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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ISMAEL SILVA FERNANDES
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Paenibacillus sp UTILIZANDO
COMO MEIO DE CULTURA A MANIPUEIRA
SALVADOR
2016
Ismael Silva Fernandes
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Paenibacillus sp UTILIZANDO
COMO MEIO DE CULTURA A MANIPUEIRA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia do Instituto de Ciências da
Saúde da Universidade Federal da Bahia como requisito
para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Vitor Hugo Moreau da Cunha
SALVADOR
2016
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Processamento Técnico, Biblioteca Universitária de Saúde,
Sistema de Bibliotecas da UFBA
F363 Fernandes, Ismael Silva.
Produção de biossurfactante por Paenibacillus sp utilizando como
meio de cultura a manipueira / Ismael Silva Fernandes. - Salvador, 2016
74 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Vitor Hugo Moreau da Cunha.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,
Salvador, 2016.
1. Biossurfactante. 2. Manipueira. 3. Agroresíduos. 4. Paenibacillus. I.
Cunha, Vitor Hugo Moreau da. II. Universidade Federal da Bahia.
Instituto de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia. IIII. Título.
CDU: 604.2:661.185
Ao meu aprimoramento como ser desse
universo e a meus pais que tanto me apoiaram
nessa minha etapa de desenvolvimento.
Agradecimentos
A Deus, por me dar a oportunidade que se chama vida!
A meus pais Ednaldo Silva Fernandes e Anailda Silva Fernandes, por sempre me
darem muito amor e incentivo na minha caminhada.
Ao meu irmão Davi Silva Fernandes, por apontar a direção desse mestrado e me
auxiliar nas pendências diárias.
Ao professor Vitor Hugo Moreau da Cunha, por abrir as portas do seu laboratório e
me dar as ferramentas necessárias para os trabalhos dessa etapa de minha vida.
A professora Samira Abdallah Hanna, por seus conselhos e carinho extremamente
bem vindos.
A Daniela Santana Lima, por fornecer a matéria prima para o desenvolvimento do
trabalho.
A Rebeca Cavalcanti Imbroinise, pelo auxílio e paciência.
Ao senhor Antônio Lima, pelos auxílios nas horas de aflição.
Aos meus colegas do LBI, pelas orientações e ajuda que me deram.
E finalizando, às dificuldades desse caminho que trilhei porque essas são na
verdade oportunidades de autoconhecimento e aprimoramento pessoal.
Fernandes, Ismael Silva. Produção de biossurfactante por Paenibacillus sp utilizando como meio de cultura a manipueira. 74f. 2016. Dissertação (Mestrado). Instituto de Ciências da Saúde. Universidade Federal da Bahia 2016.
RESUMO
Surfactantes sintéticos ou tensoativos tornam-se um dos principais poluentes
encontrados na natureza. Devido a vasta gama de utilização, são geralmente
encontrados em efluentes urbanos bem como nos corpos hídricos receptores. A
substituição desses tensoativo pelos biossurfactantes que apresentam
características ambientalmente compatíveis tornou-se um tema relevante à
pesquisa. O processo de produção dos biossurfactantes é o que inviabiliza sua
produção em larga escala. Diversos estudos estão em desenvolvimento para
descobrir novas fontes de carbono e energia que possibilitem um processo de
produção mais barato. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a utilização da
manipueira como fonte alternativa de carbono e energia para a produção de
biossurfactante pelo microrganismo Paenibacillus sp. Parâmetros como o consumo
de amido, produção de açúcares redutores e a variação da concentração de
oxigênio no meio foram utilizados para acompanhar o crescimento bacteriano.
Medição da tensão superficial, índice de emulsificação e diluição micelar crítica
foram realizados para avaliar a presença de biossurfactante no meio de cultura.
Adicionalmente, testes de estabilidade em função do pH, salinidade e temperatura
foram realizados. Os resultados mostraram que a manipueira (agroresíduo da
produção de farinha) poder ser utilizada como meio de crescimento bacteriano na
produção de biossurfactante que apresenta propriedades tensoativas estáveis
podendo ser utilizado em condições extremas de acidez, alcalinidade, salinidade e
temperatura. A otimização e o escalonamento do processo de produção são
importantes ferramentas no desenvolvimento de tecnologias ambientalmente
amigáveis e economicamente viáveis para a produção de biossurfactantes com
promissora aplicabilidade industrial.
Palavras-chave: biossurfactante, manipueira, agroresíduos, Paenibacillus
Fernandes, Ismael Silva. Biosurfactant production by Paenibacillus spp using as culture medium manipueira. 74p. 2016. Dissertation (Masters). Institute of Health Sciences. Federal University of Bahia , Salvador 2016.
ABSTRACT
Due to the broad range of synthetic surfactants utilizations, these chemicals are
usually found in urban wastes as well in water bodies receptors, becoming one of the
main pollutants found in nature. Thus, the replacement of surfactants by biological
ones (biosurfactants) is important to make environment friendly the processes in
which they are applied. biosurfactant production processes are expensive and not
feasible on large scale production scale. Many researches are being conducted to
find new carbon and energy sources in order to make the production process
cheaper. This work aimed to evaluate the use of manipueira as an alternative carbon
and energy sources for biosurfactant production using microrganisms Paenibacillus
sp. Bacterial growth was followed by measuring starch consumption, production of
reducing sugars and oxygen consumption. Measurement of surface tension,
emulsification index and critical micelle dilution were performed in order to evaluate
the presence of biosurfactant in the culture broth. Stability test of produced
surfactants against pH, salinity and temperature were made. These results suggests
that, manipueira may be used as a bacterial growth medium for production of
biosurfactants, small variation of their properties and in extreme acidic, alkaline salt
and temperature conditions.
Keywords: biosurfactant, manipueira, agricutural waste, Paenibacillus
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Representação esquemática de um tensoativo..................................... 19
Figura 2: Comportamento do tensoativo em meio aquoso.................................... 19
Figura 3: Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e____
superficial, em função da tensão superficial, indicando a C.M.C............................ 20
Figura 4: Ângulo de contato entre uma gota de líquido e uma superfície sólida... 23
Figura 5: Redução da tensão superficial facilita a entrada do líquido nas frestas___
formadas entre as fibras proporcionando a umectação........................................... 24
Figura 6: Formação de cotículas de óleo em água na presença de tensoativos____
acima da C.M.C. provocando a formação de estruturas recobertas de moléculas____
de tensoativos......................................................................................................... 25
Figura 7: a: Formação estrutural de bolhas; ____b: ilustração da composição
estrutural em espumas............................................................................................. 27
Figura 8: Representação do tipo 1 e 2 de ramnolipídeos respectivamente.......... 30
Figura 9: Estrutura química de um lipopeptídeo.................................................... 31
Gráfico 1: Variação da concentração ao decorrer do crescimento....................... 52
Gráfico 2: Variação de concentração de amido e açúcares redutores ao decorrer
do____ crescimento................................................................................................ 53
Gráfico 3 Variação da leitura de absorbância em 400 e 430 nm para obtenção da
leitura de ramnose no crescimento 2...................................................................... 54
Gráfico 4: Variação da leitura de absorbância em 400 e 430 nm para obtenção da
leitura de ramnose no crescimento 3...................................................................... 55
Gráfico 5: Variação da concentração de ramnose no decorrer do
crescimento 2.......................................................................................................... 55
Gráfico 6: Variação da concentração de ramnose no decorrer do
crescimento 3.......................................................................................................... 56
Gráfico 7: Variação da Tensão Superficial no decorrer do
crescimento 2.......................................................................................................... 57
Gráfico 8: Curva do índice de emulsificação do crescimento 2.......................... 57
Gráfico 9 Variação da tensão superficial no decorrer do crescimento 3............. 58
Gráfico 10: Curva do índice de emulsificação do crescimento 3.......................... 58
Gráfico 11: Variação da tensão superficial de acordo com a diluição do meio..... 61
Gráfico 12: Variação da tensão superficial do meio de acordo com o tempo
de exposição ao banho-maria a 100°C................................................................... 63
Gráfico 13: Medição da tensão superficial do meio diante a diferentes_____
concentrações de NaCl........................................................................................... 64
Gráfico 14: Medição da tensão superficial do meio diante a variação do pH....... 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos...... 29
Tabela 2: Caracterização físico-química da manipueira............................................42
Tabela 3: Tabela de atividades..................................................................................44
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ABS: Absorbância
BA: Bahia
C: Citosina
CaCO3: Carbonato de Cálcio
CaSO4: Sulfato de Cálcio
C.M.C.: Concentração micelar crítica
n-DBSS: n-dodecil benzeno sulfonato de sódio
DDT: Dicloro Difecil Triclopoetano
D.M.C.: Diluição micelar crítica
DNA: Ácido desoxirribonucleioco
DNS: Solução de ácido dinitrosalissílico
E24: Índice de Emulsificação
FMA: Fungos micorrízicos arbusculares
G: Guanina
HCl: Ácido clorídrico
HCN: Ácido cianídrico
HPA: Compostos aromáticos policíclicos
I2: Iodo
ICS: Instituto de Ciências da Saúde
Kl: Iodeto de Potássio
L: Litro
LB: Luria Bertani
LBI: Laboratório de Biotecnologia Industrial
mg: Miligramas
min: minuto
mL: Mililitro
N: Newton
NaCl: Cloreto de Sódio
NaOH: Hidróxido de Sódio
RNAr 16s
µL: Microlitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 16
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 20
2.1 Geral ...................................................................................................................................... 20
2.2 Específicos ............................................................................................................................. 20
3. REVISÂO BIBLOGRÁFICA .................................................................................................................... 21
3.1 TENSOATIVOS ........................................................................................................................ 21
3.1.1 TENSOATIVOS CATIÔNICOS ..................................................................................... 23
3.1.2 TENSOATIVOS ANIÔNICOS ....................................................................................... 23
3.1.3 TENSOATIVOS ANFÓTEROS...................................................................................... 23
3.1.4 TENSOATIVOS NÃO-IÔNICOS ................................................................................... 24
3.2 INFLUÊNCIA DOS TENSOATIVOS ........................................................................................... 24
3.2.1 TENSÃO SUPERFICIAL ............................................................................................... 24
3.2.2 MOLHABILIDADE E UMECTAÇÃO ............................................................................. 25
3.2.3 EMULSIFICAÇÃO e EMULSIFICANTES ....................................................................... 26
3.2.4 DETERGÊNCIA .......................................................................................................... 28
3.2.5 ESPUMAÇÃO ............................................................................................................ 28
3.3 BIOSSURFACTANTE ............................................................................................................... 30
3.3.1 GLICOLIPÍDEOS ......................................................................................................... 31
3.3.2 LIPOPEPTÍDIOS ......................................................................................................... 33
3.4 VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS BIOSSURFACTANTES EM COMPARAÇÃO AOS
SURFACTANTES SINTÉTICOS ....................................................................................................... 34
3.5 APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DOS BIOSSURFACTANTES ........................................................... 35
3.5.1 RECUPERAÇÃO MELHORADA DO PETRÓLEO (MEOR) ............................................. 36
3.5.2 APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS .................................................................................... 37
3.5.3 BIORREMEDIAÇÃO ................................................................................................... 37
3.5.4 AGRICULTURA .......................................................................................................... 39
3.5.5 MINERAÇÃO ............................................................................................................. 40
3.5.6 PRODUTOS DE HIGIENE E COSMÉTICOS .................................................................. 40
3.5.7 INDÚSTRIA DE ALIMENTOS ...................................................................................... 41
3.6 Bacillus e Paenibacillus sp ..................................................................................................... 41
3.7 MANDIOCA E MANIPUEIRA ................................................................................................... 43
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................................... 46
4.1 TABELA DE ATIVIDADES ........................................................................................................ 46
4.2 ISOLAMENTO do Paenibacillus sp ......................................................................................... 47
4.3 OBTENÇÃO DA MANIPUEIRA ................................................................................................ 47
4.4 PRODUÇÃO DO INÓCULO ..................................................................................................... 48
4.5 CULTIVO DA BACTÉRIA NA MANIPUEIRA .............................................................................. 48
4.5.1 Crescimento 1 (Em Biorreator) ................................................................................ 48
4.5.2 Crescimento 2 (Em Erlenmeyer) .............................................................................. 49
4.5.3 Crescimento 3 (Em Erlenmeyer) .............................................................................. 49
4.6 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES PELA BACTÉRIA UTILIZANDO COMO MEIO
DE CULTURA A MANIPUEIRA. ..................................................................................................... 49
4.6.1 DOSAGEM DE AMIDO .............................................................................................. 49
4.6.2 DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES .............................................................................. 50
4.7 AVALIAÇÃO DO O CRESCIMENTO DA BACTÉRIA UTILIZANDO MANIPUEIRA COMO MEIO DE
CULTURA ..................................................................................................................................... 50
4.7.1 DOSAGEM DE RAMNOSE ......................................................................................... 50
4.7.2 TENSÃO SUPERFICIAL ............................................................................................... 51
4.7.3 ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO ..................................................................................... 51
4.7.4 DETERMINAÇÃO DA DILUIÇÃO MICELAR CRÍTICA (DMC) DO EXTRATO BACTERIANO
LIVRE DE CÉLULAS ............................................................................................................. 52
4.8 ESTUDOS DE ESTABILIDADE .................................................................................................. 52
4.8.1 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE TEMPERATURA ................................................... 53
4.8.2 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE pH ....................................................................... 53
4.8.3 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE SALINIDADE ........................................................ 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................................ 54
5.1 AVALIAÇÃO DO O CRESCIMENTO DA BACTÉRIA UTILIZANDO MANIPUEIRA COMO MEIO DE
CULTURA. .................................................................................................................................... 54
5.2 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES PELA BACTÉRIA UTILIZANDO COMO MEIO
DE CULTURA A MANIPUEIRA. ..................................................................................................... 56
5.2.1 CURVA DE CONCENTRAÇÃO DE RAMNOSE ............................................................. 56
5.2.2 CURVA DE EMULSIFICAÇÃO E TENSÃO SUPERFICIAL DO MEIO ............................... 58
5.2.3 DMC E TENSÃO SUPERFICIAL ................................................................................... 62
5.3 ESTUDO DA ESTABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE FRENTE À VARIAÇÃO DE TEMPERATURA,
SALINIDADE E pH ......................................................................................................................... 64
5.3.1 ESTABILIDADE À TEMPERATURA ............................................................................. 64
5.3.2 ESTABILIDADE À SALINIDADE .................................................................................. 66
5.3.3 ESTABILIDADE À VARIAÇÃO DE pH .......................................................................... 67
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................................................... 69
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 70
16
1. INTRODUÇÃO
Surfactantes ou Tensoativos são moléculas orgânicas que usualmente
consistem de uma porção hidrofóbica e outra hidrofílica. Em consequência dessa
estrutura anfifílica os tensoativos apresentam capacidade de interagir com
substâncias de diferentes polaridades, influenciam na tensão superficial de fluidos e
tem a capacidade de formar micelas (CERQUEIRA; COSTA, 2009; PENTEADO; EL
SEOUD, 2006).
Essas propriedades fazem dos surfactantes excelentes detergentes,
emulsificantes, formadores de espuma e dispersores de hidrocarbonetos (DESAI;
BANAT, 1997). Desta forma, essas substâncias são a base de uma gama de
produtos importantes, por exemplo, na formulação de herbicidas, pesticidas,
fármacos e produtos de consumo (xampus, condicionadores), no combate de
vazamento de petróleo (PENTEADO; EL SEOUD, 2006), produção de tintas,
plásticos e nas indústrias têxteis, de mineração e de alimentos (MASTORI, 1998).
Assim, os surfactantes são tidos como uma das substâncias mais versáteis na
indústria.
Devido a sua grande utilização, os surfactantes sintéticos são geralmente
encontrados em efluentes das cidades bem como nos corpos hídricos receptores
(MASTROTI, 1998). A presença desses compostos em corpos hídricos pode gerar
sérios desequilíbrios ecológicos por sua capacidade de interferir de forma danosa na
membrana plasmática dos microrganismos e até mesmo no seu metabolismo desses
(ROMANELLI, 2004). Outro fato preocupante é a formação de uma barreira na
superfície da água que diminui a troca gasosa com a atmosfera e interferindo na
qualidade da água (DE MORAIS; DE ANGELIS, 2012; ROMANELLI, 2004).
O primeiro país a criar uma lei que tentasse minimizar as problemáticas
causadas pelo uso dos tensoativos foi a Alemanha. Em 1964, foi aprovada a
"Primeira Lei Alemã de Detergentes" que proibia a comercialização de produtos com
biodegradabilidade inferior a 80%. Outros países como Estados Unidos, França,
Reino Unido, Itália e Japão criaram leis semelhantes (MASTROTI, 1998).
No Brasil, inicialmente, a Portaria 112 de 14 de maio de 1982 do Ministério da
Saúde determinava que as substâncias tensoativas aniônicas, utilizadas na
17
composição de saneantes de qualquer natureza devem ser biodegradáveis. Porém,
critérios precisos que definissem o termo "biodegradáveis" não foram estabelecidos.
Posteriormente, o Ministério da Saúde publicou a Portaria 120 de 24 de novembro
de 1995 que estabeleceu a metodologia a ser adotada para determinação da
biodegradabilidade de tensoativos aniônicos utilizados na composição de saneantes
ou tensoativos puros. Ainda, segundo esta Portaria, o produto é considerado
satisfatório quando o grau de biodegradação do tensoativo testado for igual ou
superior ao grau de biodegradação definido para o n-DBSS (n-dodecil benzeno
sulfonato de sódio) considerado como referência de biodegradabilidade para este
teste. Apesar de bastante clara e precisa, a Portaria do Ministério da Saúde só
previu a realização de testes para água doce (ROMANELLI, 2004).
Nos últimos anos, uma tendência mundial visando à sustentabilidade das
atividades industriais e seus produtos, criou a necessidade de uma nova alternativa
que substituísse parcialmente ou até totalmente os surfactantes produzidos a partir
de processos petroquímicos, que utilizam fontes não renováveis de matéria prima
(MARCHANT; BANAT, 2012).
Uma opção para esses tensoativos sintéticos são os biossurfactantes. Os
biossurfactantes são compostos de origem microbiana, consistindo em subprodutos
metabólicos de bactérias, fungos e leveduras, que exibem propriedades
surfactantes, isto é, diminuem a tensão superficial dos líquidos e possuem alta
capacidade emulsificante (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
Em relação aos surfactantes sinteticamente produzidos, os biossurfactantes
demonstram algumas vantagens: São produzidos por microrganismos que utilizam
para a sua produção, substratos renováveis como açúcares, olhos vegetais e
glicerol; apresentam baixa toxicidade, alta biodegradabilidade e ação antimicrobiana.
Outra vantagem é o fato de apresentarem grande diversidade estrutural
(glicolipídios, lipopeptídios, ácidos graxos, e outros) oferecendo assim alta
aplicabilidade nas atividades humanas (COSTA, 2005).
Uma das classes de biossurfactante promissoras e em evidência são os
glicolipídeos, que compreendem um grupo de moléculas com longas cadeias de
ácidos alifáticos ou ácidos hidroxialifáticos ligadas a moléculas de açucares. Nessa
classe destacam-se os ramnolipídeos, trealolipídeos e soforolipídeos (GOUVEIA et
al., 2003). Outro grupo estudado são os lipopeptídeos, que consistem de peptídeos
18
cíclicos ligados a uma cadeia de ácido β-hidroxigraxo ou β-aminograxo. Ambos são
bioemulsificantes de baixa massa molecular (SOUSA, 2012).
Os pré-requisitos para a produção competitiva de biossurfactante são a
obtenção de produtos com grande atividade tensoativa, produzidos a partir de
substratos baratos através de processos economicamente viáveis e com alto
rendimento. No entanto, não é isso o que acontece no panorama atual (OLIVEIRA,
2010). Apesar dos processos biotecnológicos de produção de biossurfactante já
terem sido estabelecidos há alguns anos, o alto custo de produção e purificação
juntamente com o elevado custo para purifica-los têm impedido sua ampla utilização.
As principais dificuldades referem-se aos altos custos associados aos meios de
cultura e a baixa produtividade das cepas microbianas (OLIVEIRA, 2010).
Dessa maneira, faz-se necessário:
1) A identificação de meios de cultura alternativos para o cultivo de
microrganismos, visto que representam entre 30 a 40% do custo envolvido na
produção (JOO; CHANG, 2005).
2) A identificação de novas espécies de microrganismos que apresentem
maiores taxas de produção de biossurfactantes (DA SILVA, 2010).
3) A caracterização de condições ideais para produção em larga escala (DA
SILVA, 2010).
Em geral, substratos agroindustriais que contenham altos níveis de
carboidratos ou de lipídeos suprem a necessidade de fonte de carbono para a
produção de biossurfactantes. A utilização desses resíduos permite diminuir os
custos de produção para níveis competitivos em relação aos similares obtidos por
via petroquímica e, ao mesmo tempo reduzir os problemas ambientais relativos ao
descarte e aos custos do tratamento desses resíduos (BEZERRA, 2006).
Concomitantemente, o aproveitamento desses resíduos para a geração de produtos
com alto valor agregado, além de diminuir os danos ambientais, oportuniza a
melhoria da qualidade de vida da população rural.
Como exemplo de rejeito agroindustrial, observa-se a manipueira. A
manipueira é um resíduo com elevado teor de carboidratos que é descartada
durante o processamento da mandioca para produção de farinha e fécula. Seu
tratamento causa elevação nos custos industriais, enquanto seu descarte, direto ao
solo ou em cursos de água, causa sérios danos ambientais. Sua utilização como
19
meio de cultura em diversos processos biotecnológicos, inclusive para produção de
biossurfactantes, pode ser adequado, tanto em termos de produtividade como pelo
fato de não ser necessária suplementação nutritiva (BARROS, 2007).
Além disso, o IBGE prevê, em 2016, uma produção nacional de 23 milhões de
toneladas de mandioca, resultando aproximadamente numa produção de 5,12
milhões de toneladas de manipueira o que a caracteriza como um abundante meio
de cultura (BARROS, 2007; IBGE, 2016).
Neste projeto, pretendeu-se utilizar a manipueira como meio de cultivo de
baixo custo para a produção de biossurfactante pela bactéria Paenibacillus sp.
isolada a partir de resíduos de produção do óleo de dendê.
20
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
O objetivo geral desse trabalho é avaliar a manipueira como fonte alternativa
de carbono e energia para o crescimento e produção de biossurfactante pela
bactéria Paenibacillus sp.
2.2 Específicos
• Analisar o crescimento da bactéria previamente isoladas da torta
de dendê, gerada pelo esmagamento do dendê, utilizando a manipueira como
meio de cultura;
• Avaliar a síntese de biossurfactantes pela bactéria utilizando
como meio de cultura a manipueira;
• Estudar a estabilidade do biossurfactante produzido frente a
variações de temperatura, salinidade e pH.
21
3. REVISÂO BIBLOGRÁFICA
3.1 TENSOATIVOS
Tensoativos são substâncias naturais ou sintéticas, que possuem em sua
estrutura uma parte lipofílica (ou hidrofóbica) e uma parte hidrofílica (Figura 1).
Graças a sua estrutura molecular essas moléculas apresentam um conjunto de
propriedades intrínsecas (ROSSI et al., 2005).
Quando dissolvidas em meio líquido os tensoativos tendem permanecerem na
interface líquido-líquido, líquido-gás ou sólido-líquido de um dado sistema. Dessa
forma, ao se posicionarem nessa região elas acabam afastando as moléculas do
solvente que estão na superfície do líquido fazendo com que as forças de coesão
entre essas moléculas não exerçam efetivamente sua influencia umas nas outras e
assim levando a diminuição da tensão superficial do líquido (NITSCHKE; PASTORE,
2002).
Outra propriedade que os tensoativos apresentam, é a capacidade de criar
micelas. Quando dissolvido, por exemplo em água, pequenas quantidades de um
Figura 1 - Representação esquemática de
um tensoativo
Figura 2 – Comportamento do tensoativo
em meio aquoso
Fonte: ROSSI et al, 2005 Fonte: ROSSI et al, 2005
22
tensoativo, uma parte é dissolvida como monômero e outra parte se posiciona na
interface ar-água. As moléculas da monocamada permanecem em equilíbrio com os
monômeros que se formam na solução, e a cada concentração de monômero
corresponde uma tensão superficial característica. Quando a concentração do
biossurfactante atinge um determinado valor crítico que determina a sua saturação
na interface, ocorre uma mudança brusca nas propriedades físico-químicas do
tensoativos, fazendo com que os monômeros livres na água se agrupem em
estruturas circulares de maneira que a parte hidrofóbica fique voltada para dentro e
a parte hidrofílica fique em contato com a água (ROSSI et al, 2005). A essa estrutura
dar-se o nome de micelas (Figura 2).
A concentração onde há a saturação da interface e a formação de micelas é
dado o nome de Concentração Micelar Crítica (C.M.C). Abaixo da CMC, as
moléculas de tensoativo estão presentes na forma de monômeros dispersos e
acima, estão presentes na forma de micelas (Figura 3). Este processo de formação é
conhecido como micelização (SANTOS et al., 2007).
Fonte: SANTOS et al., 2007
Figura 3 – Esquema do comportamento do tensoativo entre as fases fluida e
superficial, em função da tensão superficial, indicando a C.M.C.
23
Tipicamente os tensoativos sintéticos possuem a estrutura R-X, onde R é uma
cadeia de hidrocarboneto variando de 8-18 átomos (normalmente linear) e X é o
grupo cabeça, polar (ou iônico). Dependendo de X os tensoativos podem ser
classificados como não-iônicos, catiônicos, aniônicos ou anfóteros (SANTOS et al.,
2007; GOUVEIA et al., 2003).
3.1.1 TENSOATIVOS CATIÔNICOS
Um tensoativo catiônico possui em geral a fórmula RnX Y, onde R representa
uma ou mais cadeias hidrofóbicas, X é um elemento capaz de formar uma estrutura
catiônica e Y é um contra íon. Os principais representantes desta classe são os sais
quaternários de amônio (MANIASSO, 2001).
3.1.2 TENSOATIVOS ANIÔNICOS
A dissociação desses tensoativos em água origina íons carregados
negativamente na superfície ativa. Dentre os tensoativos aniônicos mais
frequentemente utilizados, estão aqueles que possuem sais de ácidos carboxílicos
(graxos) monopróticos ou polipróticos com metais alcalinos ou alcalinos terrosos,
ácidos como sulfúrico, sulfônico e fosfórico contendo um substituinte de
hidrocarboneto saturado ou insaturado (SANTOS et al., 2007).
3.1.3 TENSOATIVOS ANFÓTEROS
Os tensoativos anfóteros possuem ambos os grupos aniônicos e catiônicos no
meio hidrofóbico. A depender do pH da solução e da estrutura, pode prevalecer a
espécie aniônica, catiônica ou neutra. Os tensoativos anfóteros mais comuns
24
incluem N-alquil e C-alquil betaína e sultaína como também álcool amino fosfatidil e
ácidos (MANIASSO, 2001)
3.1.4 TENSOATIVOS NÃO-IÔNICOS
Esta classe de tensoativo não apresenta moléculas dissociadas em solução
aquosa (MANIASSO, 2001).
3.2 INFLUÊNCIA DOS TENSOATIVOS
Graças as suas propriedades moleculares, quando estão em interação com
outras substâncias, os tensoativos conseguem influenciar de forma direta nas suas
propriedades como a Umectação, Molhabilidade, Emulsificação, Detergência e a
formação de Espumas.
3.2.1 TENSÃO SUPERFICIAL
A tensão superficial está presente nas interfaces entres dois fluidos (gás-
líquido ou líquido-líquido) ou entre um fluido e um sólido (sólido-gás ou sólido-
líquido) (FERREIRA, 2005). Considerando, por exemplo, a interface líquido-gás, as
moléculas presentes na superfície do líquido se encontram em um equilíbrio
dinâmico onde passam constantemente do estado liquido para o gasoso e vice-
versa. Nessas condições, quando as moléculas de água saem do estado líquido
para o gasoso, ao se desprenderem da superfície do líquido, ocorre uma mudança
ligeira de densidade da substância, criando assim um distanciamento abrupto das
moléculas que estão na superfície com as que estão no estado gasoso. Dessa
forma, graças a essa grande distância, as moléculas que estão no estado gasoso
25
não conseguem exercer a força de coesão sobre as que estão na superfície do
líquido gerando assim uma força resultante que faz com que as moléculas que estão
na superfície sejam atraídas para o interior do líquido. Em outras palavras, tensão
superficial pode ser definida como a força resultante da atração entre as moléculas
do interior do líquido pelas moléculas na sua superfície (FERREIRA, 2005).
3.2.2 MOLHABILIDADE E UMECTAÇÃO
Molhabilidade e umectação são termos utilizados para descrever um mesmo
fenômeno em aplicações diferentes. O termo molhabilidade é utilizado para
descrever o quanto uma gota de líquido se espalha sobre uma superfície, molhando-
a. Compostos de elevada tensão superficial tendem a se comportar como gotas
esféricas sobre uma superfície, molhando-a pouco, já que as moléculas apresentam
forte atração entre si e tendem a se manter juntas. Quando a tensão superficial é
menor, o líquido se espalha mais sobre a superfície, adquirindo um formato
chamado de lente. Essa lente apresenta um determinado ângulo de contato com a
superfície sólida que depende diretamente da tensão superficial do líquido (DALTIN,
2012).
Por definição tem-se que quando o ângulo de contato (θ), demonstrado na
figura 5, for θ > 90º, não há o molhamento do sólido pelo líquido, ou seja, não ocorre
o espalhamento do líquido; quando θ < 90º, há o molhamento e o líquido se espalha
espontaneamente; quando θ ≈ 0º, o líquido se espalha indefinidamente sobre o
sólido, ou seja, o molhamento é total (LUZ; RIBEIRO; PANDOLFELLI, 2008).
Figura 04 – ângulo de contato entre uma gota de
líquido e uma superfície sólida.
Fonte: DALTIN 2012
26
A redução da tensão superficial do líquido por ação de tensoativos diminui o
ângulo de contato e aumenta a área da superfície molhada (LUZ; RIBEIRO;
PANDOLFELLI, 2008).
Umectação é o termo utilizado para a molhabilidade de superfícies mais
complexas, como o molhamento de um material têxtil, em que a capilaridade é
fundamental para que o líquido penetre profundamente no material. A Figura 5
mostra como a redução da tensão superficial facilita a penetração dos líquidos nas
frestas formadas entre duas fibras do tecido, proporcionando a capilaridade e,
portanto, a umectação. É por isso que se utilizam solventes apolares na lavagem de
tecidos a seco. Como o solvente apresenta baixa tensão superficial, umecta bem o
tecido e penetra facilmente entre as fibras, arrastando eficientemente as sujeiras do
tecido. Depois de realizada a lavagem, o solvente é evaporado do tecido e
condensado em sistema fechado para reaproveitamento em uma próxima lavagem
(DALTIN, 2012).
3.2.3 EMULSIFICAÇÃO e EMULSIFICANTES
Emulsificação é a dispersão de um líquido em outro, consistindo em gotas
microscópicas que variam de tamanho entre 0,1 a 100 nm de diâmetro. Geralmente,
Figura 5 - Redução da tensão superficial facilita a entrada do líquido nas
frestas formadas entre as fibras proporcionando a umectação.
Fonte: DALTIN, 2012
27
quanto menor o diâmetro das gotículas, mais estável será a emulsão formada (DE
LIMA, 2007).
Quando se fala em misturas entre compostos polares e apolares, a
emulsificação não se mantém porque logo após da dispersão das fazes as
moléculas de substâncias apolares não oferecem forças tão atrativas quanto as que
acontecem entre compostos polares, dessa forma, existe uma tendência natural das
moléculas polares se reagruparem e expulsar do seu seio as moléculas apolares
fazendo com que essas não se misturem. Essas duas substâncias são denominados
assim de substâncias imiscíveis (DALTIN, 2012).
Dois líquidos imiscíveis não podem formar emulsões. Neste caso, para
promover a manutenção da dispersão de um líquido em outro, deve ser adicionado
um terceiro componente capaz de estabilizar o conjunto. Esse componente é
chamado de emulsificante e frequentemente é um agente tensoativos (DE LIMA,
2007).
Tomando como exemplo a mistura entre água e óleo e considerando que são
as gotículas de óleo que estão inseridas em um sistema onde o meio contínuo é a
água, as emulsões são estabilizadas a partir do momento que os tensoativos se
posicionam na interface da gotícula de óleo e o meio continuo da água, como é
demonstrado na figura 6 (DAANE et al., 2002).
A gotícula que agora tem sua superfície totalmente ocupada por tensoativos
passa a ter uma superfície capaz de atrair de forma efetiva as moléculas de água
criando ao seu redor uma camada elétrica em sua volta. Como gotículas iguais
Figura 6 - Formação de cotículas de óleo em água na presença de tensoativos acima da
C.M.C. provocando a formação de estruturas recobertas de moléculas de tensoativos.
Fonte: DALTIN, 2012
28
vizinhas vão apresentar carga eletrostática de mesmo sinal nas suas superfícies,
ocorre o efeito de repulsão entre as gotículas com tensoativos, o que impede a
aproximação entre as gotículas, mantendo-as estáveis e separadas, reduzindo a
probabilidade de coalescência (DALTIN, 2012; FERREIRA, 2005).
3.2.4 DETERGÊNCIA
Em um ambiente que se queira fazer uma limpeza normalmente se utiliza
como solvente a água. Devido a sua polaridade a grande maioria das sujeiras
polares serão solubilizadas e assim arrastadas pela água, no entanto, as sujidades
apolares se não tiradas com ações físicas, ainda permanecem no local. Para que a
água possa interagir com esses compostos apolares é adicionado a esse sistema
um tensoativo em quantidades acima de suas concentrações micelares críticas
(CMC), proporcionando uma mistura estável entre a sujeira apolar e a água em
decorrência da alta afinidade da água pelas novas superfícies criadas pelos
tensoativos (OCHOA, 2014).
As moléculas do tensoativo em micelas rapidamente ocupam as superfícies
do óleo com a água e do substrato com a água. Assim que todas essas superfícies
forem ocupadas por moléculas de tensoativo, caso ainda haja micelas em
quantidade suficiente, haverá uma tendência para moléculas de tensoativo dessas
micelas ainda procurarem se posicionar nessas superfícies. Essa tendência gera
uma força chamada de efeito cunha, que busca aumentar o tamanho das superfícies
para permitir que mais moléculas de tensoativo possam se estabilizar. Assim sendo,
a sujidade oleosa vai se deformando e sendo desprendida da superfície do substrato
e ficando livre para ser carregada pela água (DALTIN, 2012).
3.2.5 ESPUMAÇÃO
As espumas são sistemas termodinamicamente instáveis que apresentam
uma estrutura tridimensional constituída de células gasosas delimitadas por um filme
29
líquido contínuo. Essa estrutura origina-se do agrupamento de bolhas geradas ao se
dispersar um gás em um líquido que contenha agentes espumantes, como
surfactantes solúveis ou impurezas (FIGUEREDO; RIBEIRO, 1999).
Como é demonstrado na figura 7, a formação da bolha começa com o
processo de dispersão do gás pela solução que pode acontecer por agitação ou
batimento do líquido e por borbulhamento do gás no líquido. Quando as bolhas de ar
penetram na solução contendo o tensoativo, que se encontra acima de sua
concentração micelar crítica, essas bolhas de ar formam novas superfícies água–ar,
em um processo muito semelhante ao de formação de uma emulsão, quando se
utiliza um óleo em água (DALTIN, 2012; FIGUEREDO; RIBEIRO,1999). Moléculas
do surfactante difundem-se na solução em direção à interface água-ar formando
uma monocamada adsorvida que estabiliza a bolha de gás e retarda sua rápida
coalescência. A destruição das bolhas é termodinamicamente favorável, pois
provoca redução da elevada área superficial da espuma e expansão do gás contido
nas células e, consequentemente, redução da energia livre da espuma
(FIGUEREDO; RIBEIRO,1999).
Em processos industriais ou em lavagens mecânicas, a formação de espuma
é indesejável, pois reduz a capacidade dos equipamentos envolvidos nos processos
Figura 7 – a: Formação estrutural de bolhas; b: ilustração
da composição estrutural em espumas
Fonte: OCHOA, 2014
30
industriais. Já para os produtos de limpeza e xampus, os usuários esperam a
formação de espuma abundante e associam essa formação de espuma à limpeza.
Em produtos de limpeza, como os detergentes para lavagem de louças, a espuma
apresenta um efeito estético ao consumidor, mas até dificulta a limpeza, pois requer
mais enxágues para sua retirada. Em produtos como xampus, a espuma tem a
função de impedir que o tensoativo seja rapidamente levado pela água do chuveiro e
também ajuda a arrastar fisicamente as partículas de sujidades sólidas, mantendo-
as suspensas até o enxágue (ALVES, 2013).
3.3 BIOSSURFACTANTE
Biossurfactantes são moléculas anfipáticas de origem microbiana com
propriedades surfactantes, ou seja, com capacidade de diminuir a tensão superficial
e promover a emulsificação de líquidos imiscíveis. Geralmente esses compostos são
subprodutos do metabolismo de bactérias, fungos filamentosos e leveduras (DE
LIMA, 2007; OLIVEIRA, 2010). Os biossurfactantes podem ser intra, extracelulares
ou constituintes da parede celular (DE LIMA, 2007).
Muitas vezes a célula microbiana, por si só, pode demonstrar significante
capacidade emulsificante e se comportar como um biossurfactante. Muitos autores
consideram que a célula intacta possuidora de capacidade emulsificante é por si só
um biossurfactante, porém, apenas os biossurfactantes extracelulares têm o poder
de reduzir a tensão superficial de uma fase aquosa (FRANCY et al., 1991).
Existe uma grande variedade de moléculas que fazem parte do grupo dos
biossurfactante e podem ser classificadas de acordo com seu peso molecular,
composição química e sua origem microbiana (OLIVEIRA, 2010).
De acordo com o peso molecular podem ser classificados como possuidores
de baixo ou alto peso molecular. Os biossurfactantes de baixo peso molecular
apresentam uma maior eficiência em reduzir a tensão superficial e interfacial de
meios líquidos, enquanto os surfactantes de alto peso molecular demonstram uma
maior eficiência em estabilizar emulsões óleo/água (RON; ROSEMBERG, 2002).
31
De acordo com seus constituintes moleculares os biossurfactantes podem ser
agrupados nas seguintes classes: glicolipídios, lipopeptídios, ácidos graxos, lipídios
neutros, fosfolipídios e biossurfactantes poliméricos (NITSCHKE; PASTORE, 2002),
como mostra a tabela 1.
3.3.1 GLICOLIPÍDEOS
Os biossurfactantes mais conhecidos são os glicolipídeos. Essas moléculas
são constituídas de carboidratos combinados com longas cadeias de ácidos
alifáticos ou ácidos hidroxialifáticos. Nessa classe destacam-se os ramnolipídeos,
os trealolipídeos e os soforolipídeos (GOUVEIA et al., 2003; DE LIMA, 2007).
Tabela 1 – Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos
Fonte: NITSCHKE; PASTORE, 2002
32
Ramnolipídeos são os biossurfactantes mais estudados desse grupo. Sua
produção pela Pseudomonas aeruginosa foi descrita pela primeira vez por Jarvis e
Johnson em 1949, a partir dai, muitas cepas de bactérias produtoras de
ramnolipídeos foram isoladas (INÉS; DHOUHA, 2015).
Ramnolipídeos são compostos de um ou dois ácidos β-hidroxidecanóicos
(porção hidrofóbica) os quais são ligados através de ligações β-glicosidicas a uma
ou duas moléculas de ramnose formando a porção hidrofílica (WITTGENS et al.,
2011). L-Ramnose- L-ramnose- β-hidroxidecanóico- β-hidroxidecanóico e L-
rhamnosyl-β-hidroxidecanóico-β-hidroxidecanóicoque são referidas como
ramnolipídeo 1 e 2 respectivamente ilustrados na figura 09, são os principais
glicolipídios produzidos P. aeruginosa. A formação de ramnolipídeos tipo 3 e 4 que
possuem uma β-hidroxidecanóico ligada a uma ou duas moléculas de ramnose
respectivamente e ramnolipídios que possuem outros ácidos graxos como porção
hidrofóbica já foram observados em outros estudos (DESAI; BANAT, 1997).
Variações nos tamanhos das cadeias dos β-hidroxidecanóicos também são
observadas nos ramnolipídios de diferentes cepas de P. aeruginosa, até mesmo
diferentes tipos de ramnolipídeos podem ser produzidos por uma mesma cepa. Uma
mistura de mono e di-raminolipídios com a porções hidrofóbicas possuindo cadeias
carbônicas em sua grande maioria variando de 8 até 12 carbonos, vem sendo
constatado em cepas de P. aeruginosas (ABDEL-MAWGOUD, 2011).
Figura 08 - Representação do tipo 1 e 2 de ramnolipídeos respectivamente
Fonte: MÜLLER et al., 2012
33
Em outras espécies produtoras, foi observada a síntese de ramnolipídeos
com a porção hidrofóbica contendo cadeias carbônicas de até 14 carbonos. Até
então, cerca de 60 diferentes congêneres e homólogos de Ramnolipídeos vem
sendo reportados (ABDEL-MAWGOUD, 2011).
3.3.2 LIPOPEPTÍDIOS
A classe do lipopeptídeos se caracteriza existência de peptídeos ligados a
ácidos graxos, sendo que a porção protéica da molécula pode ser neutra ou aniônica
e os aminoácidos estão frequentemente dispostos em uma estrutura cíclica (DE
MORAIS, 2012; BARROS, 2007).
Lipopeptídeos representam uma classe de biossurfactantes que tem atraído
grande interesse na área científica. Isso se deve às suas excelentes propriedades
tensoativas e por suas atividades antibióticas, sendo melhor caracterizados aqueles
produzidos por Bacillus sp, incluindo surfactina, iturina, fengicina, liquenisina,
micosubtilisina e bacilomicina. Tais compostos são encontrados na natureza e são
produzidos por vários microrganismos, principalmente, do gênero Bacillus sp
(SOUSA, 2012; BARROS, 2007).
Figura 09 – Estrutura química de um lipopeptídeo.
Fonte: NITSCHKE; PASTORE, 2002
34
3.4 VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS BIOSSURFACTANTES EM
COMPARAÇÃO AOS SURFACTANTES SINTÉTICOS
Os biossurfactantes são tão ou mais eficientes e efetivos com relação à
atividade superficial e interfacial do que os surfactantes convencionais (detergentes
aniônicos sulfatados), pois produzem menor tensão superficial com menores
concentrações de produto ativo (SANTOS et al., 2007; NITSCHKE; PASTORE,
2003). Alguns biossurfactantes apresentam elevada estabilidade térmica, de pH e
força iônica, podendo ser utilizados em ambientes com condições mais drásticas do
que as suportadas pelos surfactantes convencionais. Como exemplo, tem-se que a
maioria dos biossurfactantes suporta concentrações de 10 % de NaCl (Cloreto de
Sódio) enquanto que uma concentração de 2-3 % é suficiente para inativar os
surfactantes convencionais (DE ARAUJO; FERREIRA; NITSCHKE, 2013).
Observando o destino final dos surfactantes utilizados na indústria, note-se
que na maioria das vezes essas substâncias são jogadas ao meio ambiente sem
nenhuma preocupação ou tratamento. O acúmulo dessa substância no ambiente
afeta seriamente o ecossistema, causando inclusive toxicidade aos mamíferos e
bactérias (DE MORAIS; DE ANGELIS, 2012).
Os surfactantes apresentam marcante atividade biológica. Eles são capazes
de interagir com componentes da membrana celular, tais como peptídeos e lipídeos,
aumentando a permeabilidade celular. O tensoativo também promove alterações na
estrutura das mitocôndrias e na fosforilação oxidativa, inibindo a síntese de DNA e
modificando a permeabilidade da membrana ao potássio (ROMANELLI, 2004).
Outro fato preocupante é a formação de espumas em rios pela presença dos
tensoativos. Através dela, poluentes tóxicos, impurezas e vírus são disseminados
pelo vento a grandes distâncias. Além disso, ocorre a formação de uma película
isolante na superfície da água, diminuindo a troca gasosa com a atmosfera e inter-
ferindo na qualidade da água (DE MORAIS; DE ANGELIS, 2012; ROMANELLI,
2004).
Dentro desse contexto, uma das grandes vantagens em relação aos
surfactantes sintéticos, é que os biossurfactantes são prontamente biodegradáveis
na água e no solo, apresentando uma melhor compatibilidade ambiental, o que os
35
torna adequados para aplicações como biorremediação e tratamento de resíduos
(DE ARAUJO; FREIRE; NITSCHKE, 2013). Além disso, os biossurfactantes
possuem baixa toxicidade por isso são atrativos, já que os produtos sintéticos tem
sido motivo de preocupação da população devido aos seus efeitos alergênicos. Além
disso, essa baixa toxicidade permite o uso em alimentos, cosméticos e produtos
farmacêuticos (DE MORAIS; DE ANGELIS, 2012; DE ARAUJO; FREIRE;
NITSCHKE, 2013).
Os biossurfactantes também apresentam a vantagem de não serem derivados
de petróleo. Esses tensoativos podem ser produzidos a partir de substratos
renováveis fazendo com que não dependam das variações sazonais do preço do
petróleo como é o caso dos sintéticos. Outra característica importante também é a
possibilidade de modificação da estrutura química e das propriedades físicas dos
biossurfactantes através de manipulações genéticas, biológicas ou químicas permite
o desenvolvimento de produtos para necessidades específicas (DE MORAIS; DE
ANGELIS, 2012).
É graças a esse conjunto de vantagens que os biossurfactantes estão sendo
considerados como uma opção ao uso de tensoativos sintéticos, além do que, com o
aumento da preocupação ambiental entre os consumidores, juntamente com as
legislações de controle do meio ambiente e pela necessidade de substituição de
compostos não biodegradáveis ou pouco biodegradáveis, novas alternativas devem
ser utilizadas.
3.5 APLICAÇÕES INDUSTRIAIS DOS BIOSSURFACTANTES
O maior mercado para os biossurfactantes é a indústria petrolífera, onde são
utilizados na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos
lubrificantes. Outras aplicações incluem biorremediação e dispersão no
derramamento de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de
estocagem, e a recuperação melhorada de petróleo. Porém, atualmente, as
36
aplicações se distribuem entre os mais diversos setores industriais (NETSCHKE;
PASTORE, 2002).
3.5.1 RECUPERAÇÃO MELHORADA DO PETRÓLEO (MEOR)
A extração primária de petróleo geralmente acontece auxiliada pela grande
pressão dos fluidos presentes dentro do posso. Quando a pressão já não é
suficiente para expurgar o petróleo para fora do poço se faz necessária a injeção de
água ou gás dentro dos poços para que ocorra o aumento de pressão e uma nova
etapa de extração possa ser feita. Porém, graças à alta viscosidade do óleo do
reservatório e elevadas tensões interfaciais entre os fluidos injetados e o óleo, os
fluidos injetados tendem a percorrer as regiões mais permeáveis, deixando
quantidades substanciais de óleo nas rochas porosas (CORREIA; FRANÇA;
MOTHÉ, 2004).
A MEOR consiste em uma tecnologia de recuperação do petróleo que utiliza
microrganismos ou produtos de seu metabolismo para a recuperação de óleo
residual. Os microrganismos produzem polímeros e surfactantes que reduzem a
tensão superficial óleo-rocha, reduzindo as forças capilares que impedem a
movimentação do óleo através dos poros da rocha. Os biossurfactantes também
auxiliam na emulsificação e na quebra dos filmes de óleo das rochas (BANAT,
1995).
A utilização de biossurfactantes em MEOR envolve várias estratégias, como a
injeção de microrganismos produtores de biossurfactantes no reservatório e
subsequente propagação in situ, ou a injeção de nutrientes no reservatório,
estimulando o crescimento de microrganismos selvagens produtores de
surfactantes. Para serem úteis na MEOR in situ os microrganismos devem ser aptos
a crescer em condições extremas, como alta temperatura, pressão, salinidade e
baixa tensão de oxigênio (KARANTH; DEO; VEENANADIG, 1999).
Ainda há a possibilidade de produção de biossurfactantes em reatores e
posterior injeção no reservatório. Essa estratégia é mais cara devido à necessidade
de capital para produção, purificação e introdução do biossurfactante. As outras
37
requerem que o reservatório contenha bactérias capazes de produzir quantidades
suficientes de biossurfactantes (BANAT, 1995).
3.5.2 APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
Diversas são as aplicações dos biossurfactantes para favorecer a saúde
humana. Estes compostos podem atuar como antibióticos, agentes antivirais e
antitumorais, imunomoduladores ou inibidores de enzimas e toxinas. O modo de
ação de muitos desses compostos não foi esclarecido em detalhe até o momento,
apesar de se saber que suas atividades de superfícies e de membrana
desempenham um papel importante em diversos sistemas (BARROS et al., 2007).
A surfactina, um dos mais conhecidos biossurfactantes, possui várias
aplicações farmacêuticas como a inibição da formação de coágulos; formação de
canais iônicos em membranas; atividade antibacteriana e antifúngica; atividade
antiviral e antitumoral. O biossurfactante produzido por Rhodococcus erythropolis
inibiu o vírus do herpes simples e vírus parainfluenza (NITSCHKE; PASTORE,
2002).
A iturina, lipopeptídio produzido por Bacillus subtilis, demonstrou atividade
antifúngica, afetando a morfologia e a estrutura da membrana celular de leveduras.
A inibição da adesão de bactérias entéricas patogênicas por biossurfactante
produzido por Lactobacillus foi relatada. Os autores sugeriram o desenvolvimento de
agentes antiadesivos para uso em cateteres visando diminuir a formação de
biofilmes (VELRAEDS et al., 1996).
3.5.3 BIORREMEDIAÇÃO
A biorremediação é uma tecnologia que utiliza o metabolismo de
microrganismos para eliminação rápida de poluentes presentes no ambiente ou a
38
sua redução a níveis de concentração aceitáveis (COLLA; COSTA, 2003). Nesse
contexto os biossurfactantes vêm despertando um grande interesse na remediação
de solos e ambientes marinhos, visto que além de apresentarem uma estrutura
química favorável, possui propriedades benéficas para a remediação, são produtos
biodegradáveis, o que os tornam aceitáveis na aplicação em ambientes
contaminados (NITSCHKE; PASTORE, 2002; SANTOS, 2016).
Os biossurfactantes podem ser utilizados, diretamente no ambiente, como
agentes emulsificantes para aumentar a solubilidade de contaminantes hidrofóbicos
no ambiente. A capacidade dos biossurfactantes em emulsificar e dispersar
hidrocarbonetos aumenta a degradação destes compostos no ambiente
(NITSCHKE; PASTORE 2002).
Alternativamente, podem ser utilizados microrganismos produtores ou a
adição de fatores de crescimento de microrganismos selvagens capazes de produzir
estes compostos. Alguns estudos demonstraram o aumento da biodisponibilidade de
compostos aromáticos pouco solúveis como os aromáticos policíclicos (HPA) pelo
uso de biossurfactantes. O tratamento de amostras contaminadas por fenantreno e
naftaleno com biossurfactantes resultou em aumento nas suas taxas de
mineralização e solubilização (MILLER, 1995).
A biodegradação de hidrocarbonetos derivados do petróleo por
biosurfactantes ocorre através de dois mecanismos. O primeiro envolve um aumento
na biodisponibilidade do substrato hidrofóbico para microrganismos, com a
consequente redução da tensão de superfície do meio em torno da bactéria bem
como uma redução da tensão interfacial entre a parede da célula e moléculas de
hidrocarbonetos. O outro mecanismo envolve a interação entre o biossurfactante e
da superfície celular, conduzindo a alterações na membrana, o que facilita a adesão
de hidrocarboneto (aumento na hidrofobicidade) e a redução do índice de
lipopolissacarideo da parede celular, sem danificar a membrana. Assim, os
tensoativos bloqueiam a formação de pontes de hidrogénio e permitem a interações
hidrofóbica-hidrófila, o que causa rearranjos moleculares e reduzem a tensão
superficial do líquido ao aumentar a sua área de superfície, bem como a promoção
da biodisponibilidade e consequente biodegradabilidade (SANTOS, 2016).
Além da biorremediação de hidrocarbonetos que geralmente acontecem em
acidentes derramamento de petróleo, os biossurfactantes também são empregados
39
em biorremediaçãos contra outros agentes poluentes. Vem sendo objeto de
investigação o uso de biossurfactantes na biodegradação de pesticidas. A
degradação de hexaclorociclohexano por surfactante produzido por Pseudomonas
foi relatada, sendo que outros organoclorados como DDT e ciclodienos também
foram emulsificados em menor grau (KARANTH; DEO; VEENANADIG, 1999;). Os
biossurfactantes também são úteis na biorremediação de locais contaminados com
metais pesados tóxicos como urânio, cádmio e chumbo (MILLER, 1995).
3.5.4 AGRICULTURA
Os biossurfactantes são usados na agricultura especialmente em formulações
de herbicidas e pesticidas. Os compostos ativos destas formulações são geralmente
hidrofóbicos, sendo necessários agentes emulsificantes para dispersá-los em
soluções aquosas (LIN, 1996).
Outro nicho de ação dos biossurfactantes Estudos desenvolvidos por Mnif et
al (2015), demonstram que a surfactina, um biossurfactante de caráter lipopeptídico,
demonstra propriedades antifúngicas podendo ser utilizado como um fungicida
natural no combate contra fungos que infestam plantações de batatas e tomates. O
que se torna mais adequado dentro da recente demanda por gestões de pragas
ecologicamente amigáveis.
Sachdev e Cameotra (2013), comentam que muitos benefício são gerados
nas lavouras quando existe a associação de rizobactérias produtores de
biossurfactantes às raízes de plantas. Os tensoativos produzidos por essas
bactérias aumentam a biodisponibilidade de moléculas hidrofóbicas que servem
como nutrientes para a planta, facilitando assim assimilação desse recurso. Esse
biossurfactante também proporcionam uma maior molhabilidade do solo o que
promove uma distribuição adequada de fertilizantes químicos no solo e contribuindo
para o desenvolvimento do vegetal.
40
3.5.5 MINERAÇÃO
Compostos tensoativos produzidos por culturas de Pseudomonas sp. e
Alcaligenes sp. foram utilizados para flotação e separação de calcita e eschelita. A
recuperação foi de 95% para CaSO4 e 30% para CaCO3, ressaltando que reagentes
químicos convencionais são incapazes de separar estes dois minerais. O
biodispersan, polissacarídeo aniônico, produzido por A. calcoaceticus A2, foi
utilizado na prevenção da floculação e dispersão de misturas de pedra calcárea e
água. Biossurfactantes de C. bombicola demonstraram eficiência na solubilização de
carvão (DA SILVA, 2012).
3.5.6 PRODUTOS DE HIGIENE E COSMÉTICOS
Dentre os milhares de componentes que estão disponíveis para formulações
cosméticas, a água é o mais utilizado. Como nem todos os ingredientes cosméticos
são miscíveis à água, ocorre uma necessidade prática de estabilizar e suspender as
misturas heterogêneas de água com outras matérias primas como: líquidos
parafínicos, óleos vegetais, ceras naturais e sintéticas e pigmentos inorgânicos
através de um processo de emulsificação no qual uma das fases está dispersa na
outra. Assim, emulsões cosméticas, basicamente cremes e loções, são conhecidas
pelos pesquisadores como sendo misturas relativamente estáveis de água e
componentes oleosos ou graxos, na presença de um emulsionante ou também
chamado de surfactante (COSTA, 2005).
Muitos biossurfactantes apresentam compatibilidade com a pele, com isso
são utilizados em produtos de higiene e cosméticos. Um produto comercial que
utilizava na sua composição uma complementação de soforolipídeo apresentou
excelente compatibilidade dérmica, sendo utilizado como hidratante em cremes
faciais. Alguns soforolipídeos também são usados como umectantes para
incorporação em produtos de maquiagem (COLLA; COSTA, 2003).
41
3.5.7 INDÚSTRIA DE ALIMENTOS
Tendo como foco a indústria de alimentos podemos ver que a propriedade de
emulsificação tem um papel importante na formação da consistência e textura, bem
como na dispersão de fase e na solubilização de aromas (DA SILVA 2012). Os
biossurfactantes são utilizados como emulsionantes no processamento de matérias-
primas. Os agentes tensoativos encontram aplicação em panificação e produtos
derivados de carne, onde influenciam as características reológicas da farinha e a
emulsificação de gorduras. O biossurfactante produzido por Candida utilis tem sido
utilizado em molhos prontos para saladas (KARANTH; DEO; VEENANADIG, 1999).
Apesar da aplicação potencial, a indústria de alimentos não utiliza ainda os
biossurfactantes como aditivos em larga escala. Muitas propriedades dos
biossurfactantes necessitam de aprovação para sua regulamentação como novo
ingrediente para alimentos (DA SILVA, 2012).
3.6 Bacillus e Paenibacillus sp
Bactérias em forma de bastonete, que se diferenciam em endósporos, sob
condições aeróbicas eram tradicionalmente atribuídas ao gênero Bacillus. Como
resultado desta simples definição e a importância atribuída à esporulação, uma
coleção muito diversificada de microrganismos foi atribuída a esse gênero. Mais de
60 espécies foram agrupadas nesse gênero (ASH; PRIEST; COLLINS, 1993).
Os organismos incluídos nesse grupo apresentam uma enorme variedade de
fenótipos incluindo, por exemplo: aeróbios, anaeróbios facultativos, rigorosos e até
mesmo acidófilos, alcalófilos, quimioautotróficos, halófilos, psicrófilos e termófilos.
Em adição a esta heterogeneidade fenotípica muito considerável, a composição de
bases de DNA cromossómico varia de 33 a 64 mol% de G + C (guanina + citosina),
o que é demasiado grande para ser abrangidas por um único gênero (ASH; PRIEST;
COLLINS, 1993; DAANE et al., 2002).
42
Ao longo da última década grandes avanços foram feitos para elucidar as
inter-relações naturais de Bacillus. Em particular a catalogação de oligonucleotídeos
do RNAr 16s e posteriormente à compreensão da análise de sequenciamento do
16S rRNA demonstraram que o gênero Bacillus é filogeneticamente muito
heterogênea. Análises de sequências mais abrangentes mostraram a presença de
pelo menos 5 linhas altamente divergentes dentro do gênero (ASH et al., 1991).
Em 1993, Ash, Priest e Collins (1993), desenvolveram um trabalho onde
foram apresentadas evidências filogenéticas e fenotípicas incluindo a descrição de
uma sonda altamente específica com base em assinaturas características dentro do
RNAr 16S que forneceram evidencias para a atribuição de algumas das espécies de
anaeróbios facultativos em um novo gênero, denominado Paenibacillus, além de
fornecer meio de diferenciar de forma inequívoca membros deste novo gênero de
outros bacilos formadores de esporos.
As bactérias do gênero Paenibacillus são células com formato de bastonete,
gram positivas, gram negativas ou gram lábeis. Possuem motilidade por meio de
flagelos peritricosos. Produzem esporos elipsoidais que são formados em
esporângios inchados. Nenhum pigmento solúvel é produzido em agar nutriente.São
facultativamente anaeróbias ou estritamente aeróbicas. Quase todas as espécies
são positivas para catalase. Paenibacillus larvae subsp. larvae e Paenibacillus larvae
subsp. pulvifaciens são negativas para catalase. Atividade de oxidase é variável
(SHIDA, 1997).
A reação de Voges-Proskauer (produção de acetilmetilcarbinol) é variável, e o
pH no caldo de Voges-Proskauer é inferior a 6,0. Sulfeto de hidrogênio não é
produzido. Indol é produzido por algumas espécies. Redução de nitrato em nitrito é
variável (SHIDA, 1997).
Paenibacillus possuem uma ampla distribuição, podendo ser isoladas das
mais variadas fontes incluindo solo, água, rizosfera de plantas, materiais vegetais,
forragem e fezes. Sabe-se que esse gênero possui espécies que promovem a
interação entre fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e as raízes de plantas
(HILDEBRANDT et al., 2006). Outros estudos apontam espécies desse mesmo
gênero como bons produtores de biossurfactantes, geralmente lipopeptídeos com
grandes propriedades tensoativas e apresentando também atividade antimicrobiana.
43
3.7 MANDIOCA E MANIPUEIRA
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma raiz cultivada a mais de 5.000
anos na América Tropical, que teve a sua origem no Brasil, região amazônica
fronteiriça com a Venezuela. Essa raiz tuberosa é utilizada como alimento por mais
de 400 milhões de pessoas no mundo, sobretudo nos países em desenvolvimento
onde é a principal fonte de carboidrato para a população de menor poder aquisitivo
(BEZERRA, 2012). A maior parte da sua produção destina-se à fabricação de
farinha de mandioca e o restante divide-se entre alimentação humana, animal e
processamento para amido (fécula) (CHISTE et al., 2006).
De acordo com Santos e colaboradores (2011), outra característica
importante da mandioca é a presença de linamarina e lotaustralina, que são
glicosídeos cianogênicos potencialmente tóxicos. As variedades com alto teor de
glicosídeo na polpa das raízes, além de oferecerem riscos de envenenamento, tem
sabor desagradável, sendo, por isso, classificadas como bravas ou amargas e,
variedades in natura com sabor agradável, são classificadas como mansas.
Mikumbira e colaboradores (2003), observaram que o sabor amargo é perceptível
quando as concentrações de glicosídeos cianogênicos são superiores a 100-150 mg
eq. de HCN kg-1 de massa fresca de raízes.
Um dos principais subprodutos no processamento da mandioca para
obtenção da farinha ou fécula é a manipueira. É um líquido leitoso amarelo-claro,
contendo açúcares, gomas, proteínas, linamarina, derivados cianogênicos, sais e
outras substâncias (CEREDA, 2001). Na tabela 1 está presente a caracterização
físico-química da manipueira realizada por Cereda (2001), utilizando amostras
coletadas em indústrias de processamento de mandioca.
A manipueira é rica em linamarina que é um glicosídeo cianogênico tóxico do
qual provém o HCN (ácido cianídrico), bastante volátil (GONZAGA et al., 2007).
Assim, caso seja lançada diretamente em cursos d'água, onde comumente são
despejados os resíduos líquidos industriais, a manipueira pode representar grave
problema para o meio ambiente (CEREDA, 2001).
44
Tabela 2 – Características físico-químicas da manipueira
Fonte: CEREDA, 2001
Em trabalho realizado no município de Maringá, Estado do Paraná, Silva et al.
(2005), verificaram efeito fertilizante da manipueira na cultura do sorgo. Aragão e Da
Ponte (1995), encontraram resultados que evidenciaram a superioridade das plantas
tratadas com manipueira como adubo foliar em várias diluições na cultura do quiabo
(Hibiscus sculentus L.). Vieites e Brinholi (1994) encontraram respostas positivas
para a utilização deste extrato líquido associado à adubação mineral na cultura da
mandioca, com aumento do comprimento e diâmetro das raízes e elevação da
produtividade.
Tendo em vista a facilidade para a obtenção e o baixo custo da manipueira,
considera-se que a sua utilização como fertilizante possa ser uma alternativa de
substituição dos adubos químicos industrializados. No entanto, para viabilizar essa
utilização, além da determinação de dosagem adequada para cada espécie vegetal,
fazem-se necessários cuidados prévios como o aquecimento para evitar os impactos
45
ambientais decorrentes de composto tóxicos presentes em sua constituição. Estas
etapas, prévias ao uso, encarecem a sua aplicabilidade.
No Brasil, não há o devido reconhecimento da manipueira, pela sociedade do
setor agroindustrial, como sendo um potencial agente de poluição do meio ambiente.
Considerando as medidas atuais de proteção e recuperação ambiental que vem se
expandindo em todos os setores, a sociedade está sendo conduzida para uma
reflexão mais profunda quanto às práticas adotadas pelo setor agroindustrial. O
aprofundamento na utilização dos recursos potencialmente poluentes e
aproveitáveis faz-se necessário. O setor agroindustrial brasileiro gera uma grande
quantidade de resíduos que podem ser usados como substrato para o crescimento
celular com aplicação biotecnológica. A matéria orgânica presente nesse material
pode ser usada como fonte de energia para o crescimento e para a síntese de
biomassa celular. A utilização dos resíduos da agroindústria, além de fornecer
diferentes alternativas de substratos para fermentação, também ajuda na diminuição
dos problemas de poluição (SILVA et al., 2005; PANDEY et al., 1999).
46
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 TABELA DE ATIVIDADES
A tabela abaixo descreve as atividades realizadas dentro do presente estudo.
Tabela 3 – Tabela de atividades/
Crescimentos Etapas de análises
Crescimento 1
Crescimento 2
Crescimento 3
1º Etapa
Análise do crescimento
Bacteriano
- Variação da
concentração de
Oxigênio
------
- Variação da
concentração de
amido e açucares
redutores
2ºEtapa
Análise da produção
de Biossurfactante
------
- Variação da
concentração de
Ramnose
- Variação da tensão
superficial
- Variação do índice de emulsificação
- Variação da
concentração de
Ramnose
- Variação da tensão
superficial
- Variação do índice de
emulsificação
- Diluição micelar
crítica
3º Etapa
Análise da
manutenção das
propriedades
tensoativas do
Biossurfactante
------
------
- Variação da tensão
superficial diante a
variação de pH,
Salinidade e
Temperatura
47
4.2 ISOLAMENTO do Paenibacillus sp
As cepas de Paenibacillus sp. foram isoladas de resíduos agrícolas, em
trabalhos anteriores, conforme protocolo previamente estabelecido no laboratório e
brevemente descrito a seguir.
A torta de dendê é um subproduto resultante da polpa seca do fruto, após
moagem e extração do óleo (BARROS; FERNANDES, 2013). Esse resíduo foi
coletado na fazenda Juerana localizada no Km 12, Rodovia Ilhéus-Itacaré. Após sua
coleta, a torta de dendê foi lavada com água corrente e armazenada em sacos
plásticos limpos, sendo transportados para processamento com intervalo de no
máximo 8h. Antes do processamento, foi feita uma separação e identificados de
acordo com a parte da planta coletada (cascas, folhas, galhos, etc.). Em seguida, os
resíduos agrícolas foram triturados separadamente e armazenados em frascos de
vidro estéreis (DE JESUS, 2013).
Amostras de 1g da torta foram trituradas e adicionadas em solução aquosa
contendo: 0,01% CaCl2, 0,02% de NH4Cl, 0,01% de MgSO4, 0,01% de K2HPO4, para
enriquecimento. Em seguida a solução foi incubada a 37º C, sob agitação, por 48 h.
Alíquotas desta solução foram plaqueadas em meio sólido contendo ágar, meio
mínimo e amido como única fonte de carbono. Colônias isoladas foram repicadas
novamente em placas separadas contendo ágar, meio mínimo e amido como única
fonte de carbono. Em seguida, as colônias isoladas foram mantidas em meio Miller
Hinton, caracterizadas pelo método de Gram. Subsequentemente, foi identificada
como Paenibacillus sp. por sequenciamento de gene do RNAr 16S (DE JESUS,
2013).
4.3 OBTENÇÃO DA MANIPUEIRA
A manipueira foi coletada na Fazenda Maré, localizada na rodovia BA 233,
Conde, BA. Assim que coletada, foi congelada, em garrafas pet, para inibir a ação
48
de microrganismos durante o seu transporte até ao Laboratório de Biotecnologia
Industrial (LBI), localizado no Instituto de Ciências da Saúde (ICS) da UFBA.
Logo após a seu transporte ao LBI, a manipueira foi aquecida até a fervura
para inativação das enzimas e microrganismos fermentativos presentes, como
também para remoção do material sólido insolúvel. Após resfriamento em
temperatura ambiente, a manipueira foi centrifugada a 3000 rpm por 30 minutos. O
sobrenadante foi armazenado em frascos plásticos de 2 L a -20°C (BEZERRA,
2012).
4.4 PRODUÇÃO DO INÓCULO
Inóculo é a denominação dada a suspenção, em meio líquido, de
microrganismos em concentração adequada para ser utilizado nos crescimentos da
bactéria.
O preparo do inóculo consiste em adicionar 1mL de amostra congelada da
bactéria a 250mL de meio LB (Luria Bertani) líquido, contendo 1,25g de extrato de
levedura, 2,5g de peptonas e 2,5g de NaCl. Após 48h crescimento o inóculo estava
pronto para ser utilizado nos crescimentos.
4.5 CULTIVO DA BACTÉRIA NA MANIPUEIRA
4.5.1 Crescimento 1 (Em Biorreator)
O crescimento da Paenibacillus sp em Biorreator (BIO-TEC da TECNAL) foi
realizado, utilizando-se 600mL de manipueira como caldo de cultivo e adicionado 6
mL de inóculo da bactéria para crescimento. Temperatura, pH e transferência de
massa (agitação e aeração) foram controlados automaticamente. A bactéria foi
cultivada a 37°C, com agitação a 400 rpm e com 100% de abertura da válvula de
controle de passagem de ar.
49
4.5.2 Crescimento 2 (Em Erlenmeyer)
O crescimento aconteceu em triplicata, utilizando erlenmeyers de 250mL
contendo 70mL de manipueira previamente tratada e 0,7mL de inóculo. Antes da
inoculação o meio foi autoclavado a 121°C por 20 minutos. Após a inoculação os
Erlenmeyer foram colocados em estufa com shaker a uma temperatura de 31°C e
uma rotação de 120 rpm. O crescimento teve uma duração de 120h.
Amostras foram coletadas a cada 12h, centrifugadas a 20.000 rpm para a
retirada das células e o sobrenadante foi congelado para que pudessem ser
analisados futuramente.
4.5.3 Crescimento 3 (Em Erlenmeyer)
O crescimento aconteceu em triplicata, utilizando erlenmeyers de 250mL
contendo 140mL de manipueira previamente tratada e 1,4 mL de inóculo. Antes da
inoculação o meio foi autoclavado a 121°C por 20 minutos. Após a inoculação os
Erlenmeyer foram colocados em estufa com shaker a uma temperatura de 31°C e
uma rotação de 120 rpm. O crescimento teve uma duração de 120h.
Amostras foram coletadas a cada 12h, centrifugadas a 20.000 rpm para a
retirada das células e o sobrenadante foi congelado para que pudessem ser
analisados futuramente.
4.6 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES PELA BACTÉRIA
UTILIZANDO COMO MEIO DE CULTURA A MANIPUEIRA.
4.6.1 DOSAGEM DE AMIDO
Para constatação do consumo do substrato energético, foi testada a hidrólise
do amido contido no meio. Para tal, um método colorimétrico utilizando a coloração
azul gerada quando há a formação do complexo amido-iodo foi utilizado. O protocolo
utilizado por De Jesus (2013), foi adaptado para realização das leituras em
microplacas.
50
Assim, 60 µL do das amostras livres de células foram misturadas a 540 µL de
água por osmose reversa. Dessa diluição foi retirado 15µL que foi misturado a 285
µL de lugol a 4%. A mistura foi lida em espectrofotômetro da marca Thermo
Scientific modelo Multiskan GO UV/Vis, a 620 nm. O lugol (reativo iodo-iodeto) foi
preparado diluindo a 4% um solução de KI 30g/L e I2 3g/L.
4.6.2 DOSAGEM DE AÇÚCARES REDUTORES
Os açúcares redutores foram dosados pela reação com o ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS). O protocolo utilizado por de Jesus (2013), foi ajustados para
leitura em microplacas.
As amostras livres de células foram diluídas previamente 20 vezes. Das
diluições foram retirados 35µL e misturados a 15µL de DNS.
A microplaca foi selada com filme plástico para evitar a entrada ou saída de
água dos poços. Logo após, a microplaca foi colocado em banho-maria a 100 °C
durante 5 minutos.
Após o resfriamento até a temperatura ambiente, as amostras foram lidas em
espectrofotômetro da marca Thermo Scientific modelo Multiskan GO UV/Vis numa
absorbância de 490 nm.
4.7 AVALIAÇÃO DO O CRESCIMENTO DA BACTÉRIA UTILIZANDO MANIPUEIRA
COMO MEIO DE CULTURA
4.7.1 DOSAGEM DE RAMNOSE
Sempre em triplicatas, o método foi aplicado adicionando-se 4,5 mL de
solução de ácido sulfúrico a 1 mL de amostra do caldo de crescimento livre de
células, numa diluição de 1:1000, acondicionando a mistura em tubo de ensaio com
tampa de rosca. Os tubos contendo esta solução foram colocados em banho Maria a
51
100°C, por 10 min e resfriados a temperatura ambiente. Após o resfriamento,
adicionou-se 0,1mL de solução de ácido tioglicólico. Os tubos foram
homogeneizados em vortex e guardados na ausência de luz por três horas.
Passadas as três horas foram feitas em cada amostra duas leituras de absorbância
em comprimentos de onda de 400 e 430 nm em um espectrofotômetro da marca
Biospectro, modelo SP220 (CHANDRASEKARAN; BEMILLER, 1980). Após a
obtenção das leituras nos diferentes comprimentos de onda foi feita a subitração das
leituras seguindo a seguinte equação para conseguir a leitura de absorbância
referente à concentração de ramnose.
Leitura de ABS (absorbância) da Ramnose = ABS 400nm – ABS 430nm
4.7.2 TENSÃO SUPERFICIAL
O método do anel de Du Nouy é utilizado para a medida a tensão superficial
de um líquido. Para realizar a medição, sempre em triplicatas, foi utilizado um
tensiômetro da Sigma, modelo 702/702ET, que mede a força necessária para
remover um anel de platina da superfície do líquido a ser testado.
O valor lido na escala no ponto de desprendimento é a força exercida pela
superfície do líquido sobre o anel, ou seja, a tensão superficial (DOS REIS, 2007).
Para cada leitura foram utilizados 10mL do caldo de crescimento livre de
células.
4.7.3 ÍNDICE DE EMULSIFICAÇÃO
A atividade emulsificante foi determinada de acordo como o método descrito
por Cooper e Goldenberg (1987). Foram misturados 6 ml de querosene a 4 ml do
caldo de crescimento livre de células, dentro de um tubo de ensaio com tampa
rosqueada. A mistura foi agitada em vórtex a alta velocidade durante 2 min. As
52
medições foram feitas 24h depois. O índice de emulsão (E24), um valor percentual,
corresponde à altura da camada de emulsão, dividido pela altura total do líquido,
multiplicada por 100, conforme equação abaixo:
Sendo: HEM= altura da camada emulsificante
Ht= altura total do líquido
4.7.4 DETERMINAÇÃO DA DILUIÇÃO MICELAR CRÍTICA (DMC) DO EXTRATO
BACTERIANO LIVRE DE CÉLULAS
Diluição micelar crítica é o número de diluições necessárias para se alcançar
a concentração micelar crítica. A amostra foi diluída sucessivas vezes com água
destilada e em cada diluição foi medida a tensão superficial do meio diluído. Na
diluição que apresenta o aumento da tensão superficial do meio, esta diluição é
considerada a diluição micelar crítica e no meio existe a concentração
correspondente a concentração micelar crítica. A tensão superficial foi estimada pela
pelo método do anel de du Nouy por um tensiômetro da marca Sigma, modelo
702/702ET (ROSSMANN, 2008).
4.8 ESTUDOS DE ESTABILIDADE
No intuito de caracterizar melhor o biossurfactante, após a criação de uma
curva de emulsificação e de tensão superficial, foram feitos alguns testes nos pontos
que apresentaram menor tensão superficial e maior índice de emulsificação (120h),
que observaram a estabilidade das propriedades tensoativas desse surfactante em
diferentes temperaturas, pH e níveis de salinidade no meio.
53
4.8.1 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE TEMPERATURA
Para se avaliar o efeito da temperatura na atividade emulsificante, tubos de
ensaio com tampa rosqueada, contendo 10 mL do caldo de crescimento livre de
células, foram mantidas em banho-maria a temperatura de 100°C. Nos tempos de
15, 30, 60 e 70 minutos no banho-maria e a 121°C por 15 minutos na autoclave, as
amostras foram resfriadas do aquecimento e foram resfriadas a temperatura
ambiente. Após resfriamento, determinou-se a tensão superficial da amostra
(ROCHA et al., 2007).
4.8.2 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE pH
Amostras de 10mL do meio livre de células após 120h de crescimento foram
utilizadas para essa análise.
O pH das amostras foi ajustado para diferentes valores de pH (2, 4, 6, 8, 10 e
12), utilizando a base NaOH (1M) e o ácido HCl (1M). Após 30 minutos, foi verificada
a tensão superficial em cada valor de pH (BEZERRA, 2012).
4.8.3 ESTABILIDADE EM VARIAÇÃO DE SALINIDADE
O efeito da salinidade foi determinado variando a concentração de NaCl para
1, 5, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25% (p/v) ao adicionar as quantidades do sal
correspondente às concentrações desejadas, ao meio de crescimento livre de
células e agitando o mesmo até dissolver todo o sal. As amostras permaneceram em
repouso por 3 horas, verificando-se a tensão superficial em seguida (BEZERRA,
2012; NITSCHKE; PASTORE, 2006).
Amostras de 10mL do meio livre de células após 120h de crescimento foram
utilizadas para essa análise.
54
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 AVALIAÇÃO DO O CRESCIMENTO DA BACTÉRIA UTILIZANDO MANIPUEIRA
COMO MEIO DE CULTURA.
O crescimento 1 foi feito em um biorreator a fim de dar início às análises de
crescimento. Para a constatação do crescimento bacteriano e a construção da curva
de crescimento, em um meio de cultura líquido, geralmente utiliza-se a densitometria
ótica que conta com o auxílio do espectrofotômetro em leituras de absorbância da
luz na amostra e assim chegar à quantificação da concentração de microrganismos
dentro daquele intervalo de tempo estudado (LUDWIG; OLIVA-NETO; ANGELIS,
2001), ou a contagem de microrganismo que utiliza diluições seriadas e contagem
de em placa das colônias para saber a quantidade de células viáveis no meio de
cultura (VERMELHO; PEREIRA; COELHO, 2006).
No entanto, inicialmente foi utilizada a concentração de oxigênio do meio, que
foi captado pelo sensor presente no biorreator, como indicativo do desenvolvimento
da bactéria na manipueira. O gráfico abaixo mostra a variação da concentração de
oxigênio no meio dentro de um período de 48h de crescimento.
Gráfico 01 – Variação da concentração ao decorrer do crescimento
55
Posteriormente, no crescimento 3 foi dosada a quantidade de amido e a
quantidade de açúcar redutor para constatação do consumo do substrato pela
bactéria. O gráfico abaixo demonstram os resultados.
Gráfico 02 – Variação de concentração de amido e açúcares redutores ao decorrer
do crescimento
A variação da concentração de amido e glicose no meio mostra um
comportamento dessa bactéria já visto em trabalhos anteriores (DE JESUS, 2013).
A inibição da produção de amilase pela presença de glicose em solução é
conhecida como repressão catabólica (MONTEIRO; ULHOA, 2006; FERNANDES et
al., 2007). Inicialmente a bactéria produz amilase com o intuito de utilizar o amido
como fonte de energia e carbono, com o aumento da concentração de glicose
graças à quebra do amido, ocorre a inibição da produção de amilase. Nota-se esse
padrão quando se observa o decréscimo na concentração de amido de 0h para 36h
e a manutenção com pouquíssima variação da concentração de amido até o fim do
crescimento.
Somado a isso, pode ser observado, no mesmo tempo onde observamos o
decréscimo de amido, o aumento da concentração de glicose e logo após o seu
consumo, pela bactéria, mostrado pela diminuição progressiva de sua concentração.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0h 36h 72h 120h
Co
nce
ntr
ação
(g/
L)
Tempo (horas)
amido
açu. redt.
56
Com isso, a variação da concentração de oxigênio no meio juntamente com a
variação da concentração de amido e açucares redutores, demonstram com clareza
a disposição que o microrganismo teve em se desenvolver na manipueira e também
o potencial de utilização da manipueira como fonte de carbono e energia sem
necessidade de complementações.
5.2 AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DE BIOSSURFACTANTES PELA BACTÉRIA
UTILIZANDO COMO MEIO DE CULTURA A MANIPUEIRA.
5.2.1 CURVA DE CONCENTRAÇÃO DE RAMNOSE
Inicialmente acreditava-se que o biossurfactante produzido fosse o
ramnolipídeo, com isso dosagens de ramnose foram feitas para a constatação da
produção desse biossurfactante pelo microrganismo. Os gráficos 03 e 04
demonstram os resultados obtidos a partir do crescimento 2 e 3 respectivamente.
Gráfico 03 – Variação da leitura de absorbância em 400 e 430 nm para obtenção da
leitura de ramnose no crescimento 2
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 108h 120h
leit
ura
de
ab
sorb
ânci
a
Tempo (horas)
400 nm
430 nm
57
Gráfico 04 – Variação da leitura de absorbância em 400 e 430 nm para obtenção da
leitura de ramnose no crescimento 3
No gráfico 3 e 4 pode ser observada a diminuição gradual das leituras de
absorbância. De acordo com Cahndrasekaran e Bemiller (1980), as leituras
representam a absorbância das hexoses presentes no meio analisado, dessa forma
mais uma vez pode se observar o consumo do substrato pela bactéria indicando sua
disposição em se desenvolver na manipueira. A variação da concentração de
ramnose gerada a partir da subtração das leituras de absorbância no comprimento
de onda de 400 e 430, do crescimento 2 e 3 estão demonstradas nos gráficos 5 e 6.
Gráfico 05 – Variação da concentração de ramnose no decorrer do crescimento 2
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0,1200
0,1400
0,1600
0,1800
0,2000
0h 12h 36h 48h 60h 72h 108h 120h
Leit
ura
de
ab
sorb
ânci
a
Tempo (horas)
400 nm
430 nm
310
399
293310
346
275275
168
222
133115
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 108h 120h
Co
nce
ntr
ação
(m
g/L)
Tempo (horas)
58
Gráfico 06 – Variação da concentração de ramnose no decorrer do crescimento 3
Tanto no crescimento 2 como novamente no crescimento 3, pode ser
observado o decréscimo gradual da concentração de ramnose ao decorrer do
crescimento, o que pode indicar o consumo dessa hexose pelo microrganismo.
Bezerra (2012), utilizando a manipueira como meio de cultura para a
produção de ramnolipídeo, testou três métodos de quantificação de ramnose e nos
três métodos ocorreu o mesmo decréscimo nas leituras de ramnose ao longo do
crescimento como ocorreu no presente estudo. O autor atribui essa tendência ao
consumo do biossurfactante produzido pela bactéria no decorrer do seu
crescimento, no entanto não há uma correlação entre esse decréscimo e a
diminuição da tensão superficial do meio de cultura e nem uma analise de como a
maior concentração de ramnose se encontra no tempo zero, assim como ocorreu no
presente trabalho.
5.2.2 CURVA DE EMULSIFICAÇÃO E TENSÃO SUPERFICIAL DO MEIO
Como afirmado por (PIRÔLLO, 2006), os parâmetros utilizados para a
constatação da produção de biossurfactante por uma bactéria e medir sua eficiência
são a redução da tensão superficial do meio e a variação do índice de emulsificação.
Então em paralelo a quantificação de ramnose no meio, foram feitas medições para
252
168168
120
120
56,8
11097,6
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0h 12h 36h 48h 60h 72h 108h 120h
Co
nce
ntr
ação
(m
g/L)
Tempo (horas)
59
constatações de possíveis diminuições da tensão superficial do meio e uma curva foi
criada para constatar a variação do índice de emulsificação do meio no decorrer do
tempo dos crescimentos 2 e 3. Nos gráficos 08 e 09 pode-se ver a variação da
tensão superficial e do índice de emulsificação do meio ao longo do crescimento 2.
Gráfico 07 – Variação da Tensão Superficial, do meio, no decorrer do crescimento 2
Gráfico 08 – Curva do índice de emulsificação do crescimento 2
Nos gráficos 9 e 10 são demonstradas as variações do crescimento 3.
72
49,54
26,83
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Água Destilada 0h 120h
Ten
são
su
pe
rfic
ial (
mN
/m)
Tempo (hora)
65,51% 65,51%
3,44% 3,44% 3,44%6,89%
51,72%
86,20%
96,55% 96,55% 96,55%
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 108h 120h
Índ
ice
de
em
uls
ific
ação
(%
)
Tempo (hora)
60
Gráfico 9 – Variação da tensão superficial do meio no decorrer do crescimento 3
Gráfico – 10 Curva do índice de emulsificação do crescimento 3
Os gráfico de tensão superficial demonstram no crescimento 2 e 3 a
diminuição da tensão superficial em valores bem semelhantes: 27,1 e 26,83 mN/m.
Como afirmados por Nitschke e Pastore (2006) esse valores de tensão superficial
alcançados no crescimento 2 e 3 indicam a produção de um poderoso tensoativo,
72,84
48,12
27,39 27,04 27,1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
água destilada 0h 36h 72h 120h
Ten
são
su
pe
rfic
ial (
mN
/m)
Tempo (horas)
63,27% 65,52%
3,57%10,71%
3,57% 3,45%
94,25% 91,95%
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
0h 12h 36h 48h 60h 72h 98h 120h
índ
ice
de
em
uls
ific
ação
(%
)
Tempo (horas)
61
visto que, valores semelhantes (26,6 mN/m) foram obtidos pelos autores citados,
quando analisavam a produção de biossurfactante por uma cepa de Bacillus subtilis.
Bezerra (2012), utilizando a manipueira como meio de crescimento para o cultivo de
uma cepa de Pseudomonas aeruginosa, obteve como menor valor de tensão
superficial 30,92mN/m, indicando assim que os valores de tensão superficial
demonstrados no presente trabalho se equipara a valores de tensão superficial
obtidos pela P. aeruginosa, uma das espécies bacterianas mais promissoras dentro
dos estudos de prospecção de microrganismos produtores de biossurfactante.
De acordo com Willumsen e Karlson (1997), um critério para considerar uma
biossurfactante como um bom emulsificante é a capacidade de formar emulsões e
se manter emulsionado acima de 50% por 24 horas ou mais. Analisando os gráficos
da curva de emulsificação do crescimento 2 e 3 pode ser visto indícios de que a
manipueira já possui a capacidade de emulsionar o querosene por mostrar um
índice de emulsificação que varia entre 63,27 e 65,52%,. Pode ser observado
também o grande índice de emulsificação atingido pelo biossurfactante no
crescimento 2 e 3 chegando respectivamente a 96,55 e 91,95% no tempo de 120h, o
que leva a crer que a bactéria produz um excelente emulsificante com índices
superiores aos alcançados por bactérias já largamente estudadas, quando
comparamos esses valores com os obtidos por Bezerra (2012), onde em seus
estudos os valores máximos de índice de emulsificação variaram de 50 a 68%.
Observando os resultados obtidos com a concentração de ramnose
associados às curvas do índice de emulsificação e as medições de tensão
superficial do meio, foi descartada a possibilidade de ter ocorrido a produção de
ramnolipídeo no presente estudo visto que, um aumento da concentração de
ramnose seria o esperado para que ocorresse a diminuição da tensão superficial do
meio e o que foi visto foi o contrario disso. Um indício do possível biossurfactante
produzido pela bactéria é encontrado no estudo desenvolvido por Najafi et al (2011),
onde uma bactéria de mesmo gênero (Paenibacillus alvei) produziu um
biossurfactante que apresentavam características de ser um lipopeptídeos. Estudos
futuros serão feitos no intuito de identificar o biossurfactante.
No entanto, resta a dúvida sobre a presença de ramnose na amostra sem que
evidências de produção de ramnolipídeo tenham sido constatadas. Como os
maiores valores de concentração de ramnose encontrados ocorreram no início do
62
crescimento concluiu-se que, a ramnose já estava presente na composição da
manipueira. A presença de ramnose na amostra pode ser atribuída à presença de
hemicelulose no meio de cultura. Como afirmado por Pereira e Beléia (2004),
quando fez o isolamento, fracionamento e caracterização de paredes celulares de
raízes de mandioca, a Hemicelulose é um dos principais constituintes das paredes
celulares da raiz de mandioca, variando sua concentração de acordo com a espécie
e variáveis de cultivo. Como a ramnose é um dos monossacarídeos liberados a
partir da hidrolise da hemicelulose como é demonstrado por Borges, Borges e
Buckeridge (2000), em seu trabalho que estuda alterações nas composições de
carboidratos e ácidos graxos em sementes de Jacarandá-da-Bahia
osmocondicionadas, as leituras de concentração de ramnose podem ser atribuídas à
presença da hemicelulose no meio.
Com isso, na utilização da manipueira como meio de cultura para produção
de ramnolipídeos a presença de hemicelulose pode interferir nas leituras de
ramnose proveniente do biossurfactante ou até mesmo causar falsas interpretações
de resultado indicando erroneamente o consumo do biossurfactante pela bactéria.
5.2.3 DMC E TENSÃO SUPERFICIAL
A DMC foi identificada diluindo sucessivas vezes amostras do final do
crescimento 3 (120h). A diluição onde foi houve o aumento da tensão superficial foi
considerada com a diluição micelar crítica. E a partir dai pode ser feito uma
estimativa indireta da quantidade de biossurfactante presente na amostra.
O gráfico abaixo mostra a medidas de tensão superficial em relação às
diluições feitas com o meio de cultura livre de célula.
63
Gráfico 11 – Variação da tensão superficial de acordo com a diluição do meio
Como visto no gráfico, a tensão superficial começa a aumentar a partir do
momento que o meio foi diluído 15 vezes, sendo esse ponto considerado como a
diluição micelar crítica.
Assim, podemos constatar que no meio existia uma quantidade 15 vezes
maior de biossurfactante que a concentração micelar crítica. De acordo com
Rossmann (2008), esse valor de DMC indica índices satisfatórios de produção
biossurfactante pelo microrganismo, visto que, o autor chega a essa conclusão
quando consegue valores de DMC equiparados em seu trabalho quando esse utiliza
uma cepa de Pseudomonas aeruginosas na para produção de biossurfactante.
Os valores encontrados no presente estudo superam os resultados de DMC
encontrados no trabalho feito por Fernandes (2007), que utilizando uma cepa de
Bacillus spp., alcança uma DMC de 3,6 o que indica que o meio de cultura
apresentava uma concentração de biossurfactante 3,6 vezes maior que a sua
concentração micelar crítica.
Cooper, Zajic e Gerson (1979) afirmam que valores de tensão superficial
iguais ou inferiores a 40 mN/m indicam uma redução efetiva da tensão superficial da
água destilada e indicam a presença de um biossurfactante de elevada atividade
tensoativa. Com o gráfico 11 pode ser visto que com diluições de até 45 vezes o
biossurfactante demonstra valor de tensão superficial de 34,75mN/m, valor que se
encontra abaixo do critério criado por Cooper, Zajic e Gerson (1979), o que pode
27,72
26,85
26,91
26,86
27,5
27,74
28,38
29,78
32,69
34,75
44,86
47,31
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
X2 X4 X6 X8 X10 X11 X15 X20 X30 X45 X60 X80
Ten
são
su
pe
rfic
ial (
mN
/m)
Diluição das amostras
64
indicar que o biossurfactante produzido pode, até mesmo em baixas concentrações,
diminuir bastante a tensão superficial da água destilada.
Os resultados demonstram, que a bactéria isolada da torta de dendê não só
produz biossurfactante como um biossurfactante que apresenta uma boa
capacidade emulsificante e tensoativade, além disso, de acordo com Rossmann
(2008), mostra uma produção satisfatória do biossurfactante e apresentar
diminuições efetivas da tensão superficial da água destilada até mesmo em baixas
concentrações.
5.3 ESTUDO DA ESTABILIDADE DO BIOSSURFACTANTE FRENTE À VARIAÇÃO
DE TEMPERATURA, SALINIDADE E pH
Foram realizados testes com amostras do crescimento 3 no tempo de 120h
de crescimento, analisando a estabilidade das propriedades tensoativas do
biossurfactante em diferentes exposições à altas temperatura, diferentes níveis de
pH e salinidade do meio.
5.3.1 ESTABILIDADE À TEMPERATURA
Nesse teste, as amostras livres de célula foram aquecidas a 100°C em banho-
maria e foram retiradas em diferentes intervalos de tempo (15, 30, 60 e 70 minutos).
Após as amostras atingirem a temperatura ambiente forma feitas medidas da tensão
superficial para avaliar variações. Amostras do meio também foram autoclavadas a
121°C por 15 minutos. Os resultados estão demonstrado no gráfico 12.
65
Gráfico 12 – Variação da tensão superficial do meio de acordo com o tempo de
exposição ao banho-maria a 100°C.
Os resultados mostram que ocorreram variações mínimas na tensão
superficial do meio nos diferentes tempos de exposição e no processo de
autoclavagem (121°C/15min) do meio, mostrando assim a manutenção das
propriedades tensoativas em condições extremas de temperatura assim como, no
trabalho de Nitschke e Pastore (2006), que demonstram a manutenção das
propriedades do tensoativos produzidos por uma cepa de Bacillus subtilis, diante da
exposição a temperaturas extremas incluindo a esterilização na autoclave. Além
disso, as propriedades ainda se mantiveram mesmo após 6 meses de
armazenamento em baixas temperaturas (-18°C).
Em comparação ao estudo realizado por Rocha et al. (2007), pode ser visto
uma maior estabilidade do tensoativo, visto que, no trabalho desenvolvido pelo autor
houve o aumento da tensão superficial após a exposição a altas temperaturas por 75
min e também por 15 min a 121 °C do biossurfactante produzido por uma cepa de
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145.
26,8426,92
27,23
27,36
27,08
27,14
26
26,2
26,4
26,6
26,8
27
27,2
27,4
27,6
27,8
28
inicial 15 30 60 70 autoclave
Ten
são
su
pe
rfic
ial (
mN
/m)
Tempo (minutos)
66
5.3.2 ESTABILIDADE À SALINIDADE
A estabilidade das propriedades tensoativas do surfactante diante a variação
da concentração salina no meio foi estada. Os resultados estão demonstrados no
gráfico 13.
Gráfico 13 - Medição da tensão superficial do meio diante a diferentes
concentrações de NaCl.
Ao se deparar com diferentes concentrações de NaCl, o biossurfactante
apresentou sua melhor desempenho com 10% de concentração salina no meio.
Resultados semelhantes foram demonstrados por Ilore, Amobi e Adocha (2005),
quando esse avaliou a estabilidade do biossurfactante produzido por Aeromonas
ssp., onde foi observado uma melhora nas propriedades do biossurfactante na
concentração de 5% de NaCl. O autor atribui o aumento da atividade surfactante do
tensoativo na concentração citada por ser a mesma condição de salinidade que foi
encontrada no local de isolamento da bactéria.
Pode ser observado também que em concentrações acima de 20% NaCl
mantiveram valores de tensão superficial ainda efetivos (COOPER; ZAJIC;
26,84
20,43 19,35
27,4 28,0431,06 31,91
34,7336,27 35,35
0
5
10
15
20
25
30
35
40
inicial 1% 5% 10% 12% 15% 17% 20% 23% 25%
en
são
su
pe
rfic
ial m
N/m
Concentração de NaCl (p/v)
67
GERSON, 1979). Tolerância a concentrações de sal acima de 20% também foram
demonstradas no estudo de Nitschke e Pastore (2006).
5.3.3 ESTABILIDADE À VARIAÇÃO DE pH
A estabilidade do surfactante também foi testada diante à variações de pH no
meio. Os resultados se encontram no gráfico 14.
Gráfico 14 – Medição da tensão superficial do meio diante a variação do pH
Levando em consideração a afirmação de Cooper, Zajic e Gerson (1979),
pode ser visto que mesmo em condições extremas de acidez e alcalinidade os
valores de tensão superficial do meio ainda se mantiveram dentro de valores que
definem os bons agentes tensoativos, mostrando assim grande estabilidade do
biossurfactante.
Valores de 62 mN/m de tensão superficial foram obtidos pela acidificação do
meio para pH 2 no estudo realizado por Cooper, Macdonald e Kosaric (1981),
quando avaliando a produziu surfactina por Bacillus subtilis, Variações semelhantes
foram constatadas por Nitschke e Pastore (2006). Quando o meio foi ajustado pH
32,2028,63
26,46 27,2427,88 29,34
32,33
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
2,0 4,0 6,0 7,1(120h)
8,0 10,0 12,0
Ten
são
sip
erf
icia
l (m
N/m
)
pH
68
2,0 os valores das tensões superficiais aumentaram bastante. Esses estudos só
confirmam a grande estabilidade do tensoativo analisado no presente trabalho, em
condições extremas de acidez e alcalinidade.
69
6. CONCLUSÃO
Considerando que o objetivo desse trabalho foi analisar a utilização de
manipueira como fonte alternativa de carbono e energia para o crescimento da
Paenibacillus sp. e produção de Biossurfactantes pela mesma, pode-se considerar
que a manipueira foi capaz de fornecer um meio propício para o desenvolvimento
bacteriano sem requerer complementações nutricionais.
Analisando os resultados relacionados às propriedades do biossurfactante
produzido, constata-se que esse apresenta excelentes propriedades tensoativas e
emulsificantes, superando, nesses quesitos, biossurfactantes já largamente
estudados.
Os estudos de estabilidade da propriedade do biossurfactante demonstram
que a bactéria utilizada foi capaz de produzir um biossurfactante com características
estáveis em diferentes tempo exposições a altas temperaturas, níveis de pH e
salinidade. Sendo assim, esse biossurfactante pode ser claramente utilizado em
condições extremas dentro dessas variáveis analisadas, o que faz dele um
excelente biossurfactante.
70
7. REFERÊNCIAS
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