universidade estadual paulista “jÚlio de mesquita … · aos meus pais, luiz e ema e aos meus...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
PRODUÇÃO DE Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK. E
Beauveria bassiana (BALS.) VUILL. EM DIFERENTES SUBSTRATOS E
EFEITO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA E DA TEMPERATURA
SOBRE ESTRUTURAS INFECTIVAS DESSES ENTOMOPATÓGENOS
EMMA LUIZE OTTATI-DE-LIMA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia – Área de Concentração em Proteção de Plantas.
BOTUCATU - SP Fevereiro – 2007
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CÂMPUS DE BOTUCATU
PRODUÇÃO DE Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK. E
Beauveria bassiana (BALS.) VUILL. EM DIFERENTES SUBSTRATOS E
EFEITO DA RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA E DA TEMPERATURA
SOBRE ESTRUTURAS INFECTIVAS DESSES ENTOMOPATÓGENOS
EMMA LUIZE OTTATI-DE-LIMA
Orientador: Prof. Dr. Antonio Batista Filho
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia – Área de Concentração em Proteção de Plantas.
BOTUCATU - SP Fevereiro – 2007
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRA- TAMENTO DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO UNESP - FCA - LAGEADO - BOTUCATU (SP) Ottati-de-Lima, Emma Luize, 1975- O87p Produção de Metarhizium anisopliae (METSCH.)SOROK. e Beauveria bassiana (BALS.)VUILL. em diferentes substratos e efeito da radiação ultravioleta e da temperatura sobre estruturas infectivas desses entomopatógenos / Emma Lui- ze Ottati-de-Lima . – Botucatu : [s.n.], 2007 viii, 92 f. : il. color, gráfs, tabs. Tese (Doutorado)-Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2007 Orientador: Antonio Batista Filho Inclui bibliografia. 1. Fungos patogênicos. 2. Pragas – Controle biológico. 3.
Cultura e meios de cultura(Biologia). 4. Radiação ultra- violeta. I. Batista Filho, Antonio. II. Universidade Esta- dual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (Campus de Botuca- tu). Faculdade de Ciências Agronômicas. III.Título.
II
Aos meus pais, Luiz e Ema
e aos meus irmãos Angelo e Júnior.
DEDICO
A Deus, por tudo que me tem concedido.
AGRADEÇO
Ao meu marido Paulo e
minha filhinha Luize, pela
colaboração, compreensão,
estímulo e carinhos sempre
recebidos.
OFEREÇO
III
“Ensinar não é uma função vital,
porque não tem o fim em si mesma;
a função vital é aprender”.
Aristóteles
IV
AGRADECIMENTOS
Ao meu eterno professor Dr. Antonio Batista Filho, Diretor,
Pesquisador Científico do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico e
Professor Credenciado do Departamento de Produção Vegetal da FCA/ UNESP/ Botucatu,
pela preciosa orientação, amizade e confiança.
Ao Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida, Diretor e Pesquisador
Científico do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico, pela co-orientação e
amizade.
Ao Dr. Carlos Frederico Wilcken, Professor do Departamento de
Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA), da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP/ Botucatu), pelo incentivo e por ter me
introduzido à área acadêmica.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos para a realização do curso.
Ao técnico André da Usina São João, Araras, SP por ter cedido todas
as lagartas de Diatraea saccharalis necessárias à realização deste trabalho.
Ao Instituto Biológico do Estado de São Paulo por ter cedido toda a
infraestrutura necessária à realização deste trabalho.
Ao Paulo Camargo, funcionário do Laboratório de Controle Biológico
do Instituto Biológico, pelo apoio recebido.
V
Aos Pesquisadores Científicos do Laboratório de Controle Biológico
do Instituto Biológico, Dr. Laerte Antonio Machado, Dr. Luis Garrigós Leite e Dr. Valmir
Antonio Costa.
Aos estagiários Laboratório de Controle Biológico do Instituto
Biológico, César Augusto Domene Filho, Fernando Henrique Carvalho Giometi, Lucas e
Thaís Goulart.
À estagiária Aline Maria Belasco de Almeida, pela amizade e ajuda
preciosa nos experimentos, que pareciam não ter fim.
Ao estagiário Luciano Olmo Zappelini pela ajuda, amizade e as “10
melhores da avó”.
À minha estimada amiga Mariana Hollanda Gassen pela verdadeira
amizade, apoio, ajuda indispensável em quase todos os experimentos e, nesta fase delicada da
mudança.
À Érica Cintra e Inajá Wenzel pela amizade e estímulo sempre
presentes.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Agronomia –
Área de concentração: Proteção de Plantas pelos ensinamentos transmitidos e atenção
dispensada.
Aos colegas e amigos do Programa de Pós-Graduação pelo convívio e
oportunidade de intercâmbio de idéias: Fernando Tavares e Alexandre Candido.
Aos funcionários do Departamento de Produção Vegetal Nivaldo
Lúcio Costa e à secretária Vera Lúcia da Silva Mendes pelo apoio concedido.
VI
Ao meu esposo Paulo pela correção do Summary, e por ter me ajudado
na análise estatística. Também por me dar tanto orgulho e segurança, ser muito dedicado à
nossa família, e nos fazer muitos felizes.
À minha princesinha Luize, por me trazer tanta alegria todos os dias e
achar que o trabalho da mamãe é só limpar “cocô” de lagartas no laboratório.
À minha amiga e madrinha Sandia Bergamaschi Pezerico pela amizade
sincera desde os tempos da Graduação.
Ao meu pai Luiz, minha mãe Ema, meus irmãos Angelo e Júnior, pelo
carinho e apoio a mim sempre dedicados, em todos os momentos da minha vida. Muito
obrigada!
Ao Sr. Paulo, D. Regina, Thiago, Júlio, Daniele, Guilherme, Gabriela,
Luís Geraldo, Michéle, Ana Luísa, Ana Clara e Pedrinho, que direta ou indiretamente
colaboraram na realização deste trabalho.
VII
SUMÁRIO
Página RESUMO ....................................................................................................................................1 SUMMARY ................................................................................................................................3 1 INTRODUÇÃO........................................................................................................................5 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................8
2.1 Controle microbiano..........................................................................................................8 2.2 Metarhizium anisopliae ...................................................................................................10 2.3 Beauveria bassiana .........................................................................................................11 2.4 Produção de fungos entomopatogênicos .........................................................................13
2.4.1 Produção em meio semi-sólido ................................................................................18 2.4.1.1 Produção de conídios.........................................................................................21
2.4.2 Produção em meio líquido........................................................................................25 2.4.2.1 Produção de blastosporos ..................................................................................28
2.5 Fatores ambientais ...........................................................................................................29 2.5.1 Radiação ultravioleta ................................................................................................29 2.5.2 Temperatura..............................................................................................................32
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................34 3.1 Isolados de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana ............................................34 3.2 Condição de esterilização ................................................................................................35 3.3 Repicagem de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana ........................................35 3.4 Produção semi-sólida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana .......................35
3.4.1 Concentração de conídios.........................................................................................38 3.4.2 Viabilidade de conídios ............................................................................................39
3.4.2.1 Radiação ultravioleta .........................................................................................39 3.4.2.2 Temperatura.......................................................................................................40
3.4.3 Virulência à Diatraea saccharalis............................................................................40 3.5 Produção líquida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana...............................42
3.5.1 Meio para produção de blastosporos ........................................................................42 3.5.2 Concentração de blastosporos ..................................................................................44 3.5.3 Contagem de colônias...............................................................................................45
3.5.3.1 Radiação ultravioleta .........................................................................................45 3.5.3.2 Temperatura.......................................................................................................46
3.5.4 Virulência à Diatraea saccharalis............................................................................46 3.6 Análise estatística ............................................................................................................46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................................47 4.1. Produção semi-sólida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana ......................47
4.1.1 Concentração de conídios.........................................................................................47 4.1.2 Viabilidade de conídios ............................................................................................53
4.1.2.1 Radiação ultravioleta .........................................................................................54 4.1.2.2 Temperatura.......................................................................................................58
4.1.3 Virulência à Diatraea saccharalis............................................................................62 4.2 Produção em meio líquido de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana................64
4.2.1 Concentração de blastosporos ..................................................................................64 4.2.2 Contagem de colônias...............................................................................................70
VIII
4.2.2.1 Radiação ultravioleta .........................................................................................70 4.2.2.2 Temperatura.......................................................................................................72
4.2.3 Virulência à Diatraea saccharalis............................................................................75 5 CONCLUSÕES......................................................................................................................77 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................78
1
RESUMO
Os objetivos deste trabalho foram avaliar diferentes meios de cultura
na produção, semi-sólida e líquida, de propágulos de fungos de M. anisopliae e B. bassiana,
bem como a tolerância desses propágulos a ação da radiação ultravioleta e da temperatura. Os
experimentos foram conduzidos no Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico,
em Campinas, SP. Foram realizados, para M. anisopliae e B. bassiana, 6 repetições para cada
um dos 17 tratamentos: amido de milho, arroz integral, arroz parboilizado, arroz tipo 1
(testemunha), arroz tipo 2, aveia em flocos, canjiquinha, farelo de trigo, farinha de mandioca
crua, farinha de milho amarela, farinha de trigo especial, fubá, milho em grãos, polvilho
azedo, soja em grãos, trigo moído e turfa. A viabilidade foi feita em placas de Petri plásticas
contendo BDA. Para os ensaios com radiação ultravioleta e temperatura, utilizou-se a mesma
metodologia para a viabilidade, mas cada tratamento sendo exposto à radiação por 0, 25 e 50
segundos e, em diferentes temperaturas: 20, 25, 30 e 35oC. Inoculou-se, em torre de Potter, 2
mL da suspensão de fungo de cada tratamento em lagartas de Diatraea saccharalis. Para a
concentração os melhores tratamentos de M. anisopliae e B. bassiana foram: arroz
parboilizado tipo 1, arroz tipo 1, arroz tipo 2, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído. A
viabilidade de todos os tratamentos foi superior a 94,00%; quanto maior o tempo de exposição
ao ultravioleta menor foi o número de conídios férteis. À temperatura de 35oC ocorreu perda
significativa da viabilidade de conídios e todos os tratamentos se mostraram virulentos. Para a
2
produção líquida de blastosporos de M. anisopliae e B. bassiana, foram avaliados 12
tratamentos, com 6 repetições cada, compostos pelas combinações entre as concentrações de
Carbono (C), na forma de D-glicose anidra (40% de carbono) e sacarose (42,11% de carbono),
e Nitrogênio (N) na forma de levedura de cerveja (7,31% de nitrogênio). Cada tratamento de
M. anisopliae e B. bassiana foi constituído de 6 Erlenmeyers com 100 mL de meio,
autoclavados a 1 atm e 120oC, durante 20 minutos. As concentrações de blastosporos de cada
tratamento foram determinadas com 4, 6 e 8 dias após a inoculação. Para os ensaios de
contagem de colônias em ultravioleta e temperatura, utilizou-se a mesma metodologia para a
viabilidade da produção sólida. Para a concentração de blastosporos os melhores tratamentos
de M. anisopliae foram: 16,00 g C + 7,00 g N e 14,40 g C + 7,00 g N e para B. bassiana foi
20,00 g C + 6,30 g N e 20,00 g C + 7,00 g N. A viabilidade de todos os tratamentos foi
superior a 10 colônias formadas; quanto maior o tempo de exposição ao ultravioleta menor foi
o número de colônias formadas; à temperatura de 35oC ocorreu diminuição significativa na
formação de colônias e todos os tratamentos se mostraram virulentos.
______________________________
Palavras chave: controle biológico, controle microbiano, Deuteromycotina, fungos
entomopatogênicos, Insecta, meios de cultura.
3
PRODUCTION OF Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROK AND Beauveria bassiana
(BALS.) VUILL. ON DIFFERENT MEDIA AND EFFECT OF ULTRAVIOLET
RADIATION AND TEMPERATURES ON THE INFECTIVE PROPAGULES OF THESE
FUNGI. Botucatu, 2007. 99p. Thesis (Doutorado em Agronomia/ Proteção de Plantas) –
Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.
Author: EMMA LUIZE OTTATI-DE-LIMA
Adviser: ANTONIO BATISTA FILHO
SUMMARY
The goals of this work were to evaluate different medias (semi-solid
and liquid) as for the production of M. anisopliae and B. Bassiana propagules, and also the
tolerance of these propagules to ultraviolet radiation and temperature. The experiments were
carried out at the Biological Control Laboratory of the “Instituto Biológico”, at Campinas, São
Paulo, Brazil. For both M. anisopliae and B. bassiana, 6 repetitions were performed for each
one of the 17 treatments: corn stearch, full rice, parboiled rice, type 1 rice, type 2 rice, oat
flakes, “canjiquinha”, wheat flour, raw cassava flour, yellow corn flour, special wheat flour,
corn flour, corn in grains, cassava stearch, soy in grains, crushed wheat and turf. The viability
analysis was done in plastic plates containing BDA. For each one of the bioassays in
ultraviolet and temperature exposition, the same methodology was used for viability analysis,
but each treatment was exposed to the UV radiation during 0, 25 and 50 seconds, and at
different temperatures: 20, 25, 30 and 35oC. Using the Potter tower, 2 mL of fungus
suspension, from each tratment, were inoculated into the Diatraea saccharalis caterpillars.
Regarding the sporulation, the best M. anisopliae and B. bassiana treatments were: parboiled
rice, type 1 rice, type 2 rice, yellow corn flour, corn flour and crushed wheat. The viability of
all the treatments was superior to 94,00%. Also, as longer was the duration of the exposition to
the UV, as smaller was the number of fertile conidia. At 35oC, a significant loss of conidia
viability was observed, and all the treatments have shown some level of virulence. For the M.
anisopliae and B. bassiana blastospores production over liquid media, 12 treatments were
4
evaluated, with 6 repetitions each, composed by the combinations of carbon (C), presented as
D-glicose anidra (40% Carbon) and sucrose (42,11% Carbon), and Nitrogen (N), presented as
brewer yeast (7,31% Nitrogen), concentrations. Each M. anisopliae and B. bassiana treatment
was composed by 6 Erlenmeyers with 100 mL of media, sterilized at 1 atm and 120oC, during
20 minutes. The blastospores concentration of each treatment was determined with 4, 6 and 8
day after the inoculation. For each one of the colony counting bioassays in UV and
temperature exposition, the same methodology was used for viability analysis. Regarding
blastospores concentration, the best M. anisoplie treatment swere: 16,00 g C + 7,00 g N and
14,40 g C + 7,00 g N, and for the B. bassiana, hey were 20,00 g C + 6,30 g N and 20,00 g C +
7,00 g N. The viability of all treatments was superior to 10 formed colonies; as longer was the
exposition to the UV rays duration, as smaller was the number of formed colonies; at 35o C a
significant decreasing in the number of formed colonies occurs and all treatments have shown
themselves virulent.
______________________________
keywords: biological control, microbiological control, Deuteromycotina, entomopatogenic
fungi, Insecta, culture media.
5
1 INTRODUÇÃO
No controle de pragas podemos classificar o controle microbiano é
considerado muito promissor e dentre os agentes de controle microbiano de pragas de
importância econômica destacam-se os fungos, devido à abundância de gêneros e espécies
(ALVES, 1986b e 1992; ZIMMERMANN, 1982).
Com o aumento do interesse em soluções ecologicamente corretas,
devido em grande parte à conscientização em relação ao mal uso de agrotóxicos, aumentou
também o interesse pela exploração de fungos entomopatogênicos na agricultura. Porém, do
ponto de vista prático, a escala de produção desses fungos deve ser proporcional à escala de
produção agrícola, ou seja, é necessário que sejam produzidos em grande quantidade.
Entretanto, existem limitações para aplicação de fungos, e uma delas é a forma de conservação
desses microorganismos, que mantenha a sua patogenicidade e virulência em condições de
fácil armazenamento e aplicação. Este fator está intrinsecamente ligado às formulações dos
fungos entomopatogênicos (ALVES, 1986b).
A maioria dos projetos de pesquisa com controle microbiano de insetos
é realizada com fungos entomopatogênicos, devido às características de ação desses
patógenos, pois atuam por contato e ingestão. Os fungos foram os primeiros agentes a serem
aplicados no controle microbiano de insetos, com cerca de 80% das doenças de insetos
causadas por esses patógenos (ALVES, 1986b; ALMEIDA & MACHADO, 2006).
6
No Brasil, esses patógenos vêm sendo estudados há mais de cinquenta
anos, sendo que após, 1964, com a aplicação em massa do fungo Metarhizium anisopliae para
o controle de cigarrinha-da-folha da cana-de-açúcar, Mahanarva posticata, o uso desses
entomopatógenos aumentou, criando assim novas oportunidades de projetos de pesquisa ou
mesmo a instalação de biofábricas (ALMEIDA & MACHADO, 2006).
Os gêneros Metarhizium e Beauveria são os mais estudados e
utilizados no Brasil, devido à ampla gama de insetos que podem ser controlados por estes, e
também pela facilidade de produção em laboratório (ALMEIDA & MACHADO, 2006).
M. anisopliae vem sendo utilizado desde 1969, no Estado de
Pernambuco, em programa de controle da cigarrinha da cana-de-açúcar (M. posticata). A
produção é feita em arroz e armazenada em sacos plásticos, em câmara frigorífica, à
temperatura de 2 a 5oC. Somente em 1980, mais de 100.000 hectares de cana-de-açúcar foram
pulverizados com este fungo para controle desses insetos, obtendo-se mortalidade de
aproximadamente 23% para ninfas e 40% para adultos (ALVES, 1982).
No Brasil, desde 1970 quando o M. anisopliae começou a ser
produzido em escala comercial, o arroz continua sendo o meio de cultura mais utilizado em
suas diversas formas, grão inteiro, quebrado, farelo, etc. Vários outros meios de cultura foram
testados entre eles o fubá de milho, farinha de arroz, soja, farelo de trigo, batatinha
(GUAGLIUMI et al., 1974), caldo de feijão (CRUZ et al., 1983), milho em suas várias formas
(SILVEIRA, 1987; MENDONÇA & COSTA, 1987), arroz úmido e macerado de feijão
(RAGA et al., 1987), melaço, farinha de soja e sais minerais (ALVES, 1986b).
Apesar de M. anisopliae e Beauveria bassiana serem fungos altamente
patogênicos para um grande número de insetos, nas condições naturais, muitos problemas
ocorrem quando a produção dos fungos é realizada em escala industrial, e a sua aplicação é
efetuada em grandes áreas. Assim, alguns problemas necessitam ser estudados como:
caracterização, padronização de linhagens, métodos de produção massal de conídios,
formulações, manutenção de linhagens agressivas, métodos de aplicação, compatibilidade do
fungo com inseticidas, controle associado e, principalmente, os fatores que regulam epizootias
nas condições de campo (ALVES, 1986b; ALMEIDA & MACHADO, 2006).
Mais suscetíveis às condições no campo, os entomopatógenos estão
sujeitos a fatores bióticos e abióticos, que influenciam na sua sobrevivência, propagação e
7
infecção do hospedeiro (GOETTEL et al., 2000). Entre os abióticos, a radiação solar UV é a
mais importante (FARGUES et al., 1996; BRAGA et al., 2001b; CAGAN & SVERCEL,
2001), pois pode inativar o conídio, provocar danos letais ao DNA e mutações (NICHOLSON
et al., 2000). Em geral, os efeitos da radiação UV reduzem a eficiência do fungo no campo
(BRAGA et al., 2001a).
A temperatura é um dos fatores de grande importância e atua sobre os
patógenos afetando a produção, estabilidade na estocagem e patogenicidade nas condições de
campo. Esse fator, torna-se ainda mais importante, tendo em vista a incapacidade dos
patógenos de se protegerem das variações de temperatura através de sistemas fisiológicos
(ALVES, 10982). A viabilidade e atividade biológica de fungos entomopatogênicos são
altamente influenciadas pela temperatura, umidade, substrato, radiação ultravioleta e outros
fatores (ABREU et al., 1983; BATISTA FILHO & CARDELLI, 1986; ALVES et al., 1987).
Também tem sido estudada a produção em meios líquidos através de
fermentadores visando a obtenção de propágulos (McCOY et al., 1975); Agudelo & Falcon
(1983), Thomas et al. (1986) e Rombach et al. (1986). Este processo de produção apesar de ser
um dos mais promissores ainda necessita de criteriosos estudos quanto à economicidade e
adequabilidade dos substratos, padronização, virulência e efetividade dos produtos obtidos
(ALVES & PEREIRA, 1989).
Os objetivos deste trabalho foram avaliar diferentes meios de cultura
na produção semi-sólida e líquida de propágulos de fungos de M. anisopliae e B. bassiana,
bem como o efeito dos meios na suscetibilidade dos propágulos contra a radiação ultravioleta
e temperaturas extremas, e na virulência dos fungos à Diatraea saccharalis.
8
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Controle microbiano
De um total de mais de 2,5 milhões de espécies de insetos, estima-se
que a ciência conheça cerca de 1 milhão. Cerca de 10% desse total conhecido podem ser
consideradas pragas, quer sejam elas urbanas ou da agricultura. Assim, segundo Alves
(1998b), a patologia de insetos e o controle microbiano terão importância relevante no
controle de insetos praga.
Iniciada no Brasil há cerca de 70 anos, a patologia de insetos tem como
principal meta o controle microbiano. Este, por sua vez, vem ganhando cada vez mais
importância por visar a manutenção da população de pragas abaixo do nível de dano
econômico (ALVES, 1998b).
A maioria dos projetos de pesquisa com controle microbiano de insetos
são com fungos entomopatogênicos, devido às características de ação desses patógenos, pois
atuam por contato e ingestão, possuem em grande quantidade na natureza sendo o solo o seu
maior reservatório e por serem mais difícil dos insetos tornarem-se resistentes pela sua grande
variabilidade genética (ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2006).
As diferentes estruturas do fungo a serem utilizadas no controle de
9
pragas e suas funções no ciclo natural do patógeno são: a) conídios: com função de reprodução
e de disseminação; b) blastosporos: com função de disseminação na hemolinfa do hospedeiro;
c) micélio: com função de migrar para fora do hospedeiro e permitir a conidiogênese do
fungo; d) esporos de resistência: com função de permitir a sobrevivência do fungo no solo.
Grande parte dos fungos mitospóricos pertencentes à classe-forma Hifomicetes pode ser
utilizada na forma de conídios, blastosporos e micélio, sendo as duas primeiras formas
geralmente preferidas por serem ambas infectivas ao hospedeiro. A escolha da forma a ser
utilizada do fungo vai depender da espécie e isolado do patógeno, da dificuldade na sua
produção, do ambiente onde será aplicado e do método de aplicação (LEITE et al., 2003;
ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2006).
O ciclo das relações fungo-hospedeiro depende das condições
ambientais, como temperatura, luz, umidade, radiação solar e condições nutricionais e
suscetibilidade do hospedeiro e apresenta as seguintes fases: a) adesão: os mecanismos
envolvidos na adesão ainda não são totalmente conhecidos. Existem forças eletrostáticas
envolvidas, além de relações de umidade e temperatura; b) germinação: quando o fungo
encontra condições favoráveis de umidade (acima de 90%), temperatura de 23 a 30oC, pH (5,5
a 7,0), oxigênio e nutrição, o fungo germina produzindo o tubo germinativo; c) formação de
apressórios: numa dilatação na extremidade do tubo germinativo. Nesta dilatação ocorre a
migração de conteúdo citoplasmático tornando esta área num ponto de intensa atividade
metabólica; d) formação do grampo de penetração: pode ocorrer uma diferenciação da hifa no
apressório, tornando-a mais saliente, transformando-a numa espécie de grampo para
perfuração da cutícula do inseto; e) penetração: na penetração estão envolvidos os processos
físico e químico, sendo que neste ocorre a liberação de enzimas tais como: quitinases, lipases e
proteases, que facilitam a penetração mecânica; f) colonização: a hifa penetra e inicia o
crescimento e colonização do corpo do inseto a partir dos corpos gordurosos, passando para o
tubo digestivo, causando paralisação da alimentação e interrupção alimentar, atinge o sistema
nervoso causando a paralisação do inseto, os músculos, tornando o inseto rígido e atinge a
traquéia por onde sai o corpo do inseto para se reproduzir; g) reprodução: o fungo pode se
reproduzir por processos sexual ou assexual, sendo que a maioria dos trabalhos realizada para
o controle de pragas é com a fase assexuada (ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2006).
10
Segundo Almeida & Batista Filho (2006), os sintomas de insetos
doentes com fungos são: manchas escuras pelo corpo, paralisação da alimentação, paralisia
geral, perda de coordenação de movimentos. Posteriormente o tegumento torna-se róseo, para
depois assumir coloração esbranquiçada, devido o crescimento do micélio e a partir da
esporulação o inseto assume a coloração da espécie do fungo. Exemplo: branco para
Beauveria bassiana e verde para Metarhizium anisopliae. Todas essas fases ocorrem em 4 a
10 dias, dependendo do hospedeiro e da espécie do fungo.
2.2 Metarhizium anisopliae
O fungo M. anisopliae é a espécie mais importante nas condições do
Brasil, apresentando grande variabilidade genética decorrente da heterocariose, resultando o
aparecimento de muitos isolados, com diferentes graus de virulência, especificidade, produção
de conídios e resistência ao UV (ALVES, 1986a). Metarhizium é um fungo mitospórico da
família-forma Moniliaceae caracterizado por atacar um grande número de espécies de insetos
(ALVES, 1998a).
Este fungo encontra-se distribuído de forma ampla na natureza, sendo
encontrado nos solos, sobrevivendo por longos períodos. A capacidade de sobrevivência dos
esporos é variável em função do ambiente onde foi aplicado, da temperatura, umidade,
radiação solar, etc. (ALVES, 1986a). Os insetos atacados por este fungo tornam-se
mumificados e o cadáver pode apresentar coloração que varia de verde claro a escuro,
acinzentados ou ainda esbranquiçados com pontos verdes. Esta doença é conhecida como
muscardine verde (ALVES, 1998a).
A espécie M. anisopliae tem sido usada em diversos países, como
Estados Unidos, Canadá, França, Austrália, África e Brasil (FARQUES et al., 1997; LOMER
et al., 2001; BRAGA et al., 2001b). Esta espécie ataca inúmeras espécies de insetos, e está
11
amplamente distribuído na natureza (ALVES, 1998a). Seus conídios podem ser elipsóides ou
ovóides e sua coloração pode variar de verde pálida a verde oliva.
Acredita-se que este entomopatógeno ocorra naturalmente em mais de
300 espécies de insetos das diferentes ordens, incluindo pragas importantes como larvas de
curculionídeo (praga da beterraba), Mahanarva posticata (cigarrinha-de-folhas da cana-de-
açúcar) e M. fimbriolata (cigarrinha-da-raiz da cana-de-açúcar) (ALVES, 1998a).
O fungo M. anisopliae ocorre em diversas regiões do mundo e com
uma vasta amplitude de hospedeiros. No Brasil, vem sendo usado com sucesso para o controle
das cigarrinhas das pastagens e de cana-de-açúcar (TANZINI, 2002), e é comercializado de
quatro formas: em arroz inteiro, arroz triturado, em conídios puros e em formulação oleosa.
No Estado de São Paulo tem sido usado com sucesso no controle da cigarrinha-da-raiz da
cana-de-açúcar M. fimbriolata (MACEDO et al., 1997; MENDONÇA FILHO et al., 2001;
ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2003).
2.3 Beauveria bassiana
O gênero Beauveria desenvolve-se em grande número de artrópodes,
ocorrendo em mais de 200 espécies de insetos e ácaros, incluindo carrapatos. Os insetos
atacados por este patógeno apresentam-se cobertos por micélio branco que esporula em
condições adequadas de umidade e luz. Recebe o nome de muscardine branca a doença
ocasionada por este gênero (ALVES, 1998a). A infecção ocorre geralmente por via
tegumentar e oral, sendo possível à penetração pelo sistema respiratório, pelo espiráculo
(ROBINSON, 1966).
A relação patógeno-hospedeiro depende das espécies de insetos e das
condições durante a ocorrência da doença. São condições favoráveis a alta umidade relativa e
temperatura, sendo que temperaturas altas e baixas retardam o desenvolvimento da doença
(BARSON, 1977).
12
A espécie B. bassiana Metarhizium é um fungo mitospórico da
família-forma Moniliaceae também apresenta ampla variedade de hospedeiros sendo
encontrada em diversos países controlando vários insetos-praga (FERRON, 1978; FENG et
al., 1994; FIGUEIREDO et al., 2002) como, por exemplo, mosca-branca e afídios na América
do Norte e América do Sul (GOETTEL et al., 2000). Os conídios deste fungo apresentam
coloração clara.
Nos Estados Unidos, diversas formulações à base de B. bassiana têm
sido testadas com sucesso no controle do bicudo-do-algodoeiro Anthonomus grandis (McCOY
& TIGANO-MILANI, 1992). No Brasil, B. bassiana tem-se destacado como agente de
controle biológico com potencial para ser empregado no controle de populações de adultos
desse inseto (COUTINHO & CAVALCANTI, 1988; COUTINHO & OLIVEIRA, 1991). As
biofábricas têm produzido e comercializado este entomopatógeno em arroz inteiro e triturado,
sendo também muito utilizado para o controle de cochonilhas dos citros, cupins de montículo,
moleque-de-bananeira e broca-do-café (ALVES et al., 1998a). Algumas instituições de
pesquisa têm tentado formular conídios deste fungo em óleo, como já ocorre com M.
anisopliae (ALMEIDA & BATISTA FILHO 2006).
No Brasil, o fungo B. bassiana ocorre em mais de 30 espécies de
insetos. Já foi estudado para o controle de Diatraea saccharalis (ALVES, 1986b); de
hemípteros, como o percevejo do colmo-do-arroz, Tibraca limbativentris (MARTINS &
LIMA, 1994); para Triatoma infestans, vetor da doença-de-Chagas (LUZ et al., 1998); Nezara
viridula, Piezodorus guildinii e Euschistus heros (pragas da soja) (SOSA-GÓMEZ &
MOSCARDI, 1998). Em outros países foi estudado visando ao controle do coreídeo Riptortus
linearis (praga da soja) (HU et al., 1996), e Leptoglossus zonatus (Coreidae) e Pachycoris
klugii (Scutelleridae) (pragas da nogueira) (GRIMM & GUHARAY, 1998).
13
2.4 Produção de fungos entomopatogênicos
As estruturas mais produzidas e comercializadas de M. anisopliae são
os conídios, utilizando-se meio de cultura sólido. Esse processo tem sido usado para a
manutenção rotineira de isolados e produção em pequena escala de conídios visando estudos
de laboratório, bem como a produção em grande escala visando testes de campo e
comercialização. O fungo é produzido na superfície de meio sólido, dentro de diferentes
recipientes conforme o objetivo e escala de produção (ALMEIDA & BATISTA FILHO,
2006).
A produção dos fungos M. anisopliae e B. bassiana tem sido feitas no
Brasil por algumas indústrias particulares e por organizações oficiais. Estes fungos apresentam
uma grande variabilidade natural e as organizações produtoras não tem dado a esse fato a
importância que merece. Normalmente, a produção inicia-se através do isolamento do fungo
de um inseto atacado. Não se conhecem a virulência, capacidade de produção de esporos,
viabilidade e outras características importantes da cepa a ser produzida (ALVES, 1982).
As técnicas de produção de fungos para controle de pragas devem ter
baixo custo e permitir a obtenção de alta concentração e formas viáveis e virulentas do
patógeno, que possam ser formuladas e utilizadas (ALVES, 1982).
Os isolados de M. anisopliae IBCB 348 e IBCB 425 são hoje
utilizados pela maioria das empresas produtoras de fungos entomopatogênicos do Brasil. A
transferência do conhecimento foi realizada através de projetos de implantação de seis
biofábricas no Estado de SP e o treinamento de 85 profissionais, inclusive de outros Estados
da federação (ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2006).
A produção do fungo no período de 2002/ 2003, por empresas e usinas
sediadas no Estado, foi de 268 toneladas. O valor médio de comercialização foi de R$
10,00/kg e a receita bruta no período foi de R$ 2.680.000,00. A atividade gerou 148 empregos
diretos e a área de cana tratada atingiu 161.910 ha. O valor médio do tratamento foi de R$
40,00/ha, enquanto o tratamento químico teve custo de R$ 160,00/ha. A economia média
gerada por hectare foi de R$ 120,00, totalizando uma economia global de R$ 19.429.200,00,
14
além do fato de que 3.238 toneladas de inseticidas deixaram de ser aplicadas (ALMEIDA &
BATISTA FILHO 2006).
No período de 2004/ 2005, segundo Almeida & Batista Filho (2006), a
área aplicada com o fungo foi de aproximadamente 200.000 ha, sendo que mais uma
biofábrica iniciou a produção. O custo de aplicação e o valor de bioinseticida comercializado
não variaram em relação ao período anterior.
No entanto, a maioria dos entomopatógenos, incluindo os fungos
entomopatogênicos, não estão disponíveis em quantidades e formulações adequadas para
serem utilizados no controle de pragas. Para serem utilizados com eficiência no controle
microbiano de insetos, atuando como inseticidas biológicos na estratégia chamada introdução
inundativa, esses patógenos necessitam estar disponíveis em grandes quantidades. Isso se deve
ao fato que os insetos normalmente necessitam de elevado potencial de inóculo para serem
colonizados por estes patógenos (ALVES, 1998b).
São produzidos e comercializados para o controle de pragas de
diversas culturas na Europa cerca de 100 agentes de controle biológico e, juntamente com
insetos polinizadores, movimentaram aproximadamente US$ 70 milhões em 1991
(LENTEREN et al., 1997). Segundo Faria & Magalhães (2001), no Brasil as quatro maiores
empresas produziram em torno de 155 toneladas entre os fungos B. bassiana, M. anisopliae e
Sporothrix insectorum, para o controle de cigarrinhas, ácaros, brocas, cochonilhas e do
percevejo-de-renda.
A produção em escala industrial de fungos entomopatogênicos
representa uma etapa crítica e limitante no desenvolvimento de um programa de controle
microbiano para uma determinada praga. A pesquisa de novas metodologias de sistemas de
produção é muito importante para tornar o controle microbiano de pragas economicamente
viável para ser aplicado em grandes áreas (TANZINI, 2002).
A seleção de um meio padrão e o conhecimento das condições de
cultivo mais adequadas para uma espécie ou linhagem são dois dos fatores mais importantes
na produção massal de fungos entomopatogênicos para garantir bom crescimento com alta
esporulação (KHALIL et al., 1985). Segundo Verhaar & Hijwegen (1993), a produção de
esporos pode variar consideravelmente e causar problemas na obtenção de conídios.
15
Um meio de cultura deve possuir, basicamente, uma fonte de carbono
(C) e nitrogenio (N), sais minerais e alguns fatores de crescimento (SOPER & WARD, 1981).
As fontes de C geralmente utilizadas são: amido, glicose, sacarose, dextrose e diversos outros
açúcares, enquanto que as fontes de N são geralmente componentes ricos em proteína e/ ou
aminoácidos, como extrato de soja e outros subprodutos vegetais, extrato de levedura e
peptona, podendo utilizar também componentes inorgânicos como o ácido casamino (LEITE
et al., 2003).
A composição do meio pode ter uma estreita relação com o custo e a
qualidade do fungo produzido, pois pode influenciar o tipo, formato e qualidade do propágulo
produzido, além da sua estabilidade após secagem e sua agressividade, medida em termos de
virulência e patogenicidade. Portanto, no desenvolvimento de um meio de cultura, a primeira
etapa é selecionar um meio definido ou semi definido que proporcione uma boa produção da
forma desejada do fungo. A próxima etapa é variar os nutrientes e avaliar seu impacto na
produção do patógeno, bem como na sua capacidade de suportar processos de secagem,
estabilidade e virulência. Caso o meio desenvolvido tenha custo elevado, a última etapa seria
substituir os componentes nutricionais por um substrato complexo, barato e acessível
(JACKSON et al., 1996; JACKSON, 1997).
Conforme Leite et al. (2003), a diversidade de fontes de C e N tem
sido bastante explorada no desenvolvimento de meios de cultura, especialmente de meios
complexos a base de produtos naturais. Entretanto, estudos mais recentes têm mostrado que a
proporção C:N é também um importante fator a ser considerado no desenvolvimento de meios
de cultura, principalmente de meios líquidos que visam a produção de formas submersas.
Segundo Carlile & Watkinson (1994), um meio balanceado deverá
conter cerca de dez vezes mais carbono do que nitrogênio. O primeiro é necessário como fonte
de energia, enquanto que o segundo é essencial na síntese de componentes celulares, tais como
ácidos nucléicos e quitina. Por sua vez, o fósforo é necessário na síntese de ácidos nucléicos e
ATP.
Como fonte de carbono, avaliou-se a utilização das seguintes
substâncias no crescimento e esporulação de B. bassiana, M. anisopliae e Paecilomyces
marquandii: glicose, sacarose, amido e lactose. Tanto no caso de B. bassiana e M. anisopliae,
o amido e a glicose mostraram melhores para o crescimento, sendo que o amido apresentou
16
melhor resultado para a esporulação. A glicose e sacarose obtiveram melhores resultados em
ambos os casos para P. marquandii (MONTEIRO, 1988).
Os outros elementos (nitrogênio, fósforo e potássio) foram adicionados
sob forma de tortas orgânicas, e proporcionaram aumento da massa micelial, do período de
crescimento e da esporulação de Verticillium lecanii (NAGESH & REDDY, 1997).
Para incrementar o crescimento e a esporulação dos fungos, outros
fatores podem ser acrescentados aos meios de cultivo. O extrato de levedura, excelente fonte
de vitaminas e complexo B, foi adicionado ao meio de cultivo por Oliveira (2000), e causou
incremento na produção de esporos do fungo S. insectorum. Também maior produção de
conídios e porcentagem de germinação do fungo Nomuraea rileyi foram verificadas por
Barros et al. (1988) ao se adicionar extrato de levedura.
O extrato de levedura também promoveu a mais elevada esporulação
para o isolado Passo Fundo de N. rileyi, segundo Balardin e Loch (1989). Esse mesmo
suplemento causou o maior crescimento de B. bassiana e também bons resultados para M.
anisopliae na avaliação de alguns meios de cultivo durante a verificação do efeito de difenóis
no crescimento de Verticillium lecanii, B. bassiana e M. anisopliae feita por Hsiao et al.
(1992). Nessa avaliação, apenas o meio suplementado com difenol apresentou crescimento
melhor.
Vários trabalhos têm sido efetuados com o objetivo de se encontrar
meios de cultura que favoreçam a esporulação, bem como reduzir o custo final do inseticida
(VILAS BOAS, 1996), pois substratos adequados se fazem necessários para a produção em
larga escala.
O arroz ainda é um dos substratos mais utilizados, mas alguns estudos
têm sido feitos com o objetivo de avaliar substratos alternativos e mais baratos (CRUZ et al.,
1983), como o fubá de milho, farinha de arroz, soja, farelo de trigo, batata, sorgo, feijão,
milho, arroz úmido, melaço, farinha de aveia, sais minerais, entre outros (CRUZ et al., 1983;
NAHAS & ARAI, 1987; ALVARENGA et al., 1988; VERHAAR & HIJWEGEN, 1993;
VILAS BOAS, 1996; OLIVEIRA, 2000).
Os seguintes meios de cultura naturais sólidos foram verificados por
Wenzel (2002) na produção de V. lecanii: alpiste; arroz agulhinha e integral; farelo de arroz,
soja e trigo; lentilha; lentilha moída; painço; quirela de arroz e milho; soja em grão e moída;
17
sorgo em grão e moído; e trigo em grão e moído. Os seguintes meios líquidos foram utilizados
pelo mesmo autor: arroz agulhinha; batata; farelo de arroz, soja e trigo; feijão branco, carioca,
guandú; fubá; lentilha; soja em grão, sorgo em grão e trigo em grão. A característica comum
de todos esses substratos é a fácil obtenção e baixo custo, no Brasil, visando a produção em
massa para utilização no campo.
No estudo de Vilas Boas (1996), para a produção de M. anisopliae,
quatro substratos facilmente encontrados em larga escala foram utilizados, sendo
comercializados rotineiramente na região de Pernambuco, como caupi (Vigna unguiculata),
feijão (Phaseolus vulgaris L.), fava (Phaseolus lunatus L.) e sorgo (Sorgum bicolor L.). O
comportamento do mesmo fungo foi estudado por Bastos et al. (1976), utilizando-se diferentes
meios: farinha de milho, farinha de arroz, farinha de trigo e a mistura destes amiláceos. O
objetivo era obter um volume maior de esporos e também substituir os componentes do meio
até então utilizados, por serem mais caros e algumas vezes difíceis de serem importados, como
é o caso do ágar-ágar, reduzindo assim o custo de produção.
Também foi verificada a produção de M. anisopliae em diferentes
meios de cultivo por alguns autores que utilizaram os seguintes substratos: lascas de mandioca
misturadas com farelo de arroz (MOHAN & PILLAI, 1982), arroz brunido, arroz integral,
quirelas de milho e de soja (CAMARGO, 1983) e água de côco (DANGAR et al., 1991).
O M. anisopliae é produzido e utilizado no Nordeste do Brasil desde
1969, visando o controle das cigarrinhas da cana-de-açúcar. Também em outras regiões do
país este fungo é utilizado para o controle de cercopídeos das pastagens. Os processos mais
comuns para a produção do M. anisopliae no Brasil são o da “garrafa de soro” e o do saco de
polipropileno com meio de arroz sem casca mais água (GUAGLIUMI et al., 1974;
MARQUES et al., 1981). Estes processos de produção são muito onerosos já que necessitam
de grande número de pessoas para a manipulação dos materiais nas suas diferentes fases de
desenvolvimento. Com relação a B. bassiana, podem ser utilizados os mesmos processos já
referidos para M. anisopliae.
A produção de B. bassiana tem sido feita através da fermentação em
líquido ou através do semi-sólido de arroz cozido. Em ambos os casos, consegue-se um bom
volume de conídios, por um custo relativamente baixo, sendo que o micélio seco é a forma de
produção mais comum recentemente (LEITE et al., 2003).
18
Mais suscetíveis às condições no campo, os entomopatógenos estão
sujeitos a fatores bióticos e abióticos que influenciam na sua sobrevivência, propagação e
infecção do hospedeiro (GOETTEL et al., 2000). Entre os abióticos, a radiação solar (UV) é a
mais importante (FARGUES et al., 1996; BRAGA et al., 2001b; CAGAN & SVERCEL,
2001), pois pode inativar o conídio, provocar danos letais ao DNA e mutações (NICHOLSON
et al., 2000). Em geral, os efeitos da radiação UV reduzem a eficiência do fungo no campo
(BRAGA et al., 2001a).
Segundo Tuveson & McCoy (1982), Paul & Gwynn-Jones (2003) e
Johnson (2003), a recuperação de DNA lesado pode ser iniciada através do fenômeno da
fotorreativação, que juntamente com a esporulação de algumas espécies, pode ser induzida
pelas radiações UV-A e UV-B, tornando-as benéficas nesses casos.
A temperatura é um dos fatores de grande importância e atua sobre os
patógenos afetando a produção, estabilidade na estocagem e patogenicidade nas condições de
campo. Esse fator torna-se ainda mais importante tendo em vista a incapacidade dos patógenos
de se protegerem das variações de temperatura através de sistemas fisiológicos (ALVES,
1982).
2.4.1 Produção em meio semi-sólido
Devido ao elevado preço que o arroz vem alcançando no comércio, o
custeio do substrato para o fungo tem acarretado despesas crescentes aos fabricantes, o que
levou alguns pesquisadores a realizar sucessivos trabalhos de laboratório com o objetivo de
averiguar a eficiência de outros produtos naturais que possam vir a substituí-lo. Segundo
Guagliumi et al. (1974), diversos autores têm relatado o resultado de suas pesquisas, que
sempre acabam por confirmar a superioridade do arroz como substrato sólido para o cultivo de
M. anisopliae. Este sucesso se deve, grandemente, ao fato de que, quando se usam grãos
inteiros de arroz para preparar o meio de cultura, formam-se interstícios que multiplicam
notavelmente a superfície do meio, o que permite ao fungo penetrar totalmente na massa do
19
substrato. Esse detalhe não se verifica com a maioria dos meios de cultura, onde o M.
anisopliae cresce, exclusivamente, na superfície exposta à oxigenação direta.
A superioridade do meio de arroz, em relação ao de amido e batata –
dextrose no desenvolvimento e esporulação do fungo entomopatogênico M. anisopliae já foi
comprovada por Marques & Vilas Boas (1973), Aquino (1974) e Valle et al. (1980). Moura-
Costa & Magalhães (1974) e Villacorta (1978) utilizaram esse meio de cultivo para produção
de conídios de M. anisopliae. Esse fungo é utilizado no controle biológico de cigarrinha da
cana-de-açúcar e de pastagens em substituição aos inseticidas químicos. Para tal, há
necessidade de produção em larga escala de conídios o que é feito em meio de arroz,
especialmente arroz autoclavado em sacos de polipropileno ou frascos de vidro. Moura-Costa
& Magalhães (1974), utilizaram também a farinha de arroz, obtida com auxílio de um moinho
e posteriormente passada em peneira de malhas finas, verificando bom crescimento e
esporulação em meio com concentração de 5% de farinha de arroz, 1% de ágar em pó e água
destilada. Daoust & Roberts (1983) utilizando seis diferentes tipos de meios micológicos e três
tipos de arroz concluíram que para produção de conídios o meio de arroz foi o que produziu
resultados melhores e mais econômicos mesmo comparado aos meios micológicos complexos.
Aquino (1974) apresentou o meio sólido natural constituído por grãos
autoclavados, como sendo o substrato mais indicado para o cultivo de M. anisopliae em
grande quantidade.
Vários outros substratos naturais foram testados por Aquino (1974) e
Guagliumi et al. (1974), comparados com o arroz, tais como, amido (goma de mandioca), fubá
de milho, arroz em pó, arroz quebrado, farinha de mandioca, farelo de trigo, batata doce,
batata inglesa, farelo de soja, torta de algodão, gérmen de trigo e gelose. Entre estes, a batata
demonstrou ser excelente meio de cultura, com ótima esporulação, ainda que apenas na
superfície do substrato. Porém, foi ela inferior ao meio de arroz inteiro cozido, que produziu
grande quantidade de esporos, não só na superfície, como também, nos interstícios entre os
grãos. O meio de arroz oferece, portanto, maior área de desenvolvimento ao fungo, havendo,
consequentemente, formação de maior quantidade de esporos.
Camargo (1983) testou os seguintes cereais como meios de cultura
para a produção de M. anisopliae: arroz brunido, arroz integral, quirera de milho de variedade
Asteca, quirera de milho de variedade Nutrimais e quirera de soja, sendo a todos eles
20
acrescido 60% de água antes da autoclavagem. O autor concluiu que os meios de cultura com
a utilização do arroz (brunido e integral) produziram quantidades significativamente
superiores de esporos, quando relacionados com a produção nos outros meios estudados. A
quirera de milho da variedade Asteca teve um rendimento de 31,8% inferior ao arroz brunido.
Apesar desse menor rendimento do milho na produção de esporos, é possível que compense
sua utilização face ao fato do mesmo ser mais barato que o arroz, porém há necessidade de
maiores estudos a respeito.
Em Alagoas, de acordo com Mendonça & Rocha (1992), o arroz
parboilizado é o único substrato utilizado, conseguindo-se 1010 conídios/g de arroz com o
fungo. Fernandes et al. (1994) utilizaram combinações de arroz e milho triturados, farelo de
arroz, bagacilho de cana-de-açúcar triturado e comparou-se ao arroz parboilizado, na produção
de M. anisopliae e B. bassiana (Bals.) Vuill. Concluíram que o arroz triturado mais o
bagacilho de cana foi superior aos outros meios utilizados para ambos os patógenos.
Um dos fatores observados, que favorece uma maior esporulação, é o
que permite a penetração do micélio do patógeno e sua consequente esporulação no meio de
cultura. Assim, Dorta et al. (1990), utilizando farinha de arroz, suplementou com 50% de
casca de arroz e a produção de esporos de M. anisopliae dobrou.
Vilas Boas et al. (1996) estudando a diversificação de meios de cultura
(arroz, caupi, fava, feijão e sorgo) para produção de fungos entomopatogênicos concluíram
que para B. bassiana o arroz continua sendo o meio de cultura mais econômico e de maior
produção de conídios. Já para M. anisopliae os resultados obtidos justificam diversificar o
meio de cultura para sua produção, utilizando o caupi, pois o mesmo superou o arroz em 9%
na produção de conídios. Não houve diferença significativa na mortalidade sobre D.
saccharalis, quando o entomopatógeno foi produzido no caupi e no arroz. Mas, os autores
concluem também que a vantagem na utilização do caupi é que pode ser alternado com o
arroz, pois dependendo da oferta de grãos, o caupi tem seu preço inferior ao arroz em 30%.
Neves et al. (2001), testaram a produção de B. bassiana em seis
diferentes tipos de arroz (quirera, tipo 2, extra, casca amarela, integral e parboilizado),
utilizando várias quantidades de água e três métodos de preparo, e verificaram que quirera,
integral e parboilizado foram os mais produtivos.
21
Costa & Magalhães (1974), testaram diversas composições de meio
sólido, utilizando como substrato o arroz cozido, pó de arroz e ágar em diferentes
concentrações, e concluíram que o melhor meio é composto por pó de arroz a 5%, ágar 1% e
água destilada.
2.4.1.1 Produção de conídios
Os conídios podem ser produzidos em meios sólidos, semi-sólidos e
líquidos, enquanto que as demais formas são geralmente produzidas em meios líquidos. A
produção de conídios em meio sólido tem sido usada para a manutenção rotineira de isolados
de produção em pequena escala visando estudos de laboratório, bem como para a produção em
média e grande escala visando testes em campo e comercialização. O fungo é produzido na
superfície de meio sólido, dentro de diferentes recipientes conforme o objetivo e escala
comercial (LEITE et al., 2003).
Segundo Almeida & Batista Filho (2006), para a produção de conídios
em larga escala, têm sido utilizados produtos vegetais de baixo custo, especialmente grãos de
arroz. O arroz é inicialmente mergulhado em água previamente aquecida, dentro de uma
vasilha, e pré-cozido por 15 minutos até obter a consistência emborrachada. Em seguida, o
arroz pré-cozido é colocado dentro de frascos de vidro, sacos de polipropileno ou bandejas
autoclaváveis e autoclavado por 30 minutos. Com o objetivo de fornecer espaço e oxigênio
para o fungo crescer, o substrato deve ocupar no máximo a metade do volume do recipiente.
Após o resfriamento, o meio é inoculado com conídios e, em seguida, incubado sob
temperatura média de 25oC. O uso de sacos plásticos autoclaváveis é o método mais utilizado
para a produção de M. anisopliae. Após 10 a 15 dias de incubação, os sacos são abertos e seu
conteúdo exposto ao ar ou fluxo de ar levemente aquecido por 24 horas, até secar a umidade
de 15% aproximadamente. O material então é embalado e armazenado sob refrigeração a 5oC
por até três meses e até seis meses a -10oC.
22
Os meios deficientes em N, porém ricos em C, tendem a produzir
maior quantidade de conídios (McCOY & KANAVEL, 1969; e ROMBACH et al., 1988).
Assim, os meios usados na produção em massa de fungos são geralmente constituídos de
produtos vegetais ricos em amido, como batata, arroz, aveia, milho, feijão dentre outros. Arroz
cozido é um dos meios mais utilizados para a produção de fungos mitospóricos,
principalmente nos países em desenvolvimento (JACKSON, 1997).
A conidiogênese de fungos é estimulada pela luminosidade. O fungo
B. bassiana produziu mais conídios quando exposto a um regime de luz contínua (ALVES &
MORAES, 1979), da mesma forma que S. insectorum (patógeno do percevejo-de-renda da
seringueira) em estudos realizados pelo Instituto Biológico do Estado de São Paulo (LEITE et
al., 2003). Já o fungo M. anisopliae apresentou maior produção sob fotoperíodo de 16 horas
(ALVES, 1982). A conidiogênese de M. anisopliae foi estimulada pelas lâmpadas azul,
amarela, vermelha e aquelas especiais para planta (ALVES et al., 1980).
Com relação à influência da temperatura, umidade, concentração de
gás carbônico e luminosidade sobre a estabilidade dos conídios de M. anisopliae, B. bassiana
e P. farinosus, verificou-se que a viabilidade dos conídios foi reduzida pela exposição à luz e
elevação de temperatura. Os conídios de B. bassiana e P. farinosus perderam a capacidade de
germinação mais rapidamente nas umidades mais elevadas, enquanto que M. anisopliae
sobreviveu durante mais tempo nas umidades extremas. Quando os conídios de M. anisopliae,
B. bassiana e P. farinosus foram mantidos no escuro a 8oC e 0% de umidade relativa,
observou-se uma germinação próxima a 90% dos referidos fungos, após 28, 635 e 140 dias,
respectivamente. M. anisopliae apresentou 92% de conídios germinados após 252 dias quando
mantidos no escuro a 8oC e 75% de umidade relativa. A retirada de oxigênio eliminou o efeito
desfavorável de umidades relativas intermediárias para a viabilidade de conídios de M.
anisopliae (CLERK & MADELIN, 1965).
Ao trabalharem com os fungos Isaria fumosorosea e Isaria farinosa no
Japão, Kawakami & Mikuni (1965) verificaram a redução da longevidade dos esporos em
função do aumento da temperatura e também uma maior viabilidade em baixa umidade
relativa. Observaram ainda que a viabilidade dos esporos foi baixa com uma umidade relativa
ao redor de 80%, ocorrendo um acentuamento desse comportamento em temperaturas
elevadas. Após 50 dias a viabilidade dos conídios em meio de cultura foi 36,7% para I.
23
fumosorosea e 59,9% para I. farinosa, constatando-se que, aos 115 dias, os fungos tornaram-se
inviáveis. Os autores apresentaram ainda as porcentagens de germinação dos fungos a 0, 10,
20 e 30oC, expostos a umidade relativa de 0 a 87%.
Os principais fatores ambientais que afetam a eficiência de M.
anisopliae e B. bassiana como agentes de controle biológico de Hylobius pales foram
estudados por Walstad et al. (1970). Verificaram que a B. bassiana perdia a viabilidade dos
conídios aos 15 dias quando submetido a temperatura de 21oC. M. anisopliae perdia a
viabilidade aos 75 dias, sob os mesmos 21oC. Ambos permaneceram viáveis após 12 meses,
quando armazenados a 8oC.
Zimmermann (1982) verificou correlação entre as condições de
umidade presentes e a resistência dos conídios de M. anisopliae ao calor. Para a exposição de
suspensão aquosa por 30 minutos, a temperatura média letal foi de 42oC. Conídios em pó
submetidos às umidades de 100, 76 e 33% tiveram temperaturas médias letais de 50,5, 57 e
68,8oC, respectivamente. Foi constatado ainda que após 30 minutos de aquecimento da
suspensão a 45oC, apenas 6,2% dos conídios germinaram com 24 horas de incubação.
Decorridas 48 horas, a germinação totalizou 81,8% e, após esse período, não foi possível
constatar outras determinações, uma vez que as placas estavam totalmente cobertas pelo
fungo.
Segundo Abreu et al. (1983), temperaturas de 25 a 28oC propiciaram
perdas na viabilidade de conídios de M. anisopliae aos 120 dias de armazenamento e redução
da patogenicidade para Galleria melonella.
A viabilidade e atividade biológica de fungos entomopatogênicos são
altamente influenciadas pela temperatura, umidade, substrato, radiação ultravioleta e outros
fatores. A maioria dos trabalhos efetuados com os fungos M. anisopliae (Metsch.) Sorok. e B.
bassiana (Bals.) Vuill. demonstra que com o aumento da temperatura e tempo de
armazenamento, ocorre redução na viabilidade dos conídios, sendo em freezer (-13oC) a
melhor condição para preservação (ABREU et al., 1983; BATISTA FILHO & CARDELLI,
1986; ALVES et al., 1987).
A estabilidade de fungos entomopatogênicos foi discutida por Roberts
& Campbell (1977) em experimento efetuado com conídios puros de M. anisopliae. Quando
colocados em tubos com ar, CO2 e nitrogênio e armazenados nas temperaturas -20, 4 e 25oC,
24
verificou-se elevada viabilidade após 64 semanas em todos os gases a -20oC, no ar e
nitrogênio a 4oC, enquanto que nos demais tratamentos a perda da viabilidade ocorreu com 16
semanas.
Marques & Alves (1996) trabalharam com armazenamento de M.
anisopliae e B. bassiana, e verificaram que conídios puros de B. bassiana mantidos a 20oC
durante 180 dias praticamente não mostraram redução na viabilidade, enquanto que M.
anisopliae manteve apenas 63% de viabilidade naquele período. Estudando a preservação de
formulações de B. bassiana durante sete anos, Alves et al. (1996) concluíram que, nas
temperaturas de -10 a -7oC, foram mantidas a viabilidade e virulência do fungo sobre D.
saccharalis.
O efeito de vários fatores do ambiente sobre o crescimento e
sobrevivência dos fungos foi mencionado por Roberts & Campbell (1977). Apesar de
prejudicial à sobrevivência dos conídios, o efeito sobre os demais estágios foi variável. A
temperatura elevada produziu mortalidade no estágio vegetativo de fungos
entomopatogênicos, mas os conídios foram mais resistentes ao calor. Entretanto, a viabilidade
dos conídios foi perdida mais lentamente sob baixa temperatura.
Normalmente utiliza-se meio sólido para a produção de B. bassiana e
M. anisopliae (com exceção da produção de B. bassiana em fermentação líquida na Rússia).
Considerando que doenças ocasionadas por fungos geralmente ocorrem com atraso em relação
ao ciclo da praga, a estratégia usada para o controle de insetos com esses organismos deveria
ser através da antecipação da epizootia pela introdução de uma fonte de inóculo volumosa. A
seleção de raças, através de manipulação genética provavelmente proporcionará importantes
avanços no uso de fungos entomopatogênicos. Do mesmo modo, o desenvolvimento da
produção e formulação terá um impacto significante sobre a eficiência nesses agentes de
controle de insetos (SOPER & WARD, 1981).
O aumento da temperatura e do tempo de armazenamento provocam
retardamento na germinação dos conídios de M. anisopliae e B. bassiana (MARQUES, 1993).
25
2.4.2 Produção em meio líquido
Os meios líquidos têm sido cada vez mais utilizados para a produção
de fungos em grande escala, pois permitem um melhor controle das condições físicas e
nutricionais exigidas pelo organismo (JACKSON et al., 1996; JACKSON, 1997).
Na produção de blastosporos, corpos hifais e micélio têm sido avaliado
como componentes de meio de cultura, além das fontes de C e N, também sais, componentes
específicos e aditivos (LEITE et al., 2003).
Os meios ricos em C e, principalmente, N tendem a produzir maior
quantidade de formas vegetativas: blastosporos, corpos hifais e micélio (McCOY &
KANAVEL, 1969; ROMBACH et al., 1988).
Na produção de B. bassiana em meio líquido, a proporção C:N,
representada pelos componentes sacarose:extrato de levedura, tem uma correlação direta com
a produção de conídios submersos, e inversa com a de blastosporos. A proporção de 4:1
resulta em um aumento na produção de conídios enquanto que a máxima produção de
blastosporos pode ser obtida na proporção de 1:1 (ROMBACH, 1989). Para outro isolado de
B. bassiana, constatou-se que o N é um elemento essencial para a produção de blastosporos do
fungo. Entretanto a adição de extrato de levedura reduz a produção dessa forma e estimula a
formação de micélio (BIDOCHKA et al., 1987). O desbalanceamento nutricional de um meio,
tornando-o menos complexo, também estimula a formação de micélio do fungo N. rileyi a
partir de blastosporos (PENDLAND & BOUCIAS, 1997).
Segundo Leite et al. (2003), na produção de Entomophthorales, o
excesso de nitrogênio em um meio de cultura pode inibir o crescimento do fungo devido ao
acúmulo de metabólitos. O aumento da concentração de extrato de levedura acima de 1% no
meio líquido inibe o crescimento do fungo Batkoa sp., patógeno da cigarrinha-da-raiz da cana-
de-açúcar, enquanto que o aumento da concentração total da mistura de extrato de levedura +
extrato de carne + leite desnatado acima de 2% inibe o crescimento de Furia sp. patógeno das
cigarrinhas das pastagens. Já o fungo Neozygites floridana, patógeno do ácaro-rajado, prefere
concentrações mais elevadas de nitrogênio, com aumento na produção de corpos hifais em
concentrações totais da mistura de extrato de carne + peptona + leite desnatado de até 4%.
26
A maioria dos hifomicetos produz blastosporos em cultivo submerso,
entretanto, para otimizar a produção dessa forma, parâmetros específicos precisam ser
ajustados para cada isolado estudado. Alguns isolados de M. anisopliae formam pequenas
esferas (pellets) e produzem poucos blastosporos, enquanto outros isolados se reproduzem
como micélio, formando também blastosporos. A produção de blastosporos de M. anisopliae
foi aumentada, e a formação de pellets reduzida, através da redução da atividade da água do
meio líquido, pela adição do polietileno PEG 200 ou de alta concentração de glicose (INCH &
TRINCI, 1987; HUMPHREYS et al., 1989).
A redução da atividade da água do meio líquido tem sido avaliada
procurando além de incrementar a produção do fungo, melhorar suas qualidades fisiológicas
como a tolerância à dessecação (KLEESPIES & ZIMMERMANN, 1992). A produção de
blastosporos de hifomicetos foi aumentada pela adição, no meio, de 5% de polietileno 200
(PEG 200) ou de uma concentração superior a 1,2% de Tween 80, bem como pelo ajuste da
concentração de carbono e nitrogênio e de pH (KLEESPIES & ZIMMERMANN, 1992).
Tanzini (2002) avaliou dois meios de culturas para a produção dos
fungos B. bassiana (1196), M. anisopliae (1189), S. insectorum (1229), P. fumosoroseus
(1200) e V. lecanii (1200). Os meios líquidos testados foram a base de batata-dextrose-ágar
(BDA) e meio de cultura completo (MC), utilizando frascos Erlenmeyer contendo 100 mL do
meio, mantidos em agitação mecânica por um período de sete dias, a uma temperatura de
26±0,5oC. Não houve diferença entre os meios líquidos. B. bassiana foi mais produtivo, com
109 conídios/mL, e os outros atingiram apenas 107 conídios/mL.
Segundo Cruz et al. (1983), a eficiência de alguns meios de cultura
naturais líquidos com objetivo ao favorecimento da esporulação do fungo entomopatogênico
M. anisopliae, foi estudada em caldo de feijão, caldo de arroz, caldo de batata e água. Foram
usados frascos de vidro com volume de 12 mL, que continham 3 mL de meio de cultura. Os
resultados obtidos evidenciaram que o caldo de feijão foi o meio de cultura que mais
favoreceu a esporulação, seguido do caldo de arroz. O aspecto da esporulação do fungo e a
medida da concentração de esporos foram os critérios de leitura mais notórios para a
caracterização da eficiência dos meios de cultura.
Uma cepa de fungo Beauveria sp., isolada de um exemplar de bicudo
do algodoeiro (A. grandis), foi semeada em meios de cultura naturais líquidos, à base de arroz,
27
feijão e batata, com o objetivo de serem averiguadas a produção de esporos e a viabilidade. Os
resultados evidenciaram a superioridade absoluta do caldo de feijão como indutor da produção
de conídios. No estudo de viabilidade, a germinação dos esporos foi estatisticamente
semelhante em arroz, feijão e batata (todos acima de 96%) (BATISTA FILHO et al., 1985).
Tanzini & Batista Filho (1992), produziram P. fumosoroseus (Wise)
(Brawn & Smith) nos seguintes meios de culturas líquidos: feijão 20%; feijão 20% + sacarose
3%; extrato de levedura 1%; extrato de levedura 1% + sacarose 3%; leite de soja 10%; e leite
de soja 10% + sacarose 3%, e verificaram que o melhor meio foi o macerado de feijão 20%,
com 97% de viabilidade e 1,41 x 108 conídios/mL.
Pereira & Eira (1999) descreveram um meio líquido para produção de
M. anisopliae à base de macerado de percevejo de N. viridula (Linnaeus, 1758) mais 0,2% de
sacarose, a qual produz o dobro de conídios por grama de substrato a um custo de 51 vezes
inferior, em relação ao processo convencional de produção em meio sólido.
O desenvolvimento e esporulação de M. anisopliae, B. bassiana e
Hansfordia pulvinata (Berkeley & MA Curtis) foram testados por Alvarenga et al. (1988), em
meios de cultura líquidos obtidos por maceração de quatro variedades de feijão, de soja e de
grão de bico, e verificaram que o feijão guandú é o melhor substrato para os três fungos.
Alguns meios líquidos naturais, como água de côco, extrato de abóbora
e extrato de mamão, foram testados como alternativas por Ibrahim e Low (1993) para a
produção de B. bassiana e P. fumosoroseus.
Macerados de feijão de mesa (“carioquinha” e “jalo”), feijão guandú,
soja e grão-de-bico foram testados como meio de cultivo de M. anisopliae e B. bassiana por
Alvarenga et al. (1988).
A produção do fungo entomopatogênico S. insectorum foi verificada
por Oliveira (2000) nos seguintes meios líquidos: macerados de feijão de mesa, feijão guandú
e soja, extratos de batata, fubá e soja, leite em pó, farelo de trigo e arroz.
As principais dificuldades do processo são obtenções de meios de
cultura adequados que não afetem a virulência; determinações das condições de
desenvolvimento e esporulação; e prevenção das contaminações secundárias. A grande
vantagem desse processo é a obtenção de elevadas quantidades de biomassa em um pequeno
espaço físico e em pouco tempo (ALVES, 1998a).
28
2.4.2.1 Produção de blastosporos
Na produção de blastosporos é utilizado o processo de cultivo
submerso em meio líquido, também conhecido por fermentação, realizado pela aeração
constante do meio. A produção é otimizada pela seleção de isolados específicos e variação das
condições de cultivo (LEITE et al., 2003).
O bioinseticida Boverin, que é comercializado na Rússia para controle
de várias pragas, consiste de conídios ou blastosporos de B. bassiana. Na produção de
blastosporos, o meio usado para obtenção do inóculo, em agitadores ou pequenos
fermentadores, é o mesmo usado na fase final de produção, em grandes fermentadores (2 a 63
m3), sendo constituído de 2% de extrato de levedura, 1% de xarope de milho e sais minerais.
Inicialmente o fungo é mantido no agitador por 42 horas, sob temperatura de 25 a 28oC,
atingindo concentração de até 8,8 x 108 blastosporos/mL. Em seguida, o fungo é inoculado no
fermentador, utilizando um volume de inóculo de pelo menos 2% do volume de meio. A
produção do fungo pode alcançar 15 a 20 kg de pasta de blastosporos/m3 de meio líquido,
contendo 1,0 x 109 a 1,5 x 109 blastosporos viáveis/g de pasta (LEITE et al., 2003).
A colheita do fungo, na produção de Boverin, é feita por sedimentação
dos blastosporos suspensos em uma solução de sulfato de alumínio ou por meio da sua
filtragem com uma bomba de vácuo, separando a pasta de blastosporos, seguido da secagem
do fungo. Na secagem do fungo, a técnica de liofilização tem proporcionado melhores
resultados, tendo sido a mais utilizada, inclusive para o produto Boverin. Na secagem do
fungo mais inerte, expondo o mesmo a um fluxo de ar, recomenda-se que a redução da
umidade na faixa crítica, entre 30 a 40%, seja obtida o mais rápido possível (FENG et al.,
1994).
Na China, blastosporos de B. bassiana são colhidos por filtragem. Para
isso, o fungo suspenso no substrato líquido é previamente misturado com talco ou CaCO3. O
material obtido é formulado em grânulos de 1,2 a 1,4 mm usando-se um formulador de
medicamentos. Os grânulos são expostos a um fluxo de ar com temperatura inferior a 30oC
enquanto agitados, sendo a umidade consequentemente removida. O método de secagem em
fluxo de ar é também usado para secar a pasta de blastosporos. Para isso, a pasta é exposta a
29
fluxo na pressão de 3kg/cm2, dentro de torre de secagem desenvolvida para esse fim. A
temperatura é controlada para 35 a 40oC na saída do ar. O pó seco obtido contem 1010
blastosporos/g e uma umidade de 4,66% (FENG et al., 1994).
Em culturas submersas, além de menor produção de conídios, há a
formação de blastosporos em vários fungos entomopatogênicos, como B. bassiana, B.
brongniarti, M. anisopliae, Sorosporella uvella e V. lecanii (FERRON, 1978).
2.5 Fatores ambientais
A persistência de um entomopatógeno no habitat depende basicamente
de três fatores: tipo de substrato em que o patógeno está localizado, fatores ambientais e forma
do patógeno (presença ou não de estruturas de resistência, por exemplo, esporos, poliedros,
etc.) (JAQUES, 1985).
A exposição aos fatores ambientais (temperatura, umidade, radiação
solar, etc.) é determinante para a estabilidade dos entomopatógenos (IGNOFFO & BATZER,
1971; BROOME et al., 1974; JAQUES, 1985; GRIEGO et al., 1985; ALI & SIKOROWSKI,
1986).
2.5.1 Radiação ultravioleta
As radiações podem ser benéficas, maléficas ou inócuas para os fungos
dependendo da qualidade e intensidade da radiação, tempo de exposição, etc. Quando as
radiações não causam efeitos letais, normalmente influenciam o crescimento e a reprodução
(VALLE, 1984).
Estudos em laboratório e campo sugerem que a luz solar, em especial a
porção ultravioleta do espectro, é provavelmente o fator que mais afeta a persistência de
30
inseticidas microbianos, pois atua diretamente nos ácidos nucléicos, alterando-os ou mesmo
destruíndo-os, o que impede o crescimento e a multiplicação do microrganismo (VALLE,
1984).
A luz ultravioleta (UV) com comprimento de onda entre 230 e 380 nm
estimula a esporulação em alguns fungos (LEACH, 1965).
Em M. anisopliae, os estudos sobre efeitos da luz concentram-se em
duas áreas: estímulo à esporulação e efeitos letais da luz UV (VALLE, 1984).
Bastos & Matta (1976) relatam que os melhores efeitos de produção de
esporos são obtidos com alternância de período claro/ escuro, mas Santos (1978), Matta &
Oliveira (1978) e Alves (1982) obtiveram maior produção de conídios com iluminação
contínua.
Os efeitos letais causados por luz UV (253 nm) foram demonstrados
por Corrêa (1983), Frigo (1983) e outros. Esses autores encontraram grande variabilidade
entre isolados e sugerem sua utilização em programas de melhoramento visando obter
linhagens mais resistentes.
As radiações solares também podem causar perda de viabilidade desse
fungo. Corrêa (1983) demonstrou que a luz solar direta causa altas taxas de mortalidade, mas
os conídios estão mais protegidos sob luz difusa e em solos mais porosos. Zimmermann
(1982) estudando o efeito de lâmpadas artificiais com o mesmo espectro de ação da luz solar e
com potência dez vezes maior, constatou que a luz diminui e retarda a germinação de
conídios.
A radiação solar é considerada como o principal agente causador da
inativação de entomopatógenos, especialmente na faixa ultravioleta (IGNOFFO & BATZER,
1971; BROOME et al., 1974; JAQUES, 1985; GRIEGO et al., 1985; ALI & SIKOROWSKI,
1986).
Um dos primeiros trabalhos sobre a inativação de fungos
entomopatogênicos pelo ultravioleta foi o de Ignoffo et al. (1977), onde testou-se a
estabilidade de vários tipos de patógenos. Estes autores determinaram que N. rileyi foi mais
estável que entomopoxvirus, NPV, CPV e V. necatrix, com exceção do Bacillus thuringiensis.
31
Zimmermann (1982) estimou a meia-vida de M. anisopliae em
condições de campo em 1 hora e 40 minutos quando se deixou o patógeno incubado por 24
horas e em 2 horas e 45 minutos para 48 horas de incubação.
Alves (1986c) determinou a DL50 da luz ultravioleta germicida (253,7
nm) para vários isolados de M. anisopliae, sendo que esta varia de 32,01 a 68,18 segundos.
Além disso, algumas espécies de fungos têm mecanismos de proteção
natural ao UV, porém, segundo Braga (2002a), a maioria desses microorganismos não possui
proteção contra os efeitos deletérios da luz solar.
Para se medir os efeitos dos raios UV sobre os fungos
entomopatogênicos estudados, pode-se utilizar lâmpada própria para radiação, com simulador
de radiação solar (FARGUES et al., 1996) ou com radiação natural (ROTEM et al., 1985;
SMITS et al., 1996).
O simulador solar permite que se exponham vários isolados em
diferentes tempos de exposição, e permite ainda que se tenha uma exposição estável em todos
os experimentos. As lâmpadas utilizadas no simulador solar reproduzem o espectro e
intensidade próximos aos da luz solar (ROBERTS & FLINT, 2002).
Certas lâmpadas fluorescentes emitem raios UV-A, UV-B e estas
podem ser usadas separadamente, em combinação ou ainda combinadas a outras lâmpadas que
produzem alta intensidade de UV-A, UV-B e luz visível. O espectro dessas lâmpadas reproduz
uma radiação semelhante à da luz solar ao meio-dia e, atualmente, são usadas em várias
pesquisas com microorganismos (FARGUES et al., 1997).
O método menos utilizado é o da radiação natural, dada a sua alta
variação ao longo do tempo, o que dificulta as pesquisas com microorganismos a respeito da
tolerância ao UV e seus efeitos (ROBERTS & FLINT, 2002).
Alguns autores sugerem selecionar isolados mais tolerantes à radiação
UV-B, pois sabe-se que a suscetibilidade dos fungos à radiação varia entre diferentes espécies
e entre isolados (FARGUES et al., 1996). Diversos trabalhos têm sido realizados, em
particular na França, Estados Unidos, Canadá, Eslováquia, Grécia e Brasil (FARGUES et al.,
1996; INGLIS et al., 1997; FOURTOUNI, et al., 1998; CAGAN & SVERCEL, 2001;
BRAGA et al., 2001a; BRAGA et al., 2002b), com objetivo de encontrar isolados tolerantes à
radiação UV-B, ou seja, que mantenham a viabilidade e a virulência (CAGAN & SVERCEL,
32
2001; BRAGA et al., 2001c). No Brasil, há poucos trabalhos com este intuito. Hunt et al.
(1994) e Braga et al. (2001b) encontraram isolados de fungos tolerantes, que apresentaram
porcentagem de germinação em torno de 60%, após 2 horas de exposição.
Pesquisas com objetivo de avaliar os efeitos da radiação UV sobre a
germinação e sobre a formação de colônias com isolados de M. anisopliae e M. flavoviridae
têm sido realizadas em condições de laboratório com isolados cultivados em meio de cultura
(HUNT et al., 1994; BRAGA et al., 2001abc). Também têm sido efetuadas pesquisas com
estas duas espécies produzidas em meios de cultura e depois formuladas em óleo para verificar
a resistência ao UV (MOORE et al., 1993). Também para as espécies B. bassiana e P.
fumosoroseus, os efeitos deletérios da exposição ao UV são claramente demonstrados,
ocorrendo à redução na viabilidade e na virulência (INGLIS et al., 1995; FARGUES et al.,
1996); resultados demonstram que 2 e 3 horas de exposição ao UV são suficientes para
redução drástica da virulência de conídios de M. anisopliae em insetos de 3o ínstar de D.
saccharalis (FRANCISCO, 2004).
Franco (2005) estudando a tolerância de conídios às radiações UV-A e
UV-B em função do tempo de cultivo de fungos entomogênicos concluiu que a tolerância
varia com o tempo de cultivo e com a espécie utilizada. A tolerância dos conídios dos isolados
JAB 12 de P. fumosoroseus e JAB 425 de M. anisopliae é incrementada à medida que se
aumenta o tempo de cultivo. O inverso ocorre com o isolado JAB 10 de A. aleyrodis. Para o
isolado IBCB 66 de B. bassiana, conídios muito jovens ou muito velhos são os menos
tolerantes ao UV (FRANCO, 2005).
Além da composição dos meios de cultura, a luz tem mostrado grande
influência sobre o crescimento e esporulação de muitos fungos (ALVES, 1982).
2.5.2 Temperatura
A maioria dos fungos mitospóricos é favorecida por temperaturas
próximas de 25oC durante seu crescimento e conidiogênese, enquanto que os
33
Entomophthorales preferem temperaturas mais amenas, em torno de 20oC. Os mitospóricos M.
anisopliae, B. bassiana e N. rileyi apresentam faixas de temperatura favoráveis para o
desenvolvimento de 24 a 30oC, 22 a 26oC e 20 a 30oC, respectivamente (ALVES, 1986a).
Para o M. anisopliae a temperatura ideal para germinação do esporo
encontra-se na faixa de 25 a 30oC. Por outro lado, o limite de 24 a 30oC foi estabelecido por
diversos autores como sendo a faixa ideal para o crescimento vegetativo e esporulação desse
fungo (WALSTAD et al., 1970).
Estudando o efeito da temperatura e regime luminoso sobre o M.
anisopliae, Bastos & Matta (1976) concluíram que a melhor temperatura para a esporulação
foi de 25oC e o regime luminoso mais adequado foi o de luz alternada dia e noite. Os autores
trabalharam com temperaturas variando de 5oC e os fotoperíodos luz contínua, escuro
contínuo e luz alternada (dia e noite).
Villacorta (1978) trabalhando com diferentes isolados do M.
anisopliae verificou que a 37oC houve inibição da germinação de conídios, tornando-os
inviáveis quando os mesmos eram submetidos por mais de 96 horas a essa temperatura.
Santos (1978) estudando a influência de alguns fatores no crescimento,
germinação e produção de conídios de M. anisopliae, verificou que a temperatura de 37oC
inibe a germinação de conídios, tornando-os inviáveis se os mesmos forem expostos por mais
de 96 horas nesta temperatura. Além disso a luz contínua tem influência sobre a produção de
conídios aumentando-a bastante em relação à luz alternada e ao escuro total, sendo que este
último favoreceu o desenvolvimento micelial.
34
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Controle
Biológico do Instituto Biológico, localizado em Campinas, SP.
3.1 Isolados de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
Os isolados dos fungos Metarhizium anisopliae (IBCB 425) e
Beauveria bassiana (IBCB 66), utilizados nos experimentos, provenientes da coleção de
organismos entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu”, mantida no Laboratório de
Controle Biológico, foram obtidos de uma amostra de solo de Iporanga/ SP e da broca-do-
café Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae), respectivamente.
Os isolados encontram-se armazenados em “freezer” a -12oC, na
forma de conídios puros, acondicionados em “eppendorfs”.
35
3.2 Condição de esterilização
A vidraria utilizada foi esterilizada em estufa, na temperatura de
180oC, durante 3 horas. Os meios de cultura foram esterilizados em autoclave a 121oC e 1
kgf/cm2 por 20 minutos, com exceção dos meios sólidos que foram autoclavados durante 30
minutos.
3.3. Repicagem de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
Para a realização dos bioensaios, os isolados de M. anisopliae e B.
bassiana foram repicados em placas de Petri, de 9,0 cm de diâmetro, contendo meio de
cultura BDA (200 g de batata, 20 g de ágar-ágar e 20 g de dextrose em 1000 mL de água
destilada).
Em câmara de fluxo laminar vertical previamente esterilizada com
álcool 70%, cada fungo foi inoculado em três pontos nas placas através de uma alça de
platina, previamente flambada.
As placas foram mantidas em câmaras para germinação (B.O.D.), a
25±1oC, UR 70±10% e fotofase de 12 horas. O período de incubação foi de 10 dias, e
posteriormente armazenadas em geladeira (4oC) até a utilização nos experimentos.
Os conídios produzidos foram removidos da superfície do meio de
cultura, com auxílio de espátula de metal, previamente flambada, para o preparo da suspensão
em água estéril com espalhante adesivo (Tween 80® - 0,1mL/L), contendo 1 x 108
conídios/mL.
As suspensões preparadas foram utilizadas para a produção semi-
sólida e líquida de M. anisopliae e B. bassiana.
36
3.4 Produção semi-sólida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
Foram realizadas 6 repetições para cada um dos 17 tratamentos:
amido de milho, arroz integral tipo 1, arroz parboilizado tipo 1, arroz tipo 1 (testemunha),
arroz tipo 2, aveia em flocos, canjiquinha, farelo de trigo, farinha de mandioca crua, farinha
de milho amarela, farinha de trigo especial, fubá, milho em grãos, polvilho azedo, soja em
grãos, trigo moído e turfa (Tabela1).
As quantidades de substrato e água destilada utilizadas para o preparo
dos meios naturais sólidos contidos na Tabela 1 foram baseadas no trabalho de Wenzel
(2002).
A quantidade de substrato e água utilizada variou conforme a
necessidade de se fazer uma mistura, com os diferentes tipos de substrato, que não ficasse
nem muito seca e nem muito líquida para a produção dos fungos.
Os experimentos foram divididos em 3 partes, devido ao grande
número de substratos. Após a análise estatística, foram selecionados os melhores substratos
de cada uma das 3 partes.
Cada substrato foi distribuído em sacos de polipropileno, fechados
com duas dobras, grampeado e autoclavado a 1 atm e 120oC, durante 30 minutos. Em câmara
de fluxo laminar vertical previamente esterilizada com álcool 70%, abriu-se uma parte do
saco e foi inoculado 5 mL da suspensão, com o auxílio de uma pipeta, na concentração de 1 x
108 conídios/mL. Em seguida, o saco foi fechado, novamente, com grampo de metal. Os
sacos foram agitados manualmente para homogeneização do inóculo e destorramento dos
produtos.
Os sacos foram mantidos sobre prateleiras em sala climatizada a
25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 horas (Figura 1). No quinto dia após a inoculação
fez-se uma pequena abertura nos sacos, utilizando-se uma tesoura esterilizada, visando
favorecer a esporulação do patógeno e a secagem do substrato, permanecendo por mais 4 dias
nessa condição (Figura 2). Decorridos 9 dias, os sacos foram armazenados em “freezer” (-
12oC).
37
Tabela 1. Quantidades de substrato e água destilada utilizadas para o preparo dos meios
naturais semi-sólidos.
Substrato Marca
Comercial
Quantidade de
substrato (g)
Quantidade de
água (mL)
Amido de milho Cortesia 60 36
Arroz integral tipo 1 Ráris 70 30
Arroz parboilizado tipo 1 Coradini 60 32
Arroz tipo 1 Namorado 60 32
Arroz tipo 2 Coradini 60 32
Aveia em flocos Mais Vita 60 40
Canjiquinha Cortesia 60 20
Farelo de trigo Natu’s 40 60
Farinha de mandioca crua Cortesia 60 40
Farinha de milho amarela Yoki 60 30
Farinha de trigo especial Dona Benta 73 40
Fubá Yoki 60 45
Milho em grãos à granel 70 20
Polvilho azedo Yoki 75 50
Soja em grãos Natural Life 70 20
Trigo moído Hikari 60 35
Turfa Technes Agrícola 60 10
38
Figura 1. Substratos sólidos de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66) em sacos
de polipropileno mantidos “deitados” sobre prateleiras em sala climatizada.
Figura 2. Substratos sólidos de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66) em sacos
de polipropileno mantidos “em pé” após abertura.
3.4.1 Concentração de conídios
Para o exame da concentração dos conídios, foi retirado, ao acaso,
uma amostra de 1 g do substrato com fungo de cada saco plástico, adicionando-se 10 ml de
água estéril + espalhante adesivo (Tween 80®). Foram realizadas diluições em série (10-2)
39
para obtenção de uma suspensão que permitiu a contagem dos conídios em câmara de
Neubauer sob microscópio (aumento de 400x).
3.4.2 Viabilidade de conídios
Após a quantificação dos conídios, fez-se os testes de viabilidade em
placas plásticas contendo BDA, utilizando-se, com o auxílio de uma micropipeta e em
câmara de fluxo laminar vertical previamente esterilizada com álcool 70%, 0,1 mL de cada
tratamento/ placa.
3.4.2.1 Radiação ultravioleta
As placas foram submetidas à lâmpada germicida (radiação UV de
253,7 nm), distantes 25,0 cm da fonte de radiação, expostas à radiação por 0, 25 e 50
segundos.
As placas foram incubadas por 15 horas em B.O.D. a 25oC.
Foram quantificados os números de conídios germinados e não
germinados, dos quadrantes, em microscópio ótico com objetiva de 400x (ALVES, 1998c).
40
3.4.2.2 Temperatura
Para os ensaios de temperatura utilizou-se a mesma metodologia do
item anterior, mas sendo cada tratamento exposto a diferentes temperaturas: 20, 25, 30 e
35oC.
As placas foram incubadas por 15 horas em B.O.D.
Foram quantificados os números de conídios germinados e não
germinados, dos quadrantes, em microscópio ótico com objetiva de 400x (ALVES, 1998c).
3.4.3 Virulência à Diatraea saccharalis
Para os experimentos de virulência foram realizadas 8 repetições,
contendo 10 lagartas para cada um dos 17 tratamentos, totalizando 80 lagartas por tratamento
e 1360 lagartas para o experimento.
As lagartas de D. saccharalis de 3o ínstar foram provenientes de
criação artificial em dieta, mantidas na Usina São João, Araras, SP.
Cada lote de 10 lagartas de D. saccharalis foi colocado sobre uma
placa de Petri de 12,0 cm de diâmetro para serem pulverizadas na torre de Potter. Os insetos
foram pulverizados com 2 mL da suspensão de fungo, com concentração de 1,0 x 107
conídios/mL, de cada tratamento. As testemunhas foram pulverizadas com 2 mL de água
estéril. Em todos os tratamentos foi adicionado espalhante adesivo a (0,01% de Tween 80®).
Em seguida, as lagartas foram transferidas para potes de plástico transparente de 6,5 cm de
altura x 5,0 cm de diâmetro, com tampa de rosca, permanecendo em jejum durante um
período de 24 horas. Após este período, foi oferecido colmos de cana-de-açúcar de 3,0 cm de
altura.
Cada inseto morto foi lavado em álcool 70% e água destilada, para
desinfestação superficial. Em seguida, os insetos foram transferidos para placas plásticas de
41
4,5 cm de diâmetro, contendo algodão embebido em água para formar um ambiente úmido.
As placas foram mantidas em câmara climatizada à temperatura de 25±1oC, com fotofase de
12 horas e umidade relativa de 70±10%. Por meio deste procedimento é que se obteve a
confirmação da mortalidade causada pelo patógeno, observando-se o crescimento micelial e
conidiogênese no cadáver (Figura 3).
A B
Figura 3. Lagartas de 3o ínstar de D. saccharalis, mortas e recobertas por micélio e conídios
do fungo M. anisopliae (A) e B. bassiana (B).
Os dados foram coletados diariamente por um período de 10 dias,
sendo avaliada a mortalidade (%) de lagartas de 3o ínstar de D. saccharalis.
42
3.5 Produção líquida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
3.5.1 Meio para produção de blastosporos
Foram avaliados 12 tratamentos, com 6 repetições cada, compostos
pelas combinações entre as concentrações de Carbono (C) na forma de D-glicose anidra (40%
de carbono) e sacarose (42,11% de carbono) com Nitrogênio (N) na forma de levedura de
cerveja (7,31% de nitrogênio) por litro de meio. As proporções foram baseadas no trabalho de
Sano (2005) (Tabelas 2, 3, 4 e 5).
Tabela 2. Quantidades de D-glicose anidra e levedura de cerveja para o preparo de 1,0 L de
cada meio de cultura.
Fonte de Carbono (C)
(g)
Fonte de Nitrogênio (N)
(g) Tratamentos
(40% C + 7,31% N) D-glicose anidra Levedura de cerveja
1 16,00 g C + 6,30 g N 40,00 86,13
2 16,00 g C + 7,00 g N 40,00 95,70
3 16,00 g C + 7,69 g N 40,00 105,27
Tabela 3. Quantidades de sacarose e levedura de cerveja para o preparo de 1,0 L de
cada meio de cultura.
Fonte de Carbono (C)
(g)
Fonte de Nitrogênio (N)
(g) Tratamentos
(42,11% C + 7,31% N) Sacarose Levedura de cerveja
4 20,00 g C+ 6,30 g N 47,50 86,13
5 20,00 g C+ 7,00 g N 47,50 95,70
6 20,00 g C+ 7,69 g N 47,50 105,27
43
Tabela 4. Quantidades de D-glicose anidra e levedura de cerveja para o preparo de 1,0 L de
cada meio de cultura.
Fonte de Carbono (C)
(g)
Fonte de Nitrogênio (N)
(g) Tratamentos
(40% C + 7,31% N) D-glicose anidra Levedura de cerveja
7 14,40 g C + 7,00 g N 36,00 95,70
8 16,00 g C + 7,00 g N 40,00 95,70
9 17,60 g C + 7,00 g N 44,00 95,70
Tabela 5. Quantidades de sacarose e levedura de cerveja para o preparo de 1,0 L de
cada meio de cultura.
Fonte de Carbono (C)
(g)
Fonte de Nitrogênio (N)
(g) Tratamentos
(42,11% C + 7,31% N) Sacarose Levedura de cerveja
10 18,00 g C + 7,00 g N 42,75 95,70
11 20,00 g C + 7,00 g N 47,50 95,70
12 22,00 g C + 7,00 g N 52,25 95,70
Cada tratamento foi constituído de 6 Erlenmeyers com 100 mL de
meio, vedados com tampão de algodão recobertos com papel alumínio e esterilizados em
autoclave a 1 atm e 120oC, durante 20 minutos. Em câmara de fluxo laminar vertical
previamente esterilizada com álcool 70%, foi acrescentado em cada frasco, com auxílio de
uma pipeta, 1 mL de suspensão na concentração de 1 x 108 conídios/mL. Em seguida, os
frascos foram submetidos à agitação contínua em “shaker” marca Marconi, modelo MA 830,
a 40 RPM, 26±1oC e fotoperíodo de 12 horas, onde permaneceram por 4, 6 e 8 dias (Figura
4).
Os experimentos foram divididos em 2 partes, devido a capacidade do
agitador em acomodar os Erlenmeyers. Após as análises estatísticas, foram selecionados os
melhores meios de cada uma das 2 partes.
44
Figura 4. Vista superior de Erlenmeyers inoculados e dispostos em agitador.
3.5.2 Concentração de blastosporos
As quantificações de blastosporos foram realizadas com 4, 6 e 8 dias
após a inoculação, retirando-se, em condições assépticas, uma amostra de 5 mL/ frasco para
contagem de blastosporos. Dessa amostra, 1 mL foi adicionada a 9 mL de água estéril +
espalhante adesivo (Tween 80®). Foram realizadas diluições em série (10-2) para obtenção de
uma suspensão que permitiu a contagem de blastosporos em câmara de Neubauer sob
microscópio (aumento de 400x).
Para avaliação da qualidade do fungo com relação à presença de
contaminantes, duas amostras de 0,1 mL de cada Erlenmeyer foram transferidas para placas
de Petri contendo meio de cultura BDA. As placas foram mantidas em câmaras para
germinação (B.O.D.), a 25±1oC, UR 60±10% e fotofase de 12 horas, por um período de 7
dias. Os frascos que apresentaram contaminação foram descartados.
45
3.5.3 Contagem de colônias
3.5.3.1 Radiação ultravioleta
Após a quantificação dos blastosporos, o efeito da radiação
ultravioleta sobre os propágulos foi avaliado em placas plásticas contendo BDA e
pentabiótico (0,5 g/L), utilizando-se, com o auxílio de uma micropipeta em câmara de fluxo
laminar vertical previamente esterilizada com álcool 70%, 100 μL de cada tratamento/ placa.
Em seguida, as placas foram submetidas à lâmpada germicida (radiação UV de 253,7 nm),
distantes 25,0 cm da fonte de radiação, expostas à radiação por 0, 25 e 50 segundos.
As placas foram incubadas em B.O.D. a 25oC durante 3 dias. Após
esse período foram contadas as colônias de M. anisopliae e B. bassiana formadas nas placas
(Figura 5).
A B
Figura 5. Exemplo de colônias de M. anisopliae (A) e B. bassiana (B) formadas em placas de
Petri.
46
3.5.3.2 Temperatura
Para os ensaios de temperatura, utilizou-se a mesma metodologia do
item anterior, mas sendo cada tratamento exposto a diferentes temperaturas: 20, 25, 30 e
35oC.
As placas foram incubadas em B.O.D. a 25oC durante 3 dias. Após
esse período foram contadas as colônias de M. anisopliae e B. bassiana formadas nas placas
(Figura 5).
3.5.4 Virulência à Diatraea saccharalis
Para os experimentos de virulência, foram utilizados 5 tratamentos
com 8 repetições, contendo 10 lagartas, totalizando 80 lagartas por tratamento e 400 lagartas
para o experimento.
A metodologia utilizada foi a mesma do item 3.4.3.
3.6 Análise estatística
Foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado, e
a análise foi realizada através do programa ESTAT – Sistemas de Análises Estatísticas –
desenvolvido na FCAV/ UNESP Câmpus de Jaboticabal, SP. As médias da produtividade de
blastosporos foram submetidas à análise de variância pelo teste F a 5% de probabilidade e as
médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Em algumas análises houve a
necessidade de se fazer a transformação dos dados (√x+0,5).
47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Produção semi-sólida de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
4.1.1 Concentração de conídios
Levando-se em consideração as maiores concentrações de conídios,
foram selecionados os seguintes substratos: arroz parboilizado tipo 1, arroz tipo 1
(testemunha), arroz tipo 2, canjiquinha, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído. Esses
substratos foram selecionados para ambos os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria
bassiana (Tabelas 6, 7 e 8). Entretanto, para B. bassiana, o arroz tipo 1 (testemunha) foi o
substrato mais produtivo, por isso, a partir dele, selecionaram-se os melhores substratos. O
arroz parboilizado tipo 1 não está entre os melhores produtores de conídios, mas como todos
os outros substratos selecionados foram os mesmos para M. anisopliae, procurou-se avaliá-lo
novamente.
Foram selecionados os melhores substratos de cada uma das três
etapas. Alguns substratos como: aveia em flocos, farinha de mandioca crua, farinha de milho
48
amarela e fubá necessitaram, depois da autoclavagem, a sua descompactação. Portanto, eles
exigiram maior mão-de-obra.
Tabela 6. Experimento 1: Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana
(IBCB 66) obtidas em substratos semi-sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e
fotofase de 12 h.).
Concentração (x 108 conídios/mL) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz integral tipo 1 1,65 B 0,80 B
Arroz parboilizado tipo 1 2,40 A 0,71 B
Arroz tipo 1 (Testemunha) 2,10 AB 1,38 A
Arroz tipo 2 2,71 A 1,09 AB
Canjiquinha 2,25 AB 1,34 A
Teste F 7,16* 7,81*
CV (%) 16,20 25,07
Erro padrão da média 0,1469 0,0109 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
49
Tabela 7. Experimento 2: Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana
(IBCB 66) obtidas em substratos semi-sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e
fotofase de 12 h.).
Concentração (x 108 conídios/mL) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz tipo 1 (Testemunha) 1,37 B 2,66 A
Aveia em flocos 1,71 B 0,92 BC
Farelo de trigo 1,47 B 0,35 C
Farinha de mandioca crua 0,38 C 0,92 BC
Farinha de milho amarela 1,94 AB 0,96 B
Fubá 2,57 A 1,18 B
Teste F 20,32* 32,87*
CV (%) 25,03 28,74
Erro padrão da média 0,1607 0,1368 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
50
Tabela 8. Experimento 3: Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana
(IBCB 66) obtidas em substratos semi-sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e
fotofase de 12 h.).
Concentração (x 108 conídios/mL) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz tipo 1 (Testemunha) 1,40 B 2,19 A
Milho em grãos 0,82 C 1,13 C
Soja em grãos 0,80 C 1,14 C
Trigo em grãos 0,92 C 1,25 C
Trigo moído 1,83 A 1,60 B
Turfa 0,79 C 0,80 D
Teste F 79,52* 79,83*
CV (%) 10,72 9,80
Erro padrão da média 0,0478 0,0541 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
Para M. anisopliae o trigo moído e o fubá de milho foram também
superiores ao arroz, e apresentaram resultados equivalentes entre si (2,15, 2,04 e 1,91,
respectivamente), constituindo boas opções para a produção deste fungo (Tabela 9).
Vilas Boas et al. (1996) cita diferença significativa quanto à
concentração de conídios, em relação ao arroz, quando M. anisopliae foi produzido sobre fava
e caupi e obtendo concentração bem superior. Por outro lado, o mesmo autor também cita que
feijão e sorgo apresentaram performance inferior ao arroz.
51
Tabela 9. Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66) obtidas
em substratos semi-sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Concentração ( x 108 conídios/mL) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz parboilizado tipo 1 1,94 AB 1,41 A
Arroz tipo 1 (Testesmunha) 1,91 AB 1,16 AB
Arroz tipo 2 1,94 AB 1,16 AB
Canjiquinha 1,36 B 1,08 B
Farinha de milho amarela 1,86 AB 1,14 AB
Fubá 2,04 A 1,34 AB
Trigo moído 2,15 A 1,30 AB
Teste F 2,99* 3,95*
CV (%) 18,89 12,22
Erro padrão da média 0,1455 0,0613 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
No caso de B. bassiana, segundo Vilas Boas et al. (1996), o arroz
constitui a melhor opção, do ponto de vista de produtividade, comparado à fava, feijão, sorgo
e caupi. Pelos resultados observados na Tabela 9, o arroz parboilizado foi superior apenas à
canjiquinha, tendo a esporulação de 1,41 x 108 conídios/mL.
De acordo com Mendonça & Rocha (1992), o arroz parboilizado foi o
único substrato utilizado, conseguindo-se 1010 conídios/g de arroz com o fungo. Fernandes et
al. (1994) utilizaram combinações de arroz e milho triturados, farelo de arroz, bagacilho de
cana-de-açúcar triturado e comparou-se ao arroz parboilizado, na produção de M. anisopliae e
B. bassiana (Bals.) Vuill. Os autores concluíram que o arroz triturado mais o bagacilho de
cana foi superior aos outros meios utilizados para ambos os patógenos.
Aquino (1974) comprovou a superioridade do meio de arroz em
relação ao de batata-dextrose e o de amido, na frutificação e desenvolvimento do fungo em
52
menor espaço de tempo. Marques e Vilas Boas (1973) haviam verificado o bom crescimento e
esporulação do fungo nesse meio e outros autores, como Moura Costa & Magalhães (1974) e
Villacorta (1977), utilizaram esse meio para o cultivo do fungo com sucesso.
Os resultados demonstraram que, para M. anisopliae o meio de arroz
pode ser substituído pelo fubá e o trigo moído, pois os mesmos superaram o arroz tipo 1 em
6,80% e 12,56%, respectivamente, na produção de conídios. Entretanto, deve-se levar em
consideração a relação custo/ benefício, já que ambos os substratos são mais caros que o arroz
e a produção de conídios/mL não foi tão superior nesses substratos, a ponto de justificar a
adoção de um deles em detrimento do arroz tipo 1. Conclui-se que o arroz ainda seja o
substrato mais econômico e produtivo. O arroz tipo 2 apresentou a mesma concentração de
conídios/mL do arroz tipo 1 e este é 12% mais barato que o arroz tipo 1, sendo uma ótima
opção, em termos econômicos, para a substituição na produção de conídios de M. anisopliae.
Já para B. bassiana o arroz parboilizado tipo 1 foi o meio de cultura mais econômico, mesmo
ele sendo 12% mais caro que o arroz tipo 1. Com a sua maior produção de conídios, ele supera
o arroz tipo 1 na relação custo/ benefício. O arroz tipo 2 é 21,55% mais produtivo que o arroz
tipo 1 e 5,22% mais produtivo que o fubá, entretanto o fubá é 40% mais caro que o arroz tipo
1, não sendo uma boa opção de substituição.
O arroz ainda é um dos substratos mais utilizados, mas alguns estudos
têm sido feitos com o objetivo de avaliar substratos alternativos e mais baratos, como o fubá
de milho, farinha de arroz, soja, farelo de trigo, batata, sorgo, feijão, milho, arroz úmido,
melaço, farinha de aveia, sais minerais, entre outros (CRUZ et al., 1983; NAHAS & ARAI,
1987; ALVARENGA et al., 1988; VERHAAR & HIJWEGEN, 1993; VILAS BOAS et al.,
1996; OLIVEIRA, 2000).
Neves et al. (2001), testaram a produção de B. bassiana em seis
diferentes tipos de arroz (quirera, tipo 2, extra, casca amarela, integral e parboilizado),
utilizando várias quantidades de água e três métodos de preparo, e verificaram que quirera,
integral e parboilizado foram os mais produtivos.
Quando comparamos a produtividade dos meios de cultura (Tabelas 6,
7, 8 e a Tabela 9), observamos menor produtividade nos resultados da Tabela 9 para M.
anisopliae, com exceção do trigo moído e maior produtividade para B. bassiana, com exceção
da canjiquinha. A diferença na produção de conídios no presente trabalho pode estar
53
relacionada, entre outras causas, com a dificuldade de se reproduzir, entre um experimento e
outro, todas as condições disponíveis para o crescimento do fungo, tais como: teor de umidade
do substrato, variação da temperatura da sala de incubação e nível de contaminação. Somando-
se a essa diferença, são levados em conta, também, a técnica de produção, o intervalo da
avaliação, variedades dos substratos, diferentes condições de armazenamento e vigor do
isolado (ALVES, 1998a). Entretanto, estes resultados são importantes para a comparação da
produção dos meios de cultura dentro do mesmo experimento.
4.1.2 Viabilidade de conídios
A escolha do substrato não influenciou na viabilidade de M. anisopliae
ou de B. bassiana, porém, analisando-se viabilidade de M. anisopliae, nos substratos
selecionados, observou-se que os maiores valores ocorreram nos substratos arroz tipo 1
(testemunha), arroz tipo 2, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído (Tabela 10), também
de acordo com os estudos de Vilas Boas et al. (1996).
Entretanto, ressalta-se que os valores encontrados em todos os
tratamentos foram superiores a 90% (Tabela 10), índice considerado ótimo para classificação
do material.
Assim como no trabalho de Vilas Boas et al. (1996), não houve
diferença significativa entre os tratamentos de B. bassiana.
54
Tabela 10. Viabilidade (%) de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66) obtidas em
substratos semi-sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Viabilidade (%) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz parboilizado tipo 1 94,67 C 97,08 A
Arroz tipo 1 (Testemunha) 98,25 AB 95,42 A
Arroz tipo 2 97,33 AB 95,25 A
Canjiquinha 96,00 BC 96,83 A
Farinha de milho amarela 98,83 A 94,58 A
Fubá 97,50 AB 97,25 A
Trigo moído 99,08 A 95,50 A
Teste F 7,52* 2,15ns
CV (%) 1,45 1,82
Erro padrão da média 0,5777 0,7145 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
4.1.2.1 Radiação ultravioleta
Analisando-se os efeitos da radiação ultravioleta sobre os conídios de
M. anisopliae, nos substratos selecionados, observou-se que as maiores viabilidades ocorreram
nos seguintes substratos, de acordo com o tempo de exposição à luz ultravioleta: 0 segundos –
arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído; 25
segundos – arroz parboilizado tipo1, canjiquinha e farinha de milho amarela; 50 segundos –
farinha de milho amarela (Tabela 11).
Por esses dados observou-se que houve diminuição gradativa da
viabilidade de M. anisopliae, à medida que se aumentou o tempo de exposição à radiação
ultravioleta (Tabela 11).
Tabela 11. Viabilidade (%) de M. anisopliae (IBCB 425) obtida em substratos semi-sólidos, com variação de exposição à radiação
ultravioleta (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Viabilidade (%) Tratamentos
0 segundos 25 segundos 50 segundos Teste F CV (%)
Arroz parboilizado tipo 1 94,67 C a1 52,33 AB b 5,17 BC c 206,65* 15,04
Arroz tipo 1 (Testemunha) 98,25 AB a 41,00 B b 4,17 C c 233,26* 15,91
Arroz tipo 2 97,33 AB a 18,50 C b 4,67 C c 1600,97* 7,62
Canjiquinha 96,00 BC a 61,33 A b 1,83 C c 3913,24* 3,51
Farinha de milho amarela 98,83 A a 53,33 AB b 23,67 A c 902,14* 5,27
Fubá 97,50 AB a 34,83 BC b 9,17 B c 84,27* 25,71
Trigo moído 99,08 A a 16,50 C b 2,67 C c 3429,19* 4,18
Teste F 7,52* 15,76* 84,44* - -
CV (%) 1,45 27,12 23,88 - -
Erro padrão da média 0,5777 4,3947 0,9936 - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
55
56
59
Em todos os tempos de exposição ao raio UV o único substrato que
manteve sua viabilidade superior quando comparado aos outros foi a farinha de milho amarela.
A viabilidade em 50 segundos de exposição foi de 23,67 % e a do arroz tipo 1 foi de 4,17 %.
As radiações solares também podem causar perda de viabilidade do fungo, mas a cor amarela
da farinha de milho conferiu uma maior proteção aos conídios sob luz direta. Segundo Braga
(2002a), a maioria desses microorganismos não possui proteção contra os efeitos deletérios da
luz solar. Sendo assim, a farinha de milho amarela pode ser utilizada para a produção de
conídios visando a utilização no campo sob luz direta.
Mais suscetíveis às condições no campo, os entomopatógenos estão
sujeitos a fatores bióticos e abióticos que influenciam na sua sobrevivência, propagação e
infecção do hospedeiro (GOETTEL et al., 2000). Entre os abióticos, a radiação solar UV é a
mais importante (FARGUES et al., 1996; BRAGA et al., 2001b; CAGAN & SVERCEL,
2001), pois pode inativar o conídio, provocar danos letais ao DNA e mutações (NICHOLSON
et al., 2000). Em geral, os efeitos da radiação UV reduzem a eficiência do fungo no campo, ou
seja, quando as radiações não causam efeitos letais, normalmente influenciam o crescimento e
a reprodução (VALLE, 1984; BRAGA et al., 2001a). Alguns autores sugerem selecionar
isolados mais tolerantes à radiação UV-B, pois sabe-se que a suscetibilidade dos fungos à
radiação varia entre diferentes espécies e entre isolados (FARGUES et al., 1996).
Na análise feita com B. bassiana, as viabilidades observadas em
função da radiação ultravioleta foram as seguintes: 0 segundos – não houve diferença
significativa entre os tratamentos; 25 segundos – arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2,
canjiquinha, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído; 50 segundos – canjiquinha e
farinha de milho amarela (Tabela 12).
Os substratos arroz parboilizado tipo 1, canjiquinha, farinha de milho
amarela e trigo moído, apresentaram queda de viabilidade aos 25 segundos, mas quando
expostas à radiação ultravioleta por 50 segundos, as viabilidades permaneceram estáveis
(Tabela 12). Novamente, a farinha de milho amarela se apresentou como um dos melhores
substratos conferindo maior proteção (resistência) ao raio ultravioleta devido a maior
quantidade de melanina.
No caso do arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2 e do fubá, observou-
se queda de viabilidade entre 25 e 50 segundos (Tabela 12).
Tabela 12. Viabilidade (%) de B. bassiana (IBCB 66) obtida em substratos semi-sólidos, com variação de exposição à radiação
ultravioleta (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Viabilidade (%) Tratamentos
0 segundos 25 segundos 50 segundos Teste F CV (%)
Arroz parboilizado tipo 1 97,08 A a1 32,67 BC b 31,67 BC b 712,88* 6,39
Arroz tipo 1 (Testemunha) 95,42 A a 42,00 A b 30,17 C c 653,07* 5,96
Arroz tipo 2 95,25 A a 36,33 ABC b 35,17 C c 241,43* 9,74
Canjiquinha 96,83 A a 42,83 ABC b 37,50 AB b 238,17* 8,82
Farinha de milho amarela 94,58 A a 46,67 AB b 38,33 AB b 136,11* 10,65
Fubá 97,25 A a 50,83 A b 24,83 C c 91,75* 16,28
Trigo moído 95,59 A a 34,67 AB b 34,50 BC b 25,86* 11,10
Teste F 2,15ns 4,90* 6,84* - -
CV (%) 1,82 22,26 14,74 - -
Erro padrão da média 0,7145 3,5443 2,0989 - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
57
58
Os efeitos letais causados por luz UV (253 nm) foram demonstrados
por Corrêa (1983), Frigo (1983) e outros. Esses autores encontraram grande variabilidade
entre isolados e sugerem sua utilização em programas de melhoramento visando obter
linhagens mais resistentes.
4.1.2.2 Temperatura
Analisando-se o efeito das temperaturas sobre os conídios de M.
anisopliae produzidos nos substratos selecionados, observou-se que as maiores viabilidades
ocorreram nos seguintes substratos, de acordo com a temperatura aplicada: 20oC – arroz
parboilizado tipo 1, arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2, farinha de milho amarela, fubá e
trigo moído; 25oC – arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2, farinha de milho amarela, fubá e
trigo moído; 30oC – arroz parboilizado tipo 1, arroz tipo 1 (testemunha), canjiquinha, farinha
de milho amarela, fubá e trigo moído; 35oC – arroz parboilizado tipo 1, arroz tipo 1, arroz tipo
2, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído. (Tabela 13).
No caso de M. anisopliae, o arroz tipo 1 (testemunha), farinha de
milho amarela, fubá e o trigo moído são os mais versáteis, pois apresentaram bons resultados
em toda a faixa de temperatura avaliada. A maior viabilidade de conídios é observada na
temperatura de 25oC em todos os tratamentos.
Entre 30oC e 35oC não houve diferença significativa de viabilidade
entre os tratamentos: arroz parboilizado tipo 1, arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2, farinha
de milho amarela, fubá e trigo moído. A canjiquinha foi o único tratamento a apresentar
diminuição de viabilidade entre 30oC e 35oC (Tabela 13). Os resultados observados na
temperatura de 20oC não têm diferença significativa dos resultados observados na temperatura
de 30oC.
Tabela 13. Viabilidade (%) de M. anisopliae (IBCB 425) obtida em substratos semi-sólidos, com variação de temperatura.
Temperatura Tratamentos
20oC 25oC 30oC 35oC Teste F CV (%)
Arroz parboilizado tipo 1 81,33 AB b1 94,67 C a 81,83 AB b 78,17 AB b 12,47* 6,02
Arroz tipo 1 80,67 AB b 98,25 AB a 83,67 AB b 80,67 A b 59,63* 3,11
Arroz tipo 2 80,00 AB b 97,33 AB a 77,33 B b 75,24 AB b 44,07* 4,13
Canjiquinha 77,67 B b 96,00 BC a 79,00 AB b 71,17 B c 69,38* 3,85
Farinha de milho amarela 86,00 A b 98,83 A a 84,17 A bc 80,67 A c 40,86* 3,47
Fubá 82,67 AB b 97,50 AB a 81,50 AB b 80,17 A b 41,99* 3,58
Trigo moído 82,17 AB b 99,08 A a 84,33 A b 84,33 A b 26,26* 4,26
Teste F 2,80* 7,52* 3,52* 4,61* - -
CV (%) 4,62 1,45 4,30 5,80 - -
Erro padrão da média 1,5371 0,5777 1,4329 1,8753 - - Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
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60
Estudando o efeito da temperatura e regime luminoso sobre o M.
anisopliae, Bastos & Matta (1976) concluíram que a melhor temperatura para a esporulação
foi de 25oC e o regime luminoso mais adequado foi o de luz alternada dia e noite. Os autores
trabalharam com temperaturas variando de 5oC e os fotoperíodos luz contínua, escuro
contínuo e luz alternada (dia e noite). Os resultados obtidos por este trabalho estão de acordo
com a conclusão de Bastos & Matta (1976), pois foi mostrado que os melhores resultados
foram obtidos à temperatura de 25oC (Tabela 13). Alguns autores citam a faixa favorável de
24 a 30oC para a esporulação de M. anisopliae (ROBERTS & CAMPBELL, 1977), porém,
raramente fazem referências às linhagens de fungo com os quais trabalharam.
Villacorta (1978) trabalhando com diferentes isolados do M.
anisopliae, e Santos (1978) estudando a influência de alguns fatores no crescimento,
germinação e produção de conídios de M. anisopliae, verificaram que a 37oC houve inibição
da germinação de conídios tornando-os inviáveis quando os mesmos eram submetidos por
mais de 96 horas a essa temperatura. A temperatura máxima a que os fungos foram expostos
no presente trabalho, foi de 35oC. Nessa temperatura, a viabilidade dos conídios foi
significativamente mais baixa do que a obtida a 25oC, considerada ótima, comprovando o
declínio de viabilidade a partir dos 30oC.
A mesma análise executada sobre os dados obtidos com B. bassiana,
mostrou que as maiores viabilidades ocorreram nos seguintes substratos, de acordo com a
temperatura aplicada: 20oC – canjiquinha, farinha de milho amarela e fubá; 25oC – não foi
observada diferença significativa entre os tratamentos; 30oC – arroz tipo 1 (testemunha), arroz
tipo 2, canjiquinha, farinha de milho amarela, fubá e trigo moído; 35oC – arroz parboilizado
tipo 1, arroz tipo 1 (testemunha), arroz tipo 2, canjiquinha e trigo moído (Tabela 14).
Na temperatura de 30oC, os substratos arroz tipo 1 (testemunha) e
arroz tipo 2, apresentaram aumento de viabilidade, comparando-se com a temperatura de
20oC. Os demais substratos não apresentaram diferença significativa comparando-se a
viabilidade obtida com estes, aos 20 e 30oC (Tabela 14).
Pode-se concluir que os conídios de B. bassiana são bastante sensíveis
à temperaturas acima de 30oC ocorrendo menor taxa de viabilidade a partir dessa temperatura.
Tabela 14. Viabilidade (%) de B. bassiana (IBCB 66) obtida em substratos semi-sólidos, com variação de temperatura.
Temperatura Tratamento
20oC 25oC 30oC 35oC Teste F CV (%)
Arroz parboilizado tipo 1 72,17 CD b1 97,08 A a 72,33 B b 25,67 AB c 149,45* 8,94
Arroz tipo 1 (Testemunha) 75,00 BCD c 95,42 A a 85,50 A b 20,67 AB d 647,25* 4,65
Arroz tipo 2 67,50 D c 95,25 A a 79,17 AB b 24,67 AB d 773,75* 3,99
Canjiquinha 85,67 A b 96,83 A a 82,00 AB b 29,67 A c 241,17* 6,42
Farinha de milho amarela 79,50 ABC b 94,58 A a 80,33 AB b 16,00 B c 231,07* 8,36
Fubá 82,00 AB b 97,25 A a 81,33 AB b 19,00 B c 579,23* 5,06
Trigo moído 72,50 BCD b 95,50 A a 77,67 AB b 20,50 AB c 80,08* 13,26
Teste F 8,14* 2,15ns 2,01ns 4,22* - -
CV (%) 7,13 1,82 8,87 24,65 - -
Erro padrão da média 2,2218 0,7145 2,8881 2,2455 - - Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
61
62
Segundo Walstad et al. (1970), os conídios de B. bassiana apresentam
uma faixa suportável de temperatura, para germinação, entre 15oC e 35 oC; e para esporulação,
entre 10oC e 35oC. No presente trabalho, não observaram-se efeitos das temperaturas entre
20oC e 30oC, sendo que os resultados obtidos à temperatura de 35oC foram considerados
baixos, com viabilidade abaixo de 30%.
Os fungos mitospóricos M. anisopliae, B. bassiana e N. rileyi
apresentam faixas de temperatura favoráveis para o desenvolvimento de 24 a 30oC, 22 a 26oC
e 20 a 30oC, respectivamente (ALVES, 1986a). Para M. anisopliae a temperatura ideal para
germinação do esporo encontra-se na faixa de 25 a 30oC. Além disso, o limite de 24 a 30oC foi
estabelecido por diversos autores como sendo a faixa ideal para o crescimento vegetativo e
esporulação desse fungo (WALSTAD et al., 1970).
4.1.3 Virulência à Diatraea saccharalis
Pela mortalidade confirmada (que representa o número de insetos nos
quais se observou a extrusão e reprodução do patógeno, em lagartas infectadas por M.
anisopliae), utilizando suspensões dos substratos selecionados na concentração de 1x107
conídios/mL, observou-se que a maior virulência ocorreu no arroz parboilizado, arroz tipo 1
(testemunha), arroz tipo 2, canjiquinha, fubá e trigo moído, sendo que mortalidade confirmada
foi igual ou superior a 85,00%. A farinha de milho amarela também apresentou 75,00% de
mortalidade confirmada (Tabela 15).
No caso de B. bassiana não houve diferença significativa entre os
tratamentos, sendo que em todos os tratamentos, apresentaram maior virulência do que M.
anisopliae, variando entre 93,75% a 100,00% (trigo moído) de mortalidade confirmada.
Esta capacidade do fungo produzir propágulos do patógeno é um
aspecto importante e que pode levar ao desencadeamento de epizootias em campo, uma vez
que, em condições ambientais favoráveis, mantém ou aumenta o potencial de inóculo em uma
determinada área (LECUONA & ALVES, 1988).
63
Macedo et al. (1990) observou que B. bassiana provocou, com a
mesma dosagem, mortalidade entre 38,00 e 80,00% quando inoculado em D. saccharalis,
enquanto que M. anisopliae provocou mortalidade entre 18,00 e 50,00%, quando inoculado na
mesma praga-alvo. No presente trabalho a mortalidade confirmada para B. bassiana foi entre
90,00 e 100,00% e M. anisopliae apresentou mortalidade entre 75,00 e 95,00%.
Tabela 15. Mortalidade confirmada (%) em lagartas de 3o ínstar de D. saccharalis em função
das diferentes suspensões de M. anisopliae e B. bassiana, obtidas em meios de cultura semi-
sólidos (Temperatura de 25±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Mortalidade Confirmada (%) Tratamentos
M. anisopliae B. bassiana
Arroz parboilizado tipo 1 95,00 A 98,75 A
Arroz tipo 1 (Testemunha) 91,25 AB 98,75 A
Arroz tipo 2 85,00 AB 98,75 A
Canjiquinha 87,50 AB 98,75 A
Farinha de milho amarela 75,00 B 93,75 A
Fubá 90,00 AB 93,75 A
Trigo moído 85,00 AB 100,00 A
Testemunha (água destilada) 3,75 C 2,50 B
Teste F 59,10* 118,83*
CV (%) 14,42 10,20
Erro padrão da média 0,3903 0,3089 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
64
4.2 Produção em meio líquido de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana
4.2.1 Concentração de blastosporos
Para a seleção dos meios fez-se a somatória da produção de
blastosporos (x 108/mL) nos 3 dias de avaliação. Sendo assim, foram escolhidos os 2 meios de
cultura mais produtivos de cada uma das etapas (Tabelas 16, 17, 18 e 19).
Tabela 16. Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) obtida em meio de cultura
líquido com diferentes teores de N e C, 4, 6 e 8 dias após a inoculação (Temperatura de
26±1oC e fotofase de 12 h.).
Concentração média (x 108 blastosporos/mL) Tratamentos (g)
4o dia 6o dia 8o dia ∑ (3 dias) Teste F CV (%)
1 16,00 C + 6,30 N 1,16 A a1 1,18 A a 1,31 A a 3,65 2,40ns 13,42
2 16,00 C + 7,00 N 1,21 A b 1,22 A b 1,48 A a 3,91 9,45* 11,75
3 16,00 C + 7,69 N 1,11 A b 1,19 A ab 1,29 A a 3,59 6,54* 10,21
4 20,00 C + 6,30 N 1,19 A a 1,15 A ab 1,01 B b 3,35 5,65* 8,65
5 20,00 C + 7,00 N 1,21 A a 1,16 A a 1,05 B a 3,42 1,90ns 22,80
6 20,00 C + 7,69 N 1,22 A a 1,13 A ab 1,00 B b 3,35 7,50* 8,67
Teste F 0,83ns 0,96ns 14,49* - - -
CV (%) 10,04 18,27 10,70 - - -
Erro padrão da média 0,0485 0,0886 0,0520 - - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
65
Tabela 17. Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) obtida em meio de cultura
líquido com diferentes teores de N e C, 4, 6 e 8 dias após a inoculação (Temperatura de
26±1oC e fotofase de 12 h.).
Concentração média (x 108 blastosporos/mL) Tratamentos (g)
4o dia 6o dia 8o dia ∑ (3 dias) Teste F CV (%)
7 14,40 C + 7,00 N 1,58 A a1 1,55 A a 1,49 A a 4,62 0,36ns 12,50
8 16,00 C + 7,00 N 1,30 A a 1,37 A a 1,51 A a 4,18 1,57ns 15,13
9 17,60 C + 7,00 N 1,44 A a 1,51 A a 1,55 A a 4,50 0,20ns 20,47
10 18,00 C + 7,00 N 1,31 A b 1,45 A ab 1,55 A a 4,31 4,03* 10,18
11 20,00 C + 7,00 N 1,42 A a 1,44 A a 1,54 A a 4,40 1,03ns 10,11
12 22,00 C + 7,00 N 1,44 A a 1,41 A a 1,38 A a 4,23 0,12ns 14,37
Teste F 0,74ns 0,89ns 1,36ns - - -
CV (%) 18,86 9,96 12,86 - - -
Erro padrão da média 0,1112 0,0611 0,0752 - - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
66
Tabela 18. Concentração média de B. bassiana (IBCB 66) obtida em meio de cultura líquido
com diferentes teores de N e C, 4, 6 e 8 dias após a inoculação (Temperatura de 26±1oC e
fotofase de 12 h.).
Concentração média (x 108 blastosporos/mL) Tratamentos (g)
4o dia 6o dia 8o dia ∑ (3 dias) Teste F CV (%)
1 16,00 C + 6,30 N 1,44 A a1 1,00 B b 0,87 C b 3,31 25,47* 12,11
2 16,00 C + 7,00 N 1,29 A a 0,98 B b 0,81 C c 3,08 26,21* 11,74
3 16,00 C + 7,69 N 1,24 A a 1,04 B b 0,89 C c 3,17 15,46* 11,15
4 20,00 C + 6,30 N 1,36 A a 1,43 A a 1,74 A a 4,53 1,56ns 26,24
5 20,00 C + 7,00 N 1,13 A b 1,16 BC b 1,52 A a 3,81 8,99* 13,31
6 20,00 C + 7,69 N 1,20 A b 1,48 A a 1,48 AB a 4,16 6,46* 9,92
Teste F 1,99ns 20,30* 12,86* - - -
CV (%) 14,58 11,30 22,06 - - -
Erro padrão da média 0,0763 0,0573 0,1057 - - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
67
Tabela 19. Concentração média de B. bassiana (IBCB 66) obtida em meio de cultura líquido
com diferentes teores de N e C, 4, 6 e 8 dias após a inoculação (Temperatura de 26±1oC e
fotofase de 12 h.).
Concentração média (x 108 blastosporos/mL) Tratamentos (g)
4o dia 6o dia 8o dia ∑ (3 dias) Teste F CV (%)
7 14,40 C + 7,00 N 1,18 A a1 1,19 A a 1,21 AB a 3,58 0,22ns 12,67
8 16,00 C + 7,00 N 1,23 A a 1,29 A a 1,16 B a 3,68 0,22ns 13,51
9 17,60 C + 7,00 N 1,17 A a 1,22 A a 1,22 AB a 3,61 0,19ns 12,15
10 18,00 C + 7,00 N 1,21 A a 1,24 A a 1,25 AB a 3,70 0,48ns 7,64
11 20,00 C + 7,00 N 1,18 A b 1,30 A ab 1,46 A a 3,94 9,67* 8,56
12 22,00 C + 7,00 N 1,12 A b 1,13 A a 1,13 B b 3,38 11,82* 7,82
Teste F 0,91ns 2,08ns 3,30* - - -
CV (%) 9,08 10,32 13,10 - - -
Erro padrão da média 0,0440 0,0531 0,0657 - - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
Foram selecionados os melhores meios de cada uma das duas etapas
para M. anisopliae e Beauveria bassiana (Tabela 20). Para M. anisopliae os melhores meios
de cultura foram aqueles que apresentaram D-glicose anidra (fonte de C) em sua composição e
para B. bassiana os tratamentos que continham sacarose (fonte de C).
Verificou-se, que no 4o, 6o e 8o dias de avaliação da concentração de
blastosporos de M. anisopliae, não houve diferença significativa entre os dois tratamentos e
entre os dias de avaliação (Tabela 20). Nota-se que ambos os tratamentos possuem 10% a mais
e 10% a menos de D-glicose anidra e a mesma quantidade de levedura de cerveja.
Tabela 20. Concentração média de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66) obtidas em meios de cultura líquidos com
diferentes teores de N e C, 4, 6 e 8 dias após a inoculação (Temperatura de 26±1oC e fotofase de 12 h.).
Concetração média (x 108 blastosporos/mL)
M. anispopliae B. bassiana Tratamentos (g)
4o dia 6o dia 8o dia Teste F CV (%) 4o dia 6o dia 8o dia Teste F CV (%)
2 16,00 C + 7,00 N 1,45 A a1 1,47 A a 1,50 A a 0,67ns 10,31 - - - - -
7 14,40 C + 7,00 N 1,54 A a 1,43 A a 1,38 A a 1,31ns 12,88 - - - - -
4 20,00 C + 6,30 N - - - - - 1,34 B a 1,57 A a 1,59 A a 3,57ns 12,08
11 20,00 C + 7,00 N - - - - - 1,56 A a 1,59 A a 1,60 A a 0,54ns 9,97
Teste F 0,72ns 0,30ns 0,11ns - - 9,09* 0,04ns 0,62ns - -
CV (%) 10,25 14,32 9,34 - - 8,98 10,62 12,94 - -
Erro padrão da média 0,0631 0,0882 0,0575 - - 0,0566 0,0670 0,0816 - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
68
69
Em relação à produtividade de B. bassiana, o tratamento 11 (20,00 g C
+ 7,00 g N) foi o que apresentou maior quantidade de blastosporos na avaliação do 4o dia. Não
houve diferença significativa entre as avaliações do 6o e 8o dias e entre os dias de avaliação
(Tabela 20). Assim sendo, observou-se que produtividade ficou distribuída ao longo da
análise, exceto para o 4o dia, que destacou-se dos demais.
Nota-se que ambos os tratamentos selecionados para B. bassiana
apresentam a mesma quantidade de sacarose e 10% a mais e 10% a menos de levedura de
cerveja.
Sano (2005) comenta que os meios de cultura líquidos com baixas
quantidades de extrato de levedura apresentam menor custo de produção, pois o nitrogênio é
mais caro que o carbono. O mesmo autor sugere que o custo dos componentes dos meios de
cultura poderia ser diminuído com pesquisas para se determinar produtos mais baratos que
possam substituir a D-glicose anidra e extrato de levedura, sem diminuir a concentração.
Tendo-se em vista o fato de que os meios líquidos selecionados para
M. anisopliae e B. bassiana apresentam em sua composição maior quantidade (em gramas) de
nitrogênio, o presente trabalho utilizou levedura de cerveja como fonte de N, sendo que Sano
(2005) utilizou extrato de levedura. Do ponto de vista econômico, o primeiro é mais vantajoso
que o último, apresentando-se como alternativa viável de fonte de nitrogênio.
Também observou-se que os melhores meios para a produção de
blastosporos são constituídos por menor concentração de nitrogênio e maior concentração de
carbono. Esse fato também foi observado por Oliveira (2000) e Sano (2005), que
acrescentaram diferentes concentrações de extrato de levedura aos meios líquidos para
produção de S. insectorum, e M. anisopliae, respectivamente, e obtiveram as melhores
produtividades com as menores concentrações de nitrogênio.
Apesar de existirem algumas dificuldades práticas para a produção de
fungos em meios líquidos, esse método tem grandes vantagens no que se refere à facilidade de
aplicação em condições de campo, pois o produto já se encontra pronto para ser colocado no
pulverizador a ser utilizado, evitando-se com isso os gastos com mão-de-obra para a lavagem
do material como é feito quando produzido em meio sólido de arroz. Porém, o fungo
produzido nos substratos sólidos mostrou-se mais virulentos (acima de 70,00%) quando
comparados com os meios líquidos (abaixo de 30,00%).
70
4.2.2 Contagem de colônias
4.2.2.1 Radiação ultravioleta
Observou-se que não houve diferença significativa entre os
tratamentos para M. anisopliae e entre os tratamentos de B. bassiana (Tabela 21). Porém,
observou-se que quanto maior o tempo de exposição à radiação UV, menor o número de
colônias presentes, sendo que após 50 segundos de exposição, o número de colônias foi muito
baixa.
Esses resultados concordam com as observações presentes em vários
trabalhos relacionados a influência da radiação UV sobre esporulação (LEACH, 1965),
germinação (ZIMMERMAN, 1982), viabilidade (CORRÊA, 1983) e inativação de
entomopatógenos (IGNOFFO & BATZER, 1971; BROOME et al., 1974; JAQUES, 1985;
GRIEGO et al., 1985; ALI & SIKOROWSKI, 1986).
Tabela 21. Números de colônias obtidas após incubação de blastosporos de M. anisopliae (IBCB 425) e B. bassiana (IBCB 66)
após 0, 25 e 50 segundos sob radiação ultravioleta. Temperatura de 25±1oC e fotofase de 12 h.
Número de colônias (0,1 mL/ placa de Petri)
M. anispopliae B. bassiana Tratamentos (g)
0s 25s 50s Teste F CV (%) 0s 25s 50s Teste F CV (%)
2 16,00 C + 7,00 N 11,13 A a1 6,27 A b 1,11 A c 358,30* 10,49 - - - - -
7 14,40 C + 7,00 N 10,64 A a 6,39 A b 1,31 A c 151,74* 15,18 - - - - -
4 20,00 C + 6,30 N - - - - - 10,55 A a 5,36 A b 1,95 A c 295,54* 10,36
11 20,00 C +7,00 N - - - - - 10,89 A a 6,13 A b 1,83 A c 235,77* 11,51
Teste F 1,14ns 0,04ns 0,83ns - - 0,47ns 4,36ns 0,20ns - -
CV (%) 7,33 17,06 29,51 - - 8,02 11,04 24,48 - -
Erro padrão da média 0,3259 0,4410 0,1505 - - 0,3510 0,2591 0,1888 - -
Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
71
72
4.2.2.2 Temperatura
Não houve diferença significativa entre os tratamentos para M.
anisopliae, indicando que, entre os meios testados, não há nenhum que apresente melhor
desempenho em função da temperatura. (Tabela 22). Conclui-se que não há efeito dos meios
de cultura a temperaturas extremas.
Segundo (ALVES, 1986a), o M. anisopliae e B. bassiana, apresentam
faixas de temperaturas favoráveis para o desenvolvimento de 24 a 30oC e 22 a 26oC,
respectivamente, enquanto que Walstad et al (1970) estabeleceu que o limite de 24 a 30oC é o
melhor para germinação do esporo do M. anisopliae. Bastos e Matta (1976) concluíram que a
melhor temperatura de esporulção de M. anisopliae foi de 25oC.
As Tabelas 22 e 23 sumarizam os números de colônias obtidas após
incubação a 20, 25, 30 e 35oC. Pode-se verificar que a 25 e 30oC o fungo germinou muito
bem, obtendo-se o número esperado de colônias. Entretanto, à temperatura de 20oC o
crescimento das colônias foi sensivelmente menor que o crescimento observado à 25 e 30oC.
À temperatura de 35oC o crescimento foi praticamente nulo.
Resultados semelhantes também foram observados por Santos (1978),
onde o número de colônias obtidas após incubação de conídios de M. anisopliae à 28oC foi de
98 colônias. O mesmo autor enfatiza que a temperatura de 37oC inibe a germinação dos
conídios, não tendo sido verificado crescimento algum nas placas mantidas a essa temperatura.
Entre os tratamentos de B. bassiana, o tratamento 20,00 g C + 6,30 g N
apresentou diferença significativa em relação ao tratamento 20,00 g C + 7,00 g N,
comparando-se o número de colônias a 35oC. Porém, essa variação não se mostrou consistente
ao longo das temperaturas, indicando que se trata apenas de uma variação ocasional.
Para M. anisopliae, a melhor faixa para crescimento de colônias foi
entre 25oC e 30oC, enquanto que para B. bassiana, a temperatura ótima foi de 25oC.
Tabela 22. Número de colônias de M. anisopliae (IBCB 425) obtidas em meios de cultura líquidos, com variação de temperaturas.
Temperatura Tratamentos (g)
20oC 25oC 30oC 35oC Teste F CV (%)
2 16,00 C + 7,00 N 8,87 A b1 11,13 A a 10,19 A a 0,88 A c 237,87* 9,58
7 14,40 C + 7,00 N 8,57 A b 10,64 A a 10,08 A a 0,79 A c 367,82* 7,76
Teste F 0,67ns 1,14ns 0,05ns 0,38ns - -
CV (%) 7,26 7,33 8,21 28,80 - -
Erro padrão da média 0,2584 0,3259 0,3397 0,0984 - - Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
73
Tabela 23. Número de colônias de B. bassiana (IBCB 66) obtidas em meios de cultura líquidos, com variação de temperaturas.
Temperatura Tratamentos (g)
20oC 25oC 30oC 35oC Teste F CV (%)
4 20,00 C + 6,30 N 8,11 A b1 10,55 A a 8,90 A b 0,97 A c 245,26* 9,53
11 20,00 C + 7,00 N 7,93 A c 10,89 A a 9,69 A b 0,71 B d 250,16* 9,67
Teste F 0,14ns 0,47ns 4,09ns 5,00* - -
CV (%) 10,42 8,02 7,23 23,97 - -
Erro padrão da média 0,3413 0,3510 0,2741 0,4851 - - Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5. 1 Letras maiúsculas para comparação entre médias na coluna e minúsculas para comparação na linha. * significativo a 1% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 1% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
74
75
4.2.3 Virulência à Diatraea saccharalis
Analisando-se a mortalidade confirmada de lagartas infectadas por M.
anisopliae, utilizando-se suspensões dos meios selecionados na concentração de 1x107
blastosporos/mL, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos
(Tabela 24).
No caso de B. bassiana, também não houve diferença significativa
entre os tratamentos (Tabela 24).
Segundo Sano (2005), quanto à patogenicidade, os blastosporos foram
tão eficientes quanto os conídios, quando inoculados em M. fimbriolata. Porém, os resultados
do presente trabalho mostram que, para D. saccharalis, os blastosporos apresentaram
virulência entre 26,00 e 29,00%, tanto para M. anisopliae quanto para B. bassiana em todos os
meios avaliados, enquanto que os conídios apresentaram virulência superior a 90,00% em
todos os substratos testados, tanto para M. anisopliae quanto para B. bassiana. Os blastosporos
possuem baixa resistência no ambiente porque a parede celular possui a mesma constituição
da parede da hifa, e são produzidos submersos no meio de cultura o que facilita o processo de
produção, antecipa o tempo de colheita, além de permitir um aumento na quantidade de
unidades infectivas produzidas por volume de meio. Assim, a maior produção desse propágulo
pode compensar a sua menor patogenicidade.
76
Tabela 24. Mortalidade confirmada (%) em lagartas de 3o ínstar de D. saccharalis em função
das diferentes suspensões de M. anisopliae e B. bassiana, obtidas em meios de cultura líquidos
(blastosporos), com diferentes teores de N e C, 8 dias após a inoculação (Temperatura de
26±1oC, UR de 70±10% e fotofase de 12 h.).
Mortalidade Confirmada (%) Tratamentos (g)
M. anisopliae B. bassiana
2 16,00 C + 7,00 N 26,82 A -
7 14,40 C + 7,00 N 26,17 A -
4 20,00 C + 6,30 N - 29,58 A
11 20,00 C + 7,00 N - 28,32 A
Testemunha (água destilada) 7,72 B 9,17 B
Teste F 103,59* 70,27*
CV (%) 14,89 17,26
Erro padrão da média 0,1066 0,1364 Médias seguidas de mesmas letras não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Dados transformados por √x + 0,5 * significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. ns não significativo a 5% de probabilidade pelo Teste F. CV = Coeficiente de variação.
77
5 CONCLUSÕES
a) O arroz tipo 2 é produtivo e econômico para produção de Metarhizium anisopliae;
b) O arroz parboilizado tipo 1 foi o meio de cultura mais produtivo e econômico para
Beauveria bassina;
c) A farinha de milho amarela conferiu uma maior proteção aos conídios de M.anisopliae e B.
bassiana;
d) Os melhores meios para a produção de blastosporos são constituídos por menor
concentração de nitrogênio e maior concentração de carbono;
e) Para M. anisopliae os melhores meios de cultura foram aqueles que apresentaram D-glicose
anidra (fonte de C) em sua composição e para B.bassiana os tratamentos que continham
sacarose (fonte de C);
f) M. anisopliae e B. bassiana são patogênicos e virulentos para lagartas de 3o ínstar de
Diatraea saccharalis, quando aplicado como suspensão aquosa de conídios e blastosporos
independente do meio de cultura.
78
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