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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

TRIAGEM DE PLANTAS DO CERRADO E PANTANAL SUL- MATOGROSSENSE E AÇÃO DO 3-O-TIGLOILMELIANOL

ISOLADO DE GUAREA KUNTHIANA (MELIACEAE) SOBRE RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS (CANESTRINI, 1887)

(ACARI: IXODIDAE)

Carolina da Silva Barbosa

Orientadora: Profa. Dra. Lígia Miranda Ferreira Borges

GOIÂNIA 2012

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CAROLINA DA SILVA BARBOSA

TRIAGEM DE PLANTAS DO CERRADO E PANTANAL SUL- MATOGROSSENSE E AÇÃO DO 3-O-TIGLOILMELIANOL

ISOLADO DE GUAREA KUNTHIANA (MELIACEAE) SOBRE RHIPICEPHALUS MICROPLUS (CANESTRINI, 1887)

(ACARI: IXODIDAE)

Tese apresentada para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Orientadora:

Profa. Dra.Lígia Miranda Ferreira Borges Comitê de Orientação: Profa. Dra. Carla Cristina Braz Louly – AP/UFG Profa. Dra. Simone Maria Teixeira de Sabóia Morais – ICBIV/UFG

GOIÂNIA

2012

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Dedico esta tese

A Deus, a minha orientadora, ao Alfredo, a minha família, aos amigos e aos colegas de trabalho, pelo incentivo, companheirismo e amizade. Vocês foram fundamentais para tornar meus sonhos em realidade.

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AGRADECIMENTOS

Ao criador do universo maravilhoso que nos cede para viver plenamente;

A minha orientadora Prof.ª Lígia por ter depositado em mim a confiança

para a execução deste projeto; marcou o início desta história, que permitiu

exercer a ciência e obter mais este título. Pelos seus ensinamentos, amizade e

carinho recebidos durante todo o curso, serei eternamente grata;

Ao corpo docente e equipe de apoio do Curso de Pós-graduação em

Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de

Goiás, pela oportunidade de realização desta pós-graduação;

À Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia

(FUNDECT) pelo apoio financeiro e à Universidade Estadual do Estado de Mato

Grosso do Sul (UEMS);

À profa. Andréa e família, pelos ensinamentos, atenção e convivência

agradável e carinhosa. Pelo compartilhamento de momentos alegres e festivos,

especiais de minha estada em Goiânia;

Aos professores da Universidade Estadual de Londrina: Roberta, Milton,

Navarro e ao orientador de Mestrado Odilon pelo carinho, apoio, incentivo e

valiosos ensinamentos, que marcaram para sempre o início da minha carreira

profissional. Serei eternamente grata pela confiança em mim depositada;

Ao amigo Wilson, pela atenção na elaboração deste projeto e permanente

envio de lindas mensagens de fé, recebidas com carinho;

Aos professores Fernanda e Walmir e ao Químico Henrique, pela amizade

e permanente apoio, no fornecimento do material utilizado nesta pesquisa;

Ao Reginaldo pelo marcado senso de responsabilidade e especial

dedicação no início deste projeto;

À profa. Simone e família, pela carinhosa convivência e especial apoio

técnico recebido durante a realização deste estudo;

Em especial a todos os amigos do Centro de Parasitologia e ICBIV por

terem contribuído tanto para a minha formação técnica quanto no acolhimento

carinhoso e sincero recebido durante a execução do projeto. Assim, à querida

profa. Carla e família, pela maravilhosa convivência e dedicação carinhosa. Aos

seus importantes ensinamentos e apoio recebidos durante todo o curso; ao

Marcelo pelo exemplo de companheirismo e lindas apresentações de seminário;

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à querida Sara e família, pelo exemplo de responsabilidade, dedicação e

admirável maturidade para lidar com a pesquisa e as pessoas. Pelo seu carinho

e apoio serei sempre grata; a Débora e família, Hélio, Kennedy, Loreninha,

Paulinha, Vanessa, pelo dom de reunir as pessoas e pelo carinho e atenção a

mim dispensados; a Lorena e família, com o exemplo de sua fé inabalável e

grande amizade; aos pupilos da profa. Simone, às mimadinhas Viviane e Mari e

ao Thiago, Fernando e Alex, pela atenção, carinho e orientações técnicas

recebidas na finalização desta pesquisa; às queridas e atenciosas Ana Paula e

Joana, pela agradável convivência e exemplo de profissionais; àqueles, que em

algum momento fizeram parte de minha estada aqui, especial agradecimento;

Aos amigos Andriana, Marília, Nicácio e Thaysa, pelos incansáveis

momentos de dedicação e apoio recebidos, nos primeiros anos de realização do

curso;

Aos meus familiares, em especial a minha vó Izolina e mãe Olir, pela

lembrança de tratar a todos com carinho, igualdade e sinceridade. Às suas

lindas palavras de amor e fé, que sempre tocaram a minha alma, me dando

forças para seguir em frente e realizar este sonho que também é delas. Ao meu

pai “in memorian”, pelos ensinamentos de responsabilidade, honestidade e

bondade, importantes conceitos que me garantem o sucesso em todas as

esferas de minha vida. Aos meus queridos irmãos pelo carinho e incentivo;

Em especial, ao eterno namorado Alfredo, pela incansável dedicação e

carinho em toda esta caminhada. O seu incentivo, demonstração de amor e

apoio constante permitiram transformar meu esforço e dedicação no título de

Doutor;

Ao Ixodideo R. microplus, bovinos e coelhos pela sensibilidade e

resistência imunológica e a capacidade botânica das plantas por interferirem

nesse processo; precursores deste projeto de pesquisa;

A Deus pelo dom da vida e permissão de realização de mais um sonho.

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EPÍGRAFE

Aprendi com a pós-graduação e o atletismo que

o importante é ter dom e amar o que se faz,

assim, os retoques finais da tese e os últimos

quilômetros das maratonas me permitiram

visualizar a meta e me fizeram entender que a

vitória é possível, desde que a vocação e a

perseverança trilhem o mesmo caminho.

C.S. Barbosa

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SUMÁRIO

RESUMO ....................................................................................................................... xi

ABSTRACT ................................................................................................................... xii

CAPÍTULO 1: Considerações gerais ............................................................................1

1. Introdução ....................................................................................................................1

2. R. microplus carrapato dos bovinos ..........................................................................1

2.1. Distribuição geográfica e ciclo biológico ...............................................................1

3. Importância econômica de R. microplus ..................................................................3

4. Controle e resistência de R. microplus .....................................................................4

5. Anatomia dos ovários, oogênese e vitelogênese de R. microplus ........................6

6. Triagem in vitro de plantas com bioatividade em R. microplus ..............................9

6. 1 Triagem in vitro de plantas com bioatividade em artrópodes ............................ 12

7. Protolimonóides e limonóides da família Meliaceae com atividade em artrópodes ...................................................................................................................... 13

Referências bibliográficas ............................................................................................ 17

CAPÍTULO 2 ................................................................................................................. 26

IN VITRO ACTIVITIES OF PLANT EXTRACTS FROM THE BRAZILIAN CERRADO

AND PANTANAL AGAINST RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS

CANESTRINI, 1881 (ACARI: IXODIDAE).................................................................... 26

Abstract ........................................................................................................................... 26

Introduction ..................................................................................................................... 27

Materials and Methods ..................................................................................................... 28

Results ............................................................................................................................. 29

Discussion ....................................................................................................................... 33

Acknowledgments ........................................................................................................... 34

References ....................................................................................................................... 34

CAPÍTULO 3 Efeitos do 3-O-tigloilmelianol isolado de Guarea kunthiana

(Meliaceae) sobre o ciclo reprodutivo de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae) ............................................................................. 38

Resumo .......................................................................................................................... 38

1. Introdução .................................................................................................................. 39

2. Material e métodos ................................................................................................... 40

3. Resultados ................................................................................................................. 44

4. Discussão .................................................................................................................. 50

Referências bibliográficas ............................................................................................ 54

CAPÍTULO 4: Considerações Finais .......................................................................... 58

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RESUMO

A bovinocultura leiteira e de corte são pilares de grande importância para a economia brasileira e dentre os entraves dessa atividade estão os ectoparasitas, em destaque o Ixodídeo R. microplus que tem adquirido resistência aos acaricidas sintéticos. Plantas do Cerrado e Pantanal Sul- Mato-grossense tem sido objeto de estudos biomonitorados em insetos e várias têm sido selecionadas com comprovada atividade. A presente pesquisa teve como objetivo realizar a triagem de 73 extratos etanólicos originários de 24 famílias e 44 espécies de plantas destes biomas e avaliar o efeito do composto 3-O-tigloilmelianol isolado de Guarea kunthiana (Meliaceae) sobre R. microplus. Na triagem, os extratos foram testados a 0,20% in vitro, sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Pelo índice de eficácia foram selecionados os extratos de frutos de G. kunthiana (99,08%), tronco de Nymphaea amazonum (Nymphaeaceae) (51,67%), folhas de Strychnos pseudoquina (Loganiaceae) (48,02%) e tronco de Ocotea lancifolia (Lauraceae) (34,52%). Para se conhecer as alterações causadas pelo 3-O-tigloilmelianol nos ovários, foram utilizados três grupos de 24 espécimes, entre controles e os tratados com a substância a 0,01% em teste de imersão por cinco minutos, enxugado e colocado em BOD a 27oC com 90% UR. Após 24, 48 ou 72 h cada grupo foi dissecado e os ovários foram depositados em ependorfes contendo solução tampão por 24 h, após foram incluídos em historesina, cortados com 2 μm de espessura, depositados em lâminas de vidro, corados com azul de toluidina e observados em microscópio. Na análise biométrica, registrou-se significativa redução (50%) do índice gonadossomático nas amostras com 48 e 72 h após a imersão com relação ao controle. Houve redução significativa (22 a 60%) do número de oócitos I, IV e V nos grupos tratados, com 24 e 72 h após a imersão. Os oócitos II não foram reduzidos e os oócitos III sofreram redução somente com 24 h após a imersão. Os diâmetros maiores do citoplasma e do núcleo dos oócitos I tiveram redução com 72 h após a imersão, e no diâmetro menor do citoplasma a redução foi observada com 24 h após a imersão. Nos oócitos II somente o diâmetro maior do núcleo foi diminuído no grupo com 24 horas após a imersão. Os oócitos III e V não tiveram qualquer alteração no diâmetro dos oócitos, e os da fase IV tiveram redução no diâmetro maior do citoplasma. O 3-O-tigloilmelianol provocou marcada irregularidade na deposição do córion dos oócitos nas fases III e IV, com 24 h após imersão. O 3-O-tigloilmelianol foi testado sobre as larvas a 0,01 a 0,00125% utilizando o teste “sanduiche”, utilizando em torno de 300 exemplares após 15 a 21 dias de eclosão. A mortalidade foi avaliada, após 24, 72 e168 h, porém sem registro de ação. O 3-O-tigloilmelianol foi testado sobre as metalarvas e metaninfas utilizando o teste de imersão, utilizando 100 exemplares por concentração entre tratados e controles. As ecdises foram registradas por dez dias. Observou-se que 60% de redução da ecdise em metalarvas e 20% em metaninfas na maior concentração. Os resultados desta pesquisa evidenciaram que as plantas tanto do Cerrado quanto do Pantanal Sul Matogrossense são promissoras em estudo de triagem. A descoberta da ação do protolimonóide 3-O-tigloilmelianol isolado da G. kunthiana sobre o ciclo reprodutivo de R. microplus, justificando sua prospecção como possível alternativa de controle desse carrapato. Palavras- chave: bovino, fitoterápico, parasitoses, teleóginas, vegetais

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ABSTRACT

Dairy and beef cattle farming are vital pillars of the Brazilian economy. Among the threats to this activity are ectoparasites, most notably the cattle tick R. microplus (Ixodidae), which has acquired resistance to synthetic acaricides. Plants from Brazil’s Cerrado biome and from the South Matto Grosso Pantanal have been the object of biomonitoring studies in insects, and some have shown activity. The present research aimed to carry out triage for 73 ethanolic extracts, from 24 families and 44 plant species from these biomes, and to evaluate the effect of the compound 3-O-tigloilmelianol isolated from Guarea kunthiana (Meliaceae) on R.microplus. In the triage, the extracts were tested at 0.20% in vitro, on engorged R.microplus females. Following the index of efficacy, extracts from the fruit of G. kunthiana (Meliaceae) (99.08%), stem of Nymphaea amazonum (Nymphaeaceae) (51.67%), leaves of Strychnos pseudoquina (Loganiaceae) (48.02%) and stem of Ocotea lancifolia (Lauraceae) (34.52%) were selected. To understand alterations in the ovaries caused by 3-O-tigloilmelianol, three groups of 24 specimens were used, including controls and those treated with the substance at 0.01% in immersion test for five minutes, which were then dried and placed in BOD at 27oC with 90% UR. After 24, 48 or 72 h each group was dissected and the ovaries were placed in Eppendorfs containing buffer solution for 24 h, then embedded in historesin, cut to a thickness of 2 μm, placed on glass sides, stained with toluidine blue and observed under microscope. In the biometrical analysis a significant reduction (50%) was noted in the gonadosomatic index in the samples after 48 and 72hs after exposure, compared to the control. There was a significant reduction (22 to 60%) in the number of oocytes I, IV and V in the treatment groups after 24 and 72h of exposure in relation to the control. Oocytes II were not reduced, and oocytes III were reduced only at 24 h of exposure. The greatest diameters of cytoplasm and nuclei of oocytes I were reduced at 72 h of exposure, and for the lowest diameter of the cytoplasm the reduction was seen at 24 h of exposure. In oocytes II only the greatest diameter of the nucleus was reduced in the group immersed for 24 h. Oocytes III and V showed no alteration in diameter and those from phase IV showed a reduction in the greatest diameter of the cytoplasm. The 3-O-tigloilmelianol was tested on the larvae at 0.01 to 0.00125% using the ‘sandwich’ test with about 300 examples 15 to 21 days after hatching. Mortality was evaluated after 24, 72 and 168 h, but without any action being recorded. The 3-O-tigloilmelianol was tested on the metalarvae and metanymphs, using the immersion test, using 100 examples per concentration between treatments and controls. The ecdyses were recorded ten times. It was noted that there was 60% reduction in ecdysis in metalarvae and 20% in metanymphs at the highest concentration. The results of this research showed that these plants from the Cerrado and the Pantanal are promising in the triage study. The discovery of the action of the protolimonoid 3-O-tigloilmelianol isolated from G. kunthiana on the reproductive cycle of R.microplus justifies its prospection as a possible alternative in the control of this tick. Keywords: bovine, phytotherapeutic, parasitosis, engorged females, plants.

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CAPÍTULO 1: Considerações gerais

1. Introdução

Dentre os artrópodes hematófagos obrigatórios, os carrapatos são

apontados como um dos ectoparasitas de relevante importância na

transmissão de agentes patogênicos, tanto para os animais quanto para o

homem (BERNASCONI et al.,1997; PAROLA et al., 2005; MORAES-FILHO et

al., 2009). Existe vasta variedade de animais, como répteis, aves e mamíferos

domésticos e selvagens, que podem ser parasitados por carrapatos,

(ESTRADA-PEÑA & JORGEJAN, 1999; DANTAS-TORRES et al., 2008;

TOLESANO-PASCOLI et al., 2010).

Os carrapatos pertencem à classe Arachnida, subclasse Acari, ordem

Parasitiformes e subordem Ixodides, divididos nos grupos Prostriata e

Metastriata. Essa subordem inclui as famílias Nutalliellidae, representada

somente por Nuttalliella namaqua Bedford, 1931; Argasidae, conhecidos como

carrapatos moles, representada por cinco gêneros com 186 espécies válidas e

os Ixodidae conhecidos como carrapatos duros, com 13 gêneros com cerca de

143 espécies válidas (BWMAN & NUTTALL,2008). Vários representantes da

família Ixodidae se revestem de importância econômica, por permanecerem em

alimentação por mais tempo, facilitando a transmissão de agentes patogênicos;

a espoliação sanguínea e reações alérgicas (FLECHTMANN, 1990;

BALASHOV, 2005).

2. R. microplus carrapato dos bovinos

2.1. Distribuição geográfica e ciclo biológico

O Ixodídeo R. microplus destaca-se como um dos ectoparasitas de

maior relevância econômica para a pecuária nacional, particularmente em

rebanhos Bos taurus e seus cruzamentos (ANDREOTTI et al., 2011). Este

carrapato encontra-se distribuído entre os paralelos 32o N e 32o S, desde o sul

dos Estados Unidos e região central do México até o Sul do Brasil, centro do

2

Uruguai e norte da Argentina. Ocorre ainda no norte da África, e Sul da

Austrália. Nas regiões marginais, quando a temperatura é inferior a 15o C a sua

sobrevivência fica comprometida, o que ocorre no Brasil próximo da cidade de

Rio Grande junto ao Município de Arroio Grande e Jaguarão, no extremo sul

(GONZALES, 1995).

A partir de estudos filogenéticos moleculares do DNA que

caracterizaram e determinaram a significativa similaridade entre Boophilus e o

gênero Rhipicephalus (KOCK, 1844), este ixodídeo foi realocado como

Rhipicephalus (B.) microplus o que ocasionou a mudança da nomenclatura e o

gênero Boophilus passou a designar um subgênero de Rhipicephalus

(MURREL & BARKER, 2003).

De origem asiática, R. microplus foi introduzido em vários países

tropicais e subtropicais pela importação de animais provenientes deste

continente, o que facilitou sua presença em quase todo o território brasileiro

(FONSECA et al., 1997). R. microplus pode ser comumente encontrado

parasitando principalmente os bovinos, mas também, outras espécies como

homem, caprinos, ovinos, cães e às vezes os coelhos. Entre os animais

selvagens é observado nos cervídeos (FLECHTMANN, 1990).

O ciclo biológico de R. microplus se divide em duas fases: uma no

ambiente e a outra parasitária. O ciclo se inicia quando as fêmeas ingurgitadas

se desprendem do hospedeiro e caem no solo, onde buscam um local com

pouca incidência direta dos raios solares e alta umidade, para realizar a

postura. Em média, após três dias inicia-se a oviposição, que dura em torno de

15 dias. Cada fêmea ovipõe em média 3.000 ovos, que correspondem

aproximadamente a 60% de sua massa corporal e morrem após esse evento.

(GONZALES et al., 1974).

A eclosão larval inicia-se em torno do 7o dia após o início da postura;

neste instar são conhecidas como neolarvas (hexápodes) e não possuem

poder infestante. Em torno de seis dias após a eclosão, sobem pelos caules da

vegetação (larvas infestantes) e aguardam a passagem do hospedeiro. Nessa

fase são resistentes e quando a umidade relativa do ar for cerca de 90% e a

temperatura de 15o C, sua longevidade alcança até 200 dias. Uma vez no

hospedeiro, se fixam preferencialmente nas entrepernas, períneo, virilhas, base

3

da cauda, tábua do pescoço e interior das orelhas (GONZALES et al., 1995;

FLECHMANN, 1990).

No início do parasitismo as larvas se alimentam de linfa e seu corpo se

distende pela absorção do alimento, sendo então denominadas de metalarvas.

Dessa fase, surgem às ninfas (octópodes) que passam a fazer o

hematofagismo e são denominadas de metaninfas, das quais emergem os

adultos jovens. Dependendo do instar, será denominado neandro e, em fase

mais adiantada do desenvolvimento o gonandro para os machos e neógina

para as fêmeas. Com relação ao grau de ingurgitamento das fêmeas, aquelas

que tiverem semi-ingurgitadas, serão partenógenas e as plenamente

ingurgitadas são aquelas prestes a se desprenderem do hospedeiro prévio à

oviposição são as teleóginas (FORTES, 1997).

Os machos de R. microplus, permanecem em cópula por vários dias no

hospedeiro até que a fêmea se desprende, em seguida buscam outra e assim

permanecem no hospedeiro por aproximadamente um mês ou mais

(FLECHMANN, 1990).

3. Importância econômica de R. microplus

O rebanho nacional de bovinos em 2010 atingiu 209,5 milhões de

cabeças, com aumento de 2,1% com relação a 2009; a maior concentração

localiza-se no Centro-Oeste, Norte e Sudeste. Nesse ano, a produção de leite

de origem bovina foi de 30,7 bilhões de litros, 5,6% superior a 2009 (POLL et

al., 2011).

As perdas econômicas diretas e indiretas por R. microplus alcançam

cifras altamente significativas como relatado por que relatam que cerca de 75%

das perdas econômicas causadas por parasitos externos em rebanhos bovinos

do Brasil são atribuídos ao carrapato com cerca de U$S 2 bilhões anuais

(GRISI et al. (2002).

Os bovinos explorados economicamente, principalmente na atividade

leiteira, são na sua maioria de origem europeia e asiática, com suscetibilidade

a infestações por R. microplus (CORDOVÉS, 1997). Este carrapato é

considerado o principal transmissor dos hemoparasitas Babesia bovis

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(STARCOVICI,1893), Babesia bigemina (MSTH & KILBORNE, 1893) e da

ricketsia Anaplasma marginale (THEILER, 1910) que compõem o complexo

Tristeza Parasitária Bovina (TPB), veiculados para os animais no momento da

alimentação em diferentes fases do parasitismo de R. microplus (DALGLIESH

& STEWAR 1982).

4. Controle e resistência de R. microplus

Os primeiros registros de controle das infestações de R. microplus em

bovinos no Brasil são provenientes do Rio Grande do Sul. O primeiro relato de

uso de carrapaticida para banho de imersão ou de mergulho data de 1922, pelo

Laboratório Leivas Leite, de Pelotas, RS, que também foi utilizado nos Estados

Unidos desde o final do século XIX. Muitas formas de redução das populações

de R. microplus têm sido praticadas através do tempo e desde o início do

século XX já eram utilizados carrapaticidas compostos por arsênico

cristalizado, água e soda cáustica (GONZALES, 1995).

O uso exclusivo desses acaricidas a base de arsênico desencadeou

falhas no controle de R. microplus e o primeiro caso de resistência ao arsenito

de sódio no Brasil foi relatado por FREIRE (1953). O autor destaca também

que desde 1950 no município de Alegrete, RS, registra-se resistência dos

carrapatos frente à mistura dos clorados hexaclorocicloexano (BHC) e Dicloro

Difenil Tricloroetano (DDT) utilizados em banhos de imersão. A

comercialização do DDT como carrapaticida segundo WHARTON &

ROULSTON (1970) teve início em 1946 e a resistência em larvas e fêmeas

ingurgitadas de R. microplus a esse clorado foi relatada pela primeira vez na

Austrália em 1955.

Os organofosforados foram lançados em 1955 e no Brasil a resistência

foi registrada em 1963 (GEORGE et al., 2004). Drogas com esse principio ativo

continuam sendo utilizadas no controle do R. microplus. Registros de cepas

resistentes aos organofosforados continuam ocorrendo, como observado por LI

et al. (2005) no México frente ao coumafós. Os autores enfatizam a existência

de mecanismos oxidativos de detoxificação, que o citocromo P450 era o

responsável por essa reação e que essa cepa do carrapato possuía ainda

baixa sensibilidade da acetilcolinesterase que é o sitio alvo do acaricida.

5

Recentemente no Brasil MENDES et al. (2011) comprovaram 65,25% de

resistência ao clorpirifós em amostras de R. microplus de diferentes regiões de

São Paulo.

Os piretroides são também incluídos entres os grupos de drogas antigas

que foram lançados em 1977, com registro de resistência no Brasil em 1989

(GEORGE et al., 2004). Este princípio ativo é utilizado em larga escala e com

registros crescentes de cepas resistentes de R. microplus. Recentemente,

MENDES et al. (2011) realizaram ensaios em seis regiões de São Paulo, pela

técnica do teste de envelope impregnado e registraram que populações de R.

microplus tiveram resistência de 82,6% a cipermetrina e de 86,4% a

deltametrina. Em Mato Grosso do Sul, ANDREOTTI et al. (2011), através de

biocarrapaticidogramas com alfa-cipermetrina, cipermetrina e amitraz

constataram que a eficácia desses produtos foi baixa nas amostras de

carrapatos de todo o estado. Quando esses acaricidas foram usados em

mistura com outros produtos como diclorvos, citronela, clorpirifós+butóxido,

e/ou de piperolina houve controle superior a 90%.

As formamidinas (amitraz) foram lançadas em 1975 e no Brasil houve

registro de resistência de R. microplus em 1995 (GEORGE et al., 2004). Este

produto é usado em larga escala. A resistência desse carrapato frente a este

princípio segundo FOIL et al. (2004) possivelmente ocorreu devido a uma

mutação do sítio de ação, como é o caso dos canais de sódio, onde pequenas

mudanças conferem alta resistência. Estudos realizados por SANTOS et al.

(2009) no Rio Grande do Sul utilizando cinco formulações comerciais

constataram que em 23% das populações do carrapato estudadas, o produto

teve eficácia inferior a 69% e em 29% das amostras de carrapatos o amitraz foi

ineficaz.

A descoberta do grupo das lactonas macrocíclicas (ivermectinas e

milbemicinas) (BURG et al., 1979) com ação endectocida teve grande impacto

no controle dos principais parasitas dos animais de produção. Registros de

resistência às ivermectinas nas populações de R. microplus datam desde 2001,

segundo GEORGE et al. (2004). Esse problema tem sido registrado no Brasil

por KLAFKE et al. (2006) por meio de uma triagem de populações do carrapato

no estado de São Paulo. Verificou-se aumento de 3,78 vezes na resistência em

amostra de carrapatos provenientes do município de Barra Alegre, com

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histórico de uso de ivermectina por cinco anos. Este fato também foi registrado

em Yucatan no México por PEREZ-COGOLLO et al. (2010) com registro de

redução de ação sobre R. microplus.

Outro princípio ativo acaricida é o fipronil com atividade contra insetos,

descoberto por Rhône-Paulenc em 1987, apresentado em uma conferência em

Bhigton 1992 (GANT et al., 1998). O primeiro registro de atividade sobre

carrapatos foi citado por (HUNTER et al., 1994). Recentemente, CASTRO-

JANER et al. (2010) utilizaram amostras de carrapatos de Rio Grande do Sul,

Mato Grosso do Sul e de São Paulo e conduziram testes com fipronil pelo

método de imersão de larvas. A eficácia ao produto foi de 14,9 e 2,6 para as

populações de Rio Grande do Sul e Mato Grosso do Sul, respectivamente, e as

populações de São Paulo variaram de 2,5 a 6,9 representando o primeiro

registro de resistência de R. microplus ao fipronil no Brasil.

A resistência de R. microplus aos acaricidas usuais preocupa a

comunidade científica pela necessidade de se obter novos princípios ativos.

Muitos destes são drogas antigas frente às quais os carrapatos já perderam

parcialmente ou totalmente a sensibilidade (FURLONG, 2005; FURLONG, et

al., 2007, Gomes et al., 2011).

5. Anatomia dos ovários, oogênese e vitelogênese de R. microplus

O processo que envolve o desenvolvimento do sistema reprodutivo dos

artrópodes é promovido pelos hormônios ecdisteróides. Estes exercem

diversas funções (REES, 2004) tais como maturação do esperma e nas fêmeas

age sobre a produção de feromônios de acasalamento, oogênese,

embriogênese, oviposição e no funcionamento das glândulas salivares; nos

estágios imaturos exercem efeito sobre a ecdise.

O conhecimento da morfologia e classificação da oogênese dos

Ixodídeos é uma ferramenta importante na investigação da causa da

infertilidade. Estudos realizados com carrapatos submetidos a tratamentos

tanto com produtos acaricidas usuais quanto com extratos de plantas,

explicaram a causa da inviabilidade reprodutiva de R. microplus, R.

sanguineus, Amblyomma hebraeum (Koch, 1844) e A. triste (FRIESEN et al.,

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2003; OLIVEIRA et al. 2005, 2007; OLIVO et al., 2008; DENARDI et al., 2010,

2011; ARNOSTI et al., 2011; FERNÁNDEZ-SALAS et al., 2012).

A estrutura anatômica dos ovários dos Ixodídeos apresenta a forma em

U, ovidutos bilaterais formando um par de túbulos, útero, vagina e receptáculo

seminal. Anexo ao ovário está localizado o órgão de Gené separado da

estrutura que compõe o sistema reprodutivo, que desempenha a função de

produção da cera que envolve os ovos antes de serem depositados no

ambiente (SONENSHINE, 1991). Trata-se de uma substância líquida,

composta por uma mistura complexa de alcanos de cadeia longa e ésteres de

ácidos gordurosos que tem como função principal impermeabilizar os ovos e

mantê-los unidos. (LEES & BEAMENT, 1948; BOOTH, 1992). Outras estruturas

que também fazem parte do sistema reprodutivo são duas pequenas glândulas

localizadas junto ao poro foveal, que secretam o hormônio sexual envolvido no

comportamento de acasalamento (SONENSHINE, 1991).

Na descrição do desenvolvimento dos ovários dos ixodídeos citada por

BALASHOV (1972) a oogônia aparece no estágio larval. As células

germinativas permanecem neste estágio inicial até a fase de ninfa. A oogênese

começa com a transformação dos oócitos primários, que estão presos na

parede do ovário, durante ou imediatamente após a última alimentação da

ninfa, conhecido como estágio I. Após o início da alimentação hemofágica da

fêmea adulta, os oócitos entram no estágio II, denominado pré-vitelogênese

tardia. O período de captação de vitelo pelos oócitos compreende as fases III e

IV da oogênese e no final deste período o oócito está pronto para ovulação,

denominado estágio do oócito V.

Os ovários de R. microplus, segundo SAITO et al., (2005) são

classificados como do tipo panoístico, portanto necessitam de células

nutridoras. Anatomicamente o ovário desse carrapato é semelhante ao descrito

por BALASHOV (1972) para os Ixodideos em geral. Os oócitos do estágio VI,

por motivos desconhecidos são encontrados em estado de reabsorção

(FIGURA 1).

8

FIGURA 1 - Resumo esquemático da oogênese num corte transversal do ovário de R. microplus. I: oócito I; II: oócito II; III: oócito III; IV: oócito IV; V: oócito V; epitelium do ovário (ec); lúmen (lu); oviduto (ovd); vesícula germinal (gv) (SAITO et al., 2005)

As estruturas anatômicas dos ovários de outros ixodídios, além de R.

microplus (Figura I), também foram observadas por DENARDI et al. (2004) em

Amblyomma cajennense (Fabricius,. 1787); por OLIVEIRA et al. (2005) em

Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806) e por OLIVEIRA et al. (2006) em

Amblyomma triste (Koch, 1844).

O conhecimento do evento da fecundação de R. microplus segundo

GARCÍA-FERNÁNDEZ et al. (1999) é pouco esclarecido, porém sabe-se que

trata-se de um processo complexo. A localização anatômica exata onde ocorre

não foi determinada, atribui-se a isso o fato do oviduto ser composto por

estruturas e características distintas. No entanto, acredita-se que a fecundação

ocorra na porção anterior do oviduto prévio a oviposição (Balashov, 1972).

Sabe-se que a vitelogênese é a fase em que os oócitos crescem,

começa o aparecimento dos primeiros grânulos de gema e termina com a

ovulação (DIEHL et al., 1982). Nesse período ocorre a síntese da vitelogenina,

precursora da vitelina, importante proteína da gema. A vitelogenina é

9

sintetizada no corpo gorduroso e em menor quantidade no epitélio do intestino

de carrapatos SONENSHINE (1991) é encontrada na hemolinfa. Nos

artrópodes, após esse processo a vitelogenina da hemolinfa é captada pelos

oócitos na formação dos grânulos de vitelo (TUFAIL & TAKEDA, 2008).

BRAZ et al. (1999) observaram que R. microplus não sintetiza heme,

sendo assim, obtém a quantidade de heme suficiente para a síntese das

hemoproteínas necessárias para o seu metabolismo através da digestão do

sangue. No processo da embriogênese um terço da vitelina é degradada e o

heme que é liberado liga-se às vitelinas remanescentes; cada molécula de

vitelina se liga a 31 moléculas de heme. Essa associação funciona como

antioxidante, que protegerá o embrião e serve como forma de armazenamento

de reservas, obtido na dieta e encontrado no ovo (LOGULLO et al., 2002).

Durante a oogênese, ocorre uma grande mobilização de vitelogenina

para atender o processo de vitelogênese. Para conhecer este processo

ROSELL & COONS (1992) aplicaram anticorpos policlonais contra vitelina de

Dermacentor variabilis (Say, 1821) e observaram que a concentração de

vitelogenina na hemolinfa das fêmeas variou de 1 µg/mL no primeiro dia de

alimentação até 430 µg/mL no terceiro dia de oviposição. No ovário de Ixodes

scapularis (Say, 1821) a concentração dessa proteína foi de 0,03 mg após o

ingurgitamento rápido e de 0,1 mg no final da oviposição (JAMES & OLIVER,

1996).

No desenvolvimento dos estágios de D. variabilis, ROSELL & COONS,

(1989) verificaram que a vitelina serve como reserva de nutrientes durante a

estarvação larval. ESTRELA et al. (2010), analisando extrato de larvas

observaram significativa redução da vitelina, confirmando o consumo dessa

proteína durante o desenvolvimento larval de R. microplus.

6. Triagem in vitro de plantas com bioatividade em R. microplus

A busca por novos princípios ativos para o controle de artrópodes

hematófagos a partir de plantas é um tema de preocupação mundial, em

especial para os insetos ou ácaros que atacam animais de importância

zootécnica e humanos (KIM et al., 2004; COELHO et al., 2006; ROSADO-

AGUILAR et al., 2010). A seleção de plantas com bioatividade é uma prática

10

corrente em vários países por décadas utilizando o método de triagem,

abrangendo várias famílias, gêneros e espécies, principalmente aquelas de

reconhecida ação terapêutica (CALIXTO, 2000).

Estudos de bioatividade de plantas sobre R. microplus nos últimos anos

têm alcançado resultados promissores. Revisão realizada por BORGES et al.

(2011), enfatiza que as famílias com registro de bioatividade em diferentes

fases do ciclo de R. microplus são Meliaceae, Poaceae, Myrtaceae,

Lamiaceae, Leguminoseae, Piperaceae, Clusiaceae, Sapindaceae,

Winteraceae e Annonaceae.

Para direcionar o isolamento das plantas bioativas, além do grande

número de exemplares consideram-se diferentes partes anatômicas das

plantas. Estudo de triagem de plantas foi realizado por PUYVELDE et al.

(1985), em uma série de 108 espécies, utilizando diferentes partes de 42

plantas medicinais de Rwanda, África, avaliadas em teste de imersão de

fêmeas de Rhipicephalus appendiculatus (Neumann 1901). Com os frutos de

Solanum dasyphyllum Sch. & Thonn. (Solanaceae) e a raíz de Neorautanenia

mitis A. Richard (Asclepiadaceae) observaram atividade acaricida aparente na

fração em éter de petróleo. Das plantas testadas, algumas são utilizadas na

medicina veterinária tradicional como acaricidas em Rwanda, como Securidaca

longepedunculata Fers (Polygalaceae), Nicotiana tabacum L. (Solanaceae),

Chenopodium dissotisthrothae Gilg Icyeba (Amaranthaceae), Chenopodium

ambrosioides ugandae L. (Amaranthaceae) e Tagetes patiila L. (Compositae);

outras têm a reputação de serem tóxicas e foram escolhidas entre plantas

medicinais conhecidas da medicina nativa de Rwanda. Do total de plantas

testadas, 13 apresentaram atividade acaricida variando entre 50 e 100% na

inibição de oviposição; destes, apenas o extrato dos frutos de S. dasyphyllum e

das raízes de N. mitis tiveram 100% de inibição de oviposição.

Na Tailândia CHUNGSAMARNYART et al. (1991) testaram in vitro 171

extratos etanólicos originários de 150 plantas sobre fêmeas ingurgitadas de R.

microplus. As espécies Colotropis gigantea R. Br. (Apocynaceae) e Streblus

asper Lour. (Moraceae) provocaram 92 e 100% de mortalidade 48 h após a

imersão. Após cinco dias houve atividade acaricida variando de 86 a 100% com

Alpina afficinarum, Hanc. (Zingiberaceae), Annona muricata L. (Annonaceae),

Colotropis procera (Ait.) R. Br. (Apocynaceae), Michelia champaca L.

11

(Magnoliaceae), Pachyrhisus erosus L. (Fabaceae), Plumbago zeylandica L.

(Plumbaginaceae), Polyscias balfariana B. (Araliaceae), Premna latifólia Roxb.

(Verbenaceae), Thunbergia erecta T. Anderes (Acanthaceae) e Thunbergia

laurifólia Linde. (Acanthaceae). Com menor mortalidade, variando de 71 a 85%,

foram Aganorcrion polynorphum Pu.S. Datura mete L. (Solanaceae) e

Rhinocanthus nasutus Kurrz. (Acanthaceae).

Na Costa Rica, ÁLVAREZ et al. (2007) em teste de imersão de fêmeas

de R. microplus ingurgitadas avaliaram extratos hidroalcoólicos das plantas

Piper nigrum Raf. (Piperaceae), Zizygium aromaticum L. (Myrtaceae), Petiveria

aliaceae L. (Phytolaccaceae), Echinacea angustifólia Echi. (Asteraceae), Piper

aduncum L (Piperaceae), Capsicum sp L., (Solanaceae), Gliricidia sepium

Jacq. (Leguminoceae), Poligonum punctatum (Elliott.) Polygonaceae), Morus

alba L., Allium sativum L. (Liliaceae), Z. aromaticum L. (Myrtaceae),

Cinnamomum zeylanicum Blume. (Lauraceae). As espécies que produziram

maior mortalidade foram C. zeylanicum e M. alba com 100 e 68%,

respectivamente, e com as demais plantas a ação foi em torno de 36%. Quanto

à ação sobre a inibição da oviposição se destacaram M. alba e P. negrum com

74 e 66% respectivamente. A ação das plantas sobre a inibição da eclosão foi

baixa sendo de 22,45; 18,73 e 8,14% com P. nigrum, M. alba e P. punctatum,

respectivamente.

Na busca do desenvolvimento de acaricidas naturais, MAGADUM et al.

(2009), nas Índia testaram as espécies medicinais Annona squamosa L.

(Annonaceae), Azadirachta indica A.Jus. (Meliaceae) e Tamarindus indicus L.

(Leguminosae) (sementes), folhas de Nicotiana tabacum L. (Solanaceae),

Eucalyptus globulus Labill. (Myrtaceae),Citrus leminum Risso (Rutaceae)

bulbos de Allium sativum L. (Liliaceae) e Withania somnifera L. (Solanaceae),

através de imersão de fêmeas ingurgitadas de R. microplus, na Índia. Dos

extratos rastreados, os preparados a partir das sementes de A. squamosa

tiveram indice de eficiência de 70,8%, 24 h após o tratamento. Os índices sobre

a mortalidade provocadas por E. globulus e C. leminum foram de 29,8 e 20,8%,

respectivamente.

Estudos na Índia através de diversos bioensaios foram realizados por

KAMARAJ et al. (2010) para determinar a eficácia de extratos acetônico,

clorofórmico, etilacético, hexânico e metanólico de folhas, flores e sementes de

12

Cassia auriculata L., (Caesalpinioideae), Rhinacanthus nasutus Kurz.

(Acanthaceae), Solanum torvun Sch., (Solanaceae), Terminalia chebula Retz.

(Combretaceae), e Vitex negundo L. (Verbenaceae). Os produtos foram

testados sobre larvas de R. microplus, utilizando o teste de envelope

impregnado, observou-se que com o extrato hexânico das folhas de V.

negundo a CL50 =611,67ppm e a CL90 = 1.875,50 ppm.

Em Yucatán, México, ROSADO-AGUILAR et al. (2010) realizaram

triagem com 15 famílias de plantas nativas, utilizando extratos metanólicos das

raízes, folhas, caules e cascas de caule, utilizando o teste de imersão de larvas

de R. microplus, resistentes a acaricidas tradicionais. As plantas utilizadas

foram Petiveria alliacea (L.) (Phytolaccaceae), Diospyros anisandra (Blake),

(Ebenaceae), Havardia albicans (Kunth) (Fabaceae), Caesalpinia gaumeri

Greenm. (Fabaceae); Capraria biflora (L.) (Scrophulariaceae); Solanum

tridynamum (Dunal.) (Solanaceae); Solanum erianthum D. Don. (Solanaceae),

Bursera simaruba L. Sarg. (Burseraceae), Spondias purpurea L.

(Anacardiaceae), Ocimum micranthum Willd. (Lamiaceae); Parthenium

hysterophorus L. (Asteraceae), Casearia corymbosa Kunth. (Flacurtiaceae),

Clusia flava Jacq. (Clusiaceae), Sapindus saponaria L. (Sapindaceae) e

Tabebuia guayacan Seem. (Bignoniaceae). Dessas plantas, a ação larvicida

dos extratos com as folhas de P. alliacea, H. albicans, C. gaumeri, D.

anisandra, C. biflora foram de 95,7%, 93,0%, 90,1%, 87,9% e 86,6%,

respectivamente e, com caule de P. alliacea, S. tridynamum e S. erianthum

foram de 99,2%, 98,0% e, 97,8%, respectivamente e, cascas do caule de C.

corymbosa, B. simaruba e D. anisandra foram de 99,5%, 99,1% e 98,8% e com

a raiz de O. micranthum foi de 87,0%.

6. 1 Triagem in vitro de plantas com bioatividade em artrópodes

Espécies vegetais do Cerrado do Centro Oeste Distrito Federal (DF),

tem sido alvo de pesquisas em ensaios biológicos para a obtenção de novos

princípios contra artrópodes. Para avaliar a bioatividade de extratos dessas

plantas sobre larvas de terceiro ínstar de Aedes aegypti COELHO et al. (2009a)

realizaram triagem em laboratório com 67 extratos vegetais de 29 espécies das

famílias Alismataceae, Anacardiaceae, Annonaceae, Apocynaceae,

13

Bignoniaceae, Clusiaceae, Magnoliaceae, Malpighiaceae, Meliaceae e

Mimosaceae, da flora da região do Cerrado de Brasília, DF. Os resultados

foram avaliados após 24h do tratamento e o extrato de Kielmeyera coriacea

Mart. (Clusiaceae) foi o que apresentou melhor atividade na concentração de

500 µg/mL. Outros extratos que provocaram mortalidade média igual ou

superior a 50% foram os de Taluma ovata A. St.-Hil. (Magnoliaceae), Schinus

terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae), Matayba guianensis Aubl.

(Sapindaceae), Xylopia emarginata Mart. (Annonaceae), e S. terebinthifolius.

O efeito de extratos de plantas do Cerrado da mesma região também foi

avaliado por COELHO et al. (2009b) em ninfas do primeiro estádio de

Dipetalogaster maxima (Uhler) (Hemiptera: Reduviidae). Os bioensaios foram

conduzidos para verificar a atividade inseticida de 83 extratos, pertencentes a

35 espécies das famílias Annonaceae, Apocynaceae, Asteraceae,

Bignoniaceae, Burseraceae, Flacourtiaceae, Monimiaceae, Rubiaceae,

Sapindaceae, Sapotaceae, Simaroubaceae e Zingiberaceae, em dosagem

tópica de 50 µg nos tergitos abdominais de 10 ninfas. Após 28 dias, embora

nenhum extrato tenha se destaque o extrato, com Simarouba versicolor St. Hill

(Simaroubaceae) a ação sobre a ecdise foi de 40% e 25%, respectivamente,

com o extrato hexânico do fruto e etanólico da casca.

O direcionamento dos estudos com extratos de plantas sobre

artrópodes, em destaque para Rhipicephalus (B.) microplus, deixa claro que a

forma de triagem é a mais indicada. Se faz importante a realização de um

número maior de estudos, uma vez que existe a disponibilidade de espécies de

plantas nos diversos biomas do teritório brasileiro com potencial para serem

investigadas. Os bioensaios de triagem de plantas demandam a prospecção de

elevado número de espécies com suas diferentes partes anatômicas para no

final selecionar aquelas mais eficientes.

7. Protolimonóides e limonóides da família Meliaceae com atividade em artrópodes

Os metabólitos primários das plantas são utilizados no metabolismo

basal e destes se originam os metabólitos secundários, com função de atração

de polinizadores, adaptação química à pressão ambiental ou como defensivos

14

químicos contra insetos ou outras plantas (aleloquímicos) (BALANDRIN et al.,

1985).

Estruturalmente os limonóides são triterpenoides derivados dos

triterpenos. Os produtos das oxidações preliminares destes triterpenos, que

ainda mantêm em C-17 uma cadeia de oito carbonos com diversos arranjos

estruturais, são considerados os precursores dos limonóides e denominados

protolimonóides (TAYLOR, et al., 1984; CHAMPAGNE et al., 1992).

A família Meliaceae é constituída por 51 gêneros e cerca de 1.400

espécies dispersas nas regiões tropicais e subtropicais, sendo encontrados no

Brasil representantes dos gêneros Cabralea, Carapa, Cedrela, Guarea,

Trichiliae e Swietenia (JOLY, 1975; CORREA, 1984). Existem meliáceas de

origem asiática que foram introduzidas na flora brasileira como Azadirachta

indica A. Juss, que está presente em áreas subtropicais e tropicais da África,

América e Austrália (SCHMUTTERER, 1990). No Brasil, os primeiros cultivos

realizados para pesquisa desta planta como inseticida ocorreram em 1986 no

Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) em Londrina PR, com sementes

obtidas das Filipinas (MARTINEZ, 2008).

Outra planta dessa família é Melia azedarach A. Juss, nativa do sudeste

da Ásia e norte da Austrália e que também é encontrada no Brasil; sendo

utilizada em reflorestamento. Também tem sido encontrada na América tropical

em vários países, como México, Argentina e bem como em algumas ilhas do

Caribe. Na América do Norte, encontra-se na Virginia, Sul da Flórida e Oeste

do Texas; também tem sido encontrada no sudoeste da África (LORENZI,

2003).

Quimicamente, esta família é caracterizada principalmente pela

produção de tetranortriterpenos, metabólitos secundários altamente oxidados,

conhecidos como limonóides. Compostos desse tipo são encontrados também

em espécies das famílias Rutaceae, Ceneoraceae e Simaroubaceae, nestas,

porém, com estrutura química menos diversificada (TAYLOR, et al., 1984;

CHAMPAGNE, et al., 1992).

Os limonóides conhecidos como tetranortriterpenoides, presentes em A.

indica (nim) são identificados por apresentarem atividade contra insetos,

principalmente na interrupção de seu crescimento por inibição da alimentação,

conhecida como atividade fago inibidora. A azadarichtina (AZA) é sem dúvida o

15

limonóide com maior potencial de uso contra insetos, interferindo também nas

glândulas endócrinas que controlam a metamorfose, impedindo a ecdise

(MORDUE & BLACKWEL, 1993; SALLES & RECH, 1999; VALLADARES et al.,

2003; ROY & SARAF, 2006). Essa substância pode ainda inibir a síntese de

vitelogenina durante a oogênese de artrópodes e alterar a formação da

espermatogônia (REMBOLD, 1987; SHARMA, 1992; GRAZAWI et al., 2007).

Um potente limonóide, a meliartenina, com ação antialimentar foi isolado por

CARPINELLA et al. (2002) de M. azedarach proveniente de Argentina,

comprovando ação de 90,7% sobre larvas de Epilachna paenulata (Germar,

1824) (Coleoptera: Coccinellidae) e inibição de 87,8% na alimentação de

Spodoptera eridania (Cramer, 1782) (Lepidoptera: Noctuidae).

Ensaios com AZA foram realizados em R. microplus por GIGLIOTI

(2011), utilizando extrato oleoso com concentrações de AZA a 2.000 (N2),

5.000 (N5), 9.000 (N9) e 10.000 (N10) ppm in vitro sobre fêmeas ingurgitadas e

larvas. Os extratos não foram letais para as larvas.

Estudos realizados por REMBOLD (1987) com AZA evidenciaram

potente ação, inibindo a alimentação, a fecundidade, provocando malformação

e mortalidade em Locusta migratória (Orthoptera: Acrididae). Foi confirmado

por GHAZAWI et al. (2007) que a AZA provocou alterações nos hormônios

ecdisteróides juvenis e vitelogenina, observado sobre Heteracris littoralis

(Rambur, 1838) (Orthoptera: Acrididae) onde causou alteração no crescimento

dos oócitos e túbulos espermáticos.

O gênero Guarea é representado por cerca de 150 espécies arbóreas

(PENNINGTON & STYLES, 1975), sendo poucas destas estudadas com

relação à sua composição química. Sabe-se que contém metabólitos

secundários, como protolimonóides, limonóides, sesquiterpenos, diterpenos e

triterpenos (LINS et al., 1992; GARCEZ et al., 1998; JIMENEZ et al., 1998;

LAGO et al., 2002; GARCEZ et al., 2004).

O efeito inseticida dos protolimonóides melianona e de seus derivados

21 acetilmelianona, isolados das sementes de Guarea grandiflora Decne. ex

Steud, foram estudados por JIMENEZ (1998). Foi observada ação inibitória do

crescimento larval de Ostrinia nubilalis Hübner (Lepidoptera: Pyralidae), e

também que o melianodiol causou morte nos diversos estágios do inseto.

SAMARASEKERA et al.(2004) comprovaram que dois protolimonóides,

16

skimmiarepina A e C, isolados das cascas de Aegle marmelos L. (Rutaceae),

apresentaram atividade inseticida moderada contra Phaedon cochleariae (F.)

(Coleoptera: Chrysomelidae).

Das meliáceas brasileiras Guarea kunthiana foi bioativa sobre R.

microplus, provocou atraso do início da oviposição com redução da produção

de ovos e comprometimento da embriogênese (GARCEZ et al., 2010;

MIGUITA, 2011). Os referidos autores realizaram ensaios químicos

biomonitorados sobre fêmeas ingurgitadas de, por meio do teste de imersão

para determinar o índice de eficiência reprodutiva. Com extratos etanólicos nas

concentrações de 0,05 a 0,20 %, obtiveram 89 a 99,5% de ação e com o

particionamento em hexano de 0,10 a 0,005%, a bioatividade foi de 98 a 100%.

Dessa partição obtiveram nove frações das quais a GKFSA 5 que teve

bioatividade superior a 95%. Dessa fração foi isolado o protolimonóide 3-O–

Tigloilmelianol testado nas concentrações de 0,01% a 0,000125%

apresentando índice de eficiência reprodutiva de 99 a 70 %.

A bioatividade do 3-0-Tigloimelianol sobre o ciclo reprodutivo de R.

microplus sinaliza a necessidade da continuidade do estudo biomonitorado

sobre as fases juvenis e sobre os eventos da oogênese podendo ter uso

promissor no controle desse carrapato.

17

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CAPÍTULO 2

IN VITRO ACTIVITIES OF PLANT EXTRACTS FROM THE BRAZILIAN CERRADO AND PANTANAL AGAINST RHIPICEPHALUS (BOOPHILUS) MICROPLUS CANESTRINI, 1881

(ACARI: IXODIDAE)

Carolina da Silva Barbosa . Ligia Miranda Ferreira Borges . José Nicácio . Reginaldo Dias Alves . Carlos

Henrique Miguita . Ivana Maria Povoa Violante . Lidilhone Hamerski . Walmir Silva Garcez . Fernanda

Rodrigues Garcez

Abstract

A total of 73 ethanol extracts from different anatomical parts of 44 plant species belonging to 24

families, native to the Mid-Western region of Brazil, were assessed in vitro for their effect on the

reproductive cycle of engorged females of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, using the

adult immersion test. All extracts were evaluated at the concentration of 0.2% and, among the extracts

tested, the one obtained from the fruits of Guarea kunthiana (Meliaceae) proved to be highly efficacious,

showing 99.08% of product effectiveness. Extracts from other three species were shown to be moderatly

active, namely Nymphaea amazonum trunk (Nymphaeaceae) (51.67%), Strychnos pseudoquina trunk

(Loganiaceae) (8.02%) and Ocotea lancifolia leaves (Lauraceae) (34.52%)

, while the remaining extracts were shown to be weakly active or inactive. This is the first report on

the bioactivity of these species on egg production by engorged females of R.(B.) microplus.

Keywords cattle-tick, tick control, biopesticides, Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Carolina da Silva Barbosa

Laboratório de Parasitologia Animal, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Unidade de

Aquidauana, Aquidauana, MS, 79200-000, Brazil

e-mail: csbarbosa@uems.br phone : +55-67-39042946

Fernanda Rodrigues Garcez , Walmir Silva Garcez, Carlos Henrique Miguita, Ivana Maria Póvoa

Violante, Lidilhone Hamerski

Lígia Miranda Ferreira Borges

Setor de Parasitologia, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás,

Goiânia, GO, Brazil

Centro de Ciências Exatas e Tecnologia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande,

MS, Brazil

José Nicácio

Laboratório de Entomologia, Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, MS, Brazil

Reginaldo Dias Alves

Laboratório de Parasitologia Animal, Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Unidade de

Aquidauana, Aquidauana, MS, Brazil

27

Introduction

Among the factors that affect the welfare of animals and cause production losses are endo and ecto-

parasites, especially the cattle tick R. microplus (Canestrini, 1887), which represents a major economic

problem among the ixodid species of South and Central America and Australia (Angus 1996). The

estimated losses for Brazilian cattle-ranchers are approximately two billion dollars annually, due to the

costs of treatments with acaricides, blood spoliation, and other factors (Grisi et al. 2002). In Brazil, this

ectoparasite is known as the main vector of tick-borne cattle fevers, such as the hematozoa Babesia bovis

(Starcovici 1893), B. bigemina (Mith & Kilborne, 1893) and the rickettsia Anaplasma marginale (Theiler

1910). These can cause infections alone or mixed with clinical signs of fever, anemia, jaundice,

haemoglobinuria, and loss of appetite and, depending on the animal`s clinical condition may cause death

(Guglielmone 1995; Barros et al. 2006; Jonsson et al. 2008).

The traditional methods to control tick infestations is primarily based on the intensive use of synthetic

acaricides; however, there are reports of increased resistance in various populations (Beverley 1996;

Andreotti et al. 2011). The indiscriminate use of acaricides is one of the key factors that have contributed

to this situation (Olivo et al. 2009). The first record of cattle-tick resistance in Brazil occurred in the

1950s when the first test for evaluation of resistance to synthetic insecticides was carried out (Freire

1953). Since then, the literature has reported that several synthetic acaricides have lost or reduced their

effectiveness due to the development of resistant tick strains (Davey et al. 2006; Pereira 2006; Chevillon

et al. 2007; Brito et al. 2011); therefore, increasing the demand for efficient new products which are also

environmentally safe and harmless to non-target organisms.

Plant-derived products have thus emerged as a promising alternative to the use of common synthetic

acaricides. Several studies have confirmed the effect of herbal products on arthropods, specifically on

ticks, causing reductions in weight, egg-laying, fecundity and egg viability (Koul and Walia 2009; Elango

and Rahuman 2011).

Investigations on plant extracts as a new source of acaricidal agents also have shown to be a useful

strategy because many plants accumulate organic substances in quantities and concentrations that can be

economically exploited in a sustainable manner since they are a renewable source, which is not observed

in traditional chemicals (Balandrin 1985; Chagas et al. 2003; Olivo et al. 2009; Ribeiro et al. 2010;

Borges et al. 2011).

Plants contain numerous constituents in their extracts which may also have synergistic effects due to

the presence of active compounds belonging to different classes of secondary metabolites or with

different chemical structures within the same class (Maciel et al. 2002).

The isolation of plant substances with potential acaricidal activity requires preliminary investigations

by screening the bioactivity of a large number of plants belonging to different families and parts of plants,

such as roots, stems, leaves, flowers, bark and fruits, as well as their associations (Puyvelde et al. 1985;

Mansingh & Williams 1993; Ribeiro et al. 2010; Rosado-Aguilar, et al. 2010).

The application of biopesticides in veterinary medicine is still a novel and limited process, but for

some pests, such as ticks, promising results have been obtained, especialy for the control of R. microplus

28

(Balandrin et al. 1985; Borges et al. 2003; Chagas et al. 2003; Sousa et al. 2008; Olivo et al. 2009;

Kamaraj et al. 2010; Ghosh et al. 2011).

The “Cerrado” Domain, which is the second largest of Brazil’s major biomes, after Amazonia, and the

“Pantanal”, the world’s largest wetland area with 150,355 km2 which is found in the Mid-West region of

Brazil, comprise a vast range of biodiversity (IBGE 2012). The goal of this study was to perform a

screening of plants native to the Brazilian “Cerrado” and “Pantanal” on the reproductive cycle of R.

microplus engorged females, as potential sources of active constituents that may be further exploited for

the control of the cattle-tick.

Materials and Methods

Plant material

The plants were collected in different regions of Mato Grosso do Sul, Brazil, from 2008 to 2011 and

identified by Dr. Arnildo Pott, MSc. Ubirazilda M. Resende, MSc. Vali J. Pott and MSc. Flávio M. Alves

(Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil). Voucher specimens have

been deposited at the CGMS Herbarium, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, MS, Brazil. The

list of the species investigated, including the botanical names, voucher numbers, sites of collection and

plant parts extracted is given in Table 1.

Preparation of plant extracts

Air-dried and powdered plant material (between 500g and 1.5 kg) was exhaustively extracted with

ethanol 95% at room temperature. After concentration to dryness in vacuo, the residue obtained from the

corresponding ethanol extracts was stored at -12oC until biological screening was performed. A 0.2%

solution (0.2g/100 mL) of each crude extract, which was prepared using 5% dimethylsulfoxide in

dechlorinated water, was used 60mL in the adult immersion test. The control was set up with 5%

dimethylsulfoxide in dechlorinated water.

Ticks

Engorged females of R. microplus were obtained from naturally infested Holstein cattle from the State

University of Mato Grosso do Sul in Aquidauana, Mato Grosso do Sul, Brazil. Cattle were free of

commercial acaricides for at least 60 days prior to the experiments. After collecting the ticks, they were

cleaned, dried and selected under a stereomicroscope based on their external morphological condition, as

well as their individual biomass (between 180 and 190 mg ), according to Bennet (1974). A total of 8.760

ticks were used in the experiment. For each extract, 120 pre-weighed ticks (six replicates, each containing

ten ticks) were used (six treated and six controls). All procedures were approved by the ‘‘Ethics

committee on animal experimentation of Universidade Federal de Goiás” (Protocol number 221/2009).

Adult immersion test

Engorged females were tested by immersion test according to Drummond et al. (1973). Treatment and

control solutions (10 mL each) were distributed in 12 beakers of 20 mL. Ten ticks were placed in each

beaker and remained immersed for five minutes. After this treatment, the females were dried, placed in

29

Petri dishes and stored in a chamber at 27 ± 1°C, RH>90% and scotophase for oviposition. After 15 days,

the eggs were weighed to calculate the percentage of egg conversion [egg mass weight (g)/female weight

before treatment (g)] x100 (Bennett, 1974). Eggs were then incubated for a further 15 days and, after this

period, the eggs produced by each group were weighed and incubated up to eclosion of all larvae. When

less than 50% of the larvae hatched, the eggs and larvae were mixed with 4 ml of a 1:1 solution of 96%

aqueous ethanol and glycerin, and the larvae and eggs were counted in 1ml of the solution. The

percentage of hatching was calculated as follows: [number of larvae/(number of larva + number of eggs)]

x 100. The percentage of product effectiveness (PE) was determined according to Drummond et al.

(1973), on the basis of calculation of the estimated reproduction (ER) values, as follows:

ER = egg weight (g) x % hatchability x 20000*

female weight (g)

*Constant that indicates the number of eggs present in 1g.

PE = ER (control group) – ER (treated group) x 100

ER (control group)

Statistical Analysis

The effect of ethanol extracts of plants on engorged females of R. microplus was examined in

completely randomized design experiments. The significance level was 5% (p <0.05). For comparison of

conversion in eggs and eclosion between control and treated groups was used Student's t test. The

treatment groups which differed from their controls were submitted to ANOVA and averages of product

effectiveness was compared by Tukey test (Costa 2010).

Results

Four (5.5%) out of 73 plant extracts tested on R. microplus had reproductive parameters significantly

different from their controls (Table 1). Of these the Guarea kunthiana (Meliaceae), Nymphaea amazonum

(Nymphaeaceae), Strychnos cf. pseudoquina (Loganiaceae) and Ocotea lancifolia (Lauraceae) plants

were selected as the most bioactive (Table 1).

The results obtained of in vitro efficacy of the aforementioned bioactive extracts against engorged

females of R. microplus using the adult immersion test are given in Table 2.

The highest efficiency against females of R. microplus (99%) was found for the fruit extract of G.

kunthiana, and this action was due to interference in the egg production index and hatchability of larvae.

The extract did not cause death to the engorged females; however, there was a delay in the onset of

oviposition of approximately seven days in the treated group in comparison to the control group. The eggs

had an abnormal appearance, being dark brown and dried with clumps of viable eggs which hatched after

18 days. The extracts of the trunk of N. amazonum and leaves of S. pseudoquina had intermediate

acaricide effectiveness (percentage inhibition of oviposition values of 51.67 and 48.02 %, respectively),

while the lowest efficacy was observed with the trunk extract of O. lancifolia (34.52%). The eggs from

ticks treated with these three bioactive plants did not show those changes mentioned for G. kunthiana

(Table 2).

30

Table 1. Plants from the Brazilian Cerrado and Pantanal tested against engorged females of

Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Species (Family) Voucher

number

Site of

collection/biome Plant part

Vernonia condensata Baker (Asteraceae) 1704

Campo

Grande/Cerrado

Leaves

Vernonia ferruginea Less. (Asteraceae) 9318 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Crescentia cujete L. (Bignoniaceae) 18140 Aquidauana/

Cerrado Fruits

Tabebuia aurea (Silva Manso) Benth. & Hook. f. ex S. Moore

(Bignoniaceae) 13050 Corumbá/Pantanal

Leaves

Trunk

bark

Stems

Tabebuia ochracea (Cham.) Standl. (Bignoniaceae) 23415 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Protium spruceanum (Benth.) Engl. (Burseraceae) 12450 Aquidauana/

Cerrado Leaves

Kielmeyera coriacea Mart.& Zucc. (Clusiaceae) 24930 Campo Grande/

Cerrado

Trunk

bark

Combretum laxum Jacq. (Combretaceae) 18102 Aquidauana/

Cerrado

Roots

Stems

Doliocarpus dentatus (Aubl.) Standl. (Dilleniaceae) 19350

Dois Irmãos

do Buriti/

Cerrado

Fruits

Leaves

Erythroxylum suberosum A. St.-Hil. (Erythroxylaceae) 23795 Campo

Grande/Cerrado Inner bark

Andira cuyabensis Benth. (Fabaceae) 13400 Corumbá/Pantanal Leaves

Andira humilis Mart. ex Benth. (Fabaceae) 11505 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Diptychandra aurantiaca Tul. (Fabaceae) 11638 Campo Grande/

Cerrado

Flowers

Trunk

bark

Aiouea trinervis Meisn. (Lauraceae) 8810 C. Grande/

Cerrado Fruits

Mezilaurus vanderwerffii Alves, F.M. & Baitello (Lauraceae) 15452 Aquidauana/

Cerrado Fruits

31

Nectandra cissiflora Nees (Lauraceae) 11260 Campo Grande/

Cerrado Stems

Nectandra cuspidata Nees & Mart. (Lauraceae) 11267 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Nectandra gardneri Meisn. (Lauraceae) 0172 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Trunk

Trunk

bark

Nectandra megapotamica (Spreng.) Mez (Lauraceae) 15433 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Heartwood

Trunk

bark

Ocotea acutifolia (Nees) Mez (Lauraceae) 15441 Japorã/Cerrado

Leaves

Trunk

bark

Ocotea lancifolia (Schott) Mez (Lauraceae) 3670 Campo Grande/

Cerrado

Leaves*

Trunk

bark

Ocotea suaveolens (Meisn.) Hassl. (Lauraceae) 11505 Corumbá/

Pantanal

Fruits

Leaves

Ocotea velloziana (Meisn.) Mez (Lauraceae) 15427 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Trunk

bark

Hyptis crenata Pohl ex Benth. (Lamiaceae) 18181 Cuiabá/

Cerrado

Aerial

parts

Strychnos pseudoquina A. St.-Hil. (Loganiaceae) 11443 Campo Grande/

Cerrado

Fruits

Leaves

Trunk*

Peixotoa cordistipula A. Juss. (Malpighiaceae) 18662 Aquidauana/

Cerrado

Leaves

Stems

Cedrela fissilis Vell. (Meliaceae) 17167 Aquidauana/

Cerrado Leaves

Guarea guidonia (L.) Sleumer (Meliaceae) 1870 Aquidauana/

Cerrado Fruits

Guarea kunthiana A.Juss. (Meliaceae) 11217

Dois Irmãos

do Buriti/

Cerrado

Fruits*

Trichilia silvatica C. DC. (Meliaceae) 11218

Dois Irmãos

do Buriti/

Cerrado

Leaves

Trunk

32

Rapanea guianensis Aubl. (Primulaceae) 18565 Campo Grande/

Cerrado

Fruits

Leaves

Nymphaea amazonum Mart. & Zucc. (Nymphaeaceae) 18892 Corumbá/

Pantanal

Leaves

Roots

Trunk*

Roupala montana Aubl. (Proteaceae) 24911 Aquidauana/

Cerrado

Leaves

Stems

Trunk

Alibertia sessilis (Vell.) K. Schum. (Rubiaceae) 11895 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Trunk

Palicourea marcgravii A. St.-Hil. (Rubiaceae) 12901 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Stems

Psychotria carthagenensis Jacq. (Rubiaceae) 14811 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Pogonopus tubulosus (A. Rich.) K. Schum. (Rubiaceae) 20125 Aquidauana/

Cerrado

Fruits

Trunk

Magonia pubescens A. St.-Hil. (Sapindaceae) 13823 Campo Grande/

Cerrado Fruits

Chrysophyllum marginatum (Hook. & Arn.) Radlk. (Sapotaceae) 21210 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Stems

Siparuna guianensis Aubl. (Siparunaceae) 18194 Campo Grande/

Cerrado Leaves

Guazuma ulmifolia Lam. (Sterculiaceae) 29217 Campo Grande/

Cerrado

Leaves

Trunk

bark

Solanum mammosum Lam. (Solanaceae) 19140 Campo Grande/

Cultivado Fruits

Lantana camara L. (Verbenaceae) 12912 Aquidauana/

Cerrado Leaves

Qualea parviflora Mart. (Vochysiaceae) 18338 Campo Grande/

Cerrado Trunk

* There was significant difference in egg production index and hatchability of larvae (%) in relation to

control by Student's t test (P<0.05)

33

Table 2 – Mean ± standard dos deviation of egg production index, hatchability of larvae and caricide

effectiveness (%) of bioactive extracts of plants from the Brazilian Cerrado and Pantanal tested against

engorged females of Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Plant Anatomical part Egg production

index (%)

Hatchability of

larvae (%)

Acaricide

effectiveness (%)

Means controls - 51.79 ±2.00 97.91±0.30 -

Guarea kunthiana Fruits 3.93 ± 1.35a 11.58 ± 3.26a 99.08 ± 0.40a

Nymphae amazonum Trunk 29.33 ± 4.82b 88.17 ± 4.22b 51.64 ± 8.42b

Strychnos cf pseudoquina Leaves 38.60 ± 6.22b 82.72 ± 8.74

b 48.03 ± 23.04

b

Ocotea lancifolia Trunk 32.75 ± 9.46b 76.92 ± 20.92b 34.50± 11.02c

a,b – different letters in the same column mean significant difference by the Tukey (P<0.05)

Discussion

The noteworthy effect of the ethanol extract of G. kunthianna (Meliaceae) at the concentration of

0.2% on egg production index and hatching of R. microplus, which is being reported for the first time in

the present study, was not observed in treated insects, as demonstrated by Coelho et al. (2009). These

authors reported that crude extracts of Guarea kunthiana did not show any significant larvicide activity

against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae), in spite of having enhanced the mortality of nymphs of

Rhodnius milesi (Hemiptera: Reduvidae). These differences may indicate that the active component(s) of

G. kunthiana is (are) more specific to ticks than to insects.

On the other hand, other plants from the Meliaceae family have already proved their acaricidal activity

against R. microplus. Williams (1993) and Magadum et al. (2009) reported the effect of seed extracts of

Azadirachta indica against reproductive parameters of engorged females. The action of the oily extract of

ripe fruits of Melia azedarach on reproductive performance was reported by Borges et al. (2003). In

addition, they showed that extracts of ripe fruits of M. azedarach obtained with different solvents

produced distinct effects on larvae and engorged females, with the highest efficiency being shown by the

hexane and chloroform extracts.

Nymphaea amazonum, Strychnos pseudoquina and Ocotea lancifolia, which belong to three different

plant families, exhibited significant activity in the reproductive parameters of R. microplus in the present

study, have not been previously evaluated either against the cattle-tick or any other arthropod.

Some of the plants that were ineffective against Rhipicephalus (Boophilus) microplus in the present

work, such as Guarea guidonia and Vernonia condensata, were also inactive against other arthropods. As

reported by Macêdo et al. (1997), extracts of the aerial parts of V. condensata were devoid of any activity

34

against Aedes fluviatilis at concentrations of 10, 1 and 0.1%, while 0.05% extracts of G. guidonia did not

show significant results against larvae of Aedes aegypti (Coelho et al. 2009).

However, other plants that were ineffective in the present study, namely Magonia pubescens,

Lantana camara, Palicourea marcgravii, Siparuna guianensis and Ocotea velloziana showed insecticidal

and/or acaricidal effects in earlier studies. Fernandes et al. (220a and 2008b) reported larvicidal effect

against R. microplus and R sanguineus of extracts from the stem bark of M. pubescens (LC50 = 365

g/mL). Kumar & Maneemegalai (2008) observed 100% and 84-88% mortality of larvae of A. aegypti

using 0.1% extracts of flowers and leaves, respectively, of L. camara, at half the dose used against ticks

in the present work. These extracts were also active against larvae of Culex quinquefasciatus at

concentrations of 0.3%. High rates of efficacy on engorged females of R. microplus (between 23.9 and

93.1%) were obtained by Silva et al. (2011) with ethyl acetate extracts of leaves of P. marcgravii tested at

concentrations of 0.5-10%. The extract from trunk bark of S. guianensis at 5% caused mortality of 42.5%

in Rhodnius milesi (Alves 2007), while the ethanol extract from the stem bark of O. velloziana showed

LC50 values of 213.70 mg/mL against larvae of A. aegypti (Garcez et al. 2009). These differences

between our results and those obtained in the literature may derive from several factors, such as plant part

assessed, place and season of harvest, solvent and concentration of the extracts, target species and stage

evaluated, among others. (Sidhu et al. 2003; Garcez et al. 2009; Gupta et al. 2010; Kamaraj et al. 2010).

In the present study, the observation that native plants from the Brazilian Cerrado and Pantanal have

efficacy against R. (Boophilus) microplus is of particular interest because it reinforces the need to

preserve these Brazilian biomes as promising sources of bioactive compounds. On the basis of the

significant results obtained with the crude extracts from N. amazonum, S. pseudoquina and O. lancifolia

and, particularly, with that of the fruits of Guarea kunthiana, these species may be considered as potential

candidates for using in integrated tick control programs, boosting the possibility of obtaining natural

products as alternatives to synthetic pesticides, against which the cattle tick has already developed

resistance. These plant species can be exploited in a perfectly sustainable way, since the vegetable parts

used, such as leaves, fruits or bark, do not involve the removal of plants from their environment,

preventing their extinction. So, bioassay-guided fractionation studies on the fruits of G. kunthiana, aiming

at the isolation and characterization of the active compound(s) against the cattle-tick Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, are now underway.

Acknowledgments The authors are grateful to Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino,

Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul for financial support and to Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior for the grants awarded. Thanks are also given to Dr. Arnildo Pott, MSc. Ubirazilda M. Resende,

MSc. Vali J. Pott and MSc. Flávio M. Alves for their assistance in the identification of the plant material.

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Sousa LAD, Soares SF, Júnior HBP, Ferri PH, Borges LMF (2008) Avaliação da eficácia de extratos oleosos de frutos verdes e maduros de cinamomo (Melia azedarach) sobre Rhipicephalus (Boophilus)

microplus (Acari: Ixodidae). Rev Bras Parasitol Vet 17:36-40

Williams LA (1993) Adverse effects of extracts of Artocarpus altius Park. And Azadirachta indica (A.

Juss) on the reproductive physiology of the adult female tick, Boophilus microplus (Canest.). Invert

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38

CAPÍTULO 3 Efeitos do 3-O-tigloilmelianol isolado de Guarea kunthiana

(Meliaceae) sobre o ciclo reprodutivo de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (Acari: Ixodidae)

Resumo

Foi avaliado o efeito do 3-O-tigloilmelianol, isolado de G. kunthiana,

sobre a oogênese, ecdise e como larvicida sobre R. microplus. Para isso a

substância foi utilizada a 0,01% diluído em água destilada e DMSO a 5%, e os

controles foram tratados com água destilada e DMSO a 5%. A massa dos

ovários foi aferida 24, 48 e 72 h após a imersão para obter o índice

gonadossomático (Igs). Para a análise histológica os ovários foram incluídos

em historesina. Foi registrada redução de cerca de 50% do Igs a partir de 48 h

do grupo tratado em relação ao controle. Foi observada redução de 30 a 60%

nos oócitos das fases I, III, IV e V 24 h após o tratamento, sendo que ainda nas

duas últimas fases houve redução após 72 h. Houve redução nos diâmetros

maiores do citoplasma e do núcleo nos oócitos I, após 72 h e do diâmetro

menor do citoplasma, 24 h após o tratamento. O diâmetro maior do núcleo dos

oócitos II foi diminuído 24 h após a imersão. Observou-se redução no diâmetro

maior do citoplasma nos da fase IV. O 3-O-tigloilmelianol provocou alterações

morfológicas evidentes nas fases III e IV, 24 h após o tratamento, seguido de

alteração do depósito do córion bem como do conteúdo citoplasmático. O 3-O-

tigloilmelianol foi testado sobre as larvas a 0,01 a 0,00125% utilizando o teste

“sanduiche”, utilizando em torno de 300 exemplares após 15 a 21 dias de

eclosão. A mortalidade foi avaliada, após 24, 72 e168 h, porém sem registro de

ação. O 3-O-tigloilmelianol foi testado sobre as metalarvas e metaninfas

utilizando o teste de imersão, utilizando 100 exemplares por concentração

entre tratados e controles. As ecdises foram registradas por dez dias.

Observou-se que 60% de redução da ecdise em metalarvas e 20% em

metaninfas na maior concentração. Os resultados desta pesquisa evidenciaram

que as plantas tanto do Cerrado quanto do Pantanal Sul Matogrossense são

promissoras em estudo de triagem. O resultado desta pesquisa evidencia que a

descoberta da ação do protolimonóide 3-O-tigloilmelianol isolado da G.

kunthiana sobre reprodutivo de R. microplus, indica a possibilidade de uma

nova alternativa de produro para o controle desse carrapato.

Palavras chave: bovino, carrapato, histologia, oogênese, ecdise e larvas

39

1. Introdução

O crescente registro de evolução da resistência de R. microplus aos

acaricidas sintéticos (FERNÁNDEZ-SALAS et al., 2012) tem despertado na

comunidade científica a necessidade de realizar novas investigações na busca

de formas alternativas de controle. Diversos ensaios com R. microplus têm

evidenciado que várias plantas são promissoras por conterem substâncias com

potencial acaricida (BORGES et al., 1994; MULLA & SU, 1999; RIBEIRO et al.,

2007, 2008a, 2008b, 2010; SOUSA et al., 2008; CHAGAS et al., 2012).

A maioria dos ensaios são realizados in vitro tanto com extratos brutos

quanto com as substâncias, isoladas para avaliação dos parâmetros de

mortalidade, oviposição e eclodibilidade de R. microplus (BORGES et al., 1994;

PORTER et al. 1995; PRATES et al., 1998; PEREIRA & FAMADAS, 2006;

BROGLIO-MICHELETTI et al., 2010; FERRAZ et al., 2010).

Para avaliar alterações na oogênese de carrapatos os estudos devem

ser baseados na morfologia ovariana descrita por BALASHOV (1972) e, mais

recentemente por SAITO et al. (2005), em R. microplus. DENARDI et al.

(2010), observaram alterações morfológicas em ovários de Rhipicephalus

sanguineus (Latreille, 1806) tratados com Azadirachta indica (A. Juss). Ainda

sobre este mesmo carrapato, DENARDI et al. (2011) detectaram significativa

redução da quantidade de proteína do citoplasma dos oócitos, quando

utilizaram essa mesma planta.

Os extratos de Guarea kunthiana A. Juss. (Meliaceae), nativa da flora

brasileira, é uma árvore de aproximadamente 8m de altura, nesse estudo

provocaram interferência no desenvolvimento do quarto estádio de Rhodnius

milesi (Car. Roch. & Gal. Jurb.) (Hemiptera: Heteroptera) e em larvas de

terceiro estádio de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) (COELHO et al.,

2006). Das sementes de Guarea grandifolia (Reissek) JIMENEZ et al. (1998)

obtiveram o protolimonóide 21α-acetylmelianone que provocou atraso do

desenvolvimento de pupas de Ostrinia nubilalis (Hubner). (Lepidoptera:

Crambidae).

Em estudos preliminares de triagem com 73 extratos etanólicos de 24

famílias de plantas do Cerrado e Pantanal Sul-Matogrossense, sobre fêmeas

ingurgitadas de R. microplus, observou-se que o de G. kunthiana foi a mais

40

eficaz (BARBOSA et al). Esse extrato dessa planta foi submetido a

fracionamentos químicos biomonitorados sobre essa mesma fase do carrapato

utilizando as concentrações de 0,01 a 0,00125%. Essa substância provocou

atraso do início da postura e redução no volume da massa de ovos. Alguns

carrapatos não iniciaram a postura e os que a fizeram, os ovos foram anormais

e inviáveis; apenas uma pequena parte teve eclosão normal (GARCEZ et al.,

2010).

O objetivo deste estudo foi investigar a ação do 3-O-tigloilmelianol sobre

oogênese e fases juvenis do R. microplus.

2. Material e métodos

2.1- Concentrações do 3-O-tigloilmelianol

A substância foi obtida do fruto da G. kunthiana no laboratório de Química

da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFM). O material foi

padronizado para os ensaios e armazenado em frizzer a -12C0. Para a

realização dos estudos histológicos sobre a oogênese, o 3-O- tigloilmelianol foi

utilizado a 0,01% diluído em água destilada e DMSO a 5%. O grupo controle foi

tratado com DMSO a 5% em H2O destilada e outro grupo somente com H2O

destilada. Para os ensaios sobre as metalarvas, metaninfas e como larvicida os

testes foram realizados em triplicata com concentrações a 0,01, 0,050, 0,0025

e 0,00125%.

2.2 Obtenção das fêmeas ingurgitadas de R. microplus

Fêmeas ingurgitadas foram coletadas em rebanhos da Raça Holandesa

infestados naturalmente, pertencentes à fazenda escola da Universidade

Federal de Goiás (UFG), sem exposição a produtos acaricidas sintéticos

comerciais por no mínimo 60 dias. Os carrapatos foram higienizados, secos

com papel toalha e selecionados quanto à condição morfológica externa sob

estereomicroscópio (Leica® com aumento de 40x) e padronizadas entre 170 e

190 mg (BENETT, 1974).

Algumas fêmeas ingurgitadas foram incubadas para a obtenção de

larvas, parte das quais foram testadas nos bioensaios larvicidas e as outras

foram utilizadas para infestação de coelhos visando a obtenção de metalarvas

41

e metaninfas para os testes de muda. Câmaras de alimentação de etil vinil

acetato (EVA - 5 cm x 7 cm) com abertura central de 4 x 6 cm foram fixadas

com adesivo Brascoplast nas costas de quatro coelhos adultos Oryctolagus

cuniculus, (Leporidae) L., 1758. Cerca de 400 larvas foram distribuídas em

cada câmara e fechadas com tecido de algodão. No sexto dia da infestação

coletaram-se as metalarvas e ao 12o dia as metaninfas.

Durante os ensaios as colônias foram mantidas em BOD a 27ºC ±1, UR

de 90%, em escotofase. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê

de ética na experimentação com animais da UFG (Protocolo no 221/2009).

2. 3 Tratamento dos indivíduos

2. 3. 2 Ensaios da oogênese

Para os estudos sobre a oogênese, foram utilizadas 72 fêmeas

ingurgitadas distribuídas em três grupos de 24 indivíduos, entre tratados e

controles. Os diferentes grupos experimentais de teleógenas foram submersas

em 10 mL da solução tanto da substância quanto do controle por cinco

minutos, conforme DRUMOND (1973), secas e acondicionadas em placas de

Petri. Posteriormente foram dissecadas e os ovários extraídos 24, 48 e 72 h

após a imersão.

2.3.1 Ensaios com as larvas, metalarvas e metaninfas

Para cada concentração, aproximadamente 300 larvas de 15 a 21 dias

de idade (AMARAL, 1993) foram avaliadas adotando-se o método do

“sanduíche” descrito por SHAW (1966). As larvas foram colocadas sobre um

disco de papel filtro Whatman número 01 com 14 cm de diâmetro no interior de

uma placa de Petri. Em seguida foram despejados sobre estas 5 mL da

solução, cobrindo-se com outro disco de papel de filtro e despejados mais 5

mL. As larvas permaneceram nessas condições por 10 minutos e logo “os

sanduiches” foram retirados da placa, abertos e secos com papel absorvente.

As larvas foram transferidas com pincel para envelopes de 5x10 cm de papel

filtro, previamente identificados com a concentração, número da repetição e o

42

tempo de tratamento, em seguida incubados em BOD a 27oC com 90% UR de .

Leituras de mortalidade foram realizadas 24, 72 e 168 h após a imersão, sob

estereomicroscópio Leica® com aumento de 40x, considerando em cada tempo

de avaliação tanto no tratado quanto no controle as vivas e as mortas.

Foram utilizadas 100 metalarvas e 100 metaninfas para cada uma das

concentrações e, também100 indivíduos para cada grupo controle. Os

carrapatos foram colocados em frascos de vidro de 1,5 cm de diâmetro e 4 cm

de altura contendo 1 mL da solução teste e permanecendo submersos por

cinco minutos. Após, desprezou-se o conteúdo e os espécimes foram secos e

transferidos para frascos iguais vedados com algodão esterilizado e incubados.

Diariamente, por 10 dias, foi registrada a ecdise.

2. 3. 2. 1 Obtenção dos ovários

Para proceder à extração, as fêmeas foram imobilizadas em freezer a

-18oC por cinco minutos e seus ovários foram dissecados sob

esteriomicroscópio Leica® com aumento de 40x, utilizando solução salina

(NaCl 7.5 g/L, Na2HPO4 2.38 g/L e KH2PO4 2.72 g/L). Os ovários tiveram o

peso aferido e foram depositados em eppendorfs contendo solução de

formaldeído a 4% e glicose em pH= 7,4 por 24 horas. Após este período,

descartou-se a solução de fixação e completou-se com 3 mL de álcool etílico a

70% e o material foi armazenado em geladeira (JUNQUEIRA & JUNQUEIRA,

1983).

Para quantificar a interferência do 3-O-tigloilmelianol sobre o

desenvolvimento dos ovários, foi realizado o cálculo do índice gonatossomático

(Igs), dividindo-se a média da massa das oito fêmeas (MF) pela massa total

dos ovários (MO), tanto do grupo controle quando do tratado, para cada

período de avaliação.

2. 3. 2. 2 Histologia

De cada ovário foram seccionados 0,5 cm da porção proximal do oviduto

sob estereomicroscópio. As porções foram desidratadas em concentrações

crescentes de etanol e inclusas em historesina (LEICA, Historesin, USA). Em

24 horas ocorreu a polimerização e de cada bloco foram obtidos 30 cortes

43

histológicos de 2,0 µm de espessura com ultra-micrótomo (LEICA, Ultracut

UCT, USA®) e distribuídos em três lâminas de microcopia. Em seguida foram

corados com azul de toluidina a 1% (p/v) e pH= 8,4 (VETEC, Brasil); as lâminas

foram secas e cobertas com Entelan e os cortes foram protegidos com

lamínulas. (JUNQUEIRA & JUNQUEIRA, 1983).

Para as análises histológicas foram realizadas fotomicrografias dos

ovários em microscópico fotônico (LEICA DMLB - USA) acoplado ao sistema

de captura de imagem (câmera Samsung Color Digital SHC 410 NAD), com as

objetivas de 20 e 40x.

Para a contagem total dos oócitos, todos os tipos celulares do campo

foram observados. Primeiramente os oócitos foram classificados de acordo

com as fases descritas para R. microplus (SAITO et al., 2005), seguido de

contagem de cada fase observada. A análise dos efeitos tóxicos da substância

sobre os oócitos baseou-se na caracterização das fases da oogênese, também

descrita por este autor. A fase que apresentou alteração morfológica foi

fotografada assim como o respectivo controle.

2.3.2.3 Morfometria

O estudo morfométrico das fases da oogênese foi realizado com o

Programa Imagem Pro-Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA),

utilizando os parâmetros diâmetro citoplasmático maior e menor de todas as

fases da oogênese e o diâmetro nuclear maior e menor dos oócitos I e II, visto

que o núcleo é mais evidente nessas fases da oogênese. Para tanto, foram

confeccionadas três lâminas com dez cortes para cada ovário, totalizando 24

lâminas e 240 cortes por grupo experimental. Destes, foram selecionados um

corte por lâmina e obtidas três imagens para cada fase da oogênese,

totalizando 15 imagens por lâmina e 360 imagens por grupo experimental. Para

a análise morfométrica de cada fase foram avaliadas 72 imagens perfazendo

um total de 1.440 imagens de todos os oócitos.

Para a análise das alterações morfológicas, os oócitos foram

padronizados de forma que todos estivessem no mesmo plano de corte,

quando eram observadas estruturas nucleares evidentes tanto nos grupos

tratados quanto nos controles.

44

2. 4 Análise estatística

As análises dos dados foram realizadas com o programa estaística 7.0

(Statsoft Inc., 2005) por meio do teste paramétrico ANOVA. As comparações

das médias relacionadas com o estudo de oogênese foram feitas pelo teste de

Tukey. Para a determinação da significância das médias obtidas nos ensaios

com as larvas utilizou-se o teste t de Student e para as metalarvas e

metaninfas o teste de Friedman. Os resultados foram considerados

significativos quando (p < 0,05).

3. Resultados

O Igs das fêmeas tratadas e avaliadas 24 h após a exposição foi similar

ao valor obtido com as fêmeas do grupo controle. Por outro lado, os grupos

avaliados 48 e 72h após o tratamento tiveram cerca de 50% de redução do Igs

em relação ao controle. Desta forma as próximas avaliações foram

direcionadas para os períodos de 24 e 72 h, para ampliar as observações

(Figura 1 e Tabela 1). Quanto aos controles, também se observou que os

grupos tratados com DMSO a 5% mais H2O destilada e aqueles que receberam

somente H2O destilada, não diferiram quanto ao desenvolvimento dos ovários.

Optando-se, portanto, pelo grupo que foi tratado com DMSO a 5% mais H2O

destilada, pelo fato de ter o solvente.

FIGURA 1. Ovários de 8 R. microplus tratados com 3-O-tigloilmelianol a 0,01% (T) e os controles com DMSO a 5% mais H2O (D) destilada e outro somente com H2O destilada (H), dissecados 24 h (A), 48 h (B) e 72 h (C). O 3-O-tigloilmelianol provocou alteração do número de oócitos, tanto após

24 quanto 72 h. Foi observada redução significativa de 30 a 60% dos oócitos

das fases I, IV e V nos grupos tratados e observados nos dois tempos

avaliados, com maior redução nos oócitos da fase IV. Os oócitos II não foram

A B C

45

reduzidos em qualquer tempo após o tratamento, enquanto os oócitos III foram

reduzidos somente 24 h após exposição (Tabela 2).

Alterações nos diâmetros dos oócitos foram observadas principalmente

dos oócitos da fase I. Houve redução de 15,6% no diâmetro maior do

citoplasma e 11,6% no diâmetro maior do núcleo, 72 horas após o tratamento,

e 33,5% do diâmetro menor do citoplasma 24 horas após. Nos oócitos II

somente o diâmetro maior do núcleo foi diminuído em 17,6% no grupo avaliado

24 h após a exposição ao 3-O-tigloilmelianol.

46

TABELA 1. Média ± DP da massa das fêmeas (MF), massa dos ovários (MO) em g e Índice gonadossomático (Igs) de Rhipicephalus microplus tratados com 3-O–tigloilmelianol a 0,01% após 24, 48 e 72 h da exposição.

24 h 48 h 72 h

Controle Tratado Controle Tratado Controle Tratado

MF 0,185±0,006 a 0,183±0,003a 0,179±0,008a 0,183±0,009a 0,180±0,009a 0,180±0,07a

MO 0,007±0,001a 0,006±0,002a 0,015±0,004b 0,007±0,002a 0,027±0,004a 0,013±0,003b

Igs 0,038 ±0,007 a 0,032±0,01a 0,083±0,02b 0,038±0,009a 0,150±0,026a 0,072±0,02b

Médias seguidas da mesma letra nas linhas, no mesmo tempo de observação, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)

TABELA 2. Média ± DP do número de oócitos de cada fase do estágio da oogênese de Rhipicephalus microplus tratados com 3-O–tigloimelianol a 0,01% após 24 e 72 h da exposição.

24 h

72 h

Controle Tratado Controle Tratado

OI 25,50±7,61a 17,46±8,19b 20,08±8,37a 15,71±5,49a

OII 19,71±9,22a 16,25±7,93a 18,63±4,25a 14,92±5,58a

OIII 18,67±8,31a 12,88±6,48b 16,17±3,52a 12,42±4,68a

OIV 14,71±5,29a 6,25±2,98b 17,96±6,36a 11,50±3,40b

OV 17,58±4,56a 11,50±3,69b 21,54±5,96a 17,21±4,14b

Total 96,17±20,49a 64,33±12,98b 94,38±13,79a 71,75±12,52b

Médias seguidas da mesma letra nas linhas, não diferem significativamente

entre si pelo teste de Tukey (p0,05)

47

Os oócitos III e V não tiveram qualquer alteração, enquanto os oócitos

da fase IV tiveram redução de 13,1% no diâmetro maior do citoplasma após 24

h da exposição (Tabela 3).

TABELA 3. Média ± DP do diâmetro (µm) maior e menor do citoplasma (DMC e DmC) e diâmetro maior e menor do núcleo (DMN e DmN) de Rhipicephalus microplus tratados com a 0,01% 3-O-tigloilmelianol 24 e 72 h após a imersão.

DMC DmC DMN DmN

OI

C24 54,35±15,80a 48,11±15,12a 14,06±5,78a 15,78±6,35a

T24 41,59±13,54a 32,01±9,41b 12,20±3,84a 14,88±4,55a

C72 61,41±31,81a 42,75±24,48a 21,02±10,72a 27,15±11,85a

T72 51,85±12,36b 42,63±11,44a 18,55±4,59b 22,39±5,46a

OII

C24 66,92±15,82a 58,14±15,81a 18,17±5,46a 21,67±6,16a

T24 67,58±17,01a 53,45±13,70a 15,00±5,80b 16,69±6,36a

C72 75,45±22,79a 60,12±28,01a 24,19±10,27a 28,36±10,68a

T72 71,48±30,46a 56,21±20,12a 23,64±10,00a 27,56±11,17a

OIII

C24 82,77±17,49a 73,75±16,10a - -

T24 80,02±18,71a 67,30±15,67a

C72 91,86±17,36a 76,60±25,33a - -

T72 91,89±27,25a 73,75±14,61a - -

OIV

C24 114,03±37,21a 95,61±33,87a - -

T24 99,09±19,16b 90,12±17,33a - -

C72 122,42±35,63a 99,72±26,92a - -

T72 108,67±19,36a 89,00±16,08a - -

OV

C24 163,06±64,15a 137,41±42,91a - -

T24 148,65±45,51a 134,14±61,46a - -

C72 198,20±33,06a 172,85±45,86a - -

T72 195,02±47,80a 163,51±26,74a - -

Médias seguidas da mesma letra, entre controle e tratado, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Observações morfológicas do grupo controle

Ao analisar os oócitos das fases pré-vitelogênicas e vitelogênicas do

grupo controle foram observadas as características que constam na Figura 2. A

48

fase do oócito I (A) – apresenta aspecto arredondado, com citoplasma

homogêneo e ausência de grânulos de vitelo e vesícula geminal denominada

de núcleo e, nessa fase o nucléolo é evidente. O núcleo ocupa grande parte do

citoplasma. Os oócitos II (B) - apresentam o volume do núcleo mais retraido e

aumento do citoplasma. Observa-se o início do depósito de grânulos

citoplasmáticos não corando com azul de toluidina e, o nucléolo reativo fica

evidente. Nos oócitos III (C) o citoplasma está arredondado e com evidente

presença de grânulos de vitelo, evidenciados por pequenos pontos corados

distribuidos homeogeneamente no citoplasma. A estrutura nuclear está próximo

do pedicelo. O córion está delgado e corado em azul claro. Nos oócitos III/IV

(D) é possível observar a presença de grânulos de vitelo corados em azul

intenso, distribuidos por toda a área citoplasmática. O núcleo e o nucléolo se

localizam na periferia do citoplasma. O córion é corado em azul claro e mais

espesso. Nos oócitos V (E) observa-se a predominância de grânulos de vitelo

por todo o citoplasma. Nessa fase, o núcleo e o nucléolo deixam de existir. O

córion continua espesso e corado em azul claro.

FIGURA 2. Cortes histológicos de ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus do grupo controle tratado com DMSO a 5% mais H2O e corados com azul de toluidina. Oócito I (A); Oócito II (B); Oócito III (C); Oócito III/IV (D); e Oócito IV (E) e Oócito V no oviduto (F); Citoplasma (ct); Córion (cr); Nucléolo (nl); Núcleo (nc); Pedicelo (pe). Barra =100 µm

OI OIII OII

OV

OIII/OIV OIV

B A C

F E

nc nc nc

nc nc

nc nc

nc nc

nl

nl OI

nl nl

cr

cr cr

cr

pe

pe pe

pe

100µ 100µ 100µ

100µ 100µ 100µ

ct ct ct

ct

ct

ct

pe

D

49

Observações morfológicas do grupo tratado

O 3-O-tigloilmelianol provocou alterações morfológicas evidentes nos

oócitos das fases III e IV 24 h após o tratamento, com marcada ondulação do

córion em todo o contorno dos oócitos. Houve também irregularidade na

disposição do conteúdo citoplasmático. Enquanto os oócitos I, II e V não

apresentaram alterações histopatológicas (Figura 3).

FIGURA 3. Cortes histológicos de ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus tratados a 0,01% de 3-O-tigloilmelianol e corados com azul de toluidina. Grupo tratado. Oócito I (A); Oócito II (B); Oócito III (C); Oócito III/IV (D) e Oócito V no oviduto (E) e Citoplasma (ct); Córion (cr); Nucléolo (nl); Núcleo (nc); Pedicelo (pe). Barra =100 µm

Quando o 3-O-tigloimelianol foi testado para se conhecer a sua ação

sobre a ecdise de metalarvas e metaninfas, os picos de muda concentraram-se

em aproximadamente quatro dias após os tratamentos e em dois dias nos

controles. Em todas as concentrações testadas, a ecdise das metalarvas variou

de 40 a 81% e no controle foi de 97%; as metaninfas tiveram 74% de ecdise

quando tratadas na maior concentração e o controle apresentou 96% (Tabela

4).

A 100µ 100µ 100µ

100µ 100µ

nl

nl nc

nc nc

nc

nc

pe

cr

pe

cr

pe

c

pe

c

pe

c

OI OII

OIII/IV

OIII

OV OIII/IV cr

B C

D E

cr

50

TABELA 4. Médias ± DP do percentual de ecdise de metalarvas e metaninfas de Rhipicephalus microplus tratadas com diferentes concentrações de 3-0-tigloimelianol

Concentrações Estágios

Metalarva Metaninfa

0,01 40,0 ± 1,7a 74,0 ± 2,99a

0,05 40,8 ± 2,4a 83,0 ± 2,06b

0,0025 54,0 ± 1,4a 87,0 ± 2,16b

0,00125 81,0 ± 1,2a 90,0 ± 1,15b

Controle 95,0 ± 0,7b 96,0 ± 0,97b

ANOVA; teste Student (p<0,05) para comparação de médias seguidas de letras minúsculas diferentes nas colunas são significativamente diferentes.

Nos ensaios com esta substância em larvas foi observado que este

estágio não foi suscetível nas diferentes concentrações nem nos diferentes

tempos de observação, uma vez que todas as larvas sobreviveram tanto nos

grupos tratados quanto nos controles.

4. Discussão

O protolimonóide 3-O-tigloilmelianol teve ação sobre a oogênese das

fêmeas ingusgitadas e a muda das metalarvas e metaninfas, mas não sobre as

larvas, o que indica a possível atividade sobre o sistema endócrino. O atraso e

redução da oviposição com comprometimento da embriogênese foi observado

por GARCEZ et al. (2010) e MIGUITA (2011) quanto testaram este

protolimonóide de 0,01 a 0,000125% sobre R. microplus, sem registro de morte

das fêmeas. Sabe-se que os limonóides e protolimonóides atuam no sistema

endócrino de insetos, interferindo na vitelogênese e alterando o crescimento e

processo de ecdise, além de outros efeitos deletérios (SIEBER & REMBOLD

1983; MORDUE et al., 1985; REMBOLD 1987; MORDUE & BLACKWELL

1993; JIMENEZ et al., 1998; BOHNENSTENGEL et al., 1999; VALLADARES et

al., 1999; MORDUE & NISBET, 2000). Os hormônios ecdisteróides controlam o

desenvolvimento dos estádios imaturos dos carrapatos exercendo efeito sobre

a ecdise; nas fêmeas funcionam na regulação das glândulas salivares, na

produção de feromônios sexuais, na oogênese e oviposição (REES, 2004).

51

Quando os carrapatos se desprendem dos hospedeiros possuem

reservas de nutrientes para transformar aproximadamente 50% do peso em

ovos (SONENSHINE, 1991). Esses nutrientes são utilizados na respiração

celular, detoxificação de produtos nitrogenados, ativação do crescimento e

processo de diferenciação no corpo gorduroso e tecido ovariano para atender a

oogênese, principalmente durante a vitelogênese (DIEHL et al 1991). A

substância pode ter interferido no processo de mobilização dos nutrientes, e o

mecanismo de detoxificação pode ter sido ativado pela presença do 3-O-

tigloilmelianol, implicando no redirecionamento dos nutrientes explicando em

parte os efeitos observados sobre a oogênese.

A substância atuou nas fases pré-vitelogênicas onde provocou redução

do número e diâmetro dos oócitos da fase I e reduziu o diâmetro do núcleo da

fase II. As alterações observadas nessas fases podem ser devido à maior

sensibilidade em função do processo de amadurecimento dos oócitos, uma vez

que SAITO et al. (2005) observaram uma significativa movimentação de

material nuclear para o citoplasma através dos poros nucleares, provavelmente

com RNA ribosômico, e aumento do número de ribossomos com presença de

material eletrondenso nessa estrutura.

O 3-O-tigloilmelianol reduziu o número de oócitos da fase III e o diâmetro

e número destes na fase IV. Também causou alterações morfológicas

evidentes tanto no citoplasma quanto do córion das referidas fases. Esse efeito

pode ser a consequência da ação do 3-O-tigloilmelianol nas fases anteriores,

uma vez que nesse período ocorre a síntese da vitelogenina no tecido adiposo

e intestino médio dos carrapatos que é transportada para o interior dos oócitos

pelas microvilosidades presentes na superfície interna destes

(SONENSHINE,1991). O desenvolvimento anormal da gema devido à ação de

azadirachtina foi comprovada por DENARDI et al. (2010) que observaram

diminuição da síntese de proteína quando o produto foi testado a 10% sobre

fêmeas ingurgitadas de R. microplus. O 3-O-tigloilmelianol parece ter

desempenhado ação semelhante, interferindo na síntese da vitelogenina ou

captação e depósito da vitelina, uma vez que se observou anormalidade do

volume do conteúdo dos oócitos.

Outro efeito relevante da ação do 3-O-tigloilmelianol foi com relação à

disposição irregular do córion dos oócitos da fase III/IV. SAITO et al. (2005),

52

descreveram que em R. microplus o córion é formado por um material

electrodenso de natureza lipoprotéica produzido pelos oócitos, que é

depositado no espaço entre a membrana plasmática e a lâmina basal.

Resultados semelhantes aos aqui descritos foram observados por DENARDI et

al. (2010) que verificaram que, entre outras alterações, o córion de oócitos

maduros sofreu modificações, com dobras e deformações em toda sua

extensão, devido à ação de azadirachtina sobre fêmeas ingurgitadas de

Rhipicephalus sanguineus (Latreille, 1806). Houve redução do número de

oócitos V, sem comprometer o diâmetro; isso pode ser explicado, em parte,

porque nessa fase os oócitos estão se desprendendo da parede do ovário e

muitos já se encontram no oviduto.

Efeitos sobre os oócitos semelhantes aos aqui descritos também foram

observados por ARNOSTI et al. (2011), in vivo, com fêmeas ingurgitadas de R.

sanguineus fixadas em coelhos alimentados com ração comercial contendo 1 e

5 g de ester do ácido ricinoleico isolado de Ricinus communis L.

(Euphorbiaceae). Os resultados mais evidentes foram obtidos com a maior

dose, observando-se mudanças no conteúdo citoplasmático dos oócitos com

redução das fases I e II, com consequente redução do desenvolvimento das

fases III, IV e V.

O 3-O-tigloilmelianol atuou de forma diferente na ecdise de R. microplus;

a sensibilidade das metaninfas foi mais baixa com relação às metalarvas. A

baixa ação sobre ninfas foi observada também por SOUSA et al. (2011) que

avaliaram concentrados emulsionáveis obtidos a partir de frutos verdes de M.

azedarach (L.) e observaram que esses instares foram mais resistentes frente

aos tratamentos em comparação aos demais. HACKMAN & FILSHIE (1982)

observaram que em R. microplus a camada cuticular fica evidente na pós

ecdise das ninfas e nos adultos. Nos ixodideos, nessas fases observa-se

atividade das glândulas dermais tipos I e II, que secretam lipídios que, entre

outras funções, protegem contra a desidratação (SONENSHINE, 1991;

HACKMAN, 1982). O 3-O-tigloilmelianol possivelmente pode ter se beneficiado

da reduzida espessura da cutícula das metalarvas, acentuando a ação no

processo da ecdise.

As larvas não foram afetadas pelo 3-O-tigloilmelianol. Resultado

semelhante foi observado por GIGLIOTI (2010), que testou o limonóide

53

azadiractina em diferentes concentrações sobre larvas de R. microplus e não

observou mortalidade.

A comprovação da bioatividade do 3-O-tigloilmelianol sobre as fases da

oogênese e o prolongamento do início da ecdise, bem como a redução do

número de metalarvas realizando este evento, indica que o sistema endôcrino

tenha sido afetado. O fato de que ambas as fases estarem com a cutícula

delgada possivelmente pode ter permitido a penetração da substância. A ação

do 3-O-tigloilmelianol sobre R. microplus permite incluir este metabólito em um

seleto grupo de substâncias promissoras no controle desse carrapato. Porém,

as alterações descobertas neste estudo merecem maiores investigações para

facilitar a interpretação do mecanismo de ação dessa substância.

A descoberta da ação deste protolimonóide vem de encontro com uma

necessidade urgente de se obter uma nova alternativa de possível produto para

o controle de R. microplus. O fato do 3-O-tigloilmelianol ter sido bioativo nesse

experimento sinaliza que também pode ser efetivo em outros ixodídeos.

54

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58

CAPÍTULO 4: Considerações Finais

A triagem de plantas do Cerrado e do Pantanal Sul- Mato-grossense

para isolamento de espécies bioativas em R. microplus é uma alternativa

viável. Fica evidente que as parcerias multidisciplinares são importantes no

sentido de ampliar os resultados, uma vez que, a magnitude dos achados foi

possível somente a partir de conhecimentos específicos dos pesquisadores de

cada área envolvidos na execução do projeto.

A bioatividade in vitro do protolimonóide 3-O-tigloimelianol, isolado de G.

kunthiana, sobre metalarvas, metaninfas e oogênese de R. microplus, sinaliza

a necessidade de outros estudos para elucidar totalmente o mecanismo de

ação dessa substância. Também, se fazem necessários estudos toxicológicos,

bem como, da estabilização farmacológica do composto para a realização dos

ensaios in vivo.

A possibilidade de utilização dessa substância para o controle de R.

microplus em detrimento a sua resistência aos acaricidas usuais, vem de

encontro com a necessidade de sustentabilidade de uso dos recursos naturais.

O fato de ter isolada uma substância bioativa de planta sinaliza que estas

devem ser preservadas o que também pode gerar uma fonte de renda para

comunidades da agricultura familiar.

A principal importância da descoberta é a possibilidade do uso dessa

substância como uma alternativa aos acaricidas usuais, o que vem de encontro

com o maior problema da produção de grupos genéticos bovinos sensíveis ao

R. microplus, que atualmente enfrenta um sério problema de resistência, com

registro de cepas inssensíveis a todos os produtos químicos disponíveis para o

controle desse carrapato.

A possibilidade de produtos alternativos oriundos das plantas sinaliza

que os estudos dessa linha de pesquisa são promissores, uma vez que o clima

tropical oferece um rica flora que está disponível para ser investigada visando

obter diversas substância bioativas contra o R. microplus.