i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DAS

RELAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO

Pollyana Guimarães de Oliveira

Caracterização de uma nova linhagem de célula dendrítica: AP284

Goiânia 2014

ii

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS

TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL

DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de

Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei

nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [X] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento: Concorda com a liberação total do documento [X] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s)

em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo

eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a)

Autor (a): Pollyana Guimarães de Oliveira

E-mail: pollyana.bio1@gmail.com

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor

Agência de fomento:Sim Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior

Sigla: CNPq e CAPES

País: Brasil UF: GO CNPJ: 33654831-0001/36 (CNPq) 00.889.834/0001-08 (CAPES)

Título: Caracterização de uma nova linhagem de célula dendrítica: AP284

Palavras-chave: Células Dendríticas, AP284, Il-23

Título em outra língua: Characterization of a new dendritic cell lineage: AP 284

Palavras-chave em outra língua: Dendritic cells, AP284, IL-23

Área de concentração: Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro

Data defesa: (23/10/2014)

Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito Hospedeiro

Orientador (a): Prof.Dr. Milton Adriano Pelli de Oliveira

E-mail: mapoliv@usp.com

Co-orientador (a):*

E-mail:

iii

Pollyana Guimarães de Oliveira

Caracterização de uma nova linhagem de célula dendrítica: AP284

Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre

Orientador: Milton Adriano Pelli de Oliveira

Goiânia 2014

iv

v

Programa de Pós-Graduação em Biologia das Relações Parasito-

Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Pollyana Guimarães de Oliveira

Orientador (a): Milton Adriano Pelli de Oliveira

Membros:

1. Milton Adriano Pelli de Oliveira

2. Juliana Reis Machado e Silva

3. Marina Tiemi Shio

Data: 23/10/2014

vi

“Mudaste o meu pranto em dança,

a minha veste de lamento em veste de alegria,

para que o meu coração cante louvores a ti e não cale.

Senhor, meu Deus,

eu te darei graças para sempre”.

Salmos 30:11-12

vii

Dedico à:

Deus, o autor da minha vida e único para mim, que por amor entregou seu

filho Jesus, que pela tua graça nos salva. A meu querido orientador Prof Dr

Milton A. P. de Oliveira, pela paciência, colaboração e por ter me dado à

oportunidade de desenvolver este projeto.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por seu infinito amor e bondade, pelo cuidado que

sei que tem por mim, pela força e por estar sempre ao meu lado nos

momentos em que mais preciso da sua presença. Sem a graça de Deus,

nada seria possível em minha vida, nem as mais simples conquistas.

Agradeço ao meu orientador Prof Dr Milton A. P. de Oliveria.

Agradeço por ter cumprido o seu papel com excelência e humildade,

obrigada pela paciência que teve comigo desde o primeiro momento e pelo

auxílio durante a execução das minhas atividades no laboratório. Obrigada

por compreender minhas limitações e dificuldades.

Agradeço à minha mãe Divina de Fátima, que dedicou toda a sua vida

a mim e a minha irmã. Agradeço ao meu pai de criação, Francisco, que nos

escolheu para ser a sua família. Agradeço especialmente à minha irmã

Angela, que nos deu um motivo a mais para sorrir e viver; minha sobrinha

Ana Clara, que vêm encantando as nossas vidas com a sua alegria. Amo

muito todos vocês.

Agradeço ao meu namorado André Luís, que em muitos momentos

acreditou mais em mim do que eu mesma. Obrigada pelo apoio que sempre

me deu desde a época da faculdade. Agradeço pelo companheirismo e pelo

amor. Agradeço à minha amiga Rejane, que também foi uma grande

companheira nos tempos de faculdade e que me incentivou muito a iniciar o

mestrado.

Agradeço a todos do laboratório de citocinas. Ao meu querido amigo

Clayson, que foi uns dos primeiros a me ajudar nas atividades do laboratório

e que vêm sempre me ajudando durante esse tempo. Obrigada pelo tempo

que dedicou para tirar minhas dúvidas e me auxiliar nos meus experimentos,

obrigada por sempre me ajudar com os animais do laboratório, pela

contribuição nesse projeto e por sua amizade.

Agradeço à Natália, que também teve grande contribuição no meu

desenvolvimento dentro do laboratório e que é uma pessoa admirável pela

sua competência e profissionalismo. Obrigada pelas dicas, opiniões, e por

ix

ser uma pessoa amiga e sincera. Agradeço muito à Lucilla, que em muitos

momentos me ajudou, principalmente nesta reta final. Agradeço pela sua

colaboração e paciência. Obrigada também pelos bons momentos que a sua

amizade me proporciona.

Agradeço à Jéssica que também vêm se mostrando uma grande

amiga e companheira, muito obrigada por tudo. Agradeço a Lohane, que

apesar de já não fazer mais parte da equipe do laboratório, me ajudou em

vários momentos, muito obrigada pela contribuição e pela amizade que

continua entre agente.

Em fim, agradeço a todos do Instituto de Patologia Tropical e

Saúde Pública (IPTSP) que me ajudou direto ou indiretamente. Agradeço a

todos os professores pelo conhecimento que vêm passando, pelas aulas,

pelos eventos e por toda a contribuição. Agradeço, principalmente, ao

Programa de Pós-graduação em Biologia da Relação Parasito Hospedeiro e

à Universidade Federal de Goiás pela oportunidade de formação

profissional.

x

SUMÁRIO

SUMÁRIO ...................................................................................................... x

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ................................................................. xii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................... xiii

RESUMO ...................................................................................................... xv

ABSTRACT .................................................................................................. xvi

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA ............................................ 1

1.1 Características e diversidade das células dendríticas....................... 1

1.2 Receptores semelhantes à Toll (TLRs) e sua expressão em DCs .... 5

1.3 Produção de citocinas por DCs e os diferentes perfis de resposta imune .......................................................................................................... 9

1.4 A família IL-12 ................................................................................. 12

1.5 Sinergismo de TLRs e produção de IL-12 e IL-23 .......................... 15

1.6 Linhagens de DCs e células AP284 ................................................ 16

2 JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 18

3 OBJETIVOS .............................................................................................. 20

3.1 Objetivo Geral ..................................................................................... 20

3.2- Objetivos Específicos ........................................................................ 20

4 MÉTODOS ................................................................................................ 22

4.1 Camundongos .................................................................................... 22

4.2 BMDCs, RAW264 e linhagem celular AP284 ..................................... 22

4.3 Tratamento com ligantes de TLRs e Escherichia coli ......................... 23

4.4 Anticorpos ........................................................................................... 23

4.5 Ensaio imonoenzimático (ELISA) ....................................................... 24

4.6 Análise dos marcadores de superfície de células AP284 e BMDCs por citometria de fluxo .................................................................................... 24

4.7 Produção de óxido nítrico (NO) .......................................................... 25

4.8 Ensaio colorimétrico MTT (brometo de 3 (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) ....................................................................................... 25

4.9 Parasitos e antígenos ......................................................................... 26

4.10 Infecções dos camundongos e cultura dos linfonodos ..................... 26

4.11 Análises estatísticas ......................................................................... 27

xi

5 RESULTADOS .......................................................................................... 28

5.1 Avaliação da expressão de marcadores celulares presentes em macrófagos, DCs e AP284. ...................................................................... 28

5.2 Avaliação da expressão de TLR4 por AP284 .................................... 29

5.3 Aspecto de células AP284 em cultura após estímulo com LPS ......... 30

5.4 Avaliação da produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDCs após estímulos com diferentes agonistas deTLRs ....... 30

5.5 Avaliação da produção IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDCs após estímulo com IFN-γ ............................................................. 32

5.6 Avaliação da viabilidade de células AP284 após estímulo com IFN-γ 34

5.7 Avaliação da produção de NO por células AP284 e BMDCs .............. 35

5.8 Avaliação da produção de TNF por células AP284 após estímulos com LPS e IFN-γ .............................................................................................. 36

5.9 Capacidade fagocítica de células AP284 ........................................... 38

5.10 Avaliação da produção de IL-12p40 por células AP284 infectadas por L. major..................................................................................................... 39

5.11 Avaliação da produção de IL-17 e IFN-γ in vivo após inoculação de células AP284 infectadas com L. major .................................................... 40

6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 42

7 CONCLUSÕES ......................................................................................... 48

REFERÊNCIAS ............................................................................................ 50

ANEXOS ...................................................................................................... 64

Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética ..................................................... 64

xii

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Figura 1: Marcadores de superfícies relacionados aos diferentes tipos de DCs...................................................................................3

Figura 2: Família IL12..........................................................................13

Figura 3: Avaliação da expressão de marcadores presentes em BMDC, AP284 e RAW264...................................................28

Figura 4: Avaliação da expressão de TLR4 em AP284......................29

Figura 5: Aspecto de células AP284 em cultura após estímulo com LPS.......................................................................................30

Fugua 6: Avaliação da produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDC após estímulos com LPS e E. coli........................................................................................32

Figura 7: Avaliação da produção IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDC após estímulo com IFN-γ...............33

Fugua 8: Avaliação da viabilidade de células AP284 após estímulo com IFN-γ.............................................................................34

Fugua 9: Avaliação da produção de NO por células AP284 e BMDC...................................................................................36

Figura 10: Avaliação da produção de TNF por células AP284 após estímulos com LPS e IFN-γ..................................................37

Fugua 11: Capacidade fagocítica de células AP284.............................38

Fugua 12: Avaliação da produção de IL-12p40 por células AP284 infectadas por L. major.........................................................39

Fugua 13: Avaliação da produção de IL-17 e IFN-γ in vivo após infecção com células AP284 mais L. major.........................41

xiii

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

APCs: Células apresentadoras de antígenos (do inglês antigen-presenting cells)

BMDCs: Células dendríticas derivadas de medula óssea (do inglês dendritic cells bone marrow)

cDCs: células dendríticas convencionais

CLP : progenitores linfoides comum (do inglês common lymphoid progenitors)

CMP: progenitor mieloide comum (do inglês common myeloid progenitors)

ConA: concanavalina A

DCs: células dendríticas (do inglês dendritic cell)

ER: retículo endoplasmático

ELISA: Ensaio imonoenzimático

FACS: Separação de células ativadas por fluorescência (do inglês Fluorescence Activated Cell Sorting)

GM-CSF: Fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos (do inglês Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

Inf-DC: células dendríticas inflamatórorias

iNOS: Óxido nítrico sintase induzida

IFN-γ: Interferon- gama

IFN- tipo I: Interferon tipo um

LBP: Proteína de ligação à LPS (do inglês LPS binding protein)

LC: células de Langerhans (do inglês Langerhans cells)

LPS: lipopolissacarídeo

LTA: ácido lipoteicóico

LTc: linfócitos T citotóxicos

mDCs: células dendríticas migratórias

MDP: precursor macrófago/DC

MHC: molécula principal de histocompatibilidade (do ingllês major histocompatibility complex)

MLR: reação leucocitária mista (do inglês mixed leukocyte reaction)

moDC: células dendríticas derivadas de monócitos

NK: natural Killer

xiv

NO: Óxido nítrico

PAMPs: padrões moleculares associados a patógenos (do inglês pathogen-associated molecular patterns)

PBS: Solução salina tamponada com fosfato (do inglês phosphate buffer saline)

pDCs: células dendríticas plasmocitóides

PGN: Pepitideoglicana

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

PRRs: receptores de reconhecimento de padrões (do inglês pattem recognition receptors)

RNA: ácido ribonucleico

SBF: Soro fetal bovino

SD: Desvio padrão

SDS: Dodecil sulfato de sódio (do inglês sodium dodecyl sulfate)

TGFβ: Fator de crescimento transformador beta (do inglês transforming growth factor beta)

Th: T auxiliares (do inglês T helper)

Th1: linfócitos T auxiliares do tipo 1

Th2: linfócitos T auxiliares do tipo 2

Th17: linfócitos T auxiliares do tipo 17

TLRs: Receptores semelhantes ao toll (do inglês Toll like receptors)

TMB: Tetramethylbenzidine

TNF: Fator de necrose tumoral (do inglês Tumor Necrosis Factor)

Treg: células T reguladoras

xv

RESUMO

As células dendríticas (DCs) constituem um grupo heterogêneo de

células e são as principais ativadoras de linfócitos T virgens. Durante a

apresentação de antígenos são produzidos diferentes tipos de citocinas que

interferem com o perfil de resposta imune que será gerado. A produção de

IL-12p70 favorece a diferenciação do perfil Th1 e a produção de IL-23

potencializa o perfil de resposta Th17. Devido à importância da IL-12 e IL-23

na estabilização de uma resposta imune adquirida, a produção destas

citocinas é altamente controlada e alvo de diversas pesquisas. O objetivo

deste projeto foi de caracterizar uma nova linhagem de DC AP284 a partir

dos seus marcadores de superfícies e avaliar a capacidade destas células

em produzir IL-12p40 e IL-23 após diferentes estímulos in vitro, além de

avaliar a sua capacidade fagocítica e indução de um perfil de resposta Th1

ou Th17 in vivo. A expressão dos marcadores foi analisada por citometria de

fluxo e a dosagem de IL-12 e IL23 por ELISA após o estímulo de células

AP284 in vitro com lipopolisssacáride (LPS) e Escherichia coli. Células

AP284 expressam MHC classe II, CD11c e 33D1 em sua superfície, sendo

estes marcadores característicos de populações de DCs. Após estímulos

com LPS e E.coli, células AP284 produzem grande quantidade de IL-12p40

e IL-23, mas não produzem IL-12p70. A produção de IL-12p70 não foi

detectada mesmo após a adição de IFN-γ às culturas, além disso, a

primagem das células com IFN-γ promoveu a inibição de IL-12p40 e IL-23.

Neste trabalho foi demonstrado que células AP284 são DCs, pois além de

expressarem MHC classe II expressam marcadores que são característicos

deste grupo celular. Nossos dados ainda suportam a ideia de que a

linhagem AP284 seja uma linhagem de DC17, pois produziram grandes

quantidades de IL-12p40 e IL-23, mas nenhuma quantidade de Il-12p70.

Assim, AP284 pode ser uma ferramenta importante para o estudo dos

mecanismos de indução e de regulação da produção da IL-23 e uma

possível ferramenta para o estudo da geração e manutenção de um perfil de

resposta Th17.

Palavras-chave: Células dendríticas, AP284, IL-23

xvi

ABSTRACT

Dendritic cells (DCs) are a heterogeneous group of cells and the major

activators of naive T lymphocytes. During antigen presentation, different

types of cytokines are produced and they will interfere with the immune

response profile generated. IL-12p70 promotes the differentiation of Th1

phenotype and IL-23 p enhances the Th17 response. Given the major role of

IL-12 and IL-23 on the stabilization of the acquired immune response, the

production of these cytokines is highly controlled and it is an issue for several

studies. The objective of this work was to characterize a new lineage of DC,

described as AP284, based on their surface markers and evaluate the ability

of these cells to produce IL-12p40, IL-12p70 and IL-23 after different stimulus

in vitro. Additionally it will be evaluate their phagocytic capacity and their

ability to induce a Th1 and Th17 response in vivo. The expression of the

markers was analyzed by flow cytometry and the quantitation of IL-12 and

IL23 was performed by ELISA after stimulation of cells AP284 in vitro with

lipopolysaccharide (LPS) and Escherichia coli. AP284 cells express MHC

class II, CD11c and 33D1 on its surface, which are characteristic markers of

DCs. After stimulus with LPS or E.coli, AP284 cells produce large amounts of

IL-12p40 and IL-23 but do not produce IL-12p70. The production of IL-12p70

was not detected even when IFN-γ is added to prime cultures, moreover,

priming the cells with IFN-γ promoted inhibition of IL-12p40 and IL-23. Our

data sugest that the AP284 is a DC17 lineage. Thus, AP284 can be an

important tool to study the mechanisms of induction or regulation of IL-23

production and a possible tool to study generation and maintenance of a

Th17 profile.

Keywords: Dendritic cells, AP284, IL-23

1

1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA

1.1 Características e diversidade das células dendríticas

As células dendriticas (DCs) pertencem a um grupo heterogêneo de

células responsáveis por iniciar a resposta imune adquirida, pois reconhecem e

capturam micro-organismos durante uma resposta imune inata e posteriormente

são capazes de ativar linfócitos T naïve, fazendo assim, uma conexão entre a

imunidade inata e adquirida (Heuze et al. 2013).

As DCs foram descritas no ano de 1973 e caracterizadas como uma nova

linhagem celular do sistema imune que, além de serem bastante heterogêneas,

possuíam características específicas que as diferenciavam de monócitos e

macrófagos. Algumas características observadas foram: aderência, longos

prolongamentos citoplasmáticos, capacidade de fagocitose, dentre outros

(Steinman & Cohn 1973).

No ano de 1978 foi analisado o papel funcional das DCs, quando as

células foram isoladas do baço de camundongos e demonstrado que um

pequeno número de DCs eram capazes de induzir uma intensa proliferação de

linfócitos T em uma reação leucocitária mista (MLR) após dois ou quatro dias de

cultura, mostrando que DCs poderiam ser 100 vezes ou mais potentes para

estimular células T do que outras populações linfoides (Steinman & Witmer

1978).

Estudos posteriores mostraram que DCs possuíam em sua superfície

uma alta expressão da molécula principal de histocompatibilidade de classe II

(MHC II), confirmando que elas eram as principais células que apresentavam

antígenos a linfócitos T naïve através desta molécula, iniciando assim a resposta

imune adquirida (Steinman et al. 1979).

A partir da descoberta das DCs, muitos trabalhos surgiram a fim de

caracterizar melhor esta linhagem celular. A procura de marcadores de

superfície destas células foi grande e logo foi demonstrado que DCs em um

estado imaturo expressavam alguns marcadores que geralmente não eram

expressos por DCs ativadas (Steinman 2012).

2

Nos tecidos periféricos, as DCs encontram-se em um estado de repouso

e atuam como sentinelas. Frente a uma infecção, elas reconhecem e fagocitam

micro-organismos. Após a fagocitose destes micróbios, elas passam por um

processo de maturação que é caracterizado pela maior expressão de moléculas

co-estimuladoras como CD40, CD80 e CD86 e maior produção de citocinas

(Shortman & Liu 2002; Shortman & Naik 2007).

Várias subpopulações de DCs vem sendo caracterizadas nos últimos

anos, estas subpopulações foram formadas com base em vários critérios

estudados durante o tempo, como por exemplo, os diferentes tipos de

marcadores presentes em suas superfícies e suas localizações. As diferentes

populações de DCs estão presentes na maioria dos tecidos formando uma rede

especializada para capturar antígenos (Chopin et al. 2012).

Monócitos, DCs e macrófagos têm sido historicamente classificados

dentro do sistema fagocítico mononuclear (MPS) com base em suas

características funcionais e fenotípicas, no entanto, como estas células possuem

várias diferenças e funções, uma classificação definitiva vem sendo um desafio

(Guilliams et al. 2014). Para melhor classificação destas células são sugeridos

os seguintes critérios: ontogenia, função, localização ou fenótipo (Guilliams et al.

2014).

Alguns estudos sobre a ontogenia das DCs começaram a esclarecer a

organização da linhagem de DCs murinas. O uso de técnicas com múltiplas

cores fluorescentes ajudaram a identificar a origem de células progenitoras das

diferentes subpopulações de DCs a partir de seus marcadores. Estas células

foram isoladas da medula óssea de camundongos, sangue ou baço e

enxertadas em camundongos receptores para determinar suas linhagens

(Geissmann et al. 2010).

Em camundongos, as DCs foram classificadas em cinco principais

grupos: células dendríticas convencionais (cDCs), células dendríticas

plasmocitóides (pDCs), células de Langerhans na pele (LC), células dendríticas

derivadas de monócitos (moDC) e células dendríticas inflamatórias (inf-DC)

(Guilliams et al. 2010) (Figura1).

cDCs ainda podem ser classificadas como mieloides ou linfoides, sendo

as primeiras também chamadas de DCs migratórias (mDCs) originando-se de

progenitores mieloides da medula óssea (Chopin et al. 2012). mDCs capturam

3

antígenos no local da infecção e rapidamente alcançam os linfonodos drenantes

mais próximos para a apresentação de antígenos (Reis e Sousa 2004).

Figura 1: Representação dos diferentes subconjuntos de células dendriticas e seus respectivos

marcadores de superfícies (Modificado de Guilliams et al. 2010).

Estudos demonstram que esta migração é regulada pelo receptor de

quimiocina CCR7, sendo este, fundamental para que DCs possam alcançar os

vasos linfáticos e consequentemente os órgãos linfoides (Ohl et al. 2004).

Dentre as DCs mieloides, encontra-se as DCs dermais, caracterizadas por

expressarem MHC II, CD11b, CD11c e CD301 (Dupasquier et al. 2004; Ziegler-

Heitbrock et al. 2010).

DCs de origem linfoide estão localizadas em órgãos linfoides secundários,

como linfonodos e baço. Os antígenos que chegam a estes órgãos através da

linfa ou do sangue são capturados e apresentados por estas células aos

linfócitos T (Belz & Nutt 2012). DCs de origem linfoides comumente expressam

MHC II, CD11c e CD11b (Edelson et al. 2010)

pDCs possuem aparência de células do plasma e algumas propriedades

das cDCs, pois também podem apresentar antígenos. As pDCs possuem uma

característica específica que é a capacidade de produzir interferon do tipo I (IFN

4

tipo I) após estímulos com vírus ou componetes virais, onde estudos mostram

que as pDCs são as principais células produtoras desta citocina após infecção

de camundongos com citomegalovírus (Asselin-Paturel et al. 2001).

Diferentemente de outras subpopulações de DCs, pDcs não expressam o

marcador CD11b, porém expressam os marcadores CD11c, Ly6C, B220

(Asselin-Paturel et al. 2001) e ao contrário de cDCs, que o seu precursor sai da

medula óssea para se desenvolver na periferia, o desenvolvimento de pDCs é

geralmente completo na medula (D'Amico & Wu 2003).

cDCs e pDCs compartilham um progenitor comum denominado precursor

macrófago-DC (MDP) identíficado pelos seus marcadores de superfícies Lin−

cKithi CD115+ CX3CR1+ Flt3+ (Fogg et al. 2006) e estudos mostram que alguns

subconjuntos de DCs incluindo CD11c+ CD8α-, CD11c+ CD8α+ e também pDCs

podem ter a origem de progenitores de medula óssea, tais como progenitores

linfoides comum (CLP) ou progenitores mieloides comum (CMP) (Akashi et al.

2000).

LCs estão localizadas na epiderme suprabasal formando uma rede nos

interstícios de queratinócitos e também foram descritas no epitélio escamoso

estratificado. LCs podem ser encontradas ainda nos linfonodos drenantes,

principalmente em casos de doenças inflamatórias da pele (Rausch et al. 1977).

Uma característica específica das LCs é a presença de langerina que parece ser

encontrada apenas neste subtipo (Loser & Beissert 2007).

LCs possuem algumas características compartilhadas com os

macrófagos, principalemente macrófagos residentes dos tecidos (Ginhoux et al.

2006). Devido a estas semelhanças alguns autores sugerem a classificação de

LCs como macrófagos e não DCs (Satpathy et al. 2012), porém esta

classificação ainda é contraditória, pois LCs possuem características clássicas

de DCs, como a capacidade de migrar para órgãos linfódeis periféricos para

apresentação de antígenos (Kissenpfennig et al. 2005; Wilson & Villadangos

2004).

Outra subpopulação de DCs são as moDCs. Estudos iniciais sobre esta

população demosntraram sua existência em áreas de células T nos linfonodos

com a expressão de MHC II, DC86 e MIDC-8, com pouca ou nenhuma

expressão de CD11c e poucas com a expressão de DEC-205. Estas moDCs

5

demonstraram maior capacidade fagocítica que as demais DCs de tecitos

periféricos (Randolph et al. 1999).

Monócitos também podem migrar do sangue para os tecidos durante uma

infecção e se diferenciar em inf- DCs (Serbina et al. 2008) que expressam MHC

II, CD11b, CD11c, DC-SIGN, CD107b (MAC-3) e Ly6Clow (Belz & Nutt 2012;

(Ziegler-Heitbrock et al. 2010). A natureza exata do precursor de DCs e a fase

em que os monócitos sofrem essa diferenciação ainda não são muito claras,

isso devido à subpopulações de DCs serem fenotipicamente diversas (Shortman

& Liu 2002).

Algumas citocinas podem ser importantes para o desenvolvimento de

subpopulações de DCs, como por exemplo, o fator estimulador de colônia de

granulócitos-macrófagos (CSF2/GM-CSF), onde estudos mostram que a

ausência do receptor desta citocina pode prejudicar o desenvolvimento de

algumas populações de DCs como, por exemplo, o desenvolvimento de DCs

CD103+ e CD11b+ (Greter et al. 2012).

Além da complexidade e heterogeneidade das DCs, há grandes desafios

técnicos para o avanço das pesquisas com esta linhagem. Um deles é a

escassez de DCs naturais para estudos in vivo, o que limita a experimentação.

No entanto, em modelos murinos, DCs derivadas de medula óssea (BMDC)

ainda têm sido amplamente utilizadas para estudar os papéis das DCs, onde

estas células são diferenciadas pelo tratamento com GM-CSF. (Inaba et al.

2009). Em humanos, DCs são cultivadas de forma similar a partir de células

mononucleares do sangue periférico ou monócitos CD14+ utilizando GM-

CSF/IL4 (Inaba et al. 2009).

O estudo das DCs vem aumentando ao longo dos anos devido ao seu

papel fundamental na ativação da resposta imune adquirida, fazendo com que

um melhor entendimento destas células auxilie na compreensão de mecanismos

de vacinas, geração de tolerância a transplantes ou de doenças autoimunes.

Além disso, novas técnicas baseadas na manipulação das DCs tem sido uma

poderosa ferramenta para induzir uma resposta imune protetora também contra

tumores (Morel & Turner 2010; Palucka & Banchereau 2012; Steinman 2012).

1.2 Receptores semelhantes à Toll (TLRs) e sua expressão em DCs

6

Para uma proteção adequada contra a invasão de micróbios patogênicos

é necessário um equilíbrio entre o hospedeiro e sua microbiota (Sommer &

Backhed 2013). A capacidade de o sistema imune distinguir entre micro-

organismos comensais e patogênicos é fundamental para evitar o

desenvolvimento de respostas imunes contra o próprio organismo. Assim, as

células do sistema imunológico desenvolveram uma variedade de receptores de

reconhecimento de padrões (PRRs), como os Toll-like receptors (TLRs) (Rakoff-

Nahoum et al. 2004; Sommer & Backhed 2013) e as DCs são as principais

células da imunidade inata que expressam simultaneamente diferentes TLRs

(Uematsu et al. 2006).

TLRs são moléculas que foram conservadas durante a evolução e

identificadas em vertebrados como homólogos da proteína Toll encontrados em

Drosophila melanogaste. Neste inseto, foi visto que Toll estimulava a produção

de proteínas antimicrobianas. Toll foi definido funcionalmente baseado em seu

importante papel na determinação da resistência de D. Melanogaster quando

infectadas por fungos ou bactérias Gram-positivas (Lemaitre et al. 1996).

TLRs são identificados como proteínas transmembranas do tipo I

caracterizadas por domínios extracelulares que possuem variadas repetições

ricas em leucina e um motivo citoplasmático com domímio homólogo de

sinalização do receptor de interleucina 1 (IL-1), denominado Toll/IL-1R (TIR)

(Bowie & O'Neill 2000).

TLRs podem reconhecer uma variedade de moléculas presentes em

micro-organismos denominadas padrões moleculares associados a patógenos

(PAMPs), como por exemplo, lipídios, carboidratos, peptídeos e ácidos nucléicos

(Hemmi et al. 2003).

Todos os eventos realizados por DCs como a migração para órgãos

periféricos e apresentação de antígenos a linfócitos T, são antecedidos pelo

reconhecimentos dos PAMPs na superfície de micro-organismos através de

PPRs principalmente os TLRs que estão presente em suas membranas. TLRs

na superfícies de DCs são os principais receptores que irão contribuir para a

diferenciação dos diferentes tipos de respostas imunes da imunidade adquidida.

Tanto camundongos quanto humanos são capazes de responderem a diferentes

patógenos através de TLRs (Iwasaki & Medzhitov 2004).

7

Em camundongos, vários TLRs já foram identificados, podendo ser

expressos na superfície de células. TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 e TLR6 (Pifer et

al. 2011; Shi et al. 2011) reconhecem componentes da membrana

principalmente lipídios, proteínas e lipoproteinas de origem microbiana. TLR3,

TLR7, TLR9, TLR11, TLR12 e TLR13 expressos em vesículas intracelulares

como o retículo endoplasmático (ER), endossomas, lisossomas vão reconhecer

ácidos nucléicos microbianos (Kawai & Akira 2010). Em humanos, não há

expressão de TLR12 e TLR13 e TLR11 não é funcional (Yarovinsky et al. 2005).

TLR4, o primeiro a ser descrito, foi identificado como receptor que

responde a lipopolissacarídeo (LPS), encontrado na membrana exterior de

bactérias Gram-negativas que podem causar choque séptico. Juntamente com

MD2, TLR4 forma um complexo na superfície celular que funciona como

principal componente para ligação com LPS. Outras proteínas como a proteína

de ligação de LPS (LBP) e CD14 estão envolvidas no reconhecimento de LPS

(Akashi-Takamura & Miyake 2008). LBP é uma proteína plasmática que se liga

ao LPS solúvel contribuindo para formação do complexo TLR4-MD2. Além de

ligação ao LPS, TLR4 também pode reconhecer proteínas do vírus respiratório

sincicial, proteínas de fusão do envelope do vírus de tumor mamário de

camundongos e Streptococcus pneumoniae (Akira et al. 2006).

TLR2 também está envolvido no reconhecimento de uma ampla

variedade de PAMPs (Akira et al. 2006), incluindo lipopeptídeos, peptidoglicano

e ácido lipoteicóicos de bactérias Gram-positivas ou zymozam derivado de

fungos. TLR2 comumente forma heterodímeros como TLR2-TLR1 que podem

reconhecer lipopeptídeos triacilados de bactérias Gram-negativas (Jin et al.

2007; Kang et al. 2009).

TLR3 possui a capacidade de reconhecer moléculas presentes em vírus,

como, por exemplo, o RNA de rinovírus, vírus sincicial respiratório, vírus da

encefalomiocardite e vírus do Nilo Ocidental (Akira et al. 2006; Kawai & Akira

2008). As respostas imunes antivirais desencadeadas por TLR3 ocorre

principalmente através da produção de IFN tipo I e citocinas inflamatórias, onde

estudos mostram que camundongos deficientes de TLR3 são mais suscetíveis a

infecções com citomegalovírus e humanos com deficiencia deste receptor

possuem uma maior suscetibilidade ao vírus herpes simplex 1 (Tabeta et al.

2004; Zhang et al. 2007).

8

TLR5 pode reconhecer flagelina bacteriana e DCs CD11c+ CD11b+ na

lâmina própria do intestino delgado possuem uma alta expressão deste receptor.

Estudos mostraram que estas células nos camundongos, foram capazes de

detectar Salmonella typhimurium e de produzirem citocinas pró-inflamatórias

após a infecção, dependente deste receptor. Neste mesmo estudo,

camundongos deficientes de TLR5 tiveram uma dificuldade no reconhecimento

da bactéria e um aumento de sua migração do trato intestinal para os linfonodos

(Uematsu et al. 2006).

TLR7 é outro receptor que também pode reconhecer moléculas virais e

está presente em pDCs. Após infecções por vírus, pDCs podem produzir IFN

tipo I, sendo esta resposta totalmente dependente do reconhecimento de RNA

viral por estas células (Akira et al. 2006). TLR7 e TLR8 são filogeneticamente

semelhantes. Aparentemente, TLR8 é mais expresso em humanos e pode

reconhecer ssRNA viral e TLR7 é expresso geralmente em camundongos (Akira

et al. 2006; Kawai & Akira 2008).

TLR9 também está presente em pDCs e pode reconhecer motivos CpG

de DNA presente frequentemente em bactérias e vírus, mas raramente em

mamíferos (Krug et al. 2001). CpG sintético é utilizado como agonista deste

receptor e pode ativar tanto DCs, macrófagos ou células B. pDCs também

possuem uma alta expressão deste receptor, que pode reconhecer DNA de

citomegalovírus murino, HSV-1 e HSV-2 (Akira et al. 2006; Kawai & Akira 2008).

TLR11 é expresso por células presentes no rim e bexiga, onde este

receptor pode reconhecer componentes de bactérias uropatogênicas. Estudos

mostram que camundongos deficientes deste receptor são mais suscetíveis a

infecções com estas bactérias. TLR11 também é caracterizado por reconhecer

profilina derivado de Toxoplasma gondii (Yarovinsky et al. 2005).

mDCs expressam TLR1, TLR2, TLR3, TLR5, TLR6 e TLR8, porém alguns

estudos relatam a presença de TLR7 tanto em pDCs e mDCs (Ito et al. 2002).

TLR4 é pouco expresso em DCs do baço, porém é frequentemente expresso em

DCs CD11c+ CD11b+ isoladas da medula óssea de camundongos (Boonstra et

al. 2003).

As vias de sinalização dos TLRs foram intensamente estudadas após a

descoberta da molécula adaptadora MyD88. Estudos indicam que existem vias

de sinalizações celulares específicas que definem as suas propriedades

9

imunológicas, por exemplo, pDCs e monócitos inflamatórios possuem vias de

sinalizações únicas que regulam as respostas antivirais que provavelmente

estão ausentes em outros tipos celulares (Kawai & Akira 2006)(Jin & Lee 2008;

Kawai & Akira 2006).

Estudos recentes sobre lúpus eritematoso sistêmico, mostraram que

pDCs com modificações do gene do fator de transcrição E2-2 (Tcf4) e com uma

superexpressão de TLR7 em seu endossomo estavam envolvidas de uma forma

crítica na patogênese da doença com a produção de auto-anticorpos, fazendo

destas células um alvo terapêutico para o melhor estudo do lúpus eritematoso

(Sisirak et al. 2014).

Durante a última década, tem havido um enorme avanço na compreensão

dos papéis dos TLRs no reconhecimento de patógenos e na defesa do

hospedeiro e há evidências de que as sinalizações de PRRs citosólicos em

células não imunes também tem um papel para promover a maturação de DCs e

subsequente ativação de células T específicas. Desta forma, o uso de PAMPs

ou agonistas endógenos que possam estimular tanto células imunes ou não

imunes pode ser uma ferramenta muito útil para o estudo de adjuvantes e

vacinas eficazes (Kawai & Akira 2010).

1.3 Produção de citocinas por DCs e os diferentes perfis de resposta imune

Citocinas são proteínas reguladoras do sistema imune. Quando

produzidas no local de entrada de algum patógeno, as citocinas inflamatórias,

por exemplo, regulam a capacidade de fagócitos residentes ou recrutados para

destruir o agente infeccioso. As citocinas também regulam a apresentação de

antígenos feita pelas DCs e ativação das células T virgens nos linfonodos

drenantes (Chabalgoity et al. 2007).

Após a ativação das DCs, elas podem produzir diferentes tipos de

citocinas e isso irá interferir com o perfil de resposta que será gerado (Morel &

Turner 2010). Diferentes perfis de linfócitos T CD4+ denominados T auxiliares

(Th) já foram identificados de acordo com as suas citocinas de assinatura

produzidas e seus fatores de transcrições. Estes diferentes linfócitos fazem com

10

que o sistema imune combata de forma diferente e eficiente diversos tipos de

patógenos durante uma infecção (Evans & Jenner 2013).

Atualmente, há pelo menos quatro subconjuntos de células Th bem

caracterizados: Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). Cada um destes

subconjuntos produzem citocinas específicas, bem como possuem fatores de

transcrições característicos (Yamane & Paul 2013). Outros perfis de células Th

também vêm sendo descritos, como o perfil Th9 (Dardalhon et al. 2008;

Veldhoen et al. 2008) e o perfil Th22 (Eyerich et al. 2009).

As principais citocinas que iniciam as sinalizações para diferenciação de

um perfil de resposta Th1 são IL-12 e interferon-γ (IFN-γ), onde os fatores de

transcrições T-bet, STAT1 e STAT4 são necessários para geração deste

subconjunto de células Th. A IL-12 é secretada em grande quantidade pelas

células apresentadoras de antígenos (APCs), principalemte DCs após a sua

ativação via PAMPs que irá induzir as células natural Killer (NK) a produzir IFN-γ

(Yamane & Paul 2013). IFN-γ, por sua vez, promove a expressão de T-bet que é

o fator de transcrição responsável pela indução de linfócitos Th1 (Szabo et al.

2000).

Quando há indução destes fatores de transcrições, principalmente T-bet,

os subconjuntos Th2 e Th17 são suprimidos. O perfil Th1 é importante para a

eliminação de patógenos intracelulares, onde IFN-γ é fundamental para a

ativação de fagócitos, principalmente macrófagos, resultando em um aumento

de sua atividade microbicida (Luckheeram et al. 2012; Oestreich & Weinmann

2012).

O subconjunto de linfócitos do tipo Th2 é caracterizado pela produção de

IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, onde a IL-4 é a citocina de assinatura para a

caracterização deste perfil e também a principal citocina para diferenciação de

linfócitos T virgens em Th2. Este tipo de resposta é importante para induzir a

produção de IgE e promover o recrutamento de eosinófilos para o sítio de

infecção, onde a IL-5 é fundamental para o desenvolvimento, sobrevivência e

proliferação dos eosinófilos (Goswami & Kaplan 2011). A resposta Th2 é

relevante contra infecções helmínticas, controle da inflamação e expulsão dos

vermes (Gause et al. 2013).

Para o desenvolvimento do perfil de resposta do tipo Th2, o fator de

transcrição STAT6 e GATA3 são fundamentais. STAT6 não regula diretamente a

11

transcrição de IL-4, porém regula a atividade de GATA3 para induzir a produção

dessa citocina e também de IL-13 (Lee & Rao 2004).

O subconjunto de células Th17 representa uma nova linhagem de células

Th, onde as principais citocinas secretadas por este perfil são IL-17A, IL-17F, IL-

21 e IL-22 (Bettelli et al. 2008; Kolls & Linden 2004). Citocinas do perfil Th17

induzem a secreção de várias quimiocinas que irão recrutar neutrófilos para o

local da infecção. Além disto, durante uma resposta Th17, observa-se a

secreção de peptídeos antimicrobianos importantes para uma resposta imune

contra micro-organismos extracelulares. Células Th17 também desempenham

importantes papéis no desenvolvimento de respostas autoimunes (Kurebayashi

et al. 2013).

RORγt é o fator de trancrição chave para a diferenciação de células Th17.

A diferenciação de linfócitos T virgens em células Th17 depende do aumento do

nível de mRNA de RORγt em consequência da ação coletiva de citocinas

produzidas por DCs como IL-1β, IL-6, IL-21, IL-23, e fator de crescimento

transformador beta (TGFβ) (Ratajewski et al. 2012). Diferente de células Th1 e

Th2, onde suas respectivas citocinas de assinatura IFN-γ e IL-4 amplificam suas

diferenciações, as citocinas de assinatura de células Th17, IL-17A e IL-17F, não

desempenham este papel. É descrito que, para esta amplificação, IL-21

secretada por células Th17 coopera com TGF-β para uma maior produção de

IL17 e expressão do receptor IL-23R de uma forma dependente do fator de

transcrição STAT3 que amplifica esta resposta (Luckheeram et al. 2012).

As células Tregs formam outro subtipo de linfócitos. Tregs são essenciais

para a manutenção da auto tolerância do sistema imune, regulando e

controlando as respostas desencadeadas. Um desequilíbrio em células Tregs

pode desencadear uma variedade de doenças autoimunes e danos teciduais.

(Gratz & Campbell 2014). Uma das formas em que as Tregs inibem a atividade

de células T é através da produção de citocinas anti-inflamatórias como TGF-β e

IL-10. (Fallarino et al. 2003).

Há outros subtipos de linfócitos Th que também vêm sendo descritos,

como o perfil Th9, que produz grandes quantidades de IL-9 e IL-10 (Dardalhon

et al. 2008; Veldhoen et al. 2008) e o perfil Th22 que produz IL-22 e fator de

necrose tumoral (TNF), mas não IFN-γ, IL-4 ou IL-17 (Eyerich et al. 2009).

12

As DCs ou seus progenitores devem se diferenciar para que sejam

capazes de induzir tolerância ou para que sejam capazes de induzir estas

diferentes respostas e isso dependerá do microambiente onde as DCs estão

presentes e do tipo de infecção (Trinchieri 2012). Assim, os patógenos e os

PAMPs possuem um papel decisivo na definição de qual subpopulação de

linfócitos as DCs irão induzir (Jin et al. 2012; Leber et al. 2008).

1.4 A família IL-12 A IL-12 foi descrita no ano de 1989 inicialmente com o nome de “natural

killer stimulator factor-NKSF”, mas posteriormente foi chamada de IL-12. Foi

visto que diferentemente das outras citocina, para que a IL-12 pudesse ter uma

estrutura molecular era necessário a combinação de duas cadeias, a p40 e a

p35 (Trinchieri et al. 2003).

Posteriormente, estudos mostraram que outras citocinas compartilhavam

as mesmas cadeias da IL-12, dando assim origem a família IL-12, constituída

pelas citocinas IL-12, IL-23, IL-27 e IL-35, que utilizam uma das combinações

das cadeiasα p19, p28 e p35 com uma das cadeiasβ p40 ou Ebi3 (Vignali &

Kuchroo 2012).

A cadeia p40 mais a p35 formam a IL-12p70 em sua forma ativa, a

subunidade p40 mais a subunidade p19 formam a IL-23 ativa, a subunidade p28

mais a Ebi3 formam a IL-27 e a cadeia p35 mais a cadeia Ebi3 constituem a IL-

35 ativa (Vignali & Kuchroo 2012) (Figura2).

13

Figura 2: Subunidades compartilhadas pelas citocinas da família IL-12 (Modificado de Vignali &

Kuchroo.,2012).

A diversidade desta família proporciona a ela um grande potencial, o que

não é visto em outras citocinas, tanto em relação a ligação com seus receptores

como em outras interações moleculares. Essa diversidade pode ser responsável

pelas suas variadas funções biológicas que já foram descritas em diversos

estudos (Croxford et al. 2014).

A produção de IL-12p70 e IL-23 se da principalmente por DCs, onde

estudos mostram esta produção após estímulos de BMDCs com Salmonella

entérica (Liu et al. 2006; Siegemund et al. 2007).

Uma das principais funções da IL-12p70 é a de induzir a produção de

IFN-γ, que, durante a resposta imune inata é produzida por células NK e

posteriormente por linfócitos Th1 ou linfócitos T citotóxicos (LTc). Assim, a IL-

12p70 tem importante papel na diferenciação de linfócitos T para Th1,

produtores de IFN-γ (Goriely et al. 2008; Trinchieri 2012) e o IFN-γ por sua vez

potencializa a produção de IL-12p40/p70 (Gerosa et al. 2008).

A subunidade p40 da IL-12 é geralmente secretada em grande excesso

em comparação ao heterodímero p70 sendo secretada de 10 a 1000 vezes a

mais (Oliveira et al. 2003; Trinchieri et al. 2003). Estudos com macrófagos

mostram que é necessário estímulos através de moléculas co-estimuladoras

como CD40/CD40L para que ocorra a produção de IL-12p40, mostrando uma

14

dependência desta interação através de APCs com células T para uma melhor

produção da citocina (Kennedy et al. 1996).

A adição de IL-4 na geração de algumas subpopulações de DCs também

pode favorecer a produção de IL-12, assim como IFN tipo I, que provavelmente

têm ação semelhante ao IFN-γ (Gerosa et al. 2008). Por outro lado, as citocinas

IL-10 e TGFβ são as principais responsáveis pela inibição da produção de IL-

12p70 (Karp et al. 1998; Trinchieri et al. 2003).

A IL-23 é um membro da família IL-12 que possui a subunidade p40 e a

subunidade p19, conhecida também como IL-23α. Diversos tipos de APCs

produzem IL-23, como macrófagos e principalmente DCs ativadas. Tanto em

DCs de camundongos quanto de humanos, foi visto uma atividade biológica

semelhante da IL-23 que é diferente da IL-12p70 (Tang et al. 2012).

Inicialmente, a IL-23 foi descrita como importante para induzir um perfil de

resposta Th17 e no desenvolvimento e manutenção da inflamação de algumas

doenças autoimunes, como colite, psoríase e artrite (Oppmann et al. 2000).

Posteriormente, foi demonstrado que as citocinas do perfil Th17 têm uma

importante participação na resposta imune contra fungos e bactérias extras e

intracelulares e que a IL-23 não é essencial para geração de Th17, mas para a

expansão e manutenção deste perfil (Espinosa & Rivera 2012; Khader & Gopal

2010).

A IL-23 também tem a capacidade de ativar STAT3, que pode se ligar

diretamente ao locus do gene de IL-23R e aumentar a expressão deste receptor.

Além disso, a IL-23 associada com a IL-1β pode induzir o desenvolvimento de T-

bet e RORγt em células Th17 independente de TGFβ (Luckheeram et al. 2012;

Zuniga et al. 2013).

Desta forma, uma atenção especial tem se voltado para as citocinas da

família IL-12, principalmente a IL-12 e IL-23, uma vez que a primeira é essencial

para gerar o perfil de resposta Th1(Gerosa et al. 2008; Trinchieri et al. 2003) e a

segunda está relacionada com a potencialização do perfil Th17 (Espinosa &

Rivera 2012; Khader & Gopal 2010). Assim, um melhor entendimento dos

mecanismos que induzem a produção destas citocinas poderá ser útil para

propor mecanismos para induzir ou controlar essas respostas.

15

1.5 Sinergismo de TLRs e produção de IL-12 e IL-23

Vários agonistas sintéticos vêm sendo utilizados ao longo dos anos para

estudar a produção de citocinas e a indução dos diferentes perfis de resposta

imune in vitro, uma vez que as vias de sinalizações intracelulares após a

ativação de DCs via TLRs ainda necessitam de estudos (Dillon et al. 2004). Ao

reconhecer PAMPs, os TLRs podem formar heterodímeros como, por exemplo,

TLR2-TLR1 que podem reconhecer lipopeptídeos triacilados de bactérias Gram-

negativas (Jin et al. 2007; Kang et al. 2009).

O agonista sintético Pam3cys tem sido utilizado para avaliar a função de

TLR2-TLR6 e foi visto que Pam3cys tem a capacidade de induzir a produção de

IL-12p70 e IL-23 em diferentes populações de fagócitos murinos (Dillon et al.

2004; Vanhoutte et al. 2008). No entanto, a utilização deste agonista com

heterodímero TLR1/2 tem diminuído a produção de IL-12p70 induzida por

bactérias íntegras ou por ligantes de outros TLRs em DCs de camundongos

(Barkman et al. 2008; Dillon et al. 2004; Vanhoutte et al. 2008).

Os agonistas de TLR2/6 ou TLR2/2 Peptideoglicana (PGN) (Shida et al.

2009), ácido lipoteicóico (LTA) (Manirarora et al. 2011), Pam2cys (Weiss et al.

2010) também se mostraram capazes de induzir a produção de IL-12p70 em

células de camundongos e mais uma vez estes ligantes possuem a capacidade

de inibir a produção de IL-12 quando estimulada por bactérias integras (Barkman

et al. 2008; Kaji et al. 2010; Shida et al. 2009).

Em experimentos com camundongos desprovidos de TLR2 pode ser

confirmada a inibição de IL-12, onde as células destes camundongos produziram

uma maior quantidade de IL-12p40 e IL-12p70, quando comparados com células

de animais selvagens após infecção com Staphylococcus SP (Holley et al. 2012;

Kielian et al. 2005) ou Leishmania braziliensis (Vargas-Inchaustegui et al. 2009).

Porém, a produção destas citocinas por antígenos de alguns patógenos é

comprometida na ausência de TLR2, como por exemplo, antígenos de

Schistosoma japonicum, que são incapazes de induzir IL-12p70 em DCs de

camundongos deficientes de TLR2 (Gao et al. 2012).

A inibição da produção de IL-12 por TLR1/2/6 parece estar relacionada

com a indução dos fatores de transcrição c-fos ou ERK1/2 que favorecem a

produção de IL-10, que é inibidora de IL-12 (Dillon et al. 2004; Kaji et al. 2010).

16

Já outros estudos indicam que a inibição de IL-12 por ligantes de TLR2 está

relacionada com a interação com outras moléculas como DC-SIGN e SOCS-1 e

dectina 1 (Dennehy et al. 2009; Shida et al. 2009).

Contrariando os trabalhos que demonstraram a inibição de IL-12p70 por

ligantes de TLR1/2/6, a produção de IL-23, principalmente da subunidade p19, é

favorecida pelo estímulo deste receptor tanto em células humanas quanto de

camundongos (Dennehy et al. 2009; Gerosa et al. 2008; Roses et al. 2008;

Vanhoutte et al. 2008). O estímulo de TLR4 também induz a produção de IL-12,

sendo mais potente para induzir IL-12p70 do que IL-23 (Gerosa et al. 2008; Re &

Strominger 2001).

Quando estimuladas com LPS, BMDCs produzem IL-12p40, IL-12p70 e

IL-23 (Agrawal et al. 2003; Napolitani et al. 2005; Siegemund et al. 2007).

Estudos sugerem que para uma ótima produção de 12p70 e IL-23 deve haver

uma cooperação entre diferentes ligantes de TLRs (Napolitani et al. 2005;

Trinchieri et al. 2003). Assim, ligantes de TLR9, TLR8, TLR7, TLR3 e TLR5

interagem com LPS e isso leva a um aumento da produção de IL-12 e IL-23

(Bohnenkamp et al. 2007; Napolitani et al. 2005; Theiner et al. 2008).

O sistema imune e a interação de PAMPs com receptores presentes

principalmente em DCs podem induzir uma diversidade de sinalizações e essas

interações vem sendo cada vez mais estudadas ao longo dos anos. E como a

interação de TLRs presente em DCs podem induzir a produção de diferentes

citocinas gerando diferentes perfis de resposta imune uma melhor compreensão

dessas interações são necessárias.

1.6 Linhagens de DCs e células AP284 Muitas fontes têm sido utilizadas para obtenção de DCs humanas ou de

camundongos. A forma mais comum utilizada é a de derivar estas células a

partir de precursores estimulados com GM-CSF (Chopin et al. 2012). Estes

métodos podem fornecer grandes quantidades de DCs, porém à necessidade de

repetidas eutanásias de camundongos ou de quantidades consideráveis de

amostras sanguíneas humanas, e estes métodos são relativamente mais

trabalhosos em comparação a utilização de linhagens de células imortalizadas

(Fuertes Marraco et al. 2012).

17

Atualmente tem sido descrito um número limitado de linhagens

imortalizadas de DCs. Dentre estas células, destacam-se as células D1, uma

linhagem de DC imatura dependente de GM-CSF, derivada do baço de

camundongos, onde elas podem amadurecer com LPS (Mortellaro et al. 2009;

Winzler et al. 1997). A geração de linhagens de DCs murinas imortalizadas

derivadas de células tumorais também tem sido relatada, como a linhagem

SRDC (Ruiz et al. 2005), a linhagem SVDC e a linhagem DC 2.4 derivada de

medula óssea de camundongos C57BL/6 (Shen et al. 1997).

Outros estudos mostram que foi possível gerar DCs a partir de células da

medula óssea de camundongos com a suplementação do ligante de Flt3 durante

9 dias de cultura, onde após estímulos com LPS e IFN-γ foi gerando DCs com

características fenotípicas diferentes, com a expressão de CD11c, CD86 e MHC

II (Brasel et al. 2000).

A linhagem MUTZ-3 humana também foi descrita e é uma importante

linhagem para pesquisas de DCs humanas (Gibbs et al. 2012; Santegoets et al.

2008). Estas DCs têm sido utilizadas alternativamente para investigar

características como migração, maturação, produção de citocinas (Gibbs et al.

2013) dentre outras questões.

As células AP284 foram obtidas a partir de um tumor espontâneo do baço

de um camundongo macho (F1: C57bL/6 X CBA-H2b/q) (Klasen et al. 1988). Elas

foram descritas inicialmente como macrófagos maduros expressando CD11b,

CD107b, MAC-2, FCϒRII, e MHCII. Porém foi verificado que esta linhagem foi

capaz de capturar antígenos e apresentá-los a clones de linfócitos T reativos a

albumina bovina, induzindo a sua proliferação (Klasen et al. 1988).

No presente projeto será realizada a caracterização de células AP284

como uma nova linhagem de DC a partir da comparação dos seus marcadores

de superfícies com BMDCs, assim como será avaliado a capacidade destas

células produzirem IL-12 e IL-23 após estímulos com LPS e Eschericha coli. No

presente estudo também será avaliado a capacidade de células AP284 fagocitar

leishmania e sua capacidade em induzir a diferenciação de um perfil de resposta

Th1 ou Th17 in vivo.

18

2 JUSTIFICATIVA

As DCs são as principais células ativadoras de linfócitos T virgens e

formam uma ponte entre a imunidade inata e imunidade adquirida (Chopin et al.

2012). Frente a uma infecção, estas células capturam micro-organismos e

sofrem maturação e ativação. A maturação é caracterizada pela maior

expressão de moléculas co-estimuladoras como CD40, CD80 e CD86 e maior

produção de citocinas (Steinman 2008).

Além das DCs serem as principais células que ativam linfócitos T naïves,

elas também estão relacionadas com a geração dos diferentes perfis de

respostas imunes, como Th1, Th2 e Th17, pois a partir do reconhecimento de

patógenos via receptores como TLRs por DCs, diferentes tipos de citocinas são

produzidas e isso irá interferir diretamente com o tipo de resposta que será

gerado.

Dentre as citocinas produzidas, destacam-se as da família IL-12, incluindo

a IL-12p70 e a IL-23. A geração do perfil de resposta Th1 requer a produção da

citocinas IL-12p70, enquanto a IL-23 é fundamental para a potencialização do

perfil Th17. O primeiro perfil é importante para combater patógenos

intracelulares e o segundo está relacionado com o controle de bactérias e

fungos extracelulares e também é descrito como responsável por gerar algumas

doenças autoimunes (Espinosa & Rivera 2012; Khader & Gopal 2010)

Atualmente há uma escassez de DCs para estudos tanto in vitro como in

vivo, e a forma mais comum utilizada para obtenção de DCs para estes estudos

é a derivação destas células com GM-CSF a partir de células da medula óssea

de camundongos (Chopin et al. 2012), porém, apesar deste método fornecer

grandes quantidades de DCs, é necessário a eutanásia de vários camundongos,

o que dificulta este procedimento.

Devido à importância das DCs para o reconhecimento de micro-

organismos, manutenção, equilíbrio e indução dos diferentes tipos de resposta

imune adquirida, aqui está sendo caracterizada uma nova linhagem de célula

dendrítica; a AP284, a partir dos seus marcadores de superfícies e a sua

capacidade de produzir IL-12 ou IL-23 após diferentes estímulos. Acredita-se

que esta nova linhagem celular poderá ser uma importante ferramenta para

19

melhor compreensão dos fatores e interações celulares responsáveis pela

indução da produção de IL-12 e IL-23, além de servir ainda como uma

ferramenta para estudos na geração de respostas Th1 e Th17 in vivo e in vitro.

Estas células ainda poderão ser utilizadas para testar novos fármacos

potencialmente inibidores ou estimuladores da IL-12/IL-23.

20

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterizar células AP284 como uma nova linhagem de DC a partir da

análise de seus marcadores de superfícies e seu perfil de resposta imune

através da produção de citocinas.

3.2- Objetivos Específicos

3.2.1 Comparar a expressão dos marcadores CD11c, MHCII, 33D1, MAC1,

MAC3, CD40, CD80 na superfície de BMDCs, AP284 e RAW264;

3.2.2 Avaliar a expressão de TLR4 na superfície de células AP284;

3.2.3 Avaliar a produção de IL-12p40, IL12p70 e IL-23 após o estímulo de

células AP284 e BMDCs com LPS e E. coli;

3.2.4 Avaliar a produção de IL-12p40, IL12p70 e IL-23 após o estímulo de

células AP284 e BMDCs com LPS e E. coli na presença ou ausência de IFN-γ;

3.2.5 Avaliar a viabilidade de células AP284 após estímulo com IFN-γ;

3.2.6 Avaliar a produção de TNF-α por células AP284 na presença ou ausência

de IFN-γ;

3.2.7 Avaliar a produção de NO por células AP284 e BMDCs na presença ou

ausência de IFN-γ;

3.2.8 Avaliar a capacidade fagocítica de células AP284 e sua capacidade de

produzir IL-12 após infecção com L. major;

21

3.2.9 Avaliar a produção de IFN-γ e IL17 por células de linfonodo poplíteo de

camundongos após inoculo com células AP284 ou BMDCs infectadas com

Leishmania major.

22

4 MÉTODOS

4.1 Camundongos

Para realizar os experimentos in vivo foram utilizados Camundongos

C57BL/6 machos de 8 a 12 semanas de idade do Biotério do Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP-

UFG) que foram mantidos em estantes ventiladas (UNO BV, Holanda) com

alimentação e água a vontade. Estes animais foram utilizados para obtenção de

células de medula óssea e para a infecção experimental com Leishmania major.

Os camundongos foram anestesiados com quetamina 10% e xilazina 2% no

tecido subcutâneo (0,01mL/g) antes da eutanásia por decapitação. Para cada

experimento foram utilizados 15 camundongos.

4.2 BMDCs, RAW264 e linhagem celular AP284

Células AP284 foram gentilmente doadas pelo Dr. Pieter Leenen (Centro

Médico de Erasmo de Roterdã Holanda) e foram cultivadas em placas de cultura

de 6 poços (TPP, Suíça) em meio RPMI 1640 (SIGMA Chemical Co., St Louis,

MD, USA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF- CRIPION,

Andradina, São Paulo) inativado (56ºC por 30 min com agitação), 2mM de L-

glutamina (SIGMA Chemical Co), 100 U/mL de penicilina (SIGMA Chemical co)

e 100μg/mL de estreptomicina (SIGMA Chemical co) e 50M de 2-

mercaptoetanol (SIGMA Chemical co), referido como meio completo. As culturas

foram iniciadas com 2x105 células/mL e repiques foram feitos a cada 3 ou 4 dias.

As células foram removidas por jatos de solução salina fosfatada (PBS) e

lavadas duas vezes com PBS antes dos ensaios. Este mesmo protocolo foi

seguido para o cultivo de células RAW264.

BMDCs foram obtidas a partir da cultura de células da medula óssea

femoral e tibial dos camundongos. BMDCs foram extraídas pela injeção de PBS

estéril. As células foram lavadas em PBS e 4x106 células por poço (2 ml) foram

mantidas em cultura em placas de 6 poços em meio RPMI completo acrescido

23

de 10 ng/mL de GM-CSF. As culturas foram mantidas por 8 dias sendo o meio

trocado a cada dois dias.

4.3 Tratamento com ligantes de TLRs e Escherichia coli

As células AP284 ou BMDC foram incubadas na presença ou ausência

dos seguintes estímulos indicados nas legendas das figuras: a) 0,2 ou 1,0 µg de

lipopolissacáride LPS (LPS, Escherichia coli O111: B4, Sigma) b) 1 x 108 ou 1 x

107 Escherichia coli (ATCC® 11229™) mortas pelo calor. Em alguns

experimentos, as células foram pré-tratadas com 0,2ng/mL de IFN-γ

(R&DSystems, Miniápolis, EUA) por 2 h antes da adição dos estímulos. As

bactérias E. coli foram cultivadas em meio tioglicolato (Himedia) a 37C por 48 h,

lavados duas vezes em PBS e aquecidas a 90C por 30 min antes do uso. O

número de bactérias foi quantificado por turbidez como descrito anteriormente

(Neumann et al. 1998). As células foram cultivadas com estes estímulos por um

período de 24 h.

4.4 Anticorpos

A avaliação dos níveis de IL-12p40, IL12p70, IL-23, IFN-γ, IL-17 nos

sobrenadantes das culturas foi realizada pelo método do ensaio

imonoenzimático (ELISA) de captura utilizando os clones de anticorpos C17.8

(cobertura) e o C15.6 biotinilado para detecção de IL-12p40; C18.32 (cobertura)

e C17.15 (biotinilado) para IL-12p70; G23.8 (Cobertura) e C17.15 (biotinilado)

para ELISA de IL-23; AN18 (cobertura) XMG 1.2 (biotinilado) para IFN-γ; e o kit

comercial Duo-set para IL-17 (R&D Systems). A curva padrão foi obtida com

citocinas recombinantes de camundongos (R&D Systems). A reação foi

desenvolvida com estreptavidina conjugada com peroxidase seguida com a

adição do substrato contendo peróxido de hidrogênio e OPD ou TMB A reação

foi lida em uma leitora de ELISA a 450 e 620nm.

Com exceção do anticorpo clone G23.8 (eBiscience) e do kit comercial

para IL-17, todos os outros anticorpos para os ELISAs foram obtidos a partir de

hibridomas gentilmente doados pelo Dr.Giorgio Trinchieri (National Cancer

24

Institute, EUA) ou Dr. Ises de Almeida Abrahamshon (ICB, USP, São Paulo,

Brasil). As produções destes anticorpos são feitas como rotina no laboratório de

citocinas do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública – IPTSP (UFG).

4.5 Ensaio imonoenzimático (ELISA)

O Anticorpo de cobertura foi diluído em PBS e adicionado 80µl por poço

em placa de 96 poços (Costar) permanecendo por 24 h a 4C. Após este tempo,

a placa foi lavada de 4 a 6 vezes com PBS contendo 0,02% de tween 20 (InLAB)

(PBS-Tween) para retirar os anticorpos que não foram aderidos e em seguida

foram adicionados 160µl por poço de solução bloqueio (SBF 3% em PBS)

permanecendo por um período de 1 h em temperatura ambiente.

Posteriormente, a placa foi lavada de 4 a 6 vezes com PBS-tween e em seguida

foram adicionados 80µl do sobrenadante das amostras e uma curva padrão com

diluição seriada com citocinas obtidas da R&D Systems. As placas

permaneceram por um período de 24 h a 4C. Novamente a placa foi lavada de 4

a 6 vezes com PBS-tween e adicionado o anticorpo biotinilado específico que

permaneceu por um período de 1 h em temperatura ambiente. Em seguida a

placa foi lavada de 6 a 8 vezes para posterior adição da enzima estreptavidina

conjugada com peroxidase (Invitrogen) diluída 1:1000. Esta permaneceu por um

período de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, a placa foi

lavada de 6 a 8 vezes e então adicionado o substrato TMB (Invitrogen) para

revelar a reação, que foi parada com 20 µl de H2SO4 e lida em leitora de

microplacas a 450 e 620 nm.

4.6 Análise dos marcadores de superfície de células AP284 e BMDCs por citometria de fluxo

As marcações das células foram feitas com 2 x 105 células em 100l de

PBS contendo 2% de SBF, 5 mM de EDTA e 0,02% de azida sódica (tampão de

FACS). A primeira etapa consistiu na incubação das células com um dos

anticorpos específicos por 20 min em temperatura ambiente. Após, as células

foram centrifugadas por 1 min a 1000 x g e ressuspendidas em tampão de FACS

contendo um anticorpo anti-IgG de rato (eBioscience) marcado com

25

fluoresceina. As células foram novamente incubadas por 20 min, lavadas e

ressuspendidas em 100 l de tampão de FACS. Foram coletados 20.000

eventos de cada amostra em um aparelho C6 da Accuri (Accuri, Estados

Unidos) e os dados foram analisados no programa FCS versão 4.0 (De Novo

Software).

Os anticorpos utilizados para análise por citométrica foram anti-CD11b

(Clone M1/70), anti-MHCII (Clone ER-TR3), 33D1 (Clone 33D1), CD4 (Clone

GK1.5) , CD8 (Clone 31M), CD32 (Clone 24G2), anti CD107b ( BD Clone MAC3)

anti-CD209 DC-SIGN (Clone ER-TR9), ANTI-mouse TLR2 (clone T2.5 FITC),

Abcam, Cambridge, UK), ANTI-mouse TLR4/MD2 (clone MTS510 FITC, Abcam,

Cambridge, UK) . Estes anticorpos são produzidos a partir de hibridomas no

nosso laboratório. Os anticorpos anti-CD40, anti-CD80 anti-CD86, anti-CD11c

foram obtidos comercialmente (eBioscience). Os anticorpos controles IgG1 e

IgG2b foram produzidos a partir de hibridomas clones GL113 e GL117.

4.7 Produção de óxido nítrico (NO)

A detecção de nitrito foi realiada através do método de Griess. Em placa

de 96 poços foram adicionados 50 µL do sobrenadante de amostras em

duplicata, seguido pelo reagente de Griess (0,05% N-1-naphthylethylenediamine

dihydrochoride, 0,5% de sufanilamida em 2.5% de ácido fosfórico) no mesmo

volume. A curva padrão foi feita utilizando a solução estoque de nitrito em RPMI

completo iniciado a 100µM. A leitura da placa foi realizada em leitora de ELISA

(MULTISKAN) em filtro 550nm.

4.8 Ensaio colorimétrico MTT (brometo de 3 (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio)

A viabilidade das células AP284 foi analisada pelo ensaio de MTT que é

baseado na clivagem do sal de tetrazólio, MTT (brometo de 3 (4, 5-dimetiltiazol-

2-il) -2,5-difenil) em um produto colorido de formazan através da enzima

mitocondrial succinato desidrogenase (Dutta et al. 2005). As células AP284

26

foram cultivadas por um período de 24 com LPS nas concentrações já indicadas

primadas ou não com IFN-γ em placa de 96 poços. AP284 foram mortas pelo

calor na temperatura de 60°C por 30 min para obter o controle. Após 24 h foi

adicionado 20 µl de MTT a 5mg/ml, permanecendo por um período de 6 h na

estufa a 37°C. Após este período, foram adicionados 100µl de SDS (Sodium

Dodecyl Sulfate) 10% para dissolução de cristais e novamente a placa foi

incubada a 37°C por um período de 12 h. A leitura foi realizada em Leitora de

microplacas utilizando filtro de 550nm.

4.9 Parasitos e antígenos

Formas promastigotas de Leishmania major (Friedlin) foram cultivadas em

meio de Grace (Grace´s Insect Medium, Sigma Chemical Co., NY, EUA)

suplementado com 20% de SBF, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e

100 µg/mL de estreptomicina em placas de 24 poços (TPP) a 26 C em estufa

B.O D. (Eletro Lab, São Paulo/SP). Foram realizadas passagens dos parasitos

para novo meio de cultura a cada dois ou três dias, sempre iniciando a cultura

com 5 x 105 promastigotas/mL. A contagem dos parasitos foi feita em

hemocitômetro após diluição de uma alíquota da suspensão em formaldeído

(Merck) a 0,2% em PBS e contagem. Leishmânias no quinto dia de cultura (fase

estacionária) foram utilizadas para a infecção das células in vitro ou infecção dos

camundongos. Estes parasitos foram lavados 3 vezes em PBS antes do uso.

Alternativamente 1 x 108 leishmânias em fase estacionária foram lavadas duas

vezes com PBS e congeladas e desgeladas para obtenção do extrato bruto dos

parasitos.

4.10 Infecções dos camundongos e cultura dos linfonodos

Células AP284 e BMDC na concentração de 3x106 células/mL foram

cultivadas na presença ou ausência de 3x106 formas promastigotas de L. major

na fase estacionária. Após 24 h de cultura, um total de 5X105 células AP284 ou

BMDCs infectadas com L. major, foram inoculadas em camundongos C57BL/6.

Inóculos com apenas AP284, BMDCs e L. major foram feitos como controle.

27

Após 20 dias, os animais foram eutanasiados para a extração dos linfonodos

poplíteos. Foram cultivadas 1X106 por poço das células dos linfonodos na

presença ou ausência de concanavalina A (ConA-Sigma) ou extrato bruto de L.

major a por 48 h. O sobrenadante das culturas foram utilizados para quantificar

IL-17 e IFN-γ por ELISA.

4.11 Análises estatísticas

Os resultados foram comparados quanto à significância dos mesmos pelo

método de análise paramétrica one-way ANOVA seguido de Bonferroni’s

Multiple Comparison Test. Os dados apresentados em gráficos contendo média

desvio padrão. Valores de p<0,05 serão considerados significativos.

28

5 RESULTADOS

5.1 Avaliação da expressão de marcadores celulares presentes em

macrófagos, DCs e AP284.

DCs expressam marcadores de superfície que podem distingui-las de

outros tipos celulares, como por exemplo, macrófagos. Células AP284, BMDCs e

RAW264, foram incubadas com os anticorpos específicos indicados em

materiais e métodos para comparação da expressão de seus marcadores de

superfícies. As células AP284 expressaram os marcadores característicos de

subpopulações de DCs, 33D1 e CD11c, moléculas co-estimuladoras CD80,

moléculas de MHC classe II (ER-TR3) e ER-TR9 que também é um marcador

de DCs. O mesmo foi verificado em BMDCs, exceto em relação ao marcador

33D1 e ER-TR9 que não foi expressos por estas células. Diferentemente,

macrófagos RAW264 não expressaram CD11c e MHC II. Ressalta-se que as

células AP284, BMDCs e RAW264 compartilham os marcadores comuns de

fagócitos mononucleares como a molécula MAC1 e a molécula co-estimuladora

CD40 (Figura 3).

Figura 3: Expressão de marcadores de superfície em células AP284, BMDC e RAW264.

RAW 264 e AP284 foram cultivadas em meio RPMI completo e BMDCs foram cultivadas em

29

meio RPMI com 10 ng/mL de GM-CSF por 8 dias como descrito em Materiais e Métodos. Os

histogramas representam o isotipo controle (vermelho) e o anticorpo específico (preto). Todas as

amostras foram adquiridas em citômetro Accuri e analisadas pelo software FCS Express.

5.2 Avaliação da expressão de TLR4 por AP284

Após verificar que células AP284 expressam marcadores que estão

presentes em subpopulações de DCs, foi analisado se elas possuem em sua

superfície o receptor TLR4. Sabe-se que este é um importante PRR da

imunidade inata e que pode reconhecer LPS de bactérias Gram-negativas.

A figura 4 demonstra que células AP284 expressam TLR4. Este resultado

sugere que elas podem responder a estímulos com agonistas deste receptor.

Neste caso, LPS poder ser utilizados para ativar e estimular as células.

Figura 4: Expressão do receptor semelhantes à Toll 4 na superfície das células AP284. O

histograma representa o isotipo controle (vermelho) e o anticorpo específico (preto). A amostra

foi adquirida em citômetro Accuri e analisadas pelo software FCS Express.

30

5.3 Aspecto morfológico de células AP284 em cultura após estímulo com LPS

As Células AP284 são células aderentes de crescimento lento e que

apresentam pequenas projeções de membrana lembrando dendritos de células

nervosas (Figura 5A). Como foi visto no experimento anterior que elas podem

responder a estímulos com LPS, às células, foram então cultivadas por um

período de 24 h com este agonista. Após adição de LPS às culturas, pôde ser

verificado um aumento no tamanho de seus prolongamentos de membranas e

uma maior proliferação. (Figura 5B).

(A) (B)

Figura 5: Microscopia invertida de células AP284 antes e após estímulo com LPS. (A)

AP284 sem estímulo, (B) AP284 após estímulo com LPS 0,2 µg/ml por 24 horas.

5.4 Avaliação da produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284

e BMDCs após estímulos com diferentes agonistas deTLRs

Células AP284 e BMDCs foram cultivadas com LPS e E.coli mortas pelo

calor em diferentes concentrações para avaliar a produção de IL-12p40, IL12p70

e IL-23. Observou-se que os dois estímulos utilizados induziram a produção de

IL-12p40 por células AP284, com uma produção média de 8ng/ml (±1,02) com

LPS a 1µg/ml, 40ng/ml (±7,81) com LPS a 0,2µg/ml e 60ng/ml (±1,13) com 1x107

ou 1x108 de E.coli. Todos estes resultados foram significativos quando

comparados ao controle (Figura 6A). Embora células AP284 tenham

31

produzido grandes quantidades de IL-12 p40, não houve uma detecção de IL-

12p70 com nenhum dos estímulos utilizados (Figura 6B). Por outro lado, houve

uma grande produção de IL-23 tanto após o estímulo com LPS ou com E. coli

nas diferentes concentrações, onde LPS a 0,2µg/ml induziu uma produção de

16ng/ml (±6,33), E.coli 1x107 uma produção de 24ng/ml (±4,77) e E.coli 1x108

uma produção de 21ng/ml (±2,92). Estes resultados também foram significativos

quando comparados ao controle (Figura 6C).

Como esperado, BMDCs produziram IL12p40 também com todos os

estímulos e que está dentro do seu padrão clássico de produção. Destacam-se

os estímulos com E.coli 1x108 e 1x107, com uma produção de 4ng/ml (±1,06) e

3ng/ml (±0,96) respectivamente. A produção de IL-12p40 com LPS ficou em

torno de 2ng/ml (Figura 6D).

Diferentemente da linhagem AP284, BMDCs foram capazes de produzir

IL-12p70, com uma produção em torno de 65pg/ml (±31,55) e 68pg/ml (±15,77)

quando estimuladas com E. coli 1x107 ou E.coli 1x108, respectivamente (Figura

6E). A produção de IL12p70 por BMDCs foi significativa quando comparados

aos controles não estimulados. Entretanto, não foi verificada diferença

significativa na produção de IL-23 por BMDCs com nenhum dos estímulos, onde

a produção ficou entre 0,2ng/ml e 0,5ng/ml, exceto com E. coli 1x107 onde não

houve detecção desta citocina (Figura 6F).

32

AP284

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0

2

4

6

8

20

40

60

80

*

* * *

Estímulos

IL-1

2p

40 n

g/m

L

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0

50

100

150

B AP284

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Estímulos

IL-1

2p

70 p

g/m

L

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0

10

20

30

*

*

C

*

AP284

Estímulos

IL-2

3 n

g/m

L

BMCD

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0

2

4

6

820

40

60

80

D

**

Estímulos

IL-1

2p

40 n

g/m

L

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0

50

100

150

E BMDC

ND

ND

ND

ND

**

Estímulos

IL-1

2p

70 p

g/m

L

ct

LPS 1ug

LPs 0,2u

g

E. c

oli 1

0^8

E.col

i 10^

7

0.0

0.5

1.0

1.510

15

20

25

30

F BMDC

ND

ND

Estímulos

IL-2

3 n

g/m

L

Figura 6: Análise da produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDCs

após o estímulo com LPS e Escherichia coli mortas pelo calor. IL-12p40 (A,D) IL-12p70

(B,E) IL-23 (C,F) produzidas pelas células AP284 (A,B,C) ou BMDC (D,E,F). Produção de

citocinas avaliada pela técnica de ELISA. As barras representam a média da produção de

citocinas entre os grupos e ± SD de três experimentos independentes. *Os valores considerados

significativos quando p˂0,05.

5.5 Avaliação da produção IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e

BMDCs após estímulo com IFN-γ

Como células AP284 não produziram IL-12p70 com nenhum dos

estímulos utilizados anteriormente, as células foram então primadas com IFN-γ

por um período de 2 h antes da adição dos demais estímulos, uma vez que esta

citocina favorece a expressão da subunidade p35 e consequentemente a

produção de IL-12p70. AP284 continuou a produzir IL-12p40 quando

estimuladas com LPS, porém, surpreendentemente, houve uma inibição da

produção de IL-12p40 quando as células foram primadas com IFN-γ e

33

estimuladas com LPS ou E. coli (Figura 7A). A produção de IL-12p70 continuou

não sendo detectada quando as células AP284 foram primadas com IFN-γ

(Figura 7B)

Ao contrário do que ocorreu com células AP284, IFN-γ potencializou a

produção de IL-12p40 e IL-12p70 por BMDCs, (Figura 7D e 7E). A produção de

IL-12p70 por BMDCs foi significativamente maior quando BMDCs foram

estimuladas com LPS mais IFN-γ ou E.coli e quando comparado à produção de

IL12-p70 por AP284 (p˂0,001) com os mesmos estímulos (dados não

mostrados).

Como demonstrado anteriormente, LPS e E.coli estimulou a produção de

IL-23 por células AP284, contudo observou-se que também houve uma inibição

desta citocina após primagem das células com IFN-γ, (Figura 7C). A produção de

IL-23 por BMDCs manteve-se em torno de 0,5ng/ml quando estimuladas com

LPS, porém a primagem das células com IFN-γ também inibiu a produção de IL-

23 por BMDCs, onde com a adição deste estímulo IL-23 não foi detectada

(Figura 7F).

Ct

Ct+

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.c

oli +

IFN-

0

5

10

15

40

50

60

70

A AP284

**

Estímulos

IL-1

2p

40 n

g/m

L

Ct

Ct +

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.c

oli +

IFN-

0

50

100

150200

300

400

500

B AP284

ND

ND

ND

ND

ND

Estímulos

IL-1

2p

70 p

g/m

L

Ct

Ct +

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.c

oli +

IFN-

0

10

20

30

40

C

******

AP284

Estímulos

IL-2

3 n

g/m

L

BMDC

Ct

Ct+

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.C

oli+

IFN-

0

5

10

1540

50

60

70

D

*** ***

Estímulos

IL-1

2p

40 n

g/m

L

Ct

Ct +

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.c

oli +

IFN-

0

50

100

150200

300

400

500

E BMDC

**

Estímulos

IL-1

2p

70 p

g/m

L

BMDC

Ct

Ct +

IFN-

LPS

LPS +

IFN-

E.c

oli

E.c

ol i+

IFN-

0.0

0.5

1.0

1.510

20

30

40

F

ND

ND

ND

ND

ND

Estímulos

IL-2

3 n

g/m

L

Figura 7: Produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-23 por células AP284 e BMDC após o

34

estímulo com LPS, Escherichia coli mortas pelo calor e IFN-γ. IL-12p40 (A,D) IL-12p70 (B.E)

IL-23 (C,F) produzidas pelas células AP284 (A,B,C) ou BMDC (D,E,F). Produção de citocinas

avaliada pela técnica de ELISA. As barras representam a média da produção de citocinas entre

os grupos e ± SD de três experimentos independentes. *Os valores considerados significativos

quando p˂0,05.

5.6 Avaliação da viabilidade de células AP284 após estímulo com IFN-γ

Como os dados anteriores mostraram que houve uma inibição de IL-

12p40 e IL-23 após primar as células com IFN-γ, surgiu a hipótese de que as

células poderiam estar morrendo após a adição deste estímulo. Desta forma,

resolveu-se avaliar a viabilidade das células AP284 após adição de IFN-γ

através do teste de MTT.

Após análise foi verificado que as células continuaram viáveis após a

adição dos estímulos, não havendo diferença significativa entre a viabilidade das

células estimuladas com LPS a 1µg, LPS a 0,2µg primadas ou não com INF-γ,

sendo que a viabilidade das células com todos os estímulos foi de 100%. As

células que foram mortas pelo calor não tiveram nenhuma viabilidade (Figura 8).

MTT

0

50

100

150AP CT

AP Morta pelo calor

LPS 1ug

LPS 0,2ug

LPS 1ug +

LPS 0,2ug +

** * **

Estímulos

% V

iab

ilid

ad

e c

elu

lar

Figura 8: Viabilidade de células AP284 após estímulos com LPS 1µg, LPS 0,2µg com ou

sem INF-γ. As células foram cultivadas por um período de 24h e após este prazo adicionado

20µl de MTT às culturas, onde permaneceram por 6h. Após este período, foram adicionados

100µl de SDS 10% para dissolução de cristais e a placa foi incubada por um período de 12 h. A

figura representa a porcentagem de três experimentos independentes.

35

5.7 Avaliação da produção de NO por células AP284 e BMDCs

Como foi verificado que as células AP284 continuaram viáveis após a

primagem com INF-γ, e sabendo que esta citocina induz a produção de NO,

questionou-se se uma alta produção desta substância poderia estar inibindo a

produção de IL-12p40 e IL-23 por AP284.

Foi verificada uma grande produção de NO por AP284 e BMDCs após os

estímulos utilizados. Na figura 9A pode ser verificado que células AP284

produziram 13µM (±1,32) de NO quando estimuladas com LPS a 0,2µg e houve

uma produção em torno de 12µM quando estimuladas com E.coli 1x107 ou E.coli

1x108 (p˂0,05). A primagem com IFN-γ induziu um aumento na produção de NO,

que variou de 13µM (±1,32) para 54µM (±6,05) quando estimuladas com LPS e

IFN-γ e de 12µM para 76µM (±19,96) com E.coli (Figura 9B).

BMDCs produziram maiores quantidades de NO quando estimuladas com

E.coli, produzindo em torno de 30µM. Esta produção foi dose dependente, pois

houve uma maior produção de NO com E.coli a 1x108 quando comparado com

E.coli 1x107 (Figura 9C). BMDCs também produziram maiores quantidades de

NO quando primadas com IFN-γ (Figura 9D). A diferença entre os estímulos

também foram significativos quando comparados à produção de NO com LPS ou

E.coli sem IFN-γ.

Estes dados sugerem que provavelmente o NO não está inibindo a

produção de citocinas por células AP284, pois tanto AP284 como BMDCs

produziram quantidades semelhantes de NO após primagem com IFN-γ e

BMDCs continuaram a produzir as citocinas naturalmente.

36

AP284

ct

LPS 1

ug

LPs

0,2u

g

E. c

oli 10

^8

E.c

oli 10

^7

0

10

20

30

40

* **

A

Estímulos

NO

uM

Ct

ct+

LPS

LPS+

E.c

oli

E.c

oli+

0

20

40

60

80

100*

*

B AP284

Estímulos

NO

uM

BMDC

ct

LPS 1

ug

LPs 0,

2ug

E. coli

10^8

E.coli

10^7

0

10

20

30

40

*

C

Estímulos

BMDC

Ct

ct+

LPS

LPS+

E.c

oli

E.c

oli+

0

20

40

60

80

100

**

D

Estímulos

NO

uM

Figura 9: Avaliação da produção de óxido nítrico por AP284 e BMDC após estímulos com

LPS e E.coli e. Células AP284 e BMDC foram estimulas na presença (B e D) ou ausência de

IFN-γ (A e C). Avaliação realizada pelo método de Griess. Os valores considerados significativos

quando p˂0,05.

5.8 Avaliação da produção de TNF por células AP284 após estímulos com

LPS e IFN-γ

Após verificar que a produção de NO provavelmente não influenciou na

produção de citocinas por AP284, foi então verificado a produção de TNF-α por

esta linhagem, uma vez que estudos anteriores relatam que TNF-α pode inibir a

produção de IL-12 em macrófagos de camundongos estimulados com IFN-γ e

LPS.

37

Células AP284 foram novamente primadas com IFN-γ e posteriormente

estimuladas com LPS por 24 h para posterior analise da produção de TNF-α. Foi

verificado uma produção significativa de TNF-α após os estímulos com LPS a

1µg e a 0,2µg em relação às células não estimuladas, com uma produção de

76ng/ml (± 27,88), e 65ng/ml (±22,81) respectivamente (Figura 10).

Assim como havia sido visto em relação à produção de IL-12p40 e IL-23,

a primagem das células com IFN-γ, também inibiu a produção de TNF-α, onde

com os estímulos de LPS a 1µg ou 0,2µg mais IFN-γ células AP284 passaram a

produzir em torno de 35ng/ml.

Estes dados sugerem que provavelmente a produção de TNF-α não está

influenciando na produção de IL-12 por células AP284, pois também houve uma

inibição desta citocina ao se adicionar IFN-γ às culturas.

AP284

CT

LPS 1

ug

LPS 0

,2ug

LPS 1

ug+IFN

-

LPS 0

,2ug+I

FN-

0

50

100

150

**

*

Estímulos

TN

F

ng

/ml

Figura 10: Produção de TNF-α por células AP284 após estímulos com LPS e IFN-γ. Células

AP284 foram estimuladas na presença ou ausência de IFN-γ. Produção da citocina avaliada pela

38

técnica de ELISA. A média da produção de citocinas entre os grupos e ± SD de três

experimentos independentes. *Os valores considerados significativos quando p˂0,05.

5.9 Capacidade fagocítica de células AP284

Os resultados até o momento demonstraram que células AP284 não são

capazes de produzir IL-12p70 e que provavelmente a IL-12p40 produzida está

relacionada principalmente a IL-23. Sabendo que a IL-23 está ligada ao perfil

Th17, levantou-se a hipótese de que AP284 poderia favorecer este perfil de

resposta in vivo após utilizar leishmânia como modelo de infecção.

Porém, antes de partir para esta etapa, uma questão essencial seria se as

células AP284 eram capazes de fagocitar leishmânias para poder apresentá-las

aos linfócitos T. Sendo assim, formas promastigotas do parasito foram cultivadas

por um período de 24 h juntamente com as células para avaliar a sua

capacidade fagocítica.

A figura 11 demonstra que após o período de cultivo, houve a

internalização dos parasitos pelas células, sendo assim possível avançar para

outros experimentos.

39

Figura 11- Internalização de L. major por células AP284. 5x105 de AP284 foram cultivadas

com 5X106 de L. major em fase promastigota. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS

para remoção dos parasitas não internalizados. As setas indicam formas amastigotas de L.

major fagocitadas.

5.10 Avaliação da produção de IL-12p40 por células AP284 infectadas por

L. major

Outra questão importante para ser verificada antes da realização de

experimentos in vivo, seria se após a infecção das células com L. major

ocorreria à produção de IL-12p40 e IL-23. Assim, células AP284 foram

infectadas por 24 h com um ou cinco parasitos por célula para posterior

avaliação da produção de IL-12p40.

L. major não foi capaz de induzir a produção de IL-12p40 (nem IL-23) in

vitro com nenhuma das infecções, não havendo diferença significativa das

células não infectadas com as células infectadas. (Figura12, dados não

mostrados).

Figura 12:

IL-12p40

CT

AP +

L. m

ajor 5

:1

AP +

L. m

ajor 1

:1

0

2

4

6

8

10

IL-1

2p

40 n

g/m

L

40

Produção de IL-12p40 por células AP284 após infeção com Leishmania major. As células

foram infectadas com o parasito por um período de 24 h e o sobrenadante coletado para analise

da produção da citocina.

5.11 Avaliação da produção de IL-17 e IFN-γ in vivo após inoculação de

células AP284 infectadas com L. major

Embora não tenha sido verificado um aumento na produção de IL-12p40 e

IL-23 in vitro após infecção das células com L. major, foram realizados

experimentos in vivo, já que as interações das moléculas e fatores solúveis

presentes in vivo poderiam favorecer a produção destas citocinas. Após o

cultivo do parasito com AP284 por 24 h, os animais foram inoculados com

células AP284 portando L. major.

As células de camundongos infectados apenas com L. major foram

capazes de produzir IL-17, porém, as células dos animais que não foram

infectados com o parasito não produziram esta citocina. As células dos

camundongos infectados com AP284 e BMDCs portando leishmânias não

alteraram a produção de IL-17 mesmo após o reestimulo das células com conA.

Estes dados sugerem que AP284 não interferiu na produção de IL-17 quando

estimuladas com L. major (Figura 13A).

Não havendo aumento na produção de IL-17 in vivo, foi então verificado a

produção de IFN-γ a partir dos mesmos experimentos. Da mesma forma,

células de camundongos infectados apenas com L. major, foram capazes de

produzir IFN-γ, além disto, as células dos camundongos inoculadas sem a

presença do parasito não interferiu na produção desta citocina. Assim como

para IL-17, a produção de IFN-γ por células dos camundongos infectados com L.

major na presença de células AP284 ou BMDCs não sofreu alteração mesmo

após o reestimulo das células com conA. Estes dados também sugerem que

AP284 não interferiu na produção de IFN-γ quando inoculadas juntamente com

L. major (Figura 13B).

41

IL-17

Contr

ole

L.maj

or

AP28

4

AP28

4 + L

.maj

or

BM

DC

BM

DC +

L.m

ajor

0

2000

4000

6000

8000CT

Ext

ConA

A

IL-1

7 p

g/m

L

IFN-g

Contr

ole

L.maj

or

AP28

4

AP28

4 + L

.maj

or

BM

DC

BM

DC +

L.m

ajor

0

2

4

6

8

B

IFN

g n

g/m

L

Figura 13- Produção de IL-17 e INF-γ in vivo após infecção de camundongos com L. major,

AP284 e BMDC. 3x106 de células AP284 e BMDC foram cultivadas por 24 h individualmente e

juntas com L.major para posterior infecção de camundongos C57Bl/6. Os camundongos foram

eutanasiados após 20 dias de infecção para obtenção das células dos linfonodos. As culturas

das células foram ou não estimuladas com extrato de leishmânias e ConA.

42

6 DISCUSSÃO

Apesar de existirem vários estudos em laboratórios sobre o uso

terapêutico das DCs, muitos aspectos biológicos sobre estas células ainda

precisam ser esclarecidos. Isso devido às dificuldades técnicas encontradas

para obtenção de DCs em quantidades significativas para estudos in vitro a

partir dos métodos convenconais (van Helden et al. 2008).

DCs murinas imortalizadas derivadas de células tumorais já foram

descritas, como a linhagem SRDC (Ruiz et al. 2005). Outras descrições são a

linhagem SVDC e a linhagem DC 2.4 derivada de medula óssea de

camundongos C57BL/6 (Shen et al. 1997) e também a linhagem MUTZ-3

humana (Gibbs et al. 2013; Santegoets et al. 2008). Células AP284 foram

isoladas a partir de um tumor espontâneo murino e no presente estudo foi

demonstrado que elas podem ser uma nova linhagem de DC.

‘ DCs têm sido classificadas em diferentes subpopulações (Guilliams et al.

2010) e uma das questões avaliadas para esta diferenciação é a expressão de

marcadores específicos na superfície dessas células (Chopin et al. 2012), como

por exemplo, as DCs dermais, caracterizadas por expressarem classe MHCII,

CD11b, CD11c e CD301 (Dupasquier et al. 2004; Ziegler-Heitbrock et al. 2010) e

também DCs inflamatórias, que expressam MHC II, CD11b, CD11c, DC-SIGN,

CD107b (MAC-3) e Ly6Clow (Chopin et al. 2012; Ziegler-Heitbrock et al. 2010).

Nossos dados mostraram que a linhagem AP284 possuem uma alta

expressão dos marcadores CD11c, MAC1, MAC3 moléculas MHC classe II (ER-

TR3), e também expressam o marcador 33D1, onde este marcador está

presente em DCs localizadas na polpa vermelha e na zona marginal do baço.

(Dudziak et al. 2007). Assim, provavelmnete as células AP284 são cDCs órgão

específica, pois apresentam marcadores de células dendríticas convencionais

CD11c e MHC classe II e também possuem o marcador 33D1 e não expressam

o marcador CD301 (ER-MP23), sendo este último expresso em DCs dermais

(Dupasquier et al. 2004).

A maturação de DCs após o reconhecimento de antígenos é

caracterizada pela expressão de moléculas co-estimuladoras como CD40 e

CD80 (Merad & Manz 2009; Shortman & Naik 2007) e nossos dados mostraram

43

que células AP284 também expressam estas moléculas, sugerindo que elas já

estão em um estágio mais avançado de maturação e têm um grande potencial

para apresentar antígenos para células T virgens.

Células epiteliais, células fagocíticas e os subconjuntos de DCs

expressam diferentes TLRs em suas superfícies, além de outros PRRs (Iwasaki

& Medzhitov 2004), estes receptores irão permitir que estas células respondam a

grupos específicos de micro-organismos. TLR4 é caracterizado pelo

reconhecimento de LPS presente na superfície de bactérias Gram-negativas

(Kawai & Akira 2010). Em nossos estudos, foi verificado que a linhagem AP284

expressa em sua superfície TLR4 e respondem a LPS de bactérias Gram-

negativas.

Em camundongos, todas as DCs esplênicas expressam TLR4, além dos

TLRs 1, 6, 8 e 9 (Edwards et al. 2003), porém, pDCs de camundongos não

expressam TLR3 e DCs CD8α+ de camundongos não expressam TLRs 5 e 7

(Doxsee et al. 2003; Edwards et al. 2003). Atualmente DCs CD11c+ CD11b+

derivadas de precursores de medula óssea foram identificadas com alta

expressão de TLR4 e capazes de responderem fortemnete a LPS (Boonstra et

al. 2003). Provavelmente Células AP284 podem expressar outros tipos de TLRs

e assim, responder a outros estímulos, porém são necessárias novas análises

para esta confirmação.

Estudos mostram que a expressão de genes e a secreção de citocinas

como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 foram fortemente induzidas em DCs

estimuladas com diferentes agonistas de TLRs, sendo que a utilização de

combinações destes agonistas induzem maiores quantidades destas citocinas

(Gautier et al. 2005). A IL-12 e a IL-23 fazem parte de uma mesma família, pois

possuem subunidades em comum, por exemplo, a cadeia p40 mais a p35

formam a IL-12p70 em sua forma ativa, a subunidade p40 mais a subunidade

p19 formam a IL-23 ativa (Vignali & Kuchroo 2012) e a produção de IL-12p70 e

IL-23 se da principalmente por DCs.

Em nossos estudos, BMDCs produziram quantidades significativas de IL-

12p70 quando estimuladas com LPS e E.coli, sendo que uma das principais

ações da IL-12p70 é a de intensificar a produção de IFN-γ importante na

diferenciação de linfócitos T para Th1, produtores desta citocina (Goriely et al.

2008; Trinchieri et al. 2003). O perfil Th1 é fundamental para a eliminação de

44

patógenos intracelulares, onde IFN-γ é importante para a ativação de

macrófagos, pois atua nestas células aumentando a sua atividade microbicida

(Luckheeram et al. 2012; Oestreich & Weinmann 2012).

Entretanto, nossos dados demonstraram que a linhagem AP284 com os

mesmos estímulos, não produziu IL-12p70, mas sim, grandes quantidades de IL-

12p40 e IL-23. A IL-23 é importante para potencializar o perfil de resposta do

tipo Th17, e este perfil possui uma importante participação na resposta imune

contra fungos e bactérias extra e intracelulares (Espinosa & Rivera 2012; Khader

& Gopal 2010). Assim, nossos dados suportam a ideia de que células AP284

estão relacionas com um perfil de resposta do tipo Th17, sugerindo que a IL-

12p40 produzida por estas células está relacionada com a produção ativa da IL-

23.

IFN-γ participa da ativação transcricional que codifica a subunidade p35 e

consequentemente a produção de IL-12p70 (Liu et al. 2004). Quando as células

AP284 foram estimuladas com IFN-γ novamente não houve a produção de IL-

12p70 e de forma supreendente, foi visto uma inibição da IL-12p40 e da IL-23

quando as células foram previamente primadas IFN-γ e posteriormente

estimuladas com LPS e E.coli.

IFN-γ aumenta a atividade microbicida de fagócitos devido à indução de

NO (Chu 2013) e é descrito que algumas propriedades químicas do NO

liberadas durante uma resposta inflamatória pode causar danos a células

normais (Megson & Webb 2000). Desta forma, surgiu a hipótese de que a

grande produção desta substância poderia ter sido tóxica para as células,

ocasionando a morte das mesmas e consequente diminuição da produção das

citocinas. Contudo, após a análise da viabilidade das células primadas com IFN-

γ não foi confirmada esta hipótese, uma vez que 100% das células continuaram

viáveis após primagem com IFN-γ.

Alguns estudos relatam que a produção de NO pode inibir a síntese de IL-

12 em macrófagos peritoneais de camundongos, onde foi visto in vivo que

células camundongos deficientes da enzima iNOS produzem mais IL-12 que

células de camundongos selvagens após estímulos com LPS e IFN-γ (Huang et

al. 1998). Outros estudos também relatam que NO pode inibir a expressão do

mRNA da IL-12p40 em macrófagos derivados da medula óssea, DCs e por

RAW264, uma outra linhagem de macrófago (Xiong et al. 2004).

45

Entretanto, uma questão relevante é que tanto as células AP284 e

BMDCs produziram quantidades significativas de NO após terem sido primadas

com IFN-γ, porém, BMDCs continuaram a produzir IL-12p70 em grandes

quantidades, e também não foi alterada a produção de IL-12p40 por estas

células após este estímulo. Assim, nossos dados sugerem que o NO

provavelmente não influenciou na produção de IL-12 e IL-23 por BMDCs e

provavelmente também não influenciou na produção de IL-12p40 por AP284,

porém, mais estudos devem ser feitos para confirmação desta hipótese.

Estudos relatam que TNF-α coopera com IFN-γ para ativar fagócitos e

assim, auxilia na destruição de parasitas intracelulares, como no caso de

L.major (Birkland et al. 1992; Green et al. 1990; Liew et al. 1990; Theodos et al.

1991). Outros estudos demostram que TNF-α pode inibir a produção de IL-12

em macrófagos de camundongos estimulados com IFN-γ e LPS (Ma 2001).

Portanto, outra hipótese que sugerimos, é que a produção de TNF-α poderia ter

influenciado na produção de IL-12p40 e IL-23, sendo que estudos também

mostram que estímulos via TLR4 juntamente com outros TLRs podem induzir

grandes quantidades de TNF-α (Beutler et al. 2001).

Em nossos dados foi demostrado uma alta produção de TNF-α por

células AP284 após estímulos com LPS, porém nas culturas em que as células

foram primadas com IFN-γ e estimuladas com LPS também houve uma inibição

da produção de TNF-α, indicando que não é um aumento na produção de TNF-α

que está influenciando na produção de IL-12p40 e IL-23 por células AP284. A

partir destes dados outras análises devem ser feitas a fim de verificar outras

questões que podem estar influenciando na inibição de citocinas por células

AP284.

Estudos mostram que IL-10 pode inibir a produção de citocinas pró-

inflamatórias por monócitos e macrófagos como IL-12, IL-6 e IL-8 (D'Andrea et

al. 1993). Outros estudos relatam que IL-10 pode inibir a produção de IL-12p40 e

expressão do gene p35 em monócitos humanos após estímulos das células com

Staphylococcus aureus ou LPS (Aste-Amezaga et al. 1998). Assim, outra

hipótese seria que células AP284 produzem uma elevada quantidade de IL-10 e

que assim a IL-10 poderia estar inibindo a produção de IL-12 por estas células,

porém mais estudos devem ser realizados para avaliar esta questão.

46

Uma das principais funções das DCs é a capacidade de fagocitar e

apresentar antígenos a linfócitos T, e com isso induzir diferentes perfis de

respostas imunes (Heuze et al. 2013). No atual projeto foi visto que células

AP284 foram capazes de fagocitar L. major após um período de 24 h em co-

cultura com o parasito, porém o estímulo com leishmania não foi capaz de

induzir a produção de IL-12 por células AP284.

Nossos dados até o momento sugeriram que células AP284 podem estar

comprometidas com o perfil de resposta Th17, já que houve uma grande

produção de IL-12p40 por estas células e nenhuma produção de IL-12p70.

Assim, provavelmente a produção de IL-12p40 por células P284 podem estar

relacionada com a produção da IL-23 em sua forma ativa. Sabe-se que a IL-23

não é um fator essencial para a diferenciação do perfil Th17, porém uma

resposta bem estabelecida deste perfil é sustentada apenas na presença desta

citocina, onde após a indução de células Th17, a IL-23 é responsável por

determinar se o perfil se manterá durante uma resposta imune inflamatória

(Veldhoen et al. 2006).

Mesmo que os resultados in vitro tenham sugerido que as células AP284

possam ser indutoras de uma reposta com perfil Th17, nossos estudos in vivo,

não confirmaram a indução deste perfil induzido pelas células AP284. O perfil

Th17 é caracterizado pela produção de IL-17A, IL-17F e IL-22, onde estas

citocinas induzem a produção de numerosas quimiocinas e peptídios

antimicrobianos em células epiteliais que recrutam neutrófilos e estes por sua

vez, são importantes para o controle de infecções extracelulares (Ouyang et al.

2008). Na atual pesquisa, células de animais infectados com L.major induziram

IL-17, porém células de camundongongos infectados com AP284 portando

leishmânias não alteraram a produção desta citocina.

Nossos dados mostraram que houve uma produção significativa de IL-17

por células infectadas e não infectadas, apenas quando elas foram

reestimuladas com ConA, principalmente as células do grupo controle, isso

provavelmente ocorreu devido ConA estimular a proliferção de linfócitos

(Fitzgerald et al. 2001) e isso provavelmente influenciol na produção das

citocinas.

Camundongos C57BL/6 são descritos como resistentes a infecção por

L.major, pois conseguem controlar a replicação dos parasitas e com isso curar

47

as lesões (Sacks & Noben-Trauth 2002). Nossos estudos demonstraram que

houve uma resposta clássica de camundongos C57BL/6 quando infectados com

L.major, pois houve a produção de IFN-γ por células destes camundongos.

Sabe-se que estes camundongos estão associados com uma reposta do tipo

Th1 com produção de IFN-γ frente a esta infecção (Barthelmann et al. 2012),

porém, assim como a produção de IL-17, células AP284 infectadas com L. major

também não aumentaram a produção de IFN-γ.

Os dados da atual pesquisa sugerem que a linhagem AP284 é um novo

tipo de DC e que esta nova linhagem pode ser um tipo de DC17 e assim estar

relacionada com a manutenção do perfil de resposta do tipo Th17. Apesar dos

nossos últimos resultados terem demonstrado que as células AP284 não foram

capazes de induzir esta resposta in vivo, outros estudos devem ser feitos para

confirmação destes dados.

Além do mais, esta linhagem pode ser utilizada como uma ferramenta

importante para melhorar a compreensão sobre os fatores solúveis e as

interações celulares responsáveis pela indução da IL-23 e poderá ser utilizada

para esclarecer as vias moleculares envolvidas na produção desta citocina. Esta

linhagem também poderá ser útil para o teste de novos fármacos potencialmente

inibidores ou estimuladores da IL-23.

48

7 CONCLUSÕES

Células AP284 foram caracterizadas como uma nova linhagem de DC,

pois expressam em suas superfícies marcadores que as classificam como

este tipo de célula, como CD11c, 33D1, moléculas co-estimuladoras

CD80 e moléculas MHC classe II (ER-TR3), onde estes marcadores

também são expressos por BMDCs;

A linhagem AP284 expressa em sua superfície TLR4, um importante

receptor para o reconhecimento de PAMPS da imunidade inata,

principalmente para o reconhecimento de LPS presente na superfície de

bactérias Gram-negativas, portanto células AP284 podem responder a

estímulos através deste receptor;

Após estímulos com LPS e E.coli células AP284 foram capazes de

produzir significativas quantidades de IL-12p40 e IL-23, mas não IL-

12p70;

Após primagem das células com IFN-γ, células AP284 tiveram uma

inibição da produção de IL-12p40 e IL-23 e continuaram a não produzir IL-

12p70;

Células AP284 continuaram viáveis após primagem com IFN-γ e houve

uma elevada produção de NO tanto por células AP284 e BMDCs após

adição deste estímulo, concluindo assim que a produção de NO

provavelmente não interferiu na produção de IL-12 por células AP284;

Células AP284 produziram grandes quantidades de TNF-α após

estímulos com LPS, porém também houve a inibição da citocina após

primagem das células com IFN-γ, desta forma, a produção de TNF-α

também não influenciou na produção de IL-12p40 por células AP284;

49

Os dados demonstrados no presente projeto indicam que a produção de

IL-12p40 por células AP284 provavelmente está relacionada com a IL-23

em sua forma ativa, uma vez que não houve a produção de IL-12p70.

Assim linhagem AP284 pode ser um tipo de DC17, já que a IL-23 é

responsável pela manutenção e estabilização do perfil Th17;

A relação de células AP284 com um perfil Th17 não foi confirmada em

experimentos in vivo, onde não houve uma produção significativa de IL-17

por estas células e outros estudos são necessários para melhor

esclarecer esta reposta;

Acredita-se que esta nova linhagem celular poderá ser muito importante

para uma melhor compreensão dos fatores e interações celulares

responsáveis pela indução da produção de IL-12 e IL-23 e poderá ainda

ser utilizada para testar novos fármacos potencialmente inibidores ou

estimuladores destas citocinas.

50

REFERÊNCIAS

1. Agrawal S, Agrawal A, Doughty B, Gerwitz A, Blenis J, Van Dyke T, Pulendran

B 2003. Cutting edge: different Toll-like receptor agonists instruct dendritic cells

to induce distinct Th responses via differential modulation of extracellular signal-

regulated kinase-mitogen-activated protein kinase and c-Fos. Journal of

immunology, 171, 4984-4989.

2. Akashi-Takamura S, Miyake K 2008. TLR accessory molecules. Current opinion

in immunology, 20, 420-425.

3. Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL 2000. A clonogenic common

myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature, 404, 193-197.

4. Akira S, Uematsu S, Takeuchi O 2006. Pathogen recognition and innate

immunity. Cell, 124, 783-801.

5. Asselin-Paturel C, Boonstra A, Dalod M, Durand I, Yessaad N, Dezutter-

Dambuyant C, Vicari A, O'Garra A, Biron C, Briere F, Trinchieri G 2001. Mouse

type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.

Nature immunology, 2, 1144-1150.

6. Aste-Amezaga M, Ma X, Sartori A, Trinchieri G 1998. Molecular mechanisms of

the induction of IL-12 and its inhibition by IL-10. Journal of immunology, 160,

5936-5944.

7. Barkman C, Martner A, Hessle C, Wold AE 2008. Soluble bacterial constituents

down-regulate secretion of IL-12 in response to intact Gram-positive bacteria.

Microbes and infection / Institut Pasteur, 10, 1484-1493.

8. Barthelmann J, Nietsch J, Blessenohl M, Laskay T, van Zandbergen G,

Westermann J, Kalies K 2012. The protective Th1 response in mice is induced in

the T-cell zone only three weeks after infection with Leishmania major and not

during early T-cell activation. Medical microbiology and immunology, 201, 25-

35.

9. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK 2008. Induction and effector functions

of T(H)17 cells. Nature, 453, 1051-1057.

10. Beutler E, Gelbart T, West C 2001. Synergy between TLR2 and TLR4: a safety

mechanism. Blood cells, molecules & diseases, 27, 728-730.

11. Bohnenkamp HR, Papazisis KT, Burchell JM, Taylor-Papadimitriou J 2007.

Synergism of Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by

51

monocyte-derived dendritic cells is mediated through p38 MAPK and lowers the

threshold of T-helper cell type 1 responses. Cellular immunology, 247, 72-84.

12. Boonstra A, Asselin-Paturel C, Gilliet M, Crain C, Trinchieri G, Liu YJ, O'Garra

A 2003. Flexibility of mouse classical and plasmacytoid-derived dendritic cells in

directing T helper type 1 and 2 cell development: dependency on antigen dose and

differential toll-like receptor ligation. The Journal of experimental medicine, 197,

101-109.

13. Bowie A, O'Neill LA 2000. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor

superfamily: signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial

products. Journal of leukocyte biology, 67, 508-514.

14. Brasel K, De Smedt T, Smith JL, Maliszewski CR 2000. Generation of murine

dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood, 96,

3029-3039.

15. Chabalgoity JA, Baz A, Rial A, Grille S 2007. The relevance of cytokines for

development of protective immunity and rational design of vaccines. Cytokine &

growth factor reviews, 18, 195-207.

16. Chopin M, Allan RS, Belz GT 2012. Transcriptional regulation of dendritic cell

diversity. Frontiers in immunology, 3, 26.

17. Chu WM 2013. Tumor necrosis factor. Cancer letters, 328, 222-225.

18. Croxford AL, Kulig P, Becher B 2014. IL-12-and IL-23 in health and disease.

Cytokine & growth factor reviews.

19. D'Amico A, Wu L 2003. The early progenitors of mouse dendritic cells and

plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic

precursors expressing Flt3. The Journal of experimental medicine, 198, 293-303.

20. D'Andrea A, Aste-Amezaga M, Valiante NM, Ma X, Kubin M, Trinchieri G

1993. Interleukin 10 (IL-10) inhibits human lymphocyte interferon gamma-

production by suppressing natural killer cell stimulatory factor/IL-12 synthesis in

accessory cells. The Journal of experimental medicine, 178, 1041-1048.

21. Dardalhon V, Awasthi A, Kwon H, Galileos G, Gao W, Sobel RA, Mitsdoerffer

M, Strom TB, Elyaman W, Ho IC, Khoury S, Oukka M, Kuchroo VK 2008. IL-4

inhibits TGF-beta-induced Foxp3+ T cells and, together with TGF-beta, generates

IL-9+ IL-10+ Foxp3(-) effector T cells. Nature immunology, 9, 1347-1355.

22.

52

23. Dennehy KM, Willment JA, Williams DL, Brown GD 2009. Reciprocal

regulation of IL-23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR

signaling pathways. European journal of immunology, 39, 1379-1386.

24. Dillon S, Agrawal A, Van Dyke T, Landreth G, McCauley L, Koh A,

Maliszewski C, Akira S, Pulendran B 2004. A Toll-like receptor 2 ligand

stimulates Th2 responses in vivo, via induction of extracellular signal-regulated

kinase mitogen-activated protein kinase and c-Fos in dendritic cells. Journal of

immunology, 172, 4733-4743.

25. Doxsee CL, Riter TR, Reiter MJ, Gibson SJ, Vasilakos JP, Kedl RM 2003. The

immune response modifier and Toll-like receptor 7 agonist S-27609 selectively

induces IL-12 and TNF-alpha production in CD11c+CD11b+CD8- dendritic

cells. Journal of immunology, 171, 1156-1163.

26. Dudziak D, Kamphorst AO, Heidkamp GF, Buchholz VR, Trumpfheller C,

Yamazaki S, Cheong C, Liu K, Lee HW, Park CG, Steinman RM, Nussenzweig

MC 2007. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.

Science, 315, 107-111.

27. Dupasquier M, Stoitzner P, van Oudenaren A, Romani N, Leenen PJ 2004.

Macrophages and dendritic cells constitute a major subpopulation of cells in the

mouse dermis. The Journal of investigative dermatology, 123, 876-879.

28. Dutta A, Bandyopadhyay S, Mandal C, Chatterjee M 2005. Development of a

modified MTT assay for screening antimonial resistant field isolates of Indian

visceral leishmaniasis. Parasitology international, 54, 119-122.

29. Edelson BT, Kc W, Juang R, Kohyama M, Benoit LA, Klekotka PA, Moon C,

Albring JC, Ise W, Michael DG, Bhattacharya D, Stappenbeck TS, Holtzman MJ,

Sung SS, Murphy TL, Hildner K, Murphy KM 2010. Peripheral CD103+

dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+

conventional dendritic cells. The Journal of experimental medicine, 207, 823-836.

30. Edwards AD, Diebold SS, Slack EM, Tomizawa H, Hemmi H, Kaisho T, Akira S,

Reis e Sousa C 2003. Toll-like receptor expression in murine DC subsets: lack of

TLR7 expression by CD8 alpha+ DC correlates with unresponsiveness to

imidazoquinolines. European journal of immunology, 33, 827-833.

31. Espinosa V, Rivera A 2012. Cytokines and the regulation of fungus-specific CD4

T cell differentiation. Cytokine, 58, 100-106.

32. Evans CM, Jenner RG 2013. Transcription factor interplay in T helper cell

differentiation. Briefings in functional genomics, 12, 499-511.

53

33. Eyerich S, Eyerich K, Pennino D, Carbone T, Nasorri F, Pallotta S, Cianfarani F,

Odorisio T, Traidl-Hoffmann C, Behrendt H, Durham SR, Schmidt-Weber CB,

Cavani A 2009. Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in

epidermal immunity and remodeling. The Journal of clinical investigation, 119,

3573-3585.

34. Fallarino F, Grohmann U, Hwang KW, Orabona C, Vacca C, Bianchi R,

Belladonna ML, Fioretti MC, Alegre ML, Puccetti P 2003. Modulation of

tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nature immunology, 4, 1206-1212.

35. Fitzgerald AJ, Jordinson M, Rhodes JM, Singh R, Calam J, Goodlad RA 2001.

Comparison of the effects of concanavalin-A and epidermal growth factor on

epithelial cell proliferation in the rat intestine. Alimentary pharmacology &

therapeutics, 15, 1077-1084.

36. Fogg DK, Sibon C, Miled C, Jung S, Aucouturier P, Littman DR, Cumano A,

Geissmann F 2006. A clonogenic bone marrow progenitor specific for

macrophages and dendritic cells. Science, 311, 83-87.

37. Fuertes Marraco SA, Grosjean F, Duval A, Rosa M, Lavanchy C, Ashok D,

Haller S, Otten LA, Steiner QG, Descombes P, Luber CA, Meissner F, Mann M,

Szeles L, Reith W, Acha-Orbea H 2012. Novel murine dendritic cell lines: a

powerful auxiliary tool for dendritic cell research. Frontiers in immunology, 3,

331.

38. Gao Y, Zhang M, Chen L, Hou M, Ji M, Wu G 2012. Deficiency in TLR2 but not

in TLR4 impairs dendritic cells derived IL-10 responses to schistosome antigens.

Cellular immunology, 272, 242-250.

39. Gause WC, Wynn TA, Allen JE 2013. Type 2 immunity and wound healing:

evolutionary refinement of adaptive immunity by helminths. Nature reviews.

Immunology, 13, 607-614.

40. Gautier G, Humbert M, Deauvieau F, Scuiller M, Hiscott J, Bates EE, Trinchieri

G, Caux C, Garrone P 2005. A type I interferon autocrine-paracrine loop is

involved in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic

cells. The Journal of experimental medicine, 201, 1435-1446.

41. Geissmann F, Manz MG, Jung S, Sieweke MH, Merad M, Ley K 2010.

Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science, 327, 656-

661.

42. Gerosa F, Baldani-Guerra B, Lyakh LA, Batoni G, Esin S, Winkler-Pickett RT,

Consolaro MR, De Marchi M, Giachino D, Robbiano A, Astegiano M, Sambataro

A, Kastelein RA, Carra G, Trinchieri G 2008. Differential regulation of

54

interleukin 12 and interleukin 23 production in human dendritic cells. The Journal

of experimental medicine, 205, 1447-1461.

43. Gibbs S, Spiekstra S, Corsini E, McLeod J, Reinders J 2013. Dendritic cell

migration assay: a potential prediction model for identification of contact

allergens. Toxicology in vitro : an international journal published in association

with BIBRA, 27, 1170-1179.

44. Ginhoux F, Tacke F, Angeli V, Bogunovic M, Loubeau M, Dai XM, Stanley ER,

Randolph GJ, Merad M 2006. Langerhans cells arise from monocytes in vivo.

Nature immunology, 7, 265-273.

45. Goriely S, Neurath MF, Goldman M 2008. How microorganisms tip the balance

between interleukin-12 family members. Nature reviews. Immunology, 8, 81-86.

46. Goswami R, Kaplan MH 2011. A brief history of IL-9. Journal of immunology,

186, 3283-3288.

47. Gratz IK, Campbell DJ 2014. Organ-specific and memory treg cells: specificity,

development, function, and maintenance. Frontiers in immunology, 5, 333.

48. Greter M, Helft J, Chow A, Hashimoto D, Mortha A, Agudo-Cantero J,

Bogunovic M, Gautier EL, Miller J, Leboeuf M, Lu G, Aloman C, Brown BD,

Pollard JW, Xiong H, Randolph GJ, Chipuk JE, Frenette PS, Merad M 2012. GM-

CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for

the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity, 36, 1031-1046.

49. Guilliams M, Ginhoux F, Jakubzick C, Naik SH, Onai N, Schraml BU, Segura E,

Tussiwand R, Yona S 2014. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a

unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology, 14, 571-

578.

50. Guilliams M, Henri S, Tamoutounour S, Ardouin L, Schwartz-Cornil I, Dalod M,

Malissen B 2010. From skin dendritic cells to a simplified classification of human

and mouse dendritic cell subsets. European journal of immunology, 40, 2089-

2094.

51. Hemmi H, Kaisho T, Takeda K, Akira S 2003. The roles of Toll-like receptor 9,

MyD88, and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit in the effects of two

distinct CpG DNAs on dendritic cell subsets. Journal of immunology, 170, 3059-

3064.

52. Heuze ML, Vargas P, Chabaud M, Le Berre M, Liu YJ, Collin O, Solanes P,

Voituriez R, Piel M, Lennon-Dumenil AM 2013. Migration of dendritic cells:

55

physical principles, molecular mechanisms, and functional implications.

Immunological reviews, 256, 240-254.

53. Holley MM, Zhang Y, Lehrmann E, Wood WH, Becker KG, Kielian T 2012.

Toll-like receptor 2 (TLR2)-TLR9 crosstalk dictates IL-12 family cytokine

production in microglia. Glia, 60, 29-42.

54. Huang FP, Niedbala W, Wei XQ, Xu D, Feng GJ, Robinson JH, Lam C, Liew FY

1998. Nitric oxide regulates Th1 cell development through the inhibition of IL-12

synthesis by macrophages. European journal of immunology, 28, 4062-4070.

55. Inaba K, Swiggard WJ, Steinman RM, Romani N, Schuler G, Brinster C 2009.

Isolation of dendritic cells. Current protocols in immunology / edited by John E.

Coligan ... [et al.], Chapter 3, Unit 3 7.

56. Ito T, Amakawa R, Kaisho T, Hemmi H, Tajima K, Uehira K, Ozaki Y,

Tomizawa H, Akira S, Fukuhara S 2002. Interferon-alpha and interleukin-12 are

induced differentially by Toll-like receptor 7 ligands in human blood dendritic

cell subsets. The Journal of experimental medicine, 195, 1507-1512.

57. Iwasaki A, Medzhitov R 2004. Toll-like receptor control of the adaptive immune

responses. Nature immunology, 5, 987-995.

58. Jin B, Sun T, Yu XH, Yang YX, Yeo AE 2012. The effects of TLR activation on

T-cell development and differentiation. Clinical & developmental immunology,

2012, 836485.

59. Jin MS, Kim SE, Heo JY, Lee ME, Kim HM, Paik SG, Lee H, Lee JO 2007.

Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-

acylated lipopeptide. Cell, 130, 1071-1082.

60. Kaji R, Kiyoshima-Shibata J, Nagaoka M, Nanno M, Shida K 2010. Bacterial

teichoic acids reverse predominant IL-12 production induced by certain

lactobacillus strains into predominant IL-10 production via TLR2-dependent ERK

activation in macrophages. Journal of immunology, 184, 3505-3513.

61. Kang JY, Nan X, Jin MS, Youn SJ, Ryu YH, Mah S, Han SH, Lee H, Paik SG,

Lee JO 2009. Recognition of lipopeptide patterns by Toll-like receptor 2-Toll-like

receptor 6 heterodimer. Immunity, 31, 873-884.

62. Karp CL, Wysocka M, Ma X, Marovich M, Factor RE, Nutman T, Armant M,

Wahl L, Cuomo P, Trinchieri G 1998. Potent suppression of IL-12 production

from monocytes and dendritic cells during endotoxin tolerance. European journal

of immunology, 28, 3128-3136.

56

63. Kawai T, Akira S 2006. Innate immune recognition of viral infection. Nature

immunology, 7, 131-137.

64. —— 2008. Toll-like receptor and RIG-I-like receptor signaling. Annals of the

New York Academy of Sciences, 1143, 1-20.

65. —— 2010. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update

on Toll-like receptors. Nature immunology, 11, 373-384.

66. Kennedy MK, Picha KS, Fanslow WC, Grabstein KH, Alderson MR, Clifford

KN, Chin WA, Mohler KM 1996. CD40/CD40 ligand interactions are required

for T cell-dependent production of interleukin-12 by mouse macrophages.

European journal of immunology, 26, 370-378.

67. Khader SA, Gopal R 2010. IL-17 in protective immunity to intracellular

pathogens. Virulence, 1, 423-427.

68. Kielian T, Esen N, Bearden ED 2005. Toll-like receptor 2 (TLR2) is pivotal for

recognition of S. aureus peptidoglycan but not intact bacteria by microglia. Glia,

49, 567-576.

69. Kissenpfennig A, Henri S, Dubois B, Laplace-Builhe C, Perrin P, Romani N,

Tripp CH, Douillard P, Leserman L, Kaiserlian D, Saeland S, Davoust J, Malissen

B 2005. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic

cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells.

Immunity, 22, 643-654.

70. Klasen IS, de Jong JP, Voerman JS, Ladestein RM, Leenen PJ, Benner R 1988.

Murine macrophage cell line AP284 presents antigen to cloned MT4+, Lyt-2- T

cells in vitro and in vivo. Immunobiology, 178, 261-274.

71. Kolls JK, Linden A 2004. Interleukin-17 family members and inflammation.

Immunity, 21, 467-476.

72. Krug A, Towarowski A, Britsch S, Rothenfusser S, Hornung V, Bals R, Giese T,

Engelmann H, Endres S, Krieg AM, Hartmann G 2001. Toll-like receptor

expression reveals CpG DNA as a unique microbial stimulus for plasmacytoid

dendritic cells which synergizes with CD40 ligand to induce high amounts of IL-

12. European journal of immunology, 31, 3026-3037.

73. Kurebayashi Y, Nagai S, Ikejiri A, Koyasu S 2013. Recent advances in

understanding the molecular mechanisms of the development and function of

Th17 cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms, 18, 247-

265.

57

74. Leber JH, Crimmins GT, Raghavan S, Meyer-Morse NP, Cox JS, Portnoy DA

2008. Distinct TLR- and NLR-mediated transcriptional responses to an

intracellular pathogen. PLoS pathogens, 4, e6.

75. Lee DU, Rao A 2004. Molecular analysis of a locus control region in the T helper

2 cytokine gene cluster: a target for STAT6 but not GATA3. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 16010-

16015.

76. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA 1996. The

dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent

antifungal response in Drosophila adults. Cell, 86, 973-983.

77. Liu CH, Fan YT, Dias A, Esper L, Corn RA, Bafica A, Machado FS, Aliberti J

2006. Cutting edge: dendritic cells are essential for in vivo IL-12 production and

development of resistance against Toxoplasma gondii infection in mice. Journal

of immunology, 177, 31-35.

78. Liu J, Guan X, Tamura T, Ozato K, Ma X 2004. Synergistic activation of

interleukin-12 p35 gene transcription by interferon regulatory factor-1 and

interferon consensus sequence-binding protein. The Journal of biological

chemistry, 279, 55609-55617.

79. Loser K, Beissert S 2007. Dendritic cells and T cells in the regulation of

cutaneous immunity. Advances in dermatology, 23, 307-333.

80. Luckheeram RV, Zhou R, Verma AD, Xia B 2012. CD4(+)T cells: differentiation

and functions. Clinical & developmental immunology, 2012, 925135.

81. Ma X 2001. TNF-alpha and IL-12: a balancing act in macrophage functioning.

Microbes and infection / Institut Pasteur, 3, 121-129.

82. Manirarora JN, Parnell SA, Hu YH, Kosiewicz MM, Alard P 2011. NOD

dendritic cells stimulated with Lactobacilli preferentially produce IL-10 versus

IL-12 and decrease diabetes incidence. Clinical & developmental immunology,

2011, 630187.

83. Megson IL, Webb DJ 2000. Nitrate resistance in platelets from patients with

stable angina pectoris. Circulation, 102, E87.

84. Merad M, Manz MG 2009. Dendritic cell homeostasis. Blood, 113, 3418-3427.

85. Morel PA, Turner MS 2010. Designing the optimal vaccine: the importance of

cytokines and dendritic cells. The open vaccine journal, 3, 7-17.

58

86. Mortellaro A, Urbano M, Citterio S, Foti M, Granucci F, Ricciardi-Castagnoli P

2009. Generation of murine growth factor-dependent long-term dendritic cell

lines to investigate host-parasite interactions. Methods in molecular biology, 531,

17-27.

87. Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, Sallusto F, Lanzavecchia A 2005. Selected

Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-

polarizing program in dendritic cells. Nature immunology, 6, 769-776.

88. Neumann E, Oliveira MA, Cabral CM, Moura LN, Nicoli JR, Vieira EC, Cara

DC, Podoprigora GI, Vieira LQ 1998. Monoassociation with Lactobacillus

acidophilus UFV-H2b20 stimulates the immune defense mechanisms of germfree

mice. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira

de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica ... [et al.],

31, 1565-1573.

89. Oestreich KJ, Weinmann AS 2012. T-bet employs diverse regulatory mechanisms

to repress transcription. Trends in immunology, 33, 78-83.

90. Ohl L, Mohaupt M, Czeloth N, Hintzen G, Kiafard Z, Zwirner J, Blankenstein T,

Henning G, Forster R 2004. CCR7 governs skin dendritic cell migration under

inflammatory and steady-state conditions. Immunity, 21, 279-288.

91. Oliveira MA, Lima GM, Shio MT, Leenen PJ, Abrahamsohn IA 2003. Immature

macrophages derived from mouse bone marrow produce large amounts of IL-

12p40 after LPS stimulation. Journal of leukocyte biology, 74, 857-867.

92. Oppmann B, Lesley R, Blom B, Timans JC, Xu Y, Hunte B, Vega F, Yu N, Wang

J, Singh K, Zonin F, Vaisberg E, Churakova T, Liu M, Gorman D, Wagner J,

Zurawski S, Liu Y, Abrams JS, Moore KW, Rennick D, de Waal-Malefyt R,

Hannum C, Bazan JF, Kastelein RA 2000. Novel p19 protein engages IL-12p40

to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct

from IL-12. Immunity, 13, 715-725.

93. Ouyang W, Kolls JK, Zheng Y 2008. The biological functions of T helper 17 cell

effector cytokines in inflammation. Immunity, 28, 454-467.

94. Palucka K, Banchereau J 2012. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature

reviews. Cancer, 12, 265-277.

95. Pifer R, Benson A, Sturge CR, Yarovinsky F 2011. UNC93B1 is essential for

TLR11 activation and IL-12-dependent host resistance to Toxoplasma gondii. The

Journal of biological chemistry, 286, 3307-3314.

59

96. Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R 2004.

Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for

intestinal homeostasis. Cell, 118, 229-241.

97. Randolph GJ, Inaba K, Robbiani DF, Steinman RM, Muller WA 1999.

Differentiation of phagocytic monocytes into lymph node dendritic cells in vivo.

Immunity, 11, 753-761.

98. Ratajewski M, Walczak-Drzewiecka A, Salkowska A, Dastych J 2012. Upstream

stimulating factors regulate the expression of RORgammaT in human

lymphocytes. Journal of immunology, 189, 3034-3042.

99. Rausch E, Kaiserling E, Goos M 1977. Langerhans cells and interdigitating

reticulum cells in the thymus-dependent region in human dermatopathic

lymphadenitis. Virchows Archiv. B: Cell pathology, 25, 327-343.

100. Re F, Strominger JL 2001. Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially

activate human dendritic cells. The Journal of biological chemistry, 276, 37692-

37699.

101. Reis e Sousa C 2004. Toll-like receptors and dendritic cells: for whom the bug

tolls. Seminars in immunology, 16, 27-34.

102. Roses RE, Xu S, Xu M, Koldovsky U, Koski G, Czerniecki BJ 2008. Differential

production of IL-23 and IL-12 by myeloid-derived dendritic cells in response to

TLR agonists. Journal of immunology, 181, 5120-5127.

103. Ruiz S, Beauvillain C, Mevelec MN, Roingeard P, Breton P, Bout D, Dimier-

Poisson I 2005. A novel CD4-CD8alpha+CD205+CD11b- murine spleen

dendritic cell line: establishment, characterization and functional analysis in a

model of vaccination to toxoplasmosis. Cellular microbiology, 7, 1659-1671.

104. Sacks D, Noben-Trauth N 2002. The immunology of susceptibility and resistance

to Leishmania major in mice. Nature reviews. Immunology, 2, 845-858.

105. Santegoets SJ, Bontkes HJ, Stam AG, Bhoelan F, Ruizendaal JJ, van den

Eertwegh AJ, Hooijberg E, Scheper RJ, de Gruijl TD 2008. Inducing antitumor T

cell immunity: comparative functional analysis of interstitial versus Langerhans

dendritic cells in a human cell line model. Journal of immunology, 180, 4540-

4549.

106. Satpathy AT, Wu X, Albring JC, Murphy KM 2012. Re(de)fining the dendritic

cell lineage. Nature immunology, 13, 1145-1154.

60

107. Serbina NV, Jia T, Hohl TM, Pamer EG 2008. Monocyte-mediated defense

against microbial pathogens. Annual review of immunology, 26, 421-452.

108. Shen Z, Reznikoff G, Dranoff G, Rock KL 1997. Cloned dendritic cells can

present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal

of immunology, 158, 2723-2730.

109. Shi Z, Cai Z, Sanchez A, Zhang T, Wen S, Wang J, Yang J, Fu S, Zhang D 2011.

A novel Toll-like receptor that recognizes vesicular stomatitis virus. The Journal

of biological chemistry, 286, 4517-4524.

110. Shida K, Kiyoshima-Shibata J, Kaji R, Nagaoka M, Nanno M 2009.

Peptidoglycan from lactobacilli inhibits interleukin-12 production by

macrophages induced by Lactobacillus casei through Toll-like receptor 2-

dependent and independent mechanisms. Immunology, 128, e858-869.

111. Shortman K, Liu YJ 2002. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature

reviews. Immunology, 2, 151-161.

112. Shortman K, Naik SH 2007. Steady-state and inflammatory dendritic-cell

development. Nature reviews. Immunology, 7, 19-30.

113. Siegemund S, Schutze N, Freudenberg MA, Lutz MB, Straubinger RK, Alber G

2007. Production of IL-12, IL-23 and IL-27p28 by bone marrow-derived

conventional dendritic cells rather than macrophages after LPS/TLR4-dependent

induction by Salmonella Enteritidis. Immunobiology, 212, 739-750.

114. Sisirak V, Ganguly D, Lewis KL, Couillault C, Tanaka L, Bolland S, D'Agati V,

Elkon KB, Reizis B 2014. Genetic evidence for the role of plasmacytoid dendritic

cells in systemic lupus erythematosus. The Journal of experimental medicine.

115. Sommer F, Backhed F 2013. The gut microbiota--masters of host development

and physiology. Nature reviews. Microbiology, 11, 227-238.

116. Steinman RM 2008. Dendritic cells in vivo: a key target for a new vaccine

science. Immunity, 29, 319-324.

117. —— 2012. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annual

review of immunology, 30, 1-22.

118. Steinman RM, Cohn ZA 1973. Identification of a novel cell type in peripheral

lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. The

Journal of experimental medicine, 137, 1142-1162.

119. Steinman RM, Kaplan G, Witmer MD, Cohn ZA 1979. Identification of a novel

cell type in peripheral lymphoid organs of mice. V. Purification of spleen

61

dendritic cells, new surface markers, and maintenance in vitro. The Journal of

experimental medicine, 149, 1-16.

120. Steinman RM, Witmer MD 1978. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators

of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 75, 5132-5136.

121. Szabo SJ, Kim ST, Costa GL, Zhang X, Fathman CG, Glimcher LH 2000. A

novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell, 100, 655-

669.

122. Tabeta K, Georgel P, Janssen E, Du X, Hoebe K, Crozat K, Mudd S, Shamel L,

Sovath S, Goode J, Alexopoulou L, Flavell RA, Beutler B 2004. Toll-like

receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against

mouse cytomegalovirus infection. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 101, 3516-3521.

123. Tang C, Chen S, Qian H, Huang W 2012. Interleukin-23: as a drug target for

autoimmune inflammatory diseases. Immunology, 135, 112-124.

124. Theiner G, Rossner S, Dalpke A, Bode K, Berger T, Gessner A, Lutz MB 2008.

TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells.

Molecular immunology, 45, 244-252.

125. Trinchieri G 2012. Cancer and inflammation: an old intuition with rapidly

evolving new concepts. Annual review of immunology, 30, 677-706.

126. Trinchieri G, Pflanz S, Kastelein RA 2003. The IL-12 family of heterodimeric

cytokines: new players in the regulation of T cell responses. Immunity, 19, 641-

644.

127. Uematsu S, Jang MH, Chevrier N, Guo Z, Kumagai Y, Yamamoto M, Kato H,

Sougawa N, Matsui H, Kuwata H, Hemmi H, Coban C, Kawai T, Ishii KJ,

Takeuchi O, Miyasaka M, Takeda K, Akira S 2006. Detection of pathogenic

intestinal bacteria by Toll-like receptor 5 on intestinal CD11c+ lamina propria

cells. Nature immunology, 7, 868-874.

128. van Helden SF, van Leeuwen FN, Figdor CG 2008. Human and murine model

cell lines for dendritic cell biology evaluated. Immunology letters, 117, 191-197.

129. Vanhoutte F, Paget C, Breuilh L, Fontaine J, Vendeville C, Goriely S, Ryffel B,

Faveeuw C, Trottein F 2008. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR3 synergy and

cross-inhibition in murine myeloid dendritic cells. Immunology letters, 116, 86-

94.

62

130. Vargas-Inchaustegui DA, Tai W, Xin L, Hogg AE, Corry DB, Soong L 2009.

Distinct roles for MyD88 and Toll-like receptor 2 during Leishmania braziliensis

infection in mice. Infection and immunity, 77, 2948-2956.

131. Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ, Locksley RM, Stockinger B 2006. TGFbeta

in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation

of IL-17-producing T cells. Immunity, 24, 179-189.

132. Veldhoen M, Uyttenhove C, van Snick J, Helmby H, Westendorf A, Buer J,

Martin B, Wilhelm C, Stockinger B 2008. Transforming growth factor-beta

'reprograms' the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-

producing subset. Nature immunology, 9, 1341-1346.

133. Vignali DA, Kuchroo VK 2012. IL-12 family cytokines: immunological

playmakers. Nature immunology, 13, 722-728.

134. Weiss G, Rasmussen S, Zeuthen LH, Nielsen BN, Jarmer H, Jespersen L,

Frokiaer H 2010. Lactobacillus acidophilus induces virus immune defence genes

in murine dendritic cells by a Toll-like receptor-2-dependent mechanism.

Immunology, 131, 268-281.

135. Wilson NS, Villadangos JA 2004. Lymphoid organ dendritic cells: beyond the

Langerhans cells paradigm. Immunology and cell biology, 82, 91-98.

136. Winzler C, Rovere P, Rescigno M, Granucci F, Penna G, Adorini L,

Zimmermann VS, Davoust J, Ricciardi-Castagnoli P 1997. Maturation stages of

mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. The Journal

of experimental medicine, 185, 317-328.

137. Xiong H, Zhu C, Li F, Hegazi R, He K, Babyatsky M, Bauer AJ, Plevy SE 2004.

Inhibition of interleukin-12 p40 transcription and NF-kappaB activation by nitric

oxide in murine macrophages and dendritic cells. The Journal of biological

chemistry, 279, 10776-10783.

138. Yamane H, Paul WE 2013. Early signaling events that underlie fate decisions of

naive CD4(+) T cells toward distinct T-helper cell subsets. Immunological

reviews, 252, 12-23.

139. Yarovinsky F, Zhang D, Andersen JF, Bannenberg GL, Serhan CN, Hayden MS,

Hieny S, Sutterwala FS, Flavell RA, Ghosh S, Sher A 2005. TLR11 activation of

dendritic cells by a protozoan profilin-like protein. Science, 308, 1626-1629.

140. Zhang SY, Jouanguy E, Ugolini S, Smahi A, Elain G, Romero P, Segal D,

Sancho-Shimizu V, Lorenzo L, Puel A, Picard C, Chapgier A, Plancoulaine S,

Titeux M, Cognet C, von Bernuth H, Ku CL, Casrouge A, Zhang XX, Barreiro L,

63

Leonard J, Hamilton C, Lebon P, Heron B, Vallee L, Quintana-Murci L,

Hovnanian A, Rozenberg F, Vivier E, Geissmann F, Tardieu M, Abel L,

Casanova JL 2007. TLR3 deficiency in patients with herpes simplex encephalitis.

Science, 317, 1522-1527.

141. Ziegler-Heitbrock L, Ancuta P, Crowe S, Dalod M, Grau V, Hart DN, Leenen PJ,

Liu YJ, MacPherson G, Randolph GJ, Scherberich J, Schmitz J, Shortman K,

Sozzani S, Strobl H, Zembala M, Austyn JM, Lutz MB 2010. Nomenclature of

monocytes and dendritic cells in blood. Blood, 116, e74-80.

142. Zuniga LA, Jain R, Haines C, Cua DJ 2013. Th17 cell development: from the

cradle to the grave. Immunological reviews, 252, 78-88.

64

ANEXOS

Anexo 1 – Parecer do Comitê de Ética

65