universidade federal de pernambuco centro de … · a todos do laboratório de citologia e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

GIANNE RIZZUTO ARAÚJO

CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE Fusarium lateritium, F. oxysporum e F. solani

DEPOSITADAS NA MICOTECA URM E O POTENCIAL NA DEGRADAÇÃO DE

EFLUENTES DE LAVANDERIA DE INDÚSTRIA TÊXTIL DO MUNICÍPIO DE

TORITAMA-PE

Recife

2015





TORITAMA-PE

Recife

2015

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Biologia de Fungos do Departamento

de Micologia da Universidade Federal de

Pernambuco, como parte dos requisitos para a

obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos.

Área de Concentração: Micologia Aplicada

Nome: Gianne Rizzuto Araújo

Orientadora: Elaine Malosso

Co-Orientadora: Cristina Maria de Souza Motta

Catalogação na fonte Elaine Barroso

CRB 1728

Araújo, Gianne Rizzuto Caracterização polifásica de Fusarium lateritium, F. oxysporum e F. solani depositadas na micoteca URM e o potencial na degradação de efluentes de lavanderia têxtil do município de Toritama- PE/ Gianne Rizzuto Araújo– Recife: O Autor, 2015. 71 folhas : il., fig., tab.

Orientadora: Elaine Malosso Coorientadora: Maria Cristina de Souza Motta Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.

Centro de Ciências Biológicas. Biologia de Fungos, 2015. Inclui bibliografia

1. Fungos 2. Micro-organismos biotecnológicos 3. Toritama (PE) I.

Malosso, Elaine (orientadora) II. Motta, Maria Cristina de Souza (coorientadora)III. Título

579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2016-052





TORITAMA-PE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em

Biologia de Fungos do Departamento de Micologia da

Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos

requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de

Fungos.

Data da Aprovação: 27/02/2015

COMISSÃO EXAMINADORA

MEMBROS TITULARES

Dra. Elaine Malosso (Orientadora)

Universidade Federal de Pernambuco

Dra. Laura Mesquita Paiva

Universidade Federal de Pernambuco

Dra. Virgínia Michelle Svedese

Universidade Federal do Vale do São Francisco

Dedico à minha família, aos meus pais, em

especial a minha mãe Gilmary, que sempre me

deu apoio, suporte e acreditou em mim em todos

os momentos da minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por estar sempre comigo, guiando-me e iluminando-me,

para poder realizar tudo que almejo. Sem Ele não sou ninguém.

Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, em

especial:

Aos meus pais Gilson dos Santos Araújo e Gilmary Rizzuto Araujo, que sempre

acreditaram no meu potencial e estiveram presente em todos os momentos.

À minha mãe Gilmary, que soube com muita garra e dedicação mostrar que nada na vida

vem sem esforço, que é preciso ter disciplina, coragem, dedicação, perseverança. Ela me

ensinou a nunca desistir dos meus objetivos porque um dia a vitória chega. E chegou!

Ao meu irmão George Rizzuto e minha irmã Giannina Rizzuto, por torcerem por mim e me

ajudarem sempre.

Ao meu noivo Renan Magalhães, por participar ativamente de cada etapa deste trabalho e

por sempre estar comigo, me apoiando, ajudando, torcendo, incentivando nos momentos

bons e nos difíceis também e por querer me ver crescer ao seu lado.

À minha avó Vanilda Araújo e aos meus tios, ao meu padrasto Antônio Benjamin pelo

apoio nos momentos difíceis.

À minha família por todo o apoio e carinho.

À Universidade Federal de Pernambuco pelo apoio durante os dois anos de estudo.

À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela

bolsa de mestrado concedida para a realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós Graduação em Biologia de Fungos pelo apoio.

Ao Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco e a Chefe do

departamento Profa. Dra. Cristina Maria de Souza Motta, pela disponibilização de

materiais e das instalações da Micoteca URM, do Laboratório de Biologia Molecular e do

Laboratório de Citologia e Genética para a realização deste trabalho.

À Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Garanhuns, pela

disponibilização de equipamentos e das instalações da Central de Laboratórios de

Garanhuns (CENLAG).

À minha orientadora Profa. Dra. Elaine Malosso pela confiança depositada em mim.

À Profa. Cristina Maria de Souza Motta e os demais que fazem parte da Micoteca URM

pelo apoio.

À Profa. Laura Mesquita Paiva pelo acolhimento no Laboratório de Citologia e Genética e

apoio na realização deste trabalho.

À Profa. Keila Aparecida Moreira e a Doutoranda Alana Soares pela acolhida e

colaboração na pesquisa durante a ida a Unidade Acadêmica de Garanhuns –

UAG/UFRPE.

A todos do laboratório de Citologia e Genética que me ajudaram sempre com muita

paciência.

Aos doutorandos e amigos Renan Nascimento, Dianny Silva, Jadson Bezerra, Marcela

Alves por me ajudarem incansavelmente em todos os momentos que precisei e por

contribuirem bastante na realização da pesquisa.

A todos os amigos do Departamento de Micologia e da turma 2013 do Mestrado em

Biologia de Fungos pelos bons momentos e pela amizade.

Em especial à Karla Freire pela dedicação, cumplicidade e amizade na realização desse

trabalho e na vida.

A todos meus queridos amigos que sempre torceram por mim e que acompanharam todos

os momentos dessa jornada com palavras de incentivo e conforto.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais

volta ao seu tamanho original”

Albert Eisntein

RESUMO

O pólo têxtil e de confecções do agreste de Pernambuco, que abriga várias indústrias, tem,

erroneamente, despejado grandes volumes de efluentes das lavanderias e tinturarias têxteis,

muitas vezes não tratados, em corpos hídricos da região, causando intensos danos ao

ambiente. Estudos apontam o tratamento biológico como uma boa alternativa para

solucionar os problemas com efluentes têxteis, pois são eficientes e de baixo custo. Os

fungos se destacam nesse processo devido a algumas espécies degradarem compostos

recalcitrantes. O gênero Fusarium é apontado como importante bioindicador e

biorremediador de ambientes contaminados. No estudo dos fungos, a taxonomia polifásica

utilizada atualmente objetiva integrar informações diversas, tais como: características

morfológicas, dados moleculares e de produção de metabólitos para identificação mais

precisa dos organismos. O objetivo deste estudo foi caracterizar culturas de espécies de

Fusarium depositadas na Micoteca URM quanto à taxonomia por uma abordagem

polifásica, e quanto à capacidade de degradação de efluentes de lavanderia de indústria

têxtil do município de Toritama-PE. Foram utilizadas 25 culturas de Fusarium oxysporum

(10), F. lateritium (7) e F. solani (8) depositadas na Micoteca URM. Foi realizada análise

morfológica, molecular e quantificação do ergosterol, além da análise de descoloração de

efluente têxtil coletado de uma lavanderia do município de Toritama-PE. Os fungos foram

inoculados em 50 ml do efluente esterilizado, adicionado de 0,5 g de farelo de trigo,

contido em frascos de Erlenmeyer e foram incubados durante seis e doze dias. Em seguida,

foram feitas leituras em espectrofotômetro (360nm). Na análise morfológica dos fungos

foram observadas características que concordam com as descritas na literatura,

permanecendo as espécies, segundo a morfologia, sem alterações no registro URM. A

análise filogenética de sequencias das regiões ITS e do fator de elongação Tef-1α

confirmou que a maioria dos espécimes de F. oxysporum e F. solani são, de fato, das

espécies que constam no registro de depósito, que estão distribuídas em complexos.

Entretanto, para melhor resolução das relações entre os clados e, consequentemente,

melhor delimitação dessas espécies, será necessário realizar o estudo de pelo menos mais

uma região do genoma. Quanto à produção do ergosterol, as espécies não apresentaram

variação significativa. Todos os espécimes de Fusarium apresentaram baixo percentual de

descoloração do efluente quando este foi utilizado esterilizado nos ensaios. No entanto,

novas pesquisas devem ser realizadas com esses isolados para desvendar seu verdadeiro

potencial biotecnológico.

Palavras chave: Polo têxtil. Tratamento biológico. Potencial biotecnológico

ABSTRACT

The textile and clothing industries in the Agreste region of Pernambuco have been

erroneously discharging large volumes of in natura waste water from the textiles laundries

and dry cleaners in the rivers of that region, causing severe damage to the environment.

Studies indicate the biological treatment as a good alternative to solve problems with

textile effluents as they are efficient and cheap. The fungi are highlighted in this process

due to the ability of some species to degrade recalcitrant compounds. The genus Fusarium

is pointed as an important bioindicator and biorremediador of contaminated environments.

In the studies of the fungi, the polyphasic taxonomy currently used aims to integrate

several information, such as: morphological characteristics, molecular data and the

production of metabolites to better identify the organisms. The objective of this study was

to characterize cultures of Fusarium species deposited in the Micoteca URM regarding

their taxonomy by a polyphasic approach, and their capacity of degrading laundry effluent

from the textile industry of Toritama-PE. Twenty five cultures of Fusarium oxysporum

(10), F. lateritium (7) and F. solani (8), deposited at the Micoteca URM, were used in this

study. Morphological and molecular analyses and ergosterol quantification were carried

out. Also, a discoloration analysis was performed using the textile effluent collected from a

laundry in the municipality of Toritama-PE. The fungi were inoculated into 50 ml of

sterilized effluent, added of 0.5 g of wheat bran, in Erlenmeyer flasks and incubated during

six and twelve days. Next, the supernatant was analysed using a spectrophotometer

(360nm). In the morphological analysis of the fungi, the observed characteristics agree

with those described in the literature, allowing us to keep, according to the morphology,

the URM record unchanged. The phylogenetic analysis of sequences of the ITS regions

and elongation factor Tef-1α confirmed that most of the speciemens of F. oxysporum and

F. solani belong, in fact, to the species registered in the deposit files, and these are actually

complexes of species. However, to better resolve the relationships between these clades

and, consequently, better delimit these species, the study of at least one more region of the

genome will be necessary. Ergosterol production did not vary significantly between the

studied species. All Fusarium speciemens studied showed low percentage of discoloration

when sterilized effluent was used in the test. However, new studies should be carried out

with these isolates to uncover their true biotechnological potential.

Key words: Polo textile. Biological treatment. Biotechnological potential

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1 - Fusarium lateritium URM6226 verso e anverso após 7 dias de

crescimento, a 25ºC. Verso em A e anverso em B em meio de cultura

BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura SNA.

39

Figura 2 - Fusarium oxysporum URM6052 verso e anverso após 7 dias de

crescimento, a 25ºC. Verso em A e anverso em B em meio de

cultura BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura

SNA.

40

Figura 3 - Fusarium solani URM3838 verso e anverso após 7 dias de

crescimento, a 25ºC. Verso em A e anverso em B em meio de cultura

BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura SNA.

41

Figura 4- Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium

lateritium em meio de cultura BDA e SNA. A – Macroconídios e

microconídios em meio de cultura BDA; B- Macroconídio,

microconídios e clamidósporos em meio de cultura SNA; C e D -

Macroconídios em meio de cultura BDA e SNA respectivamente,

após 7dias de crescimento.

45

Figura 5 - Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium

oxysporum em meio de cultura BDA e SNA. A – Monofiálide com

microconídios em meio de cultura BDA; B-Clamidósporos

intercalares e terminais em meio de cultura SNA; C e D –

Macroconídios e microconídios em meio de cultura BDA e SNA

respectivamente, após 7 dias de crescimento.

46

Figura 6 - Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium solani em

meio de cultura BDA e SNA. A, B e D –Macroconídios e

microconídios em meio de cultura BDA (A) e SNA (B,D) ; C-

Monofiálide com microconídios em meio de cultura BDA.

47

Figura 7 - Reconstrução filogenética de espécies de Fusarium depositadas na

Micoteca URM a partir do alinhamento de 490 nucleotídeos

correspondentes à combinação dos fragmentos ITS1 + 5.8S + ITS2

(rDNA). Valores de Bootstrap (em %) foram gerados a partir dos

métodos de Neibghbor Joining (K2P), Máxima Verossimilhança,

Máxima Parcimônia (5000 reamostragens) e de probabilidade

posterior (análise Bayesiana, abaixo do nó, 1000 reamostragens).

Somente valores acima de 50% foram apresentados. Para MP: Índice

de Consistência (CI) = 29,51% e Índice de Retenção (RI) = 99,01%.

49

Figura 8 - Reconstrução filogenética de espécies de Fusarium depositadas na

Micoteca URM a partir do alinhamento de 526 nucleotídeos

correspondentes ao fragmento do gene Tef 1-α. Valores de Bootstrap

51

(em %) foram gerados a partir dos métodos de Neibghbor Joining

(K2P), Máxima Verossimilhança, Máxima Parcimônia (5000

reamostragens) e de probabilidade posterior (análise Bayesiana,

abaixo do nó, 1000 reamostragens). Somente valores acima de 50%

foram apresentados. Para MP: Índice de Consistência (CI) = 28,99%

e Índice de Retenção (RI) = 99,06%.

Figura 9 - Curva padrão para quantificação do ergosterol, obtida com a

absorbância ajustada em 282 nm.

53

Figura 10- Figura 10 - Concentração de ergosterol obtidas do micélio das

espécies F. oxysporum (1- URM 4613; 2- URM 5845; 3- URM 6228;

4- URM 5005; 5- URM 6704; 6- URM 5858; 7- URM 5068; 8-

URM 6503; 9- URM 6052; 10- 4363), F. lateritium (11- URM 5456;

12- URM 3148; 13- URM 6226; 14- URM 4207; 15- URM 4703;

16- URM 5844; 17- URM 5291) e F. solani (18- URM 5955; 19-

URM 5074; 20- URM 3838; 21- URM 6749; 22- URM 3821; 23-

URM 6264; 24- URM 5796; 25- URM 3768).

55

Figura 11- Frascos de Erlenmeyers controle (sem os isolados de Fusarium) do

ensaio de descoloração do efluente têxtil. Efluente em condições

naturais antes do ensaio (A) e após 12 dias (B).

59

LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1 - Culturas do gênero Fusarium depositadas na Micoteca URM da

Universidade Federal de Pernambuco, utilizadas neste trabalho.

32

Tabela 2 - Acessos do GenBank de espécimes de Fusarium utilizados para

reconstrução da árvore filogenética da região ITS.

34

Tabela 3 - Acessos do banco de dados FUSARIUM ID de espécimes de

Fusarium utilizados para reconstrução da árvore filogenética dos

fragmentos do gene Tef -1α.

35

Tabela 4 - Características macroscópicas observadas nas colônias de Fusarium

da Micoteca URM após sete dias de crescimento em meio de cultura

BDA e SNA.

42

Tabela 5 - Características microscópicas observadas após 7dias de microcultivo

em meio de cultura BDA e SNA dos isolados de Fusarium

depositados na micoteca URM.

44

Tabela 6 - Análise de variância e interações entre fatores para dados de

ergosterol entre as espécies Fusarium oxysporum, Fusarium

lateritium e Fusarium solani.

55

Tabela 7 - Análise One-Sample T para os isolados das espécies de Fusarium. 56

Tabela 8 - Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium oxysporum e

Fusarium lateritium.

57

Tabela 9 - Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium oxysporum e

Fusarium solani.

57

Tabela 10- Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium lateritium e

Fusarium solani.

57

Tabela 11- Percentual de descoloração do efluente têxtil por espécies de

Fusarium.

60

SUMÁRIO

Pág.

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 14

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA.......................................................................... 16

2.1 INDÚSTRIAS TÊXTEIS NO BRASIL..................................................................... 16

2.2 PÓLO TÊXTIL E DE CONFECÇÕES DO AGRESTE DE PERNAMBUCO........ 17

2.3 EFLUENTES TÊXTEIS............................................................................................ 18

2.4 TRATAMENTO DE EFLUENTES TÊXTEIS......................................................... 19

2.4.1 Tratamento físico do efluente têxtil.......................................................................... 20

2.4.2 Tratamento químico do efluente têxtil.................................................................... 21

2.4.3 Tratamento biológico do efluente têxtil.................................................................. 22

2.5 FUNGOS................................................................................................................... 24

2.6 O GÊNERO FUSARIUM.......................................................................................... 25

2.7 O USO DA TAXONOMIA NA IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS....................... 27

2.7.1 Ferramentas moleculares no estudo da Taxonomia de fungos............................ 28

2.8 ANÁLISE DA BIOMASSA DE FUNGOS USANDO ERGOSTEROL.................. 30

3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 32

3.1 CULTURAS DE FUSARIUM................................................................................... 32

3.2 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS LINHAGENS DE FUNGOS......... 32

3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LINHAGENS DE FUSARIUM......... 33

3.3.1 Alinhamento das sequências e análise filogenética............................................... 34

3.4 EXTRAÇÃO DE ERGOSTEROL............................................................................. 36

3.4.1 Quantificação do ergosterol por cromatografia.................................................... 36

3.5 SELEÇÃO DE ESPÉCIES DE FUSARIUM DEGRADADORAS DE

EFLUENTES TÊXTEIS............................................................................................

37

3.6 ANÁLISE DOS DADOS........................................................................................... 37

4 RESULTADOS E DICUSSÃO............................................................................... 38

4.1 ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS................................. 38

4.1.1 Caracterização macroscópica................................................................................ 38

4.1.2 Caracterização microscópica.................................................................................. 43

4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FILOGENÉTICA.................................... 48

4.3 ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE ERGOSTEROL PELAS CULTURAS DE

FUSARIUM................................................................................................................

53

4.4 DESCOLORAÇÃO DO EFLUENTE TÊXTIL POR ISOLADOS DO GÊNERO

FUSARIUM................................................................................................................

58

5 CONCLUSÕES........................................................................................................ 62

REFERÊNCIAS......................................................................................................... 63

Araújo, G. R. - Caracterização polifásica de Fusarium lateritium... 14

1. INTRODUÇÃO

Os municípios de Caruaru, Toritama e Santa Cruz do Capibaribe estão localizados

no agreste pernambucano e fazem parte do pólo têxtil e de confecções do Estado. Os

efluentes descartados pelas lavanderias industriais desses municípios são despejados em

corpos hídricos, inclusive no Rio Capibaribe, que é considerado a principal fonte de água

para irrigação e abastecimento de vários municípios. Em termos de poluição ambiental

causada pelo setor têxtil, a etapa do beneficiamento é considerada a mais crítica por

empregar a maior quantidade de substâncias químicas de alto risco ambiental, possuir

elevadas concentrações de compostos orgânicos, como gomas, sabão, detergente, álcoois e

corantes, entre outras substâncias (SILVA et al., 2012).

As indústrias têxteis têm grande parcela na contaminação ambiental, devido à

liberação de grandes volumes de efluentes, muitas vezes não tratados, que causam intensos

danos ao ambiente como poluição visual e eutrofização dos rios, contaminação dos lençóis

freáticos e do solo (KUNKZ et al., 2002). O desenvolvimento de novas tecnologias para o

tratamento de resíduos é de grande interesse industrial e econômico, pois a maioria dos

corantes utilizados nessas indústrias possuem agentes tóxicos e cancerígenos que causam

danos à saúde humana (ANJANEYLU et al., 2005). O tratamento biológico das águas

residuárias vem ganhando importância devido à sua eficiência, por apresentar menores

custos na aplicação e por poder gerar produtos que não agridem o meio ambiente

(BAFANA et al., 2008). Neste contexto, os fungos possuem a capacidade de produzir

enzimas extracelulares não específicas, que agem despolimerizando uma diversidade de

compostos presentes nos efluentes têxteis (SILVA et al., 2011).

Pesquisas utilizando espécies de Fusarium apresentam resultados favoráveis

quanto à produção de enzimas. Existem relatos na literatura da produção de celulase,

poligalacturonase, α-amilase e galactose oxidase (BUENO JUNIOR et al., 2009; BRAGA

et al., 2009; TURRA; TESSMANN, 2002). Estudos indicam Fusarium como importante

bioindicador e biorremediador de ambientes contaminados, pois são capazes de degradar

compostos xenobióticos e são promissores no monitoramento de solo e águas

contaminadas (SOARES et al., 2011).

O gênero Fusarium foi descrito e classificado pela primeira vez em 1809 pelo

micólogo alemão Link e pertence à família Nectriaceae do filo Ascomycota. Possui

aproximadamente 775 espécies e subespécies, apresenta como característica a formação de

colônias com coloração pálida ou colorida, micélio aéreo e difuso (DOMSCH et al., 1980),


e são encontrados numa diversidade de ambientes (MACIEL, 2012). Este fungo pode

sobreviver de forma saprofítica sobre matéria orgânica por longos períodos, pode ser

também fitopatogênico, causando inúmeros prejuízos na economia ao acometer diferentes

espécies de vegetais, além de serem produtores de micotoxinas. Embora pesquisas

apontem este grupo de fungos como sendo grande causador de doenças em vegetais, há

descrições de espécies não patogênicas (MARTINS, 2005).

O advento das análises moleculares, com o sequenciamento de múltiplos genes

associado aos métodos de detecção e quantificação de compostos constitutivos da

biomassa dos fungos (ergosterol), tem tornado possível a identificação de espécies de

fungos morfologicamente similares (GEISER et al., 2004). A identificação das espécies de

Fusarium se faz necessária para a diferenciação das espécies entre patógenas ou não, o que

exige estudos profundos na caracterização molecular e morfológica dos isolados fúngicos

por meio da taxonomia polifásica. Para tanto, três conceitos estão envolvidos na

identificação de espécies de Fusarium: o morfológico, baseado na similaridade existente

entre os caracteres observados; o biológico, que foca na compatibilidade sexual entre

membros da mesma espécie; e o filogenético, que tem como fundamento a análise de

sequências gênicas (MACIEL, 2012).

A taxonomia polifásica utilizada atualmente objetiva integrar informações

diversas, tais como: características microscópicas e macroscópicas, fisiológicas, dados

moleculares e produção de metabólitos. Essas informações, em conjunto, são importantes

para a correta identificação das espécies. Novas classificações de espécies, inclusive, têm

sido propostas para diversos grupos de fungos com base nos dados levantados pela

taxonomia polifásica (FRISVAD; SAMSON, 2004).

Neste contexto, a hipótese deste estudo é que alguns espécimes de Fusarium

depositados na Micoteca URM após uma autenticação taxonomica polifásica, pertencem as

espécies Fusarium lateritium, F. oxysporum e F. solani e que além disso, são eficientes na

descoloração do efluente têxtil, podendo atuar como biorremediadores de ambientes

contaminados por indústrias têxteis. Com isso, o objetivo desta pesquisa foi caracterizar

isolados de Fusarium lateritium, F. oxysporum e F. solani depositados na Micoteca URM

quanto à taxonomia por uma abordagem polifásica, e quanto à capacidade de degradação

de efluentes de lavanderia de indústria têxtil do município de Toritama-PE.


2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 INDÚSTRIAS TÊXTEIS NO BRASIL

O setor têxtil surgiu no final do século XVIII e é um dos mais tradicionais

segmentos dos setores industriais, tendo destaque na economia de diversos países. O

processo de industrialização têxtil no Brasil teve inicio no final do século XIX, tomando

grande proporção no século XX, de forma que constitui hoje um fator de significativa

importância no desenvolvimento da economia nacional, além de atualmente representar a

sexta maior economia produtora de confecções no mundo (CAMPOS; CAMPOS 2005;

ARAÚJO; PEREIRA, 2006; HASSEMER, 2006; COSTA, 2008).

Segundo a Associação Brasileira da Indústria Têxtil e de Confecção (ABIT), o

setor têxtil e de confecção nacional compreende mais de 30 mil empresas e gera em torno

de 1,65 milhões de empregos em toda a sua extensa cadeia, que inclui fios, fibras,

tecelagens e confecções. Apesar dos benefícios econômicos, essa atividade possui alto

potencial poluidor (SILVA, 2012).

Estas indústrias utilizam grandes volumes de água, corantes e produtos químicos

ao longo de uma complexa cadeia produtiva, gerando efluentes líquidos, constituídos por

uma mistura de componentes coloridos e tóxicos, incluindo compostos cancerígenos, assim

como emissões gasosas e resíduos sólidos (ROBINSON et al., 2001).

Durante o processamento na indústria têxtil, há consumo de significativa

quantidade de água. Para se ter ideia dos grandes volumes envolvidos, estima-se que

aproximadamente 100 m3 de água são utilizados, em média, no processamento de cada

tonelada de tecido. Isso demonstra que a indústria deve preocupar-se em obter métodos

para suprir a demanda e também buscar alternativas para tratar e reutilizar esse bem

(HASSEMER; SENS, 2002; TORRALBA, 2008).

O setor têxtil tem se destacado como estimulador da criação de outras indústrias,

entre as quais as de máquinas têxteis, de fibras artificiais e sintéticas, de embalagens, de

drogas e anilinas. É necessário citar a importância da imensa massa trabalhadora existente

na produção de fibras naturais, na lavoura e na pecuária ovina (VIEIRA, 1995).

O Brasil possui vários pólos têxteis e de confecções, entre estes os principais são

Rio Grande do Sul (Serra Gaúcha), Santa Catarina (Vale do Itajaí), São Paulo (Americana

e região, Serra Negra, Águas de Lindóia), Minas Gerais (Belo Horizonte, Divinópolis,


Cataguases e Juiz de Fora) e Pernambuco (Caruaru, Toritama e Santa Cruz do Capibaribe)

(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE INDÚSTRIAS TÊXTIL - ABIT, 2013).

2.2 PÓLO TÊXTIL E DE CONFECÇÕES DO AGRESTE DE PERNAMBUCO

Os municípios de Caruaru, Toritama e Santa Cruz do Capibaribe estão localizados

no Agreste Pernambucano e fazem parte do pólo têxtil e de confecções do Estado de

Pernambuco. Concentram aproximadamente 60% dos estabelecimentos industriais do setor

no Estado e contribuem elevando os níveis de empregabilidade, demonstrando significativa

importância para a economia da região (LUCENA, 2004; SILVA, 2012).

As indústrias de confecções se instalaram em Pernambuco por volta de 1970

quando iniciaram suas atividades através do reaproveitamento de retalhos de tecidos de

jeans e malhas que eram trazidos de São Paulo por caminhoneiros, e vendidos às

costureiras dos municípios de Toritama e Santa Cruz do Capibaribe. Essa atividade no

setor têxtil proporcionou para os microempresários da região, matéria prima de baixo custo

que eram vendidas a preços populares estimulando o desenvolvimento e crescimento deste

setor na região, tornando-o conhecido em todo o Brasil por suas feiras populares (COSTA,

2008; BARROS, 2009; SILVA, 2012).

O município de Toritama, conhecido como a capital do jeans, corresponde a uma

área de 34,8 km2 e concentra cerca de 35 mil habitantes (IBGE, 2010). Situada no Agreste

Setentrional de Pernambuco, a cidade localiza-se a 167 km do Recife e 36 km de Caruaru.

Apesar de apresentar uma reduzida extensão territorial, o município é considerado o maior

produtor têxtil das regiões Norte e Nordeste, e responsável por 14% da produção nacional

de jeans, com cerca de 2 milhões de peças/ano, perfazendo um montante de 6 milhões de

reais/ano (CPRH, 2005).

No pólo de confecções de Toritama, mais de 80 lavanderias e tinturarias realizam

a atividade de beneficiamento do jeans. O processo de beneficiamento proporciona ao

material aspecto envelhecido, leve e confortável, alterando as características como a cor,

toque e maciez do tecido. Para realizar o processo de beneficiamento do jeans são

necessárias algumas etapas como lavagem, estonagem, amaciamento, tingimento e

branqueamento (COSTA, 2008; SILVA, 2012).

A atividade têxtil é considerade uma atividade de grande impacto ambiental e o

beneficiamento do jeans é considerado crítico por empregar, em suas etapas, a maior

quantidade de substâncias químicas de alto risco ambiental, sendo potenciais poluidoras


dos rios, do solo e do ar (BASTIAN, 2009). A maior fonte poluidora deste processo são os

efluentes gerados que apresentam características variadas, possuindo elevadas

concentrações de compostos orgânicos como gomas, sabão, detergente, álcoois, corantes

entre outras substâncias (DELLAMATRICE, 2005; DE SOUZA; PERALTA -ZAMORA,

2005, COSTA, 2008).

2.3 EFLUENTES TÊXTEIS

Os efluentes têxteis gerados nas indústrias e lavanderias são altamente coloridos,

devido à presença de corantes que não se fixaram na fibra durante o processo de

tingimento. Além dos corantes, os efluentes têxteis apresentam grandes quantidades de

sólidos suspensos, altos valores de demanda química de oxigênio (DQO) e de demanda

bioquímica de oxigênio (DBO), elevadas temperaturas, acidez ou alcalinidade e outras

substâncias que estão presentes, como os surfactantes, metais, amido, dispersantes, óleos,

emulsificantes, solventes, soda cáustica, sais orgânicos e inorgânicos (DELLAMATRICE;

MONTEIRO, 2006; SILVA, 2012). A utilização contínua de vários aditivos químicos de

composição variada tais como: umectantes, antiespumantes, eletrólitos, ácidos e bases,

sequestrantes, entre outros, durante o banho de tintura, montagem e fixação dificultam o

processo de tratamento do efluente (ZANONI; CARNEIRO, 2001).

Sabe-se que a industrialização é um fator preponderante na degradação ambiental

e que a poluição da água, do solo e do ar teve um aumento significativo a partir da

Revolução Industrial (TORRES, 1996). Apesar de existir uma preocupação universal para

evitar a contaminação ambiental, esta ocorre naturalmente através dos processos de

transformação industrial, onde há a geração de resíduos que, direta ou indiretamente, são

lançados no meio ambiente (MORAIS, 1999).

A água é um recurso valioso e está cada vez mais escasso devido ao seu uso

indiscriminado, ao elevado crescimento populacional e à elevação dos padrões de vida da

população, além da ocorrência de contaminação de toda ordem. Devido à sua abundância e

ao fato de se apresentar sob as mais diversas formas, há uma dificuldade em avaliar a

importância da água, pois, embora seja um bem renovável, há um limite na disponibilidade

mundial de recursos hídricos (DA SILVA; ESPOSITO, 2004).

Nas tinturarias e lavanderias, a água é utilizada como veículo para os produtos

químicos que participam do processo de lavagem, tingimento e acabamento dos tecidos e,

também, para remover o excesso de produtos utilizados (IMMICH, 2006). No processo de


tingimento de tecidos de algodão é necessária uma considerável quantidade de água, tendo

como consequência grandes volumes de efluentes contaminados (COSTA, 2008).

A poluição das águas ocorre num ritmo mais acelerado que a poluição

atmosférica, tendo em vista que os compostos nocivos lançados em corpos hídricos são,

em sua estrutura química, muito maiores que os encontrados no ar (FELLENBERG, 1980).

As indústrias têxteis apresentam grandes dificuldades em realizar, de maneira eficiente, o

tratamento de águas residuárias geradas em seus processos de produção, principalmente no

que diz respeito à remoção de corantes desses efluentes que, mesmo em pequenas

quantidades, apresentam cor intensa, constituindo um dos efluentes mais complexos e

problemáticos a serem tratados (VASQUES et al., 2011).

O lançamento de efluentes sem o tratamento adequado no meio ambiente ocasiona

problemas estéticos e ambientais, refletindo diretamente na atividade de fotossíntese e na

realização dos processos biológicos dos indivíduos que habitam os corpos hídricos,

causando um desequilíbrio ambiental (PEREIRA et al., 2010). Além dos danos ambientais,

o uso de diversos compostos nas indústrias têxteis em variadas concentrações pode ser

prejudicial aos humanos, podendo causar desde pequenas irritações na região ocular e

nasal até o aparecimento de câncer. Podem gerar também danos a órgãos como rins, fígado

e pulmão, além de depressão, teratogênese e mutagênese (COSTA, 2008).

2.4 TRATAMENTO DE EFLUENTES TÊXTEIS

O efluente têxtil, quando liberado no ambiente sem o devido tratamento, acaba

gerando grande impacto ambiental (KUNZ et al., 2001). Devido à complexidade,

variedade e natureza química dos compostos presentes no efluente têxtil, não há um

método universal para o seu tratamento. Tal situação verifica-se, sobretudo, em relação à

natureza química dos corantes que são confeccionados com o intuito de resistirem à ação

de agentes oxidantes, sabão, luz e suor, pois os produtos finais devem atender ao padrão de

exigência do consumidor tanto inicialmente quanto após o uso prolongado. Assim, estes

compostos apresentam elevada estabilidade e baixa degradabilidade (FERREIRA, 2001).

Segundo a Resolução nº 430 de maio/2011, do Conselho Nacional do Meio

Ambiente (CONAMA), os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser

lançados diretamente no corpo receptor se obedecerem às condições e padrões previstos na

resolução, como por exemplo, pH variando entre 5 e 9, temperatura acima de 3°C e abaixo

de 40°C, ausência de material flutuante e remoção de no mínimo 60% da DBO.


Existem basicamente três tipos de tratamento para os efluentes têxteis: físicos,

químicos e biológicos. De modo geral, o tratamento de efluentes contendo corantes pode

ser baseado em dois processos distintos: remoção da cor por técnicas que permitam

eliminar os compostos por transferência, sem degradar os componentes, ou através da

utilização de métodos que permitam a degradação parcial ou total (mineralização) dos

componentes do efluente têxtil (KAMIDA et al., 2005; SILVA, 2012).

As indústrias têxteis, geralmente, utilizam processos de tratamento de efluentes

que consistem em sistemas físico-químicos, seguidos de tratamento biológico através do

sistema de lodo ativado. Embora estes apresentem alta eficiência na remoção da cor do

efluente, apresentam também um contraponto que é a geração de um resíduo, o lodo, que é

considerado preocupante do ponto de vista ambiental, pela quantidade de corantes e outras

substâncias adsorvidas. Deste modo, a busca por alternativas de tratamento dos efluentes

têxteis que não gere nenhum tipo de resíduo é de extrema importância (OLIVEIRA et al.,

2010; PEREIRA et al., 2010; SANTOS et al., 2011).

Na região agreste de Pernambuco, a reutilização da água dentro do setor industrial

se faz necessária devido à sua escassez. Processos físico-químicos estão sendo implantados

em algumas indústrias como forma de tratamento de efluentes, possibilitando a reutilização

de cerca de 60% da água utilizada para os processos de beneficiamento de confecções. O

percentual restante da água residuária é submetida a tratamento e lançada em corpos

hídricos com baixa carga poluidora (SANTOS et al., 2005).

2.4.1 Tratamento físico do efluente têxtil

O tratamento físico dos efluentes consiste basicamente em retirar os resíduos

sólidos em suspensão, sedimentáveis e flutuantes através de processos como:

peneiramento, gradeamento, separação de óleos e gorduras, sedimentação e flotação.

Alguns processos tem a única finalidade de desinfecção, através da radiação ultravioleta.

Outros ainda possuem a capacidade de remover a matéria orgânica e inorgânica em

suspensão coloidal, reduzindo ou eliminando a presença de micro-organismos, como

filtração em areia e filtração em membranas (microfiltração e ultrafiltração)

(GIORDIANO, 2011).

Estudos sobre os tratamentos físicos mostraram que dentre os processos mais

utilizados no tratamento de efluentes e corantes têxteis está o método de adsorção com

carvão ativado. A adsorção é considerada uma das melhores tecnologias no tratamento de


efluentes, por apresentar grande aplicabilidade, possibilitando a reutilização da água no

processo industrial e, por essa razão, está sendo bastante explorada pelas indústrias. A

descoloração por adsorção pode ser influenciada por fatores como: tamanho da partícula do

corante, temperatura e tempo de contato (SILVA, 2012).

O carvão ativado é considerado como um adsorvente universal para a retirada de

partículas poluentes de águas residuárias, tais como corantes e metais pesados, devido às

suas áreas de superfície, elevada capacidade de adsorção, rápida adsorção e relativa

facilidade de regeneração. No entanto, outros materiais podem ser utilizados como

adsorventes alternativos, como o carvão ativado de coco, bambu, casca de eucalipto,

quitosana, farelo de trigo, farelo de arroz (KUNZ, 2002; SUZUKI et al., 2007;

SATHISHKUMAR et al., 2012).

De maneira geral, os processos citados anteriormente são eficientes na remoção

do material particulado, entretanto, as substâncias como os corantes e compostos orgânicos

não são degradados ou eliminados, permanecendo o problema, pois os compostos

poluentes estão concentrados em elevados teores, e não conseguem ser degradados de fato.

Apesar disto, vale salientar a importância da utilização dos métodos físicos nas etapas

iniciais de um tratamento para obtenção de um resultado eficaz (FREIRE et al., 2000).

2.4.2 Tratamento químico do efluente têxtil

O tratamento químico tem sido aplicado em sistemas ambientais com a finalidade

de atuar no melhoramento de águas e de efluentes têxteis, na purificação do ar, entre

outros. Na maioria das vezes, este é utilizado em associação com outro tipo de tratamento,

físico ou biológico, para obtenção de um resultado favorável (FREIRE et al., 2000).

Os processos químicos utilizam produtos como agentes de coagulação, flocação,

neutralização de pH, oxidação, redução e desinfecção em diferentes etapas dos sistemas de

tratamento. Estes processos, através de reações químicas, promovem a retirada dos

poluentes. Os principais processos químicos utilizados nas indústrias são clarificação

química (remove a matéria orgânica coloidal e coliformes), eletrocoagulação (remove a

matéria orgânica, incluindo compostos coloidais, óleos e gorduras), precipitação de fosfato

e outros sais pela adição de coagulantes químicos (remove nutrientes) (GIORDIANO,

2011).

O método químico utilizado com maior frequência para o tratamento de efluentes

coloridos é o processo oxidativo. A oxidação acontece pela remoção do corante dos


efluentes através da quebra dos anéis aromáticos presentes nas moléculas do corante. Em

geral, o agente oxidante utilizado é o peróxido de hidrogênio (H2O2), variando apenas o

processo de ativação, por utilização de íons metálicos ou óxidos semicondutores, tendo

como alternativa a utilização de irradiação com luz ultravioleta (SILVA, 2012).

A utilização da técnica de ozônio foi pioneira no início da década de 1970. A

oxidação utilizando ozônio pode auxiliar na degradação de diversos compostos fenólicos,

hidrocarbonetos clorados ou aromáticos, pesticidas. Um benefício desta técnica é que este

pode ser aplicado de forma gasosa, não modificando o volume final do efluente e do lodo,

entretanto, como fator negativo, se tem a curta duração do efeito da utilização do ozônio,

sendo necessária aplicação frequente, aumentando os custos do processo (ANJANEYULU

et al., 2005).

Os sistemas de tratamento químico, na maioria das vezes, não possuem total

eficiência, visto que são processos não destrutivos, ou seja, o volume dos resíduos é

diminuído, mas grande parte da fase sólida ainda continua presente sem destino adequado

(KUNZ et al., 2002). De modo geral, os métodos físico-químicos utilizados nas indústrias

têxteis auxiliam na remoção da cor e matéria orgânica, entretanto, a aplicação desses

métodos resulta em altos custos de implantação e de manutenção, além de produzir grande

quantidade de lodo (DOS SANTOS, 2005).

2.4.3 Tratamento biológico do efluente têxtil

Os tratamentos biológicos têm como objetivo remover a matéria orgânica

dissolvida e em suspensão, através da transformação destas em sólidos sedimentáveis

(flocos biológicos), ou gases. Estes processos utilizam matéria orgânica dissolvida ou em

suspensão como substrato para micro-organismos tais como fungos, bactérias e

protozoários, que a transformam em gases, água e em outras substâncias. Os produtos

finais deste processo devem apresentar uma maior estabilidade, mostrando os efluentes

agora tratados, um aspecto mais claro, uma diminuição significativa da presença de micro-

organismos e matéria orgânica (GIORDIANO, 2011).

Os tratamentos com base em processos biológicos são utilizados com maior

frequência por pesquisadores envolvidos em estudos de biodegradação, uma vez que

permitem o tratamento de grandes volumes de efluentes por diversas espécies de bactérias,

fungos e protozoários (Freire et al., 2000). Entretanto, há uma intensa busca por micro-

organismos com maior capacidade para degradar os resíduos dos efluentes de maneira mais


eficiente e com baixo custo econômico. De modo prático, existem ainda muitas

dificuldades a serem superadas devido à grande diversidade, concentração e composição de

espécies químicas presentes em inúmeros efluentes (KUNZ et al., 2002).

O tratamento biológico baseia-se na utilização dos compostos tóxicos de interesse

como substratos para o crescimento e manutenção de micro-organismos. Os processos

biológicos podem ser divididos em aeróbios e anaeróbios. Na condição aeróbia, ocorre a

formação de CO2 e H2O, e o oxigênio molecular é o aceptor de elétrons. Nos anaeróbios,

ocorre a degradação de CO2 e CH4, e o oxigênio molecular está ausente. Algumas formas

de carbono, enxofre e nitrogênio participam do processo como aceptores de elétrons (ex:

NO3, SO4-2

, CO2) (FREIRE et al., 2000).

Os processos aeróbios mais aplicados por pesquisadores para o tratamento de

efluentes são: lodo ativado, filtros biológicos e lagoas aeróbias. O sistema de lodo ativado

consiste na utilização de micro-organismos que estão em suspensão no efluente (meio

líquido) e que sofrem constante mistura pelo próprio sistema de aeração, sem precisar de

agitação. Este sistema possui vários benefícios, como a obtenção de um efluente de ótima

qualidade, é um método estável, no qual se pode alterar o tempo de contato entre o efluente

e o micro-organismo, e ainda possui a capacidade de absorver compostos tóxicos. No que

se refere à desvantagem deste processo está a formação de um grande volume de lodo,

além do enorme consumo de energia (SILVA, 2012).

Um exemplo de um tipo de tratamento é a utilização de lagoas de estabilização

que consiste de lagos com pouca profundidade onde são lançados os efluentes

contaminados, que através de processo aeróbio e anaeróbio sofrem oxidação. Esse

tratamento não possui boa eficácia, sendo um tipo de processo biológico utilizado para

tratamento de esgoto (CASAS, 2004).

De acordo com Costa (2008), a utilização de micro-organismos para

biodegradação de corantes sintéticos é um atraente e simples método de operação, cujos

mecanismos biológicos são complexos. Estudos esclarecem que os micro-organismos são

capazes de metabolizar apenas um composto e por esse motivo, realizam um processo

limitado, diferentemente do consórcio de micro-organismos que age de maneira mais

eficiente, apresentando larga capacidade enzimática capaz de degradar poluentes

complexos.

A utilização de micro-organismos no saneamento básico ambiental é prática

antiga e comum nos processos biológicos de tratamento de águas residuárias e resíduos

sólidos. A utilização de agentes biológicos pela engenharia sanitária firmou-se pela


comprovação da capacidade destes micro-organismos de catabolizar diferentes compostos

orgânicos e inorgânicos, naturais ou sintéticos, para auxiliar na solução dos problemas

relacionados aos rejeitos lançados no ambiente (DELLAMATRICE, 2005).

A biorremediação utilizando os fungos como agente biológico vem ganhando

destaque nas últimas décadas, tendo em vista diversos estudos apresentando esses

microrganismos como promissores na degradação de poluentes orgânicos (LIMA et al.,

2011). Apesar desta ascensão na utilização de fungos, outras pesquisas confirmam que

estes organismos tendem a apresentar diferentes níveis de sucesso na degradação, que

podem variar de acordo com as condições adequadas de desenvolvimento fúngico e

quantidade de poluentes tóxicos do ambiente (SINGLETON, 2001; LIMA et al., 2011).

2.5 FUNGOS

Os fungos são seres que apresentam uma organização celular mais complexa do

que as bactérias, possuem uma membrana celular envolvendo o seu núcleo e por isso são

chamados de eucariontes. Estes micro-organismos podem ser unicelulares ou

pluricelulares, apresentam uma parede celular composta geralmente de quitina, são

heterotróficos, cuja nutrição ocorre por absorção de nutrientes e sua principal substância de

reserva é o glicogênio (VERMELHO et al., 2006; WEARING, 2010). Segundo Black

(2002), a estrutura dos fungos é formada por hifas que, frouxamente organizadas, dão

origem ao micélio. As células/hifas apresentam um ou mais núcleos e podem ser septadas

(presença de septo) ou não (hifa cenocítica ou asseptada).

Os fungos podem ser divididos em dois grandes grupos: fungos filamentosos e

leveduras, que são unicelulares. A reprodução pode ocorrer de duas maneiras: assexuada

e/ou sexuada. A reprodução assexuada pode ocorrer por fragmentação da hifa ou por

germinação de esporos (VERMELHO et al., 2006). A reprodução sexuada ocorre de

diversas formas, entre elas, plasmogamia. Os fungos produzem esporos tanto assexuada

quanto sexuadamente, e os esporos podem apresentar um ou mais núcleos (BLACK,

2002). Os esporos podem apresentar morfologia e tamanhos diversos, e podem ser

transportados pelo vento, água, animais, propágulos de plantas, podendo ser resistentes as

mudanças de temperatura no ambiente (SILVA, 2012).

No ecossistema podem viver numa grande variedade de habitats, por isso são

chamados de cosmopolitas. Podem ser decompositores, sapróbios, parasitas de interesse

médico entre outros. Os fungos são essenciais na decomposição da lignina e de outros


compostos derivados da madeira. Alguns secretam resíduos do metabolismo que são

tóxicos para outros organismos (BLACK, 2002).

De acordo com Guerra et al. (2009) e Gomes (2007), existem fatores que

influenciam no crescimento fúngico tais como: temperatura, pH, luminosidade,

disponibilidade de alimento, oxigênio e hidrogênio, salinidade e disponibilidade de

substrato específico. Alguns fungos são capazes de sobreviver em condições de

temperaturas e pH extremas, é o caso dos fungos termofílicos que suportam temperaturas

acima de 40C°, e os psicrófilos que conseguem crescer em condições de temperatura

abaixo do congelamento da água.

Os fungos são responsáveis pela maioria das transformações que caracterizam a

ciclagem de matéria orgânica no ambiente. Além disso, eles apresentam grande capacidade

de adaptação do metabolismo a diversas fontes de carbono e energia, o que é um fator

essencial para a sua sobrevivência. Este atributo se deve à produção de uma grande

quantidade de enzimas, não específicas, com capacidade de degradar polímeros de origem

vegetal, assim como um grande número de outras moléculas orgânicas (SILVA, 2012).

Estudos demonstram que diversos fungos são capazes de atuar como

biorremediadores de ambientes contaminados devido à capacidade de secretar enzimas

extracelulares que degradam substâncias recalcitrantes (LIMA et al., 2011). Araújo (2012)

realizou testes em meio sólido e líquido utilizando algumas espécies dos gêneros

Aspergillus, Penicillium, Cladosporium e Fusarium para a descoloração do corante têxtil

índigo carmine. Dos gêneros testados, Fusarium apresentou melhores índices de

descoloração. Mendonça et al. (2004) afirmam em seus estudos que o gênero Fusarium

apresenta capacidade de degradar compostos aromáticos presentes em resíduos

agroindustriais, no entanto, ainda são escassas as pesquisas do gênero Fusarium como

degradador de resíduos de lavanderias têxteis industriais.

2.6 O GÊNERO FUSARIUM

O gênero Fusarium foi descrito e classificado pela primeira vez em 1809, pelo

micólogo alemão Link. Pertence à família Nectriaceae, ordem Hypocreales, classe

Sordariomycetes, filo Ascomycota (MACIEL, 2012). Mais de 1472 espécies foram

catalogadas até o momento, sendo 348 variedades e 140 formae speciales (SOUSA, 2010).

No ano de 1935, Wollenweber e Reinking realizaram a primeira grande revisão

sobre o gênero Fusarium, e foram reconhecidas cerca de 65 espécies, 55 variedades e 22


formae specialis, reunidas em 16 seções. Posteriormente, um novo sistema de classificação

baseado em apenas 9 espécies foi proposto por Snyder e Hansen (1940; 1945). Booth

(1971) propôs um sistema baseado em 44 espécies com 12 seções e Nelson et al. (1983)

propuseram um sistema de classificação com 40 espécies.

Esse gênero apresenta um elevado nível de diversidade por suas espécies exibirem

atributos morfológicos, fisiológicos e ecológicos que contribuem para que ocorram nas

mais diversas regiões geográficas do globo (BURGUESS et al., 1997). São considerados

cosmopolitas, entretanto, algumas espécies são restritas a determinados ambientes,

ocorrendo predominantemente nas regiões tropicais e subtropicais, ou em condições de

clima frio das regiões temperadas (FORTES, 2006).

A maioria das espécies de Fusarium é classificada como habitante do solo,

enquanto outras foram encontradas somente em localidades específicas (MICHEREFF et

al., 2005; LAZAROTTO, 2013). Também podem ser encontrados habitando os tecidos

vegetais como parasitas e, ainda, há relatos de espécies presentes no ar e nos alimentos

(URBEN et al., 2009). A patogenicidade desses fungos ao homem ocorre por meio de

micotoxicoses ou de doenças invasivas (NELSON et al., 1994) e muitas espécies também

podem causar o apodrecimento de grãos e são descritas, na literatura, como importantes

produtores de micotoxinas (MARTINS, 2005).

A taxonomia morfológica desse grupo é considerada complexa, por se basear nas

características fenotípicas que muitas vezes podem sofrer variações devido à influência do

ambiente e às condições nutricionais (ANGELOTTI, 2003; SOUSA, 2010). A maioria das

espécies de Fusarium descritas foi classificada através do exame das estruturas

reprodutivas assexuadas, retiradas diretamente dos hospedeiros ou do substrato natural

(VENTURA, 2000; ANGELOTTI, 2003).

Para identificação de espécies de Fusarium, alguns autores utilizam descrições

baseadas nas características culturais dos fungos, tais como: estruturas reprodutivas,

crescimento micelial, pigmentação, odores, além de observações microscópicas de

conidióforos, macroconídios, microconídios e clamidósporos. A base para identificação

das espécies desse gênero é a morfologia dos macroconídios. Além deste, outros caracteres

devem ser considerados, como a produção e morfologia dos microconídios e

clamidósporos, morfologia das culturas, taxa de crescimento e especificidade do

hospedeiro. Estudos sobre a produção de micotoxinas e o uso de ferramentas moleculares

também estão auxiliando na identificação (BOOTH, 1971; NELSON et al., 1983;

VENTURA, 2000; SUMMERELL et al. 2003; OLIVEIRA; COSTA, 2002).


Devido às variações e plasticidades apresentadas pelas características fenotípicas

do gênero Fusarium, a taxonomia baseada apenas nos conceitos morfológicos tornou-se

insuficiente, por isso, a busca por novos instrumentos e ferramentas de identificação

mostrou-se indispensável para uma classificação mais precisa (OLIVEIRA; COSTA,

2002).

2.7 O USO DA TAXONOMIA NA IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS

A palavra taxonomia tem origem grega e foi usada pela primeira vez pelo médico

e cientista sueco Carl Von Linné em 1735, na obra Systemas Naturae. O estudo

taxonômico surgiu devido à necessidade do homem de classificar, organizar e agrupar os

seres vivos com a finalidade de promover pesquisas e compreender os mesmos. Um

sistema de classificação de organismos baseado nas características morfológicas foi

utilizado e atualmente é reconhecido como um método clássico de identificação

(CAMACHO, 2013).

Apesar de fornecer informações morfológicas importantes, o método clássico

apresenta grandes limitações no processo de distinção de espécies morfologicamente

próximas que preocupam os taxonomistas no momento de determinar as características

chaves para definir um gênero ou uma espécie (GUARRO et al., 1999).

A caracterização morfológica, embora essencial, é limitada muitas vezes devido ao

número de caracteres passíveis de serem analisados (FUNGARO, 2000). Características

morfológicas marcantes, como pigmentação, textura, forma marginal e velocidade de

crescimento da colônia, produção de estruturas típicas, presença ou ausência de zonas

concêntricas (BURGESS et al., 1995; URBEN; OLIVEIRA, 1999), entre outros, são, de

modo geral, instáveis e condicionáveis a vários aspectos como, por exemplo, a composição

do meio utilizado, condições de incubação e a própria variação intraespecífica dos

organismos. Portanto, podem ser subjetivos, inconclusivos e podem induzir a erros de

interpretação quanto à identificação das espécies em estudo já que, muitas vezes, as

características de uma colônia atípica de um organismo podem assemelhar-se à colônia de

outra espécie.

A partir da década de 50, a taxonomia morfológica começou a ter influência das

informações obtidas através da citologia e genética. Ambas contribuíram para expansão do

tradicional sistema de classificação. Por volta de 1965, surgiu a taxonomia numérica, com

o objetivo de analisar em conjunto uma grande quantidade de dados de origens diversas


utilizando algoritmos matemáticos. Mais adiante, vários trabalhos foram publicados

empregando a taxonomia morfológica associada à quimiotaxonomia, e a partir da década

de 1990, surgiram às primeiras informações de pesquisas utilizando dados baseados em

sequências de DNA e analisados através da sistemática molecular (BARROS, 2013).

O aprimoramento das técnicas moleculares em estudos de taxonomia vem sendo

implantados em muitos trabalhos, e sua aplicação vem contribuindo para um melhor

entendimento das relações filogenéticas entre espécies em geral e, principalmente, de

fungos, assim como contribuindo para uma melhoria no sistema de classificação de novas

espécies (AZEVEDO et al., 2006).

Com o intuito de complementar a identificação por abordagem unicamente

fenotípica, as análises moleculares vem fornecendo informações mais estáveis, tendo em

vista que as sequências de DNA são pouco susceptíveis às alterações ambientais em curto

prazo, dando maior confiabilidade no processo de identificação de espécies. Pesquisas vem

demonstrando que resultados obtidos através de uma abordagem molecular complementam

hipóteses baseadas em estudos realizados apenas por análises morfológicas, mostrando a

importância de se realizar a identificação não só por análise morfológica, mas também,

molecular (SAMUELS; SEIFERT, 1995).

2.7.1 Ferramentas moleculares no estudo da Taxonomia de fungos

A identidade dos seres vivos é determinada pela composição e sequência do

material genético. O uso de técnicas moleculares e análise de DNA possui a vantagem de

ser um processo rápido e altamente sensível. Essas técnicas não estão sujeitas a variações

fenotípicas, à ação do ambiente, ao estágio de desenvolvimento do fungo e a outros fatores

que possam alterar a morfologia do organismo. As técnicas conhecidas de diagnóstico

molecular baseiam-se na análise direta ou indireta da composição ou da sequência dos

ácidos nucléicos para identificação e caracterização de organismos (MENEZES et al.,

2010).

O DNA ribossomal é composto por várias regiões distintas (genes e espaçadores)

e está presente em todos os organismos. Estudos filogenéticos utilizam o rDNA para

auxiliar na identificação de organismos em diversos níveis taxonômicos, inclusive na

identificação de espécies (LANA, 2004). A síntese de proteínas depende da participação do

rRNA no processo de tradução da informação genética e a codificação do rRNA está

localizada em regiões específicas do genoma chamado rDNA. Esse tem como


característica marcante sua repetitividade, uma propriedade que permite um grande número

de aproveitamentos. Sendo assim, por ser repetitivo, a proporção do rDNA é, geralmente,

alta em relação ao conteúdo total de DNA da espécie. As regiões 28S, 18S e 5.8S das

unidades de repetição apresentam pouca variação de sequência, enquanto que as regiões

espaçadoras internas variam bastante (FUNGARO, 2000).

Segundo Fungaro (2000), a região 18S é considerada a mais conservada e, por

esse motivo, é utilizada apenas para comparação de organismos filogeneticamente mais

afastados. Já a região 28S apresenta grande variação e, portanto, é adequada para a

comparação de diferentes gêneros ou, em alguns casos, de diferentes espécies. As regiões

ITS (Internal Transcribed Spacer) sofrem modificações rapidamente e, geralmente, são

apropriadas para discriminar espécies relacionadas ou, até mesmo, variedades de uma

espécie.

Ao nível de espécie, as regiões dos espaçadores internos transcritos (ITS1 e ITS2)

auxiliam nos estudos taxonômicos de vários grupos, como os fungos (CARBONE; KOHN,

1997). A região ITS nos fungos varia, aproximadamente, de 500 a 800 pares de bases e

pode ser amplificada utilizando primers universais, os quais são complementares às

sequências altamente conservadas dos genes que codificam o rRNA (LARENA et al.,

1999). Os primers universais ITS1 e ITS4 são frequentemente utilizados na amplificação

desta região (WHITE et al., 1990).

Atualmente, um grande número de sequências da região ITS de diferentes fungos

encontra-se disponível em banco de dados de sequências de nucleotídeos. A utilização de

programas computacionais, que permitem a comparação de sequências com outras

similares ou não, ajuda a definir regiões apropriadas para a síntese de primers para detectar

uma determinada espécie de fungos (LANA, 2004).

De acordo com Keeling e Inagaki (2004) o fator de alongamento da tradução1-α

(Tef) é um elemento altamente conservado da família das GTPases, que incluem fatores

protéicos envolvidos no início do alongamento e término da tradução. É considerado pelos

autores uma das proteínas celulares mais abundantes e tem como importante característica

a conservação da sequência de aminoácidos, o que tem ajudado bastante nos estudos de

análise filogenética em fungos (NAKAZATO, 2005). Stringari (2009), ao estudar a

sistemática e diversidade genética de isolados de Guignardia spp. e Phyllosticta sp.,

concluíram que as regiões ITS e Tef são úteis para a distinção entre as espécies de G.

citricarpa, G. mangiferae, P. spinarum. Em ascomycetes filamentosos, além da região ITS

e dos fragmentos do gene Tef, outros genes podem ser considerados fonte potencialmente


rica de características para estudos de populações e de especiação (CARBONE; KOHN,

1999).

Segundo Geiser et al. (2004), o fator de elongação 1-α (Tef) é uma ferramenta

alternativa de identificação dos fungos por ocorrer de forma consistente como cópia única

no gênero Fusarium e apresentar um elevado nível de polimorfismo de sequências entre

espécies intimamente relacionadas. Estes autores foram responsáveis pela criação do banco

de dados FUSARIUM-ID, no qual se encontram depositadas, atualmente, cerca de 441

sequências do gênero Fusarium que representam uma variada seleção filogenética de

sequências do fator de elongação 1-α (Tef). Desta maneira, vários pesquisadores vêm

utilizando esse banco de dados para desvendar impasses sobre espécies pertencentes ao

gênero Fusarium e, consequentemente, contribuindo para uma correta identificação

taxonômica.

2.8 ANÁLISE DA BIOMASSA DE FUNGOS USANDO ERGOSTEROL

O ergosterol é o principal esterol presente nas células ou membranas miceliais da

grande maioria dos fungos. Os níveis mais elevados deste composto encontram-se nas

camadas fosfolipídicas da membrana fúngica (PEACOCK; GOOSEY, 1989), onde o

ergosterol desempenha uma importante função estrutural e hormonal na progressão do

ciclo celular (GOAD, 1994).

Fundamental para a arquitetura da membrana citoplasmática dos fungos, o

ergosterol aumenta a microviscosidade da membrana e participa, juntamente com os

fosfolipídios, na regulação das trocas na membrana celular (CAHAGNIER, 1988;

PEACOCK; GOOSEY, 1989). A ação do ergosterol na microviscosidade da membrana

dos fungos influencia na fluidez e no movimento molecular dos lípidos em geral, que por

sua vez, modulam a atividade de enzimas na membrana, como sintetases e ATPases.

Assim, a biossíntese do ergosterol é essencial para o normal crescimento e

desenvolvimento fisiológico da célula fúngica (RICARDO, 2013).

O ergosterol é praticamente insolúvel em água, entretanto, apresenta boa

solubilidade em solventes orgânicos. Além disso, possui boa estabilidade quando

manipulado em laboratório e, principalmente, quando conservado em meio alcalino

(GESSNER; SHMITT, 1996) e protegido da luz ultravioleta (SCHWADORF; MULLER,

1989).


O ergosterol é um composto termoestável e fotossensível. Os máximos de

absorção do ergosterol dissolvido em etanol absoluto situam-se nos comprimentos de onda

de 262, 271, 282 e 293 nm, sendo a sua absorção máxima obtida a 282 nm (RICARDO,

2013).

O ergosterol é um bom indicador de crescimento de fungos, pois pode

proporcionar uma boa correlação com a biomassa metabolicamente ativa do fungo

(NYLUND; WALLANDER, 1992). O conteúdo de ergosterol varia de acordo com a fase

do crescimento fúngico e, também, entre as espécies. Estudos tem demonstrado que a

quantidade de ergosterol é maior em micélios jovens ou velhos do que em micélio na fase

estacionária (ARNEZEDER; HAMPEL, 1991). A concentração de ergosterol numa massa

fúngica é dependente do estágio de desenvolvimento e, consequentemente, de fatores como

umidade, temperatura e tempo de crescimento (BENTZ; SIX, 2006). Ele também pode

variar entre estados nutricionais, além do efeito de alguns poluentes, em locais

contaminados (BARAJAS-ACEVES et al., 2002)

Trabalhos como os de Barajas-Aceves et al.(2002), Niemenmaa et al. (2008),

Montgomery et al. (2000) mostraram que o ergosterol é um indicador útil da biomassa

fúngica, podendo ser utilizado para monitoramento em processos de biorremediação.


3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. CULTURAS DE FUSARIUM

Para o estudo taxonômico foram utilizadas 25 culturas do gênero Fusarium,

sendo sete de F. lateritium, dez de F. oxysporum e oito de F. solani provenientes da

Micoteca URM da Universidade Federal de Pernambuco (Tabela 1).

Tabela 1- Culturas do gênero Fusarium depositadas na Micoteca URM da Universidade Federal de

Pernambuco, utilizadas neste trabalho

URM ESPÉCIE SUBSTRATO ANO DE DEPOSITO

5844 Fusarium lateritium Solo 2008

5456 F. lateritium Solo 2007

3148 F. lateritium Solo marinho 1989

6226 F. lateritium Endofítico 2010

4703 F. lateritium Solo 2003

4207 F. lateritium Rizosfera de girassol 1999

5291 F. lateritium Rizosfera de cana-de-

açúcar

2006

4613 Fusarium oxyporum Sedimento de manguezal 2003

5858 F. oxyporum Solo 2006

5005 F. oxyporum Solo -

6503 F. oxyporum Solo de sistema

agroflorestal

2011



6228 F. oxyporum Solo -


6704 F. oxyporum Endofítico 2012


3838 Fusarium solani Solo 1997

3821 F. solani Solo 1997




6749 F. solani Sedimento das margens

do rio Capibaribe

2012



Fonte: Autoria própria

3.2. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS LINHAGENS DE FUNGOS

As características morfológicas macroscópicas e microscópicas foram observadas

em microscopia de luz a partir de culturas cultivadas em meio Batata Dextrose Ágar

(BDA) e Ágar Nutriente Sintético (SNA) a 25°C, com 12h de luz fluorescente e 12h na

ausência de luz. As observações foram realizadas após sete dias de incubação e, em


seguida, as placas foram fotografadas. Para revisão taxonômica foi utilizada literatura

específica (BOOTH, 1971; LESLIE; SUMMERELL, 2006).

3.3. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS LINHAGENS DE FUSARIUM

A extração e amplificação de fragmentos de DNA das culturas foram realizadas

no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Micologia, CCB, UFPE. A

biomassa foi obtida a partir de culturas em Meio Mínimo líquido e mantidas sob agitação

de 250 rpm a 28ºC por 120 horas. Em seguida, o micélio foi coletado por filtração a vácuo

e lavado com água destilada e esterilizada. Foi determinado o peso úmido para a extração

do DNA e o material foi estocado a -20ºC em microtubos de 2 ml com tampa de rosca,

acrescidos de 0,5 g de contas de vidro (‘glass beads’) com dois diâmetros diferentes na

proporção de 1:1 (acid-washed, 150-212 µm and 425-600 µm; Sigma, U.S. sieve). O

material foi triturado por agitação em alta velocidade em um FastPrep. A extração do

DNA genômico foi realizada conforme o método de Góes-Neto et al. (2005). Para

amplificação da região ITS e do fator de elongação Tef foram utilizados os primers ITS1 e

ITS4 (WHITE et al., 1990), ef1 e ef2 (O’DONNELL et al., 1988) respectivamente. As

reações de PCR foram realizadas em Termociclador Axygen num volume total de solução

de 25µl contendo 25µl de Tampão da taq (10x), 0,2µl de MgCL2 (25µM), 0,5 de dNTP

(10mM), 2µl de cada primer (5mM), 0,2µl de Taq polimerase (5U/µl), 12,6µl de H2O

miliQ, 5µl de DNA (5ng/µl) e as condições de amplificação foram definidas com uma

desnaturação inicial de temperatura de 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de

temperatura de desnaturação de 94°C durante 45 segundos, hibridação do primer a 55°C

durante 45 segundos, a extensão do primer a 72°C durante 60 segundos e uma etapa de

extensão final a 72°C durante 7 minutos. Controles negativos, contendo todos os

componentes, exceto DNA, foram utilizados em cada procedimento para detectar possíveis

contaminações. Os produtos das extrações de DNA e das reações de PCR (5 μL) foram

visualizados em gel de agarose 1% corados com GelRed, em transiluminador UV. Os

produtos de amplificação foram purificados com o kit de purificação “PureLink PCR

Purification Kit” (Invitrogen) e encaminhados para sequenciamento na Plataforma

Multiusuária de Sequenciamento e Expressão Gênica do Centro de Ciências Biológicas da

UFPE.


3.3.1 Alinhamento das sequências e análise filogenética

Os cromatogramas do sequenciamento foram analisados para auxiliar na edição

manual das sequências. Após a edição, todas as sequências foram utilizadas para busca das

mais similares depositadas no banco de dados GenBank (Tabela 2) e FUSARIUM ID

(Tabela 3), utilizando a ferramenta BLASTn. As sequências de todos os isolados de

Fusarium foram, então, alinhadas em conjunto com as recuperadas da base de dados

utilizando o programa Clustal X (LARKIN et al., 2007). Os alinhamentos foram

posteriormente editados manualmente, utilizando o programa BioEdit (HALL et al., 2011).

Árvores filogenéticas foram construídas com o emprego dos métodos de neighbor

joining (NJ), máxima verossimilhança (MV) e máxima parcimônia (MP), com 5000

reamostragens de bootstrap, utilizando o programa PAUP versão 4 (SWOFFORD, 2003).

A construção da árvore por máxima verossimilhança foi realizada usando o modelo de

substituição nucleotídica determinado pelo ModelTest 3.7 (POSADA; CRANDALL,

1998). Também foi construída uma árvore por meio de análise bayesiana (1 x 106

gerações) utilizando o programa MrBayes 3.1.2 (RONQUIST; HUELSENBECK, 2003) e

o mesmo modelo de substituição nucleotídica determinado para MV.

Tabela 2 – Acessos do GenBank de espécimes de Fusarium utilizados para reconstrução da árvore

filogenética da região ITS

Isolados Número de acesso

GenBank

Referência

Fusarium oxysporum f. sp. melonis AY188919.1 Hatsch,D. et al. (2004)

Fusarium oxysporum isolate 51 EU839400.1 Castro Lopez, N. et al.(2008)

Fusarium oxysporum f. sp. pisi strain

Arg3

KF913731.1 Bani,M. et al. (2013)

Fusarium oxysporum isolate 48 EU839398.1 Castro Lopez,N. et al.(2008)

Fusarium oxysporum isolate 42 EU839393.1 Castro Lopez,N. et al.(2008)

Fusarium equiseti isolate H02-765S

EU595566.1 Funnell-Harris,D.L. e Pedersen,J.F.

(2008)

Fusarium equiseti NRRL 26419 NR_121457.1 O'Donnell,K et al. (2009)

Fusarium equiseti isolate JG65 KJ412509.1 Valencia-Yah,T. et al. (2014)

Fusarium equiseti isolate ATT040 HQ607811.1 Rodrigues,A. et al. (2011)

Fusarium equiseti isolate JG4 KJ412500.1 Valencia-Yah,T. et al. (2014)

Fusarium lateritium AY904057.1 Melo-Sanguino,L. et al. (2005)

Fusarium lateritium FN547445.1 Santori,A. et al. (2010)


Fusarium lateritium FN547453.2 Vitale,S. et al. (2011)



Fusarium solani FJ948133.1 Sen,R. et al. (2009)

Fusarium solani FR691774.1 Sarmiento,J.M.(2010)

Fusarium solani isolate UENFCF275 JN006817.1 Gomes,V.M. et al. (2011)

Fusarium solani isolate CY230 HQ608044.1 Rodrigues,A. et al. (2010)

Fusarium solani clone OB3-1 JN882260.1 Gutierrez-Acosta,O.B. et al. (2012)

Fusarium solani HE974457.1 Lyskova,P. et al. (2012)

Trichoderma reesei strain SJVTR KF979305.1 Venkatesh,S.S. et al. (2013)

Hypocrea lixii strain CIB T44 EU280077.1 Hoyos-Carvajal,L. et al. (2007)


Tabela 3 - Acessos do banco de dados FUSARIUM ID de espécimes de Fusarium utilizados para

reconstrução da árvore filogenética dos fragmentos do gene Tef -1α

Isolados Número de acesso FUSARIUM ID

Complexo Fusarium oxysporum / espécie F. oxysporum NRRL36387



Complexo Fusarium oxysporum / espécie F. oxysporum NRLL38885

Complexo Fusarium oxysporum / espécie F. oxysporum NRLL38273

Complexo Gibberella fujikuroi / espécie F. proliferatum NRRL22944

Complexo Gibberella fujikuroi / espécie F. acutatum NRRL13308

Fusarium anguioides FD_01314 – NRRL31043

Fusarium polyphialidicum FD_01327 – NRRL25529

Fusarium sp. FD_01854 – NRRL25728

Fusarium concolor FD_01847 – NRRL13459

Complexo Fusarium incarnatum-equiseti NRRL34070

Complexo Fusarium incarnatum-equiseti 16-c NRRL34059

Complexo Fusarium incarnatum-equiseti 26-b NRRL28714

Complexo Fusarium incarnatum-equiseti 4-b NRRL36123

Complexo Fusarium solani 1-a NRRL28546

Complexo Fusarium solani 2-b NRRL43373

Complexo Fusarium solani 2-d NRRL22661

Complexo Fusarium solani 2-j NRRL43649

Complexo Fusarium solani 2-f NRRL28561

Fusarium delphinoides NRRL36152

Fusarium dimerum ET-gr. NRRL36384



3.4 EXTRAÇÃO DE ERGOSTEROL

O procedimento para extração de ergosterol foi realizado conforme a técnica

proposta por Seitz et al. (1977) com algumas adaptações. Foram utilizados 500mg de

micélio obtidos a partir do procedimento realizado no item 4.2. A biomassa foi colocada

em tubos de ensaio com tampa de rosca e adicionados 10 ml da solução extratora (etanol

absoluto + ác. Pirogálico). Os tubos foram submetidos a agitação por 2 horas em agitador

orbital e, em seguida, o conteúdo foi transferido para novos tubos e centrifugados a 12.000

rpm por 10 min a 10°C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo

tubo e adicionado 1 ml de KOH 60%, seguido de incubação em banho-maria a 90°C por 30

min. Após esse tempo, foram adicionados 1 ml de água destilada e 4 ml de hexano à cada

amostra. Os tubos foram agitados em vortex e colocado em repouso para separação das

fases. A fase hexânica foi removida para novo tubo e o processo repetido com mais 2 ml de

hexano. Em seguida, foram colocados os tubos com a fase hexânica abertos, em capela,

sobre placa aquecida para evaporação completa do hexano. Após a evaporação total do

hexano, os tubos receberam 2 ml de metanol e foram agitados em agitador orbital (TA) por

aproximadamente 1 hora. O ergosterol eluído foi transferido para tubos escuros com tampa

rosqueável e armazenados em freezer a -20°C.

3.4.1 Quantificação do ergosterol por cromatografia

O ergosterol foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Foram injetados 10µl da amostra no sistema cromatográfico no qual foi utilizado metanol

como fase móvel a um fluxo de 1ml/min. e uma coluna cromatográfica C18 fase reversa

(Kinetex- C18 – 5um 150 x 4.6 mm, Phenomenex). O ergosterol foi analisado com

detector de ultravioleta com comprimento de onda fixado em 282 nm. O tempo de retenção

cromatográfica do ergosterol foi de aproximadamente quatro minutos. A quantificação foi

realizada a partir da medida da área integrada do pico correspondente ao ergosterol contido

na amostra, comparado com a área do pico correspondente ao padrão de ergosterol.


3.5 SELEÇÃO DE ESPÉCIES DE FUSARIUM DEGRADADORAS DE

EFLUENTES TÊXTEIS

A coleta do efluente têxtil foi realizada na Lavanderia Mamute, no município de

Toritama, região agreste de Pernambuco. O efluente têxtil foi coletado em quatro pontos

distintos e, em seguida, o material foi homogeneizado em uma amostra composta. O

efluente composto foi caracterizado quanto aos parâmetros físico-químicos, apresentando

29°C de temperatura e pH 6,8. Para os testes de biodegradação do efluente têxtil, discos de

6mm de diâmetro de culturas fúngicas (sete dias/ BDA), foram inoculados em frascos de

Erlenmeyers (125 mL) contendo 50 mL do efluente têxtil esterilizado e 0,5 g de farelo de

trigo. Após a inoculação, os fracos foram armazenados em condição estática, em estufa

incubadora, a 30ºC, por doze dias, no escuro. Alíquotas de 5ml foram retiras após seis dias

e doze dias. Todo o experimento foi realizado em triplicata. Ao término deste período, o

material biodegradado foi conduzido para a análise na qual se determinou a redução da cor

em espectrofotômetro (MACHADO et al., 2006), utilizando o espectro de leitura com

comprimento de onda em 360 nm. Em seguida, o percentual de descoloração foi calculado

de acordo com a seguinte fórmula:

%D = AbsT0 – AbsTx X 100

AbsT0

Na qual:

AbsT0 = Absorbância inicial

AbsTx = Absorbância em cada tempo

3.6 ANÁLISE DOS DADOS

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. As análises foram realizadas com

auxílio do programa Assistat 7.6 beta (2011) e Minitab 17.


4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

4.1.1 Caracterização macroscópica

As 25 culturas de Fusarium depositadas na Micoteca URM da UFPE foram

avaliadas após sete dias de crescimento em meio de cultura BDA e SNA. As espécies

estudadas apresentaram as seguintes características quanto à macroscopia:

Fusarium lateritium – Em meio de cultura BDA, as colônias apresentaram em

seu verso coloração esbranquiçada, variando para cinza e podendo ser também creme,

rosado e amarronzado; seu anverso apresentou uma coloração semelhante ao verso,

entretanto em algumas colônias foi possível a observação de uma coloração amarelo

amarronzado; as colônias cresceram, em média, 4,42 cm em três dias e 10,21 cm em sete

dias; quanto ao aspecto da colônia, pode-se observar uma variação, apresentando colônias

flocosas, densas flocosas e esparsas, com margem regular e presença de micélio aéreo;

nenhuma das colônias apresentou formação de exsudato. Em meio de cultura SNA, o verso

e anverso das colônias apresentaram coloração esbranquiçada; o crescimento foi, em

média, de 2,77 cm em três dias e 7,77 cm em sete dias de incubação; as colônias

apresentaram consistência esparsa, com algumas exibindo consistência flocosa, com

margem regular, micélio aéreo e ausência de exsudatos (Figura 1).

Fusarium oxysporum – Em meio de cultura BDA, as colônias exibiram em seu

verso coloração violeta, apresentando também partes esbranquiçadas; seu anverso foi

bastante semelhante ao verso apresentando a mesma coloração; as colônias obtiveram em

média um crescimento de 2,47 cm em três dias e 8,13 cm em sete dias; as culturas

apresentaram aspecto flocoso, variando para esparso; margem regular foi verificada na

maioria das colônias, entretanto algumas exibiram margem irregular; presença de micélio

aéreo; nenhuma das colônias apresentou produção de exsudato. Em meio de cultura SNA,

as colônias mostraram uma coloração esbranquiçada para o verso e anverso; obtiveram

crescimento médio de 2,19 cm em três dias e de 7,63 cm em sete dias; colônias com

consistência flocosa esparsa foram observadas; a maioria exibiu margem regular com


algumas apresentando margem irregular; micélio aéreo presente e ausência de exsudatos

(Figura 2).

Figura 1 - Fusarium lateritium URM6226 verso e anverso após 7 dias de crescimento, a 25ºC. Verso em A e

anverso em B em meio de cultura BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura SNA



Figura 2 - Fusarium oxysporum URM6052 verso e anverso após 7 dias de crescimento, a 25ºC. Verso em A

e anverso em B em meio de cultura BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura SNA


Fusarium solani – Em meio de cultura BDA, as colônias apresentaram no verso

uma coloração creme amarronzado, variando para acinzentado e esbranquiçado; seu

anverso apresentou uma coloração esbranquiçada, variando para creme, e em algumas

colônias com pigmentação amarelo amarronzado ou rosado; o crescimento médio foi de

2,88 cm em três dias e 7,53 cm em sete dias; as culturas exibiram um aspecto flocoso

variando para denso flocoso; foi observado que a maioria das colônias apresentavam

margem regular, micélio aéreo presente e ausência de exsudato. Em meio de cultura SNA,

as colônias exibiram uma coloração de verso e anverso esbranquiçada; o crescimento das

colônias variou em média 2,78 cm em três dias e 8,03 cm em sete dias de experimento; o


aspecto das colônias variou de flocosa a flocosa esparsa; Algumas colônias apresentaram

margem regular; o micélio aéreo foi observado em todas as colônias e não foi observada a

produção exsudatos (Figura 3).

Figura 3 – Fusarium solani URM3838 verso e anverso após 7 dias de crescimento, a 25ºC. Verso em A e

anverso em B em meio de cultura BDA, verso em C e reverso em D em meio de cultura SNA


A Tabela 4 apresenta as características morfológicas macroscópicas dos isolados

de Fusarium da Micoteca URM da UFPE cultivados nos meios de cultura BDA e SNA,

incubadas a 25 oC por 7 dias.


Tabela 4 – Características macroscópicas observadas nas colônias de Fusarium da Micoteca URM após sete dias de crescimento em meio de cultura BDA e SNA

MACROSCOPIA

BDA SNA

URM Espécie Cor Diâmetro

(cm)

3Dias -7Dias

Consistência Margem Micélio

aéreo

Cor Diâmetro

(cm)

3Dias - 7Dias

Consistência Margem Micélio

aéreo

4613 Fusarium

oxysporum

Esbranquiçada 3,4 8,1 Flocosa

esparsa

Regular + Esbranquiçada 2,2 6,8 Flocosa

esparsa

Regular +

5858 F. oxysporum Esbranquiçada Centro violeta

3,0 9,0 Flocosa Regular + Esbranquiçada 2,0 7,0 Flocosa Regular +

5005 F. oxysporum Esbranquiçada Centro violeta 3,1 9,0 Flocosa Irregular + Esbranquiçada 2,0 7,1 Flocosa Irregular +

6503 F. oxysporum Esbranquiçada Centro violeta 3,0 7,9 Flocosa Regular + Esbranquiçada 3,0 9,0 Flocosa Regular +

5845 F. oxysporum Esbranquiçada Centro violeta 3,3 9,0 Flocosa

esparsa

Irregular + Esbranquiçada 2,1 8,0 Flocosa

esparsa

Irregular +

4363 F. oxysporum Esbranquiçada 3,0 7,2 Flocosa esparsa

Regular + Esbranquiçada 2,2 7,5 Flocosa esparsa

Regular +

6228 F. oxysporum Esbranquiçada 3,0 7,0 Flocosa Regular + Esbranquiçada 3,1 8,7 Flocosa Regular +


6704 F. oxysporum Esbranquiçada Centro violeta 2,2 6,8 Flocosa Irregular + Esbranquiçada 2,0 6,6 Flocosa Irregular +


5844 F. lateritium Rosada/creme 4,2 9,3 Flocosa esparsa

Regular + Esbranquiçada 2,7 8,5 Esparsa Regular +

5456 F. lateritium Acinzentada centro amarronzada 5,0 9,3 Flocosa Regluar + Esbranquiçada 4,0 9,0 Esparsa Regluar +

3148 F. lateritium Esbranquiçada 4,0 7,8 Flocosa esparsa

Regular + Esbranquiçada 2,5 6.5 Flocosa Regular +

6226 F. lateritium Amarronzada 3,8 9,2 Flocosa Regular + Esbranquiçada 2,9 9,2 Esparsa Regular +

4703 F. lateritium Esbranquiçada 4,2 9,0 Flocosa Regular + Esbranquiçada 2,5 7,4 Esparsa Regular +

4207 F. lateritium Rosada/creme 4,5 8,4 Flocosa

esparsa

Irregular + Esbranquiçada 2,3 6,4 Esparsa Irregular +

5291 F. lateritium Esbranquiçada 5,3 9,3 Flocosa esparsa

Regular + Esbranquiçada 2,7 7,4 Esparsa Regular +

3838 F. solani Esbranquiçada 2,8 9,0 Flocosa densa Regular + Esbranquiçada 2,1 9,1 Flocosa Regular +

3821 F. solani Acinzentada centro esbranquiçada


5074 F. solani Acinzentada centro

esbranquiçada

3,0 9,2 Flocosa densa Regular + Esbranquiçada 2,7 8,8 Flocosa

esparsa

Regular +

5796 F. solani Esbranquiçada 3,0 7,2 Flocosa densa Regular + Esbranquiçada 3,1 8,1 Flocosa Regular +

5955 F. solani Esbranquiçada 3,0 8,0 Flocosa

esparsa


esparsa

Regular +

6749 F. solani Esbranquiçada 3,3 8,9 Flocosa

esparsa


esparsa

Regular +

3768 F. solani Acinzentada centro esbranquiçada


6264 F. solani Esbranquiçada 3,0 8,5 Flocosa densa Regular + Esbranquiçada 3,0 7,6 Flocosa

esparsa

Regular +


Características semelhantes às encontradas nesse estudo foram descritas por Leslie

e Summerell (2006), que verificaram todas as características morfológicas (diâmetro da

colônia, coloração, textura, micélio aéreo) das três espécies e citaram a dificuldade de se

distinguir espécies utilizando apenas dados morfológicos.

Gupta et al. (2010), caracterizando morfologicamente isolados de F. oxysporum f.

sp. psidii e F. solani, observaram que após sete dias de crescimento, as colônias

apresentaram um crescimento médio de 7,25 cm em uma temperatura de 28°C, não

diferindo do resultado encontrado nesse estudo.

Polleto et al. (2006) estudaram colônias puras de F. oxysporum cultivadas em

BDA e constataram que em três dias, as colônias apresentaram um crescimento médio de

3,0 cm de diâmetro, e a coloração das colônias variou de violeta, no centro, a

esbranquiçada nas bordas.

Uma variação na coloração da colônia de F. oxysporum foi observada num estudo

taxonômico realizado por Miranda (2000), que através de estudos moleculares comprovou

que essa variabilidade morfológica era, na verdade, uma expressão do polimorfismo

genético da espécie.

4.1.2 Caracterização microscópica

A análise das características microscópicas foi realizada após sete dias de

microcultivo em condições específicas, com todos os isolados de Fusarium. Foram

observadas formação de macro e microconídios, quantidade de septos presentes em cada

conídio, tipo de fiálide, presença de clamidósporos em meio de cultura BDA e SNA

(Tabela 5).

Fusarium lateritium – Em meio de cultura BDA, macroconídios com formato

retilíneo levemente curvado nas extremidades, com tamanho variando de 16,2 µm a 56,7

µm de comprimento de 2,7 µm de largura, de parede lisa, com septos variando de um a

nove; microconídios pouco abundantes ou até inexistentes em alguns isolados, medindo

cerca de 5,4 µm a 10,8 µm de comprimento e 2,7 µm de largura, com parede lisa e

septação variando de zero a três septos; monofiálides cilíndricas; presença de

clamidósporos globosos, dispostos de maneira intercalada na hifa ou disperso no micélio.

Em meio de cultura SNA, não houve diferença nas observações (Figura 4).


Tabela 5 – Características microscópicas observadas após 7dias de microcultivo em meio de cultura BDA e SNA dos isolados de Fusarium depositados na micoteca URM

MICROSCOPIA

BDA SNA

URM Espécie Clamidosporo Macroconídio

(µm)

Septos Microconídio (µm) Septos Clamidosporo Macroconídio (µm) Septos Microconídio (µm) Septos

4613 F.oxysporum - 16,2 – 35,1 X 2,7 0 – 8 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1 - 16,2 – 48,6 X 2,7 0 - 2 5,4 – 10,8 X 2,7 0

5858 F.oxysporum - 16,2 – 45,9 X 2,7 2 – 5 5,4 – 10,8 X 2,7 1 -2 + 16,2 – 40,5 X 2,7 1 - 3 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 2

5005 F.oxysporum + 16,2 – 37,8 X 2,7 0 – 3 5,4 – 13,5 X 2,7 0 – 3 + 16,2 – 45,9 X 2,7 1 - 4 2,7 – 8,1 X 2,7 0

6503 F.oxysporum + 16,2 – 24,3 X 2,7 0 – 4 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1 - 21,6 – 48,6 X 2,7 1 - 3 2,7 – 8,1 X 2,7 0 – 1

5845 F.oxysporum - 16,2 – 40,5 X 2,7 1 – 5 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 2 + 16,2 – 35,1 X 2,7 0 - 3 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1

4363 F.oxysporum + 13,5 – 27,0 X 2,7 1 – 5 5,4 – 8,1 X 2,7 1 + 14,0 – 27,0 X 2,7 1 -3 2,7 – 8,1 X 2,7 0 – 1

6228 F.oxysporum + 16,2 – 29,7 X 2,7 1 – 3 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 2 + 16,2 – 32,4 X 2,7 0 - 3 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

5068 F.oxysporum - 16,2 – 37,8 X 2,7 1 – 4 2,7 – 8,1 X 2,7 0 -1 - 16,2 – 37,8 X 2,7 0 - 6 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 2

6704 F.oxysporum + 16,2 – 27,0 X 2,7 0 -3 5,4 – 10,8 X 2,7 0 -1 - 16,2 – 27,0 X 2,7 0 - 2 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

6052 F.oxysporum - 16,2 – 10,8 X 2,7 1 -5 5,4 – 8,1 X 2,7 1 - 13,5 – 58,0 X 2,7 1 - 3 5,4 – 10,8 X 2,7 0

5844 F. lateritium - 16,2 – 56,7 X 2,7 6 – 9 5,4 – 10,8 X 2,7 1 – 2 - 16,6 – 40,5 X 2,7 3 - 6 - -

5456 F. lateritium - 18,9 – 40,5 X 2,7 3 – 7 5,4 – 10,8 X 2,7 1 – 3 - 27,0 – 40,5 X 2,7 3 - 6 - -

3148 F. lateritium - 18,9 – 56,7 X 2,7 3 – 7 5,4 – 10,8 X 2,7 1 – 2 + 18,9 – 56,7 X 2,7 2 - 6 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 3

6226 F. lateritium - 21,6 – 32,4 X 2,7 3 – 7 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 2 + 16,2 – 27,0 X 2,7 1 - 3 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1

4703 F. lateritium - 18,9 – 54,0 X 2,7 2 – 8 - - + 16,2 – 37,8 X 2,7 3 - 5 - -

4207 F. lateritium + 16,2 – 43,2 X 2,7 1 – 5 5,4 – 10,8 X 2,7 1 – 3 - 21,6 – 40,5 X 2,7 3 -7 8,1 – 10,8 X 2,7 1 – 3

5291 F. lateritium - 16,2 – 29,7 X 2,7 2 – 3 5,4 – 10,8 X 2,7 1 + 16,2 – 24,3 X 2,7 1 -3 5,4 – 10,8 X 2,7 1

3838 F. solani + 16,2 – 27,0 X 2,7 0 – 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 18,9 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

3821 F. solani - 16,2 – 18,9 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 18,9 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

5074 F. solani + 16,2 – 18,9 X 2,7 0 – 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 18,9 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

5796 F. solani - 16,2 – 21,6 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 21,6 X 2,7 0 - 1 5,4 – 10,8 X 2,7 0

5955 F. solani + 16,2 – 18,9 X 2,7 1 – 2 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 18,9 X 2,7 0 - 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

6749 F. solani + 16,2 – 21,6 X 2,7 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 21,6 X 2,7 0 - 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1

3768 F. solani - 16,2 – 18,9 X 2,7 0 – 1 5,4 – 10,8 X 2,7 0 + 16,2 – 18,9 X 2,7 0 - 1 5,4 – 10,8 X 2,7 0 – 1

6224 F. solani - 16,2 – 18,9 X

2,7

0 – 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1 + 16,2 – 18,9 X 2,7 0 - 1 2,7 – 10,8 X 2,7 0 – 1


Figura 4 – Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium lateritium em meio de cultura BDA e

SNA. A – Macroconídios e microconídios em meio de cultura BDA; B- Macroconídio, microconídios e

clamidósporos em meio de cultura SNA; C e D - Macroconídios em meio de cultura BDA e SNA

respectivamente, após 7 dias de crescimento


Fusarium oxysporum – Em meio de cultura BDA, macroconídios com formato

falciforme moderadamente curvado e extremidades delgadas, com tamanho variando de

13,5 µm a 45,9 µm de comprimento e 2,7 µm de largura, de parede lisa, com septos

variando de zero a oito; microconídios abundantes, com formato oval, medindo cerca de

2,7 µm a 10,8 µm de comprimento e 2,7 µm de largura, com parede lisa e septação

variando de zero a três septos; monofiálides cilíndricas; clamidósporos abundantes de

parede lisa, dispostos de maneira intercalar ou terminal na hifa. Em meio de cultura SNA,

as características observadas foram bastante semelhantes, entretanto houve apenas variação

no tamanho dos macroconídios que foi de 13,5 µm a 58,0 µm de comprimento e 2,7 µm de

largura (Figura 5).

A B

C D


Figura 5 – Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium oxysporum em meio de cultura BDA e

SNA. A – Monofiálide com microconídios em meio de cultura BDA; B-Clamidósporos intercalares e

terminais em meio de cultura SNA; C e D – Macroconídios e microconídios em meio de cultura BDA e SNA

respectivamente


Fusarium solani - Em meio de cultura BDA, macroconídios com parede espessa,

formato levemente curvado e estreitamento nas extremidades, com tamanho variando de

16,2 µm a 27,0 µm de comprimento de 2,7 µm de largura, de parede lisa, com septos

variando de zero a três; microconídios de formato oval, medindo cerca de 2,7 µm a 10,8

µm de comprimento e 2,7 µm de largura, com parede lisa e septação variando de zero a um

septo; monofiálides cilíndricas; presença de clamidósporos de parede rugosa em algumas

culturas. Em meio de cultura SNA, houve apenas diferença na quantidade de

clamidósporos observados, visto que em todos os isolados os clamidósporos estavam

bastante abundantes e dispostos de maneira intercalar ou terminal na hifa (Figura 6).

A B

C D


Figura 6 – Estruturas microscópicas encontradas na espécie Fusarium solani em meio de cultura BDA e

SNA. A, B e D –Macroconídios e microconídios em meio de cultura BDA (A) e SNA (B,D) ; C- Monofiálide

com microconídios em meio de cultura BDA


Ao realizar um estudo taxonômico morfológico, Gerlach et al. (1982)

distinguiram as espécies F. lateritium, F. oxysporum e F. solani como diferentes das

demais do gênero. Os autores observaram que as colônias de F. lateritium possuíam

clamidósporos variando de globosos a subgloblosos, podendo ser observados em pares ou

solitários nas hifas, e constataram que nas espécies F. oxysporum e F. solani os

clamidósporos apresentavam paredes lisas e rugosas.

De acordo com Nelson et al. (1994), as características secundárias encontradas nas

colônias de Fusarium só são úteis na descrição de uma espécie quando as culturas são

cultivadas em condições padrão de luz, temperatura e substrato, entretanto, os autores

afirmaram que critérios secundários como pigmentação da colônia, presença e ausência de

esporodóquios, escleródios ou estromas, não devem ser considerados adequados para uma

diferenciação de espécie.

A B

C D


Analisando microscopicamente as características de F. oxysporum, Miranda

(2000) verificou que não houve diferença morfológica na estrutura dos macroconídios e

microconídios. O autor observou também que os microconídios estavam abundantemente

presentes na colônia, geralmente unicelulares e com morfologia oval ou reniforme; os

macroconídios apresentando morfologia falcada e os clamidósporos mostrando-se em

pares, terminais ou intercalares. As características encontradas no estudo realizado por

Miranda (2000) foram semelhantes às observadas nessa pesquisa.

Em um estudo realizado por Cambuim et al. (2007), estruturas como:

macroconídios longos de parede lisa, células apicais em formatos de bico, monofíalides

cilindrícas e clamidósporos isolados foram observadas, analisadas e, posteriormente,

identificadas como pertencentes a espécie F. lateritium.

Apenas com a análise das características morfológicas das espécies F. lateritium,

F. oxysporum e F. solani foi possível confirmar a identidade dos espécimes depositados na

Micoteca URM, cabendo às demais análises outras informações conclusivas.

4.2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E FILOGENÉTICA

As 25 culturas do gênero Fusarium depositadas na Micoteca URM foram

revisadas taxonomicamente utilizando como ferramentas moleculares, a região ITS do

rDNA e o gene Tef-1α. Foram obtidos para a região ITS1-5.8S-ITS2 fragmentos de

aproximadamente 500 pares de bases e para o gene Tef, os fragmentos chegaram próximos

a 600 pares de bases. Inicialmente, as 25 culturas estavam agrupadas por características

morfológicas em três espécies F. lateritium, F. oxysporum e F. solani (Tabela 1), contudo,

após a análise das sequências foi possível verificar que as espécies estão inseridas em

complexos e que a delimitação entre elas ainda não pode ser resolvida.

Na análise filogenética baseada nos fragmentos da região ITS (Figura 7) foi

possível observar que as dez sequências originadas a partir das culturas depositadas na

Micoteca URM como pertencentes à espécie F. oxysporum, agruparam-se com sequências

da mesma espécie que estão depositadas no banco de dados GenBank, formando um clado

distinto dos demais URM, com valores de bootstrap superiores a 94%, para as análises de

Neibghbor Joining, Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e análise Bayesiana.


Figura 7- Reconstrução filogenética de espécies de Fusarium depositadas na Micoteca URM a partir do

alinhamento de 490 nucleotídeos correspondentes à combinação dos fragmentos ITS1 + 5.8S + ITS2

(rDNA). Valores de Bootstrap (em %) foram gerados a partir dos métodos de Neibghbor Joining (K2P),

Máxima Verossimilhança, Máxima Parcimônia (5000 reamostragens) e de probabilidade posterior (análise

Bayesiana, abaixo do nó, 1000 reamostragens). Somente valores acima de 50% foram apresentados. Para

MP: Índice de Consistência (CI) = 29,51% e Índice de Retenção (RI) = 99,01%

Fonte: Autoria própia

Para as sequências obtidas dos sete isolados de F. lateritium não foi observado

agrupamento com nenhuma sequência da mesma espécie obtida no banco de dados

GenBank, formando um clado apenas com os espécimes de F. equiseti com valores de


suporte superiores a 98%. Essa informação sugere que culturas depositadas na Micoteca

URM como pertencentes a F. lateritium devem ser submetidas a análises de outras regiões

do DNA, o que provavelmente, poderá comprovar se pertencem ou não a uma outra

espécie, visto que as características morfológicas condizem com a espécie depositada na

Micoteca URM.

As sequências obtidas a partir dos oito isolados de F. solani agruparam-se com

sequências da mesma espécie depositadas no Genbank, formando um clado com valores de

suporte acima de 98%.

Tendo em vista a reconstrução da árvore filogenética com os fragmentos de ITS,

foi possível inferir que apenas o sequenciamento dessa região não foi conclusivo para

delimitar a espécie F. lateritium depositada na Micoteca URM, por discordar da análise

morfológica e não agrupar com nenhuma sequência da mesma espécie. Segundo Maciel

(2012) a região ITS não tem sido eficaz para a determinação de espécies de Fusarium,

devido à presença de duas cópias não homólogas da região ITS2, causando divergência nos

resultados.

Segundo Maharachchikumbura et al. (2011), deve-se observar a veracidade das

informações contidas nos bancos de dados, inclusive o Genbank, pois muitas espécies

importantes são depositadas nesses bancos públicos sem a conferência exata do nome da

espécie, o que pode ocasionar uma identificação incorreta. De acordo com Kristensen et al.

(2005) além da caracterização morfológica, a localização geográfica e a verificação da

patogenicidade de um determinado isolado, são passos indispensáveis para uma

identificação precisa em termos de espécie, auxiliando desta forma a filogenia molecular.

A análise dos fragmentos do gene Tef 1-α (Figura 8) foi realizada com a finalidade

de solucionar qualquer impasse que tenha ocorrido pela análise da região ITS, pois se sabe

que esta análise possui um maior poder de resolução para separar espécies dentro dos

clados (GEISER et al., 2004). Após a análise dos fragmentos do fator de elongação Tef 1-

α, foi possível observar que, comparando todas as sequências das culturas depositadas na

Micoteca URM com as depositadas no banco de dados específico para o gênero Fusarium

(FUSARIUM ID), houve uma separação mais concisa dos clados e a formação de quatro

complexos distintos.


Figura 8- Reconstrução filogenética de espécies de Fusarium depositadas na Micoteca URM a partir do

alinhamento de 526 nucleotídeos correspondentes ao fragmento do gene Tef 1-α). Valores de Bootstrap (em

%) foram gerados a partir dos métodos de Neibghbor Joining (K2P), Máxima Verossimilhança, Máxima

Parcimônia (5000 reamostragens) e de probabilidade posterior (análise Bayesiana, abaixo do nó, 1000

reamostragens). Somente valores acima de 50% foram apresentados. Para MP: Índice de Consistência (CI) =

28,99% e Índice de Retenção (RI) = 99,06%



O primeiro complexo foi formado pelas sequências que compõem o complexo de

espécies F. oxysporum, entretanto, o isolado URM6226, que na análise da região ITS

apresentou afinidade com as sequências de F. equiseti, mostrou fazer parte das espécies

pertencentes ao complexo F. oxysporum, com valores de suporte significativos. As

espécies URM5845 e URM6704 destacaram-se nessa análise como pertencentes ao

complexo de espécies Gibberella fujikuroi, diferindo do resultado obtido com a região ITS.

A sequência do isolado URM3148 mostrou afinidade com outro complexo de espécies

chamado complexo F. concolor, não agrupando com nenhuma sequência de espécies

depositadas na Micoteca URM e diferindo, também, do resultado observado na análise da

região ITS.

As sequências dos isolados URM4207, URM5291, URM5844, URM5456 e

URM4703 que apresentaram afinidades com as sequências de F. equiseti na análise da

região ITS, apresentaram no estudo utilizando o Tef, semelhança molecular com as

espécies do complexo F. incarnatum-equiseti. Esse resultado, mais uma vez, difere dos

encontrados na análise morfológica, em que todas as características apresentadas afirmam

que as culturas dos isolados depositados na Micoteca URM pertencem à espécie F.

lateritium.

O estudo molecular realizado confirma que os isolados depositados na Micoteca

URM devem ser autenticados por mais de um método, tendo em vista que análises

taxonômicas utilizando apenas as características morfológicas estão sujeitas a dúvidas.

Ainda analisando as sequências dos isolados de F. solani, foi possível observar

afinidades com espécies pertencentes ao complexo F. solani com valores de suporte

significativo. Com isso, pode-se afirmar que os isolados de F. solani e F. oxysporum

estudados nessa pesquisa apresentaram características morfológicas que, juntamente com

os dados moleculares, ajudaram na confirmação taxonômica desses isolados, logo,

permanecerão sem alterações no depósito na Micoteca URM. Para os demais isolados, os

dados obtidos até o momento não foram suficientes para confirmação das espécies. Assim,

novas análises de outras regiões do rDNA deverão ser realizadas para obtenção de

respostas conclusivas.

As árvores da região ITS e do fator de elongação Tef 1-α foram enraizadas com

sequências de Trichoderma reesei (KH979305.1) e Hypocrea lixii (EU280077.1), e

Fusarium delphinoides (NRRL 36152) e Fusarium dimerium ET-gr (NRRL 36384),

respectivamente.


Ao realizarem um estudo sobre diversidade filogenética utilizando espécies do

gênero Fusarium, O’Donnell et al. (2012) conseguiram distribuir as espécies em nove

complexos distintos sendo eles: Gibberella fujikuroi, Fusarium oxysporum, Fusarium

concolor, Fusarium tricinctum, Fusarium incarnatum-equiseti, Fusarium sambucinum,

Fusarium chlamydosporum, Fusarium lateritium, Fusarium solani e Fusarium

coccophilum, utilizando como referência as sequências do banco de dados FUSARIUM ID

e Fusarium MLST.

4.3 ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE ERGOSTEROL PELAS CULTURAS DE

FUSARIUM

A determinação do ergosterol foi utilizada para quantificação da biomassa fúngica

das culturas do gênero Fusarium. O conteúdo de ergosterol foi calculado a partir da curva

padrão utilizada como controle, construída com as seguintes concentrações de ergosterol:

0,03125 µg/mL, 0,125 µg/mL, 0,25 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL (Figura 9).

Segundo Ricardo (2013), a curva de calibração consiste numa representação

gráfica de um coeficiente de determinação (R2), que permite uma estimativa da qualidade

da curva.

Figura 9 - Curva padrão para quantificação do ergosterol, obtida com a absorbância ajustada em

282 nm



O tempo de retenção do ergosterol na análise em HPLC foi de aproximadamente 5

minutos. Após a leitura da curva padrão, foram feitas as análises das amostras do

ergosterol presente no micélio fúngico. De acordo com a curva de calibração do ergosterol

(Figura 9), o método apresentou uma boa correlação entre o sinal instrumental e a variação

da concentração do ergosterol. O coeficiente de determinação (R2) permitiu avaliar a

linearidade, observando-se para o estudo um coeficiente de determinação de 0, 9972.

Segundo Relacre (2000), a eficiência de um método analítico depende do grau de

conformidade entre os resultados individuais dos ensaios, quando o processo é aplicado

repetitivamente a inúmeras amostras retiradas de uma amostra homogênea.

As concentrações de ergosterol no micélio das culturas estão representadas na

Figura 10. Foi possível observar que as culturas de F. oxysporum que obtiveram maior

concentração de ergosterol foram URM6228 e URM6052, apresentando valores de 0,4936

pg/mg e 0,5348 pg/mg respectivamente. Já na espécie F. lateritium, a concentração de

ergosterol foi maior nas culturas URM3148 (0,4128 pg/mg) e URM6226 (0,2749 pg/mg).

Para a espécie F. solani a maior concentração de ergosterol foi obtidas pelas culturas

URM5955 e URM6749, apresentando 0,2940 pg/mg e 0,3774 pg/mg como maiores

valores, respectivamente.


Figura 10 - Concentração de ergosterol obtidas do micélio das espécies F. oxysporum (1- URM

4613; 2- URM 5845; 3- URM 6228; 4- URM 5005; 5- URM 6704; 6- URM 5858; 7- URM 5068; 8- URM

6503; 9- URM 6052; 10- 4363), F. lateritium (11- URM 5456; 12- URM 3148; 13- URM 6226; 14- URM

4207; 15- URM 4703; 16- URM 5844; 17- URM 5291) e F. solani (18- URM 5955; 19- URM 5074; 20-

URM 3838; 21- URM 6749; 22- URM 3821; 23- URM 6264; 24- URM 5796; 25- URM 3768)


A análise de variância ANOVA e o teste Tukey foram realizados com os valores

de ergosterol obtidos da biomassa fúngica de todos os isolados, para observar diferença

significativa na produção de ergosterol entre as espécies (Tabela 6) e entre os isolados da

mesma espécie.

Tabela 6 - Análise de variância e interações entre fatores para dados de ergosterol entre as espécies Fusarium

oxysporum, Fusarium lateritium e Fusarium solani

QUADRO DE ANÁLISE

FV

GL

SQ

QM

F

Tratamentos

Resíduos

2

22

0.05125

0.48956

0.02563

0.02225

1.1516 ns

Total 24 0.54082

ns não significativo (p ≥ .05).


A análise entre as espécies demonstrou que não houve interação entre os fatores do

estudo. A produção da biomassa dos fungos não diferiu estatisticamente, quando aplicado

o teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. O teste de Tukey também foi realizado


para cada espécie, para observar possíveis variações significativas na produção do

ergosterol entre os isolados (Tabela 7).

Em seus estudos, Chiocchio e Matkovic (2011) afirmaram que as concentrações de

ergosterol presentes no micélio dos fungos podem variar entre espécies diferentes ou entre

indivíduos da mesma espécie. Bermingham et al. (1995), ao estudarem espécies de fungos

aquáticos, perceberam que o conteúdo de ergosterol varia de acordo com a idade do

micélio.

De acordo com Zill et al. (1988), a composição do substrato pode influenciar

fortemente no teor de ergosterol presente nos fungos, tendo em vista que estudando a

espécie Rhizopus oligosporus constataram que quando cultivado em meio de cultura o seu

crescimento micelial e, consequentemente, o conteúdo de ergosterol foi elevado quando

comparado a substratos naturais.

Pasanen et al. (1999), estudando o conteúdo de ergosterol em culturas microbianas

de seis fungos filamentosos, três espécies de leveduras e um actinomiceto, constataram

uma correlação maior entre o conteúdo de ergosterol e os fungos filamentosos, do que

ergosterol com fungos viáveis totais incluindo leveduras, corroborando que o ergosterol é

um bom indicador de concentrações de biomassa fúngica, particularmente para os fungos

filamentosos.

Tabela 7 – Análise One-Sample T para os isolados das espécies de Fusarium

ANÁLISE ONE-SAMPLE T - ISOLADOS DA ESPÉCIE

Espécie Variable N Mean StDev SE Mean 95% CI

Fusarium oxysporum C1 10 0,2516 0,1712 0,0541 (0,1292;

0,3741)

Fusarium lateritium C2 7 0,1630 0,1341 0,0507 (0,0390;

0,2871)

Fusarium solani C3 8 0,1560 0,1310 0,0463 (0,0463;

0,2655)


A análise dos dez isolados da espécie de F. oxysporum revelou que não houve

diferença signifitiva na produção do ergosterol, a média está dentro do intervalo de

confiança (CI). O mesmo se aplicou aos sete isolados de F. lateritium, onde a análise não

foi significativa e a média permaneceu também dentro do intervalo de confiança (CI). Por

fim, foi constatado o mesmo na análise realizada para os oito isolados de F. solani.


Um teste utilizando dois fatores para observar se houve diferença na produção de

ergosterol também foi realizado entre as espécies F. oxysporum e F. lateritium (Tabela 8),

entre F. oxysporum e F. solani (Tabela 9) e entre F. lateritium e F. solani (Tabela 10).

Tabela 8 – Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium oxysporum e Fusarium lateritium

ANÁLISE Two-Sample T – Test and CI: C1;C2

Espécie Variable N

Mean

StDev

SE Mean

Fusarium oxysporum C1 10 0.252 0.171 0,054

Fusarium lateritium C2 7 0,163 0,134 0,051

Estimate for difference: 0,0886

95% CI (-0,0704; 0,2477); T-value = 1,20; P-value = 0,252*; DF =14

*(p ≥ 0,05) não significativo


Tabela 9 – Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium oxysporum e Fusarium solani


Espécies Variable N

Mean

StDev

SE Mean

Fusarium oxysporum C1 10 0.252 0.171 0,054

Fusarium solani C3 8 0,156 0,131 0,046


95% CI (-0,0562; 0,2475); T-value = 1,34; P-value = 0,199*; DF =15



Tabela 10 – Análise Two-Sample T entre as espécies Fusarium lateritium e Fusarium solani


Espécies Variable N

Mean

StDev

SE Mean

Fusarium lateritium C2 7 0.163 0.134 0,051

Fusarium solani C3 8 0,156 0,131 0,046


95% CI (-0,1426 0,1566); T-value = 0,10; P-value = 0,920*; DF =12



A análise de dois fatores revelou que não houve interação significativa, ou seja, não

existe uma diferença relevante na produção de ergosterol entre as espécies F. oxysporum

(C1) e F. lateritium (C2). O mesmo foi observado na análise realizada entre as espécies F.


oxysporum (C1) e F. solani (C3), bem como na análise de dois fatores realizada entre as

espécies F. lateritium (C2) e F. solani (C3).

De maneira geral, os dados indicam que a biomassa fúngica não sofreu alteração

durante a realização desse experimento, mantendo-se praticamente constante, com isso não

foi possível utilizar o ergosterol como critério para diferenciar uma espécie das demais.

Niemenmaa et al. (2008), ao analisarem a variação do conteúdo de ergosterol de

alguns fungos, dentre esses Phlebia radiata e Phanerochaete chrysosporium, em diferentes

meios de cultivo (meio líquido, sólido e meio sólido com blocos de madeira), por 35 dias,

detectaram que o conteúdo de ergosterol de P. chrysosporium em meio líquido não

apresentou diferenças significativas entre a primeira e a quinta semana.

4.4 DESCOLORAÇÃO DO EFLUENTE TÊXTIL POR ISOLADOS DO GÊNERO

FUSARIUM

A realização do ensaio de descoloração do efluente têxtil pelas espécies de

Fusarium sofreu modificação na metodologia inicial, que a princípio utilizaria o efluente

têxtil nas condições naturais da indústria, e como resultado, foi verificado que todos os

isolados utilizados no ensaio descoloriram o efluente têxtil (Figura 11), porém, o frasco

controle também apresentou descolorção. Além disso, foi realizado também um isolamento

de unidades formadoras de colônias do efluente degradado para identificação de possíveis

organismos envolvidos. Foi constatado que havia colônias de bactérias e leveduras, e nos

frascos que estavam os isolados de Fusarium inoculados foi possível isolá-los novamente.


Figura 11 – Frascos de Erlenmeyers controle (sem os isolados de Fusarium) do ensaio de

descoloração do efluente têxtil. Efluente em condições naturais antes do ensaio (A) e após 12 dias (B)


Tendo em vista esses resultados, o método teve que sofrer modificação

(esterilização do efluente) para atestar se os isolados de Fusarium eram realmente

eficientes na descoloração.

Após seis e doze dias de incubação, foram obtidos os percentuais de descoloração

do efluente têxtil esterilizado utilizando os isolados de Fusarium (Tabela11). De maneira

geral, pode-se observar que todos os isolados apresentaram um percentual de descoloração

abaixo de 50%, exceto o isolado F. oxysporum URM6228, que em seis dias apresentou um

percentual de descoloração de 41,50% e em doze dias 53,77%. O isolado que apresentou o

menor percentual de descoloração em doze dias foi F. lateritium URM4207 (11,32%).

Diante desses resultados, considerou-se que os fungos utilizados nesse

experimento apresentaram baixo potencial de descoloração quando analisados em efluente

esterilizado. Assim, nas condições naturais da indústria, em que o fungo age em consórcio

com outros micro-organismos, eles são promissores na descoloração de efluente têxtil.

A B


Tabela 11 – Percentual de descoloração do efluente têxtil por espécies de Fusarium

URM ESPÉCIE % DESCOLORAÇÃO 6

DIAS

% DESCOLORAÇÃO 12

DIAS

4613 F.oxysporum 19,81 37,73

5858 F.oxysporum 6,60 25,47

5005 F.oxysporum 12,26 29,24

6503 F.oxysporum 10,37 26,41

5845 F.oxysporum 22,64 30,18

4363 F.oxysporum 11,32 20,75

6228 F.oxysporum 41,50 53,77

5068 F.oxysporum 4,71 19,81

6704 F.oxysporum 20,75 23,58

6052 F.oxysporum 7,54 17,92

5844 F. lateritium 31,13 35,84

5456 F. lateritium 25,47 40,56

3148 F. lateritium 32,07 42,45

6226 F. lateritium 4,71 12,26

4703 F. lateritium 20,74 35,84

4207 F. lateritium 10,37 11,32

5291 F. lateritium 18,86 30,18

3838 F. solani 25,47 33,96

3821 F. solani 19,81 35,84

5074 F. solani 32,07 45,28

5796 F. solani 16,98 40,56

5955 F. solani 9,43 13,20

6749 F. solani 28,30 38,67

3768 F. solani 21,68 35,84

6264 F. solani 11,32 27,35


De acordo com Costa (2008), durante o processo de beneficiamento do jeans nas

lavanderias e tinturarias, os efluentes geralmente apresentam coloração azul dominante,

forte odor de matéria em decomposição e sedimento constituído por fibras e resíduos de

corantes. Além disso, os compostos presentes no efluente agem como substratos para

diversos microrganismos que metabolizam os nutrientes para o crescimento e manutenção

celular durante o tratamento biológico.

Num estudo de descoloração de corante têxtil realizado por Araújo (2012), foi

observado que a espécie Fusarium oxysporum apresentou um percentual de descoloração

de 100% em dez dias de experimento. O resultado encontrado por este autor difere do

presente estudo em que os isolados dessa espécie, em 12 dias de ensaio, não atingiram esse

percentual de descoloração do efluente têxtil.

Utilizando espécies do gênero Fusarium na descoloração de corante têxtil,

Torralba (2008) obteve um percentual de descoloração em torno de 75% em dois dias de

experimento. Rodriguez et al. (1994) avaliaram a capacidade de F. oxysporum e F. solani

na degradação de substâncias aromáticas como a lignina. Segundo os autores, a eficiência


na degradação da lignina por estes isolados foi atribuída à presença de enzimas oxidativas

não específicas. A lignina é um composto aromático, portanto essas enzimas podem estar

presentes nas espécies do gênero Fusarium, contribuindo para degradação de corantes.


5. CONCLUSÕES

Os 25 isolados de Fusarium depositados na Micoteca URM apresentam

características morfológicas compatíveis com as espécies Fusarium lateritium,

Fusarium oxysporum e Fusarium solani.

A análise molecular indica que os 25 isolados de Fusarium depositados na

Micoteca URM estão distribuídos em complexos de espécies.

A análise molecular não foi conclusiva para confirmar os isolados

depositados na Micoteca URM como pertencentes à espécie F. lateritium.

Os isolados de F. oxysporum e F. solani depositados na Micoteca URM

foram confirmados taxonomicamente e não deverão sofrer alterações no depósito.

O ergosterol não se mostrou uma ferramenta eficiente na distinção dos

espécimes de Fusarium depositados na Micoteca URM.

As espécies F. lateritium, F. oxysporum e F. solani não são capazes de

descolorir, com percentual considerável, o efluente da lavanderia têxtil

esterilizado.


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