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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
AVALIAÇÃO DO 5-HIDROXIMETILFURFURAL COMO PRODUTO
DE REAÇÃO DE MAILLARD DURANTE O PROCESSO DE TORRAÇÃO DE AMENDOAS DE CACAU Theobroma cacao L.
MARGARETH DA SILVA RIBEIRO
Salvador – Bahia 2014
ii
MARGARETH DA SILVA RIBEIRO
AVALIAÇÃO DO 5-HIDROXIMETILFURFURAL COMO PRODUTO DE REAÇÃO DE MAILLARD DURANTE O PROCESSO DE
TORRAÇÃO DE AMENDOAS DE CACAU Theobroma cacao L.
Orientadora: Profª Drª. Eliete da Silva Bispo
Co-orientador: Prof° Dr. Sérgio Eduardo Soares
Salvador – Bahia 2014
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre.
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Ribeiro, Margareth da Silva. Avaliação do 5-Hidroximetilfurfural como produto de reação de Maillard durante o
processo de torração de amêndoas de cacau Teobroma cacão L. / Margareth da Silva Ribeiro. - 2014.
90 f. : Il. Orientadora: Profª. Drª. Eliete da Silva Bispo. Co-orientador: Prof. Dr. Sérgio Eduardo Soares. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador, 2014. 1. Cacau. 2. Cromatografia a líquido de alta eficiência. 3. Análise cromotográfica. I. Bispo, Elite da Silva. II. Soares, Sérgio Eduardo. III. Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Farmácia. IV. Título. CDD - 633.74 CDU - 633.74
iii
Aos meus pais;
;
Dedico este trabalho aos meus pais, Elizabeth e Lourival, a minha irmã Marlucia, e a Profª Rosemary pelo estímulo ao longo da minha vida.
iv
“Nós temos tentado conquistar a natureza pela força e pelo
intelecto. O que agora nos resta é tentar o caminho do amor”.
Lord Northbourne (1940)
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, por permitir que eu superasse todas as dificuldades, encorajando-me a seguir com confiança e determinação; A minha família, principalmente aos meus pais Elizabeth e Lourival e aos meus irmãos Gilcimara, Lourival, Marcia e Marluce, pelo verdadeiro carinho, amor, ensinamentos, torcida e apoio. À minha coordenadora, Professora Dra. Rosemary Duarte Sales Carvalho, que com toda sua generosidade, paciência e profissionalismo, me ensinou a arte da dedicação e o amor à profissão, além de me ensinar a enfrentar todas as dificuldades com otimismo; À Profª. Drª. Mara Spínola, por toda a paciência, carinho, ensinamentos e amizade; À Jaff Ribeiro pelas parcerias estabelecidas, compreensão, amizade e amor; À Profª. Drª. Eliete da Silva Bispo pela orientação, paciência, confiança, ensinamentos e amizade; Ao Profº. Drº. Sergio Eduardo Soares pela paciência, carinho, auxílio e confiança; Ao Profº. Drº. Paulo Rodrigues por sua colaboração com valiosas sugestões; Aos meus amigos, por dividir alegrias e tristezas, e toda sua compreensão e atenção: Adrielle Leão, Candice Braga, Clarissa Duarte, Danila, Eleidiana Andréia, Érika Maciel, Gerson Calazans, Gilcimara Goés, Gilson Machado Filho, Iuri Mira, Leonardo Maciel, Lindanor Santana, Sandra Martins e Valmir Marques Júnior; À todos do Laboratório de Bromatologia, pela ajuda, compreensão e disponibilidade; Aos amigos do LAPESCA (Ananda, Andréia, Augusto, Carol, Diego, Denílson, Gleice, Leonardo, Lídia, Lívia, Luciane e Paulo), por todo o companheirismo e auxílio; A Priscila Oliveira, secretária da Pós-graduação em Ciência de Alimentos, por todas as dicas e compreensão; Os Professoras Janice Druzian, Celso Duarte, Alaíse Gil, Rízia de Cássia e Itaciara Nunes pelos conhecimentos adquiridos; A Universidade Federal da Bahia pelo suporte; À CAPES e CNPq, pelo apoio financeiro. Aos amigos da Fazenda Riachuelo pelo acolhimento, suporte e fornecimento do material de estudo; Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente na realização desta meta.
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................. 14
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 16
OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................................ 16
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 16
CAPÍTULO I
REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 17
1. CACAU ........................................................................................................................... 17
1.1 O cacau no Brasil e no mundo ....................................................................................... 19
1.2 O beneficiamento do cacau ........................................................................................... 20
2. TORRAÇÃO DAS AMÊNDOAS ................................................................................ 26
2.1 Torração contínua e por batelada................................................................................... 28
3. REAÇÃO DE MAILLARD .......................................................................................... 30
3.1 Produtos de reação de Maillard – 5-hidroximetilfurfural. ............................................. 34
4. VALIDACÃO DO MÉTODO ...................................................................................... 36
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 39
CAPÍTULO II
INFLUÊNCIA DO PROCESSO DE TORRAÇÃO DE AMÊNDOAS DE CACAU
(Theobroma cacao L.) NOS ASPECTOS FISICO-QUIMICOS, ATIVIDADE DE
ÁGUA E QUANTIFICAÇÃO DO HIDROXIMETILFURFURAL ............................. 45
RESUMO ........................................................................................................................... 45
ABSTRACT ....................................................................................................................... 46
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 47
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 49
2.1 Torração das amostras ................................................................................................... 49
2.2 Aspectos físico-químicos ............................................................................................... 50
2.2.1 Umidade ..................................................................................................................... 50
vii
2.2.2 Cinzas ......................................................................................................................... 50
2.2.3 Proteínas ..................................................................................................................... 50
2.2.4 Lipídios ....................................................................................................................... 50
2.2.5 Carboidratos ............................................................................................................... 50
2.3 Atividade de água .......................................................................................................... 51
2.4 Quantificação do hidroximetilfurfural ........................................................................... 51
2.4.1 Reagentes e soluções .................................................................................................. 51
2.4.2 Equipamentos e condições cromatográficas ............................................................... 51
2.4.3 Extração do hidroximetilfurfural ................................................................................ 52
2.5 Análise estatística .......................................................................................................... 52
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 53
4. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 57
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 59
CAPÍTULO III
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E TEMPO DE TORRAÇÃO NA
CONCENTRAÇÃO DO 5-HIDROXIMETILFURFURAL EM AMÊNDOAS DE
CACAU Theobroma cacao L. ........................................................................................... 61
RESUMO ........................................................................................................................... 61
ABSTRACT ....................................................................................................................... 62
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 63
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 66
2.1 Reagentes e soluções ..................................................................................................... 66
2.2 Equipamentos e condições cromatográficas .................................................................. 66
2.3 Obtenção das amostras .................................................................................................. 67
2.4 Torração das amostras ................................................................................................... 67
2.5 Extração do hidroximetilfurfural ................................................................................... 68
2.6 Procedimento de validação do método .......................................................................... 69
2.7 Análise estatística .......................................................................................................... 69
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 70
3.1 Validação do método ..................................................................................................... 70
viii
3.1.1 Seletividade ................................................................................................................ 70
3.1.2 Linearidade ................................................................................................................. 71
3.1.3 Limites de detecção e quantificação ........................................................................... 72
3.1.4 Exatidão (Recuperação) .............................................................................................. 74
3.1.5 Precisão ....................................................................................................................... 75
3.1.5.1 Precisão intradia (repetibilidade) ............................................................................. 75
3.1.5.2 Precisão intermediaria (interdia) ............................................................................. 76
3.1.6 Robustez ..................................................................................................................... 78
3.2 Quantificação do HMF em amêndoas de cacau em diferentes tempos e temperaturas.79
4. CONCLUSÃO ................................................................................................................ 83
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 85
CONCLUSÕES FINAIS ..................................................................................................... 88
SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS ..................................................................... 90
ix
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 01. Corte transversal de um fruto de cacau- A: cotilédone; B: placenta; C: polpa
mucilaginosa.........................................................................................................................18
Figura 02. Etapas do beneficiamento do cacau .................................................................. 21
Figura 03. Colheita do cacau .............................................................................................. 22
Figura 04. Corte dos frutos ................................................................................................. 22
Figura 05. Secagem do cacau feita em barcaças ................................................................ 24
Figura 06. Torrador contínuo ............................................................................................. 29
Figura 07. Visão geral da reação de Maillard..................................................................... 32
Figura 08. Esquema de formação do 5-hidroximetilfurfural .............................................. 35
CAPÍTULO II
Figura 01. Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do ajuste
do modelo de análise de variância do teor de umidade encontrada na Tabela 2 ................. 54
Figura 02. Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do ajuste
do modelo de análise de variância do teor de proteínas encontrada na Tabela 2 ................ 55
CAPÍTULO III
Figura 01. Cromatogramas obtidos por CLAE do branco da matriz, solução padrão e das
soluções amostra preparadas a partir da extração do hidroximetilfurfural em amêndoas
secas e torradas (n = 6) ........................................................................................................ 70
Figura 02. Curva analítica traçada por padronização externa para HMF (área x
concentração em mg.mL -1) obtida por HPLC/UV. y = 260252x + 2236,7e R2 = 0,9997 .. 72
Figura 03. Cromatogramas obtidos por CLAE na análise de determinação do HMF em
amêndoas de cacau torradas a temperatura de 80º C durante 60 minutos e a temperatura de
160º C durante 60 minutos. Condições: coluna: RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5 m); ácido
x
fórmico 0,1 % e acetronitrila na proporção de 95:5 (v/v); vazão: 1 mL/min; detecção: UV
280 nm................................................................................................................................. 79
Figura 04. Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do ajuste
do modelo de análise de variância da concentração de hidroximetilfurfural em amêndoas
de cacau secas e torradas encontrada na Tabela 6 ............................................................... 83
xi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 01. : Composição química média da amêndoa de cacau ........................................ 19
CAPÍTULO II
Tabela 01. Planejamento experimental utilizando como variáveis independentes o tempo
(t) e temperatura (T) ............................................................................................................ 49
Tabela 02. Aspectos físico-químicos de amêndoas torradas a 80°C., 120ºC e 160° C
durante 20, 40 e 60 minutos ................................................................................................ 53
Tabela 03. Aspectos físico-químicos de amêndoas fermentadas e secas não submetidas ao
processo de torração ............................................................................................................ 54
Tabela 04. Concentração média de hidroximetilfurfural em (mg.kg-1) e atividade de água
(Aw) das amostras de amêndoas de cacau secas e torradas em diferentes temperaturas e
tempo ................................................................................................................................... 56
CAPÍTULO III
Tabela 01. Temperaturas e tempos de torração das amêndoas de cacau. ........................... 68
Tabela 02. Comparação entre os limites de quantificação (LQ) e detecção (LD) obtidos no
método de validação para HMF por CLAE pelo presente método para determinação de
HMF e valores encontrados na literatura para diferentes matrizes ..................................... 73
Tabela 03. Comparação entre os valores de exatidão e precisão intradia obtidos no método
de validação para HMF por CLAE pelo presente método para determinação de HMF......75
Tabela 04. Avaliação da precisão intermediaria pelas variáveis “dia” e “analista”............77
Tabela 05. Avaliação estatística da robustez pelas variáveis “massa”, “tempo de
agitação”e “volume do solvente extrator”............................................................................78
Tabela 06. Concentração média de HMF em (mg.kg-1) das amostras de amêndoas de cacau
secas e torradas em diferentes temperaturas e tempo..........................................................80
xii
Tabela 07. Análise de variância na influência dos fatores temperatura e tempo na
concentração do HMF em amêndoas de cacau secas e torradas em diferentes temperaturas
e tempos................................................................................................................................81
xiii
RESUMO
A atividade cacaueira está associada, de maneira geral, às etapas de produção do cacau,
desde a preparação da terra, implantação da cultura até a produção do cacau em amêndoas
secas e torradas. A torração do cacau é um tratamento térmico fundamental na obtenção
das características de qualidade do chocolate, pois ocorrem reações químicas que fazem
com que os precursores do sabor de chocolate (aminoácidos livres e açucares redutores),
desenvolvidos durante a fermentação, sejam convertidos em produtos responsáveis pelo
sabor típico do chocolate. Durante a torração ocorre desenvolvimento do aroma e cor típica
de chocolate, principalmente pela reação de Maillard. A reação de Maillard tem
desempenhado um papel importante na melhoria da aparência e sabor dos alimentos. Tem
sido um desafio importante na indústria de alimentos, uma vez que a reação de Maillard
está relacionada com sabor, aroma e cor, em especial em processos tradicionais, tais como
a torração de grãos de café e cacau. A extensão da reação de Maillard em alimentos pode
ser monitorada pela formação de alguns compostos, o que permite avaliar a intensidade do
processamento térmico e as alterações nutricionais relacionadas a ele. O 5-
hidroximetilfurfural é um composto furânico que se forma como um intermediário na
reação de Maillard e a partir da desidratação de açúcares, em condições ácidas
(caramelização) durante os tratamentos térmicos aplicados aos alimentos. Dada a absoluta
falta de dados sobre produtos de reação de Maillard em amêndoas de cacau secas e
torradas no Brasil, este trabalho propõe-se a avaliar o teor 5-hidroximetilfurfural como
produto da reação de Maillard durante o processo de torração de amêndoas de cacau
submetidas diferentes tempos e temperaturas. O 5-hidroximetilfurfural foi determinado
pelo método que utiliza cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O teor de HMF
nas amêndoas de cacau durante a torração mostrou um aumento linear na concentração,
mas a importância de avaliar uma melhor temperatura e tempo de torração, otimizando o
processo tecnológico de fabricação do chocolate, está diretamente relacionada à avaliação
sensorial, visando a produção de chocolate de qualidade superior.
Palavras-chave: cacau, torração, hidroximetilfurfural, cromatografia líquida de alta
eficiência.
xiv
ABSTRACT
The cacao activity is associated, in general, the stages of cocoa production from land
preparation, crop establishment until the production of cocoa dry beans and toast. The
roasting of cocoa is a key heat treatment in obtaining quality traits of chocolate, because
chemical reactions that cause the chocolate flavor precursors (amino acids and reducing
sugars), developed during fermentation, are converted into products responsible occur the
typical chocolate flavor. During roasting flavor development and color typical chocolate
occurs mainly by the Maillard reaction. The Maillard reaction has played an important role
in improving the appearance and taste of food. It has been a major challenge in food
industry, since the Maillard reaction is related to taste, aroma and color, particularly in
traditional processes such as the roasting of coffee beans and cocoa. The extent of the
Maillard reaction in food can be monitored by the formation of some compounds, which
evaluates the intensity of thermal processing and nutritional changes related to it. The 5-
hydroxymethylfurfural is a furan compound formed as an intermediate in the Maillard
reaction and from dehydration of sugars under acidic conditions (browning) during the heat
treatments applied to the food. Given the absolute lack of data on Maillard reaction
products in dried cocoa beans and toast in Brazil, this study aims to assess the 5-
hydroxymethylfurfural content as a product of the Maillard reaction during the roasting
process of cocoa beans subjected different times and temperatures. The 5-
hydroxymethylfurfural was determined by the method using high performance liquid
chromatography (HPLC). The HMF content in cocoa beans during roasting showed a
linear increase in the concentration, but the importance of assessing a better temperature
and time of roasting, optimizing the technological process of making chocolate, is directly
related to sensory evaluation to production chocolate of superior quality.
Keywords: cocoa, roasted, hydroxymethylfurfural, high performance liquid
chromatography.
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INTRODUÇÃO GERAL
A palavra cacau é um termo geral que se refere tanto ao fruto quanto a semente da planta da
espécie Theobroma cacao L, pertencente à família Malvaceae. A árvore é originária do
Amazonas e outras áreas tropicais das Américas do Sul e central. Há dois grupos de T. cacao
reconhecidos, Criollo e Forastero, além de um terceiro grupo, o Trinitário, formado pela
hibridização dos grupo anteriores (WOOD & LASS, 1985).
O cacau é um fruto muito popular, pois a partir de suas sementes é obtido um dos alimentos
mais conhecidos e apreciados: o chocolate. Seu sabor é condicionado não apenas a atributos
genéticos do cacaueiro (variedade), como também a modificações que ocorrem durante seu
beneficiamento. Basicamente, após a colheita do cacau, são efetuadas as operações de abertura
dos frutos, fermentação das sementes junto à polpa que as envolve, secagem e torração para
obtenção da massa ou liquor de cacau, que será utilizado na obtenção de manteiga e pó de
cacau, além de chocolates e produtos análogos (BECKETT, 2008). Durante essas etapas são
gerados não apenas os precursores do sabor característico dos produtos de cacau, como
também compostos que não mais sofrerão modificações e que contribuirão para esse sabor.
O cacau é normalmente cultivado nos trópicos, por pequenos agricultores em países do
terceiro mundo. Seu cultivo estende-se da Colômbia, para a Venezuela, América Central e
México. Ao dispersar-se ao longo do rio Amazonas, alcança também as Guianas. Saindo das
Américas e com cerca de 70% da produção mundial proveniente da África Ocidental,
principalmente da Costa do Marfim (40%), Gana (20%), Nigéria (5%) e Camarões (5%). O
Brasil, até a chegada da vassoura de bruxa (Moniliophtora perniciosa) em 1989, era o segundo
maior produtor de cacau do mundo caindo para a quarta posição, responsável por 4% do total
mundial depois do aparecimento desta doença. A Bahia ainda é o maior produtor de cacau no
Brasil, com 64% do total produzido, seguido por Pará (25%), Rondônia (8%) e Espírito Santo
(3%) (MARTINI, 2004, LOPES, 2011).
15
A torra do cacau tem como objetivo fundamental completar o desenvolvimento das reações
químicas responsáveis pela formação das características sensoriais de sabor e cor de
“chocolate” iniciadas durante a fermentação. Complementarmente ocorre importante
diminuição no conteúdo de água, de ácidos voláteis e de outras substâncias que contribuem
para o amargor e a acidez, e do número de microrganismos presentes nas amêndoas, além de
auxiliar na separação da casca para o processo que se seguirá (MINIFIE, 1999; FERRÃO,
2002; BECKETT, 2008). A torração é uma etapa extremamente importante na tecnologia do
processamento do cacau e fabricação do chocolate, devendo-se adotar diferentes associações
de tempo e temperatura conforme as características sensoriais e tecnológicas que se deseja
obter no produto final (MINIFIE, 1999).
Durante a torração do cacau ocorre o desenvolvimento de aromas, principalmente pela Reação
de Maillard, a partir dos precursores formados durante a fermentação. Entre os compostos
aromáticos predominam em número as pirazinas (RAMLI et al., 2006).
A reação de Maillard ocorre principalmente no decorrer de um tratamento térmico, sendo
consideravelmente acelerada pelo aumento da temperatura, mas pode ocorrer também a
temperatura ambiente ou de estocagem. Ela provocada por uma reação inicial entre a função
amina de um aminoácido e as funções aldeídicas ou cetônicas de um carboidrato, ou também
pelo produto de oxidação de um ácido graxo. Os primeiros produtos da reação são incolores e
fluorescentes e sua polimerização torna-os escuros, razão pela qual a reação de Maillard é
conhecida também por reação do escurecimento não enzimático (ALLEN & HAMILTON,
1983).
Os consumidores estão cada vez mais exigentes por produtos que fazem bem a saúde. O
chocolate tem sido bastante consumido com altos teores de cacau pelo apelo funcional
associada à redução do risco de doenças cardiovasculares, devido à combinação de vários
efeitos promovidos pelos flavanóis, como o aumento da atividade antioxidante no plasma, há a
diminuição da oxidação do LDL-colesterol, aumentando a vasodilatação e inibindo a
agregação plaquetária. (WATERHOUSE, A.L.; SHIRLEY, J.R.; DONOVAN, 1996 e KEEN,
C.L., et al, 2005). Neste contexto cria-se uma preocupação quanto aos produtos de reação de
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Maillard, durante e após o processo de torração das amêndoas de cacau, visto que, alguns
produtos desta reação podem causar danos à saúde do consumidor.
As recentes atividades com variedades diferentes de cacau têm estimulado a produção de
chocolate por micro e pequenas empresas nas micro-regiões produtoras de cacau. Desta forma,
há também o interesse em, através deste estudo, auxiliar, orientar e otimizar a produção nestas
micro e pequenas empresas, como forma de contribuir para o desenvolvimento econômico e
tecnológico local.
OBJETIVOS
GERAL
Avaliar o teor do 5-hidroximetilfurfural como produto da reação de Maillard durante o
processo de torração de amêndoas de cacau submetidas diferentes tempos e temperaturas.
ESPECÍFICOS
Identificar e selecionar os materiais de cacau fermentados e secos para realização do
experimento;
Realizar os aspectos físico-químicos das amostras de cacau secas e torradas submetidas a
diferentes tempos e temperaturas;
Determinar o teor de atividade de água das amostras de cacau secas e torradas submetidas
a diferentes tempos e temperaturas;
Validar e otimizar o método de Hidroximetilfurfural.
Quantificar o teor de Hidroximetilfurfural em amostras de cacau após o processo de
torração.
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CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. O CACAU (Theobroma cacao L)
O cacaueiro pertence à ordem Malvales, família Malvaceae, gênero Theobroma, espécie
Theobroma cacao L., única utilizada comercialmente para a produção de chocolate. Os astecas
e outros grupos de língua nahuatl denominavam o cacaueiro de “cacaohoaquahuitl”, os frutos
de “cachocentli” e suas sementes de “cacaoatl”, nome utilizado atualmente para a espécie. Em
1737, Lineu denomina o gênero de Theobroma, que significa alimento dos deuses, em
referência à origem divina atribuída ao cacaueiro pelos povos mesoamericanos (LOPES et al,
2011; EFRAIM, 2009).
O cultivo do cacau necessita de chuvas regulares, temperatura média de 25ºC e precipitação
anual entre 1500 e 2000 mm. O solo deve ser profundo e fértil, sendo muito susceptível a
pragas e fungos. Atinge entre 5 a 10 metros de altura, e os primeiros frutos são colhidos cerca
de 5 anos após a plantação. O fruto do cacaueiro tem forma oval com 15 a 20 cm de
comprimento do eixo maior, e cor amarela quando maduro. O cotilédone e um pequeno
gérmen de planta embrionária são recobertos por uma película denominada testa, e a semente
é revestida por uma polpa branca com tons rosados, mucilaginosa e adocicada (MARTINI,
2004; BATALHA, 2009; BECKETT, 1994).
A atividade cacaueira está associada, de maneira geral, às etapas de produção do cacau, desde
a preparação da terra, implantação da cultura até a produção do cacau em amêndoas secas;
comercialização, relacionada com a compra e venda de amêndoas secas e transporte até as
indústrias de transformação; processamento e beneficiamento nas indústrias de transformação
do cacau; comercialização dos subprodutos das amêndoas (GOMES et al, 2010).
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Ao lado da indiscutível importância econômica, o cacau tem um grande valor ecológico.
Cultivado racionalmente, em condições que se assemelham às do seu "habitat" natural, em
florestas, com um sombreamento permanente de árvores de maior porte, o cacaueiro protege o
solo dos efeitos da erosão e da lixiviação (carreamento de elementos nutritivos pelas águas).
Suas plantações substituem a floresta original sem destruir o ambiente ecológico existente,
preservando a heterogeneidade e com ela o micro-clima e a vida das espécies vegetais e
animais das áreas cultivadas (EFRAIM, 2004).
O cacau é classificado sob três variedades: Criollo, Forastero e Trinitario, a maioria do cacau
comercializado mundialmente é tipo Forastero; o tipo Trinitario resulta da hibridização entre
Forastero e Criollo. As variedades Trinitario e Criollo produzem um chocolate considerado
de qualidade excelente e suave aroma e sabor (BECKETT, 2009).
A polpa do cacau é constituída por um conjunto de células esponjosas mucilaginosas contendo
água, frutose, glicose, sacarose, ácido cítrico e vários sais inorgânicos (Figura 2). A testa
secreta a mucilagem e atua como via de transporte entre os cotilédones e a polpa
mucilaginosa. O cotilédone apresenta células contendo reservas protéicas, lípides, amido e
células polifenólicas. No tecido fresco predominam células contendo numerosos e regulares
glóbulos lipídicos que revestem ordenadamente a face interna da membrana celular. As células
polifenólicas apresentam um grande e único vacúolo preenchido por polifenóis sendo
responsáveis pela cor dos cotilédones (MARTINI, 2004).
Figura 1. Corte transversal de um fruto de cacau - A: cotilédone; B: placenta; C: polpa
mucilaginosa.
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A composição química do cacau depende de diversos fatores, principalmente da espécie e
origem das amêndoas, das práticas agrícolas e do grau de maturação dos frutos. A composição
química média da amêndoa do cacau está apresentada na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição química média da amêndoa de cacau.
Fonte: AFOAKWA, 2010.
1.1 O cacau no Brasil e no mundo
O cacau é normalmente cultivado nos trópicos, por pequenos agricultores em países do
terceiro mundo. Seu cultivo estende-se da Colômbia, para a Venezuela, América Central e
México. Ao dispersar-se ao longo do rio Amazonas, alcança também as Guianas. Saindo das
Américas e com cerca de 70% da produção mundial proveniente da África Ocidental,
principalmente da Costa do Marfim (40%), Gana (20%), Nigéria (5%) e Camarões (5%). O
Brasil, até a chegada da vassoura de bruxa (Moniliophtora perniciosa) em 1989, era o segundo
maior produtor de cacau do mundo caindo para a quarta posição, responsável por 4% do total
mundial depois do aparecimento desta doença. A Bahia ainda é o maior produtor de cacau no
Brasil, com 64% do total produzido, seguido por Pará (25%), Rondônia (8%) e Espírito Santo
(3%) (MARTINI, 2004, LOPES, 2011).
Compostos % com relação a matéria seca
Manteiga de cacau 56,0 Cinzas 2,8
Teobromina 1,4 Cafeína 0,2
Polifenóis 6,5 Proteína bruta 12,0
Acúcares 1,2 Amido 6,3
Pentosonas 1,6 celulose 9,5
Ácidos carboxilicos 1,7
20
De acordo com o ICCO (International Cocoa Organization), os maiores produtores mundiais
de cacau são a Costa do Marfim com 1.242 mil toneladas na safra 2009/10, seguida por Gana
(632 mil toneladas), Indonésia (550 mil toneladas), Nigéria (240 mil toneladas), Camarões
(205 mil toneladas), Brasil (161 mil toneladas), Equador (160 mil toneladas) e Papua Nova
Guiné (50 mil toneladas) (ICCO, 2011).
O cacau foi introduzido na Bahia com sementes do Baixo Amazonas em 1756. Por mais de
dois séculos, os agricultores plantaram sementes destas introduções iniciais (Cacau Comum).
Em 1940 e 1950 as primeiras seleções foram feitas por parte das instituições de pesquisa, ou
seja, o ICB (Instituto do Cacau da Bahia), SIAL (Estação Instituto Agronômico do Leste) e
EEG (Estação Experimental de Goitacazes) que foram liberadas aos agricultores.
Ultimamente, com a criação da Comissão Executiva Comissão do Plano de Cacau (CEPLAC),
o foco foi voltado para híbridos interclonais. Mais recentemente, com a introdução da doença
da vassoura de bruxa na Bahia e Espírito Santo, programas de seleção recorrente foram
implementados com o objetivo de apoiar o desenvolvimento de clones (LOPES et al., 2011).
1.2 O beneficiamento do cacau
Do início do século XIX até o final dos anos 1970 vivemos “os tempos modernos do cacau”,
marcados por três grandes transformações técnicas: em 1828, Van Houten obteve pó de cacau
desengordurado; em 1847, Fry passou a comercializar chocolate em tablete, e Peter inventou o
chocolate ao leite em 1876. Estas foram as únicas inovações que merecem destaque, de modo
que a revolução da indústria de cacau é atual. Vários dogmas que eram considerados
inatacáveis há alguns anos estão sendo questionados. Assim é interessante acompanhar a
elaboração atual do cacau desde a plantação até o produto final (PONTILLON, 2009). Um
diagrama de blocos simplificado do beneficiamento de cacau é apresentado na Figura 2.
21
Figura 2: Etapas do beneficiamento do cacau Fonte: Adaptadode PEREGO et al., 2004 e PONTILLON, 2009
A tecnologia de colheita e pós-colheita do cacau é de enorme importância para se reunirem às
características que o fazem do chocolate produto tão apreciado. As sementes de cacau recém-
colhidas possuem cor púrpura (mais comum) ou branca, a depender da variedade plantada,
sabor amargo e odor adstringente. Somente após a chamada “cura” é que o cacau poderá ser
um produto de valor para a indústria e exportável. Aí adquire cor marrom característica, sabor
típico de cacau e qualidade boa ou má, estreitamente dependentes da cura. Inicialmente os
frutos são colhidos com podões (Figura 2), sendo amontoados no chão para serem abertos com
facões (Figura 3). A casca é, então, separada e o material interno (formado de sementes e
22
polpa) é levado à cura. Esta consiste de duas etapas. A primeira delas é a fermentação. Essa
etapa facilita a separação da polpa da semente além de proporcionar a ocorrência de uma série
de reações químicas. A segunda etapa é a secagem. Aí o cacau atinge a umidade necessária
para o armazenamento; reações químicas concomitantes estabilizam a cor marrom
característica (OETTERER, 2006).
Figura 3: Colheita do cacau Figura 4: Corte do fruto
Fonte:http://img1.photographersdirect.com/img/ Fonte:http://revistapesquisa.fapesp.br/ 2293/wm/pd1077050.jpg imgsite/%28195%29.jpg
A fase inicial da fermentação é anaeróbica. Há multiplicação de leveduras que convertem os
açúcares da polpa a etanol. Ocorre desintegração da mesma e desprendimento de um
exsudado. As leveduras, que fermentaram todo o açúcar da polpa, passam a usar o próprio
álcool etílico produzido como fonte de carbono. Por outro lado, o álcool produzido inibe o
crescimento das mesmas e ocorre autólise das células das leveduras havendo liberação das
enzimas importantes para promover o sabor e típico. Dentre as leveduras presentes as
principais espécies são Saccharomyces cerevisae e a Candida krusei, predominantes na Bahia
(OETTERER, 2006). Estudos realizados com o gênero Saccharomyces isolado de caixas de
processamento em Uruçuca, Bahia, demonstraram ser possível obter produtos de excelente
23
qualidade com essa levedura (LEVANON e MARTELLI, 1964; LEVANON e ROSSETINI,
1965).
Com a conversão dos açúcares a etanol, produz-se as condições aeróbicas iniciais necessárias
para o crescimento de bactérias que oxidam o etanol a ácido acético e posteriormente a CO2
(dióxido de carbono) e água. Isso produz mais calor e aumenta a temperatura, durante as
primeiras 24 horas, para aproximadamente 40ºC. A partir do segundo dia até o final do
processo realiza-se o revolvimento das amêndoas em intervalos regulares. Dessa forma evita-
se que a temperatura ultrapasse 45ºC, o que poderia ocasionar a inativação das enzimas
presentes. Além disso, esses movimentos permitem a aeração da massa e melhor uniformidade
da fermentação. A segunda fase da fermentação é aeróbica e ocorre via acetobactérias
presentes por contaminação natural e que também produzem ácido acético. Este se difunde no
tegumento que envolve as amêndoas tornando-o permeável e possibilitando a ação das
enzimas. Ao final do processo, as amêndoas apresentam coloração marrom intensa e aroma
agradável de vinagre (OETTERER, 2006).
Depois de três a sete dias, dependendo do local, das variedades e da qualidade almejada, a
fermentação é considerada suficiente e se passa a fase de secagem. Vale ressaltar que o efeito
primário da fermentação é aniquilar o embrião sob efeito de calor e, sobretudo, fabricar ácido
acético; segue-se certa degradação das paredes celulares ocasionando a migração de enzimas
que, por sua vez, entram em contato com os produtos sensíveis (PONTILLON, 2009).
Ao início da fermentação, Gálvez et al. (2007) determinou conteúdo de umidade das
amêndoas de 76,6% e valor de pH de 4,00. Após 144 h, o valor de pH atingiu 4,48 e a
umidade foi reduzida a 69,3%. Durante o monitoramento da fermentação a temperatura
alcançou o valor máximo de 51ºC depois de 48 h. Após a abertura das amêndoas foram
encontrados valores de 56,6 mg.g-1 matéria seca para glicose e 88,8 mg.g-1 matéria seca para
frutose.
A secagem natural, ou secagem solar, consiste em estender o cacau fermentado em áreas
cimentadas ou assoalhadas, bandejas, plásticos ou no próprio solo (PONTILLON, 2009). Um
24
método bastante utilizado é a secagem feita em barcaças (Figura 4). Estas são construções
típicas constituídas por um lastro de madeira erguido sobre pilares de alvenaria, e uma
cobertura que desliza sobre trilhos. A cobertura, geralmente feita de chapas de alumínio
corrugado ou de zinco, é afastada para expor as amêndoas ao sol e, quando fechada, protege
contra chuva, sereno e calor excessivo. As amêndoas são espalhadas sobre o lastro da barcaça
em uma camada uniforme com cerca de 5 cm de espessura. O revolvimento constante é feito
com um rodo de madeira, principalmente no início da secagem, a fim de evitar aglomerados.
O processo mais utilizado é a pré-secagem ao sol complementada com aquecimento artificial,
via estufas aquecidas por combustão de lenha ou gás liquefeito e/ou energia solar
(OETTERER, 2006).
Figura 5: Secagem do cacau feita em barcaças
Fonte: Fazenda Riachuelo. Autoria própria
A umidade do produto acabado é avaliada pelo tato e, sobretudo, pelo som das amêndoas
agitadas na mão. A secagem natural apresenta a vantagem de ser progressiva e gratuita em
energia, mas possui o inconveniente de ser demorada e exigir grande mão de obra,
particularmente quando é efetuada na estação chuvosa, algo que é muito comum. A secagem
artificial é usada, então, como substituto ou complemento. Se bem conduzida, essa secagem
propicia excelentes resultados, mas pode gerar dois tipos de defeitos. Em primeiro lugar, caso
o cacau entre em contato com gases de combustão, assumirá um desagradável gosto de
fumaça. Em segundo lugar, se a secagem for realizada de forma muito brusca, haverá o
25
ressecamento externo do cacau – a camada seca se forma de modo muito rápido, perde a
permeabilidade e a umidade interna tem dificuldade para sair, quando, aparentemente, o ácido
acético não é bem eliminado, o que gera um cacau de sabor ácido. O mesmo fenômeno ocorre
quando da secagem natural se os raios de sol forem muito intensos (PONTILLON, 2009).
Durante a secagem, as enzimas presentes atuam no interior da amêndoa e promovem as
reações químicas de cura, estabilizando o sabor, e a cor característicos do chocolate, com
acidez reduzida. A temperatura da secagem é importante na qualidade final das amêndoas. O
ideal está na faixa de 35 a 40 ⁰C, porque é ótima para as enzimas. O uso de temperaturas mais
baixas ou mais altas leva à perda na qualidade, pois as enzimas agem mais lentamente ou são
destruídas. Além disso, a secagem tem que durar um certo tempo para a ação enzimática
ocorrer. O período ótimo é de 4 a 5 dias, com umidade final de cerca de 7% (OETTERER,
2006).
A indústria recebe as amêndoas que deverão sofrer a manufatura, ou seja, a retirada do
tegumento e do germe para obtenção de “nibs” – amêndoas descascadas e trituradas – que é a
matéria-prima para a fabricação da massa de cacau, manteiga de cacau, cacau em pó e,
finalmente, chocolate. Após as operações preliminares, que consistem em limpeza para
eliminar impurezas e, eventualmente, calibragem para classificar as amêndoas por categoria de
tamanho homogêneo, a indústria tem duas opções: torração e em seguida descortificação –
remoção do tegumento das amêndoas – ou o inverso. No primeiro caso (que se inicia com a
torrefação), a descortificação é mais fácil uma vez que a casca fica bem descolada do grão;
mas, por outro lado, a homogeneidade da torração é dificultada pelo tamanho relativamente
grande da amêndoa (cerca de 22 mm de comprimento por 8 mm de espessura). No segundo
método, corre-se o risco de enriquecer os nibs com pedaços de casca que restaram, mas a
torração é mais homogênea (PONTILLON, 2009).
A torração consiste de um tratamento térmico das amêndoas de cacau com ar quente, a uma
temperatura entre 110 e 140°C; maiores valores de temperatura podem provocar um efeito de
super torração, com a conseqüente formação de gosto de queimado e perda das características
intrínsecas de cacau (DROUDEN et al. 1996 apud PEREGO et al., 2004). As condições
26
operacionais mudam em resposta às necessidades do processo e da planta; o processo de
torração pode ser realizado sob diferentes perfis de tempo-temperatura com obtenção de
diferentes resultados. A otimização de ambos, temperatura e tempo são essenciais para a
obtenção de elevada qualidade de sabor nos produtos finais (SANAGI et al., 1997 apud
PEREGO et al., 1999).
A importância da torração na tecnologia de produção de chocolate está associada aos seguintes
fatores: redução da umidade de 5-6% para 2% com perda de cerca de 6% em relação ao peso
total; formação do flavour e redução da microbiota bacteriana presente na matéria-prima
durante o processo fermentativo e o armazenamento (PEREGO et al., 1999 apud PEREGO et
al., 2004). Outro objetivo da torração é secar suficientemente os nibs, permitindo assim que
possam ser moídos (PONTILLON, 2009). O efeito do calor nos precursores do flavour de
chocolate, presentes no cacau após a fermentação e secagem, é de catalisador, liberando o
sabor característico do chocolate (OETTERER, 2006).
A etapa que segue-se à torração é a trituração. Esta permite a separação da casca por
peneiragem, ventilação e sucção. As amêndoas manufaturadas (torradas e trituradas) passam
por uma moagem e o produto, denominado massa de cacau – um líquido denso também
chamado de liquor - será a matéria prima para a produção da manteiga de cacau, do cacau em
pó (matéria-prima para os achocolatados) e do chocolate, conforme tratamento que receber.
Ao passar por prensas hidráulicas, extrai-se boa parte da manteiga de cacau presente na massa.
A torta restante dessa prensagem passa por moinhos que a pulverizam e produzem o cacau em
pó (OETTERER, 2006).
2. TORRAÇÃO DAS AMÊNDOAS
A torração do cacau é um tratamento térmico fundamental na obtenção das características de
qualidade do chocolate, pois ocorrem reações químicas que fazem com que os precursores do
sabor de chocolate (aminoácidos livres e açucares redutores), desenvolvidos durante a
fermentação, sejam convertidos em produtos responsáveis pelo sabor típico do chocolate.
Segundo Queiroz 1999, durante a torração ocorre: desenvolvimento do aroma e cor típica de
27
chocolate, principalmente pela reação de Maillard; redução dos teores de ácidos voláteis,
principalmente o ácido acético; inativação das enzimas capazes de degradar a manteiga de
cacau; redução do teor de umidade das amêndoas, de 8% para 2%, aproximadamente, e
mudança da textura dos cotilédones (mais quebradiça) (COHEN, JACKIX, 2004).
De maneira mais simplificada, a torração se realiza em duas etapas. A primeira fase é de
secagem, tem uma influência direta sobre a qualidade aromática, e também uma influência
indireta, por causa das reações posteriores que somente se realizam em meios com baixa
atividade de água. Durante a segunda fase se produz o desenvolvimento do sabor (RAMLI et al,
2006).
Estes precursores-chave de compostos de sabor durante a torração interagem e desenvolvem
compostos heterocíclicos voláteis. A formação destes compostos heterocíclicos não é
totalmente compreendido e levam à formação de pirazinas. As pirazinas são compostos
aromáticos que aumentam de concentração gradualmente com o decorrer da torração, sendo
que a diminuição do teor de algumas delas nas amêndoas de cacau é coincidente com o início
da sobretorração, devido possivelmente a uma volatilização, dado ao aumento de temperatura
(AFOAKWA et al, 2008a; QUEIROZ, GARCIA, 1999).
O sabor do chocolate é o resultado de uma mistura complexa de um grande número de
compostos, cerca de 400-500 compostos combinados, incluindo pirazinas, aldeídos, éteres,
tiazóis, fenóis, cetonas, alcoóis, furanos e ésteres, sendo assim impossível caracterizá-lo por
um único componente, otimizar as condições de torração do cacau significa desenvolver ao
máximo o potencial aromático das amêndoas. Esses compostos são formados através da
reação de Maillard e degradação de Strecker de aminoácidos e açúcares durante a torração
(QUEIROZ, GARCIA, 1999; RAMLI, 2006, FRAUENDORFER, SCHIEBERLE, 2008).
O processo de torra não apenas gera novos compostos voláteis de aromas específicos, por
meio da pirólise de açúcares, mas também gera perda de compostos secundários que afetam o
sabor final do chocolate. (NAZARUDDIN et al. 2000).
28
Para que sejam submetidas à torração, as amêndoas devem passar por um processo de limpeza,
que tem por finalidade remover materiais estranhos como: poeira, areia, madeira, pedras,
vidros e polpa de cacau, que podem produzir sabores desagradáveis. A limpeza é realizada por
meio de peneiras, corrente de ar e separadores magnéticos. Durante a etapa de limpeza
também ocorre a classificação quanto ao tamanho das amêndoas ou nibs para que a torração
seja mais uniforme (BECKETT, 2009).
Para ser torrado, o cacau pode se apresentar de diferentes formas: como amêndoas inteiras,
como nibs (amêndoas fragmentadas em pedaços menores) ou como massa liquida, a pasta de
cacau, também conhecida como liquor de cacau. Ao se utilizar nibs, ao invés de amêndoas
inteiras, como no processo convencional, a diferença de torração, devido à diferença de
temperatura nas diversas partes das amêndoas (centro, meio e superfície) é diminuída,
conseguindo-se melhor transferência de calor e, por conseqüência, redução do consumo de
energia. A pasta de cacau tem a vantagem de ter uma estrutura homogênea, particularmente no
que diz respeito à granulometria das partes sólidas, podendo-se evitar aquelas diferenças de
intensidade de tostado devido à heterogeneidade das dimensões dos nibs e das amêndoas de
cacau (LOPES, 2000).
2.1 Torração contínua e por batelada
Os primeiros equipamentos para torração de cacau funcionam por batelada e, devido ao grande
número de parâmetros que afetam o processo, cada operador do equipamento era responsável
pelo controle do tempo e temperatura necessários. Cabe ressaltar que mesmo atualmente o
controle do processo de torração depende bastante da experiência do torrador. Chairman et al.
(1970), destacam que nos torradores por batelada mais antigos o calor era transmitido por
condução, através das paredes dos cilindros (ar quente na camisa do torrador) ou então através
da passagem do ar entre os grãos, reduzindo as possibilidades de queima.
As amêndoas do cacau podem ser torradas por batelada ou processo contínuo. Hoje são mais
utilizados os torradores contínuos (figura 5), torradores tipo leito fluidizado, e ainda outra
versão de torrador que combina os princípios do processo continuo com os do leito fluidizado.
29
Em larga escala é mais conveniente utilizar torração continua. O principio da torração é
baseado na alta velocidade do ar, curto tempo e alta temperatura. O objetivo do uso deste
sistema é principalmente a rápida penetração do calor pela maximização do volume do ar
(BECKETT, 2009).
Figura 6: Torrador contínuo
Fonte: Fazenda Riachuelo. Autoria própria.
O método convencional de torração em amêndoas inteiras seja por processo continuo ou
batelada, apresenta algumas desvantagens criticas. A primeira delas seria a grande demanda de
energia necessária para penetrar a testa e atingir o cotilédone. Outra desvantagem é que a
torração nunca é uniforme devido à variação nos tamanhos dos grãos, alguns podem ser
sobretorrados ou então sofrer uma torração insuficiente (FADINI, 1998). A vantagem de torrar
amêndoas inteiras, entretanto, é que facilidade de remoção da casca (CRUZ, 2002).
Para conseguir o sabor requerido e maior padronização na torração precisa-se de um controle
tempo/temperatura, estipulados de acordo com a matéria prima e com as características do
produto desejado. Uns poucos graus podem fazer uma grande diferença. Mudanças na
qualidade no produto de cada torração podem ocorrer, não somente devido a influência da
30
relação tempo/temperatura, mas também pelas características do processo, como a velocidade
de rotação, vazão do ar, maquinário e tipo do produto (RAMLI et al, 2005).
Deve-se ressaltar que apesar dos mecanismos de torração variarem conforme as industrias, os
princípios básicos e objetivos desta etapa são sempre os mesmos.
3. REAÇÃO DE MAILLARD
Uma das mais importantes e complexas reações que envolvem a formação do flavour é a
reação de Maillard que ocorre em uma larga faixa de temperatura (100-150 ⁰C) para os vários
modelos de sistemas alimentícios (PORTE et al., 2007). Esta reação é responsável por alguns
dos mais prazerosos flavours conhecidos pelo homem. Falando de modo geral, a reação de
Maillard é uma reação entre carbonilas e aminas. Geralmente, as carbonilas em alimentos são
açúcares redutores, enquanto aminas podem vir de aminoácidos ou proteínas. Os principais
produtos finais da reação de Maillard são melanoidinas e outros compostos não voláteis.
Entretanto, mais de 3500 compostos voláteis têm sido atribuídos a esta reação. Mas, se por um
lado estes voláteis representam a menor porção (em massa) dos produtos da reação, por outro
eles são os principais contribuintes para o flavour de alimentos. Reineccius et al. (1972), por
exemplo, mostraram que enquanto 1,3 g (por 100 g de amêndoas) de açúcares redutores e
aminoácidos totais foram perdidos durante a torração de amêndoas de cacau, apenas 0,9 mg de
pirazinas foram formadas. Ou seja, apenas cerca de 0,07% dos reagentes foram transformados
em pirazinas enquanto o restante originou outros produtos. São, estes produtos minoritários
que dão a maior contribuição para o flavour (REINECCIUS, 2006).
A reação de Maillard é geralmente dividida em três estágios. O estágio inicial começa com
uma condensação entre um grupo amino e um açúcar redutor, levando a uma N-glicosilamina,
no caso do açúcar ser uma aldose, que sofre um rearranjo e forma o chamado produto
Amadori (ou Heyns se o açúcar redutor for uma cetose). O estágio intermediário inicia-se a
partir dos produtos Amadori/Heyns, levando a produtos da fragmentação do açúcar e havendo
liberação de um grupo amino. No estágio final ocorrem reações de desidratação,
fragmentação, ciclização e polimerização em que grupos amino participam novamente.
31
Especialmente em relação a formação de flavour, a chamada degradação de Strecker é de
extrema importância. Nela aminoácidos são degradados ocasionando desaminação e
descarboxilação. As várias reações possíveis tomam lugar a depender das condições de
temperatura, pH e natureza dos reagentes (por exemplo tipo de açúcar, aminoácido ou
proteína).
Uma visão geral é dada na Figura 7. Deve-se notar que no caso de proteínas e peptídeos o
grupo amino reativo é o da lisina, uma vez que os grupos α-amino estão comprometidos na
ligação peptídica e, portanto não disponíveis nem para reação de Maillard nem para
degradação de Strecker. Isso resulta em um comportamento diferente dos aminoácidos se
comparados a proteínas e peptídeos. É importante destacar que a maioria das pesquisas na área
de formação de flavour pela reação de Maillard considera misturas de açúcar e aminoácidos
livres, e dificilmente considera misturas açúcar-proteína ou açúcar-peptídeo. Com proteínas e
peptídeos, e na ausência de aminoácidos livres, a reação de Strecker não pode acontecer, e isto
tem conseqüências para a geração de flavour (van BOEKEL, 2006).
32
Figura 7: Visão geral da reação de Maillard Fonte: van BOEKEL, 2006.
33
A ocorrência da reação em alimentos é dependente de vários fatores. Temperaturas elevadas
(acima de 40ºC), atividade de água na faixa de 0,3 a 0,7, Ph na faixa de 6 a 8
(preferencialmente alcalino), umidade relativa de 30% a 70%, presença de cátions metabólicos
como Cu+2, que podem catalisar a reação, e da composição química dos alimentos
(MORALES & VAN BOEKEL, 1997).
A reação de Maillard tem desempenhado um papel importante na melhoria da
aparência e sabor dos alimentos. Tem sido um desafio importante na indústria de alimentos,
uma vez que a reação de Maillard está relacionada com sabor, aroma e cor, em especial em
processos tradicionais, tais como a torração de grãos de café e cacau, o fermento de pão e
bolos, a queima de cereais e do cozimento da carne. Além disso, durante a reação de Maillard
uma vasta gama de produtos é formada com uma importância significativa para o valor
nutritivo dos alimentos. A reação de Maillard pode ser reduzido por diminuição da
digestibilidade e, possivelmente, a formação de compostos tóxicos e mutagénicos.No entanto,
a reacção de Maillard é notoriamente difícil de controlar. Vários fatores envolvidos no
processamento de alimentos podem influenciar e eles podem ser considerados como variáveis
para acelerar a reação (NASS et al., 2007).
Muitos artigos discutem uma abordagem de pesquisa projetada para aumentar a compreensão
da química da reação e sua influência sobre as propriedades dos alimentos como cor, sabor e
valor nutricional, e como os atributos de qualidade associado com reação de Maillard, pode ser
previsto e controlado por modelagem cinética. Parâmetros de processamento como
temperatura, ph, torração de grãos de café e cacau podem ser controlados através de
modelagem cinética.
A reação de Maillard confere e influencia atributos sensoriais fundamentais para aceitação de
alimentos termicamente processados, com a geração de compostos voláteis responsáveis pelo
aroma e sabor (aldeídos e cetonas) e pela cor (melanoidinas) e interferência na textura
(CHARISSOU et al, 2007a e RADA-MENDONZA et al, 2004). Por outro lçado pode originar
compostos potencialmente tóxicos como a acroleína e as aminas heterocíclicas aromáticas.
34
3.1. Produtos de reação de Maillard – 5-hidroximetilfurfural
A reação de Maillard é a reação química mais importante do processamento de alimentos
provocando alterações no sabor, aroma, cor e textura. A extensão da reação de Maillard em
alimentos pode ser monitorada pela formação de alguns compostos, o que permite avaliar a
intensidade do processamento térmico e as alterações nutricionais relacionadas a ele. Entre
eles estão: a furosina, o hifdrometilfurfural e a carboximetillisina. Estes indicadores são
precursores dos pigmentos formados na fase final da reação de Maillard.
O 5-hidroximetilfurfural é um composto furânico que se forma como um intermediário na
reação de Maillard (MR) (Ames, 1992) e a partir da desidratação de açúcares, em condições
ácidas (caramelização) durante os tratamentos térmicos aplicados aos alimentos (Kroh, 1994).
Os açúcares redutores reagem de modo reversível com a amina para formar a base de Schiff.
Como demonstrado na Figura 4, a base de Shiff é submetida a uma reação chamada de
rearranjo de Amadori para originar , um derivado do 1-amino-1 desoxi-cetose. 3-Desoxiosona
é conhecido como o intermediário chave na formação do HMF. Decorre de 1,2 enolização e
desidratação da glicose ou frutose. A desidratação adicional e ciclização formam o 3-
deoxyosone 5 - hidroximetilfurfural.
Em condições ácidas, o HMF pode formar-se mesmo na baixas temperaturas (Lee & Nagy,
1990), apesar de suas concentrações, aumenta drasticamente as temperaturas altas de
tratamentos térmicos ou armazenamento.
A Figura 8 mostra os principais caminhos para a formação de HMF em alimentos. Além da
temperatura, a taxa de formação de HMF em alimentos depende do tipo de açúcar (Lee &
Nagy, 1990), o pH (Gökmen, Acar, Köksel, e Acar, 2007), e também atividade da água
(Gökmen, Acar, Serpen , e Morales, 2008; Kroh, 1994).
O HMF tem sido estudado em produtos alimentícios que sofrem danos térmicos e contendo
altas concentrações de carboidratos, tais como: frutas processadas, vegetais desidratados, café,
35
mel e leite. Além disso, seus derivados revelaram-se citotóxicos, genotóxicos e carcinogênicos
(GLATT et al. ,2005).
Figura 8 – Esquema de formação do 5-hidroximetilfurfural. Adaptado por Perez-Locas and Yaylayan (2008).
36
4. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
Para garantir que um método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a
amostra, ele deve passar pelo processo de validação. Com isso, o método torna-se capaz de
mostrar qualidade nas medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e
confiabilidade (RIBANI, 2004).
O desenvolvimento de um novo método analítico ou a adaptação ou aplicação de um método
conhecido envolve um processo de avaliação que ateste a sua eficiência em usos em rotina,
denominado validação (THOMPSON, 2002). O Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO) define validação como a comprovação,
através do fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso
específico foram atendidos.A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003)
considera que “a validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos
resultados”.Na validação de métodos cromatográficos, os parâmetros analíticos normalmente
determinados são: seletividade; linearidade; precisão; exatidão; faixa linear; robustez; limite
de detecção e limite de quantificação (RIBANI, 2004).
A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar o analito de maneira
inequívoca na presença de outras substâncias susceptíveis de interferência na determinação
(LANÇAS, 2004). A seletividade garante que o sinal obtido na resposta seja exclusivamente
do composto de interesse.
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais
à concentração do analito, enquadrados em faixa analítica especificada. Também corresponde
à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da
substância em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação (ICH, 1995). É obtida por
meio de curvas de calibração construídas relacionando à resposta do equipamento em função
de várias concentrações do analito em estudo (LANÇAS, 2004).
37
O parâmetro que avalia a proximidade entre várias medidas efetuadas na mesma amostra é a
precisão do processo analítico. A expressão da concordância entre vários resultados analíticos
obtidos para uma mesma amostra é chamada de precisão (LANÇAS, 2004). A precisão
representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma
amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas (ICH, 1995).
A exatidão, definida como a concordância entre o valor real do analito na amostra e o
estimado pelo processo analítico, constitui a chave para o propósito da validação. A exatidão
representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um
determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (RIBANI, 2004). O
numero de ensaios varia segundo a legislação ou diretriz adotada e também com as
características da pesquisa. Segundo ICH (1995) e BRASIL (2003c) deve-se utilizar um
mínimo de nove determinações envolvendo um mínimo de três diferentes níveis de
concentração, ou seja, ensaios em triplicata para três níveis de concentração. O ensaio de
recuperação constitui o método mais utilizado para validação de processos analíticos. A
recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de determinado analito,
recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra. A exatidão é
expressa como erro sistemático percentual, inerente ao processo. O erro sistemático ocorre
pela perda da substância devido à baixa recuperação da extração, medidas volumétricas
imprecisas ou substâncias interferentes na amostra (entre outros) (ICH, 1995).
O limite de quantificação (LOQ) é definido como a menor concentração do analito, que pode
ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis, sob as condições
experimentais adotadas. Pode ser estimado por meio do sinal/ruído, do desvio-padrão e por
processos estatísticos. Limite de detecção (LD) corresponde à menor quantidade de um analito
que pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada como um valor exato
(LANÇAS, 2004).
Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH), a robustez do método é a
medida da sua capacidade de permanecer inalterado sob pequenas, mas estudadas variações
nos parâmetros do método e prover indicação da sua dependência durante o uso normal . A
38
avaliação da robustez pode ser considerada durante a fase de desenvolvimento e depende do
tipo de processo em estudo. Nos testes de robustez são aplicados experimentos estatísticos que
examinam, simultaneamente, os efeitos de alterações em diferentes variáveis do método. No
caso de métodos cromatográficos, as variações referem-se a diferentes tipos de colunas,
temperatura e fluxo, entre outras. Os testes de robustez, em geral, servem para indicar os
fatores que podem influenciar, significantemente, a resposta do método estudado. Tal fato
fornece a dimensão do problema que ocorre quando o método é repetido em diferentes
condições ou é transferido, por exemplo, para outro laboratório (VAN DER HEYDEN, 1999).
39
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45
CAPÍTULO II
INFLUÊNCIA DO PROCESSO DE TORRAÇÃO DE AMENDOAS DE CACAU
Theobroma cacao L. NOS ASPECTOS FISICO-QUIMICOS, ATIVIDADE DE ÁGUA E
QUANTIFICAÇÃO DO HIDROXIMETILFURFURAL
RESUMO
As reações que ocorrem durante a torração são afetadas por fatores tais como tempo,
temperatura, atividade de água, pH, assim como pela concentração dos precursores dos
compostos aromáticos. Com isso, o presente estudo objetivou avaliar a influência da torração
de amêndoas de cacau submetidas a diferentes tempos e temperatura nos aspectos físico-
químicos, atividade de água e quantificação do hidroximetilfurfural. Para o processo de
torração de cacau, o experimento foi conduzido a partir de amêndoas de cacau, fermentadas e
secas, processadas na Fazenda Riachuelo localizada na região sul do estado da Bahia. A
metodologia utilizada para os aspectos físico-químicos foi segundo Association of Official
Analytical Chemists e atividade de água foi determinada através da quantificação da
fugacidade de água através da constate dielétrica em equipamento AQUALAB. O método
utilizado para quantificação do hidroximetilfurfural foi cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE). Na avaliação do teor de proteínas, no experimento utilizando temperatura de 160°C,
existem diferenças significativas entre os tempos 20, 40 e 60 minutos. Os resultados deste
estudo demonstraram que os aspectos físico-químicos das amêndoas torradas em diferentes
tempos e temperaturas apresentaram diferenças significativas. A redução do teor de proteínas
durante os experimentos realizados a temperatura de 160°C, pode ser considerado como
indicativo de uma ativação da reação de Maillard, com a conseqüência da produção dos seus
produtos e perda de aminoácidos nas fontes de proteínas. A concentração do
hidroximetilfurfural aumenta com o decréscimo da atividade de água e esse aumento pode está
relacionada com a velocidade de oxidação de lipídios, favorecida pelo acréscimo da
temperatura, contribuindo assim para a formação do hidroximetilfurfural como produto da
reação de Maillard.
Palavras-chave: Amêndoas secas e torradas, carboidratos, proteínas, lipídios.
46
ABSTRACT
The reactions that occur during roasting are affected by factors such as time, temperature,
water activity, pH, and the concentration of the precursors of aromatic compounds. Thus, the
present study aimed to evaluate the influence of roasting of cocoa beans subjected to different
time and temperature on the physical-chemical aspects, water activity and quantification of
hydroxymethylfurfural. For the process of roasting cocoa, the experiment was conducted from
cocoa beans, fermented and dried, processed in Riachuelo Farm located in the southern region
of Bahia. The methodology used for the physico-chemical aspects was second to Association
of Official Analytical Chemists and water activity was determined by measuring the fugacity
of water through the dielectric finds in AQUALAB equipment. The method used for
quantification of hydroxymethylfurfural was high performance liquid chromatography
(HPLC). In the evaluation of protein content using the experimental temperature of 160 ° C,
there are significant differences between the 20, 40 and 60 minutes. The results of this study
demonstrated that the physico-chemical studies of roasted almonds in different times and
temperatures significantly different aspects. The reduction of protein content during the
experiments the temperature of 160°C, can be considered as indicative of an activation of the
Maillard reaction, as a result of the production of their products and loss of amino acids in
protein sources. The hydroxymethylfurfural concentration increases with decreasing water
activity and this increase is related to the rate of oxidation of lipids, favored by higher
temperature, thus contributing to the formation of hydroxymethylfurfural as a product of the
Maillard reaction.
Keywords: dried and toasted almonds, carbohydrates, proteins, lipids.
47
1. INTRODUÇÃO
O cacau é um fruto muito popular, a partir de suas sementes é obtido um dos alimentos mais
conhecidos e apreciados: o chocolate. O cacaueiro está classificado dentro do gênero
Thebroma, família das Esterculiáceas. Sua primeira citação bibliográfica foi feita por Charles
de l’ Ecluse que o denominou como Cacao fructus. Em 1937, foi descrito como Theobroma
fructus por Linneu, que em 1753 propôs o nome Theobroma cacao, que permanece até hoje
(SODRÉ, 2007).
A formação do aroma característico do chocolate envolve três etapas: fermentação, secagem e
torrefação. Carboidratos, aminoácidos e polifeóis são importantes percursores do aroma de
cacau e do chocolate (BATALHA, 2009).
A fermentação correta é importante na obtenção de um bom aroma ao chocolate. Antes de se
proceder a fermentação, os frutos do cacau são colhidos bem maduros, garantindo assim que
as substâncias presentes na composição dos frutos já tenham sido completamente sintetizadas.
Após a colheita os frutos ficam em repouso de dois a três dias, em seguida são cortados e
retirados a poupa. Esta é armazenada em cochos de fermentação, onde ficarão de quatro a sete
dias (FERRÃO, 2007).
Após a fermentação, as amêndoas ainda contêm muita umidade. O processo de secagem visa
eliminar a água excedente. Na terceira e ultima etapa, a torração, os compostos obtidos na
fermentação e concentrados na secagem, sofrerão reações de fragmentação ou combinação
para originar novos compostos importantes para obtenção do aroma típico da amêndoa torrada
(EFRAIM et al, 2010). É na torração que ocorre às reações de Maillard, onde açúcares e
aminoácidos combinam-se para gerar a cor, e apurar o sabor e aroma.
A torração é um tratamento térmico fundamental no processamento de chocolate e suas
condições dependem de fatores como: variedade do cacau, tratamentos anteriores à torração,
umidade e características de sabor desejadas. Em condições ótimas, na torração há o
desenvolvimento máximo do potencial aromático da amêndoa. É uma operação térmica
48
caracterizada pelos seguintes fenômenos: perda do teor de água; diminuição dos ácidos
voláteis indesejáveis (principalmente acético); inativação de enzimas que podem degradar a
manteiga de cacau; desenvolvimento de aromas desejáveis através da Reação de Maillard
partindo dos precursores formados na etapa de fermentação e o desenvolvimento da coloração
típica do chocolate (DRUMMOND, 1998; LOPES et al, 2003; EFRAIM, 2004).
Já as reações que ocorrem durante a torração são afetadas por fatores tais como tempo,
temperatura, atividade de água, pH, assim como pela concentração dos precursores dos
compostos aromáticos. A torração é uma etapa extremamente importante na tecnologia do
processamento do cacau e fabricação do chocolate, devendo-se adotar diferentes associações
de tempo e temperatura conforme as características sensoriais e tecnológicas que se deseja
obter no produto final (MINIFIE, 1999). A eficiência do processo de torração é obtida pelo desenvolvimento máximo do potencial
aromático das amêndoas utilizando tempos de processamento que podem ser mais curtos e,
conseqüentemente, viabilizando uma redução de custo deste processo na indústria FADINI
(1998) verificou que a torração de cacau na forma de nibs, à temperatura de 150°C durante 38
minutos, é considerada ideal para o desenvolvimento máximo do sabor e aroma de chocolate.
QUEIROZ (1999) determinou que o tempo mais indicado para torração de amêndoas inteiras
de cupuaçu foi de 42 minutos a uma temperatura de 150°C.
A torração é a operação tecnológica mais importante no processamento de grãos de cacau.
Traz a formação de características de cor marrom, aroma suave e a textura dos grãos torrados.
Torração convectiva é o método mais comumente usado para o processamento térmico de
grãos de cacau, que são expostos a temperaturas de 130-150C para 15-45 min (RAMLI et al,
2005).
As recentes atividades com variedades diferentes de cacau têm estimulado a produção de
chocolate por micro e pequenas empresas nas micro-regiões produtoras de cacau. Desta forma,
há também o interesse em, através deste estudo, auxiliar, orientar e otimizar a produção nestas
49
micro e pequenas empresas, como forma de contribuir para o desenvolvimento econômico e
tecnológico local.
Com isso, o presente estudo objetivou avaliar a influência da torração de amêndoas de cacau
secas e torradas submetidas a diferentes tempos e temperatura nos aspectos físico-químicos,
atividade de água e quantificação do hidroximetilfurfural.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Torração das amostras
Para o processo de torração de cacau, o experimento foi conduzido a partir de amêndoas de
cacau, fermentadas e secas, com tamanhos definidos como grandes e médios, processadas na
Fazenda Riachuelo localizada na região sul do estado da Bahia. O planejamento foi realizado
em torrador apropriado existente em uma planta de processamento de chocolate da fazenda,
onde foram estabelecidos faixas de interesse experimental (níveis) para cada um dos fatores,
tendo como variáveis independentes o tempo (t) e temperatura (T), conforme tabela abaixo.
Tabela 1 – Planejamento experimental utilizando como variáveis independentes o tempo (t) e temperatura (T)
Experimento Temperatura (ºC)
Tempo (min)
1 80 20 2 80 40 3 80 60 4 120 20 5 120 40 6 120 60 7 160 20 8 160 40 9 160 60
50
2.2 Aspectos físico-químicos
2.2.1 Umidade
Association of Official Analytical
Chemists ( AOAC, 2005).
2.2.2 Cinzas
O teor de cinzas foi determinado por método gravimétrico de acordo com o Association of
Official Analytical Chemists (AOAC, 2005), usando forno mufla a 550°C.
2.2.3 Lipídios
O teor de lipídios totais determinado pelo método de extração direta com solvente orgânico
(éter etílico) em aparelho de Soxhlet por 24 horas para maior eficiência na extração da
gordura, de acordo com a metodologia preconizada Association of Official Analytical
Chemists - AOAC (2005).
2.2.4 Proteínas
A proteína foi determinada pelo conteúdo de nitrogênio total (%), segundo método
microKjeldahl, usando-se o fator 6,25 para a conversão do nitrogênio em proteínas, descrito na
AOAC (2005).
2.2.5 Carboidratos
Os carboidratos foram obtidos por diferença, ou seja, foi efetuada a somatória dos resultados
obtidos para umidade, proteínas, resíduo mineral e lipídios, e este valor foi subtraído do valor
100, que se refere ao conteúdo integral (100%) das amostras (INSTITUTO ADOLFO LUTZ,
2008).
51
2.3. Atividade de água
A atividade de água foi determinada através da quantificação da fugacidade de água através da
constate dielétrica em equipamento AQUALAB, com exatidão ±0,015 e resolução 0,001,
devidamente calibrado.
2.4. Quantificação do hidroximetilfurfural
2.4.1 Reagentes e soluções
Todas as soluções foram preparadas utilizando água purificada usando um sistema Milli-Q
(Millipore, USA). O ferrocianeto de potássio e acetato de zinco apresentavam grau P.A.
adquiridos da empresa Vetec (Brasil). A fase móvel utilizada foi composta de água acidificada
com ácido fórmico grau HPLC (Merck) e acetronitrila também grau HPLC . O padrão de
hidroximetilfurfural foi obtido da marca Merck (EUA) e apresentava pureza de 98%. A fase
móvel foi filtrada através de uma membrana de celulose regenerada 0,45 μm (Millipore) para
remover todas as impurezas.
2.4.2 Equipamento e condições cromatográficas
Os equipamentos utilizados foram: multiprocessador de alimentos Walita;balança analítica
Shimadzu; agitador tipo vortex Phoenix; centrífuga refrigerada Eppendor. O sistema de
cromatografia líquida CLAE utilizado é composto de uma bomba série 200, válvula de
amostragem, loop de 20 μL e um detector de Series 200 UV/VIS, Perkin Elmer (USA). A
separação do analito foi realizado utilizando-se uma coluna RP-C18 (250 mmx 4,6 mm, 5 μm
de tamanho de partícula, Thermo, USA) ajustada a temperatura de 32°C. O volume da amostra
injetada de 20 μL.
52
A fase móvel utilizada foi água acidificada com 0,1 % de ácido fórmico e acetronitrila nas
concentrações de 95:5 (v/v); fluxo de 1 mL min-1 sob condições isocráticas. A quantificação
foi realizada por padronização externa empregando-se curva de calibração de 9 pontos
(RUFIAN-HENARES et al., 2006b) e leitura 280 nm. A identificação foi realizada por
comparação de espectros de absorção e pelo tempo de retenção do padrão puro.
2.4.3 Extração do hidroximetilfurfural
A extração do hidroximetilfurfural em amêndoas torradas de cacau foi realizada segundo
RUFIAN-HENARES et al., (2006b) com algumas modificações. Primeiramente pesaram-se
500 mg de amostra em tubos de centrifuga de 50 mL. Adicionaram-se 5 mL de água ultrapura
e agitou-se vigorosamente por 5 min. Centrifugou-se a 5880 rpm por 10 minutos a 4°C e o
sobrenadante foi coletado em tubo de centrifuga de 50 mL. Duas novas extrações foram
realizadas com 5 mL de água ultrapura e os sobrenadantes foram combinados. Após o
sobrenadante combinados, a amostra foi lavada com 3 mL de água ultrapura e adicionadas
0,125 ml de cada uma das soluções de Carrez I e II e centrifugada a 5880 rpm por 10 minutos
a 4°C. O sobrenadante foi combinado e a mistura de sobrenadantes foi clarificada com 0,125
ml de cada uma das soluções de Carrez I e II e centrifugada a 5880 rpm por 10 minutos a 4°C.
O sobrenadante adicionado em um novo tubo de centrifuga de 50 mL. A amostra foi lavada
mais uma vez com 2 mL de água ultrapura e adicionadas 0,125 ml de cada uma das soluções
de Carrez I e II e centrifugada a 5880 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
combinado e mais uma vez foi clarificada com 0,125 ml de cada uma das soluções de Carrez I
e II e centrifugada a 5880 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e o volume
completado para 25 mL com água ultrapura. Uma alíquota de 2 mL foi filtrada (0,45 μm) e
analisada por CLAE.
2.5 Análise estatística
A análise estatística foi realizada aplicando o teste ANOVA utilizando o programa
SPSS (SPSS Inc., Chicago, EUA). Na composição centesimal, quando as hipóteses foram
53
rejeitadas (o valor de p <0,05 foi considerado significativo), foram utilizados os testes não-
paramétricos de Tukey HSD, LSD e Bonferroni. Na avaliação da quantificação de HMF em
amêndoas de cacau em diferentes tempos e temperaturas e atividade de água foram utilizados
testes de comparação múltipla, como Scheffé, Fisher (LSD) e Bonferroni para comparações
pareadas. Todas as análises foram realizadas em sextuplicatas.
3. Resultados e discussão
As análises de composição centesimal das amêndoas torradas a temperatura de 80ºC, 120ºC e
160° C apresentaram os seguintes resultados como mostra a tabela 2 abaixo:
Tabela 2: Aspectos físico-químicos de amêndoas torradas a 80°C., 120ºC e 160° C durante 20, 40 e 60 minutos.
Médias ± desvio padrão, n=6 com letras diferentes em uma mesma coluna indicam diferença significativa
(p<0.001).
Na avaliação de comparações pareadas utilizando testes de comparações múltiplas de Tukey
HSD, LSD e Bonferroni na quantificação do teor de umidade em amêndoas de cacau torradas
em diferentes tempos e temperaturas, concluiu-se que todos os níveis do fator temperatura (p
<0,001) e tempo (p <0,001) são significativamente diferentes.
Experimentos
Umidade g/100g
Cinzas g/100g
Proteínas g/100g
Lipídios g/100g
Carboidratos g/100g
1 5,45 ±0,09ª 3,26±0,07ª 15,53±0,56 ª 32,11±0,55 ª 43,72±1,30 ª 2 5,20±0,00 b 3,19±0,03ª 15,21±0,40 ª 33,45±2,18 ª 42,95±2,25 ª 3 4,96±0,08c 3,24±0,02ª 15,22±0,14 ª 36,57±0,38 ª 40,01±0,53 ª 4 3,84 ±0,02d 3,37±0,05b 14,50±0,15 ª 27,99±2,29 b 50,30±2,31 b 5 3,13±0,07e 3,50±0,08 b 14,46±0,41 ª 29,95±1,40 b 48,96±1,19 b 6 2,79±0,07f 3,42±0,07 b 14,81±0,28 ª 33,09±0,84 b 45,89±1,35 b 7 1,25±0,03 g 3,47±0,01 b 14,59±0,30 b 33,99±1,01 b 46,70±0,81 c 8 1,23±0,03 h 3,45±0,04 b 13,39±0,26c 30,49±0,40 b 51,44±0,51 c 9 1,09±0,02 i 3,42±0,02 b 12,43±0,15 d 25,50±1,00 b 57,56±0,91 c
54
Analisando a Figura 1 observa-se uma influência linear do tempo e temperatura sobre a redução
do teor de umidade nas amêndoas de cacau torradas, durante os experimentos realizados no
processo de torração. Aumentando-se o tempo e a temperatura verifica-se que ocorrem perdas
significativas no teor de umidade, perdas que podem chegar a 80% nos tratamentos com
temperaturas mais elevadas.
Figura 01. Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do
ajuste do modelo de análise de variância do teor de umidade encontrada na Tabela 2
Segundo Tabela 2, para o parâmetro cinzas existem diferenças entre os níveis de temperatura
(p<0.001). Utilizando os testes de comparação múltipla de Tukey HSD, LSD e Bonferroni,
conclui-se que existem diferenças significativas entre as temperaturas 80 e 120°C (p<0,001), e
entre 80 e 160°C (p<0,001). Mas não existem diferenças significativas entre as temperaturas de
120 e 160°C (p=0.548) e entre os níveis de tempo.
Tabela 3: Aspectos físico-químicos de amêndoas fermentadas e secas não submetidas ao processo de torração.
Experimentos
Umidade g/100g
Cinzas g/100g
Proteínas g/100g
Lipídios g/100g
Carboidratos g/100g
55
Na avaliação do teor de proteínas, existem diferenças significativas entre as temperaturas de 80
e 160°C (p<0.001), entre 120 e 160°C (p<0.001). Avaliando a temperatura de 160°C, existem
diferenças significativas entre os tempos 20, 40 e 60 minutos.Comparando o teor de proteínas
de amêndoas não submetidas ao processo de torração (Tabela 2) com as amêndoas torradas a
temperatura de 160°C, observa-se uma redução significativa no teor de proteínas.
A redução de proteínas conforme Gráfico 2, pode está associada principalmente a reação de
Maillard, na qual ocorre o consumo de aminoácidos livres durante tratamentos térmicos de
amêndoas de cacau (MERMET et al.,1992; BRITO, 2000). Portanto, a redução considerável do
teor de proteínas durante os experimentos realizados a temperatura de 160°C seria um
indicativo de uma ativação da reação de Maillard, com a conseqüência da produção dos seus
inúmeros produtos e perda de aminoácidos nas fontes de proteínas, que participam do sabor dos
alimentos tratados termicamente.
Amêndoas sem torração
5,45 ±0,09 3,30±0,07 16,57±0,17 33,76±0,19 40,92±0,16
56
Figura 02 Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do
ajuste do modelo de análise de variância do teor de proteínas encontrada na Tabela 2.
As amostras analisadas apresentaram teor de carboidratos superior a 40 % enquanto os teores
de lipídios, variando de 36,57 % a 25,50 %. Em relação ao teor de lipídios, utilizando os testes
de comparação múltipla de Tukey HSD, LSD e Bonferroni, conclui-se que existem diferenças
significativas entre as temperaturas 80 e 120°C (p<0.001), e entre as temperaturas 80 e 160°C
(p<0.001). De acordo com a Tabela 2, o teor de carboidratos apresentou diferenças
significativas entre todos os níveis de temperaturas estudadas (p<0.001). Os teores médios de
macronutrientes encontrados por LOPES et al. (2003) com amêndoas torradas a 120° C são
semelhantes ao encontrados nessa pesquisa. Os valores de umidade, proteínas, lipídios, cinzas
em base úmida são respectivamente: 4,07%, 13,49%, 33,59% e 3,05%.
A atividade de água tem sido considerada como uma propriedade fundamental no controle de
qualidade de alimentos, uma vez que expressa o teor de água que se encontra no estado livre
(ALZAMORA, 1984). As análises de atividade de água das amêndoas torradas a temperatura de
80ºC , 120ºC e 160°C apresentaram os seguintes resultados como mostra a tabela abaixo:
Tabela 4. Concentração média de hidroximetilfurfural em (mg.kg-1) e atividade de água (Aw) das amostras de amêndoas de cacau secas e torradas em diferentes temperaturas e tempo.
Experimento Temperatura
(ºC)
Tempo
(min)
Concentração de
HMF mg.kg-1
Atividade de
água (Aw)
1 80 20 0,00 0,523 2 80 40 0,02 0,396 3 80 60 0,10 0,287 4 120 20 1,02 0,315 5 120 40 1,84 0,264 6 120 60 2,54 0,219 7 160 20 2,63 0,115 8 160 40 2,68 0,103 9 160 60 2,28 0,093
57
Os valores de atividade de água dos experimentos variam de 0,093 a 0,523. Observou-se
também que o acréscimo de tempo e temperatura de torração favoreceu para o decréscimo no
teor de atividade de água. Em alguns alimentos, a remoção contínua de água resulta na
aceleração da oxidação de lipídios. A concentração do hidroximetilfurfural aumenta com o
decréscimo da atividade de água. Esse aumento da concentração de hidroximetilfurfural pode
está relacionada com a velocidade de oxidação de lipídios, favorecida pelo acréscimo da
temperatura e formação dos produtos de oxidação (aldose e cetose), contribuindo assim para a
formação do hidroximetilfurfural como produto da reação de Maillard (BOBBIO; BOBBIO,
2001; FENNEMA,2010; SOLER, 1991; TURQUOIS, 1999).
A correlação entre temperatura e tempo na concentração de Hidroximetilfurfural a atividade
de água encontradas nas amêndoas torradas foi avaliada utilizando ANOVA. Pode concluir-se
que existe diferença significativas entre as temperaturas (p <0,001) e os tempos (p <0,001)
estudadas nos experimento tanto para concentração do hidroximetilfurfural quanto atividade
de água. Como esperado, não existe diferença significativas entre as replicatas de cada
experimento (p = 0,954) .
4. Conclusão
Os resultados deste estudo demonstraram que os aspectos físico-químicos das amêndoas
torradas em diferentes tempos e temperaturas apresentaram diferenças significativas. Na
avaliação do teor de umidade, aumentando-se o tempo e a temperatura observaram-se perdas
significativas, que atingiram 80% nos tratamentos com temperaturas mais elevadas.
Em relação ao teor de proteínas, verificou-se uma diferença significativa na torração das
amêndoas a 160°C, nos tempos de 20, 40 e 60 minutos. Também foi observada uma redução
considerável do teor de proteínas durante os experimentos realizados a temperatura de 160°C,
que pode ser considerado como indicativo de uma ativação da reação de Maillard, com a
58
conseqüência da produção dos seus produtos e perda de aminoácidos nas fontes de proteínas. O
teor de carboidratos apresentou diferenças significativas entre todos os níveis de temperaturas
estudadas (p<0.001), e na avaliação do teor de lipídios não houve diferenças significativas entre
os níveis de temperaturas a 120°C e 160°C.
Observou-se que o acréscimo de tempo e temperatura de torração favoreceu para o decréscimo
no teor de atividade de água. A concentração do hidroximetilfurfural aumenta com o
decréscimo da atividade de água e esse aumento pode está relacionada com a velocidade de
oxidação de lipídios, favorecida pelo acréscimo da temperatura, contribuindo assim para a
formação do hidroximetilfurfural como produto da reação de Maillard. Além disso, existe um
efeito de interação entre os fatores temperatura e tempo (p <0,001) tanto na avaliação da
atividade de água, bem como concentração do hidroximetilfurfural.
59
REFERÊNCIAS
ALZAMORA, S. M. Preconservacion de frutas por métodos combinados. In: CONGRESSO MUNDIAL DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 1984, Buenos Aires. Anais... Buenos Aires: [s.n.], 1984. ASSOCIATION of Official Analytical Chemists – AOAC International Official Methods of Analyses. 2005, 18 ed. Washinglton D.C. BATALHA, P. G. Caracterização do cacau catongo de São Tomé e Príncipe. Lisboa. 2009. Mestrado (Mestre em Engenharia de Alimentos – Tecnologia de Produtos vegetais) Universidade Técnica de Lisboa. Instituto Superior de Agronomia. Lisboa – Portugal. BOBBIO, P.A.; BOBBIO, F.O. Química do processamento de alimentos. 3.ed., São Paulo: Varela, 2001. BRITO, E.S. Estudo de mudanças estruturais e químicas produzidas durante a fermentação, secagem e torração de cacau (Theobroma cacao L.) e propostas de tratamentos para o melhoramento do sabor. Campinas, 2000.134p. Tese de doutorado. Faculdade de Engenharia de Alimentos.UNICAMP. DRUMOND, M.CM. Relação entre o grau de torração do cacau (Theobroma cacao L.), sua qualidade nutricional e atributos sensoriais. Campinas, 1998, 127p. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Engenharia de Alimentos.UNICAMP. EFRAIM, Priscilla et al. Influência da fermentação e secagem de amêndoas de cacau no teor de compostos fenólicos e na aceitação sensorial. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 4 jan. 2009, Campinas, n. , p.262-267,. EFRAIM, P. Estudo para minimizar as perdas de flavonóides durante a fermentação de sementes de cacau para produção de chocolate. 2004. 126p. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. Campinas – SP. EFRAIM, P.; PEZOA-GARCÍA, N. H.; JARDIM, D. C. P.; NISHIKAWA, A.; HADDAD, R.; EBERLIN, M. N. Influência da fermentação e secagem de amêndoas de cacau no teor de compostos fenólicos e na aceitação sensorial. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 30, n. 1, p. 142-150, 2010. FENNEMA, O.R. Química de alimentos. 4ªed. – Editora Artmed, 2010. FERRÃO, José Eduardo Mendes. A «MORTE DA SEMENTE» SUA IMPORTÂNCIA NA TECNOLOGIA PÓS-COLHEITA DO CACAU. Revista De Ciências Agrárias, 18 jul. 2007, São Paulo, n. , p.262-267.
60
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61
CAPÍTULO III
INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA E TEMPO DE TORRAÇÃO NA
CONCENTRAÇÃO DO 5-HIDROXIMETILFURFURAL EM AMÊNDOAS DE
CACAU Theobroma cacao L
RESUMO
O cacau é um fruto muito popular, pois a partir de suas sementes é obtido um dos alimentos
mais conhecidos e apreciados: o chocolate. Seu sabor é condicionado não apenas a atributos
genéticos do cacaueiro (variedade), como também a modificações que ocorrem durante seu
beneficiamento. A torração das amêndoas do cacau tem como objetivo fundamental completar
o desenvolvimento das reações químicas responsáveis pela formação das características
sensoriais de sabor e cor do chocolate iniciadas durante a fermentação. Durante a torração do
cacau ocorre o desenvolvimento de aromas, principalmente pela Reação de Maillard, a partir
dos precursores formados durante a fermentação. O 5-hidroximetilfurfural (HMF) é um
composto intermediário formado naturalmente pela reação de Maillard que pode ser formado
também pela degradação de hexoses a altas temperaturas. Os objetivos deste trabalho foram
otimizar e validar um método que utiliza cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para
determinação do HMF em amostras de amêndoas de cacau torradas provenientes do sul do
estado da Bahia submetidas à torração em diferentes tempos e temperaturas, e avaliar a
influência da temperatura e tempo de torração na concentração do HMF, visando contribuir no
controle de qualidade da produção de chocolate. O método utilizado foi cromatografia líquida
de alta eficiência. No processo de validação, as recuperações médias obtidas variaram de
81,20 a 85,95 %, o que representa de acordo com as normas internacionais, uma boa precisão.
Foram escolhidas para avaliar a robustez as variáveis: massa, tempo de agitação e volume do
solvente extrator. A variável tempo de agitação não apresentou resultados eficazes em relação
à robustez. O método mostrou-se eficaz para a determinação do HMF nos experimentos
estudados. O teor de HMF nas amêndoas de cacau durante a torração mostrou um aumento
linear na concentração, mas a importância de avaliar uma melhor temperatura e tempo de
62
torração, otimizando o processo tecnológico de fabricação do chocolate, está diretamente
relacionada à avaliação sensorial, visando a produção de chocolate de qualidade superior.
Palavras-chave: cacau, cromatografia de alta eficiência, validação, 5-hidroximetilfurfural.
ABSTRACT
Cocoa is a very popular fruit, because from its seeds is obtained one of the most popular and
appreciated foods: chocolate. Its flavor is conditioned not only genetic attributes of cocoa
(variety), as well as the changes that occur during its processing. The roasting of cocoa beans
has as primary goal to complete the development of the chemical reactions responsible for the
formation of the sensory characteristics of flavor and color of chocolate initiated during
fermentation. During roasting the cocoa flavor development occurs primarily by the Maillard
reaction, formed from precursors during fermentation. 5-hydroxymethylfurfural (HMF) is an
intermediate compound formed naturally by the Maillard reaction can also be formed by the
degradation of hexoses to high temperatures. The objectives of this study were to optimize and
validate a method using high performance liquid chromatography (HPLC) for the
determination of HMF in samples of roasted cocoa beans from the southern state of Bahia
subjected to roasting at different times and temperatures, and to evaluate the influence of
temperature and time of roasting in the concentration of HMF, aiming to contribute to the
control of production quality chocolate. The method used was HPLC liquid chromatography.
In the validation process, the average recoveries ranged from 81.20 to 85.95%, which is in
accordance with international standards, good accuracy. Were chosen to evaluate the
robustness of the variables: mass, shaking time and volume of extracting solvent. The variable
agitation showed no effective results regarding the robustness. The method was effective for
the determination of HMF in the experiments studied. The HMF content in cocoa beans during
roasting showed a linear increase in the concentration, but the importance of assessing a better
temperature and time of roasting, optimizing the technological process of making chocolate, is
directly related to sensory evaluation to production chocolate of superior quality.
Keywords: cocoa, high performance liquid chromatography, validation, 5-
hidroxidometilfurfural.
63
.
1. INTRODUÇÃO
O cacau é um fruto muito popular, pois a partir de suas sementes é obtido um dos alimentos
mais conhecidos e apreciados: o chocolate. Seu sabor é condicionado não apenas a atributos
genéticos do cacaueiro (variedade), como também a modificações que ocorrem durante seu
beneficiamento. Basicamente, após a colheita do cacau, são efetuadas as operações de abertura
dos frutos, fermentação das sementes junto à polpa que as envolve, secagem e torração para
obtenção da massa ou liquor de cacau, que será utilizado na obtenção de manteiga e pó de
cacau, além de chocolates e produtos análogos [1]. Durante essas etapas são gerados não
apenas os precursores do sabor característico dos produtos de cacau, como também compostos
que não mais sofrerão modificações e que contribuirão para esse sabor.
O processo de torração do cacau é crucial para a obtenção das características de sabor do
chocolate. É durante o tratamento térmico que se desenvolvem os mais importantes
componentes do complexo sistema aromático do cacau.
Segundo Brunetto et al. [2], a torração é mais que um simples processo de desidratação, sendo
considerado um tratamento térmico bem definido, que deve ocorrer sob condições de tempo,
temperatura e umidade bem controladas e otimizadas para permitir o desenvolvimento das
características de sabor requeridas.
No sentido de estimular o desenvolvimento do sabor durante o tratamento térmico, o cacau
deve apresentar algumas propriedades básicas, isto é, níveis suficientes dos chamados
precursores do sabor. Tais precursores são aminoácidos e açúcares redutores livres formados
durante a fermentação e que reagem durante a etapa de torração (reação de Maillard) [3]. Na
fermentação os precursores do sabor são formados durante as profundas reações bioquímicas
que ocorrem no interior dos cotilédones, acarretando inclusive na morte do gérmen dos grãos
de cacau [4].
64
Durante a torração, a reação de Maillard desempenha um papel importante na formação do
sabor de cacau. Os aminoácidos livres são precursores de aminas em aromas de cacau, estes
são produzidos durante a fermentação através da proteólise por atividades protease. Os
açúcares redutores são carbonilas, precursores formados principalmente por meio da hidrólise
da sacarose pela ação da invertase e hidrólise enzimática de antocianinas [5].
Ramli et al. [6], destacam que a reação de Maillard ocorre durante um tratamento térmico,
sendo acelerada com o aumento de temperatura, no entanto, pode também ocorrer à
temperatura ambiente ou de estocagem. No ínicio ocorre uma reação entre a função amina de
um aminoácido e as funções aldeídicas ou cetônicas de um carboidrato, ou ainda ser
provocada pelo produto de oxidação de um ácido graxo. A principio os produtos dessa reação
são incolores e fluorescentes, sendo que sua polimerização torna-os escuros.
Os precursores de aromas desenvolvidos durante a fermentação interagem no processo de torra
para produzir o desejado sabor de chocolate. A torração é a operação tecnológica mais
importante no processamento de grãos de cacau. Traz a formação de características como cor
marrom, aroma suave e a textura dos grãos torrados. Torração convectiva é o método mais
comumente usado para o processamento térmico de grãos de cacau, sendo estes expostos a
temperaturas de 130° a 150°C para 15 a 45 minutos [7].
A extensão da reação de Maillard em alimentos pode ser monitorada pela formação de alguns
compostos, o que permite avaliar a intensidade do processamento térmico e as alterações
nutricionais relacionadas a ele. Entre eles está o hidrometilfurfural, que é o indicador e
precursor dos pigmentos formados na fase final da reação de Maillard.
O 5-hidroximetilfurfural (HMF) é um composto intermediário formado naturalmente pela
reação de Maillard que pode ser formado também pela degradação de hexoses a altas
temperaturas em meio ácido. A formação de HMF está diretamente ligada ao calor aplicado ao
alimento, sendo produzido rapidamente durante o processamento térmico e também no
armazenamento prolongado de produtos ricos em carboidratos. O HMF tem sido estudado em
65
produtos alimentícios que sofrem danos térmicos e contém altas concentrações de
carboidratos, tais como: frutas processadas, vegetais desidratados, café, mel e leite. Além
disso, seus derivados revelaram-se citotóxicos, genotóxicos e carcinogênicos [8].
Geralmente, HMF pode ser usado como marcador de qualidade para uma grande variedade de
frutas processadas, café e leite [9]. O conteúdo de HMF varia muito nos alimentos e, em geral,
está relacionado à presença de ingredientes como caramelos, mel, entre outros.
A quantidade de HMF detectável em alimentos está diretamente relacionada com a carga de
calor aplicada durante o processamento de produtos ricos em carboidratos. Outra fonte de
HMF é representada pelos ingredientes usados na formulação, tais como caramelo ou mel.
Concentrações de HMF em alimentos podem variar em grande parte às vezes superior a 1
g.kg-1 em certos frutos secos e caramelo [10,11]. HMF pode ser encontrado também em
produtos de padaria, malte, sucos de frutas, café e vinagre.
HMF é também usado para monitorar os processos de aquecimento aplicados a produtos de
cereais, tais como massas de secagem, pão fatia, bem como café e cereais. Embora as
concentrações em alguns itens de alimentos como frutas secas, caramelo e vinagre sejam
extremamente altas, pão e café são os alimentos que contribuem com a ingestão alimentar de
HMF [12].
A presença de compostos potencialmente tóxicos (tais como os aldeídos reativos) em
alimentos vem aumentando a atenção de órgãos normatiizadores e de controle de qualidade.
Em particular, alguns estudos mostram que o HMF está entre as substâncias de risco de
citotoxicidade, genotoxidade e atividade mutagênica [13]. Existem vários métodos propostos
para a determinação do HMF, mas o método por Cromatografia de Alta Eficiência (CLAE)
parece ser o mais apropriado devido a interferências provocadas por substâncias derivadas. O
crescimento da atenção que a comunidade científica vem dando às potencialidades dos efeitos
tóxicos do HMF requer esforços para estabelecer um método mais rápido e sensível para
determinar o analito em matrizes reais.
66
Com isso, o monitoramento das etapas de torração do cacau visa contribuir no controle de
qualidade da produção do chocolate, minimizando a formação de compostos que poderão
causar danos à saúde, tais como o HMF.
Com o desenvolvimento de metodologias analíticas, a grande importância da validação hoje
em dia está na qualidade das medições feitas. A qualidade na medição de dados analíticos
abrange dois critérios essenciais - utilidade e confiabilidade. Um aspecto chave da
confiabilidade ou a validade dos resultados é que eles são comparáveis, desde sua origem. A
validação é a comprovação, através do fornecimento de evidência objetiva, de que os
requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram atendidos [14]. Para
garantir que um método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra,
ele deve passar pelo processo de validação. Com isso, o método torna-se capaz de mostrar
qualidade nas medições químicas, através de sua comparabilidade, rastreabilidade e
confiabilidade [15,16].
Sendo assim, os objetivos deste trabalho foram otimizar e validar um método que utiliza
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para determinação do HMF em amostras de
amêndoas de cacau torradas submetidas a diferentes tempos e temperaturas para avaliar a
influência da temperatura e tempo de torração na produção do HMF.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Reagentes e Soluções
Todas as soluções foram preparadas utilizando água purificada usando um sistema Milli-Q
(Millipore, USA). O ferrocianeto de potássio e acetato de zinco apresentavam grau P.A.
adquiridos da empresa Vetec (Brasil). Ácido fórmico grau HPLC (Merck) e acetronitrila
também grau HPLC foram utilizados na composição da fase móvel. O padrão de
hidroximetilfurfural foi obtido da marca Merck (EUA) e apresentava pureza de 98%. A fase
móvel foi filtrada através de uma membrana de celulose regenerada 0,45 μm (Millipore) para
remover todas as impurezas.
67
2.2 Equipamento e condições cromatográficas
O sistema de cromatografia líquida CLAE utilizado foi da marca Perkin Elmer (USA), modelo
Flexar, composto de uma bomba binária, injetor manual e um detector UV/VIS. A separação
do analito foi realizada utilizando-se uma coluna RP-C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm, Thermo,
USA) ajustada a temperatura de 32°C. O volume da amostra injetada de 20 μL.
Na fase móvel foi utilizado ácido fórmico 0,1 % e acetronitrila na proporção de 95:5 (v/v),
respectivamente, sob fluxo de 1 mL min-1sob condições isocraticas . A identificação foi
realizada por comparação de espectros de absorção e pelo tempo de retenção do padrão puro.
A quantificação foi realizada por padronização externa empregando-se curva de calibração de
9 pontos [9] e detecção em 280 nm.
2.3 Obtenção das amostras
O experimento foi conduzido a partir de amêndoas de cacau, fermentadas e secas, com
tamanhos definidos como grandes e médios, processadas na Fazenda Riachuelo localizada na
região sul do estado da Bahia. As amêndoas fermentadas e secas foram recebidas após
monitoramento das etapas de colheita, fermentação e secagem. Foram misturadas várias
variedades, homogeneizados e quarteados antes de retirar a porção para torração. As amêndoas
foram analisadas através de testes físicos, como umidade das amêndoas e prova de corte. Em
seguida, foram encaminhadas para o processo de limpeza e armazenadas em lotes 16 Kg para
torração.
2.4 Torração das amostras
Foram realizadas torrações em lotes de 16 Kg ± 1Kg de amêndoas fermentadas e secas de
cacau,utilizando torrador elétrico rotativo munido de controle de temperatura, com precisão de
± 0,1°C. A temperatura utilizada na camisa de aquecimento do torrador no início do processo
68
foi estabilizada a 80°C. Foram utilizados temperaturas e tempos de torração previamente
definidos, que variaram a partir de um ponto central ( 120°/40 minutos), que foi o parâmetro
utilizado pelos produtores locais para obtenção de um produto final de boa qualidade. Os
parâmetros de tempo e temperatura estabelecidos no presente estudo são apresentados na
tabela 1.
Tabela 1 – Temperaturas e tempos de torração das amêndoas de cacau.
2.5 Extração do hidroximetilfurfural
A extração do hidroximetilfurfural em amêndoas torradas de cacau foi realizada segundo
RUFIAN-HENARES et al.[9], com algumas modificações. Primeiramente pesaram-se 500 mg
de amostra em tubos de centrifuga de 50 mL. Adicionaram-se 5 mL de água ultrapura e
agitou-se vigorosamente por 5 min. Centrifugou-se a 4500 Xg por 10 minutos a 4°C e o
sobrenadante foi coletado em tubo de centrifuga de 50 mL. Duas novas extrações foram
realizadas com 5 mL de água ultrapura e os sobrenadantes foram combinados. Após o
sobrenadante combinados, a amostra foi lavada com 3 mL de água ultrapura e adicionadas
0,125 ml de cada uma das soluções de Carrez I e II e centrifugada a 4500 Xg por 10 minutos a
4°C. O sobrenadante foi combinado e a mistura de sobrenadantes foi clarificada com 0,125 ml
de cada uma das soluções de Carrez I e II e centrifugada a 4500 Xg por 10 minutos a 4°C. O
sobrenadante adicionado em um novo tubo de centrifuga de 50 mL. A amostra foi lavada mais
uma vez com 2 mL de água ultrapura e adicionadas 0,125 ml de cada uma das soluções de
Experimento Temperatura (ºC)
Tempo (min)
1 80 20 2 80 40 3 80 60 4 120 20 5 120 40 6 120 60 7 160 20 8 160 40 9 160 60
69
Carrez I e II e centrifugada a 4500 Xg por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi combinado e
mais uma vez foi clarificada com 0,125 ml de cada uma das soluções de Carrez I e II e
centrifugada a 4500 Xg por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e o volume
completado para 25 mL com água ultrapura. Uma alíquota de 2 mL foi filtrada em membrana
de celulose regenerada (0,25 μm) e analisada por HPLC.
2.6 Procedimento de validação do método
Os ensaios de validação foram realizados seguindo os parâmetros descritos pelas normas
brasileiras e internacionais. Para avaliação da linearidade foram obtidas curvas analíticas de
soluções do padrão de hidroximetilfurfural, na faixa de concentração de 0,0099375 – 1,875
mg.mL -1 (n = 9 pontos), cada concentração foi injetada seis vezes. A origem foi incluída na
curva padrão [17,18]. Os gráficos foram construídos a partir das respostas relativas (área) no
eixo y e as concentrações correspondentes, no eixo x, para as 06 replicatas de cada
concentração do padrão. A exatidão foi avaliada através de ensaios de recuperação com
amostras fortificadas em concentrações conhecidas analisadas em sextuplicatas. Foram
adicionadas em amostras sem analito, concentrações diferentes de HMF equivalentes
fortificações de 0,94 mg.mL -1; 6,36 mg.mL -1 e 9,54 mg.mL -1.
Através dos ensaios foram avaliadas a seletividade, precisão e robustez. A precisão foi
avaliada em dois níveis: precisão intradia (repetitividade) com sextuplicatas em três
concentrações distintas; e precisão intermediária, tendo como variáveis três analistas e três
dias distintos também em sextuplicatas. As variáveis adotadas para avaliar a robustez,
utilizando a extração foram: a variação da massa, volume da alíquota do solvente extrator e
tempo de agitação. Para determinar os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) do
método, foram realizados ensaios com amostras fortificadas em concentrações decrescentes
até atingirem a razão sinal:ruido de 3:1 para o limite de detecção e a razão sinal:ruido de 10:1
para o limite de quantificação.
2.7 Análise estatística
70
A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para testar diferenças entre os níveis das
variáveis temperatura e tempo, na variável resposta “concentração de HMF”. A normalidade
dos dados foi verificada com o teste não-paramétrico de Kolmogorov-Smirnov e a
homogeneidade das variâncias com o teste de Levene. Quando foram observadas diferenças
significativas, os métodos de comparações múltiplas de Scheffé, Tukey e Fisher foram
utilizadas para fazer as comparações pareadas. Quando as condições de normalidade ou
homogeneidade das variâncias não foram verificadas, o teste não-paramétrico de Kruskal-
Wallis foi utilizado para comparar mais de dois níveis e o teste não-pramétrico de Mann-
Whitney foi utilizado para fazer comparações pareadas. Em todos os testes estatísticos, um
valor-p menor que 0.05 foi considerado significativo.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Validação da metodologia
3.1.1. Seletividade
De acordo com os cromatogramas do branco da matriz, solução padrão e das soluções amostra
preparadas a partir da extração do hidroximetilfurfural em amêndoas secas e torradas (n = 6),
evidencia-se a seletividade do método, pela ausência da detecção de picos no tR do analito,
conforme Figura 1. O método proposto demonstrou ser seletivo, não sendo afetado pelos
outros constituintes da matriz ou por interferentes dos reagentes e solventes. Como também
pode ser observado na Figura 1 o tempo de retenção do HMF nos padrões e nas amostras foi
aproximadamente 8 minutos.
71
Figura 1: Cromatogramas obtidos por HPLC do branco da matriz (A), solução padrão (B) e da solução da
amostra preparada a partir da extração do hidroximetilfurfural em amêndoas secas e torradas a temperatura de
160º C durante 60 minutos (C). Condições: coluna: RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm); ácido fórmico 0,1 % e
acetronitrila na proporção de 95:5 (v/v); vazão: 1 mL/min; detecção: UV 280 nm.
3.1.2 Linearidade
A linearidade foi determinada pelo coeficiente de determinação (R²) obtido pelo gráfico de
regressão linear através do método dos mínimos quadrados relacionando a área dos picos em
função de várias concentrações de soluções padrões. A curva de calibração foi construída
utilizando a padronização externa, a partir de 9 pontos das soluções padrão de HMF em água
nas concentrações de 0,0099375 a 1,875 mg.mL -1 , preparadas no dia distinto em que se
realizaram as análises. Os padrões foram preparados e cada concentração foi injetada 6 vezes.
A curva analítica traçada por padronização externa para HMF demonstrou conformidade na
linearidade, resultou uma equação de reta (y = 260252x + 2236,7) com coeficiente de
determinação R² igual a 0,9997, conforme exibido na Figura 2. De acordo com os critérios de
aceitabilidade dos resultados, o coeficiente de determinação da curva analítica R² deve ser
igual ou superior a 0,995 [17,18,21,22]. Isto indica a validade do método, pois obedece a uma
correlação linear nos intervalos de concentração avaliados. A curva de calibração obtida pelo
método dos mínimos quadrados pode ser expressa pela equação y = a + bx, sendo que o valor
do coeficiente de determinação obtido por padronização externa (0,9997) mostrou-se
satisfatório. A ANVISA[17] recomenda um coeficiente de correlação igual a 0,99 e o
INMETRO [14] um valor acima de 0,90.
72
y = 260252x + 2236,7R2 = 0,9997
0,00
100000,00
200000,00
300000,00
400000,00
500000,00
600000,00
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00
Figura 2. Curva analítica traçada por padronização externa para HMF (área x concentração em mg.mL -1) obtida
por HPLC/UV. y = 260252x + 2236,7e R2 = 0,9997.
3.1.3 Limites de detecção e quantificação
Os termos limite de quantificação e limite de detecção são utiliza¬dos para demonstrar a
habilidade do método em quantificar/detectar baixas concentrações de um analito [14,19]. O
limite de detecção (LOD) é definido como a menor concentração de um analito que o método
é capaz de diferenciar do sinal ruído. O limite de quantificação é definido como a menor
concentração do analito de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente
determinado com valores aceitáveis de precisão e exatidão.
O limite de detecção foi definido como três vezes o ruído da linha de base, obtido pela
determinação de diluições sucessivas e decrescentes da solução padrão de menor
concentração. O limite de quantificação também foi determinado através do ruído da linha de
base. Foi considerada como limite de quantificação a concentração determinada a partir da
relação sinal ruído superior a 10:1. [14,23].
Este método pode ser aplicado somente em procedimentos analíticos que mostram o ruído da
linha de base [18]. Para determinar a relação sinal-ruído, foi feita a comparação entre a
73
medição dos sinais de amostras em baixas concentrações conhecidas do HMF na matriz e um
branco (matriz isenta do composto de interesse) destas amostras. Assim, foi estabelecida uma
concentração mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada[18].
O LOD determinado através da razão entre sinal ruído (3:1) foi de 0,265 mg.kg-1, e o LOQ
determinado pela relação sinal ruído (10:1) foi de 0,530 mg.kg-1, conforme apresentado na
Tabela 2. Esses resultados demonstram que o método é sensível para detectar e quantificar os
níveis de concentração HMF presentes em amostras de amêndoas torradas.
Tabela 2. Comparação entre os limites de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) obtidos no método de validação para HMF por HPLC pelo presente método para determinação de HMF e valores encontrados na literatura para diferentes matrizes.
a Cromatografia líquida com detecção por UV; b cromatografia líquida com detecção de arranjo de diodos.
Na tabela 2 estão os resultados de limites de quantificação (LOQ) e detecção (LOD)
comparados a valores encontrados na literatura para diferentes matrizes. Rufiàn-Henares et al.
[9] desenvolveram uma metodologia para determinação de HMF e encontraram limites de
detecção um pouco menos encontrados neste estudo. Essas diferenças nos limites de detecção
e de quantificação podem ser influenciadas pela natureza química das diferentes matrizes e
pelas sensibilidades dos métodos aplicados.
Referência Matriz Técnica aplicada LOQ (mg.kg-1) LOD (mg.kg-1)
Este estudo Amêndoas torradas
CL/UVa 0,530 0,265
[9] Cereais matinais
CL/UVa 0,05 0,01
[12] Café CL/DADb 0,03 0,01
[24] Café CL/DADb 0,08 0,27
74
Comparando-se os dados de LOD e LOQ obtidos neste estudo com os dados da referência
encontrada, que utilizou a técnica de HPLC para a determinação de HMF em amêndoas
torradas de café, observa-se que os LOD e LOQ obtidos no presente estudo (0,265 e 0,530
mg.kg-1) são cerca de 3 vezes menores para o LOD e 2 vezes maiores para o LOQ. Uma vez
que as matrizes de amêndoas torradas de cacau e café possuem semelhanças na sua natureza,
esta diferença de sensibilidade pode ser devida aos distintos procedimentos de extração das
amostras, tais como, não remoção da fração lipídica, quantidade de massa da amostra e
volume do solvente extrator que pode resultar em um aumento no nível de interferentes e,
sensibilidade do método (Tabela 2). Portanto, nota-se que o emprego do HPLC nas condições
utilizadas no presente método de validação permite atingir níveis de sensibilidade próximos a
métodos que utilizam metodologias similares na extração das amostras.
A exatidão foi avaliada em termos da recuperação. A recuperação avalia a eficiência do
método de tratamento das amostras, sendo expressa como a porcentagem extraída da
quantidade conhecida de um analito. A exatidão de um método mede quanto o resultado de um
dado método analítico se aproxima do resultado real previamente definido [18]. Para a
validação do método de determinação de HMF em amêndoas de cacau, quantidades
conhecidas de HMF foram adicionadas em sextuplicatas da amostra em três níveis de
concentração, 0,94; 6,36 e 9,54 mg.kg-1 e em seguida manipuladas conforme procedimento de
preparo da amostra. As recuperações médias obtidas variaram de 81,20 a 85,95 %, conforme
apresentado na Tabela 3 e apresentaram uma boa recuperação, pois de acordo com a AOAC
[20] os limites para recuperação do analito são de 75 a 120 %.
75
Tabela 3. Comparação Comparação entre os valores de exatidão e precisão intradia obtidos no método de validação para HMF por HPLC pelo presente método para determinação de HMF.
(%DPR) – estimativa de desvio padrão relativo (n=6).
Rufiàn-Henares et al. [9] na validação da metodologia para determinação de HMF em cereais
matinais, fortificando amostras com concentrações diferentes de HMF encontraram limites de
recuperação variando de 97% a 100% maiores do que encontrados neste estudo. Já Murkovic e
Pichler [12] validaram a metodologia para quantificar HMF em café observaram uma média
de recuperação de 84,5%, próximo ao encontrado neste estudo. Como os critérios de aceitação
não são fáceis de definir para analito como HMF, recuperações variando de 75% a 120% ,
com um desvio padrão relativo de até 8% são aceitáveis[19,26].
3.1.5 Precisão
A precisão de um método analítico pode ser avaliada como a medida dos erros aleatórios e
representa a proximidade dos resultados obtidos a partir de medidas independentes de
amostragens múltiplas de uma amostra homogênea. A precisão do método foi avaliada
levando em consideração a repetibilidade e a precisão intermediária [26].
3.1.5.1 Precisão intradia (repetibilidade)
A precisão intradia é determinada em um curto intervalo de tempo com os resultados obtidos
nas mesmas condições de análise, ou seja, com o mesmo analista, mesmo equipamento,
mesmo laboratório e utilizando os mesmos reagentes [27].
Nível de fortificação (mg.kg-1)
Exatidão média (%)
Precisão intradia (% DPR)
Exatidão de referência(%)
AOAC [20]
Precisão de referência (% RSD)
AOAC [20] 0,94 81,20
2,12
6,36
81,32 1,47 75-120 8
9,54
85,95 2,33
76
Os resultados obtidos nos testes de repetibilidade do método, expressos por meio da estimativa
do desvio padrão relativo (DPR) das medidas de 6 replicatas das amostras, estão apresentados
na Tabela 3. Os valores dos DPR obtidos entre 1,47 a 2,33% revelam boa precisão do método.
Lee et al relataram em estudo do teor de HMF em amendoins e pasta de amendoins
consumidos na Coréia [29], utilizaram HPLC para a quantificação e validação da metodologia
e obtiveram resultados elevados para o coeficiente de variação sendo de 10,0 % para a
repetitividade em amostras de amendoins. Este elevado resultado pode derivar devido às
baixas concentrações de HMF encontradas nos analitos. Para o teor de HMF em amostras de
pasta de amendoins o CV foi de 2,56 %, próximo ao encontrado neste estudo.
A precisão do método determinada pela variação entre os resultados obtidos em medidas
sucessivas do teor de HMF em amêndoas torradas fortificadas, sendo avaliada pelo desvio
padrão relativo (DPR), também chamado de coeficiente de variação (CV) são aceitáveis
(Tabela 3), pois não foi observado valor superior a 5 %, que é o limite máximo admitido por
Brasil (2003). Segundo a Food and Drug Administration (FDA) [25], o critério de aceitação do
coeficiente de variação é menor ou igual a 2 %. Os resultados, em termos de repetitividade
obtidos são aceitáveis, uma vez que encontra-se conforme do limite aceito para validação de
métodos cromatográficos que é de 5%. [26].
3.1.5.2 Precisão intermediária (interdia)
A presisão intermediária define a habilidade do método em fornecer os mesmos resultados
quando as análises são conduzidas no mesmo laboratório, mas em dias diferentes ou diferentes
analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinação destes fatores [15]. Para a
determinação da precisão intermediária, recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com
analistas diferentes[19,30]. A precisão intermediária é reconhecida como a mais representativa
das variabilidades dos resultados em um único laboratório e, como tal, mais aconselhável de
ser adotada. O objetivo da validação utilizando o parâmetro precisão intermediária é verificar
que no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados.
77
A precisão intermediária foi avaliada a partir da análise de HMF em amêndoas torradas de
cacau, durante 3 dias não consecutivos e analistas diferentes. Os resultados, expressos por
meio de estimativa do desvio padrão relativo (DPR), estão apresentados na Tabela 4. Estes
resultados revelam que o método fornece resultados com precisão aceitável, indicando uma
precisão satisfatória para a validação de um método analítico, uma vez que valores abaixo de
15% são considerados admissíveis de acordo com a literatura [31]. Portanto evidencia-se que o
emprego do HPLC nas condições utilizadas no presente método de validação permite atingir
níveis de sensibilidade aceitáveis segundo normas como AOAC [20].
Tabela 4. Avaliação da precisão intermediaria pelas variáveis “dia” e “analista”.
* P>0,05 – Sem diferença significativa.
Avaliando à precisão intermediária (Tabela 4), observa-se que não houve diferenças
significativas entre dias e entre analistas, aplicando-se os testes não paramétricos à ANOVA e
Kruskal-Wallis. Para os dois parâmetros o valor-p foi maior que o nível de significância
considerado 0,05, indicando que as hipóteses da igualdade entre dias e entre analistas não
foram rejeitadas, e que o método não apresentou diferenças significativas entre os níveis das
variáveis dia e analista com um nível de significância de 5%. 3.1.6 Robustez
A robustez de um método analítico mede sua suscetibilidade frente a pequenas variações que
podem ocorrer durante as análises de rotina. Um método robusto tem a habilidade de fornecer
resultados inalterados quando sujeito as pequenas mudanças [16]. Portanto, avaliando o
método de extração para determinação do HMF em amêndoas torradas de cacau, foram
Variáveis Média (% DPR)
P*
1 6,78 Dia 2 6,46 0,236
3 8,42 1 2,95
Analista 2 6,78 0,849 3 7,71
78
escolhidas para avaliar a robustez as variáveis: massa, tempo de agitação e volume do solvente
extrator. Pela análise estatística dos resultados, foi verificado que não existem diferenças
significativas entre as variaveis massa (valor-p = 0,182) e volume do solvente extrator (Tabela
5).
Tabela 5. Avaliação estatística da robustez pelas variáveis “massa”, “tempo de agitação”e “volume do solvente extrator”.
A partir dos resultados obtidos, o valor-p foi menor que 0,05 para a variável tempo agitação,
demonstrando que este é um ponto crítico para o método proposto de determinação de HMF
em amêndoas de cacau secas e torradas (Tabela 5). Como foram encontradas diferenças
significativas entres os níveis da variável tempo de agitação, com um valor-p de 0,004
observou-se que existem diferenças significativas entre os tempos entre 2 e 5 min (valor-p de
0.010). Também foi observado diferenças significativas entre os tempos de 2 e 8 min. No
entanto, não foram encontradas diferenças entre os tempos de agitação de 5 e 8min (valor-p =
0,262).Os resultados da presente validação mostraram que o tempo de agitação de 2 mim pode
nao atender na extraçao do HMF para a quantificação aplicadas ao metodo de HPLC.Como
não houve diferença significativa nos tempos 5 e 8 min, constatou-se que o método possui
robustez e tais variações podem ser incorporadas ao procedimento. No caso deste estudado, a
variável tempo de agitação de 2 min não apresentou resultado satisfatório em relação à
robustez.
Variáveis Média (% RSD)
p-value
0,3 g 2.98
Massa 0,5 g 2.62 0.182
0,7g 1.25
2min 1.27
Tempo de agitação
5min 2.62 0.004
8min 2.61
4mL 7.11
Volume do solvente extrator
5mL 5.68 0.244
6mL 1.12
79
3.2 Quantificação do HMF em amêndoas de cacau em diferentes tempos e temperaturas
A Figura 3 representa os cromatogramas obtidos na análise de determinação do HMF em
amêndoas de cacau torradas a temperatura de 80º C durante 60 minutos e a temperatura de
160º C durante 60 minutos. Com a análise das amostras de amêndoas de cacau secas e torradas
a diferentes temperaturas e tempo utilizadas neste trabalho foi verificado que o método não
apresentou interferências no tempo de retenção do composto em estudo.
Figura 3: Cromatogramas obtidos por CLAE na análise de determinação do HMF em amêndoas de cacau
torradas a temperatura de 80º C durante 60 minutos e a temperatura de 160º C durante 60 minutos. Condições:
coluna: RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm); ácido fórmico 0,1 % e acetronitrila na proporção de 95:5 (v/v); vazão: 1
mL/min; detecção: UV 280 nm.
O método validado mostrou-se eficaz para a determinação do HMF nos diferentes
processamentos estudados. De acordo com os dados apresentados na Tabela 6, pode-se
verificar que os valores das concentrações do HMF aumentam com o aumento da temperatura
A
B
80
e tempo de torração. Os resultados apresentados no presente trabalho coincidem com os
encontrados por Olivero et al. [32] que avaliaram alterações em amostras de amêndoas de
cacau em sistema modelo durante o aquecimento e concluíram que o aumento da temperatura
está relacionado com o aumento de degradação de açúcares e, consequentemente, formação do
hidroximetilfurfural. Observa-se uma variação de concentração de HMF nos experimentos a
160° C e redução na concentração de HMF nas amêndoas torradas durante 60 minutos,
resultado esperado, pois segundo Krohn [33] para temperaturas da ordem dos 160° C poderá
ocorrer decomposição térmica do HMF.
Tabela 6. Concentração média de HMF em (mg.kg-1) das amostras de amêndoas de cacau secas e torradas em diferentes temperaturas e tempo.
(%DPR) – estimativa de desvio padrão relativo (n=6).
O HMF tem sido estudado em produtos alimentícios principalmente por ter sido associado a
efeitos mutagênicos por causar danos ao DNA. Além disso, seus derivados (produtos de
degradação térmica) revelaram-se citotóxicos, genotóxicos e carcinogênicos [8].
Shibao [24] obteve em estudo da quantidade de HMF em amostras de café torradas valores
entre 33,44 a 74,32 mg.kg-1. Estes valores são relativamente menores aos encontrados por
Murkovic e Pickler [12] , que em seu estudo em amostras de café encontrou teores de 300-
1900 mg.kg-1. Observa-se que os valores encontrados neste estudo em todos os experimentos
são significativamente menores do que os valores encontrados pelos autores citados. Essa
Experimento Temperatura
(ºC)
Tempo
(min)
Concentração de
HMF mg.kg-1
Média (% DPR)
1 80 20 0,00 0,00
2 80 40 0,02 5,05
3 80 60 0,10 7,69
4 120 20 1,02 4,42
5 120 40 1,84 5,68
6 120 60 2,54 5,60 7 160 20 2,63 5,47 8 160 40 2,68 1,31 9 160 60 2,28 2,85
81
diferença pode esta relacionada a natureza das matrizes, mesmo sendo ambas tratadas por
processamento térmico. A metodologia para análise de HMF em amostras de amêndoas secas
e torradas é simples relativamente à etapa preparativa, e não produz muito resíduo, similar
quando comparada a metodologia utilizada para determinar HMF em amostras de café torrado.
[12,24].
A correlação entre temperatura e tempo na concentração de HMF encontradas nas amêndoas
torradas foi avaliada utilizando ANOVA (Tabela 7). Pode concluir-se que existe diferença
significativas entre as temperaturas (p <0,001) e os tempos (p <0,001) estudadas nos
experimento. Como esperado, não existe diferença significativas entre as replicatas de cada
experimento (p = 0,954) na determinação da concentração de HMF, demonstrado a eficiência
do processo de validação do método. Além disso, existe um efeito de interação entre os fatores
temperatura e tempo (p <0,001).
Tabela 7. Análise de variância na influência dos fatores temperatura e tempo na concentração do HMF em amêndoas de cacau secas e torradas em diferentes temperaturas e tempos.
Na avaliação de comparações pareadas utilizando testes de comparações múltiplas de Scheffé,
Fisher (LSD) e Bonferroni na quantificação de HMF em amêndoas de cacau torradas em
diferentes tempos e temperaturas, concluiu-se que todos os níveis do fator temperatura (p
<0,001) e tempo (p <0,001) são significativamente diferentes.
Source Type III sum of squares
df Mean square
F p-value
Corrected model 0.028 13 0.002 849.63 < 0.001
Intercept 0.040 1 0.040 15800.40
Temperature 0.024 2 0.012 4804.99 < 0.001
Time 0.002 2 0.001 443.42 < 0.001
Temperature Time
0.001 4 0.000 136.82 < 0.001
Replication 2.70E-6 5 5.40E-6 0.214 0.954
Error 0.000 40 2.52E-6
Total 0.068 54
82
A figura 4 mostra o comportamento de interação entre a temperatura e o tempo utilizado nos
experimentos, resultante do ajuste do modelo de análise da variância demostrado na Tabela 7.
Observa-se que as amêndoas torradas a temperatura de 80° C, existe um aumento de
concentração de HMF durante a variação do tempo de torração. A formação do HMF na
temperatura de 120° C também foi crescente em relação ao aumento do tempo de torração.
Avaliando o comportamento de torração das amêndoas na temperatura de 160° C, notou-se um
comportamento diferente comparados aos tratamentos com temperaturas de 80 e 120°C.
Resultado inesperado, haja visto que o aumento de temperatura acelera a formação do HMF.
Considerando que em 160°C, pode-se ocorrer a degradação de HMF [33], espera-se que no
tempo de 60 minutos o HMF pode ter degradado em outros compostos, por isso um
decréscimo na concentração de HMF das amêndoas torradas com o referido tempo.
O processo de torração é fundamental na obtenção das características de qualidade do
chocolate. Otimizar as condições de torração das amêndoas de cacau significa desenvolver ao
máximo o potencial e as características sensoriais do chocolate[6]. O aroma envolve um
número grande de constituintes orgânicos de diferentes estruturas químicas e propriedades, em
concentrações relativas muito diferentes em nível de traços. Além disso, são compostos
termolábeis, isto é, qualquer aumento de temperatura pode causar rearranjos, ciclizações, etc.
Pressupõe-se a possibilidade de que exista uma concentração ótima de HMF durante o
processo de torração, o que poderia corresponder a um produto de melhor qualidade. Portanto,
a pesquisa sensorial é extremamente importante para a definição de tempo e temperatura ideal
para o processo de torração, como forma de contribuir para o desenvolvimento tecnológico na
produção de chocolate.
83
Figure 4. Gráfico do perfil da interação entre tempo e temperatura, resultante do ajuste do modelo de análise de variância da concentração de hidroximetilfurfural em amêndoas de cacau secas e torradas encontrada na Tabela 6.
4. CONCLUSÕES
A validação do método de análise por cromatografia líquida de alta eficiência para
determinação de HMF em amêndoas de cacau secas e torradas apresentou ótimos resultados
em todas as etapas de validação, mostrando ser sensível, preciso e exato. Na etapa de robustez
a variável tempo de agitação demonstrou ser um ponto crítico do método de extração. . O mé-
todo apresentou limites de detecção e quantificação satisfatórios (0,265 e 0,530 mg kg-1,
respectivamente), constituindo-se em uma importante ferramenta na avaliação de qualidade
das amêndoas de cacau torradas. A correlação entre aumento na concentração de HMF com o
aumento da temperatura e tempo de torração das amêndoas de cacau foi observada nas
temperaturas de 80 e 120° C. Na análise de HMF nas amêndoas torradas a 160°C foram
observadas maiores quantidades deste indicador, mesmo com decréscimo de concentração do
HMF a 160°C durante 60 minutos, que possivelmente ocorreu devido degradação térmica do
referido composto.
84
Devido a ausência de estudos que indiquem um consenso sobre a quantidade máxima a ser
consumida de produtos de reação de Maillard e de legislação especifica, os resultados obtidos
neste estudo não podem ser classificados como altos ou baixos. O teor de HMF nas amêndoas
de cacau durante a torração mostrou um aumento linear na concentração, mas a importância de
avaliar uma melhor temperatura e tempo de torração, otimizando o processo tecnológico de
fabricação do chocolate, está diretamente relacionada à avaliação sensorial, visando a
produção de chocolate de qualidade superior.
85
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CONCLUSÕES FINAIS
Todos os experimentos estudados apresentaram diferença significativa no que tange a
temperatura nos aspectos físico-químicos, atividade de água e quantificação do
hidroximetilfurfural.
Nos aspectos físico-químicos as amêndoas torradas em diferentes tempos e temperaturas
apresentaram diferenças significativas, principalmente nos tratamentos submetidos a
temperatura de 160°C. Na avaliação do teor de umidade, aumentando-se o tempo e a
temperatura observaram-se perdas significativas. Foi observada uma redução no teor de
proteínas nos tratamentos submetidos a 160°C comparados as amêndoas que não sofreram
tratamento térmico, consequentemente devido a reação de Maillard e perdas de aminoácidos
nas fontes de proteínas, corroborando com o previsto na literatura.
Com relação a atividade de água, o acréscimo de tempo e temperatura de torração favoreceu
para o decréscimo. Correlacionado a concentração do hidroximetilfurfural aumenta com o
decréscimo da atividade de água e esse aumento pode está relacionada com a velocidade de
oxidação de lipídios, favorecida pelo acréscimo da temperatura, contribuindo assim para a
formação do hidroximetilfurfural como produto da reação de Maillard. Além disso, existe um
efeito de interação entre os fatores temperatura e tempo tanto na avaliação da atividade de água,
bem como concentração do hidroximetilfurfural.
O método proposto demonstrou ser seletivo, não sendo afetado pelos outros constituintes da
matriz ou por interferentes dos reagentes e solventes. A curva analítica traçada por
padronização externa para HMF demonstrou conformidade na linearidade, com coeficiente de
determinação R² igual a 0,9997. Isto indica a validade do método, pois obedece a uma
correlação linear nos intervalos de concentração avaliados. O método validado apresentou
sensibilidade para detectar e quantificar os níveis de concentração HMF presentes em
amostras de amêndoas torradas.A precisão do método determinada pela variação entre os
resultados obtidos em medidas sucessivas do teor de HMF em amêndoas torradas fortificadas,
89
apresentaram valores aceitáveis. O método apresentou limites de detecção e quantificação
satisfatórios (0,265 e 0,530 mg kg-1, respectivamente), constituindo-se em uma importante
ferramenta na avaliação de qualidade das amêndoas de cacau torradas. . Na etapa de robustez a
variável tempo de agitação demonstrou ser um ponto crítico do método de extração.
A correlação entre aumento na concentração de HMF com o aumento da temperatura e tempo
de torração das amêndoas de cacau foi observada nas temperaturas de 80 e 120° C. Na análise
de HMF nas amêndoas torradas a 160°C foram observadas maiores quantidades deste
indicador, mesmo com decréscimo de concentração do HMF a 160°C durante 60 minutos, que
possivelmente ocorreu devido degradação térmica do referido composto. . O teor de HMF nas
amêndoas de cacau durante a torração mostrou um aumento linear na concentração, mas a
importância de avaliar uma melhor temperatura e tempo de torração, otimizando o processo
tecnológico de fabricação do chocolate, está diretamente relacionada à avaliação sensorial.
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SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS
Sugere-se, para avaliar uma melhor temperatura e tempo de torração, otimizando o
processo tecnológico de fabricação do chocolate, uma avaliação sensorial dos chocolates
produzidos com temperaturas e tempos avaliados neste estudo, com o intuito auxiliar,
orientar e otimizar a produção das micro e pequenas empresas, como forma de contribuir
para o desenvolvimento econômico e tecnológico local.
A partir do planejamento experimental utilizado neste estudo, avaliar outros indicadores da
reação de Maillard, visando contribuir no controle de qualidade da produção de chocolate
minimizando os compostos que poderão causar danos à saúde, através do monitoramento
das etapas de torração do cacau processado.