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Universidade Federal da Paraíba

Centro de Ciências Exatas e da Natureza

Departamento de Sistemática e Ecologia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Zoologia

ESTRESSE OXIDATIVO EM HIPPOCAMPUS REIDI GINSBURG, 1933

(TELEOSTEI SYNGNATHIDAE): ESTUDO COMPORTAMENTAL

Kassiano dos Santos Sousa

.

João Pessoa, Paraíba

Junho de 2015

Universidade Federal da Paraíba

Centro de Ciências Exatas e da Natureza

Departamento de Sistemática e Ecologia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Zoologia



KASSIANO DOS SANTOS SOUSA

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Zoologia), da

Universidade Federal da Paraíba,

como requisito para obtenção do

título de Mestre em Ciências

Biológicas – Zoologia.

Orientador(a): Profª. Drª. Ierecê Maria de Lucena Rosa

João Pessoa, Paraíba

Junho de 2015

KASSIANO DOS SANTOS SOUSA



Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas (Zoologia), da

Universidade Federal da Paraíba,

como requisito para obtenção do

título de Mestre em Ciências

Biológicas – Zoologia.

.

Data:_________________________________

Resultado: ____________________________

BANCA EXAMINADORA:

Ierecê Maria de Lucena Rosa, Prof.ª Dr.ª, UFPB

Júlio Santos Rebouças, Prof. Dr., UfPB

Luiz Carlos Serrano Lopez, Dr., UFPB

À minha família, pelo respeito, amor,

carinho e incentivo que sempre recebi e

por compreenderem as tantas vezes que

fui ausente. Sem vocês eu nada seria.

5

AGRADECIMENTOS

Nunca fui bom com agradecimentos, mas isso não quer dizer que não tenho muito o que agradecer... tenho até demais. O problema é que traduzir sentimentos de minimamente dois anos, não é algo fácil.

Quero agradecer primeiramente a minha família, pais e irmãos (e um grupo no whatapp com TODA a variedade possível de parentesco da minha família que ignoro há quase dois anos), vocês são demasiadamente importantes para mim. Vocês que me aguentaram quando nem eu mesmo me suportei. Pai e mãe, exemplos de desapego, amo vocês. Kalina, Kardec e Kathiane, irmãos amados, Lívia, Cauã e Hélida, sobrinhos e cunhada, obrigado por tudo.

A Profª Ierecê, por ter me aceito no desafio de me tornar um mestre e por ter acreditado que eu seria capaz, junto com meus amigos do Lapec, de seguir adiante com tantas responsabilidades de se trabalhar com animais vivos, como também por todo o apoio financeiro sempre que necessário.

Ao profº. Júlio, por todos os ensinamentos, tarde e manhãs gastas tentando me fazer entender absorbância, molaridade, modelos multivariados e uma centena de outras coisas que não eram comuns à minha realidade acadêmica. Quero agradecer por toda paciência e me desculpar por tantas mensagens e e-mails. De fato, nada, nada disso seria possível sem sua ajuda também!

A Profª. Tacyana, que sempre me auxiliou e me ajudou quando precisei, por todos os bolos e cafés, por todas as conversas, científicas ou não! Muito, muito obrigado!

Ao profº Paulo, por todos os conselhos desde a graduação e por me ensinar o amor pela fisiologia, obrigado por tudo!

Ao profº. Wallace, que mesmo em meados de viajar ao exterior, aceitou o desafio de me auxiliar no que convém a testes estatísticos que não faziam parte da minha realidade, obrigado!

Ao pessoal do LAPEC (e é aqui que mais vou sentir falta), foram tantos momentos difíceis, momentos de que queríamos desistir de tudo e ir embora, coletas que deram errado, etc etc. No entanto, agora eu vejo o quanto crescemos quanto pessoas. Todos, TODOS são importantes para mim, obrigado.

6

Souto Neto, nem tenho palavras a agradecer a você, alguém que quero próximo a mim para sempre, você foi mais que um amigo, mais que um irmão... obrigado por tudo!

Lua e Ju, nosso rolo eterno durará mais que a eternidade viu (com redundância mesmo, porque sim!)? Não aceito menos que isso, porque como já foi dito certa vez, provavelmente sempre estaremos falando de dança.

Aline e Marianna, duas pessoas incríveis. Aline, obrigado por todas as conversas, dicas e desabafos e Mary, como te falei, não foi nós que nos conhecemos, foram nossas almas que se reconheceram (e pareciam ser velhas amigas). Obrigado por tudo!

Camys e Jessyca, Babys... NOOSSA, como sinto falta de vocês. Sinto falta até das nossas coletas! Sei que ainda nos veremos muito, muito MESMO. Finalmente “É HOJE (Ludmilla, 2015)”!

Lari, Lívia e Thamara... entendam que quando não respondo no Whatapp não é porque não gosto de vocês, tá? Nossa, sinto muita falta de todos nós juntos, das festas e das conversas na pioneira e, principalmente, de praticarmos bulliyng com Lívia. Obrigado mesmo!

Rebeca, Lais, Giovanna... não tenho como expressar meu agradecimento e apreço por vocês, sempre lembrarei de nossos momentos e sempre sentirei falta, mesmo dos mais difíceis. Obrigado por estarem presentes nessa minha jornada, obrigado.

E o que falar de vocês hein, Herta e Emmanuelle (Manu)? Minhas irmãs desde que o mundo é mundo, desde antes de eu me entender por gente. Nossa, crescemos juntos, enquanto pessoas e enquanto profissionais (apesar de Manu continuar com aquele apertão chato). E ainda cresceremos muito mais! Muito obrigado por tudo!

Aos Cavalos-Marinhos, que me mostraram uma nova paixão... ainda que eu venha a trabalhar com mil outros animais, sempre lembrarei de onde tudo começou e o que devo lutar para conservar. Obrigado.

A todos os amigos que tive a oportunidade de fazer no PPGCB e na EAD nesses últimos dois anos, a convivência durante as disciplinas, os aperreios durante os prazos da coordenação e as comemorações que tivemos, levareis essas emoções para sempre comigo.

No final, a única coisa que tenho a dizer é que amo vocês, meus amigos, definitivamente... AMO VOCÊS!

7

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 16

Cavalo-marinho: O Modelo ..................................................................................................... 17

Desafios na Aquicultura .......................................................................................................... 19

Hipóteses ................................................................................................................................. 20

Contribuições para a Ciência e Industria ................................................................................. 20

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 21

CAPÍTULO I - DEGRADAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO EM CONDIÇÕES DE CULTIVO DE

HIPPOCAMPUS REIDI ......................................................................................................... 27

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 27

2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 29

2.1. Geral: ................................................................................................................................ 29

2.2. Específicos: ....................................................................................................................... 29

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................. 30

3.1. Qualidade da água ............................................................................................................ 30

3.2. Estudo da decomposição do H2O2 .................................................................................... 30

3.2.1. Procedimentos .......................................................................................................... 30

3.2.2. Medição Óptica ......................................................................................................... 31

3.3. Desenho Experimental ..................................................................................................... 32

3.4. Análises Estatísticas .......................................................................................................... 32

4. RESULTADOS ................................................................................................................. 34

4.1. Comparação entre os tratamentos .................................................................................. 36

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 37

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 39

CAPÍTULO II - REAÇÕES COMPORTAMENTAIS PARA A AVALIAÇÃO DO ESTRESSE EM

HIPPOCAMPUS REIDI GINSBURG, 1933 (SYNGNATHIDAE) EXPOSTOS AO PERÓXIDO DE

HIDROGÊNIO EM TRATAMENTOS POR IMERSÃO (BANHO).................................................. 42

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 42

1.1. Comportamento ............................................................................................................... 43

2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 45

2.1. Geral: ................................................................................................................................ 45

2.2. Específicos: ....................................................................................................................... 45


8



3.3. Análise comportamental .................................................................................................. 48

3.4. Medição Óptica ................................................................................................................ 51


4. RESULTADOS ................................................................................................................. 52

4.1. Diferenças entre sexos ..................................................................................................... 52

4.2. Diferenças entre os tratamentos (0ml/L, 5ml/L, 12.5ml/L, 13.75ml/L e 15ml/L) ............ 54

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 59

5.1. Diferenças entre sexos ..................................................................................................... 59

5.2. Diferenças entre os tratamentos (0ml/L, 5ml/L, 12.5ml/L, 13.75ml/L e 15ml/L) ............ 60

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 65


CAPÍTULO III - ESTUDO INICIAL SOBRE A UTILIZAÇÃO DA PORFINATOMANGANÊS(III) (MNTE-

2-PYP5+) COMO REGULADOR REDOX CATALÍTICO EM HIPPOCAMPUS REIDI GINSBURG, 1933

(TELEOSTEI SYNGNATHIDAE) .............................................................................................. 73

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 73

1.1. O Estresse Oxidativo ......................................................................................................... 74

2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 76

2.1. Geral: ................................................................................................................................ 76

2.2. Específicos: ....................................................................................................................... 76



3.2. Metodologia do Desenho Experimental: Matrizes Doehlert ........................................... 77


3.3. Análise comportamental .................................................................................................. 82

3.4. Medição Óptica ................................................................................................................ 85


4. RESULTADOS ................................................................................................................. 86

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 92

6. CONCLUSÃO .................................................................................................................. 94


9

ÍNDICE DE FIGURAS

INTRODUÇÃO GERAL

Figura 1: Foto de Hippocampus reidi in situ..................................................................18

CAPÍTULO I

Figura 1: Degradação Total (A) e Degradação Média (B) de peróxido de hidrogênio

(H2O2) em água do mar na presença e ausência de luminosidade em ambiente

controlado na ausência de H. reidi, LAPEC, Brasil, 2015. cl, Claro; es,

Escuro..............................................................................................................................34

Figura 2. Degradação Total (A) e Degradação Média (B) de peróxido de hidrogênio

(H2O2) em água do mar na presença e ausência de aeração em ambiente controlado na

ausência de H. reidi, LAPEC, Brasil, 2015. Ae, Aerção; Sae, Ausencia de

aeração.............................................................................................................................35


(H2O2) em água do mar em diferentes condições de área de contato da superfície da

água/ar: 5cm² e 20cm², em ambiente controlado na ausência de H. reidi, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................35

Figura 4. Degradação Total (A) e Degradação Média (B) do peróxido de hidrogênio

(H2O2) em água do mar na presença e ausência de aeração em ambiente controlado e na

presença e ausência de H. reidi (3 indivíduos), LAPEC, Brasil, 2015. Ani, Presença de

Animais; SAni, Ausência de Animais.............................................................................35


(H2O2) em água do mar entre os tratamentos com condições Claro (cl)/Escuro (es),

Presença (Ae)/Ausência (Sae) de Aeração e Presença (Ani)/Ausência (SAni) de

Animais (n = 9) em ambiente controlado, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................36

10

CAPITULO II

Figura 1. Sistema experimental com recirculação contínua de água, utilizada para

exposição de H. reidi a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio. 1: saída de

água do aquário; 2: entrada de água no aquário; 3: bomba de recirculação de água; 4:

substrato de apoio; 5: Mesa; 6: cadeira para apoio do aquário com bomba de

recirculação......................................................................................................................47

Figura 2. Gráficos dos comportamentos associados a locomoção, em ambos os sexos de

H. reidi (5 machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas), machos (1) e fêmeas (2), em

condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Nados verticais; B. Movimentos

natatórios totais................................................................................................................54

Figura 3. Gráficos dos dados biométricos de H. reidi (n = 20) associados aos

tratamentos com diferentes concentrações de H2O2 em condições controladas, LAPEC,

Brasil, 2015. A. Ganho/perda de peso; B. Taxa de sobrevivência nas diferentes

concentrações...................................................................................................................55

Figura 4. Gráficos dos comportamentos de H. reidi (n = 20) associados a diferentes

concentrações de H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Tempo em

repouso; B. Tempo aderido ao substrato de apoio...........................................................56

Figura 5. Gráficos dos comportamentos de H. reidi (n = 20) associados a diferentes concentrações de H2O2 em

condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Frequência de Pipes; B. Frequência de

Clicks..................................................................................................................................56

Figura 6: Gráficos dos comportamentos de H. reidi (n = 20) associados a diferentes

concentrações de H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Frequência

de vezes que o animal enrolou a cauda na cabeça; B. Frequência do batimento opercular

ao longo de 60min...........................................................................................................56

11

CAPITULO III

Figura 1. Cuboctaedro apresentando a localização dos pontos (13) experimentais para

três diferentes fatores codificados (X1, X2 e X3). Foram obtidos: ao longo do eixo X2,

em um trecho mediano, seis experimentos localizados nos vértices (2, 3, 5, 6, 8 e 11) e

um no centro de um hexágono, em ambos os lados; três experimentos (4, 12 e 13) estão

localizados no trecho superior e outros três experimentos (7, 9 e 10) em trecho

menor...............................................................................................................................78

Figura 2. Sistema experimental com recirculação contínua de água, utilizada para

exposição de H. reidi a diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio e MnP. 1:

saída de água do aquário; 2: entrada de água no aquário; 3: bomba de recirculação de

água; 4: substrato de apoio; 5: Mesa; 6: cadeira para apoio do aquário com bomba de

recirculação; 7: Aquário menor para exposição ao MnP; 8: Aquário maior para

exposição ao

H2O2.................................................................................................................................81

Figura 3. Gráficos dos coeficientes de regressão para os experimentos utilizando H2O2

como estressor em H. reidi (n = 14) e a MnP como antioxidante em condições

controladas, LAPEC, Brasil, 2015.. A: Tempo de Nado; B: Tempo em Repouso; C:

Frequência dos comportamentos totais de

estresse.............................................................................................................................86

Figura 4. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 no Ganho/Perda de peso de

H. reidi (n = 14) 30 dias após o experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................91

Figura 5. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 no tempo gasto por H. reidi

(n = 14) em repouso durante o experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................91

Figura 6. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 na taxa respiratória de H.

reidi durante o experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................91

12

ÍNDICE DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1: Sumário das condições experimentais: Claro/Escuro, Presença/Ausência de

Aeração, Presença/Ausência de Animais e Superfície de Contato

Água/Ar...........................................................................................................................33

Tabela 2: Efeito das variáveis na degradação do H2O2. ................................................36

CAPÍTULO II

Tabela 1: Etograma dos dados comportamentais de estresse em H. reidi......................49

Tabela 2: Etograma dos dados comportamentais de manutenção em H. reidi...............50

Tabela 3. Aspectos biométricos sob condições de estresse por H2O2, em ambos os sexos

de H. reidi (5 machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas) em condições controladas,

LAPEC, Brasil, 2015.......................................................................................................53

Tabela 4. Degradação do peróxido de hidrogênio em tratamentos experimentais, em

ambos os sexos de H. reidi (5 machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas) em

condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015..................................................................53

Tabela 5. Dados comportamentais de manutenção, em ambos os sexos de H. reidi (5

machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas), sob condições de estresse por H2O2 em


Tabela 6: Dados comportamentais de estresse, em ambos os sexos de H. reidi (5

machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas), sob condições de estresse por H2O2 em


Tabela 7: Aspectos biométricos em H. reidi (n = 20), sob condições de estresse em

variadas concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC,

Brasil, 2015......................................................................................................................57

Tabela 8: Degradação Total do peróxido de hidrogênio na presença de H. reidi (n = 20),

em variadas concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC,

Brasil, 2015......................................................................................................................57

Tabela 9: Dados comportamentais de manutenção de H. reidi (n = 20), em variadas

concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................57

13

Tabela 10: Dados comportamentais de estresse em H. reidi (n = 20), em variadas

concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................58

CAPÍTULO III

Tabela 1: Valores originais e os valores correspondentes codificados para os

experimentos com H. reidi em condições controladas, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................80

Tabela 2: Matriz experimental obtida pela metodologia de desenho experimental

Doehlert por três fatores. Valores experimentais H. reidi em condições controladas,

LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................80

Tabela 3: Etograma dos dados comportamentais de estresse em H.

reidi..................................................................................................................................83

Tabela 4: Etograma dos dados comportamentais de manutenção em H.

reidi..................................................................................................................................84

Tabela 5: Os coeficientes dos modelos obtidos para os dados biométricos em H. reidi

(n = 14) em condições controladas, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................89

Tabela 6: Os coeficientes dos modelos obtidos para os Movimentos de estresse e de

cabeça para H. reidi (n = 14) em condições controladas, LAPEC, Brasil,

2015.................................................................................................................................89

Tabela 7: Os coeficientes dos modelos obtidos para os percentuais de posição e

locomoção de H.

reidi..................................................................................................................................90

14

RESUMO

A utilização do peróxido de hidrogênio (H2O2) como forma de prevenção e

controle de mortalidades associadas com infecções fúngicas, bacterianas, e de

infestações parasitárias em diferentes espécies e ciclos de vida dos peixes é comum na

aquicultura. Sabe-se que o H2O2 afeta a atividade de transcrição celular da base-redox, o

controle a respostas inflamatórias e as respostas imunológicas, estando diretamente

relacionados ao estresse. A grande vantagem do H2O2 é o impacto ambiental mínimo

relacionado com a ausência de resíduos tóxicos; nesse sentido, estudos direcionados ao

desenvolvimento de protocolos que se utilizem de produtos de baixo risco ambiental

para o tratamento de patologias se fazem necessários. Adicionalmente, estudos que

visam ampliar os conhecimentos etológicos como um método não-invasivo de avaliação

do bem-estar animal são de grande importância na avaliação do estresse. Neste trabalho,

foi realizado um estudo com Hippocampus reidi, visando ampliar o conhecimento a

respeito do seu comportamento em condições normais e de estresse, bem como avaliar o

impacto e implicações do uso de H2O2 no manejo/cultivo de cavalos-marinhos e

possível forma de remediação/mitigação desses efeitos. Foi utilizado um total de 43

espécimes de H. reidi, provenientes da população estoque para cultivo experimental do

LAPEC (Laboratório de Peixes – Ecologia e Conservação), Universidade Federal da

Paraíba, Brasil. Observou-se que a presença de animais parece ser um fator decisivo na

degradação do H2O2, por acréscimo de matéria orgânica e bactérias ao sistema, como

também pela própria absorção por parte dos animais. Foi constatado ainda que o H2O2

tem o potencial para ser usado em tratamento por imersão (banho) em H. reidi, tendo

em vista que concentrações abaixo de 545 µM mostraram-se seguras em um período de

60 min de exposição para a espécie. Por outro lado, o peróxido de hidrogênio é tóxico

em concentrações igual/superior a 599 µM e teve profundo impacto sobre o peso,

comportamento e frequência respiratória em H. reidi. Foi testado também se Mn-

porfirina MnTE-2-PyP5+

(MnP) é um potencial antioxidante catalítico para manutenção

e cultivo de H. reidi, minimizando os impactos causados por tratamentos de altas

concentrações de H2O2. Os resultados iniciais obtidos mostraram que o MnP foi

benéfico a H. reidi, uma vez que minimizou os impactos causados por tratamentos de

altas concentrações de H2O2 a longo prazo, apresentando assim um amplo potencial a

ser estudado nessa área.

Palavras-chave: Cavalo-marinho; Comportamento; Porfirina; Cultivo; Água

Oxigenada.

15

ABSTRACT

Hydrogen peroxide (H2O2) is widely used in aquaculture; in order to prevent and

control fish mortality, often associated with fungal, bacterial and others parasitic

infections. H2O2 affects cellular transcriptional activity of redox-based; additionally, it

controls inflammatory and immune responses, being directly related to stress. The main

advantage in H2O2’s usage is the reduced environmental impact related to a lack of toxic

waste. In this direction, research to develop protocols using products with low

environment risks used in pathologies treatment is much needed. Equally important,

studies aimed at expanding the ethological knowledge as a method non-invasive

assessment of animal welfare are central in the evaluation of stress behavior. This study

was conducted with Hippocampus reidi and aimed to understand it’s behavior under

normal and stressful conditions, to assess impact and implications of H2O2’s usage in

management/culture of seahorses, as well as to work with mitigation ways that may be

useful for developing protocols for culturing seahorses. It was used a total of 43

individuals of H. reidi from a population maintained under experimental culture at

LAPEC (Laboratório de peixes –Ecologia e Conservação), Universidade Federal da

Paraíba, Brasil. The presence of animals appeared to be a decisive factor in degrading

H2O2, by addition of organic matter and bacteria into the system, but also by the it’s

absorption by animals. It was also noticed that H2O2 has the potential to be used in

treatment by immersion (bath) in H. reidi, considering that concentrations below 545

µM were considered safe for a period of 60 min exposure of specimens. It should be

noted, however, that hydrogen peroxide was toxic at concentrations equal/greater than

599 µM and had a profound impact on weight, behavior and respiratory rate in H. reidi.

We also tested if Mn-porphyrin MnTE-2-PyP5+

(MnP) is a catalytic antioxidant

potential for maintenance and husbandry of H. reidi, minimizing impacts caused by

treatments of high concentrations of H2O2. Our initial results suggest that MnP has is

beneficial to H. reidi, as it minimized impacts caused by long-term high concentrations

of H2O2 treatment, thus presenting great potential to be studied in that context.

Keywords: Seahorse; Behavior; Porfiryn; Husbandry; Oxygenated water.

16

INTRODUÇÃO GERAL

O manuseio dos peixes para diversos fins, como a medição, amostragem,

marcação e transporte na aquicultura é comum e frequentemente induzem uma resposta

primária de estresse, marcada pelo crescimento do cortisol plasmático e concentrações

de glicose, podendo levar a imunossupressão e ao retardo do crescimento (GRUTTER e

PANKURST, 2000; TREVES-BROWN, 2000; ROTLLANT et al, 2001; WEBER et al,

2009; HEO e SHIN, 2010). O estresse pode ser considerado como um estado que põe

em risco a homeostase e que pode se restabelecer através de um conjunto complexo de

respostas adaptativas (CHROUSOS, 1998). Barton et al. (1986) e Flos et al. (1988)

sugerem um efeito aditivo ou uma resposta fisiológica cumulativa ao estresse.

Para além dos fatores já citados, a utilização do peróxido de hidrogênio (H2O2)

como forma de prevenção e controle de mortalidades associadas com infecções fúngicas

(HOWE et al. 1999; RACH et al. 2004), bacterianas (SPEARE e ARSENAULT 1997;

LUMSDEN et al. 1998; RACH et al. 2000b, 2003; GAIKOWSKI et al. 2003), e de

infestações parasitárias (RACH et al. 2000a; MONTGOMERY-BROCK et al. 2001;

POWELL e CLARK 2004) em diferentes espécies e ciclos de vida dos peixes

(YANONG, 2008), pode estar relacionada ao estresse. Sabe-se, que o peróxido de

hidrogênio, juntamente com outras espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio

(superóxido, radical hidroxila, peroxinitrito, óxido nítrico, dióxido de nitrogênio, entre

outras) são amplamente reconhecidos como sinalizadores, pelo fato de afetarem a

atividade de transcrição celular da base-redox, o controle a respostas inflamatórias e as

respostas imunológicas. Essas espécies estão diretamente relacionadas ao estresse

oxidativo primário e aumentam o estresse oxidativo secundário (BARTESAGHI et al,

2007; BONELLO et al, 2007; DU et al, 2008; HIDALFO e DONOSO, 2008; LI et al,

2007; RUBBO e RADI, 2008; SALVMINI et al, 2006; SOUZA et al, 2008;

WINTERBOURN, 2008; WINTERBOURN e HAMPTO, 2008). A U.S. Food and

Drug Administration (FDA - EUA) aprovou a utilização de produtos à base de peróxido

de hidrogênio para aquicultura (U.S. Food and Drug Administration, 2002),

aumentando assim o interesse em seu uso. Contudo, ainda não há estudos sobre o

impacto e implicações do estresse oxidativo associado ao uso de H2O2 no

manejo/cultivo de cavalos-marinhos – peixes mundialmente comercializados para fins

ornamentais e para os quais se busca desenvolver protocolo de cultivo (ROSA, 2005;

17

KOLDEWEY e MARTIN-SMITH, 2010; VINCENT et al, 2011; DIAS NETO, 2011) -

e possível forma de remediação/mitigação desses efeitos.

Nesse sentido, Mn-porfirinas (MnP) têm se destacado em estudos pré-clinicos

como uma das classes mais importantes classes de reguladores redox catalíticos

(Batinić-Haberle, 2010); estudos in vivo em diversos modelos animais de fisiopatologias

de caráter oxidativo têm mostrado excelentes resultados (ASLAN et al, 2001;

PIGANELLI et al, 2002; BENOV et al, 2005; CROW et al, 2005; CSONT et al, 2005;

WU et al, 2007; GAUTER-FLECKENSTEIN et al, 2008; REBOUÇAS et al, 2008b;

SOMPOL et al, 2008).

Cavalo-marinho: O Modelo

O gênero Hippocampus engloba peixes ósseos vulgarmente conhecidos como

cavalos-marinhos. O grupo tem distribuição mundial e, juntamente com gêneros de

dragões-marinhos, cavalos-cachimbo e peixes-cachimbo, constitui a família

Syngnathidae (KUITER, 2000; LOURIE et al., 1999; 2004).

Praticamente todas as espécies de cavalos-marinhos figuram na Lista Vermelha

da World Conservation Union (IUCN), o que reflete o status de ameaça global desses

animais, decorrente do comércio internacional, da degradação de seus ambientes e das

capturas diretas e incidentais a que se encontram submetidos (LOURIE et al., 2004).

Não menos relevante, todo o gênero Hippocampus figura no Apêndice II da CITES

(Convention on the International Trade in Endangered Species of Wild Flora and Fauna),

instrumento legal que requer a demonstração por parte dos países exportadores de

cavalos-marinhos de que o comércio não é prejudicial às populações naturais. O Brasil

participa ativamente do comércio internacional de cavalos-marinhos, sendo um dos

maiores exportadores de indivíduos vivos para fins de aquarismo no mundo, e o maior

da América Latina (BAUM; VINCENT, 2005), no qual o comércio destes animais

vivos incide sobre a espécie Hippocampus reidi (Fig. 1). Essa espécie de cavalo-

marinho tem suas densidades mais altas registradas, predominantemente, nas regiões

Norte e Nordeste do litoral brasileiro (ROSA et al., 2007).

Os maiores desafios para o cultivo de cavalos-marinhos nos países em

desenvolvimento são de ordem técnica, como o manejo e as doenças, uma vez que esse

18

cultivo enfrenta os mesmos problemas que a maioria das monoculturas intensivas de

peixes, como a manutenção de uma infraestrutura de cativeiro que diminua as altas

densidades de estocagem e os níveis elevados de estresse. A alimentação inadequada e

as doenças são as principais fontes de mortalidade desses animais em cativeiro,

(WILSON; VINCENT, 1998) que, em alguns casos, surgem em consequência de uma

nutrição deficiente (CASTRO et al., 2008) e ao estresse em que são submetidos. O

fornecimento de dietas apropriadas a uma equilibrada taxa de crescimento/custo viável e

questões ambientais (KOLDEWEY e MARTIN-SMITH, 2010; JENNINGS et al,

2001), como, por exemplo, o destino dos efluentes, requerem ainda estudos. Além

desses fatores, a indisponibilidade de substratos de apoio, o transporte e a circulação de

água inadequada, bem como a manutenção desses animais em aquários comunitários

com espécies mais ágeis e agressivas, levam à debilitação e/ou mortalidade de cavalos-

marinhos. Destaca-se a ocorrência de doenças, tais como infecções bacterianas,

fúngicas, parasitoses, embolia gasosa, entre outras (ALCAIDE et al, 2001; VINCENT;

CLIFTON-HADLEY, 1989; KOLDEWEY, 2005; VINCENT; KOLDEWAY, 2006;

ROSA et al, 2005, 2006); tais enfermidades estão entre os principais fatores que

impedem o pleno desenvolvimento da piscicultura. Tendo em vista a forte exploração

comercial e as dificuldades de manutenção ex-situ de cavalos-marinhos, estudos

voltados para os seus aspectos biológicos e fisiológicos podem contribuir diretamente

para o estabelecimento de protocolos de cultivo bem definidos que forneçam

alternativas à extração desses organismos no ambiente natural.

Fonte:

Acervo LAPEC.

19

Desafios na Aquicultura

A aquicultura é geralmente considerada como a exploração ou a criação de

organismos aquáticos para fins comerciais (LANDAU, 1992) e da aquicultura mundial

(peixes para alimentação e plantas aquáticas) tem crescido significativamente durante a

metade do século passado (KOLDEWEY e MARTIN-SMITH, 2010). Enquanto a maior

parte da produção aquícola no mundo inteiro é dedicada à produção de alimentos, a

produção de peixes ornamentais é um componente importante da aquicultura industrial

em várias nações, e este setor da indústria mostra um crescimento rápido (TLUSTY,

2002).

Em geral, os benefícios da aquicultura são considerados por ter aumentado a

produção mundial de alimentos, diminuído os impactos sobre as populações selvagens,

atingido uma produção mais eficiente, e pelo apoio econômico às comunidades costeiras

menores, através da produção de exemplares jovens e de tamanho comercial de uma

ampla variedade de espécies de peixes por ano (LANDAU, 1992; NEW, 1996; OLSEN,

1996; PILLAY, 1996; WABNITZ et al., 2003; ALVES et al, 2013). No entanto, as

monoculturas intensivas de peixes enfrentam problemas como: surtos de doenças

devido ao aumento da vulnerabilidade à infecção causada por altas densidades de

estocagem e níveis de estresse elevados; fornecimento de dietas apropriadas a uma

equilibrada taxa de crescimento/custo viável; e questões ambientais (WILSON;

VINCENT, 1998; KOLDEWEY e MARTIN-SMITH, 2010; JENNINGS et al, 2001),

como, por exemplo, o destino dos efluentes. Para além destes, o transporte de espécimes

vivos para sustentar o comércio ainda é um desafio. Por vezes, os animais ficam

expostos a resíduos de excreção, à diminuição do oxigênio dissolvido, a superlotação e

fome (IGUCHI et al, 2002; PATERSON et al., 2003; WRIGHT et al, 2007). Embora

geralmente não estudados, a maioria desses benefícios e os riscos se aplicam à

aquicultura de espécies ornamentais (KOLDEWEY e MARTIN-SMITH, 2010).

No Brasil, além desses, o uso indiscriminado de produtos considerados de

elevado risco ecológico no tratamento de doenças, e a escassez de estudos direcionados

à modificação dessa realidade, produzindo tratamentos de baixo risco ambiental ainda

compõem o cenário da aquicultura no país (CRUZ et al., 2005; MAXIMINIANO et al.,

2005; LUVIZOTTO-SANTOS et al., 2009; SILVA et al., 2009). De alguma forma, os

aquicultores devem equilibrar inúmeros fatores para propiciar um ambiente ideal para o

20

organismo do seu interesse (ANDERSON, 2009). Manter esses benefícios e, ao mesmo

tempo, minimizar todas essas problemáticas de cultivo é um dos principais desafios dos

estudos atuais voltados à aquicultura.

Hipóteses

O peróxido de hidrogênio, utilizado comumente na indústria da aquicultura,

demora quanto tempo para se degradar na água salgada? Aeração, luminosidade e

animais influenciam nessa degradação? Qual seria a quantidade ideal, não letal, para o

início de estudos utilizando tratamento de patologia por peróxido de hidrogênio em H.

reidi? Teria o H2O2 algum impacto na saúde dos peixes, comportamento e fisiologia?

Qual a viabilidade da utilização da Mn-porfirina - Mn(III) meso-tetraquis(N-

etilpiridinio-2-il)porfirina - na manutenção da estabilidade celular através de sua ação

antioxidante, utilizando o H2O2 como modelo ao estresse oxidativo?

Contribuições para a Ciência e Indústria

Essa dissertação aborda questões importantes para a etologia e aquicultura de

maneira geral, se mostrando necessário para o desenvolvimento de um protocolo de

manejo eficiente e exequível para criação em cativeiro de Cavalos-Marinho no Brasil.

Estabelecer um protocolo para tratamento de enfermidades e mitigar o estresse a que

esses animais são submetidos é um dos pontos mais delicados desse processo. Sendo

assim, antigas abordagens necessitam ser adaptadas e novas abordagens precisam ser

testadas.

Nesse contexto, estudos envolvendo o peróxido de hidrogênio, utilizado

amplamente na aquicultura para manter a estabilidade da água dos aquários

(combatendo principalmente fungos e cianobactérias), como também no tratamento de

algumas enfermidades que atingem peixes (bactérias e parasitas), associado a utilização

de um biomimético da enzima superóxido dismutase (SOD) que poderá vir a diminuir o

impacto associado ao estresse oxidativo a que esses animais são submetidos são

relevantes e necessários.

21

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27

CAPÍTULO I - DEGRADAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO EM

CONDIÇÕES DE CULTIVO DE HIPPOCAMPUS REIDI

1. INTRODUÇÃO

O peróxido de hidrogénio (H2O2) é um importante intermediário nos processos

redox aquáticos, reagindo com metais vestigiais e poluentes, agindo como um forte

agente oxidante em sistemas químicos e biológicos (PETASNE e ZIKA, 1997;

O’SULLIVAN et al, 2005; CLARK et al, 2008). Tem sido amplamente utilizado em

aquicultura como tratamento por imersão (banho) contra muitos organismos causadores

de doenças em diferentes espécies e fases da vida de peixes (YANONG, 2014). Muito

embora publicações que abordem metodologias que empregam o uso do peróxido no

tratamento de doenças e profilaxia em sistemas de cultivo sejam muito escassas, é

notável um consenso para o uso do mesmo pelos aquaristas e criadores de peixes.

O peróxido de hidrogênio é eficaz contra parasitas (RACH et al. 2000a;

MONTGOMERY-BROCK et al. 2001; POWELL e CLARK 2004), fungos (HOWE et

al. 1999; RACH et al. 2004), vírus e bactérias (SPEARE e ARSENAULT 1997;

LUMSDEN et al. 1998; RACH et al. 2000b, 2003; GAIKOWSKI et al. 2003),

apresentando geralmente, uma maior atividade contra as bactérias gram-negativas do

que contra as bactérias gram-positivas (RUSSO et al, 2007). O aumento dos níveis de

atividade de catalase, quando as bactérias são cultivadas sob determinadas condições,

tais como a presença de peróxido ou até à fase estacionária, tem sido relatado

(STORTZ, TARTAGLIA e AMES 1990; GONZALEZ-FLECHA e DEMPLE, 1997;

LOEWEN 1997). Adicionalmente, Angel et al (1999) demonstraram que mesmo níveis

baixos de peróxido de hidrogênio (100 nM) causam estresse oxidativo para bactérias em

águas costeiras, baseado no aumento da concentração de enzima catalase na coluna

d’água. No entanto, a sua toxicidade apresenta valores iniciais e sensibilidade espécie

específica, tanto para microrganismos como para peixes (RUSSO et al, 2007;

YANONG, 2014), sendo, portanto, inexistentes na literatura dados que demonstrem tais

valores para o gênero Hippocampus.

28

Uma grande vantagem do H2O2 é o impacto ambiental mínimo relacionado com

a ausência de resíduos tóxicos, representando uma alternativa mais amigável ao

ambiente (KIEMER e BLACK, 1997). Em água, o H2O2 se decompõe em H2O2(ℓ) →

H2O(ℓ) + ½ O2(g), e que também tem sido usado como uma fonte de oxigênio, durante

o transporte de peixe vivo ou em lagos ornamentais (TAYLOR e ROSS, 1988). Em

aquicultura ornamental de água doce, o uso de doses menores de medicamentos por

períodos de tempo mais longos pode se mostrar favoráveis em algumas situações. O

peróxido de hidrogênio em concentrações baixas como tratamento pode ser aplicado,

por exemplo, em tanques de criações e lagoas, onde uma troca de água pode não ser

uma opção (YANONG, 2014; RUSSO et al, 2007).

O peróxido de hidrogênio parece degradar-se relativamente rápido na presença

de matéria orgânica e de aeração e, na água do mar, esse processo de degradação tem

sido atribuído à decomposição biológica envolvendo enzimas peroxidase de plâncton e

bactérias marinhas (COOPER e ZEPP, 1990; MOFFETT e ZAFIRIOU, 1993;

PETASNE e ZIKA, 1997; YANONG, 2014). Outros dissipadores potenciais incluem

decomposição catalítica mediada por metais de transição, halogenetos e partículas,

decomposição fotoquímica e um mix de dinâmicas físicas (MOFFETT e ZAFIRIOU,

1993; PETASNE e ZIKA, 1997).

Nesse sentido, estudos para compreender a estabilidade do peróxido de

hidrogénio, em diferentes tratamentos e condições ambientais estáveis para o cultivo de

Hippocampus reidi, se fazem necessários para mensurar o tempo e a frequência dessa

degradação em um sistema controlado, uma vez que a exposição excessiva ao H2O2 e a

sua utilização de forma imprópria pode resultar em toxicidade para H. reidi.

29

2. OBJETIVOS

2.1. Geral:

Avaliar a taxa e o tempo de degradação de peróxido de hidrogênio em

condições controladas para o cultivo de H. reidi.

2.2. Específicos:

Mensurar a degradação total e média do peróxido de hidrogênio em água

salgada, ao longo de 24 horas, em um sistema controlado com diferentes

condições de luminosidade e aeração;

Avaliar a degradação total e média do peróxido de hidrogênio em água salgada,

ao longo de 24 horas, na presença e ausência de exemplares de H. reidi.

Identificar os fatores que regulam as taxas de decomposição do peróxido de

hidrogênio.

30

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Qualidade da água

As variáveis físico-químicas dos aquários de populações estoque, bem como dos

demais aquários onde foram realizados os experimentos, foram controladas

constantemente. As variáveis de temperatura, salinidade e pH foram mantidas em 25°C, 27

ppm e 8,2 respectivamente. Os demais parâmetros químicos da água NH3, NH4+ foram

monitorados diariamente e não excederam os limites adequados para cavalos-marinhos

variando entre: 0 – 0,25mg/l (KOLDEWEY, 2005). Foi estabelecido também um

fotoperíodo de 10L : 14E, utilizando luz branca fria acima dos tanques, com intensidade

luminosa de cerca de 500lx na superfície da água.

3.2. Estudo da decomposição do H2O2

3.2.1. Procedimentos

Foram preparadas duas soluções (A e B) para o método I3-

de acordo com a

fórmula usual (Allen et al, 1952).

Solução “A” - Consiste de 33 g de KI, 1 g de NaOH, e 0,1 g de molibdato de

amônio tetrahidratado diluído com 500 mL com água. A solução foi agitada

durante ~10 min para a dissolução do molibdato sendo seu pH final de 12,7. A

solução foi armazenada no escuro total para inibir a oxidação do I-.

Solução “B” – É um tampão aquoso, contém 10g de KHP por 500mL de água, e

pH de 4,04;

O método I3- consiste em misturar volumes iguais das soluções A e B, seguido

pela adição em igual proporção da solução de H2O2. A absorbância da solução

resultante foi medida a 351.0 nm em uma cubeta, para se ter uma absorbância de ~0.9 (a

depender da concentração de H2O2 na solução).

Para se obter a absorbância do branco, foi calculado a absorbância esperada para

a diluição da mistura A/B com água pura e, posteriormente, foram misturados volumes

31

iguais da solução “A”, “B” e da água do mar (sem H2O2), assumindo que a diferença

entre as soluções foi devido a I3- fortuito.

Para os valores de max (I3-) a 351 nm foram assumidos os valores de Klassen et

al (1994).

A reação de H2O2 acidificada com KI para produzir I2, seguido da Iodometria

com tiossulfato de sódio padrão, é chamado de método de Kingzett (REICHERT et al,

1939; SCOTT, 1939; KINGZETT, 1880). Em altas concentrações de KI, o equilíbrio

entre I2, I- e I3

- é fortemente em favor de I3

-. A medição de I3

- pela sua absorção óptica

constitui a base do método I3- (KLASSEN et al, 1994).

H2O2 + 2I- + 2H

+ → I2 + 2H2O

I2 + I- ⇌ I3

-

3.2.2. Medição Óptica

Um espectrofotômetro BEL Photonics SP 1105, que mede a 0.001 unidade de

absorbância, foi utilizado. Os espectros apresentados no presente estudo tiveram o

Branco subtraído. As medições de absorbância foram feitas ~4 minutos após a

colocação da cubeta no espectrofotômetro, a fim de permitir que a temperatura das

soluções se igualem às do espectrofotômetro. Todas as medições de absorbância foram

feitas dentro da faixa de 24-25C.

A absorbância é proporcional à concentração de moléculas absorvedoras de luz

na amostra e ao caminho óptico da substância através da qual a luz viaja. Sendo assim, a

Lei de Beer expressa a dependência da absorbância (A) em relação ao caminho óptico

(b) e a concentração (c):

A = bc

32

3.3. Desenho Experimental

Foram selecionados nove animais com altura média 19.1 cm (±2.3) e peso

úmido 15,3 g (±0,3), respectivamente, provenientes da população estoque para cultivo

experimental do LAPEC (Laboratório de Peixes – Ecologia e Conservação),

Universidade Federal da Paraíba, Brasil. Os animais tiveram o comprimento estimado

com auxílio do software gratuito UTHSCSA Image Tool (WILCOX et al., 2002) e o

peso aferido com uma balança milesimal (Bel M-333).

Os experimentos foram feitos em quatro diferentes condições controladas

(Tabela 1). Para os ensaios envolvendo animais, utilizou-se um aquário de 21 x 36 x 30

cm (20 L), onde três animais, por vez, foram expostos a uma solução de H2O2 a 3% de

ingrediente ativo (Rioquímica) e concentração de 882 mM; os outros ensaios foram

realizados em beckers de 1 L e 2 L respectivamente, sem presença de animais. Para

cada condição experimental foram realizados três experimentos com uma réplica cada.

As concentrações testadas foram baseadas em informações empíricas e arbitradas a

partir da literatura (SAMUILOV et al, 2001; DRABKOVA et al, 2007; LARS-

FLEMMING et al, 2010; 2012). Foi definido o valor de 0,25 ml de H2O2 à 3% por 1 L

de água salgada, quantidade comumente utilizada na indústria para combate ao

surgimento e a proliferação de algas (DRABKOVA et al, 2007).

O H2O2 foi adicionado as 18:00 (h:m) de cada dia de experimento, sob as três

diferentes condições (claro/escuro, presença/ausencia de aeração e presença/ausencia de

animais). Foi retirada uma alíquota, por hora, de cada recipiente e submetido à

determinação espectrofotométrica de H2O2 por iodometria. Toda a água utilizada no

experimento passou por filtragem mecânica (Manta Acrílica – Perlon e Malha 150 µm)

e ultravioleta (Filtro UV Atman-36W), utilizado comumente para controle de

organismos planctônicos e microrganismos em sistemas de cultivo fechado.

3.4. Análises Estatísticas

Os resultados referentes às frequências e taxas de degradação do peróxido

obtidas por tratamento foram mensurados por meio da Análise de Variância (ANOVA),

sendo verificados para normalidade pelo Teste de Shapiro-Wilk (W-test). Diferenças

significativas apresentadas foram então analisadas com o teste a posteriori de Duncan,

diferenciando o(s) grupo(s) formados com as médias mais significativas. O Teste-t de

33

Student foi aplicado para verificar a existência de correlação entre as variáveis

mensuradas. A ferramenta estatística utilizada foi o STATISTICA 8 (Statsoft). Todos os

testes foram considerados significativos quando seus resultados demonstraram um nível

de p<0,05. Dados referentes às análises são apresentados na forma de porcentagem ±

erro padrão.

Condições Observações

Claro/Escuro Claro

Experimento submetido a condições normais de fotoperíodo

(10L : 14E) ao longo de 24 horas;

Escuro

Experimento submetido a condições de escuro constante, ao

longo de 24 horas;

Presença


(10L : 14E) e aeração constante, ao longo de 24 horas. A

aeração consiste na utilização de uma bomba compressora

Boyu (D-200; 1,5 W) para aerar a água;

Presença/Ausência de

Aeração

Ausência


(10L : 14E) e sem aeração, ao longo de 24 horas;

Presença/Ausência de

Animais Presença


(10L : 14E) e aeração constante, com a presença de 3

cavalos-marinho ao longo de 24 horas;

Ausência


(10L : 14E) e aeração constante, sem cavalos-marinho ao

longo de 24 horas;

Área de contato da

superfície da água/ar 5cm2


(10L : 14E) e aeração constante ao longo de 24 horas, onde

a superfície de contato Água/Ar é de 5cm2;

20cm2


(10L : 14E) e aeração constantee aeração constante ao

longo de 24 horas, onde a superfície de contato Água/Ar é

de 20cm2;

Tabela 1: Sumário das condições experimentais em ambiente controlado, LAPEC, Brasil, 2015.:

Claro/Escuro, Presença/Ausência de Aeração, Presença/Ausência de Animais e Superfície de Contato

Água/Ar

34

4. RESULTADOS

Neste experimento, os valores de concentração do H2O2 (~220,5 µM) se

mantiveram constantes na primeira hora de experimento para todos os tratamentos.

Após 15 horas, os tratamentos claro/escuro haviam perdido, respectivamente, 18,4 ±

0,5/15,3 ± 0,4 %; os tratamentos presença/ausência de aeração haviam perdido 4,2 ±

0,1/7 ± 0,6 % e os tratamentos presença/ausência de animais haviam perdido 79,2 ±

4,9/14,9 ± 1 % de sua concentração inicial de H2O2, respectivamente. Ao final das 24

horas, os tratamentos claro/escuro e presença/ausência de aeração ainda possuíam 6,8-

6,5 e 10,8-0,2 µM de H2O2, enquanto que ambos os tratamentos da condição

presença/ausência de animais já haviam degradado todo o H2O2.

A partir do Teste-t de Student realizado com todas as variáveis analisadas (taxa e

frequência de degradação) para cada situação experimental, não foi encontrada

diferença significativa entre os tratamentos para as condições claro/escuro (Fig. 1),

presença/ausência de aeração (Fig. 2) e condição área de contato da superfície da

água/ar (Fig. 3). Apenas para a condição presença/ausência de animais (Fig. 4) foi

observada diferença significativa a partir da análise, no que se refere apenas a taxa de

degradação (t = 2.74; p = 0.01).

Figura 1. Degradação Total (A) e Degradação Média (B) de peróxido de hidrogênio (H2O2) em água do

mar na presença e ausência de luminosidade em ambiente controlado na ausência de H. reidi, LAPEC,

Brasil, 2015. cl, Claro; es, Escuro.

35


mar na presença e ausência de aeração em ambiente controlado na ausência de H. reidi, LAPEC, Brasil,

2015. Ae, Aerção; Sae, Ausencia de aeração.


mar em diferentes condições de área de contato da superfície da água/ar: 5cm² e 20cm², em ambiente

controlado na ausência de H. reidi, LAPEC, Brasil, 2015.

Figura 4. Degradação Total (A) e Degradação Média (B) do peróxido de hidrogênio (H2O2) em água do

mar na presença e ausência de aeração em ambiente controlado e na presença e ausência de H. reidi (3

indivíduos), LAPEC, Brasil, 2015. Ani, Presença de Animais; SAni, Ausência de Animais.

36

4.1. Comparação entre os tratamentos

A taxa de degradação do H2O2 ao longo de 24 horas apresentou diferença

significativa entre os tratamentos (F5,289 = 6.1766, p < 0.01). A Frequência de

Degradação do peróxido não apresentou diferença significativa entre os tratamentos

(Tabela 2). A partir do teste a posteriori de Duncan foi observada a formação de dois

grupos distintos (G1 = Ani, G2 = demais tratamentos) (Fig. 5).

Claro/Escuro

(%)

Presença/ Ausência de

Aeração (%)

Presença/ Ausência de

Animais (%)

Variáveis Cl Es Ae Sae Ani SAni

Taxa de Degradação

(%) 33.2 ± 0.2 30.6 ± 0.8 20.2 ± 1.1 21.6 ± 1.6 47.2 ± 1.7* 29.3 ± 0.3

Freq. de degradação

(%) 8.9 ± 0.1 8.72 ± 0.1 8.62 ± 0.0 8.69 ± 0.0 12.19 ± 0.4 9.65 ± 0.0


mar entre os tratamentos com condições Claro (cl)/Escuro (es), Presença (Ae)/Ausência (Sae) de Aeração

e Presença (Ani)/Ausência (SAni) de Animais (n = 9) em ambiente controlado, LAPEC, Brasil, 2015.

Tabela 2: Efeito das variáveis na degradação do H2O2.

Valores com asterisco (*) denotam diferença significativa.

Cl, Claro; Es, Escuro; Ae, Presença de Aeração; Sae, Ausência de Aeração; Ani, Presença de

Animais; SAni, Ausência de animais.

37

5. DISCUSSÃO

Os dados apresentados no presente estudo demonstram que as concentrações de

peróxido de hidrogênio podem sofrer alterações variadas ao longo do tempo, como

consequência de diversas condições abióticas e principalmente decorrente de fatores

bióticos, tais como a presença de microrganismos e de outros organismos, como peixes

ornamentais - cavalos-marinhos no caso deste trabalho. Os resultados obtidos

corroboram o que vem sendo apresentado na literatura: Russo e colaboradores (2007),

por exemplo, também observou que as concentrações de H2O2 se mantiveram constantes

durante a primeira hora de experimento para todas as condições testadas, e que

alterações nas taxas de degradação de peróxido foram mais elevadas e divergiram na

presença de cinco espécies de peixes ornamentais testadas.

Segundo Yanong (2014), certo número de diferentes elementos, enzimas e

compostos, bem como luz, calor e pH elevado, todos, aceleraram a degradação do

peróxido de hidrogênio. Tort et al. (2003) achou algo parecido em seus experimentos,

onde as concentrações de peróxido de hidrogênio iniciais de 10 e 100 mg/L em tanques

de cultivo não foram mensuráveis após 2-3 dias na presença de aeração e/ou de matéria

orgânica, no entanto, sob condições de água estática, sem aeração ou matéria orgânica,

as concentrações foram reduzidas para metade até 6 dias e se tornaram imensuráveis

após 10 dias. Os dados disponíveis na literatura são, de certa forma, ainda limitados

para fins comparativos, tendo em vista que, as diferentes condições e parâmetros

testados são bastante divergentes e abordam diversas espécies e/ou sua eficácia contra

diferentes patógenos.

Ao contrário do que se acreditava, o efeito da luminosidade e da aeração parece

estar, portanto, muito mais relacionado ao aumento da degradação do peróxido pela

presença de matéria orgânica e bactérias que se aproveitem dos efeitos benéficos destas

variáveis (Ex.: FUJIOKA et al, 1981) do que diretamente daqueles dois parâmetros.

. Experiências de filtragem indicam que partículas ou micro-organismos

desempenham o papel principal na determinação do tempo de vida do H2O2 na água do

mar (PETASNE e ZIKA, 1997). Spotte e Buck (1981) mostraram uma diminuição na

contagem de bactérias (> 75% de redução) em água do mar, após passagem por filtro de

irradiação UV. Neste sentido, o fato de não observarmos diferença significativa entre

38

nenhuma variável para os tratamentos Presença/Ausência de Aeração, Claro/escuro e

Área de Contato da Superfície da Água, pode estar relacionado ao tratamento dado à

água anteriormente aos experimentos, uma vez que a filtragem mecânica e ultravioleta

(comumente utilizadas em sistemas fechados para espécies ornamentais) elimina/retira

grande parte da matéria orgânica e possivelmente dos microrganismos presentes

anteriormente na água.

Spotte e Buck (1981) demonstraram que as fezes dos animais, e adicionalmente

porções de alimento ofertado (peixe cru), contribuem para contagens mais elevadas de

bactérias na água do mar em lagos artificiais, mesmo após a passagem pela irradiação

UV. No nosso caso, os animais não foram alimentados durante os experimentos, porém

podemos sugerir que a simples presenta de exemplares de H. reidi no aquário

experimental e a excreção de compostos nitrogenados com consequente aumento da

matéria orgânica dissolvida podem ter gerado um aumento na quantidade de

microrganismos que secundariamente degradem o peróxido.

Os resultados obtidos neste estudo mostraram que, para as variáveis testadas, a

presença de animais parece ser um fator decisivo na degradação do H2O2, seja por

acréscimo de matéria orgânica e bactérias ao sistema, como também pela possível

absorção por parte dos animais e, contrariamente ao esperado, a luminosidade, aeração e

área de superfície de contato água/ar possuem uma influência muito mais secundária, do

que direta nessa degradação.

39

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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42

CAPÍTULO II - REAÇÕES COMPORTAMENTAIS PARA A AVALIAÇÃO DO

ESTRESSE EM HIPPOCAMPUS REIDI GINSBURG, 1933 (SYNGNATHIDAE)

EXPOSTOS AO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO EM TRATAMENTOS POR

IMERSÃO (BANHO)

1. INTRODUÇÃO

O peróxido de hidrogênio (H2O2), comumente utilizado como um desinfetante

para assepsia de ferimentos de maneira geral, tem sido amplamente utilizado em

aquicultura como tratamento por imersão (banho) contra muitos organismos causadores

de doenças e como forma de prevenção e controle de mortalidades associadas com

infecções fúngicas (HOWE et al. 1999; RACH et al. 2004), bacterianas (SPEARE e

ARSENAULT 1997; LUMSDEN et al. 1998; RACH et al. 2000b, 2003; GAIKOWSKI

et al. 2003), e de infestações parasitárias (RACH et al. 2000a; MONTGOMERY-

BROCK et al. 2001; POWELL e CLARK 2004) em diferentes espécies e ciclos de vida

dos peixes (YANONG, 2008). Muitos agentes patogênicos (incluindo bactérias

anaeróbias) não produzem catalase e superóxido dismutase, o que os tornam mais

sensíveis ao composto, já que não podem quebrar os componentes do peróxido

(KEYER e IMLAY, 1996; IMLAY 2002, 2003). No Brasil, essas enfermidades estão

entre os principais fatores que impedem o pleno desenvolvimento da piscicultura, uma

vez que, no tratamento de doenças, o uso indiscriminado de produtos considerados de

elevado risco ecológico, e a escassez de estudos direcionados a produtos de baixo risco

ambiental ainda compõem o cenário da aquicultura no país (CRUZ et al., 2005;

MAXIMINIANO et al., 2005; LUVIZOTTO-SANTOS et al., 2009; SILVA et al.,

2009).

Uma grande vantagem do H2O2 é o impacto ambiental mínimo relacionado com

a ausência de resíduos tóxicos, representando uma alternativa mais amigável ao

ambiente (KIEMER e BLACK, 1997). No entanto, fatores como a concentração do

produto, o tempo de exposição e a temperatura da água pode levar o peróxido de

hidrogênio a se tornar tóxico, resultando em danos como morbidade (por exemplo,

danos nas brânquias) ou mesmo mortalidade, dependendo do tamanho do peixe

(JOHNSON et al. 1993; THOMASSEN 1993; CLAYTON e SUMMERFELT 1996;

KIEMER e BLACK 1997; RACH et al. 1997; GAIKOWSKI et al. 1999; POWELL e

43

CLARK 2004). Além disso, sua toxicidade apresenta valores iniciais de exposição e

sensibilidade espécie específica, tanto para microrganismos como para peixes (RUSSO

et al, 2007; YANONG, 2014).

Inexiste na literatura, dados que demonstrem tais valores para o gênero

Hippocampus. Uma vez que as doenças estão entre uma das principais fontes de

mortalidade desses animais em cativeiro (WILSON e VINCENT, 1998), estudos

direcionados ao desenvolvimento de protocolos que se utilizem de produtos de baixo

risco ambiental (como o H2O2) para o tratamento de patologias se fazem necessários.

1.1. Comportamento

O peróxido de hidrogênio, juntamente com outras espécies reativas de oxigênio

e/ou nitrogênio (superóxido, radical hidroxila, peroxinitrito, óxido nítrico, dióxido de

nitrogênio, entre outras) são amplamente reconhecidos como sinalizadores, pelo fato de

afetarem a atividade de transcrição celular da base-redox, o controle a respostas

inflamatórias e as respostas imunológicas (BARTESAGHI et al, 2007; BONELLO et al,

2007; DU et al, 2008; HIDALFO e DONOSO, 2008; LI et al, 2007; RUBBO e RADI,

2008; SALVEMINI et al, 2006; SOUZA et al, 2008; WINTERBOURN, 2008;

WINTERBOURN e HAMPTO, 2008; ).

O H2O2, bem como a manipulação, pode gerar uma resposta primária de

estresse, marcada pelo crescimento do cortisol plasmático e concentrações de glicose

(HEO e SHIN, 2010). Dependendo da intensidade e duração do stress, podem ocorrer

ainda respostas secundárias de estresse, que incluem alterações no plasma, nos níveis

dos metabólitos, nos íons dos tecidos, nas características hematológicas e nas proteínas

de choque térmico ou de tensão (PCT), todas relacionadas com os ajustes fisiológicos,

como o metabolismo, a respiração, o estado ácido-base, equilíbrio hidromineral, função

imune e respostas celulares (PICKERING, 1981; IWAMA et al., 1997, 1998;

MOMMSEN et al., 1999) e respostas terciárias como alterações no crescimento,

condição resistência total à doença, o escopo para a atividade metabólica,

comportamento, e em última análise, a sobrevivência, resumidamente, aspectos do

desempenho de todo o animal (WEDEMEYER e MCLEAY, 1981; WEDEMEYER et

44

al., 1990). Essas respostas afetam os peixes em todos os níveis de organização, desde

molecular e bioquímica à população e comunidade (ADAMS, 1990).

Após a exposição a um estressor, a adrenalina aumenta rapidamente

(WENDELAAR BONGA, 1997) e eleva as catecolaminas em circulação

(principalmente noradrenalina e adrenalina) que estão associadas tanto com a

hipoventilação como com a hiperventilação em uma ampla variedade de vertebrados,

quer através de mecanismos reflexos periféricos ou centrais (PEYRAUD-

WAITZENEGGER, 1979; FOLGERING, 1980; FOLGERING et aL, 1982;

ELDRIDGE et aL, 1985; JANSEN et ai, 1986; TAYLOR e RANDALL, 1990;

RANDALL e TAYLOR, 1991). As injeções de catecolaminas na corrente sanguínea do

peixe podem resultar num aumento da ventilação branquial em peixes (PEYRAUD-

WAITZENAGGER, 1979; TAYLOR e WILSON, 1989; MCKENZIE, 1990;

RANDALL e TAYLOR. 1991).

A frequência respiratória tem sido empregada como indicador indireto da

condição de estresse oxidativo em peixes (BARRETO e VOLPATO, 2006; AURÉLIO,

2012), bem como a outros vertebrados, a exemplo dos roedores (GAUTER-

FLECKENSTEIN, 2010). O comportamento é tanto uma sequência de ações

quantificáveis, operando através dos sistemas nervosos central e periférico, como uma

manifestação cumulativa de processos genéticos, bioquímicos e fisiológicos essenciais à

vida (alimentação, reprodução e fuga de predadores) (DUBE e HOSETTI, 2010),

oferecendo uma perspectiva única que liga a fisiologia e ecologia de um organismo e

seu ambiente, servindo, portanto, como biomarcadores de estresse (BEITINGER, 1990;

LITTLE e BREWER, 2001). Apesar de métodos comportamentais possuírem seus

inconvenientes, como a inconsistência de resposta, períodos de formação

excessivamente longos, e estímulos estressantes (KENYON et al., 1998), a frequência

ventilatória vem se mostrando uma forma eficaz para avaliar o estresse, principalmente

porque é um método não-invasivo que concorda, em certo grau, com as medições de

cortisol, evitando assim técnicas dolorosas ou estressantes para serem usadas na

avaliação de estresse, tais como colheita de sangue (BARRETO e VOLPATO, 2004;

2006). Além disso, é um parâmetro barato e facilmente mensurável, já que podem ser

contadas visualmente, de modo que não requer equipamento sofisticado (BARRETO e

VOLPATO, 2006).

45

2. OBJETIVOS

2.1. Geral:

Determinar a toxicidade aguda do peróxido de hidrogênio, com referência aos

seus efeitos sobre o peso, comportamento e a disfunção do consumo de oxigénio

para Hippocampus reidi.

2.2. Específicos:

Avaliar a segurança da utilização do H2O2 como um tratamento químico externo

em H. reidi;

Descrever comportamentos que possam vir a ser bons sinalizadores de estresse

em H. reidi;

Verificar se a frequência respiratória de H. reidi é alterada em função das

concentrações de peróxido de hidrogênio (estressor);

Observar se há diferenças no comportamento entre machos e fêmeas de H. reidi,

quando em situação de estresse agudo;

46





constantemente. As variáveis de temperatura, salinidade e pH foram mantidas em 25°C, 27

ppm e 8,2 respectivamente. Os demais parâmetros químicos da água NH3, NH4+ foram


variando entre: 0 – 0,25mg/l (KOLDEWEY, 2005). Foi estabelecido também um

fotoperíodo de 10L : 14E, utilizando luz branca fria acima dos tanques, com intensidade

luminosa de cerca de 500lx na superfície da água.


Foram selecionados 20 animais (10 machos e 10 fêmeas) com altura média e

peso úmido equivalente a 18,5 g (±2.6) e 14,1 g (±3,6), respectivamente, provenientes

da população estoque para cultivo experimental do LAPEC (Laboratório de Peixes –

Ecologia e Conservação), Universidade Federal da Paraíba, Brasil. Os animais tiveram o

comprimento estimado com auxílio do software gratuito UTHSCSA Image Tool

(WILCOX et al., 2002) e o peso aferido com uma balança milesimal (Bel M-333).

Os tratamentos e durações foram concebidos com base em protocolos que

podem ser facilmente aplicadas em explorações agrícolas comerciais (Gaikowski et al.

1999; A U.S. Food and Drug Administration – EUA, 2002; Yanong, 2014): 60 minutos

de imersão em altas concentrações de H2O2. Este tipo de tratamento, com uma

concentração mais elevada de H2O2, pode ser adaptado a reservatórios de interiores, em

que todo o volume de água pode ser facilmente alterado.

Foi preparado um sistema de exposição que consiste em 1 aquários de 20L (21 x

36 x 30 cm) com recirculação contínua da água (Submersible Pump SP-2500, Boyu),

para homogeneização do peróxido de hidrogênio e constante oxigenação, e um substrato

de apoio (Fig. 1). Todos os experimentos ocorreram entre as 11:00 am e 18:00 pm, uma

47

vez que sabe-se que a frequência respiratória em peixes se alteram ao longo do dia

(BARRETO e VOLPATO, 2006).

Os animais foram expostos, um por vez, a quatro concentrações de tratamento

por H2O2 (218 µM, 545 µM, 599 µM, 654 µM) e um controle sem qualquer

interferência química (0 µM), com uma repetição/concentração, para cada sexo testado,

durante 60min de exposição. A mais alta concentração testada foi determinada com base

em métodos padrão de toxicidade aguda, utilizado para estimar dose críticas em ensaios

de dose-resposta (BLISS, 1935; PELTIER e WEBER, 1985, VALADARES, 2006).

Observações de aspectos biométricos, saúde e comportamento dos animais foram

observados. Foi retirada uma alíquota de água, no início e no final de cada experimento

e medido a sua absorbância em um período máximo de 40 minutos, seguindo o método

I3- de acordo com a fórmula e procedimento usual (ALLEN et al, 1952; KLASSEN et al,

1994).

Foi utilizada uma solução de H2O2 a 3% de ingrediente ativo (Rioquímica) e

concentração de 882 mM. Toda a água utilizada no experimento passou por filtragem

mecânica (Manta Acrílica – Perlon e Malha 150 µm) e ultravioleta (Filtro UV Atman-

36W), utilizado comumente para controle de organismos planctônicos e

microrganismos em sistemas de cultivo fechado, antes de cada experimento.

Figura 1. Sistema experimental com recirculação contínua de água, utilizada para exposição de H. reidi a

diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio. 1: saída de água do aquário; 2: entrada de água no

aquário; 3: bomba de recirculação de água; 4: substrato de apoio; 5: Mesa; 6: cadeira para apoio do

aquário com bomba de recirculação.

4

48

3.3. Análise comportamental

Os experimentos foram realizados com uma população de H. reidi clinicamente

saudável (ou seja, sem parasitas externos na pele, nadadeiras e brânquias; sem lesões

externas; com comportamento e alimentação normais; nenhuma mortalidade ou

morbidade conhecida ou observada). Os animais foram filmados (HDR-XR160, Sony) e

monitorados em todo o experimento para análise comportamental e posterior contagem

dos batimentos operculares por minuto (BARRETO e VOLPATO, 2006;

TANTARPALE et al, 2012; AURÉLIO, 2012), utilizando-se de métodos não invasivos

para mensurar o estresse oxidativo. Além disso, a cada 10 min durante o período do

experimento (60min), o número total do tempo que os peixes passaram no fundo, em

natação, em repouso, em exaustão e preso no substrato foi mensurado, bem como a

frequência total de movimentos natatórios horizontais, no fundo, verticais e totais, a

frequência de clicks e gapes (em ambos, a cabeça do animal se inclina para cima e o

hióide se sobressai, no click é instantâneo e no gape é feito de forma lenta) e a

frequência de batimentos operculares/min foram aferidos. Movimentos típicos de

estresse em peixes também foram observados.

As medidas comportamentais foram escolhidas para análise com base nos

trabalhos de Øverli e colaboradores (2002), Barreto e Volpato (2006), Faleiro e

colaboradores (2008), Anderson e colaboradores (2011); são elas:

A proporção do tempo gasto por cada animal, na parte inferior do tanque;

A proporção do tempo gasto por cada animal nadando;

A proporção de tempo gasto por cada animal em repouso (estacionário);

A proporção de tempo gasto pelo animal aderido ao substrato (segurando/preso

sobre apoio) contra o tempo total que o animal estava em repouso;

A proporção do tempo gasto por cada animal em exaustão;

A frequência de movimentos de natação (horizontal, vertical e no fundo do

aquário);

A frequência de comportamentos característicos de estresse em peixes;

Número de Clicks;

Número de Pipes (quando o focinho do animal rompe a superfície da água);

49

Número de Gapes;

Número de Batimentos Operculares por minuto.

Comportamentos que ocorreram tanto na ausência de qualquer estímulo externo

(adição de H2O2) como na presença, foram classificados como comportamento de

manutenção (Tab. 2), são eles: presença dos animais na parte inferior do aquário,

comportamentos de nado (horizontal, vertical e no fundo), repouso (estacionário) do

animal no fundo do aquário e/ou aderido ao substrato (segurando/preso sobre apoio),

Clicks e Gapes. Para este caso, foi medida a alteração do tempo gasto realizando estas

ações e/ou sua frequência em relação aos animais controle. A posição é um artifício de

confinamento e não é traduzível para o comportamento do cavalo-marinho em estado

selvagem; porém, em um ambiente de aquário, cavalos-marinhos podem posicionar-se

em zonas mais calmas (ANDERSON et al, 2011). Por essa razão, foi incluída,

quantificada e analisada.

Os comportamentos que só ocorreram na presença do peróxido de hidrogênio,

foram categorizados como comportamentos de estresse (Tab. 1) para H. reidi, com base

na literatura de comportamentos semelhantes descrito para outras espécies de peixes

(FRANCIS-FLOYD, 1988; BARRETO e VOLPATO, 2006; DUBE e HOSETTI, 2010;

ANDERSON et al, 2011).

Tabela 1: Etograma dos dados comportamentais de estresse em H. reidi.

Etograma de cavalo-marinho Hippocampus reidi

Comportamento de estresse

Posição Posição do animal em relação ao tanque

Exaustão

Quando ocorre à perda da capacidade de realização de ações, onde o animal fica a

deriva no aquário.

Locomoção

Posturas enquanto em locomoção

Nados irregulares

Os animais demonstram movimentos de natação irregulares, erráticos e

dardejantes, seguidos de perda de equilíbrio, podendo ou não serrem

acompanhados do peixe ficar "pendurado" verticalmente na água.

Movimentos da

cabeça

Movimentos da cabeça e suas partes

Pipe

O focinho do animal rompe a superfície da água enquanto os movimentos

operculares continuam.

Cauda enrolada

na cabeça

O animal enrola, insistentemente, a cauda na cabeça e/ou partes da mesma.

50

Tabela 2: Etograma dos dados comportamentais de manutenção em H. reidi.


Comportamento manutenção


Topo

Quando o corpo do animal localiza-se em sua maior perção, na metade superior da

altura vertical do tanque;

Fundo

Quando o animal está localizado, em sua maior porção, na metade inferior da altura

vertical do tanque;

Estacionário

Posturas enquanto estiver parado

Empoleirado

O animal está em repouso no tanque, aderido ao substrato.

Sentado

O animal está em repouso no fundo do tanque, livre do substrato. Cabeça e tronco

estão em uma posição vertical.

Locomoção


Nado

horizontal

Animal se desloca na horizontal, lateralmente, através da água em uma posição vertical

ou horizontal, nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em movimento ondulatório. A

cauda pode ser ondulado ou para a frente, estendendo-se abaixo ou atrás do animal.

Nado

vertical

Animal se desloca na vertical, através da coluna d'água em uma posição vertical,

nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em movimento ondulatório. A cauda pode ser

ondulado ou para a frente, estendendo-se abaixo ou atrás do animal.

Nado no

fundo

O animal atravessa o fundo do tanque com o tronco em posição vertical ou

obliquamente na posição vertical, nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em

movimento ondulatório. A cauda arrasta na parte inferior, estendida por trás do animal.

Movimentos

da cabeça


Click

A cabeça se inclina para cima instantaneamente, o hióide se sobressai e a boca está

aberta. Associado a um som de clique.

Gape

O animal abre a boca lentamente, com a cabeça um pouco inclina para cima e o hióide

se projeta. Não há som de clique.

51

3.4. Medição Óptica





soluções se igualem as do espectrofotômetro. Todas as medições de absorbância foram

feitas dentro da faixa de 24-25C.





A = bc


Os resultados referentes ao Peso Inicial, Peso Inicial/Final, Sobrevivência,

Degradação do H2O2 (Deg. H2O2), Tempos no Fundo, Nadando, em Exaustão, Repouso

e Substrato, Frequência de nados Horizontais (FNH), no fundo (FNF), Verticais (FNV)

e totais (FNT), bem como a frequência de movimentos típicos de estresse como Focinho

para Fora da água, Cauda enrolada na cabeça, Nados Irregulares e Movimento totais de

estresse, Frequência de Clicks e Gapes e Batimento Opercular, obtidas por tratamento

foram mensurados por meio da Análise de Variância (ANOVA), sendo verificados para

normalidade pelo Teste de Shapiro-Wilk (W-test). A fim de normalizar os dados

(quando necessário) os valores foram elevados a raiz quadrada. Diferenças

significativas apresentadas foram então analisadas com o teste a posteriori de Duncan,

diferenciando o(s) grupo(s) formado(s) com as médias significativas. O Teste-t de

Student foi aplicado para verificar a existência de correlação entre as variáveis

mensuradas. A ferramenta estatística utilizada foi o STATISTICA 8 (Statsoft).

Todos os testes foram considerados significativos quando seus resultados

demonstraram um nível de p<0,05. Dados referentes às análises são apresentados na

forma de média ± erro ou porcentagem ± erro padrão.

52

4. RESULTADOS

A toxicidade aguda do peróxido de hidrogênio para a espécie Hippocampus

reidi, durante um período de imersão (banho) de 60 minutos, foi verificada em 15ml/L,

ou 12781 80 µM, onde houve mortalidade de 100%. As concentrações de 11606 73

µM (13,75 ml/L) apresentaram nível subletal, com mortalidade de 50%. Para

concentrações iguais/inferiores a 10474 54 µM (12,5 ml/L), não houve mortalidade

em nenhum dos experimentos, mostrando-se seguras nas condições experimentais.

Entre os comportamentos observados, 4 deles só ocorreram na presença do H2O2

(t = -2.84, p = 0,01) (Tab. 2), são eles: exaustão, nados irregulares, pipe e cauda

enrolada na cabeça. Este último, não descrito até o momento para o gênero

Hippocampus, foi expresso principalmente quando os indivíduos foram expostos a

concentrações letais e subletais do peróxido de hidrogênio (Tab. 10). H. reidi enrolava

a cauda preênsil no focinho/cabeça, variando o tempo de duração do movimento (de 0 a

3 minutos), onde o animal parecia inferir alguma força no movimento.

4.1. Diferenças entre sexos

O Teste-t de Student foi realizado com as variáveis peso inicial/final,

sobrevivência (Tab. 3), nadando, em exaustão, repouso e substrato, frequência de nados

no fundo (FNF), verticais (FNV) e totais (FNT), bem como a frequência de movimentos

típicos de estresse como cauda enrolada na cabeça, nados Irregulares e movimento

totais de estresse, frequência de clicks, não mostrando diferença significativa em

nenhum dos casos (Tab. 5). Para as variáveis peso inicial (Tab. 3), degradação do H2O2

(Deg. H2O2) (Tab. 4), tempos no fundo, frequência de nados horizontais (FNH),

verticais (FNV) e totais (FNT), frequência de gapes e batimento opercular (Tab. 5) e

frequência de movimentos típicos de estresse como frequência de pipes (Tab. 6), foi

realizado o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney, onde apenas as variáveis frequência dos

nados verticais (U = 23.5, p < 0.05) (Fig. 2 - A) e nados totais (U = 20.5, p = 0.03) (Fig.

2 - B) apresentaram diferença significativa.

53

Tabela 3: Aspectos biométricos sob condições de estresse por H2O2, em ambos os sexos de H. reidi (5 machos + 5

réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas) em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Aspectos biométricos

Sexo

Variável Macho Fêmea Teste Estatístico P

Peso Inic. - Final (mg) -209.1 ± 191.6 -473.7 ± 322.1 t-value = 0.65 0.53

Sobrevivência (%) 70 ± 14.5 70 ± 15.5 t-value = 0 1.00

Tabela 4: Degradação do peróxido de hidrogênio em tratamentos experimentais, em ambos os sexos de H. reidi

(5 machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas) em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Degradação do H2O2

Sexo


Deg. H2O2 (%) 2 ± 0.5 3 ± 0.6 U = 37.0 0.33

Tabela 5: Dados comportamentais de manutenção, em ambos os sexos de H. reidi (5 machos + 5 réplicas e 5

fêmeas + 5 réplicas), sob condições de estresse por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Dados comportamentais de manutenção

Sexo


T. no Fundo (%) 76.7 ± 6.3 66 ± 6.3 U = 36.5 0,31

T. de Nado (%) 46.8 ± 9 51.9 ± 7.9 t-value = -1.41 0,69

T. de Repouso (%) 53.2 ± 9 34.8 ± 8 t-value = 1.45 0,16

T. no Substrato (%) 17.4 ± 7.9 14.6 ± 9.2 t-value = 0.23 0,82

FNH 9 ± 2.5 10.9 ± 2.4 U = 41.5 0,52

FNF 6.7 ± 2.1 12.5 ± 2.9 t-value = -1.56 0,14

FNV 18.8 ± 3.6 34.3 ± 5.5 U = 23.5 0,05

FNT 34.5 ± 6.1 57.8 ± 9.8 U = 20.5 0,03

Click 3.2 ± 0.8 2.5 ± 0.6 t-value = 0.59 0,57

Gape 0 0.5 ± 0.1 U = 21.0 0,65

Btm. Opercular 49.4 ± 2.4 44.8 ± 2.2 U = 32 0,17

Tabela 6: Dados comportamentais de estresse, em ambos os sexos de H. reidi (5 machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5

réplicas), sob condições de estresse por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Dados comportamentais de estresse

Sexo


T. de Exaustão (%) 0 13.3 ± 6.5 t-value = -1.94 0,07

Nados irregulares 3.5 ± 1.2 3 ± 1.3 t-value = 0.27 0,79

Pipe 0.9 ± 0.3 2.5 ± 0.7 U = 28.5 0,10

Cauda enrolada cabeça 1.7 ± 0.7 3.2 ± 1.3 t-value = -0.96 0,35

Mov. Estresse totais 9.8 ± 2.5 8.7 ± 2.7 t-value = 0.30 0,77 Deg. H2O2, Degradação do peróxido em durante os 60 min de experimento; FNH, Frequência de Nado na

Horizontal; FNF, Frequência de Nados no Fundo; FNV, Frequência de Nados na Vertical; FNT, Frequência de

Movimentos Natatórios Totais.

Deg. H2O2, Degradação do peróxido em durante os 60 min de experimento; FNH, Frequência de Nado na

Horizontal; FNF, Frequência de Nados no Fundo; FNV, Frequência de Nados na Vertical; FNT, Frequência de

Movimentos Natatórios Totais.

54

Figura 2. Gráficos dos comportamentos associados a locomoção, em ambos os sexos de H. reidi (5

machos + 5 réplicas e 5 fêmeas + 5 réplicas), machos (1) e fêmeas (2), em condições controladas,

LAPEC, Brasil, 2015. A. Nados verticais; B. Movimentos natatórios totais.

4.2. Diferenças entre os tratamentos com H2O2 (0 µM, 218 µM, 545 µM, 599 µM e

654 µM)

H. reidi expostos ao H2O2 tiveram perda de peso (-656,9 ± 190,2 mg) em relação

aos animais que não foram expostos (447,3 ± 40,1 mg), sendo a perda de peso maior

para as maiores concentrações de H2O2 (F4, 15 = 11.7, p < 0.00) (Fig. 3 – A). A

sobrevivência apresentou também diferença significativa entre os tratamentos (F4, 15 =

19.0, p < 0.00) (Tab. 7). A partir do teste a posteriori de Duncan foi observada a

formação de dois grupos distintos (G1 = 599 µM e 654 µM, G2 = demais tratamentos)

(Fig. 3 - A) para a variável peso inicial/final e de três grupos distintos (G1 = 599 µM,

G2 = 654 µM e G3 = demais tratamentos) para a sobrevivência (Fig. 3 - B).

A Degradação do peróxido durante o experimento não apresentou diferença

significativa entre tratamentos (Tab. 8).

Para os dados de comportamento, foi observado que animais em aquários

contendo H2O2 passavam um tempo muito maior nadando (58,6 ± 4,8 %) do que os

animais em ausência total do peróxido (12,3 ± 10,1 %, F4, 15 = 4.99, p < 0.01), e

consequentemente, menos tempo em repouso (F4, 15 = 6.48, p = 0.003). Foi encontrada

diferença significativa também entre frequência de nados horizontais (F4, 15 = 3.6, p =

0.03), verticais (F4, 15 = 3.68, p < 0.03) e totais (F4, 15 = 4.44, p = 0.01), as frequências de

A

A

B

B

55

comportamentos que só apareceram em situações com H2O2 e que são descritas na

literatura, em sua maioria como estresse, como nados irregulares (F4, 15 = 7.52, p <

0.002), frequência de pipes (F4, 15 = 7.76, p = 0.001) (Fig. 5 - A), frequências de clicks

(F4, 15 = 3.97, p = 0.02) (Fig. 5 - B), frequência que o animal enrolou a cauda na cabeça

(F4, 15 = 3.97, p = 0.02) (Fig. 6 - A), os mov. de estresse totais (F4, 15 = 19.7, p < 0.00) e

o batimento opercular (F4, 15 = 9.27, p < 0.001) (Fig. 6 - B). O teste a posteriore de

Duncan, mostrando a formação de grupos para cada variável entre os tratamentos com

diferentes concentrações de H2O2, pode ser observado na (Tab. 9 e 10).

Apesar de não ter sido encontrada diferença entre os tempos gastos pelos

animais presos ao substrato entre os tratamentos, quando considerado apenas

presença/ausência do H2O2, baixos níveis de atividade foram observados em condições

de ausência do peróxido de hidrogênio (F4, 15 = 6.48, p < 0.00), formando dois grupos

distintos (G1 = 0 µM, G2 = demais tratamentos) (Fig. 4 – A), passando mais tempo

aderidos ao substrato de apoio (t = 3.00, p = 0.01) (Fig. 4 – B).

Figura 3. Gráficos dos dados biométricos de H. reidi (n = 20) associados aos tratamentos com diferentes

concentrações de H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Ganho/perda de peso; B.

Taxa de sobrevivência nas diferentes concentrações.

A

A

B

B

56


condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Tempo em repouso; B. Tempo aderido ao substrato de apoio.


condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Frequência de Pipes; B. Frequência de Clicks.

Figura 6: Gráficos dos comportamentos de H. reidi (n = 20) associados a diferentes concentrações de H2O2 em

condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015. A. Frequência de vezes que o animal enrolou a cauda na cabeça;

B. Frequência do batimento opercular ao longo de 60min.

A

A

B

B

A

A

B

B

B

B

A

A

57

Tabela 7: Aspectos biométricos em H. reidi (n = 20), sob condições de estresse em variadas

concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Biometria

Variável 0 µM

(0 ml/L)

218 µM

(5 ml/L)

545 µM

(12,5 ml/L)

599 µM

(13,7 ml/L)

654 µM

(15 ml/L) P

Peso Inic./Final (mg) 447.3 ±

40

-214.25 ±

55

-1040 ±

368.3a

-776 ±

13.4a - 0,01

Sobrevivência (%) 100 100 100 50 ± 25a 0

b 0,00

Tabela 8: Degradação Total do peróxido de hidrogênio na presença de H. reidi (n = 20), em variadas

concentrações de tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Degradação do H2O2

Variável 0 µM

(0 ml/L)

218 µM

(5 ml/L)

545 µM

(12,5 ml/L)

599 µM

(13,7 ml/L)

654 µM

(15 ml/L) p

Deg. H2O2 (%) - 2.5 ± 0.2 2.7 ± 0.8 3.5 ± 1.1 3.8 ± 0.2 0,60

Tabela 9: Dados comportamentais de manutenção de H. reidi (n = 20), em variadas concentrações de

tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Comportamento de manutenção

Variável 0 µM

(0 ml/L)

218 µM

(5 ml/L)

545 µM

(12,5 ml/L)

599 µM

(13,7 ml/L)

654 µM

(15 ml/L) p

T. no Fundo (%) 96.9 ± 2.5 70.3 ± 5.2 55.7 ± 11.8 67.4 ± 6.3 66.5 ± 9.1 0,08

T. de Nado (%) 12.3 ± 10.1 68 ± 8.2a 43.7 ± 13.7

a 58.6 ± 5

a 64.2 ± 2.2

a 0,01

T. de Repouso (%) 87.7 ± 10.1 32 ± 8.2a 35.7 ± 11.4

a 41.4 ± 5

a 23.2 ± 6.8

a 0,00

T. no Substrato (%) 47.2 ± 21.2 13.8 ± 9.9 11.7 ± 5 6.4 ± 2.7 0.8 ± 0.4 0,13

FNH 2.4 ± 2 16.3 ± 3.9a 8.9 ± 4

a 13.2 ± 2.6

a 9.1 ± 2.6

a 0,03

FNF 3.9 ± 3.1 15.7 ± 4.4 5.9 ± 2.3 9.6 ± 4.4 13 ± 3.3 0,30

FNV 11.4 ± 9.6 35.2 ± 5a 18.4 ± 5 38.3 ± 7.8

a 29.5 ± 4

a 0,03

FNT 17.7 ± 14.7 67.2 ± 12.5a 33.3 ± 7.2 61 ± 11.9

a 51.6 ± 3.8

a 0,01

Click 0.7 ± 0.5d 1.2 ± 0.6

cd 3.3 ± 0.5

bcd 3.8 ± 1

ac 5.2 ± 1.2

ab 0,02

Gape 0.2 ± 0.1 0,0 0,0 0,0 0.2 ± 0.1 0,26

Btm. Opercular 38.5 ± 1.3 40.9 ± 2.0 52.3 ± 2.6a 54.6 ± 2.8

a 49.3 ± 1.3

a 0,00

Valores com letras iguais denotam diferença não significativa entre elas.


Horizontal; FNF, Frequência de Nados no Fundo; FNV, Frequência de Nados na Vertical; FNT,

Frequência de Movimentos Natatórios Totais.

58

Tabela 10: Dados comportamentais de estresse em H. reidi (n = 20), em variadas concentrações de

tratamentos por H2O2 em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.


Variável

0 µM

(0 ml/L)

218 µM

(5 ml/L)

545 µM

(12,5 ml/L)

599 µM

(13,7 ml/L)

654 µM

(15 ml/L) P

T. de Exaustão (%) 0,0 0,0 20.5 ± 13.7 0,0 12.6 ± 6.3 0,25

Nados irregulares 0c 0.3 ± 0.3

c 6.1 ± 1.9

a 1.9 ± 0.7

bc 7.8 ± 1.4

a 0,00

Pipe 0,0 0.5 ± 0.4 2.3 ± 0.4a 2.1 ± 0.6

a 3.5 ± 1.3

a 0,00

Cauda enrolada cabeça 0c 0.1 ± 0.1

c 5.8 ± 2

ab 1.6 ± 0.7

bc 4.9 ± 1.6

ab 0,02

Mov. Estresse totais 0,0 1.5 ± 0.3 17.5 ± 1.8b 9.3 ± 2.1

a 17.9 ± 2.5

b 0,00

Valores com letras iguais denotam diferença não significativa entre elas.


Horizontal; FNF, Frequência de Nados no Fundo; FNV, Frequência de Nados na Vertical; FNT,

Frequência de Movimentos Natatórios Totais.

59

5. DISCUSSÃO

No Brasil, Hippocampus reidi é a espécie de cavalo-marinho que tem suas

densidades mais altas registradas, predominantemente, nas regiões Norte e Nordeste do

litoral brasileiro (ROSA et al., 2007). Uma proposta de Plano Nacional de Gestão para o

Uso Sustentável dos Cavalos-Marinhos foi publicada em 2011 (DIAS NETO, 2011),

devido a sua inclusão na Lista Nacional de Espécies de Invertebrados Aquáticos e

Peixes Sobre-Explotadas ou Ameaçadas de Sobre-Explotação, de acordo com a

Instrução Normativa nº 05, de 21 de maio de 2004, do Ministério do Meio Ambiente,

instrumento legal que prevê a elaboração de um Plano de Gestão. Sendo assim, é

necessário evoluir em direção à construção do Plano propriamente dito.

O estudo atual é o primeiro a observar respostas comportamentais de estresse

agudo sob diferentes concentrações de H2O2 em H. reidi, para a utilização em

tratamento por imersão (banho) (YANONG, 2014).

5.1. Diferenças entre sexos

Ambos os sexos apresentaram comportamentos parecidos sob as variadas

situações experimentais, no entanto, os machos mostraram significativamente menos

atividade locomotora que as fêmeas. Não se sabe, até então, o mecanismo fisiológico

responsável pela diferença sexual observada na resposta locomotora ao estresse. Øverli

et al (2006) encontraram um comportamento semelhante em Truta-arco-íris

(Oncorhynchus mykiss) em seus experimentos, onde também houve uma diferença

significativa na atividade locomotora entre os sexos, porém, foram as fêmeas que

apresentaram uma menor atividade locomotora. No mesmo estudo, não foi encontrada

diferença para os níveis de cortisol entre os sexos, o que pode indicar que, isoladamente,

a variável não é representativa para esse parâmetro. Para peixes salmonídeos, sabe-se

que o cortisol, hormônios de crescimento e outras substâncias de sinal central e

periférico, como o fator de liberação da corticotropina (CRF), 5-hidroxitriptamina (5-

HT, ou serotonina), podem afetar a atividade locomotora (WINBERG et al, 1993;

ØVERLI et al, 2002; CLEMENTS et al, 2003; JOHANSSON et al, 2004;

JOHANSSON et al, 2005). Entretanto, para muitas espécies de peixes ornamentais,

60

incluindo as do gênero Hippocampus, ainda há uma lacuna em relação ao

funcionamento de tais mecanismos e respostas fisiológicas ao estresse entre indivíduos

de sexo diferentes.

É, portanto, de grande interesse notar que, entre os indivíduos machos e fêmeas

e, consequentemente, na população como um todo, não houve distinção dos

comportamentos associados restritamente ao estresse, nem tampouco aos níveis de

tolerância ao H2O2.

5.2. Diferenças entre os tratamentos com H2O2 (0 µM, 218 µM, 545 µM, 599 µM e

654 µM)

O cortisol é conhecido por diminuir a ingestão de alimentos em animais

expostos, reduzindo assim seu peso (STEVENS, 1972; GREGORY e WOOD, 1999). H.

reidi tiveram perda de peso quando expostos ao H2O2 e ganho de peso nos tratamentos

controle, o ganho de peso é inversamente proporcional à concentração do peróxido de

hidrogênio ao qual foram expostos (Fig. 3 - A). Muito embora, utilizando um estressor

diferente em seu trabalho (estresse sonoro), Anderson e colaboradores (2011)

encontraram resultados semelhantes aos nossos para a espécie H. erectus onde animais

expostos a tanques com ruído (estressor), tiveram perda de peso (ΔWt = −2.23 ± 0.30 g)

e em tanques sem ruído a perda de peso foi significantemente menor (ΔWt = −1.44 ±

0.28 g).

Sabendo que a ingestão de toxinas, aglomeração, cor do tanque e confinamento

são fatores estressantes que tem provocado uma diminuição nas taxas de crescimento

entre peixes expostos (PICKERING e POTTINGER, 1987; LUMLERTDACHA et al.,

1995; PROCARIONE et al., 1999; POTTINGER et al., 2002; COTTER et al., 2005) e

que neste experimento, todos os animais, após os três primeiros dias, já se alimentavam

normalmente, equivalente ao apresentado por Anderson e colaboradores (2011). Isso

sugere que, provavelmente, a perda de peso não ocorreu pela não ingestão de alimentos,

mas sim por um maior gasto energético do animal para recuperar a homeostase.

Os comportamentos de manutenção observados foram similares aos encontrados

para H. guttulatus (FALEIRO et al, 2008) e H. erectus (ANDERSON et al, 2011).

Faleiro e colaboradores (2008) observaram que os peixes submetidos a um estresse

61

social, em tanques com maior densidade populacional, passavam menos tempo presos

ao substrato, em repouso (U = 3935.00, N1 = 120, N2 = 80, p < 0.05). Anderson e

colaboradores (2011) submeteram espécimes de H. erectus a um estresse sonoro e não

identificaram diferença para o tempo gasto pelos animais em repouso nos tanques com

ruído e sem ruído (F3,88 = 3.96, p = 0.011); em ambos os casos, os animais passavam 94

± 1 % em repouso, porém, na primeira semana, o número de ajustes no substrato nos

tanques com ruído (69±18 %) foi significativamente maior que nos tanques sem ruído

(27±7 %, F1,120 = 7.40, p < 0.01), sugerindo assim algum desconforto no animal. H.

reidi apresentou comportamento semelhante a H. guttulatus, onde animais em aquários

contendo H2O2 passaram um tempo muito maior nadando (58.6 ± 4.8 %) do que os

animais em ausência total do peróxido (12.3 ± 10.1 %); ou seja, consequentemente,

animais expostos ao H2O2 passaram muito menos tempo em repouso (Fig. 4 - A). Øverli

e colaboradores (2006), em um estudo com Oncorhynchus mykiss, observaram uma

forte correlação entre atividade locomotora em testes de estresse agudo e estresse

induzido pelo cortisol. Especificamente, o tratamento agudo de cortisol (1h) aumentou

natação e agressividade em peixe submetido a um teste de intrusão territorial, mas

nenhum efeito foi observado no comportamento de peixes sem tratamento (ØVERLI et

al, 2002). Tais dados nos mostram que mesmo as espécies agrupadas no gênero

Hippocampus sejam consideradas espécies com baixa motilidade natatória em relação

às demais espécies de peixe (FOSTER e VINCENT, 2004), tal comportamento merece

uma atenção relevante num contexto experimental ex-situ.

Clicks em cavalos-marinhos já foram descritos em vários contextos, incluindo

agressão/competição (VINCENT, 1994; OLIVEIRA et al, 2014) e alimentação

(COLSON et al., 1998; OLIVEIRA et al, 2014). Anderson e colaboradores (2011)

observaram um aumento no número de clicks em tanques com ruídos altos, que vai ao

encontro dos índices fisiológicos de aumento do estado de estresse. Esse

comportamento já havia sido relatado por Fish (1953), que observou clicks de H.

erectus em resposta a transferências para novos recipientes de água do mar e a uma

transferência rápida entre duas massas de água que diferiam na temperatura de 12 °C, o

que pode ter representado estressores agudos. H. reidi mostrou um comportamento

similar quando em contato com H2O2, onde os tratamentos com altas concentrações

apresentaram significativamente um aumento no número de clicks, indicando assim um

maior nível de estresse (Fig. 5 - B). No contexto ambiental, os clicks podem servir

62

como uma vocalização de aflição (distress) em um ambiente não favorável (Anderson et

al, 2011). Em mamíferos e aves, esse tipo de vocalização pode ser percebido em

momentos de predação, onde os animais encontram-se nas garras/boca de um predador

(HOGSTEDT, 1983), quando animais sociais são separados de seus pares ou mães e

para anunciar sua localização para indivíduos da mesma espécie, foi associado como a

resposta ao estresse fisiológico (NORCROSS e NEWMAN, 1999; STAHL et al., 2002;

FELTENSTEIN et al., 2003). A maioria das espécies de cavalos-marinhos (incluindo H.

reidi) apresenta comportamentos de animais sociais; pode ser monogâmica (VINCENT

e SADLER, 1995; KVARNEMO et al.,2000; VINCENT et al., 2005) ou poligâmica

(LOURIE et al., 1999; WOODS, 2000; KVARNEMO et al., 2000; FOSTER e

VINCENT, 2004; SILVEIRA, 2005), ou seja, estes animais podem manter o mesmo

parceiro ao longo de pelo menos uma estação reprodutiva (FOSTER e VINCENT,

2004); uma vocalização de angústia poderia servir como alerta e ser reforçada sob

estresse (ANDERSON et al, 2011).

Os comportamentos que ocorreram apenas na presença do estressor (H2O2) são

similares aos encontrados para outros peixes em estudos de estresse agudo. Foi

observada a presença de nados irregulares, semelhante ao registrado em Labeo rohita

por Dube e Hosetti (2010), onde foi testada a toxicidade do cianeto de sódio. Assim

como para L. rohita, H reidi apresentou momentos de letargia, chegando à exaustão nos

níveis de concentração mais altos de H2O2 (12781 80 µM e 11606 73 µM) (Tab.

10), seguidos intermitentemente por hiperanimação em alguns exemplares, resultando

em movimentos erráticos. Selye (1973) descreveu um estágio de alarme inicial, a fase

seguinte de resistência e fase final de exaustão, onde esta última pode ser alcançada se

as condições estressantes são graves e/ou suficientemente prolongadas. Nos mamíferos,

esta fase é caracterizada por diminuição dos níveis de cortisol, deleção de glicogênio no

fígado, imunossupressão, e outras alterações que diminuam a sobrevivência dos

organismos (HONTELA et al, 1992).

Outro comportamento é o que Anderson e colaboradores (2011) descrevem

como Pipe, que é o ato do animal pôr o focinho para fora d’água, este comportamento é

provavelmente similar em função ao que, pra outros peixes, é descrito como Gulping.

Ambos podem ajudar a evitar o contato direto com o meio tóxico e também melhorar a

63

hipóxia, fazendo uso de uma fina camada de água rica em oxigênio na superfície,

aliviando o stress respiratório (FRANCIS-FLOYD, 1988; DUBE e HOSETTI, 2010).

O Pipe foi observado para H. reidi em todos os tratamentos onde houve presença

de peróxido de hidrogênio, aumentando gradativamente à medida que aumentou sua

concentração (Fig. 5 - A), o que pode indicar um estresse/desconforto respiratório nos

níveis de maior concentração do H2O2. Em consonância a este, registrou-se o aumento

da frequência respiratória que, similar ao ocorrido para o número de pipes, também teve

um aumento de sua frequência em concentrações mais altas de H2O2 (Fig. 6 - B) em H.

reidi, esse aumento pode ser atribuído ao desconforto respiratório, como consequência

do comprometimento do metabolismo oxidativo (DUBE e HOSETTI, 2010). A

atividade respiratória de um peixe é muitas vezes a primeira resposta fisiológica a ser

afetada pela presença de contaminantes no ambiente aquático (DUBE e HOSETTI,

2010), uma vez que as brânquias são os principais órgãos respiratórios dos peixes e

todas as vias metabólicas dependem de sua eficiência para o fornecimento de energia,

nesse contexto, danos a estes órgãos vitais causam uma cadeia de eventos que, em

última análise, levam ao estresse respiratório (MAGARE e PATIL, 2000). Barreto e

Volpato (2006) em seus estudos com Oreochromis niloticus, mostraram um contexto

onde a frequência respiratória pode distinguir entre os efeitos estressores

adequadamente pela quantificação não invasiva.

O movimento de enrolar a cauda na cabeça (Fig. 6 – A), possibilitado pelas

características peculiares dos representantes inclusos no gênero Hippocampus, como a

posição da cabeça formando um ângulo reto em relação ao eixo do corpo, uma cauda

preênsil, utilizada geralmente para se prender a substratos de apoio como algas, corais e

plantas de mangue (ROBINS; RAY, 1986; SMITH, 1997; LOURIE et al., 2004;

KUITER, 2009), ainda não havia sido descrito para os cavalos-marinhos. Similarmente,

quando exposto a uma situação de manuseio por um período prolongado, H. reidi

expressa o mesmo comportamento de enrolar a cauda na cabeça (observação pessoal), o

que pode representar um comportamento agonístico.

Comportamentos de natação irregulares, hiperexcitação, disfunção respiratória,

Piping e natação na superfície da água foram observados durante a exposição ao H2O2.

Trabalhos anteriores sobre outras espécies de peixe indicam a recuperação total entre 24

horas e 7 dias (TORT et al., 2003), enquanto no presente trabalho o tempo de

64

recuperação foi de três dias. Em Salmo salar (Salmão do Atlântico) exposto ao H2O2, o

cortisol permaneceu elevado entre 6 e 12 horas pós-tratamento e voltou para estado de

normal após 24 horas (BOWERS et al., 2002). No entanto, para Dicentrarchus labrax,

após esse período os níveis de cortisol continuavam altos (ROQUE et al, 2010). Essa

diferença pode ser explicada pelo tempo de exposição a que Salmo salar (20 min) e

Dicentrarchus labrax (60 min) a que foram expostos ao H2O2, este último com tempo

de exposição igual a este estudo. Mansell e colaboradores (2005) sugerem ainda que os

efeitos agudos do banho contendo peróxido de hidrogênio são menos prejudiciais para o

peixe do que os efeitos de infecção crônica persistente.

65

6. CONCLUSÕES

Os resultados deste estudo utilizando como modelo cavalos-marinhos indicaram

que H2O2 tem potencial para ser usado em tratamento por imersão (banho) em H. reidi,

tendo em vista que concentrações abaixo de 12.5ml/L mostraram-se seguras em um

período de 60 min de exposição para a espécie. Trabalhos com outras espécies de peixes

ornamentais mostraram que concentrações de H2O2 acima de 3,1ml/L podem ser

utilizadas para tratar bactérias externas e concentrações superiores a 6,5ml/L, podem ser

utilizadas no tratamento de Ichthyobodo spp. (parasita externo). Entretanto, os efeitos

tóxicos do H2O2, para H. reidi, podem ter causado as mortalidades observadas nas

concentrações iguais/superiores a 13.75ml/L nos tratamentos. Essas concentrações

devem ser evitadas, embora mais testes sejam justificados.

Para além dos resultados específicos obtidos neste estudo, destaca-se a

importância do comportamento animal como ferramenta relevante e útil para o

aprimoramento da aquicultura. As alterações registradas no presente trabalho mostraram

que o peróxido de hidrogênio é tóxico e que teve profundo impacto sobre o peso,

comportamento e frequência respiratória em H. reidi, nas concentrações letais e

subletais.

Nessa mesma direção, a disfunção registrada de comportamento e respiração é

um sinal importante e visualmente observável, como método não invasivo, do índice de

toxicidade por H2O2. Assim, estudos etológicos mostram-se como importantes aliados

para ampliar a compreensão acerca do estresse oxidativo provocado pelo H2O2 no

metabolismo dos peixes.

66


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73

CAPÍTULO III - ESTUDO INICIAL SOBRE A UTILIZAÇÃO DA Mn-PORFIRINA

(MnTE-2-PYP5+

) COMO REGULADOR REDOX CATALÍTICO EM

HIPPOCAMPUS REIDI GINSBURG, 1933 (TELEOSTEI SYNGNATHIDAE)

1. INTRODUÇÃO

Na aquicultura de modo geral, é comum o manuseio dos peixes para diversos

fins, como a medição, amostragem, marcação, transporte, entre muitos outros. Essas

manipulações frequentemente induzem uma resposta primária de estresse, marcada pelo

crescimento do cortisol plasmático e concentrações de glicose, podendo levar a

resultados indesejáveis como imunossupressão e retardo do crescimento (GRUTTER e

PANKURST, 2000; TREVES-BROWN, 2000; ROTLLANT et al, 2001; WEBER et al,

2009; HEO e SHIN, 2010). Respostas secundárias de estresse, que incluem alterações

no plasma, nos níveis dos metabólitos, nos íons dos tecidos, nas características

hematológicas e nas proteínas de choque térmico ou de tensão (PCT), todas

relacionadas com os ajustes fisiológicos, como o metabolismo, a respiração, o estado

ácido-base, equilíbrio hidromineral, função imune e respostas celulares (PICKERING,

1981; IWAMA et al., 1997, 1998; MOMMSEN et al., 1999) e respostas terciárias como

alterações no crescimento, condição resistência total à doença, o escopo para a atividade

metabólica, comportamento, e em última análise, a sobrevivência, resumidamente,

aspectos do desempenho de todo o animal (WEDEMEYER e MCLEAY, 1981;

WEDEMEYER et al., 1990) ainda podem ocorrer, dependendo da intensidade e duração

do stress. Essas respostas afetam os peixes em todos os níveis de organização, desde

molecular e bioquímica à população e comunidade (ADAMS, 1990). Dhabhar e

Mcewen (1997) definem stress como uma constelação de eventos, que começa com um

estímulo (estressor), que precipita uma reação no cérebro (percepção de stress), que

subsequentemente resulta na ativação de certos sistemas fisiológicos no corpo (resposta

ao stress).

O estresse também pode resultar como uma consequência de outros fatores

ambientais, incluindo condições adversas de temperatura, salinidade, pH ou oxigênio

dissolvido (FLOS et al., 1988). Esse estado põe em risco a homeostase, que pode se

restabelecer através de um conjunto complexo de respostas adaptativas (CHROUSOS,

74

1998). Barton et al. (1986) e Flos et al. (1988) sugerem um efeito aditivo ou uma

respostas fisiológicas cumulativa ao estresses. Se a intensidade do estressor é

excessivamente severa ou duradoura, os mecanismos de resposta fisiológica podem ser

comprometidos e tornar-se prejudiciais para a saúde e bem-estar dos peixes. Minimizar

fatores que levem esses animais a essa má adaptação são de grande interesse dos

gestores e aquicultores (SELYE, 1974; BARTON e IWAMA, 1991; BARTON, 2002).

1.1. O Estresse Oxidativo

A produção de ATP (Adenosina Trifosfato) nas mitocôndrias está ligada

diretamente ao O2 que é absorvido pelos organismos, bem como está envolvida no

grupo heme e na biossíntese dos centros de ferro-enxofre, de aminoácidos e do

metabolismo do nitrogênio, e na modulação da homeostase do cálcio (STOREY, 1996;

SCHEFFLER, 1999; MURPHY e SMITH, 2000; NICHOLLS e FERGUSON, 2002).

Mais de 90% de todo o oxigênio absorvido pelo corpo humano é usado na citocromo

oxidase que acrescenta quatro elétrons em cada molécula de O2 para formar água (O2 +

4H+ + 4e

- → 2 H2O) (HALLIWELL, 1992).

A cadeia respiratória mitocondrial é a maior fonte de superóxido (O2-), podendo

formar outras espécies reativas de oxigênio (ROS), como peróxido de hidrogênio

(H2O2), o radical hidroxila (OH.), e peroxinitrito (ONOO

-). Outros componentes

enzimáticos dentro da mitocôndria podem formar ROS (FINKEL, 2011; MURPHY,

2009). ROS são muitas vezes gerados na fase aquosa de plasma, por exemplo, O2 e

H2O2 pode surgir a partir de enzimas, compostos oxidantes e células fagocíticas ativadas

(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989). Todos os componentes celulares são

susceptíveis ao ataque por ROS (O2, H2O2 e .OH), particularmente por

.OH (STOREY,

1996). Danos oxidativos patológicos para as mitocôndrias em doenças e envelhecimento

são consequências da produção de ROS, embora haja muitas respostas protetoras e

adaptativas para prevenir e reparar os danos oxidativos (WALLACE, 1999;

SHIGENAGA et al, 1994).

O ânion superóxido é desintoxicado pela Mn superóxido dismutase mitocondrial

(MnSOD) ou pela SOD citoplasmática (Cu,ZnSOD) para o peróxido de hidrogénio

(H2O2), e H2O2 é convertido em H2O pela glutationa peroxidase (GPx) (WALLACE,

1999):

75

O2 + e- → O2

- superoxido

O2- + e

- + 2 H

+ → H2O2 peróxido de hidrogênio

H2O2 + e- + H

+ → H2O +

. OH

radical hidroxila

.OH + e

- + H

+ → H2O

A redução de H2O2 por superóxido (a reação de Haber-Weiss) produz a maior

parte dos radicais hidroxila in vivo. O H2O2, na presença de metais de transição

reduzidos (Fe2+, algumas vezes Cu+), pode ser convertido também no radical hidroxila

(OH.), que é altamente reativo, pela reação de Fenton.

Fe3+

+ O2- → Fe

2+ + O2

Fe2+

+ H2O2 → Fe3+

+ OH- +

. OH Reação de Fento

O2- + H2O2 → O2 + OH

- +

. OH Reação de Haber-Weiss

O estresse oxidativo é caracterizado por um desequilíbrio celular no qual os

níveis normais de oxidantes (espécies reativas) predominam sobre os níveis normais de

antioxidantes (endógenos), ocasionando, eventualmente, danos oxidativos. Este

desequilíbrio tem implicação em uma série de doenças e estados fisiopatológicos que

compreendem desde processos inflamatórios simples, a doenças neurodegenerativas e

até mesmo o câncer (BATINIĆ-HABERLE et al, 2010).

Mn-porfirinas têm se destacado em estudos pré-clinicos como uma das classes

mais importantes classes de reguladores redox catalíticos e encontram-se hoje entre uns

dos melhores modelos biomiméticos das enzimas SOD (TSE et al, 2004; MOELLER et

al, 2004; ZHAO et al, 2005; REBOUÇAS et al, 2008a). Estudos in vivo com Mn-

porfirinas apareceram há apenas alguns anos, mas os resultados em diversos modelos

animais de fisiopatologias de caráter oxidativo têm sido excelentes (ASLAN et al, 2001;

PIGANELLI et al, 2002; BENOV et al, 2005; CROW et al, 2005; CSONT et al, 2005;

WU et al, 2007; GAUTER-FLECKENSTEIN et al, 2008; REBOUÇAS et al, 2008b;

SOMPOL et al, 2008). Entre as Mn-porfirinas que se destacam nesses estudos,

encontram-se a meso-tetraquis (N-etilpiridinio-2-il)porfinatomanganês(III) (MnTE-2-

PyP5+

) e a meso-tetraquis(N-hexilpiridinio-2-il)porfinatomanganês(III) (MnTnHex-2-

PyP5+

) (BATINIĆ-HABERLE et al, 2010).

76

2. OBJETIVOS

2.1. Geral:

Verificar se a Mn-porfirina MnTE-2-PyP5+

(MnP) é um antioxidante catalítico

em potencial para manutenção e cultivo de H. reidi;

2.2. Específicos:

Avaliar se MnP é capaz de minimizar os impactos causados por tratamentos de

altas concentrações de H2O2 em H. reidi;

Mensurar, de forma preliminar, tempo de exposições e concentrações ideais e/ou

mínimas para que MnP traga benefícios a saúde de H. reidi, através de um

estudo etológico;

77





constantemente. As variáveis de temperatura, salinidade e pH foram mantidas em 25°C,

27ppm e 8.2 respectivamente. Os demais parâmetros químicos da água NH3, NO2 foram


variando entre: 0 – 0,25 (KOLDEWEY, 2005). Foi estabelecido também um fotoperíodo

de 10L : 14E, utilizando luz branca fria acima dos tanques, com intensidade luminosa de

cerca de 500lx na superfície da água.

3.2. Metodologia do Desenho Experimental: Matrizes Doehlert

Um desenho experimental é o meio mais eficiente para chegar a conclusões com

um mínimo de ensaios e a utilização de técnicas de desenho experimental multivariados

vem sendo cada vez mais difundido em vários campos de pesquisa (BENSALAH et al,

2010). Neste experimento, foi usado um design Doehlert. Matrizes Doehlert

(DOEHLERT, 1970) apresentam a vantagem de, através de poucos experimentos, varrer

de forma mais eficiente todo o domínio experimental, considerando a interação entre as

variáveis (QUIGNON et al., 1997). O design Doehlert também tem vantagens sobre

outros modelos (como Central Composite (CCD), Box–Behnken e Plackett-Burman),

devido à possibilidade de aumentar o domínio experimental por adição de outro fator,

sendo mais eficientes e podendo mover-se através do domínio experimental (KIRAN et

al, 2010; SAUTOUR et al, 2001), considerando também o efeito das interações entre as

variáveis (KIRAN et al, 2010). Outras vantagens das Matrizes Doehlert são: (1)

apresenta um domínio experimental esférico com uma uniformidade no espaço

experimental, (2) a sua capacidade de explorar a totalidade do domínio, e (3) o seu

potencial de reutilização consecutiva, onde os experimentos podem ser reutilizados

quando os limites não foram bem escolhidos inicialmente (BENSALAH et al., 2010).

78

Este desenho experimental permitiu não só a avaliação da influência relativa dos

parâmetros testados a baixo custo (necessidade de 13 combinações no lugar de 81 para

um design clássico completo, onde seria usado 3 posições (valores) para cada uma das

três variáveis testadas), mas também para determinar as interações inesperadas entre

alguns destes parâmetros.


A matriz Doehlert foi aplicada para encontrar uma tendência a uma possível

diminuição do estresse oxidativo em H. reidi. O número de experimentos necessários

(N) é dado por N = n + n2 + n0, onde “n” é o número de variáveis e “n0” é o número de

pontos centrais. Neste experimento, o valor “n0” foi fixada em 2, assim, com três fatores

(concentração de MnTE-2-PyP5+

, concentração de peróxido de hidrogênio e tempo de

exposição MnTE-2-PyP5+

), o total de pontos na matriz foi 13 (Fig. 1). As réplicas

Doehlert foram realizadas no nível central das variáveis a fim de validar o modelo por

meio de uma estimativa de variância experimental.

Figura 1. Cuboctaedro apresentando a localização dos pontos (13) experimentais para três diferentes

fatores codificados (X1, X2 e X3). Foram obtidos: ao longo do eixo X2, em um trecho mediano, seis

experimentos localizados nos vértices (2, 3, 5, 6, 8 e 11) e um no centro de um hexágono, em ambos os

lados; três experimentos (4, 12 e 13) estão localizados no trecho superior e outros três experimentos (7, 9

e 10) em trecho menor.

(X2)

(X2)

(X3)

(X3)

79

Os experimentos foram feitos utilizando soluções estoque de H2O2 a 3% de

ingrediente ativo (Rioquímica) e concentração de 882 mM e de Mn-porfirina - Mn(III)

meso-tetraquis(N-etilpiridinio-2-il)porfirina - de concentração igual a 1,99 mM.

A Mn-porfirina (MnP) foi estudado em cinco níveis, o peróxido de hidrogênio

em sete e o tempo de exposição ao MnP em 3, com seus domínios experimentais

definidos entre: 0-10 µM (MnP), 0-654 µM (H2O2) e 0-60 min (exposição ao MnP). As

concentrações de H2O2 testadas foram determinadas com base nos experimentos do

Capítulo 2.

O desenho experimental Doehlert é a distribuição uniforme dos experimentos

em um espaço tridimensional (SAUTOUR et al., 2001). Assim, 12 experimentos são

equidistantes a partir de um experimento central, tendo os valores codificados (0, 0, 0) e

são distribuídos sobre uma esfera com um raio de 1 (Fig. 1). As variáveis experimentais

Xi foram codificados como xi de acordo com o trabalho de Sena et al (2012), uma vez

que para configurar ambos, modelo e os experimentos, é necessário utilizar os valores

iniciais e os valores codificados correspondentes a estes (Tabela 1), através da seguinte

equação:

xi = ((Xi – X0i) / ΔXi)*αi

Onde “xi” é o valor codificado da variável “i”, Xi é o valor natural, X0i é o valor

no ponto central, ΔXi é o valor mudança, e αi é o valor máximo da variável codificada

(ou seja, 1,0, 0,866 e 0,816 por cinco, sete e três níveis, respectivamente) (KANARAM

e MEDICHERLA, 2010) (Tabela 2).

Foram selecionados 14 animais com altura média e peso úmido equivalente a

15.7 g (±1.9) e 12,2 g (±1,2), respectivamente, provenientes da população estoque para

cultivo experimental do LAPEC (Laboratório de Peixes – Ecologia e Conservação),

Universidade Federal da Paraíba, Brasil. Os animais tiveram o comprimento estimado

com auxílio do software gratuito UTHSCSA Image Tool (WILCOX et al., 2002) e o

peso aferido com uma balança milesimal (Bel M-333).

Os tratamentos e durações foram concebidos com base na Matriz Doehlert

(Tabela 2), seguindo o mesmo princípio dos experimentos do Capítulo 2 desta

dissertação, que foram baseados em protocolos que podem ser facilmente aplicadas em

explorações agrícolas comerciais (GAIKOWSKI et al. 1999; A U. S. Food and Drug

80

Administration – EUA, 2002; YANONG, 2014): 60 minutos de imersão em diferentes

concentrações de H2O2, precedido por exposição de 0,35 ou 60 minutos de MnP..

Foi preparado um sistema de exposição que consiste em 1 aquários aquário

pequeno de 140ml (7 x 4 x 8cm) com oxigenação constante para o tratamento com MnP

e um aquário maior, de 20L (21 x 36 x 30cm) com recirculação contínua da água

(Submersible Pump SP-2500, Boyu), para homogeneização do peróxido de hidrogênio e

constante oxigenação, e um substrato de apoio (Fig. 2). Todos os experimentos

ocorreram entre as 11:00am e 18:00pm, uma vez que sabe-se que a frequência

respiratória em peixes se alteram ao longo do dia (BARRETO e VOLPATO, 2006).

Tabela 1: Valores originais e os valores correspondentes codificados para os experimentos com H. reidi

em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Variáveis

independentes

Valores codificados e naturais

-1 -0.866 -0.816 -0.577 -0.5 -0.289 0 0.289 0.5 0.577 0.816 0.866 1

V. MnP (μl/mL) X1 0

177

352.00

528

703

V. H2O2 (ml/L) X2

0

50

100 150.00 200

250

300

TEMnP (min) X3

10

35

60

Tabela 2: Matriz experimental obtida pela metodologia de desenho experimental Doehlert por três

fatores. Valores experimentais H. reidi em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Experimentos

Valores codificados Valores naturais Concentrações

utilizadas

X1 X2 X3

V. MnP

(μl)

V. H2O2

(ml/L)

TEMnP

(min)

[MnP]

(Mol/L)

[H2O2]

(mM)

1 0 0 0

352 150 35

0.00199 872

2 0 -0.577 -0.816

352 50 10

0.00199 872

3 +1 0 0

704 150 35

0.00199 872

4 0 +0.577 +0.816

352 250 60

0.00199 872

5 -1 0 0

0 150 35

- 872

6 -0.5 -0.866 0

176 0 35

0.00199 -

7 +0.5 -0.866 0

528 0 35

0.00199 -

8 +0.5 -0.289 +0.816

528 100 60

0.00199 872

9 -0.5 -0.289 +0.816

176 100 60

0.00199 872

10 -0.5 +0.289 -0.816

176 200 10

0.00199 872

11 +0.5 +0.289 -0.816

528 200 10

0.00199 872

12 +0.5 +0.866 0

528 300 35

0.00199 872

13 -0.5 +0.866 0 176 300 35 0.00199 872

81

Os animais foram expostos, um por vez, a diferentes concentrações de MnP

(0μl/ml, 1.26μl/ml, 2.51μl/ml, 3.77μl/ml e 5.03μl/ml) no aquário menor por um

determinado tempo (10, 35 e 60 minutos) e, em seguida, transferidos para o aquário

maior contendo diferentes concentrações de H2O2 (0 µM, 218 µM, 545 µM, 599 µM,

654 µM) (Tabela 2), onde permaneceram por 60 minutos. A transferência entre o

aquário menor e o aquário maior não excedeu 10 segundos, não houve contato algum

com os animais no processo.

Observações de aspectos biométricos, saúde e comportamento dos animais

foram realizadas. Para quantificação da concentração de H2O2 nos aquários, foi retirada

uma alíquota de água, no início e no final de cada experimento e medido a sua

absorbância em um período máximo de 40 minutos, seguindo o método I3-

de acordo

com a fórmula e procedimento usual (ALLEN et al, 1952; KLASSEN et al, 1994).

Foi utilizada uma solução de H2O2 a 3% de ingrediente ativo (Rioquímica). Toda

a água utilizada no experimento passou por filtragem mecânica (Manta Acrílica –

Perlon e Malha 150µm) e ultravioleta (Filtro UV Atman-36W), utilizado comumente

para controle de organismos planctônicos e microrganismos em sistemas de cultivo

fechado, antes de cada experimento.

Figura 2. Sistema experimental com recirculação contínua de água, utilizada para exposição de H. reidi a

diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio e MnP. 1: saída de água do aquário; 2: entrada de

água no aquário; 3: bomba de recirculação de água; 4: substrato de apoio; 5: Mesa; 6: cadeira para apoio

do aquário com bomba de recirculação; 7: Aquário menor para exposição ao MnP; 8: Aquário maior para

exposição ao H2O2.

8

8

82

3.3. Análise comportamental

Os experimentos foram realizados com uma população de H. reidi clinicamente

saudável (ou seja, não haviam parasitas externos observados na pele, nadadeiras e

brânquias; sem lesões externas; comportamento e alimentação normal; nenhuma

mortalidade ou morbidade conhecida ou observada). Os animais foram filmados (HDR-

XR160, Sony) e monitorados em todo o período de 60 minutos no aquário maior para

análise comportamental e posterior contagem dos batimentos operculares por minuto

(BARRETO e VOLPATO, 2006; TANTARPALE et al, 2012; AURÉLIO, 2012),

utilizando-se de métodos não invasivos para mensurar o estresse oxidativo. Além disso,

a cada 10 min durante o período do experimento (60min), o número total do tempo que

os peixes passaram no fundo, em natação, em repouso, em exaustão e preso no substrato

foi mensurado, bem como a frequência total de movimentos natatórios horizontais, no

fundo, verticais e totais, a frequência de clicks e gapes e a frequência de batimentos

operculares/min foram aferidos. Movimentos típicos de estresse em peixes também

foram observados.

As medidas comportamentais foram escolhidas para análise com base nos

experimentos do capítulo anterior, são elas:

A proporção do tempo gasto por cada animal, na parte inferior do tanque;

A proporção do tempo gasto por cada animal nadando;

A proporção de tempo gasto por cada animal em repouso (estacionário);

A proporção de tempo que o animal gasto pelo animal aderido ao substrato

(segurando/preso sobre apoio) contra o tempo total que o animal estava em

repouso;

A proporção do tempo gasto por cada animal em exaustão;

A frequência de movimentos de natação (horizontal, vertical e no fundo do

aquário);

A frequência de comportamentos característicos de estresse em peixes;

Número de Clicks;

Número de Pipes;

Número de Gapes;

Número de Batimentos Operculares por minuto.

83

Os comportamentos foram descritos seguindo os resultados do Capítulo 2, onde

foi possível descrever quais seriam os comportamentos de manutenção e de estresse

para H. reidi. Nele, os comportamentos que ocorreram tanto na ausência de qualquer

estímulo externo (adição de H2O2) como na presença, foram classificados como

comportamento de manutenção (Tab. 3), são eles: presença dos animais na parte

inferior do aquário, comportamentos de nado (horizontal, vertical e no fundo), repouso

(estacionário) do animal no fundo do aquário e/ou aderido ao substrato

(segurando/preso sobre apoio), Clicks e Gapes. Para este caso, foi medida a alteração do

tempo gasto realizando estas ações e/ou sua frequência em relação aos animais controle.

A posição é um artifício de confinamento e não são traduzíveis para o comportamento

do cavalo-marinho em estado selvagem, porém, em um ambiente de aquário, cavalos-

marinhos podem posicionar-se em zonas mais calmas do aquário (ANDERSON et al,

2011), assim foi incluída, quantificada e analisada. Nesse mesmo sentido, os

comportamentos que só ocorreram na presença do peróxido de hidrogênio, foram

categorizados como comportamentos de estresse (Tab. 4) para H. reidi, com base na

literatura de comportamentos semelhantes descrito para outras espécies de peixes

(FRANCIS-FLOYD, 1988; BARRETO e VOLPATO, 2006; DUBE e HOSETTI, 2010;

ANDERSON et al, 2011).

Tabela 3: Etograma dos dados comportamentais de estresse em H. reidi.




Exaustão

Quando ocorre à perda da capacidade de realização de ações, onde o animal fica a

deriva no aquário.

Locomoção


Nados

irregulares

Os animais demonstram movimentos de natação irregulares, erráticos e

dardejantes, seguidos de perda de equilíbrio, podendo ou não serrem

acompanhados do peixe ficar "pendurado" verticalmente na água.

Movimentos da

cabeça


Pipe

O focinho do animal rompe a superfície da água enquanto os movimentos

operculares continuam.

Cauda

enrolada na

cabeça

O animal enrola, insistentemente, a cauda na cabeça e/ou partes da mesma.

84

Tabela 4: Etograma dos dados comportamentais de manutenção em H. reidi.


Comportamento manutenção


Topo

Quando o corpo do animal se localiza em sua maior perção, na metade superior da

altura vertical do tanque;

Fundo

Quando o animal está localizado, em sua maior porção, na metade inferior da altura

vertical do tanque;

Estacionário

Posturas enquanto estiver parado

Empoleirado

O animal está em repouso no tanque, aderido ao substrato.

Sentado

O animal está em repouso no fundo do tanque, livre do substrato. Cabeça e tronco

estão em uma posição vertical.

Locomoção


Nado

horizontal

Animal se desloca na horizontal, lateralmente, através da água em uma posição vertical

ou horizontal, nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em movimento ondulatório. A

cauda pode ser ondulada ou para a frente, estendendo-se abaixo ou atrás do animal.

Nado

vertical

Animal se desloca na vertical, através da coluna d'água em uma posição vertical,

nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em movimento ondulatório. A cauda pode ser

ondulada ou para a frente, estendendo-se abaixo ou atrás do animal.

Nado no

fundo

O animal atravessa o fundo do tanque com o tronco em posição vertical ou

obliquamente na posição vertical, nadadeira peitoral e barbatanas dorsais em

movimento ondulatório. A cauda arrasta na parte inferior, estendida por trás do animal.

Movimentos

da cabeça


Click

A cabeça se inclina para cima instantaneamente, o hioide se sobressai e a boca está

aberta. Associado a um som de clique.

Gape

O animal abre a boca lentamente, com a cabeça um pouco inclina para cima e o hioide

se projeta. Não há som de clique.

85

3.4. Medição Óptica





soluções se igualem as do espectrofotômetro. Todas as medições de absorbância foram

feitas dentro da faixa de 24-25 C.





A = bc


Os resultados foram processados em planilhas eletrônicas, utilizando-se do

software Excel® da Microsoft para realizar cálculos de planejamentos fatoriais e

otimização empregando Metodologias de Superfície de Resposta (RSM), desenvolvidos

por Teófilo e Ferreira (2006), que tem seus resultados e cálculos validados através dos

softwares Matlab 6.5 e Statistica 6.0.

Todos os testes foram considerados significativos quando seus resultados

demonstraram um nível de p ≤ 0,05. Dados referentes às análises são apresentados na

forma de média ± erro ou porcentagem ± erro padrão.

86

4. RESULTADOS

Os resultados das análises de regressão múltiplas que forneceu as estimativas

dos coeficientes do modelo estão listadas na Tabela 3. Os coeficientes de regressão, r2,

foram iguais a 0.903, 0.901 e 0.895 (Fig. 3), respectivamente, para o tempo gasto pelo

animal nadando, em repouso e a frequência de comportamentos típico de estresse;

portanto, cerca de 90% da fração da variação em torno da média, para estes parâmetros,

pode ser explicada pelos modelos (BOX e DRAPER, 1987). A variável ganho/perda de

peso do animal e as variáveis comportamentais de cauda enrolada, nados irregulares,

click e batimento opercular, apresentaram r2

com valores de 0.800, 0.771, 0.753, 0.800,

0.672. Isso claramente pode ser comprovado uma vez que o coeficiente de resposta, b0,

apresenta os mesmos valores experimentais obtidos quando todos os fatores são

ponderados com o nível codificada em 0, ou seja, b0 = Condição Experimental 1 da

Tabela 2. Nesse sentido, quanto maior for o valor absoluto dos coeficientes lineares, b1,

b2 e b3, mais importante foi a variável que influenciou a resposta.

Figura 3. Gráficos dos coeficientes de regressão para os experimentos utilizando H2O2 como estressor

em H. reidi (n = 14) e a MnP como antioxidante em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.. A:

Tempo de Nado; B: Tempo em Repouso; C: Frequência dos comportamentos totais de estresse.

Figura 3. Gráficos dos coeficientes de regressão para os experimentos utilizando H2O2 como estressor em H. reidi

e a MnP como antioxidante. A: Tempo de Nado; B: Tempo em Repouso; C: Frequência dos comportamentos totais

de estresse.

87

Similar aos observado nos experimentos do Capítulo 2, o peróxido de

hidrogênio (b2) foi a substância que causou maior impacto sobre as variáveis estudadas

(Tabelas 5, 6 e 7), influenciando de forma negativa ao bem-estar do animal em todos os

parâmetros testados. A segunda variável que teve maior influência foi o tempo de

exposição do animal ao MnP (b3), seguido da concentração de MnP (b1). O animal

perde peso com o aumento da concentração de H2O2 (0-654 µM) e tende a ganhar com o

aumento da concentração de MnP (0-10 µM) a que será exposto e com o aumento do

tempo de exposição ao mesmo (0-60min) (Tabela 5). Todas as variáveis para esse

parâmetro apresentaram um efeito quadrático (Tabela 5). Este resultado sugere que,

dependendo dos valores dos parâmetros, o valor ótimo para essas variáveis está dentro

do desenho amostral estudado. Foi demonstrada também uma interação significativa

entre [MnP] e [H2O2] (b12), [MnP] e tempo de exposição ao mesmo (b13), [H2O2] e

tempo de exposição ao MnP (b23) (Fig. 4). Esses valores sugerem uma influência

sinérgica de ambas as variáveis sobre ganho/perda de peso nos animais, com destaque

para b13 que proporciona um ganho de peso em até 923.1±55.1 mg (t = 16.75, p <

0.004) (Tabela 5).

Para o parâmetro locomoção, temos que aumento da concentração de H2O2 (0-

654 µM) e do tempo de exposição ao MnP (0-60min) tendem a tornar o animal mais

agitado, aumentando em até 28 e 16% o tempo que o animal está nadando e,

consequentemente, diminui o tempo do animal em repouso em -29 e -16%,

respectivamente (Tabela 7). O aumento da concentração de MnP (0-10 µM) não se

demonstrou significativa, no entanto, foi observado um efeito quadrático para esse

parâmetro (Tabela 7).

Os comportamentos descritos como comportamentos de estresse no Capítulo 2,

apresentaram-se em menor frequência que no capítulo anterior, uma vez que os valores

aqui achados, em alguns casos, como os da frequência de pipe e exaustão não se

mostraram suficiente para os testes. Quanto aos demais comportamentos, como a

frequência de Nados Irregulares e frequência de vezes que o animal enrolou a cauda na

cabeça, é interessante notar o efeito sinérgico presente, onde em ambos os casos,

novamente b13 mostrou uma mitigação desses comportamentos, chegando a diminuir a

frequência em até -2.9 ±0.1 e -4.5 ±0.5, respectivamente (Tabela 6). Esse efeito se torna

ainda mais claro quando observamos a frequência de movimentos totais de estresse,

88

uma vez que b13 apresentou uma diminuição nesse parâmetro ainda maior, de -8.7±2

(Tabela 6).

Os clicks, diferente do que se esperava, mostraram resultados semelhantes entre

as variáveis, onde b1, b2 e b3 proporcionaram um aumento na sua frequência em 1.2

±0.1, 1.9±0.1 e 1.5 ±0.1, respectivamente (Tabela 6). Com um efeito quadrático em b22

e b33. Também apresentou interação significativa em b23, com um aumento em até

4.1±0.3 na frequência de clicks (Tabela 6). No entanto, vale notar que por se tratar de

um estudo inicial, mesmo não tendo a significância estipulada, as sinergias entre b12 e

b13 não devem ser ignoradas, uma vez que estão próximos a esta, onde b12 apresentou

uma diminuição na quantidade de clicks (-0.7 ±0.3, t = 3,46, p = 0,07) e b13 um aumento

de 1 ±0.3 (t = 3,97, p < 0,06) (Tabela 6).

Os batimentos operculares aumentaram sua frequência em b2 (8.06±0.82) e b3

(4.83±0.82), uma vez que para esses valores, os animais também ficavam mais agitados

(Tabela 6). Todas as variáveis para esse parâmetro apresentaram um efeito quadrático,

com destaque para b2, onde o efeito quadrático apresentou um valor negativo (-

7.11±1.49), contrário ao seu valor quando consideramos só a variável linear (Tabela 6).

89

Tabela 5: Os coeficientes dos modelos obtidos para os dados biométricos em H. reidi (n = 14) em

condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Respostas Coeficiente

Biometria

Ganho/Perda de

Peso (mg)

b0 323.3 ± 24.7**

MnP b1 205.1 ± 21.4**

H2O2 b2 -4519.7 ± 21.4**

TEMnP b3 170.1 ± 21.4**

MnP 2 b11 -1031.3 ± 39.0**

H2O2 2 b22 -8398.8 ± 39.0**

TEMnP 2 b33 1551.9 ± 37.0**

MnP.H2O2 b12 -1038.7 ± 49.3**

MnP.TEMnP b13 923.1 ± 55.1**

H2O2.TEMnP b23 -2909.3 ± 55.1**

Tabela 6: Os coeficientes dos modelos obtidos para os Movimentos de estresse e de cabeça para H. reidi

(n = 14) em condições controladas, LAPEC, Brasil, 2015.

Respostas Coeficiente

Mov. de Estresse Mov. Cabeça

FCEC FNI FET

Clicks BO

b0 0.2 ± 0.2 0.1 ± 0.1 1.8 ± 0.9

0.7 ± 0.1** 38.4 ± 1**

MnP b1 0.4 ± 0.2 0.4 ± 0.1** 1.6 ± 0.8

1.2 ± 0.1** -1.8 ± 0.8

H2O2 b2 2.7 ± 0.2** 1.6 ± 0.1** 4.5 ± 0.8**

1.9 ± 0.1** 8.1 ± 0.8**

TEMnP b3 1.5 ± 0.2** 0.9 ± 0.1** 4 ± 0.8**

1.5 ± 0.1** 4.8 ± 0.8**

MnP 2 b11

-0.2 ± 0.4 -0.1 ± 0.1 3.6 ± 1.4

0.5 ± 0.2 5.6 ± 1.5

H2O2 2 b22

3.0 ± 0.4** 1.9 ± 0.1** 4.6 ± 1.4

4.0 ± 0.2** -8.1 ± 1.5**

TEMnP 2 b33

1.4 ± 0.3** 0.5 ± 0.1** 3.7 ± 1.3

2.6 ± 0.2** 5.5 ± 1.4

MnP.H2O2 b12 4.7 ± 0.5** 3.5 ± 0.1** 12.1 ± 1.8**

-0.8 ± 0.2 3.3 ± 1.9

MnP.TEMnP b13 -4.5 ± 0.5** -2.9 ± 0.1** -8.7 ± 2**

1.0 ± 0.3 -2.6 ± 2.1

H2O2.TEMnP b23 2.3 ± 0.5** 2.2 ± 0.1** -0.9 ± 2 4.1 ± 0.3** 1.6 ± 2.1

Valores com ** são significativos (p ≤ 0,05).

TEMnP, Tempo de exposição de H. reidi ao MnP; FCEC, Frequência de vezes que o animal enrolou a

cauda na cabeça; FNI, Frequência dos Nados Irregulares; FET, Frequência dos Movimentos de estresse

totais; BO, Frequência dos Batimentos Operculares.

91

Figura 4. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 no Ganho/Perda de peso de H. reidi (n = 14)

30 dias após o experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil, 2015.

Figura 5. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 no tempo gasto por H. reidi (n = 14) em

repouso durante o experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil, 2015.

Figura 6. Superfície de resposta e valores de MnP vs. H2O2 na taxa respiratória de H. reidi durante o

experimento, em condições controladas. LAPEC, Brasil, 2015.

92

5. DISCUSSÃO

As análises e parâmetros comportamentais foram selecionadas e realizadas com

base nos resultados dos estudos já apresentados anteriormente no Capítulo 2 e na

bibliografia (ØVERLI et al, 2002; BARRETO e VOLPATO, 2006; FALEIRO et al,

2008; ANDERSON et al, 2011). Por outro lado, no presente estudo, um desenho

experimental foi usado para avaliar a influência das variáveis independentes sobre o

bem-estar dos animais, sob uma nova abordagem para mensurar o efeito combinado de

diferentes concentrações de MnP (b1) e H2O2 (b2), e variados tempos de exposição de H.

reidi ao MnP (b3), por meio de um estudo comportamental associado.

O cortisol é, sabidamente, conhecido por diminuir a ingestão de alimentos em

animais expostos, reduzindo seu peso (STEVENS, 1972; GREGORY e WOOD, 1999).

Os experimentos realizados neste capítulo reforçam os resultados do Capítulo 2, uma

vez que o desenho experimental demonstrou que o H2O2 em altas concentrações possui

um efeito nocivo ao animal (Tabelas 5, 6 e 7). É interessante notar também que b1 e b3,

de forma isolada, ocasionaram um ganho no peso do animal e sua interação (b13) em

condições máximas de concentração e tempo de exposição ao MnP apresentou um sinal

de ganho de peso ainda maior (Tabela 5), indicando que para esse parâmetro, o MnP se

mostrou benéfico. Sua interação com H2O2 também demonstrou resultados satisfatórios,

uma vez que tanto b12 quanto b23 apresentaram uma perda de peso menor quando em

condições máximas do que se esperaria da variável H2O2 isoladamente (Fig. 4).

Um padrão semelhante também foi observado para outros parâmetros quando

consideramos as variáveis isoladas. Parâmetros como o tempo gasto nadando e em

repouso (Fig. 5), e nas frequências de movimentos típicos de estresse como enrolar a

cauda na cabeça, os nados irregulares e a soma dos movimentos totais de estresse, bem

como na frequência dos batimentos operculares (Fig. 6), mostraram que um aumento

em suas frequências (e diminuição, no caso do repouso) quando o H2O2 é avaliado de

forma isolada (b2) e uma diminuição em relação a b2 desses valores em b1 e b3 e, quando

observamos a interação entre as variáveis, os movimentos típicos de estresse se

destacam, por praticamente inexistirem em b13 (Tabelas 6 e 7). Em nenhum dos casos

anteriores, b12 e b23 se mostraram benéficos, o que pode indicar que as concentrações

utilizadas de MnP ou o tempo de exposição ao mesmo, não foram suficientes para

93

antagonizar os efeitos nocivos dessas altas concentrações de H2O2 em um primeiro

momento, porém, o ganho de peso dos animais após 30 dias de experimento pode

demonstrar que houve uma minimização desses efeitos nocivos a longo prazo. Vale

mencionar que nos experimentos do capítulo anterior, após 30 dias, não foi observado

ganho de peso em nenhum animal exposto ao H2O2.

O número de Clicks não pareceu se diferenciar quando consideramos as

variáveis b1, b2 e b3 isoladas, em todos os casos houve um aumento no número de clicks.

Esse aumento pode estar associado não necessariamente ao estresse, cerca de 90% dos

clicks ocorreram nos primeiros minutos após a passagem do animal do aquário menor

ao maior. Nesses primeiros minutos, os animais pareciam “clicar” repetidamente numa

tentativa de limpar o focinho, uma vez que no aquário menor, eles estavam totalmente

imersos em concentrações de MnP. Não obstante, a interação b12 apresentou um sinal de

diminuição de clicks, apesar de seu valor não ser significativo (t = 3,46, p = 0,07), por

este ser um trabalho de caráter exploratório, vale ser considerado.

Apesar de não se poder fazer uma comparação direta entre os experimentos

deste capítulo com os do Capítulo 2 por possuírem metodologias exploratórias

diferentes, é válido notar que para todos os casos, os exemplares de H. reidi deste

capítulo reduziram os comportamentos associados ao estresse (quando na presença de

MnP) do que os animais do capítulo anterior, expostos apenas ao H2O2. Também houve

uma diminuição, visual e numérica, entre os valores de todos os parâmetros, onde

parâmetros como Exaustão e frequência de Pipes não puderam participar das análises

devido a uma limitação dos testes a valores muito baixos.

Por não haver trabalhos envolvendo MnP em estudos com animais marinhos,

tampouco havendo estudos comportamentais, as informações existentes são difíceis de

comparar devido aos distintos objetivos e metodologias. No entanto, trabalhos

demonstrando o valor da MnP enquanto antioxidante catalítico in vivo são unanimidade.

Benov et al (2005) demonstraram uma supressão da diabetes induzida por estresse

oxidativo em ratos; Crow et al (2005) mostraram que MnP é um agente promissor para

o tratamento de esclerose lateral amiotrófica em camundongos, quando tratada no

início; Gauter-Fleckenstein et al (2008), através de medidas de frequência respiratória

e avaliações histopatológicas em ratos Fisher expostos a radiação, mostraram uma

capacidade de melhorar danos pulmonares e reduzir consideravelmente a expressão de

94

fatores pulmonares chave que desempenham um importante papel nas lesões

pulmonares induzidas por radiação, entre outros (ASLAN et al, 2001; PIGANELLI et

al, 2002; CSONT et al, 2005; WU et al, 2007; REBOUÇAS et al, 2008b; SOMPOL et

al, 2008).

6. CONCLUSÃO

O uso de um desenho experimental não permitiu apenas estimar a importância

relativa (coeficientes padronizados) dos diferentes efeitos sobre a resposta

comportamental de H. reidi, mas também revelou interações específicas que podem

facilmente não serem detectadas utilizando a metodologia clássica de “modificar um

fator a cada vez”, como por exemplo, o tempo de exposição ao MnP versus a sua

concentração, e a minimização dos efeitos do H2O2 em função do MnP.

Em conclusão, parece prudente julgar que os resultados do presente estudo

mostraram, de forma preliminar e exploratória, que o MnP se demonstrou benéfico a H.

reidi, uma vez que minimizou os impactos causados por tratamentos de altas

concentrações de H2O2 a longo prazo. Um tempo mais prolongado de exposição ao

MnP pelos cavalos-marinhos também tiveram um maior impacto sobre esses efeitos do

que uma maior concentração da mesma em um menor tempo de exposição. No entanto,

por se tratar de um primeiro estudo envolvendo o MnP para minimização de estresse

oxidativo em animais marinhos, mais estudos são necessários para refinar esses

resultados, utilizando outros valores de concentração e diferentes técnicas de exposição

ao MnP.

95


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