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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO

BIOQUÍMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIÇÃO

Dissertação

ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA

(EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.)

Adeline Conceição Rodrigues

OURO PRETO – MG

2015

ADELINE CONCEIÇÃO RODRIGUES

ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA

(EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Saúde e Nutrição, como parte

integrante dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Saúde e Nutrição, área de concentração:

Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição.

Orientador: Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto

OURO PRETO – MG

2015

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao Prof. Dr.Uelinton Manoel Pinto pela orientação, disponibilidade, sabedoria,

dedicação, empenho, motivação e ensinamentos que levarei por toda a vida. Sou grata a você

por ter me dado à oportunidade de desenvolver este trabalho, pelo exemplo de profissional

que é e que foi durantes esses anos.

AGRADECIMENTOS

A Deus.

A Universidade Federal de Ouro Preto, ao Programa de Pós Graduação em Saúde e Nutrição

pela oportunidade. A CAPES pela concessão da bolsa.

Ao CNPq pelo financiamento do projeto.

Aos meus pais e minha irmã Aline por serem a melhor parte da minha vida.

A minha família de Ouro Preto, Juliana, Vanessa, Eric, Poly, Carla, Angélica, Décio, pela

amizade e aconchego familiar.

As minhas queridas Anitas, Camila, Karem, Karol e Poly pela amizade.

A Michele Cristina Vieira e Caetano, pela paciência e conhecimento.

Aos colegas de laboratório pela ajuda, amizade e companhia.

A Brígida, Elis, Nayara, Ana Luisa, Bárbara e Flávia pela grande contribuição nos trabalhos.

A Profa Michele Bertoldi pela contribuição ao trabalho.

A Professora Maria Cristina Dantas Vanetti e o Professor Maurílio Lopes Martins por

participarem da banca de defesa e pelas contribuições.

A todos que contribuíram com esse trabalho, meus agradecimentos.

RESUMO

Muitas bactérias regulam a expressão gênica em resposta a sinais difusíveis produzidos de

forma dependente da densidade celular, em um processo denominado quorum sensing. Esse

processo ocorre por meio da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras. Os

fenótipos regulados pelo quorum sensing estão envolvidos nos processos de virulência,

esporulação, motilidade, produção de enzimas, bioluminescência, produção de pigmentos,

entre outros. A interrupção de qualquer das etapas do sistema quorum sensing pode provocar

consequências prejudiciais à virulência bacteriana. Alguns trabalhos evidenciam que extratos

à base de plantas apresentam ação anti-quorum sensing, com possíveis aplicações no controle

de infecções. Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutas da

família das mirtáceas, nativas do Brasil, ricas em compostos fenólicos e apresentam atividade

antioxidante e antimicrobiana. Foi objetivo do estudo detectar a atividade anti-quorum

sensing dos extratos bruto e fenólico obtidos das frutas grumixama e pitanga em

concentrações que não inibem o crescimento microbiano. Os compostos fenólicos das polpas

foram extraídos e purificados utilizando extração em fase sólida (mini-coluna C18) e

quantificados por espectrofotometria. A atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e

fenólico foi avaliada empregando diferentes bactérias e a detecção de diferentes fenótipos.

Chromobacterium violaceum foi avaliado pelo ensaio qualitativo de difusão em ágar e pelo

teste de quantificação da inibição da produção de violaceína. Em Aeromonas hydrophila e

Serratia marcescens foram avaliadas a motilidade tipo swarming e swimming e em C.

violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e Escherichia coli foi avaliada a formação de

biofilme. Os extratos de ambas as frutas apresentaram inibição significativa na produção de

violaceína por C. violaceum. Houve também inibição da motilidade bacteriana do tipo

swarming e swimming em A. hydrophila e S. marcescens. Os extratos de ambas as frutas

aumentaram a formação de biofilme em C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens e E. coli.

Esses resultados indicam que os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga apresentam

atividade anti-quorum sensing sugerindo potenciais aplicabilidades nas indústrias alimentícia

e farmacêutica, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing.

Palavras-chave: Quorum sensing. Anti-quorum sensing Extratos fenólicos. Grumixama.

Pitanga.

ABSTRACT

Many bacteria regulate gene expression in response to diffusible signals produced

dependently on cell density, in a process called quorum sensing. This process occurs by

means of producing, releasing and detecting signaling molecules. The phenotypes regulated

by quorum sensing are involved in processes related to virulence, sporulation, motility,

production of enzymes, bioluminescence, production of pigments, among others. Interrupting

any stage of the quorum sensing system can cause detrimental effects to bacterial virulence.

Some studies have shown that plant based extracts have quorum quenching effects, with

possible applications in infection control. Grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga

(Eugenia uniflora L.) are fruits that belong to the family Myrtaceae, native to Brazil, rich in

phenolic compounds and have antioxidant and antimicrobial activity. The purpose of this

study was to evaluate the quorum quenching activity of crude and phenolic extracts obtained

from grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) in concentrations

that do not inhibit microbial growth. Phenolic compounds from the pulps were extracted and

purified using solid-phase extraction (C18 mini-column) and quantified by using

spectrophotometry. Quorum quenching activity of crude and phenolic extracts was evaluated

using different bacteria and the detection of different phenotypes. For instance,

Chromobacterium violaceum was evaluated in agar diffusion assay as well as through the

quantification of violacein production; for A. hidropyla and Serratia marcescens, swarming

and swimming motilities were tested and for C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila and

Escherichia coli biofilm formation was assayed. Extracts from both fruits showed significant

inhibition of violacein production by C. violaceum. There was also inhibition of bacterial

swarming and swimming motilities for A. hydrophila and S. marcescens. The extracts of both

fruits increased biofilm formation in C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens, and E. coli.

These results indicate that crude and phenolic extracts from grumixama and pitanga present

quorum quenching activity suggesting a potential aplication in the food and pharmaceutical

industries inhibiting phenotypes regulated by quorum sensing.

Keywords: Quorum sensing. Quorum quenching. Phenolic extracts. Grumixama. Pitanga.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖

representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖

indica moléculas de H, OH ou O. ............................................................................................ 20

Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D) Grumixama

amarela. E) Sementes de grumixama. ...................................................................................... 34

Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira amarela

florida. ...................................................................................................................................... 34

Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga. .. 35

Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos. ............. 36

Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato

bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por

pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle

negativo - Água destilada estéril, D) 2520,5 mg AGE/L, E) 504,10 mg AGE/L, F) 252,05 mg

AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama....... 43


fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por



AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama. ... 43


bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por



AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga. ...................... 44


fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por

pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle


AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga. .......................... 44

Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama

em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1

) após 24

horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de

200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem

estatisticamente entre si (p<0,05). ........................................................................................... 48

Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A) Controle,

B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de grumixama na concentração de

100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41 mg AGE/L, E)

Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato bruto de

grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L. .................................................................. 49

Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de

grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC

ml-1

) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB

adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não

diferem estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................... 50

Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A)

Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de grumixama na

concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97

mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato

fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L. ............................................... 50

Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em

diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1

) após 24


200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem

estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 51

Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B)

Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89

mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato

bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na

concentração de 14,72 mg AGE/L. .......................................................................................... 52

Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga

em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1

) após 24



estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 52

Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle,

B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de

92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato

fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na

concentração de 23,15 mg AGE/L. .......................................................................................... 52

Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S.

Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes

com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de

grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na

concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato

bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de

grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56

Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S.

Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes

com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de


concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato


grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56

Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. Marcescens e

A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A.

Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na

concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61

mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na

concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52

mg AGE/L. ............................................................................................................................... 57

Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. Marcescens e

A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A.

Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L. ............................................................................................................................... 58

Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C.

Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli

ATCC10536. ............................................................................................................................ 60

Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C.


ATCC10536. ............................................................................................................................ 61

Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. Violaceum

ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110 E) E. Coli ATCC10536. ... 62

Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C.


ATCC10536. ............................................................................................................................ 63

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum

sensing em bactérias................................................................................................................. 24

Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos. ................................... 26

Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing. ...................................... 29

Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos

totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama. ............................... 45


totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga. ...................................... 45

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AGE/L - Ácido Gálico Equivalente/Litro

AHL -Acil Homoserina Lactona

AI-1 -Autoindutor 1; Acil Homoserina Lactona

AI-2 - Autoindutor-2

AI-3 - Autoindutor-3

AIP - Peptídeos autoindutores

CV026 - Estirpe mutante de Chromobacterium violaceum biossensora de AHL

DFS - Fator de sinal difusível

DMSO - Dimethylsulfoxide, diluente ou solvente

LB - Luria Bertani, meio de cultura bacteriano

MIC - Concentração inibitória Mínima

PQS - Heptil-3-hidroxi-4-quinolona, sinalizador encontrado em Pseudomonas aeruginosa

RPM - Rotações por minuto

UFC -Unidades Formadoras de Colônia

SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17

2 – REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 18

2.1 - Quorum sensing ........................................................................................................... 18

2.1.1 - Mecanismo de comunicação ................................................................................. 18

2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing ............................... 22

2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos ............ 26

2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing ............................................. 27

2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing ......................................................... 28

2.3 - Compostos fenólicos .................................................................................................... 31

2.3.1 - Definição, formação e função ............................................................................... 31

2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis) .............................................................................. 33

2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.) ...................................................................................... 35

3 – OBJETIVOS ..................................................................................................................... 37

3.1 - Objetivos ...................................................................................................................... 37

4 – MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 37

4.1 - Material vegetal............................................................................................................ 37

4.1.2. Preparo do material vegetal .................................................................................... 37

4.2 - Extração e purificação de compostos fenólico ............................................................. 38

4.3 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 38

4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas .................................................................................... 38

4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e fenólicos

.............................................................................................................................................. 39

4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum ...................... 39

4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC) .................................................... 39

4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ............... 40

4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A.

hydrophila e S. marcescens .............................................................................................. 40

4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S.

marcescens, A. hydrophila e E. coli ................................................................................. 41

4.6 - Análises estatísticas...................................................................................................... 41

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 42

5.1 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 42

5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum ............................. 43

5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC) ....................................................................... 45

5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357 . 47

5.4.1 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de

grumixama ........................................................................................................................ 47


pitanga ............................................................................................................................... 50

5.5 - Efeito dos extratos de grumixama sobre a motilidade tipo swimming e swarming em S.

marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36 ..................................................................... 55

5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S.

marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536 ................................... 59

6 - CONCLUSÃO ................................................................................................................... 65

7 - REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 66

17

1 – INTRODUÇÃO

Com o objetivo de trazer benefícios à comunidade microbiana, as bactérias possuem um

comportamento individual e também cooperativo. O comportamento cooperativo envolve a

comunicação dependente da densidade celular denominada quorum sensing. Esse sistema

envolve a produção, a detecção de moléculas sinalizadoras e a ativação de genes específicos.

Moléculas sinalizadoras são produzidas pelas bactérias, normalmente se difundem livremente

pela membrana e acumulam no ambiente circulante. O aumento da população microbiana leva

ao acúmulo dessas moléculas sinalizadoras até atingirem um limiar basal, necessário para a

sua detecção por receptores específicos. O complexo sinalizador/receptor regula a expressão

de genes modulando fenótipos bacterianos. Este sistema normalmente atua na forma de um

feedback positivo para a produção de moléculas sinalizadoras, por isso, essas moléculas são

comumente denominadas de autoindutores. Os fenótipos regulados pelo quorum sensing

envolvem motilidade, formação de biofilme, resistência a antibióticos, melhora na absorção

de nutrientes, bioluminescência, produção de pigmentos, funções de virulência e deterioração

de alimentos.

O sistema quorum sensing opera principalmente por sinalizadores denominados Acil

Homoserina Lactonas (AHLs) em bactérias Gram-negativas, oligopeptídeos em bactérias

Gram-positivas e Autoindutor 2 (AI-2) que pode ser usado por ambos grupos bacterianos. A

comunicação pode ocorrer entre a mesma espécie e entre espécies distintas, dependendo do

tipo de sinalizador utilizado. O AI-2 é responsável pela sinalização interespecífica. Existe

também a comunicação mediada pelo Autoindutor 3 (AI-3) utilizada no mecanismo de

comunicação de Escherichia coli entero-hemorragica e Salmonella enterica sorotipo

Typhimurium.

A interferência no sistema quorum sensing pode impedir as células de expressassem

fenótipos como fatores de virulência, entre outros regulados por esse sistema. O controle da

ativação dessas características é de grande interesse para saúde pública e indústria de

alimentos, considerando o aumento da resistência bacteriana a antibióticos e o uso excessivo

de conservantes de alimentos. Os inibidores do quorum sensing podem ter sua ação na

produção de moléculas sinalizadoras, na sua inativação ou interferência na ligação de seus

respectivos receptores. Alguns estudos têm mostrado que os inibidores do sistema quorum

sensing podem ser sintéticos ou naturais.

18

Existem várias espécies de plantas com comprovadas propriedades terapêuticas, incluindo

atividade antimicrobiana. Os fitoquímicos presentes nas plantas também podem apresentar

atividade anti-quorum sensing, conforme mostram alguns trabalhos. Os inibidores naturais do

sistema quorum sensing podem ser uma alternativa para o uso de antibióticos no tratamento

de infecções e aos conservantes sintéticos em alimentos. É conhecida uma vasta gama de

plantas brasileiras que apresentam atividade antimicrobiana, porém, pouco se sabe sobre a

inibição do sistema de comunicação quorum sensing por essas plantas, reforçando a

necessidade de pesquisas nessa área.

Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutos da

grumixameira e pitangueira, árvores nativas do Brasil. A atividade antimicrobiana de folhas

de grumixameira e da pitangueira, assim como de frutos da pitangueira já foi demonstrada em

alguns estudos. Embora trabalhos envolvendo atividade antimicrobiana dos frutos de pitanga

(Eugenia uniflora L.) tenham sido demonstrados, conhecer a atividade antimicrobiana

especialmente sobre a inibição do sistema quorum sensing desses frutos poderia gerar

alternativas ao controle microbiano pelo uso de agentes naturais de frutos nativos brasileiros e

aumentar o conhecimento científico relacionado ao assunto.

2 – REVISÃO DE LITERATURA

2.1 - Quorum sensing

2.1.1 - Mecanismo de comunicação

As bactérias podem apresentar um comportamento cooperativo, tendo suas atividades

realizadas de forma mais eficiente quando em uma população suficientemente grande. Esses

micro-organismos monitoram sua densidade populacional pela detecção de moléculas

sinalizadoras e regulam a expressão gênica em função da densidade celular em um

mecanismo denominado quorum sensing (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994;

FUQUA e GREENBERG, 1996; FUQUA e GREENBERG, 2003; TAGA e BASSLER, 2003;

PLATT e FUQUA, 2010).

O sistema quorum sensing foi primeiramente descrito por Nealson e Hastings (1979) para a

bactéria Vibrio fischeri, uma bactéria marinha que pode viver de forma simbiótica

colonizando órgãos luminosos de peixes e lulas e em vida livre na água do mar. Em alta

19

densidade celular, Vibrio fischeri produz luz pela ativação do sistema quorum sensing que

regula positivamente os genes responsáveis pela bioluminescência (BOSGELMEZ-TINAZ,

2002; FUQUA e GREENBERG, 2003; MARCH e BENTLEY, 2004). Em baixas densidades

populacionais, o sinal produzido por V. fischeri não se acumula e a bioluminescência não é

induzida (BOSGELMEZ-TINAZ, 2002; FUQUA e GREENBERG, 2003).

A coordenação da expressão gênica mediada pela comunicação quorum sensing ocorre

através da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras (RUMJANEK,

FONSECA, e XAVIER, 2004; GONZALEZ e KESHAVA, 2006). Os sinalizadores, também

denominados autoindutores, são moléculas produzidas por bactérias, compostos difusíveis de

baixo peso molecular, empregados na regulação quorum sensing (TAGA e BASSLER, 2003;

PLATT e FUQUA, 2010). Eles podem ser classificados em três grupos principais: O

autoindutor-1 (AI-1) que engloba as moléculas de acil homoserina lactona (AHL) usadas por

bactérias Gram-negativas, os peptídeos autoindutores (AIP) que são usados por bactérias

Gram-positivas e o autoindutor-2 (AI-2) que engloba as moléculas usadas por ambos os

grupos bacterianos (RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; NAZZARO, FRATIANNI,

e COPPOLA, 2013). Além destas moléculas, diversas outras já foram descritas na literatura

com função de sinalização no sistema quorum sensing (TSAI e WINANS, 2010), como o AI-

3 utilizado por S. enterica sorotipo Typhimurium e E. coli entero-hemorrágica (MOREIRA,

WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010).

O mecanismo de comunicação quorum sensing por bactérias Gram-negativas se faz

principalmente por meio de moléculas autoindutoras conhecidas como AHL ou AI-1

(RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO,

FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). As AHLs contêm em sua estrutura um anel lactona com

uma cadeia acila lateral variável (Figura 1). Com base no comprimento da cadeia acila, as

AHLs podem ser classificadas como moléculas de cadeia curta ou longa (GONZALEZ e

KESHAVA, 2006).

20

Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖

representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖

indica moléculas de H, OH ou O. Fonte: Pinto (2005).

O mecanismo de comunicação envolve primariamente as proteínas LuxI e LuxR e suas

homólogas. A proteína LuxI ou suas homólogas sintetiza as AHLs, catalisando uma ligação

amida entre o S –adenosilmetionina (SAM) e o grupamento acila (GONZALEZ e

KESHAVA, 2006). A proteína LuxR ou suas homólogas funciona como receptores

citoplasmáticos de AHLs (WATERS e BASSLER, 2005), e normalmente são ativadores

transcricionais. LuxR apresenta dois domínios: um conjunto de resíduos conservados no

domínio amino-terminal compreende a região de ligação a AHL, além de mediar dimerização,

e um domínio carboxi-terminal responsável pela ligação a sítios específicos no DNA alvo. A

interação da AHL com o domínio amino-terminal provoca mudanças conformacionais que

modula a expressão gênica (ZHU e WINANS, 1999; FUQUA e GREENBERG, 2003;

WATERS e BASSLER, 2005; GONZALEZ e KESHAVA, 2006; PINTO e WINANS, 2009).

As moléculas de AHL sintetizadas pela LuxI se difundem livremente pela membrana

citoplasmática aumentando sua concentração, de acordo com o aumento da densidade celular.

Ao atingir uma concentração limiar crítica, essas moléculas são capazes de voltar ao

citoplasma da célula e se ligarem ao receptor LuxR. O complexo LuxR-AHL ativa ou mais

esporadicamente reprime a transcrição de genes e em alguns casos ativa a expressão do

próprio gene luxI por um sistema de feedback positivo (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER,

2004; WATERS e BASSLER, 2005). Cada proteína LuxI produz o sinal de alta

especificidade para o seu receptor LuxR e essas proteínas receptoras também possuem sítio de

ligação específico, permitindo que LuxR seja ativado somente por seu ligante cognato. Dessa

forma, cada espécie pode responder primariamente ao acúmulo de seu próprio sinal, em um

ambiente que contenha várias espécies (WATERS e BASSLER, 2005).

Alguns mecanismos podem evitar a ativação prematura do sistema quorum sensing e a

ligação de AHL a proteína receptora LuxR. Um dos mecanismos está relacionado a

estabilidade da proteína LuxR que é dependente da presença do autoindutor, onde na ausência

desse, a proteína receptora tem meia-vida de poucos minutos, enquanto que essa meia-vida

21

aumenta para mais de 200 minutos na presença de AHL (ZHU e WINANS, 1999; PINTO e

WINANS, 2009). O segundo mecanismo é a difusão de AHL para o meio extracelular.

Somente quando uma concentração significativa de sinal se acumula, indicando elevada

densidade celular, a concentração intracelular é capaz de ativar o circuito quorum sensing

(WATERS e BASSLER, 2005).

As bactérias Gram-negativas também podem se comunicar utilizando diversas outras

moléculas sinalizadoras como, por exemplo, as dicetopiperazinas (DKPS), fator de sinal

difusível (DFS); 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona (PQS), AI-3, entre outros (TSAI e WINANS

2010).

As bactérias Gram-positivas utilizam oligopeptídeos modificados como autoindutores,

conhecidos como AIP (autoinducer peptides), no processo de comunicação célula-célula.

Esses autoindutores são ativamente exportados para fora da célula, por meio de

transportadores do tipo ABC. Quando sua concentração aumenta a um limiar, estes

oligopeptídeos se ligam a um sensor de membrana denominado histidina quinase, pertencente

a um sistema de sinalização de dois componentes. Essa ligação provoca uma cascata de

fosforilação onde um ativador transcricional atua diretamente no DNA, influenciando a

transcrição de genes específicos (FUQUA, STEPHEN e GREENBERG, 1994; TAGA e

BASSLER, 2003; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA,

2013; YARWOOD et al., 2004; BALABAN et al., 2007; RUMJANEK, FONSECA e

XAVIER, 2004).

Moléculas denominadas AI-2, também conhecidas como furanosil borato diéster, são

sinalizadores utilizados por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas para comunicação

intra e interespécies. A combinação da utilização destes sinalizadores permite a bactéria fazer

censo de sua densidade populacional e de outras espécies presentes na vizinhança

(NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013).

Outro sinalizador utilizado na comunicação quorum sensing é o AI-3, de estrutura ainda

desconhecida, utilizado no mecanismo de comunicação de E. coli O157:H7 e S. enterica

sorotipo Typhimurium. Esse sinalizador está envolvido na comunicação cruzada entre essas

bactérias e o hormônio epinefrina e norepinefrina demostrando semelhança a esses devido ao

seu reconhecimento pelo receptor QseC (SPERANDIO et al., 2003; MOREIRA,

WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010).

22

2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing

Em função do sistema quorum sensing, as bactérias são capazes de coordenar diversas

funções coletivas como a migração para ambientes favoráveis, busca de nutrientes e a

proteção pela formação de biofilmes (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012). Esse sistema

também está envolvido nos processos de virulência, competência, esporulação, conjugação,

produção de bacteriocinas, síntese de antibióticos, enzimas, bioluminescência, produção de

pigmentos, entre outros (MARCH e BENTLEY, 2004; SKANDAMIS e NYCHAS, 2012;

NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Além desses fatores, as bactérias podem

controlar pelo sistema quorum sensing, a manipulação da resposta imune do hospedeiro

durante a fase da infecção, tendo esse sistema papel importante na proteção contra a ação

antimicrobiana do sistema imune humano (BJARNSHOLT et al., 2005).

O biofilme bacteriano é um dos fenótipos importantes regulados pelo mecanismo quorum

sensing e é caracterizado como sendo um crescimento agregado de micro-organismos sobre

uma superfície. O biofilme é um mecanismo que as bactérias desenvolveram para aderir a

superfícies formando comunidades, como estratégia de sobrevivência em ambientes adversos

como a mudanças de temperatura, dessecação, raios ultravioletas e no estabelecimento de

infecções. Suas células mais expostas podem formar uma barreira física que impede ou

diminui o contato dos agentes antimicrobianos com suas células mais profundas. Dessa forma,

são altamente tolerantes a antibióticos, podendo levar a seleção de estirpes resistentes

(HOIBY et al., 2010; SREY, JAHID e HÁ, 2013).

No biofilme, podem estar presente uma ou várias espécies, gêneros e estirpes microbianas

podendo ser formado em superfície biótica e abiótica (O’TOOLE, KAPLAN e KOLTER,

2000). Sua formação é um processo dinâmico envolvendo cinco etapas, incluindo fixação

reversível, fixação irreversível, formação de microcolônias, maturação e dispersão (SREY,

JAHID e HÁ, 2013; GU e REN, 2014).

Na primeira fase, fixação reversível, as bactérias livres são apresentadas a uma superfície

sólida por fluídos ou pela motilidade bacteriana. Estruturas extracelulares, como flagelos,

curli, fímbrias ou pili e proteínas de membrana ajudam as bactérias a interagirem com as

superfícies (FERREIRA, PEREIRA e MELO, 2010). Este processo é influenciado pelas

propriedades das células bacterianas e a superfície, como a carga, hidrofobicidade e rigidez

23

(PALMER, FLIN e BROOKS, 2007) e as células bacterianas ainda podem ser removidas pela

força de cisalhamento (STOODLEY et al., 2002).

Na fase de fixação irreversível, as células aderidas iniciam a produção de substâncias

poliméricas extracelulars (EPS) que consistem em polissacáridos, DNA, proteínas e lipídeos,

promovendo a transição de fixação bacteriana reversível para irreversível (RENNER e

WEIBEL, 2011). As células se multiplicando, acumulam EPS e crescem em estruturas

tridimensionais (3D) formando biofilmes maduros. Em um biofilme maduro, o EPS adere às

células bacterianas para apoiarem a estrutura 3D, permitindo o transporte de nutrientes e

remoção de resíduos.

A maturação é uma etapa em que o biofilme se desenvolve em uma estrutura organizada

podendo ser plana ou em forma de cogumelo. Células de alguns biofilmes maduros podem ser

liberadas na fase de dispersão aderindo a uma nova superfície e formando um novo biofilme

(GU e REN, 2014; SOLANO, ECHEVERZ e LASA, 2014). O quorum sensing está

envolvido na regulação das fases de crescimento do biofilme, principalmente na fase de

maturação, regulando a densidade populacional (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012), a

produção de EPS, a motilidade e a produção de metabólitos secundários (GU e REN, 2014).

Várias espécies bacterianas também podem crescer sobre superfícies em meio semi-sólido,

utilizando o mecanismo de motilidade celular (LINDUM et al., 1998; (KEARNS, 2010).

Trata-se de uma forma de adaptação bacteriana às mudanças adversas nutricionais e físicas

garantindo vantagem de sobrevivência sob uma variedade de ambientes, possibilitando

migração para locais favoráveis a sua colonização (AN et al., 2006). Esse mecanismo é

considerado um importante fator de virulência (KIM et al., 2003; LAI, TREMBLAY e

DÉZIEL, 2009), sendo essencial para a patogenicidade bacteriana nas fases iniciais de adesão

aos tecidos do hospedeiro (MCCARTER, 2001).

Henrichsen (1972) descreveu os vários tipos de motilidade bacteriana, entre eles, as do tipo

swarming e swimming. A motilidade tipo swarming foi definida como sendo a translocação

em superfície pela ação de flagelos, apresentando padrão micromorfológico organizado em

giros e bandas, caracterizando-se como um rápido movimento bacteriano organizado,

contínuo e regular ao longo do eixo das células agregadas em feixes. Já a motilidade do tipo

swimming ocorre por meio da translocação de flagelos rotativos, porém com padrão

24

micromorfológico desorganizado onde as células se movem individualmente e de forma

aleatória em meio líquido (HENRICHSEN, 1972; KEARNS, 2010).

Muitas bactérias que apresentam motilidade secretam surfactantes, moléculas anfipáticas

que agem reduzindo a tensão superficial entre o substrato e a célula bacteriana para permitir o

espalhamento sobre a superfície (KEARNS, 2010). A produção de surfactante por algumas

bactéria é um mecanismo regulado pelo sistema quorum sensing (LINDUM et al., 1998;

EBERL et al, 1996). Além da produção de surfactante, o quorum sensing regula o sistema

flagelar, onde a expressão hierárquica de cerca de 50 genes (MACNAB, 2004; MCCARTER,

2006) e sua cascata de regulação é controlada por esse sistema, que regula a transdução de

genes envolvidos nesta característica (LINDUM et al.,1998; MCCARTER, 2006; YANG e

DEFOIRDT, 2014).

A Tabela 1 apresenta os fenótipos regulados pelo quorum sensing e as moléculas

sinalizadoras empregadas nesse processo.

Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum

sensing em bactérias.

Bactéria Sinalizador Fenótipo Referências

Aeromonas

hydrophila

N-butanoil-L-

homoserina

lactona

N-hexanoil-L-

homoserina

lactona

Protease extracelular,

formação de biofilme

Bosgelmez-

tinaz (2002)

Chromobacteri

um violaceum

N-hexanoil-L-

homoserina

lactona

Antibiótico,

exoenzimas, cianeto,

violaceína

Rumjanek,

Fonseca e

Xavier (2004),

2004;

Bosgelmez-

tinaz (2002)

E. coli AI-2, AI-3 Divisão celular

Gonzalez e

Keshava

(2006);

Bosgelmez-

tinaz (2002)

Erwinia

carotovora

N-3-

(oxohexanoil)-L-

homoserina

lactona

Antibiótico,

fatores de virulência:

proteases, celulases,

pectinases, síntese de

exopolissacarídeo,

Bosgelmez-

tinaz (2002)

25

carbapenem

Pseudomonas

fluorescens*

Ciclo(L-Phe-

L-Pro),

Ciclo(L-Tyr-

L-Pro)

DKPS

Antibiótico

fenazina

Gonzalez e

Keshava

(2006)

Pseudomonas

aeruginosa

C4-HLS;

3-oxo-C12-

HLS;

N-butanoil-L-

homoserina

lactona

N-3-

(oxododecanoil)-

L-homoserina

lactona

Fatores de

virulência,

exoenzimas, cianeto,

RpoS, lecitina,

piocianina,

ramnolipídeo, pili,

Xcp, formação de

Biofilme, RhIR,

Rumjanek,

Fonseca e

Xavier (2004)

Bosgelmez-

tinaz (2002)

Serratia

liquefaciens

N-butanoil-L-

homoserina

lactona

Antibiótico

carbapenem,

pigmento

(prodigiosina),

protease

Bosgelmez-

tinaz (2002)

Serratia

marcescens spp.

ATCC 39006

N-butanoil-L-

homoserina

lactona

N-hexanoil-L-

homoserina

lactona

Motilidade tipo

Swarming

Bosgelmez-

tinaz (2002)

Yersinia

N-hexanoyl-

L- homoserina

lactona

N-3-

(oxohexanoil)-L-

homoserina

lactona

3-oxo-C6-Acil

homoserina

lactona

Motilidade,

aglomeração

Bosgelmez-

tinaz (2002)

S.aureus AIP Virulência Rumjanek,

Fonseca e

26

Xavier (2004)

Bacillus

subtilis AIP

Competência para

aquisição de DNA,

esporulação

Rumjanek,

Fonseca e

Xavier (2004)

* Algumas estirpes de P. fluorescens não produzem AI-1 (Pinto et al., 2010; Martins et al., 2014).

2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos

O sistema quorum sensing regula comportamentos bacterianos em ecossistemas

alimentares e sua compreensão é importante podendo ser usada para criar novas alternativas

para preservação de alimentos (PINTO et al., 2007). Esse sistema regula várias enzimas com

atividade na deterioração de alimentos (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012; BAI e RAI, 2012).

Compostos de sinalização quorum sensing foram identificados em alimentos deteriorados

como leites, carnes, frutas e legumes (BAI e RAI, 2012) e em carnes armazenadas a vácuo e

aerobiamente (BLANA e NYCHAS, 2013). Também foram identificadas diferentes

moléculas sinalizadoras de quorum sensing, como as AHLs produzidas por estirpes

proteolíticas psicrotróficas isoladas de leite cru (PINTO et al., 2007). A Tabela 2 apresenta

bactérias deterioradoras de alimentos, os principais alimentos acometidos por elas, os

fenótipos de deterioração regulados pelo quorum sensing e os sinalizadores envolvidos.

Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos.

Bactéria Produto Fenótipo Molécula de

Sinalização Referências

Pseudomonas

fluorescens 395 Leite

Deterioração

proteolítica do leite

C4-HSL and

3OC8-HSL

Liu et al.,

(2007)

S. marcescens

proteamaculans

strain B5a

Leite

Deterioração

proteolítica e

lipolítica do leite

3-oxo-C6-

HSL

Christensen et

al., (2003)

Pseudomonas

fluorescens Leite

Deterioração

proteolítica do leite

L-HSL α-

amino-γ -

butyrolactones

Dunstall et

al., (2005)

Pseudomonas

phosphoreum e

Aeromonas

spp.

Filetes

de bacalhau

Atividade

quitinolítica

3-hydroxy-

C8-HSL

Flodgaard et

al., (2005)

Erwinia

carotovora Vegetais

Deterioração

celulolítica e

proteolítica

3-oxo-C6-

HSL

Jones et al.,

(1993)

Pectobacterium Brotos Deterioração 3-oxo-C6- Rasch et al.,

27

ssp. A2JM de feijão pectinolítica

eproteolítica

HSL (2005)

S. marcescens

plymuthica RVH1 Vegetais

Atividade

quitinase e protease

3-oxo-C6-

HSL e C6-HSL

Van Houdt et

al., (2007)

Hafnia alvei

Serratia

marcecens spp.

Embalag

ens a vácuo

Deterioração

proteolítica

3-

oxohexanoyl

HSL

Bruhn et al.,

(2004)

Pseudomonas

spp. Carne

Formação de

biofilme em carnes AHLs

Jay et al.,

(2003)

Photobacteriu

m phosphoreum e

Aeromonas

spp.

Filetes

de bacalhau

Deterioração

quitinolítica

3-hydroxy-

C8-HSL

Flodgaard et

al., (2005)

Fonte: Bai e Rai (2012), modificado.

2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing

A estratégia de controle de micro-organismos por meio da interferência no sistema quorum

sensing é ampla (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004) onde a capacidade de perturbar

o sistema quorum sensing pode conferir a uma determinada espécie bacteriana, vantagens

sobre outra (BASSLER, 2005). A interrupção de qualquer um dos passos da comunicação

quorum sensing pode ter consequências prejudiciais na sobrevivência e patogenia microbiana

(PAN e REN, 2009). Os mecanismos de inibição podem ser vários, como a inibição da

síntese, transporte ou secreção de AHL e da proteína receptora de AHL (LuxR) (KALIA,

2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013).

Os inibidores quorum sensing podem bloquear a expressão de virulência sem afetar o

crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e

RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013) diminuindo o risco de

desenvolvimento de resistência bacteriana (KALIA, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e

COPPOLA, 2013). Podem atuar causando enfraquecimento dos biofilmes para a exposição a

antibióticos e o sistema imunológico (GIVSKOV, 2012). Sua administração juntamente com

medicamentos pode impedir a formação de biofilmes resistentes sobre dispositivos médicos,

aumentando a sensibilidade desses a tratamentos antimicrobianos melhorando a atividade dos

antibióticos. Tem sido mostrado também que biofilmes tratados com inibidores quorum

sensing ficam mais susceptíveis a ação do sistema imune (BJARNSHOLT et al., 2005).

28

Para ser eficaz, um inibidor quorum sensing deve ser uma molécula pequena, com

capacidade de redução na expressão de genes regulados por quorum sensing, além de não

apresentar nenhum efeito adverso sobre as bactérias ou o hospedeiro e ser quimicamente

estável e resistente à degradação pelos sistemas metabólicos dos hospedeiros (PAN e REN,

2009).

2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing

A atividade anti-quorum sensing de produtos naturais é mais presente do que se imagina e

sua inibição pode ser tão importante quanto ao efeito antibacteriano, podendo contribuir ao

uso tradicional de medicamentos (ADONIZIO, KONG, MATHEE, 2009; SULTANBAWA,

2011). As substâncias inibidoras são ferramentas promissoras para a redução de doenças, pois

a disposição de antibióticos eficazes pode não ser garantida (DEFOIRDT, BRACKMAN e

COENYE, 2013). Além da atividade sobre a saúde humana, o uso de inibidores quorum

sensing presentes em compostos naturais pode melhorar a segurança de alimentos

proporcionando regulação negativa da atividade de deterioração, alterando a atividade e

sobrevivência microbiana (NAZARRO et al., 2013). A combinação desses inibidores e outros

agentes antimicrobianos pode gerar efeitos sinérgicos sobre a redução bacteriana (GIVSKOV,

2012), sendo uma estratégia eficaz para controle de infecções causadas por bactérias

patogênicas em plantas, animais e seres humanos.

Compostos presentes em produtos naturais apresentaram inibição do sistema quorum

sensing por possuírem compostos com semelhança estrutural a moléculas sinalizadoras, pela

capacidade de interferir com a atividade de AHL, modulando sua síntese, e pela interferência

com a produção de AI-2 (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e HWANG,

2006; VATTEM et al., 2007; YEO e THAM, 2012; GANIN et al., 2012; TRUCHADO et al.,

2012; BLANA E NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA E PONCE, 2013; TAN E YIN,

2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Alguns estudos também mostraram

que polifenóis são capazes de estimular a expressão da enzima AHL lactonase e interferirem

na sinalização mediada por AHL, bloqueando a comunicação celular e inibindo os

sinalizadores AI-1 e AI-2 e a formação de biofilme (NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA,

2013; KALIA, 2012). A Tabela 3 apresenta alguns compostos naturais com atividade anti-

quorum sensing.

29

Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing.

Fonte Natural Antagonista Bactérias Inibidas

Extrato de plantas

Melicope lunu-ankenda

(folhas)

Syzygium aromaticum (broto)

E. coli [pSB401]

E. coli [pSB1075]

C. violaceum CV026

P. aeruginosa PA01

P. aeruginosa lecA::lux

Alho (bulbos) P. aeruginosa

Vanilla planifolia (feijões) C. violaceum CV026

Tremella fuciformis (inteira) C. violaceum CV026

Panax notoginseng (flores e

raízes)

Areca catechu (sementes)

Prunus armeniaca (kernel de

sementes)

Prunella vulgaris (inteira)

Nelumbo nucifera (folhas)

Punica granatum (casca)

Imperata cylindrical (haste)

P. ginseng (raízes)

C. violaceum CV026

P. aeruginosa PA01

Moringa oleifera (folhas e

frutos)

Capparis spinosa (fruits)

C. violaceum ATCC

12472

C. violaceum CV026

P. aeruginosa

E. coli

Proteus mirabilis

S. marcescens

Laurus nobilis (frutos, flores,

folhas, cascas)

C. violaceum ATCC

12427

Acacia nilotica (vagens

verdes)

C. violaceum ATCC

12472

Quercus virginiana (folhas)

Chamaesyce hypericifolia

(aereas)

Tetrazygia bicolor (folhas)

Conocarpus erectus (folhas)

Bucida burceras (folhas)

Callistemon viminalis (folhas,

inflorescencia)

C. violaceum ATCC

12472

C. violaceum CV026

Agrobacterium

tumefaciens

NTL4

Vaccinium macrocarpon

V. angustifolium

Rubus idaeus

C. violaceum CV026

C. violaceum 31532

P. aeruginosa PA01

30

R. eubatus

Fragaria sp.

Vitis sp.

Origanum vulgare

Rosemarinus officinalis

Ocimum basilicum

Thymus sp.

Brassica oleracea

Curcuma longa

Zingiber officinale

E. coli O157:H7

Lonicera alpigena

Castanea sativa

Juglans regia

Ballota nigra

R.officinalis

Leopoldia comosa

Malva sylvestris

Cyclamen hederifolium

Rosa canina

R. ulmifolius

S. aureus

Ananas comosus

Musa paradiciaca

Manilkara zapota

Ocimum sanctum

C. violaceum ATCC

12472

C. violaceum CV026

P. aeruginosa PA01

Scutellaria baicalensis C. violaceum CV026

Scorzonera sandrasica

C. violaceum ATCC

12472

C. violaceum CV026

Laranja Yersinia enterocolitica

Óleos essenciais

Árvore do chá

Alecrim

C. violaceum CV026

Lippia alba

Ocotea sp.

Elettaria cardamomum

Swinglea glutinosa

Myntotachys mollis

Zingiber officinale

P. putida [pRK-C12)

E. coli [pJBA132]

Piper bredemeyeri (folhas)

P. brachypodom (folhas)

P. bogotence (inteiro)

C. violaceum CV026

Metabólitos

Bioativos

Phellinus igniarius C. violaceum CV026

Exudatos de pea (Pisum

sativum)

S. marcecens

liquefaciens MG44

S. faciens MG44

Sulforafano

Erucin P. aeruginosa

Malabaricone C

Catechin

P. aeruginosa PA01

C. violaceum CV026

31

Fonte: KOH et al., 2013.

2.3 - Compostos fenólicos

2.3.1 - Definição, formação e função

Compostos fenólicos são fitoquímicos presentes em vegetais que apresentam atividade

biológica (TIVERON et al., 2012). São metabólitos secundários encontrados em plantas, úteis

na ação defensiva contra patógenos, radiação e envolvidos na função antioxidante (COWAN,

1999; MANACH et al., 2004; TIVERON et al., 2012), estando presentes em folhas, tecidos

floridos, caules e casca de plantas (KAHKONEN et al., 1999). Os compostos fenólicos foram

identificados em plantas superiores e comestíveis e podem estar envolvidos na resposta das

plantas ao estresse contribuindo para a cura por lignificação de áreas danificadas. Possuem

propriedades antimicrobianas e suas concentrações podem aumentar após a infecção da planta

(KAHKONEN et al., 1999; COWAN, 1999). Uma molécula fenólica pode ser característica

de uma planta ou mesmo de uma espécie, órgão ou tecido da planta a qual pertence

(SCALBERT e WILLIAMSON, 2000).

Os compostos fenólicos são agentes redutores que atuam para proteger os tecidos do corpo

contra estresse oxidativo. Têm sua atividade atribuída às propriedades redox, doadores de

hidrogênio e supressores de oxigênio, além de apresentarem potencial de quelação de metais

(KAHKONEN et al., 1999; SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Além da atividade

antioxidante e antimicrobiana, os compostos fenólicos podem apresentar atividade

anticarcinogênica e antiproliferativa (KAHKONEN et al., 1999), contudo apresentam ações

biológicas específicas que ainda não foram bem compreendidas (MANACH et al., 2004). Os

mecanismos responsáveis pela inibição microbiana dos compostos fenólicos incluem a

inibição da atividade enzimática, na alteração da solubilidade lipídica da membrana celular ou

por meio de interações com proteínas não específicas de micro-organismos (KAHKONEN et

al., 1999; MANACH et al., 2004).

As principais fontes de compostos fenólicos são frutas, chás e vinho tinto. As frutas

contêm uma grande variedade de flavonóides e ácidos fenólicos que apresentam atividade

antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Em vários produtos vegetais, a composição de

fenólicos é pouco conhecida ou limitada a algumas variedades ou não está localizada as partes

comestíveis desses vegetais. Alguns alimentos, principalmente frutas exóticas e alguns

32

cereais, ainda não foram analisados quanto ao perfil e teor de compostos fenólicos (COWAN,

1999).

Fatores como sazonalidade, disponibilidade de água, radiação UV, nutrientes do solo,

poluição, ataque de patógenos, maturação no momento da colheita, processamento industrial,

armazenamento e exposição à luz podem alterar a concentração de polifenóis em plantas

(TIVERON, 2012). Métodos de preparação culinária também podem afetar os teores de

compostos fenólicos dos alimentos que podem ser eliminados com a retirada da casca dos

frutos e vegetais, pois estas substâncias estão em concentrações mais elevadas nas partes

exteriores dos frutos do que na parte interna (MANACH et al., 2004).

Os compostos fenólicos podem ser classificados em diferentes grupos, em função do

número de anéis de fenol e do tipo de elementos que ligam esses anéis uns aos outros. Podem

também estar associados a hidratos de carbono e ácidos orgânicos (KAHKONEN et al.,

1999). Sua estrutura química afeta propriedades como disponibilidade, atividade antioxidante,

interações específicas com receptores celulares, enzimas e outras (SCALBERT e

WILLIAMSON, 2000). As principais classes de compostos fenólicos são: ácidos fenólicos,

flavonóides, estilbenos e lignanas (MANACH et al., 2004; SCALBERT e WILLIAMSON,

2000).

Os ácidos fenólicos são divididos em dois grupos derivados do ácido benzóico e do ácido

cinâmico. A concentração de ácido hidroxibenzóico em plantas comestíveis é baixa e este

pode ser encontrado em frutos vermelhos, rabanete preto e cebola (MANACH et al., 2004).

Ácidos hidroxicinâmicos são mais comuns que ácidos hidroxibenzóicos e consistem

principalmente de ácido p-cumárico, caféico, ferúlico e sinápico. O ácido caféico se combina

para formar o ácido clorogênico, encontrado em muitos tipos de frutas e em concentrações

elevadas no café. As frutas com o maior teor de ácido clorogênico são amoras, kiwis,

ameixas, cerejas e maçãs. O ácido caféico é o ácido fenólico mais abundante nas frutas

representando 75% a 100% do ácido hidroxicinâmico (MANACH et al., 2004, KAHKONEN

et al., 1999; COWAN, 1999). Ácidos hidroxicinâmicos são encontrados em todas as partes do

fruto, porém as concentrações mais elevadas estão na parte exterior do fruto. Suas quantidades

diminuem com o amadurecimento e aumentam com o tamanho do fruto (MANACH et al.,

2004).

33

Os flavonóides são compostos fenólicos hidroxilados nas unidades C6- C3 ligado a um

anel aromático. São os compostos fenólicos com maior frequência em alimentos e são

representados pelos grupos das flavonas, flavononas, catequinas e antocianinas (VOLP et al.,

2008). Suas fontes mais ricas são cebola, couve encaracolada, alho poró, brócolis e mirtilos e

também se encontram presentes em vinhos tintos e chás. As concentrações de flavonóides são

maiores na parte externa das plantas e frutos que mais recebem luz solar (COWAN, 1999). Os

componentes principais do grupo das flavonas são apigenina, chrisina, kaempferol, luteolina,

miricetina, rutina, sibelina e a quercetina e suas fontes alimentares são cascas de maçãs,

cerejas, brócolis, peles de frutas, frutas como cranberries, uvas, alfaces, oliva e alho. As

flavonas têm como componentes fisetina, hesperetina, narigina, naringenina e taxifolina e

suas fontes principais são frutas cítricas e peles de frutas cítricas. Os componentes das

catequinas são catequinas, epicatequina e epigalocatequinagalato e a fonte alimentar são os

vinhos e chás. As antocianinas, pertencentes ao grupo dos flavonóides, são o grupo de

pigmentos naturais tendo como principais componentes a cianidina, delfinidina, malvidina,

pelargonidina, peonidina e petunidina e suas fontes alimentares são cerejas, uvas, franboesas,

morangos, chá e peles de frutas com pigmentos escuros.

Lignanas são formadas por duas unidades de fenilpropanos, sendo a linhaça sua fonte mais

rica. São metabolizados em enterodiol e enterolactona pela microbiota intestinal. A classe dos

estilbenos, encontrados em baixas concentrações em dietas humanas, é representada pelo

resveratrol presentes em vinhos, apresentando um efeito anticancerígeno (MANACH et al.,

2004).

2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis)

Grumixama (Eugenia brasiliensis) é uma fruta da família das Mirtáceas, ainda pouco

conhecida. No Brasil, a grumixameira ocorre nas regiões da mata litorânea do sul da Bahia até

Santa Catarina. Floresce no final do mês de setembro até novembro, com amadurecimento dos

frutos em novembro e dezembro (THITILERTDECHA, TEERAWUTGULRAG e

RAKARIYATHAM, 2008).

Foram identificadas três variedades de grumixameira, de acordo com as cores de seus

frutos: roxa, mais comum; vermelhas e brancas ou amarelas (MORENO et al., 2007). Seus

frutos são saborosos, com bom potencial para consumo in natura quanto para a

industrialização (KOHAMA et al., 2006). A grumixama é também conhecida como cereja

34

brasileira e pode apresentar atividade antidiarréica, antipirético, antirreumática e seus óleos

essenciais revelaram potencial antibacteriano (MAGINA, 2007) e anti-inflamatório

(DONATO e MORRETES, 2007). As Figuras 2 e 3 apresentam grumixamas e sua árvore

frutífera.

Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D)

Grumixama amarela. E) Sementes de grumixama. Fonte: próprio autor.

Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira

amarela florida. Fonte: próprio autor.

As variedades de cores de frutas têm uma distinta regulação bioquímica. A via fenólica

parece ser diferente nas duas variedades, onde na variedade roxa está presente uma via

bioquímica que leva ao acúmulo de antocianidinas, notado pela cor roxo escuro do fruto, e no

fruto amarelo, esses metabolitos não estão aparentemente presentes (MORENO et al., 2007).

Um estudo feito por Reynertson em 2007 analisou os componentes fitoquímicos e

bioativos de 14 frutas da família das Mirtáceas. Foram quantificados os compostos fenólicos

35

totais (24,80 ± 1,06 mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco) na grumixama, assim

como compostos antociânicos totais (8,37 ± 0,23 mg equivalentes de cianidina 3-glicosídeo/g

de peso seco). Também foram identificados seus compostos fenólicos mais importante sendo

eles as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (10,24 ± 0,42 mg/g da matéria seca) e delfinidina

3-glicosídeo (2,58 ± 0,13 mg/g da matéria seca), além de pequenas concentrações de ácido

elágico, miricetina, quercetina e rutina. Em outro estudo Abe, Lajolo e Genovese (2011)

identificaram frutos da família das Myrtaceas contendo ácido elágico, onde os maiores teores

foram encontrados em grumixama, jabuticaba e cambuci. Na fruta de grumixama foram

identificados derivados de quercetina na quantidade de 0,20g kg-1

da amostra, elevado teor de

antocianinas 1,69 g kg -1

da amostra e flavonóides 1,91g kg -1

da amostra.

Poucos estudos sobre os efeitos biológicos e antimicrobianos da polpa de grumixama

foram reportados na literatura até o momento. Alguns estudos, porém, com plantas ricas em

antocianinas comumente encontradas na grumixama, identificaram capacidade antimicrobiana

dos extratos antociânicos contra Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus e Candida

albicans.

2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.)

A pitanga (Eugenia uniflora L.), também pertencente à família das Mirtáceas, é nativa da

Mata Atlântica. Pode ser usada na alimentação in natura, para fazer sucos e doces, e também

na medicina popular, pelo uso de chás de suas folhas. As pitangueiras frutificam de outubro a

janeiro, e podem ser encontradas variações em sua coloração, desde o laranja, vermelhas e

roxas (PIO et al., 2005). As Figuras 4 e 5 apresentam pitangas em seus estágios de maturação

e sua árvore frutífera, pitangueira.

Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga.

Fonte: Lira Junior et al. (2007).

36

Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos.

Fonte: Lira Junior et al. (2007).

A pitanga é uma fonte rica em compostos fenólicos, tendo a fruta roxa maior capacidade

antioxidante quando comparada às frutas de outras cores, principalmente devido à maior

presença de antocianinas (BAGETTI et al., 2011). Os compostos fenólicos presentes na

pitanga foram identificados por Karwowski (2012), sendo eles o ácido gálico, ácido

clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico e ácido p-cumárico, além de flavonóides totais

como rutina, miricetina e quercetina.

Vendruscolo (2005) identificou espécies de plantas utilizadas na medicina tradicional

popular, entre elas E. uniflora L. (Myrtaceae). Foi verificado que as folhas são ricas em

taninos, glicosídeos de flavonóides e óleo volátil. Entre várias funções foi descrito atividade

antimicrobiana do óleo volátil.

Estudos sobre potencial antimicrobiano da pitanga, encontrados na literatura, avaliaram os

extratos de frutos e partes não comestíveis, como folhas e hastes. Holetz et al. (2002) testaram

treze extratos hidroalcoólicos de plantas, incluindo o extrato de folhas de pitanga,

encontrando atividade antimicrobiana moderada contra S. aureus e E. coli no extrato de

pitanga. Outro estudo verificou atividade inibitória dos frutos de E. uniflora L. sobre E. coli,

Streptococcus pyogenes, Providencia spp, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus spp. coagulase - (GONÇALVES, ALVES FILHO, MENEZES,

2005). Também foram encontrados efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de E. uniflora

L. contra S. aureus, Salmonella Choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans,

37

sugerindo que os componentes do extrato responsáveis pela atividade antimicrobiana

poderiam ter sido os compostos fenólico, particularmente os taninos (AURICCHIO et al.,

2007).

Os estudos apresentados acima fornecem um indicativo do potencial antimicrobiano dos

frutos e folhas da pitanga (Eugenia uniflora L.). Reconhecer a atividade anti-quorum sensing

desses frutos poderia trazer uma alternativa para seu uso como agente antimicrobiano natural.

3 – OBJETIVOS

3.1 - Objetivos

Detectar a atividade de inibição do quorum sensing bacteriano pelos extratos bruto e

fenólico das frutas tropicais brasileiras grumixama e pitanga.

4 – MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 - Material vegetal

As frutas grumixama e pitanga foram colhidas na região de Ouro Preto – MG na época de

suas respectivas frutificações. Grumixama e pitanga foram colhidas entre setembro a

novembro de 2013 e outubro de 2013 a janeiro de 2014, respectivamente. As espécies foram

coletadas, herborizadas e depositadas no Herbário Professor José Badini, da Universidade

Federal de Ouro Preto, com a seguinte identificação: (OUPR). Eugenia brasiliensis Lam.,

M.C.T.B.Messias & F.G. Zola, 2481 e Eugenia uniflora L.M.C.T.B.Messias & F.G. Zola,

2482.

4.1.2. Preparo do material vegetal

As frutas foram colhidas e armazenadas a -20°C até atingirem a quantidade suficiente para

extração da polpa. As frutas foram posteriormente lavadas em água corrente, folhas e talos

foram removidos e foram sanitizadas com solução de hipoclorito de sódio a 50mg/L por 15

minutos. Após sanitização, as sementes foram removidas manualmente e a polpa separada e

homogeneizada em multiprocessador doméstico e congelada a -20°C.

38

4.2 - Extração e purificação de compostos fenólicos

Os compostos fenólicos foram extraídos com solvente e purificados utilizando extração em

fase sólida (SPE), conforme Bertoldi (2009) com adaptações. As polpas das frutas foram

descongeladas e misturadas com solução de etanol: metanol: acetona 1:1:1 (v/v/v), seguida de

filtração em papel Whatman n° 1. Posteriormente, os solventes foram evaporados em rota-

vapor a 40°C (Büchi, Switzerland) e o extrato aquoso, chamado de extrato bruto foi eluído em

minicoluna C18 Sep-Pak Vac 35cc 10g 20 cm3 (Waters Corporation, Milford, MA) para

purificação dos compostos fenólicos. Os compostos fenólicos adsorvidos no cartucho foram

eluídos com metanol (fração adsorvida) e a fração aquosa não adsorvida foi descartada. O

metanol foi completamente evaporado em rota-vapor a 40° C e água destilada foi adicionada

até volume conhecido para obter o extrato fenólico.

4.3 - Compostos fenólicos totais

O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo ensaio do reagente Folin-

Ciocalteu (SHAHIDI e NACZK, 1996). Uma alíquota de 0,6 ml do extrato fenólico foi

diluída em 3,0 ml de reagente Folin-Ciocalteu diluído em água destilada (1:10; v/v). Depois

de 3 minutos de repouso na ausência de luz, foram adicionados 2,4 ml de solução saturada de

Na2CO3 (7,5 %; m/v). A absorbância foi determinada a 760 nm por espectrofotometria de

absorção (UV-1601 PC Shimadzu, Tokyo, Japão), após 2 horas de repouso em ausência de

luz. O índice de compostos fenólicos totais (IPT) foi determinado utilizando-se a curva padrão

de ácido gálico (0-200 mg/L) e os resultados foram expressos em mg de ácido gálico

equivalente por litro de extrato (AGE/L).

4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas

As estirpes bacterianas utilizadas neste trabalho foram C. violaceum ATCC 6357, A.

hydrophila IOC/FDA 110-36, S. marcescens (parte da coleção de culturas do Laboratório de

Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Ouro Preto) e E. coli ATCC 10536. C.

violaceum ATCC 6357 foi cultivada a uma temperatura de 28 a 30 °C, A hydrophila

IOC/FDA 110-36 e E. coli ATCC 10536 a 37 °C e S. marcescens a 30 °C. As estirpes foram

cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) contendo peptona 1 %, extrato de levedura 0,5 %,

NaCl 0,5 %, ao invés de 1.0 % (RAVN et al., 2001).

39

4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e

fenólicos

4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum

O teste foi realizado conforme Tan, Yin e Chan (2012), com modificações. As culturas de

C. violaceum foram crescidas em caldo LB por, aproximadamente, 18 horas (overnight) a 30

°C e uma alíquota de 1 ml dessa cultura foi misturada a 20 ml de ágar LB fundido em placa de

Petri estéril. O ágar foi deixado em repouso por 30 minutos e, posteriormente, poços

equidistantes de 5 mm de diâmetro foram feitos em cada placa, com o auxílio de ponteiras

estériladas. A cada poço, foram adicionados 20 µl dos extratos bruto e fenólico de grumixama

e pitanga em diferentes concentrações. O teste foi realizado com cinco concentrações dos

extratos das duas frutas. As placas foram incubadas a 30 °C por 24 horas. Água destilada

esterilizalada e o antibiótico Canamicina (100 µg/ml - Sigma Aldrich) foram utilizada como

controles. A atividade de inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum foi verificada

pela formação de um halo turvo, indicativo de crescimento bacteriano, porém sem

pigmentação, em fundo roxo, ao redor do poço contendo extrato.

4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC)

O teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi realizado pelo

método de diluição em ágar, segundo a metodologia sugerida por Wiegand, Hilpert e Hancock

(2008) com modificações. O teste MIC é usado para determinar a susceptibilidade das

bactérias a uma droga alvo ou avaliar a atividade de novos agentes antimicrobianos. O teste

em ágar determina a concentração mais baixa do agente antimicrobiano, definida nas

condições de teste, que causa inibição visível do crescimento bacteriano. Uma população de

104 UFC de cada micro-organismo foi inoculada em forma de microgotas de 5 microlitros

(spot) em ágar Mueller-Hinton, adicionado de diferentes concentrações dos extratos bruto ou

fenólico de cada fruta. As placas foram incubadas por 24 horas a temperatura ótima de

crescimento de cada micro-organismo e a MIC foi determinada como sendo a concentração

mínima em que não foi observado crescimento microbiano.

A atividade anti-quorum sensing é evidenciada por uma inibição da comunicação, não

havendo morte bacteriana. Dessa forma, testes feitos com os extratos de grumixama e pitanga

40

utilizam valores sub-MIC determinados previamente, garantindo que os resultados não

fossem devidos a morte microbiana.

4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum

O teste foi feito segundo Tan, Yin e Chan (2012) com modificações. C. violaceum foi

cultivada por 18 h a 30 °C e inoculada a uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm

(aproximadamente 108 UFC/ml) em tubos de ensaio contendo caldo LB e caldo LB

suplementado com extratos de ambas as frutas nas concentrações testadas. Os tubos foram

incubados por 24 horas a 28 °C em incubadora de agitação a 150 rotações por minuto (rpm).

A quantificação de violaceína foi obtida utilizando 1 ml de cultura de cada tubo, centrifugada

a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar a violaceína insolúvel. Em seguida, o

sobrenadante da cultura foi descartado e o pellet solubilizado em 1 ml de Dimetilsulfóxido

(DMSO), que foi agitado vigorosamente em um agitador de tubos e centrifugado novamente a

13.000 rpm durante 10 minutos para remover as células. A absorbância foi medida em

espectrofotômetro de luz vizível a 585 nm. O controle negativo foi feito com caldo LB sem

adição dos extratos e o controle positivo para inibição do sistema quorum sensing foi feito

com a adição de furanona ((Z-)-4-Bromo-5(bromomethylene-2(5h)-furanone) adquiridos da

Sigma Aldrich a uma concentração de 39,4 µM. Após o período de incubação de 24 horas,

foram realizados plaqueamentos e contagem de C. violaceum (UFC ml-1

) em culturas

contendo cada concentração dos extratos testados para comprovar que tais concentrações não

influenciaram o crescimento microbiano.

Os testes foram realizados em triplicata, e o controle negativo sem adição do extrato, foi

considerado como 100% para produção de violaceína. O percentual de inibição da produção

de violaceína foi calculado usando a seguinte fórmula:

% de inibição de violaceína = (Densidade Ótica do Controle 585 nm – Densidade Ótica do

teste 585 nm/ Densidade Ótica do Controle 585 nm)×100

4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A.

hydrophila e S. marcescens

Para o teste de avaliação da motilidade, ágar LB foi preparado contendo 0,3% de ágar-ágar

para testar o movimento tipo swimming e 0,4% para testar a motilidade tipo swarming

41

(HUBER et al., 2003). Alíquotas de extrato foram adicionadas ao ágar e vertidas em placas de

Petri esteriladas. As placas foram deixadas em repouso por 30 minutos e alíquotas de 2 µL de

cada micro-organismo, crescido overnight, foram inoculadas em forma de ponto (spot), no

centro do ágar. As placas foram incubadas a temperatura ótima para cada micro-organismo

por 24 horas. Os resultados de efeito dos extratos bruto e fenólico na motilidade tipo

swimming e swarming foram observados por meio da comparação visual com controle. O

controle negativo foi realizado com ágar, sem adição dos extratos.

4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S.

marcescens, A. hydrophila e E. coli

Para a avaliação do efeito dos extratos fenólicos sobre a formação de biofilmes, alíquotas

de 20 μL (2% da cultura ajustada para DO 0,1 a 600nm) da suspensão de células em estudo,

contendo cerca de 107 UFC/ml

-1, foram inoculadas em 180 μL de meio LB em microplacas de

poliestireno de 96 poços. Concentrações previamente determinadas dos extratos bruto e

fenólico de ambas as frutas foram adicionados aos poços. A incubação foi feita a temperatura

ótima de crescimento de cada micro-organismo por 72 horas. Após esse período, o meio de

cultura foi removido, invertendo-se a microplaca sobre papel absorvente. As células aderidas

às microplacas foram coradas por 30 minutos com 200 μL de cristal violeta a 0,1 % (p/v) em

água. Em seguida, o corante foi descartado e os poços das microplacas foram lavados, por três

vezes consecutivas, com 200 μL de água destilada. As placas foram secas em estufa a 40ºC,

por 15 minutos. O cristal violeta retido pelas células aderidas foi dissolvido em 200 μL de

etanol (95 %) e a absorbância medida a 630 nm em leitor de microplacas (CONWAY, 2012).

Os testes foram feitos em triplicata.

4.6 - Análises estatísticas

As análises foram feitos em triplicata, obtendo-se a média e desvio padrão. A significância

dos dados foi avaliada pelo teste ANOVA, empregando-se o teste de Tukey, utilizado o

software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (San Diego, Califórnia, USA). As

diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05.

42

5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 - Compostos fenólicos totais

A quantidade de compostos fenólicos do extrato bruto se grumixama foi de 2520,5 mg

AGE/L e do extrato fenólico foi obtidos de 2998,5 mg AGE/L. Em relação à pitanga, o

conteúdo de compostos fenólicos totais do extrato bruto foi de 1472,3 mg AGE/L, enquanto

que do extrato fenólico foi de 2315,2 mg AGE/L.

Guedes (2012), Mercadante (2012), Infante (2013) e Abe, Lajolo e Genovese (2012)

encontraram valores de compostos fenólicos totais da grumixama variando entre 10,40 a

26,69 mg AGE/g da matéria seca. Os trabalhos citados acima mostram a composição de

compostos fenólicos expressos em mg AGE/g da matéria seca, já os resultados desse trabalho

são expressos em mg AGE/L, dessa forma não sendo possível comparar os os resultados, mas

de observar sua identificação na grumixama. Silva et al. (2014) identificaram na polpa de

grumixama uma maior quantidade das antocianinas delfinidina 3-glicosídeo e cianidina 3-

glicosídeo. Também foram identificadas cianidina 3-galactosídeo e cianidina 3-acetil-

hexosídeo, quercetina glicuronídeo, quercetina galoil-hexosídeo, quercetina desoxi-hexosídeo,

quercetina hexosídeo, quercetina pentosídeo, eriodictiol hexosídeo, quercetina desoxihexosil-

hexosídeo, quercetina, ácido sinápico dihexosídeo hidroxi benzoil, ácido gálico dihexosídeo

sinapoil e ácido sinápico dihexosídeo benzoil.

Infarte (2013) caracterizou os principais compostos fenólicos encontrados nos extratos

vegetais de grumixama, sendo eles as catequina, epicatequina e ácido gálico e Guedes (2012)

identificou flavonoides e antocianinas. Reynertson (2007) identificou as antocianinas

cianidina 3-glicosídeo e delfinidina 3-glicosídeo, além de ácido elágico, miricetina, quercetina

e rutina presentes na grumixama.

Na pitanga, a concentração de compostos fenólicos totais foi quantificada por Bagetti et al.

(2011), Jacques et al., (2009); Abe, Lajolo e Genovese (2012) que obtiveram resultados

variando entre 95,0 e 201,8 mg AGE/100 g de polpa fresca. Os resultados obtidos no presente

estudo quando expressos em mg AGE/100 g de polpa fresca de pitanga foram 126,1 mg AGE

no extrato bruto e 104,6 mg AGE/100g de fruta no extrato fenólico e estes valores se

encontram próximos aos encontrados por esses autores. O composto fenólico predominante

determinado por Prado (2009) foi acido gálico, enquanto Karwowski (2012) identificou ácido

43

gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina, miricetina e

quercetina na pitanga. A quantificação e determinação dos compostos fenólicos é importante

na classificação da fruta quanto ao teor desses e na elucidação de quais os compostos que

poderiam estar desempenhando as atividades.

5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum

As Figuras 6, 7, 8 e 9 apresentam os resultados de inibição qualitativa do quorum sensing

em C. violaceum pelos extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga, em diferentes

concentrações. Ambos os extratos de grumixama e pitanga apresentaram atividade anti-

quorum-sensing contra C. violaceum. Esta atividade pode ser observada pela formação de

uma zona clara e turva, em fundo roxo ao redor do poço, resultante da inibição da produção

de violaceína. O teste qualitativo demostrou o potencial de ambos os extratos em interferirem

com a comunicação quorum sensing nesta bactéria.

Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato

bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por



AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama.


fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por


44


AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama.


bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por



AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga.


fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por

pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle


AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga.

Segundo Adonizio et al. (2009) a inibição do sistema quorum sensing pode ser evidenciada

pela perda do pigmento roxo, sem alteração no crescimento em C. violaceum. Como pode ser

observado nas Figuras 6-9, o antibiótico inibiu o crescimento microbiano, visualizada pela

formação de um halo transparente ao redor do poço contendo o mesmo. No caso dos extratos,

houve uma leve inibição do crescimento em algumas concentrações, porém halos

visivelmente turvos, com expressiva redução do pigmento violaceína são vistos na maioria

dos pocinhos, indicando inibição do sistema quorum sensing, especialmente para o extrato

fenólico de pitanga.

45

5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC)

As concentrações inibitórias mínimas em C. violaceum ATCC 6357, A. hydrophila

IOC/FDA 110-36, E. coli ATCC 10536 e S. marcescens estão apresentadas nas Tabelas 4 e 5,

em valores de diluição do extrato e em concentração de compostos fenólicos totais expressos

em mg AGE/L, presentes nos extratos de grumixama e pitanga.

Os inibidores quorum sensing não causam a morte de micro-organismos, agem bloqueando

a expressão de fenótipos, sem afetar o crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e

THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA,

2013). Determinar a MIC dos extratos para as bactérias utilizadas nos testes garante que os

resultados obtidos para os ensaios anti-quorum sensing sejam devidos à inibição da

comunicação bacteriana e não causados pela morte microbiana.


totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama.

Extrato de

grumixama Bactérias

mg

AGE/L

Equivalência

ao extrato puro

*

Bruto

A. hydrophila

IOC/FDA110-36 420,08 1:6

C. violaceum ATCC6357 100,82 1:20

E. coli ATCC10536 100,82 1:20

S. marcescens >100,82 <1:20

Fenólico

A. hydrophila

IOC/FDA110-36 499,75 1:6


E. coli ATCC10536 749,63 1:4

S. marcescens >149.93 <1:20

*Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro.


totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga.

Extrato de

pitanga Bactérias

mg

AGE/L

Equivalência

ao extrato puro

*

Bruto

A. hydrophila

IOC/FDA110-36 98,15 1:15


46

E. coli ATCC10536 73,61 1:20

S. marcescens >73,61 <1:20

Fenólico

A. hydrophila

IOC/FDA110-36 115,76 1:20


E. coli ATCC10536 165,37 1:14

S. marcescens >115,76 <1:20 *Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro.

Os valores das MICs do extrato bruto de grumixama obtidos para as bactérias testadas

variaram de 100,82 mg AGE/L a 420, 08 mg AGE/L e para o extrato fenólico a variação foi

de 149,93 mg AGE/L a 499,75 mg AGE/L. As bactérias mais sensíveis ao extrato bruto de

grumixama foram C. violaceum ATCC6357 e E. coli ATCC10536, já para o extrato fenólico,

C. violaceum ATCC6357 foi a bactéria mais sensível (Tabela 4).

Os valores da MICs do extrato bruto de pitanga variaram de 73,61 mg AGE/L a 98,15 mg

AGE/L. As MICs do extrato fenólico variaram de 115,76 mg AGE/L a 165,37 mg AGE/L. E.

coli ATCC 10536 foi a bactéria que apresentou a menor MIC, valor de 73,61 mg AGE/L para

o extrato bruto de pitanga e C. violaceum ATCC 6357 e A. hydrophila IOC/FDA 110-36

foram as que apresentaram as menores MICs para extrato fenólico de pitanga (Tabela 5).

A comparação dos valores da MIC obtidos neste estudo permite constatar que as bactérias

testadas apresentaram maior sensibilidade aos extratos de pitanga e que a sensibilidade foi

semelhante entre o extrato bruto e o fenólico desta fruta.

Não existe uma forma padronizada para expressão dos resultados dos testes

antimicrobianos por produtos naturais. Dessa maneira, existem variações na determinação da

MIC que impedem uma devida comparação entre diferentes agentes antimicrobianos naturais.

Tais variações podem ser atribuídas a vários fatores, como a variação na técnica aplicada (em

caldo ou meio sólido), a origem e época da colheita da planta, se são utilizadas plantas frescas

ou secas, os tipos de solventes utilizados no preparo dos extratos, o próprio micro-organismo

avaliado, entre outros (OSTROSKY et al., 2008; FENNEL et al., 2004).

Os resultados constatados neste trabalho indicaram sensibilidade antimicrobiana aos

extratos brutos e fenólicos de grumixama e pitanga, indicando que mesmo em concentrações

aproximadamente 20 vezes diluídas, os extratos apresentaram atividade antimicrobiana e que

possivelmente estando na forma diluída terão pouca influencia no aspecto sensorial do

47

alimento. Entre as características para escolha de um agente antimicrobiano, deve ser

considerada sua compatibilidade química e sensorial com o alimento alvo e sua efetividade

contra micro-organismos indesejáveis (SETTANNI; CORSETTI, 2008). Alguns extratos

naturais, quando testados como agentes antimicrobianos, apresentaram resultados

satisfatórios, porém as características sensoriais dos alimentos não foram avaliadas

(ALMEIDA et al., 2014) ou quando analisadas, tornaram sua utilização inviável (SILVA,

2007).

Em trabalho realizado por Zola (2014), foram obtidos valores da MICs para extratos de

grumixama e pitanga efetivos contra algumas bactérias de importância na área de

microbiologia de alimentos. Os valores da MIC determinados para o extrato fenólico de

grumixama foram menores que 260 mg AGE/L contra S. aureus e B. cereus, 520 mg AGE/L

contra P. aeruginosa e 1,040 mg AGE/L contra E. coli e Listeria monocytogenes. Já o extrato

fenólico de pitanga apresentou valor da MIC menor que 490 mg AGE/L contra S. aureus, E.

coli, P. aeruginosa, L. monocytogenes e B. cereus (ZOLA, 2014). Os resultados da MIC de

grumixama e pitanga obtidos no presente trabalho foram menores que os encontrados por

Zola (2014). As bactérias testadas se mostraram mais sensíveis que as bactérias usadas por

esse autor, apresentando MIC consideravelmente menor.

A atividade antimicrobiana de extratos ricos em compostos fenólicos é bem conhecida

(ALVARENGA et al, 2007). Esses compostos atuam causando danos a membrana celular ou

ruptura da camada de peptideoglicano, causando a fuga de componentes citoplasmáticos

como proteínas ou glutamato de potássio e fosfato. Causam também inibição do transporte

ativo e o desacoplamento da fosforilação oxidativa. A presença do grupo hidroxila no

composto fenólico pode influenciar na sua atividade antimicrobiana por meio da ligação ao

local ativo de enzimas, formando ligações de hidrogênio e alterando o metabolismo celular

(SALAWU et al., 2011; LIU, 2003; HAIDARI et al., 2009).

5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357


grumixama

Os extratos bruto e fenólico de grumixama, em todas as concentrações testadas,

apresentaram reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína,

48

comparadas ao controle (p<0,05) (Figuras 10 a 13). As contagens de UFC ml-1

após 24 horas

de incubação na presença dos extratos, em suas diferentes concentrações, ou dos controles,

não apresentaram diferença estatisticamente significativa, demonstrando que os mesmos

tiveram apenas propriedades de inibição do quorum sensing, sem afetar o crescimento

microbiano (Figura 10 a 13).

Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de


ml-1


adicionado de 200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras

não diferem estatisticamente entre si (p<0,05).

Os resultados revelaram ainda que todos os extratos, em suas maiores concentrações

avaliadas, tiveram uma inibição no percentual de violaceína maior ou igual ao da furanona,

composto de comprovada inibição do sistema quorum sensing (PAN e REN, 2009; GRAM et

al., 1996; MANEFIELD et al., 2000; KALIA, 2012), que inibiu 79% quando usada na

concentração de 39,4 µM. O extrato bruto de grumixama apresentou inibição da produção de

violaceína que variou entre 84 a 50 %, de acordo com a concentração avaliada (Figura 10). Os

percentuais de inibição da produção de violaceína pela furanona e pelo extrato bruto de

grumixama na concentração de 100,82 mg AGE/L não diferiram estatisticamente (p<0,05).

As duas menores concentrações avaliadas apresentaram menor eficácia na capacidade de

49

inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum (Figura 10). A redução na produção de

violaceína pode ser observada na Figura 11.

Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A)

Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de grumixama na

concentração de 100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41

mg AGE/L, E) Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato

bruto de grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L.

Nas Figuras 12 e 13 estão apresentados os resultados de inibição da produção de violaceína

pelo extrato fenólico de grumixama, em diferentes concentrações. Constatou-se que o extrato

fenólico na concentração 119,94 mg AGE/L apresentou elevada eficiência na inibição (90%),

alcançando valores superiores aquele obtido com furanona (79%). Também houve inibição da

produção de pigmento quando C. violaceum cresceu na presença dos extratos em

concentrações inferiores, porém com menor eficiência, sendo que as concentrações 59,97 mg

AGE/L e 39,98 mg AGE/L não diferiram significativamente entre si. Os resultados obtidos na

contagem de células viáveis não revelaram diferenças estatísticas entre os tratamentos,

indicando que os extratos, nas concentrações testadas, não inibiram o crescimento de C.

violaceum.

50

Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de


ml-1


adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não

diferem estatisticamente (p<0,05).

Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A)

Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de grumixama na

concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97

mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato

fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L.


pitanga

Os extratos bruto e fenólico de pitanga, em todas as concentrações testadas, apresentaram

reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína, comparadas ao

controle (p<0,05) (Figuras 14 - 17). As contagens de UFC ml-1

, após 24 horas de incubação

51

na presença dos extratos em suas diferentes concentrações ou dos controles, não apresentaram

diferenças significativas, demonstrando haver apenas propriedades de inibição do sistema

quorum sensing pelos extratos nas concentrações avaliadas (Figura 14 - 17).

Constatou-se que o extrato bruto de pitanga, na concentração de 58,89 mg AGE/L, reduziu

96,8 % a produção de violaceína em comparação ao controle, (Figura 14). Não houve

diferença significativa no percentual de inibição da produção de violaceína entre furanona e

os extratos de pitanga nas concentrações de 46,30 mg AGE/L, em 30,87 mg AGE/L e 23,15

mg AGE/L.

A Figura 15 mostra a diferença observada na produção do pigmento violaceína nas

diferentes concentrações do extrato bruto de pitanga e a Figura 17 pelo extrato fenólico da

mesma fruta.

Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em

diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1

) após 24



estatisticamente (p<0,05).

52

Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B)

Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89

mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato

bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na

concentração de 14,72 mg AGE/L.

Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga

em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1

) após 24



estatisticamente (p<0,05).

Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle,

B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de

53

92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato

fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na

concentração de 23,15 mg AGE/L.

Os resultados obtidos evidenciam que os extratos das duas frutas avaliadas, grumixama e

pitanga apresentaram-se como potenciais inibidores do sistema quorum sensing em C.

violaceum. Todos os extratos testados foram capazes de inibir a produção de violaceína,

chegando até uma redução máxima de 96,8%, em comparação ao controle. Até mesmo na

concentração 100 vezes diluída, os extratos se mostraram eficazes na redução da produção de

violaceína e, portanto na inibição do quorum sensing.

Em conformidade com o presente trabalho, vários estudos demonstraram a eficácia de

extratos naturais, contendo compostos fenólicos, em inibir a produção de violaceína por C.

violaceum. Vattem et al. (2007) demonstraram atividade anti-quorum sensing por frutas como

framboesa, mirtilo e uva, onde estas apresentaram redução na produção de violaceína que

variou de 20 a 60%. Nesse mesmo estudo, ervas e especiarias também foram testadas

apresentando redução de 78% na produção de violaceína em manjericão, 60% em tomilho e

brassica e 40% em alecrim, gengibre e açafrão. Assim, os resultados do presente estudo foram

consideravelmente maiores do que os encontrados no estudo de Vattem et al. (2007).

Kigelia africana, da família Bignoniaceae, produz uma fruta conhecida por sua forte

atividade terapêutica atribuída à presença de compostos fenólicos. O extrato obtido dessa fruta

apresentou grande potencial para atividade anti-quorum sensing com redução da produção de

violaceína em até 99,76% (CHENIA, 2011). O estudo de Borges et al. (2014) avaliou a

atividade de compostos fenólicos isolados sobre a produção de violaceína e foi constatada

redução de 59% na presença de ácido gálico, 72% no de ácido ferúlico, 75% no de caféico,

48% no de floridizina, 33% em epicatequina e 51% para glicosídeo olieuropeína, todos na

concentração de 1000 µg/ml. Outro estudo, feito por Huber et al. (2003), demostrou o efeito

na inibição do quorum sensing por compostos fenólicos como epigalocatecolamina (EGCG),

ácido elágico e ácido tâmico, que reduziram a bioluminescência em E. coli MT102 pSB403, a

fluorescência em Pseudomonas putida pKR-C12, a formação de biofilme e a motilidade

Burkholderia cepacia.

Alguns trabalhos identificaram os compostos fenólicos majoritários presentes na

grumixama e pitanga. Na grumixama foram identificados os compostos fenólicos como

antocianidinas (MORENO, 2007), cianidinas, quercetinas, ácido sinápico e ácido gálico

54

(SILVA et al., 2014). Também foram identificados catequina e epicatequina (INFARTE,

2013), flavonóides (GUEDES, 2012), ácido elágico, miricetina e rutina (REYNERTSON,

2007). Na pitanga, os principais compostos fenólicos identificados foram ácido gálico

(PRADO, 2009), ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina,

miricetina e quercetina (KARWOWSKI, 2012). Como grumixama e pitanga são frutas ricas

em compostos fenólicos, a atividade anti-quorum sensing evidenciada neste trabalho pode

estar relacionada à presença desses compostos identificados como já relatado (VATTEM et

al., 2007; CHENIA, 2011; BORGES et al., 2014; HUBER et al., 2003). Porém, a atividade

anti-quorum sensing também pode estar relacionada a outros compostos presentes nessas

frutas. Esse fato pode ser observado devido a ambos os extratos, bruto e fenólico,

apresentarem um efeito anti-quorum sensing considerável. O extrato bruto contêm todas as

substâncias presentes nas frutas que podem ser extraídas pelos solventes utilizados na

extração (etanol, metanol e acetona). Já o extrato fenólico, contêm apenas os compostos

fenólicos dessas frutas, sendo o método de extração específico para estes compostos (extração

em fase sólida – C18). Gilber e Alves (2003) e Asoanaivo et al. (2001) afirmaram que

extratos vegetais podem ser mais eficazes do que os constituintes isolados de uma planta. Este

fato pode ser atribuído pelas interações positivas entre os componentes presentes no extrato.

O beneficio do extrato pode estar na proteção do componente ativo da planta a uma

degradação enzimática, ou até mesmo por facilitar o transporte através de barreiras,

resultando em uma maior eficácia quando comparado ao composto purificado, dessa forma

sendo mais eficaz sua utilização.

Na literatura, até o momento, são escassos os estudos que avaliaram a atividade anti-

quorum sensing de frutas. Entretanto, é crescente o número de estudos que avaliam essa

atividade em plantas, incluindo ervas medicinais (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012).

Um estudo com 20 ervas da medicina tradicional chinesa demonstrou que 40% dessas inibiam

a atividade de quorum sensing, indicada pela inibição da produção de violaceína. Esse estudo

demonstrou que a atividade anti-quorum sensing pode ser mais presente do que se imagina e

esse potencial poderia oferecer um modo alternativo de ação contra bactérias patogênicas que

utilizam o sistema quorum sensing para regular virulência. Além disso, as ervas estudadas

pertenciam a diferentes famílias de plantas sugerindo que os inibidores de quorum sensing

não são exclusivos de um grupo de plantas (YEO e THAM, 2011).

55

Plantas medicinais tradicionalmente usadas em todo o mundo apresentaram inibição da

produção de violaceína, e Syzygiumcumini L. e Pimenta dioica L inibiram a produção desse

pigmento em 80% (VASAVI, ARUN e REKHA, 2013). Centella asiatica L. (VASAVI e

REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI ARUN e REKHA, 2015) reduziram

completamente a produção de violaceína, sendo os flavonóides sugeridos como os

responsáveis por essa ação. Além dessas plantas, o extrato de Rhizophora

annamalayanacasca, uma planta do mangue, apresentou atividade anti-quorum sensing por

meio de inibição da violaceína e da bioluminescência em V. harveyi demonstrando o potencial

dos frutos de manguezais como agentes anti-quorum sensing (MUSTHAFA et al., 2013).

Sementes de Cuminum cyminum, conhecido pelo nome popular de cominho, apresentaram

atividade como potentes inibidores do quorum sensing inibindo em 86% a produção de

violaceína por C. violaceum (PACKIAVATHY et al., 2011). Além desses, cafeína se mostrou

um potente inibidor do quorum sensing reduzinho significativamente a produção de

violaceína, mostrando atuar na inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN,

2013).

Além da atividade anti-quorum sensing ser evidenciada em produtos vegetais também foi

comprovada por produtos como o mel (TRUCHADO et al., 2009) e a própolis (ALVAREZ,

MOREIRA e PONCE, 2012). Méis uniflorais reduziram a produção de violaceína em até

95%, sendo essa capacidade atribuída à inibição da síntese de AHL (TRUCHADO et al.,

2009). Já a própolis apresentou redução no percentual de violaceína de, aproximadamente

60%, onde foi sugerida que essa atividade poderia ser devida a presença de compostos

fenólicos (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012).

5.5 - Efeito dos extratos de grumixama e pitanga sobre a motilidade tipo swimming e

swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36

Os extratos de grumixama e pitanga atuaram reduzindo a motilidade tipo swimming e

swarming em ambas as bactérias avaliadas. As Figuras 18, 19, 20 e 21 apresentam os

resultados para motilidade tipo swimming e swarming.

56

Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S.

marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes

com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de


concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato


grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L.

Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S.

marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes

com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de


57

concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato


grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L.

Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. marcescens

e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A.

hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L.

58

Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. marcescens e

A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A.

hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na


mg AGE/L.

O sistema quorum sensing controla a formação de biofilme, motilidade tipo swarming, a

produção de biossurfactantes, de nucleases e do pigmento vermelho chamado prodigiosina em

S. marcescens (BAKKIYARAJ et al., 2012). Como podem ser observados nas Figuras 19-22,

os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga foram capazes de reduzir a motilidade

tipo swimming e swarming, atuando como inibidores do sistema quorum sensing. Vale

ressaltar que as concentrações utilizadas não inibiram a multiplicação deste micro-organismo

(Tabela 4 e Tabela 5). Os dados da motilidade de S. marcescens ainda apontaram uma

inibição na produção de prodigiosina, pigmento vermelho cuja produção é controlada pelo

quorum sensing (THOMSON, N. R. et al, 2000; FINERAN, P. C. et al, 2005; FINERAN, P.

C. et al, 2013). Estudos semelhantes também encontraram redução na motilidade bacteriana

por produtos naturais. Nove isolados de bactérias associadas a coral, entre 19 testados por

Bakkiyaraj et al. (2012), atuaram inibindo a motilidade tipo swarming em S. marcescens.

Epigalocatequina galato (EGCG), um composto extraído do chá verde, provocou reduções na

motilidade em Campylobacter jejuni em até 75% (CASILLO et al., 2014). Já Packiavathy et

al. (2011) testaram extratos de Cuminum cyminum na motilidade em Proteus mirabilis, P.

59

aeruginosa PAO1 e S. marcescens, encontrando resultados de diminuição da motilidade tipo

swarming proporcionais as concentrações do extrato.

A cafeína atuou também inibindo de motilidade swarming em P. aeroginosas PA01 tendo

sua atividade atribuída a inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN, 2013). As

plantas Centella asiatica L. (VASAVI e REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI

ARUN e REKHA, 2015) inibiram completamente esse tipo de motilidade nessa bactéria.

A motilidade é uma característica de A. hydrophila regulada pelo quorum sensing,

envolvendo sinalizadores AI-1 e AI-2 (DANIELS, VANDERLEYDEN e MICHIELS, 2004;

KOZLOVA et al., 2008). Esse mecanismo controla a expressão de vários fatores em A.

hydrophila (SWIFT et al, 1997) pelo sistema quorum sensing, por meio dos homólogos

LuxRI chamados de AhyRI neste micro-organismo (GARDE et al., 2010). Os resultados

descritos acima evidenciaram uma inibição da motilidade tipo swimming e swarming em A.

hydrophila, possivelmente envolvendo mecanismo de inibição do quorum sensing.

Uma modificação na motilidade celular pode ter consequências profundas sobre a

patogenicidade do organismo, pois alguns genes de virulência são normalmente co-regulados

com a motilidade (MCCARTER, 2006). Os extratos de grumixama e pitanga se mostraram

efetivos na regulação da motilidade em S. marcescens e A. hydrophyla, indicando seus

potenciais em controlar processos de virulência regulados por este mecanismo.

5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S.

marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536

Os efeitos de ambos os extratos de grumixama e pitanga sobre a formação de biofilme

foram semelhantes para todos os micro-organismos estudados. Porém, C. vioulaceum foi o

micro-organismo mais influenciado na presença dos mesmos, com um aumento na biomassa

de até 240 %. Esses resultados sugerem que a substância envolvida na regulação do biofilme

pode estar presente tanto no extrato bruto como no extrato fenólico da fruta. Os resultados

para formação de biofilme para os extratos brutos e fenólicos de pitanga e grumixama estão

apresentados nas Figuras 22, 23, 24 e 25.

60

Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C.

violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli

ATCC10536.

61

Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C.


ATCC10536.

62

Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. violaceum

ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110 E) E. coli ATCC10536.

63

Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C.


ATCC10536.

Os resultados obtidos para a formação de biofilme contradizem os anteriormente descritos

neste trabalho, onde os extratos de ambas as frutas tiveram ação de inibição do sistema

quorum sensing, atuando negativamente sobre a expressão de fenótipos como produção de

pigmento em C. violaceum e motilidade em A. hydrophila e S. marcenscens. Um estudo feito

por Viana et al., 2009 apresentou resultados semelhantes a este, onde a furanona em

concentração de 1 ml L-1 não afetou o crescimento e formação de biofilme em H. alvei em

teste de microplaca utilizando cristal violeta. Além desse, um estudo feito por Ponce et al.,

2012, com Enterobacter cloacae mostrou que o sistema quorum sensing regulou de forma

negativa a atividade proteolítica nessa bactéria e na síntese de enzimas hidrolíticas mediadas

por AHLs. Ta et al., (2014) em trabalho com várias espécies de plantas encontraram que 40%

das mesmas não apresentaram nenhuma inibição ou até mesmo aumentaram a formação da

massa do biofilme, quando comparados ao controle. Em estudo feito por Ghosh et al. (2014),

64

os resultados revelaram que o extrato regulou a expressão de genes responsáveis pela

virulência e motilidade celular e reprimiu genes relacionados a formação do biofilme. A

atividade anti-quorum sensing do extrato da casca de goiaba e os resultados indicaram uma

inibição de 19% dos genes expressos em C. violaceum, envolvendo genes relacionados a

motilidade, biogênese celular, membrana externa, mecanismo de transdução e transporte e

metabolismo de aminoácido.

Os extratos de grumixama e pitanga tiveram atividade inibindo a expressão de fenótipos

regulados pelo quorum sensing e aumentando a expressão de outros, sugerindo que os

extratos contêm substâncias que desempenham atividades distintas sobre o quorum sensing.

Teplitski, Robinson e Bauer (2000) sugeriram que as plantas podem produzir substâncias que

imitam as AHLs, podendo agir positivamente em certas espécies bacterianas, ou atuar de

forma negativa em algumas outras. Naquele trabalho, feito com exsudatos de mudas de

ervilha, foi evidenciado a secreção de substâncias semelhantes a AHL com atividade inibitória

sobre a estirpe de C. violaceum CV026, porém várias outros compostos estimularam outras

estirpes repórteres do sistema quorum sensing. Esses autores sugeriram que as plantas podem

produzir falsos compostos que imitam os sinalizadores quorum sensing, interferindo com a

síntese ou transporte de AHL e também interagindo diretamente com a proteína receptora de

AHL (homóloga a LuxR).

Ahmad, Viljoen, e Chenia (2014) estudaram 22 compostos contidos em óleos essenciais e

encontraram resultados variáveis na inibição da produção de violaceína; onde foi observado

uma redução máxima de 90% em um dos compostos e um aumento por 7 dos 22 óleos

essenciais testados. Os autores sugeriram que muitos óleos essenciais têm estruturas

semelhantes às AHLs e que estas poderiam competir com a AHL relacionada à produção de

violaceína (C6-AHL). A diversidade estrutural dos compostos dos óleos essenciais permitiria

que eles tivessem um amplo espectro de atividade. De forma geral, vários compostos

presentes em fontes naturais podem possuir substâncias semelhantes às moléculas

sinalizadoras do quorum sensing (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e

HWANG, 2006; VATTEM et al., 2007; TRUCHADO et al., 2012; YEO e THAM, 2012;

GANIN et al., 2012; BLANA e NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2013;

TAN e YIN, 2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013).

Estudos descritos na literatura demonstram que produtos naturais apresentaram uma

atividade na inibição do biofilme, como naringenina, um flavonóide presente em frutas

65

cítricas, atuando em biofilmes de V. harveyi e E. coli (VIKRAM et al, 2010). Além desse,

também foram demonstradas atividades de inibição de biofilme pelos extratos fenólicos de

cloudberries selvagens finlandeses (Rubus chamaemorus) e framboesas selvagens (Rubus

idaeus) (PRILHA et al., 2014). Produtos naturais a partir de Centratherum punctatum, como

lactonas de sesquiterpeno, também inibiram a produção de biofilme em P. aeruginosa,

reduzindo a produção de AHL (AMARA, et al., 2012). Epigalocatequina galato (EGCG),

extraído do chá verde, provocou reduções de até 75% na formação do biofilme em

Campylobacter jejuni (CASILLO, HEREDIA e GARCÍA, 2014). Loughlin et al. (2013)

demonstraram a eficácia de meta-bromo-tiolactona (mBTL), um análogo do auto indutor de

P. aeroginosa, em inibir o quorum sensing impedindo a formação de biofilme neste micro-

organismo.

Diferentes mecanismos foram propostos para explicar a inibição do sistema quorum

sensing por produtos naturais. Esses mecanismos incluem a inibição da síntese da molécula

sinalizadora ou receptora, inativação enzimática do sinalizador e pela semelhança das

estruturas químicas dos produtos naturais aos sinalizadores do quorum sensing, agindo por

competição junto aos receptores. Além desses, à ligação a proteína receptora pode provocar

uma mudança na sua conformação prejudicando sua capacidade de interagir com a RNA

polimerase, reduzindo seu potencial de transcrição manifestando, assim, sua atividade como

antagonismo (Loughlin et al., 2013).

Os compostos presentes nos extratos de grumixama e pitanga podem possuir semelhança

estrutural aos sinalizadores utilizados no sistema quorum sensing ou interferir na síntese

desses, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing e em outros estimulando, como foi

evidenciado também por Teplitski, Robinson e Bauer (2000). Mais estudos devem ser

conduzidos para a identificação dos compostos presentes nos extratos das frutas testadas, bem

como a elucidação do modo de ação dos mesmos sobre o sistema quorum sensing dos micro-

organismos avaliados.

6 - CONCLUSÃO

Os resultados encontrados neste trabalho são importantes, pois ainda são escassos os

estudos sobre atividade anti-quorum sensing de frutas, principalmente frutas nativas

brasileiras. Com esse trabalho, há um incremento nas alternativas de produtos naturais com

potenciais para controlar a atividade antimicrobiana e valorização de frutas nativas brasileiras.

66

Este estudo também indica o potencial dos extratos de ambas as frutas para aplicações nas

indústrias alimentícias e farmacêuticas, inibindo fenótipos de deterioração e de virulência

regulados pelo quorum sensing.

7 - REFERÊNCIAS

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