universidade federal de goiÁs programa de pÓs … · 2018-05-10 · listeria monocytogenes em...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
ERNANDES DA SILVA FILHO
Desenvolvimento de teste rápido para detecção de
Listeria monocytogenes em alimentos
Goiânia
2018
2
i
ERNANDES DA SILVA FILHO
Desenvolvimento de teste rápido para detecção de
Listeria monocytogenes em alimentos
Or
Orientador: Prof.ªDr.ªSamira Bührer
Co-orientador: Prof.Dr. André Kipnis
Goiânia
2018
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para qualificação e futura obtenção do Título de Mestre em Medicina
Tropical e Saúde Pública.
Área de concentração: Imunologia.
ii
iii
iv
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E
SAÚDE PÚBLICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno: Ernandes da Silva Filho
Orientador: Samira Bührer
Membros:
1. Profa. Dra. Samira Bührer
2. Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza
3. Prof. Dr. Rodrigo Scaliante de Moura
Data: 27/02/2018
v
AOS MEUS PAIS, ERNANDES DA SILVA E ANA MARIA DA SILVA, POR
SEMPRE TEREM ME INSPIRADO E APOIADO EM MINHA VIDA
ACADÊMICA. POR TODOS OS ESFORÇOS QUE FIZERAM PARA QUE EU
ME DEDICASSE AOS ESTUDOS E REFORÇOS NECESSÁRIOS PARA MEU
SUCESSO PESSOAL E PROFISSIONAL.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus primeiramente, que em sua magnificente grandeza me concedeu
tudo o que foi necessário para conseguir toda a sabedoria que adquiri em todos esses
anos. Devemos sempre pedir a Deus toda sabedoria do mundo para lidar com todas
as situações.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Samira Bührer, por ter confiado em mim e me
capacitado aos estudos e experimentos durante o período de pesquisa, transmitindo-
me sua inenarrável consistência no que se propõe a realizar. Agradeço ainda por me
conceder oportunidades jamais experimentadas por mim, e por me levar ainda mais
profundamente ao mundo acadêmico, de forma honesta, objetiva e com
perseverança.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. André Kipnis, pela parceria nos experimentos, por
ceder totalmente seu laboratório (Bacteriologia Molecular) para a realização do
estudo, pela hospitalidade, pela sabedoria e atenção em todos os momentos
necessários.
À Prof.ª Dr.ª Mariane Martins de Araújo Stefani, chefe do Laboratório de Imunologia
da AIDS e da Hanseníase (LIAH), pela gentileza de nos permitir trabalhar em
parceria, pela sabedoria e ajuda com as atividades acadêmicas e por contribuir no
meu crescimento profissional.
Aos professores que compuseram minha banca de qualificação: Prof.ª Dr.ª Maria
Cláudia Dantas Porfirio Borges, Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Sousa, Prof.ª
Dr.ª Ludimila Paula Vaz, que contribuíram significativamente para a melhoria deste
trabalho. E especialmente ao Dr. Rodrigo Scaliante Moura que sempre está presente
tirando nossas dúvidas referentes ao nosso precioso ouro coloidal.
A todos meus colegas de laboratório, Dienny Rodrigues, João Pedro Torres
Guimarães, Tatiana Galvez Sanchés, Adriana Crespo, Mônica da Guarda Reis, Aline
do Carmo Gonçalves, Aline Araújo, Déborah Goerck, Rayanny de Andrade, Fábio,
vii
Muriel, Petain, Monalisa, e Danilo, pelos bons momentos dentro e fora do
laboratório.
Ao Centro de Pesquisa em Alimentos da Universidade Federal de Goiás, pelas
amostras cedidas gentilmente, análises realizadas, pela hospitalidade e parceria
estabelecidas.
Ao Laboratório de Imunologia Aplicada do Núcleo de Biotecnologia da
Universidade Federal de Pelotas, principalmente ao Dr. Fabrício Conceição e Dr.
Marcelo Mendonça pela parceria e pelas cepas e anticorpos cedidos gentilmente para
a realização do estudo.
Ao Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública – IPTSP, por me incentivar
principalmente no meio acadêmico e de pesquisa, despertando minha paixão pela
ciência e pela docência.
A todos os servidores técnico-administrativos, em especial, Zezinho, Kariny, Elaine,
Valéria, Alex e Sr. Fernando, pela disponibilidade, competência e gentileza em
resolver nossos problemas.
À minha família, mas principalmente a meus pais, por serem meu porto seguro, meus
guias, meus companheiros em todas as circunstâncias, inclusive nos momentos mais
difíceis, me mostrando o caminho a ser seguido e a nunca desistir, me transmitindo
virtudes extremamente necessárias para construção do meu eu, me apoiando de
forma inigualável em meus projetos, o que me faz ter força espiritual, psicológica e
física. Sempre confiarei e agradecerei pelo incentivo.
Ao Maurício Moreira da Cruz pela ajuda psicológica, emocional e também com o
português. Uma das grandes conquistas do ano de 2016 foi tê-lo conhecido na
faculdade.
À Dienny por sempre me ajudar na produção do nosso bendito ouro coloidal. Por
sempre estar à frente na liderança dos experimentos com ideias especiais e
inovadoras. Uma grande amiga que ficará para sempre em meu coração.
viii
À Adriana Crespo pela oportunidade e confiança em deixar que eu fizesse parte do
time de professores lecionando Imunologia durante o estágio docência. Agradeço
também por todos os macarons que me ofereceu.
À Monica Reis e Aline Gonçalves por todo o conhecimento teórico prático
compartilhado e agilidade nos experimentos. Por me fazerem ter um olhar mais
apurado diante das questões que envolvem laboratório, pesquisa e equipamentos a
serem utilizados. Por tornarem meus dias mais alegres. Por todo o conhecimento
partilhado, cardápios e dietas a serem experimentados e a filmes e séries a serem
assistidos.
Menção especial de agradecimento ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPQ) pelo auxilio financeiro.
ix
SUMÁRIO
Sumário ............................................................................................................................. vii
Tabelas, figuras e anexos ..................................................................................................... x
Símbolos, siglas e abreviaturas ........................................................................................... xii
Resumo............................................................................................................................. xiv
Abstract ............................................................................................................................ xvi
1. Introdução/Revisão de Literatura ...................................................................................... 1
1.1 O agente Listeria monocytogenes ............................................................................... 1
1.2 Antígenos .................................................................................................................. 2
1.3 Características gerais ................................................................................................. 2
1.4 Disseminação no organismo ....................................................................................... 2
1.5 Mecanismos de infecção ............................................................................................. 4
1.6 Contaminação ............................................................................................................ 7
1.7 A doença ................................................................................................................... 8
1.8 Vigilância Sanitária ................................................................................................... 9
1.9 Estudo de surtos ....................................................................................................... 10
1.9.1 Surto em produtos cárneos e embutidos ........................................................... 32
1.9.1 Contaminação de leite e derivados ................................................................... 32
1.10 Legislação e controle na produção produtos de origem animal ................................ 11
1.11 Métodos de detecção de L.monocytogenes.............................................................. 12
1.11.1 Cultura .......................................................................................................... 32
1.11.2 Provas bioquímicas ........................................................................................ 32
1.11.3 Testes imunoenzimáticos ............................................................................... 32
1.11.4 Testes por imunohistoquimica ....................................................................... 32
1.11.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................................ 32
1.11.6 Testes imunocromatográficos ........................................................................ 32
1.12 Legislação e controle na produção de produtos de origem animal ............................ 13
1.13 Métodos de detecção .............................................................................................. 15
x
1.14 Produção de materias microbiológicos .................................................................... 18
1.15 Importância dos testes rápidos ................................................................................ 19
1.16 Desenvolvimento de testes rápidos ......................................................................... 20
2. Justificativa ................................................................................................................... 24
3. Objetivos ....................................................................................................................... 26
3.1.1 Objetivo geral ....................................................................................................... 26
3.1.2 Objetivos específicos ............................................................................................ 26
4. Métodos ......................................................................................................................... 27
4.1 Cepas utilizadas........................................................................................................ 27
4.2 Cultivos bacterianos ................................................................................................. 28
4.3 Caracterização bacteriana ......................................................................................... 28
4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida ....................................................................... 30
4.6 Anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes .................................................. 30
4.7 Preparo de partículas de ouro coloidal ...................................................................... 31
4.8 Conjugação do ouro coloidal a anticorpos ................................................................. 32
4. 9 Padronização dos protótipos .................................................................................... 32
4.9.1 Padronização da membrana de NC e filtro absorvente da amostra .................... 32
4.9.2 Padronização da quantidade de amostra, volume a ser usado e estimativa do
tempo de leitura ....................................................................................................... 33
4.9.3 Bloqueio da membrana do conjugado .............................................................. 33
4.9.4 Escolha da concentração do conjugado ............................................................ 33
4.9.5 Padronização do tipo de amostra a ser testado .................................................. 34
4.9.6 Padronização das concentrações de anticorpo policlonal Anti-Internalina A e
Anti Internalina B .................................................................................................... 34
4.10 Composição do teste rápido para detecção de Listeria sp ........................................ 34
4.11 População de estudo utilizada para o desenvolvimento e avaliação dos testesc ........ 35
4.12 Protocolo de preparo das amostras das culturas de bactérias em amostras de leite.... 35
4.13 Protocolo de execução do teste ............................................................................... 36
4.14 Interpretação do teste .............................................................................................. 36
5. Resultados ..................................................................................................................... 38
xi
5.1 Culturas de Listeria monocytogenes .......................................................................... 38
5.2 Testes confirmatórios para identificação de Listeria monocytogenes ......................... 38
5.3 Preparo dos protótipos .............................................................................................. 41
5.3.1 Produção de ouro coloidal ............................................................................... 41
5.3.2 Conjugação de anticorpo MAb 2D12 ao ouro coloidal ..................................... 41
5.3.3 Sensibilização das membrana de nitrocelulose ................................................. 42
5.4 Avaliação do desempenho dos lotes de Poli Anti-InlA e Poli Anti-InlB .................... 42
5.5 Estudo de processamento visando melhora na detecção ............................................ 44
5.5.1 Sonicação ........................................................................................................ 44
5.5.2 Lise bacteriana ................................................................................................ 44
5.5.3 Lavagerm ........................................................................................................ 44
5.5.4 Conjugado – aumento na concentração de conjugado ....................................... 45
5.6 Capacidade de detecção do teste ............................................................................... 45
5.7 Capacidade de detecção em amostras de leite contaminadas com Listeria
monocytogenes ............................................................................................................... 47
6. Discussão ....................................................................................................................... 49
7. Conclusões ..................................................................................................................... 52
Referências ........................................................................................................................ 53
Anexos .............................................................................................................................. 63
xii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Tabela 1: Bactérias Cultivadas ........................................................................................... 36
Tabela 2: Correlação entre turbidez e UFC/mL de cultura de Listeria monocytogenes........ 36
Quadro 1: Visão geral dos experimentos com Linhas Teste e Conjugado ............................ 16
Gráfico 1: Curva bacteriana baseada no crescimento da bactéria através da turbidez do meio
de cultura e a contagem de Unidades Formadoras de Colônias/mL ..................................... 46
Figura 1: Patogênese da Listeria monocytogenes ................................................................. 6
Figura 2: Representação esquemática de um teste rápido de fluxo lateral ............................ 21
Figura 3: Card adesivo e disposição dos componentes de montagem de um teste rápido de
fluxo lateral ....................................................................................................................... 23
Figura 4: Esquema de diluição seriada com amostras de Leite infectadas experimentalmente
com Listeria monocytogenes .............................................................................................. 35
Figura 5: Culturas de Listeria monocytogenes crescidas em caldo TSB por 20 horas em
estufa shaker 37ºC +/-1 ...................................................................................................... 38
Figura 6: Tubos de meio TSB fermentação de carboidratos (xilose e ramnose) ................... 39
Figura 7: Microscopia ótica objetiva de 1000x mostrando coco-bacilos gram positivos,
sugerindo presença de Listeria monocytogenes................................................................... 40
Figura 8: Ágar Sangue de Cavalo sem presença de bactérias formadoras de beta-hemólise e
Ágar Sangue de Cavalo com presença sugestiva de Listeria monocytogenes com beta-
hemólise ............................................................................................................................ 40
Figura 9: Ágar ALOA com crescimento sugestivo de Listeria monocytogenes em 12 horas
(Figura A) e crescimento de 48 horas com presença de halo ao redor das colônias (Figura B)
.......................................................................................................................................... 41
Figura 10: Etapas de produção de ouro coloidal de 20nm e 40nm ....................................... 42
Figura 11: Resultado em duplicata de protótipo com Conjugado MAb 2D12 concentração X,
e linha teste Poli Anti-InlB concntração D. Amostra Listeria monocytogenes ATTCC 746625
Figura 12: Avaliação do desempenho de lotes de concentrações de Poli Anti InlB nas
concentrações B, C, D, E. Conjugado MAb2D12 concentração X – Amostras Listeria 1 A e 1
B com 2 lavagens de PBS .................................................................................................. 46
xiii
Figura 13: Avaliação do desempenho de lotes e concentrações de Poli Anti InlA nas
concentrações A, B, C, D. Conjugado MAb2D12 concentração X – Amostras Listeria 1 A e
1B com 2 lavagens de PBS 1X ........................................................................................... 43
Figura 14: Testagem com Listeria monocytogenes após processo de sonicação da cultura.
Testes Poli Anti-InlB concentração D e Conjugado concentração X ................................... 44
Figura 15: Testagem Listeria monocytogenes após uso de tampão fosfato de potássio. Testes
Poli Anti-InlB concentração D e Conjugado concentração X .............................................. 44
Figura 16: Avaliação do desempenho de lotes e concentrações de Poli Anti InLB na
concentração D. Conjugado MAb2D12 concentração X – Amostras Listeria 1A e 1B com
lavagens de PBS 1X ........................................................................................................... 44
Figura 17: Amostra Lm 1B controle positivo detectada na concentração Conjugado –
MAb2D12 concentração X ................................................................................................ 45
Figura 18: Amostra Lm 1B controle positivo fracamente detectada após o aumento de
Conjugado – MAb2D12 concentração Y ........................................................................... 45
Figura 19: Resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com amostra Lm 1B ATTCC
7644, cultura D.O. 1,381. Protótipos Poli Anti InlB concentração D – Conjugado MAb
2D12 concentração X ......................................................................................................... 47
Figura 20: Resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com amostra de leite infectado
com Lm 1B ATTCC 7644, cultura D.O. 1,270. Protótipos Poli Anti InlB concentração D –
Conjugado MAb 2D12 concentração X .............................................................................. 47
Figura 21: Resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com controle negativo Listeria
innocua, Enterobacter cloacae e Bacillus cereus, cultura D.O. 0,830. Protótipos Poli Anti
InlB concentração D – Conjugado MAb 2D12 concentração X ........................................... 48
xiv
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
APC – Antigen Presenting Cells
BSA – Bovine Serum Albumin
CPA – Centro de Pesquisa em Alimentos
DC – Dendritic Cell
DIPOA – (Diretora do Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal)
DNA – Deoxyribonucleic Acid
D.O. – Densidade óptica
ELISA – Ensaio imunoabsorvente ligado à enzima ou Ensaio imunoenzimático
EPS – Extracellular Polymeric Substances – substâncias poliméricas extracelulares
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
JUQV – Juquitiba vírus
LDTR – Laboratório de Desenvolvimento de Testes Rápidos
LIA – Laboratório de Imunologia Aplicada
LIAH – Laboratório da Imunologia da AIDS e Hanseníase
μg – Microgramas
MHC – Major Histocompatibility Complex
μL – Microlitros
mL – Mililitros
mm – Milímetros
NC – Nitrocelulose
PAMPs – Pathogen-Associated Molecular Patterns
PNCP – Programa Nacional de Controle de Patógenos
PBS – Tampão fosfato-salina
PCR – Polymerase Chain Reaction
PEG – Polietilenoglicol
SIF – Serviço de Inspeção Federal
SP – São Paulo
UFC – Unidades Formadoras de Colônias
UFG – Universidade Federal de Goiás
xv
UFPel – Universidade de Pelotas
xvi
RESUMO
Desenvolvimento de teste rápido para detecção de Listeria monocytogenes em
alimentos.
A listeriose é uma infecção bacteriana, provocada por Listeria monocytogenes, uma
bactéria transmitida principalmente pela ingestão de alimentos contaminados. É o
principal agente responsável pelas infecções alimentares com baixa taxa de
morbidade, porém quando a infecção ocorre em imunodeprimidos os índices de
mortalidade são elevados, representando um importante problema de saúde pública.
Os métodos disponíveis para a identificação da presença de Listeria monocytogenes
incluem o isolamento da bactéria através de cultivo convencional, que consiste em
um método laborioso, demorado e de baixa sensibilidade e métodos moleculares e/ou
imunológicos, normalmente complexos, de custo elevado, requerendo equipamentos
e pessoal treinado. Portanto, a busca por métodos alternativos, rápidos, sensíveis e
específicos para a detecção da presença de Listeria monocyogenes em alimentos, é
útil e necessária para prevenção da infecção e de grande valia para reduzir a taxa de
mortalidade nos imunodeprimidos, bem como, viabilizar a vigilância epidemiológica
desta enfermidade. Os objetivos do trabalho foram: Desenvolver teste
imunocromatográfico de fluxo lateral para identificação de L. monocytogenes em
alimentos; Avaliar o desempenho do teste imunocromatográfico de fluxo lateral
utilizando amostras de alimentos naturalmente e artificialmente contaminados com L.
monocytogenes. Como agente de detecção, foi impregnado à fibra de vidro o
monoclonal MAb-2D12 anti-internalina-A conjugado ao ouro coloidal. Como agente
de captura, foi sensibilizado, em papel de nitrocelulose, a linha teste com anticorpo
policlonal anti-internalina-B, e na linha controle com proteína A, para validar a
atividade do agente de detecção. Inóculos de cepas padrões de Listeria
monocytogenes foram utilizados para avaliação da detecção Listeria no teste
proposto. Como controle negativo, utilizamos cepas de Listeria innocua,
Enterobacter sp. e Bacillus cereus. Foi obtido positividade em protótipos de testes
rápidos sensibilizados com policlonal anti-InlB. Observou-se positividade em
amostras contendo meio de cultura e a bactéria recém cultivada, validando a
metodologia empregada no desenvolvimento do teste. A capacidade de detecção do
teste foi de 2x104 UFC/mL.
Palavras-chave: Listeria spp.. Imunocromatografia. Alimentos.
xvii
ABSTRACT
Rapid test development for detection of Listeria monocytogenes in food.
Listeriosis is a bacterial infection caused by Listeria monocytogenes, a bacterium
transmitted mainly by the ingestion of contaminated food. It is the main responsible
for food infections with low morbidity rate, but when contamination occurs in
immunosuppressed the mortality rates are high, representing an important public
health problem. Methods available for identification of the presence of Listeria
monocytogenes include isolation of the bacterium through conventional culture,
laborious, time-consuming and low sensitivity method, and usually complex and
costly molecular and / or immunological methods requiring trained personnel and
equipment. Therefore, the search for rapid, sensitive and specific methods for
detecting the presence of Listeria monocyogenes in foods is useful and necessary for
infection prevention and great value to reduce the mortality rate in the
immunocompromised as well as to enable the epidemiological surveillance of this
disease. The objectives of the study were: To develop lateral flow
immunochromatographic test for the identification of L. monocytogenes in foods; To
evaluate the performance of the lateral flow immunochromatographic test using food
samples naturally and artificially contaminated with L. monocytogenes. As the
detection agent, were impregnated glass fiber with anti-internalin-A MAb-2D12
conjugated to colloidal gold. As a capture agent, were sensitized, on nitrocellulose
paper, the test line with polyclonal anti-internalin-B antibody, and in the control line
with protein A, to validate the activity of the detection agent. Inoculations of
standard strains of Listeria monocytogenes were used for evaluation of the Listeria
detection in the proposed test. As a negative control, we used strains of Listeria
innocua, Enterobacter sp. and Bacillus cereus. Positivity was obtained in prototypes
of rapid tests sensitized with Polyclonal Anti-InlB. Positivity was observed in
samples containing culture medium and newly cultured bacteria, validating the
methodology used in the development of the test. The detection capacity of the test at
D concentration is 2x104 CFU / mL.
Key words: Listeria spp.. Immunochromatography. Food.
1
1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA
O patógeno alimentar Listeria monocytogenes é o agente causador da
listeriose, uma doença severa que cursa com baixas taxas de morbidade, porém com
altas taxas de mortalidade em pessoas suscetíveis à infecção, representando um
importante problema de saúde pública (ALLERBERGER, 2010).
1.1 O agente
A bactéria foi relatada pela primeira vez em 1924 por Murray, Webb e
Suann, com a denominação de Bacterium monocytogenes, por conta da monocitose
observada. Em 1927, após seu isolamento de fígado de roedores, Pirie, a nomeou de
Listerella hepatolytica em homenagem ao britânico Sir Joseph Lister, um famoso
cirurgião. Em 1940 foi denominado Listeria monocytogenes, após estudos mais
específicos sobre o patógeno infeccioso (Pirie, 1940 apud STAVRU;
ARCHAMBAUD; COSSART, 2011, MURRAY; WEBB; SWANN, 1926;
BREED; MURRAY; HITCHENS, 1948).
O gênero Listeria é constituído por dezenove espécies: L. monocytogenes,
L. inoccua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. gray, L. marthii e L.
rocourtiae, L. fleischmannii, L. weihenstepha-nensis, L. booriae, L. newyorkensis,
L. floridensis, L. aquatica, L. cornellensis, L. riparia L. grandensis, L. denitrificans
e L. murrayi (BERTSCH et al., 2013; HALTER; NEUHAUS; SCHERER, 2013;
DEN BAKKER et al., 2014; WELLER et al., 2015). Destas, apenas a L.
monocytogenes é patogênica ao homem e animais, e a L. ivanovii aos animais.
Porém, já foram relatados alguns casos de listeriose em humanos por L.ivanovii,
mostrando que essa espécie também pode apresentar caráter oportunista entérico
nos seres humanos (GUILLET et al., 2010). Até o momento, são conhecidos 13
sorotipos de L. monocytogenes (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e e
7) (TAMBURRO et al., 2010). No entanto, os sorotipos 1/2a, 1/2b e 4b estão
relacionados com mais de 90% dos casos e surtos de listeriose (VAZQUEZ-
BOLAND et al., 2001; TORRES et al., 2005).
2
1.2 Características do agente
L. monocytogenes é caracterizada por apresentar-se como um coco-bacilo
curto (6 a 20 µm), flagelado, Gram-positivo, anaeróbio facultativo, não
apresentando esporos, mostrando-se catalase positivo, fermentando carboidratos
como ramnose, sendo móvel, resistente ao congelamento e capaz de sobreviver
entre 3 ºC a 45 ºC, também podendo suportar a inúmeros congelamentos e
descongelamentos, sendo que essas peculiaridades lhe conferem proteção e maior
virulência frente ao hospedeiro (DEVER, 1993; DONELLY, 1992; FRANCO,
2008).
Na presença de cloreto de sódio (NaCl), a taxa de sobrevida é de 11%
quando incubada a 37°C por 15 dias e 13% em 10 dias. Pode sobreviver a 4°C por
aproximadamente 130 dias em caldo tripticase soja contendo NaCl na concentração
25%, com atividade de água por volta de 0,83 (FRANCO, 2008).
1.3 Antígenos do agente
Várias proteínas de superfície e algumas secretadas pela L. monocytogenes
têm sido descritas como relevantes fatores de virulência bacteriana. Muitas dessas
proteínas representam um ponto crítico na persistência desse microorganismo no
trato gastrointestinal, na aderência e entrada na célula do hospedeiro, na
movimentação de célula para célula e no escape do sistema imunológico do
hospedeiro. A maioria dos genes associados à virulência da bactéria estão
agrupados em uma mesma região de 9 kb denominada de ilha de patogenicidade de
Listeria-1 (LIPI-1). Os genes estão organizados da seguinte forma: prfA, plcA, hly,
mpl, actA, plcB. Esses genes em conjunto com os genes de internalinas A e B (inlA
e inlB), bilE e hpt, são diretamente regulados e controlados pelo gene prfA, que
codifica a proteína PrfA (fator regulador positivo) (BIERNE; COSSART, 2007).
3
Figura 1: Interação entre Internalina e E-Caderina (Adaptado de Wolf-Dieter
Schubert, 2002)
1.4 Disseminação do agente
L. monocytogenes é um microorganismo que está em grande parte da
natureza e pode sobreviver e se desenvolver em variadas condições ambientais.
Pode ser encontrado em diversos locais, como solo, água, vegetação, silagem e trato
intestinal de animais domésticos, principalmente em ruminantes (ovinos, bovinos,
caprinos). Tem tropismo por ambientes úmidos e ricos em nutrientes, que auxiliam
e propiciam o seu desenvolvimento. (NIGHTINGALE; WINDHAM;
WIEDMANN, 2005)
No ambiente de indústrias de alimentos, L. monocytogenes pode ser
encontrada em pisos, ralos, equipamentos instalados nas fábricas, sistemas de
refrigeração, sistemas de tratamento de ar entre outros, exigindo extremo cuidado
na limpeza dos equipamentos pois, apresentam a possibilidade de colonizar e se
multiplicar em várias superfícies, incluindo aço inoxidável, borracha, vidro e
polipropileno, podendo se manter nestes locais por um prolongado tempo
(MONTVILLE; MATTHEWS, 2008; VAID; LINTON; MORGAN, 2010).
Portanto, a bactéria está amplamente distribuída no ambiente doméstico (BRANCO
et al., 2003), no ambiente de plantas de processamento de alimentos (AGUADO et
al., 2004, VON LAER et al., 2009, NALÉRIO et al., 2009) e em diversos alimentos
(HOFER et al., 2006, FDA, 2017).
L. monocytogenes pode colonizar superfícies e formar biofilmes, esses
permitem ao microrganismo persistir a condições adversas, tais como a dessecação,
exposição à luz ultravioleta, tratamento com antimicrobianos e agentes sanitizantes,
representando assim grande fonte de contaminação aos produtos alimentícios que
entram em contato com os mesmos. Sua persistência pode ocorrer por vários fatores
4
que já foram estudados sobre diferentes parâmetros, como superfície de contato,
variações entre as cepas, meio, temperatura e morfologia. (KALMOKOFF et al.,
2001; BORUCKI et al., 2003; HEFFORD et al., 2005; DI BONAVENTURA et al.,
2008; AMALARADJOU; NORRIS; VENKITANARAYANAN, 2009; KUMAR et
al., 2009).
A resistência da Listeria pode ser explicada pela proteção mecânica devido
à síntese de exopolissacarídeos (EPS = Extracellular Polymeric Substances =
substâncias poliméricas extracelulares) com a formação do biofilme a situações de
estresse bacteriano (CLOETE, 2003; GANDHI; CHIKINDAS, 2007;
POIMENIDOU et al., 2009; CHAITIEMWONG; HAZELEGER; BEUMER,
2010).
Esse microrganismo pode contaminar uma grande diversidade de
alimentos crus ou processados, inclusive carnes, leite e derivados, peixes e frutos
do mar. Isolados de L. monocytogenes podem persistir em uma superfície qualquer,
mesmo após desinfecção, tornando-se parte da microbiota do ambiente por meses
ou até mesmo anos. Por isso, o patógeno faz parte dos microrganismos que mais
preocupam as autoridades no que se refere à contaminação cruzada pós-
processamento de produtos prontos para consumo (WHO/FAO, 2004). A extensa
disseminação do patógeno, aliada à tolerância a altas concentrações de sal, acidez,
atmosfera modificada, bem como sua capacidade de multiplicação sob temperaturas
de refrigeração, torna difícil a obtenção de alimentos totalmente livres desse
patógeno (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001, VON LAER et al., 2009). Não sendo
possível erradicar Listeria sp. dos alimentos, nos Estados Unidos, é necessário se
concentrar em prevenção conforme medidas profiláticas descritas no guia para
indústria FBA/USA (FDA, 2017).
1.5 Contaminação
O consumo de produtos alimentícios contaminados é o maior responsável
pela maioria dos casos de listeriose em humanos, sendo que a dose infectante
ingerida é possivelmente influenciada pela susceptibilidade do hospedeiro e
também pela linhagem envolvida da bactéria. No que se refere à quantidade de
microrganismos ingeridos necessários para o aparecimento da doença, pode variar
de 102 a 10
9 UFC (Unidades Formadoras de Colônias), sendo que isto depende do
estado imunológico do indivíduo (MCLAUCHLIN et al., 2004; JEMMI;
5
STEPHAN, 2006). A ingestão de alimentos contaminados se agrava em pessoas
que tem o sistema imune comprometido como gestantes, idosos, recém nascidos,
indivíduos com síndrome de imunodeficiência adquirida, cirrose, carcinoma e
outras doenças que atacam o sistema imune (SOUZA, 2017).
1.6 Mecanismos de infecção
O patógeno L. monocytogenes contamina um significativo número de
alimentos, mas grande parte dos surtos e casos esporádicos de listeriose estão
geralmente ligados aos produtos prontos para consumo. Devido ao fato de serem
consumidos sem cozimento prévio são mais propensos ao risco de doenças
transmitidas por alimentos. (BRITO et. al., 2008)
Os alimentos são fonte primária de infecção por L. monocytogenes. A
bactéria pode infectar uma variedade de espécies de animais e diferentes tipos de
células. Para causar sua infecção, pode ultrapassar três barreiras importantes:
epitélio intestinal, hemato-encefálica e placentária. Sendo que a primeira e principal
rota de infecção por L. monocytogenes é a passagem através do epitélio intestinal,
sendo um pré requisito para haver infecção (BHUNIA, 2008). A Listeria pode
infectar as células por dois diferentes mecanismos: invasão direta da célula ou
invasão célula-célula, utilizando uma variedade de mecanismos para escapar e
resistir à resposta imune do hospedeiro, incluindo a sobrevivência intracelular.
(POSFAY-BARBE; WALD, 2009)
No trato gastrointestinal, mais precisamente no intestino delgado, a L.
monocytogenes exposta ao estresse ocasionado pelo aumento da temperatura e
exposição ao baixo pH, estimula o aumento da produção de proteínas, promovendo
o início do estágio de virulência da bactéria. Esta infecção primária progride para a
translocação através da barreira da mucosa para a circulação sanguínea ou linfática
e posteriormente para uma disseminação sistêmica. As proteínas da parede
bacteriana levam à internalização da bactéria em células não fagocíticas, com
multiplicação no citoplasma como um patógeno intracelular facultativo e invadir
células vizinhas (RAENGPRADUB; WIEDMANN; BOOR, 2008). Depois que
alcança a corrente sanguínea, a maioria das bactérias atinge os linfonodos, baço e
fígado, em especial por causa do transporte através de macrófagos e células
6
dendríticas que facilitam a entrada da bactéria nos órgãos (PRON et al., 2001;
DREVETS; BRONZE, 2008).
No momento em que L. monocytogenes chega ao intestino delgado, utiliza
principalmente as proteínas InlA e InlB para iniciar o processo de aderência e
invasão dos enterócitos. A internalização da bactéria ocorre por um sistema de
engolfamento chamado de mecanismo tipo zíper (zipper mechanism), que em um
processo de fagocitose leva a bactéria para o interior da célula hospedeira. No
interior do fagossomo, com as baixas concentrações de ferro e carboidratos, acabam
reprimindo a expressão das internalinas e fazem com que as proteínas listeriolisina
O (LLO) e fosfatidilinositol fosfolipase C (PI-PLC) sejam expressas pela ativação
dos genes hlya e plcA, respectivamente. Ambas as proteínas agem lisando a
membrana do vacúolo fagocítico, fazendo com que a bactéria seja liberada no
citoplasma celular, em que é produzida uma alta quantidade de PrfA, promovendo a
expressão da proteína polimerizadora de actina (ActA), que acaba permitindo com
que a bactéria polimerize a actina citoplasmática da célula hospedeira e seja
impulsionada para células adjacentes (CABANES et al., 2002; COSSART;
PIZARRO-CERDA; LECUIT, 2003; PENTECOST et al., 2010).
No método de passagem para outra célula ocorre a formação de um
vacúolo com dupla membrana e nesse momento a bactéria expressa outra
fosfolipase C, a fosfatidilcolina (PCPLC, gene plcB), que quando é clivada por uma
metaloprotease (Mpl) fica na sua forma ativa. Assim, o escape da dupla membrana
é realizado mais uma vez pela proteína LLO com a ajuda de PC-PLC e por fim,
inicia-se o processo de multiplicação intracelular na nova célula (LECUIT, 2003,
GRAY; FREITAG; BOOR, 2006, HAMON; BIERNE; COSSART, 2006).
7
Figura 1: Patogênese da Listeria monocytogenes: (1) Ingestão, (2) Passagem do
intestino para a circulação, (3) Processo de engolfamento da bactéria por APC’s
(Células Apresentadoras de Antígeno) macrófagos, polimorfonucleares células
dendríticas entre outras, (4) Bactéria inserida em vacúlos intracelulares, (5) Ação da
proteína listeriolisina da L. monocytogenes, propiciando o escape do vacúolo
fagocítico, (6) L. monocytogenes se multiplica e forma uma cauda de filamentos de
actina que permitem sua movimentação, (7) A bactéria migra para a parede da
célula e empurra a membrana formando estrutura similar a pseudópodes, (8) O
pseudópode é fagocitado pela célula vizinha, (9) A célula fagocitária forma uma
dupla membrana e internaliza o vacúolo. Adaptado de: (SOUZA, 2017)
Como o sistema imune dos seres humanos possui barreiras protetoras
iniciais, nos casos em que o microrganismo consegue escapar da primeira linha de
defesa, a sobrevivência do hospedeiro depende diretamente de uma resposta do
sistema imune adaptativo, principalmente ligada à resposta de linfócitos T
citotóxicos dependente de CD8+. A habilidade da bactéria replicar-se no citosol da
célula hospedeira e migrar diretamente para células adjacentes, impossibilita uma
resposta humoral efetiva (STAVRU; ARCHAMBAUD; COSSART, 2011).
Quando a L. monocytogenes invade a corrente sanguínea, dissemina-se pelo
organismo e continua se espalhando para outros órgãos, em alguns casos pode
atingir cérebro e placenta. Para que isso não aconteça é necessário que a replicação
da bactéria seja controlada rapidamente. Por se tratar de um patógeno intracelular
facultativo, a imunidade inata é de importância na defesa.
Existe uma vasta diversidade de receptores envolvidos nas respostas
imunológicas. Sabe-se que a L. monocytogenes é reconhecida por receptores TLR2,
8
TLR5, NOD1 e NOD2, resultando na cascata de ativação de intermediários
bioquímicos como de NFkB e genes de mediadores pró inflamatórios que
auxiliarão na redução de bactérias no organismo. No entanto, existem outros
receptores que desempenham papéis importantes na detecção da bactéria, como o
caso do TLR10 (KOBAYASHI et al., 2005, OPITZ et al., 2006 MACHATA et al.,
2008, MOSA et al., 2009).
Regan et al., (2013) desenvolveram o primeiro estudo do papel essencial
do TLR10 em mediar resposta inflamatória a L. monocytogenes em macrófagos.
identificando o TLR10 como mediador chave na resposta imune inata pois quando
ocorre sua depleção a quantidade de bactérias nas células aumenta
consideravelmente. Também concluíram que o TLR2 sozinho não desempenha
papel crítico em resposta à infecção epitelial. Porém, quando associado ao TLR10,
em resposta à L. monocytogenes, a combinação deles se torna um receptor
funcional para ativação da cascata bioquímica para produção de NFkB (REGAN et
al., 2013). Quando ocorre a depleção de TLR10, a quantidade de L. monocytogenes
nas células aumenta consideravelmente, favorecendo a hipótese do envolvimento
do TLR10 na proteção contra a bactéria. (KIM et al., 2010, REGAN et al., 2013)
1.7 A doença
A listeriose é uma infecção grave que merece atenção especial pelos
sistemas de saúde porque é um sério problema de saúde pública, apresentando altas
taxas de mortalidade entre os indivíduos infectados e susceptíveis às infecções. As
condições que podem predispor a listeriose englobam neoplasias, leucemias, AIDS,
alcoolismo, diabetes (tipo 1, principalmente), doenças cardiovasculares,
transplantes renais e terapias com corticoides (FRECE et al., 2010 apud LIU, 2006;
SWAMINATHAN; GERNER-SMIDT, 2007; VANEGAS et al., 2009;
FORSYTHE, 2010).
A listeriose é um termo genérico para uma variedade de síndromes
causada por Listeria monocytogenes e as complicações mais frequentes em
humanos ocorrem na corrente circulatória, no sistema nervoso central e no útero de
mulheres grávidas (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001). Quando há a ingestão da
bactéria, a sintomatologia se assemelha com outras doenças como gripe, que vem
acompanhada de diarreia e febre. Em alguns casos, os sintomas são imperceptíveis,
fazendo com que o paciente não desenvolva nenhum sinal aparente. Em adultos, os
9
sintomas mais comuns são fadiga, febre, mal-estar, náuseas, vômitos e diarreia. Se
houver comprometimento do sistema nervoso central, pode desenvolver meningite
(recém-nascidos e idosos) e encefalite, causando em casos mais raros endocardite e
osteomelite (FRANCO, 2008). Os agravos observados são a septicemia,
gastrenterite e, em mulheres grávidas infectadas no segundo ou terceiro mês de
gestação, pode causar aborto, nascimento prematuro ou nascimento do bebê já
morto (SANT’ANA et al., 2012, YDE et al., 2010).
Existe diferença entre os surtos de gastrenterite e os surtos por Listeria em
sua forma invasiva. Os surtos estão relacionados a pessoas que não são do grupo de
risco, sendo preciso uma dose infectante maior para causar doença. Os sintomas
iniciais podem ser observados algumas horas após a exposição ao patógeno, ao
contrário da listeriose invasiva, em que os sintomas podem ser notados depois de
algumas semanas do contato com a bactéria. Os humanos podem ser portadores
assintomáticos de Listeria, sendo difícil definir a frequência que ocorrem casos de
listeriose gastrintestinal não-invasiva (MONTVILLE; MATTHEWS, 2008).
Há relatos de casos esporádicos em que sinais e sintomas da listeriose
associados com infecção sistêmica ocorrem após um período de ingestão do
patógeno que varia entre 3 e 70 dias, dificultando o rastreamento e isolamento da
fonte de contaminação. Em uma análise de 512 vegetais prontos para consumo, foi
relatado que 16 desses alimentos estavam contaminados com Listeria
monocytogenes correspondendo a 3,1% do total. Tal fato é considerado de elevada
importância visto que o patógeno é oportunista podendo gerar óbito em organismos
susceptíveis (WHO/FAO, 2004; LECUIT, 2007;, SANT’ANA et al., 2012, YDE et
al., 2010).
1.8 Vigilância sanitária
O reconhecimento e intensificação da fiscalização pelos órgãos
reguladores e indústria de alimentos são ações de grande importância para prevenir
e controlar casos e surtos de listeriose (WHO/FAO, 2004; LECUIT, 2007). Na
Europa e nos Estados Unidos, é exigida a ausência (Zero tolerance) de L.
monocytogenes em alimentos prontos para o consumo (WHO/FAO, 2004). Mesmo
com tanto esforço para estabelecer a eliminação da contaminação em alimentos,
tem sido observados surtos nos Estados Unidos e Europa com elevadas taxas de
mortalidade. O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dos Estados
10
Unidos estimou que a listeriose foi a terceira maior causa de doenças acarretadas
por patógenos alimentares naquele país entre os anos de 2000 e 2011, com uma
taxa de mortalidade de 19% (SCALLAN et al., 2011).
No Brasil, a legislação vigente exige a avaliação desse microrganismo em
produtos lácteos, cárneos e pescados, da mesma forma que nos países europeus e
nos EUA, para que esses alimentos estejam próprios para o consumo, é necessária a
ausência da bactéria em análise de amostras de aproximadamente 25 g do produto
(BRASIL, 2009, BRASIL, 2013).
Existem poucos relatos de surtos e casos isolados de listeriose no Brasil,
alguns têm sido associados ao consumo de alimentos contaminados (CRUZ et al.,
2008). Isso pode ser devido à baixa eficiência dos métodos de diagnóstico
empregados (cultura, ELISA, testes imunocromatográficos), assim como a
negligência ou ineficiência do sistema de vigilância epidemiológica do país, o qual
não consegue estabelecer um rastreamento adequado dos patógenos alimentares.
Isto pode significar que casos isolados e surtos de listeriose no Brasil são
subdiagnosticados, consequentemente subnotificados pelo sistema de vigilância
(BUENO et al., 2010). Reforçando esta hipótese, L. monocytogenes vem sendo
isolada em uma ampla variedade de alimentos em diversos estados do Brasil
(BARROS et al., 2004; NÁLERIO et al., 2009; BUENO et al., 2010).
1.9 Estudos de surtos
O primeiro surto de L. monocytogenes ocorreu em 1981 no Canadá após o
consumo de salada de repolho contaminada, 41 pessoas foram vítimas, 18
morreram (SCHLECH et al., 1983). Em seguida, diversos surtos foram reportados,
sendo que entre os anos 1998 e 1999, salsichas contaminadas foram a causa de
listeriose em 108 pessoas, levando 14 à morte, além de provocar quatro abortos em
mulheres grávidas (GRAVES et al., 2010).
Em 2011, o CDC reportou que ao menos 25 pessoas morreram nos Estados
Unidos por consumirem melões contaminados por L. monocytogenes. Este surto foi
um dos maiores e considerado um dos mais letais da última década por doenças
transmitidas por alimentos, e devido ao longo período de incubação da bactéria, o
número de indivíduos acometidos chegou a 123, com casos distribuídos em 23
estados durante os meses de agosto e setembro. Em decorrência do aumento de
casos e surtos de listeriose, a legislação alimentar de diversos países tem
11
especificado limites rigorosos para Listeria spp. e/ou L. monocytogenes (CDC,
2011). As estatísticas do evento permaneceram atrás do surto ocorrido, em Los
Angeles nos Estados Unidos, com queijo feito no estilo mexicano (mexican-style)
relatado por Linnan et al. (1988), em que 142 pessoas ficaram doentes e 48
morreram, dentre eles 20 fetos, 10 recém nascidos e 18 adultos.
Segundo o ultimo levantamento feito pelo CDC em 2017, ocorreram 8
casos de listeriose sendo que a princípio, todos foram hospitalizados incluindo os
dois casos em que houve morte, em Connecticut e Velmont. Dentre os 8 casos
relatados, um era recém nascido e cinco eram mulheres. Após a investigação
epidemiológica, eles concluíram que a causa da infecção foi a ingestão de queijo a
partir de leite cru produzido pela indústria Vulto Creamery de Walton. Foram
coletadas três amostras do lote referido e submetidas a análises laboratoriais e
identificaram a cepa de Listeria presente nas três amostras coletadas. Em março de
2017, a indústria retirou do mercado todos os queijos produzidos do leite cru
referentes aos lotes contaminados. Todo ano cerca de 1.600 pessoas são
contaminadas com L. monocytogenes nos Estados Unidos (CDC, 2017).
1.9.1 Surto em produtos cárneos e embutidos
Um surto ocorrido pelo consumo de embutido de carne de peru
contaminado comprometeu 30 pessoas, sendo que quatro foram a óbito e três
sofreram aborto (OLSEN et al., 2005). No Canadá, em 2008, foi registrado um
surto de listeriose pelo consumo de produtos de carne prontos para o consumo.
Dessa vez, dos 57 indivíduos acometidos, 22 morreram O sorotipo da bactéria
encontrado nesse caso foi o 1/2a (GILMOUR et al., 2010).
A presença de Listeria sp, em amostras de produtos cárneos foi investigada
por testes imunológicos rápidos (Tecra® Listeria VIA, Tecra® Listeria UNIQUE e
BioControl VIP® para Listeria) e pelo método clássico (Health Protection Branch,
Canadá). A concordância entre o método clássico e os testes rápidos foi
determinada com limite de 95% de confiança. Constatou-se que os testes VIA e
VIP® são de fácil execução e rápidos, além de apresentarem desempenho
comparável ao do método clássico, independentemente do alimento avaliado. O
teste UNIQUE apresentou desempenho variável com a amostra e gerou um número
elevado de resultados falsos positivos, o que dificulta seu emprego (ARAGON-
ALEGRO, 2014).
12
Foi analisada a ocorrência de Listeria spp. e L. monocytogenes na
produção de salsichas em dois estabelecimentos inspecionados pelo Serviço de
Inspeção Federal (SIF), sendo que em um deles as ferramentas de autocontrole
estavam implantadas. Os resultados das análises microbiológicas de 106 amostras,
entre matéria-prima cárnea, produto acabado e pools de swabs do ambiente pós-
cozimento, quando submetidos ao programa @Risk, apresentaram valores médios
que indicaram que 7% a 9% das salsichas continham L. monocytogenes.
Obtiveram-se 88 isolados de L. monocytogenes a partir de 106 amostras, sendo que
destas, 76 foram coletadas nas indústrias que participaram do experimento e 30
eram provenientes do varejo. Identificou-se 95% dos sorotipos como 4b, 1/2a e
1/2b. Diante destes achados, pode-se afirmar que além de apresentar fatores de
risco desconhecidos quanto à presença desse patógeno nas salsichas consumidas no
Brasil, a situação preocupa pela escassez de dados epidemiológicos, ausência de
padrões e falta de informação ao consumidor, tanto no que diz respeito à
possibilidade da presença de L. monocytogenes, especialmente para grupos de risco,
como a importância do aquecimento antes do consumo. Houve menor frequência de
L. monocytogenes na matéria-prima cárnea utilizada no preparo de salsichas,
ressaltando a importância do controle contínuo, com cumprimento dos
monitoramentos e verificações pré-estabelecidos. L. monocytogenes, sorotipo 4b,
estava presente em amostra de salsicha com registro no SIF, comercializada a
granel, em supermercado da cidade de Goiânia, a manipulação para granelização
deveria ser permitida apenas em condições especiais, contendo práticas sanitárias
que garantam a segurança do alimento (CESAR et al., 2011).
1.9.2 Contaminação de leite e derivados
A listeriose desperta preocupação das autoridades governamentais e da
comunidade científica da área de alimentos devido à capacidade de multiplicação
da bactéria em produtos lácteos sob refrigeração. O leite cru é uma fonte de
contaminação por L. monocytogenes, isto porque o seu consumo está intimamente
relacionado aos surtos registrados de listeriose. Vale ressaltar que produtos lácteos
em geral têm sido observados como fonte de surtos alimentares (MONTVILLE;
MATTHEWS, 2008; LATORRE et al., 2009). Por esses motivos, o consumo de
leite cru e produtos feitos a partir dele desperta atenção quando o assunto é a
segurança dos alimentos (KABUKI, 2004; ORAVCOVÁ et al., 2008). De acordo
13
com a Organização Mundial da Saúde (OMS), “a pasteurização é um processo
seguro que reduz o número de células de L. monocytogenes no leite cru até níveis
que não representem risco significativo para a saúde humana”. Contudo, L.
monocytogenes é capaz de crescer de forma satisfatória no leite pasteurizado
quando ocorre contaminação pós-processo, por deficiência na higienização, falta de
vigilância e treinamento ineficaz.
A capacidade de contaminar produtos lácteos, durante as etapas do
processo de produção, leva a diversos surtos de listeriose, portanto, o
monitoramento dessa bactéria em laticínios é importante (CHAICUMPA et al.,
2007; CAGRI-MEHMETOGLU et al., 2010).
De acordo com o Food and Drug Administration (FDA), casos de listeriose
relacionados a leite cru e queijos são registrados desde 1980, nos Estados Unidos.
Segundo dados do European Food Safety Authority (EFSA), o consumo de queijos
contaminados foi responsável por 0,4% do total de surtos alimentares ocorridos em
2006 na Europa (MONTVILLE; MATTHEWS, 2008; VANEGAS et al., 2009;
KOUSTA et al., 2010).
Em coletas realizadas em um laticínio do sul da Itália e em dois laticínios
do sul do Brasil, após a higienização dos equipamentos e utensílios utilizando-se
swabs estéreis, as amostras foram analisadas quanto à presença de Listeria spp., e
as colônias suspeitas foram identificadas através de métodos bioquímicos descritos
na ISO 11290-2:1998, Kit API Listeria® (BioMérieux) e BAX System (DuPont®).
Das 106 amostras analisadas provenientes da Itália, sete foram positivas para
Listeria spp. e uma foi identificada com Listeria monocytogenes. Entre as duas
amostras coletadas no Brasil, de uma iogurteira e de um recipiente de queijo
retirado de tanque com solução clorada, foi identificada Listeria innocua. Os
estudos identificaram a presença de Listeria spp. em equipamentos e utensílios de
indústrias de produtos lácteos tanto no Brasil como na Itália. Esses resultados
propiciaram ações corretivas importantes, pois foi a primeira vez que L.
monocytogenes foi isolada na indústria italiana. Sendo que foi detectada em pontos
de difícil higienização do equipamento, demonstrando a necessidade de melhorias
nos procedimentos de higienização (PIETA, 2012).
14
1.10 Legislação e controle na produção de produtos de origem animal
Países como Brasil, França e Itália já estabeleceram legislações que
possibilitam a produção de queijos utilizando o leite cru, sem nenhum tratamento
térmico. No Brasil, no dia 25 de janeiro de 2013, por meio da Portaria SDA nº
17/2013, foi criada a Comissão Científica Consultiva em Microbiologia de
Produtos de Origem Animal que possibilita a melhora no sistema de inspeção
brasileiro a garantir qualidade do produto a ser comercializado (BRASIL, 2013).
Os Programas Nacionais de Controle de Patógenos (PNCP’s), sob jurisdição
da Secretaria de Defesa Agropecuária, do Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento, permitem identificar a prevalência dos patógenos em produtos de
origem animal, produzidos pelos estabelecimentos brasileiros, registrados junto ao
SIF. Com isso, será possível a Diretoria do Departamento de Inspeção de Produtos
de Origem Animal (DIPOA) identificar e estabelecer medidas de controle para o
perigo, implantar essas medidas de controle e monitorar os resultados obtidos a fim
de garantir a segurança alimentar do consumidor frente a L. monocytogenes,
Salmonella e Escherichia coli (BRASIL, 2009; BRASIL, 2013).
A instrução normativa nº 9, de 8 de abril de 2009 institui os procedimentos
de controle de L. monocytogenes em produtos de origem animal prontos para o
consumo, tendo como objetivo monitorar e assegurar a inocuidade dos produtos
(BRASIL, 2009)
A norma interna DIPOA/SDA nº 1, de 9 de agosto de 2013 aprova os
procedimentos operacionais complementares à Instrução Normativa nº 9, de 8 de
abril de 2009, definindo os procedimentos para coleta oficial de amostras para o
controle de L. monocytogenes em produtos de origem animal prontos para o
consumo a serem adotados pelo SIF. A lei descreve todos os produtos a serem
monitorados que incluem produtos cárneos, lácteos e pescados. As análises são
realizadas e encaminhadas para laboratórios oficiais descritos na lei que incluem
pH, atividade de água, concentração de NaCl, agentes antimicrobianos (nitritos e
nitratos, por exemplo) e umidade (BRASIL, 2013).
No Brasil foi publicado, em 7 de Março de 1996, a Portaria nº 146, que
permite a fabricação de queijo a partir do leite cru, desde que o produto final seja
maturado, ou seja, processos físicos, bioquímicos e microbiológicos que cada tipo
de queijo pode sofrer, dependendo de sua característica. A respeito da produção do
15
Queijo Minas Artesanal, foi revogada a Lei Estadual nº 14.185 de 31 de Janeiro de
2002, (BRASIL, 2003).
A nova lei 20549 de 18 de Dezembro de 2012 que permite a fabricação
deste queijo com leite cru, no Estado de Minas Gerais foi regulamentada pela
aprovação da normativa Nº 30 de 7 de agosto de 2013 que dispõe sobre o processo
de produção de Queijo Minas Artesanal. O artigo 1º permite que os queijos
artesanais tradicionalmente elaborados, a partir de leite cru, sejam maturados por
um período inferior a 60 (sessenta) dias, quando estudos técnico-científicos
comprovem que a redução do período de maturação não compromete a qualidade e
a inocuidade do produto. (BRASIL, 2013)
Existem também duas portarias que estabelecem algumas normas referentes
à produção destes queijos mineiros: a Portaria n° 517, que estabelece as normas de
defesa sanitária para os rebanhos que fornecem leite para elaboração do Queijo
Minas; e a Portaria n° 518, que dispõe sobre requisitos básicos de instalações,
materiais e equipamentos para fabricação dos queijos artesanais de Minas Gerais.
Mesmo com a existência dessas legislações, um controle eficaz quanto ao
cumprimento das normas estabelecidas depende de educação de pequenos
produtores de queijos de leite cru no país pois aqueles que não estão registrados não
são inspecionados. Portanto, o consumo destes queijos é preocupante devido às
diversas fontes de contaminação por Listeria spp. (BRASIL, 2009).
1.11 Métodos de detecção de L. monocytogenes
Existem testes para identificação de Listeria monocytogenes que estão
disponíveis no mercado e em sua grande maioria, dependem de cultivo prévio do
material a ser analisado. Dentre os métodos de detecção estão incluídos: cultura,
provas bioquímicas, testes imunoenzimáticos, imunohistoquímica, PCR e
imunocromatográfico.
1.11.1 Cultura
A eficiência dos diferentes procedimentos propostos para o isolamento de
L. monocytogenes a partir de queijos está associada a inúmeros fatores como
características intrínsecas da amostra analisada (pH, atividade de água, potencial de
óxido-redução, conteúdo em nutrientes, microbiota presente e a sua distribuição no
alimento), seletividade dos meios de cultura e tipo de incubação (temperatura e
16
atmosfera) (SILVA; VILARDI; TIBANA, 1998). A identificação da Listeria
depende do cultivo prévio das amostras a serem testadas sendo que alguns são mais
seletivos favorecendo o crescimento da bactéria. A eficiência dos meios seletivos
indicadores testados variou em função do grau de contaminação do queijo, sendo o
ágar MOX (Modified Oxford Ágar) mais sensível e mais seletivo que o Palcam
para as amostras de queijos que apresentaram elevado nível de contaminação. Já
para os demais queijos analisados, ambos apresentaram a mesma eficiência. Das
103 amostras analisadas, 11 (10.8%) estavam contaminadas com L. monocytogenes,
evidenciada em amostras de queijos gorgonzola, roquefort e minas frescal (SILVA;
VILARDI; TIBANA, 1998).
1.11.2 Provas bioquímicas
MICRO-ID® Listeria é um teste para provas bioquímicas que consiste em
uma bandeja moldada com estireno com cobertura articulada que inclui quinze
câmaras de reação. Cada câmara contem discos de papel filtro impregnados com
reagentes capazes de detectar enzimas específicas e/ou produtos finais metabólicos
produzidos pela Listeria spp. A reação dos reagentes com esses produtos
bioquímicos bacterianos produz uma coloração facilmente identificável. São
realizadas diversas provas bioquímicas: glicose, nitrato, ácido sulfurico, indol,
ornitina, lisina, VP (Vogues-Proskauer), ONPG (β-galactosidase), malonato, ureia,
esculina, xilose, ramnose, manitol e sorbitol. Todas as provas são visualizadas
através de mudança na coloração da bandeja de estireno. (ANEXO V)
1.11.3 Testes imunoenzimáticos
O sistema TECRA conta com ensaios intitulados Listeria Visual
Immunoassay (LISVIA) que consiste no enriquecimento primário utilizando 20g de
amostra em meio de cultura LEB incubado a 30ºC por 24hr. Em seguida, transfere-
se 1mL da cultura em 9mL de meio Fraser e incuba a 30ºC por 24hr. No ensaio de
ELISA, são retirados 50 microlitros de tubos rotulados provenientes do kit que
contem amostra aditivada e são colocados na placa. Com 1mL da cultura em meio
Fraser é realizada ELISA que utiliza controles positivo e negativo. O fabricante não
menciona qual conjugado é utilizado na técnica. Todo o processo de ELISA leva
aproximadamente 72 horas e os resultados são fornecidos através da leitura de
17
absorbância a 450nm Sensibilidade: 1-5 UFC/25 g de amostra. Especificidade:
99%. (ANEXO VI)
Foram analisadas 84 amostras de diferentes marcas de queijo coalho de
Fortaleza-CE, sendo que pelos métodos clássicos 16 (19%) estavam contaminadas
com Listeria monocytogenes, 5 (5,9%) com Listeria innocua e 1 (1,2%) com
Listeria grayi. Listeria monocytogenes foi isolada na faixa de pH de 5,75 a 6,37 e
em atividade de água entre 0,949 e 0,970. O teste TECRA Listeria Visual
Immunoassay (LISVIA) avaliado detectou a presença de Listeria spp. em 9 (10,7%)
amostras. O plaqueamento das amostras negativas na leitura visual do teste rápido
permitiu o isolamento de Listeria spp. em 8 amostras e em 7 foi detectada a
presença de Listeria monocytogenes. Também foram avaliadas as condições de pH
e de atividade de água nas amostras contaminadas com espécies de Listeria.
Também avaliaram o TECRA Listeria Visual Immunoassay modificado que não
detectou a presença de Listeria spp. em 7 (46,2%) das amostras contaminadas
(BRANCO et al., 2003).
Estudo utilizando os testes imunoenzimáticos Listeria Visual Imunoassay
(Lis-VIA), Listeria Immunoprecipitate Assay (VIP®) e UNIQUE foram
comparados com métodos convencionais para detecção de L. monocytogenes em
produtos cárneos. O teste UNIQUE, apresentou, em geral, baixa capacidade de
detecção tendo melhor desempenho com amostras de presunto. Nas 16 amostras de
salsicha, o método clássico detectou presença de L. monocytogenes em todas as
amostras, porém, o VIP® detectou em 11 (68,8%), o Lis-VIA em 10 (62,5%) e o
teste UNIQUE detectou em 7 (43,8%) das amostras (Aragon-Alegro, 2004).
Kit API Listeria® (BioMérieux) é um teste imunoenzimático realizado no
sistema automático, conhecido como VIDAS®, para detecção de patógenos
alimentares. A detecção de Listeria monocytogenes utiliza anticorpos específicos.
Pode-se usar swabs estéreis para coleta de amostras de alimentos com suspeita de
contaminação. A amostra é adicionada ao meio de enriquecimento LPT Broth e
mantida a 30º por 30 horas. Após incubação da amostra são adicionados 5
microlitros do meio em barretes, que deve ser ligado durante cinco minutos para o
aquecimento. Em seguida aguarda-se esfriamento por dez minutos e assim
adicionar a amostra no barrete e proceder a análise que ocorre por sessenta e dois
minutos. O barrete contém anticorpos específicos fixos na parede em que é
colocada a amostra. Em seguida, adiciona-se anticorpo conjugado com fosfatase
18
alcalina seguido de lavagem. Após, adiciona-se substrato que reage com a enzima.
Em seguida, a luz ultravioleta incide sobre a amostra (370nm) e ocorre leitura
fluorescente automatizada a 450nm. Absorbância superior a 0,05 confirma a
presença de Listeria monocytogenes. Sensibilidade: 96.7%. Especificidade: 98.3%.
(ANEXO VII)
1.11.4. Testes por imunohistoquimica
No método de Imunohistoquímica realizado por Schwab e Edelweiss
(2003), observou que cinco dos dez blocos de placentas provenientes de abortos ou
partos prematuros ocorridos no ano de 2000 foram positivas para presença de
Listeria monocytogenes, indicando que essa bactéria pode ser encontrada nos fetos
mesmo depois de serem expulsos do ventre materno.
1.11.5. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
BAX System (DuPont®) é um sistema de PCR, com enriquecimento das
amostras por 24 horas no meio de cultura LEB. Durante o experimento, são usados
tubos de cluster específicos para o aparelho. Após incubação inicial, os reagentes de
lise são combinados e transferidos para tubos onde adiciona-se 50 µL da amostra
enriquecida e incuba por 30 minutos a 37 ° C. É adicionado protease ao buffer de
lise e cinco microlitros da solução lisada é transferida para os tubos de cluster que
são aquecidos a 55ºC por 30 minutos e 95º por 10 minutos. A solução é resfriada
por cinco minutos, e colocado no termociclador em aparelho que contém software
para a leitura dos resultados. Sensibilidade: 91.0%. Especificidade: 91.2%
(ANEXO VIII)
Envirologix DNAble® é um teste para detecção qualitativa do DNA de
Listeria monocytogenes como indicador da presença da bactéria na amostra. É uma
tecnologia isotérmica que permite amplificação de um alvo específico de DNA que
é detectado em tempo real e os resultados mostrados e interpretados em até 15
minutos com auxílio do Leitor DNAble®. São utilizados três produtos para permitir
a detecção qualitativa do DNA de Listeria monocytogenes: o caldo de
enriquecimento Oxoid Novel (ONE) para facilitar o crescimento de organismos; o
conjunto de Extração de Amostras DNAble® que inclui reagentes e protocolos para
preparação da amostra e agentes liofilizados para amplificação de DNA.
19
1.11.6 Testes imunocromatográficos
Para avaliarmos a sensibilidade dos testes imunocromatográficos é
importante conhecer a quantidade mínima de bactéria necessária para que apresente
positividade, porém a maior parte deles não informa. Brunelli et al. (2004)
descreveu um teste de imunocromatografia de fluxo lateral para detecção
qualitativa de L. monocytogenes em alimentos capaz de detectar o mínimo de 6,25
x 106 UFC/mL na amostra analisada, porém não informou a marca estudada.
BioControl VIP® para Listeria é um ensaio de imunocromatografia de
fluxo lateral que utiliza enriquecimento em meio de cultura e anticorpos específicos
para a detecção de Listeria sp. O fabricante alega ter sido validado para alimentos e
amostras ambientais mas não apresenta dados sobre a pesquisa e nem menciona a
sensibilidade e especificidade do teste (ANEXO IX).
O teste rápido produzido pela Merck® Singlepath® Listeria é um teste de
imunocromatografia de fluxo lateral que se baseia no enriquecimento da amostra
suspeita de contaminação com Listeria sp. É feito o enriquecimento inicial em meio
Fraser e logo após plaqueamento. Assim que é visualizado colônias suspeitas, deve-
se repicar a colônia e ressuspender em caldo seletivo (BHI ou PALCAM). Após
mudança na turbidez do meio (~ 18 horas) são pipetados 150µL nos cassetes
plásticos com 5 gotas do reagente de corrida e utilizado com amostra nos testes
rápidos. O resultado é visualizado após 30 minutos. Capacidade de detecção do
teste: 5 x 106 CFU/mL (ANEXO X).
1.14 Produção dos materiais microbiológicos para desenvolvimento de
testes
Mendonça et al. (2012) conseguiram produzir anticorpos monoclonais
(MAb) e policlonais específicos para Listeria monocytogenes. Dentre os anticorpos
produzidos, o MAb 2D12 anti-Internalina A obteve melhores resultados nos ensaios
de detecção. Assim como os policlonais anti-Internalinas A e B se mostraram
eficientes na detecção específica deste patógeno alimentar.
Na produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com
uma proteína recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes
inativadas por fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por
ELISA indireto, Western blot e imunofluorescência (MENDONÇA et al., 2012). O
MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi usado como anticorpo de detecção de
20
L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche de sensor de fibra óptica. Usando
MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras ópticas, obteve-se um limite de
detecção de ~3 x 102 CFU.mL, e um limite de detecção de ~1 x 10
5 CFU.mL-1 foi
visualizado com MAb-3F8 como captura. Os MAbs anti-InlA MAb-2D12 e anti-
Listeria MAb-3F8 foram posteriormente utilizados para sensibilizar esferas
paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS) de L.
monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog
artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas,
incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em ágar para contagem. Em paralelo, a
confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo em
tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para
separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de
fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de
aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em
queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do
MAb- 3F8 foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de
espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Isto significa que a utilização em
conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb- 3F8 foram
confiáveis e rápidos, podendo ser empregados em imunoensaios de rotina para
detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo, ambos possuem ainda
grande potencial para serem mais explorados em outras plataformas de
biossensores, assim como em outros imunoensaios de detecção e funcionalidade de
InlA e FBA em Listeria (MENDONÇA, 2011, MENDONÇA et al., 2012,
MENDONÇA et al., 2016).
1.15 Importância dos Testes rápidos
Métodos rápidos de diagnóstico, sensíveis e específicos, são ferramentas
valiosas para incrementar a detecção de agentes patogênicos em geral. Dentre os
métodos imunológicos para diagnóstico rápido, destacam-se o ensaio
imunoenzimático do tipo ELISA e o ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.
O ELISA apresenta além de rapidez na execução (3h em média), vantagens como a
possibilidade de automação, disponibilidade de reagentes quimicamente estáveis e
capacidade de analisar simultaneamente um grande número de amostras
(CHAICUMPA et al., 1995). Por sua vez, o ensaio imunocromatográfico de fluxo
21
lateral apresenta operação rápida e simples, com obtenção de resultados imediatos
(15 min), baixo custo e o não requerimento de técnicos qualificados ou
equipamentos sofisticados e caros (LIN et al., 2010; ZHANG et al., 2011). Este
método tem sido utilizado para o diagnóstico de muitas doenças contagiosas em
humanos e animais e para detecção de moléculas bioativas, hormônios, haptenos,
entre outros (HEESCHEN et al., 1998; WATANABE et al., 2001; LIN et al., 2010).
A presença de Listeria monocytogenes particularmente indica condições de
higiene críticas no processo de produção, com possibilidade da presença da bactéria
na sua forma patogênica. Contudo, o aumento na incidência de contaminação de
alimentos causada por L. monocytogenes implica também o incremento e busca por
métodos de detecção rápidos e confiáveis com o objetivo de prevenção da doença
(CDC, 2011).
Além destes fatores, os testes rápidos utilizam pequena quantidade e
variados tipos de amostra. Atualmente, os testes rápidos disponíveis visam a análise
de eletrólitos, avaliação do uso de drogas, análise de contaminação e/ou qualidade
dos alimentos, definição de gravidez, até no diagnóstico de diversas doenças
infecciosas, como sífilis, dengue e HIV. Apesar da simplicidade no uso dos testes, o
desenvolvimento é complexo. Há parâmetros a serem padronizados durante a
fabricação, tais como a escolha do melhor antígeno alvo, a concentração do
antígeno alvo, espessura da fita de nitrocelulose, espessura dos filtros absorventes,
o tipo de teste rápido (lateral flow, dipstick, ou dual path platform - DPP) entre
outros (MABEY et al., 2004; PAI et al., 2012)
1.16 Desenvolvimento dos testes rápidos
Para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico existem barreiras a
serem enfrentadas, destacando a disponibilidade de recursos. O desenvolvimento de
novas tecnologias diagnósticas deve incluir análise de desempenho do diagnóstico
em ambientes clínicos, a viabilidade operacional do teste, a padronização do
modelo do teste, além dos ajustes necessários para se assegurar a adoção e
execução efetiva do ensaio. Reconhecer estas barreiras é importante, para entender
a importância do desenvolvimento de tecnologias inovadoras que satisfaçam as
necessidades atuais e as emergentes de diagnóstico clínico (PRICE; KRICKA,
2007).
22
Alguns passos importantes devem ser tomados, desde a identificação do
antígeno ou anticorpo a ser reconhecido à otimização/padronização dos reagentes e
materiais que serão utilizados neste teste. Após desenvolver um protótipo, estudos
iniciais devem ser realizados para verificar se o alvo está sendo reconhecido, para
tanto, utilizando amostras conhecidas que permitam determinar a sensibilidade e a
especificidade do novo teste. Para determinar se o teste é viável, é preciso saber a
capacidade de detecção e os limites mínimos de concentração bacteriana que o teste
consegue detectar (LUPPA et al., 2011; PAI et al., 2012).
Os componentes de um teste imunocromatográfico rápido incluem:
almofada da amostra, membrana do conjugado, membrana de nitrocelulose,
almofada absorvente e o cassete. Durante o desenvolvimento do teste, parâmetros
devem ser avaliados para melhor escolha destes componentes (ver figura 2). A
almofada da amostra é responsável por absorver a amostra e a solução tampão de
corrida, portanto é necessário escolher a melhor espessura que viabilize esta
absorção e auxilie na retenção de possíveis elementos presentes na amostra que
possam interferir no teste (MILLIPORE, 2008; MILLIPORE, 2015).
Figura 2: Representação esquemática de um teste rápido de fluxo lateral.
MILLIPORE, 2008 (adaptado)
A membrana que absorve a solução de conjugado ouro coloidal-anticorpo
pode ser de microfibra de vidro ou poliéster, sendo responsável por manter a
estabilidade do conjugado e permitir sua liberação homogênea e reprodutível. Para
tanto, é necessário que o material escolhido para impregnar o conjugado, seja
bloqueado adequadamente. Um bloqueio heterogêneo resultará em liberação
ineficiente do conjugado (MILLIPORE, 2008; MILLIPORE, 2015).
23
O conjugado ouro coloidal-anticorpo deve permitir a formação de
imunocomplexo com a amostra em teste com base em suas propriedades físico-
químicas. O ouro coloidal possui capacidade de se ligar avidamente a outras
moléculas, como os anticorpos no processo de conjugação. Ao se ligar na linha
teste ou controle proverá uma coloração rubra, característica de positividade neste
tipo de teste. Portanto, a concentração e volume de conjugado impregnando a
membrana precisam ser definidos e padronizados (MILLIPORE, 2008;
MILLIPORE, 2015).
A membrana de nitrocelulose possibilita a fixação de proteínas utilizadas
como alvos, de detecção ou captura. Estas são impregnadas em regiões definidas,
a(s) linha(s) teste(s) e controle. O material é adequado para proporcionar fluxo
constante e homogêneo durante a passagem do complexo formado pela amostra e
conjugado, carreados pela adição de uma solução tamponada. Esta membrana pode
ser encontrada em diversas espessuras, uma membrana mais fina permite um fluxo
mais rápido e uma mais grossa um fluxo mais lento. Durante o desenvolvimento
será definida a velocidade necessária do fluxo, uma vez que um fluxo rápido
demais pode interferir na reação e formação dos imunocomplexos entre o antígeno
ou anticorpo sensibilizado e a amostra, inviabilizando a reação. Além disso, a
padronização da espessura da linha de sensibilização e a concentração destes
antígenos ou anticorpos serão definidas, levando em consideração a intensidade de
coloração obtida com amostras positivas (MILLIPORE, 2008; MILLIPORE, 2015).
A almofada absorvente é constituída de papel de celulose de alta
densidade/gramatura, responsável por absorver e reter o excesso da amostra/tampão
utilizados no teste. Definir o tamanho e espessura deste componente é importante
para que o fluxo do teste seja estimulado e para evitar que o excesso de líquido vaze
ou não seja corretamente absorvido ao final do fluxo (MILLIPORE, 2008;
MILLIPORE, 2015).
O cassete é a estrutura que comporta a tira do teste rápido e exerce pressão
em vários pontos proporcionando que o fluxo ocorra adequadamente. Uma pressão
inadequada pode bloquear a passagem da amostra e tampão da almofada da amostra
até a membrana de nitrocelulose (MILLIPORE, 2008; MILLIPORE, 2015).
Todos os componentes acima descritos ficam interligados pela sobreposição
dos materiais e são fixados por fita adesiva em um cartão plástico. A montagem
(figura 3) deve ser criteriosa, caso contrário, impedirá que a associação entre
24
amostra e conjugado e o fluxo na membrana ocorram adequadamente,
inviabilizando a utilização do teste que certamente não passará no controle de
qualidade (MILLIPORE, 2008; MILLIPORE, 2015).
Figura 3: Card adesivo e disposição dos componentes de montagem de um
teste rápido de fluxo lateral (MILLIPORE, 2008) (adaptado).
25
2 JUSTIFICATIVA
A listeriose é uma infecção grave que merece atenção especial dos órgãos
responsáveis porque é um sério problema de saúde pública, apresentando altas taxas
de mortalidade entre os indivíduos infectados e susceptíveis às infecções. O
reconhecimento e intensificação da fiscalização pelos órgãos reguladores e
indústria de alimentos são ações de grande importância para prevenir e controlar
casos e surtos de listeriose. Na Europa e nos Estados Unidos, é exigida a ausência
absoluta de L. monocytogenes em alimentos prontos para o consumo (WHO/FAO,
2004).
Os métodos disponíveis para o diagnóstico de Listeria incluem isolamento
da bactéria através de cultivo convencional usando métodos clássicos que tornam a
rotina para a detecção laboriosa e demorada (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001),
métodos imunológicos e/ou moleculares, normalmente complexos, de custo
elevado, requerendo equipamentos e pessoas treinadas (HUDSON et al., 2001).
Existem alguns kits comerciais baseados no ensaio imunocromatográfico de fluxo
lateral ou ELISA para diagnóstico rápido de listeriose, entretanto todos são
importados e de custo bastante elevado. Além disso, muitos deles apresentam
eficácia duvidosa, provavelmente porque os insumos utilizados são preparados com
antígenos ou cepas isoladas em outros países.
Durante a fase de replicação bacteriana dentro do organismo, é difícil
estabelecer imunidade humoral por conta do mecanismo de escape dificultando as
formas de diagnóstico da listeriose. Sendo assim, a utilização de um protótipo que
detecte a bactéria nos alimentos antes da ingestão, ajudaria no diagnóstico e na não
infecção das pessoas suscetíveis (GALLEGO et al., 2015).
O número de testes rápidos disponíveis no mercado internacional são
poucos e não existe nenhum teste desenvolvido no Brasil e com insumos também
desenvolvidos no território nacional. Portanto, o desenvolvimento de teste rápido
simples, baseado em imunocromatografia, que não requer equipamentos de leitura e
pode ser utilizado após treinamento rápido de qualquer pessoa, é uma boa opção
como ferramenta diagnóstica para doenças causadas por Listeria monocytogenes ou
para a identificação da presença deste patógeno em alimentos. Um teste simples
para auxiliar na prevenção da listeriose contribuiria para a queda nos índices de
mortalidade.
26
No Brasil, a legislação vigente exige a avaliação desse microrganismo
apenas em queijos de média e de alta umidade e para que esses alimentos estejam
próprios para o consumo, é necessária a ausência da bactéria em análise de
amostras de 25 g do produto. Porém, as análises não são obrigatórias para a maioria
dos alimentos. Com o desenvolvimento de um teste rápido, sensível, específico e
barato espera-se que o uso do teste pela indústria alimentícia seja incentivado,
resultando em segurança nos alimentos e consequentemente garantia de qualidade
para seus produtores e consumidores, aumentando a segurança dos produtos
colocados no mercado nacional.
27
3 OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Contribuir para a independência tecnológica na área de diagnóstico
laboratorial, melhorando o desenvolvimento e a disponibilidade de kits diagnósticos
para diagnosticar ou prevenir doenças consideradas prioritárias pelo Ministério da
Saúde.
3.2. Objetivos específicos
Desenvolver teste imunocromatográfico de fluxo lateral para detecção da
presença de Listeria monocytogenes em alimentos;
Determinar a capacidade de detecção do teste imunocromatográfico de fluxo
lateral utilizando amostras de culturas de L. monocytogenes e amostras de leite
artificialmente contaminadas com L. monocytogenes.
28
4 MÉTODOS
Este é um estudo de pesquisa aplicada, exploratória e experimental para o
desenvolvimento de um teste rápido para detecção de Listeria monocytogenes em
alimentos.
Em 2006, o laboratório de Imunologia Aplicada do Centro de
Desenvolvimento Tecnológico do Núcleo de Biotecnologia da Universidade
Federal de Pelotas (CDTec/Biotecnologia da UFPel), juntamente com o Laboratório
de Microbiologia de Alimentos da UFPel, iniciaram uma série de estudos visando o
desenvolvimento de testes rápidos de diagnóstico de listeriose e para a detecção da
presença de L. monocytogenes em alimentos. Com isso, permitiu a produção de
insumos biotecnológicos indispensáveis para a manufatura de testes rápidos de
diagnóstico para este patógeno (MENDONÇA, 2011; MENDONÇA et al., 2012).
Estudos preliminares, visando o desenvolvimento destes testes foram
iniciados no Laboratório de Imunologia da AIDS e Hanseníase (LIAH)/Laboratório
de Desenvolvimento de Testes Rápidos (LDTR)/Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP/ UFG) em 2014. Dos estudos preliminares participaram
Rodrigo Scaliante de Moura e Tatiana M. Galvez Sánchez. Tatiana intensificou os
estudos preliminares durante 3 meses, o que acelerou o processo de
desenvolvimento.
Utilizando a imunocromatografia, o teste deste estudo foi desenhado para
detecção direta de antígenos pelos anticorpos policlonais anti Internalinas A e B,
proteínas presentes somente na espécie L. monocytogenes, fixados na linha teste. Os
agentes de captura, anticorpos monoclonais (MAbs) anti-InlA (MAb-2D12)
específicos contra Listeria monocytogenes, foram conjugados ao ouro coloidal e
utilizados como marcador da reação antígeno-conjugado. Como amostra,
inicialmente foram utilizadas culturas de bactérias.
4.1 Cepas Bacterianas
Foram utilizadas cepas de L. monocytogenes, L. innocua, Enterobacter
cloacae, Bacillus cereus, que possuem capacidade de infectar alimentos,
similaridade com a bactéria alvo e ainda por serem linha de pesquisa do Dr.
Marcelo Mendonça. Todas as cepas de Listeria spp., os sorotipos de L.
29
monocytogenes e controles negativos foram cedidos pelo Laboratório de
Microbiologia de Alimentos da UFPel.
4.2 Cultivos Bacterianos
As bactérias recebidas em ágar Infusão de Cérebro-Coração (BHI) foram
mantidas em Caldo Fraser com glicerol a 20% em -20ºC durante a condução dos
experimentos e testagem dos kits. Os inóculos de culturas frescas de L.
monocytogenes e outras espécies de Listeria foram preparadas em caldo BHI, caldo
Triptona de Soja com 6% de extrato de levedura (TSB-YE) ou caldo de
Enriquecimento de Listeria (LEB) por aproximadamente 20 horas a 37oC em
agitador orbital (200 rpm). As outras bactérias não pertencentes ao gênero Listeria
foram cultivadas exclusivamente em caldos BHI e TSB-YE nas mesmas condições.
Os cultivos bacterianos foram realizados no Laboratório de Bacteriologia
Molecular (LBM) sob supervisão do Prof. Dr. André Kipnis, IPTSP/UFG.
4.3. Caracterização Bacteriana
Como metodologia de identificação morfológica e bioquímica para
avaliação, checagem de contaminação cruzada e confirmação das cepas, foram
realizados ensaios com a cepa analisada a cada experimento. Segundo a Norma ISO
11290-1:2017 da ANVISA, foram utilizados os caldos Demi-Fraser ou HalF-Fraser
e Fraser, além do ágar seletivo ALOA (Agar Listeria acc. da To Ottaviani &
Agosti). A fase confirmativa foi determinada usando fermentação de carboidratos
(Xilose e Raminose), presença de Beta-Hemólise (Ágar Sangue de Cavalo), Gram e
catalase, eletroforese em gel de poliacrilamida e utilização do equipamento VIDAS
para leitura e confirmação da presença da cepa de Listeria monocytogenes
plaqueada. Os ensaios foram realizados no Laboratório de Bacteriologia Molecular
coordenado pelo Dr. André Kipnis.
Um dos métodos mais usados para a visualização de bactérias Gram
positivas ou negativas é o método de coloração de GRAM. Como a Listeria é um
coco-bacilo Gram positivo, foi feito o método de coloração e posterior análise
microscópica da lâmina.
O ágar sangue contém vários nutrientes que a bactéria usa para o seu
crescimento. Como L. monocytogenes é uma bactéria promotora de hemólise, se as
30
hemácias presentes no ágar sangue forem lisadas, há presença de halo de inibição
ao redor das cepas caracterizando possível presença da mesma.
O ágar ALOA é um meio cromogênico seletivo usado na identificação de
Listeria monocytogenes em amostras de alimentos. A identificação ocorre por meio
da diferenciação de halos rodeando as colônias. A justificativa da presença de halo
de precipitação se dá pela caracterização do meio, em que baseia seu
funcionamento na combinação de substratos cromogênicos para detecção da
atividade de ß-glucuronidase comum a todas as espécies de Listeria e a da
fosfolipase presente especificamente em L. monocytogenes.
Foi realizado teste de fermentação de carboidratos que consiste na
inoculação da bactéria em dois caldos que são feitos em púrpura de bromocresol
base (indicador de pH acrescido com 0,5% do açúcar) a ser verificado, no caso
ramnose e xilose. A partir de tubos de caldo TSB, foi inoculado com alça nos tubos
de caldo púrpura base. Após 24 horas de incubação a 35ºC foi observado produção
de ácido, pela mudança de roxo pra amarelo. L. monocytogenes fermenta a ramnose
alterando a cor, mas, não fermenta a xilose deixando o tubo na cor púrpura.
O teste VIDAS® Listeria monocytogenes II é um teste qualitativo
automatizado, para ser utilizado nos aparelhos da família VIDAS®, que permite a
detecção específica de L. monocytogenes nos produtos alimentares e nas amostras
ambientais pela técnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). Essa técnica
consiste em várias etapas de aspiração e dispensação de meios líquidos no cone
situado dentro do aparelho e são utilizados para detecção da bactéria anticorpos
anti-Listeria. Na etapa final de revelação, o substrato (4-metilumbeliferil fosfato) é
aspirado e dispensado no cone, logo após a enzima do conjugado catalisa a reação
deste substrato obtendo um produto (4-metil-umbeliferona) sendo assim, a
fluorescência emitida é medida a 450 nm. Ao fim do teste, os resultados são
analisados automaticamente pelo aparelho que fornece um valor de teste para cada
amostra.
Para a exclusão de hipóteses de contaminação da amostra, reações
cruzadas nos testes rápidos e critérios de identificação bacteriana, a cada nova cepa
analisada, os testes confirmatórios foram realizados excluindo a leitura no
equipamento VIDAS® que foi feita apenas uma vez.
31
4.4 Eletroforese da cultura de L. monocytogenes para confirmação da
presença de proteína Internalina-A e Internalina-B em gel de
poliacrilamida a 10%
A integridade e a concentração da proteína internalina das bactérias
estocadas foram avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida à 10%, durante
40 minutos, a 80 volts (gel de empilhamento) e durante 1 hora, a 100 volts (gel de
corrida). Sob agitação constante, o gel foi posteriormente corado com solução de
Comassie Blue durante 1 hora e descorado por solução descorante durante 16 horas.
Para o desenovelamento da proteína internalina-A antes de serem aplicadas no gel,
as amostras foram submetidas a aquecimento de 100ºC, durante 5 minutos. Foram
utilizadas três cepas de Listeria monocytogenes, uma cepa de Listeria innocua, uma
cepa de Enterobacter e uma cepa de Bacillus cereus, e para referência da proteína
internalina-A e internalina-B de 80 e 50 kDa, respectivamente, foi utilizado padrão
molecular - Precision Plus ProteinTM Standards All Blue/BIO-RAD Lote: #161-
0373.
4.5 Determinação da correlação entre turbidez de cultura de L.
monocytogenes e concentração bacteriana
Foi utilizada uma alíquota da cepa de Listeria monocytogenes ATCC 7644
cultivada em meio TSB e conservadas a -20ºC com glicerina para conservação.
Foram realizados testes para correlacionar a concentração bacteriana contida no
meio TSB com a turbidez de cultura obtida através de leitura de densidade ótica em
espectrofotômetro. Para tanto, 50uL da cepa congelada foi retirada e adicionada ao
caldo TSB e colocada na estufa 37ºC sob agitação de 200rpm e deixado por 20
horas. Ao final da incubação, 500uL foram retirados e transferidos para 20mL de
caldo TSB os quais foram incubados em estufa com agitação foi deixado por 10
horas. A cada 2 horas, 1mL era retirado da cultura e procedido leitura no
espectrofotômetro em comprimento de onda de 600nm para obtenção da densidade
ótica do caldo com bactéria. Ao mesmo tempo foram retirados 5uL da cultura e
transferidos para um tubo contendo 500uL de meio TSB, correspondendo a uma
diluição 1:100 (10-2
). Desta diluição, foram transferidos 5uL para outro tubo
contendo 500uL de meio TSB, correspondendo a uma diluição 1:10.000 (10-4
).
32
Cinquenta microlitros de cada uma das diluições seriadas (10-2
e 10-4
) semeados
placas contendo meio TSA com auxílio da alça de drigalski. As placas foram
incubadas durante a noite a 37oC e no dia seguinte as colônias crescidas em cada
placa foram quantificadas. A determinação da concentração de unidade formadoras
de colônias por mL (UFC/mL) de cultura foi determinada usando a seguinte
fórmula: UFC/mL = N x FD x 200, onde N corresponde ao número de colônias da
placa, FD o inverso da diluição usada para semear a placa e 20 o fator de correção
do volume semeado (1000 µL/50µL). Os valores de UFC/mL obtidos em cada
momento da cultura foram plotados no eixo Y de um gráfico Excel e usando-se a
densidade ótica lida em cada momento como no eixo X. Com os dados inseridos no
gráfico, foi calculado a correlação entre as variáveis UFC/mL e OD da cultura
através de regressão linear, que permitiu determinar uma equação de reta para ser
usada posteriormente nas demais culturas de Listeria monocytogenes para
determinar a concentração celular em UFC/mL a partir da leitura da densidade ótica
da cultura.
4.6 Anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes
Foram utilizados na produção dos kits anticorpos monoclonais produzidos
pelo Laboratório de Imunologia Aplicada da UFPel. O MAb-2D12 contra a
proteína internalina A e policlonal contra internalina B de L. monocytogenes foram
utilizados para elaboração do sistema de fluxo lateral (MENDONÇA et al., 2012).
Anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes foram cedidos pelo Laboratório
Imunologia Aplicada do Núcleo de Biotecnologia – UFPel.
4.7 Preparo de partículas de ouro coloidal
Foram produzidas nanopartículas de ouro coloidal de 40nm a partir de
protocolo padronizado no LIAH/LDTR-IPTSP/UFG. As partículas de ouro coloidal
são produzidas com o uso de solução de cloreto áurico que após etapas de
aquecimento e resfriamento, a solução obtida é mantida ao abrigo da luz e posterior
leitura em espectrofotômetro e leitor de nanopartículas. Para garantir a integridade,
tamanho e qualidade das partículas, são realizadas leituras em espectrofotômetro,
no intervalo de 400 a 600nm. O pico de leitura e a absorbância devem estar entre
33
524 e 526nm e 1,2 e 1,3 O.D., respectivamente. O tamanho e a porcentagem de
partículas de ouro neste, é confirmado em leitor de nanopartículas (Zetasizer
Malvern®). Nestas condições, a solução de ouro coloidal produzida foi então
armazenada a 4ºC protegida da luz para posterior conjugação com anticorpos.
4.8 Conjugação do ouro coloidal à anticorpos
Para a produção do conjugado, foi utilizado protocolo padronizado no
LIAH/LDTR-IPTSP/UFG. A partir do ouro coloidal 40nm foi realizada a
conjugação aos anticorpos murinos MAb 2D12. A conjugação de anticorpos ao
ouro coloidal ocorre a partir do momento em que a solução de ouro coloidal a 40nm
está pronta. Reagentes específicos para a conjugação são produzidos e após etapas
de centrifugação, o precipitado obtido é submetido à leitura no espectrofotômetro.
Para verificar a qualidade da conjugação foi realizada leitura em espectrofotômetro
no intervalo de 450 a 650nm. O conjugado utilizado apresentou valores entre 528 e
530nm, com O.D. de aproximadamente 0,3. Nestas condições, o conjugado está
pronto para ser impregnado na membrana de fibra de vidro do conjugado.
4.9 Padronização dos protótipos
Os componentes utilizados na padronização dos protótipos foram: (1)
membrana de nitrocelulose e papel absorvente da amostra, (2) concentrações do
anticorpo Policlonal anti-Internalina-A e B na sensibilização da nitrocelulose, (3)
bloqueio da membrana do conjugado (4) concentração do conjugado MAb 2D12
para impregnação na fibra de vidro.
4.9.1 Padronização da membrana de NC e filtro absorvente da
amostra
Para verificar a velocidade do fluxo da passagem dos fluidos na NC e a
liberação da amostra, após adição do tampão no papel absorvente, uma membrana
de NC e duas espessuras da almofada da amostra foram escolhidas para ser
testadas. Como a velocidade de corrida influencia diretamente no resultado do teste,
foram considerados o tempo necessário para ocorrer a formação do complexo
conjugado-antígeno e a absorção da amostra, pois a espessura do papel absorvente
pode impedir a passagem do fluido. Foram utilizadas três combinações, sendo
34
utilizada uma densidade de membrana de NC (HF 135) e três espessuras de
almofada da amostra (1660, 1661 e 1662). Nesta fase da padronização foi utilizada
cepa pura de Listeria monocytogenes em caldo TSB e solução tampão.
4.9.2 Padronização da quantidade de amostras, volume a ser
usado nos testes e estimativa do tempo de leitura
A princípio, para definir a quantidade ideal de amostra a ser colocada,
foram testados quatro volumes da amostra de Listeria monocytogenes. Como não
foi observada diferença na mudança da intensidade de coloração da linha teste,
modificamos a quantidade de amostra a ser colocada (5µL, 10µL, 15µL e 20µL),
optamos por usar o buffer a 130µL. Os protótipos com as quantidades 15µL e 20µL
apresentaram intensidade de coloração aceitável na proteína A e foram escolhidas
para o desenvolvimento dos experimentos nos protótipos.
Para o tempo de leitura, momento em que o profissional irá definir o
resultado do teste rápido foram considerados 10 e 20 minutos. Nesta fase, foram
utilizadas amostras de bactérias com meio de cultura.
4.9.3 Bloqueio da membrana do conjugado
O bloqueio eficaz da membrana do conjugado evita que ocorram ligações
inespecíficas de outros componentes além do conjugado. Foi utilizada solução de
bloqueio contendo Trizma Sigma® (Lote 31K54339), BSA Sigma® (Lote
SLBK0462V), Tween 20 (Lote 822184) e água Milli-Q. Quando a fibra de vidro é
bloqueada é iniciado a preparação para o spray do conjugado. Foi usado
monoclonal anti-Internalina MAb 2D12 (1,36mg/mL) para produção do conjugado.
4.9.4 Escolha da concentração do conjugado
Durante o processo de impregnação do conjugado na membrana de fibra de
vidro, duas concentrações foram testadas (6µL e 12µL) utilizando o XYZ Airjet
3050 Dispenser®, com a finalidade de verificar a quantidade de conjugado mais
adequada e suficiente para interação entre a amostra e as linhas teste e controle.
Nesta fase da padronização foi usado anticorpo monoclonal anti-Internalina MAb
2D12 1,36mg/mL.
4.9.5 Padronização do tipo de amostra a ser testado
35
Após o enriquecimento com Meio TSB, as bactérias foram centrifugadas a
sete mil rotações por minuto (RPM) durante cinco minutos. Foi adicionado 200 µL
de PBS 1x e procedida nova centrifugação. Foram feitas duas, três e quatro
lavagens e a cada lavagem, as bactérias foram testadas nos cassetes com teste
rápido de diagnóstico.
Tendo em vista que o tamanho da Listeria poderia influenciar na capacidade
de detecção do teste, podendo dificultar a interação dos reagentes e a passagem
pelas fibras da NC, usamos bactérias sonicadas e inteiras. No processo de
sonicação, foram realizadas três séries de um minuto de sonicação e um minuto de
descanso. O processo foi feito com todos os isolados do estudo.
4.9.6 Padronização das concentrações de Anticorpos Policlonais Anti
Internalina A e Anti Internalina B
Para avaliarmos o desempenho dos anticorpos policlonais anti Internalina A
e B, sensibilizamos na linha teste os anticorpos nas concentrações de A, B, C e D
para Poli anti-InlA e, B, C, D e E para Poli anti-InlB.
4.10. Composição do teste rápido de detecção de Listeria
O teste é composto por uma fita de nitrocelulose (NC) para detecção. Esta
fita é composta por uma extremidade contendo uma zona receptora de amostra
constituída por fibra de celulose e uma membrana do conjugado contendo os
anticorpos IgG anti-Internalina ligados ao ouro coloidal, e na outra extremidade por
uma zona de absorção. O anticorpo policlonal anti Internalina, específico da
bactéria, é impregnado na forma de uma linha na membrana de nitrocelulose e atua
como agente de captura. Proteína A é impregnada em linha posterior paralela à do
antígeno e funciona como controle validando a reatividade do conjugado. A
composição é apoiada por um suporte e cortada em fitas de cinco mm de largura
para encaixar no cassete plástico. O cassete utilizado possui um receptáculo circular
posicionado sobre a almofada da amostra, onde se aplica a amostra e uma janela
retangular posicionada sobre a área de leitura.
36
4.11. População de estudo utilizada para o desenvolvimento e avaliação dos
testes
Na padronização da concentração de antígeno na linha teste foram utilizadas
cepas de Listeria monocytogenes ATCC 7644 e 19117 como controles positivos e
Listeria innocua CLIP 12612, Enterobacter cloacae e Bacillus cereus como
controles negativos (ver Tabela 1). Ressaltando que todas as cepas, antes do uso,
estavam em Ágar TSA-YE e Ágar Conservação.
4.12. Protocolo de preparo das amostras das culturas de bactérias em
amostras de leite
Para os testes usando amostras de leite foram procedidas dez diluições
seriadas utilizando 800µL de leite e 200µL de cultura de bactéria em meio TSB na
concentração de 5 x 1011
UFC/mL, como mostra a figura 4. Cento e trinta
microlitros de cada diluição seriada foram testados nos protótipos de testes
sensibilizados a 1mg/mL.
Figura 4: Esquema de diluição seriada com amostras de leite contaminadas
experimentalmente com Listeria monocytogenes.
200µL 200µL 200µL 200µL
800µL
Leite
800µL
Leite
800µL
Leite 800µL
Leite
800µL
Leite
Controle
Negativo 100 10
-1 10
-2 10
-3 10
-4
37
Tabela 1. Lista de bactérias cultivadas para uso no estudo
* ID = identificação das amostras
Todas as cepas acima foram acondicionadas em freezer -20ºC em eppendorfs identificados, no
Laboratório de Bacteriologia Molecular
4.13. Protocolo de execução do teste
Foram adicionados 20μL de amostra, e 130μL de tampão para iniciar o
fluxo do teste. Neste procedimento observa-se o fluxo através de uma linha de
coloração rubi movendo-se em direção das linhas teste e controle. A leitura dos
resultados foi realizada visualmente após vinte minutos.
4.14. Interpretação do teste;
O resultado do protótipo é validado se houver coloração da linha controle.
Quando a linha teste corar o teste é positivo, indicando a presença de Listeria
monocytogenes, detectada pelo anticorpo monoclonal MAb 2D12 conjugado ao
Amostras ID* n Conservados à - 20ºC
Listeria monocytogenes ATCC 7644 1A 1 Ágar TSA-YE
Listeria monocytogenes ATCC 7644 1B 1 Ágar Conservação
Listeria monocytogenes ATCC 19117 2A 1 Ágar TSA-YE
Listeria monocytogenes ATCC 19117 2B 1 Ágar Conservação
Listeria innocua CLIP 12612 3A 1 Ágar TSA-YE
Listeria innocua CLIP 12612 3B 1 Ágar Conservação
Listeria innocua SP8 (isolado UFPel) 4A 1 Ágar TSA-YE
Listeria innocua SP8 (isolado UFPel) 4B 1 Ágar Conservação
Enterobacter cloacae 5A 1 Ágar TSA-YE
Enterobacter cloacae 5B 1 Ágar Conservação
Bacillus cereus ATCC 11778 6A 1 Ágar TSA-YE
Bacillus cereus ATCC 11778 6B 1 Ágar Conservação
Total 12
38
ouro coloidal e capturada pelo policlonal Anti-Internalina na linha teste. O
resultado negativo é indicado pela ausência da linha teste (BÜHRER-SÉKULA et
al., 2003).
39
5 RESULTADOS
5.1. Culturas de Listeria monocytogenes
As cepas de L. monocytogenes foram incubadas em meio TSB por 20
horas e ao final da incubação foi observado que dependendo do tempo de cultivo e
quantidade do inóculo o crescimento das cepas difere como pode ser avaliado
qualitativamente pela turbidez distinta visualizada nas amostras 3 e 6 em
comparação com as amostras 4 e 5. (Figura 5)
Figura 5: Culturas de Listeria monocytogenes crescidas em caldo TSB por 20
horas em estufa shaker 37°C +/-1
5.2. Testes confirmatórios para identificação de Listeria
monocytogenes
As cepas usadas no presente estudos foram submetidas a testes
bioquímicos para confirmação da espécie de Listeria monocytogenes. As culturas
foram analisadas pela coloração de Gram para verificar a morfologia e tipo de
coloração assim como testadas para as provas bioquímicas de fermentação da
ramnose e fermentação da xilose (figura 6). Como esperado para a espécie, as cepas
se apresentaram na morfologia de coco-bacilo Gram positivo (figura 7),
fermentadoras de ramnose e incapazes de fermentar a xilose. Adicionalmente foi
analisada a capacidade de lise das hemácias presentes no meio Ágar sangue (figura
8), pela presença de colônias em meio ALOA cor azul apresentando halo de
40
precipitação opaco (figura 9). Finalmente a identificação de Listeria
monocytogenes foi confirmada pelo ensaio VIDAs (Anexo I).
Cultivos de bactérias sonicadas foram analisados por eletroforese em gel
poliacrilamida a 10% e pressupondo ser a presença de bandas de massa aparente
compatíveis com bandas das proteínas internalina-A e internalina-B características
de 80 e 65 kDa, respectivamente.
Figura 6 A: Tubos contendo 5mL de meio TSB, controles Negativo e Positivo.
Tubo límpido contendo apenas o meio (Controle Negativo) e Tubo turvo
contendo cepa de Listeria monocytogenes. B: Tubos Xilose e Ramnose
indicando não fermentação da xilose tornando o meio roxo e fermentando a
ramnose deixando o meio amarelo, sugerindo presença de Listeria
monocytogenes.
A B
41
Figura 7: Microscopia ótica objetiva de 1000x mostrando coco-bacilos Gram-
positivos, sugerindo presença de Listeria monocytogenes.
Figura 8: Ágar Sangue de Cavalo sem presença de bactérias formadoras de
beta-hemólise e Ágar Sangue de Cavalo com presença sugestiva de Listeria
monocytogenes com beta-hemólise
42
Figura 9: Ágar ALOA com crescimento sugestivo de Listeria monocytogenes
em 12 horas (Figura A) e crescimento de 48 horas com presença de halo ao
redor das colônias (Figura B)
5.3. Preparo dos protótipos
5.3.1 Produção do ouro coloidal
Na produção de ouro coloidal a 20nm, 97% das partículas estavam a 22nm
(Figura 10). Na produção de ouro coloidal a 40nm 95% das partículas estavam a
40,64nm. (Anexo II)
5.3.2 Conjugação de anticorpo MAb 2D12 ao ouro coloidal
Para a conjugação com anticorpos, foi observado pico entre 450 a 650nm,
com absorbância de 0,607. A concentração do MAb 2D12 sensibilizado na fibra de
vidro foi preparada nas concentrações X* e Y*. * informações confidenciais
(Anexo II)
43
Figura 10: Etapas de produção de ouro coloidal de 20nm e 40nm.
5.3.3 Sensibilização das membrana de nitrocelulose
Anticorpos policlonais Anti InlA e Anti InlB foram sensibilizados em NC
utilizando cinco concentrações, representadas pelas letras de A* a E*.
Foi detectada presença em amostras de Listeria monocytogenes nos
protótipos sensibilizados com Poli Anti-InlA e Poli Anti-InlB. O volume escolhido
para as análises foi de 20µL.(Figura 11)
Figura 11: Resultado em duplicata de protótipo com Conjugado MAb 2D12
concentração X, e linha teste Poli Anti-InlB concentração D. Amostra Listeria
monocytogenes ATCC 7466.
5.4 Avaliação do desempenho dos lotes de Poli Anti-InlA e Poli Anti-
InlB
O desempenho dos lotes de policlonais foram avaliados nos testes rápidos
usando cultura de L. monocytogenes com duas lavagens em PBS. (Figura 12 e 13)
44
Figura 12: Avaliação do desempenho de lotes e concentrações de Poli Anti InlB
nas concentrações B, C e D. Conjugado MAb2D12 concentração X – Amostras
Listeria 1 A e 1 B com 2 lavagens de PBS
Figura 13: Avaliação do desempenho de lotes e concentrações de Poli Anti InlA
nas concentrações A, B, C, D. Conjugado MAb2D12 concentração X –
Amostras Listeria 1 A e 1B com 2 lavagens de PBS 1X
Observou-se que testes sensibilizados com de Poli anti-InlB na
concentração D detectaram a presença de L. monocytogenes. Os testes
sensibilizados com Poli anti-InlA não detectaram a presença da bactéria (Figura
12).
Como critérios de escolha final, optamos pelo protótipo: utilizando InlB
como agente de captura com detecção comprovada pela visualização da linha teste,
InlB 1 A concentr. B
InlB 1 B concentr. B
InlB 1 A concentr. C
InlB 1 B concentr. C
InlB 1 A concentr. D
InlB 1 B concentr. D
InlA Lm 1 A concentr. A
InlA Lm 1 B concentr. A
InlA Lm 1 A concentr. B
InlA Lm 1 B concentr. B
InlA Lm 1 A concentr. C
InlA Lm 1 B concentr. C
InlA Lm 1 A concentr. D
InlA Lm 1 B concentr. D
45
com agente de detecção sendo liberado completamente da fibra de vidro, sem
ocorrência de ligações inespecíficas, sendo a leitura realizada após 20 minutos.
Os controles negativos (Listeria innocua, Bacillus cereus e Enterobacter
cloacae) foram testados em 100% dos protótipos de Poli anti-InlA e Poli anti-InlB,
a linha teste não apresentou coloração em nenhum deles, confirmando a
especificidade dos anticorpos utilizados no desenvolvimento do teste.
5.5 Estudo de processamento visando melhora na detecção da bactéria
5.5.1 Sonicação
A sonicação das amostras bacterianas não melhorou a intensidade da
banda nos protótipos de teste rápido. (Figura 14)
Figura 14: Teste com Listeria monocytogenes após processo de sonicação da
cultura. Testes Poli Anti-InlB concentração D e Conjugado concentração X.
5.5.2 Lise bacteriana
Com o uso de tampão fosfato de potássio para lise bacteriana, não foi
observado melhora na intensidade da coloração da linha teste dos protótipos.
(Figura 15)
Figura 15: Teste com Listeria monocytogenes após uso de tampão fosfato de
potássio na cultura. Testes Poli Anti-InlB concentração D e Conjugado
concentração X.
5.5.3 Lavagem
Uma vez que o meio de cultura possui fatores que podem atrapalhar a
detecção, foram realizadas lavagens com PBS no intuito de purificar a amostra.
(Figura 16)
Figura 16: Avaliação do desempenho de lotes e concentrações de Poli Anti
InLB na concentração D. Conjugado MAb2D12 concentração X – Amostras
Listeria 1B com lavagens de PBS 1X.
46
Após os processos, de lise bacteriana (sonicação), uso de solução fosfato
de potássio ou lavagem, não foi observada melhora na capacidade de detecção do
teste. (Figura 16)
5.5.4 Conjugado – aumento da concentração de conjugado
Com o objetivo de aumentar a capacidade de detecção do teste, foi decidido
testar com Listeria monocytogenes e avaliar se a mudança na concentração do
conjugado MAb-2D12 sensibilizado na fibra de vidro melhoraria o desempenho do
teste. A concentração de conjugado Y corresponde ao dobro da X, observamos que
a concentração mais elevada não melhorou o desempenho do teste. (Figura 17 e 18)
Figura 17: Amostra Lm 1B controle positivo detectada na concentração
Conjugado – MAb2D12 concentração X.
Figura 18: Amostra Lm 1B controle positivo fracamente detectada após o
aumento de Conjugado – MAb2D12 concentração Y.
5.6 Capacidade de detecção do teste
Para determinar o limite mínimo de detecção da presença de L.
monocytogenes na amostra pelo teste, foi determinado primeiro uma correlação
entre a turbidez de cultura de bactérias e concentração em Unidades Formadoras de
Colônia por mL (UFC/mL). Para tanto o crescimento de uma cultura de L.
monocytogenes foi monitorada através da leitura da densidade ótica e ao mesmo
tempo diluições seriadas de cada tempo foram plaqueadas em meio TSA e as
colônias crescidas foram quantificadas para determinar o UFC/mL da cultura em
cada tempo. Os resultados obtidos (Tabela 2) foram usados para construção de uma
reta após plotagem em gráfico e determinação da regressão linear da reta (Gráfico
1). A equação da reta obtida pela regressão linear foi usada para determinar a
concentração das amostras de cultura de L. monocytogenes obtidas por
espectrometria.
47
Tabela 2. Correlação entre turbidez e UFC/mL de cultura de L. monocytogenes
** UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por mL
Gráfico 1: Curva bacteriana baseada no crescimento da bactéria mediante a
turbidez do meio de cultura e a contagem de Unidades Formadoras de
Colônias / mL.
Foi visualizado resultado positivo até a nona diluição, com cultura D.O
1,381 com fator de diluição 1:5, correspondendo a diluição 1:9.765.625. Portanto, a
capacidade de detecção do teste sensibilizado com Poli Anti InlB na concentração
D é 2 x 104 UFC/mL (Figura 19).
Horário Densidade Ótica
(nm)
Colônias
isoladas
UFC/mL**
(10-9
)
6 horas 0,318 3408 6 x 109
8 horas 0,416 4720 9 x 109
10 horas 0,528 7152 10 x 109
48
Figura 19: Resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com amostra Lm
1B ATTCC 7644, cultura D.O. 1,381. Protótipos Poli Anti InlB concentração
D – Conjugado MAb 2D12 concentração X.
5.7 Capacidade de detecção em amostras de leite contaminadas com
Listeria monocytogenes
Utilizando cultura da amostra Lm 1B ATCC 7644, cultura D.O. 1,270,
diluição seriada com fator 1:5, foi observado positividade até a nona diluição,
correspondendo a 1:9.765.625. A capacidade de detecção do teste sensibilizado na
concentração D foi de 1 x 105 CFU/mL (Figura 20).
Figura 20: Resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com amostra de
leite contaminada com Lm 1B ATTCC 7644, cultura D.O. 1,270. Protótipos
Poli Anti InlB concentração D – Conjugado MAb 2D12 concentração X.
5 x 1010
UFC/mL
1 x 1010
UFC/mL
2 x 109 UFC/mL
4 x 108 UFC/mL
8 x 107 UFC/mL
1 x 107 UFC/mL
3 x 106 UFC/mL
6 x 105 UFC/mL
1 x 105 UFC/mL
2 x 104 UFC/mL
5 x 103 UFC/mL
4 x 1010
UFC/mL
9 x 109 UFC/mL
1 x 109 UFC/mL
3 x 108 UFC/mL
7 x 107 UFC/mL
1 x 107 UFC/mL
3 x 106 UFC/mL
6 x 105 UFC/mL
1 x 105 UFC/mL
5 x 104 UFC/mL
49
Os controles negativos (Listeria innocua, Bacillus cereus e Enterobacter
cloacae,) foram testados nos protótipos de Poli anti-InlA e Poli anti-InlB nas
mesmas concentrações e em condições semelhantes às culturas positivas. A linha
teste não apresentou coloração em nenhum deles, confirmando a especificidade dos
anticorpos utilizados durante o desenvolvimento do teste. (Figura 21)
Figura 21: Exemplo dos resultados obtidos em diluição seriada, fator 1:5, com
controle negativo Listeria innocua, Enterobacter cloacae e Bacillus cereus
cultura D.O. 0,830. Protótipos Poli Anti InlB concentração D – Conjugado
MAb 2D12 concentração X.
Objetivou-se desenvolver um teste rápido e de fácil execução, sendo assim,
foi definido utilização de amostras sem lavagem, utilizando o Poli Anti-InlB como
agente de captura e MAb 2D12 como agente de detecção. O protótipo foi capaz de
detectar uma fração de bactérias presentes na amostra de 2 x 104 CFU/mL,
capacidade mínima para a detecção do teste de imunocromatografia de fluxo lateral
desenvolvido neste estudo.
50
6 DISCUSSÃO
Alimentos contaminados por Listeria monocytogenes podem provocar
infecção de caráter agudo grave, e em muitos casos levando pacientes imuno
deprimidos, a óbito e aborto em grávidas. A listeriose é uma doença de difícil
diagnóstico que depende da clínica do paciente associada a dados epidemiológicos
e investigação alimentar. Portanto, o desenvolvimento de um teste rápido e simples,
visando a implementação de controle de qualidade dos alimentos, pode ser de
grande valor. Testes rápidos possuem vantagens e desvantagens, porém, neste caso
um teste aplicável deverá ter sensibilidade elevada para detectar uma fração mínima
de bactérias por grama/mililitros de alimento, ser de fácil manuseio e aplicação, não
necessitar de técnicos especializados, ser específico para o alvo em questão, e ser
rápido.
Para o desenvolvimento do teste por imunocromatografia foram cultivadas
diversas cepas de Listeria. Como controle de qualidade das cepas utilizamos os
ensaios clássicos para detecção de L. monocytogenes e observou-se que
apresentaram positividade em todos os testes. Seguindo a Norma da ANVISA, as
amostras também foram positivas confirmando que eram culturas puras de L.
monocytogenes. Além disto, a presença de internalina-A e internalina-B nas
bactérias cultivadas foi observada através de bandas de peso molecular semelhante
por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%. Observamos que o tempo gasto,
nos procedimentos de identificação através dos métodos convencionais de detecção
da bactéria, é muito superior ao tempo na realização de testes rápidos, o que
confirma a necessidade de metodologia mais descomplicada para a detecção de
Listeria em alimentos.
Observamos que todos os protótipos, utilizando o policlonal Anti InlB
como agente de captura, apresentaram positividade para detecção de L.
monocytogenes. Porém, não foi encontrada positividade nos protótipos com
policlonal Anti InlA como agente de captura. Esta ausência de ligação talvez possa
ser explicada pelo fato do agente de detecção ser o monoclonal MAb 2D12,
específico para a proteína InlA. Sendo que usando o policlonal Anti InlA, na linha
teste, tanto o agente de detecção quanto o de captura tinham como alvo a mesma
proteína, fato que pode ter ocasionado competição ou impedimento espacial.
51
Ausência desta competição pode ser a razão pela qual, ao combinarmos no
protótipo anticorpos policlonais anti-InlB e monoclonais anti InlA, foram
observados resultados positivos. Não foi possível testarmos esta hipótese pois um
monoclonal anti InlB não está disponível. Como a InlA está em abundância na
bactéria, as chances de detecção talvez poderiam ser aumentadas.
Visto que reações inespecíficas são um dos problemas enfrentados no
processo de desenvolvimento de testes, foram cultivadas como controle Listeria
innocua, Bacillus cereus e Enterobacter cloacae, por apresentarem semelhança à L.
monocytogenes. Os protótipos testados não apresentaram nenhum resultado falso
positivo quando testados com culturas destas bactérias. Porém ainda será necessário
ampliar o número de controles negativos para avaliarmos melhor a especificidade
do protótipo desenvolvido, a exemplo dos resultados obtidos em estudo realizado
com amostras de produtos cárneos avaliando o teste UNIQUE, que demonstrou
apresentar resultados falso positivo.
Tentamos aumentar a capacidade de detecção do teste com aumento da
concentração de conjugado, procedimento que não resultou em melhor
desempenho, observado pela ausência de aumento na intensidade de coloração da
linha teste.
Para avaliar as condições ideais de execução do teste, foi estudada a
influência da lavagem prévia das culturas de Listeria, na capacidade de detecção do
teste através da positividade. Observa-se que a sensibilidade é reduzida quando
aumentamos o número de lavagens das amostras. Utilizando cultura de L
monocytogenes sem lavagem observamos intensidade de coloração semelhante à
amostra com uma lavagem, o que é uma vantagem para a comercialização dos
testes, pois a necessidade de lavagens das amostras seria um passo a mais na
execução do mesmo. Já a ausência de positividade após três e quatro lavagens
provavelmente indica queda no número de bactérias na amostra testada, ficando em
número menor que a capacidade de detecção do teste.
A tentativa de aumento de resposta por lise bacteriana, através de
sonicação ou uso de tampão, não apresentou melhora na positividade dos
protótipos. Fator positivo para a execução do teste, pois acrescentaria mais uma
etapa em sua execução.
Com a adição do leite artificialmente contaminado, mimetizando o uso do
teste em amostra de leite, o tempo de corrida aumentou. Este aumento provocou a
52
apresentação de manchas densas avermelhadas com um arraste do conjugado.
Provavelmente os componentes contidos no leite influenciaram negativamente na
execução do teste. Mais experimentos deverão ser realizados para otimizar o fluxo,
como por exemplo a utilização de uma membrana de nitrocelulose com malha
menos densa. Portanto, estima-se que a técnica possa ser aperfeiçoada sem perda da
capacidade de detecção do teste.
A capacidade que o protótipo possui em detectar a presença de L.
monocytogenes depende da quantidade desta na amostra. Portanto conhecer a
menor quantidade bacteriana, necessária para o teste positivar determina a
capacidade de detecção deste. Para o protótipo linha teste Poli Anti-InlB e
conjugado MAb2D12, o limite mínimo de bactérias para detecção foi de 2 x 104
UFC/mL. Quando o protótipo foi testado com amostras de leite contaminadas
experimentalmente a capacidade de detecção aumentou o número de bactérias
necessárias para 1 x 105 UFC/mL.
O teste desenvolvido, utiliza o mesmo princípio que o teste de Brunelli et
al. (2004) porém apresenta um limite de detecção mais baixo, ou seja, necessita de
menos bactérias presentes. Embora esta capacidade de detecção seja superior a de
Brunelli, ainda precisamos melhorar o protótipo pois, para causar doença, é
suficiente que os alimentos estejam contaminados por 102 a 10
9 UFC/mL
(MCLAUCHLIN et al., 2004; JEMMI; STEPHAN, 2006).
O protótipo desenvolvido, além de ter uma capacidade de detecção
superior em relação ao teste da Merck, detecta a presença de L. monocytogenes e
não apenas Listeria spp.. Portanto, é esperado que a médio prazo o teste possa ser
utilizado em pesquisas e avaliações relacionadas a detecção de L. monocytogenes
em alimentos.
53
7 CONCLUSÕES
Foi escolhido protótipo baseado no desempenho e capacidade de detecção
utilizando Poli Anti-InlB associado ao MAb-2D12. O protótipo não apresentou
ligações inespecíficas e o tempo de corrida está dentro dos parâmetros almejados.
Foi observada uma variação na intensidade de coloração que está relacionada com a
capacidade de detecção do teste e a quantidade de bactérias na amostra examinada.
Também foi observado que o tratamento e/ou manipulação da amostra interferem
nitidamente na positividade. Portanto, foi desenvolvido um teste rápido baseado em
imunocromatografia que permite a detecção de Listeria monocytogenes em
alimentos com limite de detecção mínimo de 2 x 104 UFC/mL a 1 x 10
5 UFC/mL,
observados, respectivamente, em amostra de cultura e leite artificialmente
contaminado..
O protótipo desenvolvido apresenta potencial significativo para ser
utilizado como ferramenta qualitativa rápida, útil e específica para a detecção da
presença de L. monocytogenes pelo MAb-2D12 e capturadas pelo policlonal anti-
Internalina B.
54
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64
ANEXOS
ANEXO I: MANUSCRITO DO ARTIGO A SER SUBMETIDO
ANEXO II: Laudo do resultado Sistema VIDAS para detecção de Listeria
monoctogenes
ANEXO III: Leitura do tamanho e porcentagem das partículas de ouro
coloidal/conjugado produzidas
ANEXO IV - Kit API Listeria® (BioMérieux)
ANEXO V - BAX System (DuPont®)
ANEXO VI - Sistema TECRA®
ANEXO VII - BioControl VIP®
ANEXO VIII - Merck® Singlepath®
ANEXO IX - MICRO-ID® Listeria
65
ANEXO I – Manuscrito a ser submetido.
DESENVOLVIMENTO DE TESTE RÁPIDO PARA DETECÇÃO DE
Listeria monocytogenes EM ALIMENTOS
Ernandes da Silva Filho1; Rodrigo Scaliante de Moura
2; Ludimila Paula Vaz
Cardoso3; Marcelo Mendonça
4; Fabricio Rochedo Conceição
4; Dienny Rodrigues
de Sousa1; Mariane Martins de Araújo Stefani
1; André Kipnis
1; Samira Bührer-
Sékula1.
1- Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO,
Brasil.
2- Associação Educativa Evangélica, Anápolis, GO, Brasil.
3- Universidade Federal de Goiás, Jataí, GO, Brasil.
4- Centro de Desenvolvimento e Laboratório de Imunologia Aplicada de Biotecnologia,
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
Autor correspondente: [email protected]
RESUMO
A listeriose é uma infecção bacteriana, provocada por Listeria monocytogenes,
transmitida principalmente pela ingestão de alimentos contaminados ou pelo
contato direto com animais e/ou indivíduos infectados. Principal responsável pelas
infecções alimentares, apresenta baixa taxa de morbidade, porém quando a
contaminação ocorre em imunodeprimidos os índices de mortalidade são elevados,
representando um importante problema de saúde pública. Os métodos disponíveis
para a identificação da presença de Listeria sp. incluem o isolamento da bactéria
através de cultivo convencional, método laborioso, demorado e de baixa
sensibilidade, e métodos moleculares e/ou imunológicos, normalmente complexos,
de custo elevado, requerendo equipamentos e pessoas treinadas. Mendonça et. al
identificaram anticorpos monoclonais anti-Internalina A (Mab2D12) e policlonal
anti-internalina B (PoliAnti-InlB), presentes na membrana da Listeria
monocytogenes. Portanto, o desenvolvimento de um teste rápido, sensível e
específico para a detecção da presença da Listeria sp. em alimentos é o objetivo do
estudo. Em membrana de nitrocelulose foi impregnado PoliAnti-InlB, como agente
de captura, e proteína A como controle. Como agente de detecção, impregnamos
fibra de vidro com IgG anti-MAb-2D12 conjugada ao ouro coloidal para
visualização do resultado. Inóculos de cepas padrões de Listeria spp. são utilizados,
como amostra positiva, para avaliação da detecção Listeria no teste proposto. Como
controle negativo, foram cultivadas cepas de Listeria innocua, Enterobacter sp. e
Bacillus cereus, Escherichia coli e Salmonella spp. Foi obtido positividade nos
protótipos sensibilizados com PoliAnti-InlB nas concentrações D e E. Também
observou-se positividade em amostras de leite artificialmente contaminadas em
diluição seriada. A capacidade de detecção do teste na concentração D foi de 2x104
UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônias por mililitros).
Palavras-chave: Listeria spp.. Imunocromatografia. Alimentos.
66
INTRODUÇÃO
O patógeno alimentar Listeria monocytogenes é o agente causador da
listeriose, uma doença severa que cursa com baixas taxas de morbidade, porém com
altas taxas de mortalidade em pessoas suscetíveis à infecção, representando um
importante problema de saúde pública (ALLERBERGER, 2010).
O gênero Listeria é constituído por dezenove espécies e até o momento, são
conhecidos 13 sorotipos de L. monocytogenes. No entanto, os sorotipos 1/2a, 1/2b e
4b estão relacionados com mais de 90% dos casos e surtos de listeriose
(VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001; TORRES et al., 2005; BERTSCH et al., 2013;
HALTER; NEUHAUS; SCHERER, 2013; DEN BAKKER et al., 2014; WELLER
et al., 2015).
Várias proteínas de superfície e algumas secretadas pela L. monocytogenes
têm sido descritas como relevantes fatores de virulência bacteriana e principalmente
que, a Internalina A e Internalina B, proteínas produzidas pela bactéria, possuem
papéis importantes como antígenos de superfície responsáveis pela caracterização
do agente (BIERNE; COSSART, 2007).
Esse microrganismo pode contaminar uma grande diversidade de produtos
cárneos, lácteos e derivados, incluindo peixes e frutos do mar. Devido ao fato de
serem consumidos sem cozimento prévio, os alimentos são mais propensos ao risco
de doenças embora existam legislações vigentes para o controle dos alimentos
contaminados (BRASIL, 2013; BRITO et. al., 2008).
No Brasil, a legislação vigente exige a avaliação desse microrganismo em
produtos lácteos, cárneos e pescados, da mesma forma que nos países europeus e
nos EUA, para que esses alimentos estejam próprios para o consumo, é necessária a
ausência da bactéria em análise de amostras de aproximadamente 25 g do produto
(BRASIL, 2009, BRASIL, 2013).
Segundo o ultimo levantamento feito pelo CDC em 2017, ocorreram 8 casos
de listeriose. Dentre os 8 casos relatados, um era recém nascido e cinco eram
mulheres. Após a investigação epidemiológica, concluíram que a causa da infecção
foi a ingestão de queijo a partir de leite cru produzido pela indústria Vulto
Creamery de Walton. Em março de 2017, a indústria retirou do mercado todos os
queijos produzidos do leite cru referentes aos lotes contaminados (CDC, 2017).
Os Programas Nacionais de Controle de Patógenos (PNCP’s), sob jurisdição
da Secretaria de Defesa Agropecuária, do Ministério da Agricultura, Pecuária e
67
Abastecimento, permitem identificar a prevalência dos patógenos em produtos de
origem animal, produzidos pelos estabelecimentos brasileiros, registrados junto ao
Sistema de Inspeção Federal (SIF) conferindo a eles o poder de análise dos
produtos a serem coletados (BRASIL, 2009; BRASIL, 2013).
Existem testes para identificação de Listeria monocytogenes que são
aplicados pelos órgãos regulatórios e até mesmo disponíveis no mercado e em sua
grande maioria, dependem de cultivo prévio do material a ser analisado. Dentre os
métodos de detecção estão incluídos: cultura, provas bioquímicas, testes
imunoenzimáticos, imunohistoquímica, PCR e imunocromatográfico. (SILVA;
VILARDI; TIBANA, 1998). Como são métodos que incluem isolamento da
bactéria através de cultivo convencional usando métodos clássicos, que tornam a
rotina para a detecção laboriosa e demorada, o trabalho tem como objetivo
desenvolver um protótipo de teste imunocromatográfico rápido capaz de detectar a
presença da bactéria em alimentos (VAZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
Por ser um microrganismo intracelular facultativo, durante a fase de
replicação bacteriana dentro do organismo, é difícil estabelecer imunidade humoral,
por conta do mecanismo de escape, dificultando as formas de diagnóstico da
listeriose. Sendo assim, a utilização de um protótipo que detecte a bactéria nos
alimentos antes da ingestão, ajudaria no diagnóstico e na não infecção das pessoas
suscetíveis (GALLEGO et al., 2015).
MATERIAIS E MÉTODOS
O desenvolvimento do teste foi realizado em plataforma tecnológica
implementada no Laboratório de Imunologia da AIDS e Hanseníase (LIAH)/
Laboratório de Desenvolvimento de Testes Rápidos (LDTR)/Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP/ UFG).
Utilizando a imunocromatografia, o teste deste estudo foi desenhado para
detecção direta de antígenos pelos anticorpos policlonais anti Internalinas A e B,
proteínas presentes somente na espécie L. monocytogenes, fixados na linha teste. Os
agentes de captura, anticorpos monoclonais (MAbs) anti-InlA (MAb-2D12)
específicos contra Listeria monocytogenes, foram conjugados ao ouro coloidal e
utilizados como marcador da reação antígeno-conjugado. Como amostra,
inicialmente foram utilizadas culturas de bactérias posteriormente leite
artificialmente contaminado.
68
Na padronização da concentração de antígeno na linha teste foram utilizadas
cepas de Listeria monocytogenes ATCC 7644 e 19117 como controles positivos e
Listeria innocua CLIP 12612, Enterobacter cloacae e Bacillus cereus como
controles negativos (Tabela 1).
Tabela 1. Lista de bactérias cultivadas para uso no estudo
* ID = identificação das amostras Todas as cepas acima foram acondicionadas em freezer -20ºC em eppendorfs identificados, no
Laboratório de Bacteriologia Molecular
Cultivos bacterianos
As bactérias recebidas em ágar Infusão de Cérebro-Coração (BHI) foram
mantidas em Caldo Fraser com glicerol a 20% em -20ºC durante a condução dos
experimentos e testagem dos kits. Os inóculos de culturas frescas de L.
monocytogenes e outras espécies de Listeria foram preparadas em caldo BHI, caldo
Triptona de Soja com 6% de extrato de levedura (TSB-YE) ou caldo de
Enriquecimento de Listeria (LEB) por aproximadamente 20 horas a 37oC em
agitador orbital (200 rpm). As outras bactérias não pertencentes ao gênero Listeria
foram cultivadas exclusivamente em caldos BHI e TSB-YE nas mesmas condições.
Amostras ID* n Conservados à - 20ºC
Listeria monocytogenes ATCC 7644 1A 1 Ágar TSA-YE
Listeria monocytogenes ATCC 7644 1B 1 Ágar Conservação
Listeria monocytogenes ATCC 19117 2A 1 Ágar TSA-YE
Listeria monocytogenes ATCC 19117 2B 1 Ágar Conservação
Listeria innocua CLIP 12612 3A 1 Ágar TSA-YE
Listeria innocua CLIP 12612 3B 1 Ágar Conservação
Listeria innocua SP8 (isolado UFPel) 4A 1 Ágar TSA-YE
Listeria innocua SP8 (isolado UFPel) 4B 1 Ágar Conservação
Enterobacter cloacae 5A 1 Ágar TSA-YE
Enterobacter cloacae 5B 1 Ágar Conservação
Bacillus cereus ATCC 11778 6A 1 Ágar TSA-YE
Bacillus cereus ATCC 11778 6B 1 Ágar Conservação
Total 12
69
Os cultivos bacterianos foram realizados no Laboratório de Bacteriologia
Molecular (LBM) IPTSP/UFG.
Caracterização bacteriana
Como metodologia de identificação morfológica e bioquímica para avaliação,
checagem de contaminação cruzada e confirmação das cepas, foram realizados
ensaios com a cepa analisada a cada experimento. Segundo a Norma ISO 11290-
1:2017 da ANVISA, foram utilizados os caldos Demi-Fraser ou HalF-Fraser e
Fraser, além do ágar seletivo ALOA (Agar Listeria acc. da To Ottaviani & Agosti).
A fase confirmativa foi determinada usando fermentação de carboidratos (Xilose e
Raminose), presença de Beta-Hemólise (Ágar Sangue de Cavalo), Gram e catalase,
eletroforese em gel de poliacrilamida e utilização do equipamento VIDAS para
leitura e confirmação da presença da cepa de Listeria monocytogenes.
Determinação da correlação entre turbidez de cultura de L. monocytogenes e
concentração bacteriana
Foi utilizada uma alíquota da cepa de Listeria monocytogenes ATCC 7644
cultivada em meio TSB e conservadas a -20ºC com glicerina para conservação.
Foram realizados testes para correlacionar a concentração bacteriana contida no
meio TSB com a turbidez de cultura obtida através de leitura de densidade ótica em
espectrofotômetro. Para tanto, 50uL da cepa congelada foi retirada e adicionada ao
caldo TSB e colocada na estufa 37ºC sob agitação de 200rpm e deixado por 20
horas. Ao final da incubação, 500uL foram retirados e transferidos para 20mL de
caldo TSB os quais foram incubados em estufa com agitação foi deixado por 10
horas. A cada 2 horas, 1mL era retirado da cultura e procedido leitura no
espectrofotômetro em comprimento de onda de 600nm para obtenção da densidade
ótica do caldo com bactéria. Ao mesmo tempo foram retirados 5uL da cultura e
transferidos para um tubo contendo 500uL de meio TSB, correspondendo a uma
diluição 1:100 (10-2
). Desta diluição, foram transferidos 5uL para outro tubo
contendo 500uL de meio TSB, correspondendo a uma diluição 1:10.000 (10-4
).
Cinquenta microlitros de cada uma das diluições seriadas (10-2
e 10-4
) semeados
placas contendo meio TSA com auxílio da alça de drigalski. As placas foram
incubadas durante a noite a 37oC e no dia seguinte as colônias crescidas em cada
placa foram quantificadas. A determinação da concentração de unidade formadoras
de colônias por mL (UFC/mL) de cultura foi determinada usando a seguinte
fórmula: UFC/mL = N x FD x 200, onde N corresponde ao número de colônias da
70
placa, FD o inverso da diluição usada para semear a placa e 20 o fator de correção
do volume semeado (1000 µL/50µL). Os valores de UFC/mL obtidos em cada
momento da cultura foram plotados no eixo Y de um gráfico Excel e usando-se a
densidade ótica lida em cada momento como no eixo X. Com os dados inseridos no
gráfico, foi calculado a correlação entre as variáveis UFC/mL e OD da cultura
através de regressão linear, que permitiu determinar uma equação de reta para ser
usada posteriormente nas demais culturas de Listeria monocytogenes para
determinar a concentração celular em UFC/mL a partir da leitura da densidade ótica
da cultura.
Anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes
Foram utilizados na produção dos kits anticorpos monoclonais produzidos
pelo Laboratório de Imunologia Aplicada da UFPel. O MAb-2D12 contra a
proteína internalina A e policlonal contra internalina B de L. monocytogenes foram
utilizados para elaboração do sistema de fluxo lateral (MENDONÇA et al., 2012).
Anticorpos monoclonais e proteínas recombinantes foram cedidos pelo Laboratório
Imunologia Aplicada do Núcleo de Biotecnologia – UFPel.
Produção de ouro coloidal conjugado a anticorpos
O ouro coloidal conjugado a anticorpos foi preparado em três etapas.
Primeiramente, partículas de ouro coloidal a 20nm foram preparadas a partir de
cloreto áurico e, após etapas de aquecimento e resfriamento, foram obtidas
partículas no tamanho de 40nm, que foram conjugadas com anticorpo monoclonal
MAb2D12 e impregnados em fibra de vidro para posterior montagem.
Padronização dos protótipos
Os componentes utilizados na padronização dos protótipos foram: membrana
de nitrocelulose, papel absorvente da amostra, concentrações do anticorpo
Policlonal anti-Internalina-A e B na sensibilização da membrana, tipo de amostra a
ser testado, volumes a serem adicionados no teste, bloqueio da fibra de vidro e
concentração do conjugado MAb 2D12 para impregnação na fibra de vidro.
Protocolo de preparo das amostras das culturas de bactérias em amostras de
leite
Para os testes usando amostras de leite foram procedidas dez diluições
seriadas utilizando 800µL de leite e 200µL de cultura de bactéria em meio TSB na
concentração de 5 x 1011
UFC/mL, (figura 1). Cento e trinta microlitros de cada
diluição seriada foram testados nos protótipos de testes sensibilizados a 1mg/mL.
71
Figura 1: Esquema de diluição seriada com amostras de leite contaminadas
experimentalmente com Listeria monocytogenes.
RESULTADOS
As cepas usadas no presente estudos foram submetidas a testes
bioquímicos para confirmação da espécie de Listeria monocytogenes. As culturas
foram analisadas pela coloração de Gram para verificar a morfologia e tipo de
coloração assim como testadas para as provas bioquímicas de fermentação da
ramnose e fermentação da xilose. Como esperado para a espécie, as cepas se
apresentaram na morfologia de coco-bacilo Gram positivo, fermentadoras de
ramnose e incapazes de fermentar a xilose. Adicionalmente foi analisada a
capacidade de lise das hemácias presentes no meio Ágar sangue, pela presença de
colônias em meio ALOA cor azul apresentando halo de precipitação opaco.
Finalmente a identificação de Listeria monocytogenes foi confirmada pelo ensaio
VIDAs. Cultivos de bactérias sonicadas foram analisados por eletroforese em gel
poliacrilamida a 10% e pressupondo ser a presença de bandas de massa aparente
compatíveis com bandas das proteínas internalina-A e internalina-B características
de 80 e 65 kDa, respectivamente.
Sensibilização das membranas de nitrocelulose (NC)
Anticorpos policlonais Anti InlA e Anti InlB foram sensibilizados em NC
utilizando cinco concentrações, representadas pelas letras de A a E.
Avaliação do desempenho de lotes de Poli Anti-InlA e Poli Anti-InlB
Observou-se que testes sensibilizados com de Poli anti-InlB na concentração
D e E detectaram a presença de L. monocytogenes. Os testes sensibilizados com
Poli anti-InlA não detectaram a presença da bactéria.
Atribuindo processos de aumento de concentração de conjugado, sonicação
das amostras bacterianas, uso de tampão fosfato de potássio para lise, purificação
200µL 200µL 200µL 200µL
800µL
Leite
800µL
Leite
800µL
Leite 800µL
Leite
800µL
Leite
Controle
Negativo
72
das cepas usando PBS/tampão de lavagem e tampão de lise bacteriana, não foi
observado melhora na intensidade da coloração da linha teste dos protótipos.
Como critérios de escolha final, optamos pelo protótipo: (1) utilizando InlB
como agente de captura com detecção comprovada pela visualização da linha teste,
(2) com agente de detecção sendo liberado completamente da fibra de vidro, (3)
sem ocorrência de ligações inespecíficas, (4) sendo a leitura realizada após 20
minutos.
Foi determinado uma correlação entre a turbidez de cultura de bactérias e
concentração em Unidades Formadoras de Colônia por mL (UFC/mL). Para tanto,
o crescimento de uma cultura de L. monocytogenes foi monitorada através da
leitura da densidade ótica e ao mesmo tempo diluições seriadas de cada tempo
foram plaqueadas em meio TSA e as colônias crescidas foram quantificadas para
determinar o UFC/mL da cultura em cada tempo. Os resultados obtidos (Tabela 2)
foram usados para construção de uma reta após plotagem em gráfico e
determinação da regressão linear da reta (Gráfico 1). A equação da reta obtida pela
regressão linear foi usada para determinar a concentração das amostras de cultura
de L. monocytogenes obtidas por espectrometria.
Tabela 2. Correlação entre turbidez e UFC/mL de cultura de L. monocytogenes
** UFC/mL Unidades Formadoras de Colônias por mL
Gráfico 1: Curva bacteriana baseada no crescimento da bactéria mediante a turbidez do meio
de cultura e a contagem de Unidades Formadoras de Colônias / mL.
Horário Densidade Ótica
(nm) Colônias isoladas UFC/mL** (10
-
9)
6 horas 0,318 3408 6 x 109
8 horas 0,416 4720 9 x 109
10 horas 0,528 7152 10 x 109
73
Foi visualizado resultado positivo até a nona diluição, com cultura D.O 1,381
com fator de diluição 1:5, correspondendo a diluição 1:9.765.625. Portanto, a
capacidade de detecção do teste sensibilizado com Poli Anti InlB na concentração
D é 2 x 104 UFC/mL.
Utilizando cultura da amostra Lm 1B ATCC 7644, cultura D.O. 1,270,
diluição seriada com fator 1:5, foi observado positividade até a nona diluição,
correspondendo a 1:9.765.625. A capacidade de detecção do teste sensibilizado na
concentração D foi de 1 x 105 CFU/mL.
Os controles negativos (Listeria innocua, Bacillus cereus e Enterobacter
cloacae,) foram testados nos protótipos de Poli anti-InlA e Poli anti-InlB nas
mesmas concentrações e em condições semelhantes às culturas positivas. A linha
teste não apresentou coloração em nenhum deles, confirmando a especificidade dos
anticorpos utilizados durante o desenvolvimento do teste.
DISCUSSÃO
Alimentos contaminados por Listeria monocytogenes podem provocar infecção
de caráter agudo grave, e em muitos casos levando pacientes imunodeprimidos, a óbito e
aborto em grávidas. A listeriose é uma doença de difícil diagnóstico que depende da clínica
do paciente associada a dados epidemiológicos e investigação alimentar. Portanto, o
desenvolvimento de um teste rápido e simples, visando a implementação de controle de
qualidade dos alimentos, pode ser de grande valor.
Como controle de qualidade das cepas, utilizamos os ensaios clássicos
para detecção de L. monocytogenes e observou-se que apresentaram positividade
em todos os testes. Seguindo a Norma da ANVISA, as amostras também foram
positivas confirmando que eram culturas puras de L. monocytogenes. Além disto, a
presença de internalina-A e internalina-B nas bactérias cultivadas foi observada
através de bandas de peso molecular semelhante por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 10%. Observamos que o tempo gasto, nos procedimentos de
identificação através dos métodos convencionais de detecção da bactéria, é muito
superior ao tempo na realização de testes rápidos, o que confirma a necessidade de
metodologia mais descomplicada para a detecção de Listeria em alimentos.
Observamos que todos os protótipos, utilizando o policlonal Anti InlB como
agente de captura, apresentaram positividade para detecção de L. monocytogenes.
Porém, não foi encontrada positividade nos protótipos com policlonal Anti InlA
74
como agente de captura. Esta ausência de ligação talvez possa ser explicada pelo
fato do agente de detecção ser o monoclonal MAb 2D12, específico para a proteína
InlA. Sendo que usando o policlonal Anti InlA, na linha teste, tanto o agente de
detecção quanto o de captura tinham como alvo a mesma proteína, fato que pode ter
ocasionado competição ou impedimento espacial. Ausência desta competição pode
ser a razão pela qual, ao combinarmos no protótipo anticorpos policlonais anti-InlB
e monoclonais anti InlA, foram observados resultados positivos. Não foi possível
testarmos esta hipótese pois um monoclonal anti InlB não está disponível. Como a
InlA está em abundância na bactéria, as chances de detecção talvez poderiam ser
aumentadas.
A tentativa de aumento de resposta por lise bacteriana, através de sonicação
ou uso de tampão, não apresentou melhora na positividade dos protótipos. Fator
positivo para a execução do teste, pois acrescentaria mais uma etapa em sua
execução.
Também houve a tentativa de aumentar a capacidade de detecção do teste
com aumento da concentração de conjugado, procedimento que não resultou em
melhor desempenho, observado pela ausência de aumento na intensidade de
coloração da linha teste.
Observa-se que a sensibilidade é reduzida quando aumentamos o número de
lavagens das amostras. Utilizando cultura de L monocytogenes sem lavagem
observamos intensidade de coloração semelhante à amostra com uma lavagem, o
que é uma vantagem para a comercialização dos testes, pois a necessidade de
lavagens das amostras seria um passo a mais na execução do mesmo. Já a ausência
de positividade após três e quatro lavagens provavelmente indica queda no número
de bactérias na amostra testada, ficando em número menor que a capacidade de
detecção do teste.
Com a adição do leite artificialmente contaminado, mimetizando o uso do
teste em amostra de leite, o tempo de corrida aumentou. Este aumento provocou a
apresentação de manchas densas avermelhadas com um arraste do conjugado.
Provavelmente os componentes contidos no leite influenciaram negativamente na
execução do teste. Mais experimentos deverão ser realizados para otimizar o fluxo,
como por exemplo a utilização de uma membrana de nitrocelulose com malha
menos densa. Portanto, estima-se que a técnica possa ser aperfeiçoada sem perda da
capacidade de detecção do teste.
75
A capacidade que o protótipo possui em detectar a presença de L.
monocytogenes depende da quantidade desta na amostra. Portanto conhecer a
menor quantidade bacteriana, necessária para o teste positivar determina a
capacidade de detecção deste. Para o protótipo Poli Anti-InlB e MAb2D12, o limite
mínimo de bactérias para detecção foi de 2 x 104 UFC/mL. Quando o protótipo foi
testado com amostras de leite contaminadas experimentalmente a capacidade de
detecção aumentou o número de bactérias necessárias para 1 x 105 UFC/mL.
O teste desenvolvido, utiliza o mesmo princípio que o teste de Brunelli et al.
(2004) porém apresenta um limite de detecção mais baixo, ou seja, necessita de
menos bactérias presentes. Embora esta capacidade de detecção seja superior a de
Brunelli, ainda precisamos melhorar o protótipo pois, para causar doença, é
necessário que os alimentos estejam contaminados por 102 a 10
9 UFC/mL
(MCLAUCHLIN et al., 2004; JEMMI; STEPHAN, 2006).
O protótipo desenvolvido apresenta potencial significativo para ser utilizado
como ferramenta qualitativa rápida, útil e específica para a detecção da presença de
L. monocytogenes pelo MAb-2D12 e capturadas pelo policlonal anti-Internalina B.
AGRADECIMENTOS
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pelo
auxilio financeiro.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram que não existem conflitos de interesse associado ao
manuscrito.
REFERÊNCIAS
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77
ANEXO II: Laudo do resultado Sistema VIDAS para detecção de Listeria
monoctogenes
78
ANEXO III:
Leitura do tamanho e porcentagem das partículas de ouro coloidal/conjugado
produzidas
Ouro 20nm
Comprimento de onda (nm): 519
Abs. (O.D): 0,966
79
Ouro 40nm
Comprimento de onda (nm): 525,9
Abs. (O.D): 1,241
80
Ouro 20nm
Tamanho: 22nm
Porcentagem: 97,2%
Ouro 40nm
Tamanho: 40,64nm
Porcentagem: 94,6%
81
Conjugado:
Ouro coloidal 40nm + IgM MAb 2D12
Comprimento de onda (nm): 532
Abs. (O.D): 0,607
82