UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

CÍNTIA DAS CHAGAS BERNARDO

Conídios e blastosporos de Metarhizum spp. e Beauveria bassiana:

virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à

radiação UV-B

Goiânia

2016

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade

Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca

Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), regulamentada pela Resolução CEPEC nº 832/2007, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com

a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ X ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Nome completo do autor: Cíntia das Chagas Bernardo

Título do trabalho: Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria

bassiana: virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à radiação UV-B

3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1 Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se

imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF da tese ou

dissertação.

____________________________________ Data: 24 / 08 2016 Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste

prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão

disponibilizados durante o período de embargo.

i

CÍNTIA DAS CHAGAS BERNARDO

Conídios e blastosporos de Metarhizum spp. e Beauveria bassiana:

virulência para Rhipicephalus microplus e resposta ao calor e à

radiação UV-B

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde

Pública da Universidade Federal de Goiás como

pré-requisito para obtenção do Título de

Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Orientador: Éverton Kort Kamp Fernandes

Goiânia

2016

ii

FICHA

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO

Aluna: Cíntia das Chagas Bernardo

Orientador: Éverton Kort Kamp Fernandes

Membros:

1. Vânia Rita Elias Pinheiro Bittencourt

2. Gabriel Moura Mascarin

3. Walquíria Arruda

4. Drauzio Eduardo Naretto Rangel

Data: 19/07/2016

iii

Aos próximos leitores, que encontrem os

conhecimentos que buscam.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me permitir realizar meus sonhos;

Aos meus pais e irmão, Marta, Danilo e Bruno, que talvez não saibam o quão

importantes foram suas ligações inesperadas ou fotos... por me fazerem estar presente

mesmo nos momentos em que eu estava em Goiás. Amo vocês!

A Jésus Junca Pereira, pelo amor e por ser minha família em Goiás;

À família Junqueira, pelo acolhimento e por tornarem meus dias em Goiás mais

aconchegantes e animados;

Aos amigos que conquistei no “melhor lab do mundo”, em especial Cárita, Caroline,

Elen, Flávia, Lucas, Marcos e Ronaldo;

Ao chefe, Éverton Kort Kamp Fernandes, pelos ensinamentos, broncas e “presentes”,

os quais me fizeram crescer pessoal e profissionalmente;

À professora Walquíria Arruda, pela paciência, disponibilidade e conhecimentos

dispensados a mim;

Ao professor Wolf Christian Luz por ter sido meu orientador no início do meu caminho

no Laboratório de Patologia de Invertebrados;

À professora Isabella Vilhena Freire Martins, por ser a responsável pela minha escolha

em seguir a carreira acadêmica, além dos conselhos como mestre e mãe;

Aos demais professores e amigos que de alguma forma contribuiram para a minha

formação seja profissional ou pessoal, meu muito obrigada!

v

SUMÁRIO

TABELAS .................................................................................................................. vi

FIGURAS .................................................................................................................. vii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .............................................................. x

RESUMO ................................................................................................................... xii

ABSTRACT .............................................................................................................. xiii

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 15

2.1 Carrapatos ixodídeos ....................................................................................... 15

2.2 Ciclo biológico dos carrapatos ixodídeos ....................................................... 16

2.3 Fungos entomopatogênicos: Metarhizium e Beauveria .................................. 17

2.4 Mecanismos de defesa dos carrapatos ixodídeos contra fungos

entomopatogênicos ................................................................................................ 19

2.5 Uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos ixodídeos ........ 20

2.6 Influência de fatores abióticos, radiação ultravioleta e calor, no

desenvolvimento de fungos entomopatogênicos ................................................... 23

3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 26

4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28

4.1 Objetivo geral .................................................................................................. 28

4.2 Objetivos específicos ...................................................................................... 28

5 RESULTADOS ...................................................................................................... 29

ARTIGO 1 ................................................................................................................. 30

ARTIGO 2 ................................................................................................................. 54

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 55

7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 78

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 79

vi

TABELAS

ARTIGO 1

Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos investigados no presente estudo. ...... 34

Tabela 3. Parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus

tratadas por imersão em suspensão aquosa (107 propágulos/mL) de conídios ou

blastosporos de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363)

ou Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307). Médias seguidas de mesma letra não

diferem quanto ao efeito do tratamento sobre o parâmetro biológico (F>6,305;

H>17,7857; p<0,05). .................................................................................................. 43

ARTIGO 2

Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos utilizados nos testes de tolerância ao

calor (45ºC) e à radiação ultravioleta UV-B. ............................................................. 57

vii

FIGURAS

Figura 1. Fotomicrografia de conídios (A) e blastosporos (B) de Metarhizium

robertsii s.l. (IP 146), no aumento de 400X, em microscópio óptico. ....................... 18

Figura 2. Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos. ........................................ 19

ARTIGO 1

Figura 1. Mortalidade média de larvas Rhipicephalus microplus tratadas com Tween

80 na concentração de 0,01% (controle) ou com suspensão de conídios ou blastosporos

(107 propágulos/mL) de isolados de Metarhizium spp. (IP 46, IP 146, IP 363 e IP 1)

ou Beauveria bassiana (IP 361, CG 138, CG 397, CG 484 e IP 364). Dados obtidos a

partir de avaliação de dez réplicas em uma repetição. ................................................ 39

Figura 2. Mortalidade acumulada, no décimo dia pós-tratamento, de larvas não

alimentadas de Rhipicephalus microplus tratadas com suspensões de conídios ou

blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae

s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307), nas concentrações de 106, 107

e 108 propágulos/mL. Barras de diferentes propágulos do mesmo isolado seguidas por

asterisco (*) diferem entre si, dentro de uma mesma concentração. .......................... 41

Figura 3. Exteriorização e conidiogênese de Metarhizium robertsii (IP 146) (A: vista

ventral e B: vista dorsal) e Beauveria bassiana (IP 361) (C: vista dorsal e D: vista

ventral) sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão

com suspensão de blastosporos (107 propágulos/mL). Após término da postura as

fêmeas foram incubadas a 27 ± 1°C, UR ≥ 80% até a completa exteriorização do fungo.

.................................................................................................................................... 44

Figura 4. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus

tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Metarhizium

robertsii (IP 146) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas

viii

após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:

blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório. .............................. 45

Figura 5. Eletromicrografia evidenciando o poro anal de fêmeas ingurgitadas de

Rhipicephalus microplus tratadas com suspensão de blastosporos de isolados de (A)

Metarhizium robertsii (IP 146), ou (B) Beauveria bassiana s.l. (IP 361), após os

tempos de incubação de 48 e 4 horas, respectivamente, a 27 ± 1°C com umidade

relativa superior a 80%. .............................................................................................. 46

Figura 6. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus

tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Beauveria

bassiana (IP 361) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas

após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:

blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório. .............................. 47

ARTIGO 2

Figura 1. Espectro da irradiação baseado na fórmula de Quaite (Quaite et al. 1992)

emitido por quatro lâmpadas fluorescentes (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation,

Cleveland, USA) em câmara de madeira confeccionada para exposição de

microrganismos à radiação ultravioleta. O valor da irradiância de Quaite (743,75

mWm-2) foi obtida com auxílio do espectrorradiômetro USB2000+RAD (Dunedin,

FL) coberto por diacetato de celulose para o completo bloqueio de comprimentos de

onda inferiores a 290 nm. .......................................................................................... 60

Figura 2. Termotolerância de propágulos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), M.

robertsii (IP 146), M. acridum (ARSEF 324) e Beauveira bassiana (IP 361 e CG 307)

aquecidos a 45 ± 0,2°C em banho-maria. Conídios foram expostos ao calor por 0

(controle), 60, 120, 240 e 360 minutos, enquanto blastosporos nos tempos de 0

(controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos. Desvio padrão calculado

sobre 3 repetições independentes. .............................................................................. 63

Figura 3. Termotolerância comparativa entre conídios e blastosporos de um mesmo

isolado em Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146),

ix

Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307).

Médias seguidas por asterisco (*) ou duplo asterisco (**) diferem entre si (P < 0,05)

quando expostas a 45 ± 0,2°C, por 60 ou 120 minutos, respectivamente. ................ 64

Figura 4. Termotolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium acridum

(ARSEF 324) expostos a 45 ± 0,2°C por 0 (controle), 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40,

48, 56 ou 64 horas. Médias seguidas por asterisco (*) indicam diferença do percentual

relativo médio de UFC entre os propágulos dentro de um mesmo tempo de exposição

(F12,26=7,323; P < 0,001). .......................................................................................... 65

Figura 5. Tolerância à radiação ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos de

Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium

acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307), expostos às doses

de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, à 743,75 mW m-2 de

irradiância de Quaite (QUAITE et al., 1992). ........................................................... 67

x

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

µL - Microlitro

ARSEF - Isolados fúngicos mantidos na Collection of Entomopathogenic Fungal

Cultures nos Estados Unidos

BDAL – Batata dextrose ágar, acrescido de extrato de levedura

CFI - Coleção de Fungos de Invertebrados

CG - Isolados fúngicos mantidos na Coleção de Fungos de Invertebrados na

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

g - Gramas

IN - Índice nutricional (IN = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) –

peso da quenógina (g) × 100

IP - Isolados fúngicos mantidos na coleção do Laboratório de Patologia de

Invertebrados no Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

IPO - Índice de produção de ovos (IPO = peso da massa de ovos (g) / peso inicial

da fêmea ingurgitada (g) × 100)

IPTSP - Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

L – Litro

LPI - Laboratório de Patologia de Invertebrados

mL - Mililitro

PC – Percentual de controle

PR – Percentual relativo

RE - Reprodução estimada (RE = peso da massa de ovos (g)/peso da teleógina (g)

x % de eclosão das larvas x 20.000

SNK - Student-Newman-Keuls

xi

UFC – Unidade formadora de colônia

UFG - Universidade Federal de Goiás

UR – Umidade relativa do ar

UV-A - Radiação ultravioleta A

UV-B - Radiação ultravioleta B

UV-C - Radiação ultravioleta C

xii

RESUMO

O presente estudo comparou conídios e blastosporos de Metarhizium anisopliae s.l.

(IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307)

quanto a virulência para Rhipicephalus microplus, e quanto a tolerância ao calor e a

radiação UV-B; foi avaliado ainda o desenvolvimento de conídios e blastosporos dos

isolados IP 146 e IP 361 na cutícula de carrapatos por meio da microscopia eletrônica

de varredura (MEV). Larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram tratadas

(larvas: 106, 107 ou 108 propágulos/mL; fêmeas: 107 propágulos/mL) por imersão, com

conídios e blastosporos dos isolados avaliados. Maior percentual de mortalidade foi

obtido nos grupos de larvas tratadas com conídios de IP 361, o qual obteve menor

CL50. No bioensaio com fêmeas, blastosporos de IP 146 e IP 361 proporcionaram

percentual de controle superior a 90%, enquanto que conídios dos mesmos isolados

promoveram mortalidade de 70,97% e 63,29%, respectivamente. Para análise do

desenvolvimento dos propágulos na cutícula de fêmeas ingurgitadas, essas foram

tratadas topicamente com 50 µL de suspensão fúngica (107 propágulos/mL), incubadas

em diferentes tempos de 0 a 96 horas; após cada tempo de incubação as fêmeas foram

processadas e analisadas por MEV. Blastosporos de ambos isolados iniciaram seu

desenvolvimento já após 4 horas de tratamento, demonstrando rápido

desenvolvimento e sugerindo penetração por aberturas naturais do carrapato; com 4

horas de incubação foi possível ver a penetração de blastosporos de IP 361 através da

cutícula, situação não evidenciada pelo isolado IP 146 em nenhum tempo avaliado.

Nos testes de tolerância ao calor, o isolado de Metarhizium acridum (ARSEF 324) foi

inserido como isolado padrão, por ser conhecida a sua tolerância. Suspensões fúngicas

(103 propágulos/mL) foram expostas ao calor (45°C) por diferentes tempos, em

seguida inoculadas em placas de Petri com meio BDAY acrescido de cloranfenicol

(0,055% v/v) e incubadas por 7 dias a 27°C, e UR ≥ 80%. Conídios de ARSEF 324

(79,1%) demonstraram ser mais tolerantes ao calor do que conídios de IP 363 (55,5%),

IP 146 (1,5%), CG 307 (0%) e IP 361 (0%) no tempo de 2 horas de exposição, assim

como blastosporos no tempo de 60 minutos, demonstrando percentual relativo médio

de 100%, 12,3%, 30,7%, 55% e 0%, respectivamente. Nos testes de exposição à UV-

B, suspensões fúngicas (103 propágulos/mL) foram inoculadas em placas de Petri

contendo BDAY e expostas a diferentes doses de radiação; após tratamento, as placas

foram incubadas por 7 dias a 27°C, e UR ≥ 80%. Não houve diferença do percentual

relativo médio de conídios e blastosporos expostos a mesma dose de radiação.

Adjuvantes adequados que visem proteger os propágulos fúngicos contra fatores

abióticos estressantes são requeridos para formulações de conídios e blastosporos; no

entanto, a seleção de isolados naturalmente mais tolerantes ao calor e a radiação UV-

B podem favorecer o desenvolvimento de bioprodutos. Nesse sentido, acredita-se que

blastosporos sejam promissores para o biocontrole de carrapatos, já que estes se

demonstraram virulentos para R. microplus, além de apresentarem rápido

desenvolvimento sobre a cutícula desse artrópode, o que pode indicar menor tempo de

exposição desses propágulos a fatores abióticos limitantes no ambiente.

Palavras-chave: propágulos fúngicos, fungo entomopatogênico, carrapato, Ixodidae,

termotolerância, radiação ultravioleta.

xiii

ABSTRACT

The current study compared the virulence of conidia and blastospores of Metarhizium

anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146) and Beauveria bassiana s.l. (IP

361 and GC 307) against Rhipicephalus microplus, and the tolerance to heat and UV-

B radiation; in addition, it evaluated the development of conidia and blastospores of

the isolates IP 146 and IP 361 on the tick cuticle by scanning electron microscopy

(SEM). Larvae and engorged females of R. microplus were treated (larvae: 106, 107 or

108 propagules/mL, females: 107 propagules/mL) by immersion in conidia or

blastospores suspensions of tested isolates. The higher percentage of larval mortality

was obtained in the group treated with conidia of IP 361, which had lower LC50. In

bioassays with engorged females, IP 146 and IP 361 blastospores, provided tick

percent control superior to 90%, while conidia of the same isolates, promoted 70.97%

and 63.29% of tick control, respectively. Ticks were treated topically with 50 μL of

fungal suspension (107 propagules/mL) and incubated at different times from 0 to 96

hours to analyze its development on the engorged females cuticle; after each

incubation time, the females were fixed and analyzed by SEM. Blastospores of both

isolates have started development 4 hours after treatment, demonstrating rapid

development and suggesting penetration by the tick natural openings; at 4 hours

incubation, indicative of penetration of IP 361 blastospores through the cuticle was

observed, but no signs of penetration was observed with IP 146 blastospores at any

time evaluated. Furthermore, fungal suspensions (103 propagules/mL) were exposed

to heat (45 °C) for several time periods, then inoculated in Petri plates with BDAY

medium plus chloramphenicol (0.055% v/v), and incubated for 7 days at 27 °C and

RH ≥ 80%. ARSEF 324 conidia (79.1%) were more tolerant to heat than conidia of IP

363 (55.5%), IP 146 (1.5%), GC 307 (0%), and IP 361 (0% ) at 2 hours exposure, as

well as blastospores after 60 minutes exposure, demonstrating mean percent CFU of

100%, 12.3%, 30.7%, 55% and 0%, respectively. Fungal suspensions (103

propagules/mL) were also inoculated on BDAY in Petri plates, and exposed to UV-B

radiation; after treatment, plates were incubated for 7 days at 27 °C and RH ≥ 80%.

No difference in mean relative percent CFU between conidia and blastospores was

observed. Suitable adjuvants which aim at protecting fungal propagules against

stressful abiotic factors are required for conidia and blastospores; however, the

selection of isolates with marked natural tolerance to heat and UV-B radiation may

increase performance of bioproducts. Accordingly, it is suggested that blastospores are

promising fungal propagules for biological control of ticks, since they were virulent

against R. microplus; in addition, the rapid development of blastospores on the tick

cuticle indicates they may be exposed shortly to harmful environmental abiotic factors.

Key words: fungal propagules, entomopathogenic fungi, tick, Ixodidae,

thermotolerance, UV radiation.

14

1 INTRODUÇÃO

Os micoinseticidas são uma alternativa sustentável aos produtos químicos no

controle de artrópodes pragas, sendo, os fungos entomopatogênicos os mais promissores

agentes (ROT et al., 2013), pois são os patógenos mais abundantes naturalmente

associados a artrópodes (LACEY et al., 2015). Bioprodutos à base de Beauveria bassiana

e Metarhizium anisopliae são os mais comuns, compreendendo mais de 60% dos produtos

no mercado (FARIA; WRAIGHT, 2007), sendo também, estes dois fungos os mais

investigados para o controle de carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).

Estudos demonstram que fungos entomopatogênicos são eficazes contra

diferentes estágios de desenvolvimento de carrapatos (GINDIN et al., 2002, 2009), além

de promoverem efeitos subletais como diminuição do índice de produção de ovos e do

período de postura (REIS et al., 2008; ANGELO et al., 2010). A maioria dos estudos se

concentram na avaliação de conídios como propágulo infectante, porém, recentemente,

blastosporos têm sido explorados como alternativa promissora para o controle de

carrapatos e outros atrópodes (MIRANPURI; KHACHATOURIANS, 1990; VEGA et

al., 1999; KIRKLAND; CHO; et al., 2004; KIRKLAND; WESTWOOD; et al., 2004;

WASSERMANN et al., 2016).

Blastosporos são formas vegetativas do fungo produzidas naturalmente na

hemocele do hospedeiro (FANG et al., 2010). Apesar de apresentar vantagens em relação

a conídios como rápida germinação e multiplicação, estudos iniciais apontam esses

propágulos como menos resistentes a fatores estressantes, como o calor e à radiação UV-

B (VEGA et al., 1999; KIM et al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al., 2014). É importante

ressaltar que propágulos cuja germinação é mais rápida ficam menos tempo expostos a

fatores prejudiciais ao seu desenvolvimento (VEGA et al., 1999), os quais podem ser

minimizados por formulações protetoras (CAMARGO et al., 2012a; KIM et al., 2013).

O presente estudo comparou conídios e blastosporos de isolados de Metarhizium

spp. e Beauveria bassiana quanto a virulência para larvas e fêmeas ingurgitadas de

Rhipicephalus microplus, e avaliou o desenvolvimento desses propágulos na cutícula

desse artrópode; além disso, demonstrou a tolerância à radiação UV-B e ao calor de

conídios e blastosporos.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Carrapatos ixodídeos

Os ixodídeos, vulgarmente conhecidos como "carrapatos duros", pertencem ao

filo Arthropoda, classe Arachnida, ordem Ixodida e família Ixodidae, e possuem grande

importância econômica e na saúde pública e animal (MASSARD; FONSECA, 2004).

Estes artrópodes apresentam escudo quitinoso, que nos machos se estende por todo dorso

e nas fêmeas, larvas e ninfas cobre apenas um terço do dorso, possibilitando a expansão

do corpo após repasto sanguíneo (BRITO et al., 2006). As peças bucais presentes no

gnatossoma são anteriores e visíveis pela superfície dorsal, enquanto a abertura genital

fica na linha média ventral e o ânus é posterior (URQUHART et al., 1996).

Carrapatos são ectoparasitos obrigatórios de vertebrados e necessitam de

alimentar-se de sangue para completar seu ciclo biológico (BRITO et al., 2006). Além

dos hábitos hematófagos, os carrapatos também são vetores de bactérias, protozoários,

rickettsias e vírus em praticamente todo o mundo (BITTENCOURT, 2000). Os carrapatos

são responsáveis pela transmissão de pelo menos seis diferentes famílias de vírus, sendo

tais agentes importantes causadores de doenças em humanos e nos animais

(SONENSHINE et al., 2002).

Os gêneros de carrapatos, pertencentes à família Ixodidae, mais comumente

encontrados no Brasil são Amblyomma, Ixodes, Rhipicephalus e Dermacentor

(MASSARD; FONSECA, 2004). Bittencourt (2000) reportou que os carrapatos são

importantes parasitos para humanos e animais domésticos ou selvagens. Em humanos, os

carrapatos podem acarretar condições tóxicas severas como paralisia e toxicoses, irritação

e alergia, podendo ainda serem vetores de doenças como a febre hemorrágica do Congo,

febre maculosa e doença de Lyme (ESTRADA-PEÑA; JONGEJAN, 1999).

Os carrapatos são parasitos não permanentes, que se alimentam em mamíferos,

aves e répteis, na maioria das regiões do globo terrestre (ANDERSON, 2002). Estes

artrópodes, de um modo geral, apresentam algum grau de especificidade por hospedeiro,

porém o homem e outros animais podem ser utilizados como hospedeiros alternativos

(MASSARD; FONSECA, 2004).

16

2.2 Ciclo biológico dos carrapatos ixodídeos

Os ixodídeos são parasitos temporários e passam por períodos relativamente

pequenos sobre seus hospedeiros (URQUHART et al., 1996). O ciclo biológico desses

carrapatos consiste de um estágio inativo (ovos) e três estágios móveis e hematófagos

(larva, ninfa e adulto) (BRITO et al., 2006). A vida parasitária evolui sem interferências

climáticas, portanto, é praticamente constante nas diversas regiões onde os carrapatos

estão presentes, porém a fase de vida livre sofre interferências especialmente da

temperatura e umidade relativa do ar (GONZALES, 1975).

O número de hospedeiros que os ixodídeos utilizam para realização completa do

seu ciclo biológico varia de um a três, sendo classificados de acordo com o número de

hospedeiros como: monoxeno, dioxeno ou trioxeno (URQUHART et al., 1996).

O gênero Rhipicephalus, subgênero Boophilus, e o gênero Dermacentor são

carrapatos monoxenos (BRITO et al., 2006). Dessa forma, sobre o hospedeiro, machos e

fêmeas acasalam, começando assim o processo de alimentação e ingurgitamento das

fêmeas com sangue, as quais tendem a se desprender do hospedeiro a partir do 18º dia,

sendo que a maioria tende a cair durante o 22º dia. (FURLONG et al., 2005). Durante o

processo de repasto sanguíneo (alimentação) o carrapato injeta no hospedeiro saliva que

contém substâncias anticoagulantes e anestésicas (BRITO et al., 2006).

Cada teleógina de Rhipicephalus microplus ovipõe cerca de 3.000 ovos

(FURLONG et al., 2005). Os ovos darão origem às neolarvas de carrapatos que estarão

em condições de parasitar o animal dentro de aproximadamente seis dias (período de

endurecimento da cutícula), quando então tornam-se larvas infestantes, as quais são

capazes de se fixar e se alimentar no hospedeiro (GONZALES, 1975), começando assim

a fase parasitária do ciclo biológico do carrapato.

Sobre o hospedeiro, as larvas procuram se fixar no animal pela introdução do seu

aparelho bucal (FURLONG et al., 2005). Após alimentar-se por aproximadamente três

dias, iniciam a próxima muda para a fase de ninfa (GONZALES, 1975). No ciclo de

carrapatos monoxenos, a alimentação larval e ninfal, assim como as mudas, ocorrem

sobre o hospedeiro (BRITO et al., 2006). As ninfas dão origem a indivíduos sexuados,

chamados de neandro (machos) e neógina (fêmeas) (GONZALES, 1975).

Nos climas tropicais úmidos, o ciclo de R. microplus ocorre durante todo o ano,

sem a interrupção causada pela hipobiose das larvas, determinada pelas baixas

17

temperaturas (BRITO et al., 2006). A latitude, no entanto, influencia o fotoperíodo,

promovendo a sazonalidade e permitindo que os carrapatos sincronizem o período de vida

livre do ciclo com as condições climáticas ideais (BRITO et al., 2006).

Os gêneros Ixodes e Amblyomma são carrapatos heteroxenos apresentando em seu

ciclo até três hospedeiros diferentes (MASSARD; FONSECA, 2004). Em carrapatos

heteroxenos, o ciclo geralmente dura longos períodos; no caso do Ixodes, por exemplo, o

ciclo evolutivo requer três anos para se completar (URQUHART et al., 1996).

Assim como nos carrapatos monoxenos, uma vez fecundada, as fêmeas

completam seu único e grande repasto sanguíneo, ao contrário dos machos que se

alimentam de forma intermitente e se acasalam repetidamente (URQUHART et al.,

1996). As fêmeas ingurgitadas caem na vegetação e iniciam a oviposição

aproximadamente após 10 dias em condições favoráveis para o desenvolvimento dos ovos

(BRITO et al., 2006).

O ciclo de carrapatos heteroxenos acontece com estágios semelhantes ao de

carrapatos monoxenos, porém as mudas que ocorrem das fases de larva para ninfa e desta

para adulto acontecem no ambiente (MARTINS et al., 2007). Nos carrapatos heteroxenos

há uma atividade sazonal, pois, quando em condições de baixa umidade e altas

temperaturas a atividade desses praticamente cessa.

2.3 Fungos entomopatogênicos: Metarhizium e Beauveria

Os gêneros Metarhizium e Beauveria são os fungos entomopatogênicos mais

estudados no controle de carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008), sendo

estes fungos anamórficos pertencentes à subdivisão Clavicipitacea, Hypocreales

(BISCHOFF et al., 2009; REHNER et al., 2011).

Metarhizium anisopliae sensu lato (s.l.) e Beauveria bassiana s.l. invadem seus

hospedeiros por penetração direta da cutícula (BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA

et al., 2005; HARTELT et al., 2008). A adesão de conídios sobre a cutícula ocorre

passivamente através de interações eletrostáticas (SOSA-GOMEZ et al., 1997) e, em

seguida, é iniciado o processo de germinação. Após a germinação dos conídios, os

apressórios são formados, os quais secretam enzimas hidrolíticas que favorecem a

penetração das hifas (HARTELT et al., 2008). Uma vez dentro do hospedeiro, o micélio

se ramifica dando origem a blastosporos leveduriformes (GOETTEL; INGLIS, 1997).

18

De um modo geral, blastosporos de fungos entomopatogênicos são maiores do ue

conídios aéreos (JACKSON et al., 1997), crescendo preferencialmente na hemocele de

hospedeiros infectados (ASKARY et al., 1999) (Figura 1).

Figura 1. Fotomicrografia de conídios (A) e blastosporos (B) de Metarhizium robertsii

s.l. (IP 146), no aumento de 400×, em microscópio óptico.

Fonte: Arquivo pessoal.

A morte do hospedeiro infectado por fungos entomopatogênicos ocorre em até 10

dias (ANGELO, 2011) pela combinação da ação de toxinas fúngicas, obstrução física da

circulação, diminuição da nutrição e pela invasão dos órgãos (GOETTEL; INGLIS,

1997). Após a morte do hospedeiro, o fungo cresce externamente ao cadáver e esporula

(HARTELT et al., 2008). Segundo Goettel e Inglis (1997), um fungo apenas emerge do

cadáver de seu hospedeiro e esporula se houver condições apropriadas de temperatura e

umidade para o seu desenvolvimento (Figura 2).

A B

19

Figura 2. Ciclo biológico de fungos entomopatogênicos.

Fonte:MASCARIN; PAULI, 2010.

2.4 Mecanismos de defesa dos carrapatos ixodídeos contra fungos entomopatogênicos

A cutícula dos carrapatos, que nos ixodídeos é quitinosa, é uma barreira fisico-

química que deve ser vencida por fungos entomopatogênicos (MENT et al., 2013). A

cutícula de carrapatos ixodídeos é composta por uma camada proteica interna, uma

camada intermediária formada por lipídios e uma parte externa composta por cera,

produzida por glândulas dérmicas (SONENSHINE, 1991). Esses compostos apresentam

funções distintas, que influenciam tanto na defesa quanto na sobrevivência dos carrapatos

(CHERRY, 1969; HAMILTON et al., 1989; MENT et al., 2010).

Durante a infecção em carrapatos, fungos entomopatogênicos entram em contato

com componentes de cutícula desses artrópodes que são tóxicos aos conídios e aos tubos

germinativos (MENT et al., 2013). Depois de vencida as primeiras barreiras naturais do

hospedeiro, os fungos invadem a cavidade geral e, então, sofrem a ação do sistema de

defesa celular desencadeada pelos hemócitos presentes na hemolinfa (ALVES, 1998).

A hemolinfa é o fluído circulante no corpo dos carrapatos, sendo composto por

hemócitos (células circulantes) e plasma (líquido sem hemócitos) (GUDDERRA et al.,

2002). O plasma, componente da hemolinfa, é um meio aquoso e composto por proteínas,

aminoácidos, carboidratos, lipídios, hormônios e vários sais (ANGELO, 2011). A

20

atividade de lecitinas e hemoaglutininas, parecem estar relacionados a fatores

moleculares de reconhecimento self e non-self em reações de defesa contra bactérias e

fungos (BOWMAN; NUTTALL, 2008).

A hemolinfa contém vários tipos de hemócitos, sendo o mais abundante os

fagócitos (plasmócitos e granulócitos) (SONENSHINE et al., 2002). Os hemócitos são os

principais componentes da hemolinfa variando de 50 a 60% de seu conteúdo

(SONENSHINE, 1991), apresentando um papel importante no sistema imune do

carrapato (ZHIOUA et al., 1996). A quantidade, assim como o tipo de hemócito, é

essencial para imunidade dos artrópodes (RUSSO et al., 2001), que por meio de

mecanismos da fagocitose, encapsulação, nodulação, coagulação e cicatrização

combatem agentes externos que invadem o hospedeiro (ALVES, 1998).

As reações de defesa ocorrem provavelmente em dois estágios, sendo o primeiro

o reconhecimento de partículas estranhas pelos granulócitos e coagulócitos seguido pela

liberação de fatores de reconhecimento que numa segunda estapa conduzem os

plasmócitos em direção às partículas invasoras (ALVES, 1998). Agentes patogênicos

fracos são facilmente encapsulados e destruídos, porém, patógenos virulentos como

alguns isolados de M. anisopliae e B. bassiana, são capazes de resistir à fagocitose e

encapsulamento, e levar o hospedeiro à morte (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).

2.5 Uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos ixodídeos

Os carrapatos são vetores de difícil controle pois apresentam muitas espécies e

ciclos biológicos distintos (BLAGBURN; DRYDEN, 2009), além de serem abundanres

e bem adaptados ao ambiente em que estão inseridos. Kaufman (2010) comenta que os

carrapatos ganham grande atenção da ciência principalmente por serem vetores de vários

patógenos, e que os esforços têm-se concentrado nos métodos de controle desses

artrópodes.

Tradicionalmente, métodos de controle usando substâncias químicas, possuem

alto custo, promovem poluição ambiental e o desenvolvimento da resistência aos

acaricidas (RIBEIRO et al., 2010). A resistência às três maiores classes de carrapaticidas

que são amplamente utilizadas no controle de carrapatos: organofosforados (OPs),

piretroides (SPs) e amitraz (formamidinas), são bem documentados no México, Austrália

e Brasil (BARRÉ et al., 2008)

21

Preocupações com a segurança e o impacto ambiental, com relação à aplicação de

produtos químicos, redirecionam as pesquisas para métodos sustentáveis de controle do

carrapato, incluindo o controle biológico (CHANDLER et al., 2000). Métodos

alternativos de controle tornam-se cada vez mais importantes pelo crescente número de

relatos de resistência aos carrapaticidas químicos comumente utilizados (MERLINI;

YAMAMURA, 1998; JONSSON et al., 2000; FOIL et al., 2004; FERNÁNDEZ-SALAS

et al., 2012)

Segundo Flamini (2003), o controle de doenças causadas por ácaros parasitas de

plantas, humanos e animais está baseado no uso de drogas, porém quando essas não são

eficazes fazem com que essas pragas tornem-se um problema maior e mais sério. A partir

disso, associado a outros fatores como o aumento da procura por alimentos mais

saudáveis e com menos resíduos tóxicos, além de uma legislação mais severa quanto à

poluição ambiental, tem-se somado esforços para o desenvolvimento de biopesticidas a

base de fungos (FARIA; WRAIGHT, 2007).

O controle biológico vem sendo utilizado não somente como uma forma

alternativa de controle, mas também associado aos químicos, como uma forma de

controle integrado (BAHIENSE et al., 2006; SOUSA; BERNARDES; et al., 2011).

Parasitos, predadores de insetos e fungos entomopatogênicos têm sido apontados como

agentes promissores para o uso no controle biológico de vetores (JACKSON et al., 1997).

Vários fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados a carrapatos e

alguns têm demonstrado alta virulência contra esses artrópodes, sendo os gêneros

Metarhizium e Beauveria os mais investigados (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008).

Muitos autores citam o uso de fungos entomopatogênicos no controle de carrapatos em

testes in vitro (BITTENCOURT et al., 1996; PIRALI-KHEIRABADI et al., 2007;

ANGELO et al., 2010; SUN et al., 2011) e in vivo (BITTENCOURT et al., 2003;

ALONSO-DÍAZ et al., 2007; ANGEL-SAHAGÚN et al., 2010).

Segundo Filho et al. (2009), o controle utilizando fungos apresenta diferentes

formas de aplicação, não sendo indicados apenas como substitutos dos produtos

químicos. Muitas características devem ser levadas em consideração durante o

desenvolvimento de micopesticidas, como a viabilidade e infectividade dos propágulos

durante o armazenamento, a capacidade de infectar a praga alvo nas condições ambientais

(JACKSON; JARONSKI, 2009), as características de infecção do propágulo fúngico e

aquelas inerentes ao hospedeiro alvo (FILHO et al., 2009).

22

No entanto, o processo de avaliação do potencial de um isolado fúngico deve

considerar também o custo-benefício, ou seja, um produto economicamente viável e de

fácil produção massal (JACKSON; JARONSKI, 2009). Kleepies e Zimmermann (1992)

citam que o método mais econômico de produção em massa de fungos

entomopatogênicos, sobre condições controladas, é a fermentação líquida.

Muitos micoacaricidas e micoinseticidas tem sido desenvolvidos desde a década

de 1960, sendo mais de 60% deles à base de B. bassiana e M. anisopliae e apenas 4% dos

bioprodutos disponíveis no mercado são à base de blastosporos (FARIA; WRAIGHT,

2007). Segundo Kim et al. (2013), a produção de conídios aéreos é onerosa e demanda

muito tempo, o que aumenta os riscos de contaminação. Em contrapartida, os autores

citam que, produzidos em meio líquido, blastosporos são de mais fácil produção, estando

esta completa em 3 a 4 dias dependendo do meio utilizado. Blastosporos podem ser

produzidos em tanques de fermentação (JACKSON et al., 2003) tornando seu cultivo

mais fácil.

Apesar de alguns estudos citarem vantagens de produção de larga escala

(JACKSON; JARONSKI, 2009) ou até maior virulência (HARTELT et al., 2008) de

blastosporos em relação a conídios, pouco se sabe sobre esses propágulos. Apesar das

vantagens sobre conídios, blastosporos também apresentam desvantagens como a maior

sensibilidade a fatores estressantes como a temperatura (KIM et al., 2013). Porém, é

sabido que alguns veículos, como o óleo, são utilizados com a finalidade de proteger os

propágulos fúngicos, conídios (LOPES et al., 2007; XAVIER-SANTOS et al., 2011;

CAMARGO et al., 2012b) ou blastosporos (KIM et al., 2013), contra o danos causados

por fatores abióticos.

Alguns autores citam que bioprodutos a base de blastosporos apresentariam menor

tempo de prateleira (JACKSON et al., 1997), porém muitos estudos vêm sendo

desenvolvidos para suprir as deficiências apresentadas por esse propágulos (LANE;

TRINCI, 1991; KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1994; CLIQUET; JACKSON, 1999,

2005; MASCARIN, et al., 2015) e ressaltar suas vantagens.

23

2.6 Influência de fatores abióticos, radiação ultravioleta e calor, no desenvolvimento

de fungos entomopatogênicos

O desempenho de fungos entomopatogênicos é afetado por uma variedade de

fatores bióticos e abióticos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). Rangel et al. (2008)

citam que a radiação ultravioleta (UV) e o calor são fatores que reduzem

significativamente a viabilidade de conídios a campo. Outros autores relatam ainda a

umidade relativa do ar e fatores relativos ao hospedeiro como temperatura e composição

química das secreções da pele (POLAR et al., 2005), como fatores que podem influenciar

o desenvolvimento de fungos entomopatogênicos quando utilizados a campo.

A radiação ultravioleta é a porção mais prejudicial e mutagênica do espectro solar

(BRAGA et al., 2015), sendo convencionalmente dividida em três comprimentos de onda:

UV-C (200 - 280 nm), UV-B (280 - 315 nm) e UV-A (315 - 400 nm) (PAUL; GWYNN-

JONES, 2003). Segundo estes autores, UV-C é absorvida pelo oxigênio e o ozônio da

atmosfera e, por isso, não chega a atravessá-la, enquanto UV-B e UV-A conseguem. A

porção UV-B induz alterações em DNA, proteínas e lipídios (HIDEG et al., 2013), assim

como a porção UV-A, normalmente menos danosa.

A porção UV-B da radiação é diretamente absorvida pelo DNA levando à

formação de dímeros de pirimidina e mutagênese, em contrapartida, a radiação UV-A

gera danos oxidativos e indiretamente danos ao DNA por fotosensibilização e formação

de espécies reativas de oxigênio (FRIEDBERG et al., 1995). Fungos entomopatogênicos

possuem mecanismos de proteção e reparo aos danos causados pela radiação UV. A

produção de melanina pelo fungo, pode proteger os propágulos da exposição à condições

ambientais adversas (BUTLER; DAY, 1998) por meio de absorção comprimentos de

onda do espectro solar, inclusive a radiação UV (SHANG et al., 2012). Em fungos, as

tirosinases apresentam um importante papel na formação de pigmentos, bem como em

mecanismos de defesa e virulência (HALAOULI et al., 2006). Fotoliases, são importantes

enzimas que, ativadas pela luz, atuam na reparação do DNA após formação dos dímeros

de pirimidinas, formados pela exposição à radiação UV-B (KAO et al., 2005).

A partir disso, esforços têm se concentrado em encontrar isolados mais tolerantes

à radiação UV, os quais consigam manter a viabilidade (capacidade de germinação) e a

virulência mesmo quando expostos a altas doses de radiação (BRAGA et al., 2001).

Muitos estudos vêm sendo conduzidos mimetizando as condições de exposição à luz

24

solar, com lâmpadas fluorescentes emissoras de radição UV-B (BRAGA et al., 2001;

RANGEL et al., 2005; FERNANDES et al., 2007; TAYLOR et al., 2013) a fim de

encontrar isolados promissores para o uso em programas de biocontrole. Segundo Braga

et al., (2015), além de inviabilizar os conídios, limitar o tamanho da população de fungos

e sua dispersão, doses subletais de radiação UV podem reduzir o vigor e a sua virulência.

Muitos fatores podem influenciar a quantidade de radiação UV recebida no meio

ambiente (280 - 400 nm) como a altitude, camada de ozônio, angulação do sol,

nebulosidade e até a poluição (PAUL; GWYNN-JONES, 2003). Portanto, embora a

exposição à radição UV com auxílio de lâmpadas possua certas vantagens sobre a

exposição à radiação solar, como a reprodutibilidade e o maior controle do ambiente de

exposição dos isolados, a análise dos resultados obtidos devem ser cuidadosamente

extrapoladas para condições ambientais (BRAGA et al., 2001).

Além disso, outros fatores abióticos também são importantes limitadores da

atividade de fungos entomopatogênicos, como altas temperaturas, por exemplo (XIE et

al., 2012). Aumentos repentinos de temperatura promovem importantes danos da

estrutura celular e interferem em funções essenciais de microrganismos (RICHTER et al.,

2010). O calor úmido pode causar a desnaturação de proteínas, enquanto que baixa

umidade associada a altas temperaturas promovem danos ao DNA de microrganismos

(SETLOW; SETLOW, 1996).

Vários mecanismos de proteção são utilizados pelos fungos para suportar os

estresses aos quais são submetidos. Em resposta ao estresse térmico, células ativam uma

importante via de sinalização transitória que expressa proteínas, como as chaperonas,

chamadas de heat shock proteins (HSP), que previnem a formação de agregados não

específicos de proteínas (RICHTER et al., 2010); desta forma as HSP são importantes

indutoras de termotolerância (PLESOFSKY-VIG; BRAMBL, 1985).

Sabe-se que fungos que crescem em condições ambientais extremas tendem a

possuir mecanismos que os protegem de fatores estressantes, entre eles estão o acúmulo

de trealose e manitol (RANGEL et al., 2008). Estudos vêm sendo desenvolvidos no

intuito de, a partir de locais com condições estressantes para o desenvolvimento de

fungos, encontrar isolados mais termotolerantes (RANGEL et al., 2005b; FERNANDES

et al., 2008).

O calor em conjunto com à radiação UV são os principais responsáveis pela falha

em programas de controle biológico (RANGEL et al., 2005b). Portanto, estudos que

25

apontem isolados mais tolerantes às condições adversas presentes no ambiente onde

destina-se a aplicação de bioprodutos, são importantes para a disseminação desse tipo de

controle. Neste sentido, o uso de fungos entomopatogênicos em programas de controle

biológico de vetores não depende apenas seleção de isolados virulentos, mas também da

seleção de isolados tolerantes a fatores naturais estressantes.

26

3 JUSTIFICATIVA

O potencial de fungos entomopatogênicos para controle de carrapatos é

frequentemente subestimado (FERNANDES et al., 2012). Novos estudos que apontem

isolados e preparos fúngicos mais eficazes para controle biológico de carrapatos,

incluindo maior tolerância à condições ambientais adversas, são necessários para

popularização de produtos biológicos à base de fungos.

Cerca de 171 produtos à base de fungos são destinados ao controle de artrópodes

pragas em todo o mundo, e 42,7% deles estão ou foram disponibilizados comercialmente

na América do Sul. Apenas três produtos são indicados para controle de carrapatos,

embora não sejam produtos exclusivos para este grupo de artrópodes (FARIA;

WRAIGHT, 2007). Micoacaricidas, como são conhecidos os produtos destinados ao

controle de carrapatos e outros membros da subclasse Acari, estão disponíveis

comercialmente como conídios em formulações oleosas ou em pó molhável (FARIA;

WRAIGHT, 2007).

Micoacaricidas têm mostrado resultados promissores em estudos laboratoriais e

de semi-campo. Apesar de alguns estudos listarem uma série de vantagens de

blastosporos de fungos entomopatogênicos em relação aos conídios (JACKSON et al.,

1997; VEGA et al., 1999; HARTELT et al., 2008), pouco se sabe sobre a eficácia de

blastosporos para o controle de carrapatos. Não foram encontrados produtos à base de

blastosporos recomendados para controle de carrapatos, e dos 171 produtos biológicos à

base de fungos listados por Faria e Wraight (2007), apenas 4,1% são formulações com

blastosporos. Além disso, o desempenho dos blastosporos é pouco conhecido em

laboratório ou em campo, principalmente contra carrapatos.

As vantagens dos blastosporos em relação aos conídios incluem a germinação que

pode ser até quatro vezes mais rápida do que a de conídios, alta infectividade (VEGA et

al., 1999; HARTELT et al., 2008), e a facilidade de produção de elevadas concentrações

de blastosporos (JACKSON; JARONSKI, 2009). Esses benefícios sobrepõem algumas

das desvantagens dos blastosporos que é a menor tolerância à fatores de estresse em

relação aos conídios e menor estabilidade (KIM et al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al.,

2014; MASCARIN et al., 2015); no entanto, uma adequada formulação dos blastosporos

pode proteger esses propágulos desses efeitos.

27

O controle de carrapatos é dificultado na atualidade especialmente pelo elevado

índice de resistência aos acaricidas químicos utilizados convencionalmente. Além disso,

o seu uso indiscriminado tem chamado a atenção por causar sérios danos ao meio

ambiente e por deixar resíduos em alimentos, afetando diretamente a saúde humana e

animal (FERNANDES et al., 2012). Neste sentido, torna-se necessário a busca por

métodos de controle alternativo ao uso exclusivo do método convencional, que sejam

mais eficientes, menos tóxicos ao homem e aos animais, e de menor impacto ambiental.

Sendo assim, o presente estudo investigou a eficácia de blastosporos para controle

de carrapatos, permitindo compreender alguns importantes mecanismos de ação de

blastosporos de fungos entomopatogênicos contra carrapatos, e avaliou sua eficácia como

agente de biocontrole. Além disso, foi investigada a tolerância de blastosporos a

importantes fatores abióticos de estresse, como elevada temperatura e radiação

ultravioleta. Esses resultados, por sua vez, foram comparados aos resultados obtidos por

conídios dos mesmos isolados investigados. Neste sentido, buscou-se contribuir com o

desenvolvimento de bioprodutos para controle de carrapatos, que são importantes vetores

de patógenos que comprometem a saúde humana e animal.

28

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Contribuir com o aprimoramento do controle microbiano do carrapato

Rhipicephalus microplus, comparando a eficácia entre blastosporos e conídios de fungos

entomopatogênicos.

4.2 Objetivos específicos

Avaliar comparativamente a virulência de conídios e blastosporos de isolados de

Metarhizium spp. e B. bassiana s.l. para larvas não alimentadas e fêmeas

ingurgitadas de R. microplus;

Avaliar comparativamente a tolerância de conídios e blastosporos dos isolados de

Metarhizium spp. e B. bassiana s.l. à condições estressantes de temperatura e

radiação ultravioleta UV-B;

Investigar e comparar a velocidade de germinação de conídios e blastosporos dos

isolados Metarhizium robertsii e B. bassiana s.l. sobre a cutícula de fêmeas

ingurgitadas de R. microplus.

29

5 RESULTADOS

Artigo 1 - Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. ou Beauveria bassiana em

Rhipicephalus microplus: Virulência e desenvolvimento durante o processo de

infecção

Bernardo, C.C. Barreto, L.P., Luz, C., Arruda, W., Fernandes, E.K.K.

Experimental and Applied Acarology

Artigo 2 - Tolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria

bassiana ao calor e à radiação UV-B

Bernardo, C.C., Pereira Júnior, R.A., Luz, C., Rangel, D. E. N., Fernandes, E.K.K

Journal of Applied Microbiology

30

ARTIGO 1

Conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e Beauveria

bassiana em Rhipicephalus microplus: virulência e

desenvolvimento durante o processo de infecção

Cíntia C. Bernardo1, Lucas P. Barreto1, Christian Luz1, Walquíria Arruda2, and

Éverton K. K. Fernandes1*

1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás (UFG),

Goiânia, Goiás 74690-900, Brasil. 2 Instituto de Ciências Biológicas, UFG, Goiânia, Goiás 74690-900, Brazil.

* Correpondências devem ser enviadas para Universidade Federal de Goiás, Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Esperança s/n, Campus Samambaia,

Goiânia, GO, Brasil, 74690-900.

Telefone: +55 (62) 3209-6118; e-mail: evertonkort@ufg.br

31

Resumo

O presente estudo comparou a virulência de conídios e blastosporos de isolados de

Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) e Beauveria

bassiana s.l. (IP 361 e CG 307) sobre larvas e fêmeas ingurgitadas do carrapato

Rhipicephalus microplus; além disso, avaliou o desenvolvimento desses propágulos na

cutícula do carrapato por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Larvas de

R. microplus foram tratadas com suspensão de conídios ou blastosporos nas

concentrações de 106, 107 e 108 propágulos/mL dos quatro isolados testados. Na menor

concentração avaliada, apenas o tratamento com conídios de IP 361 promoveu

mortalidade superior ao do grupo controle, resultado que corrobora com o cálculo de

concentração letal (CL50), cujo isolado apresentou melhor resultado. Fêmeas ingurgitadas

de R. microplus foram tratadas com suspensão de conídios e blastosporos na concentração

de 107 propágulos/mL. Foram avaliados diversos parâmetros biológicos das fêmeas,

diariamente, até o término da postura. Apenas nos grupos tratados com blastosporos de

IP 146 e IP 361 houve alteração de parâmetros biológicos em relação ao grupo controle,

como, por exemplo: menor índice nutricional das fêmeas e também índice de produção

de ovos. O percentual de controle de fêmeas tratadas com blastosporos de IP 146

(97,95%) e IP 361 (92,92%) foi maior em comparação aos tratamentos com conídios dos

mesmos isolados, respectivamente, 70,97% e 63,29%. Fêmeas de R. microplus tratadas

com suspensões de IP 146 e IP 361 na concentração de 107 propágulos/mL foram

incubadas por 0, 4, 8, 24, 48, 72 e 96 horas, e após cada tempo de incubação foram

fixadas. A cutícula ventral foi dissecada, sendo, após 10 dias, desidratas, secas e

recobertas por ouro para avaliação por MEV. Blastosporos de IP 146 e IP 361 iniciaram

seu desenvolvimento após 4 horas de incubação. Mesmo após 96 horas de incubação, não

foi observado nenhuma estrutura de penetração oriundo de blastosporos de M. robertsii,

mas foi encontrado evidência da penetração destes propágulos por aberturas naturais.

Blastosporos de B. bassiana apresentaram penetração após 4 horas de incubação. Foi

observado formação de tubos germinativos em conídios, de ambos os isolados, após 48

horas de incubação. Para os estágios de larva, foi observado um melhor desempenho de

conídios em relação a blastosporos; no entanto, blastosporos foram mais virulentos para

fêmeas ingurgitadas. Portanto, acredita-se que blastosporos sejam promissores para o uso

no biocontrole de carrapatos, já que estes demonstraram-se virulentos para adultos de R.

microplus, além de apresentarem rápido desenvolvimento sobre a cutícula desse

artrópode.

Palavras-chave: fungos entomopatogênicos; propágulos fúngicos; carrapato;

microscopia eletrônica de varredura; infecção.

1. Introdução

O carrapato Rhipicephalus microplus é conhecido como carrapato do boi, e

geralmente parasita somente bovinos, porém quando a população de carrapato atinge

níveis altos nas pastagens, o parasitismo pode se estender a outras espécies (ANGELO et

al., 2010). Massard e Fonseca (2004) citam que os carrapatos, de um modo geral,

32

apresentam algum grau de especificidade por hospedeiro, podendo o homem atuar como

hospedeiro alternativo.

Na medicina veterinária, os carrapatos apresentam grande importância por serem

vetores de diversos agentes causadores de doenças, além de promoverem consideráveis

perdas econômicas (FURLONG et al., 2005). Grisi et al. (2014) estimaram que R.

microplus, somente, é responsável por gastos superiores a 3 bilhões de dólares na pecuária

nacional anualmente. O método mais empregado para o controle de carrapatos é baseado

na utilização de acaricidas químicos; entretanto, o controle de carrapatos é dificultado

especialmente pelo elevado nível de resistência aos acaricidas químicos utilizados

convencionalmente (SOUZA HIGA, 2015).

A partir disso, novas alternativas têm sido empregadas ou investigadas para controle

de carrapatos. A integração de técnicas de controle tem sido descrita como benéfica,

potencializando possivelmente o controle desses artrópodes (BAHIENSE et al., 2006;

SOUSA et al., 2011; WEBSTER et al., 2015), além de evitar o uso exclusivo de acaricidas

químicos e assim, minimizando os problemas associados à utilização indiscriminada

desses produtos. Acaricidas à base de fungos entomopatogênicos vêm sendo cada vez

mais estudados para o controle biológico destes artrópodes. Este método de controle

apresenta uma série de vantagens em relação aos produtos químicos, destacando-se a

baixa poluição ambiental, não apresentam risco para animais vertebrados e possuem alta

eficácia contra artrópodes pragas (ALONSO-DÍAZ et al., 2007).

Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana são os fungos entomopatogênicos

mais investigados quanto ao seu potencial para o controle de espécies de carrapatos em

todo o mundo (FERNANDES et al., 2008). A maioria dos produtos comerciais para o

uso em programas de controle biológico de artrópodes é a base de conídios, sendo

estimado que apenas 4% deles seja à base de blastosporos (FARIA; WRAIGHT, 2007).

Mascarin et al. (2015) demonstraram que é possível produzir blastosporos de forma

rápida, com baixo custo, e também aumentar o tempo de prateleira dos bioprodutos à base

de blastosporos. Apesar de alguns autores listarem vantagens no desenvolvimento e

produção de blastosporos de fungos entomopatogênicos em relação a conídios (VEGA et

al., 1999; JACKSON; JARONSKI, 2009), pouco se sabe sobre a eficácia de blastosporos

para o controle de carrapatos.

Esses benefícios podem superar possíveis desvantagens em relação aos conídios,

como a menor tolerância a fatores abióticos estressantes (KIM et al., 2013; OTTATI-DE-

33

LIMA et al., 2014), pois blastosporos são formados naturalmente, na hemolinfa do

hospedeiro invertebrado (FANG et al., 2010). Além disso, uma adequada formulação dos

blastosporos pode proteger esses propágulos contra fatores abióticos estressantes (KIM

et al., 2013) e garantir maior eficácia do bioproduto.

Apesar de alguns estudos compararem a eficácia de conídios e blastosporos para

insetos e carrapatos (LANE; TRINCI, 1991; KIRKLAND; CHO; et al., 2004;

KIRKLAND; WESTWOOD; et al., 2004) pouco se sabe sobre os mecanismos de

infecção de blastosporos. O mecanismo de infecção por conídios em carrapatos é melhor

esclarecido, onde estes, após aderirem a cutícula do hospedeiro, germinam e formam

tubos germinativos que culminam na formação do apressório e iniciam assim a invasão

fúngica (BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA et al., 2005).

A partir disso, o presente estudo comparou a virulência de blastosporos e conídios

de isolados de Metarhizium spp. (IP 146 e IP 363) e B. bassiana (IP 361 e CG 307),

originados do Brasil, para larvas e fêmeas ingurgitadas de R. microplus, além de

determinar o tempo de desenvolvimento e modo de infecção desses propágulos na

cutícula de carrapatos por meio da microscopia eletrônica de varredura.

2. Material e Métodos

2.1 Origem e cultivo dos fungos

A partir de estudos prévios para avaliar a produção de blastosporos em meio

líquido, foram selecionados quatro isolados de Metarhizium spp. e cinco de Beauveria

bassiana (Tabela 1). Dos isolados avaliados, oito são provenientes do Centro-Oeste e um

do Nordeste Brasileiro.

34

Tabela 1. Identificação dos isolados fúngicos investigados no presente estudo.

Código Origem Substrato/Hospedeiro Espécie

IP 1 GO, Brasil Solo Metarhizium anisopliae s.l.

IP 46 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.

IP 146 GO, Brasil Solo M. robertsii s.l.

IP 361 GO, Brasil Amblyomma cajennense

[Ixodidae][Ordem: Ixodida] Beauveria bassiana s.l.

IP 363 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.

IP 364 GO, Brasil A. cajennense

[Ixodidae][Ordem: Ixodida] B. bassiana s.l.

CG 138 PE, Brasil Cosmopolites sordidus

[Curculionidae][Ordem: Coleoptera] B. bassiana s.l.

CG 307 GO, Brasil Solo B. bassiana s.l.

CG 484 MS, Brasil Diabrotica sp.

[Chrysomelidae][Ordem: Coleoptera] B. bassiana s.l.

IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública; CG: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

Para a produção de conídios e blastosporos, foi utilizado meio Adamék modificado

(KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) com ou sem ágar respectivamente. Para obtenção

do caldo de amido utilizado no meio de cultura, foram misturados 5 g de maisena

(Maizena®, Unilever, São Paulo, Brasil) à 250 mL de água destilada; além de 3,15% de

caldo de milho os meios de cultura apresentavam 4,21% de glicose (Labsynth®, Produtos

para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) e de extrato de levedura (Difco

Laboratories®, Interlab, São Paulo, Brasil), e ainda 2,1% de Tween 80 (Labsynth®,

Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) 0,1%.

Para o cultivo dos blastosporos foram utilizados 150 mL do meio Adamék líquido

para cada frasco tipo Erlenmeyer (Pirex®, USA), sendo estes tampados com algodão

hidrófobo e colocados em agitador orbital a 150 rpm por 4 dias, em temperatura ambiente

(aproximadamente 27°C). Após o crescimento do fungo, o meio foi filtrado em funil com

gaze para remoção do micélio produzido durante o cultivo; o meio contendo blastosporos

foi colocado em tubos de centrifuga de 15 mL (Gene®, Ionlab Equip. Sup. Laborat. Hosp.

Ltda.), e centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos. Após primeira centrifugação o

sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em Tween 80® 0,01% e centrifugado

novamente para retirada de resquícios do meio de cultura. Descartou-se novamente o

sobrenadante e o ressuspendeu em Tween 80® a 0,01%.

A produção de conídios ocorreu em placas de Petri (90x10mm) contendo meio

Adamék (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) acrescido de 2% de ágar (Himedia®,

HiMedia Lab. Pvt. Ltd.). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1°C com umidade

relativa ≥80%. Os conídios foram retirados da placa com auxílio de espátula e colocados

35

em tubos tipo Falcon (15 mL) contendo 10 mL de Tween 80® 0,01% e pérolas de vidro

(4 mm de diâmetro). Os tubos contendo as suspensões conidiais foram agitados em vortéx

até a completa homogeneização, e posteriormente filtrados em funil com gaze.

A quantificação das suspensões, de conídios ou blastosporos foi feita com o auxílio

da Câmara de Neubauer.

2.2 Obtenção e preparação dos carrapatos para bioensaios

Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram obtidas a partir de vacas em lactação,

naturalmente infestadas, sem contato prévio com carrapaticidas por pelo menos 30 dias.

As coletas foram realizadas em propriedades rurais da região metropolitana de Goiânia.

As fêmeas ingurgitadas coletadas foram levadas ao Laboratório de Patologia de

Invertebrados, situado no Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade

Federal de Goiás, onde foram lavadas em água corrente e secas em papel toalha estéril.

Após a primeira lavagem, os carrapatos foram imersos respectivamente em água

destilada, solução de hipoclorito a 1% e em água destilada novamente, permanecendo 1

minuto em cada etapa. As fêmeas foram secas em papel toalha estéril e em seguida

tratadas (como será descrito a seguir), ou incubadas para permitir a oviposição.

Para obtenção das larvas de carrapatos, as fêmeas foram colocadas em placas de

Petri (100 × 15 mm) e fixadas pelo dorso com auxílio de fita adesiva dupla-face. Após 10

dias do início da postura, 50 mg da massa de ovos (aproximadamente 1000 ovos,

DRUMMOND et al., 1971) foram acondicionados em tubos de ensaio de vidro (15 x 100

mm), tampados com algodão hidrófilo e incubadas a 27±1°C e umidade relativa superior

a 80%. As larvas de R. microplus só foram utilizadas 7 dias após o término da eclosão

destas, a fim de que houvesse o completo enrigecimento da cutícula.

2.3 Bioensaios

2.3.1 Larvas não alimentadas de R. microplus

Foram produzidos 10 mL de suspensão de conídios ou de blastosporos na

concentração de 107 propágulos/mL para cada um dos 9 isolados estudados. Para os

bioensaios foram formados 3 grupos (grupo controle e grupos tratados com conídios ou

blastosporos) com 10 réplicas, para cada isolado avaliado. Cada tubo de ensaio contendo

aproximadamente mil larvas foi tratado com 1 ml de suspensão fúngica, sendo esta

36

espalhada por todo o tubo por aproximadamente 1 minuto, a fim de que todas as larvas

do tubo entrassem em contato com a suspensão de tratamento. Após esse período, os tubos

foram colocados invertidos nas estantes para absorção do excesso da suspensão de

tratamento pelo algodão. O grupo controle seguiu o mesmo método de tratamento das

larvas, no entanto, cada tubo de ensaio recebeu 1ml de solução estéril de Tween 80®

0,01%.

Em seguida, os tubos foram mantidos a 27 ±1 ºC com umidade relativa superior a

80%, sendo estimada visualmente a mortalidade das larvas a cada 2 dias, em

estereomicroscópio, sendo atribuídos valores em percentual que variaram de 0 a 100%,

em intervalos de 5%. Essa metodologia é baseada nos estudos de Grillo Torrado e

Gutierrez (1969) e Bittencourt et al. (1996).

Quatro isolados que apresentaram melhor desempenho na triagem foram

reavaliados, com três diferentes concentrações (106, 107 e 108 propágulos/mL), contra

larvas de R. microplus, utilizando metodologia semelhante ao teste anterior.

O experimento foi conduzido por três vezes, em dias diferentes, com diferentes

lotes de propágulos fúngicos. O cálculo matemático da concentração letal mediana (CL50)

e seu intervalo de confiança foram feitos pelo método de análise de próbites, segundo

Finney (1971) utilizando-se o programa “Probit or Logit Analysis”. As análises do efeito

do tratamento ou das diferentes concentrações sobre a mortalidade das larvas foram feitas

a partir da análise de variância, seguidos do teste de Student-Newman-Keuls (SNK), com

nível de significância de 5% (P ≤ 0,05).

2.3.2 Fêmeas ingurgitadas de R. microplus

Ambos propágulos de quatro isolados selecionados a partir do teste de triagem

foram avaliados contra fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Os carrapatos foram pesados

individualmente e separados por meio de cálculos de intervalo de classe [IC = (peso da

fêmea mais pesada - peso da fêmea mais leve)/número de fêmeas por grupo)], sendo

criados grupos de 8 indivíduos homogeneizados entre si de acordo com o peso.

As fêmeas de cada tratamento foram imersas por aproximadamente 1 minuto em

suspensão de blastosporos ou conídios (107 propágulos/mL) e, em seguida,

acondicionadas individualmente nos poços (volume 3,29 mL) de placas de cultura de

células (Prolab, São Paulo, Brasil). As fêmeas foram mantidas em câmara climatizada a

27 ± 1C e UR > 80%.

37

Os seguintes parâmetros biológicos foram investigados: peso inicial da fêmea

ingurgitada; peso da postura; período de postura (compreendido entre a postura do primeiro

e a do último ovo); peso da quenógina (determinado três dias após o término da postura) e

percentual de eclosão larval, avaliado através de uma leitura subjetiva da quantidade de

larvas eclodidas em relação à massa total de ovos, com o auxílio de microscópio

estereoscópio.

A partir dessas avaliações foram calculados o índice de produção de ovos (IPO) e

o índice nutricional (IN), conforme metodologia descrita por Bennet (1974), pelas

seguintes equações: IPO = peso da massa de ovos (g) / peso inicial da fêmea ingurgitada

(g) × 100; e IN = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) – peso da quenógina

(g) × 100. Foram calculados ainda a reprodução estimada (RE) e o percentual de controle,

conforme metodologia descrita por Drummond et al. (1971), usando as seguintes

equações: RE = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) × percentual de eclosão

larvas × 20.000 (constante que se refere ao número de ovos presente em 1 g de ovos de

R. microplus); Percentual de controle = RE média do grupo controle – RE média do

grupo tratado / RE média do grupo controle × 100.

Os dados referentes aos parâmetro biológicos das fêmeas foram submetidos à

análise de variância seguido de análise para comparação de médias. Período de pré-

postura e período de postura, utilizou-se o teste de Student-Newman-Keuls (SNK), e os

dados de IPO e IN o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, ambos com nível de

significância de 5% (P ≤0,05).

2.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Fêmeas ingurgitadas de R. microplus foram higienizadas conforme descrito no

item 2.2, individualmente, e tratadas topicamente com 50 μL de suspensão de conídios

ou blastosporos na concentração de 107 propágulos/mL dos isolados IP 146 (M. robertsii)

e IP 361 (B. bassiana) na região ventral da fêmea com auxílio de uma micropipeta semi-

automática (de 20 a 200μm, Labmate soft®). Após cada tempo de incubação (0, 4, 8, 24,

48, 72 e 96 horas), uma fêmea ingurgitada de R. microplus foi imersa em 1mL de fixador

(2% de paraformaldeído, 2% de glutaraldeído, 3% de sacarose e tampão cacodilato de

sódio 0,1M pH 7,2) em tubos criogênicos (Global Trade Technology®, Monte Alto, SP)

de 2 mL.

38

Após 10 dias imersas no fixador, parte da cutícula ventral das fêmeas foi dissecada

e imersa em 1 mL de tampão cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,2), em novos tubos

criogênicos. Para desidratação e preparação das amostras, estas foram lavadas três vezes

(15 minutos cada) em tampão cacodilato de sódio (0,1M, pH 7,2). Após as lavagens, as

cutículas foram desidratadas em uma série gradual de soluções de etanol (30, 50, 70, 80

e 90%), permanecendo por 15 minutos em cada solução e passando duas vezes em etanol

100%, por 10 minutos cada etapa. Posteriormente, para secagem, as amostra foram

imersas em aproximadamente 300 µL de hexametildisilazano (Electron Microscopy

Sciences, Hatfield, PA, USA), onde foram mantidas por 6 minutos. Em seguida, o líquido

foi retirado e os tubos mantidos abertos para evaporação do reagente.

Após a secagem, as amostras foram submetidas a metalização, sendo montadas

em um stub e revestidas por ouro em um sputter-aplicator (Denton Vacuum, Desk V). Ao

final, as cutículas foram analisadas e eletromicrografadas no microscópio eletrônico de

varredura (MEV) Jeol JSM 6610 em uma voltagem de aceleração de 5 kV no Laboratório

Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic) da Universidade Federal de

Goiás, para avaliação do comportamento e desenvolvimento de conídios e blastosporos.

Os experimentos foram repetidos três vezes, em dias diferentes, com diferentes

propágulos fúngicos.

3. Resultados

Nos ensaios de triagem da virulência de conídios de Metarhizium spp., três

isolados (IP 1, IP 46 e ARSEF 324) promoveram mortalidade de larvas de R. microplus

inferior a 70% no 14º dia após o tratamento; os maiores percentuais de mortalidade foram

promovidos pelos isolados IP 146 (91%) e IP 363 (77%) (Figura 1). Nos tratamentos com

blastosporos, IP 1 e ARSEF 324 promoveram mortalidade média de larvas inferior a 15%,

sendo observado maiores percentuais nos tratamentos com os isolados IP 46 (82,2%), IP

363 (96,5%) e IP 146 (100%) no 14º dia após o tratamento. Na triagem com isolados de

Beauveria bassiana, os tratamentos com suspensão conidial promoveram média de

mortalidade das larvas de 17% (CG 138), 46% (CG 484), 70% (IP 364), 83,5% (CG 307)

e 99,5% (IP 361) após a última avaliação. Tratamentos com blastosporos de B. bassiana

promoveram mortalidade abaixo de 40% para larvas de Rhipicephalus microplus, em

todos os isolados avaliados.

39

Figura 3. Mortalidade média de larvas Rhipicephalus microplus tratadas com Tween 80 na concentração de 0,01% (controle) ou com suspensão

de conídios ou blastosporos (107 propágulos/mL) de isolados de Metarhizium spp. (IP 46, IP 146, IP 363 e IP 1) ou Beauveria bassiana (IP 361,

CG 138, CG 397, CG 484 e IP 364). Dados obtidos a partir de avaliação de dez réplicas em uma repetição.

40

Na avaliação da mortalidade acumulada de larvas não alimentadas de R. microplus no 10º

dia após o tratamento (Figura 2), foi evidenciado já na concentração de 106

propágulos/mL, que, apenas o grupo tratado com conídios de IP 361 promoveu

mortalidade de larvas maior do que o observado no grupo controle (F8,18= 4,47;

P=0,0039). Na concentração de 107 propágulos/mL, os tratamentos com blastosporos de

IP 146 e IP 361, e ambos propágulos de CG 307, não diferiram do controle (F1,18= 8,05;

P=0,0001). Na concentração mais alta, 108 propágulos/mL, apenas blastosporos de IP 361

promoveram mortalidade de larvas semelhante àquela apresentada pelo grupo controle

(F8,18=22,784; P<0,0001); enquanto que a mortalidade média de larvas tratadas com

conídios de CG 307 foi de 32,75% e a dos demais grupos de tratamento foi superior a

70%. Não houve diferença significativa entre as concentrações utilizadas para um grupo

tratado com mesmo isolado e propágulo fúngico apenas quando foi utilizado conídios de

IP 146 (F2,6=2,24; P=0,1871) e IP 363 (F2,6=4,68; P=0,0595) ou blastosporos de IP 146

(F2,6=1,99; P=0,2160). Não foi observada diferença entre conídios e blastosporos dos

isolados de Metarhizium, IP 146 e IP 363 nas concentrações de 106 (F1,4=0,20;P=0,6732;

F1,4=0,19;P=0,6849), 107 (F1,4=0,81;P=0,4171; F1,4=0,49;P=0,5187) e 108

(F1,4=0,51;P=0,5126; F1,4=0,08;P=0,7912) propágulos/mL, respectivamente. Os isolados

de B. bassiana, demonstraram diferença de virulência entre propágulos. Conídios de IP

361 promoveram maior mortalidade de larvas do que blastosporos desde a menor até a

maior concentração (F1,4=1786,0;P<0,0001; F1,4=899,87;P<0,0001;

F1,4=1249,3;P<0,0001). Blastosporos de CG 307 obtiveram melhor desempenho do que

conídios nas concentrações de 107 (F1,4=17,80;P=0,0134) e 108 (F1,4=47,66;P=0,0023)

propágulos/mL.

41

Figura 4. Mortalidade acumulada, no décimo dia pós-tratamento, de larvas não alimentadas de Rhipicephalus microplus tratadas com suspensões

de conídios ou blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP 361 e

CG 307), nas concentrações de 106, 107 e 108 propágulos/mL. Barras de diferentes propágulos do mesmo isolado seguidas por asterisco (*) diferem

entre si, dentro de uma mesma concentração.

42

Nos bioensaios com fêmeas ingurgitadas de R. microplus, o índice nutricional (IN)

(H=21,1250; P=0,0068) e o índice de produção de ovos (IPO) (H=17,7857; p=0,0229)

das fêmeas tratadas com blastosporos de IP 146 e de IP 361, foram os únicos tratamentos

que promoveram índices menores do que aqueles obtidos pelas fêmeas do grupo controle

(Tabela 3). Não houve diferença entre o período de pré-postura das fêmeas do grupo

controle e aquelas tratadas com suspensões fúngicas (F8,18 = 0,61689; P=0,7528). Todos

os tratamentos promoveram menor período de postura do que aqueles observados nas

fêmeas do grupo controle (F8,18=15,6; P=0,00). Blastosporos dos isolados IP 146 (Figura

3 A e B) e IP 361 (Figura 3 C e D) apresentaram percentual de controle de fêmeas 97,95%

e 92,92%, enquanto que conídios dos mesmos isolados apresentaram 70,97% e 63,29%,

respectivamente.

43

Tabela 2. Parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão em suspensão aquosa (107

propágulos/mL) de conídios ou blastosporos de Metarhizium robertsii (IP 146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363) ou Beauveria bassiana (IP

361 e CG 307). Médias seguidas de mesma letra não diferem quanto ao efeito do tratamento sobre o parâmetro biológico (F>6,305; H>17,7857;

p<0,05).

Tratamentos Período de pré-postura Período de postura IN* IPO* RE** Percentual de controle**

Controle 3,2ns 16,7a 71,83ac 52,04a 495975,81 -

IP 146 conídios 3ns 10,5bde 68,67ac 43,35ab 143975,7 70,97 (± 13,5)

IP 146 blastosporos 3,2ns 5,3c 48,05b 19,83b 10167,51 97,95 (± 2,0)

IP 363 conídios 3,2ns 12bd 80,12a 47,65a 202507,4 59,17 (± 16,4)

IP 363 blastosporos 3ns 8,7be 60,63ab 38,06ab 105398,0 78,75 (± 12,5)

IP 361 conídios 3ns 13,3d 59,32ab 44,79ac 182061,3 63,29 (± 5,1)

IP 361 blastosporos 3,2ns 7,7ce 42,3b 25,38bc 35086,9 92,92 (± 10,3)

CG 307 conídios 3,2ns 12bd 58,89ab 43,84ac 56873,5 88,53 (± 5,3)

CG 307 blastosporos 2,7ns 10,3bde 56,48cb 38,96ab 167219,5 66,29 (± 11,0)

*IN: Índice Nutricional= peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) – peso da quenógina (g) × 100 (Bennet, 1974); IPO: Índice de Produção de ovos= peso da massa de

ovos (g) / peso inicial da fêmea ingurgitada (g) × 100 (Bennet, 1974); **RE: Reprodução Estimada = peso da massa de ovos (g) / peso da teleógina (g) × percentual de eclosão

larvas × 20.000 (Drummond, 1971); **Percentual de eclosão = RE média do grupo controle – RE média do grupo tratado / RE média do grupo controle × 100 (Drummond,

1971).

44

Figura 5. Exteriorização e conidiogênese de Metarhizium robertsii (IP 146) (A: vista

ventral e B: vista dorsal) e Beauveria bassiana (IP 361) (C: vista dorsal e D: vista

ventral) sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tratadas por imersão

com suspensão de blastosporos (107 propágulos/mL). Após término da postura as

fêmeas foram incubadas a 27 ± 1°C, UR ≥ 80% até a completa exteriorização do fungo.

Quando foi avaliado o modo e o tempo de infecção de conídios e blastosporos

do isolado de M. robertsii (IP 146), por meio da microscopia eletrônica de varredura,

foi evidenciado maior velocidade de crescimento dos blastosporos com 4 horas de

45

incubação (Figura 4a), em relação a germinação e formação de apressórios de conídios

com 48 (Figura 4d) e 72 (Figura 4f) horas de incubação, respectivamente.

Figura 6. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus

tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Metarhizium

robertsii (IP 146) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas

após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:

blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório.

Apesar da velocidade de crescimento acelerado dos blastosporos em relação

aos conídios, não foi possível visualizar estruturas sugestivas de penetração dos

blastosporos através da cutícula, mesmo após 96 horas de incubação. No entanto,

46

algumas imagens sugerem que a penetração fúngica ocorra via aberturas naturais das

fêmeas, como abertura anal (Figura 5).

Figura 7. Eletromicrografia evidenciando o poro anal de fêmeas ingurgitadas de

Rhipicephalus microplus tratadas com suspensão de blastosporos de isolados de (A)

Metarhizium robertsii (IP 146), ou (B) Beauveria bassiana s.l. (IP 361), após os

tempos de incubação de 48 e 4 horas, respectivamente, a 27 ± 1°C com umidade

relativa superior a 80%.

O isolado IP 361 (B. bassiana), comportou-se de maneira semelhante ao IP

146, exceto por blastosporos apresentarem evidências de penetração através da

cutícula dos carrapatos 4 horas após incubação das fêmeas tratadas (Figura 6a),

enquanto que conídios iniciaram seu desenvolvimento com 48 horas de incubação

(Figura 6d). Após 48 horas de incubação foi visualizado a formação de novos

propágulos na cutícula das fêmeas, partir de hifas formadas após tratamento (Figura

6c).

47

Figura 8. Eletromicrografia de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus

tratadas com suspensão de blastosporos (a, c, e) ou conídios (b, d, f) de Beauveria

bassiana (IP 361) na concentração de 107 propágulos/mL. Fêmeas foram incubadas

após tratamento por 4, 48 ou 72 horas a 27 ± 1°C com UR superior a 80%. B:

blastosporos; C: conídio; TG: tubo germinativo; AP: apressório.

4. Discussão

O presente estudo reporta resultados promissores para blastosporos de isolados

de Metarhizium sp. e Beauveria bassiana, indicando que este pode ser um propágulo

fúngico a ser explorado no controle de carrapatos, embora a maioria dos trabalhos

48

indiquem conídios como principal propágulo para o uso em programas de biocontrole

(BITTENCOURT et al., 2003; ALONSO-DÍAZ et al., 2006; BARCI et al., 2009;

ÁNGEL-SAHAGÚN et al., 2010).

Alguns estudos apontam que a composição nutricional do meio de produção

pode ter efeito marcante na viabilidade, virulência e produção de propágulos (LANE;

TRINCI, 1991; KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1994; JACKSON et al., 1997;

ISSALY et al., 2005; MASCARIN; JACKSON, M. A.; et al., 2015). A partir disso, os

isolados utilizados nos testes do presente estudo, foram submetidos às mesmas

condições de manipulação. Os propágulos foram produzidos em mesmo meio de

cultura com ou sem ágar, para produzir conídios ou blastosporos respectivamente, para

que estes tivessem acesso aos mesmos tipos de nutrientes e em quantidades iguais.

Nos testes com larvas de R. microplus não foi observada diferença significativa

quanto a mortalidade das larvas tratadas com conídios ou blastosporos de Metarhizium

sp.; no entanto, isolados de B. bassiana demonstraram diferença entre os propágulos.

O tratamento com conídios de IP 361 (B. bassiana) foi o que promoveu maior

mortalidade de larvas já na menor concentração. Esses resultados estão de acordo com

os resultados de Lane e Trinei (1991), que avaliaram conídios e blastosporos de B.

bassiana para o controle de cigarrinha (Nephotettix virescens) e encontraram menores

CL50 nos tratamentos com conídios. Apesar disso, blastosporos do outro isolado de B.

bassiana avaliado, CG 307, demonstrou melhor desempenho do que conídios,

indicando que a diferença de virulência não está ligada somente às características de

cada propágulo, mas também ao fator genético e especificidade de cada isolado.

Contraditoriamente, nos testes realizados com fêmeas ingurgitadas de R.

microplus, em geral, blastosporos promoveram maior percentual de controle quando

comparado a conídios de um mesmo isolado. KIRKLAND et al. (2004) compararam

diferentes concentrações de suspensões de conídios e blastosporos de B. bassiana,

demonstrando um maior percentual de mortalidade no tratamento com conídios em

adultos de Amblyomma maculatum. Hartelt et al. (2008) testaram suspensões conidiais

e de blastosporos de M. anisopliae, e reportaram menor tempo letal (TL50) para larvas

e ninfas de Ixodes ricinus, quando essas foram tratadas com blastosporos.

Diferentes resultados de um mesmo isolado obtidos para os estágios de larva

e adultos do carrapato, possivelmente foram obtidos pelas características de infecção

49

de cada propágulo, as quais foram evidenciadas neste trabalho, durante a análise por

microscopia eletrônica de varredura.

Tradicionalmente, a infecção de fungos entomopatogênicos, como os dos

gêneros Metarhizium e Beauveria, ocorre por penetração através da cutícula do

artrópode alvo (KIRKLAND; CHO; et al., 2004). Porém, não foi evidenciado

apressório, em blastosporos de M. robertsii (IP 146), na cutícula de fêmeas

ingurgitadas de R. microplus, apesar de que, nos ensaios de virulência, foi observada

morte das fêmeas e consequente exteriorização do fungo. O atual trabalho sugere que

a penetração desses propágulos, em carrapatos, ocorra especialmente por penetração

em aberturas naturais, característica que dificultaria a infecção de larvas de carrapato

pelo fungo, já que estas apresentam menor número e tamanho de aberturas em relação

aos adultos (ESTRADA-PEÑA et al., 2012).

No entanto, blastosporos de B. bassiana (IP 361) formaram apressório e

apresentaram um crescimento acelerado em relação a conídios, demonstrando dupla

possibilidade de penetração, através da cutícula e por aberturas naturais de carrapatos.

Apesar dessa vantagem em relação aos conídios, é sabido que muitos aspectos

biológicos estão envolvidos e podem influenciar na virulência de fungos

entomopatogênicos. É sabido que a cutícula de carrapatos apresentam componentes

tóxicos aos conídios e tubos germinativos, os quais o fungo entra em contato durante

o processo de infecção (MENT et al., 2013). A partir disso, a penetração por aberturas

naturais pode impedir a exposição do fungo a esses componentes fungicidas.

Assim como no presente estudo, Vega et al. (1999) concluíram que o

crescimento de blastosporos, em relação a conídios foi mais rápido, quando avaliaram

Isaria fumosorosea (=Paecylomyces fumosoroseus) em cutícula de mosca branca. Os

autores citam ainda que blastosporos não necessitam de nutrientes externos para iniciar

a germinação, sendo esse um dos fatores que tornam esses propágulos mais ágeis para

iniciar o processo de infecção. Outro fator importante no processo de infecção por

blastosporos é a extensa colonização externa da cutícula do carrapato (Figuras 4e e

6e), podendo portanto, por pressão mecânica, favorecer a penetração das hifas, além

de dificultar as trocas gasosas pelo artrópode, a partir do tamponamento dos

espiráculos.

50

Foi observado também no presente estudo que ocorre a formação de novos

propágulos na cutícula de fêmeas tratadas com blastosporos, já que estes são pedaços

de hifas, produzidos por brotamento. Neste contexto, em comparação a conídios, o

tratamento com blastosporos pode potencializar o processo de infecção e

consequentemente a virulência do fungo.

Portanto, os resultados obtidos apontam evidências de que blastosporos são

promissores para o controle de carrapatos, e descrevem uma possível e importante

forma de infecção por fungos entomopatogênicos, uma vez que até então, a penetração

através da cutícula era a principal forma de penetração descrita para os gêneros

Metarhizium e Beauveria (BITTENCOURT et al., 1999; KIRKLAND; CHO; et al.,

2004; ARRUDA et al., 2005).

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54

ARTIGO 2

Tolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e

Beauveria bassiana ao calor e à radiação UV-B

Bernardo, C.C.1, Pereira Júnior, R.A.1, Luz, C., Rangel, D. E. N.1,

Fernandes, E.K.K1*

1 Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás

(UFG), Goiânia, Goiás 74690-900, Brasil.

* Correpondências devem ser enviadas para Universidade Federal de Goiás, Instituto

de Patologia Tropical e Saúde Pública, Avenida Esperança s/n, Campus Samambaia,

Goiânia, GO, Brasil, 74690-900.

Telefone: +55 (62) 3209-6118; e-mail: evertonkort@ufg.br

55

Resumo

O presente estudo avaliou comparativamente a tolerância ao calor e à radiação

ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos dos isolados IP 146 (Metarhizium

robertsii), IP 363 (Metarhizium anisopliae s.l.), IP 361 (Beauveria bassiana s.l.), CG

307 (B. bassiana s.l.) e ARSEF 324 (Metarhizium acridum). Para os testes de

termotolerância, suspensões conidiais ou de blastosporos (103 propágulos/mL) foram

acondicionadas em tubos de vidro com rosca e expostas a 45°C em banho-maria.

Conídios foram expostos por 0 (controle), 60, 120, 240 ou 360 minutos, enquanto

blastosporos foram tratados por 0 (controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120 e 150 minutos.

Após os tratamentos, 50 μL das suspensões foram inoculados e espalhados sobre a

superfície do meio batata dextrose ágar suplementado com extrato de levedura

(BDAL), em placas de Petri, e estas foram incubadas por sete dias a 27 ± 1°C com

umidade relativa superior a 80%. Após o período de incubação, foram contadas as

unidades formadoras de colônia (UFC) e calculado o percentual relativo de UFC dos

tratamentos em relação ao controle. Conídios de ARSEF 324 (79,1%) demonstraram

ser mais tolerantes ao calor do que conídios de IP 363 (55,5%), IP 146 (1,5%), CG 307

(0%) e IP 361 (0%), com apenas 2 h de exposição; assim como blastosporos no tempo

de 60 minutos, demonstrando percentual relativo médio de 100%, 12,3%, 30,7%, 55%

e 0%, respectivamente. Quando foi comparada a tolerância entre os propágulos nos

tempos de 60 e 120 minutos de exposição ao calor, conídios de IP 363 foram mais

tolerantes do que blastosporos em ambos tempos; enquanto blastosporos de CG 307

foram mais tolerantes do que conídios. A partir disso, propágulos do isolado ARSEF

324, foram expostos ao calor por 0 (controle), 1, 2, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 e 64

h. Até o tempo de 4 h, ARSEF 324 não demonstrou diferença na tolerância entre os

propágulos avaliados; após esse período, conídios foram mais tolerantes do que

blastosporos até o tempo de 48 h, e em seguida tornaram-se semelhantes quanto a

tolerância até 64 h de exposição. Para os ensaios de tolerância à radiação UV-B,

suspensões de conídios ou blastosporos (103 propágulos/mL) foram espalhadas em

placas de Petri contendo meio BDAL e expostas às doses de 0 (controle), 1,33, 2,67,

4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, a irradiância de Quaite de 743,75 mW m-2. Depois de

irradiadas, as placas foram incubadas e avaliadas assim como descrito no teste anterior.

Não houve diferença entre a tolerância de conídios e blastosporos, de um mesmo

isolado, expostos às diferentes doses de radiação avaliadas. Blastosporos de IP 146, IP

363, IP 361, CG 307 e ARSEF 324 não diferiram entre si quanto à tolerância à radiação

UV-B; ARSEF 324 foi o mais tolerante quando conídio foi o propágulo avaliado, não

demonstrando diferença no percentual de UFC nas doses avaliadas. Os resultados

demonstraram que há uma grande variação entre propágulos de um mesmo isolado

quanto a tolerância ao calor; no entanto, pequena variação foi observada quanto a

tolerância à radiação UV-B. Esses resultados mostram que blastosporos não são

necessariamente mais sensíveis a fatores abióticos do que conídios de um mesmo

isolado de fungo entomopatogênico, principalmente a UV-B. Além disso, formulações

adequadas que visem a proteção dos propágulos fúngicos contra fatores abióticos

estressantes são necessárias tanto para conídios quanto para blastosporos; deste modo,

considerando a tolerância ao calor ou à radiação UV-B, blastosporos são potencial

candidatos a ingrediente ativo de bioprodutos para controle de artrópodes.

Palavras-chave: Termotolerância; radiação ultravioleta; fungos entomopatogênicos;

propágulos fúngicos; controle microbiano.

56

1 Introdução

Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são os fungos

entomopatogênicos mais estudados no controle biológico de artrópodes

(FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). Segundo Rangel et al. (2004) o sucesso do

biocontrole está associado à manutenção da viabilidade dos propágulos fúngicos após

a aplicação no ambiente. Fatores abióticos como a radiação solar ultravioleta,

especialmente UV-B, e o calor reduzem significativamente a viabilidade de conídios

quando aplicados a campo, o que faz com que se tornem obstáculos importantes a

serem transpostos pelos fungos (RANGEL et al., 2008; FERNANDES et al., 2015).

Para a seleção de fungos entompatogênicos promissores para o biocontrole, a

tolerância a fatores estressantes é tão importante quanto à virulência desses fungos ao

artrópode alvo (XIE et al., 2012).

Conídios aéreos são os principais propágulos fúngicos utilizados em

bioprodutos comerciais, e apenas cerca de 4% dos produtos disponíveis possuem

blastosporos como ingrediente ativo (FARIA; WRAIGHT, 2007). Blastosporos são

estruturas fúngicas formadas por fungos entomopatogênicos durante o processo de

infecção no artrópode, naturalmente encontrados em sua hemocele (FANG et al.,

2010). Blastosporos são reportados como sendo promissores para o uso em programas

de controle biológico (MIRANPURI; KHACHATOURIANS, 1990; KLEESPIES;

ZIMMERMANN, 1994; VEGA et al., 1999; HARTELT et al., 2008), mas apesar

disso, pouco se sabe sobre a tolerância dessas estruturas a fatores abióticos.

Algumas vantagens da utilização de blastosporos em relação a conídios têm

sido relatadas devido ao menor custo e tempo de produção, além do rápido

desenvolvimento sobre o hospedeiro (VEGA et al., 1999; KIM et al., 2013). No

entanto, Kim et al., (2013) relataram desvantagens destes propágulos em relação aos

conídios, como a menor estabilidade ao armazenamento e a menor tolerância ao calor,

atribuindo a isso a membrana mais fraca de blastosporos do que a presente em

conídios. Estas desvantagens podem ser minimizadas acrescentando ou retirando

algum tipo de suplemento do meio de cultura utilizado na produção, ou ainda

utilizando formulações protetoras (JACKSON et al., 1997, 2003; KIM et al., 2013;

MASCARIN; JACKSON, M. A.; et al., 2015). Além disso, o rápido desenvolvimento

57

de blastosporos sobre a cutícula de artrópodes promove um menor tempo de exposição

desses propágulos a fatores estressantes, como calor e UV-B (VEGA et al., 1999).

A partir disso, o presente estudo visou avaliar comparativamente a tolerância

ao calor e a UV-B de conídios e blastosporos de isolados de Metarhizium robertsii (IP

146), Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium acridum (ARSEF 324) e

Beauveria bassiana (IP 361 e CG 307).

2 Material e Métodos

2.1 Origem e cultivo dos isolados

A partir de ensaios de triagem da patogenicidade de isolados de fungos

entomopatogênicos para larvas de Rhipicephalus microplus (BERNARDO;

FERNANDES, dados não publicados), foram selecionados dois isolados de

Metarhizium e dois isolados de Beauveria bassiana sensu lato, com notável virulência,

para avaliação de sua tolerância a fatores abióticos estressantes (Tabela 1). O isolado

australiano de Metarhizium acridum, ARSEF 324, armazenado na ARS Collection of

Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF), nos Estados Unidos, foi inserido nos

testes por ser um isolado sabidamente tolerante ao calor e à radiação UV-B (BRAGA

et al., 2001; RANGEL et al., 2005b).

Tabela 3. Identificação dos isolados fúngicos utilizados nos testes de tolerância ao

calor (45ºC) e à radiação ultravioleta UV-B.

Código Origem Substrato/Hospedeiro Espécie

IP 146 GO, Brasil Solo Metarhizium robertsii s.l.

IP 361 GO, Brasil Amblyomma cajennense

[Ixodidae][Ordem: Ixodida]

Beauveria bassiana s.l.

IP 363 GO, Brasil Solo M. anisopliae s.l.

CG 307 GO, Brasil Solo B. bassiana s.l.

ARSEF 324 Queensland,

Austrália

Austracris guttulosa

[Orthoptera: Acrididae]

M. acridum

IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Goiânia, GO, Brasil; CG: Embrapa Recursos Genéticos e

Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil; ARSEF: Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal

Cultures, Ithaca, NY, Estados Unidos.

58

Para a produção de conídios e blastosporos, foi utilizado meio Adamék

modificado (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) com ou sem ágar

respectivamente. Para obtenção do caldo de amido utilizado no meio de cultura, foram

misturados 5 g de maisena (Maizena®, Unilever, São Paulo, Brasil) à 250 mL de água

destilada; além de 3,15% de caldo de milho os meios de cultura apresentavam 4,21%

de glicose (Labsynth®, Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) e de

extrato de levedura (Difco Laboratories®, Interlab, São Paulo, Brasil), e ainda 2,1% de

Tween 80 (Labsynth®, Produtos para laboratórios Ltda., Diadema, SP, Brasil) 0,1%.

Para o cultivo dos blastosporos foram utilizados 150 mL do meio Adamék

líquido para cada frasco tipo Erlenmeyer (Pirex®, USA), sendo estes tampados com

algodão hidrófobo e colocados em agitador orbital a 150 rpm por 4 dias, em

temperatura ambiente (aproximadamente 27°C). Após o crescimento do fungo, o meio

foi filtrado em funil com gaze para remoção do micélio produzido durante o cultivo; o

meio contendo blastosporos foi colocado em tubos de centrifuga de 15 mL (Gene®,

Ionlab Equip. Sup. Laborat. Hosp. Ltda.), e centrifugado a 3000 rpm por 5 minutos.

Após primeira centrifugação o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido

em Tween 80® 0,01% e centrifugado novamente para retirada de resquícios do meio

de cultura. Descartou-se novamente o sobrenadante e o ressuspendeu em Tween 80®

a 0,01%.

A produção de conídios ocorreu em placas de Petri (90x10mm) contendo meio

Adamék (KLEESPIES; ZIMMERMANN, 1992) acrescido de 2% de ágar (Himedia®,

HiMedia Lab. Pvt. Ltd.). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1°C com

umidade relativa ≥80%. Os conídios foram retirados da placa com auxílio de espátula

e colocados em tubos tipo Falcon (15 mL) contendo 10 mL de Tween 80® 0,01% e

pérolas de vidro (4 mm de diâmetro). Os tubos contendo as suspensões conidiais foram

agitados em vortéx até a completa homogeneização, e posteriormente filtrados em

funil com gaze.

A quantificação das suspensões, de conídios ou blastosporos foi feita com o

auxílio da Câmara de Neubauer.

59

2.2 Termotolerância

Alíquotas de 2 mL de suspensões de conídios ou blastosporos (103

propágulos/mL) foram transferidas para tubos de ensaio de vidro com rosca (16 × 125

mm) e imediatamente aquecidos em banho-maria a 45 ± 0,2 ºC.

Os tubos contendo 2 mL das suspensões de blastosporos foram submetidos aos

tempos de exposição de 0 (controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos.

As suspensões conidiais foram expostas ao calor por 0 (controle), 60, 120, 240 e 360

minutos.

Após cada tempo de exposição ao calor, uma alíquota de 50 µL

(aproximadamente 50 propágulos) foi inoculada em placas de Petri (90 x 15 mm)

contendo meio Batata Dextrose Ágar (Difco® Laboratories, distribuído por Interlab,

São Paulo, Brasil) acrescido de 1g/L-1 de extrato de levedura (BDAL), e 0,05%

cloranfenicol (p/v) para evitar contaminação por bactérias. O inóculo foi espalhado

pela superfície do meio com auxílio de Alça de Drigalski. As placas foram incubadas

a 27 ± 1ºC, em ausência de luz, por sete dias. Após esse período foram contadas as

colônias em cada placa e calculado, para cada tempo de exposição, o percentual

relativo (PR) de unidades formadoras de colônia (UFC):

𝑃𝑅 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑥 100

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙ô𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒

Conídios e blastosporos do isolado de melhor desempenho nos teste anterior,

foi submetido ainda à exposição prolongada ao calor (45 ± 0,2°C) pelos tempos de 0,

1, 2, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 e 64 horas, seguindo metodologia semelhante ao

ensaio anterior. Ambos os ensaios foram repetidos três vezes, em dias diferentes, e

com diferentes lotes de propágulos para cada experimento.

2.3 Tolerância à radiação ultravioleta UV-B

Suspensões de conídios ou blastosporos (103 propágulo/mL) foram inoculadas

(50 µL) em placas de Petri (90 × 15 mm) contendo meio BDAL, e espalhadas por toda

60

a superfície do meio com auxílio da Alça de Drigalski. As placas foram imediatamente

expostas a 743,75 mW m-2 de radiação UV-B de acordo com Quaite et al. (1992). As

amostras foram expostas à radiação UV-B em uma câmara de madeira contendo quatro

lâmpadas ultravioleta (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation, Cleveland, USA) com pico

de UV-B em 313 nm e mínima eliminação de radiação UV-A (Figura 1). As lâmpadas

foram ligadas previamente à exposição por 20 minutos para estabilização da emissão

de radiação.

Figura 9. Espectro da irradiação baseado na fórmula de Quaite (Quaite et al. 1992)

emitido por quatro lâmpadas fluorescentes (UVB-313 EL, Q-Lab Corporation,

Cleveland, USA) em câmara de madeira confeccionada para exposição de

microrganismos à radiação ultravioleta. O valor da irradiância de Quaite (743,75

mWm-2) foi obtida com auxílio do espectrorradiômetro USB2000+RAD (Dunedin,

FL) coberto por diacetato de celulose para o completo bloqueio de comprimentos de

onda inferiores a 290 nm.

A temperatura na câmara foi mantida em 26 ± 1ºC por climatização da sala, e

a temperatura e umidade relativa foram registradas por um equipamento data logger

HOBO H8® (Onset Computer Corporation, Bourne, MA, USA) durante todo o

experimento. As placas de Petri contendo as amostras foram cobertas com um filme

de diacetato de celulose (JCS Industries, Le Mirada, CA, USA) com 0,13 mm de

espessura para bloquear radiação ultravioleta com comprimento de onda inferior a 290

nm (UV-C e pequenos comprimentos de onda de UV-B), que em condições naturais é

61

bloqueada pela atmosfera e não atinge a superfície terrestre. No entanto, este filtro

permite a passagem de UV-B (290–320 nm) em maior parte, e UV-A (320–400 nm).

Placas do grupo controle foram cobertas com papel alumínio para bloquear toda

radiação UV e mantidas dentro da câmara durante a exposição. O espectro da

irradiação foi mensurado com utilização de espectrorradiômetro USB 2000+RAD

(Dunedin, Flórida, Estados Unidos), e a dose determinada em kJm-2 em função do

espectro e do tempo de exposição (BRAGA et al., 2001).

Placas contendo suspensões de conídios ou blastosporos foram expostas a

doses de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01, 5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, correspondendo aos

tempos de 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos. Após a exposição, as placas foram

incubadas a 27 ± 1ºC, em ausência de luz, por sete dias. Em seguida foram contadas

as colônias em cada placa e calculado o percentual relativo de UFC, como descrito no

item 2.2. Os experimentos foram conduzidos por três vezes, em dias diferentes e com

lotes de propágulos diferentes para cada experimento.

2.4 Análise estatística

Diferenças entre os percentuais relativos médios de UFC foram determinados

através de análise de variância fatorial (ANOVA fatorial), seguidos do teste Student-

Newman-Keuls (SNK). Comparação de termotolerância de conídios e blastosporos

nos tempos de 60 e 120 minutos de exposição foi realizada por ANOVA uma via. Para

todas as análises utilizou-se nível de significância de 5% (P ≤ 0,05).

3 Resultados

Grande variação de termotolerância foi observada entre os isolados

investigados. No tempo de 60 minutos de exposição de conídios a 45°C, foi observado

que IP 363 (M. anisopliae s.l.) foi tão tolerante quanto ARSEF 324 (M. acridum). Aos

120 minutos de exposição, no entanto, as médias do percentual relativo de UFC (PR)

de conídios dos isolados ARSEF 324 (79,1%) e IP 363 (55,5%) diferiram entre si e

dos demais isolados; já conídios de CG 307 (7,58%), IP 146 (1,5%) e IP 361 (0%)

62

apresentaram baixa tolerância ao calor com percentual médio próximo ou igual a zero

(F16,50 = 9,322; P < 0,001) (Figura 2).

Blastosporos dos isolados de Metarhizium spp., IP 363 (92%), ARSEF 324

(90,8%) e do isolado de B. bassiana, CG 307 (89,6%), apresentaram percentuais

relativos de UFC estatisticamente iguais até 30 minutos de exposição ao calor, sendo

os dois últimos (ARSEF 324 e CG 307) semelhantes até o tempo de 45 minutos, com

percentual médio de 85,8% e 84%, respectivamente. Blastosporos de IP 361 (B.

bassiana) foram menos tolerantes ao calor, diferindo dos demais isolados já no tempo

de 15 minutos de exposição (F36,98 = 20,379; P < 0,001) (Figura 2).

63

Figura 10. Termotolerância de propágulos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), M.

robertsii (IP 146), M. acridum (ARSEF 324) e Beauveira bassiana (IP 361 e CG 307)

aquecidos a 45 ± 0,2°C em banho-maria. Conídios foram expostos ao calor por 0

(controle), 60, 120, 240 e 360 minutos, enquanto blastosporos nos tempos de 0

(controle), 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 240 e 360 minutos. Desvio padrão calculado

sobre 3 repetições independentes.

Comparações do percentual relativo médio de UFC entre os propágulos de cada

isolado foram feitas nos tempos de 60 e 120 minutos de exposição ao calor. Conídios

de M. anisopliae s.l. (IP 363) foram mais tolerantes após 60 minutos de exposição do

64

que blastosporos do mesmo isolado (F1,4=11,707; P = 0,026), enquanto que

blastosporos de CG 307 mostraram-se mais tolerantes do que conídios (F1,4 = 14,18; P

= 0,019) (Figura 3). Os isolados IP 146 (F1,4 = 0,23; P = 0,655), ARSEF 324 (F1,4 = 1;

P = 0,373) e IP 361 (F1,4 = 3,73; P = 0,125) não demonstraram diferença na

termotolerância entre propágulos avaliados com 60 minutos de exposição. Após 120

minutos de tratamento, conídios de IP 363 (55,5%) continuaram apresentando maior

percentual de UFC do que blastosporos (0%) (F1,4 = 226,97; P < 0,001). Em

contrapartida, blastosporos (100%) de ARSEF 324 foram mais tolerantes do que

conídios (86,3%) após 120 minutos de exposição ao calor (F1,4 = 539,27; P < 0,001).

Os demais isolados IP 146 (F1,4 = 1; P = 0,373), IP 361 (ambos propágulos com

percentual igual a zero) e CG 307 (F1,4 = 3,98; P = 0,116), não demonstraram diferença

de tolerância ao calor entre propágulos no tempo de 120 minutos de exposição.

Figura 11. Termotolerância comparativa entre conídios e blastosporos de um mesmo

isolado em Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii (IP 146),

Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307).

Médias seguidas por asterisco (*) ou duplo asterisco (**) diferem entre si (P < 0,05)

quando expostas a 45 ± 0,2°C, por 60 ou 120 minutos, respectivamente.

Não foi observada diferença estatística entre os propágulos de ARSEF 324 até

o tempo de 4 horas de tratamento (Figura 4). Após esse período, conídios de ARSEF

65

324 foram mais tolerantes ao calor do que blastosporos até o tempo de 40 horas de

exposição; no tempo de 48 horas e nos tempos subsequentes de exposição ao calor,

conídios e blastosporos igualaram-se novamente em tolerância (F12,26 = 7,323; P <

0,001), com conídios apresentando percentual relativo de UFC em torno de 20%. Com

16 horas de exposição ao calor, enquanto conídios apresentaram percentual relativo

médio de 57,3%, blastosporos já não apresentavam formação de colônias.

Figura 12. Termotolerância de conídios e blastosporos de Metarhizium acridum

(ARSEF 324) expostos a 45 ± 0,2°C por 0 (controle), 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16, 24, 32, 40,

48, 56 ou 64 horas. Médias seguidas por asterisco (*) indicam diferença do percentual

relativo médio de UFC entre os propágulos dentro de um mesmo tempo de exposição

(F12,26=7,323; P < 0,001).

Avaliando-se a diferença de tolerância entre propágulos de um mesmo isolado,

apenas conídios de ARSEF 324 na dose de 4,01 kJm-2 (F1,4 = 10,06; P = 0,033) e de

CG 307 nas doses de 1,33 (F1,4 = 10,88; P = 0,029), 2,76 (F1,4 = 18,12; P = 0,013), 4,01

(F1,4 = 21,33; P = 0,009) e 5,35 kJm-2 (F1,4 = 10,50; P = 0,031) apresentaram tolerância

superior a de blastosporos; para os demais isolados e doses não houve diferença de

tolerância entre os propágulos.

**

*

* **

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 4 6 8 16 24 32 40 48 56 64

Perc

entu

al re

lativo d

e U

FC

Tempo de exposição (horas)

Conídios Blastosporos

66

Conídios dos cinco isolados não diferiram entre si em tolerância até a dose de

4,01 kJm-2 (F20,60 = 1,78; P = 0,043); porém, quando expostos a doses maiores, o

isolado ARSEF 324 foi o único isolado que não demonstrou diferença de tolerância

entre as doses avaliadas. Houve queda na tolerância de conídios dos isolados avaliados,

com o aumentos das doses de radiação, exceto para o isolado ARSEF 324 (F5,12 = 0,69;

P = 0,635), demonstrado ser o isolado mais tolerante. Em relação aos blastosporos,

apenas o isolado CG 307 (F5,12 = 9,53; P < 0,001) demonstrou queda na tolerância a

UV-B entre a primeira dose (1,33 kJ m-2) e as demais (2,67 a 8,03 kJ m-2); ARSEF 324

(F5,12 = 1,15; P = 0,383), IP 146 (F5,12 = 1,21; P = 0,360), IP 363 (F5,12 = 1,50; P =

0,258) e IP 361 (F5,12 = 2,99; P = 0,055) não demonstraram diferença na tolerância a

UV-B entre as doses avaliadas.

67

Figura 13. Tolerância à radiação ultravioleta (UV-B) de conídios e blastosporos de Metarhizium anisopliae s.l. (IP 363), Metarhizium robertsii

(IP 146), Metarhizium acridum (ARSEF 324) e Beauveria bassiana s.l. (IP 361 e CG 307), expostos às doses de 0 (controle), 1,33, 2,67, 4,01,

5,35, 6,69 ou 8,03 kJm-2, à 743,75 mW m-2 de irradiância de Quaite (QUAITE et al., 1992).

68

4. Discussão

Ambos os propágulos do isolado ARSEF 324 apresentaram maior

termotolerância quando comparado aos demais isolados avaliados; assim como os

ensaios de exposição à UV-B demonstraram que conídios desse isolado foram os mais

tolerantes. Estudos prévios com conídios desse isolado demonstraram tolerância

semelhante aos obtidos no presente trabalho tanto para calor quanto para UV

(RANGEL et al., 2005a, 2005b; FERNANDES et al., 2010), o que confirma a notável

tolerância desse isolado de M. acridum a fatores abióticos estressantes.

Micro-organismos os quais crescem em ambientes adversos tendem a

desenvolver mecanismos mais eficazes de proteção (RANGEL et al., 2008). A notável

tolerância de M. acridum ao calor em relação a outros fungos entomopatogênicos está

possivelmente relacionada ao local de isolamento deste fungo; essa espécie é isolada

em regiões quentes e áridas e apresenta certa especificidade por insetos da classe

Orthoptera, que apresentam comportamento de realizar exposição ao sol para elevar a

temperatura corpórea (BLANFORD; THOMAS, 2000). Apesar dos fungos

entomopatogênicos serem, em geral, mesofílicos, com temperatura de crescimento

variando entre 10 e 40 ºC e temperatura ótima entre 25 e 35 ºC (COONEY;

EMERSON, 1964), existe uma grande variabilidade entre as espécies e seus isolados

tanto na suscetibilidade ao calor (RANGEL et al., 2005b; FERNANDES et al., 2008)

quanto para à radiação ultravioleta (BIDOCHKA et al., 2001; RANGEL et al., 2005a;

FERNANDES et al., 2007), o que geralmente é atribuído à distribuição geográfica

destes isolados.

Apesar de vários trabalhos demonstrarem a tolerância de fungos

entomopatogêncios a fatores abióticos estressantes, pouco se sabe sobre o

comportamento de blastosporos frente ao calor e a outras intempéries do ambiente. No

presente estudo, blastosporos foram, de forma geral, menos tolerantes ao calor do que

conídios do mesmo isolado. Tal característica também foi observada por Kim et al.,

(2013) quando avaliaram a termotolerância de propágulos de Isaria fumosorosea. A

maior sensibilidade dos blastosporos ao calor em relação aos conídios poderia ser

prevista ao considerar que conídios são estruturas de resistência encontradas

normalmente no ambiente, enquanto que blastosporos são produzidos, durante o

69

processo de infecção, na hemocele do hospedeiro (ORTIZ-URQUIZA; KEYHANI,

2015), sendo portanto, estruturas não adaptadas para ambientes hostis.

Fungos entomopatogênicos reagem de diferentes formas quando submetidos a

estresses, desencadeando diferentes mecanismos de proteção e reparação causados por

essas condições. A exposição a altas temperaturas, por exemplo, induz a produção de

proteínas chamadas de heat shock (HSP), as quais previnem a desnaturação das

proteínas induzidas pela exposição ao calor (RICHTER et al., 2010), incrementando

assim a termotolerância do fungo (PLESOFSKY-VIG; BRAMBL, 1985). Dessa

forma, apesar de conídios e blastosporos apresentarem mecanismos semelhantes de

proteção contra o calor, possivelmente os danos causados aos blastosporos são

maiores.

Frente à exposição à radiação ultravioleta, fungos entomopatogêncios

apresentam mecanismos de proteção e também de reparação de danos. No presente

estudo, os ensaios com exposição à radiação UV-B demonstraram pouca variação de

tolerância entre isolados e seus propágulos nas diferentes doses avaliadas. Neste caso,

provavelmete, apesar dos danos causados pela exposição, os diferentes propágulos

apresentam os mesmos mecanismos de reparação, sendo portanto capazes de fazê-lo

apesar do dano inicial. As principais enzimas envolvidas nesse processo são as

fotoliases, as quais utilizam a luz como fonte de energia para a remoção dos dímeros

de pirimidina formados no DNA das células expostas a UV-B (KAO et al., 2005).

Contraditoriamente, Ottati-de-Lima et al. (2014) citam que blastosporos apresentam

baixa tolerância à radiação ultravioleta, porém neste estudo não é mencionada a dose

de radiação utilizada nos testes.

Apesar de mais sensíveis ao calor, blastosporos de M. robertsii (IP 146) e B.

bassiana (IP 361) iniciam a germinação mais rapidamente do que conídios

(BERNARDO; FERNANDES, dados não publicados), assim como observado por

Vega et al. (1999) para Isaria fumosorosa (=Paecylomyces fumosorosea). Tal

característica é importante, pois quanto mais rápido o processo de infecção, menor será

o tempo de exposição do propágulo a fatores abióticos estressantes (VEGA et al.,

1999), sendo maior a possibilidade de causar infecção e morte do hospedeiro. O tempo

de penetração do fungo através da germinação de conídios na cutícula de carrapatos

pode variar de 24 a 48 horas, apresentando com 72 horas massiva penetração dos

70

propágulos, portanto um longo período o qual o fungo fica exposto a fatores abióticos

adversos (ARRUDA et al., 2005; BERNARDO; FERNANDES dados não

publicados).

Segundo Jackson et al. (2010), o processo de produção do fungo pode ser

manipulado para obtenção de propágulos mais tolerantes e, consequentemente, mais

eficientes. A partir disso, algumas técnicas têm sido desenvolvidas no intuito de

maximizar o potencial de fungos entomopatogênicos para o biocontrole. Já foi relatado

que conídios submetidos a estresse durante o crescimento, seja ele nutricional,

osmótico ou térmico, tendem a apresentar maior tolerância ao calor e à radiação UV-

B (RANGEL et al., 2008). Além disso, as formulações têm sido intensamente

estudadas e têm demonstrado aficácia no incremento da tolerância de conídios

(ANGELO et al., 2010; CAMARGO et al., 2012; BARRETO et al., 2016) e

blastosporos (KIM et al., 2013) de fungos entomopatogênicos ao calor.

Vários fatores estão envolvidos na escolha adequada do fungo e do propágulo

a ser utilizado em programas de biocontrole, passando pelo comportamento do

artrópode alvo até a estratégia de aplicação do bioproduto. Ao considerar aplicações

do fungo no ambiente onde a praga está inserida (tratamento indireto), pode ser mais

apropriada a utilização de propágulos mais adaptados à condições adversas, como por

exemplo conídios. No entanto, se o intuito é o tratamento do artrópode alvo

(tratamento direto), propágulos que possuam mecanismos de infecção mais rápidos e

que, portanto, estejam menos expostos a fatores abióticos, como os blastosporos,

devem ser preferidos. Neste sentido, técnicas adequadas que visem aumentar a

tolerância ou proteger os propágulos fúngicos contra o calor e à radiação UV-B são

requeridas por ambos propágulos. Contudo, é importante desmistificar as

especulações sobre a tolerância de blastosporos; ambos propágulos estudados são

importantes e possuem qualidades e desvantagens, sendo prudente a avaliação como

um todo das características de cada propágulo e isolado, buscando minimizar as

desvantagens de cada um deles e potencializar seus pontos positivos.

71

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75

6 DISCUSSÃO

Ensaios de virulência de conídios e blastosporos de Metarhizium spp. e

Beauveria bassiana para larvas não alimentadas de Rhipicephalus microplus

demonstraram melhor desempenho de conídios de IP 361 (B. bassiana), com maior

mortalidade e menor CL50 em relação aos demais tratamentos. Porém, para fêmeas

ingurgitadas de R. microplus, blastosporos dos isolados IP 146 (Metarhizium robertsii)

e IP 361 (B. bassiana) foram os mais virulentos promovendo menores índices

nutricional e de produção de ovos, além de um maior percentual de controle.

A partir dessa diferença de suscetibilidade entre os estágios de

desenvolvimento do carrapato, foi pesquisado o modo de infecção dos propágulos de

M. robertsii (IP 146) e B. bassiana (IP 361) em fêmeas ingurgitadas de R. microplus.

Foi observado que blastosporos de ambos isolados avaliados apresentaram

crescimento acelerado sobre a cutícula, permitindo a rápida colonização externa do

carrapato, o que favoreceu a cobertura e a possível penetração de blastosporos por

aberturas naturais desses artrópodes. Em contrapartida, conídios penetram unicamente

através da cutícula do carrapato como demonstrado neste e em outros trabalhos

(BITTENCOURT et al., 1999; ARRUDA et al., 2005).

Apesar de não ser o único fator que influencia na virulência de fungos, a

cutícula é, no entanto, a primeira barreira a ser transposta (MENT et al., 2010). Durante

a infecção em carrapatos, fungos entomopatogênicos entram em contato com

componentes de cutícula desses artrópodes que são tóxicas aos conídios e aos tubos

germinativos (MENT et al., 2013). As características de infecção observadas no

presente estudo para blastosporos podem, portanto, amenizar a exposição destes

propágulos a componentes fungiostáticos da cutícula de R. microplus.

Larvas de R. microplus são menores do que adultos dessa espécie, além de não

apresentarem poro genital ou espiráculo, como evidenciado por Estrada-Peña et al.

(2012). Tais características podem justificar o fato de blastosporos terem sido, em

geral, mais virulentos para fêmeas ingurgitadas de R. microplus, enquanto conídios

dos mesmos isolados terem sido mais virulentos para larvas, já que o menor número e

tamanho das aberturas presentes nas larvas de carrapatos poderiam dificultar essa via

76

de penetração por blastosporos. Além disso, considerando que larvas de carrapatos

são, em geral, mais sensíveis a fungos entomopatogênicos do que fêmeas ingurgitadas

(CASTRO et al., 1997), a penetração do fungo por blastosporos através das aberturas

anal e genital pode justificar a maior virulência desses propágulos para fêmeas

ingurgitadas em relação às larvas.

Blastosporos de IP 361 (B. bassiana) demonstraram a formação de apressório

pelo menos 44 horas antes do que conídios do mesmo isolado. Apesar de não haver

evidência da penetração através da cutícula de carrapatos por blastosporos do isolado

IP 146 (M. robertsii), nos bioensaios foi evidenciado o feito da infecção sobre a

biologia das fêmeas ingurgitadas, e observada a exteriorização do fungo a partir do

cadáver das fêmeas tratadas. Segundo (LEGER, ST. et al., 1991), no entanto, a

formação de apressório não é um pré-requisito para o processo de infecção, já que

substâncias mucilaginosas responsáveis pela adesão dos fungos na cutícula do

artrópode são produzidas também a partir de hifas em crescimento, maiores que 2 μm.

Foi evidenciado a formação de novos blastosporos na cutícula de fêmeas

tratadas com blastosporos de IP 361, promovendo portanto uma renovação e aumento

do número dos propágulos na cutícula do carrapato. Tais características dos

blastosporos demonstram o potencial destes propágulos para o uso em programas de

biocontrole.

O rápido desenvolvimento de blastosporos em relação aos conídios também

foi demonstrado em Isaria fumosorosea sobre a cutícula de mosca branca (VEGA et

al., 1999) e em meio de cultura (JACKSON et al., 2003). Resultados promissores

foram demonstrados por Hall (1979) quando comparou conídios e blastosporos de

Lecanicillium lecanii (=Verticillium lecanii) contra Macrosiphonella sanborni

(Hemiptera: Aphididae), e comprovou que blastosporos foram duas vezes mais

virulento. Para carrapatos, foram reportados índices menores que 10% na muda de

larvas e ninfas ingurgitadas de Ixodes ricinus tratadas com blastosporos de M.

anisopliae (WASSERMANN et al., 2016).

Miranpuri e Khachatourians (1990) observaram virulência semelhante de

conídios e blastosporos de B. bassiana contra larvas de Aedes aegypti, assim como

Kim et al. (2013) demonstraram para propágulos de I. fumosorosea contra mosca

branca. Mesmo não demonstrando diferenças de virulência entre propágulos, tais

77

resultados mostram quão promissores são os blastosporos para o uso em programas de

biocontrole. Mascarin et al. (2015) citam que o baixo custo na produção e

processamento de micoacaricidas são cruciais para a comercialização destes. Neste

contexto, blatosporos demandam menor custo e tempo de produção do que conídios

(KIM et al., 2013), tornando-se assim propágulos que despertam interesse como

ingrediente ativo de bioprodutos.

Apesar de maior facilidade de produção em larga escala e da rápida germinação

sobre a cutícula de artrópodes, evidências indicam que blastosporos, de um modo

geral, seriam menos tolerantes ao calor e à radiação UV-B do que conídios (KIM et

al., 2013; OTTATI-DE-LIMA et al., 2014). Naturalmente, blastosporos são estruturas

em desenvolvimento encontradas no interior do artrópode infectado, enquanto

conídios são estruturas de resistência (ORTIZ-URQUIZA; KEYHANI, 2015). No

entanto, Vega et al. (1999) afirmaram que propágulos que germinam mais rapidamente

precisam de menos tempo para penetrar no hospedeiro, e deste modo, estes tendem a

ficar menos tempo expostos a fatores adversos do ambiente. Além disso, formulações

e diferentes técnicas de produção dos fungos podem aumentar a tolerância destes

propágulos a fatores estressantes (RANGEL et al., 2008; KIM et al., 2013).

Kim et al. (2013) demonstraram menor termotolerância de blastosporos de I.

fumosorosea em relação aos conídios da mesma espécie, porém citam que a

formulação destes em óleo aumentam significativamente sua tolerância. Cliquet e

Jackson (1999) demonstraram a influência dos componentes do meio de cultura na

tolerância de blastosporos de I. fumosorosea à secagem à quente, assim como Rangel

et al. (2006) observaram na tolerância à radiação UV-B de conídios de M. anisopliae.

De modo geral, conídios e blastosporos dos isolados avaliados apresentaram tolerância

semelhante às doses de radiação UV-B utilizadas no presente estudo. Portanto,

técnicas que visem incrementar a tolerâcia de propágulos fúngicos a fatores ambientais

adversos são necessários para ambos os propágulos, conídios e blastosporos.

Trabalhos que demonstrem isolados mais tolerantes e promovam o conhecimento das

respostas de cada propágulo e isolado ao artrópode alvo e às intempéries encontradas

em campo durante o uso do fungo em programas de biocontrole são importantes para

disseminar o uso do controle biológico.

78

7 CONCLUSÕES

1. Dentre os isolados avaliados, conídios foram mais virulentos para larvas de

Rhipicephalus microplus do que blastosporos;

2. Blastosporos de Metarhizium spp. foram mais virulentos para fêmeas ingurgitadas

de R. microplus do que conídios deste gênero, e também do que ambos propágulos

de B. bassiana,;

3. Blastosporos germinaram consideravelmente mais rápido do que conídios sobre a

cutícula de fêmeas ingurgitadas de R. microplus;

4. Dupla possibilidade de penetração de blastosporos de B. bassiana foi evidenciada

em carrapatos: por aberturas naturais e através da cutícula;

5. A formação de novos propágulos sobre a cutícula de fêmeas ingurgitadas de R.

microplus tratadas com blastosporos de Beauveria bassiana foi detectada;

6. Blastosporos de Metarhizium spp. foram mais sensíveis ao calor do que conídios;

7. A termotolerância de blastosporos em relação a de conídios de Beauveria

bassiana variou entre isolados;

8. De modo geral, blastosporos foram tão sensíveis à radiação UV-B quanto os

conídios dos mesmos isolados avaliados.

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