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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANTONIO PEDRO FRÓES DE FARIAS
ISOLAMENTO, SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
PRODUTORAS DE BIOATIVOS COM POTENCIAL PARA
APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DO PETRÓLEO
Salvador - BA
Fevereiro, 2016
ANTONIO PEDRO FRÓES DE FARIAS
ISOLAMENTO, SELEÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
PRODUTORAS DE BIOATIVOS COM POTENCIAL PARA
APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA DO PETRÓLEO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade Federal da
Bahia como requisito para obtenção do grau de
Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Dr. Paulo Fernando de Almeida
Coorientadora: Dr.ª Josilene Borges Torres
Lima Matos
Salvador - BA
Fevereiro, 2016
FICHA CATALOGRÁFICA
F224 Farias, Antonio Pedro Fróes de.
Isolamento, seleção e identificação de bactérias produtoras de bioativos com potencial para aplicação na indústria do petróleo / Antonio Pedro Fróes de Farias. - Salvador, 2016.
92 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Fernando de Almeida. Coorientadora: Profa. Dra. Josilene Borges Torres Lima Matos.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, 2016.
1. Petróleo - Bactérias. 2. Tensoativos. 3. Microbiologia industrial. I. Almeida, Paulo Fernando de. II. Matos, Josilene Borges Torres Lima. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. IV. Título.
CDU: 606
Dedicado a ela, que sempre acreditou no
menino da Zona Rural, estudante de Colégio
Público, o filho de Dona Flor e Dema do Leite.
E disse que ele chegaria lá...
...ela sabia!!
Maria das Mercês de Farias Souza – Tia Cecê
(in memoriam)
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo que me foi concedido. Saúde, força, coragem e sabedoria
para superar os obstáculos e realizar esta conquista. A Bom Jesus da Lapa, por sua
companhia constante, todas as bênçãos alcançadas e por ter colocado tantas pessoas
boas em meu caminho.
A minha família, em especial aos meus pais Valdemar Barreto (Dema do Leite)
e Florisbela Fróes (Flor) por todo o amor, carinho, dedicação e incentivo durante esse
período longe de casa. Aos meus irmãos Jorge, Renato (Bá) e Marquinhos pelo amor
e companheirismo que existe entre nós. As minhas cunhadas, Thalita e Joseane. E a
princesa Jujú, que fez minha caminhada mais feliz!
A minha namorada Lais Reis, pela compreensão e paciência nessa jornada.
Pela ajuda constante nas inúmeras correções, mas, principalmente, pelo amor,
carinho e confiança que me fizeram continuar. Te amo!
A todos os meus tios (as) e primos (as), em especial a Gilberto Tibério, meu
amigo, pelos conselhos e apoio que nortearam minha caminhada.
Aos meus sogros, Dona Leide e Antônio (Tó) por me acolherem em sua casa e
fazerem de mim, seu filho. A toda família Reis, da qual tenho orgulho de dizer que
faço parte.
A UFBA - Universidade Federal da Bahia, que abriu novas portas para minha
formação, contribuindo com toda a estrutura física e de pessoal, em especial ao ICS.
Ao meu orientador Prof. Dr. Paulo Almeida por ter me acolhido, pela paciência,
apoio e confiança, fundamental no desenvolvimento desse trabalho. É uma honra
fazer parte do grupo LABEM.
A Prof.ª Josilene Matos, pelo apoio e confiança sem igual, pelo auxílio no
desenvolvimento da pesquisa e pelas correções. Muito obrigado!
Aos colegas do LABEM: Diego Montes, Tatiane, Igor, Marcela, Nai, Roseane,
João, Daniel, Leila, Joalene, Jackson, Lais, Débora, Bethânia, pelo auxílio nas
dúvidas, e por estarem sempre dispostos a ajudar. Em especial ao pessoal do
BIOMOL, Luciana e Mariane, fundamentais para o desenvolvimento da parte
molecular.
Aos meus amigos Sueli, Luiz e Fúlvia, por terem me acompanhado durante
essa caminhada, dando apoio, incentivo e ajudando sempre, obrigado!!
Ao técnico Edmundo, sem o senhor, seria muito mais difícil chegar até aqui.
Aos alunos de Iniciação científica, Flávia Marília e Mariana Cozza, que fizeram
parte diretamente da pesquisa, muito obrigado!
A todo o pessoal do Moura Costa, na pessoa do Prof. Fábio Chinália, que
sempre manteve as portas abertas, colaborando com o desenvolvimento do trabalho.
Ao Prof. Adailson Feitosa, pelo auxílio constante e por ser uma fonte de
inspiração, para continuar melhorando cada dia mais. Obrigado!
Ao meu amigo José Brito, que apesar da distância, sempre se manteve
presente, apoiando e dando força!
A Ivonilton Junior, parte da minha família, que ao longo desses dois anos foi
uma parceria sem igual para todos os momentos.
A meu amigo/irmão Jorge Alberto, que apesar de todas as dificuldades, sempre
me ajuda e da força para continuar.
A FAPESB e ao CNPQ pela concessão da bolsa e pelo incentivo financeiro e
científico apostado em nossos projetos.
A PETROBRÁS/UN-BA pelo fornecimento das amostras de água produzida.
Ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal da
Bahia, pela oportunidade concedida.
Ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Ferramentas para a Saúde
– PDTIS-FIOCRUZ pelo uso de suas instalações.
A todos os professores do Programa de Mestrado em Biotecnologia.
Aos membros da banca, por aceitarem o convite e pelas valiosas sugestões.
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte desse processo, deixo os
meus sinceros agradecimentos.
Farias, Antonio Pedro Fróes. Isolamento, seleção e identificação de bactérias produtoras de bioativos com potencial para aplicação na indústria do petróleo. 92f.: il. 2016. Dissertação (Mestrado). Instituto de Ciências da Saúde. Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2016.
RESUMO
A corrosão microbiologicamente influenciada é constituída pelo consórcio de diversos micro-organismos, destacando-se as bactérias redutoras de sulfato (BRS) dado sua relevância na constituição do biofilme promotor dos problemas associados à biocorrosão. Além das BRS, os campos de petróleo abrigam comunidades microbianas do subsolo que contêm uma rica diversidade de bactérias. Dentre elas estão as petrobióticas: micro-organismos que apresentam atividade benéfica, produzindo compostos úteis durante o seu crescimento que melhoram a recuperação de petróleo. Essas bactérias estão associadas com o controle de BRS, através da produção de substâncias antimicrobianas e/ou com a produção de bioativos (biopolímeros e biossurfactantes) que auxiliam na recuperação de óleo em campos maduros. O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e identificar bactérias produtoras de bioativos para aplicação na indústria do petróleo. No total, 26 bactérias foram isoladas de amostras de água produzida, sendo 13 bactérias do poço A e 13 do poço B. Todas as bactérias apresentaram capacidade de desnitrificação heterotrófica e/ou autotrófica, isso pode estar relacionado aos níveis de nitrato encontrados para as amostras de água produzida, 360 mg.L-1 no poço A e 907 mg.L-
1 no poço B. O perfil metabólico para a redução do molibdato a azul de molibdênio foi apresentado por 23 cepas, sendo que 10 mostraram os maiores níveis de redução. Os resultados dos testes de inibição mostraram que 10 linhagens apresentaram atividade inibitória frente às BRS, pela produção de substâncias antimicrobianas, destacando-se as cepas AMD (10 mm), AT6 (11 mm) e AT11-2 (13 mm). Os maiores valores obtidos para a produção de biopolímeros com base no diâmetro da camada de muco foram observadas para as cepas JV4, JV4-1, AMD e AT11-2 (40 mm). As cepas JV1, JV4, AMD, AT6 e AT11-2 apresentaram os melhores resultados para a produção de biossurfactante. Além disso, essas amostras mantiveram emulsão estável por mais de 90 dias. No presente trabalho foi possível selecionar diversas bactérias produtoras de bioativos de interesse para aplicação na indústria do petróleo. Estas, foram identificadas como Bacillus sp. (3), Bacillus subtilis (1), Bacillus thurigiensis (1), Bacillus pumilus (1), Bacillus cereus (1) e Staphylococcus sp. (1). Esta pesquisa serve como base para o desenvolvimento de diversos trabalhos com potencial aplicação na indústria do petróleo, tais como: inibição de BRS por produção de substâncias antimicrobianas, utilização das bactérias em processos de biorremediação e a constituição de consórcios microbianos que podem ser utilizados para a tecnologia MEOR. Palavras-chave: Bactérias petrobióticas, Bioativos, Substâncias antimicrobianas.
Farias, Antonio Pedro Fróes. Isolation, selection and identification of bacteria producing bioactive with potential for application in the oil industry. 92f.: il. 2016. Dissertation (Master). Institute of Health Sciences. Federal University of Bahia, Salvador, 2016.
ABSTRACT
The microbiologically influenced corrosion is made by a consortium of several micro-organisms, especially the sulfate reducing bacteria (BRS) given its importance in the constitution of biofilm promoter of the problems associated with biocorrosion. Besides the BRS, oilfield harbor microbial communities subsoil that contain a rich variety of bacteria. Among them are petrobiotics: microorganisms that have beneficial activity, producing useful compounds during their growth to enhance oil recovery. These bacteria are associated with the BRS control by the production of antimicrobial substances and/or the production of bioactive (biopolymers and biosurfactants) that aid in oil recovery in mature fields. This study aimed to isolate, select and identify bioactive producing bacteria for application in the oil industry. A total of 26 bacteria were isolated from produced water samples, 13 bacteria of the pit A and 13 pit B. All bacteria have denitrification capacity (heterotrophic and/or autotrophic), this may be related to nitrate levels found for samples of produced water, 360 mg.L-1 to pit A and 907 mg.L-1 to pit B. The metabolic profile for reduction of the molybdate to molybdenum blue was shown by 23 strains and 10 showed the greatest levels of reduction. The results of the inhibition tests showed that the strains inhibited 10 BRS, production of antimicrobial substances, especially AMD strains (10 mm), AT6 (11 mm) and AT11-2 (13 mm). The highest values obtained for the production of biopolymers based on the diameter of the mucus layer were observed for strains JV4, JV4-1, AMD and AT11-2 (40 mm). The strains JV1, JV4, AMD, AT6 and AT11-2 presented the best results for biosurfactant production. In addition, these samples remained stable emulsion for more than 90 days. In the present study it was possible to select several bioactive producing bacteria of interest for application in the oil industry. These were identified as Bacillus sp. (3) Bacillus subtilis (1), Bacillus thuringiensis (1), Bacillus pumilus (1), Bacillus cereus (1) and Staphylococcus sp. (1). This study serves as a basis for the development of various studies with potential application in the oil industry, such as: inhibition BRS by production of antimicrobial substances, use of bacteria in bioremediation processes and the constitution of microbial consortia that can be used for MEOR technology.
Keywords: Petrobiotics bacteria, Bioactive, Antimicrobial substances.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma da recuperação secundária de petróleo através da injeção de água produzida. ......................................................................................................... 19
Figura 2. Ilustração do ciclo microbiano do enxofre. ................................................ 23
Figura 3. Desenvolvimento de biofilme microbiano. ................................................. 31
Figura 4. Ilustração esquemática da interação dos ciclos enxofre/nitrogênio que podem ocorrer em reservatórios de petróleo............................................................. 37
Figura 5. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio MBT. ....................... 45
Figura 6. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio AAC. ....................... 46
Figura 7. Fluxograma do teste de inibição em placas. ............................................. 50
Figura 8. Placas com meio MBT após o inóculo da água produzida. ....................... 59
Figura 9. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato. ............................ 63
Figura 10. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato sulfeto-oxidantes. .................................................................................................................................. 65
Figura 11. Teste de redução do molibdato. .............................................................. 67
Figura 12. Atividade antimicrobiana das cepas isoladas da água produzida contra a Desulfovibrio spp. ...................................................................................................... 69
Figura 13. Teste de antagonismo em placas por sobrecamada das cepas isoladas da água produzida contra a cepa Desulfovibrio spp. ...................................................... 70
Figura 14. Produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida. ............. 71
Figura 15. Confirmação da produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida................................................................................................................... 72
Figura 16. Quantificação em porcentagem da produção de biossurfactante através do método de índice de emulsificação. .......................................................................... 74
Figura 17. Análise da redução da tensão superficial para as bactérias isoladas da água produzida. ......................................................................................................... 75
Figura 18. Análise comparativa do índice de emulsificação (%) e tensão superficial (mN/m) para as cepas selecionadas como produtoras de biossurfactante. .............. 76
Figura 19. Análise filogenética das sequências parciais do gene rRNA 16S (~700 pb) obtidas a partir das cepas produtoras de bioativos. .................................................. 78
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição do meio CSB modificado. ..................................................... 48
Tabela 2. Caracterização físico-química da água produzida coletada nos poços A e B. .................................................................................................................................. 56
Tabela 3. Bactérias isoladas da água produzida - poço A. ....................................... 59
Tabela 4. Bactérias isoladas da água produzida - poço B. ....................................... 60
Tabela 5. Teste metabólico para bactérias redutoras de nitrato (BRN) e bactérias redutoras de nitrato/oxidantes de sulfeto (BRN-OS). ................................................ 62
Tabela 6. Teste para avaliar a capacidade das bactérias isoladas da água produzida de reduzir o molibdato (VI) a azul de molibdênio (V). ................................................ 66
Tabela 7. Bactérias produtoras de bioativos selecionadas para identificação a nível molecular. .................................................................................................................. 77
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAC Ágar Amido Caseína
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AP Água Produzida
APS Adenosina Fosfosulfato
atm. Atmosfera
BOD Estufa Bacteriológica
BRN Bactéria Redutora de Nitrato
BRN-OS Bactéria Redutora de Nitrato Oxidante de Sulfeto
BRS Bactéria Redutora de Sulfato
CSB Coleville Synthetic Brine
CMI Corrosão Microbiologicamente Influenciada
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
DNA Ácido Desoxirribonucleico
Eh Potencial Redox
EOR Recuperação Avançada do Petróleo
EPS Exopolissacarídeo
E24 Índice de Emulsificação
FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz
g Grama
g.L-1 Grama por Litro
h Hora
ICS Instituto de Ciências da Saúde
ISP-2 Ágar Extrato de Malte Extrato de Levedura
LABEM Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Micro-organismos
L Litro
M Molar
MBT Meio a Base de Glicerina Bruta e Borra de Petróleo
MEOR Recuperação Avançada do Petróleo com Micro-organismos
mg.L-1 Miligrama por Litro
min. Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
mN/m MiliNewtons por Metro
mV Milivolt
nº. Número
ND Não Detectado
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
rRNA Ácido Ribonucleico Ribossômico
rpm Rotação Por Minuto
SAM Substância Antimicrobiana
THPS Tetrakis (Hidroximetil) Fosfônio Sulfato
TSA Ágar Triptona de Soja
TSB Caldo Triptona de Soja
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFC Unidade Formadora de Colônia
μL Microlitro
μm Micrometro
µHg Micrometro de Mercúrio
% Porcentagem
º C Graus Centígrado
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 17
2.1. Geral .................................................................................................................. 17
2.2. Específicos ....................................................................................................... 17
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 18
3.1. Água produzida e recuperação secundária do petróleo ............................... 18
3.2. Caracterização da água produzida ................................................................. 20
3.2.1. pH ................................................................................................................ 20
3.2.2. Potencial redox (Eh) .................................................................................... 21
3.2.3. Composição ................................................................................................. 21
3.3. Microbiologia do petróleo ................................................................................ 22
3.3.1. Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)......................................................... 22
3.3.1.1. BRS mesófilos Gram-negativos ............................................................ 25
3.3.1.2. BRS Gram-positivos formadores de esporos ........................................ 26
3.3.1.3. BRS termófilas Gram-negativas ............................................................ 26
3.3.1.4. Arqueobactérias termófilas Gram-negativas ......................................... 27
3.3.2. Outros micro-organismos do petróleo .......................................................... 28
3.4. Acidificação biogênica dos reservatórios (souring) ..................................... 30
3.5. Corrosão Microbiologicamente Influenciada (CMI) ....................................... 30
3.6. Métodos de prevenção e controle do souring e CMI ..................................... 33
3.6.1. Limpeza mecânica ....................................................................................... 33
3.6.2. Proteção catódica ........................................................................................ 33
3.6.3. Biocidas ....................................................................................................... 34
3.6.4. Uso de molibdato ......................................................................................... 34
3.6.5. Inibição microbiana da corrosão .................................................................. 35
3.7. Antagonismo microbiano ................................................................................ 36
3.7.1. Exclusão biocompetitiva .............................................................................. 36
3.7.2. Biofilmes protetores e agentes antimicrobianos .......................................... 38
3.7.3. Inibição por bacteriófagos ............................................................................ 39
3.8. Bioativos para aplicação na indústria do petróleo ........................................ 39
3.8.1. Biopolímeros ................................................................................................ 40
3.8.2. Biossurfactantes .......................................................................................... 41
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 43
4.1. Água produzida de campos de petróleo ........................................................ 43
4.2. Caracterização das amostras de água produzida ......................................... 43
4.2.1. Determinação de íons .................................................................................. 43
4.2.2. Determinação de parâmetros físico-químicos (Eh/pH) ................................ 44
4.3. Isolamento e caracterização de micro-organismos de amostras de água produzida. ................................................................................................................ 44
4.3.1. Isolamento de bactérias da água produzida ................................................ 44
4.3.2. Caracterização - teste de redução do nitrato ............................................... 47
4.3.3. Caracterização - teste para bactérias sulfeto-oxidantes .............................. 47
4.3.4. Caracterização - teste de redução do molibdato ......................................... 49
4.4. Estudos laboratoriais de antagonismo .......................................................... 50
4.5. Produção de biopolímeros .............................................................................. 51
4.6. Produção de biossurfactantes ........................................................................ 52
4.6.1. Índice de emulsificação ................................................................................ 52
4.6.2. Tensão superficial ........................................................................................ 53
4.7. Identificação dos micro-organismos selecionados ...................................... 53
4.7.1. Extração de DNA ......................................................................................... 53
4.7.2. Reação de PCR ........................................................................................... 54
4.7.3. Reação de sequenciamento ........................................................................ 55
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 56
5.1. Caracterização físico-química das amostras de água produzida da indústria do petróleo ............................................................................................... 56
5.2. Isolamento de bactérias a partir de amostras de água produzida ............... 58
5.2.1. Bactérias isoladas do poço A ....................................................................... 58
5.2.2. Bactérias isoladas do poço B ....................................................................... 60
5.3. Caracterização dos micro-organismos isolados das amostras de água produzida. ................................................................................................................ 61
5.3.1. Bactérias Redutoras de Nitrato (BRN) ......................................................... 61
5.3.2. Bactérias Redutoras de Nitrato Oxidantes de Sulfeto (BRN-OS) ................ 64
5.3.3. Redução do molibdato ................................................................................. 66
5.4. Testes laboratoriais de antagonismo ............................................................. 68
5.5. Produção de biopolímeros .............................................................................. 71
5.6. Produção de biossurfactante .......................................................................... 73
5.6.1. Índice de emulsificação ................................................................................ 73
5.6.2. Análise da tensão superficial ....................................................................... 74
5.7 Identificação molecular das cepas selecionadas como produtoras de bioativos................................................................................................................... 77
6. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 80
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 82
8. APÊNDICE ............................................................................................................ 92
15
1. INTRODUÇÃO
A produção de petróleo é seguida de uma significante produção de água,
conhecida como água de produção, constituindo a maior parte do rejeito da indústria
petrolífera (ALMEIDA et al., 2009). Quando há uma queda na pressão natural do
reservatório, essa água é reinjetada nos poços a fim de deslocar o óleo existente no
poço de injeção em direção aos poços produtores (recuperação secundária do
petróleo) (BACHMANN et al., 2014; EKINS et al., 2007). Métodos terciários, ou
recuperação avançada do petróleo (EOR), incluem processos térmicos e químicos
para produzir uma extração de petróleo adicional (SANDREA; SANDREA, 2007).
Os métodos terciários incluem também a utilização de micro-organismos e/ou
seus produtos metabólicos na recuperação do óleo residual (BANAT, 1995; JACK,
1991). Este tipo de recuperação envolve a estimulação de micróbios nativos ou a
injeção, no reservatório, de consórcios bacterianos com o objetivo de produzir
mecanismos e produtos metabólicos específicos que levem à melhoria da
recuperação do óleo (ALMEIDA; RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
Os maiores problemas associados à reinjeção de água para recuperação
secundária de petróleo são o controle da corrosão e a minimização da injeção de
sólidos no reservatório. Esses processos corrosivos em sistemas de injeção de água
podem ser tanto de natureza química (presença de oxigênio e produtos corrosivos)
quanto induzida por micro-organismos (PENNA et al., 2002).
A corrosão microbiologicamente influenciada (CMI) é constituída pelo consórcio
de diversos micro-organismos, destacando-se as bactérias redutoras de sulfato (BRS)
dado sua relevância na constituição do biofilme promotor dos problemas associados
à biocorrosão (NEUMANN, 2012). As BRS têm como importante característica a
capacidade de degradação anaeróbia da matéria orgânica, promovendo a redução do
sulfato a sulfeto, provocando a acidificação dos reservatórios (souring) e o
desenvolvimento da biocorrosão. Essas bactérias são apontadas como as principais
responsáveis pela biocorrosão de materiais de ferro e aço na indústria de petróleo,
gerando um custo elevado na manutenção de equipamentos e metais usados
(CORTEZ, 2009).
Além das BRS, campos de petróleo abrigam comunidades microbianas do
subsolo que contêm uma rica diversidade de bactérias (VOORDOUW, 2001). Uma
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grande variedade de micro-organismos já foi isolada ou tem sido detectada na água
produzida de campos de petróleo, a partir de técnicas de biologia molecular, como por
exemplo: bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas e micro-organismos
microaerófilos (MAGOT et al., 2000). Dentre estas bactérias, estão as petrobióticas:
micro-organismos que apresentam atividade benéfica, produzindo compostos úteis
durante o seu crescimento que melhoram a recuperação de petróleo (ALMEIDA et al.,
2004). Essas bactérias estão associadas com o controle de BRS e/ou com a produção
de compostos bioativos (biopolímeros e surfactantes) que auxiliam na recuperação de
petróleo em campos maduros (ALMEIDA; RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
Para combater os problemas de acidificação e biocorrosão causados pelas
BRS, a indústria petroquímica tem investido em produtos químicos como biocidas ou
inibidores da formação de biofilmes. Porém, o uso frequente de biocidas para inibir o
crescimento microbiano apresenta elevado nível de toxidade (GARDNER; STEWART,
2002). Além disso, as BRS possuem uma grande capacidade adaptativa, reduzindo a
eficiência do uso de biocidas através de biofilmes de proteção e pelo surgimento de
cepas resistentes (TANG et al., 2009).
A injeção de nitrato através da estratégia de exclusão biocompetitiva, ou a
combinação de tratamentos, tais como, injeção de nitrito com molibdato e/ou biocidas,
são alternativas cada vez mais estudadas (GIEG et al., 2011). Entretanto, a eficiência
do nitrato em campos de petróleo nem sempre é previsível e o tratamento está
condicionado ao custo, disponibilidade e, em especial, ao modo de aplicação, uma
vez que dependendo do sistema a ser tratado poderá ser necessária a adição de
outros sais e/ou biomassa exógena a fim de garantir a eficácia do processo biológico
(SEGUI, 2009; SOUSA, 2009).
A dificuldade na eliminação das BRS aderidas às estruturas metálicas na forma
de biofilmes e a crescente taxa de resistência dos micro-organismos às estratégias
classicamente usadas tem impulsionado pesquisas que visam o desenvolvimento de
estratégias alternativas para o controle da biocorrosão. Uma delas é a utilização de
micróbios antagonistas ou o produto de seu metabolismo para eliminar micro-
organismos causadores da corrosão (ALBUQUERQUE et al., 2014; ZARASVAND;
RAI, 2014). Sendo assim, a utilização de substâncias antimicrobianas (SAM) pode ser
a chave para o controle dos efeitos nocivos causados por essas bactérias
(ALBUQUERQUE et al., 2014; ROSA et al., 2013).
17
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Isolar, selecionar e identificar bactérias produtoras de bioativos com potencial
para aplicação na indústria do petróleo.
2.2. Específicos
Caracterizar físico-quimicamente amostras de água produzida oriundas de
campos de petróleo com problemas de souring e corrosão microbiologicamente
influenciada (CMI);
Isolar micro-organismos antagonistas às BRS a partir de amostras de água
produzida;
Avaliar atividade metabólica dos micro-organismos, quanto à redução de
nitrato, molibdato e sulfeto-oxidantes;
Caracterizar os micro-organismos quanto à produção de biopolímeros e
biossurfactantes;
Identificar as cepas selecionadas como produtoras de bioativos, através de
técnicas moleculares.
18
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Água produzida e recuperação secundária do petróleo
A produção de petróleo gera grandes volumes de resíduos líquidos em todo o
mundo. A água produzida (AP) é um subproduto da extração de petróleo e gás natural
e representa o principal resíduo gerado durante o processo de separação, para que
esses fluidos possam se transformar em produtos comerciais (MOTTA et al., 2013,
TELLEZ et al., 2002).
O termo “água produzida” é utilizado para descrever a mistura de água de
formação (naturalmente encontrada em reservatórios de petróleo e gás) e
hidrocarbonetos que, mesmo após tratamento, contém uma pequena quantidade de
óleo (EKINS et al., 2007). A água produzida é formada a partir de diferentes
compostos (orgânicos e inorgânicos) e tem como principais constituintes: óleo,
minerais dissolvidos da formação, compostos químicos residuais da produção, sólidos
da produção, gases dissolvidos e micro-organismos (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
Segundo Fakhru’l-Razi et al. (2009), a quantidade de AP gerada é dependente
do método de recuperação e a natureza da formação, ocorrendo um aumento gradual
durante o processo de produção. No início, um campo produz pouca água, em torno
de 5 a 15% da corrente produzida. Entretanto, à medida que a vida econômica dos
poços vai se esgotando, o volume de água pode aumentar significativamente,
correspondendo a uma faixa de 75 a 90% (THOMAS, 2004).
Para maximizar os níveis de recuperação do petróleo, a água produzida é
reinjetada nos reservatórios para aumentar a pressão interna e deslocar o óleo
existente no poço de injeção em direção a superfície - recuperação secundária do
petróleo (Figura 1) (VOORDOUW, 2011).
Antes de ser reinjetada nos poços, a água de produção deve ser submetida a
um tratamento de modo a torna-la mais adequada ao reservatório e aos fluidos neles
existentes. Convencionalmente, ela pode ser tratada por diferentes métodos: físicos,
químicos e biológicos (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
19
Figura 1. Fluxograma da recuperação secundária de petróleo através da injeção de água produzida.
Fonte: Voordouw, p. 403 (2011).
A recuperação primária (extração do petróleo pela pressão natural do poço) é
responsável pela extração de até 20% do petróleo. Já a recuperação secundária
(usada quando há uma queda na pressão natural do reservatório) é um método que
permite obter uma recuperação de 45-50% do petróleo. Métodos terciários, ou
recuperação avançada do petróleo (EOR – Enhanced Oil Recovery), incluem
processos térmicos e químicos para produzir uma extração de petróleo adicional de
7-15% (GOA et al., 2009; SANDREA; SANDREA, 2007).
Os métodos terciários incluem também a utilização de micro-organismos e/ou
seus produtos metabólicos na recuperação do óleo residual (MEOR – Microbial
Enhanced Oil Recovery). Este tipo de recuperação envolve a estimulação dos micro-
organismos naturais do reservatório ou injeção de consórcios microbianos,
especialmente selecionadas, para produzir eventos metabólicos específicos que
levam à melhoria da recuperação de petróleo (BANAT, 1995; JACK, 1991).
Os micro-organismos podem sintetizar compostos análogos aos utilizados em
processos EOR a partir da fermentação de substratos ou matérias-primas de baixo
custo, para aumentar a recuperação de óleo de reservatórios marginais. Portanto,
20
MEOR apresenta grande potencial para substituir a EOR, que é uma tecnologia muito
cara (SHIBULAL et al., 2014).
O processo de recuperação de petróleo pela injeção de AP promove a redução
da salinidade e da temperatura da água de formação e, consequentemente, estimula
o crescimento microbiano ao tornar as condições do meio favorável à sua proliferação
(NEUMANN, 2012). Isso pode representar um sério risco às atividades operacionais
de recuperação do petróleo, uma vez que, aumenta a fonte de nutrientes disponíveis
e estimula a atividade de bactérias redutoras de sulfato que provocam a acidificação
dos reservatórios (souring) e o desenvolvimento da biocorrosão (SOUSA, 2009).
3.2. Caracterização da água produzida
As propriedades físicas e químicas da água produzida variam
consideravelmente, dependendo da localização geográfica do campo, da formação
geológica e dos tipos de hidrocarbonetos que estão sendo produzidos (VEIL et al.,
2004). As propriedades e o volume da água produzida podem variar ao longo do
tempo de vida de um reservatório. Além disso, as condições operacionais e produtos
químicos utilizados em instalações de processamento também interferem na sua
composição (FAKHRU’L-RAZI et al., 2009).
3.2.1. pH
Realizar a análise do potencial hidrogeniônico (pH) da água produzida é
necessário para o monitoramento do seu poder de corrosão, do crescimento de micro-
organismos e, com o intuito de verificar se tal AP se enquadra dentro das legislações
pertinentes para o controle de efluentes industriais (RIBEIRO, 2013). O pH ótimo para
o crescimento das BRS em poços geralmente é entre 5 e 8. No entanto, a avaliação
do pH mensurado à pressão atmosférica pode não refletir necessariamente o pH real
in situ, uma vez que o pH é influenciado por dissolução de gases sob alta pressão.
Esta característica tem que ser levada em consideração na interpretação da natureza
indígena das bactérias recuperadas a partir de amostras do subsolo (MAGOT et al.,
2000).
21
3.2.2. Potencial redox (Eh)
O potencial de oxirredução, determina as características do ambiente quanto a
fugacidade de oxigênio (ambiente redutor ou oxidante). É sabido que bactérias
redutoras de sulfato requerem um Eh negativo para seu crescimento inicial. Sendo
assim, o Eh encontrado na AP é um registro metabólico da possível presença de BRS
nos poços de petróleo (POSTGATE, 1979).
3.2.3. Composição
A água produzida é uma mistura de materiais orgânicos e inorgânicos. Os
compostos orgânicos naturais podem ser divididos em quatro grupos principais:
alifáticos (incluindo os naftênicos), aromáticos, polares e ácidos graxos. A quantidade
relativa e a distribuição de peso molecular destes compostos variam de poço para
poço. Os compostos aromáticos juntamente com os alifáticos, constituem os
chamados hidrocarbonetos da água produzida e o material orgânico está presente
tanto nas formas dispersa, como dissolvida (OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2000).
A água produzida apresenta em sua composição, diferentes compostos
inorgânicos. Dentre eles, cátions (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Sr2+, Fe2+) e ânions (Cl-,
SO42-, CO3
2-, HCO3-), responsáveis pelo potencial de incrustação dessas águas (VEIL,
et al., 2004). A determinação da concentração destes elementos é importante para o
monitoramento da água onde se encontra a estrutura metálica, já que essas variáveis
influenciam diretamente o processo corrosivo e o metabolismo dos micro-organismos
(GALVÃO, 2008).
É importante lembrar que o conhecimento sobre as características físicas,
químicas e a composição da água produzida são indispensáveis para avaliar a
possibilidade de seu uso nos processos de reinjeção, assim como prever as condições
existentes para o crescimento de BRS e os possíveis problemas decorrentes do
souring biogênico (NEUMANN, 2012; SEGUI, 2009).
22
3.3. Microbiologia do petróleo
Uma grande diversidade taxonômica e funcional de micro-organismos tem sido
recuperada de reservatórios de extração de petróleo: desde anaeróbios estritos,
termófilos e hipertermófilos, até anaeróbios facultativos e termotolerantes. Aeróbios
também foram isolados ou tem sido detectados por técnicas moleculares (LOPES,
2010; MAGOT et al., 2000; ORPHAN et al., 2000).
Dentre os micro-organismos anaeróbios estritos presentes nos reservatórios de
petróleo, as BRS são o grupo bacteriano mais bem estudado devido ao seu papel
central nos processos de biocorrosão.
3.3.1. Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS)
O ciclo do enxofre é complexo, pois o enxofre pode existir em diversos estados
de oxidação na natureza. Em ambientes onde há a presença de oxigênio o sulfato é
termodinamicamente estável e em ambientes anaeróbios o sulfeto é mais constante
(ALMEIDA, 2005). Além disso, o ciclo do enxofre está intimamente ligado a outros
ciclos de elementos, tais como os ciclos do carbono e do nitrogênio (MUYZER;
STAMS, 2008).
O sulfato é utilizado por muitos micro-organismos como fonte de enxofre para
as suas necessidades biossintéticas. A capacidade de utilizar essa substância como
aceptor de elétrons nos processos geradores de energia, no entanto, envolve a
redução de uma grande quantidade de SO4-2, processo restrito às BRS (MADIGAN et
al., 2010).
A redução de sulfato a sulfeto não ocorre espontaneamente nas condições
físicas da atmosfera, e requer uma mediação catalítica por atividade biológica
(ALMEIDA, 2005). A redução do sulfato pode ocorrer de duas formas: 1) redução
assimilatória - o H2S formado é imediatamente convertido a enxofre orgânico, sob a
forma de aminoácidos e outros compostos sulfurados orgânicos; 2) redução
desassimilatória - uma pequena quantidade de enxofre reduzido é assimilada pelo
organismo, mas praticamente todo o H2S formado é excretado no ambiente externo
(MADIGAN et al., 2010).
23
As BRS têm um papel chave no ciclo do enxofre (Figura 2). Eles são micro-
organismos ubíquos de habitats anaeróbios que utilizam o sulfato como aceptor
terminal de elétrons para a degradação de compostos orgânicos, formando sulfeto,
sem a assimilação significativa de enxofre em biomassa celular. O processo de
redução global do sulfato pode ser representado pela equação:
2CH2O + SO4-2 + 2H+ ⇔ H2S + CO2 + H2O (1)
onde CH2O representa um composto orgânico. Subsequentemente, o sulfeto pode ser
oxidado sob condições aeróbias por bactérias sulfurosas quimiolitotróficas ou em
condições anóxicas por bactérias sulfurosas fototróficas (GILBERT et al., 2002;
MUYZER; STAMS, 2008).
Figura 2. Ilustração do ciclo microbiano do enxofre.
Fonte: Muyzer; Stams, p. 443 (2008).
24
Algumas BRS podem realizar a desproporcionação do enxofre: processo de
geração de energia no qual o enxofre elementar ou o tiossulfato atuam como doador
e aceptor de elétrons, resultando na formação simultânea de sulfato e sulfeto. Em
adição aos compostos inorgânicos de enxofre, uma grande variedade de compostos
orgânicos de enxofre (isto é, proteínas contendo enxofre) são sintetizados por micro-
organismos e considerados parte do ciclo microbiano do enxofre (TANG et al., 2009).
As BRS são capazes de reduzir o sulfato (SO42-) e por vezes outros compostos
de enxofre, como o sulfito (SO32-) e o tiossulfato (S2O3
2-), a sulfeto, isto é, realizam a
redução desassimilativa do íon sulfato, onde este íon atua como agente oxidante para
metabolizar a matéria orgânica (MADIGAN et al., 2010). A produção de H2S pelas
BRS podem causar sérios problemas para as indústrias de petróleo, já que esse
composto é altamente reativo, corrosivo e tóxico (MUYZER; STAMS, 2008).
As BRS apresentam crescimento em ampla faixa de pH (entre 5,0 e 9,0),
grandes variações de temperatura, além de uma ampla faixa de condições osmóticas
e um baixo potencial redox (TANG et al., 2009). São micro-organismos anaeróbios
estritos que estão distribuídas em ambientes terrestres e aquáticos. No entanto,
alguns gêneros de BRS conseguem sobreviver a longos períodos de exposição ao
oxigênio na natureza pela presença das enzimas superóxido dismutase e superóxido
redutase (VOORDOUW, 2001).
Atualmente, as BRS podem ser divididas em dois grupos metabólicos
principais: aqueles que degradam compostos orgânicos incompletamente ao acetato;
e aqueles que degradam compostos orgânicos completamente em dióxido de carbono
(MUYZER; STAMS, 2008). Existem também as bactérias redutoras de sulfato que não
necessitam de compostos orgânicos como fonte de energia ou doadores de elétrons.
Nesse caso, o crescimento bacteriano não ocorre através de um processo
heterotrófico, mas sim, autotrófico e geralmente com a produção de enxofre elementar
como produto inorgânico final (MADIGAN et al., 2010). Os dois primeiros grupos de
micro-organismos são os que mais contribuem para que ocorra o processo no qual o
H2S é produzido e assim afeta diretamente as superfícies metálicas que conduzem a
corrosão eletroquímica e anaeróbia (MAGALHÃES, 2014).
A redução desassimilatória do SO42- a H2S requer oito elétrons e ocorre por
meio de vários estágios intermediários. Primeiramente, o sulfato é ativado por uma
enzima ATP sulfurilase, resultando na formação de adenosina fosfosulfato (APS). A
enzima APS redutase reduz o sulfato ativado em sulfito (SO32-) com liberação de
25
adenosina monofosfato (AMP). Por fim, a enzima sulfito redutase converte o sulfito a
H2S. As taxas de crescimento das BRS sugerem que há formação de um ATP para
cada sulfato reduzido a sulfeto quando o H2 é utilizado como doador de elétrons.
Quando o lactato ou o piruvato são os doadores de elétrons, ocorre a formação
adicional de ATP a nível de substrato, durante a oxidação do piruvato a acetato e CO2,
via acetil-COA e acetil fosfato (MADIGAN et al., 2010; MUYZER; STAMS, 2008).
Com base em análises da sequência de rRNA 16S, as BRS podem ser divididas
em quatro grupos principais: mesófilos Gram-negativos; Gram-positivos formadores
de esporos; eubactérias termófilas Gram-negativas e arqueobactérias termófilas
Gram-negativas. Todos esses grupos são caracterizados pelo uso do sulfato como
aceptor final de elétrons durante a respiração anaeróbia (CASTRO et al., 2000;
POSTGATE, 1979).
3.3.1.1. BRS mesófilos Gram-negativos
Este grupo de BRS está localizado dentro da subdivisão delta Proteobacteria.
Em algum ponto da evolução microbiana, a subdivisão delta divergiu de outros
membros do grupo Proteobacteria a partir de um ancestral comum fotoautotrófico,
perdendo sua capacidade fotossintética e sendo convertido para heterotrofia
(WOESE, 1987).
Segundo Castro et al., (2000) duas famílias de BRS foram propostas para delta
Proteobacteria:
1) Desulfovibrionaceae - inclui os gêneros Desulfovibrio e Desulfomicrobium;
2) Desulfobacteriaceae - inclui os gêneros Desulfobulbus, Desulfobacter,
Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfomonile, Desulfonema,
Desulfobotulus e Desulfoarculus.
O gênero de BRS mais frequentemente estudado é a Desulfovibrio, comum em
habitats aquáticos ou solos encharcados, contendo matéria orgânica em abundância
e concentrações suficientes de sulfato. Esse gênero possui grande importância na
26
indústria do petróleo, pois está associada a CMI de tubulações metálicas de campos
de petróleo (MADIGAN et al., 2010; MAGOT et al., 2000; TORTORA et al., 2012).
Além de bactérias redutoras de sulfato, a subdivisão delta inclui bactérias
redutoras de enxofre (ordem Desulfovibrionales), Myxobacteria, Bdellovibrio,
Pelobacter e Geobacter (LONERGAN et al., 1996). As bactérias redutoras de enxofre
são organismos anaeróbios obrigatórios que utilizam formas oxidadas de enxofre,
como sulfato e enxofre elementar (S0), em vez do oxigênio como aceptor de elétrons
tendo como produto dessa redução o sulfeto de hidrogênio (TORTORA et al., 2012).
3.3.1.2. BRS Gram-positivos formadores de esporos
Este grupo é dominado pelo gênero Desulfotomaculum e é colocado dentro do
grupo de bactérias Gram-positivas com baixa quantidade de GC. Este gênero inclui
as únicas BRS conhecidas capazes de formar endosporos resistentes ao calor, uma
característica partilhada com diversas espécies de Bacillus e Clostridium. Em
contraste com as BRS mesófilas, algumas espécies de Desulfotomaculum são
termófilas moderadas, com temperatura ótima de crescimento entre 54 e 65º C
(CASTRO et al., 2000; LEÃO, 2009).
As espécies desse gênero exibem grande diversidade na obtenção de
nutrientes, oxidando incompletamente uma ampla gama de substratos incluindo
lactato, etanol, butanol e ácidos carboxílicos na presença de sulfato. Dependendo da
espécie, substratos orgânicos são oxidados incompletamente a acetato ou
completamente a CO2 (CASTRO et al., 2000; MAGOT et al., 2000).
Embora a maioria das BRS formadoras de esporos gram-positivas sejam
encontradas em ambientes similares aos das BRS mesófilas gram-negativas, a
formação de esporos permite a esse grupo sobreviver por longos períodos (meses ou
anos) em condições óxicas e de dissecação (STUBNER; MEUSER, 2000).
3.3.1.3. BRS termófilas Gram-negativas
As duas espécies mais bem caracterizados neste grupo de BRS são
Thermodesulfobacterium comuna e Thermodesulfovibrio yellowstonii (ambas isoladas
27
a partir de fontes de águas hidrotermais). Embora estes dois gêneros tenham
características fisiológicas e fenotípicas semelhantes, eles diferem na forma (vibrião
e bacilo) e teor de GC (CASTRO et al., 2000).
As Termodesulfobacteria são um pequeno grupo de bactérias termófilas
primitivas que habitam as águas quentes em volta de chaminés vulcânicas
submarinas, nascentes hidrotermais e lençóis profundos de petróleo. São organismos
estritamente anaeróbios que utilizam o sulfato para oxidar compostos orgânicos ou
inorgânicos disponíveis no ambiente, produzindo energia e liberando sulfeto
(JEANTHON et al., 2002).
Thermodesulfobacterium é uma bactéria termofílica (temperatura ótima de
crescimento é de 70º C), incapaz de utilizar o acetato como doador de elétrons em
seu metabolismo energético. Em vez disso, ela utiliza compostos como lactato,
piruvato e etanol como doadores de elétrons, reduzindo o sulfato a sulfeto (MADIGAN
et al., 2010).
3.3.1.4. Arqueobactérias termófilas Gram-negativas
No domínio Archaea, as bactérias redutoras de sulfato são representadas por
membros do gênero Archaeoglobus. Esse gênero de BRS hipertermófila, com
temperatura ótima de crescimento de 83º C, possui algumas coenzimas únicas de
bactérias metanogênicas, que permitem produzir pequenas quantidades de metano
durante o crescimento. Utilizam H2, formato, glicose, lactato e piruvato como fonte de
energia e podem reduzir o SO42-, S2O3
2- ou SO32- a sulfeto (MADIGAN et al., 2010;
MAGOT et al., 2000). Apenas duas espécies foram descritas até hoje, as quais foram
isoladas a partir de sistemas hidrotermais marinhos: Archaeoglobus fulgidus e
A. profundus. As principais diferenças entre as duas espécies são que A. fulgidus
possuem flagelos, são quimiolitotróficos facultativos e produzem pequenas
quantidades de metano, enquanto A. profundus não possuem flagelos, são
quimiolitotróficos obrigatórios e não produzem metano (CASTRO et al., 2000).
28
3.3.2. Outros micro-organismos do petróleo
Outras importantes comunidades microbianas destes ambientes são
representadas pelas arqueas metanogênicas (principalmente as mesófilas), bactérias
(mesófilas e termófilas) e arqueas fermentativas, além de bactérias redutoras de ferro
e manganês (MAGOT et al., 2000).
O Isolamento de micro-organismos metanogênicos tem sido bem sucedido a
partir de águas de poços de petróleo com temperaturas mesófilas e alta salinidade. Já
bactérias termófilas foram isoladas a partir de reservatórios que apresentam altas
temperaturas. A combinação de alta temperatura e salinidade, em campos de
petróleo, geralmente reduz drasticamente as populações microbianas, incluindo as
metanogênicas (MAGOT et al., 2000).
Bactérias fermentadoras mesófilas, termófilas e hipertermófilas constituem uma
importante comunidade microbiana do ambiente de campos de petróleo. As bactérias
fermentadoras termófilas têm sido isoladas com uma frequência muito maior que as
mesófilas, devido as altas temperaturas encontradas na maioria dos campos de
petróleo. Termófilos anaeróbios, em geral, também têm sido estudados,
principalmente devido ao potencial industrial das suas enzimas termoestáveis
(MAGOT et al., 2000).
Bactérias redutoras de ferro mesófilas têm sido detectadas em fluidos de
campos de petróleo e identificadas como Shewanella putrefaciens. Esta bactéria pode
reduzir o enxofre elementar, sulfito e tiossulfato em sulfeto e usar H2 ou formato como
doador de elétrons (MAGOT et al., 2000). Bactérias termófilas redutoras de ferro e
manganês, Deferribacter thermophilus, foram isoladas a partir de águas de produção
no Mar do Norte (GREENE et al., 1997).
No grupo das espécies anaeróbias facultativas encontradas em poços de
petróleo estão as BRN, que incluem bactérias autotróficas e heterotróficas. Os
principais gêneros heterotróficos desses organismos são: Achomobacter, Aerobacter,
Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Flavobaterium, Lactobacillus, Micrococcus,
Proteus, Pseudomonas e Spirrillum (SEGUI, 2009). As BRN quimiolitotróficas são
representadas por Thiobacillus denitrificans, Sulfurimonas denitrificans (antigamente
conhecido como Thiomicrospira denitrificans) e a espécie autotrófica facultativa
Pseudomonas stutzeri (SHAO et al., 2010).
29
Vários trabalhos relatam a recuperação de bactérias aeróbias de reservatórios
de petróleo. Sette et al. (2007) analisando a composição das comunidades
microbianas em reservatórios de petróleo, utilizando métodos dependentes e
independentes de cultivo, identificaram 9 diferentes grupos taxonômicos. Estes micro-
organismos mostram-se relacionados à Acidithiobacillus, Arcobacter, Alicyclobacillus,
Bacillus, Acinetobacter, Halanaerobium, Leuconostoc, Marinobacter, Rhodococcus,
Streptomyces, Propionibacterium e Streptococcus.
Bactérias aeróbias também foram relatadas por Lopes (2010) estudando a
diversidade taxonômica de bactérias isoladas da água de formação de reservatórios
de petróleo da Bacia de Campos. Os principais gêneros isolados foram: Marinobacter,
Halomonas, várias espécies de Bacillus, Citreicella, Stenotrophomonas,
Achromotobacter, Micrococcus, Kocuria, algumas espécies de Streptomyces, e
Staphylococcus.
Representantes de bactérias do gênero Streptomyces spp. já foram
caracterizados em vários estudos de diversidade bacteriana em campos de petróleo
(LOPES, 2010; OLIVEIRA et al., 2008; SETTE et al., 2007; SILVA et al., 2013). Este
grupo tem uma ampla distribuição em diferentes reservatórios de petróleo em todo o
mundo e tem sido descrito como degradadores de hidrocarbonetos (SETTE et al.,
2007). A recuperação de bactérias do gênero Streptomyces em campos de extração
de petróleo pode revelar uma nova abordagem no desenvolvimento de substâncias
antimicrobianas para a redução dos problemas causados pelas BRS, uma vez que,
esse grupo de micro-organismos é conhecido como potenciais produtores de uma
variedade de metabólitos secundários com atividades biológicas distintas (BÉRDY,
2005).
Uma avaliação abrangente da diversidade, processos metabólicos e condições
de habitat para os micro-organismos do petróleo é de importância prática para avaliar
as potencialidades econômicas dos campos de petróleo. Ela também ajuda na
compreensão de como os fatores bióticos in situ podem afetar as operações de
produção de petróleo (OKORO et al., 2016). Essas informações podem ajudar na
elaboração de medidas de prevenção de problemas associados com a biocorrosão de
equipamentos, a biotransformação e a biodeterioração do petróleo (LOPES, 2010).
30
3.4. Acidificação biogênica dos reservatórios (souring)
A acidificação de reservatórios de petróleo pode ser atribuída a vários
mecanismos, bióticos e abióticos, sendo a geração microbiológica de sulfeto o que
melhor explica o fenômeno. Este mecanismo baseia-se no consumo anaeróbio da
matéria orgânica por micro-organismos através da utilização de íons sulfato como
aceptor final de elétrons (metabolismo desassimilativo do sulfato). O sulfeto gerado
no metabolismo das BRS é um gás altamente tóxico, corrosivo e inflamável, com um
odor desagradável que pode causar sérios problemas de saúde e também problemas
ambientais (FAUQUHAR, 1997; SEGUI, 2009).
O souring é um problema generalizado em toda a indústria do petróleo, que
ocorre tanto em operações onshore (reservatórios terrestres, pouco profundos onde a
redução de sulfato por BRS mesófilas é prevalente) quanto offshore (reservatórios no
fundo do mar em que a injeção de água do mar fornece uma fonte de sulfato para a
atividade de BRS termófilas) (GIEG et al., 2011; NEMATI et al., 2001).
Esse biofenômeno representa um impacto considerável na produção, pois
contribui para o aumento da biocorrosão, reduz a qualidade do petróleo produzido,
afeta a produtividade dos poços pela geração de incrustantes e potencializa os riscos
ambientais devido à toxicidade do sulfeto. Além disso, a necessidade de remoção do
H2S antes da utilização do petróleo e da reciclagem da água produzida, aumenta os
custos de produção (HUBERT; VOORDOUW, 2007; TANG et al., 2009).
Estudos microbiológicos para determinar a presença ou ausência de BRS
indígenas e a quantificação dos nutrientes disponíveis e limitantes antes da injeção
de água, pode ajudar na concepção de medidas de prevenção contra a acidificação
dos campos de petróleo (MAGOT et al., 2000).
3.5. Corrosão Microbiologicamente Influenciada (CMI)
Interações físico-químicas entre um material metálico e o seu ambiente pode
conduzir a corrosão. A corrosão eletroquímica é uma reação que envolve a
transferência de elétrons a partir de metais de valência zero para um aceptor de
elétrons externo, causando liberação dos íons metálicos para o meio circundante e
31
deterioração do metal. Este processo ocorre através de uma série de reações
químicas (anódicas e catódicas), em contato direto ou em estreita proximidade, com
a superfície metálica (BEECH; SUNNER, 2004).
Vários micro-organismos, nomeadamente, bactérias, fungos e algas, estão
envolvidos no processo de corrosão de superfícies. A deterioração de metais devido
à atividade microbiana é denominada biocorrosão ou corrosão microbiologicamente
influenciada (BEECH; SUNNER, 2004; CORTEZ, 2009), que pode ser atribuída,
sobretudo, à colonização inicial de metais e ligas de uso industrial através da formação
de biofilmes, à produção de metabólitos secundários corrosivos como o H2S e à
despolarização catódica (VIDELA, 2002).
Os biofilmes são ecossistemas microbianos extremamente complexos,
podendo ser constituídos por uma diversidade de micro-organismos. Estas estruturas
são constituídas de agregados celulares; material polimérico extracelular (EPS)
resultante do metabolismo microbiano; matéria orgânica e inorgânica; e,
principalmente, de água (Figura 3) (VIDELA, 2002).
Figura 3. Desenvolvimento de biofilme microbiano.
Fonte: Davis (2007).
Os biofilmes são formados em diversos estágios: 1 - adesão de micro-
organismos planctônicos na superfície sólida; 2 - adesão e multiplicação de micro-
organismos aeróbios (sésseis); 3 - crescimento celular e produção de EPS; 4 -
crescimento de micro-organismos anaeróbios internamente ao biofilme; e 5 -
desenvolvimento adicional, formando o biofilme maduro, o que pode favorecer o
desprendimento das camadas mais externas (MADIGAN et al., 2010).
A produção de EPS permite a sobrevivência celular pela fixação a várias
superfícies em seu ambiente natural sob a forma de incrustações. Nesses biofilmes
32
formam-se zonas anaeróbias, ainda que em meios oxigenados, fornecendo aos micro-
organismos condições favoráveis para o seu crescimento (HAMILTON, 1985).
As bactérias que se encontram agregadas, devido ao biofilme, apresentam
algumas vantagens sobre as planctônicas, uma vez que se tornam menos vulneráveis
à ação de antimicrobianos e biocidas em geral, bem como se encontram mais
protegidas de fatores ambientais agressivos. Por outro lado, podem estabelecer-se
ambientes simbióticos, facilitando assim a aquisição de nutrientes e a manutenção da
espécie (CORTEZ, 2009).
Os biofilmes formados em superfícies de materiais metálicos alteram os
processos eletroquímicos da interface solução/metal fornecendo um ambiente
propício às atividades metabólicas das bactérias associadas à biocorrosão, levando a
corrosão do substrato colonizado. Isto é feito por deposição física de substâncias
tóxicas, a formação de subprodutos ácidos e corrosivos, por despolarização da célula
de corrosão através do aumento da utilização de hidrogênio, de oxigênio ou de
composto de ferro no ambiente (OSSAI et al., 2015).
As BRS são apontadas como o grupo responsável pelos casos mais graves da
CMI, estando intimamente relacionadas com a biocorrosão de materiais de ferro e aço
usados na indústria (BEECH; SUNNER, 2004). A biocorrosão, aliada à
potencialização do souring biogênico e ao plugueamento da formação rochosa, levam
ao decréscimo da produção de petróleo e a deterioração de estruturas metálicas e
equipamentos, além de provocar danos ao meio ambiente e à saúde humana
(ALMEIDA et al., 2006; SEGUI, 2009; TANG et al., 2009).
Os problemas associados à biocorrosão e bioincrustação (acumulação
indesejável de depósitos de natureza biológica sobre uma superfície) de sistemas
industriais variam desde a contaminação microbiológica até falhas estruturais devido
à corrosão. As partes do sistema que frequentemente sofrem de tais riscos são:
sistemas de refrigeração (abertos ou fechados); linhas de injeção de água; tanques
de armazenamento; sistemas de tratamento de água residual; sistemas de filtração;
tubulações; membranas de osmose reversa; e sistemas de distribuição de água
potável (VIDELA, 2002).
Para evitar a biocorrosão os métodos empregados devem abordar as seguintes
questões fundamentais: inibição do crescimento e/ou atividade metabólica dos micro-
organismos e a modificação do ambiente no qual o processo de corrosão ocorre (para
evitar a adaptação das bactérias às condições existentes). Os métodos comumente
33
utilizados para prevenir e controlar a CMI são: procedimentos de limpeza; uso de
biocidas; revestimentos protetores; e a proteção catódica (VIDELA, 2002).
3.6. Métodos de prevenção e controle do souring e CMI
Vários métodos podem ser empregados para prevenir e/ou controlar o souring
e a CMI. A escolha do método será definida pela relação custo-benefício, ou seja,
eficiência pretendida e estimativa de custos (GALVÃO, 2008).
Estratégias para o controle do souring e CMI em reservatórios de petróleo
incluem: injeção de AP com baixos teores de sulfato; remoção mecânica do biofilme;
controle da atividade microbiana por injeção de biocidas; injeção de nitrato e/ou nitrito
para inibir a atividade de BRS; combinar tratamentos, tais como injeção de nitrito com
molibdato e/ou biocidas; formação de biofilmes protetores com bactérias benéficas;
ou ainda, micro-organismos antagonistas à atividade das BRS (GIEG et al., 2011).
3.6.1. Limpeza mecânica
Envolve qualquer método capaz de remover depósitos formados sobre
superfícies metálicas. Dentre esses métodos, o tratamento por pigging (utilização de
instrumentos que se deslocam no interior do sistema com a pressão da água ou do
próprio fluido transportado na tubulação, removendo depósitos orgânicos,
incrustações ou qualquer material que esteja aderido à parede interna da tubulação),
se mostra o mais eficaz. A limpeza mecânica também pode ser realizada por
escovação, materiais abrasivos ou utilização de jatos d’água com alta pressão
(GALVÃO, 2008).
3.6.2. Proteção catódica
Proteger catodicamente uma estrutura significa eliminar, por processo artificial,
as áreas anódicas da superfície do metal fazendo com que toda a estrutura adquira
34
comportamento catódico. Como consequência, o fluxo de corrente elétrica
ânodo/cátodo deixa de existir e a corrosão é eliminada. Os métodos de proteção
catódica são: proteção catódica galvânica e proteção catódica por corrente impressa
(GALVÃO, 2008).
3.6.3. Biocidas
Os biocidas são compostos individuais (ou uma mistura de compostos) capazes
de matar micro-organismos ou inibir o crescimento microbiano. Eles podem ser
inorgânicos ou orgânicos e a sua eficácia depende da natureza dos micro-organismos
a serem eliminadas e das condições de operação do sistema a ser tratado (VIDELA,
2002).
Os biocidas de amplo espectro incluem glutaraldeído, tetrakis (hidroximetil)
fosfonio sulfato (THPS), cloreto de benzalcônio, formaldeído, hipoclorito de sódio,
cocodiaminas, entre outros (VIDELA; HERRERA, 2005).
Normalmente, os biocidas comercialmente disponíveis são tóxicos e não
biodegradáveis, alguns, potencialmente perigosos para o pessoal de campos
petrolíferos e o meio ambiente. Eles também são caros e requerem aplicação repetida
ou contínua para que sejam eficazes. Além disso, o uso contínuo de biocidas pode
levar ao aparecimento de populações microbianas resistentes, através da resistência
bioquímica ou por falta de penetração nos biofilmes, in situ, em gasodutos (GIEG et
al., 2011).
3.6.4. Uso de molibdato
O íon molibdato (MoO42-) é um inibidor metabólico de baixa toxicidade
específico de BRS (DE JESUS, 2015). Ele entra na célula por um sistema de
transporte de sulfato e interfere com a formação de APS, a forma ativa do sulfato na
célula durante as reduções assimilativa e desassimilativa. A presença do molibdato
leva à formação de adenosina fosfomolibdato na célula, em vez de adenosina
fosfosulfato, o que provoca escassez de compostos de enxofre reduzidos necessários
ao crescimento bacteriano (NAIR et al., 2015; PATIDAR; TARE, 2005).
35
O molibdato é um inibidor do processo de redução de sulfato, mas a sua
eficácia depende do metabolismo das BRS: é eficaz quando elas estão reduzindo
ativamente sulfato, mas ineficaz se as BRS estão fermentando ou em estado de
repouso (baixa concentração de sulfato) (GIEG et al., 2011). Uma alternativa para o
controle das BRS com o uso de molibdato é a adição consorciada nitrito/molibdato
(dois inibidores metabólicos de BRS), que apresenta atividade inibitória sinérgica,
podendo controlar a produção biogénica de H2S (PERCIVAL, 1999; PREDICALA et
al., 2008).
Além de ser um inibidor metabólico, o molibdato também pode atuar como um
inibidor anódico, formando um filme protetor nas estruturas metálicas, passivando o
metal e reduzindo a corrosão (MODESTO, 2008).
3.6.5. Inibição microbiana da corrosão
É a diminuição da reação de corrosão geralmente realizada por substâncias
(inibidores de corrosão) que, quando adicionadas em pequenas quantidades para um
determinado ambiente, diminui a taxa de ataque por este meio ambiente a um metal
(VIDELA; HERRERA, 2005).
A dificuldade na eliminação das BRS aderidas às estruturas metálicas na forma
de biofilmes e a crescente taxa de resistência dos micro-organismos às estratégias
classicamente usadas (antibióticos/biocidas) tem impulsionado pesquisas que visam
o desenvolvimento de estratégias alternativas para o controle da biocorrosão
(ALBUQUERQUE et al., 2014).
A utilização de micróbios antagonistas ou o produto de seu metabolismo para
eliminar micro-organismos causadores de corrosão é uma alternativa que vem sendo
cada vez mais estudada. Diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar a
inibição da corrosão por bactérias, tais como: consumo de oxigénio na superfície do
metal devido a formação de biofilme; formação de materiais inorgânicos; geração de
antimicrobianos por biofilmes; produção de biossurfactante secretado pelo biofilme; e
inibição de corrosão por bacteriófagos (MORADI et al., 2015).
36
3.7. Antagonismo microbiano
O alto custo, toxicidade e por vezes ineficácia das atuais estratégias físicas e
químicas para controlar a corrosão têm chamado atenção para a utilização de micro-
organismos em mecanismos inibitórios, e isso tem gerado grande interesse. Alguns
dos métodos inibidores incluem aplicações de bactérias redutoras de nitrato, biofilmes
regenerativos, substâncias antimicrobianas (SAM) e uso de bacteriófagos
(ZARASVAND; RAI, 2014).
3.7.1. Exclusão biocompetitiva
A Inoculação de bactérias como antagonistas competitivas em campos de
petróleo tem sido proposta para o controle da acidificação (ZUO, 2007).
O antagonismo bacteriano é um processo em que o crescimento e atividade de um
micro-organismo inibe o crescimento de outro (KRISTIJA; BAI, 2013).
Além de BRS, muitos outros micro-organismos, tais como bactérias redutoras
de nitrato heterotróficas (BRN) e bactérias redutoras de nitrato oxidante sulfeto (BRN-
OS) podem estar presentes nos campos de extração de petróleo. Essas bactérias
estão envolvidas em estratégias de atenuação do sulfeto (Figura 4) (TANG et al.,
2009).
A injeção de nitrato estimula o crescimento de BRN, que irão competir com as
BRS pelas mesmas fontes de carbono, tais como ácidos graxos voláteis. A energia
gerada na redução de nitrato é maior do que a energia obtida a partir da redução de
sulfato, promovendo uma atividade mais intensa das BRN que, por seu metabolismo
energeticamente mais favorável, provoca uma redução das fontes nutricionais
disponíveis para o desenvolvimento das BRS (VIDELA; HERRERA, 2005).
Por outro lado, as BRN-OS são quimiolitotróficas, ou seja, utilizam a energia da
oxidação do sulfeto para obter energia, reduzindo o nitrato a nitrito (VOORDOUW,
2011). Sendo assim, essas bactérias não competem com as BRS por compostos
orgânicos. O nitrito gerado pelo metabolismo das BRN-OS inibe o crescimento das
BRS, pois esse composto inibe a enzima sulfito redutase, responsável por catalisar a
redução do sulfito a sulfeto nas BRS (ZARASVAND; RAI, 2014).
37
Figura 4. Ilustração esquemática da interação dos ciclos enxofre/nitrogênio que podem ocorrer em reservatórios de petróleo.
Fonte: Gieg et al., p. 273, (2011). As interseções entre os ciclos biogeoquímicos do nitrogênio e do enxofre são: 1 - amonificação; 2 - sulfetogênese; 3 - oxidação parcial e completa de sulfeto; 4 - competição de BRN e BRS por doadores de elétrons, juntamente com a redução incompleta de nitrato em nitrito; 5 - reação química com sulfeto e nitrito; 6 - inibição da atividade da enzima sulfito redutase pelo nitrito.
As bactérias oxidantes de sulfeto são conhecidas pelo importante papel na
remoção de H2S in situ a partir dos reservatórios de petróleo onshore e offshore e são
utilizadas nos processos ex situ para o tratamento de gás ácido e águas carregadas
de sulfeto (TANG et al., 2009).
A abordagem microbiana que propõe a alteração das características da água
produzida com nitrato ou uma combinação de nitrato e BRN-OS, surgiu como uma
opção atraente para controlar o souring (TANG et al., 2009). No entanto, apesar dessa
metodologia ter se mostrado eficiente no controle da biocorrosão, a sua ação em
campos petrolíferos nem sempre é previsível. Tais incertezas têm estimulado um
exame dos mecanismos fundamentais da inibição pela utilização de nitrato/nitrito,
revelando um conjunto complexo de interações biológicas, bioquímicas e abióticas
(Figura 4). A importância dessas reações varia entre os reservatórios com diferentes
condições físico-químicas, microbiota e regimes de tratamento secundário (GIEG et
al., 2011).
38
3.7.2. Biofilmes protetores e agentes antimicrobianos
Algumas bactérias produzem biofilmes que inibem a biocorrosão através de
uma série de mecanismos: remoção de agentes de corrosão, produção de peptídeo
inibidor dentro do biofilme, eliminação de bactérias causadoras de corrosão por
agente antimicrobiano e a produção de biossurfactante (ZARASVAND; RAI, 2014;
ZUO, 2007).
Moradi et al. (2015) avaliando o efeito inibidor da corrosão pela formação de
biofilmes protetores observaram que a bactéria Vibrio neocaledonicus sp. e seu
subproduto metabólico aumentou em mais de sessenta vezes a proteção contra a
corrosão do aço carbono. Esse efeito foi causado pela formação de uma camada
inibidora de EPS que cobriu completamente as superfícies metálicas.
Em outro estudo, Jayaraman et al. (1999) avaliando a inibição de BRS por
produção de peptídeos antimicrobianos em biofilmes produzidos por Bacillus
subtilis, descobriram que estas substâncias foram capazes de inibir o crescimento das
bactérias Desulfovibrio vulgaris e D. gigas, reduzindo significativamente as taxas de
corrosão em condição de cultura contínua. Segundo os autores, a produção dessas
substâncias no biofilme tem duas vantagens: a primeira é que ela evita a dificuldade
de difusão biocida em biofilme e a segunda é que mantêm uma concentração mais
elevada do antimicrobiano dentro do biofilme devido às substâncias exopoliméricas
que formam a matriz do biofilme e impedem a sua difusão.
A produção de agentes antimicrobianos por bactérias também pode eliminar os
micróbios associados à biocorrosão. Magalhães (2014), estudando micro-organismos
antagonistas às BRS oriundas de amostras de água produzida, observou que
substâncias produzidas pelas bactérias Halomonas aquamarina e Marinobacter
hydrocarbonoclasticus, ambas com metabolismo desnitrificante, foram capazes de
inibir o crescimento da bactéria Desulfovibrio vulgaris.
Várias bactérias produzem biossurfactantes com atividade antimicrobiana. Os
raminolipídeos de P. aeruginosa e a surfactina de B. subtilis funcionam como
antibióticos, solubilizando os principais componentes das membranas celulares
microbianas (LIN, 1996). Através da excreção destes biossurfactantes no meio, os
micro-organismos adquirem maior chance de sobrevivência e maior competitividade
na busca por nutrientes (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
39
3.7.3. Inibição por bacteriófagos
Bacteriófagos ou fagos são vírus que infectam os procariotos, bactérias e
arqueas, com natureza geral similar à de outros vírus. São constituídos por ácido
nucleico envolto por uma capa proteica (capsídeo), podendo ou não possuir envelope
lipoproteico (MADIGAN et al., 2010). A utilização de bacteriófagos como agentes
antimicrobianos pode ser vantajosa pela sua alta especificidade, precisão e potência
em comparação ao uso de biocidas, possuindo a capacidade de infectar bactérias de
forma seletiva. Além disso, a capacidade de autorreplicação do fago, aumenta a sua
dosagem ao longo do curso do tratamento (ALBUQUERQUE et al., 2014).
3.8. Bioativos para aplicação na indústria do petróleo
Trabalhos realizados na área de tratamento de efluentes apontam o uso de
micro-organismos nos mais variados ramos da atividade industrial: indústria de
alimentos, petróleo, mineração, no tratamento de efluentes e acidentes
potencialmente capazes de impactarem solos e corpos hídricos (NAZIAZENO, 2012).
Tecnologias microbianas são consideradas ferramentas comercialmente competitivas
e ambientalmente sustentáveis que aumentam a produção de petróleo (ALMEIDA;
RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
A recuperação de petróleo por ação microbiana (MEOR) é um método de
recuperação terciária que utiliza micro-organismos (ou seus produtos metabólicos),
para modificar as propriedades físicas e/ou químicas dos reservatórios, facilitando os
processos necessários à mobilização de óleo residual (BANAT, 1995; JACK, 1991;
SHENG, 2013;).
Os mecanismos responsáveis pelo aumento da recuperação observados com
a MEOR são vários e incluem: redução da tensão superficial e interfacial entre óleo e
água, obstrução seletiva por biopolímeros, produção de gás, biodegradação e
alteração da molhabilidade (GOA et al., 2009; SHENG, 2013).
A descoberta de espécies bacterianas produtoras de bioativos de interesse
biotecnológico (capazes de crescer nas condições encontradas na maioria dos
reservatórios), as tornam promissoras para a utilização na tecnologia MEOR
(ALMEIDA; RAMOS-DE-SOUZA, 2010).
40
3.8.1. Biopolímeros
Os polissacarídeos bacterianos podem ser classificados pelas suas funções
biológicas em polissacarídeos intracelulares de armazenagem, polissacarídeos
capsulares, que estão estreitamente ligadas à superfície da célula e polissacarídeos
bacterianos extracelulares (EPS), também conhecidos como gomas hidrossolúveis ou
biopolímeros (SCHMID et al., 2015).
Devido a facilidade de sua obtenção (produção independente de condições
climáticas, possibilidade de utilização de matérias-primas regionais, maior rapidez na
obtenção do produto) os EPS tem sido bastante estudados (SOUZA; GARCIA-CRUZ,
2004).
Na indústria de petróleo os biopolímeros são utilizados para aumentar a
viscosidade da água de inundação, melhorando a mobilização e recuperação do
petróleo em campos maduros (SEN, 2008). Quando o óleo do reservatório tem
viscosidade um pouco elevada, pode-se adicionar polímeros à água de injeção para
transformá-la em um fluido que se desloque dentro do meio poroso com a mesma
mobilidade que o óleo. Devido a essa semelhança, o fluido injetado em vez de
escolher caminhos preferenciais e se dirigir rapidamente para os poços de produção,
se difunde mais no meio poroso, aumentando a eficiência na recuperação. Esses
biopolímeros podem também ser usados para preencher áreas que ficaram vazias
devido ao deslocamento do óleo (GOA et al., 2009; THOMAS, 2004).
Os atributos desejáveis aos biopolímeros utilizados nestas aplicações estão
relacionados, principalmente, às suas propriedades reológicas, que permitem a
formação de soluções viscosas a baixas concentrações e estabilidade em ampla faixa
de pH e temperatura. Atualmente, a goma xantana é o polímero mais utilizado, não
tendo nenhum outro substituto em escala comercial que supere suas qualidades
(LUVIELMO; SCAMPARINI, 2009).
Tendo em vista a larga utilização de biopolímeros em diversos setores
industriais, a busca por novos micro-organismos que produzam EPS em grandes
quantidades e com menor custo de produção tem despertado grande interesse
(BORGES, 2015). Pesquisas tem direcionado esforços em busca da obtenção de
novos biopolímeros. Apesar dos avanços, poucas cepas foram completamente
41
estudadas dentro da ampla diversidade microbiana produtora de EPS (SOUZA;
GARCIA-CRUZ, 2004).
3.8.2. Biossurfactantes
Biossurfactantes são compostos anfifílicos que contêm um grupo hidrofílico e
um grupo hidrofóbico e por isso são capazes de exibir uma variedade de atividades
de superfície que permitem a solubilização de substratos hidrofóbicos (SATPUTE et
al., 2010). Enquanto os surfactantes químicos são classificados de acordo com a
natureza do seu grupo polar, os biossurfactantes são classificados com base em sua
natureza bioquímica (PIRÔLLO, 2006). As principais classes incluem: glicolipídeos,
lipopeptídeos e lipoproteínas, biossurfactantes poliméricos, fosfolipídios e ácidos
graxos (GOUVEIA et al., 2003).
Dentre os glicolipídeos, os mais estudados são os raminolipídeos produzidos
por bactérias do gênero Pseudomonas (GOUVEIA et al., 2003). Já na classe dos
lipopeptídeos destaca-se a surfactina produzida por bactérias do gênero Bacillus
(JOSHI et al., 2013). Esses biossurfactantes apresentam diversas propriedades com
aplicações industriais, tais como detergência, emulsificação, solubilização,
umectabilidade, espumantes e atividade antimicrobiana, dentre outras (NITSCHKE;
PASTORE, 2002).
Muitos agentes tensoativos produzidos e utilizados hoje são sintéticos. Isto
ocorre devido ao alto custo na produção de surfactantes microbianas (CHRISTOFI;
IVSHINA, 2002). Porém, os biossurfactantes apresentam importantes vantagens
sobre os surfactantes químicos, pois, além de serem biodegradáveis e apresentarem
baixa toxicidade, são mais resistentes às variações de temperatura, pH e a condições
de elevada salinidade (ALVAREZ et al., 2015). Outra importante propriedade é a sua
capacidade de apresentar atividade biológica como antimicrobiano.
Na indústria do petróleo os biossurfactantes produzidos pelos micro-
organismos reduzem a tensão superficial óleo-rocha, reduzindo as forças capilares
que impedem a movimentação do óleo através dos poros da rocha (SEN, 2008).
Alguns surfactantes microbianos podem também melhorar a produção de petróleo
através da remoção de detritos e parafinas em suspensão (ALMEIDA; RAMOS-DE-
SOUZA, 2010).
42
As principais estratégias para a utilização de biossurfactantes em MEOR são:
produção em condições industriais, seguido por adição ao reservatório, juntamente
com o fluxo de água (MEOR ex situ); penetração de células metabolicamente ativas
no reservatório para a produção de compostos tensoativos na interface óleo-água; e
a injeção de nutrientes selecionados (e inibidores de crescimento para o crescimento
indesejado) para um reservatório, estimulando assim o crescimento de micro-
organismos indígenas produtores de biossurfactante desejados (BACHMANN et al.,
2014).
A utilização de micro-organismos petrobióticos na MEOR é uma alternativa
incontestavelmente eficiente para melhorar a recuperação de óleo, especialmente em
campos maduros e em reservatórios de petróleo com alto teor parafínico (ALMEIDA
et al., 2004). Para tanto, metodologias de triagem para a seleção de micróbios eficazes
são essenciais para atingir as quantidades e qualidades desejadas de
biossurfactantes (SATPUTE et al., 2010).
43
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Água produzida de campos de petróleo
Os poços de extração de petróleo, onde foram realizadas as coletas das
amostras de efluentes, são campos maduros, pertencentes à região da Bacia do
Recôncavo Baiano que apresentam problemas de souring.
Foram realizadas duas coletas de amostras de água produzida, em períodos
distintos. A primeira coleta (poço A) foi realizada em 29 de outubro de 2014. A amostra
foi obtida de uma estação de tratamento, através de uma tubulação da região
denominada cabeça de poço, local onde ocorre a entrada de água produzida sem
neutralizante.
A segunda coleta (poço B) foi realizada em 11 de março de 2015. A amostra foi
coletada da cabeça de poço numa segunda estação de tratamento.
Após a coleta, as amostras foram transportadas em frascos de borossilicato
âmbar até a unidade laboratorial do LABEM - Laboratório de Biotecnologia e Ecologia
de Micro-organismos, localizado no ICS-UFBA.
4.2. Caracterização das amostras de água produzida
4.2.1. Determinação de íons
Os íons NO3, SO4-2 e HS-, foram determinados por cromatografia de troca
iônica (cromatógrafo iônico ICS3000, Dionex, USA) operando com um detector de
condutividade (MONTES et al., 20015). A coluna usada para ânions foi a Ion Pack
AS23 e o eluente foi o hidróxido de sódio, com um fluxo de 0,25 mL/min e volume de
injeção de 100 μL.
44
4.2.2. Determinação de parâmetros físico-químicos (Eh/pH)
Os parâmetros físico-químicos avaliados foram: potencial redox (Eh) e o
potencial hidrogeniônico (pH). Esses parâmetros indicam as condições eletrolíticas do
meio, permitindo a inferência sobre qual via metabólica ativa durante os testes. Para
realizar as análises foram aliquotadas 7 mL da amostra em tubos polietileno tipo
Falcon de 50 mL. A leitura do potencial redox foi feita em eagametro da Thermo
Electron Corporation, modelo Orion 3 Star com eletrodo de platina e calamelano
saturado e calibrado em solução para -100 mV e 100 mV, os valores foram expressos
em miliVolt (mV). O pH foi medido em peagametro Thermo Electron Corporation,
modelo Orion 3 Star, calibrado em solução padrão para pH 4,0; 7,0 e 10,0.
4.3. Isolamento e caracterização de micro-organismos de amostras de água
produzida.
4.3.1. Isolamento de bactérias da água produzida
Para o isolamento de bactérias com potencial de inibir o crescimento de BRS
foram realizados experimentos-piloto onde foi utilizado um meio a base de glicerina
bruta e borra de petróleo - MBT (nas concentrações de 2 e 0,7%, respectivamente),
como única fonte de carbono suplementados com os seguintes nutrientes: fosfato de
potássio monobásico (5,0 g.L-1); citrato de sódio (0,5 g.L-1); extrato de levedura (0,5
g.L-1) e ágar (1,5%), pH 7,0. Esse meio foi escolhido devido à semelhança com as
fontes de nutrientes disponíveis em poços de extração de petróleo.
O isolamento foi realizado através da técnica das diluições seriadas em placas,
onde 14 mL da amostra de água produzida foi homogeneizada em 125 mL de solução
salina (0,85% NaCl) estéril em frascos de Erlenmeyer de 250 mL (diluição 10-1). A
suspensão foi misturada em agitador rotatório, a 150 rpm por 30 minutos, a
temperatura ambiente.
A segunda diluição (10-2) foi realizada transferindo-se 1 mL da diluição 10-1 para
tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina (0,85% NaCl), e assim
sucessivamente até a diluição 10-3. As amostras foram plaqueadas no meio MBT, e
incubadas em BOD a 38º C, 4 dias. Em seguida foi feita uma raspagem superficial das
45
placas, transferindo uma alçada para tubos contendo o meio Triptona de Soja (TSB)
(Himedia), 38º C, 24 h. Dos tubos que apresentaram crescimento aparente (turvação),
foi retirada uma alçada e, através da técnica de esgotamento por estrias, plaqueada
em Ágar Triptona de Soja (TSA). Colônias que apresentaram crescimento foram
isoladas, purificadas e armazenadas em ultra freezer a -70º C (Figura 5).
Figura 5. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio MBT.
Fonte: Próprio autor.
No intuito de isolar actinomicetos da água produzida (devido ao seu conhecido
potencial na produção de substâncias inibitórias), foi utilizado a técnica das diluições
seriadas em placas, onde 14 mL da amostra foi homogeneizada em 125 mL de
solução salina (0,85% NaCl) estéril em frascos de Erlenmeyer de 250 mL (diluição 10-
1). A suspensão foi misturada em agitador rotatório, a 150 rpm por 30 minutos, a
temperatura ambiente. A segunda diluição (10-2) foi realizada transferindo-se 1 mL da
diluição 10-1 para tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina (0,85% NaCl), e
46
assim sucessivamente até a diluição 10-3. As amostras foram plaqueadas no meio
Ágar Amido Caseína (AAC), seletivo para actinomicetos, contendo 150 mg.L-1 do
antifúngico Fluconazol.
Para análise do perfil bacteriano, foi retirada uma alíquota de 0,1 mL de cada
diluição e inoculada em triplicata na superfície do meio solidificado, espalhando-se
homogeneamente com auxílio da alça de Drigalsky. As placas foram incubadas em
BOD a 28º C, por 10 dias. As colônias foram transferidas para o meio de manutenção
Ágar Extrato de Malte Extrato de Levedura (ISP-2), pH 7.0, pela técnica de
esgotamento por estrias em placa para posterior obtenção das culturas purificadas.
As estirpes purificadas estão mantidas na forma de suspensão de células/esporos em
meio Hogness, a temperatura de - 70º C (Figura 6).
Figura 6. Fluxograma do isolamento de bactérias com o meio AAC.
Fonte: próprio autor.
47
4.3.2. Caracterização - teste de redução do nitrato
O teste de redução do nitrato determina a habilidade do micro-organismo em
reduzir o nitrato (NO3) a nitrito (NO2) ou gás nitrogênio (N2) (desnitrificação). Para o
teste foi utilizado o meio caldo nitrato, em proporções para 1L: peptona 5,0 g ; extrato
de carne 1,5 g; extrato de levedura 1,5 g; cloreto de sódio 5,0 g e nitrato de potássio
0,5 g (ANVISA, 2013).
As cepas isoladas foram ativadas em meio TSB, 24 h. Em seguida, uma
alíquota de 100 μL (109 UFC/mL) foi inoculado em tubos com o meio caldo nitrato
contendo tubos de Durham invertidos (para observar a formação de gás N2). Um tubo
controle (não inoculado) também foi testado.
A presença de nitrito foi detectada pela adição de 0,5 mL da solução ácido
sulfanílico (reagente A) e 0,5 mL da solução α-Naftilamina (reagente B). O
desenvolvimento de cor vermelho tijolo, devido a formação do corante vermelho
diazônio, isto é, p-sulfobenzeno-azo-a-naftilamina, indica a redução de nitrato a nitrito.
Para os tubos que não desenvolveram cor, o nitrato não foi reduzido ou ocorreu
redução tardia a amônia ou gás nitrogênio. Isso foi verificado pela formação de gás
dentro dos tubos de Durham, ou pela adição de 0,001 g de pó de zinco no tubo. O
zinco reduz nitrato a nitrito resultando em cor vermelha. A cor vermelha indica que o
nitrato continua presente e não foi reduzido anteriormente. Ausência de cor vermelha
após a adição de pó de zinco indica que não há nitrato presente e assim o nitrato foi
reduzido além de nitrito (ANVISA, 2013).
4.3.3. Caracterização - teste para bactérias sulfeto-oxidantes
O teste para bactérias sulfeto-oxidantes determina a habilidade do micro-
organismo de reduzir o nitrato (NO3) a nitrito (NO2) (desnitrificação) utilizando o H2S
como única fonte de energia (redução quimiolitotrófica do nitrato através da oxidação
do sulfeto). Para isso foi utilizado o meio Coleville Synthetic Brine (CSB) modificado
(ECKFORD; FEDORACK, 2002).
A solução dos componentes principais, a de elementos-traço e a de
micronutrientes, expressos na Tabela 1 foram preparadas separadamente. Para 1 L
48
de meio CSB modificado, foram adicionados 50 mL de solução de elementos traços e
10 mL de solução de micronutrientes.
A solução de sulfeto de sódio (Na2S.9h2O) 0,1 M foi preparada como solução
estoque estéril e adicionada em alíquotas de 0,25 mL em cada frasco, de modo a
obter a concentração final de 2,5 mM para um volume reacional final de 10,0 mL.
Tabela 1. Composição do meio CSB modificado.
Componente Concentração (g.L-¹)
Componentes principais
KH2PO4 0,027
MgSO4.7H2O 0,680
CaCl2.2H2O 0,240
NH4Cl 0,020
(NH4)2SO4 0,130
NaHCO3 1,900
KNO3 1,000
Resazurina 0,001
Elementos-traço
EDTA 2,000
FeCl3 0,290
CaSO4.2H2O 1,200
MgSO4.7H2O 2,000
NaCl 0,160
Na2HPO4 1,400
KH2PO4 0,720
Componente Concentração (g.L-1)
Micronutrientes
H2SO4 0,005 L
MnSO4.H2O 2,280
ZnSO4.7H2O 0,500
H3BO3 0,500
CuSO4.5H2O 0,025
CoCl2.6H2O 0,045
Fonte: Fonseca, p. 104 (2012).
49
Os meios de cultura foram distribuídos em frascos “tipo penicilina” e purgados
por meio de fluxo de N2 (100%). Os frascos foram esterilizados por 15 minutos por
autoclavação a 121°C e 1 atm. A leitura dos tubos foi realizada após o período de
incubação de 72 horas.
A presença de nitrito foi detectada pela adição dos reagentes A e B
mencionados no item anterior (4.3.2.). Para a determinação do nitrato foi efetuada a
adição de solução de difenilamina ácida. Foi transferido 0,5 mL de cada frasco (antes
de adicionar os reagentes A e B) para tubos de ensaio estéreis com capacidade para
5,0 mL. A ele foi adicionado duas a três gotas da solução difenilamina ácida.
Difenilamina (C6H5)2NH 200 mg
Ácido sulfúrico (H2SO4) 100 mL
A difenilamina oxidada na presença de nitrito ou nitrato é convertida em
difenilbenzidina e, posteriormente, em um sal de coloração azul, denominado
quinoidiamonium. A coloração azul indica a presença de nitrato na amostra e possível
ausência de bactérias desnitrificantes (resultado negativo) (FONSECA, 2012).
4.3.4. Caracterização - teste de redução do molibdato
Para o teste foi utilizado o meio ágar molibdato em proporções para 1 L: glicose
10 g; sulfato de amônio heptahidratado 3,0 g; cloreto de sódio 5,0 g; extrato de
levedura 0,5 g; molibdato de sódio dihidratado 2,4 g e ágar 15 g, pH 7,0. A glicose foi
esterilizada separadamente (SHUKOR et al., 2008).
Os micro-organismos foram ativados em caldo TSB, 24 h. Posteriormente, as
bactérias foram transferidas com o uso de uma alça bacteriológica para o meio ágar
molibdato, e foram incubadas em BOD por 24 h. A presença de colónias azuis significa
que as bactérias reduziram o molibdato.
50
4.4. Estudos laboratoriais de antagonismo
Com o objetivo de realizar o teste de efetividade contra a produção biogênica
de sulfeto, foi feito o teste de antagonismo em placas por sobrecamada (Figura 7).
Uma alíquota de 50 μl das culturas (109 UFC/mL) a serem testadas quanto a
capacidade inibitória foram transferidas para tubos tipo Falcon contendo 10 mL de
caldo TSB, incubados a 38º C, 24 h. Após esse período, as amostras foram
centrifugadas a 8.000 rpm, por 10 minutos, 4º C. O sobrenadante foi transferido para
um novo tubo Falcon estéril e foi centrifugado novamente (MAGALHÃES, 2014). Em
seguida, o sobrenadante foi filtrado com papel filtro 0,22 μm para a remoção de todas
as células microbianas.
Figura 7. Fluxograma do teste de inibição em placas.
Fonte: Próprio autor.
51
Os sobrenadantes livres de células foram transferidos para frascos “tipo
penicilina”, cobertos com parafilme e armazenados em ultra freezer a -70°C por 24
horas. Após esse período, as amostras foram concentradas por liofilização em
liofilizador Liotop, modelo L101, -49°C, pressão abaixo de 500 µHg, ciclo contínuo, 24
h. O material liofilizado foi ressuspenso em 50 µL de água mili-Q estéril (amostras
200x concentradas), armazenado em geladeira, a 4º C, até a realização do teste de
inibição.
A cepa de BRS utilizada para os testes de antagonismo foi a Desulfovibrio spp.,
pertencente a coleção de culturas do LABEM (Laboratório de Biotecnologia e Ecologia
de Micro-organismos). A Desulfovíbrio spp. (inóculo de 1 mL) foi ativada em frascos
de penicilina contendo o meio Postgate modificado (RAMOS, 2013), e incubada a 38º
C, 24 h. Posteriormente, foi feito a contagem das bactérias pelo método do laranja de
acridina (SAMPAIO, 2014). A concentração do inóculo foi ajustada para 1X106
UFC/mL. A partir dessa diluição, 1 mL do inóculo foi transferido para tubos de
penicilina com meio Postgate modificado semissólido 1% (armazenados em banho
maria a 45º C), resultando na diluição 10-5, utilizado para fazer a sobrecamada.
Para os testes de inibição por sobrecamada, 10 μL do caldo livre de células
(200x concentrado) foi inoculado em discos de papel filtro (5 mm) na superfície de
placas contendo o meio Postgate modificado, seguido de secagem por 30min. Após
esse período, foi realizado o inóculo da cepa Desulfovíbrio spp. (105) na forma de
sobrecamada. As placas foram incubadas em câmara de anaerobiose, à 38°C, 48 h.
Para cada um dos isolados, o experimento foi realizado em triplicata. A formação de
um halo claro ao redor das culturas indicou a inibição do crescimento (ROSA et al.,
2013). Para a análise estatística, foi realizado o teste de Scott-Knott, a 5% de
probabilidade.
4.5. Produção de biopolímeros
A capacidade para produzir exopolissacarídeos (EPS) foi determinada com a
metodologia descrita por Paulo et al. (2012). As cepas isoladas da água produzida
foram ativadas em caldo TSB, 24 h. Em seguida, uma alíquota de 5 μL (109 UFC/mL)
foi inoculada em discos de papel de filtro (5 mm) esterilizados colocados sobre a
superfície do meio de cultura modificado contendo 2% de extrato de levedura, 1,5%
52
K2HPO4, 0,02% de MgSO4, 0,0015% MnSO4, 0,0015% de FeSO4, 0,003% de CaCl2,
0,0015% de NaCl, 1,5% de ágar e 10% de sacarose, com pH ajustado para 7,5
(GUIMARÃES et al., 1999). As culturas foram incubadas a 30°C durante 48 h, e a
produção de EPS foi observado com base na formação de uma camada mucoide em
torno dos discos de papel de filtro dos inoculados bacterianas (PAULO et al., 2012).
Esta camada mucoide foi removida com uma alça de inoculação e adicionado em 2
ml de etanol absoluto. A formação de um precipitado confirma a presença de EPS.
Para cada um dos isolados, a análise foi realizada em triplicata. A análise
experimental consistiu de medição com um paquímetro, o diâmetro da camada de
muco em torno dos discos de papel (SANTOS, 2015). Para a análise estatística, foi
realizado o teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
4.6. Produção de biossurfactantes
Para a caracterização da produção de surfactantes, 1 mL das bactérias
isoladas da água produzida (109 UFC/mL) foram ativadas em frascos de Erlenmeyers
de 250 mL contendo 49 mL de caldo TSB e incubadas em BOD a 38º C, 120 rpm, 24
h. Após a incubação, 2,5 mL do inóculo bacteriano foi transferido para Erlenmeyers
de 125 mL contendo 22,5 mL de meio TSB, seguido de incubação a 38º C, 180 rpm,
96 h. Para cada um dos isolados, a análise foi realizada em triplicata. Após esse
período, o caldo de fermentação foi centrifugado a 4.000 rpm, 4º C por 20 min., para
a obtenção do caldo livre de células.
4.6.1. Índice de emulsificação
O índice de emulsificação foi determinado em tubos de ensaio com tampa de
rosca pela adição de 2,0 mL de óleo mineral e 2,0 mL do sobrenadante, agitado em
Vortex por 2 min. e deixado em repouso por 24 horas. O índice de emulsificação (E24)
foi calculado como segue: E24 = [altura da camada emulsionada (mm) / altura total do
líquido na coluna (mm)] x 100. A estabilidade das emulsões ainda foi verificada a cada
30 dias durante 90 dias (HABA et al., 2000).
53
4.6.2. Tensão superficial
A tensão superficial foi determinada no meio de cultura livre de células
utilizando o Tensiômetro KSV (modelo Sigma) a 25º C. Como controle, utilizaram-se
os meios de cultura sem inóculo. As análises foram feitas pelo método do anel de
distanciamento usando o tensiômetro de Du Nouy (JOSHI et al., 2013). Neste método,
a amostra é colocada em um recipiente do aparelho, com o anel inicialmente
submerso. Uma força adicional é exercida sobre o anel no momento em que a lâmina
do líquido vai se romper, sendo então determinada a tensão superficial (DAMIÃO,
2012). A análise foi realizada em triplicata. Para a análise estatística, foi realizado o
teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
4.7. Identificação dos micro-organismos selecionados
4.7.1. Extração de DNA
As bactérias que apresentaram características promissoras para a produção de
bioativos de interesse para a indústria do petróleo foram selecionadas para a
identificação a nível molecular.
Para a extração de DNA foi utilizado o protocolo de extração para células de
crescimento em suspensão, pelo método do Brazol (LGC Biotecnologia). Para a
realização deste protocolo as culturas foram preparadas no dia anterior (crescimento
18\24 horas).
Alíquotas de 1 mL das amostras foram transferidas para tubos tipo Eppendorf
de 1,5 mL. A amostra foi centrifugada a 5.000xg por 5 min, para formar o pellet. Em
seguida, as células foram lisadas através de repetidas pipetagens pela adição de 1
mL do Brazol. Os tubos foram agitados com agitador, tipo Vórtex, por 2 min e
adicionou-se 250 μL de clorofórmio gelado. As amostras foram agitadas novamente.
Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 12.000xg, a 4º C, 20 min. O
sobrenadante foi transferido para novos tubos contendo 500 μL de etanol absoluto
gelado. Os tubos foram agitados por inversão por 2 min, seguido de centrifugação a
12.000xg por 15 min.
54
O sobrenadante foi desprezado por cuidadosa decantação, e o pellet foi lavado
em 500 μL de etanol 70%. As amostras foram homogeneizadas por inversão e
centrifugadas a 12.000xg, 4º C, 10 min. O sobrenadante foi desprezado e o pellet foi
dissolvido em 40 μL de H2O Milli-Q estéril. A amostra foi armazenada em geladeira a
-20º C, até a sua utilização.
4.7.2. Reação de PCR
O mix para a reação de PCR foi realizado em um microtubo com capacidade
para 200 μL. Foi utilizado a Taq PCR Master Mix 2X da Promega e os primers,
conforme descrito abaixo:
Primer RNA ribossomal 16S de Eubactéria
fD1 - 5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'
rP2 - 5' - ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3'
Os reagentes utilizados na reação de PCR, para um volume final igual a 25 μL,
são os que seguem: H2O Milli-Q esterilizada, até 25 μL; enzima Master Mix 12,5 μL;
forward primer (10 μM) e reverse primer (10 μM) 0,8 μL; DNA molde 2 μL.
As reações foram incubadas em um termociclador Veriti® 96 (Aplied
Biosystems), a 95º C, durante 3 minutos, para desnaturação do DNA e ativação da
Taq DNA polimerase (Master Mix 2X). Após a desnaturação, a reação de amplificação
foi composta por 35 ciclos formados por uma etapa de desnaturação, a 95º C durante
45 segundos, uma temperatura de anelamento a 59º C por 45 segundos e uma etapa
de extensão a 72º C, durante 1 minuto. Ao final dos ciclos, a reação foi mantida a 72º
C, durante 20 minutos.
A purificação dos produtos de PCR foi realizada utilizando a enzima illustra
ExoPro Star 1-Step (GE) seguindo as recomendações do fabricante.
55
4.7.3. Reação de sequenciamento
O resultado do PCR gerou um segmento de DNA de aproximadamente 1500
pb e o produto foi sequenciado pela plataforma de sequenciamento da Fundação
Osvaldo Cruz (FIOCRUZ). As sequências foram checadas para presença de chimera
e a árvore filogenética foi construída usando sequências “tipo” do gene rRNA 16S
bacteriano depositados em “Silva” – High Quality Ribosomal RNA Databases. As
sequências foram alinhadas e analisadas pelo programa MEGA 5 usando o teste de
bootstrap para 1000 repetições com a técnica Neighbour-Joining gerado pelo
algoritmo Kimura 2-parâmetros.
56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização físico-química das amostras de água produzida da indústria
do petróleo
Para a caracterização físico-química das amostras de água produzida foram
analisados os parâmetros, pH, Eh, nitrato, sulfato, sulfeto, cloreto e ácidos orgânicos
voláteis. Os resultados da caracterização das amostras de água produzida dos poços
A e B são apresentados na tabela 2.
Tabela 2. Caracterização físico-química da água produzida coletada nos poços A e B.
Poço pH Eh Concentração (mg.L-1)
Nitrato Cloreto Sulfato Sulfeto Ác.Org.*
A 6,2 -158mV 360 22.588 < 2 7,94 < 2
B 7,4 -123mV 907 28.790 3,2 ND < 2
*Ácidos orgânicos voláteis; ND - Não Detectado.
A partir da análise da tabela, pode-se observar que o pH da água de ambos os
poços se mostraram em torno da neutralidade. O potencial hidrogeniônico encontrado
na AP das estações de tratamento foram: 6,2 para o poço A e 7,4 no poço B. Valores
semelhantes foram observados por Kaster et al., (2007) estudando o efeito do nitrato
e nitrito na sulfetogênese por BRS termófilas utilizando amostras de água produzida
do Mar do Norte. Segundo Magot et al. (2000) valores de pH entre 5,0 e 8,0 fornecem
condições adequadas à atividade das BRS.
Já o potencial redox (Eh) foi de -158 mV para o poço A e -123mV para o poço
B, evidenciando que os locais onde foram coletadas as amostras de água produzida
apresentavam caráter redutor. Segundo Postgate (1979) BRS requerem um Eh
negativo para o seu crescimento inicial. Sendo assim, o potencial redox encontrado
para os poços A e B são favoráveis para o crescimento desse grupo de bactérias.
Com relação às concentrações de íons, os dados obtidos através de
cromatografia demonstram que as concentrações de cloreto nos poços A e B foram
22.588 mg.L-1 e 28.790 mg.L-1, respectivamente. Valores superiores (41.180 mg.L-1)
57
foram encontrados por Segui (2009), estudando a bioatenuação da geração de
sulfeto, por meio da utilização de nitrato, em água produzida. Segundo o autor, a alta
concentração de cloreto nas amostras de água produzida é decorrente da presença
desses íons nos materiais rochosos onde se encontra o petróleo.
Com relação às concentrações de nitrato, os valores encontrados para a água
produzida no poço A foi de 360 mg.L-1, inferior ao apresentado pela amostra do poço
B, 907 mg.L-1. Os valores de nitrato encontrados nas amostras de água produzida são
superiores aos relatados por uma série de outros autores: 0,276 mg.L-1, Segui (2009);
0,31/2,63 mg.L-1, Parente (2006); 27,5 mg.L-1, Sousa (2009).
Jenneman et al. (1999) demonstraram, em testes de campo, que a aplicação
de 207 mg.L-1 de NO3 foi suficiente para a remoção total de sulfeto. Já Segui (2009),
estudando a bioatenuação da produção de sulfeto em laboratório, observou que níveis
entre 500 e 1000 mg.L-1 de NO3 foram eficientes na inibição da geração de sulfeto.
Portanto, as altas concentrações de nitrato encontradas no presente trabalho podem
estar relacionadas a aplicação dessa substância nos campos de extração de petróleo
para inibir a geração de sulfeto pelas BRS.
A variável sulfato da água produzida dos poços A e B foram < 2 e 3,2 mg.L-1,
respectivamente. Esses valores diferem dos encontrados por Neumann (2012) que
obteve valores entre 10,31 mg.L-1 e 71,61 mg.L-1, estudando a avaliação de uma nova
metodologia para detecção de micro-organismos redutores de sulfato aplicada à
indústria de petróleo e gás. Ele destaca a importância do íon sulfato em relação às
outras variáveis físico-químicas, uma vez que observou uma correlação direta entre a
disponibilidade de sulfato na água produzida e o crescimento de BRS, com
consequente produção de sulfeto.
As concentrações de sulfeto nas amostras de água produzida foram 7,94 mg.L-
1 para o poço A e não foi detectada no poço B. Esses valores se encontram dentro
das especificações da resolução nº 430 do CONAMA para o descarte de efluentes
(BRASIL, 2011).
Segundo Okoro et al. (2016) baixas concentrações de sulfato, aliado a altas
concentrações de sulfeto são indicativos da ocorrência de souring nos campos de
extração de petróleo. Segundo o mesmo, baixas concentrações de sulfeto detectadas
no laboratório podem subestimar os valores reais do campo devido à alta volatilidade
do H2S.
58
Com relação a presença de ácidos orgânicos voláteis (ácido acético,
propiônico, butírico e ácido pirúvico), as amostras analisadas apresentaram valores
inferiores a 2 mg.L-1. Esses valores se enquadram nos padrões determinados pela
resolução CONAMA nº. 393, que determina a concentração máxima de óleos e graxas
para o descarte da água produzida (BRASIL, 2007). Segundo Grigoryan et al. (2008),
essas fontes de carbono merecem especial atenção na caracterização da água
produzida, pois elas são facilmente metabolizadas pelas BRS, sendo consideradas os
principais doadores de elétrons para a redução desassimilativa do sulfato em campos
de petróleo.
Vale ressaltar que o conhecimento sobre a composição da água produzida é
indispensável para verificar a possibilidade de seu uso nos processos de reinjeção,
assim como prever os possíveis problemas decorrentes do desenvolvimento do
souring biogênico (NEUMANN, 2012).
5.2. Isolamento de bactérias a partir de amostras de água produzida
5.2.1. Bactérias isoladas do poço A
As bactérias isoladas da amostra de água produzida, poço A, estão
representadas na Tabela 3. Os micro-organismos isolados a partir dos meios MBT e
AAC foram caracterizados quanto a sua forma e reação tintorial da parede celular, à
coloração de Gram.
No total, 13 bactérias foram isoladas, sendo 8 provenientes do meio MBT (meio
a base de glicerina bruta e borra de petróleo) e 5 do meio AAC (seletivo para
actinomicetos). O emprego da coloração de Gram teve como objetivo verificar a
pureza das culturas e a forma predominante como os micro-organismos isolados se
apresentavam.
As bactérias isoladas do poço A se apresentaram como: cocos, diplococos,
estafilococos, bacilos e diplobacilos. Com relação a composição da parede celular,
todos os isolados são bactérias Gram positivas (13 isolados), sendo que alguns são
formadores de endosporos, uma estrutura especialmente resistente formada dentro
de uma célula que protege a bactéria das condições ambientais adversas (TORTORA
et al., 2012).
59
Tabela 3. Bactérias isoladas da água produzida - poço A.
Meio origem - MBT
Cepa Gram Forma
Jv1 + Diplococos
Jv4 + Estafilococos
Jv4-1 + Bacilos curtos
Ap1A-MBT + Cocos
Ap1B-MBT + Diplobacilos
Ap1C-MBT + Bacilos
Ap2A-MBT + Bacilos
Ap2B-MBT + Bacilos
Meio origem - AAC
Ap01-A + Diplobacilos
Ap01-B + Bacilos
Ap01-C + Diplobacilos
Ap01-D + Bacilos
AMD + Bacilos
A Figura 8 mostra o aspecto do meio MBT, após inóculo da água produzida e
incubação em estufa bacteriológica a 38º C, 4 dias. A presença da borra de petróleo
como fonte de carbono adicional, forma pequenas gotículas de óleo na superfície do
meio, dificultando a visualização das bactérias. Dessa forma, foi realizado uma
raspagem por toda a superfície do meio de cultura, transferindo o conteúdo para o
meio TSB e, em seguida, para o meio TSA, a fim de realizar o isolamento das bactérias
da água produzida.
Figura 8. Placas com meio MBT após o inóculo da água produzida.
Fonte: próprio autor.
O meio a base de glicerina bruta foi utilizado para o isolamento de bactérias
com potencial antagonista às BRS. Pesquisas demonstram que a glicerina bruta
60
possui composição rica em carbono de fácil degradação sendo utilizada por micro-
organismos como fonte de carbono em seu metabolismo. Além disso, esse meio
apresenta semelhança com as fontes de nutrientes disponíveis em poços de extração
de petróleo (RAMOS, 2011).
Os parâmetros ambientais do reservatório, tais como: temperatura,
permeabilidade, acidez e salinidade limitam os tipos de micro-organismos que podem
ser usados para os processos in situ visando a recuperação do petróleo ou controle
da produção biogênica do sulfeto (ALMEIDA et al., 2004). Dessa forma, o isolamento
de bactérias petrobióticas com meios seletivos e procedimentos de triagem
adequados são etapas importantes para a seleção de micro-organismos produtores
de bioativos que já estão adaptados às condições do campo (ALVAREZ et al., 2015).
5.2.2. Bactérias isoladas do poço B
As bactérias isoladas da amostra de água produzida do poço B estão
representados na Tabela 4. As culturas isoladas nessa amostra também foram
caracterizadas quanto a sua forma e agrupadas de acordo com a composição de sua
parede celular (Gram + ou Gram -).
Tabela 4. Bactérias isoladas da água produzida - poço B.
Meio origem - MBT
Cepa Gram Forma
AT11-1 + Bacilos
AT11-2 + Bacilos AT12 + Bacilos curtos AT13 + Bacilos
AT14-1 - Bacilos AT14-2 - Bacilos AT14-3 + Bacilos
Meio origem - AAC AT1 + Bacilos curtos AT2 + Diplobacilos AT3 - Bacilos AT4 + Bacilos AT5 + Bacilos AT6 + Cocobacilos
No poço B, foram isoladas 13 cepas, sendo 7 provenientes do meio MBT e 6
do meio AAC. A forma bacteriana predominante foi a bacilar, diferindo do resultado
61
encontrado no poço A, onde algumas bactérias se apresentaram na forma de cocos.
Quando analisado a composição da parede celular, 10 bactérias foram classificadas
como Gram positivas e 3 como Gram negativas.
O meio Ágar Amido Caseína utilizado no presente trabalho é seletivo para o
isolamento de actinomicetos, bactérias de grande interesse industrial, conhecidas pela
sua capacidade de produção de substâncias inibitórias frente a outros micro-
organismos (TORTORA et al., 2012). Bactérias do gênero Streptomyces spp.,
representante desse grupo de micro-organismos, já foram caracterizados em vários
estudos de diversidade bacteriana em campos de petróleo (LOPES, 2010; OLIVEIRA
et al., 2008; SETTE et al., 2007; SILVA et al., 2013).
A recuperação de bactérias do gênero Streptomyces em campos de extração
de petróleo pode revelar uma nova abordagem no desenvolvimento de substâncias
antimicrobianas (SAM) para a redução dos problemas causados pelas BRS. Porém,
a diversidade de bactérias encontrada nas amostras de água produzida utilizando o
meio AAC foi baixa. Dessa forma, todas as bactérias que apresentaram crescimento
utilizando esse meio de cultura foram isoladas e submetidas aos testes metabólicos e
de antagonismo.
5.3. Caracterização dos micro-organismos isolados das amostras de água
produzida.
5.3.1. Bactérias Redutoras de Nitrato (BRN)
O resultado do perfil metabólico das cepas isoladas para bactérias redutoras
de nitrato heterotróficas (BRN) é apresentado na Tabela 5.
Das 26 cepas testadas, 24 se mostraram capazes de reduzir o nitrato a nitrito
utilizando uma fonte orgânica de carbono como doador de elétrons (desnitrificação
heterotrófica). Apenas as cepas Ap1C-MBT e AMD, isoladas do poço A, não
reduziram o nitrato. Todas as cepas do poço B mostraram perfil metabólico positivo
para a redução heterotrófica do nitrato. Nenhuma das bactérias testadas apresentou
formação de bolha de gás nos tubos de Durham, indicativo para a redução do nitrato
além do nitrito (N2) (ANVISA, 2013).
62
Tabela 5. Teste metabólico para bactérias redutoras de nitrato (BRN) e bactérias redutoras de nitrato/oxidantes de sulfeto (BRN-OS).
Cepa Teste BRN* Teste BRN-OS**
NO3 NO2 Bolha de gás Crescimento NO3 NO2
Jv1 + - + ●
Jv4 + - + ●●
Jv4-1 + - + ●/-
Ap1A-MBT + - + ●●●
Ap1B-MBT + - - --
Ap1C-MBT - - + ●●●
Ap2A-MBT + - + --
Ap2B-MBT + - + ●●
Ap01-A + - - --
Ap01-B + - + ●●
Ap01-C + - + ●●●
Ap01-D + - + ●
AMD - - + ●●
AT1 + - - --
AT2 + - + ●●●
AT3 + - - --
AT4 + - + ●●
AT5 + - + ●●●
AT6 + - - --
AT11-1 + - + ●●●
AT11-2 + - + ●/-
AT12 + - + ●●
AT13 + - + ●●
AT14-1 + - + ●●●
AT14-2 + - - ●
AT14-3 + - + ●/-
*Interpretação do teste para BRN: (+) reduziu o nitrato; (-) não reduziu o nitrato.
**Interpretação do teste para BRN-OS: (--) não reduziu; (●/-) fraca redução; (●) redução
aparente; (●●) forte redução; (●●●) máximo de redução observada.
A Figura 9 mostra o resultado do teste para BRN. A variável empregada para
determinar a capacidade de reduzir o nitrato a nitrito foi a formação da cor vermelho-
tijolo após a adição das soluções A e B (Figura 9-A/B). As bactérias que não reduziram
o nitrato se mantiveram incolor após o teste (Figura 9-C). Para confirmar a presença
63
do nitrato no meio foi adicionado 0,001 g de zinco (Figura 9-D). Foi utilizado também
2 tubos com o caldo nitrato, sem inóculo, como controle (Figura 9-E/F).
Figura 9. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato.
Fonte: Próprio autor. A/B - resultado positivo para BRN; C - bactéria não reduziu o nitrato a nitrito; D - confirmação da não redução pela presença de nitrato após adição de uma pitada de zinco; E/F - controles negativo e positivo (respectivamente).
O elevado número de bactérias com capacidade de desnitrificação heterotrófica
encontrado no presente trabalho pode estar relacionado aos níveis de nitrato
encontrados para as amostras de água produzida de ambas as estações de
tratamento, 360 mg.L-1 no poço A e 907 mg.L-1 no poço B.
Segundo Voordouw (2011) a adição de nitrato estimula o crescimento de
bactérias redutoras de nitrato (BRN), promovendo uma atividade mais intensa desse
grupo de bactérias nos campos de petróleo, o que provoca uma redução das fontes
nutricionais disponíveis, impedindo o desenvolvimento das BRS. Assim, a adição de
64
nitrato, pode induzir uma mudança na população dominante de BRS para BRN,
reduzindo os danos causados pela CMI.
No entanto, o uso de nitrato como agente controlador da produção de sulfeto é
um processo temporário, pois, pode levar ao aumento de biomassa das BRS.
Consequentemente, quando houver o esgotamento das fontes de nitrato disponíveis,
haverá um aumento significativo na produção de sulfeto, agravando ainda mais os
efeitos do souring (MAGALHÃES, 2014; SOUSA, 2009).
5.3.2. Bactérias Redutoras de Nitrato Oxidantes de Sulfeto (BRN-OS)
A determinação do perfil metabólico das bactérias isoladas como redutoras de
nitrato oxidantes de sulfeto (BRN-OS) é apresentado na Tabela 5.
Primeiramente, foi determinado o crescimento “aparente” das bactérias no meio
CSB. Dos 26 isolados, 20 apresentaram turbidez nos frascos “tipo penicilina”. Para
confirmar o crescimento dos micro-organismos por processo de desnitrificação
autotrófica utilizando o H2S como única fonte de energia, a presença do nitrito na
amostra foi revelada pelo teste de redução do nitrato (ANVISA, 2013).
Das 20 cepas que apresentaram turbidez, 7 mostraram os maiores níveis de
redução do nitrato, outras 7 apresentaram forte redução, evidenciado pela cor
vermelho tijolo formado nos frascos após a adição das soluções A e B. Das 6 bactérias
restantes, 2 se mostraram reativos para a redução quimiolitotrófica do nitrato, 3
apresentaram fraca redução e a cepa Ap2A-MBT não reduziu o nitrato.
Das 6 bactérias que não apresentaram turbidez, 5 se mantiveram incolores
após o teste e não são capazes de reduzir o nitrato de forma autotrófica. No entanto,
a cepa AT14-2 mostrou-se reagente para a presença do nitrito. Ainda analisando a
tabela 5, é possível observar que as cepas Ap1C-MBT e AMD (que não reduziram o
nitrato de forma heterotrófica) mostraram a capacidade de reduzir o nitrato pela
oxidação do sulfeto.
A Figura 10 mostra o resultado do teste para BRN-OS que relaciona a
intensidade da cor formada ao nível de redução do nitrato.
65
Figura 10. Resultado do teste para bactérias redutoras de nitrato sulfeto-oxidantes.
Fonte: Próprio autor. A - controle negativo; B - não reduziu; C - fraca redução; D - redução aparente; E - forte redução; F - máximo de redução observada.
O frasco da figura 10-A foi o controle. Bactérias que não reduziram o nitrato se
mantiveram incolores após a adição dos reagentes (10-B). A presença do nitrato na
amostra foi confirmada pela adição da solução de difenilamina ácida, que na presença
dessa substância, forma um precipitado azul (não mostrado). As bactérias que tiveram
crescimento, apresentaram variada capacidade de redução do nitrato: fraca redução
(10-C); redução aparente (10-D); forte redução, com a formação da coloração
vermelho-tijolo (10-E); e máximo de redução observada nos frascos com cor
enegrecida (10-F).
Todas as bactérias isoladas no presente estudo apresentaram pelo menos um
tipo de redução desassimilativa do nitrato, autotrófica ou heterotrófica. O grande
número de bactérias desnitrificantes encontrado pode estar relacionado a injeção de
nitrato nos poços de petróleo para inibir a geração de sulfeto pelas BRS. Esta ideia é
corroborada por Magalhães (2014) que estudando bactérias com atividade
antagonista às BRS, observou populações de BRN (isoladas de água produzida de
um poço de extração na Bacia do Recôncavo Baiano), 6 vezes maiores que a
66
população de BRS, indicando a adição dessa substância nos campos de extração de
petróleo.
5.3.3. Redução do molibdato
Os resultados para o teste de redução do molibdato são apresentados na
Tabela 6.
Tabela 6. Teste para avaliar a capacidade das bactérias isoladas da água produzida de reduzir o molibdato (VI) a azul de molibdênio (V).
Cepa (Poço A) Redução do
molibdato Cepa (poço B)
Redução do
molibdato
Jv1 ●● AT1 ●
Jv4 ●/- AT2 --
Jv4-1 ● AT3 ●●
Ap1A-MBT ●/- AT4 ●●
Ap1B-MBT ● AT5 ●●
Ap1C-MBT ● AT6 ●
Ap2A-MBT ● AT11-1 ●●
Ap2B-MBT ●● AT11-2 ●
Ap01-A -- AT12 ●●
Ap01-B ● AT13 ●●
Ap01-C -- AT14-1 ●●
Ap01-D ●/- AT14-2 ●●
AMD ● AT14-3 ●
Interpretação do teste: (--) incolor; (●/-) fraca redução; (●) reduziu o molibdato; (●●) forte redução do molibdato.
Das 26 bactérias testadas, 23 apresentaram capacidade de reduzir o molibdato
(VI) a azul de molibdênio (V). No entanto, o nível de redução variou entre os isolados
microbianos: 10 cepas apresentaram forte redução do molibdato, 8 do poço B e 2 do
poço A; perfil de redução intermediária foi observado em 10 bactérias, sendo 6 do
poço A e 4 do poço B; fraca redução do molibdato foi observado em 3 cepas, todas
67
do poço A; e 3 bactérias não apresentaram perfil redutor, 2 do poço A e 1 do poço B.
Pelo resultado exposto percebe-se que a maioria dos isolados oriundos do poço B
apresentaram perfil metabólico para a redução do molibdato.
A Figura 11 mostra a interpretação para o teste de redução do molibdato onde
relaciona a intensidade da cor formada ao nível de molibdênio produzido. Na figura
11-A a bactéria testada não foi capaz de reduzir o molibdato. Já a bactéria mostrada
na figura 11-B apresentou uma fraca redução, pois as colônias se coraram fracamente
em azul. Resultados positivos para o teste foi observado nas figuras 11-C e D, onde
as colônias tendiam a um azul escuro ou se coraram totalmente em azul,
respectivamente.
Figura 11. Teste de redução do molibdato.
Fonte: próprio autor. A - não reduziu o molibdato; B - fraca redução; C - redução intermediária; D - forte redução do molibdato.
Diversos autores relatam a eficiência do molibdato como inibidor metabólico
específico de BRS (NAIR et al., 2015; PATIDAR; TARE, 2005). Contudo, esse
composto apresenta elevado valor comercial, tornando inviável sua utilização em
campos de petróleo (DE JESUS et al., 2015; SOUSA, 2009).
68
Na Malásia, molibdênio, sob a forma de molibdenita é extraído como um
subproduto da mineração de cobre e tem havido relatos de vários casos de poluição
causado por vazamento acidental de sistema de transporte de metal e lixiviação dos
metais do local de mineração (SHUKOR et al., 2008). No Brasil o molibdênio é extraído
como um coproduto ou subproduto da mineração de esmeraldas, na região de Campo
Formoso e Pindobaçu, na Bahia (BRAGA, 2013).
Biorremediação usando enzimas microbianas para tratar a poluição por metais
pesados é um processo revolucionário que tem crescido extensivamente na era da
biotecnologia. A redução de molibdato por micro-organismo é um fenômeno
interessante porque o produto mostra um azul intenso permitindo que o progresso da
redução seja observado (SHUKOR et al., 2008). Esse processo pode ser utilizado
para imobilizar molibdénio solúvel em formas insolúveis, reduzindo a sua toxicidade.
O produto azul de molibdênio adere fortemente às células indicando que a remoção
do metal a partir de solução tem potencial de biorremediação (OTHMAN et al., 2013).
Testes piloto em nosso laboratório tem demonstrado o potencial inibidor do azul
de molibdênio produzido pelas bactérias isoladas da água produzida frente as BRS
(dados não mostrados). Sendo assim, estudos combinados de biorremediação,
associado a produção de um composto inibitório de baixo custo, mostra-se uma
alternativa interessante para aplicação na indústria do petróleo.
5.4. Testes laboratoriais de antagonismo
O resultado dos testes laboratoriais de antagonismo em placas é mostrado na
Figura 12. Das 26 cepas testadas quanto ao potencial inibidor contra a bactéria
Desulfovíbrio spp., 10 apresentaram algum tipo de inibição microbiana. Halos de 6
mm foram observados para as cepas AP2A-MBT e AT11-1. A bactéria AP1A-MBT
obteve halo de 7 mm. Outras 4 linhagens produziram halos de 8 mm (JV4, AP1B-MBT,
AP1C-MBT e AP2B-MBT).
Os melhores resultados obtidos para os testes de inibição foram observados
para as bactérias AMD (10 mm), AT6 (11 mm) e AT11-2 (13 mm). Valores superiores
aos obtidos por Magalhães (2014), que testando bactérias com atividade antagonista
às BRS oriundas de amostras de água produzida de poços de petróleo, obteve halos
69
entre 7 e 9 mm para a cepa Halomonas aquamarina e 8-9 mm para a cepa
Marinobacter hydrocarbonoclasticus.
Figura 12. Atividade antimicrobiana das cepas isoladas da água produzida contra a Desulfovibrio spp.
Fonte: Próprio autor. Médias seguidas pela mesma letra, entre as barras, não diferem pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
A inibição mais expressiva encontrada no presente trabalho (13 mm para a
cepa AT11-2) foi superior ao relatado por Rosa et al. (2013) estudando o antagonismo
de bactérias do gênero Streptomyces contra bactérias envolvidas em processos
biocorrosão, que obtiveram halos de 12 mm. O sobrenadante da cepa Streptomyces
lunalinharesii 235, que apresentou atividade inibitória frente à bactéria
Desulfovibrio alaskensis, estava concentrado 300 vezes. Diferente dos sobrenadantes
das amostras testadas no presente trabalho, concentrados 200 vezes.
A Figura 13 mostra a diferença entre o controle negativo, placa apenas com
BRS (13-A), e a formação dos halos de inibição pela adição das SAM (13-B).
70
Figura 13. Teste de antagonismo em placas por sobrecamada das cepas isoladas da água produzida contra a cepa Desulfovibrio spp.
Fonte: própria autor. A - Controle negativo; B - Halo de inibição.
A inibição de bactérias redutoras de sulfato pela produção de SAM tem sido
relatada em vários trabalhos na literatura. Jayaraman et al. (1999) avaliando a inibição
de BRS por produção de peptídeos antimicrobianos em biofilmes produzidos por
Bacillus subtilis, evidenciaram que estas substâncias foram capazes de inibir o
crescimento das bactérias Desulfovibrio vulgaris e D. gigas, reduzindo
significativamente as taxas de corrosão em condição de cultura contínua.
Gana et al. (2011) estudando o potencial antagonista de uma espécie
nanopatogênica de Bacillus sp., obtido a partir de um campo de petróleo argelino
contra um consórcio de BRS, observaram que o inibidor biológico produzido pela cepa
apresentou melhor desempenho e eficácia na inibição da produção de sulfeto pelas
BRS, quando comparado com o biocida químico THPS.
Rosa et al. (2013) estudando o potencial inibitório de bactérias do gênero
Streptomyces contra bactérias envolvidas em processos de biocorrosão, observaram
SAM de caráter proteico capazes de inibir a bactéria Desulfovibrio alaskensis.
Já Moradi et al. (2015) avaliando o efeito inibidor da corrosão pela formação de
biofilmes protetores observaram que a bactéria Vibrio neocaledonicus sp. e seu
subproduto metabólico aumentaram em mais de sessenta vezes a proteção contra a
corrosão do aço carbono.
Atualmente, existe uma busca crescente por moléculas eficientes e menos
tóxicas (green molecules) para o controle dos problemas causados pelas BRS na
indústria do petróleo (ALBUQUERQUE et al., 2014). Dessa forma, bactérias que
apresentam atividade inibitória frente a Desulfovíbrio spp., mostram-se como
71
potenciais produtoras de SAM contra os micro-organismos causadores dos processos
de biocorrosão (ROSA et al., 2013).
5.5. Produção de biopolímeros
A produção de EPS foi observado em todos os isolados da água produzida. A
Figura 14 apresenta gráfico com a média dos resultados obtidos para a produção de
biopolímeros com base no diâmetro da camada de muco (mm). Foi aplicado um teste
de comparação de médias (Scott-Knott), para determinar se havia diferença
significativa na produção de biopolímeros entre os isolados.
Figura 14. Produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida.
Fonte: Próprio autor. Médias seguidas pela mesma letra, entre as barras, não diferem pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Considerando a produção média de biopolímeros (mm), pode-se observar que
houve diferença estatística entre os cultivos isolados da água produzida. As maiores
produções foram encontradas para as cepas JV4, JV4-1, AMD e AT11-2 (40 mm). Já
72
os menores valores encontrados para a produção de EPS foram observados para as
cepas AP01-A, AP01-D, AT1 e AT2 (entre 4 e 8 mm).
A Figura 15 mostra a confirmação da produção de biopolímeros pelas bactérias
isoladas da água produzida.
Figura 15. Confirmação da produção de EPS pelas bactérias isoladas da água produzida.
Fonte: Próprio autor.
A presença de EPS associados a células bacterianas pode ser reconhecido
pela formação de colônias mucosas em meio sólido (15-A) ou pela formação de longos
filamentos pela extensão da colônia com uma alça de inoculação (15-B). A
confirmação da produção de biopolímeros é vista na Figura 15-C pela formação de
um precipitado após a adição do etanol (PAULO et al., 2012; RUAS-MADIEDO;
REYES-GAVILÁN, 2005).
Micro-organismos produtores de EPS são importantes para a tecnologia
MEOR uma vez que tais compostos podem aumentar a recuperação de petróleo
através da modificação do perfil geológico do reservatório (BACHMANN et al., 2014).
73
Os biopolímeros são utilizados para aumentar a viscosidade da água de inundação,
melhorando a mobilização e recuperação do óleo em campos maduros. Eles ainda
podem ser utilizados para bloquear de forma seletiva zonas de alta permeabilidade,
assegurando que a subsequente injeção de água produzida aumente o varrimento do
petróleo (SEN, 2008; SHENG, 2013).
Além das aplicações citadas, os EPS produzidos por micro-organismos tem
sido fonte de estudo de muitos pesquisadores na busca por cepas microbianas
capazes de produzir biofilmes benéficos para inibir ou reduzir os efeitos nocivos
causados pelas BRS na indústria do petróleo (GHAFARI et al., 2013; JAYARAMAN et
al., 1999; MORADI et al., 2015; ZARASVAND; RAI, 2014).
A busca por novos micro-organismos que produzam EPS em grandes
quantidades com menor custo de produção tem despertado grande interesse
(BORGES, 2015). A indústria anseia por novos biopolímeros que possuam
propriedades reológicas distintas, com estabilidade em ampla faixa de pH, salinidade
e temperatura (GAO, 2015).
5.6. Produção de biossurfactante
5.6.1. Índice de emulsificação
Os critérios utilizados para selecionar bactérias produtoras de biossurfactantes
são: habilidade de produzir emulsificado, reduzir a tensão superficial abaixo de 40
mN/m, além de manter pelo menos 50% do volume da emulsão original 24h após sua
formação (DAMIÃO, 2012).
A Figura 16 mostra a quantificação em porcentagem da produção de
biossurfactante através do método de índice de emulsificação. Comparando as
linhagens entre si observou-se que as bactérias JV1, JV4, AMD, AT4, AT6 e AT11-2,
apresentaram índice de emulsificação acima de 50% após 24 horas. A produção de
biossurfactante para essas cepas variou entre 54 e 68%, sendo as maiores produções
observadas para as cepas AT6 (60%) e AMD (68%).
Esses valores são semelhantes aos encontrados por Damião (2012) que
estudando a produção de biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa e a
74
bioprospecção de genes relacionados com raminolipídeos em diferentes meios,
obteve índice de emulsificação entre 60 e 64%.
Figura 16. Quantificação em porcentagem da produção de biossurfactante através do método de índice de emulsificação.
Fonte: Próprio autor.
Com exceção da cepa AT4, todas amostras com índice de emulsificação maior
que 50% permaneceram com emulsão estável por mais de 90 dias de produção. A
produção de emulsões estáveis permite ao micro-organismo se aderir a superfícies
hidrofóbicas muito fortemente, com implicações na capacidade de biodegradação
(CHRISTOFI; IVSHINA, 2002).
5.6.2. Análise da tensão superficial
Visando analisar a eficiência do biossurfactante produzido pelas cepas isoladas
da água produzida no meio TSB, foram efetuadas medidas da tensão superficial
(Figura 17). A tensão superficial do controle (meio de cultura sem inóculo) foi 53,2
mN/m. Bons produtores de biossurfactante reduzem a tensão superficial a 40mN/m
ou menos (HABA et al., 2000).
75
Das 26 cepas testadas, 10 apresentaram valores inferiores a 40 mN/m. As
reduções da tensão superficial para essas linhagens variaram entre 27,83 e 31,92
mN/m, sendo o melhor resultado observado para a cepa AT11-2 (27,83 mN/m).
Porém, os resultados não diferiram estatisticamente entre eles.
Figura 17. Análise da redução da tensão superficial para as bactérias isoladas da água produzida.
Fonte: Próprio autor. Médias seguidas pela mesma letra, entre as barras, não diferem pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Gouveia et al. (2003), estudando bactérias produtoras de biossurfactante
isolados de poços de petróleo, obtiveram valores para a redução da tensão superficial
entre 28,2 e 34,05 mN/m, para linhagens de Pseudomonas produtoras de
raminolipídeos.
Bento et al. (2005) avaliando a diversidade de micro-organismos produtores de
biossurfactante, obtiveram o melhor resultado para redução da tensão superficial (41,1
mN/m), utilizando um consórcio bacteriano isolado de solos contaminados com óleo
diesel.
Joshi et al. (2013) estudando a produção de biossurfactante por linhagens
pertencentes ao gênero Bacillus spp., observaram 24 estirpes com atividade de
tensão superficial entre 28 e 35 mN/m. Essas bactérias foram isoladas de habitats
76
diversos (águas termais, oceano, poços de petróleo, bomba de gasolina, etc.), com
alta salinidade e/ou temperatura, sendo que a cepa identificada como
B. licheniformis TT42, apresentou redução da tensão superficial para 28 mN/m, contra
o petróleo bruto a 80º C. Segundo os autores, os resultados obtidos aumentam a
possibilidade de utilizar bactérias desse gênero, nos processos de recuperação
melhorada do petróleo.
Analisando conjuntamente o índice de emulsificação (Figura 16) e a eficiência
do biossurfactante produzido (Figura 17), pode-se observar que as cepas JV1, JV4,
AMD, AT6 e AT11-2 obtiveram os melhores resultados.
Alvarez et al. (2015) estudando estirpes bacterianas produtoras de
biossurfactante com potencial biotecnológico para aplicação em MEOR, selecionaram
a bactéria Bacillus amyloliquefaciens TSBSO 3.8, por produzir um composto de alta
atividade, com índice de emulsificação de 63%, tensões superficial e interfacial de
28,5 e 11,4 mN/m (respectivamente), utilizando o meio de cultura TSB. Esses
resultados se assemelham aos obtidos pelas cepas selecionadas como produtoras de
biossurfactante no presente trabalho (Figura 18).
Figura 18. Análise comparativa do índice de emulsificação (%) e tensão superficial (mN/m) para as cepas selecionadas como produtoras de biossurfactante.
Fonte: Próprio autor. Médias seguidas pela mesma letra, entre barras, não diferem pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
77
Analisando a figura é possível observar que os melhores resultados para o
índice de emulsificação e para a redução da tensão superficial foram obtidos pelas
cepas AMD (68%) e AT11-2 (27,83 mN/m), respectivamente. Os valores encontrados
para essas linhagens diferiram estatisticamente dos demais micro-organismos.
Consórcios bacterianos exibem uma grande variedade de mecanismos
metabólicos na quebra dos componentes do óleo, incluindo a produção de agentes
emulsionantes e tensoativos (BENTO et al., 2005).
Almeida et al. (2004), estudando a seleção de micro-organismos para aplicação
em MEOR, obtiveram as melhores taxas de mobilização de óleo em experimentos de
laboratório utilizando consórcio bacteriano de Bacillus brevis, B. licheniformis e B.
polymyxa. Sendo assim, a utilização das cepas AMD e AT11-2 como consórcios
petrobióticos produtores de bioativos com complementaridade metabólica, pode ser
uma alternativa interessante para a tecnologia MEOR.
5.7 Identificação molecular das cepas selecionadas como produtoras de
bioativos
A Tabela 7 mostra as linhagens bacterianas que foram selecionadas para a
identificação molecular devido a seus desempenhos na produção de compostos
bioativos para aplicação na indústria do petróleo.
Tabela 7. Bactérias produtoras de bioativos selecionadas para identificação a nível molecular.
Caract. destaque: Inibição; Biossurfactante; Biopolímero; Redução do Molibdato.
Cepa Halo Biossurfactante
Biopolímero Molibdato Emulsificação Tensão mN/m
JV4 8mm 54% 29,6 40mm -+
AP1B-MBT 8mm 6% 54,3 20mm +
AP1C-MBT 8mm 10% 51,1 22mm +
AP2B-MBT 8mm - 54,3 32mm ++
AMD 10mm 68% 29,6 40mm +
AT4 - 58% 51,9 28mm ++
AT6 11mm 60% 29,6 24mm +
AT11-2 13mm 56% 27,8 40mm +
78
A sequência (~700 pb) do rRNA 16S das oito cepas selecionadas como
produtoras de bioativos revelaram uma significativa homologia (P≥95%) com as
sequências de Bacillus sp. (3), Bacillus subtilis (1), Bacillus thurigiensis (1), Bacillus
pumilus (1), Bacillus cereus (1) e Staphylococcus sp. (1).
As sequências homólogas obtidas nesse trabalho foram identificadas através
de análise filogenética comparando com micro-organismos “tipo” depositados no site
“Silva” – High Quality Ribosomal RNA Databases (Figura 19).
A partir da análise filogenética das sequências de rRNA 16S dos isolados é
possível observar que as cepas AP1B-MBT, AP1C-MBT e AT4 apresentaram alta
identidade, sendo agrupadas com a bactéria Bacillus sp. Já os isolados AP2B-MBT,
AMD e AT6 estão relacionados com as espécies Bacillus subtilis, Bacillus thurigiensis,
Bacillus pumilus e Bacillus cereus.
Várias espécies de Bacillus são extremamente diferentes em diversos aspectos
metabólicos e fisiológicos. Contudo, elas são intimamente relacionadas, sendo
consideradas pelos taxonomistas como variantes de uma mesma espécie, diferindo
essencialmente por genes carreados em plasmídeos, que são facilmente transferidos
de uma bactéria para outra (TORTORA et al., 2012).
Figura 19. Análise filogenética das sequências parciais do gene rRNA 16S (~700 pb) obtidas a partir das cepas produtoras de bioativos.
Fonte: próprio autor.
Borrelia rectrrentis AF107360
Pseudomonas sp
Pseudomonas aeruginosa PACS2
AT6
AP2B
Bacillus thuringiensis AB741470
AMD
Bacillus pumilus AB020208
Bacillus cereus G9241
Bacillus subtilis AB018484
clone OPB54 AF027087
AT11-2
Arcobacter butzleri DQ464342
AP1B
AP1C
KP207648 Bacillus sp
AT4
Thermovibrio ammonificans AY263403
Thermovibrio ruber AJ316619
99
38
25
25
12
10
29
5
0.5
79
A prevalência das bactérias selecionadas como pertencentes ao gênero
Bacillus é corroborado pelos dados na literatura sobre a distribuição generalizada de
Bacillus spp. em ambientes associados ao petróleo, incluindo reservatórios de
petróleo (OLIVEIRA et al., 2008; SETTE et al., 2007; VASCONCELLOS et al., 2010).
Bactérias do gênero Staphylococcus também já foram detectados em amostras de
petróleo em estudos anteriores (LOPES et al., 2010; SILVA et al., 2013).
Vasconcellos et al. (2009) estudando o isolamento e a capacidade de
biodegradação de bactérias em amostras de petróleo, isolaram vinte e oito estirpes
bacterianas aeróbias a partir do óleo biodegradado e água de formação. Essas
bactérias foram identificadas como Bacillus sp., Bacillus pumilus, Halomonas sp.,
Pseudomonas stutzeri, Microbacterium sp., Micrococcus sp., Brevibacillus sp. e
Methylobacterium sp.
Lopes (2010) estudando a diversidade taxonômica de bactérias isoladas da
água de formação de reservatórios de petróleo da Bacia de Campos, relatou bactérias
aeróbias pertencentes aos gêneros: Marinobacter, Halomonas, várias espécies de
Bacillus, Citreicella, Stenotrophomonas, Achromotobacter, Micrococcus, Kocuria,
algumas espécies de Streptomyces, e Staphylococcus.
Silva et al. (2013) estudando a diversidade de comunidades microbianas em
amostras de petróleo da Bacia do Potiguar isolaram vinte e três estirpes bacterianas
aeróbias por meio de cultivo que pertenciam aos gêneros Curtobacterium, Kocuria,
Janibacter, Brevundimonas, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Petrobacter e
Brachymonas.
80
6. CONCLUSÕES
A presença de poços de extração de petróleo com problema de biocorrosão é
uma realidade na Bacia do Recôncavo Baiano e mostra a necessidade de
desenvolvimento de alternativas menos nocivas (como a utilização de SAM) para o
controle e redução dos problemas causados pelas BRS.
Os procedimentos de isolamento e caracterização utilizados neste trabalho
mostraram-se eficientes para a seleção apropriada de uma variedade de bactérias a
partir da água produzida.
O elevado número de bactérias com capacidade de desnitrificação encontrado
no presente trabalho pode estar relacionado aos níveis de nitrato encontrados para as
amostras de água produzida de ambas as estações de tratamento.
Isolados microbianos com perfil metabólico para a redução do molibdato
possibilita o desenvolvimento de estudos combinados de biorremediação, associado
a produção de compostos inibitórios de baixo custo, sendo uma alternativa
interessante para aplicação na indústria do petróleo.
Os melhores resultados obtidos para os testes de inibição foram observados
para as bactérias AMD (10 mm), AT6 (11 mm) e AT11-2 (13 mm). A inibição de
bactérias redutoras de sulfato pela produção de SAM por linhagens isoladas da água
produzida, demonstra o potencial uso dessas cepas a fim de reduzir os problemas
causados pela BRS na indústria do petróleo.
O screening rápido para determinar o potencial de micro-organismos isolados
da água produzida como produtores de EPS mostrou-se eficiente. Faz-se necessário
estudos complementares para determinar o tipo de biopolímero produzido, suas
características reológicas e sua potencial aplicação na tecnologia MEOR.
As cepas JV1, JV4, AMD, AT6 e AT11-2 apresentaram os melhores resultados
para a produção de biossurfactantes. Além disso, as amostras mantiveram emulsão
estável por mais de 90 dias de produção. Os resultados obtidos pelas cepas AMD
(68%) para o índice de emulsificação e AT11-2 (27,83 mN/m) para a redução da
tensão superficial, merecem especial atenção, uma vez que, consórcios petrobióticos
produtores de bioativos com complementaridade metabólica podem ser uma
alternativa interessante para a tecnologia MEOR.
81
A maioria das bactérias selecionadas como produtoras de bioativos foram
identificadas como pertencentes ao gênero Bacillus.
Esta pesquisa serve como base para o desenvolvimento de diversos trabalhos
com potencial aplicação na indústria do petróleo, tais como: (1) inibição de BRS por
produção de substâncias antimicrobianas; (2) utilização das bactérias em processos
de biorremediação; (3) e a constituição de consórcios microbianos que podem ser
utilizados para a tecnologia MEOR.
82
REFERÊNCIAS
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APÊNDICE
Caracterização dos micro-organismos isolados da água produzida.
Cepa Molecular Inibição Biossurfactante
EPS Molibdato BRN BRN-OS Emulsão Tensão
JV1 - - 58% 30,5 mN/m 19 mm ++ + ●
JV4 Staphylococcus sp. 8 mm 54% 29,6 mN/m 40 mm -+ + ●●
JV4-1 - - 38% 29,6 mN/m 40 mm + + ●/-
AP1A-MBT - 7 mm 30% 55,8 mN/m 24 mm -+ + ●●●
AP1B-MBT Bacillus cereus 8 mm 6% 54,3 mN/m 20 mm + + --
AP1C-MBT Bacillus sp. 8 mm 11% 51,1 mN/m 22 mm + - ●●●
AP2A-MBT - 6 mm 8% 43,9 mN/m 24 mm + + --
AP2B-MBT Bacillus subtilis 8 mm - 54,3 mN/m 32 mm ++ + ●●
AP01-A - - - 50,2 mN/m 5 mm - + --
AP01-B - - 20% 46,1 mN/m 23 mm ++ + ●●
AP01-C - - - 53,2 mN/m 18 mm - + ●●●
AP01-D - - - 51,0 mN/m 4 mm -+ + ●
AMD Bacillus pumilus 10 mm 68% 29,6 mN/m 40 mm + - ●●
AT1 - - - 44,3 mN/m 9 mm + + --
AT2 - - - 53,0 mN/m 7 mm - + ●●●
AT3 - - - 50,9 mN/m 22 mm ++ + --
AT4 Bacillus thurigiensis - 58% 51,8 mN/m 28 mm ++ + ●●
AT5 - - - 29,5 mN/m 24 mm ++ + ●●●
AT6 Bacillus sp. 11 mm 60% 29,5 mN/m 34 mm + + --
AT11-1 - 6 mm 21% 31,9 mN/m 16 mm ++ + ●●●
AT11-2 Bacillus sp. 13 mm 56% 27,8 mN/m 40 mm + + ●/-
AT12 - - - 50,1 mN/m 27 mm ++ + ●●
AT13 - - 17% 43,5 mN/m 22 mm ++ + ●●
AT14-1 - - 20% 45,5 mN/m 25 mm ++ + ●●●
AT14-2 - - 21% 30,7 mN/m 24 mm ++ + ●
AT14-3 - - 40% 29,2 mN/m 22 mm + + ●/-