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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
NATHÁLIA ALMEIDA DE SOUSA
Controle de ovos de Aedes aegypti com Metarhizium anisopliae IP 46
por diferentes técnicas
Goiânia
2013
2
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e
Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
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Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e
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1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Nathália Almeida de Sousa
E-mail: [email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ ]Sim [ X ] Não
Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento: Sigla:
País: UF: CNPJ:
Título: Controle de ovos de Aedes aegypti com Metarhizium anisopliae IP 46 por diferentes
técnicas
Palavras-chave: Aedes aegypti, formulações, fungos entomopatogênicos
Título em outra língua: Control of Aedes aegypt eggs with Metarhizium anisopliae by different techniques
Palavras-chave em outra língua: Aedes aegypti, formulations, entomopathogenic
fungi
Área de concentração: Parasitologia
Data defesa: (20/02/2013)
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública/ IPTSP – UFG
Orientador (a): Prof. Dr. Wolf Christian Luz
E-mail: [email protected]
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1
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________________________________________ Data: ____ /____ /_____
Assinatura do (a) autor (a)
1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste
prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão
disponibilizados durante o período de embargo.
i
NATHÁLIA ALMEIDA DE SOUSA
Controle de ovos de Aedes aegypti com Metarhizium anisopliae IP 46
por diferentes técnicas
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título de
Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Área de concentração: Parasitologia
Orientador: Prof. Dr. Wolf Christian Luz
Goiânia
2013
ii
iii
“O que vale na vida não é o ponto de
partida e sim a caminhada. Caminhando
e semeando, no fim terás o que colher.”
Cora Coralina
iv
Dedico este trabalho aos meus pais
Geraldo Domingos de Sousa e Elaine
Eliza Gomes de Almeida, pelo seu amor
incondicional, educação e sábias
palavras.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Christian Luz, Professor do Departamento de Microbiologia,
Imunologia, Parasitologia e Patologia (DMIPP), Setor de Parasitologia do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da Universidade Federal de Goiás (UFG)
por todo auxílio e pela excelente supervisão e orientação.
Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás pela oportunidade.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.
A todos os membros da equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados –
IPTSP/UFG, em especial ao Profº. Drº. Éverton Kort Kamp, Renan Nunes Leles,
Juscelino Rodrigues, Walmirton D’Alessandro Bezerra, Luciana Silva Lobo, Priscilla
Rodrigues Borges e Rayssa de Fátima Hubner Campos pelo apoio, auxílio e
companheirismo.
À equipe do Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstico -
IPTSP/UFG - em especial a Drª Heloísa Helena Garcia da Silva e a técnica Carmeci
Natalina Elias pelo fornecimento dos ovos utilizados nos experimentos.
Aos meus pais, Elaine Eliza e Geraldo Domingos, pelo exemplo, amor e incentivo
constantes.
À minha tia, Eliane Eliza, que mesmo longe, me mostra seu apoio e admiração em
pequenos gestos de amor.
Ao meu querido Marcelo, por todas as formas de afeto, motivação, apoio e paciência.
Aos meus verdadeiros amigos, que nunca deixaram de estar ao meu lado.
A Deus, sempre presente em minha vida, me dando força e fé para continuar a busca
por um futuro melhor.
Meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que de alguma forma doaram um
pouco de si para que a conclusão deste trabalho se tornasse possível.
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ..................................................................................................... v
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS .................................................................. ix RESUMO ........................................................................................................................ xi ABSTRACT ................................................................................................................... xii 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
1.1. Aedes aegypti ..................................................................................................... 1
1.1.1. Aspectos morfológicos ............................................................................... 1 1.1.2. Aspectos fisiológicos .................................................................................. 4 1.1.3. Aspectos biológicos .................................................................................... 5
1.2. Dengue ............................................................................................................... 8 1.2.1. Vírus e infecção .......................................................................................... 8
1.2.2. Epidemiologia ............................................................................................. 9 1.2.3. Controle da Dengue .................................................................................. 12
1.3. Fungos entomopatogênicos .............................................................................. 15 1.3.1. Formulações de conídios e técnicas de aplicação ..................................... 20
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 22 3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
3.1. Objetivo geral .................................................................................................. 23 3.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 23
4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 24
4.1. Origem e preparação do fungo ......................................................................... 24 4.2. Origem dos mosquitos e processamento dos ovos ........................................... 25
4.3. Bioensaios ........................................................................................................ 25
4.4. Análise estatística ............................................................................................ 26
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 28 5.1. Desenvolvimento de micélio ou conídios sobre ovos de A. aegypti ................ 28
5.2. Eclosão de larvas sobre papel filtro ................................................................. 29 5.3. Eclosão de larvas após submersão dos ovos em água...................................... 31
6. DISCUSSÃO .......................................................................................................... 34
6.1. Desenvolvimento de micélio e conidiogênese sobre ovos ............................... 34
6.2. Eclosão de larvas estimulada pelo fungo ......................................................... 34 6.3. Formulação de conídios e desenvolvimento de dispositivo para controle de A.
aegypti ........................................................................................................................ 35 7. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 38 8. RECOMENDAÇÕES ............................................................................................. 39
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 40
vii
FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Cabeça de culicídeo em vista superior - (A) Culicinae fêmea, com destaque às
antenas pilosas e os palpos menores que a probóscida; (B) Culicinae macho, destacando
as antenas plumosas e os palpos maiores do que a probóscida. a: antena; pa: palpo
maxilar; pr: probóscida. Fonte: Eiras 2005.......................................................................1
Figura 2. Aedes aegypti, com destaque ao desenho particular em forma de lira no
escudo. Fonte: http://melliton.wordpress.com/2010/04/06/bacteria-contra-transmissao-
da-dengue..........................................................................................................................2
Figura 3. Ovos de Aedes aegypti......................................................................................3
Figura 4. Larva de quarto estádio de Aedes aegypti........................................................4
Figura 5. Forma pupal de Aedes aegypti..........................................................................4
Figura 6. Fases evolutivas de Aedes aegypti. Fonte: www.prdu. unicamp. br
/dengue/mosquito.html......................................................................................................8
Figura 7. Número de casos de dengue notificados por semana epidemiológica em Goiás
de 2010 a 2013. Fonte: Planilha semanal – SES/GO......................................................11
Figura 8. Sorotipos de vírus da dengue circulantes no estado de Goiás no ano de 2012.
Adaptado de: http://portalsaude.saude.gov.br/portalsaude/arquivos/ap_balnco_dengue.
pdf. - Acesso em: 13 de Agosto de 2012.........................................................................12
Figura 9. Ciclo das relações patógeno-hospedeiro entre fungos e insetos. Fonte: Alves
1998.................................................................................................................................18
Figura 10. Aplicação direta (a) e indireta (b) de suspensão de conídios formulados em
água ou óleo-água em ovos de Aedes aegypti, secagem do papel filtro em placa de Petri
(c) e incubação em câmara úmida (d)..............................................................................26
Figura 11. Ovos de Aedes aegypti com desenvolvimento de micélio e conidiogênese
sobre papel filtro, após aplicação de conídios formulados e incubação em umidade
relativa > 98% por 15 dias...............................................................................................28
Figura 12. Número relativo de ovos de Aedes aegypti com micélio ou conídios de
Metharizium anisopliae IP 46 na sua superfície após tratamento direto ou indireto com
diferentes concentrações de conídios suspensos em água (a, c) ou óleo-água (b, d),
respectivamente, e exposição a 25 ºC e umidade relativa > 98% por 15 dias.................29
Figura 13. Número relativo de larvas de Aedes aegypti eclodidas sobre papel filtro após
tratamento direto e indireto de ovos com conídios de Metharizium anisoplie IP 46 em
viii
diferentes concentrações, suspensos em água (a, c) ou óleo-água (b, d), respectivamente,
e exposição a 25 ºC e umidade relativa > 98% por 15 dias.............................................30
Figura 14. Eclosão relativa acumulada de larvas de Aedes aegypti após tratamento
indireto (a) ou direto (b) de ovos com diferentes concentrações de conídios de
Metharizium anisopliae IP 46 suspensos em água (-●-) ou óleo-água (-○-) e exposição a
25 ºC e umidade relativa > 98% por 15 dias e subsequente submersão dos ovos em água
por 10 dias.......................................................................................................................32
Tabela 1. Concentração de eliminação de 50 e 90 % das larvas de Aedes aegypti (CEL50
e CEL90) (conídios/cm2), com respectivos intervalos de confiança (95% I. C.), após
aplicação direta ou indireta de conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 formulados em
água ou óleo-água em ovos e incubação a 25C e umidade relativa > 98% por 15
dias...................................................................................................................................33
ix
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
mm Milímetro
Fig. Figura
L4 Larva de quarto estádio
ºC Graus Celsius
RNA Ácido ribonucleico
DEN-1 Sorotipo 1 do vírus da Dengue
DEN-2 Sorotipo 2 do vírus da Dengue
DEN-3 Sorotipo 3 do vírus da Dengue
DEN-4 Sorotipo 4 do vírus da Dengue
DC Dengue Clássico
FHD Febre Hemorrágica da Dengue
SCD Síndrome do Choque da Dengue
ºN Graus ao Norte
ºS Graus ao Sul
FAU Febre Amarela Urbana
FAS Febre Amarela Silvestre
FUNASA Fundação Nacional da Saúde
OPAS Organização Panamericana da Saúde
DDT Dicloro Difenil Tricloroetano
OMS Organização Mundial da Saúde
UBV Ultra Baixo Volume
USA United States of America
IPT Instituto de Pesquisas Tecnológicas
Pr1 Protease 1
DTX Destruxinas
pH Potencial hidrogeniônico
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
UFG Universidade Federal de Goiás
BDA Batata, Dextrose e Agar
UR Umidade Relativa
g Grama
ml Mililitro
x
cm2 Centímetro quadrado
µl Microlitro
SDAY Sabouraud, Dextrose, Agar and Yeast
UV-C Radiação ultravioleta C de onda curta
cm Centímetro
ANOVA Análise de Variância
log Logaritmo
CEL50 Concentração de Eliminação de 50% das Larvas
CEL90 Concentração de Eliminação de 90% das Larvas
Tab. Tabela
I.C. Intervalo de Confiança
xi
RESUMO
Casos de resistência de Aedes aegypti a inseticidas, associados ao risco de produtos
químicos para o meio ambiente e à saúde humana, incentivam a busca por medidas
alternativas de controle desse mosquito. Fungos entomopatogênicos, especialmente
Metarhizium anisopliae IP 46, possuem especificidade para artrópodes e não provocam
danos ao homem e ao ambiente. Esse fungo é virulento para os estágios de larva e
adulto, mas sua atividade ovicida contra A. aegypti ainda é pouco explorada.
Formulações de conídios com aditivos, como óleos, visam auxiliar o fungo a superar
efeitos adversos ao seu desenvolvimento e potencializar sua ação entomopatogênica. A
aplicação direta de formulados de conídios sobre um inseto leva a uma maior
contaminação quantitativa quando comparada a aplicação indireta, ou seja, sobre uma
área na qual o inseto entra em contato posteriormente. Entretanto, métodos de aplicação
indireta de conídios são mais indicados para infectar e eliminar ovos e adultos de A.
aegypti no campo, onde a pulverização direta de micoinseticidas sobre esses parece
inviável. O presente estudo relatou dados importantes sobre a efetividade de conídios
formulados em água e óleo-água e técnicas de aplicação direta e indireta em ovos de A.
aegypti. Conídios de M. anisopliae IP 46 foram formulados em água e óleo-água a 10%
de óleo vegetal em cinco concentrações crescentes (3,3 x 103, 10
4, 3,3 x 10
4, 10
5 e 3,3 x
105 conídios/ cm
2). Os formulados foram aplicados sobre 30 ovos (em cada teste) em
papel filtro (aplicação direta) e sobre o papel filtro com exposição posterior dos ovos
(aplicação indireta). Os ovos foram incubados por 15 dias a 25 ± 1 °C e umidades
relativas ≥ 98%. Diariamente, foram avaliados o crescimento de micélio, a
conidiogênese sobre os ovos e a eclosão sobre o papel filtro. Ao 15º dia de exposição,
papéis filtro com ovos foram transferidos para recipiente com 20 mL de água de torneira
autoclavada. A eclosão de larvas na água foi examinada diariamente, durante 10 dias. A
atividade ovicida de M. anisopliae aumentou em altas concentrações de conídios
independente da técnica de aplicação. Houve desenvolvimento de micélio e conídios
sobre ovos, independentemente do tipo de formulação e da técnica de aplicação. As
concentrações de eliminação de larvas (CEL) foram menores com conídios formulados
em óleo-água aplicados direta ou indiretamente (CEL50 ≤ 4,8 x 103 conídios/ cm
2 e
CEL90 ≤ 1,9 x 105 conídios/ cm
2). IP 46 também foi efetivo contra ovos de A. aegypti
quando conídios foram formulados em óleo-água e aplicados indiretamente. O presente
estudo mostrou que a aplicação indireta de formulado fúngico à base de óleo parece ser
uma ferramenta apropriada para infectar ovos postos por fêmeas de A. aegypti sobre um
substrato tratado com conídios.
Palavras - chave: Aedes aegypti, formulações, fungos entomopatogênicos.
xii
ABSTRACT
Cases of insecticide resistance of Aedes aegypti associated with risk of chemical
products to environment and human health encourage the search of alternative measures
to control this mosquito. Entomopathogenic fungi, especially Metarhizium. anisopliae
IP 46, have specificity to arthropods and do not cause damages to humans and the
environment. This fungus is virulent to larvae and adult stages, but their ovicidal
activity against A. aegypti is still little explored. Formulations of conidia with additives,
such as oils, aim to help the fungus to overcome adverse effects on their development
and potentiate its entomopathogenic action. Direct application of formulated conidia on
an insect leads to a greater quantitative contamination compared to indirect application,
namely over an area in which the insect subsequently comes into contact. However,
methods of indirect application of conidia are more indicated to infect and remove eggs
and adults of A. aegypti in the field, where a direct spray of micoinsecticides seems
unfeasible. This study reports important data on the effectiveness of conidia formulated
in water or oil-in-water and directly or indirectly application techniques on eggs of A.
aegypti. IP 46 conidia were formulated in water or oil-in-water at 10% of vegetable oil
in five concentrations (3.3 x 103, 10
4, 3.3 x 10
4, 3.3 x 10
5 and 10
5conidia/ cm
2).
Formulated conidia were applied on 30 eggs (each test) on filter paper (direct
application) or on filter paper with subsequent exposure of eggs (indirect application).
The eggs were incubated for 15 days at 25 ± 1 ° C and relative humidities ≥ 98%. Daily,
the growth of mycelium, conidiogenesis on eggs and eclosion on the filter paper were
checked. At 15 days of exposure, filter papers with eggs were transferred to 20 ml
sterilized tap water in a container. Eclosion of larvae in water was examined daily for 10
days. The ovicidal activity of M. anisopliae increased at h igher conidia concentrations
tested regardless of the application technique. There was development of mycelium and
conidia on eggs, regardless of the type of formulation and application technique. The
larvae elimination concentrations (LEC) were lowest with oil-in-water formulated
conidia applied direct or indirectly (LEC50 ≤ 4.9 x 103 conidia/ cm
2 and LEC90 ≤ 1.9 x
105 conidia / cm
2). IP 46 was also effective against eggs of A. aegypti when conidia
were formulated in oil-in-water and indirectly applied. The results showed that an
indirect application of oil-based fungal formulation seems to be an adequate tool for
infecting eggs laid by A. aegypti females on substrates treated with conidia.
Key words: Aedes aegypti, formulations, entomopathogenic fungi.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aedes aegypti
1.1.1. Aspectos morfológicos
Aedes aegypti Linnaeus 1762, pertence ao Filo Arthropoda, à Classe Insecta, à
Ordem Diptera, Família Culicidae e Subfamília Culicinae. Como todo indivíduo
pertencente a esse filo, essa espécie apresenta metameria, ou seja, o corpo dividido em
segmentos, denominados metâmeros. Alguns desses segmentos se unem e formam a
cabeça, o tórax e o abdome.
Os adultos dessa espécie medem cerca de 3-6 mm de comprimento, entretanto,
os indivíduos do sexo masculino são, de maneira geral, menores do que as fêmeas.
Possuem o corpo delgado, pernas longas, cabeça globosa, tórax comprimido
lateralmente e abdome cilíndrico. O tórax, as pernas, as asas e o abdome são revestidos
por escamas com tonalidade castanho-escura e há presença de anéis prateados na porção
basal de cada segmento das pernas.
Na cabeça está inserido um par de antenas com o flagelo constituído por 15 a 16
segmentos dotados de longos pelos. Nas fêmeas os pelos são escassos e apresentam
aspecto piloso (Fig. 1 A). Enquanto nos machos, são bastante numerosos e conferem
aspecto plumoso às antenas (Fig. 1 B), Os palpos maxilares inserem-se lateralmente
entre as antenas e a base da probóscida e são mais curtos que a probóscida nas fêmeas e
mais longos que a probóscida nos machos. As peças bucais formam aparelho do tipo
picador-sugador, nos indivíduos do sexo feminino e do tipo sifonador-sugador nos
machos (Fig. 1).
Figura 1. Cabeça de culicídeo em vista superior - (A) Culicinae fêmea,
com destaque às antenas pilosas e os palpos menores que a probóscida;
(B) Culicinae macho, destacando as antenas plumosas e os palpos
maiores do que a probóscida. a: antena; pa: palpo maxilar; pr:
probóscida. Fonte: Eiras 2005.
2
O tórax é formado por três segmentos, o prototórax, mesotórax e metatórax,
sendo a parte dorsal de cada segmento chamada de noto. Há a presença de escamas
branco-prateadas compondo uma nítida faixa curva, de cada lado do tórax (mesonoto) e
outra mais fina e reta, longitudinal, central, formando um desenho em forma de lira
(Fig. 2). Cada segmento do tórax tem um par de pernas, formadas por coxa, trocanter,
fêmur, tíbia e tarso subdividido em cinco tarsômeros e na sua extremidade há a presença
de garras tarsais denteadas. As asas (um par), inseridas no tórax, são estreitas e
alongadas e permanecem superpostas sobre o abdome, quando em repouso.
Figura 2. Aedes aegypti, com destaque ao desenho particular em
forma de lira no escudo. Fonte: http://melliton.wordpress.com/2010/
04/06/bacteria-contra-transmissao-da-dengue.
O abdome é formado por dez segmentos e membranas intersegmentais flexíveis
conectam os segmentos entre si. A elasticidade das membranas possibilita a distensão
abdominal após a alimentação sanguínea das fêmeas, favorecendo a maturação de uma
grande quantidade de ovos. Os últimos segmentos abdominais são modificados para
formar a genitália, sendo diferentes em machos e fêmeas (Forattini 2002).
O corpo desses organismos é revestido por um esqueleto externo, constituído de
partes rígidas e flexíveis que fornecem proteção mecânica contra dessecamento e
parasitismo e ainda permitem a locomoção. A epiderme é responsável pela produção
das três camadas acelulares que compõem o exoesqueleto: a epicutícula, mais externa e
delgada, constituída por lipídios, como ceras; a exocutícula, com quitina e esclerotina
(proteína) conferindo rigidez e a endocutícula, mais espessa e flexível, também
composta principalmente por quitina e outras proteínas. As regiões intersegmentais são
3
constituídas principalmente de quitina, mas pobres em esclerotina, o que confere aos
adultos maior capacidade de movimentação. Entretanto a falta desse componente deixa
esses locais frágeis e, portanto, mais suscetíveis à ação de patógenos, por exemplo.
Os ovos de A. aegypti são elípticos e não ultrapassam 1 mm de comprimento
(Fig. 3). Logo após a postura, a membrana externa dos ovos é flexível e de cor clara.
Em seguida, torna-se rígida e negra, conferindo proteção mecânica e contra a perda
excessiva de água pelo embrião nele contido. A membrana permite ainda que
aconteçam trocas gasosas com o meio externo. Células foliculares que circundam o
oócito secretam proteínas que formam o revestimento dos ovos, chamado cório. Esse é
constituído por duas camadas, a mais interna é chamada de endocório e a externa, de
exocório (Forattini 2002). Esse revestimento é formado na sua maioria por proteínas e
alguma parte por quitina (Li & Li 2006; Moreira et al. 2007)
Figura 3. Ovos de Aedes aegypti
As formas larvais dessa espécie são eucéfalas e ápodas. A cabeça é globosa,
pequena, parcialmente unida ao tórax, bastante esclerotizada e pouco pigmentada. Na
cabeça está inserido um par de antenas e o aparelho bucal do tipo mastigador-raspador.
O tórax das larvas é globoso e mais largo que a cabeça. Os três segmentos torácicos são
fundidos e revestidos por cerdas. As larvas apresentam dez segmentos abdominais. No
oitavo segmento localiza-se o sifão respiratório e no décimo, conhecido por lobo anal, é
onde termina o tubo digestivo das larvas (Fig. 4) (Forattini 2002).
4
Figura 4. Larva de quarto estádio de Aedes
aegypti
As pupas apresentam o formato de vírgula, sendo formadas por cefalotórax
(cabeça + tórax) e abdome. A forma pupal é destituída de mandíbulas funcionais, ou
seja, não se alimentam nesse estágio. No cefalotórax estão inseridas duas trompas
respiratórias, que ficam constantemente acima da superfície líquida possibilitando trocas
gasosas. No último segmento abdominal situa-se um par de paletas natatórias, que
auxiliam na movimentação das pupas (Fig. 5) (Forattini 2002).
Figura 5. Forma pupal de Aedes aegypti
1.1.2. Aspectos fisiológicos
Esse mosquito, como todo inseto, tem tudo digestivo completo, com boca,
intestino anterior, médio e posterior. O intestino anterior e o posterior são forrados por
5
cutícula e não possuem microvilosidades. O intestino anterior é tubular e simples, pois
em insetos hematófagos não são necessárias estruturas para a digestão de sólidos
(Marcondes 2001). O intestino médio tem grande importância na absorção de
substâncias e multiplicação de patógenos.
A hemolinfa circula pela cavidade geral do corpo dos mosquitos transportando
água, substâncias nutritivas, restos metabólicos, hormônios e células de defesa. Túbulos
de Malpighi, que compõem o sistema excretor, retiram substâncias tóxicas ou
desnecessárias e água da hemolinfa e levam até o início do intestino posterior. A
respiração é realizada por tubos quitinizados, as traqueias, que levam o ar até os tecidos.
Inicialmente o ar penetra por espiráculos localizados nas laterais do tórax e abdome, que
direcionam o ar às traqueias (Marcondes 2001).
A. aegypti possui desenvolvimento pós-embrionário por holometabolia, ou seja,
com metamorfose completa. Assim, apresenta os estágios de ovo, quatro estádios
larvais, pupa e adulto (Fig. 6). As formas imaturas, as larvas, são muito diferentes dos
adultos em morfologia e biologia. Para que as larvas iniciem um novo estádio é
necessária troca do tegumento liberando a exúvia. A larva L4 passa para o estágio de
pupa, período em que os tecidos da larva são destruídos e os do adulto são formados.
1.1.3. Aspectos biológicos
As fêmeas grávidas colocam seus ovos preferencialmente em recipientes
artificiais com água acumulada, tanto abandonados pelo homem, como garrafas e pneus,
quanto os utilizados para armazenar água para uso doméstico, como caixas d’água
(Forattini & Brito 2003). As fêmeas ovipõem preferencialmente durante o período
diurno. Depositam os ovos nas paredes internas de criadouros sombreados e úmidos,
próximos à superfície da água ou sobre substratos molhados adjacentes a água (Madeira
et al. 2002). Após um único ciclo gonotrófico, período entre o repasto sanguíneo e a
colocação dos ovos, acontecem múltiplas oviposições. A fêmea interrompe a oviposição
a procura de novos locais para a postura dos ovos, garantindo assim a sobrevivência e
dispersão de sua prole. Esse comportamento tem sido chamado de oviposição em saltos
(Reiter 1991, 1996, 2007).
Imediatamente após a ovipostura, os ovos apresentam coloração branca e são
flexíveis, mas em poucos minutos se tornam pretos e mais resistentes. Após o
desenvolvimento embrionário, que se completa em 48 horas a temperatura de 27 ºC e
6
umidade relativa elevada e sem contato dos ovos com a água, as larvas entram em
diapausa. Assim, os ovos permanecem viáveis por muitos meses, resistindo à
dessecação (Silva & Silva 1999; Luz et al. 2008). Os ovos em diapausa podem ser
transportados pelo homem a grandes distâncias, tornando-se o principal meio de
dispersão do inseto. A rigidez do córion confere aos ovos maior resistência (Pereira et
al. 2006), reduzindo a influência de fatores desfavoráveis como baixa umidade,
temperaturas extremas, radiação ultravioleta, além da ação de patógenos e inseticidas.
Essa resistência é um sério obstáculo para o controle efetivo do mosquito.
Em criadouros com condições favoráveis, as larvas eclodem. A diapausa é
interrompida não só após submersão dos ovos na água, como também por agitação,
variações de temperatura da água e estímulos por metabólitos produzidos por
microrganismos (Livdahl et al. 1984). Bactérias presentes na água proporcionam uma
lenta redução do oxigênio disponível, o que estimula a eclosão de larvas de A. aegypti
(Ponnusamy et al. 2011). Entretanto, metabólitos químicos derivados de plantas podem
estimular larvas a eclodirem, independentemente da diminuição de oxigênio dissolvido
em água (Ponnusamy et al. 2011). De modo contrário, um grande número de larvas
presentes no mesmo criadouro tem efeito negativo sobre a eclosão de novas larvas
(Livdahl et al. 1984; Livdahl & Edgerly 1987; Tsuda et al. 1991). Larvas recém
eclodidas se alimentam de matéria orgânica presente no criadouro e, em cerca de dez
dias, completam os quatro estádios larvais e chegam à fase de pupa e emergência de
adultos (Fig. 6).
Os mosquitos adultos são de fase terrestre e são insetos voadores. Adultos
apresentam sexos separados e possuem caráter antropofílico. Após a emergência, os
mosquitos procuram abrigos para repouso, principalmente em domicílios humanos ou
no peridomicílio. Tem preferência por locais pouco iluminados, com umidade elevada e
sem movimentação de ar. Nos abrigos ocorrem o endurecimento da cutícula corporal e o
amadurecimento da genitália externa do macho, que dura até 24 horas. Após esse
período, os machos estarão aptos para a cópula, que ocorre durante o vôo (Forattini
2002).
Machos e fêmeas adultos se alimentam de água e substâncias energéticas,
geralmente hidratos de carbono. Procuram por substâncias açucaradas presentes no
néctar de flores, orvalho e gotículas presentes na superfície de frutas e excretadas por
afídeos (Forattini 2002). Essas substâncias são requeridas em quantidades suficientes
para a realização de suas funções biológicas como voo e dispersão, com exceção à
7
maturação dos ovos. As fêmeas possuem o hábito da hematofagia e são necessários um
ou mais repastos sanguíneos para conclusão do ciclo gonotrófico. Os nutrientes
provenientes do sangue ingerido são convertidos em substâncias proteicas que serão
transportados aos ovários e formarão o vitelo que será incorporado aos oócitos
(Clements 2000).
As fêmeas restrigem seus hábitos hematófagos aos horários diurnos e seus picos
de maior atividade são ao amanhecer (7:00-10:00) e pouco antes do crepúsculo
vespertino (16:00-19:00) (MS 2009). Elas se alimentam frequentemente no homem e
em animais domésticos. A estratégia usada pelas fêmeas para encontrar fontes
sanguíneas combina o rastreamento ativo à espera em locais frequentados pelos
hospedeiros. Ao escolher hospedeiros para a alimentação, as fêmeas são atraídas além
da visão, por correntes de ar quente, ácido lático presente no suor, CO2 e umidade
provenientes da respiração dos hospedeiros (Forattini 2002). Fêmeas alimentadas com
sangue humano acumularam mais reservas de triglicerídeos (lipídeos) quando
comparadas a fêmeas alimentadas com sangue de galinha ou camundongos.
Triglicerídeos são a principal fonte de energia para mosquitos de comportamento
sedentário, ou seja, que se locomovem pequenas distâncias, como o A. aegypti
(Harrington et al. 2001).
Em geral, as fêmeas podem alcançar o raio de 50-100 metros de vôo durante
toda a sua vida (OPAS 1994). Estudos demonstraram que a indisponibilidade de
criadouros para oviposição aumenta o potencial de dispersão da fêmea de A. aegypti em
busca de tais locais (Edman et al. 1998). A seleção do criadouro é feita através de
estímulos visuais, táteis e olfatórios, que atraem ou repelem a fêmea, direcionando-a ao
local mais propício à colocação dos ovos. Dentre esses estímulos estão cor, densidade
óptica, textura, refringência do substrato, umidade, temperatura e volume do recipiente
(Davis & Bowen 1994; Badano & Regidor 2002; Harrington et al. 2008). Bactérias ou
fungos saprobiônticos e seus metabólitos voláteis, presentes em águas poluídas ou em
infusões à base de gramíneas, atraem fêmeas de A. aegypti e outros mosquitos, para a
oviposição (Sivagnaname et al. 2001; Navarro et al. 2003).
8
Figura 6. Fases evolutivas de Aedes aegypti. Fonte:
www.prdu.unicamp.br/dengue/mosquito.html
1.2. Dengue
1.2.1. Vírus e infecção
Uma fêmea de A. aegypti, pode se alimentar em diferentes hospedeiros (doentes
ou não) e se infectada, disseminar patógenos, como o vírus da dengue. Uma vez
infectada com o vírus da dengue, ela permanece assim pelo resto da sua vida, podendo
infectar novos hospedeiros. Outra forma de transmissão do vírus é a transmissão
transovariana ou vertical. A fêmea infectada transmite o vírus da dengue para sua
progênie antes da colocação dos ovos. Novas larvas, pupas e jovens adultos já emergem
infectados (Rosen et al. 1983; Consoli & Oliveira 1998). Antígenos do vírus da dengue
foram detectados até a sétima geração de fêmeas inicialmente infectadas. A transmissão
vertical, no vetor, em sucessivas gerações é um dos fatores mais importantes envolvidos
na manutenção do vírus no ambiente, principalmente em períodos interepidêmicos. Por
esse motivo, mosquitos podem ser considerados reservatório do vírus da dengue (Joshi
et al. 2002).
A dengue, uma das arboviroses humanas mais importantes atualmente, é uma
doença infecciosa, febril, causada por vírus da família Flaviviridae. É um vírus de RNA
cadeia simples. Quatro sorotipos foram identificados, DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4.
Todos os sorotipos são transmitidos ao homem pela picada de mosquitos do gênero
Aedes infectados, principalmente o A. aegypti no Brasil. A infecção por um deles
9
confere proteção permanente para o mesmo sorotipo e imunidade parcial e temporária
contra os outros tipos (MS 2009).
O vírus da dengue, presente nas glândulas salivares do mosquito, alcança a
corrente sanguínea do hospedeiro, no momento do repasto sanguíneo realizado pelas
fêmeas adultas. Após o período de incubação de 4 a 10 dias o vírus pode produzir um
amplo espectro de apresentações clínicas, com sinais, sintomas e evolução
imprevisíveis. Muitos pacientes se recuperam após um quadro clínico sem gravidade e
auto-limitante, mas uma pequena proporção de doentes pode ter um progresso grave da
doença, caracterizado principalmente por extravasamento de plasma com ou sem
hemorragia. Infecções sintomáticas pelo vírus da dengue podem ser classificadas em
três categorias: febre indiferenciada, febre da dengue ou dengue clássico (DC) e febre
hemorrágica da dengue (FHD). A FHD foi subdividida em quatro níveis de gravidade,
com os níveis III e IV definidos como síndrome do choque da dengue (SCD) (OMS
2009).
No dengue clássico as manifestações são febre alta, de 39 a 40 ºC, cefaléia,
mialgia, prostração, anorexia, artralgia, náuseas, vômitos, astenia, dor retroorbital,
exantema e prurido cutâneo. Esses sintomas se estendem de 5 a 7 dias, mas a debilidade
física pode permanecer por várias semanas. Na FHD, inicialmente os sintomas são
semelhantes aos do DC, mas geralmente entre o 3º ou 4º dia ocorre o agravamento do
quadro. Aparecem manifestações hemorrágicas e colapso circulatório, como petéquias,
equimoses, epistaxe, gengivorragia e hemorragias cavitárias. Choque da dengue pode
ocorrer entre o 3º e o 7º dia de doença, decorrente do aumento da permeabilidade
vascular e consequente extravasamento plasmático e falência circulatória. Este quadro
pode levar ao óbito em 12 a 24 horas (MS 2012a).
1.2.2. Epidemiologia
A. aegypti está adaptado a ambientes urbanos e é encontrado em mais de cem
países tropicais e subtropicais entre as latitudes 35 ºN e 35 ºS. É um importante vetor
não só da dengue como também da febre amarela urbana (FAU) (Tauil 2006; Foley et
al. 2007). Entretanto, até a metade do século XX, esse vetor era importante somente na
transmissão da FAU (Tauil 1986). Apesar da FAU estar erradicada no Brasil desde
1942, em consequência da utilização de vacina, o risco de reurbanização da febre
amarela silvestre (FAS) é constante (Lima 1985). Isso porque indivíduos não vacinados
10
podem ser infectados com o vírus da FA no ambiente silvestre através de outros vetores,
principalmente Haemagogus sp. Uma vez no ambiente urbano, estes indivíduos
infectados poderão entrar em contato com A. aegypti, ainda no período de incubação ou
fase virêmica da doença. Assim, após o repasto sanguíneo e a infecção, o A. aegypti
poderá transmitir a FAU para pessoas não imunizadas.
Acredita-se que A. aegypti chegou ao Brasil, pela primeira vez, durante o
período de colonização. Ovos foram trazidos da África a bordo de navios que faziam o
tráfico de escravos (Consoli & Oliveira 1998). Colonizou inicialmente cidades
portuárias e dispersou-se em seguida para outras regiões (Franco 1969). Durante os anos
de 1960 e início de 1970 houve a interrupção da transmissão da FAU no Brasil e em
muitos países das Américas a partir de campanhas de erradicação do mosquito A.
aegypti em seus territórios. Entretanto as medidas de controle e vigilância
epidemiológica não foram mantidas e o Brasil enfrentou reinfestações desse vetor, que
se disseminou para todas as Unidades da Federação (Tauil 2002; OMS 2009).
As epidemias de dengue são um sério problema de saúde pública e são
intensificadas devido ao crescimento desordenado das cidades e a falta de habitação e
saneamento básico. Esses fatores favorecem a emergência de novos sítios de reprodução
do mosquito, limita as medidas de controle do mosquito e o acesso dos doentes aos
serviços de saúde. Em todo mundo, os níveis de infestação desse mosquito aumentaram
devido a mudanças climáticas e também pela evolução dos meios de transportes que
facilitam a dispersão do vetor e disseminação do vírus (Lounibos 2002; Ribeiro et al.
2006). A dengue possui caráter sazonal, pois no verão, com a maior ocorrência de
chuvas e temperaturas elevadas, há aumento da densidade vetorial e incidência de novos
casos. Entretanto, nos períodos interepidêmicos ou de seca, a população de mosquitos se
mantém em criadouros artificiais e mesmo com baixos níveis de infestação continuam a
transmissão do vírus da dengue. Portanto, a doença pode ocorrer em qualquer época do
ano e localidade que ofereça população humana suscetível, o vetor e o vírus.
O número de casos reportados anualmente pela Organização Mundial da Saúde
na década de 1996-2005 foi de 0,4 a 1,3 milhões. Atualmente, são estimados 50 milhões
de infecções pelo vírus da dengue por ano (OMS 2009). Por ser uma doença infecciosa,
o número de casos varia consideravelmente de um ano para o outro e subnotificações e
diagnósticos errados são os principais obstáculos para dimensionar o real quadro da
dengue no mundo.
11
Entre 2001 e 2007, foram somados quase 2.800.000 casos de dengue na
Argentina, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai. Desses 98,5% dos casos foram notificados
no Brasil, que também teve a taxa de letalidade mais alta do grupo (OMS 2009). O
Ministério da Saúde, Brasil, totalizou de janeiro a abril de 2012, 286.011 casos de
dengue, enquanto no mesmo período do ano de 2011 foram registrados 507.798 casos,
caracterizando uma redução de 44% no número de indivíduos doentes registrados (MS
2012b). Goiânia e Aparecida de Goiânia estão entre os dez municípios (acima de
100.000 habitantes) com maior concentração de casos de dengue notificados entre
janeiro e abril de 2011 e 2012 (MS 2012b). O número de casos notificados em Goiás
nas primeiras cinco semanas do ano de 2013 tem crescimento acelerado em comparação
ao número de casos notificados nos anos de 2010 a 2012 (SES/GO. Fig. 7)
Figura 7. Número de casos de dengue notificados por semana epidemiológica em Goiás de 2010 a
2013. Fonte: Planilha semanal – SES/GO.
A dengue no Brasil se disseminou de forma constante ao longo do tempo,
intercalando-se com a ocorrência de epidemias. O surgimento de novas epidemias está
associado à introdução e circulação de novos sorotipos do vírus ou alteração do sorotipo
predominante e à presença e densidade de A. aegypti (Siqueira Jr et al. 2005; Braga &
Valle 2007). No Brasil, até o ano de 2010 eram encontrados apenas três sorotipos:
DENV-1, DENV-2 e DENV-3. No ano de 2010 ocorreu a introdução do sorotipo
DENV-4 no estado de Roraima (MS 2010) e hoje esse sorotipo é encontrado em
diversos estados brasileiros, dentre eles, Goiás (Fig. 8) e Rio de Janeiro (MS 2012b).
12
Figura 8. Sorotipos de vírus da dengue circulantes no estado de Goiás no ano de 2012. (Adaptado de:
http://portalsaude.saude.gov.br/portalsaude/arquivos/ap_balnco_dengue.pdf. - Acesso em: 13 de Agosto
de 2012.
Pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de vacina eficaz contra o vírus da
dengue são bastante promissoras. Uma vacina candidata tetravalente recombinante de
vírus atenuados contra a dengue tem demonstrado segurança e imunogenicidade
satisfatórias em testes pré-clínicos in vitro e in vivo, bem como em estudos clínicos em
indivíduos naive e imunes a flavivírus. A vacina tem demonstrado ser genética e
fenotipicamente estável, não hepatotrópica e incapaz de infectar mosquitos pela via oral.
O esquema de três doses induz respostas imunes humorais e celulares contra os quatro
sorotipos na grande maioria dos vacinados. Entretanto, ainda é necessário o
acompanhamento a longo prazo, para definir a duração da imunidade e segurança contra
eventos adversos muito raros (Guy et al. 2010).
Não existem medidas de controle específicas direcionadas ao homem, uma vez
que não se dispõe de nenhuma vacina eficaz contra os quatro sorotipos do vírus ou
drogas antivirais. Atualmente, o único elo vulnerável da cadeia epidemiológica da
dengue é o mosquito. Assim, o controle está centrado na redução da densidade vetorial.
1.2.3. Controle da Dengue
As únicas garantias para que não haja transmissão da dengue são a ausência de
circulação viral e a manutenção de níveis baixos de infestação do mosquito A. aegypti.
13
O controle do mosquito deve ser baseado em várias ações, como: o manejo ambiental,
promovendo mudanças no meio ambiente para a destruição de criadouros potenciais do
vetor; melhorias em saneamento básico e coleta de resíduos sólidos; conscientização
comunitária quanto à infestação domiciliar pelo mosquito e controle químico das várias
formas do vetor. O Ministério da Saúde, através da Fundação Nacional de Saúde
(FUNASA) implantou diversos programas visando controlar a transmissão da doença.
Essas ações foram dirigidas à população e aos órgãos setoriais de saúde e saneamento,
buscando a eliminação dos focos de criação do mosquito A. aegypti no domicílio e
peridomicílio (OPAS 1995). Em todos os programas houve uma associação entre
campanhas para a eliminação de criadouros e o emprego de inseticidas químicos.
O controle químico iniciou com o uso de um organoclorado sintético, o dicloro-
difenil-tricloroetano (DDT), inseticida de efeito prolongado ou residual que, quando
aplicado em paredes e tetos de casas, permanece ativo contra os insetos por vários
meses (Rozendaal 1997). Outros inseticidas utilizados nos programas de controle de
doenças transmitidas por mosquitos pertencem aos grupos dos organofosforados,
carbamatos e piretróides. Todos atuam sobre o sistema nervoso central de insetos. O
organofosforado temefós é o larvicida sintético recomendado pela OMS para tratamento
focal em depósitos domiciliares de água potável (Braga & Valle 2007), sendo
largamente utilizado no controle de A. aegypti.
Inseticidas organofosforados são biodegradáveis e não se acumulam nos tecidos,
mas não são específicos para insetos causando efeitos tóxicos em organismos não-alvo,
como homem e animais domésticos. Um exemplo é a intoxicação aguda em vertebrados
devido à inibição irreversível da aceticolinesterase, o que gera acúmulo de acetilcolina
na fenda sináptica dos receptores nervosos e provoca hiperatividade e colapso do
sistema nervoso (Eldefrawi 1976; Eldefrawi et al. 1982).
Há grande interesse no desenvolvimento de inseticidas botânicos naturais ou
sintéticos, isso devido aos princípios ativos de plantas serem mais seletivos para o
inseto alvo, com menores danos ao homem e o ambiente. Um dos principais inseticidas
de origem botânica, que estão sendo utilizados, são os piretróides. São compostos
naturais obtidos a partir do piretro, extraídos do crisântemo (Elliot et al. 1973) ou a
maioria deles, análogos sintéticos, como a aletrina, resmetrina e cipermetrina (Zerba
1988). Eles agem interferindo na transmissão dos impulsos nervosos, tanto por ação
sobre os canais de sódio, como por agirem como antagonistas do GABA nos receptores
gabaérgicos. A pesquisa de compostos químicos derivados de plantas, para o
14
desenvolvimento de inseticidas botânicos, é outra importante linha de estudo para
controle de mosquitos (Musthukrishnan & Pushpalatha 2001; Silva et al. 2008).
Muitos locais registraram a emergência de populações de A. aegypti resistentes
aos inseticidas químicos comumente utilizados. Devido a este fator, são necessárias
aplicações de doses crescentes de inseticidas para o controle efetivo deste mosquito, o
que pode aumentar o risco de intoxicação do homem, animais e ambiente (Macoris et al.
1995; Hemingway & Ranson 2000). Apesar desses indícios, as medidas efetivamente
empregadas para o controle de mosquitos ainda são o uso de inseticidas sintéticos de
atividade larvicida, o temefós, e de atividade adulticida, malathion e piretróides, além de
campanhas públicas para eliminação de possíveis criadouros. Entretanto, nos últimos
anos, estimuladas por esses fatores, são realizadas pesquisas para o desenvolvimento de
medidas integradas de controle de dengue.
Uma alternativa para o controle de mosquitos são os reguladores de crescimento,
substâncias químicas que atuam como análogos do hormônio juvenil, como
Pyriproxifen e Methoprene, ou como inibidores da síntese da quitina, como
Diflubenzuron (Martins & Silva 2004) e Novaluron, muito utilizados em programas de
controle de mosquitos. Esses reguladores impedem a ecdise e ocasionam a morte de
larvas (Borges et al. 2004). Devido à atuação específica, apresentam riscos reduzidos de
toxicidade para vertebrados (Braga et al. 2005).
Com relação ao controle de focos de formas larvárias de A. aegypti, a
Organização Mundial de Saúde e o Ministério da Saúde recomendam os seguintes
produtos: Temephos, como larvicida de primeira escolha; Bacillus thuringiensis var.
israelensis, como agente de controle biológico e Diflubenzuron, Novaluron e
Pyriproxifen, como inibidores do crescimento. Para controle do mosquito adulto é
utilizada a aplicação espacial a Ultra Baixo Volume (UBV) de Malathion. Devido à alta
dispersão dos aerosóis e ao risco de contato com organismos não alvo, esse tipo de
controle é somente utilizado para bloqueio da transmissão de vírus da dengue e para
controle de surtos e epidemias. A nebulização destes inseticidas químicos elimina, por
ação de contato, todos os mosquitos que estiverem voando pelo local. Portanto, para
aumentar a eficácia, é recomendado que o horário da aplicação do inseticida coincida
com o de maior atividade vetorial dos adultos. Os ovos são resistentes, de difícil
controle e não existem produtos químicos disponíveis no mercado com ação ovicida
para serem utilizados em campanhas de saúde pública (MS 2009; OMS 2009).
15
O controle biológico apresenta grande potencial para o combate a insetos vetores
de patógenos, pois é efetivo e seguro para o homem e animais (Legner 1995; Becker &
Ascher 1998) e causa repressão do vetor alvo com inimigos naturais específicos. Há
relatos do uso de microcrustáceos aquáticos do gênero Mesocyclops, predadores de
larvas de mosquitos, em poços e locais de armazenamento de água em um vilarejo do
Vietnã. Não houve o reaparecimento de larvas e adultos de A. aegypti durante dois anos
após a eliminação do mosquito (Nam et al. 1998). Peixes larvófagos também
apresentam potencial para controle de larvas de A. aegypti em criadouros permanentes
(Cavalcanti et al. 2007).
Bactérias foram os primeiros agentes utilizados no controle biológico de larvas
de mosquitos, por apresentarem ação rápida e seletiva (Becker & Ascher 1998).
Algumas linhagens e produtos comerciais à base da bactéria B. thuringiensis var.
israelensis e de proteínas de seus cristais são muito efetivos contra mosquitos (Ibarra et
al. 2003). Os produtos VectoBac® e Teknar® (Valent BioSciences Corporation, USA)
à base dessa bactéria são formulações comerciais regularmente utilizadas para o
controle de larvas de dípteros aquáticos, como mosquitos e borrachudos, há alguns anos
(Andrade 2008). Em 2005, foi lançado no Brasil, pela Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, a empresa Bthek Biotecnologia e o Instituto de Pesquisas Tecnológicas
(IPT), o larvicida Bt-Horus® para controle de larvas de A. aegypti (Andrade et al.
2007). Bactérias, como o B. thuringiensis var. israelensis e o Bacillus sphaericus,
produzem endotoxinas proteicas, as quais, quando ingeridas pelas larvas, atacam e
destroem seu intestino médio, levando-as à morte. Entretanto, já foram registrados casos
de resistência de mosquitos a toxinas bacterianas (Tabashnik 1994), aumentando assim
o interesse para outros agentes de controle biológico de mosquitos, principalmente
fungos.
1.3. Fungos entomopatogênicos
Mais de 700 espécies de fungos já foram relatadas como patogênicas para
insetos, sendo os fungos, causadores de cerca de 80% das doenças que acometem esses
organismos (Alves 1998). Os fungos estão dispersos em diferentes ambientes como
solos, vegetais, água e ar e foram os primeiros patógenos de insetos utilizados no
controle microbiano, principalmente para controlar pragas agrícolas (Humber et al.
1981). Mas, estudos os mostram como importantes agentes também para o controle de
16
insetos de importância em saúde pública (Luz et al. 2003, 2007). O uso destes agentes
apresenta vantagens como não serem agressivos à saúde humana e ao meio ambiente
(Ward et al. 1998), além da especificidade à insetos e a alta capacidade de dispersão e
multiplicação no ambiente.
A etapa inicial do processo de infecção se dá pela adesão que ocorre logo após a
deposição dos conídios sobre o inseto e visa a preparação do local para a fase de
penetração. O processo de adesão depende da presença de enzimas (quimioelastase,
esterase e N- acetilglucosaminidase) que estão presentes na superfície dos conídios não
germinados e alteram a superfície do tegumento do inseto, favorecendo a nutrição e a
germinação do fungo (St. Leger et al. 1991). Encontrando condições favoráveis de
umidade, pH, oxigênio e nutrição, o fungo germina sobre o inseto, produzindo um tubo
germinativo. Alguns fungos sob determinadas condições formam na extremidade do
tubo germinativo uma estrutura denominada apressório, que corresponde a uma
dilatação das hifas. Nesta fase, a atividade metabólica se eleva devido a migração do
conteúdo citoplasmático para o tubo germinativo, com a presença de mitocôndrias,
ribossomos e outros componentes nucleares. Há também nessa fase a intensa produção
de enzimas (proteases, lipases e quitinases).
Na penetração estão envolvidos processos físicos, devido à pressão da hifa
terminal que rompe áreas membranosas ou esclerosadas, e processos químicos,
resultantes da liberação das enzimas que facilitam a penetração mecânica e o
metabolismo do tubo germinativo (Khachatourians 1998). Na cutícula, ao redor do local
de penetração, aparecem sintomas de histólise (decomposição do tecido por ação
enzimática). O aparelho bucal, espiráculos, ânus, sifão respiratório e tarsos são locais de
penetração, porém as membranas intersegmentais do abdome são as portas de entrada
mais comuns para os fungos em geral.
A penetração do fungo através da cutícula de insetos ocorre, em parte, pela ação
sinérgica de diferentes enzimas degradadoras de cutícula. As proteases, além de estarem
envolvidas nos processos de formação e germinação dos esporos, têm funções
nutricionais importantes, sendo capazes de hidrolisar cadeias polipetídicas em
moléculas menores, que são absorvidas pelas células fúngicas. As lipases são
responsáveis pelo fracionamento dos lipídios existentes na superfície dos insetos, para
posterior metabolização pelos microrganismos. As quitinases, por sua vez, promovem a
hidrólise da quitina dos insetos, através de um sistema quitinolítico que envolve duas
hidrolases (quitinases e quitobiase).
17
A correlação entre a virulência de fungos entomopatogênicos com a produção de
enzimas que degradam a cutícula de insetos tem sido investigada. Uma protease está
comprovadamente envolvida na patogenicidade de M. anisopliae, a protease Pr1. Esta e,
provavelmente outras proteases, são fatores de virulência que promovem a degradação
localizada de proteínas da cutícula, expondo os demais componentes da cutícula,
promovendo a invasão do hospedeiro. A protease purificada (Pr1) de M. anisopliae var.
anisopliae foi capaz de remover 25-30% das proteínas cuticulares, sugerindo que
proteases estariam envolvidas na hidrólise da cutícula e facilitariam a penetração da hifa
através da mesma. Para que ocorra a hidrólise das proteínas cuticulares é necessária
adsorção de proteases à cutícula (St. Leger et al. 1986).
Após a penetração, inicia-se o processo de colonização do hospedeiro. A hifa
sofre engrossamento e se ramifica inicialmente na cutícula e posteriormente na
hemocele. O fungo coloniza a cavidade interna do corpo do hospedeiro e produz
metabólitos secundários, como ácidos orgânicos e toxinas ciclodepsipeptídicas,
conhecidas como destruxinas (DTX) que vão pronunciar o processo patológico. Foram
descritos diversos tipos de DTX, as quais causam paralisia muscular, inibição da função
de hemócitos e túbulos de Malpighi (Wang et al. 2003). Os sintomas causados pela
patogenia sobre o hospedeiro são perda da sensibilidade, perda da coordenação dos
movimentos e paralisia, levando-o à morte. Após a morte do hospedeiro, as hifas
invadem órgãos internos e, com o esgotamento de nutrientes, começam a emergir pelos
espiráculos e usando pressão mecânica saem através das áreas mais fracas se estendendo
para fora da cutícula.
A umidade apresenta papel fundamental no sucesso da invasão e mortalidade
causada por fungos em insetos terrestres. Altos índices de mortalidade de triatomíneos
causados por fungos entomopatógenicos foram encontrados em umidades próximas a
saturação (Luz & Fargues 1999; Fargues & Luz 2000; Lazzarini et al. 2006). Em
condições apropriadas de umidade relativa e temperatura, novo micélio aparece sobre o
cadáver e o fungo produz esporos (Alves 1998, Luz & Fargues 1998). Estes propágulos
infecciosos se dispersam pelo ambiente e contaminam novos hospedeiros, auxiliados
por fatores bióticos e abióticos, tais como vento, chuva, homem, animais, etc. (Fig. 8).
18
Figura 9. Ciclo de Metarhizium sp em inseto hospedeiro (modificado).
(Fonte: Alves 1998).
Fungos entomopatogênicos, além de causarem doença e morte de insetos, podem
produzir efeitos secundários, como a redução da fecundidade individual (número de
ovos postos) e da fertilidade (viabilidade dos ovos), afetando o potencial reprodutivo da
população de insetos. Diminuindo a população de insetos transmissores de patógenos,
reduz-se o potencial vetorial dessas espécies.
Beauveria bassiana, causou doença fúngica e alterou a capacidade reprodutiva
da lagarta da raiz do milho, Diabrotica virgifera virgifera (Mulock & Chandler 2001).
Fargues et al. (1991) mostraram que a infecção da larva do besouro da batata do
Colorado por B. bassiana a 22°C reduziu a fecundidade dos adultos sobreviventes.
Metarhizium anisopliae tem capacidade de reduzir a fecundidade, fertilidade e
longevidade de adultos do inseto fitófago Megaluthrips sjostedti. O fungo também
contribui para a perda de apetite e redução da alimentação, em consequência da
produção de toxinas e ruptura mecânica dos tecidos pelo crescimento de micélio (Ekesi
& Maniania 2000). Adultos de Anopheles gambiae, Culex fatigans e A. aegypti cujas
19
larvas foram infectadas por Aspergillus parasiticus sofreram redução na fecundidade e
longevidade dos adultos sobreviventes à infecção (Nnakumusana 1985).
O potencial de fungos dos gêneros Metarhizium, Isaria, Paecilomyces e
Lecanicillium para controlar adultos de A. aegypti foi demonstrado por Leles et al.
(2010). Entretanto, dentre os fungos terrestres, M. anisopliae, destaca-se como um dos
mais estudados para utilização no controle microbiano de mosquitos (Alves et al. 2002;
Scholte et al. 2004, 2007). É um fungo filamentoso, ascomiceto, pertencente à família
Clavicipitaceae. Apresenta características importantes para seleção de um agente para
controle biológico como distribuição cosmopolita, encontrado comumente em solos, em
clima temperado e tropical, podendo ser cultivado em meios artificiais baratos, além de
não apresentar patogenicidade para o homem e outros organismos (Zimmermann 1993,
2007; Genthener et al. 1998). Os conídios de M. anisopliae podem ser estocados com
facilidade e associados a formulações óleo-água (Batta 2003), atuando sobre um grande
número de pragas.
O potencial de M. anisopliae já foi demonstrado no controle de cupins
(Fernandes & Alves 1991), carrapatos (De Melo et al. 2006; Lopes et al. 2007; Camargo
et al. 2012), moscas (Wrigth et al. 2004), além de insetos de importância em saúde
pública como triatomíneos (Lazzarini et al. 2006) e mosquitos (Alves et al. 2002; Silva
et al. 2004; Luz et al. 2007).
Atividades larvicida e adulticida de B. bassiana e M. anisopliae em mosquitos já
foram descritas em condições de laboratório (Scholte et al. 2003, 2004; Silva et al.
2004). A. gambiae associado a estas espécies de fungo podem reduzir os níveis de
transmissão vetorial da malária em mais de 80% (Scholte et al. 2003, 2005). Adultos de
A. aegypti, A. albopictus e C. quinquefasciatus tratados com conídios de M. anisopliae
tiveram mais de 80% dos seus indivíduos infectados (Scholte et al. 2003, 2007).
M. anisopliae é patogênico para mosquitos do gênero Aedes na fase de ovo (Luz
et al. 2008; Albernaz et al. 2009; Santos et al. 2009; Leles et al. 2012), na fase larvar
(Scholte et al. 2004; Silva et al. 2004) e nos adultos (Scholte et al. 2007; Paula et al.
2008; Leles et al. 2010). Isolados de M. anisopliae causaram até 100% de mortalidade
de larvas de segundo estádio de A. aegypti (Silva et al. 2004).
A fêmea de A. aegypti infectada por M. anisopliae pode ter uma alteração da
oogênese e da quantidade de ciclos gonotróficos durante sua vida. Como consequência,
diminuem a quantidade de ovos postos, interferindo na fecundidade, como já foi
comprovado para outras espécies de insetos (Ekesi & Maniania 2000). A infecção
20
fúngica pode também ser transmitida à progênie, durante o período pré-natal. Ou seja, o
fungo pode infectar a larva dentro do ovo e reduzir o número de larvas eclodidas,
alterando a fertilidade dos ovos. Durante a oviposição, fêmeas com cutícula
contaminada por conídios, podem contaminar o criadouro. Ovos postos sobre esse
substrato podem ter larvas infectadas antes e após a eclosão. Larvas eclodidas infectadas
podem não conseguir passar pelos quatro estádios larvais, estágio pupal e adulto. Com a
interferência na sobrevivência das larvas, menos fêmeas adultas se infectarão com o
vírus da dengue durante o repasto sanguíneo e transmitirão o vírus.
1.3.1. Formulações de conídios e técnicas de aplicação
Com o objetivo de aprimorar o controle biológico de mosquitos, especialmente
A. aegypti, são necessárias pesquisas em formulações que mantenham a viabilidade e
potencializem a virulência dos conídios, apesar da interferência negativa de condições
ambientais na ação de fungos entomopatogênicos no campo.
Fatores ambientais como temperatura, umidade, radiação solar, chuvas e pH
podem interferir na germinação, esporulação e virulência do fungo (Ment et al. 2010).
Aditivos em formulados de conídios visam auxiliar o fungo a superar tais efeitos
adversos ao desenvolvimento fúngico e potencializar sua ação entomopatogênica
(Daoust et al. 1983; Burgues 1998; Alves et al. 2002).
Óleos protegem conídios de radiações ultravioletas, baixa umidade, altas
temperaturas, aumentam o contato e a distribuição de propágulos fúngicos na cutícula
hidrofóbica do inseto ou superfície do ovo, criando assim condições favoráveis ao
desenvolvimento fúngico (Stathers et al. 1993; Alves et al. 1998). A utilização de
conídios formulados em óleo resultou em aumento da mortalidade de insetos tratados
quando comparada com formulações aquosas de conídios (Bateman & Alves 2000; Luz
& Batagin 2005). Esporos fúngicos formulados em óleo são utilizados com grande
sucesso no controle de gafanhotos (Bateman 1997; Lomer et al. 2001). A adição de óleo
mineral a suspensão de M. anisopliae e B. bassiana aumentou o efeito patogênico
desses fungos contra diversos estágios de Rhipicephalus microplus (Camargo et al.
2012). A eficácia de uma linhagem de M. anisopliae (IP 46), coletada em solo do
cerrado do Brasil, aumentou contra ovos de A. aegypti, quando conídios foram
formulados em óleo (Albernaz et al. 2009).
21
A aplicação direta de conídios sobre um inseto leva a uma maior contaminação
quantitativa comparada a aplicação indireta, ou seja, sobre uma área tratada com
conídios na qual o inseto entra em contato posteriormente (Luz & Batagin 2005).
Estudos com A. aegypti e M. anisopliae comprovaram que a aplicação direta de
conídios sobre ovos proporcionaram um elevado crescimento fúngico sobre os ovos e
uma reduzida taxa de eclosão, mesmo em baixas concentrações de conídios. Entretanto,
altas umidades são uma condição essencial para a atividade do fungo em ovos (Luz et
al. 2008; Santos et al. 2009; Albernaz et al. 2009).
Fêmeas grávidas colocam seus ovos em substratos próximos a coleções de água,
mas sem o contato desses com a água, as larvas são capazes de sobreviver por meses em
diapausa e podem estar expostas a infecções por entomopatógenos. Entretanto, a
aplicação de um micoinseticida, sobre ovos presentes em sítios de reprodução, parece
ser impraticável. Métodos de tratamento de dispositivos adaptados de reprodução, que
atraiam adultos ao repouso, acasalamento e oviposição, com formulados fúngicos
efetivos contra ovos, são promissores para o controle de A. aegypti em campo.
Uma armadilha, com uma área tratada com conídios, desenvolvida para atrair e
infectar triatomíneos, proporcionou uma elevada mortalidade destes após contato direto
com a superfície tratada ou transmissão horizontal de conídios entre indivíduos (Pedrini
et al. 2009). Estudos recentes comprovaram que fêmeas de A. aegypti não detectaram a
presença de conídios, formulados em água e óleo-água, nos locais de oviposição (Lobo
Luciana, comunicação pessoal). Esses dispositivos com superfícies tratadas com fungo
poderiam ser colocados em áreas domiciliares e peridomiciliares e fêmeas atraídas se
contaminariam com conídios juntamente com seus ovos postos sobre a superfície
tratada. Leles et al. (2012) mostraram que conídios de M. anisopliae misturados a solo
são capazes de infectar ovos de A. aegypti depositados sobre o solo (aplicação indireta),
mesmo em pequenas concentrações. Portanto, o conhecimento da eficácia de técnicas de
aplicação direta e indireta de conídios de IP 46 formulados em água ou em emulsão
óleo-água em ovos de A. aegypti em condições de laboratório é necessário ao
desenvolvimento de medidas de controle do mosquito.
22
2. JUSTIFICATIVA
O aumento de populações de A. aegypti resistentes a inseticidas, os efeitos
tóxicos destes produtos químicos ao homem e ao ambiente, o aumento preocupante de
epidemias de dengue, dentre outros fatores, incentivam a busca por medidas integradas
de controle deste mosquito. Fungos entomopatogênicos, especialmente M. anisopliae IP
46, possuem especificidade elevada para insetos e têm mecanismo de ação por pressão
mecânica de hifas e produção de enzimas histolíticas sobre a cutícula de insetos. De
acordo com o inseto contaminado podem ser produzidas diferentes enzimas, portanto a
seleção de insetos resistentes à ação do fungo é pouco provável. M. anisopliae não
provoca danos à saúde humana e ao ambiente e é virulento para ovos, larvas e adultos
de A. aegypti. Para o desenvolvimento de micoinseticidas efetivos contra este vetor é
necessária a elaboração de estratégias que otimizem a eficiência do fungo. Contudo, não
existe informação sobre a atividade desse fungo em ovos de A. aegypti colocados sobre
uma superfície tratada com conídios de M. anisopliae IP 46 formulados em água ou
emulsão óleo-água (aplicação indireta). Conhecimentos a cerca desta técnica irão
contribuir para o aumento da efetividade do fungo e desenvolvimento de medidas de
controle integrado da população de A. aegypti em campo.
23
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Contribuir para o controle integrado e sustentável de A. aegypti.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar a atividade de conídios de M. anisopliae IP 46 formulados em água e
emulsão óleo-água, com óleo vegetal emulsionável, em ovos de A. aegypti, em
condições de laboratório.
Avaliar o efeito de técnicas de aplicação, direta e indireta, de formulados de
conídios de M. anisopliae IP 46 em ovos de A. aegypti, em condições de laboratório.
24
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Origem e preparação do fungo
M. anisopliae s.l. IP 46 (Rocha et al. 2013) foi isolado em 2001 de amostra de
solo coletada no Cerrado do estado de Goiás, Brasil e está armazenada na coleção de
culturas de fungos entomopatogênicos no IPTSP, UFG. Esta linhagem foi selecionada
devido a sua atividade em ovos de A. aegypti (Luz et al. 2007, 2008; Santos et al. 2009;
Leles et al. 2012). Antes dos testes foi realizada a passagem do fungo em hospedeiro
adultos de A. aegypti com o objetivo de estimular e padronizar a virulência do fungo
(Adames et al. 2011). O fungo foi reisolado e conídios foram cultivados em placas de
Petri (100 × 20 mm) com meio BDA (batata, dextrose e ágar) a 25 oC, 75 ± 5% de
umidade relativa (UR) e fotofase de 12 horas por 15 dias (Luz et al. 2007). Para a
preparação do meio, 170 g de batatas descascadas e cortadas em pequenos pedaços
foram autoclavadas em 1.000 ml de água destilada. Após resfriamento e filtração por
peneira, o filtrado foi acrescido de água destilada até 1.000 ml, 20 g de dextrose e 18 g
de ágar. O meio teve o pH ajustado em sete, foi autoclavado novamente durante 20
minutos e distribuído em placas de Petri.
Colônias de conídios de M. anisopliae IP 46 foram raspadas da superfície de
cultura com uma espátula e uma pequena porção foi suspensa em 10 ml de Tween 80
(Synth®) estéril a 0,1% em tubo de vidro. A suspensão foi agitada com pérolas de vidro
em agitador de tubos (Vortex) por três minutos, filtrada por algodão hidrófilo, e após
diluição em água com Tween 80 a 0,1%, os conídios foram quantificados em câmara de
Neubauer.
Foram ajustadas cinco concentrações de conídios: 3,3 x 103, 10
4, 3,3 x 10
4, 10
5,
3,3 x 105 conídios/ cm
2 (Leles et al. 2012). Cada uma delas foi formulada em água ou
óleo-água. A formulação oleosa foi preparada pela agitação de água com óleo vegetal
emulsionável (GRAXOL®
, Agrária Indústria e Comércio, Jardinópolis, SP, Brasil) a
10% do óleo por 60 segundos. Para os controles foram utilizados água ou emulsão óleo-
água sem conídios. Antes de cada teste a viabilidade dos conídios foi verificada, pela
inoculação de 50 µl de conídios suspensos em água (106 conídios/ ml) em meio SDAL
(Sabouraud, Dextrose, Agar, Extrato de levedura) em placas de Petri. Após 6-24 horas
de incubação do meio, a 25 ºC e 12 horas de fotofase, foram quantificados 100 conídios
em quatro diferentes áreas do meio. Conídios foram considerados germinados quando o
comprimento do tubo germinativo era superior ao diâmetro do conídio.
25
4.2. Origem dos mosquitos e processamento dos ovos
A população de A. aegypti utilizada nos testes foi originária de larvas livres de
vírus coletadas em 1991 em Goiânia, Brasil. A criação foi mantida em condições
adequadas no Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstico do
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás,
conforme metodologia descrita por Silva et al. (1998). Os testes foram realizados com
ovos de três a cinco dias de idade. Esses foram expostos, antes dos tratamentos, a luz
ultravioleta (Phillips UV-C lâmpada ultravioleta germicida G30 T8, Holanda) por 15
minutos para reduzir o número de microrganismos nas suas superfícies.
4.3. Bioensaios
Para os testes foram utilizados pequenos quadrados de papel filtro esterilizados,
com área superficial de 1 cm2
e espessura de 1 mm (Luz et al. 2007; Albernaz et al.
2009). Foram realizados dois tipos de tratamento de ovos com conídios formulados, a
aplicação direta e a aplicação indireta. Trinta ovos foram, cuidadosamente, colocados
com um pincel sobre o papel filtro e tratados topicamente (Fig. 9 a), caracterizando a
aplicação direta. Para a aplicação indireta, o papel filtro foi tratado com conídios
formulados e em seguida, trinta ovos foram colocados sobre esta superfície (Fig. 9 b).
Independentemente do tipo de tratamento foram aplicados, com pipeta semiautomática,
50 µL da suspensão de conídios formulados em água ou óleo-água. Para os controles
foram aplicados 50 µL de água ou óleo-água sem conídios. Os papéis filtro foram
colocados em placas de Petri, secos por uma hora em condições de ambiente (Fig. 9 c) e
incubados em câmara plástica (10 x 11 x 15 cm) a 25 ± 1 °C e umidade relativa (UR) >
98% mantida com auxílio de panos úmidos (Fig. 9 d) (Luz et al. 2007).
Os ovos foram examinados 24 horas após incubação e aqueles que apresentaram
dano físico visível foram retirados do teste. Independente da ocorrência ou não de dano,
somente 20 ovos, foram mantidos em cada teste. Diariamente, foi avaliado o
crescimento do fungo sobre os ovos. Ao 15º dia de incubação os papéis filtro contendo
os ovos foram submersos em 20 ml de água estéril em copos plásticos (3,5 cm de
diâmetro × 5 cm de altura) e mantidos a 25 ± 1 °C, 75 ± 10% de UR e 12 horas de
fotofase. Após submersão dos ovos foi adicionada à superfície da água, em dias
alternados, pequena quantidade de ração triturada para gato (Black Jack; Alisul
Alimentos S.A.; São Leopoldo, Rio Grande do Sul, Brasil). Diariamente o nível da água
26
nos recipientes foi verificado e reposto, se necessário, até o nível original. A eclosão das
larvas foi estimulada pela incubação diária dos recipientes por 15 minutos em banho
Maria a 37 °C (Luz et al. 2007). A eclosão foi acompanhada durante 10 dias após
submersão dos ovos na água e larvas presentes foram removidas dos recipientes e
eliminadas.
Figura 10. Aplicação direta (a) e indireta (b) de suspensão de conídios formulados em água
ou óleo-água em ovos de Aedes aegypti, secagem do papel filtro em placa de Petri (c) e
incubação em câmara úmida (d).
4.4. Análise estatística
Foram realizadas seis repetições independentes dos testes, utilizando diferentes
culturas fúngicas de M. anisopliae IP 46. Dados foram avaliados por análise de
variância (ANOVA) e teste de comparação múltipla Student-Newman-Keuls para
comparação de médias do número de ovos com micélio ou conídios, eclosão de larvas
sobre papel filtro e após a submersão em água. As médias foram consideradas
estatisticamente diferentes a P < 0,05. Os valores das concentrações de inibição de 50 e
27
90% da eclosão das larvas (CEL50 e CEL90) foram calculados para determinação da
virulência do fungo para ovos e obtidos por análises de Probit (Micro Probit by Thomas
and Alexandra Sparks, C 1986, 1987). Valores de CEL foram calculados pela adição do
(i) número de larvas eclodidas e mortas sobre papel filtro e (ii) número de ovos sem
eclosão de larvas após a submersão em água por 10 dias.
28
5. RESULTADOS
5.1. Desenvolvimento de micélio ou conídios sobre ovos de A. aegypti
Foram observados micélio ou conídios de M. anisopliae IP 46 sobre os ovos
após quatro dias de incubação destes tratados com o fungo, independentemente da
formulação aplicada (conídios formulados em água ou óleo-água) e do tipo de
tratamento (direta ou indireta) (Fig. 10). Entretanto, o desenvolvimento do fungo sobre
os ovos aconteceu de forma mais rápida após a aplicação de formulado com alta
concentração de conídios (F5,35 ≥ 10,2; P < 0,0001; Fig. 11 a-d). Não foi encontrado
efeito da técnica de aplicação, para o mesmo formulado, sobre o número de ovos com
micélio ou conídios na sua superfície ao longo do tempo testado (15 dias) (F1,358 ≤ 3,6;
P ≥ 0,06). Entretanto, o número relativo de ovos com desenvolvimento de micélio e
conídios foi significativamente maior quando ovos foram tratados diretamente com
formulações óleo-água, quando comparadas a suspensões aquosas de conídios (F1,358 =
12.2; P < 0,001; Fig. 11 a, b)
Figura 11. Ovos de Aedes aegypti com desenvolvimento de
micélio e conidiogênese sobre papel filtro, após aplicação de
conídios formulados e incubação em umidade relativa > 98% por
15 dias.
29
Figura 12. Número relativo de ovos de Aedes aegypti com micélio ou conídios de Metharizium
anisopliae IP 46 na sua superfície após tratamento direto (a,b) ou indireto (c,d) com diferentes
concentrações de conídios suspensos em água (a, c) ou óleo-água (b, d), e exposição a 25 ºC e umidade
relativa > 98% por 15 dias.
5.2. Eclosão de larvas sobre papel filtro
Vinte e quatro horas após os tratamentos foram encontradas larvas eclodidas
sobre o papel filtro, sem submersão destes em água. Tal comportamento foi observado
no decorrer dos 15 dias de incubação em câmara úmida para ovos tratados com
conídios, mas não para ovos do controle, que teve baixa eclosão observada somente nos
primeiros dias. Todas as larvas que emergiram dos ovos não submersos em água,
morreram em algumas horas (Fig. 12 a-d). A eclosão de larvas a partir dos ovos
expostos em papel filtro aumentou significativamente em altas concentrações de
30
conídios independentemente da formulação fúngica utilizada e do tipo de tratamento
(F5,35 ≥ 16,8; P < 0,0001). Significativamente mais larvas eclodiram dos ovos tratados
diretamente com conídios formulados em óleo-água do que aqueles ovos tratados
indiretamente com o mesmo formulado (F 1,358 = 11,9; P < 0,0001; Fig 12 b, d). Não foi
encontrado efeito das técnicas de aplicação direta ou indireta sobre a eclosão
quantitativa de larvas sobre o papel filtro quando foram testados conídios formulados
somente em água. (F 1,358 = 5,7; P = 0,18; Fig. 12 a, c).
Figura 13. Número relativo de larvas de Aedes aegypti eclodidas sobre papel filtro após tratamento direto
(a,b) e indireto (c,d) de ovos com conídios de Metharizium anisoplie IP 46 em diferentes concentrações,
suspensos em água (a, c) ou óleo-água (b, d), e exposição a 25 ºC e umidade relativa > 98% por 15 dias.
31
5.3. Eclosão de larvas após submersão dos ovos em água
A eclosão acumulada de larvas, a partir de ovos tratados e incubados por 15 dias
nas condições estabelecidas e depois submersos em água por até 10 dias, caiu
significativamente com o aumento das concentrações de conídios, independentemente
das técnicas de formulação e aplicação testadas (F 5,138 = 23,2; P < 0,0001; Fig. 13 a, b).
Quando foi feita a aplicação indireta de conídios, não houve diferença significativa
quanto ao tipo de formulação testada sobre a eclosão acumulada de larvas (Fig. 13 a).
Entretanto, menos larvas eclodiram a partir dos ovos tratados diretamente com conídios
formulados em óleo do que aqueles tratados com conídios formulados apenas em água
(F 1,7 = 12,7; P < 0,0001; Fig. 13 b).
As concentrações de conídios para eliminação de 50% (CEL50) e 90% (CEL90)
das larvas foram avaliadas para as duas formulações e técnicas de aplicação estudadas.
Aplicando conídios, suspensos em água, diretamente sobre os ovos a CEL50 foi de 7,3 x
104 conídios/ cm
2, enquanto utilizando a mesma suspensão em aplicação indireta, a
CEL50 foi de 1,1 x 104 conídios/ cm
2. Quando conídios foram formulados em óleo-água
os valores de CEL50 foram 1 x 103 conídios/ cm
2 para aplicação direta e 4,8 x 10
3
conídios/ cm2 para aplicação indireta (Tab. 1). Os valores de CEL90 foram de 2,6
x 10
6
conídios/ cm2 para suspensão aquosa e 1,4 x 10
4 conídios/ cm
2 para formulação óleo-
água aplicadas diretamente sobre os ovos e 4,1 x 105
conídios/ cm2
para suspensão
aquosa e 1,9 x 105
conídios/ cm2
para formulação óleo-água em aplicação indireta (Tab.
1).
32
Figura 14. Eclosão relativa acumulada de larvas de Aedes aegypti após tratamento indireto
(a) ou direto (b) de ovos com diferentes concentrações de conídios de Metharizium
anisopliae IP 46 suspensos em água (-●-) ou óleo-água (-○-) e exposição a 25 ºC e umidade
relativa >98% por 15 dias e subsequente submersão dos ovos em água por 10 dias.
33
34
6. DISCUSSÃO
6.1. Desenvolvimento de micélio e conidiogênese sobre ovos
M. anisopliae IP 46 teve maior atividade ovicida quando formulado em óleo-
água e aplicado em altas concentrações de conídios diretamente sobre os ovos de A.
aegypti. Com essa combinação específica de técnicas de formulação e aplicação, um
grande número de ovos foi coberto pelo fungo (micotizados) sobre papel filtro em 15
dias de exposição. A maioria das larvas, após a eclosão sobre o papel filtro e sem o
acesso à água sucumbiu e consequentemente uma pequena quantidade de larvas eclodiu
após a submersão dos ovos na água. Esses dados são compatíveis com aqueles
encontrados por Albernaz et al. 2009, após o tratamento direto de ovos com conídios de
M. anisopliae IP 46 formulados em óleo de girassol e exposição a umidade > 98%.
Entretanto, mesmo com a utilização de óleos para formulação de conídios, a exposição
dos ovos à altas umidades é determinante para eficácia da atividade ovicida de IP 46 e o
desenvolvimento do fungo sobre os ovos (Luz et al. 2008; Santos et al. 2009; Albernaz
et al. 2009).
Quando consideradas as formulações testadas individualmente, a técnica de
aplicação de conídios não influenciou o desenvolvimento do fungo sobre os ovos.
Também, se os ovos foram expostos ao papel filtro previamente tratado com o fungo ou
se foram tratados topicamente com conídios, não foi relevante para influenciar o
número total de ovos com desenvolvimento de micélio ou conídios sobre sua superfície.
A exposição dos ovos ao fungo por 15 dias foi suficiente para o desenvolvimento do
fungo sobre os ovos, tornando-os inviáveis, independente de como os conídios foram
aplicados. Estudos anteriores com M. anisopliae e outros fungos entomopatogênicos
contra ovos de A. aegypti também mostraram que ovos micotizados (com
desenvolvimento fúngico sobre sua superfície se tornam inviáveis (Luz et al. 2007,
2008; Santos et al. 2009; Albernaz et al. 2009; Leles et al. 2012). Larvas dentro dos
ovos, provavelmente sucumbem à infecção fúngica, apresentando redução da eclosão
larval após a submersão dos ovos em água, mas essa observação não foi confirmada no
presente estudo.
6.2. Eclosão de larvas estimulada pelo fungo
Os resultados do estudo sugerem que a eclosão de larvas sobre o papel filtro em
câmara úmida após a exposição dos ovos aos formulados fúngicos foi estimulada pela
35
presença de conídios de IP 46 sobre a superfície do ovo, pelo desenvolvimento de
estruturas fúngicas e pela produção de metabólitos. As larvas dentro dos ovos podem ter
sido estimuladas a eclodirem devido ao breve umedecimento de parte ou toda a
superfície dos ovos durante a aplicação inicial de formulados do fungo, seja ela tópica
ou por exposição dos ovos ao papel filtro tratado e úmido. Entretanto, os baixos índices
de eclosão larval nos controles indicam que o umedecimento inicial dos ovos durante os
tratamentos estimulou apenas uma pequena fração das larvas a eclodirem. Foi
perceptível que larvas continuaram a eclodir de ovos tratados com o fungo, mas não de
ovos não tratados (controle) durante os 15 dias de incubação dos ovos em câmara úmida
após os tratamentos.
Os resultados se assemelham aos encontrados por Leles et al. (2012), que
também evidenciaram a eclosão de larvas de A. aegypti a partir de ovos colocados sobre
solo tratado com M. anisopliae IP 46 formulado em água e incubados em câmara
úmida por 25 dias. No mesmo estudo a eclosão de larvas iniciou-se aos 13,3 ± 5,3 dias
quando o solo foi tratado com 3,3 x 103
conídios/ cm2
e aos 7,2 ± 0.4 dias com solo
tratado com 3,3 × 105 conídios/ cm
2, observando-se a influência direta da concentração
de conídios sobre o estímulo à eclosão de larvas, como também foi observado no
presente estudo.
Eclosão espontânea aumentou após 5-10 dias de exposição e em altas
concentrações de conídios e particularmente quando os ovos foram tratados diretamente
com conídios formulados em óleo-água. Evidências mostram que larvas de A. aegypti
são estimuladas a eclodirem em ambiente com microbiota abundante (Ponnusamy et al.
2011), como também parece acontecer no presente estudo, onde algumas larvas dentro
de ovos tratados com fungos foram estimuladas a eclodirem em resposta a provável
penetração da casca dos ovos pelas hifas do fungo. O potencial de fungos
entomopatogênicos contra ovos de mosquitos ainda é pouco investigado e os
mecanismos de ação e infecção dos fungos não são totalmente compreendidos.
6.3. Formulação de conídios e desenvolvimento de dispositivo para
controle de A. aegypti
Em teste multiopcional com água, papel filtro úmido e lama, como substratos
para a oviposição, fêmeas grávidas de A. aegypti foram atraídas a colocar ovos sobre a
lama (Lobo, Rodrigues e Luz, comunicação pessoal). A lama mantém um microclima
úmido, mas não permite o acúmulo de água sobre sua superfície. Se após a eclosão, não
36
houver uma mínima quantidade de água, larvas de culicíneos não conseguem sobreviver
e tornarem-se vetores de doenças, mesmo que ovos não estejam infectados por fungos.
Esse fator sugere que algum dispositivo elaborado para controle desses vetores, por
atração de fêmeas grávidas à oviposição sobre um substrato tratado com fungo, não
deveria conter água acumulada que permitisse o desenvolvimento de larvas até o estágio
de adultos.
Com relação aos resultados apresentados, não houve redução importante da
atividade ovicida após a exposição indireta de ovos de A. aegypti a conídios de IP 46
formulado em óleo-água, com óleo vegetal, quando comparado a aplicações diretas do
fungo na mesma formulação. Isso pôde ser provado pelos valores de CEL50, que não
diferiram para conídios formulados em água e aplicados indiretamente dos valores
encontrados para conídios formulados em óleo-água e aplicados direta ou indiretamente.
Uma formulação fúngica oleosa parece ser a mais apropriada para testes em um
dispositivo adaptado de reprodução para expor fêmeas grávidas e seus ovos a um
substrato tratado com um micoinseticida em campo.
A quantidade de óleo aplicada sobre o papel filtro no presente estudo foi muito
pequena (5 µl/ cm2). Em um recente teste de laboratório, fêmeas de A. aegypti expostas
a dispositivos simulados de reprodução tratados com conídios de M. anisopliae IP 46,
formulados em água ou óleo-água, não foram repelidas pela presença de conídios e óleo
vegetal sobre papel filtro. Tal comportamento se repetiu no primeiro teste de campo em
Goiânia, Brasil, com Aedes sp, que depositaram ovos sobre superfície tratada com
conídios formulados no mesmo óleo (Lobo, Rodrigues e Luz, comunicação pessoal). A
atividade ovicida poderia ser potencializada pelo uso de óleos vegetais ou minerais ou
pelo uso de concentrações de conídios mais altas. Entretanto, é necessário testar se o
tipo e a concentração do óleo escolhido para formular o fungo podem repelir fêmeas
grávidas. Estudos nesse sentido evitarão possíveis interações negativas entre óleo e
mosquitos, permitindo a aproximação de adultos com a superfície tratada com um
formulado fúngico oleoso, a ocorrência da oviposição e infecção de adultos e ovos.
O desenvolvimento e esporulação de M anisopliae sobre os ovos aumenta o
inóculo fúngico viável no substrato, onde novas fêmeas, no momento da oviposição, e
os ovos postos podem subsequentemente serem infectados. Essa contínua reciclagem
aumenta a persistência do fungo e o efeito residual do micoinseticida, especialmente em
dispositivos elaborados para atrair e inocular fêmeas e seus ovos. Os conídios podem
37
eventualmente serem dispersos até outros locais pelas fêmeas contaminadas, que
deixam o substrato após a oviposição.
Estes estudos de laboratório mostram que formulações de M. anisopliae IP 46 à
base de óleo podem ser promissoras para o desenvolvimento de estratégias práticas para
a redução de populações de ovos viáveis de culicíneos em condições de campo. Esta
nova abordagem requer menos material fúngico, do que os modos convencionais de
aplicação de conídios, para obter resultados semelhantes. Assim, reduzem-se os custos
no caso da produção, comercialização e uso de um produto à base de M. anisopliae
contra A. aegypti.
38
7. CONCLUSÕES
A aplicação direta de formulações de M. anisopliae IP 46 à base de óleo vegetal
aumentou a atividade entomopatogênica do fungo, comprovada pela grande quantidade
de ovos com micélio ou conídios e eclosão sobre o papel filtro e pela redução do
número de larvas eclodidas após submersão em água dos ovos tratados.
A técnica de aplicação indireta de conídios de M. anisopliae IP 46 em ovos de A.
aegypti também se mostrou efetiva em reduzir a população de ovos viáveis desse vetor,
em condições de laboratório, e se mostra a técnica mais viável a ser aplicada em campo.
Ovos de A. aegypti são passíveis de serem alvos de aplicações de formulações à
base de fungos entomopatogênicos, como M. anisopliae IP 46.
39
8. RECOMENDAÇÕES
Um impedimento para o controle integrado desse vetor em campo é o baixo
efeito residual de conídios formulados e aplicados em substratos. Então, é necessária a
realização de mais testes visando encontrar óleos e substratos que protejam e
mantenham a virulência do fungo por mais tempo em um dispositivo de reprodução
colocado em campo. Estudos futuros devem avaliar a persistência dos conídios no
meio, ou seja, o tempo que esses permanecem viáveis e podem contaminar e infectar
novos adultos e ovos.
Com o objetivo de elucidar e confirmar os mecanismos de infecção e patogenia
de M. anisopliae IP 46 para ovos de A. aegypti são recomendados estudos com
microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura com o intuito de observar se
há a penetração do córion por hifas e quais os locais com maior frequência de
penetração e técnicas de biologia molecular para detecção de material genético deste
fungo no interior do ovos supostamente infectados.
40
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