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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E CIÊNCIAS AMBIENTAIS

CAMPUS II – AREIA – PB

CURSO DE AGRONOMIA

COMPORTAMENTO IN VITRO DE Chalara paradoxa SOB DIFERENTES

CONDIÇÕES DE CULTIVO

TARCIANA SILVA DOS SANTOS

AREIA – PB

ABRIL/2013

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Trabalho de graduação apresentado à

coordenação do Curso de Agronomia da

Universidade Federal da Paraíba, Centro de

Ciências Agrárias para a obtenção do Título de

Engenheira Agrônoma.

ORIENTADORA: Profª. Dra. Luciana Cordeiro do Nascimento

AREIA – PB

ABRIL/2013

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MONOGRAFIA APROVADA EM: ________/____________________/________

BANCA EXAMINADORA

Profª. Dra. Luciana Cordeiro do Nascimento

Orientadora - UFPB/CCA

Msc. Wilza Carla Oliveira de Souza

1º Examinadora - UFPB/PPGA

Msc. Andréa Celina Ferreira Demartelaere

2º Examinadora - UFPB/PPGA

AREIA – PB

ABRIL/2013

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Á Deus por iluminar todos os dias de minha vida, e por me ajudar a

encontrar o caminho correto.

Aos meus pais e meus irmãos, pela força, apoio, amor em todos os

momentos bons e ruins.

DEDICO

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AGRADECIMENTOS

À Deus, por mais esse importante passo na minha vida. Por tudo que venho

conquistando e posso conquistar, pela coragem, saúde e disposição durante a minha

formação acadêmica.

Aos meus pais, José Benedito dos Santos e Maria José Silva dos Santos, por todos

os esforços para que pudesse estudar e que sempre me ajudaram, e em momento algum me

deixaram só. Agradeço a eles, por terem me dado o legado da educação e respeito com o

próximo, apesar das dificuldades.

A meus irmãos, Tarcila Silva dos Santos e Oscar Benedito dos Santos, pelo carinho,

amizade e apoio.

À professora, Dra. Luciana Cordeiro do Nascimento, pela orientação, dedicação,

compreensão e disponibilidade para realização deste trabalho;

A Ms. Wilza Carla Oliveira de Souza, por ter contribuído com esse trabalho e pelas

valiosas sugestões.

A todos os grandes mestres que passaram na minha vida até aqui. Em especial ao

CCA/UFPB, aos professores, amigos e todos os funcionários, principalmente os que fazem

parte do Laboratório de Fitopatologia e que contribuíram para realização desse trabalho.

A Eliazar Felipe de Oliveira e toda sua família por terem sempre acreditado no meu

sucesso e contribuído para tal realização. Agradeço pelo amor, carinho e os conhecimentos

que me passou de forma clara e paciente.

Aos meus melhores amigos Juliana Vidal, Sayonara, Rosa Pessoa, Luana Santos,

Alânia Bento, Sérgio José, Livânia Santos, José dos Santos, Josivaldo Genuino e Cristiane

Rodrigues pelo apoio em todas as horas.

E a todos aqueles que não foram citados, mas que de alguma forma contribuíram

para minha formação acadêmica, o meu muito obrigado.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 01

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 02

2.1 GERAL .............................................................................................................. 02

2.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................. 02

3. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 02

3.1. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DO ABACAXIZEIRO ......................... 02

3.2. PODRIDÃO NEGRA DO ABACAXIZEIRO ............................................ 04

3.3. EPIDEMIOLOGIA DA PODRIDÃO NEGRA .......................................... 04

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 06

4.1 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS E PREPARAÇÃO DOS MEIOS .......... 06

4.2 MEIOS DE CULTURA ................................................................................. 06

4.3 INCUBAÇÃO DO FUNGO .......................................................................... 06

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................... 07

4.5 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL ..................................... 07

4.6 AVALIAÇÃO DA ESPORULAÇÃO E GERMINAÇÃO ......................... 07

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 08

5.1 CRESCIMENTO MICELIAL ..................................................................... 08

5.2 ESPORULAÇÃO ........................................................................................... 10

5.3 GERMINAÇÃO ............................................................................................. 13

6. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 15

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 16

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Desdobramento de interação tripla significativa (meios de cultura x regimes de

luz x temperaturas) com Chalara paradoxa para a variável crescimento micelial... .......... 09


luz x temperaturas) de Chalara paradoxa para a esporulação (1,0 x 104/ml).... ................. 12


luz x temperaturas) com Chalara paradoxa para a variável germinação (1,0 x 104/ml).. .. 14

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SANTOS, T. S. Comportamento in vitro de Chalara paradoxa sob diferentes condições

de cultivo. Areia – PB, 2013. 20p. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em

Agronomia). – Universidade Federal da Paraíba.

RESUMO - A podridão negra do fruto do abacaxizeiro Ananas comosus L., causada pelo

fungo Chalara paradoxa, é considerada a principal doença pós-colheita dessa cultura,

sendo responsável por perdas elevadas em frutas destinadas ao consumo in natura e

indústria. Estudos são escassos no que concerne o conhecimento morfofisiológico e

nutricional desse patógeno, visando pesquisas que envolvam diferentes condições de

cultivo, como meios de cultura, temperaturas e luminosidades, que são fatores essenciais

para determinação do comportamento do patógeno. Portanto, o objetivo do trabalho foi

avaliar o comportamento in vitro do C. paradoxa em diferentes condições de cultivo,

visando o crescimento, a esporulação e a germinação, podendo obter informações que

possam subsidiar o manejo do patógeno em condições de campo. Os meios de cultura

utilizados foram (Batata – dextrose-ágar, Aveia-dextrose-ágar, Abacaxi-dextrose-ágar e

leite de coco-dextrose-ágar), sob temperaturas de 15, 25 e 35°C e diferentes regimes de

luminosidades (claro contínuo, escuro contínuo e alternância luminosa) em B.O.D. O

crescimento micelial foi avaliado diariamente, medindo-se em dois sentidos

diametralmente opostos durante cinco dias, período em que o crescimento fúngico

completou toda extensão da placa de Petri. Foi avaliada a taxa de esporulação e

germinação através da suspensão de conídios pela adição de 2 mL de ADE em placas

contendo a colônia fúngica, sendo observado em hemacitômetro. O delineamento

experimental foi inteiramente casualisado com cinco repetições, em arranjo fatorial (4 x 3

x 3). Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas

entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados mostraram que as

melhores condições de cultivo in vitro de C. paradoxa para crescimento micelial,

esporulação e germinação, foram obtidas na temperatura de 25°C, para os meios AV e

BDA em alternância luminosa e o meio BDA com regime escuro contínuo.

Palavras-chaves: Ananas comosus L., Podridão negra, Crescimento micelial, Esporulação,

Patogênese

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SANTOS, T. S.. In vitro behavior of Chalara paradoxa under different culture

conditions. Areia – PB, 2013. 20p. Work for course conclusion (Undergraduation in

Agronomy)- Universidade Federal da Paraíba, Centro Ciências Agrárias – Areia – PB –

Brazil.

ABSTRACT - The black rot of pineapple fruits (Ananas comosus L.), caused by the

Chalara paradoxa, is considered the main post harvest disease of this crop, causing high

losses in fruit for the fresh market and industry. Studies are scarce regarding the

knowledge and nutritional morphophysiological best conditions of this pathogen involving

different culture conditions, such as culture media, temperatures and luminosities, which

are key factors in determining the behavior of the pathogen. Therefore, the objective of this

work was to evaluate the in vitro behavior of C. paradoxa in different growing conditions,

mycelial growth, sporulation and germination while information that can support the

management of the pathogen under field conditions. The culture media used was (potato -

dextrose agar, oat dextrose agar, dextrose agar pineapple and coconut milk dextrose agar),

at 15, 25 and 35 ° C and different luminosities (continuous light, continuous dark and

alternating light) in BOD. Mycelial growth was assessed daily by measuring in two

diametrically opposite directions for five days, during which fungal growth has completed

entire length of the Petri dish. It was evaluated the rate of germination and sporulation of

conidia suspension by the addition of 2 mL of distilled water in plates containing the

fungal colonies, and observed in hemacytometer. The experimental design was completely

randomized with five replications in a factorial design (4 x 3 x 3). Data were subjected to

analysis of variance and means were compared by Tukey test at 5% probability. The

results showed that the best conditions for in vitro cultivation of C. paradoxa for mycelial

growth, sporulation and germination were obtained at 25 °C, for OAT and PDA in

alternating light and PDA with continuous dark regime.

Keywords: Ananas comosus L., black rot, mycelial growth, sporulation, pathogenesis

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1. INTRODUÇÃO

O Brasil é um dos líderes mundiais na produção e na exportação de vários produtos

agropecuários, apresenta expressivo crescimento no comércio internacional do

agronegócio, consolidando sua posição como um dos maiores produtores e exportadores de

alimentos para mais de 200 países. (MAPA, 2013). Sendo o terceiro produtor de frutas,

superando apenas pela China e Índia (SANTIAGO; ROCHA, 2001). No entanto, de modo

geral, ainda reportam se perdas de trutas e hortaliças da ordem de 30 a 40% (GOMES,

1996).

O abacaxizeiro é uma planta monocotiledônea da ordem Poales, família

Briomeliacea, subfamília Bromelioideae, gênero Ananas, espécie Ananas comosus

(MATOS, 1995). O seu fruto pode ser consumido na forma in natura, sorvetes, doces,

picolés, refrescos e sucos caseiros. Em regiões secas e quentes obtêm-se vinho doce e

fermentado, sendo o suco do fruto verde utilizado como vermífugo em alguns países

(MEDINA et al., 1987).

Um grande desafio ao cultivo de abacaxizeiro são as doenças fúngicas que afetam o

desenvolvimento da cultura, a produtividade e a qualidade dos frutos pós-colheita

(GRANADA et al., 2004). Dentre estas doenças destaca-se a podridão negra do

abacaxizeiro sendo considerada uma das mais importantes em pós-colheita, no

armazenamento e transporte de frutos (ALVES et al., 2009).

O agente etiológico da podridão negra é o fungo Chalara (Thielaviopsis) paradoxa

(De Seynes) Hoehn, cuja forma teleomórfica corresponde a Ceratocystis paradoxa (Dade)

C. Moreau. (MICHEREFF, 2013). É considerado um patógeno agressivo e de difícil

controle, cujo sintoma característico é o progressivo escurecimento e apodrecimento da

casca e da polpa, inviabilizando a comercialização dos frutos, principalmente para locais

distantes (FERRARI, 2009). A incidência da podridão negra é intensificada pela

associação da temperatura amena, na faixa de 25 °C e um período de molhamento de 24

horas. (ALVES et al., 2009).

O meio de cultura, a temperatura e a luminosidade são fatores essenciais para

determinação do comportamento do patógeno em condições in vitro, auxiliando na

estimativa de condições ideais para o progresso da doença no campo. Os estudos

relacionados ao conhecimento morfofisiológico e nutricional deste patógeno ainda são

escassos na literatura. Assim, a pesquisa relacionada a esses fatores poderá incrementar nas

estratégias de manejo integrado de C. paradoxa.

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2. OBJETIVOS

2.2. GERAL

- Avaliar o comportamento in vitro do fungo C. paradoxa em diferentes condições de

cultivo.

2.3. ESPECÍFICOS

- Analisar o crescimento, a esporulação e a germinação de C. paradoxa em diferentes

meios de cultura, temperaturas e regimes de luminosidade;

- Obter informações que possam subsidiar o manejo de C. paradoxa em condições de

campo.

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DO ABACAXIZEIRO

Originário da América do Sul foi introduzido a partir do século XVI na África, na

Ásia e na Austrália, sendo atualmente cultivado em várias regiões tropicais e subtropicais

ao redor do mundo. No Brasil, o gênero Ananas tem seu centro de origem à região da

Amazônia, por encontrar o maior número de espécies (REINHARDTE et al., 2000).

Planta de clima tropical, obtém crescimento ótimo e melhor qualidade de frutos nas

faixas de temperaturas entre 22 a 32ºC, com a amplitudes térmicas diárias de 8 a 14ºC e

chuvas variando de 1.200 a 1.500mm anuais (NASCENTE et al., 2005). Altamente

exigentes em luz, com insolação anual ótima de 2.500 a 3.000 horas, ou seja, 6,8 a 8,2

horas de luz solar por dia. Sendo recomendado para o cultivo, altitudes variando desde o

nível do mar até 400 metros de altitude (SIMÃO, 1998).

O abacaxizeiro compõe-se de um caule (talo) curto e grosso, ao redor do qual

crescem as folhas, em forma de calhas, estreitas e rígidas, e no qual também se inserem

raízes axilares. O sistema radicular é fasciculado (em cabeleira), superficial e fibroso,

encontrado em geral à profundidade de zero a 30 centímetros e, raras vezes a mais de 60

cm da superfície do solo. A planta adulta das variedades comerciais mede 1,00 m a 1,20 m

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de altura e 1,00 m a 1,50 m de diâmetro (REINHARDTE et al., 2000). A inflorescência é

uma espiga, e o fruto é composto, resultado da coalescência de um grande número de

frutos simples, do tipo baga, denominados frutilhos, os quais estão inseridos num eixo

central, coração ou miolo, em disposição espiralada e intimamente soldados uns aos outros.

No ápice do fruto existe um tufo de folhas – a coroa – resultante do tecido meristemático

apical que a planta possui desde a sua origem (ALVES et al., 2009).

O fruto é abundante em açúcar, muito rico em sais minerais e vitaminas A, B1, B2

e C, em que cada 100g de polpa fresca de abacaxi contém aproximadamente 50

quilocalorias, 89% de água, 0,3% de proteína, 0,5% de lipídios, 5,8% de glicídios, 3,2% de

celulose e 0,3% de sais, apresentando quantidade considerável de potássio, ferro, cálcio,

manganês e magnésio (GOMES, 1976; SOARES et al., 2004). Além da produção de fibras,

ocorre também a produção da enzima proteolítica, denominada de bromelina, muito

utilizada como amaciante de carnes, produção de cerveja e indústria farmacêutica

(CARVALHO; CUNHA, 1999).

A qualidade dos frutos é atribuída as características físicas externas (coloração da

casca, tamanho e forma do fruto), e internas conferidas por um conjunto de constituintes

físico-químicos e químicos da polpa, responsáveis pelo sabor, aroma e valor nutritivo que

envolvem diversas cultivares de abacaxizeiro: Smooth Cayene, Sigapore Spanish, Queen,

Espanola Roja, Peroleira e a Pérola, de grande importância econômica para o consumo na

forma in natura e para a industrialização.

Segundo dados da FAO de 2010, indicam que o abacaxi e a terceira fruta tropical

mais produzida no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor mundial com uma

produção de 1.740.840 toneladas, superado apenas pela Tailândia com uma produção de

2.353.037 toneladas de frutos.

A produção nacional de frutos concentra-se na região Norte, sendo o estado do

Pará, o primeiro colocado, com uma produção de 389.971 milheiros de frutos, já a Paraíba,

com 347.515 (IBGE, 2010, FAOSTAT, 2010). Verificando que o clima, o solo, a

disponibilidade de água para irrigação, aliados à disponibilidade e custo de mão-de-obra,

conferem à região Nordeste, a liderança na produção e exportação de frutas tropicais

(ALVES, 2009).

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3.2. PODRIDÃO NEGRA DO ABACAXIZEIRO

A redução das perdas pós-colheita na cadeia produtiva de frutas representa um

constante desafio, considerando que são órgãos que apresentam alto teor de água e

nutrientes e, mesmo depois da colheita até a senescência, mantém vários processos

biológicos em atividade, apresentando desta forma maior predisposição a distúrbios

fisiológicos, danos mecânicos e à ocorrência de podridões (KADER, 2002). A aparência

dos frutos esta relacionado ao formato, à casca, à coroa e o pedúnculo, sendo um fator

responsável por sua aceitação e pode ser limitante à sua comercialização. Tanto a aparência

quanto suas características de sabor e aroma podem ser severamente comprometidas pelo

escurecimento interno, causando infecções microbianas (GONÇALVES; CARVALHO,

2000).

Dentre os patógenos que afetam a cultura, destacam-se Fusarium guttiforme, agente

causal da fusariose, por encontrar-se presente nas principais regiões produtoras do país,

provocando perdas elevadas na produção de frutos. A Phytophthora nicotiana van Brenda

de Haan var. parasitica (Dastur) causa a podridão-do-olho, doença de expressão

econômica em regiões de alta pluviosidade ou onde se pratica a abacaxicultura sob

irrigação, já a Chalara (Thilaviopsis) paradoxa causa a podridão negra do abacaxizeiro,

que pode tanto infectar as mudas, provocando a sua morte, quanto causar podridão de

frutos em pós-colheita (MATOS, 2000).

3.3. EPIDEMIOLOGIA DA PODRIDÃO NEGRA

Várias doenças têm sido responsáveis por grandes perdas na produção de

abacaxizeiro, dentre elas, a podridão negra é considerada a principal doença causada pelo

fungo Ceratocystis paradoxa (Dade) C. Moreau, cuja forma anamórfica corresponde a

Chalara (Thielaviopsis) paradoxa (De Seyn) Sacc.), causando infecção nos frutos e

apresentando exsudação de suco, com odor semelhante ao de álcool etílico, decorrente da

fermentação da glicose, que vai resultar num fruto oco, contendo apenas as fibras dos

feixes vasculares. Com o avanço da doença, ocorre esporulação e crescimento micelial do

fungo na superfície do fruto (ADISA; FAJOLA, 1982).

O patógeno pode sobreviver na forma de microconídios e clamidósporos, no solo

ou no fruto apodrecido. Sob condições de alta umidade relativa do ar, os conídios podem

ser produzidos nos restos de cultura. Os principais agentes de disseminação são o vento,

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insetos (atraídos pelo cheiro adocicado dos tecidos infectados) e por salpicos de chuvas

(MATOS; SANCHES, 2007).

Estudos diversos têm relacionado o efeito da temperatura e período de molhamento

sobre o desenvolvimento de doenças fúngicas (WILSON et al., 1990; SILVA et al., 2001;

LIMA FILHO, 2003). No entanto, os patógenos diferem quanto a temperatura ideal para

seu pleno desenvolvimento e infecção, podendo temperaturas diferentes da considerada

ideal interferirem na germinação e no número de conídios formados (AGRIOS, 2005).

A incidência da podridão negra é intensificada pela associação de temperatura

amena e alta umidade relativa, fator indispensável para a germinação da maioria dos

esporos fúngicos e para a penetração do tubo germinativo no hospedeiro, além de aumentar

a suscetibilidade da planta a fitopatógenos, afetando a incidência e a severidade da doença

(AGRIOS, 2005, MATOS; SANCHES, 2007). A temperatura ótima para o

desenvolvimento do fungo, esporulação e produção de clamidósporos está em torno de

25°C (ADISA; FAJOLA, 1982; ADASKAVEG et al., 2002). Abaixo de 15°C e acima de

34°C, o fungo tem seu desenvolvimento retardado (GOES, 2005). Em temperaturas abaixo

de 8°C o crescimento do fungo é inibido (FROSSARD, 1978).

Apesar da importância do patógeno, os relatos sobre a epidemiologia e biologia de

C. paradoxa são escassos. Assim, pouco se conhece sobre dos efeitos das condições

climáticas, fatores nutricionais, variações genéticas do patógeno e tipo de resistência do

hospedeiro. Para desenvolver estudos dessa natureza, há necessidade de se fazer

inoculações artificiais em ambientes controlados, o que requer a produção massal de

conídios do patógeno, assim como se investigar os fatores bióticos e abióticos, que

influenciam no crescimento, esporulação e germinação do fungo, para que possa

estabelecer estratégias futuras de controle (ANADA et al., 2002).

No desenvolvimento do meio de cultivo, segundo Jackson et al. (1996) e Jackson

(1997), três etapas devem ser consideradas: a primeira é selecionar um meio que

proporcione uma boa produção da forma desejada do fungo, a segunda é variar os

nutrientes e avaliar o seu impacto na produção do patógeno e a última é substituir os

componentes nutricionais por um substrato complexo, barato e acessível. Desta forma, há

necessidade de estudos sobre meios que propiciem bom crescimento, esporulação

correlacionando com a temperatura e luminosidade, que são fatores essenciais para

estimular a esporulação dos fitopatógenos (DINGRA; SINCLAIR, 1995).

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4. MATERIAL E MÉTODOS

Os trabalhos foram desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia, Departamento de

fitotecnia e Ciências Ambientais do Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da

Paraíba, Campus II, Areia-PB.

4.1. OBTENÇÃO DOS ISOLADOS E PREPARAÇÃO DOS MEIOS

O fungo C. paradoxa foi obtido da Coleção de Fungos Fitopatogênicos do

Laboratório de Fitopatologia, para obtenção de colônias jovens do fungo, o mesmo foi

repicado em meio BDA (200g batata, 10g dextrose, 18g Ágar), cultivado a 25°C por um

período de sete dias e a confirmação da etiologia realizada com auxílio de microscópio

óptico e estereoscópio com aumento de 40%, para visualização das estruturas do patógeno.

4.2. MEIOS DE CULTURA

Os meios de cultura testados foram BDA (200g batata, 10g dextrose, 18g Ágar);

CC (200ml de leite de coco comercial, 10g dextrose, 18g Ágar); AV (60g Aveia em Flocos

Quaker®, 10g dextrose, 18g Ágar); AB (200 mL de suco concentrado de abacaxi, 10g

dextrose,18g Ágar). O volume foi completado para 1L acrescentando-se água destilada

esterilizada (ADE) e autoclavagem a 121°C por 15 min. O pH dos meios foram

padronizados dentro da faixa de 4,5 – 5,0 com ajuda de um potenciômetro (WISMER,

1949).

4.3. INCUBAÇÃO DO FUNGO

Foi retirado um disco de colônia jovem do fungo (5mm de diâmetro) contendo

conídios e transferidos para o centro de cada placa de Petri contendo os diferentes meios de

cultura, sendo incubados em diferentes temperaturas (15, 25 e 35 ºC) e regimes de

luminosidade (Claro contínuo, Escuro contínuo e Alternância luminosa) em B.O.D.

(Biologic Oxygen Demand).

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4.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

O delineamento estatístico utilizado foi Delineamento Inteiramente Casualisado

com cinco repetições (cada repetição composta por cinco placas) em arranjo fatorial 4 x 3

x 3 (quatro meios de cultura (BDA, AV, CC, AB), três regimes de luminosidade (claro

continuo, escuro continuo, alternância luminosa-12 horas de claro e 12 horas de escuro) e

três temperaturas (15, 25, 35 °C).

Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas

pelo este de Tukey a 5% de probabilidade para testar as hipóteses dos efeitos principais e

das interações, utilizando o SOFTWARE SAS, versão 8.2 (SAS, 2001).

4.5. AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO MICELIAL

Após 24 horas de incubação iniciou-se a avaliação do crescimento micelial (CM),

até o terceiro dia de incubação, onde a colônia fúngica cultivada nos meios AV, BDA e AB

ocuparam todo o diâmetro da placa de Petri. Onde as leituras foram feitas com auxílio de

um paquímetro digital, em dois sentidos diametralmente opostos.

4.6. AVALIAÇÃO DA ESPORULAÇÃO E GERMINAÇÃO

Quando o crescimento micelial do fungo completou todo diâmetro da placa, foi

realizado a contagem de esporos, em microscópico óptico, com auxílio da câmara de

Neubauer (MORAES; ALVÊS, 1986).

Para o preparo da suspensão foi adicionando 20 mL de ADE por placa, fazendo a

remoção superficial da colônia, com o auxílio de uma escova de cerdas macias para

liberação dos esporos, filtrando-o em gaze esterilizada com dupla camada.

Foi feito simultaneamente a contagem e a avaliação de esporos germinados, sendo

considerado germinado quando o comprimento do seu tubo germinativo foi maior ou igual

ao menor diâmetro do esporo (BERGAMIN FILHO et al., 1995).

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. CRESCIMENTO MICELIAL

A análise dos resultados apresentado na Tabela 1 mostrou que houve interação

tripla significativa para todas as variáveis. Estas interações, meios de cultura x

temperaturas x regimes de luz, foram desdobradas para avaliação dos efeitos principais e

das interações (meio de cultura dentro de cada nível de regimes de luz e temperatura,

regimes de luz dentro de cada meio de cultura e temperatura dentro de cada meio de

cultura e regimes de luz). Verificando que houve diferença significativa a 5% de

probabilidade entre as interações para o crescimento micelial.

Na temperatura de 15 °C, os meios AV, BDA e AB com regime de claro contínuo,

obtiveram as maiores taxas de crescimento micelial (56,23; 66,77; 55,30 mm), diferindo

estatisticamente do meio CC, verificando que não houve crescimento micelial nesse

tratamento, como mostra a Tabela 1.

Na temperatura de 25ºC para os meios AV, BDA e AB, nas três condições de

luminosidade (alternância luminosa, escuro contínuo e claro contínuo), o crescimento

micelial (90,00; 90,00; 88,40 mm), (89,16; 90,00; 90,00 mm) e (89,32; 90,00; 90,00 mm),

foi superior em relação ao meio CC (15,71; 18,30 mm) com claro e escuro continuo, de

acordo com a Tabela 1.

Os resultados obtidos na temperatura de 35 ºC para os meios AV, BDA e AB

obtiveram maiores taxas de crescimento micelial no escuro continuo (6,10; 10,84; 22,34

mm) em relação aos demais regimes de luminosidade e o meio CC.

Os resultados obtidos no trabalho de Borba et al., (2006) afirmam que a

constituição do meio de cultura utilizado pode influenciar o modo de crescimento do

fungo.

Brito (2006) usando diferentes substratos, concluiu que, o crescimento micelial de

todos isolados de Curvularia eragrostidis testados, apresentaram variação na velocidade

do crescimento micelial, em função do meio utilizado e das características fisiológicas dos

isolados.

Alves, et al., (2009) trabalhando com C. paradoxa em frutos de abacaxizeiro,

verificaram a temperatura que mais favoreceu no desenvolvimento da doença foi de 25 ºC.

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Tabela 1. Desdobramento de interação tripla significativa (meios de cultura x regime de luz x temperaturas) para Chalara paradoxa para a

variável crescimento micelial

*** Alter.- Alternância luminosa (12 horas de claro e 12 horas de escuro); Escuro- Escuro contínuo; Claro- Claro contínuo.

** CC- Meio coco; AV- Meio aveia; BDA- Meio batata; AB- Meio abacaxi.

*Letras minúsculas iguais na coluna não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade e letras maiúsculas iguais na linha em cada temperatura e meio de cultivo e gregas na

linha em cada regime de luminosidade.

Meios

TEMPERATURA °C

15 25 35

Alter. Escuro Claro Alter. Escuro Claro Alter. Escuro Claro

CC

00,00 Adα

00,00 Acβ 00,00 Acβ 00,00 Bbα 15,71Abα 18,30Abα 00,00 Aaα 00,00Adβ 00,00Aaβ

AV 16,99 Bcβ 15,81B bβ 56,23 Abβ 90,00 Aaα 90,00 Aaα 88,40Aaα 00,00 Baγ 6,10 Acγ

00,00 Baγ

BDA 46,81 Baβ 26,43 Caβ 66,77A aβ 89,16 Aaα 90,00Aaα 90,00 Aaα 00,00 Baγ 10,84 Abγ

00,00 Baγ

AB 41,92 Bbβ 28,81 Caβ 55,30 Abβ 89,32 Aaα 90,00 Aaα 90,00 Aaα 00,00 Baγ 22,34 Aaγ

00,00 Baγ

CV (%) = 11,29

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5.2. ESPORULAÇÃO

A análise dos resultados, de acordo com a Tabela 2, mostrou que houve

interação tripla significativa para todas as variáveis. Estas interações, meios de cultura x

temperaturas x regimes de luz, foram desdobradas para avaliação dos efeitos principais

e das interações (meio de cultura dentro de cada nível de regimes de luz e temperatura,



probabilidade entre as interações para a esporulação.

Na temperatura de 15 °C observou as maiores taxas de esporulação (63,92;

84,36; 97,68 x 104/mL) no meio AV, em os todos os regimes de luminosidades

(alternância luminosa, escuro contínuo e claro contínuo). O meio BDA obteve maior

esporulação no claro contínuo (132,61 x 104/mL) e o meio AB nos regimes com

alternância luminosa e escuro contínuo (106,4; 89,08 x 104/mL) como mostra a Tabela

2.

Com relação à esporulação na temperatura de 25 ºC, os maiores índices foram

encontrados no meio AV com regimes de alternância luminosa e claro contínuo

(299,03; 173,94 x 104/mL), no meio BDA com alternância luminosa e escuro contínuo

(287,52; 317,97 x 104/mL) e AB em alternância luminosa (276,04 x 10

4/mL) de acordo

com a Tabela 2.

Na temperatura de 35 ºC foi observado os maiores índices de esporulação nos

meios AV, BDA e AB com regime de luminosidade para o escuro contínuo (29,12;

33,48; 83,05 x 104/mL) em relação ao meio de CC com todos os regimes de

luminosidade, Tabela 2.

Alexandre (2009) analisando a caracterização morfológica de isolados de C.

paradoxa, constatou que, de modo geral, a maior esporulação (conídios/mL) foi obtida

no meio BDA, sendo responsável pelo maior crescimento micelial. Já os meios ARM

(Sacarose, 20g; MgSO4.7H2O, 0,4g; KCL, 1,6 g; Ca(NO3), CDA e CZA(Sacarose-

K2HPO4-NaNO3;MgSO4.7H2O, KCL; FeSO4.7H2O; ágar) promoveram uma

esporulação intermediária.

Observações realizadas por Rosa e Meneses (2001) na caracterização

patogênica, fisiológica e morfológica de Pseudocercospora musae, concluiu que os

meios que mais influenciaram foi o leite de coco, BDA e aveia, obtendo maior

11

crescimento micelial, enquanto que o BDA, maltrose-peptona, V-8 e Czappek,

obtiveram a maior produção de conídios.

12

Tabela 2. Desdobramento de interação tripla significativa (meios de cultura x regimes de luz x temperaturas) de Chalara paradoxa para a

esporulação (1,0 x 104/ml)





Meios

TEMPERATURA °C

15 25 35


CC

00,00 Acβ

00,00 Abβ 00,00 Abα

67,85Abα

52,64 Acα 00,00 Bcα

00,00Aaβ

00,00Acβ

00,00Aaα

AV 63,92 Abβ 84,36 Aaβ 97,68 Aaβ 299,03Aaα 275,65Abα 173,94 Aaα

00,00Baγ

29,12Abγ

00,00Baγ

BDA 85,62 Bbβ 88,44 Baβ 132,61Aaα 287,52Aaα 317,97Aaα 128,04 Bbα 00,00Baγ 33,48Abγ

00,00Baβ

AB

106,4 Aaβ

89,08 Aaβ 00,00 Bbβ

276,04Aaα

268,18 Abα 157,68 Babα

00,00Baγ

83,05Aaβ

00,00Baβ

CV (%) = 28,44

13

5.3. GERMINAÇÃO

A análise dos resultados, de acordo com a Tabela 3, mostrou que houve

interação tripla significativa para todas as variáveis. Estas interações, meios de cultura x

temperaturas x regimes de luz, foram desdobradas para avaliação dos efeitos principais

e das interações (meio de cultura dentro de cada nível de regimes de luz e temperatura,



probabilidade entre as interações para a germinação.

Na temperatura de 15 ºC observou melhores índices de germinação (8,84; 9,28;

8,84 x 104/ml), nos meios AV, BDA e AB com regime de alternância luminosa em

relação ao meio CC em todos os regimes de luminosidades como mostra a Tabela 3.

Na temperatura de 25 ºC foi encontrado os maiores índices de germinação nos

meios AV com regime de alternância luminosa (11,23 x 104/ml), no meio BDA sobre

alternância luminosa e escuro contínuo (10,65; 13,88 x 104/ml) e o meio AB com

regime escuro continuo (10,84 x 104/ml), sendo superior em relação ao meio CC com os

diferentes regimes de luminosidades, Tabela 3.

Observando os dados referentes à temperatura de 35 ºC, apresentaram maiores

taxas de germinação para os meios AV, BDA e AB com regime de luminosidade escuro

contínuo (0,6; 1,24; 11,80 x 104/ml), em relação o meio CC com os diferentes regimes

de luminosidades, Tabela 3.

Para determinar os efeitos das temperaturas no crescimento micelial e

germinação de esporos de Bipolares euphorbiae, Nechet et al., (2006) testaram oito

temperaturas (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40 °C) concluindo que a faixa de temperatura

de 25 °C, favoreceu o crescimento micelial, enquanto a maior germinação dos conídios

foi obtida a 30 °C.

De acordo com Gazziero et al., (1989) os efeitos das condições de luminosidades

(escuro e luz) influenciaram na germinação dos conídios de Bipolares euphorbiae,

verificando que, no tratamento mantido com o regime escuro, ocorreu o aumento de

quatro a cinco vezes para desenvolvimento dos tubos germinativos, quando comparado

com o mantido sob regime de luz.

14

Tabela 3. Desdobramento de interação tripla significativa (meios de culturas x regimes de luz x temperaturas) para Chalara paradoxa para a

variável germinação (1,0 x 104/ml)





Meios

TEMPERATURA °C

15 25 35


CC 0,0 Abβ 0,0 Acβ 0,0 Abα

3,88 Acα

3,13Abα 0,0Bcα

0,0Aaβ

0,0Acβ

0,0Aaα

AV 8,84 Aaα 2,96Baαβ 3,56Baβ 11,23 Aaα 3,42Cbα 7,97Baα 0,0aβ 0,6Abβ

0,0Baγ

BDA

9,28 Aaα

1,92Cabβ 4,60Baα 10,65Aaα 13,88A aα 3,04Bbα 0,0Baβ 1,24A bβ

0,0Baβ

AB 8,84 Aaα 1,16Babβ 0,0Cbα 7,65 Bbα 10,84A aα 0,0 Ccα 0,0Baβ 11,80A aα

0,0Baα

CV (%) = 25,55

15

6. CONCLUSÃO

As melhores condições de cultivo in vitro de C. paradoxa para crescimento

micelial, esporulação e germinação, foi obtida na temperatura de 25 °C, com alternância

luminosa nos meios AV e BDA, e regime escuro contínuo para o meio BDA.

16

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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