UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

CARLOS LÍVERTON DA SILVA BORGES

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAS

PARCIAIS DA PEÇONHA DA ARANHA CARANGUEJEIRA

Acanthoscurria natalensis.

Feira de Santana, BA

2008

CARLOS LÍVERTON DA SILVA BORGES

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAS

PARCIAIS DA PEÇONHA DA ARANHA CARANGUEJEIRA

Acanthoscurria natalensis.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feirade Santana(UEFS) como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Prof. Dr. Maria Elena de Lima Pérez Garcia Laboratório de Venenos e Toxina Animais Departamento de Bioquímca e Imunologia Universidade Federal de Minas Gerais. Co-Orientadoras: Prof. Ms. Ilka Biondi Laboratório de Animais Peçonhentos e Herpetologia Departamento de Ciência Biológicas(UEFS) Prof. Dr. Sandra Aparecida de Assis Laboratório de Enzimologia Departamento de Saúde (UEFS)

Feira de Santana, BA

2008

Este trabalho é dedicado a minha família

a qual com muito amor me apoiou nos

diversos momentos em que precisei, em especial

minha mãe, minha esposa, minha filha,

minha irmã e meus tios.

E uma homenagem póstuma a minha querida

Avó Inés

AGRADECIMENTOS

Agradeço de todo coração a todos aqueles que me apoiaram e deram aquela força para a

concretização desse trabalho.

Agradeço primeiramente a Professora Ilka Biondi, pela co-orientação(LAPH-UEFS) sem

a qual não estaria realizando esta fase da minha vida acadêmica e a todos os alunos, estagiários e

funcionários do LAPH em especial o Alexandre (O mano), a Dulce, a Rafaela e a Josemir meu

braço direito com as aranha.

À professora Sandra Aparecida de Assis pela co-orientação .

À professora Maria Elena (LVTA-UFMG), pela paciência,e orientação deste trabalho. E

a todo o pessoal do Laboratório de Venenos e Toxinas Animais –LVTA-UFMG, em especial ao

Breno Rates pela imensa colaboração, à Karla, à Marcella, ao Vitor, à Camila, ao Filipe e à

Juliana (Jú).

Aos Amigos, do Laboratório de Enzimologia e Bioquímica de Proteínas, em especial ao

Jamil pelo aprendizado com sua experiência, ao Alexandre Santos e à Kádima pelas orientações

e discussões esclarecedoras.

Ao pesquisador Dr. Antônio Brescovit (Instituto Butantã) pela confirmação da

identificação da espécie Acanthoscurria natalensis.

Ao Amigo Hugo Leonardo da eletrofisiologia pela realização dos experimentos nesta

área, e enfim, a todos os que direta ou indiretamente colaboraram com esse trabalho.

Ao proprietário do Ranário Vivendas da Rainha- Ribeirão das Neves (MG), por ceder

gentilmente as pulpas das moscas utilizadas nesse estudo.

E a Deus, meu Senhor e Criador, acima de tudo pelo sustento e graça a mim concedido.

“ Ainda que eu fale as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver amor, serei como o

sino que ressoa ou como prato que retine. Ainda que eu tenha o dom de profecia e

saiba todos os mistérios e todo conhecimento, e tenha uma fé capaz de mover

montanhas, se não tiver amor, nada serei. (...) O amor nunca perece; mas as profecias

desaparecerão, as línguas cessarão, o conhecimento passará...”

I Corintios 13:1-8

RESUMO

O estudo biotecnológico de compostos bioquímicos de invertebrados especialmente

peçonhas de aranhas e escorpiões representa uma fonte para a formulação de novos fármacos.

Assim, o presenta trabalho tem como objetivo a purificação parcial da peçonha da Acantoscurria

natalensis. Para a purificação da peçonha utilizou-se a metodologia de cromatografia líquida de

alta performance (CLAE). A determinação das massas moleculares e o seqüenciamento parcial

das toxinas isoladas foram feitas utilizando-se espectrometria de massa e degradação de Edman,

Eletroforeses uni e bi-dimensionais foram utilizadas para auxiliar na caracterização da peçonha

e toxinas isoladas. Os testes de atividade biológica compreenderam ensaios de toxicidade em

mosca domestica (Musca domestica) e ensaios eletrofisiológicos em canais iônicos (sódio e

cálcio) utilizando-se células de gânglio dorsal de rato. O fracionamento por cromatografia de

troca catiônica resultou na separação de 32 picos que foram submetidos à cromatografia em

coluna de fase reversa, onde foram isoladas duas toxinas (AnTxI e AnTxII). Estudos

eletrofisiológicos com AnTx1, em neurônios do gânglio dorsal de rato (DRG), indicaram ação

bloqueadora em canais para sódio e para cálcio. Resultados preliminares indicam que a toxina

causa inibição da corrente de cálcio nas células DRG, em concentrações nanomolares. Em

conclusão, neste trabalho isolamos e caracterizamos parcialmente duas toxinas (AnTxI e

AnTxII) da peçonha da aranha A.natalensis e mostramos que uma delas (AnTx1) bloqueia com

alta potëncia, canais para cálcio, podendo representar uma importante ferramenta para estudos

farmacológicos destes canais.

Palavras-chave: Mygalomorphae, Acanthoscurria natalensis, toxina, canais iônicos

ABSTRACT

The biochemical and pharmacological studies from venoms especially that of invertebrates,

including spiders and scorpions, represent a source for the formulation of new medicines. Like

this, the present work has as objective the partial purification and biological characterization of

the venom of the spider Acanthoscurria. natalensis. This work was proposed considering the

lack of studies with this venom and its potential to present new molecules from biological

interest. The purification of this venom was done by using high performance liquid

chromatography (HPLC) techniques. The molecular mass and the partial sequences were

obtained by using mass spectrometry, Edman degradation and automatic sequence

determination, as techniques. Electrophoresis uni and bi-dimensional were used to complement

the characterization of the venom and of their toxins. Biological activity tests included toxicity

assays in fly (Musca domestica) and electrophysiological assays in ionic channels (sodium and

calcium) in cells from dorsal root ganglion of rat (DRG). The chromatography by cationic

exchange in HPLC originated 32 fractions that were submitted to a reverse phase column. Two

toxins (ANTx1 and ANTxII) were isolated. Electrophysiological studies showed that AnTx1, in

nanomolar doses, blocks the calcium currents in DRG neurons from rat., and in less extension

the sodium current. These results indicated that AnTx1 is a promising tool o study calcium

channels.

Key words: Mygalomorphae, Acanthoscurria natalensis, toxin, ionic channels, calcium

channels.

Lista de abreviações e siglas

Termos Técnicos ACN Acetonitrila BSA Albumina de soro bovino. Cav Canais para cálcio voltagem-dependentes Ca++ Íon cálcio Cl- Íon cloreto CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiëncia CIEX “Chromatography cationic ion- exchange” cm Centímetro DRG “Dorsal Root Ganglion” -Glânglio da Raiz Dorsal DHP 1,4 dihidropiridina Da Dalton DMEM “Dulbecco's Modified Eagle Médium”- Meio de cultura Modificado de Eagle. DL50 Dose letal para morte de 50% do grupo teste ECA Enzima Conversora de angiotensina HVA “High Voltage Activated”- Ativado por alta voltagem HBSS Hank’s Balanced Salt Solution -Solução fisiológica de Hank HPLC “ High Performance Liquid Chromatography” K+ Íon potássio Kv Canal para potássio, voltagem-dependente kDa Kilodalton LVA “Low Voltage Activated”- Ativado por baixa voltagem M Molar mM Milimolar mL Mililitro mV Milivoltes µL Microlitro µΩ Microohm µM Micromolar ng Nanograma nM Nanomolar Nav Canal para sódio, voltagem-dependente Na+ Íon sódio PI Ponto isoelétrico pS picosegundo RPM Rotações por minuto RPC “Reverse phase chromatografy” - Cromatografia de fase reversa SDS Dodecil sulfato de sódio TFA Ácido trifluoracético TEMED Tetrametiletilenodiamino V Volts v/v Volume por volume

i

Lista de Tabelas

Página

Tabela 1 Lista de toxinas isoladas das peçonhas da infra-ordem das Mygalomorphae

08

Tabela 2 Nomenclatura das subunidades α1 de canais para cálcio, dependentes de voltagem clonados

13

Tabela 3 Alinhamento das toxinas homólogas aos cinco fragmentos das toxinas, AnTxI e AnTxII, comparadas pelo BLAST-p

39

ii

Lista de Figuras

Figura 1 Morfologia das aranhas caranguejeiras. 04

Figura 2 Theraphosidae – A..natalensis. 05

Figura 3 Estrutura básica dos canais iônicos. 10

Figura 4 Extração da peçonha da A. natalensis 17

Figura 5 Aplicação das amostras em diferentes concentrações da peçonha e toxinas em moscas (Musca domestica).

22

Figura 6 Perfil eletroforético do gel de poliacrilamida da peçonha ( de A. natalensis e da toxina isolada ( AnTxI ))

30

Figura 7 Perfil eletroforético do gel bidimensional da peçonha das fêmeas de A. natalensis.

31

Figura 8 Perfil cromatográfico (troca catiônica) da peçonha de Fêmea e de Macho.

33

Figura 9 Perfil cromatográfico da toxina isolada AnTxI da A. natalensis em cromatografia de fase reversa.

34

Figura 10 Perfil cromatográfico das frações de CIEX obtidas da peçonha da A. natalensis

35

Figura 11 Perfil da cromatografia em fase reversa (RPC) da toxina isolada - AnTxI.

37

Figura 12 Efeito do curso temporal da corrente após exposição à toxina AnTxI.

42

Figura 13 Traçados representativos das correntes totais carreadas pelos canais para cálcio sensíveis à voltagem no neurônio DRG.

43

iii

Indice

PÁGINA

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 Revisão da literatura 2

1.1.1 Biologia das aranhas 2

1.2 Características gerais da peçonha das aranhas caranguejeiras

6

1.2.1 Toxinas isoladas de peçonhas de caranguejeiras

7

1.2.2 Atividade em canais iônicos de toxinas isoladas de peçonhas de caranguejeiras

7

1.3 Os canais iônicos 9

1.3.1 Canais para cálcio - breve introdução

11

1.4 Células do gânglio dorsal 14

2. OBJETIVOS 15

2.1 Objetivo geral 15

2.2 Objetivos específicos 15

3. MATERIAL E MÉTODOS 16

3.1 Coleta e manutenção A. natalensis 16

3.2 Identificação da A. natalensis 16

3.3 Extração da peçonha de A. natalensis 16

3.4 Dosagem da concentração de proteínas 18

3.5 Fracionamento da peçonha de A. natalensis 18

3.5.1 Cromatografia de troca catiônica-CIEX

18

3.5.2 Cromatografia de fase reversa (CLAE-FR)

18

3.6 Eletroforese Unidimensional em poliacrilamida - SDS (SDS-PAGE)

19

3.7 Eletroforese em gel bidimensional (2D-PAGE) 20

3.8 Bioensaios com a peçonha bruta e toxinas, em insetos

20

3.8.1 Testes de toxicidade em insetos. 20

3.8.2 Testes eletrofisiológicos da AnTxI em canais para Ca 2+

23

3.8.3 Cultura celular de células DRG do gânglio dorsal de ratos

23

3.9 Espectrometria de Massa 25

3.9.1 Análise da peçonha isolada por ESI-Q-TOF-MS

25

3.9.2 Análise da peçonha por MALDI-TOF/TOF-MS

26

3.10 Determinação da seqüência N-terminal das toxinas AnTxI e AnTxII

27

4.RESULTADOS E DISCUSSÃO 28

4.1 Eletroforese unidimensional em poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Eletroforese em gel bidimensional (2D-PAGE)

28

4.2 Cromatografia da peçonha de A. natalensis 32

4.3 Análise por Espectrometria de Massas 36

4.4 Determinação da seqüência N-terminal do peptídeo AnTxI

38

4.5 Testes biológicos 40

4.5.1 Teste de toxicidade em insetos 40

4.5.2 Testes eletrofisiológicos com a toxina AnTxI em canais para cálcio voltagem-dependentes.

41

5. CONCLUSÕES 44

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47

ANEXOS 55

Formulação para a eletroforese em poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)

55

Formulação para a solução de Hank's 56

Formulação para o experimento de “patch-clamp”

56

1 INTRODUÇÃO

A busca por princípios ativos utilizando-se da biodiversidade, tanto da fauna, como da

flora, tem se intensificado ao longo dos anos. Nessa óptica, os princípios ativos de peçonhas

animais vêm despertando interesse da indústria farmacêutica e biotecnológica. Um exemplo

ilustrativo, foi a descoberta de que um peptídeo do veneno da Jararaca (Bothops jararaca) inibe

a enzima conversora da angiotensina I (ECA) em angiotensina II (que leva ao aumento da

pressão arterial) na década de 60, pelos Doutores Sérgio Ferreira e Lewis J. Greene. Este e

outros peptídeos da peçonha são capazes de abaixar a pressão arterial. A partir dessa descoberta

a indústria formulou um produto conhecido comercialmente como captropil®, cujo uso no

tratamento de problemas hipertensivos vem salvando muitas vidas em todo o mundo.

O conhecimento dos compostos presentes nos venenos e peçonhas de animais é

importante não só para a formulação de soros no tratamento nos envenenamentos, como também

para o descobrimento de princípios ativos para sua utilização como possíveis fármacos. Assim

como os vertebrados, os invertebrados, por exemplo, aranhas e escorpiões, representam um

campo interessante para a descoberta de toxinas e de outras substâncias ativas (DE LIMA et

al,2007, ESCOUBAS et al., 2000b).

Várias toxinas já estudadas, isoladas de diferentes peçonhas de artrópodos, interferem

com estruturas e processos biológicos diversos, como canais iônicos, por atuar como

antibacterianos, anti-hipertensivos, etc (LAMPE et al, 1993; DE LIMA et al, 2007; PERREIRA

et al, 2006; GRISHIN, 1999, VERANO BRAGA et al., 2008). Um exemplo pode ser visto na

peçonha da aranha armadeira, Phoneutria nigriventer que apresenta várias toxinas com ampla

gama de ação em canais iônicos, como sódio, potássio e cálcio, possuindo atividade em

mamíferos e algumas com atividade inseticida específica (GOMEZ et al, 2002; DE LIMA et al.,

2007; FIGUEIREDO et al., 1995; FIGUEIREDO et al.,2001; DE LIMA et al., 2002;

OLIVEIRA et al., 2003; NUNES et al., 2008). Várias destas toxinas interagem com sítios

específicos do sistema nervoso, modificando funções, atuando na neurotransmissão central ou

periférica, pré ou pós-sinapticamente, na liberação de neurotrasmissores e/ou interferindo com a

transdução de sinais.

SENFE- RIBEIRON et al., 2008, faz um revisão sobre toxinas de aranhas com aplicação

biotecnológica e destaca dentre outras, a toxina de Loxosceles sp como de grande importância

para o estudo na linha de imunoterápicos, modulador de resposta inflamatória e imunopatológica

e como biopesticidas. Outro trabalho que merece destaque focaliza um peptídeo rico em glicina

1

que apresenta atividade antimicrobiana, extraído da hemolinfa da aranha Acanthoscurria

gomesiana (LORENZINI, D. M. et al ,2003).

O presente estudo teve como objetivo estudar a peçonha da aranha Acanthoscurria

natalensis, do semi-ariado baiano, como possível potencial biotecnológico..

1.1 Revisão da literatura

1.1.1 Biologia das aranhas

As aranhas são animais pertencentes ao filo Arthopoda, classe Arachnida. Compreendem

cerca de 40 mil espécies já descritas (FOELIX, 1996). Esses animais são cosmopolitas, ocorrem

em regiões tropicais e subtropicais, tendo baixa freqüência de habitat nas regiões polares

(CODDINGTON e LEVI,1991). De acordo com seus hábitos, as aranhas são classificadas em

subterrâneas, terrículas, cavernículas, dendrícolas, adaptando-se também à vida subaquática

(FOELIX, 1996; RAVEN, 1985). São carnívoras caçando as suas presas vivas, através de duas

estratégias básicas : (i) a construção de teia para aprisionar as presas; (ii) saltando sobre a presa,

segurando-as com as garras e inoculando a peçonha. As aranhas das famílias Licosidae,

(tarântulas), Ctenidae (armadeiras), Salticidae (papa-moscas) e Theraphosidae (caranguejeiras),

apresentam essa segunda estratégia, e em geral, são errantes, caçadoras e solitárias.

Aranhas, exceto as da família Uloboridae, possuem um par de glândulas situadas no

cefalotórax com ductos que chegam até as quelíceras. As quelíceras são utilizadas para secretar a

peçonha e paralisar suas presas. Segundo FRIEDEL, 1989, as aranhas utilizam como função

primária a peçonha para imobilização de suas presas. Entretanto a peçonha, por apresentar

variabilidade de componentes, acaba por provocar efeito letal. Esta gama de compostos ativos,

na sua grande maioria age no sistema nervoso, sendo que a açao no sistema muscular passa a ser

um efeito secundário. O conhecimento da biologia juntamente com os efeitos causados por estas

peçonhas vem possibilitando o estudo de princípios ativos, conhecendo-se suas estruturas e

estudando-se seus modos de ação. Estima-se que exista cerca de 19.000.000 de moléculas, nas

peçonhas das duas infra ordem de aranhas descritas Araneomorphae e Mygalomorphae

demonstrado-se assim, a necessidade de estudos bioquímicos e farmacológicos (ESCOUBAS,

2006).

As Araneomorphae são conhecidas como aranhas verdadeiras e compreendem o maior

grupo de espécies, onde podemos destacar os gêneros Phoneutria, Lycosa e Loxosceles, por

2

serem responsáveis pelo maior número de acidentes em humanos no Brasil, justificando vários

estudos realizados (GOMEZ et al., 2002. FRONTALI, N., GRASSO, A, 1964, DE LIMA et al.,

2007; DE LIMA et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 1995; FIGUEIREDO et al.,2001;

OLIVEIRA et al., 2003). As Mygalomorphae são representadas pelas caranguejeiras e são

conhecidas como falsas aranhas devido a posição anatômica das suas quelíceras. Para esta infra-

ordem estão descritas 15 famílias, 300 gêneros e aproximadamente 2.500 espécies (HEDIN &

BOND, 2006). As caranguejeiras são caracterizadas, anatomicamente, por apresentar pêlos no

corpo, agrupamento ocular do tipo cômoro ocular, e quelíceras em posição paralela, com as

glândulas localizadas na porção basal das quelíceras (BRAZIL, 1925). (FIG. 1). Dentro desta

infra-ordem está alocada a família Theraphosidae, com 112 gêneros e 906 espécies (THE

WORLD SPIDER CATALOG, 2008). 45% destes gêneros habitam as regiões neotropicais

(HEDIN & BOND, 2006).

Para o Brasil, estão descritos 32 gêneros da família Theraphosidae (THE WORLD

SPIDER CATALOG, 2008). Destes, apenas os gêneros Acanthoscurria, Grammostola,

Lasiodora e Vitalius vêm sendo mais estudados e são encontrados em todo território brasileiro

principalmente, n o Norte e no Nordeste (BARRAVIEIRA,1994; MONTANDON, 2007).

As espécies do gênero Acanthoscurria (FIG. 2) estendem-se pela América do Sul e

Central. São aranhas terrestres, alimentando-se basicamente, de insetos, pequenos lagartos, de

roedores, rãs, minhocas e outras aranhas. São principalmente escavadoras e caçadoras,

paralisando suas presas pela inoculação de peçonha (FOELIX, 1996).

3

Figura 1- Morfologia das aranhas caranguejeiras. A-Anatomia externa de aranhas caranguejeiras B- Aspecto

externo das aranhas caranguejeiras C-Anatomia Interna do cefalotórax das aranhas. Fonte: Soerensen, B., 1997;

FOELIX, S. D. Biology of spiders. Oxford University Press, inc., 1996.

A B

C

4

Figura 2 - Theraphosidae - Acanthoscurria natalensis ;

Fonte: http://www.birdspiders.com/archive/15B036F2KD0B7KAEC2K14B24A24C046092C.html

5

1.2 Características gerais da peçonha das aranhas caranguejeiras

Apesar do vasto número de espécies descritas para as aranhas, poucas delas apresentam

seu veneno bem caracterizado, como nos escorpiões, serpentes e outros animais peçonhentos

(GOMEZ et al., 2002. FRONTALI, N., GRASSO, A, 1964, DE LIMA et al., 2007; 2002;

FIGUEIREDO et al., 1995; 2001; OLIVEIRA et al., 2003).

De um modo geral, a peçonha das aranhas caranguejeiras compreende uma mistura de

sais, nucleotídeos, aminoácidos livres, neurotransmissores, poliaminas, peptídeos, proteínas e

enzimas (ESCOUBAS e RASH, 2004; ESCOUBAS et al., 2000b; SAVEL-NIEMANN, 1989;

RASH e HODGSON, 2002). Dentre esses componentes o grupo de moléculas de maior interesse

são as neurotoxinas que podem ser divididas em dois grupos: o das acilpoliaminas e o das

toxinas polipeptídicas, que são classificadas de acordo com suas características funcionais e

moleculares (GRISHIN, 1999).

As acilpoliaminas ou poliaminas amidadas são compostos orgânicos neurotóxicos

formados por uma cadeia de poliamina alifática com um grupo acil aromático final, de baixa

massa molecular (300-700Da). Este tipo de toxina foi descrito pela primeira vez na peçonha da

aranha japonesa Nephila clavada por KAWAI et al. (1982). As acilpoliaminas são compostos

que bloqueiam especificamente receptores de glutamato (HIDAI et al., 1999), sendo o glutamato

um neurotrasmissor excitatório em músculo esquelético de insetos e também o principal

neurotransmissor excitatório no sistema nervoso central de mamíferos. Assim as poliaminas são

ferramentas para estudos da neurofisiologia de vertebrados e de invertebrados, tendo potencial

como agente farmacológico ou agroquímico, que pode ser explorado (HIDAI et al., 1999; KAN

et al.,2002).

Já as toxinas peptídicas, isoladas de peçonhas de aranhas em geral, têm cadeia de 30 a 77

resíduos de aminoácidos. As neurotoxinas com baixa massa molecular geralmente interagem

com canais iônicos das membranas de células excitáveis, bloqueando a transmissão sináptica

por interferir com os potenciais de ação, enquanto que as de alto peso molécula, em geral,

ligam-se a unidades de receptores de membrana pré-sináptica, intensificando a secreção de

neurotransmissores (GRISHIN,1999).

6

1.2.1 Toxinas isoladas de peçonhas de caranguejeiras

Os trabalhos com isolamento de toxinas de peçonhas de caranguejeiras iniciaram-se no

final da década de 80, com teste de toxicidade em baratas com a peçonha da aranha Eutypelma

californicum, onde as toxinas ESTxI e ESTxII foram isoladas e testadas por Savel-Niemman e

Roth em 1989. Em aranhas chinesas do gênero Selenocosmia foram isolados vários peptídeos

com diversas funções, entre eles estão: 1) Huwentoxina I (HwTxI), 2) SHL-I, 3) Huwentoxina II

(HwTxII), 4) Huwentoxina IV (HwTxIV) e 5) Hainatoxinas IV e V entre outros peptídeos de

outras aranhas (TABELA 1). Esses peptídeos atuam em receptores nicotínicos, outros possuem

atividades hemaglutinante, inseticida, ou inibem canais para sódio (LIANG, et al 1993; LIANG

e PAN, 1995; PENG et al., 2001; SHU e LIANG, 1999; PENG et al., 2002; LIU et al. 2003;

XIAO e LIANG, 2003). Dentre essas atividades a ação em canais iônicos tem despertado

interesse especial, pois a alta seletividade para receptores e subtipos de canais iônicos ainda é

pouco conhecida. LAMPE et al, 1993, isolaram um peptídeo que bloqueia canais para cálcio e

posteriormente LAMPE, 1999 isolaram um peptídeo com ação analgésica, ambos das peçonhas

de Grammostola spatulata.

1.2.2 Atividade em canais iônicos de toxinas isoladas de peçonhas de

caranguejeiras

As toxinas ativas em canais iônicos possuem em geral, massa molecular entre 4 a 10

kDa com grande quantidade de resíduos de cisteína, variando de seis a quatorze pontes

dissulfeto. A ação das toxinas em canais iônicos leva à paralisia das presas por inibição ou

excessiva estimulação da transmissão nervosa. No primeiro caso, as toxinas inibem canais para

sódio (Nav) ou para cálcio (Cav) - voltagem-dependentes. No segundo caso, ocorre uma

excessiva estimulação de Nav ou inibição do canal para potássio (Kv)-voltagem-dependentes

(GRISHIN,1999; SWARTZ, 2007). De acordo com levantamento feito por Escoubas & Rash

(2004), os canais iônicos para sódio e para potássio são os mais susceptíveis à ação pelas toxinas

de caranguejeiras (TABELA 1).

7

Tabela 1-Lista de toxinas isoladas das peçonhas da infra-ordem das Mygalomorphae Toxinas Nome Espécies Massa Molecular Referências TxP5 Toxic protein 5 B. smithi 3959.56 ?? Kaiser et al., 1994 CvTxII Covalitoxin II Coremiocnemis validus 3406.94 ?? Balaji et al., 2000 GSAFI – G. spatulata 3707.46Analgésico Lampe, 1999 GSAFII – G. spatulata 3979.76Analgésico/ antiarritímico Lampe and Sachs, 1999 GsMTx2 Grammostola mechanotoxin 2 G. spatulata 3922.73 MSC ?? Oswald et al., 2002 GsMTx4 Grammostola mechanotoxin 4 G. spatulata 4095.90 MSC (SAC) Suchyna et al., 2000 HaTx1 Hanatoxin 1 G. spatulata 4114.73 Kv2.1 Swartz and MacKinnon, 1995 HaTx2 Hanatoxin 2 G. spatulata 4098.73 Kv2.2 Swartz and MacKinnon, 1995 HmTx1 Hetereroscodratoxin 1 H. maculata 3997.45 Kv2 / Kv4 (4.1) Escoubas et al., 2002 HmTx2 Hetereroscodratoxin 2 H. maculata 4757.55 Kv2 Escoubas et al., 2002 HnTxI Hainantoxin-I S. hainana 3607.22 ?? PDB entry 1NIX HnTxIV Hainantoxin-IV S. hainana 3987.59 Nav TTX-S Liu et al., 2003 HnTxV Hainantoxin-V S. hainana 3972.57 Nav TTX-S Xiao and Liang, 2003 HwTxI Huwentoxin-I S. huwena 3750.42 tipo N (L?) Liang et al., 1993 HwTxIV Huwentoxin-IV S. huwena 4107.82 Nav TTX-S Peng et al., 2002 PaTx1 Phrixotoxin 1 P. auratus 3548.36 Kv4.2 / 4.3 Diochot et al., 1999 PaTx2 Phrixotoxin 2 P. auratus 3921.75 Kv4.2 / 4.3 Diochot et al., 1999 PcTx1 Psalmotoxin 1 P. cambridgei 4689.45 ASIC1a Escoubas et al., 2000a ProTxI Protoxin I T. pruriens 3987.55 Nav1.2, 1.5, 1.7, 1.8 Middleton et al., 2002 ProTxII Protoxin II T. pruriens 3826.64 Nav1.2, 1.5, 1.7, 1.8 Middleton et al., 2002 ScTx1 Stromatoxin 1 S. calceata 3791.36 canal p/ K v2.1 / 2.2 / 4.2 Escoubas et al., 2002 SGTx1 – Scodra griseipesb 3776.32 cK ?? Marvin et al., 1999 SHL-1 SHLP-I S. huwenaa 3540.05 células vermelhas do sangue ?? Liang and Pan, 1995 SNX-482 – H. gigas 4495.06 Cav E classe Newcomb et al., 1998 VSTx1 Voltage sensor toxin 1 G. spatulata 3997.73 canal p/ K Ruta et al., 2003 v-GsTx SIA v-grammotoxin SIA G. spatulata 4110.74 tipo Cav N&P/Q Lampe et al., 1993 TxP1 Toxic protein 1 B. smithi 4399.38 ?? Kaiser et al., 1994 ESTx1 Eurypelma spider toxin E. californicum 4413.41 ?? Savel-Niemann, 1989 ESTx2 Eurypelma spider toxin E. californicum 4399.38 ?? Savel-Niemann, 1989 HwTxII (Gln) Huwentoxin-II S. huwenaa 4299.16 ?? Shu and Liang, 1999 HwTxII (Ileu) Huwentoxin-II S. huwenaa 4284.19 ?? Shu and Liang, 1999 LpTx1 Lasiotoxin 1 L. parahybana 5722.86 ?? Escoubas et al., 1997b LpTx2 Lasiotoxin 2 L. parahybana 5674.77 ?? Escoubas et al., 1997b

Fonte: P. Escoubas & L. Rash, 2004

8

1.3 Os canais Iônicos

As células excitáveis dos animais são capazes de, no estado celular de equilíbrio, alterar a

polaridade da membrana, gerando sinalizações elétricas rápidas, com participação ativa dos

canais iônicos. Esta atividade é vista em neurônios, células musculares e endócrinas, onde essa

resposta rápida é essencial para o funcionamento do sistema.

Os canais iônicos (FIG.3) são constituídos de glicoproteínas transmembrânicas,

seletivas a íons e estão ancorados na membrana plasmática. Estes canais possuem um poro onde

os íons atravessam um filtro seletivo, e um mecanismo de abertura de comportas, conhecido

como “gating”, onde ocorre a abertura e o fechamento dos canais em milissegundos, como

resposta aos estímulos elétricos/químicos ou mecânicos, mudança de voltagem, alteração da

concentração de ligantes como neurotransmissores, peptídeos e hormônios (HILLE, 1992). A

Figura 4 ilustra a estrutura geral esquemática, dos canais iônicos para sódio, cálcio e potássio.

A presença dos canais iônicos representa uma economia energética para as células. Sua

eficiência no controle do gradiente celular diminui gastos com a entrada e saída de milhões de

íons por segundo. Os canais são também substratos para processos biofísicos como a

transmissão sináptica, a contração muscular, o processamento de informações intracelulares e

atuam na produção e na liberação de substâncias celulares. Os principais canais iônicos são

classificados quanto à sua permeabilidade e seletividade a íons. Eles são divididos em quatro

grupos ou famílias envolvendo os seguintes íons: Na+ , Ca++ , Cl- e K+. Estes canais podem

responder diferentemente a diferentes voltagens e a ligantes externos ou internos.

Em geral, os canais apresentam dois estados, um aberto e outro fechado, mas alguns

canais podem possuir um estado inativo no qual o poro vai estar ocluso em uma região, mesmo

estando aberto. Esta abertura e o fechamento são diretamente controlados por fatores como

voltagem, modificações covalentes ou ação de fatores exógenos como toxinas e algumas drogas

que bloqueiam a ação do canal e podem ou não ser reversíveis. Assim, o estudo de toxinas

animais e o conhecimento específico das suas ações nesses canais e nos processos

eletrofisiológicos das células representam interesse primário na busca de possíveis modelos de

fármacos e do maior conhecimento estrutural e funcional do sistema nervoso, em nível

molecular.

9

Figura 3 - Estrutura básica dos canais iônicos. Estrutura esquemática para os canais para sódio e para cálcio,

voltagem-dependentes (Nav e Cav). A subunidade alfa, principal responsável pela função dos canais iônicos, forma

quatro domínios (I a IV), com seis segmentos, que atravessam a membrana. O segmento 4 (S4-representado em

verde), é o sensor de voltagem dos canais. À direita – representação esquemática de subunidades de canais para

potássio (Kv). Os canais para sódio e para cálcio possuem sub-unidades acessorias, não representadas aqui. Fonte:

Catterall, W.A. et al., 2007

externo

interno

Subunidade α

10

1.3.1 Canais para cálcio - breve introdução.

As células nervosas e musculares têm suas funções ligadas à entrada e saída de íons.

Dentre esses íons, o cálcio desempenha papel importante na liberação de neurotransmissores, na

expressão gênica, dentre outras. Estas ações são iniciadas a partir de canais para cálcio

dependentes de voltagem, que foram descritos primeiramente em células musculares de

crustáceos por Fatt e Katz (1953).

A importância dos canais para cálcio tem sido demonstrada em testes eletrofisiológicos,

neuroquímicos e neurofarmacológicos (HILLE, 1992). Sua classificação básica está diretamente

ligada ao tipo de corrente gerada para a despolarização da membrana, podendo existir correntes

de baixa voltagem (“Low Voltage Activated”- LVA) e correntes de alta voltagem (“High

Voltage Activated” - HVA). Estas correntes apresentam, respectivamente, condutância na faixa

de 5-9 pS e 13-24 pS. A partir dessas correntes e da ação nas diferentes células, os canais para

cálcio são classificados em cinco grupos:T, L, N, P/Q e R (NOWYCKY et al, 1985.;

CARBONE & LUX, 1984; MINTZ et al, 1992; BIRNBAUMER et al, 1994; HOFMANN et al,

1994; ERTEL et al, 2000).

Os canais tipo T utilizam correntes LVA e são denominados assim por serem transitórios

e de rápida inativação. Os demais utilizam correntes tipos HVA e apresentam-se com

despolarização de longa duração. Os canais tipo L (de “long lasting”) estão presentes em células

musculares esqueléticas e cardíacas e são sensíveis a drogas como 1,4 dihidropiridina (DHP). Os

canais tipo N (de “neuron”) são semelhantes aos tipo L, mas apresentam-se em neurônios, sendo

insensíveis a drogas do tipo DHP. Em células de Purkinje ocorre uma variação da corrente, em

sua maioria, chamada de P (de “Purkinge”). Esta corrente é bloqueada seletivamente pela toxina

peptídica da peçonha da aranha Agelenopsis aperta (ω-agatoxina IVA - ‘ω-Aga IVA’) em

concentrações < de 90 nM. Em concentrações maiores, esta toxina bloqueia também um

componente chamado Q. Assim estes canais foram classificados como canais P/Q. Em alguns

casos, existe uma corrente que não é bloqueada pelos inibidores dos canais citados acima, sendo

denominada de R (de “resistent”) pela sua resistência a tais drogas.

Além disso, os canais para cálcio (FIG. 3) vão ter variações decorrentes de suas

subunidades α e β, chamadas de sub-unidades acessórias e que modulam a ação destes canais,

estando entre os canais mais diversificados e heterogêneos, dentre os canais iônicos. A

subunidade α ou α1 é constituída por um poro condutor, pelo sensor de voltagem, pelo sistema

de regulação e pelos sítios de regulação do canal. Esta subunidade é típica para os canais iônicos,

contendo quatro domínios (I-V) subdivididos em seis segmentos transmembrânicos (S1-S6) com

11

uma alça entre os segmentos S5 e S6 (FIG.3). As subunidades β são subunidades

transmembrânicas ligadas por pontes dissulfeto à subunidade α entre os domínios I e II, podendo

variar em quatro subtipos (β1 – β4). Essa interação com a subunidade β gera ainda mais variação

e diversidade de ação dos canais para cálcio (PRAGNELL et al, 1994).

Atualmente, assim como para os demais íons, a nomenclatura utiliza o símbolo químico

do íon com um subscrito (Cav ), um indicador numérico correspondente à família da subunidade

α (1-3) e outro para a ordem da descoberta da subunidade dentro daquela família (1 em diante).

Exemplo, Cav 1.1 que corresponderia a uma corrente do tipo L contendo a subunidade α1S. Os

demais tipos estão representados na TABELA 2 .

12

Tabela 2- Nomenclatura das subunidades α1 de canais para cálcio, dependentes de voltagem clonados

Nome Nome inicial

Gene e Cromossoma humano

Tipos de canais

Nome inicial

Tecido primário

Cav 1.1, α11.1

α1S, α1S,

CaCh1 CACNA1S, 1q31-32

• músculo esquelético

Cav 1.2, α11.2

α1C, rbC, CaCh2

CACNA1C, 12q13.3

Cav 1.2a Cav 1.2b Cav 1.2c

α1C-a

α1C-b

α1C-b

• coração • músculo liso • adrenal,cérebro,

coração, pituitária Cav 1.3, α11.3

α1D, rbD, CaCh3

CACNA1D, 3q14.3

• cérebro, pâncreas, rim,ovário,coclea

Cav 1.4, α11.4

α1F CACNA1F, Xq11.23

• retina

Cav 2.1, α12.1

α1A, rbA, CaCh4, BI

CACNA1A, 19p13

Cav 2.1a Cav 2.1b

BI1 BI2

• cérebro, coclea, pituitária • cérebro, coclea, pituitária

Cav 2.2, α12.2

α1B, rbB, CaCh5, BIII

CACNA1A, 9q34

Cav 2.2a Cav 2.2b

α1B-1

α1B-2

• cérebro, sistema nervoso • cérebro, sistema nervoso

Cav 2.3, α12.3

α1E, rbE, CaCh6, BII

CACNA1E, 1q25-31

Cav 2.3ª Cav 2.3b

• cérebro, coclea, retina, coração, pituitária

• cérebro, coclea, retina Cav 3.1, α13.1

α1G CACNA1G, 17q22

Cav 3.1a

• cérebro, sistema nervoso

Cav 3.2, α13.2

α1H CACNA1H, 16p13.3

Cav 3.2a

• cérebro, coração, rim, fígado

Cav 3.3, α13.3

α1I CACNA1I, 22q12,3-13-2

Cav 3.3a

• cérebro

Fonte: Ertel et al, 2000

13

1.4 Células do gânglio dorsal

As células DRG (“dorsal root ganglion”) são células que apresentam uma diversidade de

canais iônicos. Dentre esses, os canais para cálcio são bem representados nestas células.

Em células DRG cardíacas foram encontradas e testadas correntes do tipo L, N, P/Q e R

(ROLA, et al., 2003) o que demonstra a ampla variedade de canais para cálcio existentes nestas

células. Neurotoxinas como ω-CgTx GVIA, ω –CgTx MVII C (Omega conotoxinas de moluscos

do gênero Conus) e ω -Aga IVA (toxina da aranha Agelonopsis aperta) bloqueiam, em

vertebrados, com especificidade, correntes para cálcio do tipo N, Q, e P, respectivamente

(DUNLAP et al. 1995; MILJANICH e RAMACHANDRAN, 1995; OLIVERA et al.1994,

WICHER e PENZLIN, 1997).

Nos insetos, em células DRG de gânglios nervosos, são encontrados canais para cálcio

com correntes T, L e N, com propriedades diferentes daquelas dos vertebrados, além das

correntes P/Q (WICHER e PENZLIN, 1997).

14

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Este trabalho teve como objetivo iniciar a caracterização estrutural, bioquímica e

farmacológica da peçonha da aranha caranguejeira Achantoscurria natalensis.

2.2 Objetivos específicos

Purificar e caracterizar bioquímica- e farmacologicamente, pelo menos uma

toxina desta peçonha.

; (este objetivo esta sem sentido...)

Verificar o perfil protéico da peçonha A. natalensis expressanda por por técnicas

cromatográficas e de eletroforese uni- e bi-dimensional;

Testar a atividade insetotóxica da peçonha e da(s) toxina(s) isolada(s).

Analisar a atividade biológica da(s) toxina(s) isolada(s), por estudos

eletrofisiológicos.

Caracterizar estrutural e parcialmente, as massas moleculares e as seqüências N-

terminais das toxinas purificadas;

Comparar as seqüências obtidas com outras, depositadas em bancos de dados;

buscando-se possíveis homologias.

15

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta e manutenção A. natalensis

As aranhas caranguejeiras A. natalensis foram coletadas na cidade de Feira de Santana e

foram mantidas em cativeiro sob controle de humidade e temperatura no Laboratório de Animais

Peçonhentos e Herpetologia (LAPH-UEFS), com alimentação realizada de 15 em 15 dias.

3.2 Identificação da A. natalensis

A identificação dos espécimes A. natalensis foi realizada por nós. Posteriormente exemplares

destes espécimes foram enviados para o Dr. Antônio Brescovit, do Instituto Butantan (IB-São

Paulo) que confirmou nossa identificação.

3.3 Extração da peçonha de A. natalensis

A peçonha da aranha foi coletada com o uso de micropipetas, após a estimulação das

quelíceras com choque elétrico (9V) (FIG.4). A peçonha foi armazenada em tubos Falcon de

50 mL contendo 30 mL de solução aquosa de TFA 0,1% (v/v). Esta suspensão foi centrifugada a

10000 RPM, durante 10 minutos (centrifuga Eppendorf 5804-R). O sobrenadante foi coletado,

liofilizado e armazenado a - 4ºC.

16

Figura 4- Extração da peçonha da Acanthoscurria natalensis utilizando-se micropipetas, após a estimulação das

quelíceras com choque elétrico (9V).

17

3.4 Dosagem da concentração de proteína

A dosagem de proteína foi realizada em um espectrofotômetro Shimadzu UV-160 A . A

absorbância foi medida nos comprimentos de onda ( λ) = 280 e 260. A partir destas leituras

utilizou-se a estimativa: x mg/mL de proteína = 1,55.A280 – 0,76.A260 (WALKER, J. M,

2002).

3.5 Fracionamento do peçonha de Acanthoscurria natalensis

3.5.1- Cromatografia de troca catiônica-CIEX

A separação parcial dos componentes da peçonha de A. natalensis (machos e fêmeas) foi

realizada no Laboratório de Enzimologia e Físicoquímica de Proteínas (UFMG) e no

Laboratório de Venenos e Toxinas Animais - LVTA (UFMG). Foram utilizados 2,0 mL da

solução de peçonha bruta, solubilizada em água deionizada.

As análises cromatográfias foram realizadas nos sistema do ÄKTA Explorer 100 HPLC

system (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), controlado pelo software UNICORN 4.11 e

equipado com coletor automático de frações Frac920 (Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden).

Alternativamente, foi utilizado o sistema SHIMADZU-10 A, com coleta manual de frações. A

eluição foi monitorada através da absorbância de luz ultravioleta (λ = 214 e 280 nm, no sistema

ÄKTA Explorer 100 e λ = 214 no sistema SHIMADZU-10 A).

A peçonha foi centrifugada a 10000 RPM, (micro-centrifuga Hettich- Mikro 200R). O

sobrenadante foi aplicado em uma coluna de troca catiônica TSK-Gel CM-SW 15 cm X 4.6 mm

(Tosoh Biosep, Montgomeryvile, USA), equilibrada com acetato de sódio (50 mmol.L-1 , pH 5)

e fluxo de 0,75 mL/min . O sistema foi eluído com um gradiente linear de NaCl 1M, pH 5 em

acetato de sódio (50 mmol.L-1 ), durante 123 minutos.

3.5.2 – Cromatografia de fase reversa

Após a cromatografia de troca catiônica eram feitos “pools” dos picos.

1 mL de cada destas frações eram eram aplicados em uma coluna de fase reversa SourceTM 15

4,6/100 (Pharmacia Biotech, Uppsala,Sweeden). A coluna era previamente equilibrada com uma

18

solução aquosa de 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético com um fluxo de 1,0 mL/min e com

eluição em gradiente linear (0–100%) de acetonitrila durante 50 minutos.

3.6 Eletroforese Unidimensional em poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) em duas

etapas:

(i) A peçonha foi solubilizada em uma solução aquosa de TFA 0,1% (v/v), 30 µL desta

solução foram acrescentados a 30 µL do tampão da amostra (2 mL de SDS à 10%, 500 µL de 2-

mercaptoetanol, 2 mL de glicerol, 400 µL de azul de bromofenol à 2%, 2,5 mL de Tris-HCl-0,5

M-pH 6,8, e 10 mL de água destilada e deionizada). Essa solução era aquecida à 80ºC por 10

minutos. O gel teve como padrão molecular o kit SIGMA M0671(“Recombinant Molecular

Weight Marker”) de 15, 25, 35, 50, 75, 100 e 150 kDa. Previamente, os géis de corrida e de

concentração foram montados como: I-Gel de corrida à 15%; II- Gel de concentração à 5% (

FORMULAÇÃO EM ANEXO). O tempo de corrida foi cerca de 2:30 à 3h, voltagem de 110V.

Após a corrida o gel foi submetido à coloração com prata, sendo este procedimento realizado

conforme descrito (WEBER & OSBORN, 1969; LAEMMLI, 1970).

(ii) A fração contendo 30 µL a toxina (AnTx1) originada na cromatografia de fase reversa,

contendo TFA-H2O (1%) e ACN (cerca de 35%) foi adicionada a 30 µL do tampão da amostra

(2 mL de SDS à 10%, 500 µL de 2-mercaptoetanol, 2 mL de glicerol, 400 µL de azul de

bromofenol à 2%, 2,5 mL de Tris-HCl-0,5 M-pH 6,8, e 10 mL de água destilada e deionizada).

Essa solução era aquecida à 80ºC por 10 minutos. O gel teve como padrão molecular o kit da

SIGMA M0671 (“Recombinant Molecular Weight Marker”) (M.W. 15, 25, 35, 50, 75, 100 e

150 kDa). Previamente, os géis de corrida e de concentração foram montados como: I-Gel de

corrida à 15%; II- Gel de concentração à 5% ( FORMULAÇÃO EM ANEXO). O tempo de

corrida foi cerca de 2:30 à 3h, voltagem de 110V. Após a corrida o gel foi submetido à

coloração com prata. Este procedimento foi realizado conforme já descrito (Weber & Osborn,

1969; Laemmli, 1970).

19

3.7 Eletroforese em gel bidimensional (2D-PAGE)

As peçonhas de fêmeas (50 microgramos de peçonha) foram diluídas com o tampão para

a primeira dimensão da isoeletro-focalização acrescidas de DTT (10 mg/mL) em um volume

total de 250 µL, com agitação por 1 hora e centrifugação por 30 minutos (10.000 RPM,

centrifuga Hettich- Mikro 200R). O sobrenadante foi aplicado no suporte da “strip” e coberto

com a “strip” de 13 cm deixando hidratar por 12 horas. Após a hidratação as “strips” foram

levadas para a eletro-focalização no Ettan IPGphor II, por 15 horas, com programação previa

para “strips” de 13 cm, de acordo com instruções do fabricante, sendo retiradas e congeladas em

seguida. Posteriormente, as “strips” foram levadas à segunda dimensão do gel passando por um

gel de poliacrilamida de 18 cm, com concentração de 12 %, com glicerol a 5 % com corrida a

150 V por 14 horas. Em seguida, o gel foi corado com Comassie Blue G-250 a 2 % por 24 horas

(O’FARRELL, 1975).

3.8 Bioensaios em insetos, com a peçonha bruta e toxinas.

3.8.1 Testes de toxicidade em insetos.

Para testar a atividade biológica da peçonha da Acanthoscurria natalensis em insetos

foram utilizadas moscas domésticas (Musca domestica). As moscas utilizadas, provenientes do

Ranário Vivendas da Rainha-Ribeirão das Neves (MG) foram mantidas no insetário do

Laboratório de Venenos e Toxinas Animais, Departamento de Bioquímica e Imunologia,

UFMG, durante várias gerações até sua utilização.

As moscas, pesando em média 20 mg cada, com 3 a 4 dias de vida, foram anestesiadas

pelo abaixamento da temperatura corporal. Elas foram colocadas em tubos Falcon de 50 mL

tampados e inseridos em um recipiente contendo banho de gelo com temperatura em torno de

4ºC, por cerca de 2-3 minutos. As injeções foram preparadas utilizando-se um controle com

solução salina (0,9 % p/v de NaCl) contendo 0,1 % (p/v) de BSA. As amostras eram diluídas na

solução controle e continham diferentes concentrações da peçonha bruta, ou da toxina. As

amostras foram injetadas via-intratoráxica (FIGUEIREDO et al. ,1995) entre os dois primeiros

pares de patas. Em cada concentração utilizaram-se dez moscas (n=10), o volume das injeções

foi de 0,5 µL/ mosca.

20

As amostras foram injetadas utilizando-se uma seringa Hamilton®contendo na

extremidade um tubo capilar de vidro (FIG.5) estirado (a quente) para o afinamento da ponta.

Após as injeções as moscas foram acondicionadas em recipientes plásticos, tampados com furos

para ventilação, limpos, contendo solução aquosa de sacarose (5 %), abrigados de outros insetos.

Foram feitas observações do comportamento (paralisia, agitação, vôo e demais atividades) nas

primeiras horas, 24 hs e 48 hs após as injeções. Este ensaio foi repetido por três vezes, pelo

menos.

21

Figura 5- Fotografia mostrando a aplicação de amostra (controle, peçonha ou toxina) em moscas (Musca

domestica) utilizando-se seringa Hamilton® com capacidade de 1mL. Observe o tubo capilar (estirado) inserido na

ponta da agulha e utilizado para inserção no abdome da mosca.

22

3.8.2 Testes eletrofisiológicos da AnTxI em canais para Ca2+

Para verificar os possíveis efeitos da toxina AnTxI em canais para cálcio foram utilizadas

células DGR (“Dorsal glanglion root”) do gânglio dorsal de ratos, provindas do Laboratório de

Membranas Excitáveis no Instituto de Ciências Biológicas (ICB-UFMG).

3.8.3 Cultura celular de células DRG do gânglio dorsal de ratos

Animais

Ratos Wistar (Rattus novergicus), machos, pesando entre 90-150 g, foram sacrificados

por decapitação, utilizando-se uma guilhotina. Para cada cultura foram utilizados dois ratos,

separadamente.

Cultura Celular

Os gânglios DRG, de onde emanam as raízes do nervo isquiático na medula espinhal:

região lombar (L4 e L5) e sacral (S1) foram dissecados, removidos cirurgicamente e transferidos

imediatamente para dois tubos Falcon de 15 mL, contendo, em separado, 4 mL de solução

fisiológica de Hank (Hank’s Balanced Salt Solution- HBSS) sem adição de Ca2+ e Mg2+ (Hank’s

Modificada), gelada, acrescida de 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina (Sigma, St. Louis,

Mo, USA). Os gânglios foram lavados com a mesma solução de Hank Modificada, gelada, num

total de quatro repetições para cada tubo Falcon.

Os gânglios foram transferidos para tubos Falcon contendo 5 mL de meio DMEM com

alta glicose (Sigma, St. Louis, Mo, USA), acrescido de 1% de antibiótico

penicilina/estreptomicina, contendo 1 mg/mL de enzima colagenase (Tipo 1) (Sigma, St. Louis,

Mo, USA). Esta suspensão foi incubada por 75 min, a 37°C, em banho-maria. Ao final do

período, os gânglios foram lavados com meio DMEM alta glicose acrescido de 1% de

antibiótico penicilina/estreptomicina, num total de três repetições.

Posteriormente, os gânglios foram incubados com uma solução contendo 0,25% (p/v) de

tripsina (Sigma, St. Louis, Mo, USA) e 0,025% de EDTA (Ecibra, Sto Amaro/SP, Brasil) em

HBSS sem Ca2+ e Mg2+, por um período de 15 minutos, a 37°C, em banho-maria. Após o

período de incubação, os tubos foram lavados com 5 mL de meio DMEM alta glicose acrescido

de 1% de antibiótico penicilina/estreptomicina com de 10% de soro fetal bovino (SBF-Cultilab,

Brasil) – DMEM completo, para inativação enzimática, num total de três lavagens.

23

Os gânglios foram então cuidadosamente triturados com uma pipeta Pasteur de vidro em

1,5 mL de meio DMEM para induzir a dissociação mecânica do tecido. O diâmetro da ponta da

pipeta correspondia a dois terços do diâmetro dos gânglios.

As células dissociadas e em suspensão foram colocadas em lamínulas de vidro (20 x 20

mm) (Corning, México) (200 µL) pré-recobertas (período mínimo de 24 horas) com 200 µL por

lamínula poli-L-lisina (60µg/mL) (Sigma, St. Louis, Mo, USA). O excesso de poli-L-lisina foi

removido das lamínulas antes das células serem plaqueadas na placas de Petri. As lamínulas com

as células aderidas foram introduzidas em placas de Petri (35 x 10 mm) (Sarstedt, Newton,

USA), as células foram mantidas a 37 °C em uma atmosfera humidificada a 100% e aerada a

95% O2 e 5% CO2 durante um período de 120 minutos. Posteriormente, foram acrescentados 2

mL de meio DMEM em cada placa de Petri.

Experimentos de “ PATCH-CLAMP”

Os experimentos eletrofisiológicos foram realizados num período de 6 a 12 horas após o

término da cultura. Para os experimentos de “whole-cell patch-clamp”, cada lamínula foi

dividida em quatro partes, por uma caneta com a ponta de diamante. Este experimento teve o

objetivo de medir as correntes provocadas pelos íons cálcio nas células DRG. As correntes de

cálcio foram medidas por meio da técnica de “patch-clamp”, na configuração “voltage-clamp,

whole-cell” em células DRG à temperatura ambiente (25ºC). Os experimentos foram executados

em um microscópio, no qual foi acoplado um sistema de micromanipulação sob uma mesa

antivibratória no Laboratório de Membranas Excitáveis e Eletrofisiologia do Instituto de

Ciências Biológicas (ICB-UFMG). Foram utilizadas três soluções fisiológicas na preparação de

“patch-clamp” denominada solução interna de pipeta (SI), solução externa I ou solução de

Tyrode (SE1) e solução externa II ou solução externa para isolar a corrente total de Ca2+ (SE2) .

As lamínulas com as células foram lavadas com a solução externa I e as células

permaneciam incubadas nesta solução durante a etapa inicial do registro eletrofisiológico à

temperatura ambiente.

As pipetas foram confeccionadas a partir de capilares de vidro a fim de obter-se

resistências na ordem de 1,5 – 2,5 µΩ. As pipetas então eram cuidadosamente preenchidas com a

solução interna. As lamínulas foram focalizadas no microscópio e uma célula alvo, ou neurônio

do tipo fibra C (fibra C- fibra nervosa, nociceptiva, com diâmetro entre 20 à 30 µM) foi

escolhida e posicionada em frente à microperfusão.

24

O sistema de microperfusão, formado por um solenóide e um capilar de perfusão,

permitiu expor a célula a dois tipos de soluções (controle, SE2) e a experimental contendo a

toxina (100 nM) diluída na solução externa II. A perfusão manteve as células totalmente

banhadas pelas soluções com 35 µL (controle ou experimental) enquanto as leituras das

correntes eram obtidas.

Um amplificador HEKA EPC-9 acoplado a um microcomputador Mac PowerPC realizou

a monitoração das correntes iônicas em tempo real correspondentes aos protocolos aplicados,

com seqüência de pulsos de voltagem disparados em ordem temporal definida. A configuração

“whole cell” era obtida no momento em que a membrana se rompia e ocorria a difusão da S1

para dentro da célula, permitindo o registro das correntes iônicas totais para o cálcio e a sua

estabilidade com as soluções.

Na configuração “whole cell”, um pulso teste de voltagem foi aplicado para se verificar a

corrente total na célula. Esse procedimento inicialmente mantinha as células em um potencial de

-80 mV (potencial de holding), injetando em seguida um pré-pulso hiperpolarizante de -120 mV,

com duração de 1s, de modo a requisitar o maior número possível de canais de cálcio no estado

fechado. Um potencial despolarizante era então aplicado para +50 mV, com duração de 1s,

potencial no qual a probabilidade de abertura dos canais para cálcio é maior e o traçado obtido

refletia a abertura desses canais nas células DRG.

A solução contendo a toxina só foi liberada quando o pulso ou registro se estabilizou. O

traçado em tempo real visualizado não podia mostrar alterações significativas enquanto a célula

estivesse exposta à solução externa (SE1).

3.9 Espectrometria de Massa

3.9.1 Analise da peçonha isolada por ESI-Q-TOF-MS

As análises por espectrometria de massa foram realizadas em um aparelho Q-ToF Micro TM (Micromass, Grã Bretanha), pertencente ao Laboratório de Biomoléculas no ICB/UFMG. O

aparelho está equipado com fonte de ionização electrospray operada em modo positivo. A

voltagem do capilar foi estabelecida em 3-3,5kV e as voltagens sample cones foram 30-40 V. A

calibração do espectrômetro de massa foi feita com NaI, com janela de 1000 a 20000 m/z. As

amostras foram diluídas em acetonitrila 50%/TFA 0,1%/água deionisada/destilada e introduzidas

no aparelho utilizando-se uma bomba de seringa com fluxo entre 5-10µL/min. Os dados obtidos

foram analisados utilizando-se o programa MassLynx® 4.0.

25

3.9.2 Analise da peçonha por MALDI-TOF/TOF-MS

As análises de MALDI-TOF/TOF MS (matrix assisted laser desorpotion/ionization time

of flight tandem time of flight mass spectrometry) foram realizados em um aparelho Autoflex III

(Bruker Daltonics, Alemanha), pertencente ao Laboratório de Biomoléculas no ICB/UFMG,

com o controle através do programa FelxControl 2.4.30.0 (Bruker Daltonics, Alemanha). Cada

amostra foi misturada em uma solução com 5 mg ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, 200 µL de

água destilada, 250 µL de acetonitrila (ACN) e 50 µL de TFA a 3%(v/v) na proporção de 1 da

amostra para 3 partes da solução e inserida com micropipetas (0,5 µL) em uma placa de amostra

(MTP Anchorchip 600/384). A calibração do aparelho foi feita com padrões externos (Protein

Calibration Standard I, Bruker Daltonics, Alemanha). Os espectros foram obtidos em modo

positivo/refletido, com a freqüência do laser justada em 50 Hz. Na fragmentação de peptídeos

foram empregados CID (Collision Induced Dissociation) (N2) e LID (Laser Induced

Decomposition). Os dados obtidos foram analisados através do programa flexAnalysis 2.4

(Bruker Daltonics, Alemanha) e com o programa PepSeq (Micromass, Grã - Bretanha).

3.9.2.1 Preparação e proteólise das amostras

As amostras foram diluídas em 20 µL de tampão NH4HCO3 (0,4M) contendo uréia (8M),

posteriormente adicionaram-se 5 µL de DTT- 45 mM (Di-tio-treitol) e procedeu-se a incubação

a 50ºC, por 15 minutos. Após resfriamento adicionaram-se 5 µL de iodoacetamina (100mM) e

seguiu-se incubação durante 15 minutos, ao abrigo da luz para não degradar o iodoacetamina.

Em seguida, as amostras receberam 130 µL de água deionisada e seus conteúdos foram

aliquotados em dois grupos de 80µL. Na primeira alíquota acrescentou-se 0,8 mL de tripsina e

na outra alíquota adicionou-se 1,2 mL da protease V8. As alíquotas foram incubadas a 37ºC

durante 24 h., posteriormente foram dessalinizadas através de micropurificação em ZipTips®

C18 (Millipore-Bedford, E.U.A.). A micropurificação ocorreu com a preparação do ZipTips®

C18 passando três vezes com 8 µL de acetonitrila (ACN) desprezando-se a acetonitrila após essa

preparação. As amostras foram lavadas por três vezes com TFA 0,1% e em seguida o conteúdo

foi lavado em solução aquosa de 50% (v/v) de ACN em solução aquosa de 0,1% (v/v) de TFA

por dez vezes. Feito isso, as amostras foram submetidas à análise por MALDI-TOF/TOF.

26

3.10 Determinação da sequência n-terminal das toxinas AnTxI E AnTxII

Foi utilizado um seqüenciador automático de proteínas, Shimadzu PSSQ-21A para o

seqüenciamento através da degradação de Edman. Em uma solução de 0,1:0,5:0,5

TFA:H2O:ACN foram colocadas 50 µL da amostra, essa mistura foi aplicada sobre um disco de

fibra de vidro contendo o polímero SEQUA-BRENE (Sigma), previamente tratado com

procedimentos padronizados do equipamento PSSQ-21A. A derivação foi feita com solução de

fenilisotiocianato em n-heptano a 5% com solução de ácido trifluoroácético e trimetilamina a

12%. A derivação foi seguida de uma etapa de conversão do intermediário tiazolina em PTH-

aminoácido por solução aquosa de ácido trifluoroacético a 25%. A separação dos PTH-

aminoácidos ocorreu em uma coluna de fase reversa (WAKOSIL-PTH 25 cm x 4,6 mm, Wako,

Japão) com a eluição conduzida em condição isocrática por solução denominada de “PTH-AA

mobile Phase” (Wako, Japão). Os tempos de retenção dos PTG-aminoácidos obtidos foram

comparados com padrões.

27

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Eletroforese unidimensional em poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e Eletroforese

em gel bidimensional (2D-PAGE)

A análise eletroforética do gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) da peçonha da A.

natalensis (FIG. 6) demonstra a presença de pelo menos sete bandas visualizadas nos géis. A

canelata (A) está representada pelos padrões de massa molecular. Na canaleta (B) observa-se o

perfil da peçonha com bandas de massas moleculares diversas: abaixo de 15 kDa, uma banda em

torno de 35 kDa, outras acima de 50kDa até 150 kDa, demonstrando a variedade de

componentes presentes na peçonha analisada. Chama atenção a existência de várias bandas nas

faixas de mais altas massas moleculares. De modo geral, nas peçonhas de aranhas, predominam

os peptídeos, em detrimento de proteínas com mais altas massas moleculares. Montandon (2007)

trabalhando com a peçonha de Grammmostola iheringi, aranha caranguejeira da região do Sul

do Brasil, mostrou perfil eletroforético com certas semelhanças ao encontrado na peçonha de A.

natalensis, por exemplo, uma quantidade maior de bandas moleculares abaixo de 15 kDa.

Herzig et al, 2004 e Ricardson et al, 2006, verificaram a presença de massas moleculares abaixo

de 15 kDa e acima de 50kDa para peçonha do gênero Phoneutria. Pretel et al, 2005 obtiveram

resultados semelhantes para a peçonha de Loxosceles sp. Estes dados, em certa medida

confirmam um padrão já característico de massas moleculares, encontrados nas peçonhas de

aranha.

Na canaleta (C) observa-se que a toxina AnTx1 migrou como uma grande banda

espalhada. Isto se deve, provavelmente, à quantidade relativamente grande de toxina aplicada ,

cerca de 30 microgramas.. Há poucos trabalhos relacionados com peçonhas de aranhas da

família Theraphosidae. Como exemplo podemos citar os trabalhos realizados por Kalapothakis

et al, 2003, com a peçonha de Lasiodora sp., onde verificou-se os efeitos desta em corações

isolados de ratos.

Apesar de que, relativamente poucas bandas terem sido encontradas, deve-se considerar

que em muitos casos a eletroforese uni-dimensional não separa moléculas diferentes mas que

têm a mesma massa molecular. Buscando-se esclarecer esta questão utilizou-se também a

eletroforese bi-dimensional.

As peçonhas de A. natalensis (fêmeas e machos) quando resolvidas em um gel (2D-

PAGE) não demonstraram deferenças aparentes entre os sexos. Um experimento representativo

destes resultados é observado para o gel 2D com a peçonha de fêmeas da A. natalensis (FIG.7)

28

Este gel foi escolhido por mostrar melhor resolução no momento de coloração. Neste gel

verifica-se uma gama de componentes protéicos de diferentes PI´s. Isto comprova que no gel

unidimensional uma mesma banda pode congregar diferentes componentes, que são separados

quando submetidos ao gel bidimensional. Embora não tivéssemos a oportunidade de explorar

mais os diferentes “spots”, este experimento foi importante no sentido de mostrar claramente, a

diversidade de componentes da peçonha. Ricardson et al, 2006 analisaram três peçonhas de

espécies do gênero Phoneutria por 2D-PAGE, determinando uma média de 80 spots,

caracterizados como proteínas de massa molecular abaixo de 12 kDa e alguns peptídeos com

massa em torno de 4kDa.

Apesar do presente experimento (gel 2D-PAGE) ter sido realizado uma única vez para cada

peçonha (macho e fêmea) e apesar dos padrões de massas moleculares apresentarem-se

irregulares na migração, dificultando a avaliação das massas moleculares que constituem a

peçonha, nossos resultados mostram um maior agrupamento de compostos com PIs

intermediários, e com massas molecular acima de 55kDa para as peçonhas de ambos os sexos de

A. natalensis. Infelizmente, no presente estágio deste trabalho não foi possível avaliar-se as

massas dos “spots”, por espectrometria de massas. O que se faz é a digestão enzimática dos

“spots” no gel, posterior coleta dos fragmentos protéicos e análise das massas por

espectrometria de massas.

29

Figura 6 – Perfil eletroforético do gel de poliacrilamida 15%(SDS-PAGE), da peçonha de A. natalensis e da toxina

isolada (AnTxI –Massa molecular de 5374 Da.). (A) Padrão de massas moleculares - kit da SIGMA “Recombinant

Molecular Weight Marker”SIGMA M0671 -(M.W. 15, 25, 35, 50, 75, 100 e 150 kDa- ”); (B) Peçonha da aranha

A.natalensis ; (C) Toxina (AnTxI). Cada amostra aplicada continha 30 µg da peçonha e da toxina.

PadrãoMassa Molecular

15 kDa

25 kDa

35 kDa

50 kDa

75 kDa100 kDa150 kDa

BA

30

Figura 7- Perfil eletroforético do gel bidimensional da peçonha de fêmeas de A. natalensis (50 microgramas). Os padrões moleculares foram: miosina (200 kDa), beta-galactosidase (116,3 kDa), Fosfolipase B (97,4 kDa), BSA (66,3 kDa), glutamato desidrogenase (55,4 kDa), lactato desidrogenase (36,5kDa), amidrase carbônica (31,0 kDa),inibidor de tripsina (21,5 kDa), lisozima (14,4 kDa), aprotinina (6,0 kDa), cadeia β da insulina (3,5 kDa), cadeia α da insulina ( 2,5 kDa)

PI

MW

Padrão

31

4.2 Cromatografia da peçonha de A. natalensis

A cromatografia foi realizada em duas etapas: cromatografia em troca catiônica e em fase

reversa foram escolhidas visando-se a obtenção da melhor resolução dos componentes da

peçonha de machos e de fêmeas de A. natalensis. A análise das duas peçonhas (machos e

fêmeas) por cromatografia de troca catiônica (CIEX) resultou na coleta de 32 picos para ambos

os sexos. O perfil cromatográfico demonstra que as peçonhas dos machos apresentaram uma

maior área e maior altura nas frações compreendidas entre os picos 04 e 12 (FIG.8). Todas as

frações coletadas (machos e fêmeas) foram re-fracionadas na segunda fase através de

cromatografia de fase reversa (CLAE-FR). A grande maioria das frações resultantes da fase

reversa das duas peçonhas de A. natalensis (machos e fêmeas) demonstram baixa

hidrofobicidade, eluindo-se no inicio da corrida, entre 9 a 10ml do tampão de eluição (FIG. 9).

Em ambas as peçonhas (de machos e fêmeas) dois picos eluíram com 60ml de tampão de corrida

(FIG.9). Estes picos foram eluídos com maior grau de pureza (FIG.10). Como pode-se

perceber, apesar das poucas bandas apresentadas na eletroforese unidimensional a peçonha

apresenta uma grande quantidade de compostos, o que concorda com os resultados da

eletroforese 2D.

32

A

B

0 40 80 120

ABS

214

0

ABS

214

0

100

100

mL

%

%

Figura 8 – A CIEX foi desenvolvida em uma coluna TSK-Gel CM-SW 15cm x 4.6 mm(Tosoh Biosep) equilibrada

com 50mmol.L-1 de acetato de sódio pH 5, e fluxo de 0,75mL/min e gradiente linear de 0 a 1.0 mol/L de NaCl (1M-

pH 5) durante 123 minutos. Monitorado pela absorbância à 214 e 280nm, apresentando 32 picos demonstrando a

semelhança entre as Peçonhas. A linha vermelha representa a leitura da absorbância a 280 nm, a linha azul a

absorbância a 214 nm, a linha verde a concentração de NaCl e a marrom a condutância.

33

Fra

çõe

s d

a C

IEX

Figura 9 – Perfil cromatográfico por CLAE-FR das frações de CIEX obtidas da peçonha da Acanthoscurria

natalensis. As frações obtidas na etapa de CIEX foram aplicadas à coluna de fase reversa( Source TM 15 4.6/100),

previamente equilibrada com TFA/H2O (eluente A). A eluição teve um gradiente linear (0 -100%) de TFA/ACN

(eluente B). Fluxo; 1mL/min monitorada por leitura a 214nm.

mL

34

14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 360

100

200

300

400

500

600

700

Eluição (mL)

Abs

214

nm

(m

AU

)

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Gra

dien

te (

%B

)

Figura 10 - Perfil cromatográfico da toxina isolada AnTxI da A. natalensis em CLAE-FR. Aplicou-se 1mL da

fração 12 (vide figura anterior) onde foi encontrada a toxina, em uma coluna Source TM 15 4.6/100 (Pharmacia

Biotech, Uppsala, Sweeden) equilibrada com TFA 0,1%(solução A), eluída em um gradiente linear com

acetonitrila/TFA 0,1% (solução B) durante 50 minutos, e monitorado pela absorbância à A214.

35

4.3 Análise por Espectrometria de Massas

As frações re-purificadas da peçonha de A. natalensis (machos e fêmeas) pela

cromatografia de fase reversa, foram submetidas à análise por espectrometria de massa

(MALDI-TOF/TOF MS). Para todos os picos que apresentaram baixa hidrofobicidade não foi

possível detectar as massas moleculares correspondentes, por espectrometria de massa. Por outro

lado, para os dois picos eluídos mais tardiamente, as massas moleculares detectadas foram de

5374 Da e 6763 Da, para as duas peçonhas (machos e fêmeas). O grau de pureza das duas

toxinas foi verificado utilizando-se (MALDI-TOF/TOF MS) (FIG. 11), e pelo electrospray –

(ESI-Q-ToF) (dados não mostrados). As toxinas foram denominamos de AnTxI e AnTxII,

respectivamente, fazendo-se referência ao nome da espécie Acanthoscurria natalensis.

Entendemos que se faz necessário averiguar posteriormente, a razão pela qual os vários

componentes que apresentaram baixa hidrofobicidade aparentemente não foram ionizados

durante a análise de massas, não sendo assim detectados. Escoubas et al, 2006, trabalhando com

aranha Atrax rubustos, ordem Mygalomorphae que habitam a região da Austrália, obtiveram

toxinas com massa moleculares próximas às encontradas na peçonha de A. Natalensis. Estes

dados vêm reforçar mais uma vez, que o perfil da massa molecular das peçonhas de aranhas se

mantém com grande semelhança entre as Mygalomorphae.

36

Figura 11- Espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF MS) do peptídeos AnTxI e AnTxII isolados da

peçonha da A. natalensis .

ANTxI

ANTxII

5374 Da

6763 Da

37

4.4 Determinação da seqüência N-terminal do peptídio AnTxI

O peptídeo AnTxI foi clivado com tripsina e com V8 e os produtos resultantes foram

submetidos ao seqüenciamento pelo MALDI-TOF/TOF MS. O N-terminal de AnTxI foi

também seqüenciado pela técnica de degradação de Edman (TABELA 3 ). Após a determinação

da massa molecular (5374 Da), por espectrometria de massas, o peptídeo AnTxI foi seqüenciado

parcialmente, e apresentou os seguintes resíduos de aminoácidos:

IIECFFSCEIEKDGKSKEGKPCKPKG .

Este peptídeo teve sua seqüência comparada com outras depositadas em um banco de

dados (BLAST-P). Os resultados estão expressos na tabela 3, onde verifica-se que as

huwentoxinas (LIANG et al., 1993), toxinas encontradas na peçonha de certas aranhas chinesas,

Selenocosmia huwena foram os peptídeos que apresentaram similaridade de seqüência com a

AnTxI. . A toxina AnTxI teve sua sequência N-terminal similar com neurotoxinas como a

Huwentoxina-2 (HWTxII), ESTx1, ao TxP1 e o precursor das Toxina LTx2, HwTx II, HwTx-

VII . A toxina AnTxII apresentou sequência com similaridade às toxinas magi-15, a OcF32-8, e

à Phospholipase A2 (DIAO et al 2003; SHU & LIANG 1999; SAVEL-NIEMANN 1989;

VIEIRA et al. 2004; KAISER et al 1994; TSAI et al,2000; SATAKEA et al, 2004).

As toxinas Huwentoxina-2 e magi-15 apresentam ação paralisante reversível 6h após a

sua aplicação em insetos. A toxina LTx2, presente na peçonha das Lasiodoras sp (VIEIRA,A.L.,

et al. 2004), apresenta ação inibitória nos canais para cálcio e modulação dos canais para sódio.

Estas propriedades também foram observadas para a toxina estudada no presente trabalho (ver

adiante).

Pela comparação citada acima, as possíveis ações para AnTxI poderiam ser : i) inseticida;

ii) ação bloqueadora em canais para cálcio e/ou sódio, iii) aglutinação de lectina, iv) inibidor de

tripsina e v) paralisante, devido a ações no sistema nervoso central. Com tais informações,

iniciaram-se os testes biológicos “in vivo” em animais e `in vitro`em células, buscando-se

verificar as ações da peçonha e das toxinas isoladas.

38

Tabela 3- Alinhamento dos (cinco) fragmentos das toxinas isoladas (AnTxI e AnTxII) com toxinas

homólogas, depositadas em banco de dados ( BLAST-p)

proteína alinhamento Ação referência

AnTxI-Fragmento tripsina LLECFFSCELEK

Huwentoxin-2 form 1 precursor (HwTx-II) LFECSFSCEIEK Diao,J., et al,2003 Huwentoxin-7 precursor (HwTx-VII)

LFECSFSCEIEK

Diao,J., et al,2003 Huwentoxin-2 forma 2(HwTx-II)

LFECSFSCEQEK

Shu,Q. and Liang,S.P.,1999

AnTxI-N-terminal

IIECFFSCEIEKDGKSKEGKPCKPKG

Neurotoxina ESTx1

IFECVFSCDIE -----KEGKPCKPKG Savel-Niemann,A.1989 Toxina LTx2 precursor

ECTFECDI----K -KEGKPCKPKG

Vieira,A.L., et al. 2004 Veneno protein 1 (TXP1) IFECVFSCDIE -----KEGKPCKPKG Kaiser,I.I., et al1994 AnTxII -Fragmento 1

NLYQFKNMIQCTNTR

phospholipase A2

NLYQFKNMI KCTNTR

Tsai,H.Y., et al,2005

AnTxII-Fragmento 2

AE_ICATVYVGR

Neurotoxina magi-15

ATVICGTIYVGGKEEN Satakea, H., et al, 2004

AnTxII-Fragmento 3

CNNHCDCE

Neurotoxina Oc F32-8

39

4.5 Testes biológicos

4.5.1 Teste de toxicidade em insetos

Os testes biológicos foram realizados com as duas toxinas (AnTxI e AnTxII) entretanto

optamos por apresentar os dados referentes aos ensaios com a toxina AnTxI, por ter sido

possível fazer os mesmos em triplicadas devido a maior quantidade disponível desta toxina

purificada. Os testes de toxicidade em insetos foram realizados com a peçonha e com a toxina

purificada..

A peçonha foi diluída em salina contendo albumina (0,1%). A solução foi injetada por

via intratoráxica em moscas (Musca domestica) em diferentes doses (0,25 µg; 0,5 µg; 1 µg; e 2

µg/mosca). Observou-se ação paralisante da peçonha sobre os insetos com doses a partir de 1,0

µg/mosca. A paralisia foi reversível nas primeiras horas após a injeção da dose de 1,0 µg/mosca

e após 12h para a dose de 2,0 µg/mosca. Além da ação paralisante, as moscas apresentavam

espasmos musculares, com movimentação das patas de forma não coordenada, sugerindo ação

no sistema neuro-muscular.

A toxina AnTxI foi diluída na mesma solução (salina + albumina) e quando injetada em

moscas (Musca domestica) causou excitação, seguida de efeito paralisante reversível após as

primeiras horas da injeção. O efeito era notado a partir de 35 ng/mosca. 48 horas após a injeção

da maior dose (70 ng/mosca) ocorria letalidade acentuada. Neste caso observa-se um efeito

inseticida desta toxina, embora em doses bastante superiores a outras já conhecidas como, por

exemplo, a toxina AaH-IT do escorpião africano Androctonus australis Hector, cuja toxicidade

(DL50) é em torno de 2 ng (DE DIANOUS, et al,1987; LEGROS, et al 2005). Há que se

considerar, entretanto, que os testes utilizados para a AaH-IT referem-se à ação paralisante desta

toxina em larvas de moscas varejeiras (Spodopera frugiperda). Teste semelhante ao do presente

trabalho, com moscas adultas (M.domestica), foi utilizado para ensair toxinas obtidas do veneno

da aranha “armadeira” Phoneutia nigriventer. Neste caso, a toxicidade (DL50) da toxina TX4(6-

1) que mostrou propriedades inseticidas, foi de 3,8 ± 2 ng/mosca (FIGUEIREDO et al, 1995).

Esta toxina apresentou uma taxa de mortalidade alta com efeitos excitatórios semelhantes aos de

toxinas peptídicas presentes em peçonhas de escorpiões e de outras aranhas (ZLOTKIN, 1983;

ZLOTKIN et al., 1985; ADAMS et al., 1989). Comparando-se a toxina AnTxI com as toxinas

inseticidas de escorpião e da P. nigriventer, estas últimas apresentam-se mais potentes para

insetos. Como dito acima, efeitos letais da toxina em estudo, ocorreram com dose de 70

ng/mosca contra 3,8 ng para TX4(6.1) da aranha armadeira.

40

4.5.2 Testes eletrofisiológicos com a toxina AnTxI em canais para cálcio

voltagem-dependentes (Cavs)

Os ensaios com a toxina AnTxI foram realizados com neurônios do gânglio da raiz dorsal

(DRG) de ratos. Testes preliminares evidenciaram ação inibitória da toxina sobre as correntes de

sódio e de cálcio. A inibição da corrente de sódio foi baixa e não foi explorada neste trabalho.

Contudo, a inibição da corrente de cálcio foi bastante intensa com a perfusão de 100nM da

toxina (FIG. 12). Estes experimentos de isolamento da corrente para o cálcio foram realizados

com o devido cuidado, evitando-se a interferência do íon sódio nos registros.

A baixas doses da toxina (100nM) observou-se inibição imediata na corrente total

carreada pelos canais para cálcio, sensíveis à voltagem, indicando alta afinidade deste peptídeo

por estes canais. Nas figuras 12 e 13 verifica-se que apesar da reversão, após lavagem da

preparação, parte da corrente manteve-se inibida, indicando que a AnTxI mantém interações

fortes com parte dos sítios dos canais (responsáveis pelo seus comportamentos cinéticos), ou

com alguns canais específicos que compõem a corrente total, que não se desfez após a lavagem.

Conclui-se com estes resultados, que a toxina AnTxI causou inibição da corrente dos

canais para cálcio. Esse resultado corrobora com outros obtidos com a toxina LTx2, da peçonha

da aranha caranguejeira Lasiodoras sp, que apresenta ação inibitória nos canais para cálcio e

modulação nos canais para sódio (VIEIRA,A.L., et al. 2004). Essa atuação nos canais para

cálcio pode concorrer para explicar os espasmos (excitação) e a paralisia, apresentadas pelas

moscas que foram injetadas com esta toxina. Sabe-se que os canais para cálcio estão diretamente

envolvidos na contração de células musculares (WITHERS, 1992).

Embora as células (DRG) utilizadas nos estudos eletrofisiológicos tenham sido oriundas

de rato, Rattus norvegicus, outros estudos (em andamento por grupo colaborador) indicam ações

desta toxina em canais para cálcio e para sódio, em células de inseto (De Lima, comunicação

pessoal). Com os ensaios realizados nas células nervosas (DRG) de rato ainda não se pode

afirmar qual (quais) o(s) tipo(s) de canais para cálcio que são os alvos da toxina.

41

Tempo (s)

0 100 200 300 400

Cor

rent

e (p

A)

-1e-8

-8e-9

-6e-9

-4e-9

-2e-9

0

AnTxI (100nM) Lavagem

Figura 12 – Efeito no curso temporal da corrente (em pico Amperes, pA) após exposição à toxina AnTxI, na

concentração de 100 nM. O pico da corrente total carreada pelos canais para cálcio sensíveis à voltagem no

neurônio DRG, no período de estabilização do registro é representado por círculos pretos, por círculos vermelhos no

instante de exposição à toxina e por círculos azuis após lavagem, (quando a solução contendo a toxina era trocada

pela solução sem a toxina). Observa-se a reversão da maior parte da inibição da corrente causada pela toxina.

42

Figura 13 - Traçados representativos das correntes totais carreadas pelos canais para cálcio sensíveis à voltagem no

neurônio DRG. A linha de base, no período de estabilização da corrente (linha preta), o pico de inibição pela AnTxI

na concentração de 100nM (linha vermelha) e a corrente após lavagem (linha azul).

Tempo (ms)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Cor

rent

e (A

)

-8e-9

-6e-9

-4e-9

-2e-9

0

2e-9

ControleAnTxI (100nM)Lavagem

(pA)

43

5 CONCLUSÕES

A peçonha da aranha caranguejeira A.natalensis representa uma fonte de substâncias,

com atividades biológicas, a grande maioria a ser explorada. A complexidade da peçonha é

evidenciada quando a mesma foi submetida à cromatografia e à eletroforese bidimensional, que

possibilitam melhor separação dos componentes protéicos demonstrando a presença de vários

picos e `spots`, rescpetivamente. Pela cromatografia de troca iônica observam-se trinta e dois

picos, tanto em peçonha de espécimens machos como de fêmeas, mostrando que não existem

diferenças aparentes do ponto de vista qualitativo, quanto ao gênero. Entretanto, diferenças

quantitativas foram evidentes em algumas regiões, por exemplo, naquela dos picos de 4 a 12. É

possível ainda, que existam outras diferenças que não foram evidenciadas por esta metodologia.

A peçonha, quando injetada em mosca doméstica (Musca domestica), mostrou atividade

de excitação seguida de paralisia nestes insetos. Em doses mais baixas, como 0,25 µg e 0,5 µg, o

efeito da peçonha foi reversível. Doses maiores, como 2 µg, foram letais.

Os experimentos envolvendo cromatografia de troca iônica seguida de cromatografia de

fase reversa mostraram-se eficientes para a separação de toxinas da peçonha da A. natalensis. Na

cromatografia de fase reversa a quase totalidade dos componentes é eluída no início do processo,

mostrando a baixa hidrofobicidade dos mesmos. Com essa metodologia foram isoladas duas

toxinas de baixa massa molecular, a ANTxI com 5374Da. e a ANTxII com 6763 Da. Por

espectrometria de massas não foram detectados outros componentes, o que deverá ainda ser

averiguado. Ambas as toxinas ANTxI e a ANTxII foram testadas em moscas e apresentaram

toxicidade na ordem de nanogramos. A dose de 70ng por mosca foi a maior dose aplicada e os

efeitos observados foram idênticos aos obtidos quando da aplicação de doses maiores de

peçonha. Verificou-se portanto, que tanto a peçonha como as duas toxinas isoladas apresentam

efeitos tóxicos em moscas, sendo as toxinas mais potentes.

A toxina AnTxI teve sua seqüência N-terminal determinada

(IIECFFSCEIEKDGKSKEGKPCKPKG ) e, quando esta foi comparada a outras

sequências de toxinas depositadas em um banco de dados, mostrou homologia com toxinas

ativas em canais para cálcio e para sódio. Ensaios eletrofisiológicos (patch clamp) em neurônios

de gânglio dorsal de rato mostraram que a toxina bloqueou a corrente para cálcio destas células,

em doses nanomolares, portanto apresentando alta afinidade. Este processo é parcialmente

44

reversível com a lavagem da preparação. A toxina também apresentou bloqueio sobre a corrente

para sódio tanto nas células DRG de rato, como em céluas de inseto (De Lima, com.pessoal).

Em conclusão, a toxina obtida em estado puro neste trabalho, mostra ação mais seletiva

em canais para cálcio, o que poderia relacionar-se à sua atividade excitatória e paralisante em

insetos. A ação em canais para sódio parece menos potente e deve ainda ser investigada.

Acreditamos que esta toxina possa vir a ser uma ferramenta farmacológica importante

para o estudo de canais para cálcio voltagem dependentes. Estes estudos, quando concluídos,

contribuirão para avaliar o real potencial desta toxina em possíveis aplicações em saúde e ou

biotecnologia. Por outro lado, os demais componentes da peçonha também representam um

valioso material a ser estudado.

45

Perspectivas futuras

Este trabalho representa uma primeira avaliação da peçonha de A. natalensis, que ocorre

na região do semi-árido baiano. Entendemos que pontos fundamentais para se conhecer melhor

os componentes desta peçonha necessitam de continuidade, como: .

(i) concluir o seqüênciamento das toxinas isoladas;

(ii) concluir os estudos eletrofisiológicos com as toxinas isoladas, verificando seus

possíveis efeitos em diferentes sub-tipos de canais para cálcio e s;

(iii) avaliar a ação das toxinas isoladas em canais para sódio;

(iv) separar e analisar (bioquímica e farmacologicamente) os demais componentes desta

peçonha;

(v) verificar quais os compostos e/ou toxinas que podem ser utilizados como um provável

produto biotecnológico, para a realização de ensaios específicos.

46

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

FORMULAÇÃO PARA A ELETROFORESE EM

POLIACRILAMIDA-SDS (SDS-PAGE)

tampão da amostra : 2 mL de SDS à 10%, 500 µL de 2 –mercaptoetanol, 2 mL de

glicerol, 400 µL de Azul de bromofenol à 2%, 2,5 mL de Tris-HCl(0,5 M-pH 6,8), e 10

mL de água destilada e deionizada.

I-Gel de corrida à 15%: 12,5mL de acrilamida 30%; 6,25mL de TRIS-HCl -1,5M ,pH-

8,8; 250µL de dodecil sulfato de sódio à 10%; 5,85 mL de água tipo II(deionizada e

destilada) ; 125 µL de persulfato de amônio; 25 µL de TEMED,

II- Gel de concentração à 5%: 0,834 mL de acrilamida 30%; 1,25mL de tris-HCl -

1,5M ,Ph - 6,8; 50µL de Dodecil Sulfato de Sódio à 10%; 2,83 mL de água ; 25 µL de

persulfato de amônio; 10 µL de TEMED.

Solução de prata amoniacal: solução A- 15mL de NaOH e 0,5 mL de NH4OH e

Solução B- 0,3 g de AgNO3 e 5mL de água deionizada completando a solução com

água deionizada até completar 50 mL.

Pré-fixado por 1 hora no pré-fixador I contendo uma solução de 50% de etanol e 7,5%

de ácido acético.

Pré-fixador II com uma solução de etanol 5% e ácido acético 7,5% .

Procedimento: Após a corrida o gel era submetido à coloração com prata sendo pré-

fixado por 1 hora no pré-fixador I, posteriormente foi pré-fixado por mais 1 hora no

pré-fixador II, feita está prefixação foram realizadas lavagens no gel para a fixação

com o glutaraldeido a 10% durante 30 minutos. Depois da fixação o gel foi novamente

lavado até a extração do excesso do glutaraldeído e incubado com a solução de prata

amoniacal. Em seguida o gel foi lavado com uma solução de 50 µL de ácido cítrico

(2,3M), 200 µL Formaldeído ( 38% em 200 mL de água deionizada) e inativado com

ácido acético (1% v/v).

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FORMULAÇÃO PARA A SOLUÇÃO DE HANK'S

A composição de HBSS é em mM: NaCl 137,93 (J.J. Baker, México); KH2PO4 0,44

(Merck, Darmstadt, Alemanha); KCl 5,33 (Sigma, St. Louis, Mo, USA); NaHCO3 4 mM

(Sigma, St. Louis, Mo, USA); Na2HPO4 0,3 (Sigma, St. Louis, Mo, USA); Glucose 5,6 (Sigma,

St. Louis, Mo, USA); CaCl2 1,8 mM (Sigma, St. Louis, Mo, USA); MgCl2 1 mM (Labsynth,

Diadema / SP, Brasil) ajustado a pH 7,4 com NaOH.

FORMULAÇÃO PARA O EXPERIMENTO DE “PATCH-CLAMP”

solução interna de pipeta (SI-20 mM de TEA-Cl, 100 mM de CsCl, 2 mM de MgCl2,10

mM de HEPES, 11 mM de EGTA, 1 mM de CaCl2 ,4 mM de ATP-Mg, 100 mM de

GTP-Li, pH= 7,2, ajustado com CsOH ),

solução externa I ou solução de Tyrode (SE1- 130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de

CaCl2, 1 mM de MgCl2 ,10 mM de HEPES e 10 mM de Glicose, pH=7,4 ajustado com

NaOH )

solução externa II ou solução externa para isolar a corrente total de Ca2+ (SE2-35 mM de

TEA-Cl, 100 mM de cholina-Cl, 10 mM de CsCl, 0,8 mM de MgCl2 , 10mM de HEPES,

2 mM de CaCl2 , 10 mM de Glicose, ph 7,4, ajustado com CsOH) .

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