universidade federal de pelotas programa de pós...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Dissertação
Identificação de Marcadores Bioquímicos e Proteínas de Fase Aguda no Líquido Amniótico de
Éguas no Momento do Parto
Ilusca Sampaio Finger
Pelotas, 2014
ILUSCA SAMPAIO FINGER
Identificação de Marcadores Bioquímicos e Proteínas de Fase Aguda no Líquido Amniótico de Éguas no Momento do Parto
Orientador: Dr. Carlos Eduardo Wayne Nogueira
Co-Orientadora: Dra. Bruna da Rosa Curcio
Pelotas, 2014
Dissertação apresentada a o P rograma d e Pós-Graduação e m V eterinária da Universidade F ederal de P elotas, co mo requisito par cial à obt enção do t ítulo d e Mestre em Ciências veterinárias.
Universidade Federal de Pelotas / Sistema de BibliotecasCatalogação na Publicação
F498i Finger, Ilusca SampaioFinIdentificação de marcadores biquímicos e proteínas defase aguda no líquido amniótico de éguas no momento doparto / Ilusca Sampaio Finger ; Carlos Eduardo WayneNogueira, orientador ; Bruna da Rosa Curcio, coorientador.— Pelotas, 2014.Fin32 f. : il.
FinDissertação (Mestrado) — Programa de Pós-Graduaçãoem Medicina Veterinária, Faculdade de Veterinária,Universidade Federal de Pelotas, 2014.
Fin1. Gestação. 2. Eletrólitos. 3. Proteinograma. 4.Albumina. 5. Transferrina. I. Nogueira, Carlos EduardoWayne, orient. II. Curcio, Bruna da Rosa, coorient. III. Título.
CDD : 636.1
Elaborada por Gabriela Machado Lopes CRB: 10/1842
Banca examinadora:
Profª. Dra. Bruna da Rosa Curcio
Prof. Dr. Augusto Schneider
Prof. Dr. Charles Ferreira Martins
Agradecimentos
À Deus, por me levar aonde a Sua graça esta para me proteger.
À minha família, por demonstrar que entre nós deve reinar a confiança, a fidelidade,
o respeito mútuo, para que o amor se fortifique e nos una cada vez mais. Sem vocês
eu não saberia o significado de permanecer em perfeita união, um para o outro e
todos para Deus e que nossas conquistas devem ser edificadas em cima de valores
humanos e cristãos.
Aos amigos de Itaqui, apesar da distância estão sempre juntos a mim, em meu
coração.
Às amigas do meu grupo do EMAÚS Pelotas – FIAT, que unidas em Cristo, são
meus exemplos de que um amigo ama em todos os momentos.
Aos colegas da clínica Albeitar e Millie Marchiori, pela amizade, apoio e
oportunidades de aprendizado.
As famílias Bálsamo Espinosa e Cremonti, sempre me recebendo de braços abertos
em suas casas neste período em Pelotas, como duas verdadeiras famílias.
Ao meu orientador, Carlos Eduardo Wayne Nogueira, pela paciência e ensinamentos
desde o período de graduação, um verdadeiro mestre.
À minha co-orientadora, Bruna da Rosa Curcio, pelo empenho, dedicação e
incentivo em meu caminho acadêmico.
À todo o grupo de trabalho ClinEq, ao Prof. Charles e todos as outras pessoas que
juntas se esforçaram para que esse trabalho fosse realizado.
Ao Carlos meu namorado, pela cumplicidade e companheirismo.
Resumo FINGER, I lusca Sampaio. Identificação de marcadores bioquímicos e proteínas de fase aguda no líquido amniótico de éguas no m omento do parto. 2014. 32f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A análise do l íquido amniótico é útil para compreender o processo bioquímico que envolve a uni dade feto-placentária. O objetivo do pr esente es tudo foi i dentificar marcadores bioquímicos e proteínas da fase aguda no l íquido amniótico de éguas saudáveis no m omento do p arto. A co leta do l íquido am niótico foi r ealizada pel o método de amniocentese, assim que exposta a bolsa amniótica na primeira fase do parto, através de punção direta. Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, entre 5 e 21 an os de i dade, da r aça P uro S angue I nglês, na r egião S ul d o B rasil. A composição bioquímica f oi avaliada e mpregando-se kits co merciais e o proteinograma pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE). Os resultados obtidos de m édia e erro pa drão da média p ara os componentes bioquímicos foram: p H 7, 70+0,02, g licose 1, 22+0,08 ( mg/dL), fosfatase al calina 30,45+2,67 ( UI/L), g amma – GT 4 ,66+0,62 ( UI/L), uréia 3 3,59+2,34 ( mg/dL), creatinina 5,10+0,59(mg/dL), sódio 54,35+2,51 (mEq/L), potássio 1,71+0,12 (mEq/L), cloretos 72,09+5,94 (mEq/L), cálcio 3,86+0,23 (mg/dL), osmolaridade 277,32+17,76 (mOsml/L) e pr oteína t otal 2 6,04+4,39 ( mg/dL). A osm olaridade apr esentou correlação com os íons sódio (R=0,60), potássio (R=0,55) e cá lcio (R=0,53). Foram detectadas vinte e duas proteínas d e fase ag uda, s endo q ue as pr oteínas inflamatórias albumina e transferrina foram identificadas em mais de 97% das éguas avaliadas. F oi p ossível a i dentificação de m arcadores bioquímicos e pr oteínas inflamatórias no l iquido amniótico de ég uas saudáveis a t ermo. S omente a transferrina apr esentou-se di ferente entre o s grupos de i dade, com concentrações inferiores no grupo de éguas mais velhas. Palavras-chave: Gestação. Eletrólitos. Proteinograma. Albumina. Transferrina.
Abstract FINGER, Ilusca Sampaio. Identificação de marcadores bioquímicos e proteínas de fase aguda no líquido amniótico de éguas no m omento do pa rto. 2014. 32f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. The anal ysis of a mniotic fluid i s useful f or und erstanding t he bi ochemical pr ocess involving the fetal-placental uni t. The aim of this study was to evaluate biochemical profile and acute phase proteins in the amniotic fluid of healthy mares during labor. The co llection o f a mniotic fluid w as performed by am niocentesis method, onc e exposed to the amniotic sac in the first stage of labor, by direct puncture. It has been observed forty T horoughbred pr egnant mares in S outhern B razil. T he biochemical composition was evaluated using commercially kits and proteinogram was measured by el etrophoresis in p oliacrylamide g el ( SDS – PAGE). T he results of m ean and standard error were: pH 7.70+0.02; glucose 1.22+0.08; alkaline phosphatase 30.45+ 2.67 ( IU/L); g amma – GT 4 .6+0.62 ( IU/L), ur ea 3 3.59+2.34 ( mg/dL), cr eatinine 5.10+0.59(mg/dL), so dium 5 4.35+2.51 ( mEq/L); pot assium 1. 71+0.12 ( mEq/L), chloride 72.09+5.94 ( mEq/L); ca lcium 3.86+0.23 ( mg/dL); os molarity 277. 32+17.76 (mOsml/L) and total protein 26.04+4.39 (mg/dL). The osmolarity was correlated with ions sodium (R=0.60), potassium (R=0.55) and calcium (R=0.53). Twenty-two acute phase protein were detected and that inflammatory proteins albumin and t ransferrin have been i dentified in m ore t han 97% o f t he evaluated m ares. I t was possible t o identify bi ochemical markers and i nflammatory pr oteins in t he am niotic fluid o f healthy full term mares. Only the transferrin presented among different age groups, with lower concentrations in the older group of mares. Keywords: Gestation. Electrolytes. Proteinogram. Albumin. Transferrin.
Lista de Tabelas
ARTIGO 1 Perfil Bioquímico e Proteínas de Fase Aguda no L íquido Amniótico
de Éguas Saudáveis Tabela 1 M édia, Erro P adrão ( S.E), V alores Mínimo e M áximo das variáveis
analisadas no líquido amniótico no momento do parto (N=31)................. 22 Tabela 2 M édia, Erro P adrão das Concentrações, V alores Mínimo e M áximo do
Peso M olecular d as pr oteínas identificadas no l íquido am niótico no momento do parto (N= 36). ......................................................................23
Lista de Abreviaturas
Da - Dálton
Gama – GT - Gama Glutamil Transferase
IgA - Imunoglobulina A
IgG - Imunoglobulina G
kDa - Kilo Dálton
Mcal - Mega Calorias
mEq/L - Mili Equivalente por litro
mg/dL - Miligramas por decilitro
MHz - Megahertz
mL - Mililitro
mm - Milimetro
mOsml/L - Miliosmol por litro
pH - Potencial hidrogeniônico
UI/L - Unidade internacional por litro
Sumário
1 Introdução .............................................................................................................. 10
2 Objetivos ................................................................................................................ 13
3 Artigo...................................................................................................................... 14
4 Conclusão geral ..................................................................................................... 30
5 Referências ............................................................................................................ 31
1 INTRODUÇÃO
A região sul do Brasil concentra grande parte da criação de equinos da raça
Puro S angue I nglês do país, d esta forma, é i mportante o r econhecimento d os
principais problemas q ue co mprometem es ta cr iação. Assim c omo o
desenvolvimento de ferramentas que aumentem a produtividade da atividade. Sendo
que q ualquer di stúrbio oco rrido dur ante a g estação, n o per i-parto ou no per íodo
neonatal pode r esultar no co mprometimento d a sa úde do po tro, oca sionando
prejuízos aos criadores.
As condições que contribuem para perdas em gestações avançadas incluem
agentes infecciosos, anormalidades fetais ou placentárias, anormalidades estruturais
e do enças sistêmicas da g estante ( MACPHERSON, 20 07). A uni dade ú tero-
placentária pode ser comprometida por processos de hipoxemia ou infecção, o que
interfere n a di fusão e ntre as circulações materna e fetal, r eduzindo o a porte d e
nutrientes e oxigênio para o feto e placenta. Em resposta a este processo, ocorre um
estresse fetal que pode dar origem a um retardo no crescimento intra-uterino – IUGR
(ROSSDALE, 2004). O IUGR é definido como o nascimento de um indivíduo com o
peso at é 10% abaixo do co nsiderado n ormal para a po pulação de aco rdo co m o
tempo de g estação ( KITCHEN, 1968), e r esulta de dan o celular e alterações
endócrinas, metabólicas e da função ca rdiovascular. De aco rdo com a se veridade
destas alterações podem ocorrer morte fetal, aborto ou prematuridade (ROSSDALE,
2004). A ca usa m ais frequente d e per da d e g estação est á associada a pl acentite
que, em ég uas, é no rmalmente ca usada p or i nfecção asce ndente v ia ce rvical. A
Placentite ascendente é a principal causa de parto prematuro em éguas, representa
mais de 30% dos partos prematuros e mortes neonatais dentro das primeiras 24h de
vida (MCKINNON, 2009).
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Com a av aliação obs tétrica da égua dur ante a g estação e no p ós-parto,
torna-se possível reconhecer fatores que comprometem a g estação e a viabilidade
do f eto e do ne onato. Desta f orma, é possível intervir na ég ua ou no p otro
precocemente ao aparecimento de condição clínica.
O em brião eq uino se t orna um bl astocisto logo após migrar par a o co rno
uterino. Neste momento o embrião encontra-se no estádio de mórula ou blastocisto
inicial. As células do embrião compactado se dividem para formar uma mórula de 32
células, a q ual se c aracteriza por apr esentar um pequeno g rupo de cé lulas no
interior da estrutura rodeada externamente por outro grupo de células. Estas células,
localizadas externamente formarão o t rofoblasto. O qual posteriormente originará o
córion, q ue per manece co mo o co ntato d a pl acenta co m o end ométrio dur ante a
gestação (GUINTER, 1998). O âmnio é formado a partir de dobras do t rofoblasto,
sendo constituído por dois folhetos, entre e les há o es paço amniótico, contendo o
líquido amniótico (ASBURY; LeBLANC. 1993).
O l íquido amniótico reflete o est ado materno fetal tanto por sua composição
como pelo seu volume, tendo importância na boa evolução da gestação (DERTKIGIL
et al ., 2005). A análise deste fluido fetal é utilizada para compreender o pr ocesso
bioquímico q ue env olve a uni dade feto-placentária, se ndo p ossível av aliar a
viabilidade fetal.
Em eq uinos existem pouco s trabalhos sobre o t ema, co ntudo j á foi
demonstrado q ue a v ariação n a co ncentração dos componentes bioquímicos do
fluido amniótico p ode t er uma r elação si gnificativa co m a sa úde fetal, podendo
indicar ce rtas enfermidades (KOCHHAR et al., 199 7).Em éguas da r aça P uro
Sangue Inglês, a osmolaridade apresentou uma correlação positiva com a idade da
parturiente, e nzimas e el etrólitos do l íquido am niótico ( CURCIO et al ., 2012). E m
estudo realizado por Zanella et al. (2013) os autores identificaram que em éguas, de
acordo com o período gestacional, há uma variação na composição bioquímica tanto
do líquido amniótico quanto do líquido alantóide. A concentração de lactato no fluido
amniótico f oi avaliada no m omento do p arto em ég uas, podendo ser út il na
identificação dos n eonatos q ue necessitam de i ntervenção precoce, l ogo a pós o
nascimento ( PIRRONE et al ., 201 2). M ais estudos devem se r d esenvolvidos para
que o l íquido am niótico poss a se r u ma e ficiente ferramenta n a rotina cl ínica de
equinos.
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Um g rande desa fio n a m edicina env olve a det ecção e m onitoramento da
inflamação, a qual resulta de diversas enfermidades (CRISMAN, 2008). Na busca de
marcadores precoces da inflamação e processos infecciosos em equinos, pesquisas
com proteínas da fase aguda da inflamação estão sendo desenvolvidas também na
espécie equina (GARRY et al., 1996, HULTÉN et al.,1999). Com o estabelecimento
de pesquisas nessa área, as proteínas de fase aguda são cada vez mais utilizadas
no diagnóstico e prognóstico nas doenças dos animais domésticos (CANISSO et al.,
2014).Em resposta a infecção ou injúria, essas proteínas são rapidamente liberadas
na corrente sanguínea e s uas concentrações são di retamente relacionadas com a
severidade da condição inflamatória do animal (CRISMAN, 2008).
A avaliação do l íquido amniótico no momento do parto é um método pouco
invasivo e ág il capaz de demonstrar processos de comprometimento da pl acenta e
feto. Poucos são os estudos clínicos desenvolvidos em líquido amniótico de equino e
não há relatos na literatura da realização de proteinograma em fluidos fetais. Desta
forma, se faz necessária a i dentificação de marcadores bioquímicos e proteínas de
fase aguda no líquido amniótico de ég uas saudáveis no momento do parto, sendo
este o objetivo explorado nesta dissertação.
2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
O objetivo deste estudo é identificar marcadores bioquímicos e proteínas de
fase aguda no líquido amniótico em éguas saudáveis no momento do parto.
Objetivo Específico
- Realizar pr oteinograma d o l íquido am niótico no momento d o parto e m
éguas saudáveis.
- Determinar as concentrações de eletrólitos e enzimas presentes no líquido
amniótico de éguas saudáveis no momento do parto.
3 ARTIGO
PERFIL BIOQUÍMICO E PROTEÍNAS DE FASE AGUDA NO LÍQUIDO AMNIÓTICO DE ÉGUAS SAUDÁVEIS
I.S. Finger; B. R. Curcio; C. Haetinger; L.S. Feijó; F.M. Pazinato; N.C. Prestes;
C.E.W. Nogueira.
Submetido à revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
15
Artigo 1
2
3
PERFIL BIOQUÍMICO E PROTEÍNAS DE FASE AGUDA NO LÍQUIDO 4
AMNIÓTICO DE ÉGUAS SAUDÁVEIS 5
6
BIOCHEMICAL PROFILE AND ACUTE PHASE PROTEIN OF AMNIOTIC FLUID 7
IN HEALTHY MARES 8
9
I.S. FingerI*; B. R. CurcioIII; C. HaetingerI; L.S. FeijóI; F.M. PazinatoI; N.C. PrestesII; 10
C.E.W. NogueiraIII. 11
12 IPós – Graduanda, Faculdade de Veterinária, UFPel, Pelotas, RS 13 IIUniversidade Estadual de São Paulo, UNESP, Botucatu, SP 14 IIIUniversidade Federal de Pelotas, Faculdade de Veterinária, UFPel, Pelotas, RS 15
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RESUMO 26
A análise do líquido amniótico é útil para compreender o processo bioquímico que 27
envolve a unidade feto-placentária. O objetivo do presente estudo foi identificar 28
marcadores bioquímicos e proteínas da fase aguda no líquido amniótico de éguas 29
saudáveis no momento do parto. A coleta do líquido amniótico foi realizada pelo 30
método de amniocentese, assim que exposta a bolsa amniótica na primeira fase do parto, 31
através de punção direta. Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, entre 5 e 21 anos 32
de idade, da raça Puro Sangue Inglês, na região Sul do Brasil. A composição bioquímica 33
foi avaliada empregando-se kits comerciais e o proteinograma pela técnica de 34
eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE). Os resultados obtidos de média e 35
erro padrão da média para os componentes bioquímicos foram: pH 7,70+0,02, glicose 36
1,22+0,08 (mg/dL), fosfatase alcalina 30,45+2,67 (UI/L), gamma – GT 4,66+0,62 37
(UI/L), uréia 33,59+2,34 (mg/dL), creatinina 5,10+0,59(mg/dL), sódio 54,35+2,51 38
(mEq/L), potássio 1,71+0,12 (mEq/L), cloretos 72,09+5,94 (mEq/L), cálcio 3,86+0,23 39
(mg/dL), osmolaridade 277,32+17,76 (mOsml/L) e proteína total 26,04+4,39 (mg/dL). 40
A osmolaridade apresentou correlação com os íons sódio (R=0,60), potássio (R=0,55) e 41
cálcio (R=0,53). Foram detectadas vinte e duas proteínas de fase aguda, sendo que as 42
proteínas inflamatórias albumina e transferrina foram identificadas em mais de 97% das 43
éguas avaliadas. Foi possível a identificação de marcadores bioquímicos e proteínas 44
inflamatórias no liquido amniótico de éguas saudáveis a termo. Somente a transferrina 45
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações inferiores no grupo 46
de éguas mais velhas. 47
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Palavras–chave: Gestação, Eletrólitos, Proteinograma, Albumina, Tranferrina. 49
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ABSTRATC 57
The analysis of amniotic fluid is useful for understanding the biochemical process 58
involving the fetal-placental unit. The aim of this study was to evaluate biochemical 59
profile and acute phase proteins in the amniotic fluid of healthy mares during labor. The 60
collection of amniotic fluid was performed by amniocentesis method, once exposed to 61
the amniotic sac in the first stage of labor, by direct puncture. It has been observed forty 62
Thoroughbred pregnant mares in Southern Brazil. The biochemical composition was 63
evaluated using commercially kits and proteinogram was measured by eletrophoresis in 64
poliacrylamide gel (SDS – PAGE). The results of mean and standard error were: pH 65
7.70+0.02; glucose 1.22+0.08; alkaline phosphatase 30.45+ 2.67 (IU/L); gamma – GT 66
4.6+0.62 (IU/L), urea 33.59+2.34 (mg/dL), creatinine 5.10+0.59(mg/dL), sodium 67
54.35+2.51 (mEq/L); potassium 1.71+0.12 (mEq/L), chloride 72.09+5.94 (mEq/L); 68
calcium 3.86+0.23 (mg/dL); osmolarity 277.32+17.76 (mOsml/L) and total protein 69
26.04+4.39 (mg/dL). The osmolarity was correlated with ions sodium (R=0.60), 70
potassium (R=0.55) and calcium (R=0.53). Twenty-two acute phase protein were 71
detected and that inflammatory proteins albumin and transferrin have been identified in 72
more than 97% of the evaluated mares. It was possible to identify biochemical markers 73
and inflammatory proteins in the amniotic fluid of healthy full term mares. Only the 74
transferrin presented among different age groups, with lower concentrations in the older 75
group of mares. 76
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Keywords: Gestation, Electrolytes, Proteinogram, Albumin, Transferrin. 78
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INTRODUÇÃO 89
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O líquido amniótico no início da gestação é produzido a partir de secreções do 91
epitélio amniótico e da urina fetal. Posteriormente, com o desenvolvimento da gestação, 92
o esfíncter vesical impede a liberação da urina fetal para a cavidade amniótica e a saliva 93
e as secreções nasais fetais passam a fazer parte da composição do líquido amniótico 94
(Baetz et al., 1976).As funções vitais para o desenvolvimento e a manutenção da vida 95
fetal como a oxigenação, nutrição e a remoção das excretas nitrogenadas são realizadas 96
pela circulação placentária (Guinter, 1998; Prestes, 2006). Neste contexto, o líquido 97
amniótico desempenha papel fundamental na gestação como no parto das éguas 98
(Zanella et al., 2013). 99
A unidade útero-placentária pode ser comprometida por processos de 100
hipoxemia ou infecção, o que interfere na difusão entre as circulações materna e fetal, 101
reduzindo o aporte de nutrientes e oxigênio para o feto e a placenta (Rossdale, 2004). O 102
líquido amniótico reflete o estado materno fetal tanto por sua composição como pelo 103
seu volume, tendo importância na boa evolução da gestação (Dertkigil et al., 2005). Em 104
equinos existem poucos trabalhos sobre o tema, contudo já foi demonstrado que a 105
variação na concentração dos componentes bioquímicos do fluido amniótico pode ter 106
uma relação significativa com a saúde fetal, podendo indicar certas enfermidades 107
(Kochhar et al., 1997).Em éguas da raça Puro Sangue Inglês, a osmolaridade apresentou 108
uma correlação positiva com a idade da parturiente, enzimas e eletrólitos do líquido 109
amniótico (Curcio et al., 2012). Em estudo realizado por Zanella et al. (2013) os autores 110
identificaram que em éguas, de acordo com o período gestacional, há uma variação na 111
composição bioquímica tanto do líquido amniótico quanto do líquido alantóide. A 112
concentração de lactato no fluido amniótico foi avaliada no momento do parto em 113
éguas, podendo ser útil na identificação dos neonatos que necessitam de intervenção 114
precoce, logo após o nascimento (Pirrone et al., 2012). Mais estudos devem ser 115
desenvolvidos para que o líquido amniótico possa ser uma eficiente ferramenta na rotina 116
clínica de equinos. 117
Um grande desafio na medicina envolve a detecção e monitoramento da 118
inflamação, a qual resulta de diversas enfermidades (Crisman, 2008). Com o 119
estabelecimento de pesquisas nessa área, as proteínas de fase aguda são cada vez mais 120
19
utilizadas no diagnóstico e prognóstico nas doenças dos animais domésticos (Canisso et 121
al., 2014).Em resposta a infecção ou injúria, essas proteínas são rapidamente liberadas 122
na corrente sanguínea e suas concentrações são diretamente relacionadas com a 123
severidade da condição inflamatória do animal (Crisman, 2008). 124
A avaliação do líquido amniótico no momento do parto é um método pouco 125
invasivo e ágil capaz de demonstrar processos de comprometimento da placenta e feto. 126
Poucos são os estudos clínicos desenvolvidos em líquido amniótico de equino e não há 127
relatos na literatura da realização de proteinograma em fluidos fetais. Desta forma, o 128
objetivo deste estudo é identificar marcadores bioquímicos e proteínas da fase aguda no 129
líquido amniótico de éguas saudáveis no momento do parto. 130
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MATERIAL E MÉTODOS 132
Animais 133
Este estudo foi realizado em um criatório de cavalos da Raça Puro Sangue 134
Inglês, localizado no município de Bagé, sul do Brasil, latitude 31°34’48.54” e 135
longitude 54°11’06.38”. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de 136
Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas, sob o 137
número de protocolo 23110.005008/2013-43. 138
As éguas eram mantidas durante o verão em campo nativo e durante o inverno 139
a consorciação de azevém (Lolium multiflorum), trevo branco (Trifolium repens) e 140
cornichão (Lotus corniculatus) como pastagem cultivada. A suplementação era 141
realizada através de ração balanceada com garantia de 12% de proteína e 27,5% Mcal 142
de energia digerível. A água estava disponível ad libitum. 143
Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, saudáveis, entre 5 e 21 anos de idade, 144
apresentando o mesmo padrão de escore corporal. As éguas foram divididas em dois 145
grupos de acordo com Madill (2002): o grupo 1 (n= 19), éguas jovens, com idades entre 146
cinco e oito anos (6,8 + 0,32) e o grupo 2 (n= 21), éguas com idade superior a nove 147
anos(13,1 + 0,85). 148
As éguas foram monitoradas durante todo o período gestacional por médico 149
veterinário. Mensalmente eram submetidas a exames de palpação retal e 150
ultrassonográficos para avaliação do feto e da placenta. A partir do 5o mês de gestação 151
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realizava-se a medição da espessura da junção útero-placentária via transretal utilizando 152
transdutor linear de 5 MHz, conforme descrito Renaudin et al. (1997). 153
Trinta dias antes da data de previsão do parto as éguas eram direcionadas para 154
o lote de parição e mantidas soltas a campo sob vigilância contínua até iniciar o parto. O 155
tempo médio de gestação foi de 345,8 + 1,9 dias. Após o rompimento da bolsa 156
alantoideana e exposição da membrana amniótica eram conduzidas às cocheiras 157
maternidade para que todos os partos fossem assistidos. Todos os partos foram 158
eutócicos com o nascimento de potros viáveis. 159
As placentas foram inspecionadas e pesadas imediatamente após a expulsão. O 160
peso médio das placentas foi de 6,7 + 0,2 Kg. Para avaliação macroscópica, as placentas 161
foram dispostas em formato de “F”, conforme descrito por Schlafer (2004). Foram 162
coletados fragmentos de sete pontos para avaliação histopatológica, sendo estes 163
correspondentes a estrela cervical, corpo uterino, corno gravídico e não gravídico, 164
bifurcação, âmnio e cordão umbilical, estes foram armazenados em tubos Falcon® de 165
50mL acrescidos de solução de formalina tamponada a 10% para fixação e posterior 166
avaliação microscópica. Todas as éguas utilizadas neste estudo apresentaram padrão 167
histopatológicas das placentas sem alteração, de acordo com a avaliação descrita por 168
Lins et al. (2012). 169
170
Coleta de material 171
A coleta do líquido amniótico foi realizada através de punção direta da vesícula 172
amniótica, com seringa de 20mL e agulha (40x12 mm) estéril (método de 173
amniocentese), assim que exposta a bolsa amniótica na primeira fase do parto. 174
O material foi imediatamente transferido para tubos falcon® de 15 mL e 175
estocado em freezer sob temperatura de - 20°C para posterior avaliação. 176
177
Análise Bioquímica do Líquido Amniótico 178
As análises bioquímicas foram realizadas no laboratório de patologia clínica da 179
Faculdade de Veterinária e Zootecnia da UNESP/Botucatu, similar ao descrito por 180
Zanella et al. (2013). Foram avaliados pH, glicose, fosfatase alcalina, gamma – GT, 181
uréia, creatinina, sódio, potássio, cloretos, cálcio, osmolaridade e proteína total A 182
quantificação foi realizada com espectrofotômetro, SB – 190 Celm (Companhia 183
21
Equipadora de Laboratórios Modernos, Barueri, São Paulo, SP, Brasil), para todos os 184
elementos, exceto sódio e potássio através do equipamento CELM FC – 280 fotômetro 185
de chama (Companhia Equipadora de Laboratórios Modernos). Para quantificar os 186
níveis de creatinina, uréia e cloretos foi utilizado kit CELM (Companhia Equipadora de 187
Laboratórios Modernos) de acordo com as instruções do fabricante. 188
189
Proteinograma 190
O proteinograma do líquido amniótico foi obtido pela técnica de eletroforese 191
em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS – PAGE), 192
noLaboratório de Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária - FCAV - 193
UNESP, Jaboticabal, conforme método descrito por Laemmli (1970) e as 194
recomendações de Fagliari e Silva (2002). Após o fracionamento, o gel foi corado 195
durante duas horas em solução de azul de coomassie; em seguida, foi descorado em 196
solução de metanol e ácido acético. Os pesos moleculares e as concentrações das 197
proteínas foram determinadas mediante leitura em densitômetro computarizado 198
(Densitometer CS9301- PC - Shimadzu, Tokyo-Japan). Para a identificação das 199
proteínas no gel, foi utilizada solução marcadora (Sigma Marker, Wide Range – Saint 200
Louis, USA) com diversos pesos moleculares, variando de 20.000 a 200.000 dáltons. 201
202
Análise Estatística 203
A análise estatística foi realizadacom auxílio do software Statistix8.0® 204
(Analytical Software, Tallahassee, FL, USA). Todos os valores bioquímicos e proteínas 205
de fase aguda foram expressos em média + erro padrão. Os dados foram submetidos a 206
teste de normalidade Shapiro Wilk. Foi realizado para todas as variáveis respostas o 207
teste de correlação de Pearson. As comparações entre as médias das proteínas de fase 208
aguda entre os grupos foram realizadas pelo teste Two Sample T Test. O teste exato de 209
Fisher foi utilizado para comparar os índices de éguas que apresentaram proteínas 210
inflamatórias entre os grupos de idade. 211
212
213
214
215
22
RESULTADOS 216
217
Não foi observada correlação entre as proteínas inflamatórias identificadas no 218
líquido amniótico. No entanto, nas análises bioquímicas foi possível observar que a 219
osmolaridade apresentou correlação positiva com sódio (R = 0.60, p = 0,0001), potássio 220
(R = 0.55, P =0,0004) e cálcio (R = 0.53, P = 0,0007). 221
Os resultados das análises bioquímicas realizadas no líquido amniótico das 222
éguas no momento do parto estão apresentados na Tab. 1. 223
224
Tabela 1. Média, Erro Padrão (S.E), Valores Mínimo – Máximo das variáveis 225
analisadas no líquido amniótico no momento do parto (N=31). 226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
No traçado densitométrico foram detectadas no líquido amniótico vinte e duas 243
proteínas com pesos moleculares variando 19.439 a 272.284 dáltons (Da). Destas, dez 244
proteínas foram consideradas para o estudo, por serem imunoglobulinas e proteínas de 245
fase aguda. Assim nas 36 éguas utilizadas para essa análise, destacaram-se com 246
respectiva percentagem no fluido amniótico a albumina (n=36; 100%), transferrina 247
Variável Média+S.E Valores Mínimo –
Máximo
pH 7,70+0,02 7,42 – 7,97
Glicose (mg/dL) 1,22+0,08 1,0 – 3,0
Fosfatase Alcalina (UI/L) 30,45+2,67 8,0 – 95
Gamma – GT (UI/L) 4,66+0,62 1,80 – 16,4
Uréia (mg/dL) 33,59+2,34 6,80 – 61,8
Creatinina (mg/dL) 5,10+0,59 2,0 – 17,3
Sódio (mEq/L) 54,35+2,51 31 – 89
Potássio (mEq/L) 1,71+0,12 0,9 – 3,5
Cloretos (mEq/L) 72,09+5,94 47 – 239
Cálcio (mg/dL) 3,86+0,23 1,8 – 6,47
Osmolaridade (mOsml/L) 277,32+17,76 143 – 633
Proteína Total (mg/dL) 26,04+4,39 9,23 – 139,07
23
(n=35; 97,22%), IgG cadeia leve (n=33; 91,7%), IgG cadeia pesada (n=30; 83,33%), 248
IgA (n=30; 83,3%), haptoglobina (n=22; 61,11%), ceruloplasmina (n=21; 58,3%), α1 - 249
antitripsina (n=13; 36,11%), α1 - glicoproteína ácida (n=7; 20%) e 23 kDa (n=2; 5,6%). 250
As concentrações destas dez proteínas, apresentadas pela média, juntamente com seus 251
respectivos erros padrões, valores mínimos e máximos dos pesos moleculares, 252
encontram-se na Tab. 2. Na comparação entre os grupos de idade, não foi observada 253
diferença na porcentagem de éguas em que foram identificadas as proteínas 254
inflamatórias. Na avaliação da concentração das proteínas entre os grupos, somente a 255
transferrina apresentou diferença (p=0.01), sendo detectadas médias superiores no grupo 256
de éguas jovens (47,8 + 14,2) em relação às éguas mais velhas (10,3 + 3,7). 257
258
Tabela 2. Média, Erro Padrão das Concentrações, Valores Mínimo e Máximo do Peso 259
Molecular das proteínas identificadas no líquido amniótico no momento do parto 260
(N=36). 261
262
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280
281
282
Proteínas de Fase
Aguda
(mg/dL)
N Média+S.E Valores
Mínimo-Máximo (Da)
Albumina 36 177,01+30,58 63,74 – 69,76
Transferrina 35 37,98+9,47 80,53 – 89,32
IgG Cadeia Leve 33 148,99+39,90 23,80 – 40,60
IgG Cadeia Pesada 30 10,43+2,63 23,88 – 61,72
IgA 30 1,10+0,51 151,54 – 194,12
Haptoglobina 22 17,47+12,88 40,70 – 56,97
Ceruloplasmina 21 0,39+0,10 93,40 – 120,40
α1 – Antitripsina 13 15,21+9,10 59,41 – 64,30
α1 – glicoproteína ácida 7 0,24+0,08 33,86 – 41,40
23 kDa 2 7,50+3,35 23,30 – 23,42
24
DISCUSSÃO 283
284
Este estudo determinou componentes bioquímicos em todas as amostras de 285
líquido amniótico obtidas no momento do parto. A unidade feto-placentária é um 286
sistema dinâmico, o qual realiza trocas constantes entre a circulação materna e os 287
fluidos fetais, sendo que a variação nas concentrações desses componentes pode ter uma 288
relação significativa com a saúde fetal (Kochhar et al., 1997). 289
O valor médio encontrado para o pH foi de 7,70. A discreta alcalinidade 290
demonstrada para o valor do pH pode estar relacionada a presença dos eletrólitos, 291
contudo não foi encontrada correlação entre eles. Em equinos não existem valores 292
identificados de pH do líquido amniótico no momento do parto. Em estudo realizado 293
por Martins (2004) o pH identificado no líquido amniótico de cadelas variou de 7,50 a 294
8,50.Em estudo realizado em ovelhas por Prestes et al.(2001), os autores observaram 295
uma diminuição do pH ao longo da gestação, os autores sugerem que esta diminuição 296
ocorra devido ao aumento de secreções e eliminação de proteínas oromucóides. 297
A composição eletrolítica do líquido amniótico varia muito e essas trocas 298
refletem a atividade dos rins, pulmões e trato digestório (Gulbis et al.,1998). No 299
presente estudo os níveis de sódio identificados foram inferiores aos valores obtidos nas 300
três fases da gestação por Zanella et al. (2013). 301
De acordo com o estudo realizado por Kochhar et al.(1997) há uma elevação 302
na concentração de íons potássio e cálcio no fluido alantóide, sugerindo um aumento da 303
urina e atividade metabólica fetal. Estes eletrólitos demonstraram uma diminuição no 304
líquido amniótico no momento do parto ao comparar com os dados obtidos para o terço 305
final da gestação por Zanella et al.(2013). 306
Em estudo realizado em ovelhas por Prestes et al. (2001), os cloretos 307
demonstraram a mesma tendência que o sódio. Em que houve uma diminuição dos 308
níveis ao longo dos terços gestacionais. Zanella et al. (2013) observaram um aumento 309
no terço médio e uma redução no terço final da gestação. Em nosso estudo, os níveis 310
dos íons cloretos foram superiores aos valores obtidos por Zanella et al. (2013). Através 311
do estudo dos eletrólitos como sódio, potássio e cálcio foi possível demonstrar que estes 312
componentes e suas respectivas variações influenciaram na osmolaridade do líquido 313
amniótico. 314
25
O valor médio de 1,22 mg/dL para os níveis de glicose no líquido amniótico no 315
momento do parto foi inferior ao valor de 4.0 mg/dL observado por Zanella et al. (2013) 316
no terço final da gestação. Isto demonstra que há uma redução na concentração de 317
glicose de acordo com a evolução da gestação em éguas saudáveis. Em mulheres, a 318
glicose do fluido amniótico é utilizada como um indicador sensível e específico de 319
infecção intra-amniótica (Kirshon et al., 1991). Em estudos com ovelhas (Burd et al., 320
1975; Carter et al., 1993) os autores demonstraram que a placenta metaboliza 321
rapidamente a glicose, produzindo grande quantidade de lactato como subproduto. A 322
concentração de lactato no líquido amniótico de equinos esta relacionada positivamente 323
com o pH do potro imediatamente após o nascimento, uma vez que um pH baixo pode 324
indicar hipóxia neonatal (Pirrone et al.,2012). 325
A fosfatase alcalina está correlacionada com maturidade, formação óssea e 326
principalmente, com a função renal fetal (Hahnemann, 1974). Pode ocorrer um aumento 327
da atividade da enzima devido a maturação avançada do intestino, fígado, ossos e rins 328
fetais, a entrada direta de células descamadas da mucosa intestinal no líquido amniótico 329
ou eventual passagem de matéria fecal durante o processo de nascimento (Williams et 330
al., 1993). Os níveis obtidos para esta enzima em nosso trabalho no momento do parto, 331
foram inferiores ao valor obtido por Zanella et al. (2013) no terço final da gestação. 332
Sugerindo que com a proximidade do parto, em éguas saudáveis, há uma redução na 333
atividade da fosfatase alcalina. 334
Em estudo realizado por Prestes et al. (2001) foi possível determinar grande 335
concentração da enzima gama – GT nos rins, pâncreas e fígado, participando do 336
metabolismo de vários mediadores de funções fisiológicas. Assim, os valores obtidos 337
para esta enzima no líquido amniótico no momento do parto demonstram a atividade 338
destes órgãos em potros oriundos de éguas gestantes saudáveis. 339
A concentração média de uréia foi de 33.59, valor este inferior ao valor obtido 340
por Zanella et al. (2013), no terço final da gestação. Através destes valores é possível 341
observar uma redução nos níveis de uréia no liquido amniótico no momento do parto. 342
O aumento na concentração de creatinina no líquido amniótico reflete a 343
maturação do sistema urinário no neonato equino (Williams et al., 1993), uma vez que a 344
creatinina representa um bom marcador de maturação e função renal em humanos 345
(Begneaud et al., 1969). O rim fetal é afuncional durante o seu período de formação, 346
26
porém sua contribuição no final do processo de maturação fetal é importante para a 347
sobrevida do concepto (Lumbers et al., 1985). O estudo realizado em ovelhas sem 348
alterações gestacionais por Prestes et al. (2001), comprovou que os valores de creatinina 349
no líquido amniótico aumentaram conforme a evolução da gestação. Para Vaala (1999), 350
o nível de creatinina sérica não é um marcador confiável da função renal dos potros 351
neonatos, porque a placenta é a principal responsável pela eliminação de metabólitos do 352
feto e a elevação da creatinina é geralmente uma consequência de disfunção placentária. 353
Desta forma, o nível obtido de creatinina no líquido amniótico de éguas sadias reflete 354
uma adequada função feto-placentária, e um potencial marcador dessa condição. 355
Em estudos realizados por Canisso et al. (2014) e Coutinho et al. (2013), os 356
autores demonstraram um aumento nos níveis séricos das proteínas inflamatórias 357
haptoglobina e Amilóide A sérica, em éguas com alterações inflamatórias na placenta. 358
No líquido amniótico de equinos, não há relato da avaliação de proteínas de fase aguda. 359
A albumina demonstrou estar presente em todas (100%) as amostras (177.01+30.58 360
mg/dL). A proteína identificada com peso molecular de23 kDa (7.50+3.35 mg/dL) 361
apresentou o menor percentual e foi identificada em apenas duas amostras (5,6%). 362
A transferrina, proteína de fase aguda negativa, apresentou um valor 363
significativamente inferior no grupo de éguas mais velhas. Apresentando um padrão 364
similar ao descrito sobre as concentrações de albumina, em vacas multíparas, o que 365
pode representar um marcador de processos inflamatórios associados a processos 366
reprodutivos no pós-parto (Krause et al., 2013). 367
368
CONCLUSÃO 369
370
Foi possível identificar marcadores bioquímicos e proteínas inflamatórias no 371
líquido amniótico de éguas saudáveis no momento do parto. Somente a transferrina 372
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações menores no grupo 373
de éguas mais velhas. 374
375
376
377
378
27
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4 CONCLUSÃO GERAL Poucos são os estudos desenvolvidos em l íquido am niótico n a esp écie
equina. D esta forma, a partir dos resultados bioquímicos e o pr oteinograma
apresentados foi possível determinar valores de referência para a análise do líquido
amniótico d e ég uas saudáveis no m omento d o par to. Somente a t ransferrina
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações inferiores no
grupo de éguas mais velhas.
Mais estudos devem ser desenvolvidos para que o l íquido amniótico possa
ser uma eficiente ferramenta na rotina clínica de equinos.
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