrolítica ou oxidativa), foram adicionados às reações uma série de

inibidores de radicais livres. Foram utilizados: 10% (v/v) de DMSO

(dimetil-sulfóxido), sequestrador do radical hidroxila (OHł); 10 mM de

KI (iodeto de potássio), inibidor da geração de peróxidos (R-O-OH); 10

U da enzima SOD (superóxido-dismutase), seqüestrador do radical

ânion superóxido (O2ł-

); 10mM de NaN3 (azida de sódio), sequestrador

de oxigênio singlete (1O2); 500 µM de TEMPO (N-oxil-2,2,6,6-

tetrametilpiperidina), um sequestrador de radicais oxigênio-, metal- e

carbono-centrados. Além dos sequestradores de radicais livres também

foram realizados testes com 70% (v/v) de D2O, a qual é conhecida por

aumentar o tempo de meia-vida do oxigênio singlete. Esses ensaios

foram realizados sob irradiação UV-A de acordo com as condições

reacionais padrão. Para o complexo 4 não foram realizados testes em

D2O.

3.3.6. Efeito da presença e ausência de oxigênio

Com o intuito de verificar qual a influência do oxigênio

molecular na clivagem do DNA pelos complexos, foram realizados

19

testes de clivagem, nas condições padrão, porém na ausência de

oxigênio, em atmosfera de argônio.

As soluções foram preparadas com água desoxigenada. O

preparo da água desoxigenada foi realizado da seguinte forma: a água

foi submetida à agitação sob vácuo, para eliminação das bolhas de ar e

em seguida foi borbulhada com argônio. Essa água permaneceu em

atmosfera de argônio até o momento do preparo das soluções e reações

de clivagem (FISCHER, 2010). As soluções e misturas reacionais foram

preparadas em uma “glove bag” (modelo X-17-17, 12R). As reações

foram então expostas a luz UV-A por cinco minutos. As mesmas

misturas reacionais também foram realizadas na presença de oxigênio.

Também foi realizado um controle de Fe (EDTA)2-

(100 µM) (NETTO;

STADTMAN, 1996) ou CuCl2 e ácido 3-mercaptopropriônico (MPA),

pois esses sistemas clivam o DNA somente na presença de oxigênio

molecular, sob irradiação UV-A por 5 minutos e 4 horas na ausência de

luz UV-A.

3.3.7. Efeito dos ligantes dos sulcos do DNA

A distamicina e o verde de metila são moléculas que se ligam

especificamente ao sulco menor e maior do DNA, respectivamente

(VAN DYKE; HERTZBERG; DERVAN, 1982; KIM; NORDEN,

1993). A inibição da clivagem demonstra por qual dos dois sulcos

ocorre a interação e consequente clivagem. Então, para verificar se os

complexos atuam preferencialmente por algum dos sulcos do DNA,

foram adicionados ao DNA, distamicina (50 łM) ou verde de metila

(50 łM), 30 minutos antes da adição dos complexos nas condições

reacionais padrão.

3.3.8. Cinética de clivagem do DNA

Para os testes cinéticos de clivagem de DNA plasmidial com os

complexos 1, 2, 3 as condições reacionais determinadas foram: [DNA] =

400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 100 µM. Tempo de

reação: 75 segundos em luz UV-A e 9h no escuro a 37°C. Após o início

das reações uma alíquota foi retirada a cada 15 segundos para as reações

em luz UV-A e em 0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h e 9 h para as reações no escuro.

As condições reacionais para o complexo 4 foram: [DNA] = 400 ng; 25

mM de PIPES, pH 7; [complexo]: 100 µM. Tempo de reação: 5 minutos

em luz UV-A e 48 h no escuro a 37°C. Após o início das reações uma

alíquota foi retirada a cada um minuto para as reações em luz UV-A e

em 0 h, 6 h, 10 h, 24 h, 34 h e 48 h para as reações no escuro. Controles

20

reacionais, na ausência dos complexos também foram realizados para se

observar a degradação espontânea do DNA.

Como as condições reacionais testadas apresentaram excesso de

catalisador (complexo) em relação à concentração do substrato (DNA),

o perfil cinético de clivagem para essa reação foi considerado como de

pseudo-primeira-ordem. As constantes observadas de clivagem de DNA

(kobs) foram determinadas a partir da representação gráfica do plote do

logaritmo neperiano da fração intacta do DNA (F I) em função do tempo

reacional (BORTOLOTTO, 2011).

3.4. Interação dos complexos com CT-DNA

Para avaliação da interação do complexo com DNA, foram

realizadas análises espectrofotométricas. O DNA utilizado para esses

ensaios foi o CT-DNA (Calf Thymus DNA – DNA do timo de bezerro)

tipo XV (Sigma, USA). O CT-DNA é um DNA linear formado por uma

mistura de diferentes fragmentos de DNA genômico dupla-fita. Devido

as suas propriedades bioquímicas e físico-químicas já definidas essa é a

molécula de DNA mais utilizada em estudos de interação complexo-

DNA (BORTOLOTTO, 2011). Os testes a seguir foram realizados com

o complexo 1, 2 e 3.

3.4.1. Titulação espectrofotométrica (UV-Vis)

Para analisar a interação dos complexos com o CT-DNA foram

realizadas titulações espectrofotométricas. Essa técnica é utilizada, pois

quando o DNA interage com pequenas moléculas o espectro UV-Vis

das mesmas é modificado (BORTOLOTTO, 2011). O espectro UV-Vis

dos complexos e as titulações com o CT-DNA foram realizados em um

espectrofotômetro Ultrospec 2100 (Amersham Biosciences USA).

Para os complexos 1 e 2, a concentração dos complexos utilizada

para a titulação foi de 10 µM e para o complexo 3 foi de 25 łM. As

titulações ocorreram em 5 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 25% (v/v) de

CH3CN com concentrações crescentes de CT-DNA (0,8 a 14 µM). As

varreduras foram na faixa de 200 a 600 nm, a 37°C logo após a adição

do CT-DNA. O controle foi realizado com uma amostra contendo

somente CT-DNA tamponado. Os espectros do controle foram

subtraídos dos espectros das titulações para eliminar o espectro de

absorção do DNA presente entre 200 e 300nm.

A constante intrínseca de ligação ao DNA (Kb) foi obtida pela

equação 1, abaixo, na qual: łf e łb são as absortividades molares do

complexo livre e do totalmente ligado ao DNA, respectivamente e ła é

21

a absortividade da amostra após cada adição de CT-DNA. O valor de

Kb foi obtido da razão entre o coeficiente angular e linear do gráfico de

[DNA] / ( ła - łf) por [DNA] (WOLFE; SHIMER; MEEHAN, 1987;

PYLE et al., 1989; BORTOLOTTO, 2011).

Equação 1:

)(

1

)(

[DNA]

)(

[DNA]

fbbfbfa K

3.4.2. Desnaturação térmica do DNA

A dupla-hélice do DNA pode ser desnaturada quando submetida

a extremos de pH ou temperaturas elevadas pelo rompimento das

ligações de hidrogênio entre as bases pareadas. Como resultado ocorre o

empilhamento das bases nitrogenadas e um desenovelamento da dupla

hélice formando duas fitas separadas ao longo da molécula. A interação

entre as bases nitrogenadas do DNA diminui a absorção de luz UV pela

molécula em relação a uma molécula de DNA simples fita. A

desnaturação do DNA pode então ser detectada pelo aumento da

absorção de luz (efeito hipercrômico) (NELSON; COX, 2006). A

temperatura necessária para que metade das moléculas de DNA seja

desnaturado é chamada de temperatura média de desnaturação (Tm),

quando outra molécula se liga ao DNA a Tm pode variar.

A partir desses conceitos as Tm do CT-DNA na ausência e na

presença dos complexos foram calculadas. Os ensaios foram realizados

no espectrofotômetro de UV-Vis Ultrospec 2100 (Amersham

Bioscienses, USA). 100 µM de CT-DNA não tratados e tratados com 10

µM dos complexos permaneceram 10 minutos na temperatura de início

do experimento (40 ºC). A temperatura foi então aumentada em

1°C/minuto até 90 °C. O tampão utilizado foi o tampão fosfato (1 mM)

pH 7,2 e 2 mM de NaCl (ARIAS et al., 2009; GARCÍA-GIMÉNEZ

et al., 2009; BORTOLOTTO, 2011). A Tm foi calculada pelo ponto

médio da progressão não linear sigmoidal de Boltzmann e confirmada pela primeira derivada da A260 nm pela temperatura.

22

3.4.3. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)

A técnica de dicroísmo circular (CD, do inglês, circular

dichroism) é muito utilizada para determinar a estrutura secundária de

proteínas e a conformação helicoidal do DNA (EFTHIMIADOU et al.,

2007; GHARAGOZLOU; BOGHAEI, 2008; SHENG et al., 2008) em

solução. O espectro de CD da dupla hélice direita na forma B do DNA

possui sinais característicos: uma banda positiva em 275 nm devido ao

empilhamento das bases do DNA e uma banda negativa em 245nm

referente à helipticidade direita do DNA. As mudanças observadas nas

duas bandas características de CD do DNA correspondem a mudanças

na estrutura do mesmo quando existe interação com outras moléculas

(CHEN et al., 2008b).

Os ensaios de CD foram realizados em um espectropolarímetro

de dicroísmo circular modelo J-815 (JASCO, USA). Os espectros de CD

foram obtidos a partir de uma amostra de 100 µM de CT-DNA em 5

mM de Tris-HCl (pH 7,4), esta foi titulada com concentrações

crescentes de complexos (5 a 25 µM). As varreduras foram realizadas

entre 220 e 400 nm, a 37°C, logo após a adição dos complexos.

23

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Clivagem de DNA plasmidial

4.1.1. Efeito da concentração do complexo

A clivagem de DNA plasmidial pelos complexos de Cu(II) e

Tb(III) foram analisadas em concentrações crescentes de complexos, na

presença e ausência de luz UV-A. Os resultados obtidos na presença de

luz UV-A podem ser observados nas figuras 12, 13, 14 e 15.

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

[complexo] M 0 2,5 5 10 20

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)

Figura 12: Clivagem de DNA plasmidial pelo complexo 1 em

diferentes concentrações. Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 10

mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 0 a 20 µM. Tempo de reação: 5

minutos em luz UV-A.

24

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

[complexo] M 0 2,5 5 10 20

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





25

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

[complexo] M 0 2,5 5 10 20

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





Os três complexos de Cu(II) apresentaram atividade de clivagem

de DNA plasmidial dependente da concentração do complexo. Através

dos resultados obtidos observamos maior atividade de clivagem de DNA

com o complexo 1. Na concentração de 5 µM e 5 minutos de irradiação

UV-A este complexo foi capaz de produzir aproximadamente 60% de F

II e em 20 µM, 80% de F II e 16% de F III. No entanto o complexo 2

apresentou 66% de F II apenas na concentração de 20 µM e não foi

capaz de clivar o DNA em F III nas condições testadas. O complexo 3

começa clivar o DNA em F III a partir do tratamento com 10 µM e no

tratamento com 20 µM produziu-se 84% de F II e 7% de F III.

Souza e colaboradores (2010) apresentaram resultados de

clivagem de DNA utilizando complexos de Cu(II) com ligantes dpq

similares aos encontrados pelo complexo 1 porém em 15 minutos de

exposição a luz UV e 12,5 µM de complexo. Patra, Nethaji e

Chakravarty (2007), descrevem complexos de Cu(II) com ligantes dpq

ou dppz capazes de clivar o DNA com eficiência similar aos resultados

26

mostrados para os complexos 1 e 3, porém em maior tempo de

exposição a luz UV (1 hora) e maior concentração (50 µM).

A atividade de clivagem de DNA plasmidial pelo complexo 1 já

foi reportada na literatura, Chen e colaboradores (2011), descrevem a

formação de 92% de F II após 1 hora de exposição à luz UV-A com 0,2

µM do complexo. No trabalho mencionado não é citada a capacidade da

luz UV-A na qual os testes foram realizados, o tempo de exposição à luz

UV-A foi 12 vezes maior e a concentração do complexo foi 100 vezes

menor por isso. Uma comparação exata não pode ser realizada, já que as

três variáveis são importantes para a eficiência de clivagem dos

complexos.

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F I

[complexo] M 0 10 25 50 100

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)



mM de PIPES pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 0 a 100 µM. Tempo de

reação: 5 minutos em luz UV-A.

27

O complexo 4 também apresentou clivagem de DNA plasmidial

dependente da concentração do complexo. Na presença de 50 µM do

complexo foram observadas 40% de F II e 5 % de F III. Estudos com

complexos de Gd(III) e La(III) registraram fotoclivagem de DNA em

luz UV-A (6W) durante 2 horas de reação (HUSSAIN et al., 2011).

Complexos de Eu(III) também demonstraram fotoclivagem de DNA,

porém de forma menos eficiente que a observada neste trabalho (CHEN

et al., 2010).

As figuras 16, 17, 18 e 19 mostram os resultados obtidos com

diferentes concentrações dos complexos 1, 2 e 3 na ausência de luz.

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

[Complexo] M: 0 2,5 5 10 20

F III

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)



mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 0 a 20 µM. Tempo de reação: 8h

na ausência de luz a 37°C.

28

0

20

40

60

80

100

F II

F I

[Complexo] M: 0 2,5 5 10 20

F I

F II

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





29

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

[Complexo] M: 0 2,5 5 10 20

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





A partir dos resultados obtidos podemos observar que a atividade

de clivagem na ausência de luz também é dependente da concentração

do complexo, porém a clivagem foi reduzida para os três complexos e

nenhum deles foi capaz de clivar o DNA em ambas as fitas (F III) nestas

condições.

Complexos de Cu(II) com ligantes dpq e dppz reportados na

literatura não apresentaram clivagem de DNA quando as reações foram

incubadas por 15 minutos com 12,5 µM de complexo (SOUZA et al.,

2010a), por 30 minutos e 50 µM de complexo (PATRA; NETHAJI;

CHAKRAVARTY, 2007) ou por 30 minutos e 5 µM de complexo

(PATRA et al., 2008) na ausência de fotoativação. Para o complexo 1, Chen e colaboradores (2011) apontam esse complexo como

praticamente inativo na ausência de luz.

30

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

[Complexo] M 0 10 25 50 100

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)



mM de PIPES pH 7; NaCl 5 mM; [complexo]: 0 a 100 µM. Tempo de

reação: 24h na ausência de luz a 37°C.

Na ausência de luz UV-A o complexo 4 foi incapaz de promover

a clivagem de DNA. Esse resultado está de acordo com o observado por

nosso grupo com o complexo [Fe(tdzp)3] (SOUZA et al., 2010b)

possuindo o mesmo ligante do complexo 4. Como o centro metálico é

diferente podemos sugerir que a atividade de fotoclivagem pode estar

relacionada ao ligante tdzp.

31

4.1.2. Atividade do sal de cobre(II) e dos ligantes dpq e dppz

Este ensaio foi realizado para descobrirmos o efeito do metal e

dos ligantes na clivagem de DNA plasmidial. A atividade de clivagem

de DNA do sal de cobre(II) sob luz UV-A está apresentado na figura 20.

Soluções homogêneas dos ligantes dos complexos não foram obtidas

devido à insolubilidade desses compostos e por esse motivo os testes

não foram realizados. A partir do resultado apresentado na figura 20

podemos assumir que a fragmentação do DNA não é realizada pelo

cobre de forma isolada, já que não se observou clivagem de DNA nos

testes com CuCl2 nas mesmas condições reacionais testadas para os

complexos. Diversos trabalhos relatam ausência de atividade dos

ligantes dppz e dpq, nas concentrações de 5 µM fotoirradiados por UV-

A durante trinta minutos (PATRA et al., 2008), 5 µM fotoirradiados por

UV-A durante uma hora (PATRA et al., 2009), 50 µM fotoirradiados

por UV-A durante uma hora (PATRA; NETHAJI; CHAKRAVARTY,

2007), 3,5 µM em luz UV-A por uma hora (CHEN et al., 2011). Os

ensaios dos trabalhos citados também foram realizados em tampão Tris-

HCl pH 7,2. Isso sugere que a clivagem de DNA observada pela

atividade dos complexos não é ocasionada pelo ligante dpq ou dppz

isolados dos complexos.

32

0

20

40

60

80

100FI

FII

FIII

F II

F I

[CuCl2] 0 2,5 5 10 20

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)

Figura 20: Atividade do CuCl2 nas mesmas condições testadas para os

complexos 1, 2 e 3. [DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4;

[CuCl2]: 2,5 a 20 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

4.1.3 Atividade do sal de térbio(III)

A atividade de clivagem de DNA do sal de térbio(III) sob luz

UV-A está apresentado na figura 21. A partir deste resulado podemos

concluir que a fragmentação do DNA não é realizada pelo térbio de

forma isolada, já que não foi observada clivagem considerável de DNA

nas mesmas condições testadas para o complexo 4.

33

DN

A

Com

ple

xo 4

Sal de térb

io

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)

Figura 21: Atividade do TbCl3 nas mesmas condições testadas para o

complexo 4. [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; [TbCl3]: 100

µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

O resultado dos testes de clivagem para o ligante tdzp está

representado na figura 22. Nesse ensaio não foi observada clivagem de

DNA promovida pelo ligante tdzp durante 24 horas no escuro. No

entanto foi observada clivagem do DNA em 5 minutos de reação sob luz

UV-A. Esse resultado não era esperado, mas pode ser explicado pela

fotossensibilidade do motivo tiadiazol presente na estrutura do ligante

tdzp.

34

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F II

[tdzp] M 0 50 100 0 50 100

Luz UV-A Escuro

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)

Figura 22: Atividade do ligante tdzp nas mesmas condições testadas

para o complexo 4. [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; [tdzp]:

50 e 100 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A e 24 horas no

escuro a 37°C.

35

4.1.3. Efeito da força iônica

O efeito da força iônica na clivagem de DNA pelos complexos

foi testado pelo aumento da concentração de NaCl nas misturas

reacionais. Como o DNA, em condições fisiológicas, apresenta carga

negativa devido ao grupo fosfato (DOMINGOS et al., 2003), moléculas

com comportamento de cátions teriam sua interação diminuída na

presença de NaCl. Nas figuras 23, 24, 25 e 26 podemos observar a

influência das interações eletrostáticas na clivagem de DNA pelos

complexos 1, 2, 3 e 4.

0

20

40

60

80

100FI

FII

FIII

[Complexo 1] (5 M)

NaCl

-

- -

+ ++++

50 100 200 300

Posição 1 2 3 4 5 6

FII

FI

FIII

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)




[NaCl]: 0 a 300 mM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

36

0

20

40

60

80

100FI

FII

FIII

[Complexo 2] (20 M)

NaCl

-

- -

+ ++++

50 100 200 300

FII

FIII

FI

Posição 1 2 3 4 5 6

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





37

0

20

40

60

80

100FI

FII

FIII

[Complexo 3] (7,5 M)

NaCl

-

- -

+ ++++

50 100 200 300

FII

FIII

FI

Posição 1 2 3 4 5 6

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)



[DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 7,5 µM;


38

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

Posição 1 2 3 4 5 6

[Complexo 4] (25 M)

NaCl

-

- -

+ ++++

50 100 200 300

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)



[DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; [complexo]: 25 µM;


Os resultados de clivagem de DNA em concentrações crescentes

de NaCl demonstraram redução da atividade dos complexos. Os

complexos 1, 2 e 3 apresentaram redução de ~38% de F II comparando a

atividade dos complexos na ausência e na presença de 300 mM de NaCl.

O complexo 4 demonstrou redução de ~12% de F II na presença de 300

mM de NaCl em relação a produção de F II nas condições padrão de

clivagem. Dessa forma, podemos sugerir que os quatro complexos em

estudos fazem interações eletrostáticas com o DNA para promover a

clivagem, e na presença de NaCl essas interações são diminuídas, provavelmente porque os íons de Na

+ presentes no meio tendem a

estabilizar a estrutura do DNA por amenizar a repulsão dos grupos

fosfatos carregados negativamente (HAGERMAN, 1988).

39


Para avaliarmos o mecanismo de clivagem de DNA pelos

complexos foram realizados testes de clivagem na presença de

sequestradores de radicais livres e D2O. Os resultados obtidos estão

apresentados nas figuras 27, 28, 29, 30 e 31. D

NA

Co

mp

lexo

1

DM

SO KI

SO

D O2

D

3N

aN

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5 6 7

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)





[D2O]: 70% (v/v); [NaN3]: 10 mM.Tempo de reação: 5 minutos em luz

UV-A.

40

DN

A

Com

ple

xo 2

DM

SO KI

SO

D O2

D

3N

aN

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5 6 7

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)






UV-A.

41

DN

A

Co

mple

xo

3

DM

SO KI

SO

D O2

D

3N

aN

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5 6 7

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)




[complexo]: 7,5 µM; [DMSO]: 10% (v/v); [KI]: 10 mM; [SOD]: 15 U;


UV-A.

42

DN

A

Com

ple

xo 1

Com

ple

xo 2

Com

ple

xo 3

DN

A +

TE

MP

O

1 +

TE

MP

O

2 +

TE

MP

O

3 +

TE

MP

O

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5 6 7 8

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)

Figura 30: Clivagem de DNA plasmidial pelos complexos 1, 2 e 3 na

ausência e presença de TEMPO. Condições reacionais: [DNA] = 400

ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 5; 20 e 7,5 µM; TEMPO:

500 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

A fotoclivagem do DNA pelos complexos em estudo foi reduzida

quando adicionados os sequestradores de radicais livres (com exceção

da SOD para os complexos 1 e 2). O complexo 1 apresentou 71% de F

II na ausência de KI e 30% na presença de KI e quando o TEMPO foi

adicionado a F II diminui de 69% para 36%. A presença de DMSO e

NaN3 também inibiu parcialmente a clivagem de DNA pelo complexo

indicando a presença do radical hidroxila e oxigênio singlete. No

entanto a presença de D2O aumentou levemente a atividade do

complexo. O resultado encontrado por Chen e colaboradores (2011)

43

para o complexo 1 sugere o envolvimento de oxigênio singlete no

mecanismo de clivagem de DNA pois a adição de DMSO e KI não

reduziram a atividade do complexo. Os resultados do complexo 2

demonstraram maior redução de clivagem quando KI foi adicionado à

reação, 63% de F II para o tratamento com o complexo e 34% de F II na

presença de complexo e KI. Nas reações com TEMPO a F II diminui de

43% na presença apenas do complexo para 29%. Na presença de NaN3

foi observado aumento da atividade do complexo, esse evento pode ter

ocorrido pela formação do radical azidil como já descritos em outros

trabalhos. A formação do radical azidil pode ocorrer quando o cobre e

excesso de H2O2 oxidam a azida (YAMAMOTO; KAWANISHI, 1989;

LI et al., 1995; RAMIREZ; GOMEZ MEJIBA; MASON, 2005). Esse

resultado sugere formação de H2O2 para formação do radical azidil

aumentando assim a atividade do complexo e explicando a perda de

atividade na presença de KI. A redução de clivagem de DNA do

complexo 3 na presença de KI foi de 70% de F II (tratamento com

complexo) para 26% (adição de KI). A adição de DMSO, SOD e NaN3

também reduziram a clivagem de DNA mas de maneira menos evidente,

indicando a presença de radicais hidroxila, ânion superóxido e oxigênio

singlete. Na presença do TEMPO a redução de F II foi de 29%. Esses

resultados sugerem clivagem oxidativa e participação de várias espécies

radicalares na clivagem de DNA pelos complexos 1, 2 e 3.

Nas condições de fotoclivagem testadas podemos sugerir que a

formação de radicais livres é Cu(I)-dependente, a redução do Cu(II) para

Cu(I) pode ser explicada pela fotoativação do motivo

quinoxalina/fenazina dos ligantes dpq e dppz (TOSHIMA et al., 2002).

Após a formação de Cu(I), este pode participar de reações tipo-Fenton

nas quais ele reage com H2O2 formando OHł (HALLIWELL;

GUTTERIDGE, 2007).

Reação tipo-Fenton:

Cu(I) + H2O2 ł Cu(II) + OHł + OH

-

O Cu(I) também pode reagir com o oxigênio molecular gerando

O2ł-

que se dismuta em H2O2 e participa na geração de OHł pela reação

de Fenton (SOUZA et al., 2010a).

44

DN

A

Co

mple

xo

4

DM

SO KI 3

Na

N

TE

MP

O

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

Posição 1 2 3 4 5 6

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


presença de diferentes sequestradores de radicais livres. Condições

reacionais: [DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; [complexo]: 25

µM; [DMSO]: 10% (v/v); [KI]: 10 mM; [NaN3]: 10 mM; [TEMPO]:

500 µM Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

O complexo 4 apresentou redução de atividade na presença de

DMSO, KI, NaN3 e TEMPO (figura 31). Esses resultados sugerem

clivagem oxidativa do DNA pela formação de radicais livres de

oxigênio e carbono-centrados. O complexo [Fe(tdzp)3] possui o mesmo

ligante tdzp e também apresentou diminuição da sua atividade de

clivagem na presença do inibidor de radicais carbono-centrados

(SOUZA et al., 2010b).

45

4.1.5. Efeito da presença e ausência de oxigênio

Os testes em atmosfera de argônio foram realizados para que se

pudesse avaliar se o oxigênio molecular é necessário para clivagem de

DNA pelos complexos. Os resultados da atividade dos complexos na

ausência de oxigênio estão representados na figura 32 e 34. Nas figuras

33 e 35 estão os resultados das reações na presença de oxigênio

molecular, as quais foram realizadas em paralelo às reações na

atmosfera de argônio.

DN

A

Fe-E

DT

A

Com

ple

xo 1

Com

ple

xo 2

Com

ple

xo 3

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


complexos 1, 2 e 3 na ausência de oxigênio, em atmosfera de argônio.

Condições reacionais: [DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 5; 20 e 7,5 µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-

A.

46

DN

A

Fe

-ED

TA

Co

mple

xo

1

Co

mple

xo

2

Co

mple

xo

3

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F III

F I

Posição 1 2 3 4 5

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


complexos 1, 2 e 3 na presença de oxigênio. Condições reacionais:

[DNA] = 400 ng; 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexos]: 5; 20 e 7,5

µM. Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

A fotoclivagem de DNA pelos complexos 1, 2 e 3 em atmosfera

de argônio foi aumentada em relação à fotoclivagem na presença de

oxigênio. Podemos observar que o complexo 3 clivou toda forma

superenovelada (F I) do DNA em F II e F III. A sugestão que pode ser

feita para esse comportamento seria a atuação do oxigênio molecular

como sequestrador dos radicais produzidos pelos complexos, dessa

forma estaria competindo com o DNA pelos radicais e por isso a

atividade dos complexos é aumentada na ausência do oxigênio

molecular.

47

DN

A

+ M

PA

2C

uC

l

Com

ple

xo 4

DN

A +

TE

MP

O

Com

ple

xo 4

+ T

EM

PO

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

1 2 3 4 5Posição

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


complexo 4 na ausência de oxigênio. Condições reacionais: [DNA] =

400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; NaCl 5 mM; [complexo]: 25 µM.

Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

48

DN

A

+ M

PA

2C

uC

l

Com

ple

xo 4

DN

A +

TE

MP

O

Com

ple

xo 4

+ T

EM

PO

0

20

40

60

80

100F I

F II

F III

F II

F I

1 2 3 4 5Posição

F III

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


complexo 4 na presença de oxigênio. Condições reacionais: [DNA] =


Tempo de reação: 5 minutos em luz UV-A.

A fotoclivagem de DNA pelo complexo 4 não foi inibida em

atmosfera de argônio, no entanto na presença do sequestrador de radicais carbono-centrado, TEMPO, na ausência de oxigênio, a

clivagem foi totalmente inibida. Esse resultado corrobora o encontrado

por Souza e colaboradores (2010), com o complexo [Fe(tdzp)3] no qual

foi sugerido que o motivo tiadiazol no ligante tdzp forma um radical

tdzp-centrado após a exposição a luz UV-A, o qual oxidaria a estrutura

49

do DNA e consequentemente promove a quebra da fita. No entanto, o

complexo 4 parece agir também pela formação de oxi-radicais, os quais

poderiam ser gerados pela reação do radical tdpz-centrado com o

oxigênio molecular.

4.1.6. Efeito dos ligantes dos sulcos do DNA

Os dois ligantes dos sulcos do DNA, verde metila e distamicina,

utilizados nos ensaios promoveram clivagem de DNA nas condições

testadas para os complexos 1, 2 e 3 (10 mM de Tris-HCl pH7,4 e

fotoativação em luz UV-A por cinco minutos) e por esse motivo os

resultados foram desconsiderados. Os resultados encontrados para o

complexo 4 estão na figura 36 e demonstram que nenhum dos ligantes

de sulco reduziram a clivagem de DNA promovida pelo complexo 4, o

que sugere que a ligação específica à um dos sulcos não é necessária

para o evento de clivagem.

50

DN

A

DN

A +

Dis

tam

icin

a

DN

A +

Ve

rde

de m

etila

Com

ple

xo 4

Com

p 4

+ d

ista

mic

ina

Com

p 4

+ v

erd

e d

e m

etila

0

20

40

60

80

100F I

F II

F II

F I

Posição 1 2 3 4 5 6

Fo

rma

do

DN

A p

las

mid

ial

(%)


presenças dos ligantes dos sulcos de DNA. Condições reacionais:

[DNA] = 400 ng; 25 mM de PIPES, pH 7,0; NaCl 5 mM; [complexo]:

25 µM; [distamicina]: 50 µM; [verde de metila]: 50 µM. Tempo de

reação: 5 minutos em luz UV-A.

51

4.3.7. Cinética de clivagem do DNA

Os perfis cinéticos dos complexos 1, 2, 3 e 4 foram analisados

tanto na presença de luz UV-A quanto no escuro. Os resultados dos

ensaios cinéticos sob luz UV-A para os complexos 1, 2, 3 e 4 estão

representados nas figuras 37, 38, 39 e 40.

0 20 40 603.0

3.5

4.0

4.5

5.0

kobs = 0,89 min-1

t1/2 = ~46 s

Tempo (s)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





em luz UV-A.

52

0 20 40 603.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

kobs = 0,25 min-1

t1/2 = 2,8 min

Tempo (s)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





em luz UV-A.

53

0 20 40 603.0

3.5

4.0

4.5

5.0

kobs = 0,92 min-1

t1/2 = ~44 s

Tempo (s)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





em luz UV-A.

A constante observada de clivagem de DNA (Kobs) para o

complexo 1 na presença de luz UV-A foi de 0,89 min-1

, a qual resulta

em um t1/2 de ~46 segundos para o DNA superenovelado. Nas mesmas

condições o complexo 2 apresentou um kobs de 0,25 min-1

que representa

um t1/2 de ~2,8 minutos. O complexo 3 apresentou um resultado bastante

similar ao do complexo 1, kobs de 0,92 e um t1/2 de ~44 segundos para o

DNA superenovelado. Os complexos de Cu(II), Cu(dox)(phen) e

Cu(tc)(phen), quando fotoativados em luz UV-A apresentaram

resultados semelhantes com um t1/2 de ~ 30 segundos (BORTOLOTTO,

2011).

54

0 1 2 3 4 53.0

3.5

4.0

4.5

5.0

kobs = 0,17 min-1

t1/2 = ~4 min

Tempo (min)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]




PIPES, pH 7,0; [complexo]: 100 µM. Tempo de reação: 5 minutos em

luz UV-A.

Na presença de 100 µM do complexo 4 o Kobs da reação foi

estimado em 0,17 min-1

resultando em um tempo de meia vida (t1/2) de

aproximadamente 4 minutos para o DNA nesta reação. O complexo

[Fe(tdzp)3] (o qual possui o mesmo ligante) apresentou um kcat (kobs no

nível de saturação) de 0,31 min-1

em condições reacionais similares

(SOUZA et al., 2010b).

Os resultados dos ensaios cinéticos no escuro para os complexos

1, 2, 3 e 4 estão representados nas figuras 41, 42, 43 e 44.

55

0 2 4 6 82.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Kobs = 0,15 h-1

t1/2 = 4,4 h

Tempo (h)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





escuro a 37°C.

56

0 2 4 6 83.5

4.0

4.5

5.0

Kobs = 0,08 h-1

t1/2 = 8,1h

Tempo (h)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





escuro a 37°C.

57

0 2 4 6 83.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

Kobs = 0,035 h-1

t1/2 = 19,8 h

Tempo (h)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]





escuro a 37°C.

Na ausência da luz UV-A os complexos apresentaram perfis

cinéticos inferiores como era esperado. Estes ensaios reforçam a

importância da fotoativação para uma melhor eficiência na atividade dos

complexos. No escuro o complexo 1 apresentou um Kobs de 0,15 h-1

e

um t1/2 de ~4,4 h, o Kobs para o complexo 2 foi de 0,08 h-1

gerando um

t1/2 de ~8 h. Entre os complexos de Cu(II), o complexo 3 é o que

apresenta maior redução de atividade na ausência da luz UV-A, Kobs de

0,035 h-1

e t1/2 de ~19 h. Bortolotto (2011) também descreve Kobs

menores para os complexos Cu(dox)(phen) e Cu(tc)(phen) na ausência

da fotoativação por luz UV-A.

58

0 10 20 30 40 504.0

4.2

4.4

4.6

4.8

kobs: 0,0032 h-1

t1/2: ~211 h

Tempo (h)

ln [

DN

A s

up

ern

ov

ela

do

%]




PIPES, pH 7,0; [complexo]: 100 µM. Tempo de reação: 48h no escuro a

37°C.

A reação de clivagem pelo complexo 4 na ausência de luz UV-A

apresentou Kobs de 0,0032 h-1

e tempo de meia vida (t1/2) de

aproximadamente 211 horas para o DNA. Esse resultado demonstra a

importância da fotoativação para o aumento da velocidade da reação.

Quando a reação é fotoativada o tempo de meia vida do DNA diminui

aproximadamente três mil vezes.

59

4.2. Interação dos complexos com CT-DNA

4.2.1. Titulação espectrofotométrica (UV-Vis)

A realização deste experimento permitiu o cálculo da constante

intrínseca de ligação (Kb) dos complexos com o DNA e a determinação

da forma de ligação pelas mudanças observadas nos espectros. Os

resultados estão apresentados nas figuras 45, 46 e 47.

350 360 370 380 390 4000.00

0.05

0.10

0.15

0.20 Kb = 4,45 x 105 M

-1

(nm)

Ab

so

rbâ

nc

ia



DNA]: 0,8 a 7,8 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 10 µM;

temperatura: 37°C.

60

350 360 370 380 390 4000.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10Kb = 3,73 x 10

5 M

-1

(nm)

Ab

so

rbâ

nc

ia



DNA]: 1 a 9,8 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 10 µM;

temperatura: 37°C.

61

280 300 320 3400.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Kb = 6,02 x 104 M

-1

(nm)

Ab

so

rbâ

nc

ia



DNA]: 1,6 a 14 µM; 5 mM de Tris-HCl, pH 7,4; [complexo]: 25 µM;

temperatura: 37°C.

Conforme concentrações crescente de CT-DNA foram

adicionadas ao complexo observou-se uma intensa diminuição na

absorção de luz (hipocromismo) entre 365 e 375 nm para os complexos

1 e 2, referente ao ligante dppz, e um leve efeito hipocrômico entre 280

e 310 nm para o complexo 3. Para os complexos 1 e 2 podemos observar

um pequeno efeito batocrômico (deslocamento para maiores łmax) nas

bandas de 375 nm.

Hipocromismo e batocroísmo ocorrem quando a forma de

interação entre pequenas moléculas e o DNA é a intercalação

(BARTON; DANISHEFSKY; GOLDBERG, 1984) e, portanto esta é a

forma de ligação ao DNA sugerida para os complexos 1 e 2. Para o

complexo 1, Chen e colegas (2011) descrevem os mesmos efeitos

hipocrômicos e batocrômicos no espectro deste complexo quando

concentrações crescentes de DNA foram adicionadas. Em relação ao Kb os complexos 1 e 2, com ligante dppz,

apresentaram resultados similares 4,45 e 3,73 x105 M

-1 e uma casa de

grandeza maior que o encontrado para o complexo 3, com ligante dpq,

6,02 x104 M

-1. Esses resultados estão de acordo com outros presentes na

62

literatura, tanto nos valores encontrados de Kb como na ordem de maior

ligação para complexos de Cu com ligantes dppz em relação a

complexos de cobre com ligantes dpq (GUPTA et al., 2004; DHAR;

NETHAJI; CHAKRAVARTY, 2006; SELVAKUMAR et al., 2006;

PATRA et al., 2008; ROY et al., 2008b; LAHIRI et al., 2009; CHEN et

al., 2011).

4.2.2. Desnaturação térmica do DNA

Como a ligação de pequenas moléculas com o DNA pode alterar

a Tm do mesmo, nesse ensaio foi realizada a desnaturação térmica do

CT-DNA na ausência e presença dos complexos. O resultado pode ser

observado na figura 48.

A Tm do DNA livre dos complexos foi de 58,0°C. Na presença do

complexo 1 a Tm aumentou para 60,4°C, na presença do complexo 2 o

aumento foi para 60,2°C e na presença do complexo 3 para 59,8°C. O

aumento da Tm confirma a capacidade de ligação dos complexos com o

DNA e sugere um aumento da estabilidade da dupla-hélice dificultando

a desnaturação (BORTOLOTTO, 2011). Esses resultados concordam

com as constantes de ligação intrínseca calculadas para os complexos,

os complexos 1 e 2 com os ligantes dppz apresentaram maior Kb e maior

variação de Tm em relação ao complexo 3 com o ligante dpq.

63

40 50 60 70 80 900

20

40

60

80

100

DNA

Complexo 1

Complexo 2

Complexo 3

Temperatura (ºC)

Ab

so

rbâ

nc

ia r

ela

tiv

a

Figura 48: Desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e presença

dos complexos 1, 2 e 3. Condições reacionais: [CT-DNA]: 100 µM; 1

mM tampão fosfato pH 7,2; [complexo]: 10 µM. Temperatura: 40 a

90°C, um grau por minuto.

4.2.3. Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)

Através da técnica de CD podemos avaliar a estrutura secundária

do CT-DNA, empilhamento das bases e/ou helicidade direita da dupla

hélice, na presença e ausência dos complexos. Nas figuras 49, 50 e 51

estão os resultados obtidos.

64

220 240 260 280 300 320-4

-2

0

2

4

6CT-DNA

r=0,05

r=0,1

r=0,15

r=0,2

(nm)

CD

(m

deg

)



5mM de Tris-HCl pH 7,4; [complexo]: 5 a 16 µM.

220 240 260 280 300 320-4

-2

0

2

4

6CT- DNA

r=0,1

r=0,15

r=0,2

r=0,25

(nm)

CD

(m

deg

)




65

220 240 260 280 300 320-4

-2

0

2

4

6CT- DNA

r=0,05

r=0,1

r=0,15

r=0,2

r=0,25

(nm)

CD

(m

deg

)




A adição de concentrações crescente do complexo 1 à solução de

CT-DNA resultou em hipercromismo da banda em 275 nm,

hipocromismo da banda em 245 nm e um leve deslocamento da banda

em 275 nm para 272 nm (hipsocromismo). Na presença de

concentrações crescentes do complexo 2 também foi observado

hipercromismo na banda de 275 nm, hipocromismo em 245 nm e um

moderado efeito batocrômico na banda de 275 nm para 268 nm. Quando

o complexo 3 foi adicionado observou-se um leve efeito hipercrômico

na banda em 275 nm, hipocromismo na banda de 245 nm e um pequeno

deslocamento de 275 para 272 nm e 245 para 243 nm.

Agentes intercalantes como o brometo de etídio promovem

hipercromismo da banda positiva e hipocromismo da banda negativa do

espectro de CD da molécula de DNA (PARODI; KENDALL;

NICOLINI, 1975). Os três complexos avaliados provocaram estas

alterações no perfil de CD do CT-DNA e, portanto pode-se sugerir que

eles atuem como agentes intercalantes. Esse resultado corrobora os resultados encontrados na titulação espectrofotométrica dos complexos

1 e 2.

66

5. CONCLUSÕES

Os três complexos de cobre(II), [Cu(acac)dppz](ClO4),

[Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O e [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O foram

capazes de clivar o DNA plasmidial em concentrações micromolares e

pH próximo da neutralidade, na presença e ausência da luz UV-A. No

entanto, a atividade dos mesmos é melhorada quando ocorre a

fotoativação. O complexo [Tb(tdzp)(acac)3] também foi capaz de clivar

o DNA plasmidial em concentrações micromolares e em pH 7,0 quando

fotoativado, porém, em 24 horas de teste na ausência de luz UV-A não

foi observada a clivagem do DNA plasmidial. Os sais de cobre e térbio

não foram capazes de clivar o DNA plasmidial nas mesmas condições

testadas para os complexos. Os quatro complexos tiveram sua atividade

diminuída pelo aumento da força iônica, esse resultado indica a

participação de interações eletrostáticas entre os complexos e o DNA

para que ocorra a clivagem.

A utilização de sequestradores de radicais livres de oxigênio e

carbono-centrado reduziu a atividade dos complexos metálicos testados,

no entanto nenhum sequestrador de radical foi capaz de inibir totalmente

a atividade dos complexos. O mecanismo de clivagem é oxidativo e

sugere-se a formação de radical hidroxila, oxigênio singlete, radicais

peróxidos e carbono-centrado. Os ligantes dpq e dppz estão envolvidos

no processo de geração de radicais de oxigênio e carbono-centrado por

possuírem motivos fotossensíveis, assim como o motivo tiadiazol do

ligante tdzp gera o radical tdzp-centrado após exposição à luz UV-A. Na

presença da enzima superóxido dismutase o complexo 2 foi capaz de

gerar o radical azidil e aumentar seu potencial de clivagem. Em

atmosfera de argônio a atividade dos complexos 1, 2 e 3 não foi

diminuída provavelmente pela maior formação de radicais carbono-

centrados. O complexo 4 também não apresentou redução da atividade

em atmosfera de argônio, no entanto quando o sequestrador TEMPO foi

adicionado a clivagem foi totalmente inibida, confirmando a

participação do radical tdzp-centrado.

Os ensaios cinéticos com os quatro complexos demonstraram

diminuição do tempo de meia-vida do DNA superenovelado tanto na presença quanto na ausência de fotoativação por luz UV-A, no entanto a

fotoativação dos complexos acelera velocidade de clivagem do DNA.

Os complexos com ligantes dppz, 1 e 2, interagem de forma mais

forte com o CT-DNA em relação ao complexo 3, com ligante dpq. Os

67

três complexos foram capazes de aumentar a Tm do CT-DNA, as

maiores alterações foram observadas nos complexos 1 e 2. Os

complexos 1, 2 e 3 provocaram hipercromismo da banda positiva e

hipocromismo da banda negativa do espectro de CD da molécula de

DNA, o mesmo perfil encontrado para agentes intercalantes de DNA.

68

6. PERSPECTIVAS

Determinar os sítios de clivagem pelos quais os complexos

[Cu(acac)dppz](ClO4), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O ,

[Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O e [Tb(tdzp)(acac)3] clivam o DNA

por espectrometria de massa e DNA footprinting.

Determinar as constantes de associação e dissociação dos quatro

complexos com o DNA por calorimetria de titulação isotérmica

(ITC, do inglês, Isothermal Titration Calorimetry).

Testar a atividade dos complexos em outros substratos de DNA

(linear dupla-fita e simples-fita).

Verificar os produtos de oxidação gerados pelos complexos por

cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.

69

7. REFERÊNCIAS

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synthesis, structural, spectral and antitumor activities of ortho-naphthaquinone

thiosemicarbazone and its transition metal complexes. Inorganica Chimica Acta, v.

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tetracationic tris(2,2 ł-bipyridine) ligand. Journal of Inorganic Biochemistry, v.

103, n. 7, p. 1067-1073, 2009.

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Mestrado. Universidade Federal de Santa Catarina. Florianópolis, 2011.

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70

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