universidade federal da bahia faculdade de … · doutora suzana telles da cunha lima. e a quem eu...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
EDGARD FREITAS DE SIQUEIRA JUNIOR
PERFIL DE EXPRESSÃO PROTÉICA DE LEVEDURAS COMERCIAIS DO
GENERO SACCHAROMYCES E O PAPEL DAS PROTEINAS NA SELEÇÃO DE
ESPÉCIES COM POTENCIAL BIOTECNOLOGICO
Salvador
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
EDGARD FREITAS DE SIQUEIRA JUNIOR
PERFIL DE EXPRESSÃO PROTEICA DE LEVEDURAS COMERCIAIS DO
GENERO SACCHAROMYCES E O PAPEL DAS PROTEINAS NA SELEÇÃO DE
ESPÉCIES COM POTENCIAL BIOTECNOLOGICO
Orientador: Prof. Dr. Celso Duarte Carvalho Filho.
Co-orientadora: Prof.ª ª Dra. Suzana Telles da Cunha Lima
Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal da Bahia, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação em
Ciências de Alimentos para a obtenção do titulo de
Mestre.
Salvador
2013
Sistema de Bibliotecas da UFBA
Siqueira Junior, Edgard Freitas de. Perfil de expressão protéica de leveduras comerciais do gênero saccharomyces e o papel das proteínas na seleção de espécies com o potencial biotecnológico / Edgard Freitas de Siqueira Junior. - 2013. 168 f.: il. Inclui anexos e apêndices. Orientador: Prof. Dr. Celso Duarte Carvalho Filho. Co-orientadora: Profª Drª Suzana Telles da Cunha Lima.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2013.
1. Biotecnologia. 2. Saccharomyces cerevisiae. 3. Fermentação. 4. Leveduras. 5. Leveduras (Fungos). 6. Etanol. l. Carvalho Filho, Celso Duarte. II. Lima, Suzana Telles da Cunha. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia. IV. Título. CDD - 620.8 CDU - 60
Érica Francisca de Souza
AGRADECIMENTOS
Se você está lendo esta mensagem é porque eu consegui. E não foi fácil chegar até
aqui. Do processo seletivo, passando pela aprovação até a conclusão do Mestrado,
foi um longo caminho percorrido. Nada foi fácil, nem tão pouco tranquilo. “A sola do
pé conhece toda a sujeira da estrada” (proverbio africano).
Foram momentos muito difíceis. Difícil ao ponto de pensar em desistir. Mas ai eu
parei e percebi que existiam pessoas que acreditavam em mim e que me fizeram
crer que ia ser possível finalizar esse projeto de vida.
“Toda pessoa sempre é as marcas das lições diárias de outras tantas pessoas”
(Caminhos do Coração – Gonzaguinha).
E em se falando de marcas e lições diárias, o meu agradecimento inicial é a Deus,
por não desistir de mim, por aquebrantar meu coração e acalma-lo, me dando forças
para seguir em frente. A ti MEU PAI MEU MUITO OBRIGADO. A Jesus Cristo por
me guiar e me manter firme e forte e por afastar todo maligno que me tentou freiar
nessa jornada. A ti SENHOR O MEU MUITO OBRIGADO.
Nesse mestrado eu tive a oportunidade de conhecer vários profissionais, várias
personalidades. Mas uma com TODA CERTEZA DO MUNDO me marcou
profundamente. Pelo seu lado pessoal: pela simplicidade, pela humildade, pelo
carisma, pela generosidade, pela amizade, pela confiança, pela integridade. Pelo
seu lado profissional: pela competência, pelo conhecimento, pela garra, pela
determinação, pela força de vontade, pela bravura, pela ética. Essa MULHER e
PROFISSIONAL a quem eu tanto agradeço é a minha Co-orientadora Professora
Doutora Suzana Telles da Cunha Lima. E a quem eu devo tantas desculpas pelos
momentos tensos em que vivemos.
O outro GRANDIOSO PROFISSIONAL e HOMEM que também eu devo os meus
agradecimentos é ao meu Orientador Professor Doutor Celso Duarte de Carvalho,
que entendeu as minhas dificuldades e principalmente acreditou em mim e também
enxergou a possibilidade de que esse projeto poderia sim dá certo. E que esteve ao
meu lado no inicio, meio e fim dessa passagem. A você professor sou meu grato
pelos nortes e pelos caminhos que me direcionou a caminhar.
Gostaria de agradecer também a minha mãe querida que eu amo muito e que
mesmo em distancia tem orado por mim sempre e eu tenho recebi as bênçãos todos
os dias por suas orações, me dando força e coragem para prosseguir e sempre com
a Fé.
Digo também que sou um privilegiado por ter conhecido pessoas maravilhosas como
minha turma de mestrado: Wellington, Mary Daiane, Marina, Andréa, Samantha,
Yolanda, Iuri, Lydia, Natalie, e todos aqueles que estavam juntos nessa jornada.
Meus agradecimentos também a Mariana de Assis pelos momentos maravilhosos de
convivência e troca de experiências no laboratório, aprendi muito com você Mari.
Sou extremamente grato ao Departamento de Biologia. A Professora Luciana Veiga
Barbosa pelo acolhimento no Departamento de Biologia. A Professora Paula Ristow
pelo acolhimento ao LBM – Laboratório de Biologia Molecular. Sou muito grato por
tudo que vocês me proporcionaram e pela confiança depositada em minha pessoa
para uso dos setores do departamento.
Sou mais privilegiado ainda pelas novas amizades que conquistei no Departamento
de Biologia: Luã Tainã, Willian Oliveira, Gabriel Lima, Flavia, Cíntia. Vocês terão
sempre a minha amizade. Muito Obrigado pela companhia e paciência que tiveram
comigo.
Não poderia deixar de agradecer ao Departamento de Física ao LAMUME
(Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica), no Laboratório de Física
Nuclear Aplicada no Instituto de Física. Ao Professor Antônio Ferreira e a Jessica
Guerreiro. Meu muito obrigado.
E tudo isso de bom que me aconteceu e a todas essas pessoas maravilhosas que
eu conheci só tenho a agradecer. Se hoje eu sou MESTRE é porque caminhamos
juntos.
MUITO OBRIGADO!
Edgard Freitas de Siqueira Junior
1
Sumário SIGLAS, SIMBOLOS, UNIDADES E GRANDEZAS. ................................................................... 4
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... 6
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................... 7
RESUMO GERAL ................................................................................................................................ 9
GENERAL ABSTRACT ..................................................................................................................... 11
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................................... 13
........................................................................................................................................... 16
SUMÁRIO ........................................................................................................................................... 17
RESUMO ............................................................................................................................................. 18
ABSTRACT ......................................................................................................................................... 20
1. A BIOTECNOLOGIA DE LEVEDURAS E FUNGOS FILAMENTOSOS ............................ 22
2. OS BIOPROCESSOS .................................................................................................................. 24
2.1. BIOPROCESSOS E A INDÚSTRIA ....................................................................................... 24
2.2. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVEISIAE COMO CULTURA INICIADORA
APLICADA EM BIOPROCESSOS FERMENTATIVOS. ............................................................ 24
2.2.1. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ............................................................ 24
2.2.2. CULTURAS STARTERS OU INICIADORAS ................................................................... 26
2.3. AS TECNOLOGIAS DAS FERMENTAÇÕES ...................................................................... 27
2.3.1. O PÃO ...................................................................................................................................... 29
2.3.2. O VINHO .................................................................................................................................. 30
2.3.3. A CACHAÇA ........................................................................................................................... 31
2.3.4. A CERVEJA ........................................................................................................................ 32
3. A PROTEÔMICA ....................................................................................................................... 33
4. SACCHAROMYCES CEREVISIAE E O ESTRESSE CELULAR .................................... 34
4.1. ESTRESE POR TEMPERATURA ......................................................................................... 37
4.2. ESTRESSE POR PH ÁCIDO .................................................................................................. 38
4.3. ESTRESSE POR ETANOL ................................................................................................. 40
5. CHAPERONAS MOLECULAS E HSPS ................................................................................ 42
6. REFEREÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS ............................................................................................ 47
........................................................................................................................................... 64
EXPRESSÃO PROTEICA E ANALISE DE PROTEINAS DE LEVEDURAS STATERS DO
GÊNERO SACCHAROMYCES EM BIOPROCESSOS ............................................................. 64
2
RESUMO ............................................................................................................................................. 66
ABSTRACT ......................................................................................................................................... 67
CAPÍTULO 2 ....................................................................................................................................... 68
EXPRESSÃO PROTÉICA E ANÁLISE DE PROTEÍNAS DE LEVEDURAS STATERS DO
GÊNERO SACCHAROMYCES EM BIOPROCESSOS ............................................................. 68
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 68
2. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 71
2.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................... 71
3. METODOLOGIA ........................................................................................................................ 72
3.1. AMOSTRAS ............................................................................................................................ 72
3.2. PREPARAÇÕES DOS INOCULOS EM MEIO YEPD (YEAST EXTRACT-PEPTONE-
DEXTROSE) .......................................................................................................................................... 73
3.3.2. PREPARAÇÃO DOS INOCULOS EM CONDIÇÕES INDUTORAS DE ESTRESSES
............................................................................................................................................................... 73
A) ESTRESSE POR CALOR .......................................................................................................... 73
B) ESTRESSE POR ÁCIDO (BAIXO PH) ..................................................................................... 73
C) ESTRESSE POR ETANOL ........................................................................................................ 74
3.3.3. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS ...................................................... 74
A) EXTRAÇÃO DE PROTEINAS (LISE CELULAR DE LEVEDURAS) .................................. 74
B) QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS PELO MÉTODO DE BRADFORD .......................... 75
C) ANALISE DE ELETROFORESE ............................................................................................... 76
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 79
4.1. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSES ETANÓLICO .................... 79
4.2. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSE ÁCIDO .................................. 92
4.3. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA PARA ESTRESSE POR CALOR .................. 100
4.4. TERMOTOLERÂNCIAS E A TOLERÂNCIAS AO ETANOL ....................................... 108
5. CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 116
6. PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................................................. 118
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 119
......................................................................................................................................... 140
EFEITO DO ESTRESSE POR ETANOL SOBRE A MORFOLOGIA DAS CELULAS DE
LEVEDURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE ................................................................... 140
SUMARIO ............................................................................................................................................ 141
RESUMO ........................................................................................................................................... 142
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 144
3
EFEITO DO ESTRESSE POR ETANOL SOBRE A MORFOLOGIA DAS CELULAS DE
LEVEDURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE ................................................................... 146
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 146
2. OBJETIVO .................................................................................................................................... 151
3. METODOLOGIA.......................................................................................................................... 152
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 153
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 160
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 164
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 165
4
SIGLAS, SIMBOLOS, UNIDADES E GRANDEZAS.
°C – graus Celsius
a.C – antes de Cristo
Arp1 – actin-related protein 1
ATP – Adenosina Trifosfato
BSA – bovine serum albumin
cm – centímetro
CO2 – Dióxido de Carbono
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
Eros – Espécies Reativas de Oxigênio
GRAS – Generally Regarded As Safe
g.L-1; g/L – Gramas por Litros.
g – Grama
H2O – molécula de água
H+ - Prótons de Hidrogênio
Hcl – Ácido Clorídrico
HSE – Heat Shock Element
HSF – Heat Shock Factor
HSP – Heat Shock Proteins
HSR – Heat Shock Responde
Kb – Kilobase
kDa – Quilo Dalton
KV – quilovolts
M – Molaridade
Mb – Megabase
MEV – Microscopia Eletrônica por Varredura
5
ml – mililitro
mg – miligrama
mM – Mili Molar
MM - marcador de massa molecular
N – normalidade
NaCl – Cloreto de Sódio
nm – nanômetro
ORFs – Open Reading Frames
O2 – Oxigênio
pH – Potencial Hidrogeniônico
PKC – proteína cinase C
PMSF – Phenylmethysulphonylfluoride
q.s.p – quantidade suficiente para
SCP – Single Cell Protein
SDS – sodium dodecyl sulfate
SO2 – Dióxido de Enxofre
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Sódio-Dodecil-Sulfato
RNAm – Acido Ribonucleico mensageiro
r.p.m. – Rotação por Minuto
TF – Trigger Factor
v/v – volume por volume
YEPD – do inglês Yeast Extract Peptone Dextrose
% - porcentagem
µL – Microlitro
μm – micrometro
6
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Gel de Separação - Composição do Gel de Separação utilizado na analise por SDS-PAGE
TABELA 2 – Gel de Empilhamento - Composição do Gel de Empilhamento utilizado na analise por SDS-PAGE TABELA 3 – Etapas e Soluções da coloração com Nitrato de Prata TABELA 4 – Resultado – Peso Molecular de Proteínas – Estresse Etanolico - Proteínas com expressão aumentada com a crescente concentração de etanol (3%-5%-7%-9%-12%-15%) no meio solido YEPD. TABELA 5. Relação de alguns Genes e Proteínas envolvidas no estresse etanolico.
TABELA 6 – Resultado – Peso Molecular de Proteínas – Estresse Acido - Proteínas encontradas com o aumento de pH (2,5-3,5-4,5-5,0-6,0) com adição de acido clorídrico 6N no meio solido YEPD
TABELA 7 – Genes de Saccharomyces cerevisiae induzidos durante a fermentação em baixo pH.
TABELA 8 – Resultado – Peso Molecular de Proteínas – Estresse Térmico Proteínas encontradas com o aumento de temperatura (°C) (30°- 35°- 40°C) no meio solido YEPD.
TABELA 9 – Relação de alguns Genes e Proteínas envolvidas no estresse por calor em Saccharomyces e fungos filamentosos.
TABELA 10 – Tabela de Comparação dos Pesos Moleculares Encontrados e as Possíveis Funções Bioquímicas destas proteínas
7
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – S. cerevisiae S 04 – Estresse Etanolico; FIGURA 2 – S. cerevisiae S 189 – Estresse Etanolico; FIGURA 3 – S. cerevisiae ScVY – Estresse Etanolico FIGURA 4 – S. cerevisiae ScVB – Estresse Etanolico FIGURA 5 – S. cerevisiae ScFC – Estresse Etanol FIGURA 6 – S. cerevisiae ScFP – Estresse ácido FIGURA 7 – S. cerevisiae ScVY – Estresse ácido FIGURA 8 – S. cerevisiae S04 – Estresse ácido FIGURA 9 – S. cerevisiae ScFP – Estresse ácido FIGURA 10 – S. cerevisiae ScFP – Estresse Térmico FIGURA 11 - A estrutura e a reprodução de uma célula típica de levedura. FIGURA 12 - Formação de pseudohifas (seta) FIGURA 13A. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD sob condições normais – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 13A. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD sob condições normais. A seta sinaliza a forma arredondada da levedura – Imagem aumentada 8.000 X FIGURA 14B. 1– Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 3% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 14B. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 3% de concentração de etanol. As setas sinalizam a formação de pseudohifas. – Imagem aumentada 8.000 X FIGURA 15C. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 5% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 15C. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 5% de concentração de etanol. A seta em preto mostra deformações na parede celular da levedura em consequência do aumento da concentração de etanol. As setas em laranja indicam os botões de iniciação e alongamento – Imagem aumentada 8.000 X
8
FIGURA 16D. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 7% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 17D. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 7% de concentração de etanol A seta mostra deformações na parede celular da levedura em consequência do aumento da concentração de etanol – Imagem aumentada 8.000 X FIGURA 18E. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 9% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 19E. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 9% de concentração de etanol. A seta vermelha indica a formação de pseudohifas. E as setas em verde a mudança na forma de arredondada para alongada – Imagem aumentada 8.000 X. FIGURA 20F. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 12% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1.500 X FIGURA 21F. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 12% de concentração de etanol. A seta sinaliza a formação de um broto – Imagem aumentada 8.000 X FIGURA 22G. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 15% de concentração de etanol. Como é possível observar na imagem, todas as leveduras apresentam deformações – Imagem aumentada 1.500 X. FIGURA 23G. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 15% de concentração de etanol – Imagem aumentada 8.000 X
9
RESUMO GERAL
O emprego das culturas iniciadoras de fermentação é cada vez mais comum na
indústria, ao passo que estudos detalhados no campo dos bioprocessos avançam.
As células de todos os organismos respondem a uma variedade de condições
estressantes através da modulação da transcrição e tradução de uma série de
proteínas altamente conservadas, denominadas genericamente de proteínas de
estresse. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um organismo modelo importante
para o estudo de respostas eucarióticas a estresses ambientais. O presente trabalho
teve como objetivo avaliar e analisar a proteômica de leveduras do gênero
Saccharomyces em condições de estresse de etanol, baixo pH e aumento de
temperatura, identificando proteínas que com o aumento de expressão e
relacionacionando-as com outras citadas na literatura científica. Adionalmente
visamos avaliar as possíveis alterações na morfologia da Saccharomyces cerevisiae
variedade bayanus, proveniente de danos causados pelo estresse etanólico. As
culturas foram inoculadas em meio de cultura e submetidas às diferentes condições
de estresse. A partir da análise eletroforética foi possível conhecer o perfil proteico
das cepas ScFP, ScFC, ScVB, ScVY, S04 e S-189. A análise das alterações
morfológicas foi feita por Microscopia Eletrônica por Varredura. Os resultados
indicam que a expressão aumentada de peptídeos apresentou variações de acordo
com a cultura e o tipo de estresse. Ocorreu aumento na expressão de uma série de
proteínas entre 10 e 220 kDa. Essas proteínas apresentam perfil eletroforético
aproximado ao de Heat Shock Protein e/ou chaperonas moleculares sintetizadas em
resposta às condições de estresse. A análise morfológica mostrou que as células-
filhas permanecem mecanicamente conectadas com a célula-mãe, com
deformações, do tipo alongamento e formação de cachos. Possivelmente
relacionada à toxidade do etanol, ou uma desidratação devido ao aumento da
concentração desse álcool. Outra característica observada foi a crescente formação
de pseudohifas. Concluiu-se que as cepas estudadas apresentaram aumento na
expressão de proteínas específicas como resposta adaptativa ao estresse. As cepas
testadas também mostraram diferenças em seu desempenho de adaptação as
condições adversas. Característica esta um fator natural de defesa. Apesar disto,
todas as cepas apresentaram comportamento fermentativo bastante satisfatório,
demonstrando-se adequadas para uso em bioprocessos industriais.
10
Palavras-Chaves: Biotecnologia, Saccharomyces cerevisiae, fermentação, etanol,
chaperonas moleculares, HSP, proteômica.
11
GENERAL ABSTRACT
The use of starting cultures for fermentation is increasingly common in the industry,
while detailed studies in the scientific field advance. The cells of all organisms
respond to a variety of stressful conditions through a quick transcription and
subsequent translation of a series of highly conserved proteins, called generically of
stress proteins. The yeast Saccharomyces cerevisiae it is an important model for the
study of eukaryotic responses to environmental stresses. The present study aimed to
evaluate and analyze the proteomics of yeasts from the genus Saccharomyces under
stress conditions of ethanol, low pH and temperature increase, identifying proteins
that have increased expression and relating them with others cited in the literature.
Additionally we aim to evaluate the possible changes in the morphology of the yeast
Saccharomyces cerevisiae variety bayanus, from damage caused by ethanol stress.
The cultures were inoculated in culture medium and subsequently submitted to
different stress conditions From the analysis it was possible to know the
electrophoretic protein profile of the strains ScFP, SCFC, ScVB, ScVY, S04 and S-
189. The analysis of morphological changes was performed by Scanning Electron
Microscopy. As a result it was found that the increased expression of peptides
presented variations according to the culture and the kind of stress. An increase in
the expression of a series of proteins between 10 and 220 kDa. These proteins have
been identified as possible HSPs and/or molecular chaperones synthesized as
response to stress conditions. Morphological analysis showed that the daughter cells
remain mechanically connected to the mother cell, with deformation, such as
stretching and cluster formation. Possibly related to toxicity of ethanol or dehydration
due to the increasing concentration of alcohol. Another feature was the increasing
formation of pseudohiphae. It was concluded that the studied strains of
Saccharomyces showed increased expression of specific proteins as adaptive
response to stress. The strains tested showed differences in their performance to
adapt the adverse conditions. Feature a factor this natural defense. Nevertheless, all
strains were fermentative behavior quite satisfactory, showing yourself suitable for
use in industrial bioprocesses.
12
Key Words: Biotechnology, Saccharomyces cerevisiae, fermentation, heat shock
proteins, temperature, low pH, ethanol, molecular chaperones, HSP, morphology and
pseudohyphae
13
INTRODUÇÃO GERAL
A maioria dos bioprocessos de interesse industrial envolve o cultivo de
microrganismos e o acúmulo de seus produtos, como antibióticos, vitaminas,
enzimas, ácido acético, ácido cítrico, entre outros (OLIVEIRA, 2009).
A Biotecnologia consiste no uso de sistemas celulares para o desenvolvimento de
processos e produtos de interesse econômico e social. Dentre os sistemas celulares,
os fungos são de grande interesse biotecnológico. Talvez eles estejam dentre os
seres vivos, que mais geram produtos e processos de importância fundamental para
o bem-estar da população (AZEVEDO, 2004).
Nas últimas décadas observou-se um aumento maciço no uso de leveduras como
modelo de organismo eucarioto para o estudo de fenômenos celulares
fundamentais, em parte devido ao aumento dos conhecimentos a cerca de seu
genoma, principalmente da espécie S. cerevisiae que é mais amplamente utilizada e
por isso categorizada no grupo das leveduras “convencionais” (OLIVEIRA, 2009).
A S. cerevisiae é um microrganismo importante nos bioprocessos por ser não
patogênico, e por sua longa história de aplicação na produção artesanal e industrial
de produtos consumíveis como o pão, etanol, cachaça e vinho. Foi classificada
como microrganismo geralmente considerado seguro (GRAS – Generally Regarded
as Safe) (OSTERGAARD, et al., 2000).
Processos fermentativos e tecnológicos bem estabelecidos para a produção em
larga escala com o uso de S. cerevisiae, fazem este importante para muitos
processos biotecnológicos. No entanto, nem sempre as espécies selecionadas de
ambientes naturais para iniciarem um processo fermentativo portam todas as
características desejáveis para o sucesso da fermentação. Desse modo, inicia-se um
longo trabalho dos pesquisadores da área para estudar os aspectos pormenorizados
de microrganismos fermentadores e de novas tecnologias de estudo com suas
cepas.
Outra importante razão para a aplicabilidade da levedura S. cerevisiae dentro do
campo da biotecnologia é sua susceptibilidade a modificações genéticas pela
tecnologia do DNA recombinante. Essa qualidade que vem sendo bastante facilitada
pela publicação, do genoma completo da levedura (OSTERGAARD et. al., 2000).
Diversos fatores afetam a fermentação, tendo como alvo principal o seu rendimento,
ou seja, “a porcentagem do açúcar que se transforma em álcool, em relação à
14
quantidade máxima teórica da equação de Gay- Lussac” (FERMENTEC, 1978).
Entre os principais fatores que podem afetar produção de etanol destacam-se
temperatura, pH, contaminação bacteriana, aeração/agitação, nutrientes e o próprio
etanol.
S. cerevisiae apresenta um ciclo de crescimento característico. A fase lag reflete a
adaptação fisiológica das células ao novo meio de cultura no qual foram
introduzidas. Nessa fase o metabolismo de célula está ativo, criando condições para
que elas possam se dividir, embora as células ainda não estejam se dividindo. Ao
diminuir a disponibilidade de glicose no meio, ocorre a depressão catabólica
(transição diáuxica), com uma parada transiente na divisão celular, enquanto as
células são preparadas para o metabolismo respiratório. Após a divisão celular é
retomado um ritmo mais lento, utilizando etanol como fonte de carbono, produzido
durante a fermentação (fase pós-diáuxica). Quando todas as fontes de carbonos são
exauridas, as células entram na fase estacionária, na qual podem sobreviver na
ausência de nutrientes (PRINGLE e HARTWELL, 1982; FUGE e WERNER-
WASHBURNE, 1997).
Sendo assim, as células de levedura são submetidas a vários tipos de estresses à
medida que as condições do meio mudam, tanto em ambientes naturais quanto em
processos industriais. Os danos provocados pelo estresse e a resposta da levedura,
dependem do tipo e grau do estresse, e da posição da levedura em seu ciclo de
divisão celular no momento em que ocorre o estimulo (FOLCH-MALLOL et.al, 2004).
A capacidade de responder rapidamente a essas e outras alterações ambientais são
importantes para a atividade geral da célula e sua sobrevivência.
Todos os organismos são formados por água e moléculas de diversos tipos,
inorgânicas e orgânicas. Entre estas últimas, encontram-se as proteínas, um grupo
de macromoléculas, que participam de numerosas atividades, cumprindo um papel
fundamental para os seres vivos.
Um dos objetivos da biotecnologia é a expressão de proteínas de interesse
econômico e industrial. Os benefícios e produtos estratégicos estão relacionados
com a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis como novos
antibióticos, agentes terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e
polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes,
biolixiviação e recuperação de minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e
15
prevenção de doenças emergentes em seres humanos, animais e plantas, e a
otimização da capacidade microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das
águas.
A análise da expressão global através do proteôma permite revelar proteínas (ou os
genes codificantes) envolvidas em processos dinâmicos que ocorrem após a
perturbação de um dado estado fisiológico, através da comparação da sua
concentração celular, antes e após essa perturbação. A monitorização do nível das
proteínas, através de proteómica quantitativa (também conhecida por análise de
expressão proteômica ou proteômica comparativa), permite apreciar o resultado da
regulação da expressão genética que ocorre pós-transcrição e pós-tradução e pode
fornecer numerosas pistas quanto à função biológica das diversas proteínas
envolvidas e esclarecer qual o seu envolvimento nos processos biológicos
examinados. (E-ESCOLA, 2005)
A compreensão a respeito da resposta das células às alterações ambientais é um
tópico de grande interesse porque pode oferecer pistas sobre os aparatos
moleculares que permitem as células se adaptarem a novos ambientes. Os
mecanismos moleculares que estão envolvidos na regulação do remodelamento da
expressão gênica em virtude da adaptação a novos ambientes são a chave para a
elucidação de muitas respostas sobre o comportamento celular perante estímulos
adversos. Sendo assim, frente à diversidade existente e à necessidade de melhor
aproveitamento de certas particularidades microbianas de interesse, gerada pela
exploração do seu metabolismo em processos biotecnológicos, propusemo-nos
avaliar o perfil de expressão proteica de leveduras comercias (leveduras iniciadoras
ou starters) da espécie S. cerevisiae com potencial biotecnológico.
16
REVISÃO DE LITERATURA
17
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................................. 18
ABSTRACT ......................................................................................................................................... 20
1. A BIOTECNOLOGIA DE LEVEDURAS E FUNGOS FILAMENTOSOS ............................ 22
2. OS BIOPROCESSOS .................................................................................................................. 24
2.1. BIOPROCESSOS E A INDÚSTRIA ....................................................................................... 24
2.2. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVEISIAE COMO CULTURA INICIADORA
APLICADA EM BIOPROCESSOS FERMENTATIVOS. ............................................................ 24
2.2.1. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ............................................................ 24
2.2.2. CULTURAS STARTERS OU INICIADORAS ................................................................... 26
2.3. AS TECNOLOGIAS DAS FERMENTAÇÕES ...................................................................... 27
2.3.1. O PÃO ...................................................................................................................................... 29
2.3.2. O VINHO .................................................................................................................................. 30
2.3.3. A CACHAÇA ........................................................................................................................... 31
2.3.4. A CERVEJA ........................................................................................................................ 32
3. A PROTEÔMICA ....................................................................................................................... 33
4. SACCHAROMYCES CEREVISIAE E O ESTRESSE CELULAR .................................... 34
4.1. ESTRESE POR TEMPERATURA ......................................................................................... 37
4.2. ESTRESSE POR PH ÁCIDO .................................................................................................. 38
4.3. ESTRESSE POR ETANOL ................................................................................................. 40
5. CHAPERONAS MOLECULAS E HSPS ................................................................................ 42
6. REFEREÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS ............................................................................................ 47
18
RESUMO
A Biotecnologia se ocupa da transformação ou tratamento de materiais de origem
biológica. Abrangendo uma área ampla do conhecimento que decorre da ciência
básica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genética, etc.), da ciência
aplicada (técnicas imunológicas e bioquímicas, assim como técnicas decorrentes da
física e da eletrônica), e de outras tecnologias (fermentações, separações,
purificações, informática, robótica, controle de processos e etc.). Entre os sistemas
celulares, os fungos são de grande interesse biotecnológico. Os processos levados a
cabo por agentes biológicos são denominados de Bioprocessos e definidos como
um conjunto de operações que efetuam o tratamento da matéria-prima/resíduo
incluindo o preparo dos meios, a esterilização (quando o processo demandar) e a
transformação do substrato em produto(s) por rota bioquímica, seguida de
processos de separação e purificação. O emprego das culturas iniciadoras de
fermentação é cada vez mais comum na indústria, ao passo que estudos detalhados
no campo científico avançam. Além disso, as técnicas moleculares contribuem com
o entendimento dos processos de resposta aos estresses, permitindo que alterações
pontuais e correções possam ser realizadas. Diversos fatores físicos (temperatura,
pressão osmótica), químicos (pH, oxigenação, nutrientes minerais e orgânicos,
inibidores) e microbiológicos (espécie, linhagem e concentração da levedura,
contaminação bacteriana), afetam o rendimento da fermentação e a eficiência da
conversão de açúcar em etanol. As células de Saccharomyces cerevisiae, quando
submetidas a condições de estresse, desenvolvem uma rápida resposta molecular
para reparar danos e proteger as estruturas. A resposta ao choque térmico é
caracterizada pela síntese de proteínas especificas denominada de proteínas de
choque térmico ou HSP (heat shock protein), que funcionam como chaperonas nos
processos de desnaturação e recuperação de proteínas danificadas. A
termotolerância pode ser definida como a capacidade transitória das células de
19
sobreviverem quando exposta a temperaturas elevadas. A tolerância à acidez é uma
característica importante para as leveduras industriais assim sendo, a utilização das
linhagens de S. cerevisiae resistente ao estresse acido contribui positivamente para
indústria de álcool combustível. O estresse etanolico é, provavelmente, uma das
mais interessantes condições para análise, já que um critério tradicional usado para
a seleção de linhagens de leveduras é a tolerância ao etanol. Isso se dá devido às
altas concentrações desse álcool durante a vinificação. Para que ocorra uma
fermentação mais saudável, concluiu-se que as leveduras produtoras de álcool
como as Saccharomyces cerevisiae devem ser resistentes a condições estressantes
durante o processo de fabricação de álcool devido aos efeitos adversos no que
tange a membrana celular diminuindo a viabilidade celular da levedura. Neste
contexto, um importante mecanismo de auxilio ao processo de enovelamento in vivo
de muitas proteínas é baseado na participação de chaperonas moleculares ou
proteínas de choque térmico (heat shock proteins ou HSP). As chaperonas
moleculares são capazes de auxiliar no enovelamento de outras proteínas,
prevenindo interações errôneas e consequente formação de agregados proteicos
dentro das células.
Palavras-Chaves: biotecnologia, fermentação, cultura starter, estresse celular,
chaperonas moleculares, HSP.
20
ABSTRACT
Biotechnology is a very broad branch of technology that takes care of the processing
or treatment of materials of biological origin. This theme covers a wide area of
knowledge today that stems from the basic science (molecular biology, microbiology,
cell biology, genetics, etc.), applied science (immunological and biochemical
techniques, as well as techniques from physics and electronics), and other
technologies (fermentations, separations, purifications, computer science, robotics
and process control). Among the cellular systems, fungi are of great interest to
biotechnology. The processes carried out by biological agents are called
Bioprocesses and defined as a set of operations that perform the processing of the
raw material/waste including media preparation, sterilization (when the process
demand) and the transformation of the substrate into product (s) by biochemical
route, followed by separation and purification processes. The use of starting cultures
of fermentation is increasingly common in the industry, while detailed studies in the
scientific field advance. In addition, molecular techniques contribute to the
understanding of the processes of stress response, allowing specific changes and
corrections to be carried out. Several physical factors (temperature, osmotic
pressure), chemical (pH, oxygen, mineral nutrients and organic inhibitors) and
microbiological (species, strain and concentration of yeast, bacterial contamination),
affect the yield of fermentation and the efficiency of converting sugar into ethanol.
The cells of Saccharomyces cerevisiae, when subjected to stress conditions, develop
a rapid molecular response to repair damage and protect structures. The answer to
thermal shock is characterized by the synthesis of specific proteins called heat shock
protein or HSP (heat shock protein), which act as chaperones in the processes of
denaturation and recovery of damaged proteins. The thermotolerance can be defined
as the transitional ability of cells to survive when exposed to high temperatures.
Acidity tolerance is also an important feature for industrial yeasts; the use of S.
21
cerevisiae strains resistant to acid stress, for exemple, contributes positively to fuel
alcohol industry. Ethanol stress is probably one of the most interesting conditions for
analysis, since a traditional criteria used for the selection of yeasts strains is the
tolerance to ethanol. This is due to the high concentrations of alcohol during
winemaking. For a healthier fermentation, it was concluded that the alcohol-
producing yeast such as Saccharomyces cerevisiae must be resistant to stressful
conditions during the alcohol manufacturing process due to adverse effects related to
the cell membrane and subsequent decrease in cell viability. In this context, an
important mechanism to aid the process of in vivo folding of many proteins is based
on participation of molecular chaperones or heat shock proteins (HSP). The
molecular chaperones are able to assist in the folding of other proteins, preventing
erroneous interactions and consequent formation of protein aggregates within cells.
Key Words: biotechnology, Saccharomyces cerevisiae fermentation cultures staters,
cellular stress, molecular chaperones, HSP
22
REVISÃO DE LITERATURA
1. A BIOTECNOLOGIA DE LEVEDURAS E FUNGOS FILAMENTOSOS
Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformação
ou tratamento de materiais de origem biológica. Spinks (1980) define Biotecnologia
como a utilização de organismos vivos ou sistemas biológicos para a produção
industrial e seu uso em serviços de saneamento. Ou seja, biotecnologia é baseada
na busca e descoberta de recursos biológicos industrialmente exploráveis.
Esse tema abrange hoje uma área ampla do conhecimento que decorre da ciência
básica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genética etc.), da ciência
aplicada (técnicas imunológicas e bioquímicas, assim como técnicas decorrentes da
física e da eletrônica), e de outras tecnologias (fermentações, separações,
purificações, informática, robótica e controle de processos). Trata-se de uma rede
complexa de conhecimentos onde ciência e tecnologia se entrelaçam e
complementam (MALAJOVICH, 2012). De uma maneira ampla, a biotecnologia é
definida como uma atividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que
utiliza agentes biológicos (microrganismos) para fazer produtos úteis ou resolver
problemas (MALAJOVICH, 2012).
A Biotecnologia consiste, portanto, no uso de sistemas celulares para o
desenvolvimento de processos e produtos de interesse econômico e social. Entre os
sistemas celulares, os fungos são de grande interesse biotecnológico. Talvez sejam
eles os seres vivos, que mais geram produtos e processos de importância
fundamental para o bem-estar da população. (AZEVEDO, 2004).
Assim, a contaminação natural, não apenas da massa do pão, mas também de uvas
e grãos de cevada, com a levedura S. cerevisiae e a sua subsequente fermentação
originaram o vinho e a cerveja que até os dias de hoje fazem parte dos nossos
hábitos alimentares. As fermentações industriais com leveduras contribuem
atualmente de forma significativa para a economia de vários países. São produzidas
por ano centenas de toneladas de leveduras utilizadas para a produção de pão,
vinho, cerveja, bebidas destiladas, cidra, saquê e licores. Outro importante produto
23
industrial derivado de S. cerevisiae, cujas células são ricas em proteínas, ácidos
nucléicos, vitaminas e sais minerais e apresentam níveis negligenciáveis de
triglicerídeos, é o extrato de levedura que tem importantes aplicações na indústria
alimentícia e na de fermentações industriais, servindo como componente do meio de
fermentação (PEREIRA, et.al., 2008).
Considerando ainda o potencial biotecnológico das leveduras, microrganismos dos
gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Cândida são capazes de fermentar
diferentes açúcares a etanol. É de particular importância para o Brasil à produção de
álcool combustível por fermentação da sacarose do caldo da cana-de-açúcar por S.
cerevisiae, tendo em vista ser o país, juntamente com os Estados Unidos, os
maiores produtores mundiais de etanol combustível. Adicionalmente, o etanol está
sendo cada vez mais valorizado internacionalmente como combustível líquido, em
comparação à gasolina, derivado do petróleo. Sendo produzido a partir de recursos
renováveis, não contribui para o efeito estufa e suas consequências, como as
grandes modificações climáticas que estão afetando negativamente a Terra. Vale
ressaltar, entretanto, que bactérias como Zymomonas mobilis podem ser também
utilizadas em processos fermentativos de produção de etanol. (PEREIRA, et.al.,
2008).
Os fungos apresentam as seguintes aplicações: Agricultura (controle biológico de
insetos e nematoides, micorrizos); Produtos de fermentação (etanol, glicerol, ácido
cítrico); Enzimas industriais; Biomassa (fermento de padaria, micoproteína); Indústria
de alimentos (panificação, queijaria); Indústria de bebidas (cervejas e vinhos,
destilados); Produtos metabólicos (extrato de levedura, hormônios de crescimento
vegetal); Indústria farmacêutica (antibióticos, vitaminas, vacinas, esteroides).
(MALAJOVICH, 2012).
A biotecnologia e as indústrias farmacêuticas e de alimentos empregam muitas
linhagens de Saccharomyces. Esta extensa e proveitosa associação tem criado a
necessidade de um melhor entendimento das peculiaridades metabólicas nestes
microrganismos (PENNINCKX, 2002).
24
2. OS BIOPROCESSOS
2.1. BIOPROCESSOS E A INDÚSTRIA
As técnicas e produtos biotecnológicos possuem aplicações em diferentes áreas,
sendo as principais ligadas à indústria, ambiente, saúde, agropecuária, além da área
cientifica. Essas aplicações estão relacionadas à decomposição de materiais ou
substâncias químicas pela ação de seres vivos, sobretudo, pela ação de
microrganismos; no desenvolvimento de antibióticos; melhoramento genético na
agropecuária; e o desenvolvimento de processos e metodologias de estudos em
genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica.
Os processos levados a cabo por agentes biológicos são denominados de
Bioprocessos e definidos como um conjunto de operações que efetuam o tratamento
da matéria-prima/resíduo, o preparo dos meios, a esterilização (quando o processo
demandar) e a transformação do substrato em produto(s) por rota bioquímica,
seguida de processos de separação e purificação de produto(s). (PEREIRA, et.al.,
2008)
São consideradas expressões sinonímias: processos fermentativos com
microrganismos naturalmente ocorrentes ou recombinantes, processos
biotecnológicos, processos com células animais ou vegetais, processos enzimáticos
ou os tratamentos biológicos de resíduos e efluentes. Por motivos históricos, ainda
hoje o termo processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer
processo microbiano operado em grande escala, independentemente de ser ou não
uma fermentação. (PEREIRA, et.al., 2008)
2.2. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVEISIAE COMO CULTURA
INICIADORA APLICADA EM BIOPROCESSOS FERMENTATIVOS.
2.2.1. LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE
As leveduras são fungos que se apresentam, usual e predominantemente, sob a
forma unicelular, possuem reprodução vegetativa por gemulação, possuem parede
celular. São microrganismos capazes de crescimento aeróbio ou anaeróbio
facultativo. Na ausência de oxigênio as leveduras fermentam os carboidratos e
25
produzem etanol e dióxido de carbono, sendo úteis em processos industriais
principalmente na área de alimentos. Cada espécie tem uma forma característica,
mas, mesmo em culturas puras, há consideráveis variações de tamanho e de forma
das células individuais, dependendo da idade e do ambiente (GOMES, 2004; AIDOO
et al., 2006; MORENO-ARRIBAS e POLO, 2005 apud LOCK, L.L. 2007).
A levedura, termo que na linguagem comum se reduz a S. cerevisiae, é talvez o
mais antigo microrganismo domesticado. Desde a antiga civilização Egípcia até aos
dias de hoje, a levedura tem sido utilizada pelo homem. Em 1872, com os primeiros
estudos de Louis Pasteur, o enorme e desconhecido potencial de S. cerevisiae
começou a ser explorado. Devido a sua tradicional importância biotecnológica, como
panificação, produção de cerveja e vinho, as pesquisas historicamente tem se
focado em S. cerevisiae acumulando um profundo conhecimento sobre a genética,
fisiologia, bioquímica, engenharia genética e tecnologia fermentativa desta levedura
(BARNETT, 2003; COSTA, 2001).
Algumas das características que tornam as leveduras muito utilizadas não só em
estudos científicos, mas também na indústria, tecnologia e aplicações médicas ou
farmacêuticas, são o seu fácil e económico cultivo com baixas necessidades
nutricionais, assim como o seu estatuto de segurança (GRAS: Generally Regarded
As Safe).
S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus, S. cariocanus, S. krudiavzevii e S. mikatae,
são as leveduras do gênero Saccharomyces que constituem um grupo denominado
Saccharomyces sensu stricto. Todas estas leveduras apresentam elevadas
semelhanças fenotípicas sendo a sua distinção por vezes árdua. Este grupo de
leveduras possui algumas características fenotípicas comuns como a gemulação
multilateral, a facilidade de esporulação mesmo sob condições nutricionais
favoráveis, sendo as células destas leveduras habitualmente diploides (RAINIERI et
al., 2003).
A S. cerevisiae é um dos melhores modelos de sistema eucariótico unicelular porque
seu metabolismo possui semelhança com eucariotos superiores, tornando este
microrganismo uma valiosa ferramenta de estudo do metabolismo e fisiologia
celular. Os ensaios realizados com microrganismos são fáceis, rápidos e podem
utilizar um grande número de células com as mesmas características genéticas.
(SOARES et al., 2005 apud OLIVEIRA, A.L.C., 2009).
26
Nas últimas décadas ocorreu um aumento maciço no uso de leveduras como
modelo de organismo eucarioto para o estudo de fenômenos celulares
fundamentais, em parte devido ao aumento dos conhecimentos de seu genoma,
principalmente da espécie S. cerevisiae que é mais amplamente utilizada e por isso
categorizada no grupo das leveduras “convencionais”.
Saccharomyces é um microrganismo aeróbio facultativo, isto é, que tem a habilidade
de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de
anaerobiose. Os produtos finais do metabolismo do açúcar irão depender das
condições ambientais em que a levedura se encontra. Assim, em aerobiose, o
açúcar é transformado em biomassa, CO2 e água, e, em anaerobiose, a maior parte
é convertida em etanol e CO2, processo denominado de fermentação alcoólica. O
etanol e o CO2 são produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em
anaerobiose (LIMA et al., 2001). Os carboidratos considerados substratos para a
fermentação podem ser endógenos (constituintes da levedura, como glicogênio e
trealose) como exógenos (sacarose, glicose, frutose e outros), estes últimos
fornecidos à levedura (SANTOS et. al., 2010).
Em 1987, The Yeast Genome Directory (GOFFEAU et al., 1996) publica o mapa
genético completo de S. cerevisiae S288C e um inventário com a classificação de
todas as proteínas de levedura e as estratégias de sequenciamento aplicadas. Os
12,8 Mb de DNA do genoma estão organizados em 16 cromossomas e alguns
plasmídeos. Contém aproximadamente 5800 ORFs (Open Reading Frames) que
codificam proteínas específicas, com espaçamento médio de 2 kb (DUJON, 1996).
Bancos de dados como o Saccharomyces Genome Database
(http://www.yeastgenome.org/) e o Comprehensive Yeast Genome Database
(http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/) contêm grande quantidade de informação sobre
genômica e proteômica.
2.2.2. CULTURAS STARTERS OU INICIADORAS
Na indústria alimentícia, culturas starters ou culturas iniciadoras de fermentação
consistem na seleção de microrganismos de alimentos com atividade metabólica
estável e conhecida, portadores de outras características usadas para produzir
alimentos e bebidas fermentadas de aparência, corpo, textura e sabor desejáveis
27
(RAY, 2004). Atualmente esse termo abrange as formas de microrganismos
fermentadores inoculados ao meio também com função protetora contra espécies
contaminantes (GERBAUX et al., 2009).
Considerando-se os avanços biotecnológicos recentes, o uso das culturas
iniciadoras de fermentação faz uma grande revolução na indústria de elaboração de
vinhos. Muitos microrganismos antes presentes nas fermentações espontâneas, seja
vindo do interior da fruta, sejam advindos de lesões na casca da fruta causadas por
insetos e pássaros, ou mesmo, em razão das práticas vitivinícolas, puderam ser
isolados e avaliados de diversas formas. A partir disso, suas interações no mosto e
em meios sintéticos simulados desenvolvidos em laboratório vêm fornecendo
melhores resultados à indústria vinícola (KÖNIG; et. al., 2009 apud SANTOS, et. al.,
2008).
2.3. AS TECNOLOGIAS DAS FERMENTAÇÕES
A importância industrial das leveduras vem se estendendo além da fermentação
tradicional. Atualmente, os produtos da biotecnologia a partir de leveduras afetam
muitos setores comerciais importantes, como as indústrias de alimentos, bebidas,
biocombustíveis, produtos químicos, enzimas industriais, produtos farmacêuticos,
produtos agrícolas e o ambiente. Tem-se a previsão de que a produção tradicional
de álcool etílico, por indústrias cervejeiras, vinícolas, indústrias de bebidas
destiladas e de combustíveis, e a produção de biomassa, pela indústria alimentícia,
irão continuar a fornecer a maior quantidade de produtos fermentados do mundo.
Esta suposição está baseada no fato de que a levedura S. cerevisiae é responsável
pela produção dos principais produtos de fermentação, isto é, 60 milhões de
toneladas de cerveja, 30 milhões de toneladas de vinho, 800.000 toneladas de
proteína microbiana e 600.000 toneladas de fermento de pão ao ano (PRETORIUS
et al., 2003 apud OLIVEIRA, A.A.C., 2009).
A ampla diversidade e versatilidade dos microrganismos têm conduzido ao
desenvolvimento e ampliação das fermentações industriais nos dias atuais. Esses
microrganismos atuam como catalisadores da síntese de produtos, que podem ser
desde pequenas moléculas (como etanol) ou macromoléculas extremamente
complexas (como enzimas) (MAZID, 1993, apud OLIVEIRA, A.A.C., 2009).
28
Desta forma a produção de etanol tem emergido como uma das estratégias mais
viáveis no que diz respeito a fontes não convencionais de energia, uma vez que
esse bioproduto tem inúmeras aplicações tanto na área farmacêutica, quanto na
química ou alimentícia (ZAFAR et al., 2005 apud OLIVEIRA, A.A.C., 2009).
O termo fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das
bolhas de dióxido de carbono resultante da ação das leveduras sobre o extrato de
frutas ou grãos de malte. A fermentação alcoólica era conhecida e utilizada pelos
povos antigos para produção de bebidas a partir de caldos açucarados obtidos pelo
esmagamento de frutas (OLIVEIRA, 1960).
A descoberta dos processos fermentativos é um acontecimento que ocorreu várias
vezes em momentos diferentes da história da humanidade. A fermentação trazia
duas vantagens fundamentais; uma era a eliminação das substâncias tóxicas de
alguns grãos, e a outra, a preservação dos alimentos (MALAJOVICH, 2012).
Os alimentos fermentados constituem hoje a terceira parte da dieta humana. Seja
por facilitar a assimilação dos nutrientes, seja por apresentar menos substâncias
tóxicas, esses alimentos entram na categoria dos denominados alimentos
funcionais, isto é, alimentos que proveem benefícios extras além dos que seriam
esperados em função dos componentes (MALAJOVICH, 2012).
A fermentação alcoólica consiste na transformação dos açucares do mosto em
etanol, gás carbônico e energia, sob a ação catalítica de leveduras. Quando
condições de temperatura, acidez, concentração de açucares, qualidade da cana-
de-açúcar, higiene, preparação do pé de cuba (forma de se fazer a ativação das
leveduras, sendo que a mais utilizada é a Saccharomyces bayanus) e do mosto são
improprias, podem desenvolve-se outros tipos de microrganismos que consomem os
açucares ou então o álcool, produzindo compostos orgânicos indesejáveis para a
qualidade final do produto, além de reduzir o rendimento do processo. (CAMARGO
et.al, 1990).
Segundo Oliveira e Pagnocca (1988) citado por Bassi (2011), durante o processo de
fermentação alcoólica para a produção de etanol, durante uma safra, o fermento
sofre inúmeras reciclagens e interferências externas vindas do caldo que compõe o
mosto, do próprio ambiente, além de outras fontes, tornando-se vulnerável à
contaminação por outros microrganismos, inclusive leveduras indesejáveis (aquelas
que não são colocadas no processo), sendo necessário um constante
29
monitoramento da fermentação. Os mesmo autores ressaltam que existem diversos
métodos utilizados no monitoramento, sendo que a utilização de meios de
crescimento diferenciais e seletivos é bastante comum.
Diversos fatores físicos (temperatura, pressão osmótica), químicos (PH, oxigenação,
nutrientes minerais e orgânicos, inibidores) e microbiológicos (espécie, linhagem e
concentração da levedura, contaminação bacteriana), afetam o rendimento da
fermentação e a eficiência da conversão de açúcar em etanol (LIMA ET al., 2001).
Com o progresso da tecnologia de bebidas, as linhagens de levedura foram sendo
selecionadas segundo características desejáveis ao processo e ao produto. A
produtividade e eficiência de fermentação, a tolerância ao etanol e à temperatura, a
resistência às altas concentrações de açúcares, habilidade de flocular e de produzir
ou não certos componentes do aroma das bebidas e a propriedade de produzir
metabólitos anti-contaminantes (caráter "killer") são constantes fontes de interesse
(HAMMOND, 1995).
Suomalainen (1970) relata que as matérias-primas utilizadas na fabricação de
bebidas pouco contribuem para a formação do aroma, sendo seus componentes
produzidos principalmente pelo metabolismo das leveduras durante a fermentação,
dependendo do tipo de levedura utilizada e das condições sob a qual se conduz a
fermentação e a destilação, em bebidas destiladas.
2.3.1. O PÃO
A arte da panificação surgiu em diferentes lugares, entre 7000 e 5000 a.C. Os
primeiros pães eram bolachas planas de cereais moídos e água, cozidas sobre
pedras quentes. Mais tarde, deve ter sido observado que, deixando a massa em
repouso por um tempo, melhorava-se a textura e a digestibilidade dos pães. O passo
seguinte ocorreu, provavelmente, ao acrescentar uma pequena parte da massa crua
(“massa ácida” ou “pé de massa”) da preparação anterior. (MALAJOVICH, 2012).
As leveduras de panificação possuem baixa taxa de permanência nas fermentações
industriais (BASSO et al., 1993). Sendo assim, a matéria-prima e as condições
operacionais podem influenciar sensivelmente a estabilidade e o desempenho das
leveduras durante a fermentação. (RAVANELI, 2010)
30
Os estudos microbiológicos atuais indicam a coexistência, no “pé de massa”, de
bactérias lácticas e leveduras.
Durante muitos séculos a preparação do pão envolvia, necessariamente, o processo
natural de fermentação, de modo que cada padeiro tinha que preparar seu “pé de
massa”. A passagem do procedimento artesanal à panificação industrial ocorreu em
1876, nos Estados Unidos, com a produção e venda de cubos de levedura
prensada, mediante um processo patenteado pelos imigrantes austro-húngaros
Charles e Max Fleischman. (MALAJOVICH, 2012).
Atualmente, comercializam-se três tipos de fermento biológico (leveduras) para a
panificação: o fermento prensado ativo, com 68-72% de umidade, que requer
refrigeração durante o armazenamento e dura entre três e cinco semanas; o
fermento seco não ativo que se conserva mais tempo e não exige refrigeração, mas
deve ser hidratado antes de usar; e o fermento ativo instantâneo que, por não
requerer hidratação, pode ser adicionado diretamente aos ingredientes secos.
(MALAJOVICH, 2012).
2.3.2. O VINHO
O vinho é uma bebida alcoólica que resulta de fermentação do mosto de uva. A sua
história tem mais de 8000 anos, considerando-se o seu processo de produção como
um dos mais antigos processos biotecnológicos no mundo (PRETORIUS, 2000;
THIS et al., 2006). Do ponto de vista bioquímico, o vinho pode ser definido como
uma solução multi-componente líquida, constituída principalmente por água, etanol,
glicerol e ácidos orgânicos. Como compostos minoritários (mas igualmente
importantes) têm-se os componentes responsáveis pelo flavour (sabor-aroma)
(ROSSOUW et al., 2008; SWIEGERS et al., 2009). Alguns destes compostos podem
estar originalmente presentes nas uvas, ou podem ser sintetizados durante o
processo de vinificação (PIZARRO et al., 2007 apud VIANA, 2009).
Saccharomyces assume um papel fundamental na transformação anaeróbica do
mosto de uva em vinho. O processo fermentativo pode ser conduzido por estirpes de
leveduras comerciais selecionadas ou pode deixar-se o mosto fermentar com a flora
nativa presente na adega e nas uvas. Em ambos os casos, S. cerevisiae e S.
bayanus são as espécies de leveduras que conduzem a fermentação e as espécies
31
predominantes ao longo da maior parte do processo (QUEROL et al., 1994;
LOPANDIC et al., 2008 e BISSON, 2004 apud VIANA, 2009).
A fermentação vinária é um processo bioquímico e ecológico complexo que envolve
uma multiplicidade de fatores de estresse que, de uma forma sinérgica, promovem o
desenvolvimento sequencial de diferentes espécies de leveduras (FLEET & HEARD,
1993; BISSON, 1999; BAUER & PRETORIUS, 2000; FLEET, 2003; ZOTT et al.,
2008). No início de fermentação, o mosto constitui a primeira situação de estresse
quer pela elevada concentração de açúcares presentes (elevada pressão osmótica),
quer pela presença de compostos antimicrobianos (SO2 e resíduos de pesticidas) e
presença de microrganismos competidores (presença de fatores killer e de
moléculas quorum-sensing e influência da densidade espacial) (YAP et al., 2000;
FLEET, 2003; NISSEN et al., 2003; HOGAN, 2006; PEREZ-NEVADO et al., 2006). À
medida que a fermentação decorre, aumenta a concentração de etanol e de CO2,
sobe a temperatura (nos casos em que não é controlada), ocorre o esgotamento de
nutrientes e de O2 (VIANA, 2009).
2.3.3. A CACHAÇA
A cachaça é uma bebida alcoólica produzida pela destilação do mosto da cana-de-
açúcar fermentado, muito apreciada por possuir aroma e sabor característico e
considerada o destilado alcoólico mais popular produzido no Brasil (CARDOSO,
2006). As leveduras e as condições de fermentação são apontadas como os fatores
que mais influenciam para a característica final dessas bebidas, pois é durante a
fermentação alcoólica que a maioria dos compostos responsáveis pelo sabor é
formada (LEHTONEN e JOUNELAERIKSSON, 1983).
A fabricação é caracterizada pelo preparo do fermento inicial ou “pé de cuba”, que
consiste na propagação da microbiota natural ocorrente numa mistura geralmente
composta de caldo de cana-de-açúcar, milho, arroz e/ou farinha de soja de forma
que a fermentação alcoólica é realizada pela ação de comunidades mistas de
leveduras (PATARO et al., 2002). O metabolismo fermentativo das leveduras difere
entre as espécies e linhagens, e este fato influencia diretamente na composição final
das bebidas (CLEMENTE JIMENEZ et al., 2005; GOMES et al., 2008). Dessa forma,
a fermentação espontânea característica da produção da bebida, pode causar
32
grande variabilidade sensorial no produto final obtido dentro de uma mesma safra
comprometendo a padronização e qualidade (GOMES et al., 2008).
Assim, a utilização de leveduras selecionadas como fermento iniciador ou culturas
starter tem sido indicada como a principal maneira de padronizar e
consequentemente elevar a qualidade da bebida (PATARO et al., 2002; GOMES et
al., 2008). No entanto, a contaminação de culturas starter ou outras culturas
selecionadas, com leveduras indesejáveis ao processo estão entre os principais
responsáveis pela redução do rendimento fermentativo e da qualidade do produto
final em processos fermentativos industriais de produção de bebidas alcoólicas
(CHEN et al., 1999).
2.3.4. A CERVEJA
A cerveja, talvez a mais popular das bebidas, tem sua fabricação há milhares de
anos durante os quais sofreu aprimoramento técnico visando o aumento de sua
produção e de seu consumo (MARTINS, 1991). Segundo MEILGAARD (1981) citado
por OLIVEIRA, (2011), a cerveja pode ser considerada um produto de qualidade
complexa, influenciado por fatores físicos, químicos e biológicos, apresentando em
sua composição no mínimo 800 componentes de sabor.
O processo de fermentação contínua com base na tecnologia de células de levedura
imobilizadas permite produzir um produto final aceitável com grande economia de
tempo (BRÁNYIK et al., 2008). A aplicação de leveduras de cerveja imobilizada por
fermentação contínua é uma oportunidade desafiadora para a indústria cervejeira.
No entanto, planta-piloto e processos em escala industrial encontraram problemas
de engenharia (escolha suporte, projeto do reator, o risco de contaminação) que,
juntamente com o efeito da imobilização sobre a fisiologia das leveduras, um
impacto dificilmente previsível sobre o perfil de sabor da cerveja produzida. Portanto,
apesar das vantagens econômicas, o processo contínuo até agora é aplicado
industrialmente apenas na fase de maturação e produção de cerveja sem álcool
(BRÁNYIK et al., 2005 apud OLIVEIRA, 2011).
33
3. A PROTEÔMICA
A proteômica é o estudo em larga escala das proteínas, usualmente por métodos
bioquímicos. A palavra proteômica tem sido associada tradicionalmente à exibição
de um grande número de proteínas de uma linhagem celular ou organismo em géis
bidimensionais (ANDERSON e ANDERSON, 1996; CELIS et at., 1996; WILKINS et
al., 1996; WILKINS et al., 1997; GALDOS, 2009 apud RIVERO et.al., 2010).
A proteômica esta relacionada com o conjunto de tecnologias, que tem por objetivos
separar e identificar proteínas em amostras biológicas complexas (ISFOR et al.,
2002 apud RIVERO et.al., 2010).
Nesse sentido a proteômica já existe desde o final da década de 1970 quando
pesquisadores iniciaram a formação de bancos de dados de proteínas utilizando a
então recentemente desenvolvida técnica de eletroforese de gel bidimensional (O
´FARREL. 1975).
As proteínas controlam a maioria dos processos celulares, os quais ocorrem em
grande diversidade, podendo agir como enzimas, anticorpos, hormônios,
componentes estruturais e receptores celulares (AEBERSOLD e MANN, 2003; DE
SOUZA et al., 2003).
Tais fatos impulsionaram o desenvolvimento de novas tecnologias para o estudo
deste conjunto de proteínas expressas. Estas ferramentas passaram então, a ser
denominadas instrumentos da “Proteômica (AEBERSOLD et al., 2000)”.
A proteômica pode ser dividida em três áreas principais: (1) Microcaracterização
protéica para a identificação em larga escala de proteínas e suas modificações pós-
traducionais; (2) comparação dos níveis de proteína com aplicação potencial em
uma ampla faixa de doenças e (3) estudos das interações proteína-proteína usando
técnicas tais como a Espectrometria de Massas (PANDEY; MANN, 2000 apud
RIVERO et.al., 2010).
As proteínas de interesse podem também ser identificadas na base do
conhecimento do ponto isoelétrico e do peso molecular aparente, determinados a
partir dos géis bidimensionais (JAMES, 1997). Outra alternativa para a separação de
proteínas é pelas técnicas bidimensionais como ponto isoelétrico seguido de
eletroforese em gel de poliacrilamida (mapeamento protéico), um método que tem
apresentado características destacáveis, tais como o alto poder de resolução e boa
34
reprodutibilidade quando são usados para separar soluções complexas de proteína,
assim como extratos de plantas ou soro humano (KLOSE, 1975).
A preparação apropriada das amostras é essencial para obter bons resultados na
proteômica. O melhor método de extração, precipitação e solubilização das
proteínas variam de uma amostra para outra e deverá ser estabelecido para cada
caso em particular (RABILLOUD, 2002; CORTHALS et al., 2000; STULTS e
ARNOTT, 2005; GORG et al., 2010; USAMI et al., 2007; GALDOS, 2009).
Geralmente aplicam-se cada vez mais métodos como a espectrometria de massas
que é altamente sensível e que requerem quantidades menores de material e têm
uma eficiência mais elevada do que os métodos convencionais de sequenciamento
(sensibilidade do femtomole às concentrações do attomole). (GALDOS-RIVEIROS,
et. al., 2010).
4. SACCHAROMYCES CEREVISIAE E O ESTRESSE CELULAR
“Das moscas de frutas às doenças autoimunes e ao câncer, as proteínas
chaperonas são as moléculas maravilhosas cativando a imaginação de
pesquisadores em toda a comunidade científica. Muitas novas avenidas serão
abertas através do estudo e do entendimento da resposta celular ao estresse.
Estamos apenas começando a portentosa aventura que aguarda nosso
descobrimento de como as células lidam com o estresse.” (WYNN et al, 1994).
As respostas aos diferentes tipos de estresse é uma característica fundamental na
adaptação dos organismos vivos às condições adversas do ambiente. A capacidade
de responder rapidamente às variações de temperatura, nutrientes, bem como,
outras alterações ambientais é importante para a atividade geral da célula e sua
sobrevivência. A compreensão a respeito da resposta das células às alterações
ambientais é um tópico de grande interesse porque pode oferecer pistas sobre os
aparatos moleculares que permitem as células a se adaptarem a novos ambientes.
Os mecanismos moleculares que estão envolvidos na regulação do remodelamento
da expressão gênica em virtude da adaptação a novos ambientes são a chave para
a elucidação de muitas respostas sobre o comportamento celular perante estímulos
adversos. O estudo de respostas ao estresse é crucial para a compreensão de como
organismos unicelulares e multicelulares se adaptam a diversas mudanças do meio
35
ambiente. Tais respostas requerem um sistema complexo de reconhecimento e
transdução de sinal, permitindo o crescimento e proliferação da célula bem como a
expressão de genes, atividades metabólicas e outras características da célula.
As células de S. cerevisiae, quando submetidas a condições de estresse,
desenvolvem uma rápida resposta molecular para reparar danos e proteger as
estruturas (ESTRUCH, 2000). Essa resposta é caracterizada pela síntese de
proteínas específicas, aumento do nível celular de trealose, alteração da
composição lipídica da membrana plasmática, dentre outros fatores (MELO 2006
apud SANT’ANA, 2009).
Os organismos unicelulares, para manter condições ótimas de crescimento e
funcionamento, necessitam de um ambiente intracelular especifico e balanceado.
Qualquer flutuação no ambiente interno pode resultar em uma variedade de
perturbações que podem reduzir a atividade enzimática, interromper o fluxo
metabólico, danificar as estruturas celulares e alterar os gradientes químicos,
levando a celular em uma condição de instabilidade. Porem as células é capaz de
manter a homeostase interna mesmo diante de um ambiente externo variado
Em leveduras, dois aspectos das respostas ao estresse têm sido bem analisados, a
síntese de proteínas de respostas ao estresse e a acumulação de trealose (SWAN E
WATSON, 1998). Em culturas de S. cerevisiae ocorre o acumulo de trealose em
resposta a uma mudança de temperatura de 30°C para 44°C, quando a
concentração de trealose atinge valores intracelulares máximos (CARVALHEIRO et.
al. 1999). A resposta ao choque térmico é caracterizada pela síntese de proteínas
especificas denominadas de proteínas de choque térmico ou HSP (heat shock
protein), que funcionam como chaperonas nos processos de desnaturação e
recuperação de proteínas danificadas (JAKOBSEN e PELHAM, 1991; MORIMOTO,
1993). Elevadas temperaturas e processos de fermentação industrial, constituem um
fator de seleção de linhagens de leveduras termotolerantes. A resposta de choque
térmico pode variar entre linhagens industriais de S. cerevisiae, porem as leveduras
industriais é geralmente mais termotolerantes do que as de laboratórios (LEWIS
et.al. 1997). Nas fermentações industriais, a necessidade de reduzir os custos de
resfriamento do mosto, de obter altas taxas de sacarificação e fermentação,
remoção continua de etanol, e de se obter baixos níveis de contaminação tem
estimulado a pesquisa com leveduras termotolerantes ou termofilicas (BANAT et.al.
36
1998; ESTRUCH, 2000). Linhagens industriais de S. cerevisiae e K. marxianus
crescem bem a 45°C quando previamente adaptadas a temperaturas menores
(BALLESTEROS et. al., 1993).
O fato de S. cerevisiae ter o seu genoma completamente sequenciado permite a
identificação rápida de genes envolvidos na resposta ao estresse com uma função
específica, bem como a identificação de ortólogos noutros organismos.
Todas estas características fazem da levedura S. cerevisiae um excelente modelo
experimental para o estudo da resposta ao estresse. Além disso, o seu estudo
permite a compreensão de determinados mecanismos moleculares utilizados pelos
mamíferos na regulação de diversos tipos de estresse, tais como o estresse
oxidativo, que pode estar associado a doenças neurodegenerativas, má circulação
sanguínea, cancro, anemia, desenvolvimento anormal dos ossos e do sistema
nervoso e respostas imunes deficientes (OLIVEIRA, 2009).
Em geral, as condições adversas, que estes microrganismos enfrentam, afetam
principalmente as estruturas celulares (ex. as membranas) e as diferentes
macromoléculas, especialmente os lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, os quais
sofrem modificações estruturais que danificam suas funções (FOLCH-MALLOL et. al.
2004).
Respostas na membrana celular vêm sendo estudadas quando essas são
submetidas a todos os tipos de estresse com o intuito de estudar todos os
fenômenos ocorridos ao longo do estresse (OLIVEIRA, 2009).
Heerklotz (2001) afirmou que o estresse celular facilita a permeabilização da
membrana, onde o mesmo utilizou a titulação isotérmica calorimétrica e vários
modelos de sistemas. Foram estimadas a entalpia, entropia e energia livre e
analisados os dados de captação frente aos de liberação. Chegando assim a
conclusão de tal permeabilidade.
Pereira e Geibel (1999) citado por Oliveira (2009) analisaram as respostas, através
da microscopia eletrônica, da membrana celular em células de S. cerevisiae quando
submetidas a estresse oxidativo e averiguaram que há a formação de poros na
membrana ao longo do estresse onde a diferença do tamanho do poro controle para
o poro da célula com estresse seria de aproximadamente 100%.
Células eucarióticas podem responder a uma variedade de estresses ambientais tais
como disponibilidade de nutriente, entre outras (pH, temperatura, etanol, etc.).
37
4.1. ESTRESE POR TEMPERATURA
Os fungos, na sua maioria apresentam faixa ótima de temperatura de crescimento
entre 25-40ºC. Alguns toleraram temperaturas próximas ao congelamento da água e
outros temperaturas acima de 40°C (termotolerantes). A temperatura afeta os
diferentes parâmetros de crescimento microbiano, como, o tempo de adaptação
(fase lag), a taxa específica de crescimento e o rendimento em células, bem como
influencia tanto o metabolismo primário quanto o secundário de vários modos
(CARLILE E WATKINSON, 1997 apud SANTOS, 2012).
A liberação de calor produzida durante as atividades metabólicas dos
microrganismos provoca uma elevação significativa da temperatura no decorrer das
fermentações
S. cerevisiae é uma levedura mesofílica (20°- 40°C) utilizada em muitos processos
industriais, tais como produção de bebidas alcoólicas, biomassa (panificação e
alimentos) e vários produtos do metabolismo (DEMAIN et. al., 1998).
A temperatura afeta diretamente a ecologia microbiana e as reações bioquímicas
das leveduras (TORIJA et. al., 2003). A temperatura exerce um efeito em todos os
aspectos do crescimento, metabolismo, viabilidade e fermentação das leveduras.
A temperatura ideal para o metabolismo das leveduras durante a fermentação
encontra-se na entre 28 e 34 ºC. Temperaturas inferiores a 30-32 ºC prolongam o
tempo de fermentação enquanto temperaturas elevadas inibem o crescimento
celular, especialmente na presença de elevados teores de etanol (STUPIELO e
HORII, 1981).
A produção inicial de etanol em destilarias ocorre na faixa de 25°C a 35°C. A
temperatura ótima varia entre as leveduras, sendo que as leveduras termofilicas
apresentam temperaturas ótimas de crescimento acima de 40°C (WALKER, 1998).
Valores de temperatura acima destes citados podem gerar enfraquecimento da
levedura, criar boas condições para o aparecimento de outros microrganismos e
ocasionar maiores perdas de álcool por evaporação. Temperaturas inferiores a 25°C
diminuem a atividade da levedura (CARDOSO, 2006).
A termotolerancia pode ser definida como a capacidade transitória das células de
sobreviverem quando exposta a temperaturas elevadas (LASZLO, 1988). As
leveduras que apresentam termotolerancia intrínseca suportam choque térmico a
38
50°C, enquanto que as leveduras que apresentam termotolerancia induzida resistem
a choque térmico somente quando adaptadas a elevações suaves de temperaturas
(p. ex. 30 minutos de exposição a 37°C). Outros fatores são capazes de afetar a
termotolerancia das leveduras como: agentes químicos, pressão osmótica, valores
baixo de pH externo, fase de crescimento, aquisição de resistência na fase
estacionaria e estado nutricional (PIPER, 1993, apud SOUZA, 2009).
As respostas ao estresse térmico em leveduras são bem estudadas. Um aumento de
10 a 15°C acima da temperatura ótima de crescimento induz a síntese de um grupo
de proteínas chamadas de HSP. A maioria das proteínas destes grupos são
proteases e chaperoninas que estão envolvidas em impedir a desnaturação ou
induzir a renaturação de proteínas, a degradação de proteínas com defeito no seu
empacotamento e desintegração de agregados proteicos por desnaturação.
Algumas destas proteínas se encontram também presentes em temperaturas ótimas
e estudos genéticos indicam que são proteínas indesejáveis para a manutenção da
estrutura correta da folha pregueada de outra proteína, unir e separar unidades
proteicas em estruturas oligoméricas e degradar proteínas desnaturadas ou com
defeitos na estrutura secundaria (LINDQUIST, 1992 apud SOUZA, 2009).
4.2. ESTRESSE POR PH ÁCIDO
Na literatura há deficiência de informações sobre o efeito do pH sobre os parâmetros
de crescimento de fungos, apesar de haver considerável informação em relação ao
efeito do pH inicial do cultivo. O metabolismo do fungo altera o pH, seja pela
absorção de ânion ou cátion ou pela produção de ácidos orgânicos ou amônia.
Durante o cultivo o tamponamento é difícil de ser obtido, pois as próprias
substâncias usadas como tampões podem ser assimiladas ou podem ser tóxicas
naquelas quantidades que seriam necessárias para se conseguir efetivo
tamponamento. Apenas em biorreatores do tipo fermentadores o pH pode ser
mantido constante durante o crescimento do fungo. A concentração do íon
hidrogênio em um meio de cultura pode afetar o crescimento microbiano
indiretamente, pelo seu efeito na disponibilidade de nutrientes ou, diretamente, pela
sua ação nas superfícies celulares (CARLILE e WATKINSON, 1997).
39
Em relação ao pH, sabe-se que as fermentações se desenvolvem numa ampla faixa
de valores, sendo adequada a faixa entre 4 e 5. Nos mostos industriais, os valores
de pH geralmente se encontram na faixa de 4,5 a 5,5. A tolerância à acidez é outra
característica importante para as leveduras industriais (LIMA et al., 2001), porém,
sabe-se que valores muito baixos de pH, além de ocasionarem perda de nutrientes
como nitrogênio e potássio, segundo GOMES (1998), aumentam a sensibilidade ao
etanol, aos ácidos orgânicos e ao SO2.
Fermentações conduzidas em meios ácidos resultam em maiores rendimento de
etanol, pelo fato de se restringir o crescimento do fermento, com a consequente
redução da produção do glicerol e de contaminação bacteriana. Entretanto,
fermentações alcoólicas se desenvolvem bem em níveis elevados de pH como em
melaços (pH 5,8 a 5,9). Já os de caldo de cana fermentam sem correção de acidez,
em pH natural que varia de 5,2 a 6,8, a utilização das linhagens de S. cerevisiae
resistente ao estresse acido é uma característica importante para indústria de álcool
combustível. (MONACO, 2007 e LIMA et al., 2001).
A maioria das células dos eucariotos superiores possui altas concentrações de
proteínas em seu citoplasma que funcionam como ácidos e bases orgânicos.
Proteínas contendo maior numero de histidina, por exemplo, tamponam o meio
intracelular em pH próximo do neutro. Nucleotídeos semelhantes a ATP, além de
outros metabólitos de baixo peso molecular contem grupos ionizáveis que também
tamponam o citoplasma (NELSON e COX, 2004 apud SANT’ANA, 2009).
Algumas leveduras são capazes de crescer em meio com pH entre 4,5 e 6,5
(WALKER, 1998), porem ácidos orgânicos como acido sorbico, o acido benzoico e o
acido acético, os quais têm sido utilizados na preservação de alimentos, inibem o
crescimento de leveduras em baixo pH (PIPER, et. al., 1998; PIPER, et. al 2001
apud SANT’ANA, 2009).
Acidos orgânicos, quando não dissociados, são capazes de atravessar a membrana
plasmática por difusão (CASSIO, et. al., 1987). Uma vez no citoplasma esses ácidos
se dissociam gerando prótons H+ e o ânion correspondente. Quanto maior o pH do
meio maior o grau de dissociação do acido. Um ácido orgânico quando se dissocia
no meio intracelular diminui o pH citosolico. O acumulo do ânion no citoplasma pode
aumentar a produção de radicais livres, em aerobiose, induzindo o estresse
oxidativo (PIPER, et. al., 2001 apud SANT’ANA, 2009).
40
Os ácidos orgânicos inibem a resposta ao estresse de choque térmico e aumentam
a frequência de mutações que causam deficiência no metabolismo respiratório de S.
cerevisiae, quando cultivadas em elevadas temperaturas (CHENG, et. al., 1999). O
tratamento de células de S cerevisiae com ácidos orgânicos inibe a síntese de HSP
e, consequentemente, a termotolerancia (PIPER, et. al., 1998).
A presença do acido acético na concentração de 50mM no meio de crescimento (pH
3,5) semelhante ao acido sorbico, diminui o pH citosolico e aumentam a atividade da
H+-ATPase na membrana plasmática da célula de S. cerevisiae (CARMELO, et. al.
1998).
4.3. ESTRESSE POR ETANOL
O custo efetivo da produção de etanol depende, entre outros fatores, do alto
rendimento e da rápida conversão dos carboidratos a etanol. Entretanto, o etanol
acumulado no meio de cultura pode se tornar um fator de estresse significativo
durante a fermentação.
Segundo Silva et.al. (2008), durante o processo da fermentação alcoólica origina-se
uma série de compostos que podem atuar como inibidores potenciais. Entre eles
podem ser citados os metabólitos secundários, contaminantes totais e, ate mesmo, o
etanol produzido no processo. A natureza e concentração desses compostos
dependem das condições do processo, como temperatura do meio e tempo de
fermentação.
As altas concentrações de etanol têm um efeito prejudicial sobre proteínas,
bicamada fosfolipídica e outros componentes celulares (ROSE, 1993).
Em consequência disso, há uma limitação do crescimento do microrganismo e de
sua atividade metabólica, bem como do rendimento desse álcool (GUERZONI et al.,
1994). Essas influências prejudiciais do etanol sobre o crescimento, viabilidade e
fermentação de S. cerevisiae são largamente explicadas em função de seus efeitos
nos processos associados à membrana (ROSE, 1993). Os principais sítios para os
efeitos do etanol em leveduras são membranas celulares, algumas proteínas
hidrofóbicas e hidrofílicas e o retículo endoplasmático (WALKER, 1998). A exposição
das leveduras ao etanol resulta em um aumento da fluidez da membrana e
consequente diminuição da sua integridade (MISHRA e PRASAD, 1989). A
41
diminuição da disponibilidade de água, devido à presença do etanol causa a inibição
de enzimas chaves na via glicolítica e essas proteínas podem ser desnaturadas
(HALLSWORTH, 1998).
Do ponto de vista fisiológico, o etanol inibe o crescimento e a viabilidade das
leveduras por atuar negativamente sobre os diferentes sistemas de transportes
(incluindo permeases de aminoácidos), sobre a sinalização celular da glicose e
atividade de enzimas chaves da via glicolitica (ALEXANDRE e CHARPENTIER,
1998; BISSON 1999).
E para Fernandes, (2008), o etanol afeta diretamente a membrana celular das
leveduras, devido ao estresse causado pela exposição das mesmas ao etanol. O
etanol age de maneira sinergística intoxicando a célula da levedura, levando-a a
morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular (OLIVA NETO, 2006).
Segundo Maia (1995) o teor de etanol é um fator limitante da fermentação alcoólica.
Pode-se considerar que, acima de 8ºGL, o etanol já começa a dissolver a membrana
da célula, efeito que aumenta com o aumento da temperatura.
O etanol parece alterar o grau de polaridade da membrana celular citoplasmática,
causando interrupção do crescimento em concentrações elevadas (LYND et.al.,
1991) e, ainda, aumentando a fluidez da membrana (LLOYD et.at., 1993). Estas
alterações em fluidez resultam em mudanças na permeabilidade de prótons
(CARTWRIGHT et. al., 1986).
Concentrações elevadas de ácidos graxos insaturados na membrana, vitaminas e
proteínas parecem aumentar a tolerância ao etanol. Outros fatores fisiológicos, tais
como, composição do meio, acumulo intracelular de etanol, temperatura e pressão
osmótica podem contribuir para a elevação da tolerância ao etanol (D’AMORE e
STEWART, 1987). A ação da trealose consiste em estabilizar a membrana e
proteger as células das leveduras frente aos efeitos do etanol. Assim, a
concentração intracelular deste dissacarídeo tem desempenhado um papel
importante sobre capacidade da célula em tolerar elevadas concentrações de etanol
(MAJARA et.al., 1996 apud SOUZA, 2009).
Holzberg et. al. (1967) demonstraram que o crescimento celular não é inibido em
concentrações de etanol inferiores a 26 g.L-1, mas é inibido totalmente quando a
concentração de etanol atinge 68,5 g.L-1 no meio de fermentação. Loung (1984)
observou que o etanol apresentava efeito significativo sobre a velocidade do
42
crescimento celular a concentrações acima de 15 g.L-1 e que a concentração de
etanol máxima a partir da qual as células não mais cresciam era de
aproximadamente 100 g.L-1. Esse mesmo autor também verificou que a capacidade
de produção de etanol de S.cerevisiae era completamente inibida a uma
concentração de etanol de 105 g.L-1. Daugulis e Swaine (1987) encontraram valores
máximos de etanol onde as células não cresciam mais de 87,5 a 140 g.L-1, para
sistemas utilizando diversas linhagens de leveduras. A análise desses valores deve
ser cuidadosa, entretanto, uma vez que eles dependem do tipo de microrganismo,
do seu estado fisiológico, do meio de cultura e da temperatura (SOUZA, 2009).
Leveduras isoladas de destilarias mostraram inibição de suas atividades
fermentativas em batelada simples a 30°C quando a concentração de etanol no meio
foi superior a 8%. Acima de 8% de etanol, a fermentação ocorre de forma
gradativamente reduzida. Por outro lado, grandes perdas em biomassa foram
observadas em concentração de etanol no meio da ordem de 4% (PERES e
LALUCE, 1998 apud SOUZA, 2009).
Para que ocorra uma fermentação mais saudável, concluiu que as leveduras
produtoras de álcool como as Saccharomyces cerevisiae são expostas a condições
estressantes durante o processo de fabricação de álcool devido a diversos fatores,
entre o qual o teor de etanol (8ºGL), afeta a membrana celular diminuindo a sua
viabilidade celular da levedura alcoólica (CRUZ et.al, 2001).
5. CHAPERONAS MOLECULAS E HSPS
Em geral, as proteínas só podem desempenhar suas respectivas atividades
biológicas após atingirem suas estruturas nativas, as quais são obtidas através de
um processo conhecido como enovelamento proteico. Este processo é basicamente
determinado pela própria sequencia de aminoácidos da proteína, ou seja, toda a
informação necessária para o enovelamento e formação da estrutura nativa esta
contida em sua estrutura primaria (ANFINSEN, 1973 apud CAGLIARI 2009).
Ainda de acordo com Cagliari (2009), o processo de enovelamento é influenciado
por varias forças, como a energia livre, a concentração proteica do meio, a formação
de ligações dissulfeto e alterações pos-traducionais, tais como glicosilação,
adenilação, etc. (RUDDON et al., 1996). Em um meio com alta saturação proteica,
43
podem ocorrer interações das regiões hidrofóbicas de proteínas não enoveladas ou
parcialmente enoveladas, formando agregados proteicos que precipitam nas células
e tecidos (JAENICKE et al., 1999; BEISSINGER e BUCHNER, 1998; FINK, 1999;
RAMOS e FERREIRA, 2005). As falhas no processo de enovelamento, com
formação de agregados proteicos, podem estar relacionadas com algumas doenças
humanas degenerativas e amiloides como: Alzheimer (AGOROGIANNIS et al.,
2004), câncer (THOR et al., 1991; TETU et al., 1992) e outras (BEISSINGER e
BUCHNER, 1998; CHAI, et al., 1999; RUDDON et al., 1996; THOMAS et al., 1995).
Neste contexto, um importante mecanismo de auxilio ao processo de enovelamento
in vivo de muitas proteínas é baseado na participação de proteínas conhecidas
como chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico (heat shock proteins
ou HSP) (BORGES e RAMOS, 2005; apud CAGLIARI 2009).
As HSP são uma classe de proteínas altamente conservadas, desde seres primitivos
(procariotas) até o homem, o que é um indício de seu grande valor evolutivo. As
HSP podem ser agrupadas em famílias: HSP-27, HSP-47, HSP-60, HSP-70, HSP-90
e HSP-1103, de acordo com suas sequências de aminoácidos e com seus pesos
moleculares (em kD-quilodaltons), determinados por eletroforese (FULLER et. al.,
1994).
A família HSP-70 é a mais conservada filogeneticamente. Sua estrutura, no homem,
são 72% homóloga em relação às HSP-70 de drosófilas (HUNT et. al. 1985). As
famílias HSP-60 e HSP-70 são as mais ligadas ao processo geral de dobramento de
proteínas nas células (WYNN et. al., 1994).
A família HSP90 esta presente em todos os filos estudados, com exceção de
archaea bactéria, no qual parece estar ausente. Nos eucariotos, a presença de pelo
menos uma isoforma citoplasmática da HSP90 e essencial para a sobrevivência sob
qualquer condição ambiental (BORKOVICH et al., 1989), enquanto que a homologa
em bactéria, HtpG, e dispensável sob condições normais de crescimento (SPENCE
et al.,1990). A HSP90 citoplasmática é uma das proteínas mais abundantes,
representando aproximadamente 1% do total das proteínas mesmo na ausência de
choque-térmico (LAI et al., 1984), há qual pouco afeta sua expressão. A
concentração intracelular da HSP90 depende do tipo de célula em questão, variando
de 10 a 150M (NOLLEN e MORIMOTO, 2002). A HSP90 esta localizada
predominantemente no citoplasma e em menor quantidade no núcleo
44
(SCHALATTER et al 2002). Além disso, já foram encontradas evidencias de que a
Hsp90 estaria também na superfície celular (FERRARINI et al. 1992).
Assim como outras grandes classes de chaperonas moleculares, a HSP90 também
apresenta uma atividade de proteção, prevenindo a agregação inespecífica de
proteínas parcial ou totalmente desenoveladas (WIECH et al., 1992). Outra
característica especifica da HSP90 e seu papel regulador na indução de alterações
conformacionais em proteínas substrato enoveladas/nativas que levam a ativação ou
estabilização das mesmas (JAKOB et al., 1995).
As HSP100, relacionadas à família das Clps (caseinolytic protease), tem atividade
ATPasica e estão envolvidas nas mais diversas atividades biológicas tais como
tolerância ao estresse, proteólise, transposição de DNA e regulação genica
(PARSELL et al., 1994; SCHIRMER et al., 1996; SCHIRMER et al., 1998 apud
CAGLIARI 2009).
A função mais importante das HSP100 seria a de auxiliar na solubilização de
proteínas que estariam formando agregados (SCHIRMER et al., 1996) e/ou atuando
na desorganização de agregados proteicos em seus componentes (LEVTCHENCO
et al., 1997).
As chaperonas do grupo HSP60 agem sempre sobre uma proteína já pronta que
tenha um erro na configuração terciária. O erro aparece sempre como uma
sequência de aminoácidos hidrofóbicos que ficam expostos e são reconhecidos
pelas chaperonas (aliás, todas as chaperona reconhecem e se ligam a sequências
hidrofóbicas de aminoácidos). Uma vez detectado o erro, as HSP60 se ligam à
proteína, aprisionando-a dentro de uma reentrância da própria chaperona, formando
um ambiente separado do citossol, propício para que a energia do ATP, que a
chaperona hidrolisou, consiga modificar o enovelamento da proteína. As chaperonas
do grupo das HSP60 parecem um barrilzinho (CORRÊA, 2004).
Nas condições em que proteínas incorretamente dobradas se acumulam nas
células, começa uma resposta ao estresse, ou HSR. Esta se inicia pela ativação de
um fator específico de transcrição, chamado HSF- 1. Tal fator estaria presente na
célula normal e não estressada como um monômero inativo. Em resposta ao
estresse metabólico, rapidamente sofreria trimerização, o que tornaria possível sua
ligação imediata a uma sequência de nucleotídeos, chamada de HSE, localizada
45
dentro da região promotora dos genes que codificam as HSP, tudo resultando em
alto nível de transcrição dos genes do choque térmico.
As chaperonas moleculares são proteínas capazes de auxiliar ao enovelamento de
outras proteínas, deste modo prevenindo interações errôneas e consequente
formação de agregados proteicos dentro das células. No entanto, ao realizarem tal
tarefa, não interferem na estrutura tridimensional final ou nativa das proteínas
auxiliadas, respeitando o conceito formulado por ANFINSEN (1973), o qual afirma
ser a sequencia primaria que determina a estrutura nativa. Segundo Hendrick e Hartl
(1995), uma chaperona molecular pode ser definida como: “Uma proteína que se liga
e estabiliza uma conformação de outra forma instável de outra proteína, facilitando
seu destino correto in vivo: seja no enovelamento, formação oligomérica, transporte
para um compartimento sub-celular especifico ou alternância controlada entre
conformações ativas e inativas” (tradução).
As chaperonas moleculares foram descritas inicialmente como Hsp, porque muitas
apresentam sua síntese induzida em células submetidas a condições de estresse
por calor. As chaperonas apresentam, de modo geral, afinidade por sequencias
inespecíficas de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos na superfície dos
polipeptídios não enovelados. (CAGLIARI, 2009)
As células necessitam da atividade das chaperonas moleculares não só para
prevenir a agregação de proteínas com conformação não nativa, durante a aquisição
da sua estrutura aquando da sua síntese, mas também para evitar e/ou reverter
interações incorretas que ocorrem, por exemplo, em condições de estresse, tais
como temperaturas elevadas, que provocam o desenrolamento das proteínas
expondo superfícies que normalmente estão protegidas no interior. A ligação a uma
chaperona poderá não somente bloquear agregação direta entre as moléculas
através de proteção das superfícies interativas nos polipeptídios não nativos,
incluindo as de subunidades não montadas, como também evitar ou reverter mau
enrolamento dentro da própria molécula. Para além de protegerem áreas
potencialmente reativas na sequência polipeptídica, os chaperones funcionam
também como catalisadores no processo de enrolamento. (CAGLIARI, 2009)
Além de auxiliar o enovelamento proteico, as chaperonas também participam de
outras atividades, tais como: 1) transporte, através de membranas, de polipeptídios
recém-sintetizados para as organelas; 2) prevenção da agregação proteica e
46
interações não desejadas/produtivas durante o enovelamento; 3) resolubilização/
desagregação de agregados proteicos, bem como o encaminhamento dos mesmos
para vias de degradação (BORGES e RAMOS, 2005). Também estão relacionadas
ao controle intracelular hormonal corticoide e a outros fatores de transcrição, assim
como na montagem de complexos proteicos a partir de suas subunidades (FINK,
1999; HENDRICK et al., 1993; RUDDON et al., 1997).
Muitas chaperonas, embora sejam expressos constitutivamente, são sintetizados em
concentrações elevadas em condições de estresse e por isso são classificados
como proteínas de estresse ou de choque térmico (heat shock proteins – Hsp). Mas
existem chaperonas que não são proteínas de estresse, bem como existem
proteínas de choque térmico que não são chaperonas.
Os processos apresentados a seguir mostram a atuação geral de chaperonas em
relação ao problema de superfícies interativas (ELLIS, VAN DER VIES, 1991 apud
NETO, 2012):
Síntese de Proteínas. A região amino-terminal de cada polipeptídio é
sintetizada antes da região carboxila-terminal, podendo, nesta condição,
haver a atuação de chaperonas interagindo com a proteína em formação,
com o objetivo de impedir interações incorretas de elementos da própria
estrutura protéica ou com outros componentes celulares.
Transporte de Proteínas. Proteínas que adentram em organelas como retículo
endoplasmático, mitocôndrias, plastídios e periplasmos bacterianos
atravessam a membrana somente em um estado desdobrado ou semi-
enovelado. As proteínas são sintetizadas por ribossomos citossólicos na
forma de precursores, sendo que o transporte para o interior de determinada
organela pode ser procedido apenas por intermédio de interação com uma
chaperona.
Função Proteica. Em muitas situações, o funcionamento normal de complexos
oligoméricos envolve mudanças em interações subunidade-subunidade, de
forma que exposições transitórias de superfícies de contato destes complexos
podem ser mediadas por chaperonas moleculares.
Resposta de Estresse. Estresse ambiental pode causar desnaturação de
proteínas. Para a proteção contra o estresse imposto, as células acumulam
proteínas que previnem a produção de agregados de proteínas desnaturadas.
47
6. REFEREÊNCIAS BIBLIGRÁFICAS
AEBERSOLD, R.; MANN, M. (2003). Mass spectrometry-based proteomics.
Nature, v. 402, p. 198-207.
AEBERSOLD, R.; HOOD, L. E.; WATTS, J. D. (2000). Equipping scientists for the
new biology. Nature Biotechnology, v. 18, p. 359,
AGOROGIANNIS EI, AGOROGIANNIS GI, PAPADIMITRIOU A, HADJIGEORGIOU
GM. (2004) Protein misfolding in neurodegenerative diseases. Neuropathol Appl
Neurobiol 30(3): 215-24.
AIDOO, K.E., ROB, N.M.J. ; SARKAR, P.K. (2006). “Occurrence and function of
yeasts in Asian indigenous fermented foods”. FEMS Yeast Research ,
Amsterdam, v. 6, p. 30-39.
ALEXANDRE, H.; CHARPENTIER, C. (1998). Biochemical aspects of stuck and
sluggish fermentation in grape must. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., v.20,n. 1, p.
20-27,
ANDERSON, N. G.; ANDERSON, N. L. (1996).Twenty years of Two-dimensional
electrophoresis: past, present and future. Electrophoresis, v. 17, p. 443-453.
ANFINSEN CB. (1973) Principles that govern the folding of protein chains.
Science 181: 223-30.
AZEVEDO, J.L.; FUNGOS (2004) – Genetica e Melhoramento de Fungos na
Biotecnologia; Revista Biotecnologia Ciencia e Desenvolvimento. Universidade de
Goias.
BALLESTEROS, I., OLIVA, J.M., BALLESTEROS, M., CARRASCO, J. (1993).
Optimization of the simutaneaus saccharification and fermentation process
using thermotolerant yeast. Applied Biotechmistry and Biotechnology 30/40
201-211
BANAT, I.M., NIGAM, P., SINGH,D., MARCHANT, R., MCHALE, A.P., (1998).
Ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentration: Part 1
– Yeast in general. Word Journal Microbiology and Biotechnology 13, 809-821
BASSI, A.P.G., (2011) Tolerância ao estresse e caracteristicas fermentativas de
leveduras Dekkera bruxellensis da fermentação alcoolica. Dissertação a titulo de
Mestre. Curso de Ciencias e Tecnologia de Alimentos da Universidade de São Paulo
da Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz”. Piracibaca, São Paulo. In:
OLIVEIRA, M.C.F.L.; PAGNOCCA, F.C. Aplicabilidade de meios seletivos
48
empregados na indústria cervejeira para a detecção de leveduras selvagens
em unidades sucroalcooleiras. In: SIMPOSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS,
8., São Lourenço, 1988. Anais... São Lourenço: SINAFERM, 1988. p. 78-81.
BASSO, L.C.; AMORIM, H.V.; OLIVEIRA, A.J. & LOPES, M.L. (2008) Yeast
selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res. 8: 1155–1163.
BASSO, L.C.; OLIVEIRA, A.J.; ORELLI, V.F.D.M.; CAMPOS, A.A.; GALLO,
C.R.;AMORIM, H.V. (1993) Dominância das leveduras contaminantes sobre as
linhagens industriais avaliada pela técnica de cariotipagem. Congresso
Nacional da STAB, 5. Águas de São Pedro, p. 245-250, (Anais).
BARNETT, J. A.; PAYNE, R. W.; YARROW, D. (2000). Yeast: characteristics and
identification.3rd ed. Cambridge, p. 1-27.
BELSSINGER M, BUCHNER J (1998) How chaperones fold proteins. Biol. Chem.
379: 245-59.
BISSON, L. (1999) - Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Viticult., 50:
107-109.
BISSON, L. (2004) - The biotechnology of wine yeast. Food Biotechnol., 18: 63-96.
BORGES JC, RAMOS CH. (2005) Protein folding assisted by chaperones.
Protein Pept Lett. 12: 257- 61.
BORKOVICH KA, FARRELLY FW, FINKELSTEIN DB, TAULIEN J, LINDQUIST S.
(1989) Hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations
for growth of cells at higher temperatures. Mol Cell Biol. Sep;9(9):3919-30.
BULL, A.T.; WARD, A.C. & GOODFELLOW, M. (2000). Search and discovery
strategies for biotechnology: the paradigm shift. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, 64(3): 573–606.
BRÁNYIK T., VICENTE A., DOSTÁLEK P., TEIXEIRA J.A. (2008): A review of
flavour formation in continuous beer fermentations. Journal of the Institute of
Brewing, 114, 3–13.
BRÁNYIK, T.; VICENTE, A.A.; DOSTÁLEK, P.; TEIXEIRA, J.A. (2005): Continuous
BeerFermentation Using Immobilized Yeast Cell Bioreactor Systems.
Biotechnol. Prog. 21.
49
CAGLIARI, T.C., (2009) Analise da expressão de chaperonas moleculares em
plantas e clonagem, purificação e caracterização inicial das proteínas Hsp100 e
Hsp90 de cana de açúcar. Tese de Doutorado. Instituto de Biologia Funcional e
Molecular da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo
CAMARGO, C.A.; USHIMA, A.H.; RIBEIRO, A.M.M.; SOUZA, M.E.P.;SANTOS, N.F.
(1990). Manual de recomendações: conservação de energia na indústria de
açúcar e do álcool. São Paulo: Instituto de Pesquisas Tecnologicas, p 31-41.
CARDOSO, Maria das Graças. (Ed.). (2006). Produção de Aguardente de Cana.
2.ed. Lavras:UFLA, 445p.
CARLILE, M.; WATKINSON, S.C. (1997) “The fungi”., London: Academic Press,
p.460.
CARMELO, V.; SANTOS, R.; VIEGAS, C.A.; SÁ-CORREIA, I. (1998). Modification
of Saccharomyces cerevisiae thermotolerance following rapid. Exposure to
acid estress. International Journal of Food Microbiology. 42: 225-230.
CARTWRIGHT, C.P.; JUROSZEK, J. R.; ROSE, A.H. (1986). Ethanol dissipate the
protomotive force across the plasma-membrane of Saccharomyces cerevisiae.
J. Gen. Microbiol., v. 132, p.369-377, Part 2.
CARVALHEIRO, F., ROSEIRO, J.C., GIRIO,F.M (1999). Interactive effects of
sodium chloride and heat shock on trehalose accumulation and glycerol
production by Saccharomyces cerevisiae Food Microbiology 16, 543-550
CASSIO, F.; LEÃO, C.; VAN UDEN, R. (1987). Transporte of lactateand other
Short-Chain Monocarboxylates in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl.
and Environm. Microbiology. 53, 509-513
CELIS, J. E.; GROMOV, P.; ØSTERGAARD, M.; MADSEN, P.; HONORÉ, B.
DEJGAARD, K.; OLSEN, E.; VORUM, H.; KRISTENSEN, D. B.; GROMOVA, I.;
HAUNSØ, A.; VAN DAMME, J.; PUYPE, M.; VANDEKERCKHOVE, J.; HOLM
RASMUSSEN, H. (1996).Human 2-D PAGE databases for proteome analysis in
health and disease: http://biobase.dk/cgi-bin/celis. FEBS Letters., v. 398, p. 129-
134.
CHENG, L.; MOHRABY, J.; PIPER, P. (1999). Weak organic acid treatment
causes a threalose accumulation in low-pH cultures of Saccharomyces
cerevisiae, not displayed by the more preservative-resistant
Zygosaccharomyces bailli. FEMS microbiology Letters. 170, 89-95.
50
CHAI Y,KOPPENHAFER SL, BONINNI NM, PAULSON HL. (1999) Analysis of the
role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine
disease. J Neuroscience. 19: 10338-47.
CLEMENTE-JIMENEZ, J. M. et al. (2005).Influence of sequential yeast mixtures
on wine fermentation. Int J Food Microbiol, v. 98, p. 301-308, feb.
CLEMENTEJIMENEZ,J.M.; MINGORANCECAZORLA, L.;
MARTINEZRODRIGUEZ,S.; HERASVAZQUEZ,F. J.; RODRIGUEZVICO,F.
(2005).Influence ofsequential yeast mixtures on wine fermentation. Food
Microbiol., v.98, p.301308.
CORTHALS, G. L.; WASINGER, V. C.; HOCHSTRASSE, D. F.; SANCHEZ, J. C.
(2000).The dynamic range of protein expression: A challenge for proteomic
research. Electrophoresis, v. 21, p. 1104-1115.
COSTA, D.A. (2001) Caracterização de leveduras termotolerantes para
produção de etanol celulósico; Dissertação a titulo de Mestre; Universidade
Federal de Ouro Preto; Ouro Preto, Minas Gerais.
CORRÊA ,L. (2004).Controle de qualidade da síntese protéica. Biologia Celular
I. p. 77, São Paulo.
CRUZ, Sandra Helena da.et.al. (2001). Por uma Fermentação Mais Saudável.
D’AMORE, T.; STEWART, G.G. (1987). Ethanol tolerance in yeast. Enzime
Microbiol. Technol., v.9, p.322- 330,
DAUGULIS, A.J.; SWAINE, D.E.; (1987). Examination of substrate and product
inhibition kinetics on the production of ethanol by suspended and iimmobilized
cell reactor. Bioetechnol. Bioeng., v. 29, p. 639-645.
DE SOUSA, M. V.; FONTES, W.; RICART, C. A. (2003). Análise de Proteomas: O
despertar da era pós-genômica. Revista on line-Biotecnologia Ciência ε
Desenvolvimento. p. 12-14.
DEMAIN, A. L.; PHAFF, H. J.;KURTZMAN, C. P. (1998). The industrial and
agricultural significance of yeasts. In: KURTZAM, C. P.; FELL, J. W. (Ed.) The
Yeasts: a toxinomic study. Amsterdan: Elsevier Science Publisher BV, cap 3 pag.
13 – 19.
DUJON B. (1996) The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet.
12 (7): 263-70
51
E-escola Instituto Superior Tecnico – Analise da Expressão de Proteomica.
Disponivel em http://www.e-escola.pt/ftema.asp?id=128&canal=5. Acessado em 20 de Maio de
2013.
ELLIS RJ, VAN DER VIES SM. (1991) Molecular chaperones. Annuals Reviews of
Biochemistry ; 60: 321-347.
ESTRUCH, F. (2000). Stress-controlled transcription factors, stress-nduced
genes and stress tolerance in budding yeast. Federation of European
Microbiological Societies Microbiology Reviews, Amsterdam, v. 24, p.469-486.
EMELYANOV VV. (2002) Phylogenetic relationships of organellar Hsp90
homologs reveal fundamental differences to organellar Hsp70 and Hsp60
evolution. Gene. 299: 125-133.
FERMENTEC S/C LTDA.(1978) Processo de Fabricação de álcool. Piracicaba,
SP. 108 p.
FERNANDES,Patricia M.B.et.al. (2008) Ácidos Graxos de Membrana e Trealose
na Resposta de Levedura a Alta Pressão Hidrostática.Universidade Federal do
Espírito Santo- Vitória.
FERRARINI M, HELTAI S, ZOCCHI MR, RUGARLI C. (1992) Unusual expression
and localization of heatshock proteins in human tumor cells. Int J Cancer. 51:
613-619.
FINK AL. (1999) Chaperone-mediated protein folding. Physiol Rev. 79:425-49.
FLEET, G. H. & HEARD, G. M. (1993) - Yeasts: growth during fermentation. In:
Fleet, G. M. (Ed.), Wine Microbiology amd Biotechnology. Harwood Academic
Publishers, Chur, Switzerland, 27-54.
FLEET, G. H. (2003) - Yeasts interactions and wine flavour. Int. J. Food
Microbiol., 87: 11-22.
FOLCH-MALLOL,J.L.; GARAY-ARROYO, A.; LLEDIAS, F.; ROBLES, A.A.C. (2004)
La respuesta a estrés em la levedura Saccharomyces cerevisiae. Rev. Latinoam.
Microbiol.,v 46, p24-46.
FULLER KJ, ISSELS RD, Slosman DO et al. (1994) Cancer and the heat shock
response. Eur J Cancer; 30:1.884-91.
FUGE, E.F. e WERNER-WASHBURNE, M. (1997) Stationary phase in the yeast
Saccharomyces cerevisiae, In: Hohmann, S., Mager, W.H. (eds) Yeast Responses,
NY. Springer, p. 53-74.1997.
52
GALDOS, A. C. R. (2009) Análise proteômica do saco vitelino de bovinos.
[Proteomic analisys of bovine yolk sac]. 2009. 111 f. Dissertação (Mestrado em
Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo.
GALDOS-RIVEROS, A. C.; PIZA, A.R.T.; RESENDE, L.C.; MARIA, D.A.; MIGLINO,
M.A. (2010) Proteomica: Novas fronteiras de pesquisa. ENCICLOPÉDIA
BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.6, N.11; Pág. 2
GERBAUX, V. et al. (2009) Influence of Inoculation with Malolactic Bacteria on
Volatile Phenols in Wines. Am J Enol Vitic, v. 60, p. 233-235, jun.
GOMES, D.S. (2004). Efeito dos fatores de transcrição Yap1 e Ace1 na via de
desintoxicação de cádmio em S. cerevisiae. Dissertação (Mestrado em
Bioquímica), UFRJ.
GOMES, F.C.O.; SILVA, C.L.C.; MARINI, M.M.; OLIVEIRA, E.S.; ROSA, C.A. (2008)
Use of selected indigenous Saccharomyces cerevisiae strains for the
production of the traditional cachaça in Brazil. Journal of Applied Microbiology,
v.103, p.24382447.
GÖRG, A.; KLAUS, A.; LÜCK, C.; WEILAND, F. (2010) Two-dimensional
electrophoresis with immobilized pH gradients for proteome analysis: A
laboratory manual. Disponivel em: <http://www.wzw.tum.de/blm/deg/>. Acesso em: 2
Julho 2013
GOFFEAU A., BARREL, B.G., BUSSEY, H., DAVIS, R.W., DUJON, B., FELDMANN,
H., GALIBERT, F., HOHEISEL, J.D., JACQ, C., JOHNSTON, M., LOUIS, E.J.,
MEWES, H.W., MURAKAMI, Y., PHILIPPSEN, P., TETTELIN, H., OLIVER, S.G.
(1996) Life with 6000 genes. Science 274: 563-567
GUERZONI, M. E., LANCIOTTI, R., SINIGAGLIA, M., ANESE, M., LERICE, C. R.
(1994) Influence of some selected ions on system water activity and on ethanol
vapour pressure and its inhibitory action on Saccharomyces cerevisiae.
Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 40, n. 12, p. 1051-1056, Dec.
HALLSWORTH, J. E. (1998) Ethanol-induced water stress in yeast. Journal of
Fermentation and Bioengineering [S.I.], v. 85, n. 2, p. 125-137.
53
HAMMOND, J.R.M. (1995) Genetically-modified brewing yeasts for the 21st
century. Progress to date. Yeast, v.11, n.16, p.1613-1627.
HEERKLOTZ, H. (2001), “Membrane Stress and Permeabilization Induced by
Asymmetric Incorporation of Compounds”, Biophysical Journal, v.85, p.184-195.
HENDRICK JP, HARTL FU. (1993) Molecular chaperone functions of heat-shock
proteins. Annu Ver Biochem. 62: 349-84.
HOGAN D. A. (2006) - Quorum sensing: alcohols in a social situation. Curr. Biol.,
16: R457-R458.
HOLZBERG, I.; FINN, R.N.; STEINKRAUS, K. H. A (1967) kinetic study of the
alcoholic fermentation of grape juice. Biotecnol. Bioeng., v.9, p. 413-427.
HUNT C, MORIMOTO RI. (1985) Conserved features of eukaryotic hsp70 genes
revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc
Natl Acad Sci USA; 82:6.455-9.
ISFOR, R. J. (2002) Proteomics analysis of striated muscle. Journal of
Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sci. v. 771,
p. 155-165.
JAENICKE R. (1999) Stability and folding of domain proteins. Prog Biophys Mol
Biol. 71: 155-241.
JAMES, P. (1997) Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of
proteomics. Quaterly reviews of biophysics, v. 30, p. 279-331.
JAKOBSEN, B.K., PELHAM, H.R.B. (1991). A conserved heptapeptide restrains
the activity of the yeast heat shock transcriptation factor. The EMBO Journal 10,
369-375.
JAKOB U, LILIE H, Meyer I, Buchner J. (1995) Transient interaction of Hsp90 with
early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in
vivo. J Biol Chem. 270(13): 7288-94.
KLOSE, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and
electrophoresis of mouse tissues. A Novel Approach to Testing for Induced Point
Mutations in Mammals. Humangenetik, v. 26, p. 231-243.
KÖNIG, H., UNDEN, G. e FRÖHLICH, J. (2009) Biology of Microorganisms on
Grapes, in Must and in Wine. BerlinHeidelberg: Springer-verlang.
54
LAI BT, CHIN NW, STANEK AE, KEH W, LANKS KW. (1984) Quantitation and
intracellular localization of the 85K heat shock protein by using monoclonal
and polyclonal antibodies. Mol Cell Biol. 4: 2802-2810.
LASZLO, A. Evidence for two states of thermotolerance in mammalian cells.Int.
J.Hyperther.,v.4, n. 5, p.513-526, 1998.
LEHTONEN, M.; JOUNELAERIKSSON, P. Volatile and nonvolatile compounds in
the flavour of alcoholic beverages. In: PIGGOTT, J. R. Flavour of distilled
beverages: Origin and Development. Florida: Verlag Chemie Internacional Inc.,
1983. p.6478.
LEVCHENKO I, YAMAUCHI M, Baker TA. (1997) ClpX and MuB interact with
overlapping regions of Mu transposase: implications for control of the
transposition pathway. Genes Dev. 11: 1561-72.
LEWIS J.G., LEARMONTH, R.P., ATTFIELD, P.V., WATSON, K (1997) Stress co-
tolerance and trehalose content in baking strains of Saccharomyces
cerevisiae. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 18, 30-36.
LIMA, U.A.; BASSO, L.C.; AMORIM, H.V., Produção de etanol. In: Lima, U.A.;
Aquarone, E.; Borzani, W.; Schmidell, W. (Ed.) Biotecnologia Industrial, São Paulo:
Edgard Blücher LTDA, 2001, cap. 1, p. 11-20.
LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.;SCHMIDELL, W. 2001. Biotecnologia
Industrial. Processos Fermentativos e Enzimaticos. São Paulo: Ed. Edgard
Blucher LTDA, 3, 593
LINDQUIST, S. Heat shock proteins and stress tolerance in microorganisms.
Curr. Opin. Genet. Dev., v. 2, n. 5, p. 748-755, 1992.
LOCK, L.L., 2007, Seleção de leveduras lipoliticas isoladas de bromélias e produção
e caracterização da lipase bruta e Debaryomyces melissophillus BI81, Quimica
Industrial UNISc, In: AIDOO, K.E., ROB, N.M.J. ; SARKAR, P.K. (2006).
“Occurrence and function of yeasts in Asian indigenous fermented foods”.
FEMS Yeast Research , Amsterdam, v. 6, p. 30-39; MORENO-ARRIBAS M.V. &
POLO M.C. (2005) “Winemaking biochemistry and microbiology: current
knowledge and future trends.” Critical Reviews in Food Science and Nutrition ,
Amsterdam, v. 45, p. 265-286.
LOPANDIC, K., TIEFENBRUNNER, W.,GANGL, H.,MANDL, K., BERGER, S.,
LEITNER, G., ABD-ELLAH, G. A., QUEROL, A., GARDNER, R. C., STERFLINGER,
55
K. & PRILLINGER, H. (2008) - Molecular profiling of yeasts isolated during
spontaneous fermentations of Austrian wines. FEMS Yeasts Res., 8: 1063- 1075.
LLOYD, D.; MORELL, S.; CARLSEN, H.N.; DEGN, H.; JAMES, P.E.; TOWLANDS,
C.C. Effects of growth with etanol on fermentatiion and membrane fluidity os
Saccharomyces cerevisiae. Yeast, v.9, n.8, p.825-833, 1993.
LOUNG, J. H. T. Kinetics of ethanol inhibition in alcohol fermentantion.
Biotecnol.Bioeng., v.27, p. 280-285, 1984.
LYND, L.R.; AHN, H. J.; ANDERSON, G.; HILL, P.; KERSEY, D.S.;KLAPATCH, T.
Thermophilic ethanol production – investigation of ethanol yield and tolerance
in continuous culture. Appl. Biocherm. Biotechnol., v.28-9, p. 549-569, 1991.
MAIA, Fabrício Simplíco. Alternativas para Exportação de Cachaça Artesanal:
Um exemplo da Alemanha. Disponível em
:www.editora.ufla.br/BolTecnico/pdf/bol_57.pdf Acessado em: 04 abril.2013.
MAJARA, M.; O’CONNOR-COX, E.S.; AXCELL, B.C. Trehalose – A stress
protectant and stress indicator compound for yeast exposed to adverse
conditions. J. Am. Soc. Brew. Chem., v. 54, n.4, p.221-227, 1996.
MALAJOVICH M. A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro, Edições da Biblioteca Max
Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, 2012.
MARTÍN, C.; MARCET, M.; ALMAZÁN, O.; JONSSON, L.J. Adaptation of a
recombinant xyloseutilizing Saccharomyces cerevisiae strain to a sugarcane
bagasse hydrolysate with high content of fermentation inhibitors. Bioresource
Technology, v. 98, p. 1767-1773, 2006.
MARTINS, S.M. Como Fabricar Cerveja. São Paulo: Ícone Editora, 2aed, 77p.1991.
MAZID, M. A. (1993) “Biocatalysts and immobilized enzyme/cell bioreactors.
Biotechnology.” v.11, p. 690-695.
MEILGAARD, M.C. Proceedings of the second MBAA: Symposium on sensory
analysis,MBAA, Master Brewers, v.18, n.1, p.1-41, 1981.
MELO, H. F. Resposta ao estresse ácido em leveduras da fermentação
alcoólica industrial Tese de Mestrado, Recife/PE, p. 118, 2006.
56
MISHRA, P.; PRASAD, R. Relationship between ethanol tolerance and fatty acyl
composition of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol [S.I.], v. 30,
p. 294–298, 1989.
MONACO, M.A.S.L.; Efeito protetor o magnésio no choque térmico e o estresse
pelo etanol em leveduras saccharomyces cerevisiae. Piracicaba, Universidade
de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, p.64, 2007.
MORENO-ARRIBAS M.V. & POLO M.C. (2005) “Winemaking biochemistry and
microbiology: current knowledge and future trends.” Critical Reviews in Food
Science and Nutrition , Amsterdam, v. 45, p. 265-286.
MORIMOTO,R.I., (1993) Cells in stress: transcriptional activation of the heat
shock genes. Science 259, 1409-1410.
NELSON, D.L.; COX, M.M., 2004.Buffering against pH changers in biological
systems. In: Principles of biochermistry ed. Lehninger A.L. pp47-74. New York:
W.H. Freeman and Company.
NETO, J.M.F.A. (2012) Proteinas de estresse HSP’s como complemento do
sistema de defesa antioxidante. EFdesportes.com, Revista Digital. Buenos Aires,
Año 17, n°167, Abril de 2012. Disponivel em:
http://www.efdeportes.com/efd167/proteinas-de-estresse-hsps.htm. Acessado em
Maio de 2013. In: ELLIS RJ, VAN DER VIES SM. Molecular chaperones. Annuals
Reviews of Biochemistry 1991; 60: 321-347
NISSEN, P., NIELSEN, D. & ARNEBORG, N. (2003) - Viable Saccharomyces
cerevisiae cells at high concentrations cause early growth arrest of non-
Saccharomyces yeasts in mixed cultures by a cell-cell contact-mediated
mechanism. Yeast, 20: 331-341
NOLLEN EA, Morimoto RI. (2002) Chaperoning signaling pathways: molecular
chaperones as stresssensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci. 115: 2809-2816.
O’FARRELL, P. H. High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of
Protein. The Journal of Biological Chemistry, v. 250, n. 10, p. 4007-4021, 1975.
OLIVEIRA, A.A.C; (2009) Estudo Fisiológico e Morfologico da Aplicação de
Estresse Eletroquimico em Cultivos de Leveduras. Dissertação apresentada ao
corpo docente do curso de Pos-Graduação em Tecnologia de Processos Quimicos
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009 In: MAZID, M. A. (1993)
“Biocatalysts and immobilized enzyme/cell bioreactors. Biotechnology.” v.11,
p. 690-695; ZAFAR, S.; MOHAMMAD, O.; MOHAMMED, S.; HUSAIN, S. Batch
57
Kinetics and modeling of etanolic fermentation of whey. International Journal of
Food Science and Technology. V.40, p. 597-604, 2005
OLIVEIRA, A.L.C., (2009), Estudo Fisiologico e morfológico da aplicação de
estresse eletroquímico em cultivos de leveduras, Escola de Quimica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro. In: SOARES, D.G., ANDREAZZA, A.C.,
SALVADOR M. (2005) “Avaliação de compostos com atividade antioxidante em
células da levedura Saccharomyces cerevisiae” Braz. J. Pharm. Sciences, v.41,
n.1, p.95-100.
OLIVEIRA, E.R. Histórico da fermentação alcoólica. In: SEMANA DE
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA, 1960, Piracicaba, Anais... Piracicaba: USP, 1960.
f.196.
OLIVEIRA, M.A. (2011) Produção de cerveja de baixo teor alcoolico utilizando
leveduras imobilizadas em biopolimeros. Dissertação a titulo de Mestre.
Universidade Tiradentes UNIT. Aracajú, Sergipe In: MEILGAARD, M.C.
Proceedings of the second MBAA: Symposium on sensory analysis,MBAA,
Master Brewers, v.18, n.1, p.1-41, 1981.
OLIVEIRA, M.C.F.L.; PAGNOCCA, F.C. Aplicabilidade de meios seletivos
empregados na indústria cervejeira para a detecção de leveduras selvagens
em unidades sucroalcooleiras. In: SIMPOSIO NACIONAL DE BIOPROCESSOS,
8., São Lourenço, 1988. Anais... São Lourenço: SINAFERM, 1988. p. 78-81.
OLIVA NETO, Pedro de. Efeito de Fatores Inibidores na Fermentação Alcoólica.
Produção de Etanol: Qualidade da Matéria-Prima. Faculdade de Ciências e Letras
de Assis – UNESP. 2006.
OSTERGAARD, S.; OLSSON, L.; NIELSEN, J. (2000) “Metabolic engineering of
Saccharomyces cerevisiae”. Microbiology and Molecular Biology Rewiews, v. 64,
p. 34-50.
PANDEY, A.; MANN, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature,
Massachusetts, v. 405, n. 6788, p.837-846, 2000.
PARSELL DA, KOWALL AS, Lindquist S. (1994) Saccharomyces cerevisiae
Hsp104 Protein. J Biol Chem. 269: 4480-7.
PATARO, C.; GUERRA, J.B.; GOMES, F.C.O.; NEVES, M.J.; PIMENTEL, P.F.;
ROSA, C.A. Trehalose accumulation, invertase activity and physiological
characteristics of yeasts isolated from 24 h fermentative cycles during the
artisanal Brazilian cachaça. Braz. J. Microbiol., v.33, p.202208, 2002.
58
PENNINCKX, M.J. (2002). An overview on glutathione in Saccharomyces versus
non-conventional yeasts. FEMS Yeast Research, 2, 295-305.
PEREIRA R.S., GEIBEL J. (1999), “Direct observation of oxidative stress on the
cell wall of Saccharomyces cerevisiae strains with atomic force microscopy”,
Molecular and Cellular Biochemistry, v.201, p.17-24.
PEREIRA, JR, NEI; BOM, E.P.S., FERRARA M A. 2008. Tecnologia de
bioprocessos – Rio de Janeiro: Escola de Química/UFRJ,. 62 p.: il. – (Séries em
Biotecnologia, v. 1)
PERES, M.F.S.; LALUCE, C. Ethanol tolerance of thermotolerant yeasts
cultivated on mixtures of sucrose and ethanol. J. Ferment. Bioeng., V. 85, n.4. p.
388-397, 1998
PEREZ-NEVADO, F., ALBERGARIA, H., HOGG, T. & GIRIO, F. (2006) - Cellular
death of two non-Saccharomyces wine related yeasts during mixed
fermentation with Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Food Microbiol., 108: 336-
345.
PIPER, P. W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by
the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., v. 11, n. 4, p. 339-
356, 1993.
PIPER, P.; CALDERON, C.O.; HATZIXANTHIS, K.; MOLLAPOUR, M. 2001. Weak
acid adaptation: the estress response that confers yeast with resistence to
organic acid food preservative. Microbiology. 147, 2635-2642.
PIPER, P.; MAHÉ, Y.; THOMPSON, S.; PANDJAITAN, R.; HOLYAK, C.; EGNER, R.
MUHBAUER, M.; COOTE, P.; KUCHLER, K. 1998. The Pdr12 ABC transporter in
requiredfor the development of weak organic acid resistence in yeast. The
EMBO Journal. 17, 4257-4265.
PIZARRO, F.,VARGAS, F. A. & AGOSIN, E. (2007) - A systems biology
perspective of wine fermentations. Yeast, 24: 977-991.
PRETORIUS, I.S.; TOIT, M. du; RENSBURG, P. van.(2003) “Designer yeasts for
the fermentation industry of the 21st century.” Food Technol. Biotechnol. v. 41, n.
1, p. 3-10.
PRETORIUS, I.S.(2000) - Tailoring wine yeast for the new millennium: novel
approaches to the ancient art of winemaking. Yeast, 16: 675-729.
59
PRINGLE, J.R.e HARTWELL, L.H. The Saccharomyces cerevisiae cell cycle. In:
Strantern, J.N., Jones, E. W., eds. The molecular biology of the yeast
Saccharomyces cerevisiae, life cycle and inheritance. Cold Spring Harbor, NY., p 97-
142, 1982.
QUEROL, A., BARRIO, E. & RAMÓN, D. (1994) - Population dynamics of natural
Saccharomyces strains during wine fermentation. Int. J. Food Microbiol., 21: 315-
323.
RABILLOUD, T. Two dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old
fashioned, but still climbs up the mountains. Proteomics, v. 2, p. 3-10, 2002.
SWAN, T.M, WATSON, K (1998) Stress tolerance in yeast sterol auxotroph: role
of ergosterol, heat shock protein and trehalose. FEMS Microbiology Letters 169,
191-197.
RAINIERI, S., ZAMONELLI, C., KANEKO, Y. (2003) Saccharomyces sensu stricto:
Systematics, genetic diversity and evolution. J Biosc Bioeng 96 (1): 1-9
RAMOS CH, FERREIRA ST. (2005) Protein folding, misfolding and aggregation:
evolving concepts and conformational diseases. Protein Pept Lett. 12: 213-22
RAVANELI, C.G. (2010) Qualidade da matéria-prima, microbiota, fermentativa e
produção de etanol sob ataque de Mahanarvaa fribiolata em cana-de-açucar.
Dissertação a titulo de Doutor. Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
Filho”, Jaboticabal, São Paulo.
RAY, B. Fundamental Food Microbiol. CRCPress, p. 173-181, 2004.
RIVEROS, A.C.G.; PIZA, A.R.T.; RESENDE, L.C.; MARIA, D.A.; MIGLINO, M.N.
Proteomica novas fronteiras de pesquisa clinica. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA,
Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.6, N.11; 2010 Pág. 1 In: GALDOS, A. C. R.
Análise proteômica do saco vitelino de bovinos. [Proteomic analisys of bovine
yolk sac]. 2009. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.
ROSSOUW, D.,NAES, T. & BAUER, F. F. (2008) - Linking gene regulation and the
exo-metabolome: A comparative transcriptomics approach to identify genes
that impact on the production of volatile aroma compounds in yeast. BMC
Genomics, 9: 530-548.
ROSE, A. H. Composition of the envelope layers of Saccharomyces cerevisiae
in relation to flocculation and ethanol tolerance. Journal of Applied
Bacteriology, Oxford, v. 74, p. 110-118, Sept. 1993.
60
RUDDON RW, BEDOWNS E. (1997) Assisted protein folding. J Biol Chem. 272:
3125-8.
RUDDON RW, SHERMAN SA, BEDOWS E. (1996) Protein folding in the
endoplasmic reticulum: lessons from the human chorionic gonadotropin beta
subunit. Protein Sci. 5: 1443-52.
SANT’ANA, G.S. (2009) Resposta ao estresse acido em Saccharomyces
cerevisiae e efeito protetor do ino sodio na morte celular induzida por acido.
Dissertação a titulo de Doutor. Universidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto
Minas Gerais. In: MELO, H. F. Resposta ao estresse ácido em leveduras da
fermentação alcoólica industrial Tese de Mestrado, Recife/PE, p. 118, 2006.
SANTOS, D. ; GELINSKI, J.M.L.N., (2008) Cultura iniciadora da fermentação de
vinhos. Evidência, Joaçaba v. 8 n. 1-2, p. 57-84, janeiro/dezembro 2008, In: KÖNIG,
H., UNDEN, G. e FRÖHLICH, J. Biology of Microorganisms on Grapes, in Must
and in Wine. BerlinHeidelberg: Springer-verlang, 2009
SANTOS, J.R.A.; GUSMÃO, N.B.; GOUVEIA, E.R. (2010). Seleção de linhagens
industrial de Saccharomyces cerevisiae com potencial desempenho para a
produção de etanol em condições adversas de temperatura e de agitação.
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.12, n.1, p.75-80
SANTOS, R.R., (2002) Caracterização e aplicação de borras do refino de óleos
vegetais para produção de lipax fungica por fermentação no estado sólido.
Dissertação a titulo de Mestre. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Rio de
Janeiro. In: CARLILE, M.; WATKINSON, S.C. (1997) “The fungi”., London:
Academic Press, p.460.
SCHIRMER EC, GLOVER JR; Singer MA; Lindquist S. (1996) HSP104/Clp
proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci
21:289-96.
SCHLATTER H, LANGER T, ROSMUS S, Onneken ML, Fasold H (2002). A novel
function for the 90 kDa heat-shock protein (Hsp90): facilitating nuclear export
of 60 S ribosomal subunits. Biochem J. 362: 675-684.
SCHIRMER EC, QUEITSH C, KOWAL AS, Parsell DA, Lindquist S. (1998) The
ATPase Activity of Hsp104, Effects of Environmental Conditions and Mutations
J Biol Chem. 273(25): 15546-52.
SILVA, José Alexandro. et.al. Aplicação da Metodologia de Planejamento Fatorial
e Análise de Superfícies de Resposta para Otimização da Fermentação
Alcoólica.Universidade Estadual da Paraíba.Química Nova.2008.Vol.31
61
SOARES, D.G., ANDREAZZA, A.C., SALVADOR M. (2005) “Avaliação de
compostos com atividade antioxidante em células da levedura Saccharomyces
cerevisiae” Braz. J. Pharm. Sciences, v.41, n.1, p.95-100.
SOUZA, C.S. (2009). Avaliação da produção de etanol em temperaturas
elevadas por linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a titulo de
Doutor. Universidade de São Pailo. São Paulo. In: PIPER, P. W. Molecular events
associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces
cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., v. 11, n. 4, p. 339-356, 1993; LINDQUIST, S.
Heat shock proteins and stress tolerance in microorganisms. Curr. Opin. Genet.
Dev., v. 2, n. 5, p. 748-755, 1992.
SPENCE J, CEGIELSKA A, Georgopoulos C. (1990) Role of Escherichia coli heat
shock proteins DnaK and HtpG (C62.5) in response to nutritional deprivation. J
Bacteriol 172 (12): 7157–7166.
STUPIELLO, J.P.; HORII, J. Condução da fermentação alcoólica. Saccharum, v.
17, p.43-46, 1981
STULTS, J. T.; ARNOTT, D. Proteomics. Methods Enzymology, v. 402, p. 245–
289, 2005.
SUOMALAINEN, H. Yeasts and its effect on the flavour of alcoholic
beverages. Journal of the Institute of Brewing, v.76, p.422-425, 1970.
SWIEGERS, J. H., KIEVIT, R. L., SIEBERT, T., LATTEY, K. A., BRAMLEY, B. R.,
FRANCIS, I. L., KING, E. S. & PRETORIUS, I. S. (2009) - The influence of yeast on
the aroma of Sauvignon Blanc wine. Food Microbiol., 26: 204-211.
TETU B, LACASSE B, BOUCHARD HL, LAGACE R, HOUT J, LANDRY J. (1992)
Prognostic influence of HSP-27 expression in malignant fibrous histiocytoma:
a clinicopathological and immunohistochemical study. Cancer Res. 52: 2325-8.
THIS, P.; LACOMBE, T & THOMAS, M.R. (2006) - Historical origins and genetic
diversity of wine grapes. Trends Genet., 22: 511-519.
THOMAS PJ, QU BH, PEDERSEN PL. (1995) Defective protein folding as a basis
of human disease. Trends Biochem Sci. 20: 456-9.
THOR A, BENZ C, MOORE D2d, GOLDMAN E, EDGERTON S, LANDRY J,
SCHWARTZ L, MAYALL B, HICKEY E, WEBER LA. (1991) Stress response
62
protein (srp-27) determination in primary human breast carcinomas: clinical,
histologic, and prognostic correlations. J Natl Cancer Inst. 83: 170-8.
TORIJA, M. J.; ROZES, N.; POBLET, M.;GUILLON, J. M.; MAS, A. Effect of
fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces
cerevisiae. Int. J. Food Microbiol., v. 80, p.47-53, 2003.
USAMI, M.; MITSUNAGA, K.; NAKAZAWA, K. Two-dimensional electrophoresis
ofprotein from cultured postimplantation rat embryos for development toxicity
studies. Toxicology in Vitro, v. 21, p. 521-526, 2007.
VIANA, T.M.L. (2009) Caracterização Bioenergetica de Sacaromyces cerevisiae
em fermentação vinária Dissertação a titulo de Mestre. Universidade técnica de
Lisboa. Lisboa, Portugal. In: PIZARRO, F.,VARGAS, F. A. & AGOSIN, E. (2007) - A
systems biology perspective of wine fermentations. Yeast, 24: 977-991;
BISSON, L. (2004) - The biotechnology of wine yeast. Food Biotechnol., 18: 63-96.
WALKER M. W.; Yeast Growth. In WALKER, M. W (Ed.). Yeast Physiology and
Biotecnology. Chichester: Jonh Wiley & Sons, 1998. p. 101-202.
WALKER, G.M. 1998. Yeast physiology and biotecnology. John Wiley and Snos.
England. 350.
WIECH H, BUCHNER J, ZIMMERMANN R, JAKOB U. (1992) Hsp90 chaperones
protein folding in vitro. Nature. 358: 169-170.
WILKINS, M. R.; PASQUALI, C.; APPEL, R. D.; OU, K.; GOLAZ, O.; SANCHEZ,
J.C.; JAN, J. X.; GOOLEY, A. A.; HUGHES, E.; HUMPHERY-SMITH, I.; WILLIANS,
K.L.; HOCHSTRASSER, D. F. From proteins to proteomes: large scale protein
identification by two-dimensional electrophoresis and amino acid analysis.
NatureBiotechnology, v.14, p. 61-65, 1996.
WILKINS, M. R.; WILLIANS, K. L.; APPEL, R. D.; HOCHSTRASSER, D. Proteome
research: new frontiers in functional genomics. Germany: Springer-Verlag, 1997.
p 243.
WYNN RM, DAVIE Jr, COX, RP, CHUANG DT. Molecular chaperones: heat-shock
proteins, foldases and matchmakers. J Lab Clin Med 1994; 124:31-6.
YAP, N. A., DE BARROSLOPES, M., LANGRIDGE, P. & HENSCHKE, P. A. (2000) -
The incidence of killer activity of non-Saccharomyces yeasts towards
indigenous yeast species of grape must: potential application in wine
fermentation. J. Appl. Microbiol., 89: 381-389.
63
ZAFAR, S.; MOHAMMAD, O.; MOHAMMED, S.; HUSAIN, S. Batch Kinetics and
modeling of etanolic fermentation of whey. International Journal of Food Science
and Technology. V.40, p. 597-604, 2005
ZOTT, K., MIOT-Sertier, C., CLAISSE, O., LONVAUD-Funel, A. & MASNEUF-
Pomarede, I. (2008) -Dynamics and diversity of non-Saccharomyces yeasts
during the early stages in wine making. Int. J. Food Microbiol., 125: 197-203.
.
.
64
EXPRESSÃO PROTEICA E ANALISE DE PROTEINAS DE
LEVEDURAS STATERS DO GÊNERO SACCHAROMYCES EM
BIOPROCESSOS
65
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................................. 66
ABSTRACT ......................................................................................................................................... 67
CAPÍTULO 2 ....................................................................................................................................... 68
EXPRESSÃO PROTÉICA E ANÁLISE DE PROTEÍNAS DE LEVEDURAS STATERS DO
GÊNERO SACCHAROMYCES EM BIOPROCESSOS ............................................................. 68
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 68
2. OBJETIVOS .................................................................................................................................. 71
2.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................... 71
3. METODOLOGIA ........................................................................................................................ 72
3.1. AMOSTRAS ............................................................................................................................ 72
3.2. PREPARAÇÕES DOS INOCULOS EM MEIO YEPD (YEAST EXTRACT-PEPTONE-
DEXTROSE) .......................................................................................................................................... 73
3.3.2. PREPARAÇÃO DOS INOCULOS EM CONDIÇÕES INDUTORAS DE ESTRESSES
............................................................................................................................................................... 73
A) ESTRESSE POR CALOR .......................................................................................................... 73
B) ESTRESSE POR ÁCIDO (BAIXO PH) ..................................................................................... 73
C) ESTRESSE POR ETANOL ........................................................................................................ 74
3.3.3. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS ...................................................... 74
A) EXTRAÇÃO DE PROTEINAS (LISE CELULAR DE LEVEDURAS) .................................. 74
B) QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS PELO MÉTODO DE BRADFORD .......................... 75
C) ANALISE DE ELETROFORESE ............................................................................................... 76
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 79
4.1. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSES ETANÓLICO .................... 79
4.2. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSE ÁCIDO .................................. 92
4.3. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA PARA ESTRESSE POR CALOR .................. 100
4.4. TERMOTOLERÂNCIAS E A TOLERÂNCIAS AO ETANOL ....................................... 108
5. CONCLUSÕES ........................................................................................................................ 116
6. PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................................................. 118
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 119
66
RESUMO
O eucarioto inferior Saccharomyces cerevisiae é um organismo modelo importante
para o estudo de respostas eucarióticas a estresses ambientais. O presente trabalho
teve como objetivo avaliar e analisar a expressão de proteína da levedura do gênero
Saccharomyces em condições de estresse com variação na concentração de etanol,
de pH baixo e aumento de temperatura, identificando os pesos moleculares de
proteínas que aumentaram a expressão proteica nessas condições e relacionar as
proteínas encontradas com proteínas citadas na literatura. As culturas staters de
fermento biológico seco foram inoculadas em Meio YEPD e posteriormente foram
submetidas as diferentes condições de estresses (calor, etanol e baixo pH). A partir
das analises de SDS-PAGE foi possível conhecer o perfil proteico das leveduras.
Todas as cepas analisadas apresentaram bom crescimento nas condições de
estresse a qual foram submetidas. As expressões aumentadas de peptidios
apresentou variações de acordo com a cultura e o tipo de estresse. Ocorreram
expressão de proteínas com alto peso molecular 60kDa 220 kDa. Assim como
expressão de proteínas de baixo peso molecular 10kDa a 50kDa. As expressões dos
pesos moleculares foram relacionada como possiveis proteínas HSPs e/ou
chaperonas moleculares como resposta das cepas às condições de estresse. O
aumento da tolerância ao etanol é induzível, ocorrendo frequentemente sob as
mesmas condições que os que conduzem a uma maior termotolerância. Várias das
alterações induzidas em levedura por exposição aos níveis de estresse de etanol
são idênticos aos causados por um estresse térmico. A condição de pH baixo
consiste numa situação de estresse que comumente é encontrada em processos
fermentativos industriais. E foi possível concluir que devido a boa tolerância ao
etanol, baixo pH e a boa tolerância a temperaturas elevadas, as cepas aqui
estudadas, parecem reunir atributos necessários para suas permanências nos
bioprocessos, pelo menos, através dos parâmetros testados.
Palavras-Chaves: Saccharomyces cerevisiae, estresse térmico, estresse etanolico,
estresse ácido, HSP e chaperonas moleculares
67
ABSTRACT
The inferior eukaryote Saccharomyces cerevisiae is an important model for the study
of eukaryotic responses to environmental stresses. The present study aimed to
evaluate and analyze the protein expression of yeast from the genus Saccharomyces
under high concentration of ethanol, temperature and low pH, identifying the
molecular weights of peptides that increased expression under these conditions, and
relate them to proteins cited in the literature. The starters yeast cultures were
inoculated in Agar YEPD and subsequently underwent different stress conditions
(heat, ethanol and low pH). From the SDS-PAGE analysis it was possible to know the
protein profile of yeasts. All strains tested showed good growth under stress
conditions to which they were subjected. The increased expression of peptides
presented variations according to the culture and the kind of stress. Increased
expression occurred with high molecular weight proteins: 60kDa and 220 kDa, as
also low molecular weight 10kDa and 50kDa. These proteins were related to possible
HSPs and/or molecular chaperones, translated as a strains response to stress.
Increased tolerance to ethanol is inducible, often taking place under the same
conditions as those which lead to increased thermotolerance. Several of the changes
induced in yeast by exposure to high ethanol levels are identical to those caused by
a thermal stress. The low pH condition consists of a situation that is commonly found
in industrial fermentation processes. It was possible to conclude that due to good
tolerance to ethanol, low pH and high temperatures, the strains studied here seem to
gather necessary attributes for bioprocesses, at least according to the parameters
tested.
Key Words: Saccharomyces cerevisiae, heat stress, stress ethanolic, acid stress,
heat shock protein, HSP and molecular chaperones
68
CAPÍTULO 2
EXPRESSÃO PROTÉICA E ANÁLISE DE PROTEÍNAS DE LEVEDURAS
STATERS DO GÊNERO SACCHAROMYCES EM BIOPROCESSOS
1. INTRODUÇÃO
No contexto da genética atual, o fenótipo pode ser observado a partir dos pontos de
vista morfológico, fisiológico, bioquímico e molecular. Sob a visão molecular, o
fenótipo pode ser descrito em termos de RNAm e proteínas, associados ao genoma
e influenciados pelo ambiente. Dessa maneira, a relação entre genótipo e fenótipo
torna-se bastante complexa (MATTICK, 2003).
A sequência de um gene não deve ser mais considerada isoladamente na predição
de sua função, e a análise do RNAm é somente um pouco mais informativa. Já a
atividade das proteínas está proximamente associada à função do gene, uma vez
que é o produto final da regulação da atividade gênica. Nesse sentido, a proteômica,
que visa caracterizar o conjunto de proteínas expressas em um dado momento,
surge como mais uma ramificação entre as ômicas para complementar os estudos
sobre a biologia molecular das células (WILKINS et al., 1996). A proteômica é
também uma poderosa ferramenta no melhoramento genético, pois, diferentemente
do que ocorre quando são utilizados marcadores fenotípicos ou baseados em DNA,
a proteômica fornece informação em nível molecular da variabilidade genética que é
efetivamente expressa do genoma (PENNINGTON e DUNN, 2001).
As agressões ambientais a que os organismos estão expostas desencadeiam
respostas biológicas muito complexas que envolvem mecanismos gerais e
específicos de resposta. Estes mecanismos dependem de diversos fatores que
interagem entre si, sendo difíceis de estudar numa perspectiva integrada. (E-
ESCOLA, 2009)
Os organismos modelo desempenham um papel crucial na compreensão desses
mecanismos adaptativos decorrentes de variações rápidas e bruscas no meio
ambiente que permitem a manutenção de um estado de equilíbrio que garanta a
sobrevivência e evolução (GASCH, et. al., 2002, apud ROPIO, 2010).
As células de todos os organismos respondem a uma variedade de condições
estressantes através de uma rápida transcrição e subseqüente tradução de uma
69
série de proteínas altamente conservadas, denominadas genericamente de
proteínas de estresse (LOCKE et al., 1990). O termo “proteína de estresse” tem
caráter genérico na descrição de eventos biológicos, uma vez que diferentes
estímulos podem induzir o mesmo mecanismo de defesa celular (WELCH, 1993). As
HSP’s surgem na literatura como uma das classes de proteínas de estresse melhor
estudadas.
O aumento na expressão das HSPs foi inicialmente evidenciado em Drosophila
melanogaster, por meio de choque térmico (incubação em diferentes temperaturas
elevadas). Hoje já se conhece que a resposta heat shock é uma propriedade geral
de todas as células, tanto em condição de hipertermia quanto de demais estados de
alteração homeostática, tais como exposição a metais pesados, aumento na
concentração de cálcio intracelular, diminuição de glicose para fornecimento de
energia às células, infecções virais e bacterianas, hipóxia, análogos de aminoácidos,
aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs), presença de toxinas, etc.
(SCHLESINGER, 1986; BIENZ, PELHAM, 1987; WELCH, 1992; YELLON, MARBER,
1994).
As HSPs são de fundamental importância para a sobrevivência das células, não
apenas em condição de estresse, onde se vê aumento na síntese de proteínas
dirigidas à reparação de danos celulares, mas também em eventos de transporte e
enovelamento (folding) de proteínas em formação (NEUPERT et al., 1990;
GETHING, SAMBROOK, 1992; CRAIG, 1993; MORIMOTO, 1993; STUART et al.,
1994; TERLECHY, 1994). Por isso, são também denominadas de “chaperonas
moleculares” (FLAHERTY et al., 1990; HENDRICK, HARTL, 1993; HALL, 1994 apu
NETO, 2012).
Algumas classes de proteínas de estresse são constitutivas, sendo denominadas de
proteínas cognatas. As proteínas cognatas são membros constitutivos de famílias de
proteínas de estresse que funcionam em condição fisiológica normal.
As chaperonas moleculares podem ser definidas como uma categoria de proteínas
que assessoram a formação correta de outros polipeptídios, embora não sejam
componentes próprios da estrutura funcional normal destes (ELLIS, VAN DER
VIES,1991). O grande problema de proteínas em formação e daquelas recém-
sintetizadas é a exposição de suas superfícies interativas com o ambiente
intracelular, que poderia facilitar contatos com outras moléculas, desencadeando
70
alterações na conformação estrutural e funcional já programadas da proteína. As
chaperonas moleculares têm como função principal assistir a autoformação e
enovelamento de cadeias polipeptídicas, por inibição de vias alternativas de ligação
de outras proteínas às cadeias que se formam, auxiliando na não formação destas
interações incorretas (ELLIS, VAN DER VIES, 1991apud NETO, 2012) .
Trata-se de um fungo unicelular leveduriforme com ciclo eucarioto típico e completo,
e tem sido amplamente estudado, tornando-se ferramenta importante nas pesquisas
sobre mutagênese, reparo de DNA e mecanismos que respondem a estresses
ambientais (MARIS et.al.; 2001; BOEIRA et. al; 2002.; PUNGARTNIK et. al., 2002
apud NASCIMENTO, 2007).
Dentre as vantagens da sua utilização como microorganismo modelo estão a sua
fácil manipulação laboratorial e aplicação de métodos de genética molecular
clássica, um tempo de geração curto, o fato de não ser patogénico para humanos ter
o genoma completamente sequenciado (KUCHARCZK et. al. 2001, ALTMANN et. al.
2007).
71
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar e analisar a expressão de proteína da levedura do gênero Saccharomyces
em condições de estresse etanólico, acido e térmico.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar os pesos moleculares de proteínas que aumentaram a expressão
proteica em condições de estresses;
- Relacionar as proteínas encontradas com dados da literatura científica;
72
3. METODOLOGIA
Os experimentos descritos a seguir, foram desenvolvidos no Laboratório de Biologia
Molecular Carmen Lemos, no Instituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia,
Campus de Ondina, Salvador, Bahia.
3.1. AMOSTRAS
Foram utilizadas cepas de leveduras starter do gênero Saccharomyces utilizadas
para as fermentações de cerveja, vinho, cachaça e pão:
A) Fermento Cervejeiro (seco) Safale S-04 Ale – Fabricante: Product of denmark
“LALLEMAND”. Origem: Áustria. Código utilizado para estirpes nesta
dissertação é a S04
B) Fermento Cervejeiro (seco) Saflager S-189 Lager - Fabricante: Product of
denmark “LALLEMAND”. Origem: Áustria. Código utilizado para estirpes nesta
dissertação é a S189
C) Fermento Biológico (seco) para produção de cachaça gentilmente cedida pelo
Cenex – Centro de Extensão do ICB – UFMG. Código utilizado para estirpes
nesta dissertação é a ScFC
D) Fermento Biológico (seco) para produção de vinho gentilmente cedido pela
Vinícola no município de Lagoa Grande (Pernambuco) 361m de altitude
(IBGE, 2011), 8°59’47” de latitude Sul, longitude 40°16’18” (IBGE, 2006)
situadas na região do Vale do Submédio do São Francisco. Código utilizado
para estirpes nesta dissertação é a ScVB (Saccharomyces cerevisiae
variedade bayanus) e ScVY (Saccharomyces cerevisiae variedade
desconhecida “y”).
E) Fermento Biológico Seco Instantâneo especial para pães, pizza da marca Dr.
Oetker. Comprado em supermercado. Código utilizado para estirpes nesta
dissertação é a ScFP (Saccharomyces cerevisiae para fermentação de pão).
73
3.2. PREPARAÇÕES DOS INOCULOS EM MEIO YEPD (YEAST EXTRACT-
PEPTONE-DEXTROSE)
De cada estirpe de fermento biológico seco foi pesados 25g e adicionadas em 225
ml de agua destilada estéril. Posteriormente as amostras foram homogeneizadas em
Stomacher Mc 1204 (Digital Blender ITR) a 200 rpm por 2 minutos. Foi retirada uma
alíquota de 0,1ml da diluição decimal de 10-1 e semeada com o auxilio de Alça de
Platina em placas de Petri em triplicata contendo Meio Agar YEPD (Yeast Extract-
Peptone-Dextrose - 10,0 g/L de glicose (Vetec); 20,0 g/L de Agar bacteriológico
(Acumedia); 5,0 g/L de peptona (Acumedia); e 5,0 g/L de extrato de levedura
(Acumedia); agua destilada 1000ml), suplementadas com clorafenicol (Himedia), na
concentração de 0,001% (100mg/L), em fluxo laminar vertical (Modelo Standart). As
placas foram incubadas em Estufa BOD (Alfakit) a temperatura de 28°C por 48 horas
(YARROW, 1998). Essas placas foram consideradas como placas padrões (cultivo-
mãe) que posteriormente foram utilizadas como inoculo de crescimento de leveduras
submetidas às diferentes condições de estresses.
3.3.2. PREPARAÇÃO DOS INOCULOS EM CONDIÇÕES INDUTORAS DE
ESTRESSES
A) ESTRESSE POR CALOR
Foi retirada uma colônia de levedura com auxilio de alça de platina, de uma placa
contendo meio YEPD e a levedura e semeadas em uma outra placa de petri
contendo meio YEPD sem clorafenicol.
As placas foram incubadas em estufas nas seguintes temperaturas: 30°C, 35°C e
40°C por 5 dias.
A semeadura foi feita em triplicata para cada estirpe de fermento biológico seco.
B) ESTRESSE POR ÁCIDO (BAIXO PH)
Foi retirada uma colônia de levedura com auxilio de alça de platina de uma placa de
petri contendo meio YEPD e a levedura e semeadas em uma outra placa de petri
contendo meio YEPD sem clorafenicol ajustados para diferentes valores de pH: 2,5;
74
3,5; 4,5; 5,0 e 6,0 com solução de acido clorídrico (HCl) 6N. Os meios acidificados
foram autoclavados separando-se a solução nutritiva da solução aquosa de ágar,
logo que saiu da autoclave o conteúdo dos dois frascos foram unidos e então os
meios foram vertidos em placas de Petri. As placas inoculadas foram incubadas em
estufa a 28°C por 7 dias.
C) ESTRESSE POR ETANOL
Foi retirada uma alçada de uma placa contendo meio YEPD e a levedura e
semeadas em uma outra placa de petri contendo meio YEPD sem clorafenicol
adicionando-se etanol absoluto nas concentrações finais de 3%, 5%, 7%, 9%, 12%,
15% e 21% (v/v). O etanol foi adicionado ao meio liquefeito e a temperatura de 50-
55°C vedando as placas com filmes plásticos. As placas inoculadas foram incubadas
em estufa a 28°C por 7 dias.
3.3.3. EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS
A) EXTRAÇÃO DE PROTEINAS (LISE CELULAR DE LEVEDURAS)
O método de lise celular de levedura descrito abaixo foi baseado no protocolo de
BIOQUIMICA EXPERIMENTAL QBQ – 4025 do DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
DO INSTITUTO DE QUIMICA DA USP.
Em um tubo de centrífuga com tampa com auxilio de alça de platina foi pesado
aproximadamente 1 g (peso úmido) de células de leveduras crescidas em meios
adversos (estresses etanolico, acido e térmico). Adicionou-se 4 mL de tampão de
lise. Em seguida ressuspendeu-se as células usando um vórtice.
Adicionou-se 40 µL de PMSF 100 mM em etanol e homogeneizou-se em vórtice. 8
mL de pérolas de vidro lavadas e secas foram adicionadas a suspensão. Agitou-se
ininterruptamente em vórtice durante 1 min (processo de lise).
A solução foi resfriada em banho de gelo por 1 min. Essa operação foi repetida por
mais 4 vezes.
75
Em seguida centrifugou-se a suspensão de células + pérolas de vidro a 850x g por 2
min. Foi removido cuidadosamente o sobrenadante – evitando coletar o material
precipitado – para um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO.
O tubo LISADO foi mantido em banho de gelo.
Foi feito uma ressuspensão do precipitado + pérolas de vidro em 4 mL de tampão de
lise. Adicionou-se mais 40 µL de PMSF 0,1 M em etanol e homogeneizou em vórtice.
Essa etapa foi repetida por mais 2 vezes, reunindo-se os sobrenadantes no mesmo
tubo LISADO.
Usando uma proveta, o volume do LISADO foi determinado.
O lisado foi divido em 3 alíquotas de igual volume em tubos plásticos, identificados
com o nome de cada levedura em estudo.
Armazenou-se em freezer a –20°C
B) QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS PELO MÉTODO DE BRADFORD
O método de coloração por Bradford (1976) é uma técnica para determinação de
proteínas, que utiliza o corante azul brilhante de Coomassie. Para quantificação de
proteínas foi realizada uma curva padrão com diferentes concentrações de albumina
de soro bovino (Curva de BSA) em função da absorbância obtida a 595nm, obtendo-
se R2 = 0,9454.
Este método de forma adaptada consiste basicamente na mistura de 10µl da
amostra proteica em 790µl de água Mili-Q e posterior adição de 200 µl do reagente
de Bradford. Após 5 minutos de incubação em temperatura ambiente são lidas as
absorbâncias e os resultados são expressos em mg de proteína por ml da amostra
comparando-se com a curva padrão.
Para a quantificação de proteína das amostras de fermento biológico seco, foi feito o
seguinte procedimento: os tubos de lisados foram retirados do freezer e colocados
em um recipiente com gelo previamente preparado. Em seguida aplicou-se o método
de Bradford (1976). Os resultados obtidos foram correlacionados com a curva
padrão de BSA. A conversão de Absorbância em concentração de proteína foi obtida
com a ajuda de um software GrafPad Prism 5 Project.
Os tubos com o lisado proteico foram novamente colocados num freezer para
posteriormente serem utilizados nas análises de eletroforese.
76
C) ANALISE DE ELETROFORESE
A análise de eletroforese do tipo SDS-PAGE foram desenvolvidas de acordo com o
método estabelecido por Laemmli (1970). Foram utilizados géis cuja concentração
foi 10% de acrilamida, polimerizados em placas de vidro (7,8 x 9,2 cm) à
temperatura ambiente, usando sistema BioRad. A TABELA 1 e 2 contém a
composição dos géis e a TABELA 3 contem as etapas e soluções da coloração com
nitrato de prata, utilizados neste trabalho.
TABELA 1. GEL DE SEPARAÇÃO
12,5%
H2O 2,5ml
30% Acryl. 3,0ml
Separ. 4X
Buffer
1,9ml
10% APS 112µl
TEMED 5µ
Composição do Gel de Separação utilizados na analise por SDS-PAGE
TABELA 2. GEL DE EMPILHAMENTO
1GRL
H2O 1,0ml
30% Acryl. 300 µl
Stack. 4X
Buffer
444 µl
10% APS 28µl
TEMED 5µl
Composição do Gel de Empilhamento utilizados na analise por SDS-PAGE
Para a realização da eletroforese em gel de poliacrilamida, a quantidade de proteína
utilizada, foi padronizada afim de utilizar uma mesma quantidade de proteína em
cada leitura.
No preparo das amostras seguiu-se a seguinte metodologia: a) usou-se cerca de 10-
15 µl de proteína e adicionou uma quantidade adequada de 2X tampão contendo de
beta-mercaptoetanol; b) aplicou 5 µl do marcador de peso molecular BenchMark
Protein Ladder.
77
As analises de eletroforese foram feitas separadamente, tomando como base o tipo
de amostra (estirpe de fermento biológico seco) e o tipo de estresse ao qual cada
fermento biológico seco foi submetido.
As analises foram realizadas em uma cuba de eletroforese (Mini-protean 3 cell
Eletroforesis®, Biorad), a 75 volts em tampão de corrida (15g de Tris Base; 72g de
glicina; 50ml de SDS 10%, H2O q.s.p. 500ml com agua destilada) e finalizada
quando o azul de bromofenol atingiu a borda inferior do gel. A fonte utilizada foi
Gibco BRL Eletrophoresis Power Supply, modelo 250, da Life Technologies.
Os géis foram corados por nitrato de prata, seguindo protocolo padronizado no
LABIMUNO – ICS/UFBA. A coloração consiste basicamente de imersões em
diferentes soluções, seguindo as etapas de: fixação; incubação, na qual o gel é
sensibilizado para aumentar a subsequente formação de imagens; coloração,
quando ocorre a impregnação com o nitrato de prata; e a revelação quando ocorre o
desenvolvimento das imagens.
Na TABELA 3 são apresentadas as composições das soluções e as etapas da
coloração.
Após o bloqueio da reação os géis foram colocados em solução de secagem
contendo glicerol, etanol e água (1:5: 19) e fotografados para avaliação posterior.
3.4. TABELAS E RELAÇÃO DAS ORF, GENE, FUNÇÃO OU ATIVIDADE DA
PROTEINA CODIFICADA E PESO MOLECULAR.
Para formação das tabelas foi feita pesquisa no site: http://mips.helmholtz-
muenchen.de/genre/proj/yeast/listSearch.html?order=entry. Usando as seguintes palavras
chaves e/ou fazendo relação entre as mesmas: estresse por etanol, estresse
térmico, estresse baixo pH, termotolerância, HSP, chaperona moleculares.
78
TABELA 3. Etapas e Soluções da coloração com Nitrato de Prata
ETAPAS/SOLUÇÕES COMPOSIÇÃO TEMPO
I. Fixação 50% de etanol; 12% de
acido acético.
1h ou deixar overnight
II. Lavagem 30% de etanol 3 vezes por 20 minutos
III. Incubação Tiossulfato de sódio 0,8mM
(0,02g de Tiossulfato de
sódio para 100 ml de
solução
3 minutos
IV. Lavagem
Rápida
H2O destilada
V. Coloração
com Nitrato
de Prata
Para 100 ml de solução de
0,2g de nitrato de prata;
20µl de formaldeído; H2O.
30 minutos
VI. Lavagem H2O destilada 2 vezes por 20 segundos
VII. Revelação Para 100 ml de solução: 6g
de Na2CO3; 20 µl de
formaldeído; 250 µl de
Tiossulfato de sódio 0,8mM;
H2O.
Até o aparecimento da
imagem
VIII. Bloqueio 50% de etanol; 12% de
acido acético.
79
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Saccharomyces spp. É a primeira escolha para a produção industrial de etanol, por
conta de sua boa capacidade fermentativa, alta tolerância ao etanol e outros agentes
inibidores (produzidos durante a fermentação) ou até mesmo durante o pré-
tratamento da matéria prima a ser fermentada e sua capacidade de crescer
rapidamente sob condições anaeróbicas que são as condições encontradas nos
tanques de fermentação de larga escala (MUSSATO et al., 2010).
A microflora dos processos fermentativos industriais pode constituir uma boa fonte
de microrganismos com características relevantes do ponto de vista industrial,
especialmente leveduras tolerantes ao stress (BASSO et al., 2008; MUSSATO et al.,
2010), pois é sabido que durante o processo de propagação da biomassa
(ESTRUCH, 2000; HOHMANN, 2002) as células estão frequentemente sujeitas a
inúmeros estímulos estressantes (BASSO et al., 2008; MUSSATO et al., 2010) tais
como: estresse osmótico, oxidativo e térmico; exposição a altas concentrações de
etanol e/ou falta de nutrientes e ressecamento. Estas condições adversas podem
afetar dramaticamente a dinâmica da população, a fermentação industrial e
consequentemente a produção de etanol (ESTRUCH, 2000; HOHMANN, 2002).
Sabe-se que a S. cerevisiae emprega uma série de vias responsivas ao estresse
para se adaptar às mudanças drásticas do ambiente (DING et al., 2010).
4.1. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSES ETANÓLICO
Na produção de etanol pela via fermentativa tem se procurado leveduras que
apresentem alta tolerância ao etanol para se obtiver vinhos, cachaças, com maior
grau alcoólico.
Os principais fatores de retardo do crescimento da levedura, redução da viabilidade
e habilidade fermentativa incluem alterações na fluidez da membrana e
desnaturação de proteínas causadas pelo aumento da concentração de álcool
durante a fermentação (DING et al., 2010; FERREIRA, 2002 e BETZ et al., 2004).
As linhagens de leveduras S. cerevisiae em nosso estudo foram submetidas ao
crescimento em concentrações de etanol de 3%, 5%, 7%, 9%, 12%%, 15% e 21%
em placas contendo meio YEPD.
80
Em relação ao crescimento apenas estirpe S04 cresceu até uma concentração de
15% de etanol v/v (FIGURA 1). Não houve crescimento de leveduras em
concentrações de 21% v/v de etanol. Tornando a concentração de 15% de etanol
um fator limitante para o crescimento celular de Saccharomyces.
Este dado difere do trabalho apresentado por BASSI et.al (2011), onde se verificou
que em relação à tolerância ao estresse de etanol, a levedura contaminante Dekkera
bruxellis não cresceu em concentração de 12% ou maiores. A estirpe PE-02 de S.
cerevisiae cresceu em concentrações em até 12% de etanol. Para o mesmo autor,
essa concentração seria um fator limitante para o crescimento de leveduras
contaminantes em destilarias. Conterno et. al.(2006) verificaram que linhagens de
Br. bruxellensis foram tolerantes a pelo menos 10% de etanol.
Ensaios eletroquímicos de Wang et. al. (2007) demonstraram que o limite máximo de
tolerância ao etanol de S. cerevisiae é de 25% (v/v) de etanol, coerente com os
resultados obtidos pelos mesmos autores através das medições convencionais da
capacidade fermentativa.
Antonogelo (2012) avaliou o crescimento em placas com meio sólido contendo
etanol em concentrações de 0%, 9%, 12%, 13%, 14%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%,
17%, 17,5% e 18% durante 3 dias de crescimento. O resultado das análises revelou
que das oitenta e seis cepas testadas, vinte e duas cepas foram capazes de crescer
em meio contendo entre 17 e 17,5% de etanol e por isto foram consideradas
tolerantes ao etanol. Outras 9 cepas foram capazes de crescer somente até a
concentração de 9% de etanol e foram consideradas menos tolerantes ao etanol. A
mesma autora também fez uso da cepa de fermentação de cerveja S04 e teve como
resultado crescimento somente até a concentração de 9% de etanol. Este dado
difere do obtido no nosso trabalho onde a estirpe S04 teve crescimento em até 15%
de etanol. Isso pode ser explicado pelo tempo de crescimento diferente em ambos
os trabalhos. A curva de crescimento de microrganismos é dividida em 4 fases: Fase
Lag ou Adaptativa, Fase Log ou de Crescimento Exponencial; Fase Estacionaria e
Fase de Declinio e Morte. Uma vez que ocorre alteração no meio de crescimento do
microrganismo, o mesmo necessitará de um tempo maior para se adaptar a aquele
ambiente antes de um crescimento exponencial. Ou seja, a sua fase Lag deverá ser
estendida. Logo o tempo de crescimento de três dias que a autora deixou as cepas
em incubação talvez não tenha sido suficiente para um crescimento exponencial.
81
Verificamos que diferentes proteínas ou chaperonas provenientes de choque térmico
também foram otimamente induzidas em níveis variados de etanol acima de 3%
conforme mostrado na TABELA 4
Ainda de acordo com a TABELA 4, em se tratando da expressão de proteínas, a que
se mostrou menos resistente foi à estirpe S-189, apresentando apenas 4 bandas
com aumento de expressão. Isso pode esta relacionada com o fato de que a
levedura S-189 seja do tipo Lager que faz fermentação melhor em temperaturas
mais baixas, além de ser uma levedura de baixa fermentação não se mostrando
muito resistente ao aumento da concentração de etanol. Para esta estirpe é possível
verificar o aumento de expressão nas bandas de 160 kDa, 90 kDa, 50 kDa e 30 kDa
(ver FIGURA 2).
* + etanol 3% 5% 7% 9% 12% 15%
M 1 2 3 4 5 6
90kDa
50kDa
30kDa
25kDa
15kDa
10kDa
FIGURA 1. Levedura Saccharomyces cerevisiae S 04 – Estresse Etanolico
82
* + etanol 3% 5% 7% 9% 12%
M 1 2 3 4 5
160kDa
90kDa
50kDa
30kDa
FIGURA 2 - Levedura Saccharomyces cerevisiae S 189 –Estresse Etanolico
83
TABELA 4 – PESO MOLECULAR DE PROTEINAS – ESTRESSE ETANÓLICO
Peso Molecular (kDa)
BenchMark Proteína Ladder
S. cerevisiae Fermento
biológico da cachaça (ScFC)
S. cerevisiae Fermento
biológico do pão (ScFP)
S. cerevisiae Fermento biológico do vinho variedade
bayanus (ScVB)
S. cerevisiae Fermento biológico do vinho variedade
desconhecida (ScVY)
S. cerevisiae Fermento biológico da cerveja – Safale
(S-04)
S. cerevisiae Fermento
biológico da cerveja – Safale
(S-189)
220
160 X
120
100 X
90 X X
80 X
70 X X
60 X
50 X X X X X X
40 X
30 X X X X X X
25 X X X X
20 X X
18 X
15 X X X
10 X
Tabela 4: Proteínas com expressão aumentada com a crescente concentração de etanol (3%-5%-7%-9%-12%-15%) no meio solido YEPD
84
Já o perfil de expressão proteica das demais estirpes analisadas para estresse
etanolico foi bastante semelhante. Como verificado nas leveduras utilizadas na
fermentação de vinho, a levedura ScVY teve aumento da expressão de bandas de
18kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa e 60kDa, como mostrado na FIGURA 3,
bastante similar com a expressão da levedura ScVB que teve aumento 15 kDa,
25kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa e 70kDa conforme mostra a FIGURA 4, demonstrando
que as duas respondem ao estresse etanolico de um modo bastante parecido.
* + etanol 3% 5% 7% 9% 12%
M 1 2 3 4 5
60kDa
50kDa
40kDa
30kDa
18kDa
70kDa
50kDa
40kDa
30kDa
25kDa
15kDa
* + etanol 3% 5% 7% 9% 12%
M 1 2 3 4 5
FIGURA 4 - Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus– Estresse Etanolico
15kDa
FIGURA 3 – ScVy -Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade desconhecida – Estresse Etanolico
85
A variação de tolerância ao etanol observada nas células das diferentes estirpes
pode ser explicada através de vários fatores, tais como: composição lipídica da
membrana plasmática (JIMENEZ e BENITEZ, 1987; LLOYD et al., 1993; SAJBIDOR,
1997; CHI e ARNEBORG, 2000; YOU et al., 2003; TAKAGI et al., 2005),
acumulação de trealose (MANSURE et al., 1994; SHARMA, 1997; LUCERO et al.,
2000) ou da proteína de choque térmico HSP104 (SANCHEZ et al., 1992; PIPER,
1995), atividade da H+-ATPase membranar (ROSA e SÁ-CORREIA, 1991; SUPPLY
et al., 1995; AGUILERA et al., 2006) e estabilidade mitocondrial (AGUILERA e
BENITEZ, 1985; IBEAS e JIMENES, 1997). O etanol é ainda referido na literatura
como um forte indutor de mutantes respiratórios de S. cerevisiae (NORTON et al.,
1995; IBEAS e JIMENEZ, 1997, apud VIANA 2009).
Células de leveduras expostas a etanol sintetizam solutos compatíveis, gliceral, e
sintetiza trealose como protetores (CAUSTON, et.al. 2001) fato também observado
em estresse induzido por álcool, que foi inibido pelo acumulo de trealose (CRAIG et.
al.1994; DELUNA, et. al. 2001; DICHTL, et. al 1997). As leveduras acumulam grande
quantidade de trealose, tornando-se assim, excelentes modelos para o estudo de
resposta das células eucarióticas a diversos estresses (PANEK, et.al., 1995 apud
MOREIRA, 2007).
ELBEIN (1974) descreveu o papel da trealose como fonte de armazenamento de
glicose para energia e/ou para síntese de componentes celulares. Porém, o papel da
trealose não se limita apenas a reserva de carboidratos, mas está relacionada
principalmente com, a proteção contra estresse: desidratação (FRANÇA et.al 2007);
dessecação (LIU et. al. 2005); congelamento, estresse térmico (ATTFIELD et. al
1987), estresse osmótico (HOUNSA et. al. 1993); produtos químicos como metano e
peroxido de hidrogênio (BENAROUDJ et.al. 2001), e metais pesados.
Estudos realizados no sentido de esclarecer quais os agentes/mecanismos
intervenientes na tolerância de estirpes de S. cerevisiae ao etanol revelaram que a
superóxido dismutase mitocondrial (MnSOD) codificada por SOD2 (COSTA et al.,
1993), a H+-ATPase membranar (AGUILERA et al., 2006; LEI et al., 2007), a
biossíntese de ergosterol (LEI et al., 2007) e a biossíntese de fosfolipídios (CHI et
al., 1999) são essenciais para a aquisição de tolerância ao etanol.
O etanol pode ser um indutor de HSPs através da desestabilização das interações
hidrofóbicas da estrutura da proteína que conduz à associação de chaperonas Hsp
86
com estas proteínas desestabilizadas e concomitante ativação de genes de choque
térmico (MAGER & MORADAS-FERREIRA, 1993).
Conforme mostrado na TABELA 5, algumas dessas expressões podem ser as
proteínas relacionadas à resposta ao estresse, como por exemplo, a proteína Asr1
(alcohol sensitive RING/PHD finger 1 protein) codificada pelo gene ASR1/YPR093C
(33,346 kDa) que foi a primeira proteína de leveduras considerada envolvida numa
via putativa de sinalização responsiva ao álcool. A proteína Ars1p é uma proteína
que esta envolvida na via de sinalização da resposta putativa do álcool e se acumula
no núcleo sob estresse etanólico. Todas as estirpes de leveduras submetidas a este
tipo de estresse apresentadas neste trabalho tiveram um aumento de expressão
proteica da banda a proteína de peso molecular aproximado de 33kDa. Sob estresse
alcoólico essa proteína muda sua distribuição intracelular do citoplasma e se
acumula no núcleo, transmitindo um sinal de estresse através da membrana
plasmática para o núcleo, assim representando um elemento chave na tolerância ao
etanol (BETZ et al., 2004). Embora Izawa et. al. (2006) afirmem o contrário, vários
autores confirmaram que a proteína Asr1 é necessária para a tolerância ao álcool,
representando um importante papel na resposta ao estresse alcoólico (DING et al.
2010) sendo essencial para o crescimento normal da célula em meio contendo altas
concentrações de álcool (BETZ et al., 2004; DING et al., 2010).
O aumento expressão da banda de aproximadamente 100kDa para a levedura ScFc
mostrada na FIGURA 5 pode ser a proteína de choque térmico HSP104 descrito por
Sanchez, et al. (1992); Glover e Lindquist (1998); Parsell, et.al. (1994), Parsell, et
al. proteína de resposta ao estresse, incluindo: o de calor, etanol, (1991) como uma
arsenito de sódio e um homólogo dos ClpA e clpB proteases de E. coli.
Outra possibilidade é que esse aumento de intensidade da banda de
aproximadamente 100kDa seja uma proteína H+ATPase membranar como descrito
por (ROSA e SÁ-CORREIA, 1991; ROSA e SÁ-CORREIA, 1992; MONTEIRO et al.,
1994), tendo como etanol um dos fatores ambientais de estresse que estimulam a
atividade desta enzima in vivo.
A H+-ATPase presente na membrana plasmática de S. cerevisiae é conhecida por
ser essencial a diversas funções celulares, entre as quais a absorção de nutrientes
(KOTYK, 1994), a regulação do pH intracelular (GOFFEAU e SLAYMAN, 1981) e do
87
potencial de membrana (CARMELO et al., 1997), o crescimento celular (PORTILLO
e SERRANO, 1989) e a osmorregulação (MARTINEZ DE MARÃNÓN et al., 2001).
Outra possibilidade é de que a expressão aumentada de proteínas equivalentes às
bandas de 90kDa, 80kDa e 70kDa esteja relacionada com HSP’s da família das
HSP90 e HSP70. Segundo PIPER et.al., (1994), apesar das proteínas de HSP90
serem mais fortemente induzidas pelo calor, foi observada a indução também por
etanol em menor grau quando comparado ao choque térmico. A levedura S.
cerevisiae tem dois genes de HSP90 funcionalmente equivalentes (HSC82 e HSP8.
2);. BORKOVICH et al, (1989). O HSC82 exibe uma expressão constitutiva alta que
aumenta apenas ligeiramente após o choque térmico, enquanto HSP82 que mostra
muito menor expressão basal ainda é fortemente ativada por choque térmico.
HSC82, portanto, contribui mais para a HSP90 presente durante o crescimento
vegetativo normal, enquanto que a expressão da HSP82 é a principal responsável
pelo aumento da proteína HSP90 com choque térmico (BORKOVICH et ai., 1989). O
produto de HSP82 (PM 81.419kDa) se distinguiu da HSC82 (PM, 80.885kDa) pela
sua mobilidade ligeiramente mais lenta em géis 1D das proteínas induzidas pelo
estresse, é a HSP90 de forma induzida pelo etanol (PIPER et.al., 1994). Isso leva a
crer que as expressões aumentadas de peptídeos com peso molecular aproximado
M 1 2 3 4 5
100kDa
80kDa 50kDa
30kDa
20kDa
FIGURA 5 – (ScFc) Levedura Saccharomyces cerevisiae – Estresse Etanol
* + etanol 3% 5% 7% 9% 12%
88
de 80kDa apresentadas neste trabalho sejam referentes às proteínas HSP82 e
HSC82.
Outro ponto a ser observado é a indução da expressão de bandas de baixo peso
molecular, como mostrado na FIGURA 4. Um estudo recente confirmou que várias
pequenas Hsps são induzidas por etanol embora a perda de pelo menos uma destas
proteínas (HSP26) não afeta a tolerância a este tipo de estresse (PETKO e
LINDQUIST, 1986; SUSEK e LINDQUIST, 1989).
As “small HSP” (sHSP) constitui uma família de proteínas com peso molecular entre
12 e 43 kDa, que podem formar estruturas multimétricas e exibir uma ampla gama
de funções celulares. (HORVÁTH et al., 2008).
Em 2000, Sales et.al., demonstraram que HSP12p desempenha função protetora da
membrana plasmática face ao estresse induzido pela desidratação e pelo etanol.
Segundo (PIPER et.al., 1994) na análise de Northern do mRNA da estirpe BJ2168
sondadas para genes transcritos de HSP26 indicou que o mRNA de HSP26
detectável com a adição de 2% de etanol, é praticamente indetectável após a adição
de 4% de etanol. No entanto, é muito mais fortemente induzida com novos aumentos
da concentração de etanol, eventualmente, (em etanol a 10%) a tornar-se tão
fortemente induzida por etanol como por choque térmico. A proteína Pulse-labelling
nesta estirpe mostra também um aumento da indução de HSP26 com o aumento de
etanol.
A proteína de choque térmico HSP26 (23,879kDa) está relacionada com a
superfamília das proteínas de choque térmico pequenas; não tem efeito sobre
termotolerancia; é induzida por estresse osmótico (resistência ao etanol) e limitação
de glicose (HASLBECK et. al.(1999); YOSHIKAWA, et al. (2009);
Outra importante classe de proteínas de choque térmico são as HSP70. A família de
70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70s) é sem dúvida a família mais
altamente conservada das proteínas ao longo da evolução. Em leveduras, a família
das chaperones ubíquas é encontrada em diversos compartimentos celulares e
desempenha papéis importantes na viabilidade celular (CRAIG, et. al. 1993). As
HSP70 são proteínas menores, que se ligam em sequências hidrofóbicas expostas e
mantêm a cadeia peptídica desenovelada até que ela possa assumir a conformação
tridimensional correta. Essa chaperona tem duas tarefas importantes: ajudar o
enovelamento e impedir que várias proteínas mal formadas, com sequências
89
hidrofóbicas expostas, formem agregadas, que além de inúteis podem ser muito
nocivos. Ela ajuda proteínas que estejam sendo sintetizadas em ribossomos livres
no citoplasma ou proteínas que foram transferidas para o retículo endoplasmático.
Nesse caso, entra em ação outro conjunto de chaperonas do grupo HSP70 que são
encontradas dentro do retículo; a mais conhecida delas é a BIP, que é considerada
marcadora do retículo endoplasmático (FREITAS, et. al; 2012).
Na S. cerevisiae, a superfamília HSP70 citosólica inclui as proteínas SSA, SSB, e as
famílias SSE e a família atípica SSZ1 ("stress seventy A, B, E, Z” *). Os parálogos
SSE1 e SSE2, embora claramente relacionado com a HSP70, são mais bem
classificados como membros da subfamília de proteínas semelhantes a HSP70 e
HSP110 (WERNER-WASHBURNE et. al., 1987). Vale citar que todas as estirpes de
leveduras submetidas ao estresse no presente trabalho, tiveram aumento de
expressão de bandas variando entre 60kDa a 90kDa. A relação dessas proteínas
esta especificada na TABELA 7.
O aumento da tolerância ao etanol é induzível, ocorrendo frequentemente sob as
mesmas condições que os que conduzem a uma maior termotolerância (SANCHEZ
et a /, 1992;. COSTA et al, 1993.).
A perda rápida de proteína ATPase da membrana plasmática com o estresse de
etanol contrasta com a estimulação da atividade desta enzima. Ambas as influências
sobre a ATPase afetarão o seu papel na manutenção da homeostase (SERRANO,
1991) e, portanto, devem ter efeitos importantes sobre a tolerância à exposição
prolongada ao etanol.
O efeito tóxico do etanol pode ser verificado na inibição das enzimas glicolíticas e
em numerosos processos biológicos, muitos dos quais estão associados com os
lipídios da membrana celular (PETROV, et. al, 1990; INGRAM et.al. 1984; DOMBEK,
et. al., 1986 apud MONACO, 2007).
Muitas das mudanças induzidas em leveduras pela exposição a níveis estressantes
de etanol são idênticas àquelas causadas pelo estresse térmico (PIPER, 1993;
PIPER et.al. 1994). As respostas de proteção induzida por choque térmico e etanol
também mostra um grau de similaridade (PLESSET et. al., 1982). Por exemplo,
proteínas de choque térmico HSP 90 e HSP70 induzidas pelo calor são idênticas
àquelas induzidas pelo etanol (PIPER et. al., 1994). Esse dois estresses também
tem efeitos indutivos similares nos níveis das duas principais proteínas integrantes
90
da membrana plasmática. A ATPase e a HSP30. Na realidade, o álcool e a
temperatura exercem um efeito sinergistico na resposta das células ao choque
térmico, com álcoois mediando à redução nas mínimas e máximas temperaturas
requeridas para a indução da resposta ao estresse em S. cerevisiae (CURRAN;
KHALAWAN, 1994).
91
TABELA 5. Relação de alguns Genes e Proteínas envolvidas no estresse etanolico.
ORF GENE FUNÇÃO OU ATIVIDADE DA PROTEINA CODIFICADA PESO MOLECULAR
(Da)
YHR104W GRE3 Enzima Aldose Redutase. Induzida por estresse osmótico (etanol), iônico, oxidativo, choque térmico. 37,188
YCR021C HSP30 Proteína de Choque Térmico induzida por choque térmico, tratamento com etanol, acido orgânico fraco. 37,044
YFL0144 HSP12 Proteína de Choque Térmico induzida por choque térmico, oleato e álcool, osmosetresse. 11,693
YHR206W SKN7 Fator de transcrição envolvida na osmoregulação 69,202
YLL026W HSP104 Proteína de Choque Térmico responsiva para estresse, incluindo: calor, etanol e arsenito de sódio. 102,034
YLR251W SYM1 Proteína requerida para o metabolismo do etanol e induzida por choque térmico 22,915
YNL064C YDJ1 Proteína da família da HSP40. Chaperona envolvida na regulação da HSP70 e HSP90
durante estresse
44,670
YBR072W HSP26 Proteína de Choque Térmico 23,879
YOL151W GRE2 Enzima Methylglyoxal reductase. Induzida por estresse osmtico, iônico, oxidativo, choque
térmico e metais pesados.
38,169
YPL223C GRE1 Proteína induzida por estresse osmótico 19,025
YPR006C ICL2 Proteína Não Funcional Isocitrato Liaze. Induzida por etanol 64,976
YRE065C ICL1 Enzima Isocitrato Liase. A expressão dessa proteína é induzida por crescimento em
etanol e reprimida por crescimento em glicose
62,408
YHR076W PTC7 Proteína Fosfatase 2C Mitocondrial. Expressão induzida por crescimento em etanol e
sustentada pelo crescimento em glicose
41,190
YPR093C ASR1 Proteína envolvida em uma via de sinalização de resposta putativa ao álcool. Acumula no
núcleo sob estresse de álcool
33,347
YBR086C IST2 Proteína da membrana plasmática envolvida na osmotolerancia 105,856
YMR175W SIP18 Proteína do estresse osmótico 8,873
FONTE: FREITAS (2013)
92
4.2. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA POR ESTRESSE ÁCIDO
O pH ideal para fermentação encontra-se na faixa de 4 a 5, sendo que em meios
ácidos eles conduzem a maiores rendimentos de etanol, pois restringem o
crescimento da levedura e a produção de produtos secundários como o glicerol,
além de reduzir a contaminação bacteriana. Para mostos preparados com melaço, é
preferível que o pH do meio esteja na faixa de 4,5 a 5,5, pois nesta faixa a
capacidade tamponante do melaço é boa (LIMA, et. al.; 2001).
Com o intuito de conferir se as cepas tolerantes ao álcool eram capazes de crescer
em meio com pH baixo, situação frequente na indústria, as cepas estudadas tiveram
seu crescimento avaliado em placas com meio sólido YEPD contendo valores de pH:
2,5 e 6,0.
Em relação ao crescimento, todas as cepas de leveduras estudadas apresentaram
crescimento em todas as faixas de pH. Este resultado pode ser explicado pelo fato
de que embora os valores de pH dos mostos industriais se encontram na faixa de
4,5 a 5,5, para diminuir os efeitos da ação de bactérias, as destilarias brasileiras
utilizam o tratamento ácido em pH entre 2,0 – 2,5 suportado pelas leveduras devido
à manutenção da homeostase de forma quase independente dos valores do pH do
meio. Este meio acidificado se torna então um fator de seleção para a população de
leveduras, pois tolerância ao pH baixo é um dos fatores que levam à seleção de
linhagens de leveduras capazes de dominar o processo fermentativo.
De todas as estirpes de leveduras aqui testadas, a ScFp, a ScVy e a S04 foram as
que tiveram menor aumento na expressão de proteínas quando submetidas ao
estresse de baixo pH. Apenas três bandas em cada estirpe foram possíveis de ser
detectadas: 50kDa, 40kDa e 18kDa; 90kDa, 70kDa e 20kDa; 160kDa, 50kDa e
20kDa respectivamente como mostram as FIGURAS 6, 7 e 8.
93
50kDa
70kDa
90kDa
160kDa
50kDa
20kDa
20kDa
40kDa
18kDa
pH 2,5 3,5 4,5 5,0 6,0
M 1 2 3 4 5
pH 2,5 3,5 4,5 5,0 6,0
M 1 2 3 4 5
M 1 2 3 4 5
pH 2,5 3,5 4,5 5,0 6,0
FIGURA 6 – Levedura ScFP – Estresse acido FIGURA 7 – Levedura ScVy – Estresse acido
FIGURA 8 – Levedura S04 – Estresse acido
94
Em S. cerevisiae, o pH baixo afeta a organização da parede celular devido à
desnaturação de proteínas gerando, a partir daí, outras disfunções celulares que
podem diminuir a capacidade fermentativa e causar morte (MALAKAR et al., 2006).
A condição de pH baixo consiste numa situação de estresse que comumente é
encontrada em processos fermentativos industriais. No Brasil, por exemplo, na
fermentação da cana de açúcar, 90% das células de levedura são recicladas de
maneira que, após cada ciclo de fermentação, as células são lavadas em solução de
pH 2,0 por 1 hora para reduzir contaminações bacterianas, e reutilizadas em novos
processos, porém, esse procedimento expõe as células a uma situação de estresse
ácido (WHEALS et al. 1999; BASSO et al., 2008).
Esse pré-tratamento acido pode fazer com que a levedura crie uma maior condição
de resistência ao estresse de baixo pH durante o processo fermentativo da cachaça.
O aumento expressão de proteínas relacionadas às bandas de aproximadamente
100kDa e 10 kDa, como mostra a FIGURA 9, pode estar relacionado com as
proteínas H+-ATPase da membrana plasmática (Pma1p) e a H+ATPase da
membrana vacuolar ou V-ATPase (Vma9p). Em S. cerevisiae, o mecanismo primário
de resposta a estresse ácido se deve ao funcionamento da Pma1p que é a proteína
estrutural mais abundante na membrana plasmática, perfazendo de 10 a 20% do
total de proteínas presentes, e ao funcionamento desta enzima na membrana
vacuolar (V-ATPase) (SERRANO et al., 1986; RAO et.al., 1992; PORTILLO, 2000
apud MARTINS, 2013).
A Pma1 é uma ATPase da membrana plasmática, maior reguladora do pH
citoplasmático, com peso molecular de 99,618kDa. Já a Vma9 uma ATPase
exclusivamente vacuolar é uma proteína essencial para a acidificação do vacúolo e
tem peso molecular de 8,381 kDa. Ambas estão relacionadas com resposta ao
estresse acido.
Estudos realizados por Malparida e Serrano (1981) demonstram que a H+-ATPase
membranar mantém o pH intracelular de S. cerevisiae entre 6,0 e 7,0, devido ao
bombeamento de prótons, mesmo quando ocorrem grandes variações no pH
externo. O crescimento de leveduras em meios ácidos demonstrou provocar um
aumento na atividade da H+-ATPase, comprovando-se paralelamente a existência
de uma correlação muito forte entre a enzima e o aumento da atividade catalítica
(ERASO et al., 1987).
95
Através do bombeamento de prótons para fora da célula realizado pela Pma1p e da
compartimentalização vacuolar pela ATPase, a expensas de ATP, essas enzimas
contribuem para manter o equilíbrio entre pH interno e externo (RAO et al., 1992;
PORTILLO, 2000).
A função da H+-ATPase da membrana plasmática é gerar um gradiente
eletroquímico de prótons que, por sua vez, energiza transportadores secundários
importantes para a captação de nutrientes e íons, o que contribui para manutenção
da homeostase de pH e iônica da célula. Esse equilíbrio é essencial para a
funcionalidade celular
Devido à boa tolerância ao etanol e a boa tolerância ao pH acido, as cepas aqui
estudadas, parecem reunir atributos necessários para sua permanência no processo
fermentativo, pelo menos, através dos parâmetros testados.
A acidificação do meio desencadeia uma série de problemas, entre eles a
diminuição do crescimento celular, da síntese de metabólicos, porém, esta
acidificação também induz respostas adaptativas e tanto a produção de ácidos
orgânicos como o funcionamento da H+-ATPase provocam redução do pH do caldo
fermentativo. Neste sentido, vários estudos têm avaliado diferentes estratégias com
a finalidade de favorecer a manutenção do equilíbrio do pH intracelular em células
pH 2,5 3,5 4,5 5,0 6,0
M 1 2 3 4 5
70kDa
50kDa
100kDa
30kDa
25kDa
20kDa
10kDa
FIGURA 9 – ScFP – Estresse Ácido
96
de leveduras comumente utilizadas na indústria de alimentos e bebidas, incluindo a
adição de bases ao meio de cultivo ou ainda técnicas de manipulação gênica
(PATNAIK et. al., 2002; CÁNOVAS et. al., 2007; YÁÑEZ et. al., 2008; WEI et. al.,
2008).
De acordo com a FIGURA 10 a cepa S04 demonstrou aumento de expressão de
acordo com as bandas de aproximadamente 160kDa e 50kDa, que pode esta
relacionado com as proteínas kinase Bck1p (aproximadamente 160kDa - proteína
kinase responsável por controlar a integridade celular) e a Slt2p (aproximadamente
50kDa - Serina/treonina Kinase MAP responsável pela regulação da manutenção da
parede celular e progressão do ciclo celular) são proteínas essenciais em ambientes
ácidos. O aumento da expressão de peso molecular de proteínas encontradas neste
trabalho está descrita na TABELA 6.
No trabalho de Claret, S. et al. (2005) foi avaliado o efeito da exposição de S.
cerevisiae em estresse em baixo pH (HCl) e a ativação da via PKC como resposta.
Durante condições de crescimento em baixo pH a via PKC foi ativada, e o sensor
Mid2p foi identificado como decisivo na ativação desta via, demonstrando que os
componentes Bck1p e Slt2p da cascata MAPK são essenciais em ambiente ácido.
Mid2p (aproximadamente 40kDa - proteína O-glisolisada da membrana plasmática)
atua como um sensor para garantir a integridade da parede celular.
Além desses componentes, os mesmo autores também constataram o envolvimento
de RGD1 na via PKC em pH ácido, comprovando a interação de duas vias, uma
envolvendo o sensor Mid2p e o outro envolvendo Rgd1p, ambos convergem na via
de integridade celular, traduzindo a sinalização em pH baixo. Demonstraram
também, que a interrupção das duas vias envolvidas gera mutantes incapazes de
sobreviver sob condições de estresse ácido (MELO 2006).
Cepas como ScVB, S189 tiveram aumento de expressão de bandas entre 60kDa e
70kDa que pode esta relacionado com outra importante proteína que de resposta ao
estresse de baixo pH que é a Ssb1p. É uma chaperona molecular ATPase
citoplasmática da família da HSP70 e que apresenta peso molecular de
aproximadamente 66kDa.
Para MELO (2006), verificou que apenas o gene SSB1 da família da HSP70 foi
induzido em pH 2. A proteína Ssb1p encontra-se associada a ribossomos no
97
citoplasma, desempenhando um papel importante na síntese de proteínas
(ESTRUCH, 2000).
Embora a lavagem acida utilizada na indústria alcooleira seja um fator de estresse
(WHEALS, et. al. 1990; BORSNAN, 2000), ainda não esta claro como os ácidos
inorgânicos afetam a viabilidade das células de leveduras (CHENG et. al. 1999). S.
cerevisiae é mais sensível à temperatura de 47°C quando o acido clorídrico esta
presente no meio, porém essa sensibilidade é maior na presença de acido acético.
O efeito do tratamento ácido esta relacionado com a termotolerancia e dependente
do valor de pH, do tipo de acido utilizado e da presença ou ausência de glicose no
meio. A redução do pH intracelular é maior na presença de acido acético do que na
presença do acido clorídrico (CARMELO et. al.; 1997). A utilização de linhagens de
S. cerevisiae resistente ao estresse ácido é uma característica importante para a
indústria de álcool combustível.
Na TABELA 7 esta apresentado genes da S. cerevisiae induzidos durante a
fermentação em baixo pH e a função ou atividade da proteína codificada.
98
TABELA 6 – PESO MOLECULAR DE PROTEINAS – ESTRESSE ACIDO
Tabela 6: Proteínas encontradas com o aumento de pH (2,5-3,5-4,5-5,0-6,0) com adição de acido clorídrico 6N no meio solido YEPD
Peso Molecular (kDa)
BenchMark Protein Ladder
S. cerevisiae Fermento
biológico da cachaça (ScFC)
S. cerevisiae Fermento
biológico do pão (ScFP)
S. cerevisiae Fermento biológico do Vinho variedade
bayanus (ScVB)
S. cerevisiae Fermento biológico do Vinho variedade
desconhecida (ScVY)
S. cerevisiae Fermento biológico da cerveja – Safale
(S04)
S. cerevisiae Fermento
biológico da cerveja – Safale
(S-189)
220 X
160 X
120
100 X
90 X X
80
70 X X X
60 X
50 X X X
40 X X
30 X X
25 X X X
20 X X X X X
18 X
15
10 X
99
TABELA 7. Genes de Saccharomyces cerevisiae induzidos durante a fermentação em baixo pH.
ORF GENE FUNÇÃO OU ATIVIDADE DA PROTEINA CODIFICADA PESO MOLECULAR (kDa)
YMR323W ERR3 Proteína similar a enolase 47,312 YOR393W ERR1 Proteína de função desconhecida similar a enolase 47,327 YHR139C SPS100 Proteína requerida para maturação da parede do esporo 34,226 YMR169C ALD3 Aceltadeido desidrogenase citoplasmática envolvida na síntese de beta alamina 55,385 YBR117C TKL2 Transcetolase similar a Tkl1p 75,029 YDL196W OXR1 Proteína de função desconhecida requerida para reparar danos oxidativos 30,779 YGR144W THI4 Proteína requerida para a síntese de tiamina 34,991 YLR197W SIK1 Proteína nucleolar do Box C/D snoRNP 55,864 YDR222W ORF não caracterizada 47,414 YCL030C HIS4 Polipeptídios multifuncional: fosforribosil-ATP, fosforribosil-AMP cicloidrolase e histidinol desidrogenase. 87,721 YHR094C HXT1 Transportador de glicose de baixa afinidade 63,261 YDL229W SSB1 Proteína da família da HSP70 66,601 YNL002C RPL7 Proteína nucleolar constituinte da partícula pré-ribossomal 66S 36,559 YLR175W CBF5 Proteína componente do Box H/ACA snoRNP 54,705 YDR019C GCV1 Subunidade T do complexo mitocondrial glicina descarboxilase 44,469 YPL217C BMS1 Proteína nucleolar envolvida na síntese do ribossomo 40S 135,542 YEL026W SNU13 Proteína do complexo U3 snoRNP e do complexo U4/U6-U5 tri-snoRNP 13,569 YIR035C ORF não caracterizada 27,480 YNL308C KRI1 Proteína nucleolar envolvida na síntese do ribossomo 40S 68,653 YDL141W BPL1 Biotina apoproteina ligase 76,363 YHL042W ORF não caracterizada 17,570 YER081W SER3 3-fosfoglicerato desidrogenase 51,193 YPL061W ALD6 Acetaldeido desidrogenase citoplasmática envolvida na conversão de acetaldeido a acetato 54,414 YPL266W DIM1 Dimetilase do rRNA 18S 35,951 YMR305C SCW10 Proteína da parede celular similar às glicanases 40,469 YPL278C ORF não caracterizada 11,420 YGR146C ORF não caracterizada
Proteína U3 snoRNP 23,996
101,238 YPL126W NAN YGL008C PMA1 Proteína ATPase da membrana plasmática. Maior regulador do pH citoplasmático. 99,618 YCL005W-A VMA9 Subunidade da proteína do complexo V-ATPase. É uma H+-ATPase vacuolar essencial para a
acidificação vacuolar 8,381
FONTE: FREITAS (2013)
100
4.3. PERFIS DE EXPRESSÃO PROTÉICA PARA ESTRESSE POR CALOR
As cepas de leveduras foram submetidas ao estresse em temperaturas de 30°C,
35°C e 40°C. Temperaturas acima de 45°C não foram consideradas, pois os
processos de fermentação não excedem 42°C em grandes operações de nível
industrial.
Houve crescimento de todas as cepas de leveduras para os diferentes graus de
temperatura.
Todas as cepas apresentaram poucas bandas com aumento de expressão. A cepa
S189 foi a que apresentou uma menor quantidade de aumento de expressão de
bandas (60kDa e 25kDa). Isso pode estar relacionado com as suas características: a
cepa S189 é do tipo LAGER, ou seja, fermenta em baixas temperaturas e de baixa
capacidade de fermentação.
Outra explicação pode estar relacionada ao fato das cepas terem sido submetidas
diretamente ao estresse sem que antes fosse aplicado um pré-tratamento térmico,
numa temperatura um pouco acima da ótima de crescimento, para conferir um efeito
de termotolerancia quando forem aplicadas temperaturas subletal.
De acordo com BALAKUMAR et.al. (2012) a adição para temperaturas de
crescimento aplicando um choque térmico antes da exposição às altas temperaturas
teve um efeito significante na termotolerância. Quando a cultura cultivada em 28°C
foi incubada em 36°C e foi posteriormente sujeita a temperatura de 58°C, 20% da
viabilidade foram observadas. Por outro lado, as células que foram transferidas
diretamente de 36 para 58°C mostraram 2% de viabilidade em 10h. O aumento na
termotolerância é devido à rápida mudança na temperatura de crescimento, de 28°C
para 36°C, resultando em proteção contra morte em 58°C.
Para Crowe et.al (1984), quando a temperatura de crescimento era 23, 30 e 36°C, a
fração de sobrevivência (%) da S. cerevisiae em 52°C durante 5min era 90, 10 e
2.08 respectivamente. Para BALAKUMAR et. al. (2012) as culturas crescidas em 28,
32 e 36°C mostraram 1, 12 e 28% de viabilidade em 58°C depois de 5h. A mudança
na temperatura de crescimento, de 28°C para 36°C, resultou em um aumento
significante na viabilidade (50%). A viabilidade das células em 58°C alcançou 0 em
10% e 20h com culturas crescidas em 28 e 32°C respectivamente. Mudando a
101
cultura da levedura de 23 para 36°C por um breve período, resultaria em uma
viabilidade melhor.
Parry et. al. (1976) confirmaram que as células em fase exponencial de crescimento
apresentaram uma resistência mínima ao choque térmico (52ºC, durante 30 minutos)
comparativamente com as células em fase estacionária, confirmando a maior
termossensibilidade que já havia sido descrita pelos outros autores. Além disso,
trabalhos posteriores também têm confirmado este tipo de comportamento (PIPER,
1993; WERNER-WASHBURNE et al., 1993; STEELS et al., 1994; HALLBERG e
HALLBERG, 1996). Vários autores se referem às consequências ao nível celular da
exposição de células de S. cerevisiae em fase exponencial a temperaturas
superiores à temperatura ótima de crescimento: perda rápida de viabilidade
(SCHENBERG-FASCINO e MOUSTACCHI, 1972; SANCHEZ e LINDQUIST, 1990),
indução de síntese de proteínas de choque térmico e transposição gradual de
células para a fase G1 do ciclo celular (JOHNSTON e SINGER, 1980), tornando-as
termotolerantes (LINDQUIST e CRAIG, 1988). Células termotolerantes em fase
estacionária apresentam elevados níveis de proteínas de choque térmico
(BOUCHERIE, 1985; PETKO e LINDQUIST, 1986; PIPER, 1993; WERNER-
WASHBURNE et al., 1993; STEELS et al., 1994; HALLBERG e HALLBERG, 1996).
O aumento na síntese de HSPs pode levar à aquisição de termotolerância quando
da exposição à temperatura subletal e, também, a outras condições de estresse,
como pH, metais pesados e salinidade (FEDER e HOFMANN, 1999). Embora a
síntese de HSPs, em resposta ao choque térmico, seja uma alteração bioquímica
conservada entre os organismos, diversos estudos têm demonstrado que há grande
diferença entre os organismos quanto à indução de HSPs, possibilitando a
separação inter e intra-espécies quanto à capacidade de tolerância aos estresses,
incluindo as leveduras (SANCHEZ & LINDQUIST, 1990) e os fungos filamentosos.
Para as condições de estresse descritas no trabalho, a cepa ScFP apresentou um
perfil com a síntese de varias proteínas, com peso molecular de 100kDa, 60kDa,
50kDa, 30kDa e 25kDa sendo essa síntese proporcional ao tempo nas condições de
estresse conforme mostra a FIGURA 10.
102
FIGURA 10. Cepa ScFP – Estresse Térmico
Além da cepa ScFP, as cepas S04, S189, ScVB, ScVY e ScFC fizeram a síntese de
proteínas de baixo peso molecular: 25kDa, 30kDa e 50kDa. ScVB, ScVY, S189 e
ScFC também sintetizaram proteínas de peso molecular de 60kDa. Apenas as cepas
ScFP, S04 e ScVY tiveram aumento de bandas de alto peso molecular 100kDa;
100kDa e 90kDa; 100kDa respectivamente.
O resultado do aumento da expressão de peso molecular de proteínas mediante o
estresse térmico analisadas neste trabalho esta descrito na TABELA 8.
Alguns relatos têm sugerido que a indução de HSPs é particularmente dependente
do estado fisiológico e do tipo de célula exposta à condição de estresse térmico
(NEIDHARDT et al., 1984). O acúmulo de HSPs na célula parece ser regulado de
maneira que o aumento dessas proteínas venha a proteger a célula e conferir níveis
de termotolerância mais altos.
100kDa
50kDa
60kDa
25kDa
30kDa
T.(°C) 30° 35° 40°
1 2 3
103
TABELA 8 – RESULTADO – PESO MOLECULAR DE PROTEINAS - ESTRESSES TERMICO
Peso Molecular (kDa)
BenchMark Protein Ladder
S. Cerevisiae Fermento
biológico da cachaça (ScFC)
S. cerevisiae Fermento
biológico do pão (ScFP)
S. Cerevisiae Fermento biológico do Vinho variedade
bayanus (ScVB)
S. cerevisiae Fermento biológico do Vinho variedade
desconhecida (ScVY)
S. cerevisiae Fermento biológico da cerveja – Safale
(S04)
S. cerevisiae Fermento
biológico da cerveja – Safale
(S-189)
220
160
120
100 X X X
90 X
80
70
60 X X X X X
50 X X X X X
40
30 X X X X
25 X X X X
20
15
10
Tabela 8: Proteínas encontradas com o aumento de temperatura (°C) (30°C-35°C-40°C) no meio solido YEPD
104
A indução de sHSPs proteínas de choque térmico de baixa massa molecular pode
estar relacionada com a capacidade de cada isolado em recuperar o crescimento
após a exposição ao estresse térmico (FERREIRA, 2007).
As alterações bioquímicas que ocorrem durante a exposição de células a altas
temperaturas ainda não são conhecidas por completo. No entanto, a síntese de
proteínas de estresse, especialmente as HSPs, parece ser um dos principais
mecanismos de defesa da maioria dos organismos na tolerância a estresses
transientes, que não comprometem a integridade das estruturas celulares
(NEIDHARDT et al., 1984; VIERLING, 1991; FEDER e HOFMANN, 1999; SUN et al.,
2002; SANMIYA et al., 2004; EIFERT et al., 2005; PIVOVAROVA et al., 2005).
As proteínas sintetizadas pelas cepas S04, ScVY e ScFP, com de aproximadamente
100kDa e nosso estudo, pode esta relacionada com a proteína de choque térmico
HSP104 kDa. Sob condições laboratoriais, a proteína de choque térmico HSP104
demonstrou ser responsável pela tolerância a uma série de condições de estresse
(calor, etanol, arsenito e armazenamento a baixa temperatura) (SANCHEZ et al.,
1992) e a sua expressão demonstrou ser suficiente para célula adquirir
termotolerância.
A HSP12, também já foi relacionada com o estresse por calor. Em recente estudo,
Karreman et. al., (2007) relataram que a HSP12p, uma proteína hidrofílica de
resposta ao stress, influencia na rigidez e permeabilidade, além de aumentar a
flexibilidade da parede celular de S. cerevisiae. A regulação para expressão desta
proteína é vinculada a condições de aumento da temperatura, pressão osmótica e
concentração salina ou ainda, perturbações na parede da célula. A HSP12p é uma
proteína de peso molecular de 11,692kDa localizada na membrana plasmática e
induzida por choque térmico, estresse oxidativo, osmostresse, entrada na fase
estacionaria, depleção de glicose, oleato e álcool.
Além disso, esta termotolerância pode também ser adquirida através de vários
mecanismos fisiológicos: produção de trealose (WIEMKEN, 1990), água celular não
congelável (KOMATSU et. al., 1991), retenção do ciclo celular na fase G0
(PLESSET et. al., 1987), fosforilação independente decAMP (COOTE et. al., 1992) e
atividade da H+-ATPase membranar (COOTE et. al., 1991). O choque térmico
provoca igualmente um aumento do teor de glucose intracelular, com inibição parcial
da glicólise (NEVES e FRANCOIS, 1992). Outros autores referem ainda que nestas
105
situações de estresse térmico subletal se observa igualmente o estímulo da
atividade da H+-ATPase membranar e da via RAS-adenilato ciclase (PIPER, 1993).
Na TABELA 9 tem descritos algumas proteínas de Saccharomyces que
possivelmente são induzidas por calor.
Na TABELA 10 apresenta a comparação dos pesos moleculares encontrados e as
possíveis funções bioquímicas destas proteínas.
106
TABELA 9. Relação de alguns Genes e Proteínas envolvidas no estresse por calor em Saccharomyces e fungos filamentosos.
ORF GENE FUNÇÃO OU ATIVIDADE DA PROTEINA CODIFICADA PESO MOLECULAR (kDa)
YDL100C GET3 ATPase envolvida na resistência ao estresse por calor e metais pesado 39,354 YAL005C SSA1 Proteína de choque térmico citosolica da família da HSP70 69,767 YBL075C SSA3 Proteína de choque térmico citosolica da família da HSP70 70,546 YBR072W HSP26 Proteína de Choque Térmico 23,879 YBR169C SSE2 Proteína de choque térmico da família da HSP70. Indução acima de 37°C 77,620 YCR021C HSP30 Proteína de Choque Térmico. Induzida por choque térmico, etanol, acido orgânico fraco e limitação de glicose. 37,045 YDL229W SSB1 Proteína de choque térmico da família da HSP70 66,601 YDR171W HSP42 Proteína de Choque Térmico 42,817 YDR258C HSP78 Proteína de choque térmico da família do Clpb da protease dependente de ATP, mitocondrial. Coopera com
Ssc1p na termotolerancia mitocondrial após choque térmico 91,336
YEL030W ECM10 Proteína de Choque Térmico da família da HSP70 13,906 YER103W SSA4 Proteína de choque térmico citosolica da família da HSP70. Desempenha pouco ou nenhum papel
na termotolerancia 63,261
YER057C HMF1 Heat Shock induceable Inhibitor of cell growth 13,906 YFL014W HSP12 Proteína de Choque Térmico. Induzida por choque térmico, estresse oxidativo, osmosestresse, entrada na fase
estacionaria, depleção de glicose oleato e álcool. 11,692
YFL016C MDJ1 Proteína de choque térmico – Chaperona 55,561 YGL073W HSF1 Fator de Transcrição de choque térmico ativando múltiplos genes de respostas aos estresses que incluem
hipertermia 93,282
YJR045C SSC1 Proteína de Choque Térmico 70 mitocondrial - proteína relacionada 70,628 YKL164C PIR1 Proteína requerida para tolerância do choque térmico 34,621 YLL024C SSA2 Proteína de choque térmico citosolica da família da HSP70. Pouca indução entre 27-37°C 69,470 YLL026C HSP104 Proteína de Choque Termico. Responsivo ao estresse incluindo calor, etanol e arsenito de sódio 102,035 YLR251W SYM1 Proteína necessária para o metabolismo de etanol induzida por choque térmico 22,915 YLR259C HSP60 Chaperona – Proteína de choque térmico mitocondrial. 60,751 YLR369W SSQ1 Proteína de choque térmico mitocondrial 70 72,375 YMR173 DDR48 Proteína de choque térmico. Induzida por choque térmico na ausência do elemento de estresse térmico (TSE), na
ausência de Hsf1p. 46,232
YMR186W HSC82 Proteína de Choque Térmico. Chaperona citoplasmática da família da HSP90. Expressa constitutivamente a um nível muito elevado e é moderadamente induzida pelas altas temperaturas
80,900
YNL007C SIS1 Proteína de choque térmico. 37,590
107
YNL0209W SSB2 Proteína de choque térmico citosolica da família da HSP70. Reprimida após mudança de 23-37°C 66,594 YNL281W HCH1 Reguladora de proteínas de choque térmico Z que se liga a HSP90 e pode estimular a atividade
ATPase Chaperona – Proteína de choque térmico
17,246
16,474
YNL328C
MDJ2 YOL052C-A DDR2 Proteína de Choque Térmico DDRA2 5,954 YOR232W MGE1 Chaperona – Proteína de Choque Térmico 26,066 YPL106C SSE1 Proteína de Choque Térmico da família da HSP70. Mutante nulo tem um crescimento lento em todas as
temperaturas 77,366
YPL240C HSP82 Proteína de Choque Térmico. Expressa constitutivamente em um nível muito baixo e é fortemente induzida pelo calor. Tem atividade ATPase
81,406
YJL159W HSP150 Proteína de choque térmico induzida pelo calor, estresse oxidativo e limitação de nitrogênio. 30,804 YBR067C TIP1 Esterase – Transcrição é induzida pelo choque de calor e frio 20,727 YDR059C UBC5 Ubiquitina. Expressão induzida pelo calor. Medeia a seleção de proteínas de vida curta e normal.
Componente central da resposta ao estresse 16,280
YGL181W GTS1 Proteína contendo zinc-finger regula a tolerância ao calor, ciclo celular, a esporulação, tempo de vida.
44,470
FONTE: FREITAS (2013)
108
4.4. TERMOTOLERÂNCIAS E A TOLERÂNCIAS AO ETANOL
Várias das alterações induzidas em levedura por exposição aos níveis de estresse
de etanol são idênticas aos causados por um estresse térmico.
Conforme descrito no QUADRO 1 muitas das proteínas sintetizadas (quanto ao peso
molecular encontrado) pelo estresse de etanol, podem ser também as mesmas
sintetizadas pelo estresse térmico (pesos moleculares em destaque).
Não é surpreendente, portanto, que o etanol atua de uma forma sinérgica para
aumentar os danos causados pelo calor. Tanto o calor quanto o etanol causa
desordenamento na membrana e desnaturação de proteínas (PIPER, 1993). Tanto o
choque térmico subletal (COOTE et al., 1991) como a adição de etanol
(CARTWRIGHT et al., 1987; ROSA e SÁ-CORREIA, 1991) estimula dramaticamente
a atividade de ATPase da membrana plasmática, a enzima geralmente responsável
pela manutenção do gradiente de prótons através da membrana plasmática
(SERRANO 1991).
Calor e etanol induzem também proteínas de choque térmico (HSPs) tanto em
levedura como em outros organismos. A forma da proteína HSP90, que é a mais
fortemente induzida pelo calor (HSP82), foi observada a ser induzida pelo etanol, em
menor grau do que por choque térmico. S. cerevisiae tem dois genes de Hsp90
funcionalmente equivalentes (HSC82 e HSP82);. BORKOVICH et al, (1989). HSC82
exibe uma expressão constitutiva alta que aumenta apenas ligeiramente após o
choque térmico, enquanto HSP82 que mostra muito menor expressão basal ainda é
fortemente ativada por choque térmico. HSC82, portanto, contribui mais para a
Hsp90 presente durante o crescimento vegetativo normal, enquanto que a
expressão da HSP82 é a principal responsável pelo aumento da proteína Hsp90
com choque térmico (BORKOVICH et al., 1989).
As proteínas da família Hsp70 de S. cerevisiae são codificadas por uma família de
multigenes compreendendo não menos do que 8-9 genes, três dos quais (SSAI,
SSA3 e SSA4) são induzidas por choque térmico (WERNER-WASHBURNE et.al.,
1987).
109
Estes são os três genes de S. cerevisiae Hsp7O que também são fortemente
ativadas por choque térmico, apesar de um deles (SSAI) mostra significativa
expressão em células não estressadas (WERNER-WASHBURNE et al, 1987).
A exposição das células de leveduras a temperatura acima da considerada ótima de
crescimento proporciona aumento da síntese de proteínas (ESTRUCH, 2000).
Fernandes, et. al., (1993) descreveram o aparecimento de proteínas de 37kDa da
parede celular de leveduras quando submetidas a um aumento de temperatura de
crescimento de 26°C para 40°C.
Watson e Cavicchiolo (1993), trabalhando com leveduras S. cerevisiae e S. sake a
37°C e submetidas a choque térmico de 52°C por 5 minutos ou crescidos em
temperaturas de 23°C e submetidos ao choque térmico de 37°C por 30 minutos,
notaram que as leveduras adquiriram maior tolerância ao etanol, sugerindo que
houve produção de proteínas de choque térmico pelas mesmas.
QUADRO 1. Relação Comparativa de Proteínas Sintetizadas por estresse de calor e
etanol
CEPAS ANALISADAS PESO MOLECULAR DE PROTEINAS
SINTETIZADAS POR ESTRESSE TERMICO
(kDa)
PESO MOLECULAR DE PROTEINAS
SINTETIZADAS POR ESTRESSE ETANOLICO
(kDa)
Cepa S04 100 – 90 – 50 90 – 50 – 30 – 25 – 15 – 10
Cepa S189 60 – 25 160 – 90 – 50 – 30
Cepa ScVB 60 – 50 – 30 – 25 70 – 50 – 40 – 30 – 25
Cepa ScVY 100 – 60 – 50 – 30 60 – 50 – 30 – 25 – 18 – 15
Cepa ScFC 60 – 50 – 30 – 25 100 – 80 – 50 – 30 – 20
Cepa ScFP 100 – 60 – 50 – 30 – 25 70 – 50 – 30 – 25 – 20
110
TABELA 10 – Tabela de Comparação dos Pesos Moleculares Encontrados e as Possíveis Funções Bioquímicas destas proteínas
Peso Molecular (kDa) Possíveis Proteínas Classificação Funcional Referencia Bibliográfica
220 Nenhuma referencia
encontrada ---- ----
160 Nenhuma referencia
encontrada ---- ----
100
HSP 104 (102,035kDa)
Proteína de Choque Térmico de resposta ao estresse, incluindo: o calor, o etanol, e arsenito de sódio;
Sanchez Y, et al. (1992); Glover JR e Lindquist (1998);Parsell DA et ai. (1991). Parsell DA et ai. (1994).
IST2 (105,854kDa) Proteína da Membrana Plasmática envolvida na osmotolerancia De Hertogh B, Carvajal E, Talla E, Dujon B, Baret P, Goffeau A. (2002).
90
HSP78 (91,336kDa) - Proteína de choque térmico de família clpb de proteases dependentes de ATP, mitocondrial.
Atividade Chaperona; Induzida por choque térmico e fonte de carbono; podem substituir Ssc1p para evitar a agregação de proteínas da matriz mitocondrial; reativação da síntese de proteína mitocondrial após o estresse de calor depende Hsp78p; parece agir em concertação com outras chaperonas mitocondriais; expressa em cytosol Hsp78p pode substituir Hsp104.
Germaniuk A, Liberek K, Marszalek J (2002); Leonhardt SA, Fearson K, Danese PN, Mason (1993); Moczko M, Schönfisch B, Voos W, Pfanner N, Rassow J (1995).
SCH9 (91,889kDa)
Envolvida na transativação de genes responsivos osmostress; A serina / treonina - proteína quinase envolvida na resposta ao stress.
Fabrizio P, et al. (2001); Pascual-Ahuir A and Proft M (2007) Crauwels M et.al.
(1997)
80
HSP82 (81,406kDa)
HSC82 (80899 kDa)
Expressa constitutivamente em um nível muito baixo e é fortemente induzido pelo calor; tem atividade ATPase; pertence à família da proteína de choque térmico HSP90; induzida pelo calor é uma chaperonina homóloga E.coli HTPG e HSP90 de mamífero.
Chaperona citoplasmática da família da HSP90; função redundante e
Borkovich KA, Farrelly FW, Finkelstein DB, Taulien J, Lindquist S.(1989); Duina AA, et al. (1998); Finkelstein DB and Strausberg S (1983).
Borkovich KA, Farrelly FW,
111
quase idêntica à HSP82p, e juntas elas são essenciais; expressa constitutivamente em níveis basais 10 vezes mais elevados do que HSP82 e induzida 2-3 vezes por choque térmico;
Finkelstein DB, Taulien J, Lindquist S. (1989); Byrne KP and Wolfe KH (2005) .
70
SSA1p (69,767kDa)
Proteína de Choque Térmico da família da HSP70; Transporte celular; metabolismo; proteína com função de ligação ou cofator de exigência (estrutural ou catalítico); Proteína “FATE” (dobramento, modificação, destination).
Kim S, Schilke B, Craig EA, Horwich AL. (1998); Becker J, Walter W, Yan W, Craig EA. (1996); Ziegelhoffer T, Lopez-
Buesa P, Craig EA. (1995)
SSA2p (77,620kDa)
Proteína de Choque Térmico da família da HSP70; poderá estar envolvido
na dobragem de proteínas, localizada no citoplasma.
Mukai H, Kuno T, Tanaka H, Hirata D, Miyakawa T, Tanaka C. (1993).
SSA3p (70,546kDa)
Proteína de Choque Térmico da família da HSP70; Proteína de estresse da HSP 70 que esta envolvida no enovelamento de proteínas e em respostas a estresses
Werner-Washburne M, Stone DE, Craig EA. (1987);Ghaemmaghami S et.al. (2003); Hartl FU and Hayer-Hartl M (2002)
SSA4p (69,651kDa)
Proteína de Choque Térmico da família da HSP70; expressão é limitada às
condições de stress; desempenha pouco ou nenhum papel na termotolerância.
Chughtai ZS, Rassadi R, Matusiewicz N, Stochaj U. (2001); Bukau B and Horwich AL.(1998)
EMC10 (70,084kDa)
Proteína de Choque Térmico da família da HSP70; forte semelhança com
Pmr1p, precursor mitocondrial hsp70 humano e de outros membros da família Hsp70; resultados de superexpressão de Ecm10p em extensas agregações de DNA mitocondrial.
Baumann F, Milisav I, Neupert W, Herrmann JM.(2000); Sakaseagawa Y, et.al. (2003)
112
SSC1 (70,628kDa)
Proteína mitocondrial de choque térmico, relacionada com a proteína 70; detectada também no núcleo depois do choque térmico; envolvida na translocação e dobragem de proteínas.
Morishima N, et al. (1990) Liu, Q. et.al. (2001); Craig, EA, et.al. (1987)
60
HSP60 (60,751kDa)- ATPase
Proteína de Choque Térmico; Chaperona mitocondrial; HSP60 são ATPase e tem afinidade por proteínas desdobradas; previne a agregação e medeia redobramento de proteína após o choque térmico.
Cheng MY, et.al. (1989); Sanyal, A, et.al. (1995)
ICL1 (62,408kDa) – Isocitrato
Liase
A expressão de ICL1 é induzida por crescimento em etanol e reprimida
por crescimento em glicose; catalisa a formação de succinato e glioxilato de isocitrato, uma reação de chave do ciclo do glioxilato.
Fernandez E et.al. (1992) Luttik MA, et al. (2000).
TCM62 (64,259kDa) - Chaperona necessária para a
montagem de succinato desidrogenase mitocondrial
Similaridade com a chaperonina HSP60; Resposta a estresse – resgate de células, defesa e virulência; Proteína “FATE” (dobramento, modificação, destination).
Dibrov E, Fu S, Lemire BD.
50
Nenhuma referencia encontrada
---- ----
40
HSP30 (37,045kDa) – Proteína de Choque Térmico
Induzida por durante a entrada até à fase estacionária, resultante da limitação de glucose. Induzida por choque térmico, exposição ao etanol, osmostress, fraco exposição ácido orgânico e glicose limitação; Atividade Chaperona;
Seymour IJ, Piper PW. De Hertogh B, (1999);
Carvajal E, Talla E, Dujon B, Baret P, Goffeau A (2002)
113
SLG1 (39,269kDa)
Proteína necessária para a integridade da parede celular e para a resposta ao estresse;
Pruyne D, Bretscher A. (2000); Ketela T, Green R, Bussey H (1999); Delley
Ketela PA, Hall MN.(1999); T, Green R, Bussey H (1999); Delley PA, Hall MN,
HSP42 (42,817kDa) – Proteína de Choque Térmico
Pequena proteína de choque térmico (sHSPs) com a atividade chaperone;
Envolvido em reorganização do citoesqueleto após o choque térmico; expressada tanto em condição de estresse como de não estresse.
Haslbeck M, et al. (2004); Wotton D, et al. Gu (1996); J, Emerman M, Sandmeyer S(1997); Petko L and Lindquist S (1986)
AAD4 (33,997kDa)
Aril Álcool Desidragenase envolvida na resposta ao estresse oxidativo; expressão induzida em células tratadas com a micotoxina patulina.
Dickinson JR et.al. (2003); Delneri D, et al. (1999)
30
MRH1 (36,190kDa) - Proteína de membrana relacionadas
com Hsp30p
Forte semelhança com a suposta proteína de choque térmico YRO2; Similaridade com HSP30p;
De Hertogh B, Carvajal E, Talla E, Dujon B, Baret P, Goffeau A. (2002).Wu, K. et.al. (2000)
HSP150 (30,804kDa) - Membro da família Pir1p/Hsp150p/Pir3p
Necessária para a estabilidade da parede celular; induzida por choque térmico, estresse oxidativo, e limitação de nitrogênio.
Yun DJ, et al. (1997); Toh-e A. et.al. (1993); Russo P, et al. (1993) ; Russo P, et al. (1992).
114
ASR1 (33,346kDa) - Alcohol
Sensitive Ring/PHD finger
A proteína envolvida numa via de sinalização de resposta putativa de álcool, e acumula-se no núcleo sob stress álcool.
Betz C, Schlenstedt G, Bailer SM. (2004); Kellis M, Patterson N, Endrizzi M, Birren B, Lander ES.(2003); Cliften P, Sudarsanam P, Desikan A, Fulton L, Fulton B, Majors J, Waterston R, Cohen BA, Johnston M.(2003)
25
HSP31 (25,669kDa) – Chaperona ou Cisteina
Protease.
Membro da superfamília DJ-1/ThiJ/PfpI. que inclui DJ-1 humano envolvido na doença de Parkinson, existe como um dímero e contém um suposto local de ligação a metais
Wilson MA, St Amour CV, Collins JL, Ringe D, Petsko
GA (2004);
FAP7 (22,723kDa)
A proteína envolvida na resposta ao stress oxidativo
Juhnke H, Charizanis C, Latifi F, Krems B, Entian KD (2000).
ADD6 (23,918kDa)
Suposta proteína envolvida na resposta ao stress oxidativo
Delneri D, et al. (1999); Dichinson JR et.al. (2003)
20
HSP26 (23,879kDa)
Relacionada com a superfamília de proteínas de choque térmico pequena; não tem efeito sobre termotolerancia; induzida por estresse osmótico (resistência ao etanol) e limitação de glicose.
Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR, Buchner J. EMBO J.(1999); Yoshikawa K, et al. (2009);Hong ME et.al. (2010); Lewis JÁ, et.al. (2010), Jimenez-marti, E. et.al. (2009); Yazawa H
et.al (2007)
GRE1 (19,025kDa)
Proteína induzida por estresse osmótico; estresse induzido (osmótica, iónica, oxidativo, choque térmico e de metais pesados);
Vido K, et al. (2001)Garau-Arroyo A. and Covarrubias AA (19999); Lopez-Martinez G, et al. (2012).
115
18 Nenhuma referencia
encontrada ---- ----
15 Nenhuma referencia
encontrada ---- ----
10
HSP12 (11629 kDa)
Proteína de Choque Térmico; Indução por osmostress depende de Hog1p e Pbs2p; indução em células estressadas é reduzida ou suprimida na elevada presença da proteína quinase A; induzida pelo calor, osmostress, stress oxidativo, fase estacionária e pelo AMPc; proteína da membrana plasmática envolvida na
manutenção da organização da membrana em condições de estresse.
Varela JC, Praekelt UM, Meacock PA, Planta RJ, Mager WH. (1995); Siderius M. et.al. (1997); Rep M, et al. (1999)
SIP18 (8,87kDa)
Proteína de estresse osmótico; expressão induzida por estresse osmótico; osmótica indução é dependente da via-PBS2 Hog1.
Marquez JA, et al. (1998); Miralles VJ and Serrano R (1995); Dang NX and
Hincha DK (2011)
FONTE: FREITAS (2013)
116
5. CONCLUSÕES
As estirpes de levedura Saccharomyces cerevisiae cresceram em todas as
condições de estresse testadas, caracterizando boa resistência a condições
adversa e consequentemente, boa habilidade fermentativa do ponto de vista
industrial.
As estirpes estudadas de Saccharomyces apresentaram aumento na
expressão de proteínas específicas como resposta adaptativa ao estresse.
O grupo de proteínas com aumento na expressão variou de acordo com o tipo
de estresse aplicado.
A maioria das proteínas cuja expressão foi aumentada sob estresse tem
peso molecular equivalente ao de HSPs. Porém outras, com PM diferentes
destas e que tiveram aumento de expressão, também foram discutidas neste
estudo.
Todas as leveduras tiveram aumento na expressão de proteínas de
aproximadamente 33kDa quando submetidas ao estresse etanólico. De
acordo com a literatura, esta é possivelmente uma Asr1 envolvida em via
putativa de sinalização responsiva ao álcool.
O aumento de expressão da proteína com aproximadamente 10 kDa pode
estar relacionado com as enzimas V-ATPase e H-ATPase (relacionadas ao
controle do pH celular e vacuolar), dado relevante já que a resistência ao
meio acido é de suma importância industrial, pois nestas condições se reduz
a contaminação por bactérias
A cepa S04 apresentou aumento na expressão de proteínas com
aproximadamente 160kDa e 50kDa, que podem estar relacionadas com a
kinase Bck1p e Slt2p, também essenciais em ambientes ácidos;
117
A cepa de levedura S189, sendo uma levedura LAGER (baixa capacidade
fermentativa e fermentação em baixa temperatura), foi a que teve menor
aumento de expressão proteica tanto para o estresse etanólico, quanto para o
estresse térmico;
O pouco aumento de expressão proteica das leveduras sob estresse térmico
pode estar relacionado ao fato das cepas terem sido submetidas diretamente
a temperatura subletal, sem que antes fosse aplicado um pré-tratamento
térmico;
A cepa ScFP foi a que teve um maior numero de proteínas com aumento de
expressão (com pesos moleculares 100, 60, 50, 30 e 25kDa);
Varias proteínas que aumentaram sua expressão sob estresse etanólico
também o fizeram em condições de estresse de temperatura.
As cepas testadas mostraram diferenças em seu desempenho de adaptação
as condições adversas. Apesar disto, elas apresentaram comportamento
fermentativo bastante satisfatório, demonstrando-se adequadas para uso
industrial.
118
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Este trabalho realizado no âmbito da dissertação de Mestrado permitiu constatar que
as células de S. cerevisiae exibiram um comportamento fisiológico peculiar, pois não
só foram capazes de manter a sua atividade metabólica (crescimento e reprodução),
como apresentaram igualmente capacidade de sobreviver face às condições de
estresse existentes e características dessas fases.
No entanto, certamente que muitas questões ficaram por esclarecer. Portanto é
sugestivo:
O uso de métodos que permitam isolar e identificar de forma mais eficiente
às proteínas com expressão diferenciada e purificação das mesmas;
Como alternativa, estaria o isolamento de bandas diretamente do gel e
espectrometria de massa;
Utilização da técnica de western blot é um poderoso e importante método
em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a
separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana
adsorvente. Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas
proteínas principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em
determinada amostra.
Uso de marcadores anti-HSP.
119
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGUILERA, A. & BENITEZ, T. (1985) - Role of mitochondria in ethanol tolerance
of Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol., 142: 389-392.
AGUILERA, F., PEINADO, R. A., MILLAN, C., ORTEGA, J. M. & MAURICIO, J. C.
(2006) – Relationship between ethanol tolerance, H+-ATPase activity and the
lipid composition of plasma membrane
AGUILERA, F., PEINALDO, R. A., MILLAN, C., ORTEGA, J. M. & MAURICIO, J. C.
(2006) – Relationship between ethanol tolerance, H+-ATPase activity and the
lipid composition of plasma membrane in different wine yeast strains. Int. J.
Food Microbiol., 110: 34-42.
ALEXANDRE, H.; CHARPENTIER, C. (1998) Biochemical aspects of stuck and
sluggish fermentation in grape must. J. Ind. Microbiol.Biotechnol. v.20, n. 1, p.
20-27.
ALTMANN, K., M. DURR, and B. WESTERMANN,(2007). Saccharomyces
cerevisiae as a model organism to study mitochondrial biology: general
considerations and basic procedures. Methods Mol Biol, 372: p. 81-90.
ANTONANGELO, A.T.B.F. (2012). Genotipagem de leveduras presentes no
processo industrial de produção de álcool combustível e estudo do
polimorfismo de genes envolvidos no processo fermentativo em
Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a titulo de Doutor. Universidade Estadual
Paulista. Botucatu. São Paulo.
ATTFIELD, P.V.;(1987) Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae
during exposure to agents that induce heat shock response. FEBS Letters, v
225, n 1, p259-263.
BASSI, A.P.G. (2011). Tolerância ao estresse e características fermentativas de
leveduras Dekkera bruxellensis isoladas da fermentação alcoólica. Dissertação
a titulo de Mestre. Universidade de São Paulo. Escola Superior de Agricultura “Luiz
de Queiroz”. Piracicaba. São Paulo.
BASSO, L. C, DE AMORIM, H. V., DE OLIVEIRA, A. J. and LOPES, M. L.
(2008).Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS yeast
research, v. 8, n. 7, p. 1155–1163.
120
BAUMANN F, MILISAV I, NEUPERT W, HERRMANN JM.(2000). Ecm10, a novel
hsp70 homolog in the mitochondrial matrix of the yeast Saccharomyces
cerevisiae. FEBS Lett. Dec 29; 487(2):307-12.
BERNADOUJ, N.; LEE, D.H.; GOLDBERG, A.L.;(2001) Trehalose accumation
during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by
oxygen radicals. The journal of Biological Chemistry, v. 276, n26, p 24261-24267,
BECKER J, WALTER W, YAN W, CRAIG EA.(1996) Functional interaction of
cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in
vivo. Mol Cell Biol. Aug; 16(8):4378-86.
BETZ, C.; SCHLENSTEDT, G. & BAILER, S.M. (2004) Asr1p, a novel yeast
Ring/PHD finger protein, signals alcohol stress to the nucleus. The J. Biolog.
Chem. 279 (27): 28174–28181.
BIENZ M, PELHAM HRB.(1987) Mechanism of heat-shock gene activation in
higher eukaryotes. Advances in Genetics; 24: 31-72.
BISSON, L.(1999) Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Viticult., V 50,
n.1, p. 107-119.
BIRCH, R. M. and WALKER, G. M. (2000). Influence of magnesium ions on heat
shock and ethanol stress responses of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and
Microbial Technology, v. 26, n. 9–10, p. 678–687.
BOUCHERIE, H. (1985) - Protein synthesis during transition and stationary
phases under glucose limitation in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 161:
385-392.
BORKOVICH KA, FARRELLY FW, FINKELSTEIN DB, TAULIEN J, LINDQUIST S.
(1989) hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations
for growth of cells at higher temperatures. Mol Cell Biol.Sep; 9(9):3919-30.
BROSNAN, M.P., DONNELLY, D. JAMES, T.C., BOND, U., (2000) The stress
response is repressed during fermentation in brewery strains of years. J Appl
microbial 88:746-755
BUKAU B and HORWICH AL. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone
machines. Cell 92(3):351-66
121
BYRNE KP and WOLFE KH (2005) The Yeast Gene Order Browser: combining
curated homology and syntenic context reveals gene fate in polyploid
species. Genome Res 15(10):1456-61
CÁNOVAS, M., BERNAL, V., SEVILLA, A. and IBORRA, J. L. (2007). Salt stress
effects on the central and carnitine metabolisms of Escherichia coli.
Biotechnology and bioengineering, v. 96, n. 4, p. 722–737.
CAUSTON, H., REN, B., KOH, S.S., HARBISON, CT., KANIN, E., JENNINGS, E.G.,
LEE, T.I., TRUE, H.L., LANDER, E.S., & R.A. YOUNG. (2001). Remodeling of yeast
genome expression in response to environmental changes. Mol Biol Cell.
12(2):323-37.
CARMELO, V., SANTOS, H. & SÁ-CORREIA, I. (1997) - Effect of extracellular
acidification on the activity of plasma membrane ATPase and on the cytosolic
and vacuolar pH of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta, 1325: 63-
70.
CHENG, L., MOGHRABY, J. AND PIPER, P.W. (1999). Weak organic acid
treatment causes a trehalose accumulation in low-pH cultures of
Saccharomyces cerevisiae, not displayed by the more preservative resistant.
Zygosaccharomyces bailli. FEMS microbiology Letters 170, 89-95
CHENG, m.y. ET. AL. (1989) Mitochondrial heat shock protein hsp60 is essential
for assembly of protein imported into yeast mitochondria. Nature 337 (6208):
620-5
CHI, Z. & ARNEBORG, N. (1999) - Relationship between lipid composition,
frequency of ethanol induced respiratory deficient mutants, and ethanol
tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol., 86: 1047-1052
CHI, Z. & ARNEBORG, N. (2000) - Saccharomyces cerevisiae strains with
different degrees of ethanol tolerance exhibit different adaptive responses to
produced ethanol. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 24: 75-78.
CHUGHTAI ZS, RASSADI R, MATUSIEWICZ N, STOCHAJ U.(2001) Starvation
promotes nuclear accumulation of the hsp70 Ssa4p in yeast cells. J Biol Chem.
Jun 8;276(23):20261-6. Epub 2001 Mar 7.
CLARO, F.B., RIJBRACK, K., SOARES E.V.(2007), Flocculation onset in
Saccharomyces cerevisiae: effect of ethanol, heat, osmotic stress. Journal
Applied Microbiology, Oxford, v.102, n. 3, p. 693-700, Mar.
CLIFTEN P, SUDARSANAM P, DESIKAN A, FULTON L, FULTON B, MAJORS J,
WATERSTON R, COHEN BA, JONHNSTON M (2003) Finding functional features
122
in Saccharomyces genomes by phylogenetic footprinting. Science. 2003 Jul 4;
301(5629):71-6. Epub May 29.
COSTA, V., REIS, E., QUINTANILHA, A. & MORADAS-FERREIRA, P. (1993) -
Acquisition of ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae: the key role of
the mitochondrial superoxide dismutase. Arch. Biochem. Biophys., 300: 608-614.
CONTERNO, L.; JOSEPH, L.C.M.; ARVIK, T.J.; HENICK-KLING, T.; BISSON,
L.F.(2006). Genetic and physiological characterization of Brettanomyces
bruxellensis strains isolated from wines, American Journal of Enology and
Vinicuture, Geneva, v. 57, n.2, p.139-147.
COOTE, P. J., COLE, M. B. & JONES, M. V. (1991) - Induction of increased
thermo tolerance in Saccharomyces cerevisiae may be triggered by a
mechanism involving intracellular pH. J. Gen Microb., 137: 1701-1708.
COOTE, P. J., JONES, M. V., EDGAR, K. & COLE, M. B. (1992) - TPK gene
products mediate cAMPindependent thermo tolerance in Saccharomyces
cerevisiae. J. Cell Microbiol., 138: 2551-2557
CRAIG EA. (1993) Chaperones: helpers along the pathways to protein
folding. Science; 260: 1902-1904.
CRAIG, E. A., BAXTER, B.K., BECKER, J., HALLADAY, J. & T. ZIGELHOFTER.
(1994). Is Hsp70 the cellular thermometer? Trends Biochem. Sci. 16:135-140.
CRAIG EA, GAMBILL BD, NELSON RJ. (1993). Heat shock proteins: molecular
chaperones of protein biogenesis. Microbiol. Rev. 57:402– 414.
CRAIG E.A., et.al. (1987) SSC1, a member of the 70kda heat shock protein
multigene family of Saccharomyces cerevisiae, is essential for growth. Proc
Natl Acad Sci USA 84(12): 4156-60
CROPPER, T. & RENSING, L. (1993). Inhibitors of proteases and other stressors
induce low molecular weight heat shock proteins in Saccharomyces cerevisiae.
Exp Mycoll7, 46-54.
CRAUWELS, M. et.al (1997) The Sch9 protein kinase in the yeat Saccharomyces
cerevisiae controls cAPK activity and is required for nitrogen activation of the
fermentable-growth medium induced (FGM) pathway. Microbiology 143 (Pt8): 2627-
37
CURRAN, B.P.G., KHALAWAN, S.A.(1994) Alcohols lower the threshold
temperature for the maximal activation of a heat shock expression vector in the
123
yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology, Reading, v.140, n 9, p. 2225-2228,
Sep.
DANG, N.X. and HINCHA, D.K. (2011) Identification of two hydrophilins that
contribute to the desiccation and freezing tolerance of yeast Saccharomyces
cerevisiae cells. Cryobiology 62(3): 188-93
DE HERTOGH B, CARVAJAL E, TALLA E, DUJON B, BARET P, GOFFEAU A.
(2002) Phylogenetic classification of transporters and other membrane proteins
from Saccharomyces cerevisiae. Funct Integer Genomics. 2002 Sep; 2(4-5):154-
70. Epub Jun 5. Review.
DELLEY PA, HALL MN,(1999) Cell wall stress depolarizes cell growth via
hyperactivation of RHO1. J Cell Biol. Oct 4; 147(1):163-74.
DELNERI D, et al. (1999) Disruption of seven hypothetical aryl alcohol
dehydrogenase genes from Saccharomyces cerevisiae and construction of a
multiple knock-out strain. Yeast 15(15):1681-9
DELUNA, A., AVENDAÑO, A., RIEGO, L, & A. GONZALEZ. (2001). NADP
glutamate dehydrogenase isoenzymes of Saccharomyces cerevisiae.
Purification, kinetic properties, and physiological roles. J Biol Chem. 276(47):43775-
83.
DE VIRGILIO, C., PIPER, P. W, BOLLER, T. & WIEMKEN, A. (1991). Acquisition of
thermo tolerance in Saccharomyces cerevisiae without heat shock protein
Hspl04 and in the absence of protein synthesis. FEBS Lett 288, 86-90.
DIBROV E, FU S, LEMIRE BD.(1998) The Saccharomyces cerevisiae TCM62
gene encodes a chaperone necessary for the assembly of the mitochondrial
succinate dehydrogenase (complex II). J Biol Chem. Nov 27; 273(48):32042-8.
DICKINSON, JR et. al (2003) The catabolism of amino acids to long chain and
cmplex alcohos in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem 278(10): 8028-34
DICHTL, B., STEVENS, A., & D. TOLLERVEY. (1997). Lithium toxicity in yeast is
due to the inhibition of RNA processing enzymes. EMBO J. 16(23): 7184-95.
DING, J; HUANG, X; ZHAO. N; GAO. F; LU, Q & ZHANG, K. (2010) Response of
Saccharomyces cerevisiae to ethanol stress involves actions of protein Asr1p.
J. Microbiol. Biotechnol. 20(12): 1630–1636.
124
DOMBEK K. M., INGRAM, L. O.(1986) Determination of the intracellular
concentration of ethanol in Saccharomyces cereviaiae during fermentation.
Applied and Environmental Microbiology, Baltimore, V. 51, n. 1, p. 197-200, Jan
1986a.
DUINA AA, et al. (1998) Requirement for Hsp90 and a CyP-40-type cyclophilin in
negative regulation of the heat shock response. J Biol Chem273 (30):18974-8
E-escola, (2009), Taxogenomica ambiental. E-escola Instituto Superior Técnico
Disponível em: < http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=584&ordem=2>. Acessado
em: 23 de maio de 2013.
EIFERT, C.; BURGIO, M.R.; BENNETT, P.M.; SALERNO, J.C. & KORETZ, J.F.
(2005) N-terminal control of small heat shock protein oligomerization: Changes
in aggregate size and chaperone-like function. Biochim. Biophys. Acta, 1748:146-
156.
ELBEIN, A.D. (1974), The metabolism of α, α Trehalose. Advances in
Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, v.30, p.227, 256.
ELLIS RJ, VAN DER VIES SM. (1991) Molecular chaperones. Annuals Reviews of
Biochemistry 1991; 60: 321-347.
ERASO, P. & GANCEDO, C. (1987) - Activation of yeast plasma membrane
ATPase by acid pH during growth. FEBS Lett., 224: 187-192.
ERASO, P. & PORTILLO, F. (1994) - Molecular mechanism of regulation of yeast
plasma membrane H (+)-ATPase by glucose. Interaction between domains and
identification of new regulatory sites. J. Biol. Chem., 269: 10393-10399
ESTRUCH, F. (2000) Stress-controlled transcription factors, stress-induced
genes, and stress tolerance in budding yeast. FEMS Microbiol. Rev. 24:469–486.
FABRIZIO P, et al. (2001) Regulation of longevity and stress resistance by Sch9
in yeast. Science 292(5515):288-90.
FEDER, M.E. & HOFMANN, G.E. (1999) Heat-shock proteins, molecular
chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology.
Ann. Rev. Physiol., 61:243-282.
FERNANDEZ, E. et. al. (1992) The ICL1 gene from Saccharomyces cerevisiae.
Eur J Biochem 204(3): 983-90
125
FERNANDES, P.A.; MORADAS-FERREIRA, P.; SOUZA, M. (1993) Flocculation of
Kluyveromyces marxianus is induced by a temperature upshift. Yeast, Chichester,
v.9, n.8, p. 859-866, Aug.
FERREIRA, A.S., TÓTOLA, M.R.; PARREIRA, A.G., BORGES, A.C.(2007)
Crescimento micelial e síntese de proteínas de choque térmico em três
isolados de fungos ectomicorrízicos sob condições de temperaturas supra-
ótimas. Rev. Bras. Ciênc. Solo vol.31 no. 1 Viçosa Jan./Feb.
FERREIRA, L.V. (2002) Estudo da fermentação alcoólica em frascos agitados.
266p. Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos) - Universidade Estadual de
Campinas, Campinas, 2002.
FINKELSTEIN DB and STRAUSBERG S (1983) Identification and expression of a
cloned yeast heat shock gene. J Biol Chem 258(3):1908-13
FLAHERTY KM, DELUCA-FLAHERTY C, MCKAY DB. (1990) Three-dimensional
structure of the ATPase fragment of a 70Kda heat-shock cognate
protein. Nature; 346: 623-628.
FRANÇA, M.B.M; PANEK, A.D.; ELEUTHERIO, E.C.A. (2007) Oxidative stress and
its effects during dehydration. Comparative Biochemistry and Physiology,
v.146, p.621-631.
FREEMAN, B. C. & YAMAMOTO, K. R. (2002) Disassembly of transcriptional
regulatory complexes by molecular chaperones, Science. 296, 2232-5.
FREITAS, E.S.JR (2013) PERFIL DE EXPRESSÃO PROTÉICA DE LEVEDURAS COMERCIAIS DO GENERO SACCHAROMYCES E O PAPEL DAS PROTEINASNA SELEÇÃO DE ESPÉCIES COM POTENCIAL BIOTECNOLOGICO. Dissertação a Titulo de Mestre. Universidade Federal da Bahia, Salvador Bahia.
FREITAS, W.E.S.; FERNANDES, P.L.O.; LEITE, G.A.; DANTAS, J.I.A.; PONTES,
C.A.C. (2012) Ação das Proteínas de Choque Térmico em frutos.
AGROPECUÁRIA CIENTÍFICA NO SEMIÁRIDO – ISSN 1808-6845. UFCG -
Universidade Federal de Campina Grande. Centro de Saúde e Tecnologia Rural –
CSTR. Campus de Patos – PB. V. 8, n. 2, p. 24-31. Disponível em:
www.cstr.ufcg.edu.br. Acessado em: 30 de Jun. de 2013.
GASH, A. P. (2003). The environmental stress response: a common yeast
response to diverse environmental stresses. Yeast Stress Responses: Topic in
Current Genetics. Germany: v. 1, p. 11–57.
126
GASH, A.P. and M. WERNER-WASHBURNE,(2002) The genomics of yeast
responses to environmental stress and starvation. Funct Integer Genomics,. 2(4-
5): p. 181-92.
GARAY-ARROYO, A. and COVARRUBIAS, A.A. (1999) Three genes whose
expression is induced by stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15(10A):
879-92.
GERMANIUK A, LIBEREK K, MARSZALEK J. (2002) A bichaperone (Hsp70-
Hsp78) system restores mitochondrial DNA synthesis following thermal
inactivation of Mip1p polymerase. J Biol Chem. Aug 2; 277(31):27801-8. Epub
2002 May 21.
GETHING MJ, SAMBROOK J. (1992) Protein folding in the cell. Nature; 355: 33-
45.
GLOVER JR and LINDQUIST S (1998) Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel
chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell 94(1):73-
82
GOFFEAU, A. & SLAYMAN, C. W. (1981) - The proton-translocating ATPase of
the fungal plasma membrane. Biochim. Biophys. Acta, 639: 197-223.
GU J, EMERMAN M, SANDMEYER S. (1997) Small heat shock protein
suppression of Vpr-induced cytoskeletal defects in budding yeast. Mol Cell Biol.
1997 Jul; 17(7):4033-42.
HAHN, J. S. & THIELE, D. J. (2004) Activation of the Saccharomyces cerevisiae
heat shock transcription factor under glucose starvation conditions by Snf1
protein kinase, J Biol Chem. 279, 5169-76.
HAHN, J. S., HU, Z., THIELE, D. J. & IYER, V. R. (2004) Genome-wide analysis of
the biology of stress responses through heat shock transcription factor, Mol
Cell Biol. 24, 5249-56
HALBERG, E. M. & HALBERG, R. L. (1996) - Translational thermo tolerance in
Saccharomyces cerevisiae. Cell Stress Chaperones, 1: 70-77.
HALL TJ. Role of hsp70 in cytokine production. (1994) Experimentia 1994; 50:
1048-1053
HASLBECK M, WALKER S, STROMER T, EHRNSPERGER M, WHITE HE, CHEN
S, SAIBIL HR, BUCHNER J. EMBO J (1999) Hsp26: a temperature-regulated
chaperone. Dec 1; 18(23):6744-51.
127
HASLBECK M, et al. (2004) Hsp42 is the general small heat shock protein in the
cytosol of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J 23(3):638-49
HENDRICK JP, HARTL FU.(1993) Molecular chaperone functions of heat-shock
proteins. Annuals Reviews of Biochemistry; 62: 349-384.
HIGHTOWER, L. E. (1991) Heat shock, stress proteins, chaperones, and
proteotoxicity, Cell. 66, 191-7.
HOHMANN, S. and MAGER, W. H. (1997). Shaping up: the responses of yeast to
osmotic stress. Yeast Stress Responses. Georgetown: R G Landes. p. 101–146.
HOHMANN, S. (2002) Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:300–372.
HONG, M.E. et. al.(2010) Identification of gene targets eliciting improved alcohol
tolerance in Saccharomyces cerevisiae through inverse metabolic engineering.
J. Biotechnol 149(1-2): 52-59
HORVÁTH, I.; MULTHOFF, G.; SONNLEITNER, A.; VÍGH, L. (2008) Membrane-
associated stress proteins: More than simply chaperones. Biochimica et
Biophysica Acta. v.1778, p.1653-1664.
HOUNSA, C.G.; BRANDT, E.V.; THEVELEIN, J.; HOHMANN, S.; PRIOR, B.A.
(1993) Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under
osmotic stress. Microbiology p 281-289, 1993.
IBEAS, J. L. & JIMENEZ, J. (1997) - Mitochondrial DNA loss caused by ethanol in
Saccharomyces flor yeasts. Appl. Environ. Microbiol., 63: 7-12.
IBGE-INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA: Relatório de
estação Geodésica. Brasil. p.1, 2006.
IBGE-INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA: Relatório de
estação Geodésica. Basil. 1p, 2011.
JAMEISON, D.J. (1998). Oxidative stress responses of the yeast
Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14, 1511-1527.
JIMENEZ, J. & BENITEZ, T. (1987) - Adaptation of yeast cell membranes to
ethanol. Appl. Environ. Microbiol., 53: 1196-1198.
128
JIMENIS-MARTI, E. et. al. (2009). Genetic manipulation of HSP26 and YHR087W
stress genes may improve fermentative behavior in wine yeats unde
vinification conditions. Int. J. Fod Microbiol. 130(2): 122-30
JOHNSTON, G. C. & SINGER, R. A. (1980) - Ribosomal precursor RNA
metabolism and cell division in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen.
Genet., 178: 357-360.
JUHNKE H, CHARIZANIS C, LATIFI F, KREMS B, ENTAIN KD (2000) The essential
protein fap7 is involved in the oxidative stress response of Saccharomyces
cerevisiae. Mol Microbiol. Feb;35(4):936-48.
KELLIS M, PATTERSON N, ENDRIZZI M, BIRREN B, LANDER ES.(2003)
Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory
elements. Nature. May 15; 423(6937):241-54.
KETELA T, GREEN R, BUSSEY (1999) SaccharomycesJ Bacteriol. Jun;
181(11):3330-40.
KIM S, SCHILKE B, CRAIG EA, HORWICH AL. (1998) Folding in vivo of a newly
translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic
yeast Hsp70 proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. Oct 27; 95(22):12860-5.
KOMATSU, Y., OBUCHI, K., IWAHASHI, H., KAUL, S., ISHIMURA, M., FAHY, G. M.
& RALL, W. F. (1991) - Deuterium oxide, dimethylsulfoxide and heat shock
confer protection against hydrostatic pressure damage in yeast. Biochem.
Biophys. Res. Commun., 174: 1141-1147.
KOTYK, A. (1994) - Dependence of the kinetics of secondary active transports
in yeast on H+-ATPase acidification. J. Membr. Biol., 138: 29-35.
KUCHARCZYK, R. and J. RYTKA, (2001) Saccharomyces cerevisiae--a model
organism for the studies on vacuolar transport. Acta Biochim Pol. 48(4): p. 1025-
42.
LEI, J., ZHAO, X., GE, X. & BAI., F. (2007) - Ethanol tolerance and the variation of
plasma membrane composition of yeast floc populations with different size
distribution. J. Biotechnol., 131: 270-275.
LEONHARDT SA, FEARSON K, DANESE PN, MASON TL.(1993) HSP78 encodes
a yeast mitochondrial heat shock protein in the Clp family of ATP-dependent
proteases. Mol Cell Biol. Oct; 13(10):6304-13.
129
LEWIS JA, et al. (2010) Exploiting Natural Variation in Saccharomyces
cerevisiae to Identify Genes for Increased Ethanol Resistance. Genetics 186(4):
1197-205
LIMA, U. A.; BASSO, L. C.; AMORIM, H. V. Produção de etanol. In: SCHMIDELL,
W.; LIMA, U.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (2001 ) (Coord.). Biotecnologia
industrial: Processos fermentativos e enzimáticos. São Paulo: Edgard Blücher, v.
3, cap. 1, p. 1-46.
LINDQUIST, S. & CRAIG, E. A. (1988) The heat-shock proteins, Annu Rev Genet.
22, 631-77.
LINDQUIST, S. & CRAIG, E. A. (1988) - The heat-shock proteins. Annu. Rev.
Genet., 22: 631-677.
LIU, Q.et. al. (2001). Mitochondrial Hsp70 Ssc1: role inprotein folding. J. Biol.
Chem. 276(9): 6112-8.
LUCERO, P., PEÑALVER, E., MORENO, E. & LAGUNAS, R. (2000) - Internal
trehalose protects endocytosis from inhibition by ethanol in Saccharomyces
cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 66: 4456-4461.
LUTTIK MA, et al. (2000) The Saccharomyces cerevisiae ICL2 gene encodes a
mitochondrial 2-methylisocitrate lyase involved in propionyl-coenzyme A
metabolism. J Bacteriol 182(24):7007-13
LIU, JIANGHAI; ZHANG, YINGMEI; HUANG, DEJUN; SONG GANG.(2005)
Cadmium induced MTs synthesis via oxidative stress in yeast Saccharomyces
cerevisiae. Molecular and Cellular Biochemistry, v.280, p.139-145,
LLOYD, D., MORREL, S. CARLSEN, H. N., DEGN, H., JAMES, P. E. &
ROWLANDS, C. C. (1993) – Effects of growth with ethanol on fermentation and
membrane fluidity of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 9: 825-833.
LOCKE M, NOBLE EG, ATKINSON BG. (1990) Exercising mammals synthesize
stress proteins. American Journal of Physiology; 258: C723-C729.
LOPEZ-MARTINEZ G, et al. (2012) The STF2p Hydrophilin from Saccharomyces
cerevisiae is required for Dehydration Stress Tolerance. PLoS One7 (3):e33324
MAGER, W. H. & MORADAS-FERREIRA, P. (1993). Stress response of yeast.
Biocbem J 290, 1-13.
130
MALPARTIDA, F. & SERRANO, R. (1981) - Proton translocation catalyzed by the
purified yeast plasma membrane ATPase reconstituted in liposomes. FEBS
Lett., 131: 351-354
MALAKAR, D., DEY, A. and GHOSH, A. K. (2006). Protective role of S-adenosyl
Lmethionine against hydrochloric acid stress in Saccharomyces cerevisiae.
Biochimica et biophysica acta, v. 1760, n. 9, p. 1298–1303.
MARTINS, R.L., (2013) Importância das reservas energéticas para a resposta ao
estresse ácido em Saccharomyces. Dissertação a titulo de Mestre. Universidade
Federal de Ouro Preto. Ouro Preto.Minas Gerais. In: SERRANO, R, Kielland-Brandt,
M. C. and FINK, G. R. (1986). Yeast plasma membrane ATPase is essential for
growth and has homology with (Na + K+), K+- and Ca2+- ATPases. Nature, v.
319, n. 6055, p. 689–693. RAO, R., NAKAMOYO, R. ., Verjovski Almeida, S. and
Slayman, C. W. (1992). Structure and function of the yeast plasma-membrane
H+-ATPase. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 671, p. 195–203.
MANSURE, J. J. C., PANEK, A. D., CROWE M. & CROWE, J. H. (1994) - Trehalose
inhibits ethanol effects on intact yeast-cells and liposomes. Biochim. Biophys.
Acta, 191: 309-316.
MARTÍNEZ de MARÃNÓN, I. TOURDOT-MARECHAL, R. & GERVAIS, P. (2001) -
Involvement of osmotic cell shrinkage on the proton extrusion rate in
Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Food Microbiol., 67: 241-246.
MARQUEZ JA, et al. (1998) The Ssn6-Tup1 repressor complex of
Saccharomyces cerevisiae is involved in the osmotic induction of HOG-
dependent and -independent genes. EMBO J 17(9):2543-53
MATTICK, J.S. (2003) Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-
coding RNAs in complex organisms. BioEssays, v.25, p.930-939, 2003.
MELO, F. H., (2006). Resposta ao estresse acido em leveduras da fermentação
alcoólica industrial. Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia
de Fungos do Departamento de Miologia da Universidade Federal de Pernambuco
como parte dos requisitos para a obtenção de titulo de doutor. Recife-PE
MIRALLES, V.J. and SERRANO, R. (1995) A genomic locus in Saccharomyces
cerevisiae with four genes up-regulated by osmotic stress. Mol. Microbiol 17(4):
653-62
MOCZKO M, SCHÖNFISCH B, VOOS W, PFANNER N, RASSOW J. (1995) The
mitochondrial ClpB homolog Hsp78 cooperates with matrix Hsp70 in
maintenance of mitochondrial function. J Mol Biol.Dec 8; 254(4):538-43.
131
MONACO, M.A.L.S., (2007) Efeito protetor do magnésio no choque térmico e
estresse pelo etanol em leveduras Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a
titulo de Mestre. Universidade de São Paulo. Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”. Piracicaba. São Paulo. In: PRETOV, V.V.; OKOROKOV, L.A.; Increase of
the anion and proton permeability of Saccharomyces carlsbergensis
plasmalemma by n-alcohols as a possible cause of its de-energization. Yeast,
Chichester, v.6, n. 4, p. 311-318, July/Aug. (1990); INGRAN, L.O.; BUTTKE, T.M.,
Effects of alcohols. Journal of Bacteriology, Baltimore, v.125, n. 2, p. 670-678, Feb.
1976.
MONACO, M.A.L.S., (2007) Efeito protetor do magnésio no choque térmico e
estresse pelo etanol em leveduras Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a
titulo de Mestre. Universidade de São Paulo. Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”. Piracicaba. São Paulo. In: FERNANDES, P.A.; MORADAS-FERREIRA, P.;
SOUZA, M.(1993) Flocculation of Kluyveromyces marxianus is induced by a
temperature upshift. Yeast., Chichester, v.9, n.8, p. 859-866, Aug.
MONTEIRO, G., SUPPLY, P., GOFFEAU, A. & SÁ-CORREIA, I. (1994) - The in vivo
activation of Saccharomyces cerevisiae plasma membrane H+-ATPase by
ethanol depends on the expression of the PMA1 gene, but not of the PMA2
gene. Yeast, 10: 1439-1446.
MOREIRA, L.M.C. (2007). Papel da trealose na proteção durante o estresse
oxidativo causado por cadmio e a resposta adaptativa a este estresse em
Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a titulo de Mestre. Comissão Nacional de
Energia Nuclear. Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear. Belo
Horizonte. Minas Gerais. In: PANEK, A.D. (1995) Trehalose metablism – new is in
technological applications. Brazilian Journal of Medical and Biological Research,
v.28, p. 169-181.
MORISHIMA N, et al. (1990) A subunit of yeast site-specific endonuclease SceI
is a mitochondrial version of the 70-kDa heat shock protein. J Biol Chem265(25):
15189-97
MORIMOTO RI. (1993) Cells in stress: transcriptional activation of heat shock
genes. Science ; 259: 1409-1410
MUKAI H, KUNO T, TANAKA H, HIRATA D, MIYAKAWA T, TANAKA C.(1993)
Isolation and characterization of SSE1 and SSE2, new members of the yeast
HSP70 multigene family. Gene. Sep 30; 132(1):57-66
132
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G.; GUIMARÃES, P. M. R. et al. (2010).
Technological trends, global market, and challenges of bio-ethanol production.
Biotechnol Advan. 28:817–830.
NASCIMENTO, N.C. (2007). O alcaloide braquicerina e estresse oxidativo em
Psychotria bracyceras e Saccharomyces cerevisiae. Dissertação a titulo de
Mestre. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre. Rio Grande do
Sul. In: MARIS, A.F.; ASSUMPÇÃO, A.L.K., BONATTO, D.; BRENDEL, M. and
HENRIQUES, J.A.P. 2001. Diauxi shift-induced stress resistance against
hydroperoxides in Saccharomyces cerevisiae is not an adaptative stress
response and does not depend on functional mitochondria. Currents Genetics,
39: 137-149
NEIDHARDT, F.C.; VANBOGELEN, R.A. & VAUGHN, V.(1984) The genetic and
regulation of heat-shock proteins. Ann. Rev. Genet., 18:295-329.
NETO, J.M.F.A. (2012) Proteínas de estresse HSP’s como complemento do
sistema de defesa antioxidante. EFdesportes.com, Revista Digital. Buenos Aires,
Año 17, n°167, Abril de 2012. Disponivel em:
http://www.efdeportes.com/efd167/proteinas-de-estresse-hsps.htm. Acessado em
Maio de 2013. In: ELLIS RJ, VAN DER VIES SM. Molecular chaperones. Annuals
Reviews of Biochemistry 1991; 60: 321-347.
NETO, J.M.F.A. (2012) Proteínas de estresse HSP’s como complemento do
sistema de defesa antioxidante. EFdesportes.com, Revista Digital. Buenos Aires,
Año 17, n°167, Abril de 2012. Disponível em:
http://www.efdeportes.com/efd167/proteinas-de-estresse-hsps.htm. Acessado em
Maio de 2013. In: FLAHERTY KM, DELUCA-FLAHERTY C, MCKAY DB. Three-
dimensional structure of the ATPase fragment of a 70Kda heat-shock cognate
protein. Nature 1990; 346: 623-628; HENDRICK JP, HARTL FU. Molecular
chaperone functions of heat-shock proteins. Annuals Reviews of
Biochemistry 1993; 62: 349-384; HALL TJ. Role of hsp70 in cytokine
production. Experimental 1994; 50: 1048-1053.
NEUPERT W, HARTL FU, CRAIG EA.(1990) How do polypeptides cross the
mitochondrial membranes? Cell; 63: 447-450
NEVES, M.-J. & FRANCOIS, J. (1992) - On the mechanism by which a heat shock
induces trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J., 288:
559-864.
NORTON, S., WATSON, K. & D’AMORE, T. (1995) - Ethanol tolerance of
immobilized brewer’s yeast cells. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43: 18-24.
133
PARRY, J. M., DAVIES, P. J. & EVANS, W. E. (1976) - The effects of cell age upon
the lethal effects of physical and chemical mutagens in the yeast,
Saccharomyces cervisiae. Mol. Gen.Genet., 146: 27-35.
PARSELL DA, et al. (1991) Hsp104 is a highly conserved protein with two
essential nucleotide-binding sites. Nature 353(6341):270-3
PARSELL DA, et al. (1994) Protein disaggregation mediated by heat shock
protein Hsp104. Nature 372(6505): 475-8
PARSELL, D. A., SANCHEZ, Y., STITZEL, J. D. & LINDQUIST, S. (1991). Hspl04 is
a highly conserved protein with two essential nucleotide binding sites. Nature
353, 270-273.
PASCUAL-AHUIR A and PROFT M (2007) The Sch9 kinase is a chromatin-
associated transcriptional activator of osmostress-responsive genes. EMBO
J26 (13):3098-108
PATNAIK, R., LOUIE, S., GAVRILOVIC, V., et al. (2002). Genome shuffling of
Lactobacillus for improved acid tolerance. Nature biotechnology, v. 20, n. 7, p.
707–712.
PEREZ-ORTIN, J. E., GARCIA-MARTINEZ, J. & ALBEROLA, T. M. (2002) - DNA
chips for yeast biotechnology. The case of wine yeasts. J. Biotechnol., 98: 227-
241.
PETKO, L. & LINDQUIST, S. (1986) - Hsp26 is not required for growth at high
temperatures, nor for thermo tolerance, spore development, or germination.
Cell, 45: 885-894.
PIPER, P. (1995) - The heat-shock and ethanol stress responses of yeast
exhibit extensive similarity and functional overlap. FEMS Microbiol. Lett., 134:
121-127.
PIPER, P. W.; TALREJA, K.; PONARETOU, B.; MORADAS-FERREIRA, P.; BYRNE,
K. PRAEKELT U.M.; MEACOCK, P.; RECNACQ and BOUCHERIE H. (1994)
Induction of major heat-shock proteins of Saccharomyces cerevisiae, inlcudin
plasma membrane Hsp30, by ethanol level above a critical threshold,
Microbiology, 140, 3031-3038
134
PIPER, P. (1993) - Molecular events associated with acquisition of heat
tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., 11:
339-355.
PIVOVAROVA, A.V.; MIKHAILOVA, V.V.; IVAN S. CHERNIK, I.S.; CHEBOTAREVA,
N.A.; LEVITSKY, D.I. & GUSEV, N.B.(2005) Effects of small heat shock proteins
on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res.
Comm., 331:1548–1553.
PENNINGTON, S.R.; DUNN. M.J. (2001) Proteomics: from protein sequence to
function. New York: Springer-Verlag e BIOS scientific Publishers, 1v
PORTILLO, F. (2000). Regulation of plasma membrane H+-ATPase in fungi and
plants. Biochimica et biophysica acta, v. 1469, n. 1, p. 31–42.
PORTILLO, F. & SERRANO, R. (1989) - Growth control strength and active site
of yeast plasma membrane ATPase studied by site-directed mutagenesis. Eur.
J. Biochem., 186: 501-507.
RAO, R., NAKAMOTO, R., VERJOVSKI, ALMEIDA, S. and SLAYMAN, C. W. (1992).
Structure and function of the yeast plasma-membrane H+-ATPase. Annals of the
New York Academy of Sciences, v. 671, p. 195–203.
REP M, et al. (1999) Osmotic stress-induced gene expression in
Saccharomyces cerevisiae requires Msn1p and the novel nuclear factor
Hot1p. Mol Cell Biol 19(8):5474-85
RIEGER KJ, KANIAK A, COPPÉE JY, ALJINOVIC G, BAUDIN-BAILLIEU A,
ORLOWSKA G, GROMADKA R, GROUDINSKY O, DI RAGO JP, SLONIMSKI PP.
(1997) Large-scale phenotypic analysis--the pilot project on yeast chromosome
III. Yeast. 1997 Dec; 13(16):1547-62.
RODRIGUES-POUSADA, C. A., NEVITT, T., MENEZES, R., AZEVEDO, D.,
PEREIRA, J. & AMARAL, C. (2004) Yeast activator proteins and stress response:
an overview, FEBS Lett. 567, 80-5.
ROPIO, J. A., (2010). O complexo mediador e a atividade transcricional do Yap1
e Yap8 na levedura sob estresse de arsênio. Dissertação a titulo de Mestre da
Faculdade de Ciências de Universidade de Lisboa. Portugal, Lisboa. In: GASH, A.P.
and M. WERNER-WASHBURNE, The genomics of yeast responses to
environmental stress and starvation. Funct Integer Genomics, 2002. 2(4-5): p.
181-92.
135
ROSA, M. F. & SÁ-CORREIA, I (1992) - Ethanol tolerance and activity of plasma
membrane ATPase in Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces
cerevisiae. Enzyme Microb. Technol., 14: 23-27.
ROSA, M. F. & SÁ-CORREIA, I. (1991) - In vivo activation by ethanol of plasma
membrane ATPase of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 57:
830-835.
RUSSO P, et al. (1992) A heat shock gene from Saccharomyces cerevisiae
encoding a secretory glycoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A 89(9):3671-5
RUSSO P, et al. (1993) Dual regulation by heat and nutrient stress of the yeast
HSP150 gene encoding a secretory glycoprotein. Mol Gen Genet 239(1-2):273-80
SAKASEGAWA, Y. et.al. (2003) Ecm10p localizes in yeast mitochondrial
nucleoids and its overexpression induces extensive mitochondrial DNA
aggregations. Biochem Biophys Res Commun 309(1): 217-21
SAJBIDOR, J. (1997) - Effect of some environmental factors on the content and
composition of microbial membrane lipids. Crit. Rev. Biotechnol., 17: 87-103.
SANCHEZ, Y. & LINDQUIST, S. L. (1990) - HSP104 required for induced thermo
tolerance. Science, 248: 1112-1115
SANCHEZ, Y., TAULEIN, J., BORKOVICH, K. A. & LINDQUIST, S. (1992). Hspl04
is required for tolerance to many forms of stress. EMBO J 11, 2357-2364.
SANCHEZ Y, et al. (1992) Hsp104 is required for tolerance to many forms of
stress. EMBO J 11(6):2357-64
SANMIYA, K.; SUZUKI, K.; EGAWA, Y. & SHONO, M.(2004) Mitochondrial small
heat-shock protein enhances thermo tolerance in tobacco plants. FEBS Letters,
557:265- 268.
SANYAL, A. et. al. (1995) Heat shock protein HSP60 cam alleviate the phenotype
f mitochondrial RNA-deficient temperature-sensitive mna2 pet mutants.Mol.
Gen Genet 246(1): 56-64
SCHLESINGER MJ.(1986) Heat shock proteins: the search for functions. Journal
Cell Biology; 103: 321-325.
SCHENBERG,-FASCINO, A. & MOUSTACCHI, E. (1972) - Lethal and mutagenic
effects of elevated temperature on haploid yeast. Mol. Gen. Genet., 115: 243-287
136
SHARMA, S. C. (1997) - A possible role of trehalose in osmotolerance and
ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Lett., 152: 11
15.
SERRANO, R. (1991). Transport across yeast vacuolar and plasma membranes.
In The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Genome 4namics,
protein synthesis, and Energetics, pp. 523-585. Edited by J. N. Strathern, E. W.
Jones & J. R. Broach. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory
Press
SEYMOUR IJ, PIPER PW.(1999) Stress induction of HSP30, the plasma
membrane heat shock protein gene of Saccharomyces cerevisiae, appears not
to use known stress-regulated transcription factors. Microbiology. Jan; 145 (Pt
1):231-9
SIDERIUS,M. et.al. (1997) High-osmolarity signaling in Saccharomyces
cerevisiae is modulated in a carbon-dependent fashion. Microbiology 143 (Pt.
10): 3241-50
SUN, W.; MONTAGU, M.V. & VERBRUGGEN, N. (2002) Small heat shock
proteins and stress tolerance in plants. Biochim. Biophys. Acta, 1577:1-9.
SUPPLY, P., DEXAERDE, A. D., ROGANTI, T., GOFFEAU, A. & FOURY, F. (1995) -
In-frame recombination between the yeast H+-ATPase isogenes Pma1 and
Pma2: insights into the mechanism of recombination initiated by a double-
stand break. Mol. Cell. Biol., 15: 5389-5395.
STEELS, E. L., LEARMONTH, R. P. & WATSON, P. (1994) - Stress tolerance and
membrane lipid unsaturation on Saccharomyces cerevisiae grown aerobically
and anaerobically. Microbiology, 140: 569-576.
STUART RA, CYR DM, and NEUPERT W.(1994) Hsp70 in mitochondrial
biogenesis: from chaperoning nascent polypeptide chains to facilitation of
protein degradation. Experimental; 50: 1002-1011
SUSEK, R. E. & LINDQUIST, S. L. (1989). Hsp26 of Saccharomyces cerevisiae is
related to the superfamily of small heat shock proteins, but is without a
demonstrable function. Mol Cell Biol9, 5265-5271.
TAKAGI, H., TAKAOKA, M., KAWAGUSHI, A. & KUBO, Y. (2005) - Effect of L-
proline on sake brewing and ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. Appl.
Environ. Microbiol., 71: 8656-8662
137
TERLECKY SR.(1994) Hsp70s and lysosomal proteolysis. Experimentia; 50:
1021-1025
TOH-E, et.al. (1993) Three yeast genes, PIR1, PIR2 and PIR3, containing internal
tandem repeats, are related to each other, and PIR1 and PIR2 are required to
tolerance to heat shock. Yeast 9(5): 481-94
VARELA JC, PRAEKELT UM, MEACOCK PA, PLANTA RJ, MAGER WH.(1995) The
Saccharomyces cerevisiae HSP12 gene is activated by the high-osmolarity
glycerol pathway and negatively regulated by protein kinase A. Mol Cell Biol.
1995 Nov;15(11):6232-45.
VIANA, T.M.L. (2009) Caracterização Bioenergética de Sacaromyces cerevisiae
em fermentação vinária Dissertação a titulo de Mestre. Universidade técnica de
Lisboa. Lisboa, Portugal. In: NORTON, S., WATSON, K. & D’AMORE, T. (1995) -
Ethanol tolerance of immobilized brewer’s yeast cells. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 43: 18-24; IBEAS, J. L. & JIMENEZ, J. (1997) - Mitochondrial DNA
loss caused by ethanol in Saccharomyces flor yeasts. Appl. Environ. Microbiol.,
63: 7-12
VIDO K, et al. (2001) A proteome analysis of the cadmium response in
Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 276(11):8469-74
VIERLING, E. (1991) Roles of heat shock proteins in plants. Ann. Rev. Plant
Physiol. Plant Molec. Biol., 42:579-620, 1991.
WATSON, K.; CAVICCHIOLO, R. (1983) Acquisition of ethanol tolerance in yeast
cell by heat shock. Biotechnology Letters, Kew, v.5, n. 10, p. 683-688, Oct.
WANG, M., ZHAO, J., YANG, Z., DU, Z. & YANG, Z. (2007) - Electrochemical
insights into the ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae.
Bioelectrochemistry, 71: 107-112
WEI, P., LI, Z., HE, P., LIN, Y. and JIANG, N. (2008). Genome shuffling in the
ethanologenic yeast Candida krusei to improve acetic acid tolerance.
Biotechnology and applied biochemistry, v. 49, n. 2, p. 113–120.
WERNER-WASHBURNE, M., BRAUN, E., JONHNSTON, G. C. & SINGER, R. A.
(1993) - Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.
Rev., 57: 383-401.
138
WERNER-WASHBURNE M, STONE DE, CRAIG EA (1987) Complex interactions
among members of an essential subfamily of hsp70 genes in Saccharomyces
cerevisiae.Mol Cell Biol. 1987 Jul; 7(7):2568-77
WELCH WJ.(1993) How cells respond to stress. Scientific American; 268: 34-41.
WELCH WJ.(1992) Mammalian stress response: cell physiology,
structure/function of stress proteins, and implications for medicine and
disease. Physiological Reviews; 72: 1063-1081.
WHEALS, E.A., BASSOL.C. ALVES, D.M.G., AMORIM, H.V. (1990). Fuel ethanol
25 years. TrendsBiotechnol 17: 482-487.
WHEALS, A. E., BASSO, L. C., ALVES, D. M. and AMORIM, H. V. (1999). Fuel
ethanol after 25 years. Trends in biotechnology, v. 17, n. 12, p. 482–487.
WILKINS, M.R. et al.(1996) Current challenges and future applications for
protein maps and posttranslational vector maps in proteome projects.
Electrophoresis, v.17, p.830-838.
WIEMKEN, A. (1990) - Trehalose in yeast, stress protectant rather than reserve
carbohydrate.Antonie van Leeuwenhoek, 58: 209-217.
WILSON MA, ST AMOUR CV, COLLINS JL, RINGE D, PETSKO GA.(2004) The 1.8-
A resolution crystal structure of YDR533Cp from Saccharomyces cerevisiae: a
member of the DJ-1/ThiJ/PfpI superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Feb
10; 101(6):1531-6. Epub 2004 Jan 26.
WOTTON D, et al. (1996) Multimerization of Hsp42p, a novel heat shock protein
of Saccharomyces cerevisiae, is dependent on a conserved carboxyl-terminal
sequence. J Biol Chem 271(5):2717-23
WU, K. et. al. (2000) Expression and subcellular localization of a membrane
protein related to Hsp30p in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta
1463 (2): 477-82.
YÁÑEZ, R., MARQUES S., GÍRIO, F. M. and. ROSEIRO, J. C. (2008). The effect of
acid stress on lactate production and growth kinetics in Lactobacillus
rhamnosus cultures. Process Biochemistry, v. 43, n. 4, p. 356–361
YAZAWA, H. et. al. (2007) Disruption of URA7 nd GAL6 improves the etanol
tolerance and fermentation capacity of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 24(7):
551-60
139
YELLON DM, MARBER MS.(1994) Hsp70 in myocardial
ischaemia. Experimental 1994; 50: 1075-1083
YOSHIKAWA K, et al. (2009) Comprehensive phenotypic analysis for
identification of genes affecting growth under ethanol stress in
Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 9(1):32-44
YOU, K. M., ROSENFIELD, C. L. & KNIIPPLE, D. C. (2003) - Ethanol tolerance in
the yeastcSaccharomyces cerevisiae are dependent on cellular oleic acid
content. Appl. Environ. Microbiol., 69: 1499-1503
YUN DJ, et al. (1997) Stress proteins on the yeast cell surface determine
resistance to osmotic, a plant antifungal protein. Proc Natl Acad Sci U S A94
(13):7082-7
ZHAO, M., TANG, D., LECHPAMMER, S., HOFFMAN, A., ASEA, A., STEVENSON,
M. A. & CALDERWOOD, S. K. (2002) Double-stranded RNA-dependent protein
kinase (pkr) is essential for thermo tolerance, accumulation of HSP70, and
stabilization of ARE-containing HSP70 mRNA during stress, J Biol Chem. 277,
44539-47
140
EFEITO DO ESTRESSE POR ETANOL SOBRE A MORFOLOGIA DAS
CELULAS DE LEVEDURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE
141
SUMARIO
RESUMO ........................................................................................................................................... 142
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 144
EFEITO DO ESTRESSE POR ETANOL SOBRE A MORFOLOGIA DAS CELULAS DE
LEVEDURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE ................................................................... 146
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 146
2. OBJETIVO .................................................................................................................................... 151
3. METODOLOGIA.......................................................................................................................... 152
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 153
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 160
6. CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 164
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 165
142
RESUMO
As leveduras são microrganismos eucariotos unicelulares, de parede celular rígida,
que possuem tamanho microscópico de 1 a 5 μm de diâmetro e de 5 a 30 μm de
comprimento. Apresentam-se, na sua maioria, de forma esférica a ovóide ou até
mesmo de filamentosa a elipsoide. Usualmente as células da levedura
Saccharomyces cerevisiae crescem na forma de células globulares únicas. Fungos
simples evoluíram para mecanismos sofisticados para detectar e responder a
estímulos ambientais, ativando chaves de desenvolvimento que resultam em
mudanças coordenadas em sua fisiologia celular, morfologia e adesão celular. O
objetivo deste trabalho foi avaliar através da técnica de Microscopia Eletrônica por
Varredura as possíveis alterações na morfologia da levedura Saccharomyces
cerevisiae variedade bayanus, proveniente de danos causados pelo estresse
etanólico. Para análise de Microscopia Eletrônica amostras da levedura crescidas
em meios YEPD em diferentes concentrações de etanol foram fixadas em superfície
adesiva condutora e metalizadas com fina película de ouro, adequando-as para a
análise morfológica. Como resultado foi possível verificar que as células-filhas
permanecem mecanicamente conectadas com a célula-mãe. Isso se deve a
presença de uma proteína da parede celular que persiste após a divisão, mas que
não impedem a separação de forma mecânica. Nas imagens aumentadas em
8,000X sinalizadas por setas vermelhas foi detectado deformações, como o
alongamento e união (formação de cachos) das leveduras que cresceram em
estresse etanolico. Como podemos observar nas figuras com aumento de 1,500 X,
concentrações progressivamente mais altas de etanol causam crescentes
deformações na parede celular da levedura. Essas deformações podem estar
relacionadas a uma resposta devido à toxidade do etanol, ou uma desidratação
devido ao aumento da concentração desse álcool. Outra característica observada foi
a crescente formação de pseudohifas. O aumento da concentração de etanol
também causou um dimorfismo celular na levedura, que passou de uma célula
ovoide para uma célula. Foi possível também verificar a formação de botões de
iniciação e alongamento. Como conclusão as células de leveduras aos cachos
devido ao aumento da concentração de etanol. Nas figuras apresentadas neste
capitulo, percebe-se que a formação de pseudo-hifa torna-se mais evidente em
143
cultivos à medida que a concentração de etanol aumenta. Esta capacidade de
formar cachos também está relacionada à temperatura a que são submetidas nas
dornas de fermentação, onde tendem a se aglomerar com o mesmo objetivo. Esta
característica é transmitida de mãe para filha, tornando-se um fator natural de
defesa.
Palavras-Chaves: Saccharomyces cerevisiae, crescimento, morfologia, etanol,
pseudohifas, Microscopia Eletrônica por Varredura.
144
ABSTRACT
Yeasts are unicellular eukaryotic microorganisms, with rigid cell wall, which have
microscopic size of 1 to 5 μm in diameter and 5 to 30 μm in length. They are mostly
from spherical to ovoid, or even from filamentous to ellipsoid. Usually the yeast
Saccharomyces cerevisiae grows in the form of single globular cells. Simple fungi
have evolved sophisticated mechanisms to detect and respond to environmental
stimuli, enabling development keys that result in synchronized changes on cellular
physiology, morphology and adhesion. During pseudohifal growth, the cells become
elongated, sprouting occurs synchronously, unipolar and blooms do not separate,
producing chains of cells that are called pseudohyphaes. The aim of this work was to
evaluate, through the technique of Scanning Electron Microscopy (SEM), the
possible changes in the morphology of the yeast Saccharomyces cerevisiae,
bayanus variety, caused by ethanol stress. For electron microscopy analysis of yeast
grown in YEPD media in different concentrations of ethanol, the samples were fixed
in conductive adhesive surface, composed of carbon and metallized with thin film of
gold, to make them conductive and adapted for morphological analysis. As a result it
was possible to verify that the daughter cells remain mechanically connected with the
parent cell. This is due to the presence of a cell wall protein that persists after the
split, but that did not prevent the mechanical separation. On 8.000 x images the red
arrows show detected deformations, such as stretching and union (formation of
bunches) of yeasts grown under ethanol stress. As we can see in the figures
(1.500X), progressively higher concentrations of ethanol cause deformations in the
cell wall of yeast. These deformations can be related to a response due to the toxicity
of ethanol, or dehydration due to increased concentration of this alcohol. Another
feature was the increasing formation of pseudohyphae. The increase in concentration
of ethanol also caused a cell dimorphism in yeast, which went from ovoid to
elongated from. It was also possible to verify the formation of initiation and elongation
buds. We concluded that yeast cells in bunches come from from isolated cells, that in
conditions of ethanol stress become attached. According to MEV images, we also
noticed that the pseudohiphae formation becomes more evident when alcohol
concentration increases. This ability to flock is also related to the temperature at
145
which the fermentation undergoes. This characteristic is transmitted from mother to
daughter, becoming a natural defense factor.
Key Words: Saccharomyces cerevisiae, growth, morphology, ethanol,
pseudohyphae, mycelial elongation
146
EFEITO DO ESTRESSE POR ETANOL SOBRE A MORFOLOGIA DAS CELULAS
DE LEVEDURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. INTRODUÇÃO
As leveduras são os principais microrganismos responsáveis pela conversão de
açúcares em etanol em nível industrial. As células de leveduras fazem uso desta
conversão para obterem energia necessária à manutenção de suas atividades vitais,
sendo o álcool etílico um produto de excreta de seu metabolismo (SANTOS, 2008)
As leveduras são microrganismos eucariotos unicelulares, de parede celular rígida,
que possuem tamanho microscópico de 1 a 5 μm de diâmetro e de 5 a 30 μm de
comprimento. Apresentam-se, na sua maioria, de forma esférica a ovóide ou até
mesmo de filamentosa a elipsoide. Assim como outros tipos de fungos, as leveduras
não realizam fotossíntese, apenas absorvem nutrientes contidos no meio onde
vivem, através de trocas bioquímicas, fazendo com que se multipliquem e produzam
produtos e subprodutos metabólicos (PELCZAR; et. al., 1997; ALTERTHUM, 2001).
Usualmente as células da levedura S. cerevisiae crescem na forma de células
globulares únicas. A habilidade desta levedura para formar pseudohifa perde-se na
maioria das cepas selecionadas em laboratórios, que buscam células que se
separam facilmente (GANCEDO, 2001).
A taxonomia das leveduras indica que as leveduras constituem um grupo de
fungos, cujas espécies podem ser caracterizadas por uma série de características
morfológicas, fisiológicas e bioquímicas. As principais características empregadas na
classificação das leveduras são: morfológicas - classificação ao nível de gênero;
características fisiológicas - classificação ao nível de espécies, características
bioquímicas - classificação ao nível de estirpes. (LODDER e KREGER Van RIJ
1952; LOODER 1970; KREGER Van RIJ 1984 e KREGER Van RIJ 1987).
SENAI/DN (2000) apud SANTOS, (2008) cita como principais características
morfológicas, citológicas e fisiológicas de células de leveduras:
Variam de 2 a 20 micra, podendo medir 100 micra de comprimento. A largura
varia geralmente de 1 a 9 micra. São encontradas sob diferentes formas. A
oval é a mais frequente.
147
As células de leveduras são eucarióticas. Podem apresentar cápsulas, como
as bactérias. A parede celular contém glucana, manana, lipídios e fosfatos. A
quitina pode estar presente
As leveduras se multiplicam assexuadamente, através da formação de brotos
ou gemas. A célula mãe pode dar origem a até 20-25 células-filhas.
Em muitas espécies de leveduras ocorrem sucessivas gemulações, e quando
há mais de sete células juntas, denomina-se pseudomicélio, pela semelhança aos
micélios dos bolores. As leveduras que formam películas sobre a superfície de
líquidos produzem o pseudomicélio.
A levedura S. cerevisiae se desenvolve melhor em meio contendo fonte de carbono,
vitaminas, como a tiamina e o ácido pantotênico, e também os nutrientes minerais
tais como: sais de nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, cálcio, zinco,
manganês, cobre, ferro, iodo, entre outros (BARNETT; PAYNE; YARROW, 2000;
PINHEIRO, 2004; AMORIM; BASSO; LOPES, 2009).
Fungos simples evoluíram mecanismos sofisticados para detectar e responder a
estímulos ambientais, ativando chaves de desenvolvimento que resultam em
mudanças coordenadas em fisiologia celular, morfologia e adesão celular. Crítica
depleção de nutrientes frequentemente induz a paragem do crescimento e a
formação de esporos capazes de tolerar uma grande variedade de tensões
ambientais. No entanto, numa solução alternativa é a mudança dimórfica ao
crescimento filamentoso, caracterizado por redes de ramificação das cadeias de
células ou de hifas para formar um micélio (GANCEDO, 2001 e PALECEK et. al.,
2002). Esse interruptor dimórfico é essencialmente modular e pode ser ativado por
uma grande variedade de estímulos apropriados para o estilo de vida do fungo.
A morfologia celular, a formação de uma cápsula de polissacarídeos, a ausência ou
presença de vacúolos de glóbulos de lipídeos, e o desenvolvimento das
mitocôndrias dependem das condições físico-químicas e da idade do cultivo do
microrganismo (BOURGEOIS e LARPENT, 1995).
Por sua vez, muitos processos bioquímicos industriais empregam leveduras e
fungos filamentosos dimórficos para dirigir a produção dos compostos químicos
desejados. A fermentação de hidratos de carbono em frutas, grãos e outras
biomassas ao etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae é o processo
148
fundamental para uma vasta gama de produtos desde vinhos finos a aditivos de
gasolina (PALECEK et. al., 2002 e PRETORIUS 2000).
Na FIGURA abaixo, é possível visualizar a estrutura e a reprodução de uma célula
típica de levedura.
FIGURA 11 - A estrutura e a reprodução de uma célula típica de levedura.
FONTE: SCHOHN, 2007
A S. cerevisiae, cresce normalmente como células de brotamento simples. Embora
as observações espalhadas sobre a capacidade desta levedura a crescer em forma
filamentosa foram feitas há muito tempo (GUILLIERMOND, 1920 apud GANCEDO,
2001), o fato de que as maiorias das cepas de laboratório crescem exclusivamente
na forma unicelular (KLEYN, et. al, 1971) fez com que o dimorfismo nesta levedura
não recebesse atenção significativa até a década passada. Em 1992, Gimeno et
al. (1992) relataram que, numa estirpe diploide em particular de S. cerevisiae, a
privação de nitrogênio causou a formação de pseudohifas e levou a um crescimento
filamentoso. Durante o crescimento pseudohifal, as células se tornam alongadas, a
149
brotação ocorre de forma síncrona unipolar e os brotos não se separam, produzindo
as cadeias de células que são chamados de pseudo. (ver FIGURA 12 )
FIGURA 12 - Na imagem a seta mostra a formação de pseudohifas
FONTE: CECCATO-ANTONINI et.al 2004
A produção de etanol pela levedura está ligada tanto ao processo de respiração no
qual ocorre o crescimento celular, quanto ao processo de fermentação em que
ocorre a produção de etanol. Na respiração, a degradação de moléculas de açúcar
pelas células em CO2 e H2O, produz um saldo energético de 36 ATP, muito
importante para a multiplicação celular e para a formação de biomassa. É
interessante que a levedura tenha uma boa taxa de crescimento, sendo o etanol um
produto de excreção que, em altas concentrações, torna-se tóxico às células de
levedura (LIMA; et.al., 2001; PINHEIRO, 2004; NELSON; COX, 2011).
S. cerevisiae apresenta um ciclo de crescimento característico. A fase lag
corresponde à fase de adaptação fisiológica das células ao novo meio de cultura no
qual foram introduzidas. Nessa fase o metabolismo de célula está ativo, sintetizando
enzimas e coenzimas, criando condições para que elas possam se dividir, embora
as células ainda não estejam se dividindo. Na fase exponencial, o numero de células
aumenta exponencialmente com o tempo, usando energia proveniente da
fermentação. Ao diminuir a disponibilidade de glicose no meio, ocorre a depressão
catabolica (transição diauxica), com uma parada transiente na divisão celular,
150
enquanto as células são preparadas para o metabolismo respiratório. Após a divisão
celular é retomado um ritmo mais lento, utilizando etanol como fonte de carbono,
produzido durante a fermentação (fase pos-diauxica). Quando todas as fontes de
carbonos são exauridas, as células entram na fase estacionaria, na qual podem
sobreviver por muito tempo na ausência de nutrientes (PRINGLE e HARTWELL,
1982; FUGE e WERNER-WASHBURNE, 1997).
Vários álcoois também podem induzir alterações morfológicas. DICKINSON 1994; e
DICKINSON 1996, demonstrou que alguns álcoois de fusel, que permanecem após
a maior parte do etanol ser removido a partir de qualquer fermentação de leveduras,
podem promover uma aberrante, morfologia alongada em S. cerevisiae. A
morfologia das células em crescimento, sob a forma pseudohifal é muito semelhante
ao de células expostas a estes álcoois fusel. Lorenzet al. (2000) caracterizou a
ligação entre estas alterações morfológicas induzidas pelo álcool e
pseudohifas. Vários álcoois, nomeadamente álcool isoamílico e butanol, promovem
um crescimento filamentoso em meio sólido e de forma alongada e filamentosas em
meio líquido. O etanol também reforça o crescimento filamentoso em células
diploides.
151
2. OBJETIVO
Avaliar através da técnica de Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) as
possíveis alterações na morfologia da levedura Saccharomyces cerevisiae variedade
bayanus, proveniente de danos causados pelo estresse etanolico.
152
3. METODOLOGIA
Para análise de Microscopia Eletrônica a amostra da levedura S. cerevisiae
variedade bayanus crescidas em meios YEPD em diferentes concentrações de
etanol (3%, 5%, 7%, 9%, 12%, 15% e 21%) foram fixadas em superfície adesiva
condutora, composta por carbono, e metalizadas com fina película de ouro, em
Spputer Coater Denton Vacuum Desk V, de modo a torna-las condutoras,
adequando-as para a análise.
As imagens com microscópio foram executadas com tensão de aceleração dos
elétrons variando entre 5 KV e 20 KV e analisadas através de imagens formadas
pelo Foi utilizado o MEV JEOL JSM-6610LV Scanning Electron Microscope, com
filamento de tungstênio, magnificação máxima de 300.000X pertencente ao
Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica (LAMUME).
153
4. RESULTADOS
Os resultados são apresentados através de imagens reveladas por MEV.
A) Levedura Sem Estresse Etanolico
FIGURA 13A. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD sob condições normais – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 13A. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD sob condições normais. A seta sinaliza a forma elíptica/oval da levedura – Imagem aumentada 8,000 X
154
B) Levedura com crescimento em 3% de Etanol no meio YEPD
FIGURA 14B. 1– Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 3% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 14B. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 3% de concentração de etanol. As setas sinalizam a formação de pseudohifas. – Imagem aumentada 8,000 X
155
C) Levedura com crescimento em 5% de Etanol em meio YEPD
FIGURA 15C. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 5% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 15C. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 5% de concentração de etanol. A seta em branco mostra deformações na parede celular da levedura em consequência do aumento da concentração de etanol. As setas em laranja indicam os botões de iniciação e alongamento – Imagem aumentada 8,000 X
156
D) Levedura com crescimento em 7% de Etanol em meio YEPD
FIGURA 16D. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 7% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 17D. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 7% de concentração de etanol. As setas mostram deformações na parede celular da levedura em consequência do aumento da concentração de etanol – Imagem aumentada 8,000 X
157
E) Levedura com crescimento em 9% de Etanol em meio YEPD
FIGURA 18E. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 9% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 19E. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 9% de concentração de etanol. As setas em vermelho indicam a formação de pseudohifas. E as setas em verde a mudança na forma de arredondada para alongada – Imagem aumentada 5,000 X
158
F) Levedura com crescimento em 12% de Etanol em meio YEPD
FIGURA 20F. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 12% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
FIGURA 21F. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 12% de concentração de etanol. A seta sinaliza a formação de um broto – Imagem aumentada 8,000 X
159
G) Levedura com crescimento em 15% de Etanol em meio YEPD
FIGURA 22G. 1 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 15% de concentração de etanol. Como é possível observar na imagem, todas as leveduras apresentam deformações – Imagem aumentada 1,500 X.
FIGURA 23G. 2 – Levedura Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus crescida em meio YEPD com 15% de concentração de etanol – Imagem aumentada 1,500 X
160
5. DISCUSSÃO
As células na forma de pseudohifa possuem algumas características como: forma
celular alongada, deficiência em separação celular e um padrão de brotamento
unipolar (FUJITA et al., 2005). As células-filhas permanecem mecanicamente
conectadas com a célula-mãe por uma proteína da parede celular que persiste após
a divisão, mas podem ser separadas mecanicamente. A mudança do padrão de
divisão celular em microrganismo dimórficos é modulada por fatores ambientais, tais
como, disponibilidade de nutrientes (KRON, 1997). As características citadas pelos
autores acima também foram observadas em nossos estudos, no que tange o
crescimento unido e formação de pseudohifas, à medida que a concentração de
etanol aumenta. Essas características morfológicas podem ser verificadas nas
imagens aumentadas em 8,000X sinalizadas por setas vermelhas.
Sabe-se que células de levedura Saccharomyces cerevisiae quando em meio de
cultivo pobre em fonte de carbono ou nitrogênio, formam pseudo-hifas, inclusive as
vias de sinalização moleculares para estes eventos já estão elucidadas (ZARAGOZA
e GANCEDO, 2000).
Zaragoza e Gancedo (2000) estudaram outros fatores que influenciam a morfologia
celular, como cultivos em que a fonte de carbono usada foi um álcool não
metabolizável (propanolol) e cultivos com estresse osmótico resultante de
concentrações de 1M de cloreto de sódio. Os autores concluíram que a formação de
pseudohifas em cultivos de levedura S. cerevisiae provavelmente é uma resposta
fisiológica tanto à escassez de nutrientes no meio de cultivo quanto uma resposta a
ambientes em situação de estresse (ZARAGOZA e GANCEDO, 2000).
Como podemos observar nas figuras com aumento de 1,500 X, concentrações
progressivamente mais altas de etanol causam crescentes deformações na parede
celular da levedura. Essas deformações podem estar relacionadas a uma resposta
devido à toxidade do etanol, ou uma desidratação devido ao aumento da
concentração desse álcool. Ou característica observada foi a crescente formação de
pseudohifas.
Gancedo (2001) sugere que estas formações em resposta ao estresse podem
auxiliar as células a sobreviver em ambientes possivelmente danosos. Outra
deformação a ser analisada são formações côncavas como mostrado nas FIGURAS
161
21D. 2 E 20C.2 indicadas pelas setas em preto. Essa deformação pode esta
associada à desidratação da parede celular pelo etanol e/ou resposta ao ambiente
estressante como forma de sobreviver ao mesmo.
As concentrações de aminoácidos também afetam o crescimento filamentoso, quer
pelo fornecimento de uma fonte de nitrogênio ou através de um mecanismo de
sinalização independente. Klasson et ai. (1999) mostraram que mutações no gene
SSY1 permease de ácido aminado ou gene PTR3 regulador permease peptídeo
induziu o alongamento. Provavelmente isso venha a justificar o alongamento da
levedura mostrada na FIGURA 19E. 2 indicada pelas setas em verde.
As duas melhores vias caracterizadas que regulam a formação de filamentos é a
proteína quinase dependente de cAMP (proteína cínase A, PKA) e STE cascatas de
MAPK (revisto por BORGES-WALMSLEY et.al., 2000; D’SOUZA et.al., 2001;
LENGELER, et.al., 2000; PAN, et.al., 2000; POSAS, et.al., 1998).
Os microrganismos tanto secretam quanto excretam uma ampla variedade de
compostos. Algumas destas substâncias resultarem de processos metabólicos
normais, tais como os álcoois em leveduras fermentativas. Embora o etanol seja o
produto de fermentação primária em S. cerevisiae, a levedura produz uma variedade
de outros álcoois, principalmente produtos do metabolismo dos aminoácidos de
cadeia ramificada, conhecidos coletivamente como álcoois fusel (WEBB, 1963).
No trabalho de Dickinson (1996) a uma concentração de 0,5% (v / v), álcool
isoamílico induziu a formação de extensões semelhantes a hifas em estirpes
diplóides e haploides de S. cerevisiae em meio complexo líquido. Estas extensões,
que se desenvolvem através do botão de iniciação e alongamento, são sujeitos à
divisão e a replicação do DNA nuclear e parecem semelhantes em muitos aspectos
a uma forma aberrante do ciclo de divisão celular. Álcool n-amilo foi tão eficaz como
o álcool isoamílico para induzir semelhantes a hifas de extensão (DICKINSON,
1996). Esses botões de iniciação e alongamento foram possíveis ser verificados,
como indicados nas FIGURAS 18A. 2 E 20C.2 em setas na cor laranja
Lorenz et al. (2000) demonstraram respostas a vários álcoois na morfologia celular e
tanto na colónia de S.cerevisiae. Estes álcoois (etanol, metanol, propanol,
isopropanol, butanol, isobutanol, álcool amílico e isoamílico) estimularam as células
haploides de se diferenciar em uma forma filamentosa semelhante ao diploide
específico, induzida pela inanição de nitrogênio, causando o desenvolvimento de
162
pseudohifas. Ambos os fenômenos envolvem uma morfologia alongada da célula,
alteração no padrão de brotamento, e uma dependência de elementos da via MAPK
feromônio-responsivo.
Outro gene essencial para a diferenciação pseudohifal sob uma série de condições
de teste não padronizados incluindo a temperatura alterada e aumento de nitrogênio
é o SWE1.
La Valle e Wittenberg (2001), concluíram que a quinase Swe1 modula o
desenvolvimento filamentoso sob uma ampla gama de condições e que a sua função
é parcialmente redundante com os TEC1 Flo8 e fatores de transcrição.
Usando duas estirpes industriais para a produção de etanol, Ceccato-Antonini e
Silva (2000) observaram transição para extensões semelhantes a hifas ou
pseudohifas (aglomerados de células) por adição de IAA (álcool isoamilico) 0,3-0,9%
v / v em Agar YEPD. Todas as alterações foram reversíveis quando as leveduras
foram reinoculadas em YEPD sozinho. Embora a formação de pseudohifas seja um
resultado de limitação de nitrogênio, foi também observada em resposta à adição de
IAA. A morfologia filamentosa da levedura pode ser problemática para o processo de
fermentação como a formação de uma “espuma” (concentração de células de
levedura) na parte superior do tanque de fermentação, retendo gás preso nos
tanques, fazendo com que o mosto da cana que flui para fora dos tanques ocasione
a perda de açúcar e álcool. Portanto, quando a temperatura na fermentação é acima
de 34°C e a levedura forma pseudomicélios se gasta bem mais antiespumante e
dispersante na fermentação (CECCATO-ANTONINI, et. al., 2000).
De acordo com os resultados obtidos por POSSAS (2010), dados foram suficientes
para provar a suposição de que as leveduras em forma de pseudomicélios possuem
desvantagens em relação a células soltas unicelulares, pois como demonstrado, as
mesmas possuem uma menor capacidade de converter o substrato recebido em
etanol, sugerindo uma maior probabilidade de fornecer perdas no processo
fermentativo devido aos residuais de açúcares não assimilados. Ainda segundo a
autora, os resultados comprovam que o tipo rugoso tem menor capacidade de
conversão do substrato em etanol, devido a uma menor área de contato com o meio,
pois as células estão em disposição aglomerada, diferentemente das unicelulares
que possuem uma área de contato muito maior com o meio. Indicando que este fato
reduz significativamente o rendimento fermentativo uma vez que a não conversão do
163
substrato em etanol demanda perdas significativas, bem como diminuição da
eficiência global da indústria. Os dados comprovaram que o tipo que se apresenta
com pseudomicélios possuem maior capacidade de tolerar o etanol formado,
portanto se aglomeram em cachos a fim de se autoproteger, evitando a exposição
das células-filhas aos fatores adversos. A autora concluiu também que o teor
alcoólico das leveduras aos cachos revertidas em soltas é maior do que a original
rugosa, portanto tem uma melhor Eficiência de Fermentação. É de se esperar,
então, que a unidade industrial que estiver trabalhando com leveduras soltas vai
influenciar na melhoria da Eficiência de Recuperação em ART.
164
6. CONCLUSÃO
As células de leveduras aos cachos são oriundas de células isoladas, que em
condições de estresse se tornam assim, principalmente devido ao aumento
da concentração de etanol, como forma de proteção.
Nas figuras apresentadas neste capitulo, percebe-se que a formação de
pseudohifa torna-se mais evidente em cultivos à medida que a concentração
de etanol aumenta. Desta forma, sugere-se que elevadas concentrações de
etanol pode ser danosas às células de levedura Saccharomyces cerevisiae
explicando também a menor formação de biomassa.
Esta capacidade de formar cachos também está relacionada à temperatura a
que são submetidas nas dornas de fermentação, onde tendem a se aglomerar
com o mesmo objetivo. Esta característica é transmitida de mãe para filha,
tornando esta característica um fator natural de defesa.
165
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTERTHUM, F (2001). Elementos de microbiologia. In: BORZANI, W.;
SCHMIDELL, W.; LIMA, U.; AQUARONE, E. (Coord.). Biotecnologia industrial:
fundamentos. São Paulo: Edgard Blücher. v.1, cap. 1, p 1-32.
AMORIM, H. V.; BASSO, L. C.; LOPES, M. L.;(2009) Sugar cane juice and
molasses, beetmolasses and sweet sorghum: composition and usage. In:
INGLEDEW, W. M.; KELSALL,D. R.; AUSTIN, G. D.; KLUHSPIES, C. The alcohol
textbook: a reference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries. 5th
ed.: Norflolk: Nottingham University Press.Cap. 5, p. 39-46.
BARNETT, J. A.; PAYNE, R. W.; YARROW, D.(2000) Yeast: characteristics and
identification.3rd ed. Cambridge. p. 1-27.
BORGES-WALMSLEY, M.I.; WALMSLEY, A.R. (2000) cAMP signalling in
pathogenic fungi: control of dimorphic switching and pathogenicity. Trend.
Microbiol., 8:133-141.
BOURGEOIS, C. M.; LARPENT, J. P. (1995) Microbiologia Alimentar. Volumen 2:
Fermentaciones alimentarias. Zaragoza: Acribia, p. 19-29.
CECCATO-ANTONINI S.R., SUDBERY, P.R (2004) Filamentous growth
in Saccharomyces cerevisiae, Braz. J. Microbiol. vol.35 no.3 São Paulo July/Sept.
CECCATA-ANTONINI, S.R.; PARAZZI, C. (2000) Monitoramento microbiológico
da fermentação etanólica: uma experiência. Jornal Cana, jan, p.25-26.
D’SOUZA, C.A.; HEITMAN, J.(2001) Conserved cAMP signalling cascades
regulate fungal development and virulence.FEMS Microbiol. Rev., 25:349-363.
DICKIINSON, J.R. (1996) 'Fusel' alcohols induce hyphal-like extensions and
pseudohyphal formation in yeasts. Microbiology, 142:1391-1397.
FUGE, E.F. & WERNER-WASHBURNE, M. (1997) Stationary phase in the yeast
Saccharomyces cerevisiae. In. Hohmann S., Mager, W.H., eds Yeast Stress
Response, NY, Springer, p. 57-74.
FUJITA, A.; HIROKO, T.; HIROKO, F. e OKA, C.(2005) Enhancement of superficial
pseudohyphal growth by overexpression of the SFG1 gene in yeast
Saccharomyces cerevisiae. Gene, v.363, p.97-104, 2005.
166
GANCEDO, J. M.(2001) Control of pseudohyphae formation in Saccharomyces
cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev., v.25, n.1, p.107-23, 2001.
GIMENO, C.J.;LJUNGDAHL, P.O.; STYLES, C.A.; FINK, G.R.(1992) Unipolar cell
divisions in the yeast Saccharomyces cerevisiae lead to filamentous growth:
regulation by starvation and RAS. Cell, 68:1077-1090.
KLASSON, H.; FINK, G.R.; LJUNGDAHL, P.O. (1999) Ssy1p and Ptr3p are plasma
membrane components of a yeast system that senses extracellular amino
acids. Mol. Cell Biol., 19:5405-5416.
KLEYN, J.; HOUGH, J.(1971) The microbiology of brewing. Annu. Rev. Microbiol.,
25:583-608.
KREGER VAN RIJ, N.J.W. (1984), The yeasts: a taxonomic study. 3. Ed.
Amsterdam: .Elsevier Science Publishing. 1082p.
KREGER VAN RIJ, N.J.W (1987), Classification of yeasts. In: ROSE, A.H.
HARRISON, J.S. (Ed) The yeast. Academic Press, v.1, p. 5-61.
KRON, S. J. (1997) Filamentous growth in budding yeast. Trends Microbiol, v.5,
n.11, p.450-4, 1997.
LA VALLEe, R.; WITTENBERG, C.(2001) A role for the Swe1 checkpoint kinase
during filamentous growth of Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 158:549-562,
2001.
LENGELER, K.B.; DAVIDSON, R.C.; D'SOUZA, C.; HARASHIMA, T.; SHEN, W.C.;
WANG, P.; PAN, X.; WAUGH, M.; HEITMAN, J. Signal transduction cascades
regulating fungal development and virulence. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:746-
785.
LIMA, U. A.; BASSO, L. C.; AMORIM, H. V.(2001) Produção de etanol. In:
SCHMIDELL, W.; LIMA, U.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. (Coord.). Biotecnologia
industrial: Processos fermentativos e enzimáticos. São Paulo: Edgard Blücher, v.
3, cap. 1, p. 1-46.
LORENZ, M.C.; CUTTER, N.S.; HEITMAN, J.(2000) Characterization of alcohol-
induced filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell,
11:183-199.
LODDER; J. & KREGER, VAN RIJ, N.J. (1952), The yeasts. A taxonomic
study.London: Amsterdam North Holland.
167
LODDER, J. (1970), The yeasts: a taxonomic study. London: Amsterdam North
Holland. 1385 p.
NELSON, D.; COX, M.(2011) Princípios de bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto
Alegre: Artmed.
PAN, X.; HARASHIMA, T.; HEITMAN, J.(2000) Signal transduction cascades
regulating pseudohyphal differentiation of Saccharomyces cerevisiae. Curr.
Opin. Microbiol., 3:567-572.
PALECEK, S.P.; PARITH, A.S.; KRON, S.J.(2002) Sensing, signalling and
integrating physical processes during Saccharomyces cerevisiae invasive and
filamentous growth. Microbiology, 148:893-907.
PELCZAR, M. J; CHANE, C. S.; KRIEG, N. R.(1997) Microbiologia: conceitos e
aplicações. 2.ed. São Paulo: McGraw-Hill, v. 1, p. 52-187.
PINHEIRO, R. I. C.(2004) Estudo do efeito da pressão na fisiologia de
leveduras. 2004. 292 f. Dissertação (Doutorado em Engenharia Química e
Biológica) – Escola de Engenharia, Universidade do Minho, Braga.
POSAS, F.; TAKEKAWA, M.; SAITO, H.(1998) Signal transduction by MAP kinase
cascades in budding yeast. Curr. Opin. Microbiol., 1:175-182.
PRETORIUS, I.S.(2000) Tailoring wine yeasts for the new millenium: novel
approaches to the ancient art of winemaking. Yeast, 16:675-729.
PRINGLE, J.R. & HARTWELL, L.H.(1982) The Saccharomyces cerevisiae cell
cycle. In: Strathern, J.N., Jones, E.W., Broach, J.R. eds. The molecular biology of
the yeast Saccharomyces cerevisiae, life cycle and inheritance Cold Spring
Harbor, NY, p.97-142.
SANTOS, A.M., (2008) Fermentação alcoólica com levedura imobilizada em
colmos de bambu e em fibra de coco. Dissertação (mestrado). Universidade
Federal de Alagoas, Maceió.
SANTOS, A.M., (2008) Fermentação alcoólica com levedura imobilizada em
colmos de bambu e em fibra de coco. Dissertação (mestrado). Universidade
Federal de Alagoas, Maceió. In: SENAI/DN, 2000, Elementos de apoio para o
sistema APPCC (Série Qualidade e Segurança Alimentar), 2a ed, Brasília, Projeto
APPCC Indústria Convênio CNI/SENAI/SEBRAE
168
SCHOHN, A. J.(2013) Yeast: Brings it all together! DisponÌvel
em:http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/beer/yeast/yeast2.htm.
Acesso em: mar. 2013.
WEBB, A.D.; INGRAHAM, J.L(1963). Fusel oil. Adv. Appl. Microbiol., 5:317-353,
1963.
ZARAGOZA, O. e GANCEDO, J. M.(2000) Pseudohyphal growth is induced in
Saccharomyces cerevisiae by a combination of stress and cAMP signalling.
Antonie Van Leeuwenhoek, v.78, n.2, p.187-94, 2000.