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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

ÁLVARO BEZERRA CARDOSO

ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA

João Pessoa – PB

2008

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1

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

ÁLVARO BEZERRA CARDOSO

ESTUDO HISTOMORFOMÉTRICO COMPARATIVO DA REPARAÇÃO ÓSSEA EM RATOS APÓS O USO DE BIOMATERIAIS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA

Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-

Graduação em Odontologia da Universidade

Federal da Paraíba e Universidade Federal da

Bahia para obtenção do título de Doutor em

Odontologia

Área de Concentração: Estomatologia Orientadores: Fabiano Gonzaga Rodrigues

Francisco de Assis Limeira Júnior

João Pessoa – PB

2008

2

DATA DA DEFESA DE TESE: 12 de dezembro de 2008

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Prof. Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues

Orientador

_______________________________________

Profª. Drª. Tânia Lemos Coelho Rodrigues

Examinadora Interna

_______________________________________

Profª. Drª. Andressa Feitosa Bezerra de Oliveira

Examinadora Interna

_______________________________________

Prof. Dr. Riedel Frota

Examinador Externo

_______________________________________

Prof. Dr. José Rodrigues Laureano Filho

Examinador Externo

_________________________________________

Prof. Dr. Francisco de Assis Limeira Júnior

Suplente Interno

_________________________________________

Prof. Dr. José Ivo Queiroz do Amaral

Suplente Externo

3

A Deus, por estar sempre do meu lado em todos os momentos da minha vida,

dando-me forças e sabedoria para tantas conquistas.

À minha família que sempre apoiou minhas escolhas, em especial aos meus irmãos

(Germano, Henrique e Rafael), por fazerem parte da minha vida, e juntamente

comigo, comemorarem mais um trabalho realizado.

Aos meus pais, Paulo e Ismênia, exemplos constantes de amor aos filhos, por me

ensinarem carinhosamente a enfrentar cada etapa da vida, incentivando e apoiando

todos os meus projetos. Meu eterno amor e gratidão.

4

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Aos Professores Dr. Fabiano Gonzaga Rodrigues e Dr. Francisco de Assis

Limeira Júnior, exemplos de dedicação, seriedade e profissionalismo na pesquisa

odontológica; por acreditarem em meu potencial e pelo apoio em todos os

momentos, minha imensa gratidão por orientarem este trabalho e pelos valiosos

ensinamentos durante o curso de pós-graduação.

5

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal da Paraíba, por me acolher nos últimos cinco anos,

durante os cursos de mestrado e de doutorado, nesta instituição de bases

educacionais sólidas.

Aos Professores do Programa Integrado de Pós-Graduação em Odontologia da

Universidade Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia, em especial

ao Dr. Ricardo Cavalcanti Duarte (coordenador do programa), ao Dr. Lino João da

Costa (Coordenador da área de concentração em Estomatologia), à Dra. Tânia

Lemos Coelho Rodrigues e à Dra. Maria Sueli Marques Soares, pela

oportunidade de realizar o curso de Doutorado em Estomatologia, assim como pelas

sinceras amizades conquistadas.

Ao Laboratório de Tecnologia Farmacêutica e ao Laboratório de

Experimentação Animal, ambos da Universidade Federal da Paraíba, por permitir a

realização da parte experimental do trabalho, cedendo os animais e o ambiente

dentro de condições idéias de criação e manutenção, assegurando a confiabilidade

desta pesquisa.

6

Ao Senhor Luis Crispim, funcionário do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da

Universidade Federal da Paraíba, pela colaboração no cuidado e manutenção dos

animais utilizados durante todo o trabalho.

Aos Acadêmicos Carol, Lariane, Suennya e Thiago (Odontologia – UFPB), em

especial a Isa (Ciências Biológicas – UFPB) e ao Adelmo (Odontologia – UFPE),

pelo carinho e ajuda no trato com os animais, a participação de todos vocês foram

de fundamental importância na fase experimental deste trabalho.

À Faculdade de Odontologia de Pernambuco – FOP/UPE, em especial ao Prof.

Dr. Emanuel Sávio de Souza Andrade, pela disponibilização do laboratório de

Patologia Bucal, colaborando no desenvolvimento desta pesquisa.

Aos técnicos em patologia Armando (FOP/UPE) e Catarina, pela valiosa

contribuição no processamento das lâminas.

Ao Laboratório de Patologia Geral do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal da Paraíba, por ceder os microscópicos para análise

histológica, em especial à Profa. Dra. Cláudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo,

pela orientação na interpretação dos dados histológicos, sua participação foi de

extrema valia, engrandecendo a realização deste trabalho.

7

Ao Prof. Dr. Leonardo Vidal Batista e ao acadêmico Thallys do Departamento de

Informática da Universidade Federal da Paraíba, por tornarem possível a realização

da análise morfométrica desta pesquisa.

A todos os amigos do doutorado em Estomatologia (UFPB), em especial, Allan

Ullisses, Marcos Paiva, Luís Carlos, Andréa Queiroga e Giliara Carol, pela

convivência e amizade.

Ao grande amigo Ricardo Gurgel, pela amizade sincera e apoio desde os tempos

da especialização em cirurgia e mestrado em Diagnóstico Bucal. Esse trabalho

também é fruto de todo seu empenho e compromisso com o conhecimento científico,

com sua ajuda pudemos vencer diversos obstáculos e comemorar juntos mais essa

conquista.

A todos os professores da Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da

Universidade de Pernambuco, em especial, Dr. Belmiro Vasconcelos, Dr. Caubi

Figueiredo, Dr. Emanuel Dias, Dr. Laureano Rodrigues e Dr. Ricardo Holanda,

pela amizade e todos os ensinamentos na área de cirurgia; exemplos a serem

seguidos.

Ao fraterno amigo Riedel Frota, sempre disposto a ajudar, exemplo de dedicação e

profissionalismo na construção do conhecimento científico, pela amizade e apoio

constantes, minha eterna gratidão pelo incentivo e convívio em família.

8

Ao meu primo Pedro Paulo, à sua querida esposa Luciana e seus filhos Pedro

Filho e Nádia, por todos os momentos de alegria e descontração em família,

acolhendo-me fraternalmente em sua casa.

À família Oliveira Buril, por me acolher carinhosamente, em especial a Juliana

Buril, por toda compreensão e amor, a sua dedicação e companhia vem sendo

muito especial na construção de mais uma etapa de minha vida.

Aos amigos de plantão do Hospital Getúlio Vargas, em especial, Bruno de Lira,

Nelson Studart, Jorge Orestes, Jorge Luís, Lauro, Sérgio e Selenildo, pelos

momentos de descontração e amizade sincera.

A todos os Amigos, que de forma direta ou indiretamente, contribuíram e torceram

em favor da realização deste trabalho.

Muito obrigado a todos!

9

"É melhor tentar e falhar,

que preocupar-se e ver a vida passar;

é melhor tentar, ainda que em vão,

que sentar-se fazendo nada até o final.

Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias tristes em casa me esconder.

Prefiro ser feliz, embora louco,

que em conformidade viver ..."

(Martin Luther King)

10

RESUMO1

A presente pesquisa é um estudo experimental que avaliou a reparação óssea em

ratos, utilizando biomateriais de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz

inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β -

tricálcio-fosfato). Foram utilizados 36 ratos, machos e wistar albinos, distribuídos

aleatoriamente em dois grupos com 18 animais cada e com a denominação G1

(bovino) e G2 (sintético). Foi confeccionado um defeito de 5,0 mm de diâmetro no

osso parietal em cada lado da sutura sagital do animal, onde o lado esquerdo

correspondeu ao experimento (preenchido por biomaterial de origem bovina ou

sintética) e o lado direito ao controle (preenchido por coágulo sanguíneo). Após os

períodos de 15, 30 e 45 dias do procedimento cirúrgico, os espécimes foram

enviados para processamento histológico e analisados em microscopia óptica. As

imagens obtidas foram segmentadas e submetidas à análise morfométrica para

avaliação da reparação óssea (quantificação de matriz óssea neoformada). Os

dados foram processados no programa SPSS (Statistical Package for the Social

Sciences) 13.0 para Windows, sendo a análise estatística com nível de significância

de 5%. Os resultados demonstraram que, embora sem diferença estatisticamente

significante, os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina e

sintética apresentaram uma melhor reparação óssea em comparação ao controle,

sendo a matriz óssea neoformada (µm2

1 Este trabalho está de acordo com as normas de documentação da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS (ABNT), a saber: NBR 6022, Informação e Documentação – Referências – Elaboração, ago. 2002. NBR 14724, Informação e Documentação – Trabalhos acadêmicos – Apresentação, 2006.

) maior nos defeitos ósseos preenchidos por

osso de origem bovina. Conclui-se que os biomateriais utilizados contribuíram no

processo de reparação dos defeitos ósseos.

Palavras-chave: Regeneração Óssea. Materiais Biocompatíveis. Ratos.

11

ABSTRACT

This present experimental study evaluated the bone repair in rats following the use of

bovine (cortical organic matrix, cancellous inorganic matrix e bovine collagen) and

synthetic (hydroxiapatite + β-tricalcium-phosphate) origin biomaterials. Thirty six

Wistar albinus male rats were studied in two randomized groups with eighteen

animals: G1 (bovine) and G2 (synthetic). A 5,0 mm in diameter defect was

confectioned in both parietal bones in each side of the sagital medium suture of the

animal, where the left side corresponded to the experiment (filled with bovine or

synthetic bone) and the right side to the control (empty surgical cavity). The

specimens at 15, 30 and 45 days after the surgical procedure were sent for

histological processing and analyzed by optical microscopy. The images were

segmented and subjected to morphometric data analysis for evaluation of bone

repair (neoformed bone matrix quantification). The statistics analysis was performed

by the statistical program SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 13.0 for

Windows, considering significance of 5%. The results showed that, although there

was no statistically significant difference between groups, the defects submitted to

bovine and synthetic origin biomaterials presented better bone repair, being the

neoformed bone matrix (µm2

) greater to bovine bone. Therefore, we concluded that

the biomaterials used in this study contributed to the bone healing process.

Key-words: Bone Regeneration. Biocompatible Materials. Rats

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Rato Wistar, macho albino, adulto jovem 56

Figura 2 Animais acondicionados em gaiolas plásticas 57

Figura 3 Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica 59

Figura 4 Anti-sepsia e infiltração anestésica local 60

Figura 5 Incisão linear através da pele e periósteo 61

Figura 6 Exposição da calvária após descolamento e afastamento do

retalho 61

Figura 7 Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo:

biomaterial bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica

esponjosa e colágeno bovino) 62

Figura 8 Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo:

biomaterial sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-

fosfato) 62

Figura 9 Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0) 63

Figura 10 Sutura contínua festonada da pele (mononylon 5-0) 63

Figura 11 Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos

espécimes 65

Figura 12 Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana 66

Figura 13 Imagem do defeito ósseo do grupo G2A (biomaterial de origem

sintética – experimento) com 45 dias 69

Figura 14 Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo

que será segmentada em sete classes 69

13

Figura 15 Classe utilizada para cálculo da área (µm2 ) da matriz óssea

neoformada 69

Figura 16 Grupo 1A - 15 dias. Defeito ósseo em toda extensão. Partículas

do biomaterial (*). Bordas do defeito (>). H.E. 75

Figura 17 Grupo 1A - 15 dias. Neoformação óssea a partir da borda do

defeito (>). H.E. 75

Figura 18 Grupo 1A - 15 dias. Detalhe da figura 17, evidenciado

neoformação óssea (*) significativa a partir da borda do defeito.

H.E. 75

Figura 19 Grupo 1A - 15 dias. Formação de trabécula óssea (*) entre as

partículas do biomaterial. H.E. 75

Figura 20 Grupo 1A - 30 dias. Neoformação de tecido ósseo (*) entre o

biomaterial implantado. Bordas do defeito (>). H.E. 77

Figura 21 Grupo 1A - 30 dias. Neoformação óssea na borda do defeito (>).

H.E. 77

Figura 22 Grupo 1A – 30 dias. Maior aumento da figura 21, evidenciando a

formação da trabécula óssea (*). H.E. 77

Figura 23 Grupo 1A – 30 dias. Formação de tecido ósseo no interior do

defeito (*).H.E. 77

Figura 24 Grupo 1A – 30 dias. Pavimentação osteoblástica (>) a partir da

trabécula óssea neoformada. H.E. 77

Figura 25 Grupo 1A – 45 dias. Extensa neoformação de tecido ósseo (*).

Bordas do defeito (>). H.E. 79

Figura 26 Grupo 1A – 45 dias. Neoformação óssea (*) nas adjacências das

partículas do biomaterial. H.E. 79

14

Figura 27 Grupo 1A – 45 dias. Trabécula óssea incipiente (*), evidenciando

pavimentação osteoblástica (>). H.E.

79

Figura 28 Grupo 1B – 15 dias. Ausência de neoformação óssea no interior

da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 83

Figura 29 Grupo 1B – 15 dias. Neoformação óssea (>) incipiente na borda

do defeito. H.E. 83

Figura 30 Grupo 1B – 15 dias. Detalhe da figura 29, exibindo a

neoformação da trabécula óssea (*). H.E. 83

Figura 31 Grupo 1B – 30 dias. Defeito ósseo sem evidência de

neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito

(>). H.E. 85

Figura 32 Grupo 1B – 30 dias. Presença de neoformação óssea incipiente

(*) a partir da borda do defeito. Vasos sanguíneos congestos (>)

em meio a tecido conjuntivo fibroso. H.E. 85

Figura 33 Grupo 1B – 30 dias. Detalhe da figura 32, evidenciando a

neoformação óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito.

H.E. 85

Figura 34 Grupo 1B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando neoformação

incipiente de tecido ósseo (*) no interior da cavidade. Bordas do

defeito (>). H.E. 87

Figura 35 Grupo 1B – 45 dias. Neoformação óssea a partir da borda do

defeito (>). H.E. 87

Figura 36 Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da trabécula óssea neoformada (*)

no interior do defeito. H.E. 87

15

Figura 37 Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da figura 35, exibindo a

neoformação de tecido ósseo a partir da borda do defeito (*).

H.E.

87

Figura 38 Grupo 2A – 15 dias. Defeito ósseo, exibindo as partículas do

biomaterial (*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E. 91

Figura 39 Grupo 2A – 15 dias. Neoformação óssea incipiente (>) na borda

do defeito. H.E. 91

Figura 40 Grupo 2A – 15 dias. Detalhe da figura 39, evidenciando a

pavimentação osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea.

Presença de vasos sanguíneos congestos (*). H.E. 91

Figura 41 Grupo 2A – 30 dias. Defeito ósseo, exibindo neoformação óssea

a partir das bordas do defeito (>). H.E. 93

Figura 42 Grupo 2A – 30 dias. Neoformação óssea (>) a partir da borda do

defeito e das partículas do biomaterial. H.E. 93

Figura 43 Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a

trabécula óssea neoformada (*) entre as partículas do

biomaterial. H.E. 93

Figura 44 Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a

neoformação óssea a partir da borda do defeito (*). H.E. 93

Figura 45 Grupo 2A – 45 dias. Neoformação óssea em toda extensão da

cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 95

Figura 46 Grupo 2A – 45 dias. Tecido ósseo neoformado (*) a partir da

borda do defeito (>), estendendo-se para o interior do defeito.

H.E. 95

16

Figura 47 Grupo 2A – 45 dias. Trabéculas ósseas no interior do defeito (*)

nas adjacências das partículas do biomaterial. H.E.

95

Figura 48 Grupo 2B – 15 dias. Defeito ósseo sem evidência de

neoformação óssea no interior da cavidade (*). Bordas do defeito

(>). H.E. 99

Figura 49 Grupo 2B – 15 dias. Neoformação óssea incipiente a partir da

borda do defeito (>). H.E. 99

Figura 50 Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 49, exibindo trabécula

óssea neoformada (*) e atividade osteoblástica nas adjacências

(>). H.E. 99

Figura 51 Grupo 2B – 30 dias. Ausência de neoformação óssea no interior

da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E. 101

Figura 52 Grupo 2B – 30 dias. Tecido conjuntivo no interior do defeito

ósseo com presença de vasos sanguíneos congestos (>). H.E. 101

Figura 53 Grupo 2B – 30 dias. Osso neoformado a partir da borda do

defeito (*). H.E. 101

Figura 54 Grupo 2B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando tecido

conjuntivo fibroso no interior da cavidade (*) e presença de

neoformação óssea incipiente (>) a partir das bordas do defeito.

H.E. 103

Figura 55 Grupo 2B – 45 dias. Detalhe da figura 54, exibindo a

neoformação óssea incipiente a partir da borda do defeito (>).

H.E. 103

Figura 56 Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 54, evidenciando tecido

conjuntivo fibroso com vasos sanguíneos congestos (>). H.E. 103

17

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Média da área (µm2

112

) da matriz óssea neoformada segundo o

grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias

18

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Infiltrado inflamatório segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação 105

Tabela 2 Vascularização segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação 106

Tabela 3 Reação de corpo estranho (RCE) segundo o grupo, o subgrupo e

o tempo de avaliação 107

Tabela 4 Tecido conjuntivo fibroso segundo o grupo, o subgrupo e o tempo

de avaliação 108

Tabela 5 Atividade osteoblástica segundo o grupo, o subgrupo e o tempo

da avaliação 109

Tabela 6 Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação 110

Tabela 7 Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação

óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação 111

Tabela 8 Média e desvio padrão da área (µm2

111

) da matriz óssea

neoformada segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45

dias

19

LISTA DE QUADROS

Quadro 01 Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o

período de observação 58

20

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BMP .................... Proteína morfogenética óssea

Ca .................... Cálcio

Ca10(PO4)6(OH)2 ......

CCS .................... Centro de ciências da saúde

Hidroxiapatita

CFB .................... Cálcio fosfato bifásico

EEB .................... Encefalopatia espongiforme bovina

FOP .................... Faculdade de Odontologia de Pernambuco

G1 .................... Grupo - enxerto de origem bovina

G1A .................... Subgrupo experimental do G1

G1B .................... Subgrupo controle do G1

G2 .................... Grupo - enxerto de origem sintética

G2A .................... Subgrupo experimental do G2

G2B .................... Subgrupo controle do G2

HA .................... Hidroxiapatita

HE .................... Hematoxilina / eosina

IGF .................... Fatores de crescimento semelhante à insulina

IL-1 .................... Interleucina-1

IL-2 .................... Interleucina-2

L*a*b* .................... Sistema de cores definidas pelo brilho (L*) e pelas

coordenadas de cromaticidade (a* e b*)

LEA .................... Laboratório de experimentação animal

LTF .................... Laboratório de tecnologia farmacêutica

21

n .................... Número

OA .................... Osso autógeno

P .................... Nível de significância

PDGF .................... Fator de crescimento derivado de plaquetas

PGA .................... Ácido poliglicólico

PLGA .................... Ácido poli-lático-co-ácido glicólico

PLLA .................... Ácido Poli-L-lático

RCE .................... Reação de corpo estranho

RGB .................... Sistema de cores aditivas formado por vermelho (Red),

verde (Green) e Azul (Blue)

rpm .................... Rotações por minuto

SID .................... Submucosa de intestino delgado porcina

SPSS .................... Statistical Package for the Social Sciences

TCF .................... Tecido conjuntivo fibroso

TCP .................... Tricálcio fosfato

TGF-β .................... Fator transformador de crescimento β

UFBA .................... Universidade Federal da Bahia

UFPB .................... Universidade Federal da Paraíba

UPE .................... Universidade de Pernambuco

22

LISTA DE SÍMBOLOS

% .................... Percentual

β .................... Letra grega “beta”

µm .................... Micrômetro

® .................... Marca registrada

: .................... Razão

+ .................... Sinal de mais

< .................... Menor que

> .................... Maior que

= .................... Igual a

± .................... Sinal de mais ou menos

cm .................... Centímetros

g .................... Grama

Kg .................... Quilograma

mg .................... Miligrama

ml .................... Mililitro

mm .................... Milímetro

N-cm .................... Newton centímetro

ºC .................... Grau Celsius

rpm .................... Rotações por minuto

23

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 27

2 REVISÃO DE LITERATURA 31

2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA 31

2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos 33

2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS 34

2.2.1 Origem 35

2.2.2 Composição Química 36

2.2.3 Mecanismo de Ação 37

2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA 38

2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA 43

3 PROPOSIÇÃO 51

3.1 OBJETIVO GERAL 51

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 51

4 HIPÓTESES 53

5 MATERIAIS E MÉTODOS 55

5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA 55

5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA 56

5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS 56

5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS 57

5.5 GRUPOS DE ESTUDO 57

5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS 58

5.7 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO 58

24

5.7.1 Anestesia Geral 59

5.7.2 Técnica Cirúrgica 60

5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E

SINTÉTICA UTILIZADOS

64

5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS 65

5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E

45 DIAS

65

5.11 ANÁLISE HISTOLÓGICA 66

5.12 ANÁLISE MORFOMÉTRICA 68

5.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA 69

5.14 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS 70

5.15 FONTE DE FOMENTOS 70

6 RESULTADOS 72

6.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA 72

6.1.1 Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento) 72

6.1.2 Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle) 80

6.1.3 Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento) 88

6.1.4 Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle) 96

6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA 104

6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 104

6.3.1 Infiltrado Inflamatório 104

6.3.2 Vascularização 105

6.3.3 Reação de Corpo Estranho (RCE) 107

6.3.4 Tecido Conjuntivo Fibroso (TCF) 107

6.3.5 Atividade Osteoblástica 108

25

6.3.6 Neoformação óssea 109

7 DISCUSSÃO 114

8 CONCLUSÃO 123

REFERÊNCIAS 125

APÊNDICE 132

ANEXO 133

26

Introdução

27

1 INTRODUÇÃO

O tecido ósseo possui características biológicas que promovem sua regeneração

espontânea quando lesionado, repondo a porção perdida (TAGA et al., 1997). Em

grande parte, isto se deve a habilidade dos fatores de crescimento em direcionar as

células-tronco para as vias condrogênica e osteogênica, e ao papel das forças

mecânicas que estimulam a remodelação óssea (SICCA et al., 2000; CARNEIRO et

al., 2005).

Há situações em que a capacidade de reparo é limitada pelo tamanho da perda

óssea como aquelas causadas por trauma, patologias ou conseqüência de

procedimentos cirúrgicos diversos. Nestes casos, o defeito ósseo torna-se crítico a

reparação espontânea, onde se faz necessário o uso de enxertos para um correto

tratamento e bom prognóstico (CARNEIRO et al., 2005).

A reconstrução do tecido ósseo tem despertado grande interesse por parte das

diversas especialidades cirúrgicas (MARQUES et al., 1982; VOLPON, XAVIER,

GONÇALVES, 1982; RIOS et al., 1996; LIRA, 1998), onde nos métodos tradicionais

de tratamento tem-se utilizado o enxerto ósseo autógeno. Isto se deve a sua

propriedade osteogênica e facilidade de incorporação em comparação aos tipos

homógenos e xenógenos. No entanto, a utilização dos enxertos ósseos autógenos

agrega riscos ao paciente, incluindo a realização de mais um sítio operatório com

incisão cirúrgica adicional, aumento da morbidade pós-operatória, debilitação da

área doadora e quantidade óssea disponível limitada, principalmente em crianças e

28

adultos que se submeteram a procedimentos cirúrgicos anteriores (FIGUEIREDO et

al., 2001, SANADA et al., 2003; 2004; SASSIOTO et al., 2004; TUDOR et al., 2008).

Desta forma, tem-se procurado criar ou extrair da natureza materiais que substituam

o osso ou que, associados a ele ou a outros materiais, promovam o incremento da

reparação e neoformação óssea, sendo assim, biocompatíveis, osteocondutores,

osteogênicos e/ou osteoindutores (FROTA, 2006). Dentro deste contexto, observam-

se diversos trabalhos sobre o estudo da reparação óssea, utilizando os mais

diversos biomateriais, tais como: polímero de mamona (JACQUES, J. W. et al.,

2004; LAUREANO FILHO, J. R. et al., 2007), hidroxiapatita sintética (LIMEIRA

JÚNIOR, 2004; SOCCOL et al, 2006), β-tricálcio fosfato (FROTA, 2006), osso bovino

orgânico (MARINS et al, 2004; GERBI et al., 2003; PINHEIRO et al., 2003) e

inorgânico (PINHEIRO et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; ZAMBUZZI et al.,

2005, 2006).

Os derivados inorgânicos sintéticos como a hidroxiapatita e fosfato tricálcio, têm

recebido grande atenção como materiais de preenchimento, espaçadores e

substitutos para os enxertos ósseos, principalmente devido a sua

biocompatibilidade, bioatividade e características de osteocondução em relação ao

tecido hospedeiro (DAMIEN, PARSONS, 1991; SICCA et al., 2000; MOREIRA et al.,

2003; SANADA et al., 2003).

O papel de carreador dos fatores de indução óssea pode ser desempenhado pelo

osso bovino cortical ou medular, macro ou microgranular, desproteinizado. Além de

fornecerem uma estrutura de suporte e osteocondução, podem prover também um

29

alto conteúdo de cálcio e fósforo, essenciais para a neoformação do tecido ósseo

(SCIADINI et al., 1997; YUKNA et al., 1998; SICCA et al., 2000; ZAMBUZZI et al.,

2005, 2006).

Neste sentido, este estudo tem como finalidade contribuir para o conhecimento do

comportamento da reparação óssea quanto à utilização dos biomateriais de origem

bovina e sintética.

30

Revisão de Literatura

31

2 REVISÃO DE LITERATURA

Defeitos ósseos de origem genética e/ou subseqüentes a traumas, bem como

ressecções tumorais ou reabsorção óssea após perda dentária, tem constituído uma

barreira primária nas reconstruções ósseas antes de reabilitações orais (TUDOR et

al, 2008).

O tratamento de lesões ósseas extensas do complexo buco-maxilo-facial deve ser

realizado pela técnica do enxerto autógeno, quando o tecido ósseo vital é retirado de

uma área doadora e rapidamente transferido para o local da lesão. Entretanto, esse

procedimento nem sempre pode ser realizado pelo cirurgião devido à dificuldade de

obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora (TAGA et al, 1997).

O desenvolvimento dos biomateriais, especialmente dos substitutos ósseos, é

atualmente objeto de intensa pesquisa para utilização em cirurgia ortopédica,

traumatológica e buco-maxilo-facial. Desta forma, com intuito de suprir as limitações

conseqüentes ao uso de enxerto autógeno e/ou de bancos de osso, os biomateriais

vêm sendo utilizados com perspectiva de uma reconstituição do tecido ósseo, seja

no reforço de uma estrutura ou preenchimento de um defeito (GUTIERRES et al.,

2006).

2.1 REGENERAÇÃO ÓSSEA

Os eventos que ocorrem durante a cicatrização normal de feridas de tecidos moles

também ocorrem na reparação de um osso lesado e dividem-se basicamente em

32

três estágios (inflamatório, fibroblástico e remodelador). Embora não ocorram

mutuamente exclusivos, participam dessa seqüência de forma bem definida e

interdependente. O estágio inflamatório inicia-se no momento que ocorre a lesão

tecidual, e na ausência de fatores que prolonguem a inflamação, dura de 3 a 5 dias,

apresentando duas fases: a vascular e a celular. O estágio fibroblástico inicia-se a

partir da formação dos fios de fibrina que derivam da coagulação sanguínea e se

entrecruzam nas feridas, formando uma rede sobre a qual os fibroblastos podem

iniciar a precipitação de substância fundamental e tropocolágeno. No estágio final da

reparação (remodelador), muitas das fibras colágenas depositadas aleatoriamente

são destruídas à medida que são substituídas por novas fibras orientadas para

melhor resistir às forças de tensão sobre a ferida (HUPP, 2005).

A resposta adaptativa do osso após um trauma se expressa basicamente pela

instalação de um processo inflamatório, similar ao de outros tecidos, contudo, devido

a consistência elevada do osso, o edema e os mecanismos vasculares são limitados

e restritos. O tecido ósseo exacerba outros mecanismos, também presentes nos

tecidos moles, mas não com a mesma magnitude. Assim, destaca-se a presença de

uma reatividade celular proeminente e a formação do calo ósseo como fenômeno

reparativo fundamental. Também é destacado o fato de haver um processo

hemorrágico inicial importante, seguido de coagulação e formação de trombo intra-

ósseo (DOUGLAS, 2006)

Os osteoblastos e osteoclastos estão envolvidos na reconstrução e remodelação do

tecido ósseo lesado. As células osteogênicas (osteoblastos), importantes para a

reparação óssea, são derivadas de três fontes: periósteo, endósteo e células

33

mesenquimais pluripotentes indiferenciadas circulantes. Os osteoclastos, derivados

de células precursoras de monócitos, funcionam para reabsorver osso necrótico e

osso que necessita ser remodelado. Os osteoblastos depositam o osteóide que, se

mantido completamente imóvel durante o processo de cicatrização, chega à

calcificação (HUPP, 2005).

2.1.1 Resposta Biológica aos Biomateriais Substitutos Ósseos

A incorporação de biomateriais substitutos ósseos apresenta 5 estágios: 1)

inflamatório, promovendo uma resposta celular do hospedeiro; 2) revascularização

do tecido; 3) osteocondução, na qual o enxerto tem a função de arcabouço para o

crescimento de vasos e formação de osso; 4) osteoindução, em que as células

mesenquimais do hospedeiro são induzidas por proteínas morfogenética óssea

(BMP) encontradas no biomaerial a se transformarem em osteoblastos e 5)

remodelação óssea com características de formação e reabsorção contínua de osso

(SOCCOL et al., 2006).

Após a implantação de um biomaterial, ocorre a formação de um hematoma com

uma resposta do tipo inflamatória com aderência e revestimento de glicoproteínas ao

material. Por processo de quimiotaxia, numerosas células são recrutadas para o

local: neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos (reação de corpo estranho).

Estas últimas exercem atividade fagocitária e estimulam a ação dos linfócitos,

fibroblastos, osteoclastos e células polimorfonucleares. Em seguida, inicia-se a

angiogênese, com a migração e proliferação de células endoteliais. Estas irão formar

uma rede de capilares que constituíra o suporte vascular. Posteriormente, a ação de

34

citoquinas (IL-1 e IL-2) e de diversos fatores de crescimento (TGF-β, PDGF, IGF,

BMP’s) vão promover a diferenciação das células mesenquimais pluripotentes com a

formação de matriz óssea e de osso imaturo. Por fim, a maturação e a remodelação

encerram este processo (GUTIERRES, 2006).

O processo de incorporação do osso cortical difere do esponjoso devido a lenta

revascularização do primeiro, o que diminui a possibilidade de anastomoses término-

terminais, levando o dobro do período de tempo para este processo. O retardo é

proveniente da estrutura arquitetônica do osso cortical, uma vez que a atividade

osteoclástica precede a revascularização. Desta forma, os osteoclastos promovem o

aumento da porosidade, podendo chegar a 50%, fazendo o material perder a

resistência mecânica. Outra diferença é a tendência do osso cortical em permanecer

com uma parte viável e outra necrótica, enquanto o esponjoso tende a ser

completamente substituido com o tempo (PINTO, MIYAGUSKO, PEREIRA, 2003).

2.2 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS

Na busca de desenvolver substitutos biológicos para restaurar, manter ou melhorar a

função de diversos tecidos, várias estratégias tem sido utilizadas, tais como: 1)

reposição com biomaterial sintético; 2) biomateriais xenógenos submetido à ligação

cruzada para estabilização; 3) células presas em câmeras de difusão, micro-

cápsulas ou que cresceram sobre substratos reabsorvíveis; 4) substâncias capazes

de induzir a proliferação celular e tecidual (fatores de crescimento e morfogenes),

destinadas e/ou implantadas em local adequado (SICCA et al., 2000).

35

Neste contexto, é crescente o interesse no desenvolvimento de biomaterias que

possuam propriedades biológicas e físico-químicas adequadas para o tratamento de

perdas ósseas (SANADA et al, 2003). Desta forma, as características desejadas de

um material ósseo-substituto são: biocompatibilidade, previsibilidade, aplicação

clínica sem riscos trans-operatórios e mínimas reações pós-operatórias, além de

aceitação por parte do paciente (SICCA et al, 2000).

2.2.1 Origem

Os biomateriais podem ser obtidos de diferentes origens e classificados como:

autógeno, alógeno, aloplástico e xenógeno.

1) Autógeno – Origina-se do mesmo individuo. É considerado a referência (padrão

ouro) devido as suas vantagens biológicas e potencial osteogênico, mas apresenta

desvantagens, tais como: morbidade da área doadora e disponibilidade limitada

(CONZ; GRANJEIRO; SOARES, 2005; SCHLEGEL et al, 2006; ADEYEMO et al,

2008).

2) Alógeno – Obtido de uma mesma espécie através de banco de ossos humanos.

Apresenta risco de contaminação, necessidade de armazenamento especial e

controle rígido de infecção (American Academy of Periodontology - AAP, 2001;

SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).

3) Aloplástico – derivados inorgânicos como o fosfato tricálcio e a hidroxiapatita

sintética. Apresenta vantagem em relação aos auto e aloenxerto devido à sua fácil

36

esterilização e armazenamento. Já as suas desvantagens incluem graus variáveis

de reabsorção, pouca ação em defeitos diafisários, entre outros (SOCCOL et al,

2006).

4) Xenógeno – Obtido de outra espécie. Usualmente de origem bovina, vem

apresentando resultados promissores e mostra-se como uma alternativa à

intervenção cirúrgica de uma área doadora (autógeno) ou aos riscos de

contaminação e custos com exames laboratoriais (alógeno). No entanto, a

capacidade de reparo pode variar de acordo com a forma e tamanho das partículas

do material (SANADA et al, 2003; CONZ;GRANJEIRO; SOARES, 2005).

2.2.2 Composição Química

Segundo Gutierres (2008), quanto a sua composição química, os biomateriais

podem ser divididos em 4 classes:

1) Metais e ligas metálicas - p. ex.: titânio (ELIAS, 2008).

2) Cerâmicas - p. ex.: materiais cerâmicos à base de fosfato de cálcio, tais como:

fofato tricálcio – TCP (FROTA, 2006) e hidroxiapatita – HA (LIMEIRA JÚNIOR,

2004).

3) Polímeros - p. ex.: poliuretana de mamona (LAUREANO FILHO et al., 2007),

PLLA (ácido poli-L-lático), PGA (ácido poliglicólico) e PLGA (ácido poli-lático-co-

ácido glicólico) (SAKATA; ALBERTO-RINCON; DUEK, 2004).

37

4) Compósitos – p. ex.: compósito de biovidro-polihidroxibutirato (GUERRA NETO;

PAIVA; COSTA, 2005)

2.2.3 Mecanismo de Ação

Quanto ao mecanismo da ação, os biomateriais podem ser classificados em:

osteocondutores, osteogênicos, osteopromotores e osteoindutores.

1) Osteocondução – É a habilidade para suportar o crescimento ósseo ao longo de

uma superfície de contato. A capacidade osteocondutora é atribuída ao material,

geralmente inorgânico, que orienta a proliferação celular, permitindo a aposição de

tecido ósseo originado de células osteoprogenitoras já existentes (SANADA et al,

2003; TUDOR et al, 2008).

2) Osteopromoção – É a habilidade para atuar separando células com

características distintas, como fibroblastos e osteoblastos. Na regeneração tecidual

guiada os materiais osteopromotores buscam impedir que fibroblastos proliferem

para dentro da região do defeito ósseo em detrimento dos osteoblastos que

proliferam mais lentamente (SANADA et al, 2003).

3) Osteoindução – É a habilidade para induzir células mesenquimais indiferenciadas

a se diferenciarem em osteoblastos (SANADA et al, 2003).

38

4) Osteogênese – É a habilidade para estimular a formação de osso diretamente a

partir de osteoblastos, o que é feito geralmente por materiais orgânicos (SICCA et al,

2000).

2.3 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA

Materiais xenógenos vêm sendo pesquisados como biomateriais desde os anos 60,

incluindo ensaios clínicos para o preenchimento de defeitos ósseos (MELCHER;

DENT, 1962; SCOOP; KASSOUNY; MORGAN, 1966).

O advento de novos biomateriais xenógenos, como o osso bovino que se comporta

como promotor da reparação e carreador de fatores de indução óssea, parece

representar o futuro da reconstrução de defeitos ósseos. Entretanto, há uma

preocupação constante com a apresentação destes biomateriais, tais como: forma e

tamanho. O papel de carreador dos fatores de indução óssea potencialmente pode

ser desempenhado pelo osso bovino medular ou cortical, macro ou microgranular,

desproteinizado ou desmineralizado (CARNEIRO et al, 2005).

O processamento do osso bovino pode resultar em dois tipos distintos de material: o

inorgânico e o orgânico. 1) O osso bovino inorgânico é livre de proteínas e células, e

está caracterizado pelo elevado conteúdo de hidroxiapatita. A desproteinização é

obtida através de tratamento térmico a temperaturas superiores a 3000C, mas

quanto mais alta a temperatura, menor a possibilidade de bioabsorção do material.

Por outro lado, o tratamento com solventes orgânicos, álcalis e ácidos com

concentração e temperatura controlada leva à remoção de células, detritos celulares

39

e várias proteínas não colágenas, bem como a porção mineral, deixando um

arcabouço protéico constituído basicamente de colágeno tipo I e pequena

quantidade de fatores de crescimento, como a proteína morfogenética óssea. 2) O

osso bovino orgânico, adequadamente processado e desmineralizado, proporciona

um material de enxerto poroso constituído principalmente de colágeno bovino tipo I,

que apresenta grande homologia com o colágeno humano. Possui, ainda, traços de

fatores de crescimento que podem estimular a osteogênese (SANADA et al, 2003).

Wenz; Oesch; Hortst (2001) avaliaram o risco de transmissão da encefalopatia

espongiforme bovina - EEB (“doença da vaca louca”) através de biomateriais

derivados de osso bovino. Os autores utilizaram o Bio-Oss® e o Osteograf®

e

concluíram através de evidência teórica e experimental que estes biomateriais não

apresentam risco de transmissão de EEB para os pacientes.

Indovina e Block (2002) avaliaram a reparação óssea em alvéolo após a extração de

pré-molares superiores e inferiores em cães, utilizando biomateriais derivados de

osso bovino inorgânico (Bio-Oss®) e de fosfato de cálcio (embarc® e Bone Source®).

Os autores realizaram avaliações clínica e radiográfica com 2, 4, 6 e 8 semanas e,

após oito semanas, o osso alveolar foi removido e submetido à avaliação histológica.

Todos os alvéolos cicatrizaram sem sinais de infecção. Clinicamente, não houve

diferenças entre os grupos. Radiograficamente, o grupo com osso bovino

apresentou, juntamente com o controle, uma maior radiopacidade em comparação

com os grupos que utilizaram material a base de fosfato de cálcio. Estes pareciam

permanecer intactos sem reabsorção e substituição. Na análise histológica, foi

observada eventual reação de corpo estranho nos dois grupos com fosfato de cálcio,

40

onde o alvéolo permanecia predominantemente preenchido pelo material

implantado. No grupo controle observou-se formação óssea, assim como no grupo

com osso bovino que apresentou neoformação óssea entre as partículas do material

remanescente. Portanto, histologicamente, houve diferença significativa dos grupos

controle e com osso bovino em comparação aos dois grupos com fosfato de cálcio.

Sanada et al. (2003) avaliaram a biocompatibilidade de blocos de osso bovino

esponjoso acelular e desmineralizado (Gen-Ox®

). Foram utilizados 30 ratos albinos

(Wistar) divididos aleatoriamente em grupos com períodos de 3, 7, 14, 21 e 28 dias.

Blocos de 5,0 x 12,0 mm do material foram implantados no músculo abdutor da coxa

dos animais. Tomadas radiográficas foram realizadas antes do sacrifício dos

animais. Na avaliação histológica dos períodos de 3 e 7 dias, foi evidenciado

processo inflamatório agudo, caracterizado pela presença de neutrófilos, reabsorção

do coágulo sanguíneo e angiogênese. Entre 14 e 21 dias, houve reabsorção do

material implantado e sua substituição por tecido conjuntivo fibroso. Com 28 dias, na

maioria dos casos, observaram-se apenas pequenos fragmentos da matriz

implantada envolto por tecido conjuntivo. Radiograficamente, não foi evidenciada

presença de mineralização. Com base nos resultados, os autores concluíram que o

biomaterial derivado da matriz de osso esponjoso bovino desmineralizado em bloco

é biocompatível quando implantado em tecido conjuntivo intramuscular de ratos,

sendo absorvido e substituído por tecido conjuntivo característico da região, sem

qualquer indício de ocorrência de osteogênese ectópica.

Num estudo experimental, Marins et al. (2004), avaliaram a reparação óssea em

defeitos de 8,0 mm no osso parietal de ratos, utilizando o osso bovino orgânico

41

(Gen-Ox®

). Os animais foram divididos em dois grupos, onde no primeiro, os defeitos

ósseos eram preenchidos por matriz bovina orgânica e no segundo grupo, por

coágulo sanguíneo. Os resultados demonstraram que o material testado foi

lentamente reabsorvido, favorecendo angiogênese, adesão e migração celular e

neoformação óssea a partir das bordas da lesão. Entretanto, alguns animais

apresentaram reação granulomatosa de corpo estranho com a presença de

inúmeras células gigantes que impediram a neoformação óssea local. Os autores

atribuíram este fato, à ausência de desmineralização e à falta de remoção de fatores

antígenos durante o processamento do biomaterial. Foi concluído que o osso bovino

orgânico, quando bem controlada a qualidade da produção do material, apresenta

uma ótima alternativa para a reparação óssea devido à sua alta capacidade

osteocondutora.

Thorwarth et al. (2006), num estudo experimental prospectivo, avaliaram a formação

óssea da matriz bovina inorgânica (Bio-Oss®

) associada ou não ao osso autógeno

numa proporção de 3:1. Foram criados defeitos ósseos de 8,0 mm na calota

craniana de porcos. A análise histológica identificou osseointegração em ambos os

grupos nos tempos avaliados, no entanto, a avaliação microradiográfica demonstrou

um significante aumento da neoformação óssea no grupo que fez uso da matriz

inorgânica associada ao enxerto autógeno após 6 e 8 semanas. Os autores

concluíram que a melhor reparação óssea aconteceu devido à osteoindução

promovida por elementos celulares transplantados com o osso autógeno.

Serra-Silva; Albergaria-Barbosa; Mazzonetto (2006) avaliaram clinica e

radiograficamente o comportamento da associação de matriz orgânica de osso

42

bovino (Gen-Ox®) com proteína morfogenética de osso bovino (Gen-Pro®

), na

proporção 5:1, em comparação ao enxerto de osso autógeno proveniente do ramo

mandibular na promoção da reparação óssea no levantamento do seio maxilar.

Foram utilizados 10 pacientes com a necessidade de levantamento bilateral do seio

menor que 6,0 mm determinado por tomografia computadorizada. Em todos os

pacientes, um lado foi determinado como experimental (associação de enxerto

bovino) e o outro controle (enxerto autógeno). Após o período de 6 a 11 meses, os

implantes eram colocados. A avaliação foi através de radiografia panorâmica e

avaliação trans-operatória da formação óssea da área enxertada e estabilidade dos

implantes. Os resultados mostraram uma melhor formação óssea e estabilidade

inicial dos implantes no grupo controle, embora no grupo experimental, o torque para

colocação dos implantes tenha sido maior que 30 N-cm.

Tudor et al. (2008) avaliaram a regeneração óssea em defeitos de 10,0 mm

realizados no osso frontal de porcos. Foram utilizados nove animais onde cada um

teve dez defeitos, sendo nove divididos para a formação de três grupos

experimentais: 1 - osso autógeno, 2 - osso alógeno (Puros®) e 3 - osso bovino

(Navigraft®

); e um defeito para o grupo controle. Os animais foram observados com

1, 8 e 12 semanas. Com base nos resultados, após 12 semanas, todos os materiais

testados promoveram a completa formação óssea do defeito e o grupo controle

apresentou aproximadamente 75% de preenchimento ósseo. Através da

microradiografia, observou-se, entre os materiais testados, uma taxa de

mineralização de 5 a 10% menor em comparação ao enxerto de osso autógeno.

Entretanto, não se observou diferença estatística entre os grupos experimentais.

43

2.4 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM SINTÉTICA

Materiais aloplásticos vêm sendo utilizados no preenchimento de cavidades ósseas

na tentativa de induzir reparação óssea. No início dos anos 70, muitos

pesquisadores começaram a estudar um grupo de materiais sintéticos constituídos

de cerâmicas de fosfato de cálcio. Nos anos 80, uma série de artigos foi publicada,

avaliando os diversos aspectos destas cerâmicas. Estes materiais são

biocompatíveis, pois não induzem qualquer reação adversa, além de conter cálcio e

fosfato, os quais são presentes no tecido ósseo (BUCHAIM et al, 2002).

É possível produzir materiais cerâmicos sintéticos com uma composição semelhante

à matriz óssea inorgânica e sem limitações em termos de quantidade disponível.

Entre eles, temos: 1) sulfato de cálcio, 2) biovidros e 3) materiais cerâmicos à base

de fosfato de cálcio (fosfato tricálcio – TCP, hidroxiapatita – HA, biocompósitos à

base de fosfato de cálcio e cimentos de cerâmica injetáveis) (GUTIERRES et al.,

2006).

A cerâmica de hidroxiapatita tem sido estudada por tratar-se de uma substância

bioativa não tóxica, que provoca pouca reação tecidual, apresentando-se como um

importante recurso para a substituição óssea (MOREIRA et al, 2003).

Materiais de fosfato de cálcio podem ser encontrados na natureza (hidroxiapatita de

coral) ou sintetizados por métodos de precipitação que utilizam reagentes químicos.

A hidroxiapatita, Ca10(PO4)6(OH)2, é a biocerâmica de fosfato de cálcio mais

conhecida e estudada. Nas áreas médica e odontológica, o termo “hidroxiapatita” é

44

muitas vezes usado para descrever os materiais de fosfato de cálcio. Geralmente,

estas biocerâmicas são aceitas como osteocondutoras e não osteoindutoras (CONZ;

GRANJEIRO; SOARES, 2005).

Tem sido mostrado que materiais denominados como hidroxiapatita pura

apresentam biocompatibilidade diferente daqueles formados pela mistura de

hidroxiapatita e fosfato tricálcio. Resultados preliminares utilizando cultura de células

sugerem que a presença de maior porcentagem de microporos (< 10 µm) interfere

negativamente com a biocompatibilidade da hidroxiapatita. Tais evidências sugerem

que o comportamento biológico destas cerâmicas é dependente de vários fatores,

tais como: composição química e características físicas finais do produto (ROSA;

SHAREEF; NOORT, 2000).

A hidroxiapatita sintética consiste em um material inorgânico comumente usado em

falha óssea e constituinte da fase mineral dos tecidos calcificados. Pode ser utilizada

em defeito ósseo sem carga ou em falha onde a carga, estresse de torção ou

cisalhamento é neutralizado por implante rígido, como placa e parafusos (SOCCOL

et al, 2006).

Orr et al. (2001) avaliaram propriedades mecânicas compressivas de defeitos

ósseos de 3,5 mm de diâmetro por 8,0 mm de profundidade confeccionados na

porção distal do fêmur de coelhos. Foram utilizados os biomateriais derivados de

osso bovino inorgânico (Bio-Oss®) e de hidroxiapatita sintética (Calcitek®)

comparados com o grupo controle (sem preenchimento do defeito) e com o grupo

anatômico (sem o defeito). Os grupos foram avaliados nos seguintes períodos: osso

45

bovino inorgânico (2, 6 e 26 semanas), hidroxiapatita sintética (6 e 26 semanas),

grupo controle (2, 6 e 26 semanas) e o grupo anatômico (2 semanas). Os resultados

mostraram não haver diferença das forças compressivas no período de 2 semanas

entre o grupo que utilizou o osso bovino inorgânico e o grupo anatômico. Nos

períodos de 2, 6 e 26 semanas, o grupo do osso bovino inorgânico apresentou força

compressiva maior que o grupo controle. O grupo da hidroxiapatita sintética teve

força compressiva bem maior que o grupo controle e o grupo do osso bovino

inorgânico nos tempos de 6 e 26 semanas, apresentando diferença estatística

significante. Quanto ao módulo de elasticidade, o grupo do osso bovino inorgânico

apresentou valores bem próximos do grupo controle, portanto sem diferença

estatística, enquanto que o grupo da hidroxiapatita sintética obteve valores

significativamente maiores que os citados grupos.

Buchaim et al. (2002) analisaram a reparação óssea em defeitos ósseos realizados

na tíbia de ratos Wistar submetidos ao alcoolismo crônico experimental. No grupo

experimental, os animais recebiam álcool etílico diluído a 6% como dieta líquida,

sendo subdivididos em experimental-1 onde o defeito permanecia sem

preenchimento e experimental-2 quando preenchido por hidroxiapatita sintética

associada ao β-tricalcio-fosfato (Gen-Phos®), na proporção de 70 e 30%,

respectivamente. O grupo controle diferiu do experimental apenas na dieta líquida

constituída por água, apresentando controle-1 (defeito sem preenchimento) e

controle-2 (preenchido por Gen-Phos®). Os animais do grupo experimental foram

gradualmente adaptados ao álcool, recebendo uma dieta líquida de álcool etílico a

2% na primeira semana, a 4% na segunda e 6% na terceira. Após o período de

adaptação, os ratos receberem a dieta líquida de álcool etílico a 6% por 60 dias para

46

serem submetidos aos procedimentos cirúrgicos. Todos os grupos foram avaliados

microscopicamente nos tempos de 10, 20 e 40 dias. Os resultados mostraram que

uma dieta alcoólica conduziu a uma neoformação óssea mais discreta de todos os

espécimes em todos os períodos observados, causando preenchimento ósseo

incompleto da cavidade cirúrgica após 40 dias de reparo. A neoformação óssea foi

mais favorável em alguns animais que tiveram a implantação do Gen-Phos®

após 20

dias de reparo.

Horch et al. (2006) estudaram o efeito a longo prazo da cerâmica de beta-tricálcio

fosfato (β-TCP - Cerasorb®) em diferentes sítios da reconstrução alveolar. Cento e

cinqüenta e dois (152) pacientes foram avaliados, onde a maioria das indicações

para o β-TCP foi para o preenchimento de cistos mandibulares (n=52), seguido de

fissura alveolar (n=38), defeitos periodontais (n=24) e aumento de assoalho do seio

maxilar (n=16). Nos defeitos maiores que 2,0 cm de diâmetros, o β -TCP foi

combinado com enxerto autógeno esponjoso, na proporção de 1:1, proveniente da

região retro-molar, da tuberosidade ou do mento mandibular. Avaliação clínica,

radiológica e por ultrasonografia (na verificação da presença de micropartículas do

material nos nódulos linfáticos regionais) foi realizada com 4, 12 e 52 semanas no

pós-operatório. Em 16 casos, foram realizadas biópsias que demonstraram completa

regeneração óssea. Este fato foi possível devido à necessidade de um segundo

procedimento cirúrgico para remoção de material de fixação (placas e parafusos)

e/ou para inserção de implantes dentários. Distúrbios na cicatrização foram

observados em 9,2% dos pacientes, perda parcial do material em 5,9%, enquanto

que a perda total em 2%. Devido à sua versatilidade, baixa taxa de complicações e

47

bons resultados ao longo prazo, o β-TCP sintético apresentou-se como adequado

material para o preenchimento de defeitos ósseos em região alveolar.

Fujita et al. (2003) analisaram as diferenças na osteogênese e reabsorção da

hidroxiapatita (HA) e do β-tricálcio-fosfato (β-TCP ) sob a forma de blocos com

macro e microporos. Os materiais foram implantados entre o osso parietal e o

periósteo de ratos Wistar e avaliados com 1, 2, 4, 8 e 24 semanas. Os resultados

obtidos demonstraram que a força compressiva foi maior para a HA e a

concentração de íons Ca foi maior para o β-TCP nos períodos de 4 e 8 semanas. Na

análise histomorfométrica, observou-se que a neoformação óssea aumentou com o

tempo, porém foi significantemente maior nos poros do bloco de HA em comparação

ao β-TCP em 24 semanas. No mesmo período, houve uma grande diminuição na

quantidade remanescente do bloco de β-TCP, apresentando diferença significativa

quando comparado a HA que se manteve praticamente estável durante todo este

período. Os autores concluíram que os blocos de HA são mais adequados,

considerando o modelo utilizado, para implantação do tipo onlay.

Miranda et al. (2005) realizaram um estudo experimental comparativo de enxerto

ósseo orgânico (osso autógeno – crista ilíaca) e material inorgânico (Osteosynt® -

hidroxiapatia + tricálcio-fosfato) em fraturas de rádio em coelhos. Foram utilizados 20

animais, divididos em 2 grupos, que se submeteram a remoção de um segmento

osteoperiosteal em todo seu diâmetro com 1 cm de comprimento. No grupo 1,

colocaram-se fragmentos de enxerto orgânico e no grupo 2, fragmentos do material

inorgânico. Os animais foram sacrificados com 15, 30, 45, 60 e 75 dias. Na

avaliação radiográfica, foi possível observar a completa reparação óssea em todos

48

os grupos, sendo de forma mais rápida com menor tempo de evolução no grupo 2

que utilizou o osso inorgânico; fato esse confirmado pela análise histológica. Como

conclusão, os autores afirmam que o material ósseo inorgânico pode ser usado de

rotina em cirurgia ortopédica, proporcionando uma cicatrização óssea precoce.

Soccol et al. (2006) avaliaram os biomateriais de hidroxiapatita de cálcio sintético

(HA) e submucosa de intestino delgado porcina (SID) no preenchimento de defeitos

ósseos de 0,75 x 1,5 cm criados em mandíbula de ratos Wistar. Foram utilizados 24

animais divididos aleatoriamente em dois grupos: 1 (HA) e 2 (SID), sendo

padronizado à esquerdo o preenchimento do defeito com o material e à direita o não

preenchimento serviu de controle. Após 40 dias, procedeu-se a eutanásia dos

animais e por conseqüente a análise macroscópica e histomorfométrica das peças.

Os resultados evidenciaram uma melhor neoformação óssea com a utilização da

hidroxiapatita (76,64%) quando comparado ao grupo da submucosa de intestino

delgado porcina (63,64%). Entretanto, os dois biomateriais mostraram-se efetivos

quando comparados ao controle.

Fellah et al. (2008) estudaram a osteogenecidade da cerâmica de cálcio fosfato

bifásico - CFB (MBCP®), constituída por hidroxiapatita + β -tricálcio fosfato na

proporção de 60/40, em comparação ao osso autógeno (OA). A cerâmica foi

sinterizada nas temperaturas de 1050, 1125 e 1200 oC, produzindo diferentes micro-

porosidades. Os materiais foram implantados em locais ectópicos (músculo para-

espinhal) e ortotópicos (osso femural) de cabras e analisados nos períodos de 6 e

12 semanas. Para implantação intramuscular, foram criados 4 diferentes grupos: 1)

OA, 2) CFB 1050 oC, 3) CFB 1125 oC e 4) CFB 1200 oC. No preenchimento dos

49

defeitos ósseos além dos grupos anteriormente citado foi adicionado um quinto para

controle (sem preenchimento) Com base nos dados obtidos, a propriedade de

osteoindução não foi observada em nenhum dos grupos estudados após os

períodos de observação nos locais ectópicos (musculatura para-nasal). Nos ossos

femorais, os materiais foram colocados dentro de um cilindro de politetrafluoroetileno

e implantados em defeitos críticos de 9,0 mm de diâmetro por 10,0 mm de

profundidade. Para os grânulos de CFB 1050 e 1125 oC, observou-se formação

óssea tanto no período de 6 quanto de 12 semanas. Para o grânulo de 1200 o

C,

houve presença de mineralização discreta apenas em 12 semanas. Os defeitos sem

preenchimento não apresentaram formação óssea. Os enxertos autógenos foram

completamente reabsorvidos nos dois locais estudados. Desta forma, os autores

concluíram que o biomaterial ósseo de origem sintética pode apresentar estabilidade

e propriedades osteogênicas superiores que o enxerto autógeno em defeitos críticos

confeccionados em osso femoral de cabras.

50

Proposição

51

3 PROPOSIÇÃO

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar histomorfometricamente a reparação óssea após a utilização de biomateriais

de origem bovina e sintética em defeitos de 5,0 mm de diâmetro na calvária de ratos

Wistar nos períodos de 15, 30 e 45 dias.

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Avaliar comparativamente o processo de reparo de defeitos ósseos padronizados

em calvária de ratos Wistar, submetidos a:

1) Biomaterial de origem bovina (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica

esponjosa e colágeno bovino).

2) Biomaterial de origem sintética (cerâmica de hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato)

52

Hipóteses

53

4 HIPÓTESES

HIPÓTESE H

0

Os biomateriais de origem bovina e sintética não estimulam reparação óssea em

defeitos de 5,0 mm

de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.

HIPÓTESE H

1

Os biomateriais de origem bovina e sintética estimulam reparação óssea em defeitos

de 5,0 mm

de diâmetro confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.

HIPÓTESE H

2

O biomaterial de origem bovina estimula uma melhor reparação óssea em

comparação ao de origem sintética em defeitos de 5,0 mm

de diâmetro

confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.

HIPÓTESE H

3

O biomaterial de origem sintética estimula uma melhor reparação óssea em

comparação ao de origem bovina em defeitos de 5,0 mm

de diâmetro

confeccionados na calvária de ratos Wistar albinus.

54

Materiais e Métodos

55

5 MATERIAIS E MÉTODOS

A presente pesquisa baseou-se num estudo experimental que foi realizado no

Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB.

5.1 SELEÇÃO E TAMANHO DA AMOSTRA

Foram utilizados 36 ratos machos albinos (Rattus norvegicus da família Muridae, da

variedade Wistar), adultos jovens, com massa corporal variando entre 270 e 370g,

advindos do Biotério do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade

Federal da Paraíba – LTF / UFPB (Figura 1). O tamanho da amostra configurada foi

baseado na literatura científica correlata, na qual se pôde constatar um número de

animais compatível com a necessidade de resultados confiáveis, do ponto de vista

de significância estatística, bem como com o respeito às questões bioéticas

(LIMEIRA JÚNIOR et al., 2003; LIMEIRA JÚNIOR, 2004).

56

Figura 1 – Rato Wistar, macho albino, adulto jovem.

5.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO DA AMOSTRA

Clinicamente, os animais que apresentassem lesão da dura-máter, infecção,

deiscência da sutura e exposição do enxerto, bem como, alguma patologia no

transcorrer dos períodos de experimentação seriam excluídos e substituídos. Do

ponto de vista histológico, seriam excluídos os espécimes que apresentassem perda

do material testado durante o processamento da amostra e os com interposição de

tecido mole (tecido intracraniano) na área avaliada.

5.3 ACONDICIONAMENTO DOS ANIMAIS

Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas atapetadas com maravalha

de pinus, sendo 3 animais por gaiola (Figura 2). Os animais foram mantidos no

Laboratório de Experimentação Animal do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal da Paraíba – LEA / CCS / UFPB na temperatura de 23ºC ±

57

2ºC, ciclo claro-escuro de 12 horas. A limpeza das gaiolas foi efetuada segundo o

protocolo do Laboratório.

Figura 2 - Animais acondicionados em gaiolas plásticas

5.4 ALIMENTAÇÃO DOS ANIMAIS

Os animais receberam ração sólida peletizada2

Os 36 ratos foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos G1 (bovino) e G2

(sintético) com 6 animais para os períodos de 15, 30 e 45 dias (Quadro 1). Em cada

animal, foram confeccionados dois defeitos de 5,0 mm de diâmetro no osso parietal

em cada lado da sutura sagital, de forma que o lado esquerdo correspondeu ao

experimento (G1A - preenchido pelo osso de origem bovina ou G2A – osso de

com alto teor de proteína (20 a 27%)

e água ad libitum.

5.5 GRUPOS DE ESTUDO

2 Labina® - Purina Nutrimentos

58

origem sintética) e o lado direito ao controle (G1B ou G2B - preenchido pelo coágulo

sanguíneo).

Quadro 1 – Divisão dos grupos de acordo com a origem do biomaterial e o período

de observação

G 1 G 2

DIAS (Origem Bovina) (Origem Sintética)

15 6 6

30 6 6

45 6 6

TOTAL 18 18

5.6 IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS

Cada gaiola foi identificada individualmente, bem como cada animal, onde

constaram: nome do experimento, responsável pela pesquisa, grupo, massa

corporal do animal, datas do nascimento, cirurgia e sacrifício. A identificação foi

realizada em formulário especifico e com lápis pincel na cauda do rato, onde cada

animal conteve marcações específicas, identificando seu grupo (Apêndice).

5.7 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO

Os procedimentos de anestesia geral e técnica cirúrgica seguiram os princípios

descritos por Frota (2003, 2006), a saber:

59

5.7.1 Anestesia Geral

Para a anestesia geral dos animais, foi utilizado Cloridrato de Quetamina a 5% (60-

90 mg/kg)3 e Cloridrato de Xilazina a 2% (4-8 mg/kg)4

Figura 3 - Tricotomia e imobilização em mesa cirúrgica específica

e aplicados no músculo da

coxa do animal, obtendo-se um período de aproximadamente duas horas de

anestesia. Imediatamente após a anestesia, foi realizada a tricotomia da região

mediana da calota craniana dos ratos e os animais foram imobilizados em uma

mesa cirúrgica específica pela região temporal através de pinos de contensão

lateral, bem como pelos incisivos superiores e inferiores em local específico (Figura

3).

3 Vetanarcol® - König 4 Dorcipec® - Vallée

60

5.7.2 Técnica Cirúrgica

Primeiramente, foi realizada a anti-sepsia da região da calota craniana, com

Polivinilpirrolidona-iodo5 a 10% na região a ser incisada. Após aposição dos campos

operatórios, promoveu-se a infiltração anestésica local de 0,1ml de Cloridrato de

Lidocaína com Adrenalina6

Figura 4 - Anti-sepsia e infiltração anestésica local

, na concentração de 1:200.000 (Figura 4). Este

procedimento foi adotado, com o intuito de diminuir o sangramento no trans-

operatório e promover um maior conforto no pós-operatório imediato.

Em seguida, realizou-se uma incisão linear através da pele e do periósteo, indo da

região fronto-nasal a protuberância occipital externa, com o uso de uma lâmina de

bisturi7 número 15, montada em cabo de bisturi8 do tipo Bard-Parker número 3

(Figura 5). Com o destaca-periósteo9

5 Povidine Degermante® - Ceras Johnson 6 Xylocaína® com Epinefrina 1:200.000 – Astra Zeneca 7 Feather Safety Razor CO., LTD. Medical Division 8 Bard-ParkerTM 9 Quinelato Schobell Industrial Ltda

de Molt, efetuou-se o descolamento do retalho

e o seu afastamento através de descoladores delicados (Figura 6).

61

Figura 5 - Incisão linear através da pele e periósteo

Figura 6 – Exposição da calvária após descolamento e afastamento do retalho

Através de uma broca trefina10 de 5,0 mm de diâmetro, foi realizada uma ostectomia,

utilizando uma peça de mão reta para micro motor elétrico11 acionado a uma

velocidade de 30.000 rpm. A irrigação foi externa com uso de soro fisiológico12

10 Sistema de implantes PPMM 11 Beltec® - modelo LB 100 12 Soro Fisiológico® - Darrow

0,9%,

evitando, assim, um superaquecimento e subseqüente necrose óssea. A ostectomia

criou um defeito ósseo circular de 5,0 mm de diâmetro e de espessura total

(aproximadamente 0,5 mm), no lado esquerdo (localização mais caudal) e direito

62

(localização mais cefálica), na região parietal, tendo-se o cuidado de não

comprometer a dura-máter. O preenchimento do defeito ósseo no lado esquerdo

(experimento) foi feito com biomaterial de origem bovina (grupo G1) ou sintética

(grupo G2) e no lado direito (controle) com coágulo sanguíneo. (Figuras 7 e 8).

Figura 7 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial

bovino (matriz orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino)

Figura 8 – Defeitos ósseos de 5,0 mm de diâmetro. Lado esquerdo: biomaterial

sintético (cerâmica de hidroxiapatita + β-tricálcio-fosfato)

63

Por último, foi confeccionada a sutura interrompida simples para o periósteo e a

sutura contínua simples para a pele foi confecionada com o fio de poliamida13

Figura 9 – Sutura interrompida simples do periósteo (mononylon 5-0)

(mononylon 5-0) (Figuras 9 e 10).

Figura 10 – Sutura contínua simples da pele (mononylon 5-0)

13 Ethicon® - Johnson & Johnson

64

5.8 BIOMATERIAIS SUBSTITUTOS ÓSSEOS DE ORIGEM BOVINA E SINTÉTICA

Os biomateriais substitutos ósseos de origem bovina e sintética utilizados

apresentavam a seguinte composição, respectivamente:

Gen-mix®14

Gen-phos®

Material composto, microgranular (0,25 - 1,0 mm), liofilizado, contendo osso bovino

desproteinizado e osso bovino desmineralizado.

Composição:

1. Matriz orgânica de osso bovino cortical (0,5 cc)

2. Matriz inorgânica de osso bovino esponjoso (0,5 cc)

3. Colágeno bovino aglutinante (0,5 cc)

15

Material ósseo cerâmico bifásico, biocerâmica sintética, de alta pureza, porosa e

microgranular (0,5 – 0,75 mm)

Composição:

1. Hidroxiapatita porosa absorvível (60 - 70%)

2. β-tricálcio-fosfato (30 - 40%)

14 Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP. 15 Genius - Baumer S.A., Mogi Mirim/SP.

65

5.9 CUIDADOS PÓS-OPERATÓRIOS

Os animais foram mantidos a temperatura corpórea, sendo acondicionados em

ambiente sem ar condicionado, com o intuito de o ambiente permanecer aquecido

no período pós-anestésico, evitando assim, hipotermia corporal, depressão cardio

respiratória e óbito (HARKNESS, WAGNER, 1993). Foi efetuada a limpeza da ferida

cirúrgica, para que os animais que despertassem primeiro da anestesia não

ficassem estimulados a praticar o canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue

presente na ferida cirúrgica. A dieta foi mantida (FIGUEIREDO, TAKITA,

GOLDENBERG, 1997).

5.10 OBTENÇÃO DOS ESPÉCIMES APÓS OS PERÍODOS DE 15, 30 E 45 DIAS

Após a realização da anestesia geral, o procedimento cirúrgico para obtenção dos

espécimes iniciou com uma incisão trapezoidal de espessura total, abrangendo os

tecidos moles da região parietal da calota craniana (Figura 11).

Figura 11 – Incisão trapezoidal de espessura total para obtenção dos espécimes

66

Posteriormente, efetuou-se a ressecção parcial da calota craniana, utilizando uma

broca carbide16

número 702, montada em peça de mão reta e acionada por micro-

motor elétrico, a uma velocidade de 30.000 rpm. A ostectomia foi realizada com

margem de segurança para não haver um superaquecimento do espécime, com

conseqüente necrose e alteração dos resultados (Figura 12). A eutanásia dos

animais foi através da dose letal do anestésico.

Figura 12 – Espécime obtido após ressecção parcial da calota craniana

5.11 ANÁLISE HISTOLÓGICA

O processamento histológico foi realizado no laboratório de Patologia Bucal da

Faculdade de Odontologia de Pernambuco – FOP / UPE. Os espécimes foram

fixados em formol neutro (paraformaldeído 4%), à temperatura ambiente e

posteriormente descalcificados em solução de ácido nítrico a 0,5% por 15 dias. Após

a descalcificação, os espécimes foram lavados em água corrente, por 24 horas,

desidratados em cadeia crescente de álcool (70 a 100%), diafanizados em banhos

16 Dentoflex Instrumentos Cirúrgicos

Partículas do biomaterial implantado após obtenção do espécime

67

de xilol e incluídos em parafina. Os espécimes foram seccionados em cortes semi-

seriados de 3,0 µm no maior diâmetro do defeito e corados por Hematoxilina e

Eosina (H.E.).

A análise histológica foi realizada no Laboratório de Patologia Geral do Centro de

Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba - CCS / UFPB. Foram

utilizados como parâmetros histológicos: infiltrado inflamatório, vascularização,

reação de corpo estranho (RCE), tecido conjuntivo fibroso (TCF), atividade

osteoblástica e neoformação óssea. Para a avaliação dos resultados histológicos

nos diferentes parâmetros, foi utilizado (1) para presente e (0) para ausente. Quando

presente, o infiltrado inflamatório e a vascularização foram classificados como leve

(1), moderado (2) e intenso (3); a atividade osteoblástica em (1) presente e (2)

fortemente presente; e, a neoformação óssea, segundo os aspectos, a saber:

1) Leve – neoformação óssea incipiente restrita às bordas do defeito ósseo;

2) Leve-moderada – neoformação óssea mais marcante, representada pela

deposição de trabéculas a partir das bordas do defeito ósseo;

3) Moderada – neoformação óssea a partir da borda do defeito ósseo e no interior do

mesmo, mas em áreas restritas;

4) Moderada-intensa – neoformação óssea a partir da borda e no interior do defeito

ósseo quase preenchendo toda a extensão deste;

5) Intensa – Preenchimento do defeito ósseo por trabéculas de osso neoformado,

em toda sua extensão, mas não em espessura;

6) Completa – Preenchimento total do defeito ósseo por trabéculas de osso

neoformado, tanto em extensão como em espessura.

68

5.12 ANÁLISE MORFOMETRICA

A análise morfométrica foi realizada no departamento de informática da

Universidade Federal da Paraíba - UFPB, por dois observadores independentes,

quantificando a área (µm2

) de matriz óssea neoformada, através do método de

segmentação de imagens (QUEIROGA et al., 2008) (Figuras 13, 14 e 15).

Passos da Segmentação de Imagens:

1. Transformação da imagem do sistema RGB para o sistema L*a*b*

2. Segmentação utilizando o algoritmo k-médias com 7 clusters (classes) a partir das

bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*.

3. Nova segmentação usando o k-médias com 3 clusters a partir da classe da

segmentação anterior que apresentou a região de neoformação óssea.

4. Binariazação da imagem pelo método de Otsu.

5. Contagem de pixels com valor “1” (brancos) da imagem binária para mensurar a

área (em pixels).

6. Cálculo da área (em µm²) a partir de dados obtidos usando uma escala como

referência.

69

Figura 13 – Imagem do defeito ósseo do grupo G2A (biomaterial de origem

sintética – experimento) com 45 dias

Figura 14 – Imagem extraída correspondente ao conteúdo do defeito ósseo que será

segmentada em sete classes

Figura 15 – Classe utilizada para cálculo da área (µm2

matriz óssea neoformada

) da

5.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Na análise dos dados foram obtidas distribuições absolutas e percentuais (Técnicas

de Estatística Descritiva) e foram utilizados os seguintes testes estatísticos: Qui-

quadrado de Pearson (ou Exato de Fisher quando as condições para utilização do

70

teste Qui-quadrado não foram verificadas), teste de Mann-Whtiney, Wilcoxon

pareado e F (ANOVA) para medidas repetidas com comparações LSD (Least

significance diference).

O nível de significância utilizado na decisão dos testes estatísticos foi de 5,0%. Os

dados foram digitados na planilha Excel e o software utilizado para a obtenção dos

cálculos estatísticos foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) na

versão 13.

5.14 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

O estudo foi desenvolvido segundo as normativas contidas no Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal e após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal

do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba –

LTF / UFPB (ANEXO 2).

5.15 FONTE DE FOMENTOS

Os itens de consumo para realização da pesquisa foram financiados pelo próprio

pesquisador.

71

Resultados

72

6 RESULTADOS

Os dados foram descritos para os grupos G1 (bovino) e G2 (sintético), sendo G1A e

G2A para os subgrupos experimentais e G1B e G2B para os controles.

6.1 ANÁLISE HISTOLÓGICA

Em todos os espécimes estudados, independentemente do grupo e do tempo de

observação, foram verificadas a presença de tecido conjuntivo fibroso e a ausência

de reação de corpo estranho. Os demais parâmetros histológicos (inflamação,

vascularização, atividade osteoblástica e neoformação óssea) estiveram presentes,

variando quanto à classificação.

6.1.1 Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento)

15 dias

Das seis amostras deste subgrupo, uma foi excluída devido à perda da peça durante

o processamento histológico. Dos cinco animais, a inflamação observada variou de

leve a moderada, sendo três casos para a forma leve e dois para a moderada. A

vascularização foi moderada em dois casos e intensa em três. A atividade

osteoblástica foi fortemente presente em quatro animais e presente em apenas um.

A neoformação óssea apresentou-se como leve em apenas um caso, leve-moderada

em dois e moderada nos outros dois (Figuras 16, 17,18 e 19).

73

30 dias

A inflamação foi leve em todos os animais e a vascularização evidenciada foi

predominantemente intensa, com apenas um caso da forma leve. A atividade

osteoblástica foi fortemente presente nos seis casos. A neoformação óssea teve as

formas leve-moderada, moderada e moderada-intensa, cada uma com dois casos

(Figuras 20, 21, 22, 23 e 24).

45 dias

A inflamação identificada foi leve para os seis animais e a vascularização intensa,

com exceção de um caso em que se apresentou de forma leve. Em todos os

animais, a atividade osteoblástica foi fortemente presente. A neoformação óssea foi

predominantemente moderada, apresentando apenas um caso moderado-intenso e

outro da forma intensa (Figuras 25, 26 e 27).

74

PRANCHA 01

Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 15

dias)

Figura 16 - Grupo 1A - 15 dias. Defeito ósseo em toda extensão. Partículas do

biomaterial (*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 17 – Grupo 1A - 15 dias. Neoformação óssea a partir da borda do defeito (>).

H.E.

Figura 18 - Grupo 1A - 15 dias. Detalhe da figura 17, evidenciado neoformação

óssea (*) significativa a partir da borda do defeito. H.E.

Figura 19 - Grupo 1A - 15 dias. Formação de trabécula óssea (*) entre as partículas

do biomaterial. H.E.

76

PRANCHA 02

Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 30

dias)

Figura 20 - Grupo 1A - 30 dias. Neoformação de tecido ósseo (*) entre o biomaterial

implantado. Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 21 - Grupo 1A - 30 dias. Neoformação óssea na borda do defeito (>). H.E.

Figura 22 – Grupo 1A – 30 dias. Maior aumento da figura 21, evidenciando a

formação da trabécula óssea (*). H.E.

Figura 23 – Grupo 1A – 30 dias. Formação de tecido ósseo no interior do defeito

(*).H.E.

Figura 24 – Grupo 1A – 30 dias. Pavimentação osteoblástica (>) a partir da trabécula

óssea neoformada. H.E.

78

PRANCHA 03

Fotomicrografias do Grupo 1A (biomaterial de origem bovina – experimento 45

dias)

Figura 25 – Grupo 1A – 45 dias. Extensa neoformação de tecido ósseo (*). Bordas

do defeito (>). H.E.

Figura 26 - Grupo 1A – 45 dias. Neoformação óssea (*) nas adjacências das

partículas do biomaterial. H.E.

Figura 27 - Grupo 1A – 45 dias. Trabécula óssea incipiente (*), evidenciando

pavimentação osteoblástica (>). H.E.

80

6.1.2 Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle)

15 dias

Nos seis animais da amostra, a inflamação observada foi predominantemente

moderada, apresentando apenas dois casos na forma leve. Em sua maioria, a

vascularização identificada foi intensa, tendo apenas um caso leve e outro

moderado. A atividade osteoblástica esteve presente em quatro casos e fortemente

presente em dois casos. A neoformação óssea, em sua maioria, foi do tipo leve,

apresentando um espécime leve-moderado e outro moderado (Figuras 28,29 e 30).

30 dias

Dos seis espécimes deste subgrupo, um foi excluído devido à perda da peça durante

o processamento histológico. Entre os cinco casos, a inflamação apresentou-se na

forma leve. A vascularização foi leve apenas para um caso, tendo a forma moderada

em dois espécimes e intensa para os demais. A atividade osteoblástica foi presente

em quatro espécimes e apenas um foi identificado como fortemente presente. A

neoformação óssea foi predominantemente leve, apresentando apenas um caso

leve-moderado (Figuras 31, 32 e 33).

45 dias

Nos seis espécimes, a inflamação foi leve e a vascularização intensa. A atividade

osteoblástica foi presente em apenas um caso, sendo os demais identificados como

81

fortemente presente. A neoformação óssea foi leve em apenas um caso, leve-

moderada em dois e moderada nos outros três (Figuras 34, 35, 36 e 37).

82

PRANCHA 04

Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 15

dias)

Figura 28. Grupo 1B – 15 dias. Ausência de neoformação óssea no interior da

cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 29. Grupo 1B – 15 dias. Neoformação óssea (>) incipiente na borda do

defeito. H.E.

Figura 30. Grupo 1B – 15 dias. Detalhe da figura 29, exibindo a neoformação da

trabécula óssea (*). H.E.

84

PRANCHA 05

Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 30

dias)

Figura 31 – Grupo 1B – 30 dias. Defeito ósseo sem evidência de neoformação óssea

no interior da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 32 – Grupo 1B – 30 dias. Presença de neoformação óssea incipiente (*) a

partir da borda do defeito. Vasos sanguíneos congestos (>) em meio a tecido

conjuntivo fibroso. H.E.

Figura 33 – Grupo 1B – 30 dias. Detalhe da figura 32, evidenciando a neoformação

óssea incipiente (*) a partir da borda do defeito. H.E.

86

PRANCHA 06

Fotomicrografias do Grupo 1B (biomaterial de origem bovina – controle 45

dias)

Figura 34 – Grupo 1B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando neoformação incipiente

de tecido ósseo (*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 35 – Grupo 1B – 45 dias. Neoformação óssea a partir da borda do defeito (>).

H.E.

Figura 36 – Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da trabécula óssea neoformada (*) no

interior do defeito. H.E.

Figura 37 – Grupo 1B – 45 dias. Detalhe da figura 35, exibindo a neoformação de

tecido ósseo a partir da borda do defeito (*). H.E.

88

6.1.3 Grupo 2A (enxerto de origem sintética – experimento)

15 dias

Entre os seis animais, a inflamação identificada foi predominantemente moderada,

com exceção de dois casos que foram leve. A vascularização teve dois casos do tipo

moderado e os demais na forma intensa. A atividade osteoblástica teve apenas um

espécime do tipo presente, sendo os demais fortemente presente. A neoformação

óssea foi leve em um caso, leve-moderada em quatro e moderada em outro (Figuras

38, 39 e 40).

30 dias

A inflamação foi leve para os seis casos e a vascuarização intensa na maioria dos

espécimes, tendo apenas um na forma leve. A atividade osteoblástica foi fortemente

presente em todos os animais. A neoformação óssea foi predominantemente leve-

moderada, apresentando apenas dois casos do tipo moderado (Figuras 41, 42, 43 e

44).

45 dias

Nos seis animais, a inflamação identificada foi leve. A vascularização foi leve em

apenas um caso, moderada em dois e intensa nos outros três. A atividade

osteoblástica foi fortemente presente em todos os espécimes. A neoformação óssea

89

apresentou-se nas formas moderada, moderada-intensa e intensa, cada uma com

dois casos (Figuras 45, 46 e 47).

90

PRANCHA 07

Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento

15 dias)

Figura 38 – Grupo 2A – 15 dias. Defeito ósseo, exibindo as partículas do biomaterial

(*) no interior da cavidade. Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 39 – Grupo 2A – 15 dias. Neoformação óssea incipiente (>) na borda do

defeito. H.E.

Figura 40 – Grupo 2A – 15 dias. Detalhe da figura 39, evidenciando a pavimentação

osteoblástica (>) envolta da trabécula óssea. Presença de vasos sanguíneos

congestos (*). H.E.

92

PRANCHA 08

Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento

30 dias)

Figura 41 – Grupo 2A – 30 dias. Defeito ósseo, exibindo neoformação óssea a partir

das bordas do defeito (>). H.E.

Figura 42 – Grupo 2A – 30 dias. Neoformação óssea (>) a partir da borda do defeito

e das partículas do biomaterial. H.E.

Figura 43 – Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a trabécula

óssea neoformada (*) entre as partículas do biomaterial. H.E.

Figura 44 – Grupo 2A – 30 dias. Detalhe da figura 42, evidenciando a neoformação

óssea a partir da borda do defeito (*). H.E.

94

PRANCHA 09

Fotomicrografias do Grupo 2A (biomaterial de origem sintética – experimento

45 dias)

Figura 45 – Grupo 2A – 45 dias. Neoformação óssea em toda extensão da cavidade

(*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 46 – Grupo 2A – 45 dias. Tecido ósseo neoformado (*) a partir da borda do

defeito (>), estendendo-se para o interior do defeito. H.E.

Figura 47 – Grupo 2A – 45 dias. Trabéculas ósseas no interior do defeito (*) nas

adjacências das partículas do biomaterial. H.E.

96

6.1.4 Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle)

15 dias

Dos seis casos, a inflamação foi leve em dois espécimes e moderada em quatro. A

vascularização identificada foi leve em apenas em um caso, moderada em três e

intensa no outros dois. A atividade osteoblástica foi predominantemente presente,

excetuando um caso fortemente presente. A neoformação óssea foi leve em cinco

espécimes e apenas um foi leve-moderado (Figuras 48, 49 e 50).

30 dias

Entre os seis espécimes, a inflamação foi leve em sua maioria, excetuando um caso

do tipo moderado. A vascularização foi leve em dois casos, moderada em três e

intensa em um. A atividade osteoblástica foi presente em quatro animais,

apresentando-se fortemente presente nos outros dois. A neoformação óssea foi

predominantemente leve com quatro casos e leve-moderada nos outros dois

(Figuras 51, 52, 53).

45 dias

A inflamação foi predominantemente leve, excetuando um caso moderado. Dos seis

animais, um apresentou vascularização leve e os demais na forma intensa. A

atividade osteoblástica foi presente e fortemente presente com três casos cada. A

97

neoformação óssea identificada foi leve em três espécimes, leve-moderada em dois

e moderada em um (Figuras 54, 55 e 56).

98

PRANCHA 10

Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 15

dias)

Figura 48 – Grupo 2B – 15 dias. Defeito ósseo sem evidência de neoformação óssea

no interior da cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 49 – Grupo 2B – 15 dias. Neoformação óssea incipiente a partir da borda do

defeito (>). H.E.

Figura 50 – Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 49, exibindo trabécula óssea

neoformada (*) e atividade osteoblástica nas adjacências (>). H.E.

100

PRANCHA 11

Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 30

dias)

Figura 51 – Grupo 2B – 30 dias. Ausência de neoformação óssea no interior da

cavidade (*). Bordas do defeito (>). H.E.

Figura 52 – Grupo 2B – 30 dias. Tecido conjuntivo no interior do defeito ósseo com

presença de vasos sanguíneos congestos (>). H.E.

Figura 53 – Grupo 2B – 30 dias. Osso neoformado a partir da borda do defeito (*).

H.E.

102

PRANCHA 12

Fotomicrografias do Grupo 2B (biomaterial de origem sintética – controle 45

dias)

Figura 54 – Grupo 2B – 45 dias. Defeito ósseo, evidenciando tecido conjuntivo

fibroso no interior da cavidade (*) e presença de neoformação óssea incipiente (>) a

partir das bordas do defeito. H.E.

Figura 55 – Grupo 2B – 45 dias. Detalhe da figura 54, exibindo a neoformação óssea

incipiente a partir da borda do defeito (>). H.E.

Figura 56 – Grupo 2B – 15 dias. Detalhe da figura 54, evidenciando tecido conjuntivo

fibroso com vasos sanguíneos congestos (>). H.E.

104

6.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA

A análise morfométrica da matriz neofomada foi realizada através do método de

segmentação de imagens em sete classes nos períodos de 15, 30 e 45 dias. No

entanto, aos 15 e 30 dias, não foi possível a segmentação adequada das imagens

para a contagem da área (µm2

) nos subgrupos experimentais e controles dos grupos

1 e 2. Para o tempo de avaliação de 45 dias, observou-se uma área

correspondentemente maior no subgrupo experimental do grupo 1 (14.872,88 ±

5.826,09) em relação ao grupo 2 (10.598,37 ± 3.071,55).

6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados são apresentados segundo o grupo (1 ou 2), subgrupo (experimento

ou controle) e tempo de avaliação (15, 30 ou 45 dias).

6.3.1 Infiltrado Inflamatório

De acordo com a Tabela 1, na avaliação com 15 dias, todos os animais

apresentaram inflamação que variou de leve a moderada, tanto nos subgrupos

experimentais quanto controles, independentemente do grupo (1 ou 2). As

freqüências foram de dois a quatro casos. Aos 30 e 45 dias, todos os subgrupos

experimentais apresentaram inflamação leve e nos subgrupos controles, com

exceção de um caso no grau moderado para ambos os tempos no grupo 2, todos

tiveram inflamação leve. Os resultados estatísticos não foram significantes (p >

0,05).

105

Tabela 1 – Infiltrado inflamatório segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação

Grupo Avaliação/Subgrupo Inflamação I II Valor de p n % n % • 15 dias

Experimental Leve 3 60,0 2 33,3 p(1)

= 0,567

Moderada 2 40,0 4 66,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0

Controle Leve 2 33,3 2 33,3 p(1)

= 1,000

Moderada 4 66,7 4 66,7 TOTAL 6 100,0 6 100,0 • 30 dias

Experimental Leve 6 100,0 6 100,0 ** TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 5 100,0 5 83,3 p(1)

= 1,000

Moderada - - 1 16,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0 • 45 dias

Experimental Leve 6 100,0 6 100,0 ** TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 6 100,0 5 83,3 p(1)

= 1,000

Moderada - - 1 16,7 TOTAL 6 100,0 6 100,0 (**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias. (1) Através do teste Exato de Fisher.

6.3.2 Vascularização

Em relação ao estudo da vascularização (Tabela 2), na avaliação com 15 dias, todos

os animais dos subgrupos experimentais encontravam-se com vascularização

moderada a intensa, onde as freqüências variaram de um a quatro casos. Nos

subgrupos controles, os espécimes tiveram vascularização leve, moderada e

intensa, variando de um a quatro casos. Com 30 dias, nos subgrupos experimentais,

o grau de vascularização intenso foi predominante e apenas um animal em ambos

os grupos (1 e 2) apresentou vascularização leve. Quanto aos subgrupos controles,

106

a vascularização foi leve, moderada e intensa, variando de um a três casos. Aos 45

dias, cada subgrupo experimental teve apenas um caso de vascularização leve,

sendo os demais espécimes do grau intenso, com exceção do grupo 2 que

apresentou dois casos da forma moderada. Nos subgrupos controles, a maioria dos

casos foram de vascularização intensa e apenas um, em ambos os grupos (1 e 2)

foram da forma leve. Os resultados não foram estatisticamente significantes (p >

0,05).

Tabela 2 – Vascularização segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação

Grupo Avaliação/Subgrupo Vascularização I II Valor de p n % n % • 15 dias

Experimental Moderada 2 40,0 2 33,3 p(1)

= 1,000

Intensa 3 60,0 4 66,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0

Controle Leve 1 16,7 1 16,7 p(1)

= 0,740

Moderada 1 16,7 3 50,0 Intensa 4 66,7 2 33,3 TOTAL 6 100,0 6 100,0 • 30 dias

Experimental Leve 1 16,7 1 16,7 p(1)

= 1,000

Intensa 5 83,3 5 83,3 TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 1 20,0 2 33,3 p(1)

= 1,000

Moderada 2 40,0 3 50,0 Intensa 2 40,0 1 16,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0 • 45 dias

Experimental Leve 1 16,7 1 16,7 p(1)

= 0,697

Moderada - - 2 33,3 Intensa 5 83,3 3 50,0 TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 1 16,7 1 16,7 p(1)

= 1,000

Intensa 5 83,3 5 83,3 TOTAL 6 100,0 6 100,0 (1) Através do teste Exato de Fisher.

107

6.3.3 Reação de Corpo Estranho (RCE)

Segundo a Tabela 3, não foram verificados reação de corpo estranho em nenhum

dos animais analisados, independentemente do grupo, subgrupo e tempo de

avaliação.

Tabela 3 – Reação de corpo estranho (RCE) segundo o grupo, o subgrupo e o

tempo de avaliação

Grupo Avaliação/Subgrupo RCE I II Valor de p N % n % • 15 dias

Experimental Ausente 5 100,0 6 100,0 **

Controle Ausente 6 100,0 6 100,0 ** • 30 dias

Experimental Ausente 6 100,0 6 100,0 **

Controle Ausente 5 100,0 6 100,0 ** • 45 dias

Experimental Ausente 6 100,0 6 100,0 **

Controle Ausente 6 100,0 6 100,0 ** (**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.

6.3.4 Tecido Conjuntivo Fibroso (TCF)

A Tabela 4 mostra que em todos os animais analisados, independentemente do

grupo, subgrupo e tempo de avaliação, foi verificada a presença de tecido conjuntivo

fibroso.

108

Tabela 4 – Tecido conjuntivo fibroso segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação

Grupo Avaliação/ Subgrupo TCF I II Valor de p n % n % • 15 dias

Experimental Presente 5 100,0 6 100,0 **

Controle Presente 6 100,0 6 100,0 ** • 30 dias

Experimental Presente 6 100,0 6 100,0 **

Controle Presente 5 100,0 6 100,0 ** • 45 dias

Experimental Presente 6 100,0 6 100,0 **

Controle Presente 6 100,0 6 100,0 ** (**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias.

6.3.5 Atividade Osteoblástica

Segundo a Tabela 5, na avaliação com 15 dias, a atividade osteoblástica nos

subgrupos experimentais apresentou-se, em sua maioria, fortemente presente com

80,0% no grupo 1 e 83,3% no grupo 2. Os animais dos subgrupos controles tiveram

a predominância do tipo presente, sendo quatro casos no grupo 1 (66,7%) e cinco

no grupo 2 (83,3%). Após 30 dias, os subgrupos experimentais tiveram atividade

osteoblástica fortemente presente em 100% dos espécimes e os subgrupos

controles apresentaram a maioria presente, sendo 80,0% no grupo 1 e 66,7% no

grupo 2. Com 45 dias, todos os animais dos subgrupos experimentais tiveram

atividade osteoblástica fortemente presente (100%). O subgrupo controle do grupo 1

apresentou a maioria fortemente presente (83,3%), enquanto do grupo 2 foi

igualmente presente (50%) e fortemente presente (50%). Não se verificou diferenças

109

significantes entre os grupos para nenhum dos subgrupos e tempo de avaliação (p >

0,05).

Tabela 5 – Atividade osteoblástica segundo o grupo, o subgrupo e o tempo da

avaliação

Grupo Avaliação/subgrupo Atividade I II Valor de p osteoblástica N % n % • 15 dias

Experimental Presente 1 20,0 1 16,7 p(1)

= 1,000

Fortemente presente 4 80,0 5 83,3 TOTAL 5 100,0 6 100,0

Controle Presente 4 66,7 5 83,3 p(1)

= 1,000

Fortemente presente 2 33,3 1 16,7 TOTAL 6 100,0 6 100,0 • 30 dias

Experimental Fortemente presente 6 100,0 6 100,0 ** TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Presente 4 80,0 4 66,7 p(1)

= 1,000

Fortemente presente 1 20,0 2 33,3 TOTAL 5 100,0 6 100,0 • 45 dias

Experimental Fortemente presente 6 100,0 6 100,0 ** TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Presente 1 16,7 3 50,0 p(1)

= 0,545

Fortemente presente 5 83,3 3 50,0 TOTAL 6 100,0 6 100,0 (**) Não foi possível determinar devido à ausência de categorias. (1) Através do teste Exato de Fisher.

6.3.6 Neoformação óssea

A Tabela 6 mostra os resultados da neoformação óssea segundo o grupo, o

subgrupo e o tempo de avaliação, classificando-a em: 1) leve, 2) leve-moderada, 3)

moderada, 4) moderada-intensa, 5) intensa e 6) completa. Não houve diferenças

estatisticamente significantes (p > 0,05).

110

Tabela 6 – Neoformação óssea segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de

avaliação

Grupo Período/ Grupo Neoformação óssea I II Valor de p N % n % • 15 dias

Experimental Leve 1 20,0 1 16,7 p(1)

= 0,740

Leve-moderada 2 40,0 4 66,7 Moderada 2 40,0 1 16,7 TOTAL 5 100,0 6 100,0

Controle Leve 4 66,7 5 83,3 p(1)

= 1,000

Leve-moderada 1 16,7 1 16,7 Moderada 1 16,7 - - TOTAL 6 100,0 6 100,0 • 30 dias

Experimental Leve-moderada 2 33,3 4 66,7 p(1)

= 0,481

Moderada 2 33,3 2 33,3 Moderada-intensa 2 33,3 - - TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 4 80,0 4 66,7 p(1)

= 1,000

Leve-moderada 1 20,0 2 33,3 TOTAL 5 100,0 6 100,0 • 45 dias

Experimental Moderada 4 66,7 2 33,3 p(1)

= 0,610

Moderada-intensa 1 16,7 2 33,3 Intensa 1 16,7 2 33,3 TOTAL 6 100,0 6 100,0

Controle Leve 1 16,7 3 50,0 p(1)

= 0,766

Leve-moderada 2 33,3 2 33,3 Moderada 3 50,0 1 16,7 TOTAL 6 100,0 6 100,0

(1) Através do teste Exato de Fisher.

Na tabela 7, após a obtenção da média dos escores da neoformação óssea,

observou-se que nos períodos de 15 e 30 dias os valores dos subgrupos

experimentais foram maiores no grupo 1. Após 45 dias, o grupo 2 apresentou uma

média superior no subgrupo experimental. No entanto, não foi possível identificar

diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p > 0,05).

111

Tabela 7 – Média e desvio padrão da média dos escores da neoformação óssea

segundo o grupo, o subgrupo e o tempo de avaliação

Tipo de enxerto Avaliação Subgrupo I II Valor de p (Média ± DP) (Média ± DP) % • 15 dias Experimental 2,20 ± 0,84 2,00 ± 0,63 p(1)

= 0,604

Controle 1,50 ± 0,84 1,17 ± 0,41 p(1)

= 0,727

• 30 dias Experimental 3,00 ± 0,89 2,33 ± 0,52 p(1)

= 0,275

Controle 1,20 ± 0,45 1,33 ± 0,52 p(1)

= 1,000

• 45 dias Experimental 3,50 ± 0,84 4,00 ± 0,89 p(1)

= 0,470

Controle 2,33 ± 0,82 1,67 ± 0,82 p(1)

= 0,316

(1) Através do teste de Mann-Whitney.

A Tabela 8, evidencia a média da área (µm2

) da matriz óssea neoformada na

avaliação de 45 dias, sendo os valores correspondentemente mais elevados nos

subgrupos experimental e controle do grupo 1, entretanto, sem diferenças

estatisticamente significante (p > 0,05) (Gráfico 1).

Tabela 8 – Média e desvio padrão da área (µm2

) da matriz óssea neoformada

segundo o grupo e o subgrupo na avaliação de 45 dias

Grupo Subgrupo I II Valor de p (Média ± DP) (Média ± DP) • Experimental 14872,88 ± 5826,09 10598,37 ± 3071,55 p(1)

= 0,222

• Controle 5952,89 ± 3899,53 3689,09 ± 2194,10 p(1)

= 0,222

(1) Através do teste de Mann-Whitney.

112

Gráfico 1 – Média da área (µm2

) da matriz óssea neoformada segundo o grupo e o

subgrupo na avaliação de 45 dias

14872,88

10598,37

5952,89

3689,09

0

4000

8000

12000

16000

Enxerto I Enxerto II

· Experimental· Controle

113

Discussão

114

7 DISCUSSÃO

A reconstrução do complexo Buco-Maxilo-Facial decorrente de perdas ósseas,

preferencialmente deveria ser realizada pela técnica que utilizasse o enxerto

autógeno. Isto ocorre quando o tecido ósseo vital é removido de uma área doadora

e, no mesmo tempo cirúrgico, transferido para a região a ser reconstruída. No

entanto, nem sempre esse procedimento pode ser realizado devido à dificuldade de

obtenção de tecido ósseo suficiente da área doadora, além do potencial aumento da

morbidade com um procedimento cirúrgico adicional (TAGA et al., 1997).

Por essas razões, uma série de pesquisas tem sido realizada com o intuito de

desenvolver materiais que possuam propriedades de biocompatibilidade e

osteocondução (ZAMBUZZI et al., 2005). Desta forma, biomateriais xenógenos como

a matriz orgânica e inorgânica de osso bovino, assim como de origem sintética, a

hidroxiapatita e o tricálcio fosfato, apresentam-se como substitutos ósseos viáveis

nas cirurgias reconstrutivas de pequenas áreas.

Para o tratamento de defeitos ósseos do complexo Buco-Maxilo-Facial, vários

modelos animais têm sido propostos no desenvolvimento de um protocolo padrão

(TAGA et al., 1997; BUCHAIM et al, 2002; LIMEIRA JÚNIOR, 2004; FELLAH et al.,

2008). A calvária de animais é usualmente utilizada para avaliação de materiais

osteopromotores (HANDSCHEL et al., 2002; LAUREANO FILHO et al., 2007;

TUDOR et al, 2008). Neste trabalho, o uso da calota craniana de ratos adultos

Wistar foi devido à disponibilização de um osso de origem embrionária, semelhante

ao dos maxilares. O osso parietal é formado por uma placa que apresenta corticais

115

externa e interna compactas, relativamente espessas, com faixa intermediária

estreita de osso medular e com ossificação intramembranosa (CRUMP et al., 1996;

FROTA, 2006). Adicionado a isso, além do baixo custo, o modelo permite um

manejo relativamente fácil na avaliação da reparação óssea (JONES et al., 2007).

Para obter resultados confiáveis dos materiais testados, o modelo animal deve

permitir a reprodutibilidade de seus resultados e possível comparação entre as

amostras. A reparação nos defeitos ósseos do modelo não deve realizar-se

espontaneamente durante o período de observação, sendo, portanto, definido como

tamanho crítico (HOLLINGER; KLEINSCHMIDT, 1990; SCHLEGEL et al, 2006).

Para esta pesquisa, foi utilizado o defeito ósseo de 5,0 mm de diâmetro, definido

como limite crítico para o osso parietal de ratos Wistar (BOSH; MELSEN;

VARGEVIK, 1998; JONES et al., 2007). Isto permitiu um estudo pareado, pois a

ostectomia pôde ser realizada bilateralmente à sutura mediana, o que evitou o seio

sagital, prevenindo a sua ruptura e conseqüente possibilidade de morte do animal

por hemorragia. Adicionalmente, o acesso cirúrgico foi único e não houve

dificuldades no manuseio dos biomateriais quanto a sua inserção nas cavidades

ósseas, assim como no fechamento da ferida.

Os biomateriais utilizados na presente pesquisa foram o composto de hidroxiapatita

e tricálcio fosfato (Gen-phos®) e o enxerto de matriz orgânica e inorgânica de osso

bovino (Gen-mix®). Estes biomateriais são de micro partículas com características

osteocondutoras e reabsorção relativamente lenta. Estas propriedades foram

observadas ao longo da pesquisa e revelaram-se positivas, uma vez que foi

116

observado um melhor processo de reparo do experimento em comparação ao

controle.

Para Sicca et al. (2000), o tamanho dos grânulos dos diferentes tipos dos

biomateriais é um fator importante para o sucesso do reparo ósseo. Contudo, os

autores acreditam não haver uma definição clara de qual tamanho é adequado para

cada tecido ou condição clínica, uma vez que as características físico-químicas de

cada biomaterial e/ou do defeito ósseo também afetam a resposta tecidual. Este fato

foi observado por Mankani et al. (2001) que demonstraram que partículas de

hidroxiapatita / tricálcio fosfato com 0,1 - 0,25 mm de tamanho resultavam em maior

formação óssea. Em outro estudo, Moreira et al. (2003) observaram a influência

sobre a integração óssea da hidroxiapatita (HA) em relação ao tamanho dos

grânulos do biomaterial, onde as partículas de menores dimensões (212µm)

promoveram uma maior velocidade e melhor qualidade do processo de reparo

ósseo. No entanto, o efeito do tamanho dos grânulos quando da utilização de matriz

inorgânica e orgânica de osso bovino parece não interferir na reparação óssea.

Sicca et al. (2000) observaram não haver diferença na resposta celular ao osso

cortical bovino implantados em subcutâneo de ratos na forma micro (0,25 – 1,0 mm)

e macro granular (1,0 – 2,0 mm). Em outro estudo, sobre o processo de reparo de

defeitos ósseos preenchidos por osso medular bovino, Carneiro et al. (2005)

constataram resultados semelhantes para ambas as formas das partículas do

biomaterial.

No presente estudo, o composto hidroxiapatita sintética / tricálcio fosfato (HA/TCP)

utilizado foi o microgranular com partículas de 0,5 a 0,75 mm, ou seja, entre 500 a

117

750 µm. Este fato pode explicar o melhor desempenho do biomaterial de origem

bovina sobre o HA/TCP, uma vez que para o primeiro, o tamanho dos grânulos

parece não influenciar no processo de reparo. Embora os resultados não tenham

sido estatisticamente significantes e ambos os biomateriais tenham tido resultados

superiores ao controle, partículas menores de HA (< 0,5 mm) possivelmente

contribuiriam na reparação óssea.

Buchaim et al. (2002) observaram que o Gen-phos® apresentou baixa neoformação

óssea no período de 10 dias, onde foi evidenciada exuberante reação inflamatória

induzida pelo material. O processo de reparo do defeito ósseo em tíbia de ratos foi

mais significativo a partir dos 20 dias, provavelmente devido à incorporação do

cálcio e do fosfato nos tecidos fagocitados pelos osteoblastos, observando uma

diminuição do infiltrado inflamatório.

O declínio da resposta inflamatória, em relação ao tempo, também foi observado por

Zambuzzi et al. (2006), que verificou, ainda, o aumento da vascularização do tecido

conjuntivo após a utilização da matriz inorgânica bovina em tecido subcutâneo de

ratos. Resultados estes que corroboram com Carneiro et al. (2005) em relação a

matriz orgânica bovina, tanto na forma micro quanto macro granular.

Os grupos 1 e 2 desta pesquisa apresentaram comportamento semelhante aos

estudos acima mencionados. Ambos os grupos exibiram uma reação inflamatória

inicialmente leve a moderada, que diminuiu de intensidade quando se prolongava o

tempo de observação, e um tecido conjuntivo com grau moderado de vasos

sanguíneos, cuja vascularização se maximizou com o tempo. Em um primeiro

118

momento, de acordo com Frota (2006), a reação inflamatória ao biomaterial é

esperada e pode inibir a resposta à reparação inicial pela perpetuação da sua fase

inflamatória. No entanto, a inflamação tecidual não é decorrente, exclusivamente, do

biomaterial utilizado, mas também inerente ao próprio processo de reparação

tecidual. Portanto, os resultados do presente estudo corroboram com as

observações de Frota (2006), visto que o processo inflamatório foi evidenciado em

ambos os subgrupos, experimental e controle, entretanto, com graus variáveis de

intensidade.

Segundo Al Ruhaimi (2000), a presença de células gigantes multinucleadas,

caracterizando uma reação inflamatória do tipo corpo estranho é claramente

conhecida como inibidora da neoformação óssea. Este fato foi evidenciado por

Marins et al. (2004), após o uso de osso bovino orgânico em calvária de ratos. Os

autores observaram, em alguns espécimes com um e três meses, a presença de

focos de corpo estranho e de reação granulomatosa próximos do biomaterial,

juntamente com aglomerados de macrófagos e células gigantes multinucleadas

rodeados por linfócitos e quase nenhuma formação óssea. Aos poucos casos

constatados foram atribuídos a provável descalcificação incompleta do biomaterial

durante sua produção.

Por outro lado, Fujita et al. (2003), após a implantação de blocos de hidroxiapatita

(HA) e β-tricálcio-fosfato (β-TCP) sobre o osso parietal de ratos, entre o periósteo e

a superfície óssea, identificaram a presença de reação de corpo estranho (RCE)

junto ao biomaterial, no entanto, sem proximidade da matriz óssea neoformada. Isto

se deve ao fato que os biomateriais de origem bovina ou sintética, quando

119

implantados em tecido subcutâneo, induzem reação granulomatosa do tipo corpo

estranho devido à tentativa do organismo em promover a reabsorção dos mesmos.

Ressalta-se que este fato não implica necessariamente na inexistência de

biocompatibilidade.

Desta forma, parece comum este tipo de reação ao material quando implantado em

tecido mole, sendo a reação minimizada no uso em defeitos ósseos (FELLAH et al,

2007). Em conformidade com tais observações, nesta pesquisa chamou bastante

atenção o fato de não ter sido observada a reação de corpo estranho em nenhum

dos grupos, seja no experimento ou controle, independente do período observado.

O tecido conjuntivo fibroso (TCF) foi identificado em todos os espécimes desta

amostra, evidenciando variações quanto à sua celularidade do tecido ao longo do

tempo, o que corrobora com os achados de Thorwarth et al. (2006) que observaram

uma ampla quantidade de tecido conjuntivo fibroso com potencial osteogênico após

o uso da matriz bovina inorgânica. Diferentemente de Handschel et al. (2002), em

seu estudo sobre o tricálcio fosfato, no qual não houve presença de fibrose entre as

partículas do biomaterial, possibilitando uma maior integração do mesmo ao osso.

Em todos os animais deste estudo, foi visualizada a atividade osteoblástica nos

grupos 1 e 2, entretanto a atividade osteoblástica esteve, nos subgrupos

experimentais, mais fortemente presente em comparação ao controle. Os achados

histológicos mostraram pavimentação osteoblástica em trabéculas ósseas

neoformadas, tanto a partir das bordas do defeito quanto da superfície das partículas

do biomaterial, o que vai de encontro aos resultados de Handschel et al. (2002) que

120

atribuiram ao tricálcio fosfato (TCP) a ausência de osteocondutividade quando

implantados na calvária de ratos Wistar. No entanto, esta propriedade do TCP foi

relatada por Frota (2006), assim como da hidroxiapatita por Limeira Júnior (2004).

A neoformação óssea esteve presente em todos os espécimes da amostra. No

entanto, exibiu maior intensidade nos subgrupos experimentais, principalmente nos

períodos de 30 e 45 dias. O padrão da reparação óssea foi muito semelhante nos

grupos 1 e 2, ou seja, houve um aumento gradativo da reparação com o tempo,

sendo tal aumento sempre mais elevado em comparação aos subgrupos controles.

Estes resultados estão em conformidade com os achados de autores que

trabalharam com matriz óssea bovina (TAGA et al, 1997; MARINS et al., 2004;

TUDOR et al., 2008) e com Hidroxiapatia / tricálcio fosfato (BUCHAIM et al., 2002;

MIRANDA et al, 2005; FELLAH et al., 2007).

No presente estudo, a matriz óssea neoformada foi submetida à análise

morfométrica através do método de segmentação de imagens (QUEIROGA et al.,

2008). Para a segmentação, foi utilizado o algoritmo k-médias com 7 clusters

(classes) a partir das bandas “a” e “b” do sistema L*a*b*. No entanto, nos períodos

de 15 e 30 dias, as imagens segmentadas não apresentaram classes que pudessem

ser aproveitadas no cálculo de área (µm²). Desta forma, apenas o período de 45 dias

foi considerado. Este fato pode ter ocorrido em função da neoformação óssea

incipiente e da presença marcante das partículas dos biomateriais nos períodos de

15 e 30 dias que provavelmente dificultaram uma dissociação efetiva das imagens.

121

Segundo a tabela 7, os subgrupos experimentais tiveram as médias dos escores da

neoformação óssea ligeiramente maiores para o grupo 1 aos 15 e 30 dias e para o

grupo 2 aos 45 dias. Estes valores foram muito próximos e não foi possível

determinar diferença estatisticamente significante entre os grupos. No entanto, a

tabela 8 mostra que a média das áreas da matriz óssea neoformada (µm²) foi maior

para o grupo 1 aos 45 dias. Isto evidencia uma melhor tendência do grupo 1 para

reparação óssea, porém não se pôde também constatar diferença significante.

A reparação óssea nos subgrupos controles ocorreu basicamente a partir das

bordas do defeito e de forma incipiente em comparação aos subgrupos

experimentais. Estes, por sua vez, apresentaram neoformação óssea entre as

partículas do biomaterial, principalmente aos 30 e 45 dias. Neste último período, foi

possível a identificação do preenchimento de toda extensão do aspecto basilar do

defeito ósseo na maioria dos animais dos grupos 1 e 2.

Diante do exposto acima, a presente pesquisa evidenciou que os biomateriais

testados apresentaram características semelhantes com relação à influência sobre o

metabolismo do tecido ósseo, sendo, portanto, osteocondutores. Desta forma, estão

indicados como substitutos do tecido ósseo na reparação de defeitos ósseos.

122

Conclusão

123

8 CONCLUSÃO

De acordo com os dados obtidos nesta pesquisa, pode-se concluir que:

• Os defeitos ósseos submetidos aos biomateriais de origem bovina (matriz

orgânica cortical, matriz inorgânica esponjosa e colágeno bovino) e sintética

(cerâmica de hidroxiapatita + β -tricálcio-fosfato) apresentaram uma melhor

reparação óssea em comparação ao controle nos períodos de 15, 30 e 45 dias.

• O biomaterial de origem bovina apresentou uma reparação mais precoce e uma

maior deposição de matriz óssea neoformada (µm2

).

124

Referências

125

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132

APÊNDICE - IDENTIFICAÇÃO DAS GAIOLAS E DOS ANIMAIS

PESQUISA: Estudo histomorfometrico comparativo da reparação óssea em

ratos após o uso de enxertos de origem bovina e sintética.

RESPONSÁVEIS PELA PESQUISA: Orientadores - Fabiano Gonzaga Rodrigues

Francisco de Assis Limeira Júnior

Doutorando - Álvaro Bezerra Cardoso

GRUPO*:

Animais** Nascimento Peso Cirurgia Sacrifício

01

02

03

04

05

06

* Identificação dos grupos: 01 círculo – 15 dias

02 círculos – 30 dias

03 círculos – 45 dias

** Identificação dos animais: 01 – I 02 - II 03 - III 04 - IIII 05 - IIIII 06 - IIIIII

133

ANEXO

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