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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CONSERVAÇÃO E
MANEJO DE RECURSOS NATURAIS – NÍVEL MESTRADO
Thaís Maylin Sobjak
ATIVIDADE DO SISTEMA ANTIOXIDANTE E EFEITOS NEUROTÓXICOS
EM LARVAS DE Rhamdia quelen EM EXPOSIÇÃO AGUDA AO GLIFOSATO
CASCAVEL
2016
THAÍS MAYLIN SOBJAK
ATIVIDADE DO SISTEMA ANTIOXIDANTE E EFEITOS NEUROTÓXICOS
EM LARVAS DE Rhamdia quelen EM EXPOSIÇÃO AGUDA AO GLIFOSATO
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
Graduação em Conservação e Manejo de
Recursos Naturais da Universidade Estadual do
Oeste do Paraná.
Orientadora: Ana Tereza Bittencourt Guimarães
Coorientadora: Silvia Romão
CASCAVEL
2016
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) S659a
Sobjak, Thaís Maylin
Atividade do sistema antioxidante e efeitos neurotóxicos em larvas de Rhamdia quelen em exposição aguda ao glifosato ./Thaís Maylin Sobjak.
Cascavel, 2016. 60 f.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Tereza Bittencourt Guimarães Coorientadora: Profª Drª. Sílvia Romão Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus de Cascavel, 2016 Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Conservação e Manejo de Recursos Naturais 1. Herbicida. 2. Organofosforado. 3. Jundiá. 4. Sazonalidade. 5. Larvicultura. I. Guimarães, Ana Tereza Bittencourt. II. Romão, Sílvia. III. Universidade Estadual do Oeste do Paraná. IV. Título. CDD 20.ed. 597
632.954 CIP-NBR 12899
Ficha catalográfica elaborada por Helena Soterio Bejio – CRB 9ª/965
Agradecimentos
Todos que estão no meio acadêmico sabem que a conclusão de um curso, um mestrado
ou um doutorado é considerada mais uma fase que se completa, mais uma etapa que
concluímos, mais um degrau que subimos. Essas etapas nos transformam de diversas
formas, nos amadurecendo, nos fazendo descobrir e entender coisas novas, mas nada
disso é possível sem a contribuição de pessoas. Em algumas poucas palavras quero
expressas meus agradecimentos a todos que participaram desta minha etapa “mestrado”.
Agradeço ao Único que foi capaz de me sustentar em meio aos desesperos, me lembrando
que só Ele pode cuidar de mim de maneira assombrosamente maravilhosa, ao Único que
me capacitou a completar mais esta etapa me mostrando quão admiráveis são todos os
Seus feitos. Ao Deus desconhecido no Aerópago, mas revelado numa estrabaria.
Agradeço a minha orientadora, Ana Tereza, que me ensinou não apenas o que eu
precisava saber para concluir esta fase, mas também me aceitou com as minhas
diferenças, me levou a superar minhas dificuldades e limitações sem humilhações e
inúteis frustrações, me ensinou a refletir sobre as diversas situações e respeitar os outros
como seres humanos.
A mesma gratidão eu sinto pela minha Coorientadora Silvia, sempre disposta a nos
ensinar, independente do horário ou do desespero que eu demonstrasse. Obrigada pela
paciência e pelo esforço empregado no meu desenvolvimento.
À CAPES pela bolsa de estudos fornecida para realização deste trabalho.
Agradeço também a minha família por todo amparo e base sólida que me deram até aqui.
Aos meus pais por todo apoio e sustento, em todas as formas. Ao meu irmão por todas as
formatações e até pelas madrugadas me ajudando com os artigos.
Sou grata também a todos meus tios e primos que se preocuparam comigo e nos ajudaram
nesta caminhada.
Aos amigos, que me ajudaram de alguma forma. Agradeço aqueles que me ouviram
pacientemente e me mostraram um outro ângulo daquela situação. Aqueles que me
distraíram nos momentos de tensão. Aqueles que me acolheram em suas casas. Aqueles
que me ouviram chorar, enxugaram minhas lágrimas e contaram uma piada para que eu
pudesse pensar em outra coisa. Aqueles que releram meus trabalhos, viram minhas
apresentações, me criticaram e ajudaram a trabalhar a crescer. Aqueles que se tornaram
como irmãos.
Vocês todos fizeram parte desta caminhada, Marília, Giuliana, Eliseu, Linda, Queli,
Jardel, Andrey, Suellen, Rogério da Silva, Josivange, Dona Geni, Rogério de Oliveira,
Idiani, Érika, Marisa e Carlos, Mafe (Maria Fernanda), Virgílio, Matheus, Rennan.
Agradeço também ao pessoal do laboratório de Patologia da UFFS de Laranjeiras do Sul-
PR, por todo apoio, pelas horas de trabalho, pelo espaço concedido, especialmente a
professora Luiza, por todo conhecimento e tempo ajudando nas análises, ao Cristian, que
não mediu esforços para realizar o experimento e ao Lucas pelas análises bioquímicas.
Ao pessoal da bioquímica da Unioeste que me ajudou com todas as análises,
especialmente ao Giovanne, a Letícia e a Carla.
Ao laboratório de Biologia Celular da Unioeste pelo espaço físico e todos os
equipamentos.
Aos funcionários da Unioeste- Cascavel.
RESUMO
O avanço das técnicas agrícolas possibilitou melhoria e maior produtividade de alimentos,
mas também fez com que o uso exacerbado e inadequado de agroquímicos promovesse
efeitos agudos a espécies não-alvo. Os agrotóxicos são os agentes de maior potencial na
degradação dos ambientes aquáticos, já que, por meio do deflúvio superficial de áreas
agrícolas, escoam substâncias orgânicas ou inorgânicas, naturais ou sintéticas. Dentre os
agrotóxicos mais utilizados atualmente pode-se citar o herbicida não-seletivo glifosato e
compostos organofosforados. Para se compreender e prevenir os danos causados ao
ambiente, pesquisadores têm utilizado múltiplos biomarcadores como uma ferramenta
eficaz para avaliação de contaminação ambiental. O presente estudo foi dividido em dois
estudos: um experimento manipulativo e outro natural. O primeiro estudo teve por
objetivo investigar os efeitos neurotóxicos e sobre o sistema em larvas de Rhamdia quelen
expostas a concentração subletal de glifosato. Neste estudo foi possível concluir que,
apesar dos animais expostos ao glifosato terem maior porcentagem de sobrevivência,
ocorreu uma indução precoce da atividade colinesterásica e do sistema antioxidante,
seguido da dificuldade de manutenção das atividades do sistema antioxidante nos horários
posteriores, resultando em uma maior lesão ao nível celular. O estresse que os animais
sofreram ao serem expostos ao herbicida glifosato provoca uma alteração no seu
metabolismo sendo característica de resistência elástica. No segundo estudo, o objetivo
proposto foi avaliar alterações neurotóxicas e do sistema antioxidante em R. branneri
presentes em riachos com diferentes níveis de contaminação ambiental nos períodos de
outono e inverno. Nesta análise, a resposta dos biomarcadores está relacionada à variação
temporal, e possivelmente à exposição desses animais à agrotóxicos. Com os resultados
obtidos observou-se que, a biota local respondeu de forma diferente em cada estação,
sinalizando que a fauna está em contato com agentes oxidantes e colinesterásicos no
período de outono, quando há maior frequência de plantio e uso de agrotóxicos
Palavras-chave: herbicida; organofosforado; jundiá; sazonalidade; larvicultura
ANTIOXIDANT SYSTEM ACTIVITY and NEUROTOXIC EFFECTS in
LARVAE of Rhamdia quelen in ACUTE EXPOSURE to GLYPHOSATE
ABSTRACT
The advancement of agricultural techniques has enabled improvement and greater
productivity, but also made the use of agrochemicals and inadequate in promoting
exaggerated acute effects to non-target species. The pesticides are agents of greatest
potential in degradation of aquatic environments, since, through the flood of agricultural
areas, flowing organic or inorganic substances, natural or synthetic. Among the pesticides
most used currently, include the non-selective herbicide glyphosate and
organophosphorus compounds. To understand and prevent the damage caused to the
environment, researchers have used multiple biomarkers as an effective tool for
evaluation of environmental contamination. This study was divided into two studies: a
manipulative experiment and other natural. The first study aimed to investigate the
neurotoxic effects and about the system in larvae of Rhamdia quelen exposed to sublethal
concentration of glyphosate. In this study it was possible to conclude that, in spite of the
animals exposed to glyphosate having highest percentage of survival, there was an early
induction of cholinesterase activity and antioxidant system, followed by the difficulty of
maintaining the activities of antioxidant system in later times, resulting in a greater injury
at the cellular level. The stress that animals suffer when they are exposed to the herbicide
glyphosate causes a change in your metabolism being characteristic of elastic resistance.
In the second study, the objective was to evaluate changes in antioxidant system and
neurotoxic R. branneri present in streams with different levels of environmental
contamination during autumn and winter. In this analysis, the response of biomarkers is
related to the temporal variation, and possibly the exposure of these animals to pesticides.
With the results obtained showed that the local biota responded differently in each season,
signaling that the fauna is in contact with oxidizing agents and cholinesterasic in the
period of autumn, when there is increased frequency of planting and use of pesticides.
Keywords: herbicide; organophosphate; silver catfish; seasonality; larviculture
LISTA DE TABELAS
Artigo I
Tabela 1- Atividade de biomarcadores em ovos/larvas de Rhamdia quelen não exposto
(Controle) e expostos durante 72 horas a 6,5 mg/L de glifosato. Os resultados estão
expressos em média + EPM para cada grupo em cada tempo de exposição..................23
Artigo II
Tabela 1- Análise de parâmetros físicos e químicos das águas dos riachos obtidos nas
estações de Outono e Inverno..........................................................................................47
Tabela 2- Análise de parâmetros físicos e químicos das águas dos riachos obtidos no
Inverno.............................................................................................................................47
Tabela 3- Análise da concentração de pesticidas nas amostras de sedimento dos
riachos..............................................................................................................................48
Tabela 4 - Médias e Desvios-Padrão das variáveis biométricas de R. branneri.............48
Tabela 5- Autovalores e variâncias acumuladas para cada eixo, e respectivas cargas
fatoriais............................................................................................................................51
LISTA DE FIGURAS
Artigo I
Figura 1. Taxa de sobrevivência (%) de ovos/larvas de Rhamdia quelen nos grupos
Controle e Tratado com 6,5 mg/L de glifosato.. ............................................................. 23
Figura 2. Atividade de biomarcadores em ovos/larvas de Rhamdia quelen expostos a 6,5
mg/L de glifosato (Tratamento) e animais acondicionados apenas em água (Controle),
por diferentes tempos de experimentação (12, 24, 48 e 72 horas).. ............................... 25
Figura 3. Índice de Resposta de Biomarcadores Integrados (RBI). ............................... 26
Figura 4. Valores de RBI para os horários de exposição do grupo Tratado ao glifosato.
........................................................................................................................................ 26
Figura 5. Modelo conceitual da atuação do glifosato sobre ovos/larvas de Rhamdia quelen
.........................................................................................................................................31
Artigo II
Figura 1. Mapa com indicação dos pontos de coleta....................................................... 41
Figura 2. Percentual médio de área de plantio na região oeste do Paraná. SEAB,
2016.................................................................................................................................46
Figura 3. Box plots dos biomarcadores avaliados no rio Manoel Gomes, Arroio
Pedregulho e Córrego Arquimedes................................................................................. 50
Figura 4. Diagrama de Ordenação das variáveis bióticas (biomarcadores) e abióticas
(Vegetação e Pesticida) derivadas da análise de componentes principais....................... 51
Figura 5. Médias e Desvios Padrão das cargas fatoriais do primeiro e segundo
componente principal...................................................................................................... 52
SUMÁRIO
RESUMO............................................................................................................ vi
ANTIOXIDANT SYSTEM ACTIVITY and NEUROTOXIC EFFECTS in
LARVAE of Rhamdia quelen in ACUTE EXPOSURE to GLYPHOSATE ........... vii
ABSTRACT ....................................................................................................... vii
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................... 11
Capítulo I .......................................................................................................... 15
Atividade do sistema antioxidante e efeitos neurotóxicos em larvas de Rhamdia
quelen em exposição aguda ao glifosato .......................................................... 16
RESUMO .................................................................................................. 16
1. Introdução ............................................................................................. 17
2. Material e Métodos ................................................................................. 18
3. Resultados .............................................................................................. 23
4. Discussão ................................................................................................ 27
5. Conclusão ............................................................................................... 32
Referências ................................................................................................ 32
Capítulo II ........................................................................................................ 37
Avaliação do sistema antioxidante e neurotoxicidade em Rhamdia branneri
(Teleostei: Heptapteridae) coletadas em riachos da bacia do baixo rio Iguaçu . 38
RESUMO .................................................................................................. 38
1. Introdução ............................................................................................. 39
2. Material e Métodos ................................................................................. 40
3. Resultados .............................................................................................. 46
4. Discussão ................................................................................................ 52
5. Conclusão ............................................................................................... 56
Referências ................................................................................................ 57
INTRODUÇÃO GERAL
Este estudo teve como propósito realizar experimentos manipulativos e naturais
com espécies de peixe do gênero Rhamdia, pertencentes a ordem Siluriforme, classe
Actinopteriggi e família Heptapteridae (BOCKMANN; GUAZZELLI, 2003). A espécie
Rhamdia quelen (QUOY & GAIMARD, 1824) apresenta distribuição desde o sudoeste
do México ao centro da Argentina (BALDISSEROTTO; RADUNZ NETO, 2004). Sua
ampla distribuição, grande tolerância a baixas temperaturas, elevada taxa de reprodução
e ganho rápido de peso durante os meses mais quentes do ano (GOMES et al., 2000) são
os principais motivos para o seu interesse em piscicultura. Esta espécie apresenta
importância econômica e o impulso da larvicultura deste peixe gerou um modelo para
otimizar a produtividade de peixes em diversas regiões do Brasil (KREUTZ et al., 2010).
Outra espécie deste gênero é a Rhamdia branneri (HASEMAN,1911), endêmica
da bacia do rio Iguaçu, o que a torna ainda mais importante para o monitoramento de
riachos pertencentes a esta bacia hidrográfica. Esta espécie possui corpo e nadadeiras
cinzas, mais claro na região ventral. Corpo alongado, arredondado próximo à cabeça,
comprimido na região da base da nadadeira adiposa, sem escamas, cabeça deprimida,
adiposa longa e boca terminal e barbilhões ao redor da boca (BAUMGARTNER et al.,
2012).
Além do interesse econômico e a preocupação com a espécie, os peixes são
utilizados como bioindicadores devido a elevada disponibilidade de informações sobre o
ciclo de vida de grande número de espécies de peixes, bem como por incluírem uma
grande variedade de níveis tróficos (ARAÚJO, 1998), uma vez que todos os peixes são
sensíveis as alterações das variáveis físicas e químicas da água (AURORA-PIS et al.,
2008), as quais podem ser alteradas pelas atividades humanas (CHOVANEC; HOFER;
SCHIEMER, 2003).
Os agentes de maior potencial na degradação dos ambientes aquáticos são os
agrotóxicos que, por meio do deflúvio superficial de áreas agrícolas, escoam substâncias
orgânicas ou inorgânicas, naturais ou sintéticas (RESENDE, 2002). Os peixes podem ser
afetados pela exposição direta aos agrotóxicos aplicados para eliminar ou controlar
possíveis agentes patogênicos (TAVECHIO; GUIDELLI; PORTZ, 2009) e por controle
direto de ervas daninhas que circundam tanques usados para piscicultura (VICK, 2010).
Podem ser afetados indiretamente por compostos xenobióticos que atingem mananciais e
rios, decorrentes da elevada descarga de efluentes industriais, domésticos e pela
agricultura (RESENDE, 2002).
Dentre os agrotóxicos mais utilizados atualmente pode-se citar o herbicida não-
seletivo glifosato, um sal isopropilamínico de glicina, que, segundo as empresas
fabricantes, é menos propenso a mover ou persistir no solo e águas superficiais e apresenta
baixa toxicidade para mamíferos (DUKE; POWLES, 2008), e compostos
organofosforados. Estes últimos são utilizados tanto na aquicultura quanto na agricultura,
para o controle de patógenos, sendo inseticidas que tem como função a inibição da
atividade da enzima colinesterase no núcleo nervoso central de invertebrados. São
considerados muito tóxicos para os seres vivos, mas por serem moléculas mais
hidrossolúveis e instáveis no ambiente são mais utilizados (SILVA; CAMPOS; BOHM,
2013).
Para se compreender a dinâmica e os efeitos dos agrotóxicos no ambiente e nos
seres vivos, pesquisadores têm utilizado como ferramenta os experimentos manipulativos
e naturais. Experimentos manipulativos são realizados visando um maior controle das
variáveis, e permitem maior confiança nas interferências sobre causa e efeito, mas são
limitados a escalas espaciais relativamente pequenas e curtos períodos de tempo
(GOTELLI; ELLISON, 2011).
Experimentos naturais avaliam a ação de inúmeras variáveis intervenientes que
podem afetar o comportamento animal e alterar a estrutura da comunidade (GOTELLI;
ELLISON, 2011). Comunidades biológicas dos sistemas fluviais são assembleias de
organismos adaptados a condições regionais, incluindo o ambiente físico e recursos
alimentares, e são ainda refinadas por meio de interações com outras espécies (ALLAN;
CASTILLO, 2007). Desta forma, experimentos naturais permitem avaliar a diminuição
da riqueza de espécies em ambientes afetados.
O presente manuscrito foi dividido em dois artigos científicos, sendo o primeiro
intitulado “Atividade do sistema antioxidante e efeitos neurotóxicos em larvas de
Rhamdia quelen em exposição aguda ao glifosato”, e o segundo, “Avaliação do sistema
antioxidante e neurotoxicidade em Rhamdia branneri (Teleostei: Heptapteridae)
coletadas em riachos da bacia do baixo Iguaçu”. Esta sequência de artigos tem como
proposta realizar a análise em ambiente controlado, mas também realizar a avaliação em
ambientes naturais.
Com isso, espera-se que este manuscrito possibilite uma reflexão sobre os efeitos
de agrotóxicos presentes em ambientes controlados, mas também em situações de
sinergismo com outras variáveis intervenientes. Desta forma, será possível estabelecer
relações de efeito estático, mas também em modelos estocásticos.
REFERÊNCIAS
ALLAN, J. D.; CASTILLO, M. M. Stream ecology: structure and function of running
waters. 3a ed. Dordrecht: Springer Science & Business Media, 2007.
ARAÚJO, F. G. Adaptação do índice de integridade biótica usando a comunidade de
peixes para o rio Paraíba do Sul. Revista Brasileira de Biologia, v. 58, n. 4, p. 547–558,
1998.
AURORA-PIS, M. et al. Efecto de la emisión de residuales urbano-industriales en la
enseada de la Coloma, costa sur de Pinar del Río, Cuba. Revista Eletronica de
Veterinaria, v. 9, n. 5, 2008.
BALDISSEROTTO, B.; RADUNZ NETO, J. Criação de Jundiá. Santa Maria: UFSM,
2004.
BAUMGARTNER, G. et al. Peixes do baixo rio Iguaçu. Maringá: Eduem, 2012.
BOCKMANN, F. A.; GUAZZELLI, G. M. Family Heptapteridae (Heptapterids). In:
REIS, R. E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS JR., C. J. (Eds.). . Checklist of the
freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003. p.
406–431.
CHOVANEC, A.; HOFER, R.; SCHIEMER, F. Fish as bioindicators. In: Bioindicators
and biomonitors- Principles, Concepts and Applications. [s.l: s.n.]. v. 6p. 639–676.
DUKE, S. O.; POWLES, S. B. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest
Management Science, v. 64, n. 1, p. 319–325, 2008.
GOMES, L. DE C. et al. Biologia do Jundiá Rhamdia quelen (Teleostei, Pimelodidae).
Ciência Rural, v. 30, n. 1, p. 179–185, 2000.
GOTELLI, N. J.; ELLISON, A. M. Princípios de Estatística Em Ecologia. [s.l.]
ARTMED, 2011.
KREUTZ, L. C. et al. Exposure to sublethal concentration of glyphosate or atrazine-based
herbicides alters the phagocytic function and increases the susceptibility of silver catfish
fingerlings (Rhamdia quelen) to Aeromonas hydrophila challenge. Fish and Shellfish
Immunology, v. 29, p. 694–697, 2010.
RESENDE, Á. V. Agricultura e qualidade da Água : Contaminação da Água por
Nitrato. Planaltina: [s.n.].
SILVA, M. R. DA; CAMPOS, A. C. E. DE; BOHM, F. Z. AGROTÓXICOS E SEUS
IMPACTOS SOBRE ECOSSISTEMAS AQUÁTICOS CONTINENTAIS. SaBios-
Revista de Saúde e Biologia, v. 8, n. 2, p. 46–58, 2013.
TAVECHIO, W. L. G.; GUIDELLI, G.; PORTZ, L. ALTERNATIVAS PARA A
PREVENÇÃO E O CONTROLE DE PATÓGENOS EM PISCICULTURA. Boletim do
Instituto de Pesca, v. 35, n. 2, p. 335–341, 2009.
VICK, B. Glyphosate application in aquacultureUnited States Patent Application
Publication, 2010.
Capítulo I
Atividade do sistema antioxidante e efeitos neurotóxicos em larvas de Rhamdia
quelen em exposição aguda ao glifosato
Artigo apresentado em defesa de dissertação de Mestrado
Artigo a ser enviado para a Revista Chemosphere
16
Atividade do sistema antioxidante e efeitos neurotóxicos em larvas de Rhamdia 1
quelen em exposição aguda ao glifosato 2
3
Thaís Maylin Sobjak1*, Silvia Romão2, Cristian Zwetzch do Nascimento3 e Ana Tereza 4
Bittencourt Guimarães1 5
6
1Pós-graduação em Conservação e Manejo de Recursos Naturais, Universidade Estadual 7
do Oeste do Paraná. Cascavel-PR. 2Universidade Federal da Fronteira Sul. Laranjeiras do 8
Sul-PR. 3Pós-graduação em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca, Universidade 9
Estadual do Oeste do Paraná. Toledo-PR. * [email protected] 10
11
RESUMO 12
O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do glifosato sobre o sistema 13
antioxidante, bem como efeitos neurotóxicos em larvas de Rhamdia quelen. Foi realizado 14
um delineamento inteiramente casualizado com ovos de jundiá distribuídos em 48 15
recipientes com 300 mL de água, os quais foram subdivididos aleatoriamente em grupos 16
controle e tratado com glifosato (6,5 mg/L). Estes foram avaliados em quatro tempos (12, 17
24, 48 e 72 horas), cada qual com seis repetições. Em cada tempo foi avaliado a taxa de 18
sobrevivência dos ovos/larvas (%), e coletadas amostras para as análises relativas ao 19
sistema antioxidante (catalase - CAT, glutationa transferase- GST, glutationa redutase - 20
GR, e lipoperoxidação - LPO), e avaliação neurotóxica (colinesterases). Ao longo das 72 21
horas de experimentação, houve maior taxa de sobrevivência entre os animais tratados 22
com glifosato, contudo foi detectada indução precoce do sistema antioxidante e efeitos 23
colinérgicos. Em 12 horas foi o maior valor de Resposta Integrada de Biomarcadores 24
(RIB=1,26) havendo indução da enzima colinesterase e GR. Em 24 horas, o valor de RIB 25
foi de -2,56, havendo inibição da enzima colinesterase e indução de GR. Em 48 horas, o 26
valor foi de -0,76, havendo indução de LPO. Por fim, o valor mais baixo de RIB foi em 27
72 horas (-4,65), havendo indução da GST e inibição dos demais biomarcadores. Por fim, 28
foi possível detectar o efeito agudo do glifosato ao longo do desenvolvimento inicial de 29
R. quelen, observando-se a diminuição do controle do sistema antioxidante e efeitos 30
neurotóxicos. 31
Palavras-chave: herbicida; jundiá; estresse oxidativo; larvicultura 32
33
17
1. Introdução 1
O herbicida não-seletivo glifosato é um sal isopropilamínico de glicina, que foi 2
lançado no mercado agrícola, em 1974, para o controle de ervas daninhas em cultivares 3
(Duke e Powles, 2008). Em 2013, o glifosato representou cerca de 40% do consumo de 4
agrotóxicos no Brasil, quando foram comercializadas 186 mil toneladas da substância 5
(Bento Filho, 2015). 6
O sucesso comercial foi decorrente de sua boa translocação em plantas, bem 7
como da rápida inativação do produto por microrganismos do solo, e de sua baixa 8
toxicidade para demais organismos. A ação principal do glifosato é sobre a via do ácido 9
chiquimato, inibindo a atividade da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintetase, 10
e consequentemente, interfere na síntese dos aminoácidos aromáticos: fenilalanina, 11
tirosina e triptofano (Amrhein et al., 1980). Esta via bioquímica é encontrada em plantas 12
superiores, algas e algumas bactérias, as quais podem sofrer ação do glifosato (Christy et 13
al., 1981; Shehata et al., 2013; Wong, 2000). A segunda razão para o seu sucesso 14
comercial ocorreu com a introdução de plantas transgênicas resistentes ao glifosato, 15
fazendo com que o herbicida aja somente sobre as plantas daninhas. Atualmente é o 16
herbicida mais vendido no mundo, usado em áreas agrícolas e não agrícolas (Myers et al., 17
2016). 18
Apesar da ampla comercialização deste herbicida, pesquisas recentes têm 19
mostrado que o glifosato provoca alterações no metabolismo de diversos organismos, 20
como invertebrados (Cuhra et al., 2015; Deepananda et al., 2011), anfíbios (Relyea, 2005; 21
Rissoli et al., 2016), peixes (Kreutz et al., 2010; Langiano and Martinez, 2008), ratos 22
(Benedetti et al., 2004) e humanos (Gasnier et al., 2009; Thongprakaisang et al., 2013). 23
O problema maior do uso contínuo e descontrolado deste herbicida é sua ação 24
sobre os organismos não-alvo. Nestes organismos, o principal efeito relatado é o aumento 25
na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS – Reactive Oxygen Species), tal como 26
o íon superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (-OH) (Cogo 27
et al., 2009; Rondón-Barragán et al., 2012). As ROS são propensas a causar danos 28
potencialmente tóxicos, mutagênicos ou cancerígenos devido à sua alta reatividade 29
iônica. Os alvos para os danos das ROS incluem os principais grupos de biomoléculas, 30
como DNA, lipídeos e proteínas (Nordberg e Arnér, 2001). 31
Os sistemas celulares antioxidantes atuam para mitigar os efeitos das ROS, 32
podendo ser divididos em dois grupos principais: enzimáticos e não-enzimático. Os 33
sistemas de enzimas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e glutationas), bem 34
18
como reações de membranas (lipoperoxidação) podem ser utilizadas como biomarcadores 1
de estresse oxidativo (Nordberg e Arnér, 2001). Para compreender os efeitos de agentes 2
xenotóxicos, avalia-se a atividade de biomarcadores bioquímicos, permitindo antecipar 3
mudanças que podem ocorrer em um ambiente (Freire et al., 2008). 4
Apesar dos inúmeros estudos avaliativos do efeito de glifosato sobre adultos de 5
organismos não-alvo, ainda há um interesse especial sobre o seu efeito em organismos 6
em fase inicial de desenvolvimento, em especial organismos de vida aquática. O impulso 7
da larvicultura do peixe Rhamdia quelen (QUOY & GAIMARD, 1824), também 8
chamado de jundiá, gerou um modelo para otimizar a produtividade de peixes em diversas 9
regiões do Brasil (Kreutz et al., 2010). Esta espécie nativa pertence a ordem Siluriforme, 10
classe Actinopterygii e família Heptapteridae (Bockmann e Guazzelli, 2003). Apresenta 11
distribuição desde o sudoeste do México ao centro da Argentina (Baldisserotto e Radunz 12
Neto, 2004). Sua ampla distribuição geográfica, bem como tolerância aos meses de 13
inverno, elevada taxa de reprodução e ganho rápido de peso durante os meses mais 14
quentes do ano (Gomes et al., 2000) são os principais motivos para o seu interesse na 15
piscicultura. 16
Entretanto, há uma grande preocupação sobre a contaminação de ovos e larvas de 17
peixes, uma vez que pisciculturas geralmente são construídas em áreas próximas a 18
cultivares, e, portanto, expostas aos agrotóxicos. Além disso, o glifosato tem atingido 19
diretamente espécies cultivadas, especialmente porque tem sido utilizado para controle 20
de plantas aquáticas em tanques de cultivo (Vick, 2010). 21
Diante do exposto, o glifosato pode agir indiretamente sobre espécies não-alvo, 22
em especial quando este produto é lixiviado até o leito dos rios, ou então pode agir 23
diretamente quando aplicado em tanques de cultivo. Desta forma é necessário entender e 24
antecipar as remediações para os possíveis danos que organismos em estágio larval 25
estejam sofrendo. Por isso, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos neurotóxicos 26
promovidos pelo herbicida glifosato, bem como ações sobre sistema antioxidante em ovos 27
e larvas do peixe Rhamdia quelen. 28
29
2. Material e Métodos 30
31
2.1 Delineamento experimental 32
O trabalho foi conduzido na Universidade Federal da Fronteira Sul- UFFS- 33
Laranjeiras do Sul-PR, no mês de fevereiro de 2016, após autorização pelo Comitê de 34
19
Ética de Uso Animal da Universidade Estatual do Oeste do Paraná. Os reprodutores 1
provenientes de estações comerciais de cultivo foram transferidos para o Laboratório de 2
Patologia Animal, e separados por sexo foram mantidos em duas caixas de polietileno 3
com 500 L de água com aeração constante e temperatura ambiente. 4
Nove fêmeas que apresentavam ventre abaulado, abertura da papila urogenital 5
levemente inchada e avermelhada foram selecionadas, bem como 4 machos que 6
liberavam esperma sob leve pressão abdominal contendo o orifício genital protraído 7
(Baldisserotto e Gomes, 2013; Baldisserotto e Radunz Neto, 2004). Os animais foram 8
induzidos a reprodução utilizando extrato hipofisário de carpa (EHC), o qual fora 9
macerado e diluído em soro fisiológico. O extrato foi injetado na musculatura da região 10
dorsal dos reprodutores e matrizes, sendo que as fêmeas foram pesadas individualmente 11
e receberam uma dose preparatória de 0,5 mg EHC.Kg-1 e, após 10 horas, uma segunda 12
dose de 5,0 mg EHC.Kg-1. Os machos receberam uma dose única de 2,5 mg EHC.Kg-1 13
no mesmo horário da aplicação da segunda dose nas fêmeas. 14
Após as aplicações dos extratos hipofisários, a temperatura da água foi monitorada 15
de hora em hora, e a liberação dos gametas após a indução hormonal para o R. quelen foi 16
estimada entre 220-240 Unidades Térmicas Acumuladas (UTA) (Baldisserotto e Radunz 17
Neto, 2004). A coleta dos gametas masculinos foi realizada após um período de 9 horas 18
(225 UTA) por meio de leve massagem na região ventral do animal no sentido céfalo-19
caudal (Witeck et al., 2011). A primeira gota de sêmen foi desprezada para evitar possível 20
contaminação, ou ativação dos gametas, e o restante foi coletado em um tubo de ensaio. 21
As fêmeas foram extrusadas após 9 horas e 15 minutos (231,2 UTA), de modo 22
similar ao procedimento realizado nos machos, e seus ovócitos foram coletados em 23
recipiente seco e de peso conhecido. O peso total dos ovócitos liberados de cada fêmea 24
foi pesado em balança analítica. Do material coletado das fêmeas foi escolhida àquela 25
com maior peso de ovócitos (56,03g). Três amostras de 0,1 g de ovócitos foram 26
observadas em microscópio estereoscópico, e realizada a estimativa do número relativo 27
de ovócitos por grama de material liberado. Obteve-se uma média de 1.560 ovócitos.g de 28
ovócitos-¹. 29
Os ovócitos foram fertilizados com 0,27 mL de sêmen (Bombardelli et al., 2006), 30
sendo que para ativação dos gametas foi adicionado 100 mL de água e realizada 31
movimentação manual dos gametas durante dois minutos. Após a movimentação, o 32
excesso de água foi retirado. Após a fertilização, em um delineamento experimental 33
inteiramente casualizado, amostras de 1 mL dos ovos foram distribuídos em 48 34
20
recipientes plásticos, contendo 300 mL de água mantidos à temperatura de 24+0,5o C e 1
oxigenação constante. Estes recipientes foram aleatorizados em grupo Controle (n=24) e 2
Tratado com 6,5 mg/L de glifosato (n=24), sendo que tal concentração foi considerada 3
como subletal uma vez que a CL50 para alevinos da espécie foi definida como 7,3 mg/L 4
por Kreutz et al. (2008). Em cada tempo de experimentação (12, 24, 48 e 72 horas) foram 5
aleatorizadas seis repetições. 6
Em cada tempo foram contados o número de indivíduos mortos e vivos em cada 7
repetição. Foi realizada a razão entre o número de indivíduos vivos e o número total, 8
definindo-se a taxa de sobrevivência de ovos/larvas por tempo de experimentação. 9
10
2.2 Análise e preparação do material biológico 11
As coletas realizadas em 12h, 24h, 48h e 72h após a contaminação, sendo as 12
amostras compostas por um pool de todos os indivíduos vivos de cada réplica. As 13
amostras foram homogeneizadas em 1 mL de tampão Tris HCl pH 7,4 e centrifugados a 14
12.000g por 10 minutos, a 4°C. O homogenato de todos os indivíduos foi congelado à -15
20°C para posteriores análises. 16
17
2.3 Dosagem proteica 18
A quantificação de proteína das amostras foi determinada pelo método de 19
Bradford, utilizando albumina de soro bovino como padrão (Bradford, 1976). Todas as 20
amostras foram então normalizadas para 1 mg de proteína/mL. 21
22
2.4 Dosagem enzimática associada à neurotoxicidade 23
A análise da atividade da enzima colinesterase (ChE) foi realizada por meio do 24
método de Ellman et al. (1961), modificado para microplaca por Silva de Assis (1998), 25
cujo princípio é a mensuração da produção da tiocolina quando a acetiltiocolina é 26
hidrolisada. Isso é feito pela reação contínua do tiol com o íon 5:5-ditiobis-2-27
nitrobenzoato para produzir o ânion de coloração amarelada do ácido 5-tio-2-28
nitrobenzóico. 29
A reação foi realizada em triplicata, em 300 L de solução contendo 0,05mM de 30
ácido 5,5′-Ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) e 1,5mM de Acetiltiocolina (ATC). Foi 31
calculada a atividade da ChE em relação a concentração de proteína (mg/mL), usando o 32
coeficiente de extinção molar do DTNB (1,36mM-1.cm-1). A quantificação da proteína foi 33
21
calculada a partir da amostra bruta e a leitura realizada a 22°C. Os resultados foram 1
expressos em nmol.min-1.mg proteína-1. 2
3
2.5 Dosagem enzimática associada ao sistema antioxidante 4
A atividade da Catalase (CAT) foi acompanhada pelo decréscimo da absorbância 5
a 240nm (Aebi, 1984), a partir do princípio de dismutação do peróxido, cujo coeficiente 6
de extinção molar é de 40 -1.cm-1. As duplicatas, em 2 mL de solução em uma cubeta 7
de quartzo a 25oC, apresentaram concentração final de 0,01 mg de proteína.mL-1, sendo 8
que o meio de reação apresentou concentrações finais de 13,5mM de H2O2, 50 mM de 9
TRIS-HCl pH 8,0 e 0,25 mM de EDTA. Os resultados da atividade da enzima catalase 10
foram expressos em mmol.min-1.mg de proteína-1. 11
O princípio da análise da atividade da Glutationa transferase (GST) é de que a 12
enzima catalisa a conjugação da glutationa reduzida (GSH) com o substrato sintético 13
CDNB que produz um conjugado detectado em 340nm (Habig et al., 1976). Durante o 14
ensaio, a atividade enzimática é proporcional à velocidade de produção do composto 15
conjugado. O ensaio foi realizado em triplicata, em microplaca, sendo que a amostra 16
apresentou concentração final de 0,020 mg de proteína.mL-1. O meio de reação apresentou 17
concentrações finais de 0,94 mM de CDNB e 0,94 mM de GSH. A leitura foi realizada à 18
22°C. O coeficiente de extinção molar do conjugado GSH/CDNB é 9,6 mM-1.cm-1 e a 19
unidade foi expressa em nmol.min-1.mg de proteína-1. 20
A Glutationa redutase catalisa a redução da glutationa dissulfeto (GSSG) através 21
da oxidação do NADPH, cujo decréscimo de absorbância é medido a 340nm (Sies et al., 22
1979). O ensaio foi realizado em duplicata, em microplaca, o meio de reação apresentou 23
concentrações finais de 0,138 mM de NADPH, 3,81 mM de GSSG e 3,75 mM de EDTA. 24
A reação foi realizada à 22°C. O coeficiente de extinção molar do NADPH é 6,22 mM-25
1.cm-1. A unidade foi expressa em nmol.min-1.mg de proteína-1. 26
A determinação da reação de lipoperoxidação (LPO) foi realizada com objetivo 27
de quantificar indiretamente os peróxidos, refletindo assim a intensidade da peroxidação 28
lipídica (Lushchak et al., 2009). Foi realizado o método de TBARS (Buege e Aust, 1978), 29
realizando comparações de absorbância com curva de padrões de Malondialdeído 30
(MDA), principal subproduto de peroxidação lipídica celular. Para preparação da amostra 31
o meio contendo alíquota de 0,33 mg/mL de proteína da amostra em ácido tricloroacético 32
(TCA) 6,7% em volume final de 180 μL, foi agitado em vórtex, deixado em banho de 33
gelo por 5 minutos e centrifugado por 5 minutos a 12000g a 4 ºC. Para a dosagem das 34
22
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), 40 L do sobrenadante, assim 1
como de diferentes concentrações de MDA foram adicionados em microplaca, em 2
triplicata, a meio de reação contendo 21,42 mM de TBA, 17,86 mM de NaOH (utilizado 3
para solubilização do TBA), 0,73 M de TCA, 0,032mM de BHT, etanol 3% (utilizado 4
para solubilização do BHT) em PBS. A leitura da reação foi realizada à 22°C, após 60 5
minutos de incubação a 60oC, em uma absorbância de 535 nm. Os resultados da 6
peroxidação lipídica foram expressos em nmol de MDA.mg de proteína-1. 7
8
2.6 Resposta Integrada de Biomarcadores 9
A partir dos resultados obtidos com os biomarcadores, foi calculado o índice de 10
Resposta Integrada de Biomarcadores (RIB), descrito por Beliaeff and Burgeot (2002) e 11
modificado por Sanchez et al. (2013). Para o cálculo do RIB, foi realizada a razão entre 12
os dados dos biomarcadores das amostras do grupo Tratado e a média das réplicas de cada 13
horário do grupo Controle. Cada razão foi logaritimizada (Yi+1) e então calculadas as 14
médias gerais (𝜇) e desvios padrão (s). Então, os valores logaritmizados de Yi+1 (yi) 15
foram padronizados pela fórmula: 𝑍𝑖 =(𝑦𝑖−𝜇)
𝑠 . O mesmo procedimento foi também para 16
o grupo Controle, calculando-se os valores padronizados 𝑍0. Foi calculada a diferença 17
entre Zi e Z0 (A), que determina o valor de resposta de cada biomarcador em cada horário 18
de exposição. A soma dos valores de A define o valor de RBI para cada horário no grupo 19
exposto ao glifosato. Os dados de cada biomarcador foram representados em gráficos tipo 20
radar, indicando o desvio do biomarcador investigado em relação ao grupo Controle. 21
22
2.7 Análise estatística 23
As variáveis % de sobrevivência, bem como a razão dos valores (Yi) de ChE, CAT, 24
GST, GR e LPO, em função das médias dos horários no grupo Controle, foram 25
comparadas entre os grupos e tempos de contaminação, tendo a normalidade dos resíduos 26
verificada pelo teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade das variâncias por meio do teste 27
de Levene. As variáveis foram analisadas por meio do teste paramétrico ANOVA-fator 28
duplo, seguido do teste de Tukey-HSD. Em todos os testes estatísticos o nível de 29
significância utilizado foi de 0.05. 30
Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa R (Core Team, 2015), 31
fazendo uso dos pacotes estatísticos ExpDes.pt (Ferreira et al., 2013), plyr (Wickham, 32
2011) e ggplot2 (Wickham, 2009). 33
23
3. Resultados 1
Foi possível observar diferenças estatísticas com relação à sobrevivência dos 2
animais entre os grupos e os tempos de exposição ao glifosato (F3; 29=3,71; p=0,022). A 3
diferença de sobrevivência entre os grupos foi significativa a partir de 48 horas de 4
experimentação, sendo maior no grupo Tratado com glifosato (93%) quando comparado 5
ao grupo Controle (75%) (Fig.1). Vale ressaltar que foi verificada maior atividade 6
natatória entre os animais expostos ao glifosato. 7
Na Tabela 1 são apresentadas as médias e erros padrão dos biomarcadores. 8
9
Fig. 1. Taxa de sobrevivência (%) de ovos/larvas de Rhamdia quelen nos grupos Controle 10 e Tratado com 6,5 mg/L de glifosato. 11
Tabela 1 12 Atividade de biomarcadores em ovos/larvas de Rhamdia quelen não exposto (Controle) 13 e expostos durante 72 horas a 6,5 mg/L de glifosato. Os resultados estão expressos em 14 média + EPM para cada grupo em cada tempo de exposição. 15
12 h 24 h 48 h 72 h
ChE Controle 0,25±0,023 19,97±0,67 0,48±0,05 38,75±7,9 nmol.min-1.mg de proteína-1
Tratado 3,56±0,26 30,51±8,4 2,81±0,38 107,71±5,4
CAT Controle 2,03±0,65 2,87±1,08 3,71±1,05 4,80±0,99 mmol.min-1.mg de proteína-1
Tratado 3,81±1,46 4,6±0,67 4,18±0,64 4,45±0,87
GST Controle 0,094±0,002 0,091±0,002 0,089±0,001 0,092±0,001 nmol.min-1.mg de proteína-1
Tratado 0,092±0,004 0,089±0,002 0,083±0,001 0,096±0,001
GR Controle 0,57±0,16 0,72±0,15 0,73±0,2 0,96±0,24 nmol.min-1.mg de proteína-1
Tratado 1,48±0,4 1,61±0,27 1,08±0,3 0,73±0,05
LPO Controle 0,82±0,32 1,06±0,21 0,07±0,04 0±0 nmol TBARS.min-1.mg de
proteína-1 Tratado 0,46±0,10 1,50±0,63 0,24±0,07 0±0
ChE- Colinesterase; CAT- Catalase; GST- Glutationa S-Transferase; GR-Glutationa Redutase; 16 LPO- Lipoperoxidação. 17
18
As análises a seguir, foram realizadas com os valores das razões entre grupo 19
Tratado e as médias do grupo Controle, as quais foram consideradas constituintes da linha 20
24
de base. Ao avaliar a atividade da enzima Colinesterase, a qual é marcadora de efeitos 1
neurotóxicos, houve diferença significativa na interação entre grupos e tempo de 2
experimentação (F3; 29=60,49; p<0,0001), indicando elevação significativa da atividade 3
enzimática no grupo Tratado com glifosato quando comparado ao grupo Controle em 12h 4
(Média±SE=14,5±1,09) e 48h (5,74±0,77) de experimentação (Fig. 2a). 5
Na avaliação da enzima catalase e GST, não houve diferença significativa entre 6
os grupos, assim como entre os horários (F3; 29=0,53; p=0,661; F3; 29=1,72; p=0,184, 7
respectivamente) (Figs. 2b-c). 8
Em relação a GR, houve diferença significativa entre os grupos (F1; 29= 4,78; p= 9
0,037), sendo possível observar médias significativamente mais elevadas de sua atividade 10
no grupo exposto ao glifosato quando comparado ao grupo Controle, com destaque 11
especial aos horários de 12h (2,59±0,70) e 24h (2,23±0,37) de exposição (Fig. 2d). 12
Para a LPO houve diferença significativa na interação entre grupos e tempos de 13
experimentação (F3; 29=6,5; p=0,001), indicando elevação da reação de lipoperoxidação 14
no grupo Tratado com glifosato em 48h (6,94±1,88) de experimentação (Fig. 2e). 15
O índice RIB foi definido para cada horário, mostrando as diferenças observadas 16
no grupo Tratado em relação à linha de base. O valor do índice RIB em 12 horas de 17
experimentação foi igual a 1,26, indicando, portanto, a indução da atividade enzimática 18
da colinesterase e da glutationa redutase (Fig. 3a). Em 24 horas, o valor de RIB reduz 19
para -2,56, indicando forte inibição da atividade enzimática colinesterásica, mas ainda 20
indução da atividade da glutationa redutase e manutenção das atividades das demais 21
enzimas em acordo com a linha de base definida pelo grupo Controle (Fig. 3b). Em 48 22
horas, o valor do índice ainda indica inibição dos biomarcadores, sendo equivalente a 23
-0,76. Neste horário, observou-se a inibição das atividades específicas das enzimas 24
catalase, GR e GST, aumento dos níveis de reação de lipoperoxidação, e equivalência da 25
atividade da colinesterase à linha de base (Fig. 3c). Em 72 horas, temos o maior valor de 26
inibição enzimática, RIB=-4,65, em que observamos que apenas a GST está levemente 27
induzida, e as demais enzimas tiveram suas atividades inibidas quando comparadas à 28
linha de base (Fig. 3d). 29
Em síntese, observa-se o decréscimo do RIB ao longo do desenvolvimento larval 30
em animais expostos ao glifosato (Fig. 4). Tal fato, sugere que neste período experimental 31
ocorre a indução precoce da atividade colinesterásica e do sistema antioxidante (12h), e 32
a partir de 24 horas observa-se os primeiros efeitos neurotóxicos, seguido da dificuldade 33
de manutenção das atividades do sistema antioxidante nos horários posteriores. 34
25
1
Fig. 2. Atividade de biomarcadores em ovos/larvas de Rhamdia quelen expostos a 6,5 2 mg/L de glifosato (Tratamento) e animais acondicionados apenas em água (Controle), por 3 diferentes tempos de experimentação (12, 24, 48 e 72 horas). * Diferença com a linha de 4 base no respectivo tempo, p<0,05. a) Colinesterase (ChE); b) Catalase (CAT); c) 5 Glutationa Transferase (GST); d) Glutationa Redutase (GR); e) Lipoperoxidação (LPO). 6
a
b
c
e
d
*
*
*
*
*
*
26
1
2
3
Fig. 3. Índice de Resposta de Biomarcadores Integrados (RBI). Colinesterase (ChE), 4 catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), glutationa redutase (GR) em diferentes 5 horários (12h, 24h, 48h e 72h) em pool de ovos/larvas de R. quelen tratados com glifosato. 6 Os biomarcadores representam a relação com o grupo Controle (linha de base - laranja). 7 A área acima do zero representa a indução do biomarcador, enquanto o valor abaixo do 8 zero representa a inibição do biomarcador. 9
10
Fig. 4. Valores de RBI para os tempos de exposição do grupo Tratado ao glifosato. 11
-1,5-1
-0,50
0,51
1,5LPO
ChE
CATGST
GR
12h
IBR = 1,26
-1,5-1
-0,50
0,51
1,5LPO
ChE
CATGST
GR
24h
IBR=-2,56
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5LPO
ChE
CATGST
GR
48h
IBR=-0,76
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5LPO
ChE
CATGST
GR
72h
IBR=-4,65
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
12h 24h 48h 72h
RB
I
27
4. Discussão 1
Foi observada maior taxa de sobrevivência em larvas do grupo Tratado a partir de 2
48 horas, indicando 93% de sobrevivência, enquanto o grupo Controle apresentou 75% 3
de sobrevivência. Graeff et al. (2008) tiveram resultado de 70% de sobrevivência em 4
alevinos de jundiá não contaminados, sendo um dado similar a situação do grupo Controle 5
deste estudo. 6
A alta taxa de sobrevivência, observada entre os animais tratados com glifosato, 7
pode estar relacionada a ação deste produto sobre agentes etiológicos patogênicos aos 8
peixes. Apesar de não ter sido realizada uma análise da qualidade da água para 9
identificação de possíveis patógenos, há evidências na literatura de que o herbicida 10
glifosato age sobre fungos ambientais (Dallmann et al., 2010) e também sobre bactérias 11
(Shehata et al., 2013), podendo, portanto, ter promovido a diminuição de agentes 12
patogênicos nas unidades experimentais dos ovos/larvas tratados. Muitos dos agentes 13
patogênicos que causam doenças em organismos aquáticos são formas facultativas 14
presentes nos sistemas aquáticos. Na natureza, uma elevada frequência de animais 15
aparentemente normais e saudáveis hospeda potenciais agentes patogênicos sem 16
evidência de sinais clínicos ou manifestação de doença (Meyer, 1991). Bactérias, vírus e 17
fungos são os principais agentes causadores de problemas para gametas e embriões de 18
peixes. A transmissão vertical é comum entre as doenças virais, sendo geralmente 19
responsável pela mortalidade de ovos e alevinos, ocorrendo, geralmente, quando os pais 20
são portadores assintomáticos de alguma doença (Brandão, 2004). Os jundiás podem ser 21
portadores de bactérias descritas como patogênicas, tais como: Plesiomonas shigelloides, 22
Aeromonas sp., Flavobacterium sp., Pseudomonas sp., Staphylococcus sp., Edwardsiella 23
tarda, Yersinia ruckeri, Vibrio sp., Micrococcus sp., Pasteurella sp. e Acinetobacter sp., 24
os quais causam infecção e aumento da mortalidade de ovos de peixes (Shama et al., 25
2000). Porém estes agentes patogênicos não foram avaliados no presente estudo. 26
Além da avaliação da taxa de sobrevivência dos animais, foi também realizada a 27
avaliação de efeitos neurotóxicos sobre a atividade enzimática da colinesterase. Esta 28
enzima exerce uma função chave na regulação da transmissão do impulso nervoso, 29
hidrolisando a acetilcolina acumulada na sinapse colinérgica (Becker et al., 2009). Os 30
carbamatos e organofosforados agem inibindo sua atividade, por isso essa enzima é 31
amplamente utilizada como biomarcador de qualidade ambiental (Carvalho et al., 2013). 32
Mas, além da ação inibitória de pesticidas sobre essa enzima, metais pesados e íons 33
metálicos bivalentes podem induzir a atividade da colinesterase (Tsigelny et al., 2000). 34
28
Apesar de alguns estudos encontrarem inibição da colinesterase pelo glifosato 1
(Glusczak et al., 2006; Modesto and Martinez, 2010), no presente estudo foi observada 2
indução precoce da atividade enzimática, como observado pelo valor de RIB, sendo mais 3
elevada no grupo Tratado em 12 e 48 horas em relação à linha de base. Ao avaliar o 4
desenvolvimento do animal nesta fase inicial, em 12 horas geralmente se observa a 5
formação da vesícula de Kupffer, bem como o mesencéfalo levemente proeminente 6
(Rodrigues-Galdino et al., 2010), esperando-se, portanto, baixos valores de atividade da 7
colinesterase. 8
De forma similar, a indução desta atividade enzimática foi também observada para 9
a espécie de peixe Cyprinus carpio quando expostos ao glifosato (Cattaneo et al., 2011) 10
e aos herbicidas imazetapir e imazapic (Moraes et al., 2011). Salbego et al. (2010) 11
também observaram indução da atividade colinesterásica muscular em Leporinus 12
obtusidens exposto a baixas concentrações de glifosato. Miron et al. (2005) observaram 13
indução da atividade desta enzima em Rhamdia quelen como efeito dos herbicidas 14
clomazone, quinclorac e metil metsulforon sugerindo que os animais podem compensar 15
o estresse causado pela exposição aos agrotóxicos, aumentando a atividade 16
colinesterásica. Essa ativação da enzima pode representar um aumento na hidrólise do 17
neurotransmissor acetilcolina, com consequente decréscimo na ativação dos receptores 18
nicotínicos e muscarínicos. 19
No presente estudo, pudemos observar hiperatividade das larvas expostas ao 20
glifosato quando comparadas ao grupo Controle. A indução ou inibição da colinesterase 21
pode influenciar no processo de neurotransmissão colinérgica e promover efeitos de 22
letargia ou nado errático (Miron et al., 2005). Contudo, vale ressaltar que todos estes 23
estudos foram realizados em peixes adultos, não havendo evidências de atividade da 24
enzima colinesterase em larvas de peixes expostas ao glifosato. 25
Além da avaliação de efeitos neurotóxicos, foi também realizada a avaliação das 26
respostas do sistema antioxidante quando ovos/larvas foram expostos ao glifosato. A 27
enzima catalase (CAT) tem como principal função impedir o acúmulo do peróxido de 28
hidrogênio (H2O2), o qual é geralmente resultante da dismutação do superóxido pela 29
enzima superóxido dismutase (Barbosa et al., 2010). No presente estudo, a atividade da 30
enzima CAT em animais tratados com glifosato não apresentou diferença significativa 31
quando comparada aos animais do grupo Controle. A manutenção da atividade da CAT 32
observada neste trabalho foi semelhante aos resultados encontrados por Glusczak et al. 33
(2007), que também não observaram alterações na atividade desta enzima no fígado de 34
29
Rhamdia quelen expostos a 0,2 e 0,4 mg.L-1 de glifosato por 96 horas, e por Modesto e 1
Martinez (2010), que também não observaram alteração na atividade da enzima para 2
Prochilodus lineatus expostos ao mesmo herbicida. A CAT e a enzima Glutationa 3
Peroxidase metabolizam o H2O2, gerando H2O e O2; se o H2O2 não for metabolizado, 4
pode gerar radicais hidroxil (•OH) através da reação de Fenton, que é a mais reativa das 5
ROS agindo especialmente sobre os lipídeos das membranas plasmáticas (Hermes-Lima 6
and Storey, 1993). 7
Contudo, a atividade da CAT pode ser aumentada ou diminuída em ambientes 8
contaminados, dependendo do agente químico. Moraes et al. (2011) observaram aumento 9
da atividade da CAT no fígado de Cyprinus carpio no sétimo dia de exposição aos 10
herbicidas imazetapir e imazapic. Porém, Crestani et al. (2007) mostraram redução da 11
atividade da catalase hepática em R. quelen expostos ao clomazone. Os resultados 12
encontrados na literatura sobre a atividade dessa enzima são variados e podem ser 13
explicados considerando-se que o potencial antioxidante dos peixes muda de acordo com 14
a espécie, o órgão e o seu habitat (Glusczak et al., 2007). 15
A GST não teve diferença significativa quando realizada a comparação das médias 16
entre os grupos Controle e Tratado. Porém, observa-se pelo valor de RIB uma indução da 17
sua atividade em 72 horas. Um resultado similar foi observado por Ferreira et al. (2010), 18
que mostraram um aumento na atividade da GST do fígado de R. quelen expostos ao 19
glifosato. Modesto e Martinez (2010) também observaram aumento na atividade da GST 20
em Prochilodus lineatus após 24 e 96 h exposição ao glifosato, sugerindo que esta 21
elevação é decorrente do aumento do processo de biotransformação do herbicida pelo 22
animal, bem como por ocorrer a metabolização dos lipoperóxidos formados pela reação 23
de Fenton, indicando a ativação dos mecanismos de defesa. 24
A elevação da atividade desta enzima no grupo exposto ao glifosato, durante as 25
primeiras 24 horas de desenvolvimento, é mais um indicativo de que este herbicida induz 26
alterações no sistema antioxidante. Quando um agente oxidante age no citoplasma de uma 27
célula ocorre o aumento da concentração de GSSG e a depleção de GSH. O excesso de 28
GSSG resulta em ambiente mais oxidante, que favorece a formação de pontes dissulfeto 29
(-SS-) em proteínas portadoras de grupamento tiol (-SH). As pontes dissulfeto oxidam 30
tais proteínas, com prejuízo as suas funções. Esta oxidação é reversível graças a ação da 31
GR, a qual reduz a GSSG à GSH com gasto de NADPH. Desta forma, é possível sugerir 32
que nas primeiras 24 horas de desenvolvimento, quando ocorre o período de eclosão 33
larval, para manter o organismo em homeostase o sistema antioxidante trabalha para a 34
30
recuperação da GSH (Ferreira e Matsubara, 1997). Nesta etapa frágil do 1
desenvolvimento, observa-se baixa mobilidade prévia à eclosão, com aproximadamente 2
100 batimentos cardíacos por minuto, e ausência de pigmentação (Rodrigues-Galdino et 3
al., 2010). 4
A reação TBARS indicou um aumento na lipoperoxidação, a qual foi induzida 5
para os animais que foram expostos durante 48 horas ao glifosato. Nesta fase do 6
desenvolvimento larval, observam-se os olhos pigmentados, boca como uma abertura 7
elíptica, o início do desenvolvimento dos barbilhões, poro anal, bolsas faríngeas e os 8
opérculos abertos (Rodrigues-Galdino et al., 2010). Logo, nesta fase de desenvolvimento 9
é esperado o aumento da reação de lipoperoxidação em decorrência das inúmeras 10
transformações do organismo do animal. 11
Menezes et al. (2011) observaram um aumento também dos níveis de TBARS 12
para R. quelen expostos ao glifosato, e posterior diminuição desses níveis, no período de 13
recuperação dos animais. Vieira et al. (2016) obtiveram resultados de aumento de danos 14
genéticos em animais com elevada lipoperoxidação, sugerindo que os produtos desta 15
reação podem agir sobre outros componentes celulares, como os ácidos nucléicos, como 16
consequência de uma maior permeabilidade da membrana celular. Além disso, o radical 17
.OH também promove o processo de peroxidação lipídica, atuando sobre os carboidratos 18
e as proteínas extrínsecas, bem como nas porções polares fosfolipídicas; uma reação em 19
cadeia dos radicais livres promove dano oxidativo no glicocálix, afetando a função celular 20
e contribuindo para a geração de inúmeras patologias (Halliwell and Gutteridge, 2015). 21
Logo, elevações nos níveis de lipoperoxidação nos deixam alertas para danos que podem 22
não ser visíveis precocemente, mas sim ao longo do desenvolvimento do espécime. 23
Segundo Fränzle (2003), a resistência a qualquer forma de estresse é um sistema 24
de propriedades internas inatas de um organismo que pode se opor à produção de uma 25
tensão gerada por um esforço específico, ou ainda ativar um mecanismo de reparação que 26
reverte à tensão. Este sistema tem dois componentes principais: as resistências plásticas 27
e as elásticas. O aumento da resistência plástica irá prevenir (ou pelo menos reduzir) a 28
formação de uma lesão gerada por um fator estressor, o qual poderia promover um efeito 29
ainda mais deletério se o organismo não fosse adaptado. Já a resistência elástica é 30
reversível após a remoção do fator estressor, mas sua ação prolongada pode levar a danos, 31
ou até a morte do organismo afetado. A permanência do agente estressor por um período 32
prolongado leva a transformação de uma resistência elástica em uma resistência plástica, 33
31
podendo resultar em prejuízos para o organismo, seja para sua sobrevivência como para 1
reprodução. 2
Ao longo do desenvolvimento de um animal, uma exposição suficientemente 3
longa a um fator estressor, como o herbicida glifosato, pode prejudicar ou matar o 4
organismo, e ainda, acabar afetando o desenvolvimento de gerações futuras. Sendo que 5
este indivíduo pertence a uma população, a qual se integra a uma comunidade, o 6
desequilíbrio de sua homeostase pode, a médio e longo prazo, desestabilizar toda a 7
interação da cadeia ecológica. 8
Logo, um xenobiótico, como o glifosato, promove a resistência elástica que se 9
expressa na forma de efeitos neurotóxicos, bem como respostas bioquímicas do sistema 10
antioxidante que podem produzir mutações no material genético de um organismo, as 11
quais podem gerar efeitos letais ou subletais. Quando esta pressão permanece por longo 12
período, pode resultar na resistência plástica, que tem como resposta a redução da 13
longevidade de toda uma população, bem como sua redução na capacidade reprodutiva. 14
Estes dois últimos fatores geram alteração na estrutura de uma população e da 15
comunidade a qual pertence, podendo resultar na perda da biodiversidade. Realizando tal 16
reflexão em ambientes de cultivo de peixes, pode se esperar a redução do plantel e, 17
portanto, inúmeras implicações sócio-econômicas (fig. 5). 18
19
Fig. 5. Modelo conceitual da atuação do glifosato sobre ovos/larvas de Rhamdia quelen. 20
21
O presente estudo mostra, portanto, evidências de que a exposição aguda do 22
glifosato às larvas de R. quellen promoveu efeitos neurotóxicos e alterações da atividade 23
32
do sistema antioxidante, o que possivelmente leva a um efeito sobre a resistência elástica 1
do animal. 2
5. Conclusão 3
Por meio deste estudo pode-se concluir que, apesar dos animais expostos ao 4
glifosato terem maior porcentagem de sobrevivência, ocorreu uma indução precoce da 5
atividade colinesterásica e do sistema antioxidante, seguido da dificuldade da estabilidade 6
das atividades do sistema antioxidante nos tempos posteriores, resultando em uma maior 7
lesão ao nível celular. O estresse que os animais sofreram à exposição ao herbicida 8
glifosato provocou uma alteração no seu metabolismo, que sugere uma característica de 9
resistência elástica. 10
Contudo, observando o dano celular e compreendendo que animais expostos a um 11
fator estressor por um longo período de tempo podem sofrer lesões irreversíveis, as quais 12
podem ser mantidas no seu DNA e propagadas para as gerações posteriores na forma de 13
uma resistência plástica, lança-se a proposta para se realizar trabalhos que comprovem as 14
consequências de exposições crônicas ao glifosato, em especial, pela detecção de 15
alterações neurotóxicas, no sistema antioxidante e ações genotóxicas. 16
17
Agradecimentos 18
À agência de fomento Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – 19
CAPES. 20
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40 41
37
Capítulo II
Avaliação do sistema antioxidante e neurotoxicidade em Rhamdia
branneri (Teleostei: Heptapteridae) coletadas em riachos da bacia do
baixo rio Iguaçu
Artigo já apresentado no Exame de Qualificação Geral
Artigo enviado a Revista Ecotoxicology and Environmental Safety
38
Avaliação do sistema antioxidante e neurotoxicidade em Rhamdia branneri 1 (Teleostei: Heptapteridae) coletadas em riachos da bacia do baixo rio Iguaçu 2
3
Thaís Maylin Sobjak1*, Silvia Romão2 e Ana Tereza Bittencourt Guimarães1 4
5
1Pós-graduação em Conservação e Manejo de Recursos Naturais, Universidade Estadual 6
do Oeste do Paraná. Cascavel-PR. 2Universidade Federal da Fronteira Sul. Laranjeiras do 7
Sul-PR.* [email protected] 8
9
RESUMO 10 11 O uso de múltiplos biomarcadores tem se mostrado eficaz para avaliação de contaminação 12
ambiental. Neste trabalho o sistema antioxidante e efeitos de neurotoxicidade em 13
Rhamdia branneri foram avaliados para compreender a dinâmica da biota associada ás 14
variáveis físicas e químicas do ambiente no período de outono e inverno. As coletas foram 15
realizadas em maio e agosto de 2015, em três riachos pertencentes à bacia do baixo rio 16
Iguaçu: rio Manoel Gomes, arroio Pedregulho e córrego Arquimedes. Foram realizadas 17
análises de sedimento, as quais apontaram a presença dos organofosforados Disulfoton, 18
Metilparation e Ronnel Fenclorfos no rio Manoel Gomes e córrego Arquimedes. No 19
outono, houve inibição da atividade da ChE do cérebro (p<0,0002) e músculo (p<0,001) 20
de amostras coletadas no rio Manoel Gomes e córrego Arquimedes. No rio Manoel 21
Gomes foi observada a elevação da LPO (p=0,00075) no período de outono, estando 22
associado a maior utilização de agrotóxicos neste período. No presente estudo, a resposta 23
dos biomarcadores está relacionada à variação temporal, e possivelmente à exposição 24
desses animais à agrotóxicos. Apesar dos riachos estarem localizados em regiões com 25
ampla vegetação circundante, as análises de solo mostram que resíduos de agrotóxicos 26
atingem estas localidades. A biota local respondeu de forma diferente em cada estação, 27
sinalizando que a fauna está em contato com agentes oxidantes e colinesterásicos no 28
período de outono, quando há maior frequência de plantio e uso de agrotóxicos. 29
30 Palavras-chave: organofosforado; jundiá; sazonalidade 31
32
33
39
1. Introdução 34
35
A evolução no meio agrícola ocorreu por meio dos avanços tecnológicos no 36
maquinário, defensivos e transgênicos. Contudo, este avanço fez com que o uso 37
exacerbado e inadequado de agroquímicos promovesse efeitos agudos a espécies não-38
alvo. Carneiro et al. (2015), em um dossiê da Associação Brasileira de Saúde Coletiva 39
(Abrasco), mencionaram um consumo excessivo de agrotóxicos no Brasil, assumindo o 40
posto de maior mercado mundial de agrotóxicos em 2012. Nesse ano, a escala mundial 41
de consumo de agrotóxicos cresceu em 93%, enquanto no Brasil o consumo de 42
agrotóxicos elevou cerca de 190%. Dentre os estados brasileiros, o Paraná ocupa o 43
segundo lugar na produção de grãos do país (19%) (IBGE, 2016), sendo também um dos 44
maiores consumidores de agrotóxicos (UFPR, 2015). 45
O Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA), da 46
ANVISA (2014), analisou 1.397 amostras de alimentos em 2012, das quais 347 (25%) 47
foram consideradas insatisfatórias por apresentarem agrotóxicos em níveis acima do 48
Limite Máximo de Resíduo (LMR) e/ou agrotóxicos não autorizados para a cultura. O 49
excesso de agrotóxicos em alimentos para consumo pode acontecer devido aos erros 50
durante a aplicação, que são causados pela falta de treinamento de quem aplica o produto 51
(ANVISA, 2014; Chaim, 2004). O uso inadequado e excessivo promove a seleção de 52
novos patógenos, propiciando, a médio prazo, o aumento da concentração de agrotóxicos 53
aplicados. Como consequência ocorre uma crescente contaminação de mananciais 54
resultante do deflúvio superficial de áreas agrícolas, que escoam essas substâncias 55
orgânicas ou inorgânicas, naturais ou sintéticas (Resende, 2002). 56
Dentre os diversos problemas causados por agrotóxicos, um dos principais está 57
associado à alteração da estrutura da comunidade e consequente diminuição da riqueza 58
de espécies. Comunidades biológicas dos sistemas fluviais são assembleias de 59
organismos adaptados a condições regionais, incluindo o ambiente físico e recursos 60
alimentares, e são ainda refinadas por meio de interações com outras espécies (Allan e 61
Castillo, 2007). 62
Um dos instrumentos utilizados para a compreensão e prevenção do impacto 63
ambiental tem sido o uso de biomarcadores, já que apenas identificar e quantificar os 64
agrotóxicos no ambiente não é suficiente para se compreender os danos causados às 65
comunidades. Os biomarcadores têm especificidades distintas e, em programas de 66
40
biomonitoramento, o uso de múltiplos biomarcadores tem se mostrado mais eficaz que a 67
avaliação de apenas um indicador de poluição (Freire et al., 2008). 68
Uma das vantagens do biomonitoramento é a avaliação de espécies nativas e 69
endêmicas. Rhamdia branneri é uma espécie pertence à ordem Siluriformes e família 70
Heptapteridae. Por muito tempo foi considerada sinonímia da Rhamdia quelen, porém 71
segundo os trabalhos de Abucarma e Martins-Santos (2001), esta espécie apresenta 72
diferenças cariotípicas, e Mise et al. (2013) apresentaram diferenças ecomorfológicas 73
entre R. branneri e R. voulezi. A distribuição geográfica da R. branneri é restrita à bacia 74
do rio Iguaçu, o que a torna ainda mais importante para o monitoramento de riachos 75
pertencentes a esta bacia hidrográfica (Baumgartner et al., 2012). 76
O objetivo deste trabalho foi avaliar alterações neurotóxicas e do sistema 77
antioxidante em R. branneri presentes em riachos com diferentes níveis de contaminação 78
ambiental nos períodos de outono e inverno. 79
80
2. Material e Métodos 81
82
2.1 Área de Estudo 83
A bacia do rio Iguaçu está localizada ao sul do estado do Paraná e compreende 84
101 municípios. A área em estudo localiza-se no terceiro planalto do Estado, sendo que 85
o seu elevado desnível proporciona vantagens para o aproveitamento energético. Suas 86
características geomorfológicas, morfodinâmicas e hidrográficas proporcionaram 87
elevado grau de endemismo de sua ictiofauna (Baumgartner et al. 2012). 88
Os riachos estudados apresentam as seguintes características (Fig. 1): 89
- Rio Manoel Gomes (25°09.723' S 53°49.768' W), afluente do rio Floriano está 90
localizado no Parque Nacional do Iguaçu (PNI), o qual é considerado a maior unidade de 91
conservação no domínio da Mata Atlântica de Interior, sendo um dos últimos 92
remanescentes preservados desse tipo de vegetação no sul do país, com 185.262,5ha 93
(ICMBio, 2016). 94
- Arroio Pedregulho (25°6'6.10' S; 53°18'41.26' W), afluente do rio do Salto está 95
localizado na região rural do distrito Rio do Salto (Cascavel-PR); o local de coleta está 96
incluso em uma unidade de conservação particular, localizada no Sítio Paraíso. 97
- Córrego Arquimedes (25º09.177' S 53º16.657' W), afluente do Rio do Oeste, situado na 98
área rural próximo ao distrito Rio do Salto (Cascavel-PR). 99
41
100
Fig.1. Mapa com indicação dos pontos de coleta. 1. Rio Manoel Gomes, 2. Arroio 101 Pedregulho, 3. Córrego Arquimedes. 102 103
Os pontos de coleta nos riachos foram classificados em função do uso do solo, 104
com auxílio do programa Google Earth Pro®. Em cada riacho foi definido um polígono 105
a partir dos pontos mais altos da microbacia, seguindo à montante a partir do ponto de 106
coleta. Em seguida, foram delimitadas áreas de remanescentes florestais e áreas rurais 107
dentro do polígono, definindo-se, assim, percentuais dessas áreas dentro de cada 108
microbacia. 109
Para a região em estudo foi também avaliado o período de plantio de cultivares 110
(milho e soja) no ano de 2015. O período de plantio e os primeiros dias de crescimento 111
dos cultivares está associado ao uso de pesticidas para o controle de pragas. Tais 112
informações foram obtidas a partir dos dados da Secretaria da Agricultura e do 113
Abastecimento do Paraná (SEAB, 2016). 114
115
2.2 Análise das variáveis abióticas 116
Nas estações de Outono e Inverno, a temperatura, pH, oxigênio dissolvido, 117
condutividade e sólidos totais foram coletadas com o uso de uma sonda multiparâmetros 118
de qualidade da água Horiba U-50. 119
120
42
2.3 Análise de água 121
Na estação de inverno foram realizadas coletas de amostra água dos riachos, sendo 122
amostrados 5L de água, acondicionados em frascos âmbar, devidamente refrigerados e 123
posteriormente, encaminhados para o Laboratório de Qualidade de Água e Limnologia 124
da Universidade Federal do Paraná, em Palotina-PR. As variáveis analisadas foram DBO, 125
sólidos suspensos totais, sólidos totais fixos, sólidos totais voláteis, sólidos totais, fósforo 126
total, N-NH4, N-NO3, N-NO2, N-org, seguindo a metodologia do Standart Methods 127
(APHA, 1998). 128
Os valores obtidos para cada ponto de amostragem foram utilizados para a 129
conferência com os parâmetros de referência de águas Classe 1, definidos na resolução 130
n.357/2005 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) (Conama, 2005), 131
conforme segue: 132
Classe 1: águas que podem ser destinadas: 133 a) ao abastecimento para consumo humano, após tratamento 134
simplificado; 135 b) à proteção das comunidades aquáticas; 136 c) à recreação de contato primário, tais como natação, esqui aquático e 137 mergulho, conforme Resolução CONAMA no 274, de 2000; 138 d) à irrigação de hortaliças que são consumidas cruas e de frutas que se 139 desenvolvam rentes ao solo e que sejam ingeridas cruas sem remoção 140 de película; e 141 e) à proteção das comunidades aquáticas em Terras Indígenas. 142
143 2.4 Análises de sedimento dos Riachos 144
No inverno foi realizada uma análise de resíduos de pesticidas em sedimento dos 145
riachos, no período de inverno, para caracterização da contaminação ambiental. Em cada 146
ponto amostrado foi coletado cerca de 1kg de sedimento dos riachos, acondicionado em 147
saco plástico e posteriormente encaminhado para o Laboratório de Análises Agro-148
Ambientais (LAAA), da Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Os compostos 149
organoclorados e organofosforados foram analisados segundo a metodologia descrita por 150
Fernandes et al. (2012), e expressos em partes por bilhão (ppb). 151
152
2.5 Análise do material biológico 153
A amostragem de material biológico foi realizada em duas coletas, a primeira no 154
Outono (março/abril-2015) e a segunda, no Inverno (agosto-2015). A técnica de pesca 155
elétrica foi utilizada em um trecho de 50 m do rio, sendo realizadas três passadas 156
sucessivas, com duração aproximada de 40 minutos, no sentido jusante-montante. Após 157
as capturas, os peixes foram anestesiados em cepacaína e realizada a secção medular, 158
seguindo os procedimentos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal 159
43
da Universidade Estadual do Oeste do Paraná. Os animais após eutanasiados, tiveram 160
suas vísceras retiradas e em seguida congelados em nitrogênio líquido. 161
Na estação de Outono foram amostrados 35 peixes e no Inverno, 27 peixes. Após 162
as coletas, o material biológico foi encaminhado ao Laboratório de Ecologia de Peixes da 163
Universidade Estadual do Oeste do Paraná, descongelados, porém mantidos resfriados. 164
Os animais foram devidamente pesados (peso total, peso visceral e peso gonadal) e 165
mensurados (comprimento padrão e comprimento total). 166
167
2.6 Dosagem enzimática associada com neurotoxicidade 168
A quantificação de proteína das amostras foi determinada pelo método de 169
Bradford, utilizando albumina de soro bovino como padrão (Bradford, 1976). 170
As porções do cérebro e parte da musculatura do pedúnculo caudal foram 171
separadas, homogeneizadas em 2 mL de tampão fosfato pH 7,4 e centrifugados a 9.500 g 172
por 10 minutos, a 4°C. Em seguida, a análise da atividade da enzima colinesterase (ChE) 173
foi realizada com o objetivo de avaliar o efeito de possível contaminação por pesticidas 174
organofosforados e carbamatos. A análise foi realizada por meio do método de Ellman et 175
al. (1961), modificado para microplaca por Silva de Assis (1998), cujo princípio é a 176
mensuração da produção da tiocolina quando a acetiltiocolina é hidrolisada. Isso é feito 177
pela reação contínua do tiol com o íon 5: 5 ditiobis-2-nitrobenzoato para produzir o anion 178
amarelo do ácido 5-tio-2-nitrobenzóico. 179
A reação foi realizada em triplicata, em 300 uL de solução contendo 0,05mM de ácido 180
5,5′-Ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB) e 1,5mM de Acetiltiocolina (ATC). Foi calculada 181
a atividade da ChE em relação a concentração de proteína (mg/mL), usando o coeficiente 182
de extinção molar do DTNB (1,36mM-1.cm-1). A quantificação da proteína foi calculada 183
a partir da amostra bruta e a leitura realizada a 22°C. Os resultados foram expressos em 184
nmol.min-1. mg proteína-1. 185
186
2.7 Dosagem enzimática associada com sistema antioxidante 187
Outra porção da musculatura do pedúnculo caudal foi homogeneizada em tampão 188
Tris HCl pH 7,4, na proporção de 1:5, e centrifugadas a 13680g por 10 minutos, a 4°C. 189
A partir deste homogenato, foram realizadas as análises de estresse oxidativo. 190
A determinação da lipoperoxidação (LPO), com objetivo de quantificar 191
indiretamente os peróxidos produzidos refletindo a intensidade da peroxidação lipídica 192
(Lushchak et al., 2009), foi realizada por meio do método de TBARS, mensurada a 193
44
absorbância de 535nm (Buege e Aust, 1978), a partir de comparação com curva de 194
padrões de Malondialdeído (MDA), principal subproduto de peroxidação lipídica celular. 195
Para preparação da amostra o meio contendo alíquota de 0,33 mg/mL de proteína da 196
amostra em ácido tricloroacético (TCA) 6,7% em volume final de 180 μL, foi agitado em 197
vórtex, deixado em banho de gelo por 5 minutos e centrifugado por 5 minutos a 13680 198
rpm a 4 ºC. Para a dosagem das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), 40 199
uL do sobrenadante, assim como de diferentes concentrações de MDA foram adicionados 200
em microplaca, em triplicata, a meio de reação contendo 21,42 mM de TBA, 17,86 mM 201
de NaOH (utilizado para solubilização do TBA), 0,73 M de TCA, 0,032mM de BHT, 202
etanol 3% (utilizado para solubilização do BHT) em PBS. A leitura da reação foi realizada 203
à 22°C, após 60 minutos de incubação a 60 oC. A peroxidação lipídica foi estimada a 204
partir da curva de MDA e os resultados foram expressos como nmol de MDA. mg de 205
proteína-1 . 206
A atividade da superóxido dismutase (SOD) foi avaliada de acordo com o método 207
proposto por Crouch et al. (1981) modificado. O princípio desta análise consiste em 208
quantificar o azul de tetrazolium (NBT), mensurada a 560nm durante 1,5 hora. Em meio 209
de reação, a SOD realiza reação de dismutação do íon superóxido a peróxido de 210
hidrogênio, diminuindo a capacidade de oxidação do NBT. Uma alíquota de 0,75 mg/mL 211
de proteína em etanol 25% foi preparada em volume de 800 μL e centrifugada a 13680 g 212
(4 °C) durante 20 min. A partir do sobrenadante o meio de reação foi preparado em 213
microplaca de 96 poços. Em triplicatas, em volume final de 200uL contendo 0,1 mg de 214
proteína.mL-1, 0,09 mM de NBT, 0,015 mM de EDTA, 34,78 mM de sulfato de 215
hidroxilamina, 79 mM de tampão carbonato de sódio pH 10,2 e a placa lida à 22°C. Os 216
valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos em U/mg de proteína. 217
Uma unidade de atividade de SOD é definida como a quantidade de enzima que inibe a 218
reação de oxidação de NBT por 50% da inibição máxima. 219
A atividade da Catalase (CAT) foi acompanhada pelo decréscimo da absorbância 220
a 240nm (Aebi, 1984), a partir do princípio de dismutação do peróxido, cujo coeficiente 221
de extinção molar é de 40 -1.cm-1. Nas duplicatas, em 2 mL de solução em uma cubeta 222
de quartzo, a amostra apresentou concentração final de 0,01 mg de proteína.mL-1, sendo 223
que o meio de reação apresentou concentrações finais de 13,5mM de H2O2, 50 mM de 224
TRIS-HCl pH 8,0 e 0,25 mM de EDTA. 225
O princípio da análise da atividade enzimática da Glutationa transferase (GST) é 226
de que a GST catalisa a conjugação da GSH com o substrato sintético CDNB que produz 227
45
um conjugado detectado em 340nm (Habig et al., 1976). Durante o ensaio, a atividade 228
enzimática é proporcional à velocidade de produção do composto conjugado. O ensaio 229
foi realizado em triplicata, em microplaca, sendo que a amostra apresentou concentração 230
final de 0,020 mg de proteína.mL-1. O meio de reação apresentou concentrações finais de 231
0,94 mM de CDNB e 0,94 mM de GSH. A leitura foi feita à 22°C. O coeficiente de 232
extinção molar do conjugado GSH/CDNB é 9,6 mM-1.cm-1 e a unidade foi expressa em 233
mmol.min-1.mg de proteína-1. 234
A Glutationa redutase catalisa a redução da glutationa dissulfeto (GSSG) através 235
da oxidação do NADPH, cujo decréscimo de absorbância é medido a 340nm (Sies et al., 236
1979). O ensaio foi realizado em duplicata, em microplaca, o meio de reação apresentou 237
concentrações finais de 0,138 mM de NADPH, 3,81 mM de GSSG e 3,75 mM de EDTA. 238
A reação foi realizada à 22°C. O coeficiente de extinção molar do NADPH é 6,22 mM-239
1.cm-1. A unidade foi expressa em mmol.min-1.mL-1.mg de proteína-1. 240
241
2.8 Análise estatística 242
Todas as análises listadas a seguir foram realizadas no programa R (Core Team, 243
2015). As variáveis biométricas (comprimento total, comprimento padrão, peso total, 244
peso das vísceras e peso das gônadas) e bióticas (ChE, LPO, CAT, SOD) foram 245
comparadas para cada ponto entre as estações, tendo a normalidade verificada pelo teste 246
de Shapiro-Wilk e a homogeneidade das variâncias por meio do teste F. Quando em 247
normalidade e homogeneidade, as variáveis foram analisadas por meio do teste 248
paramétrico T para amostras independentes, e quando não atendiam tais pressupostos, foi 249
aplicado o teste não paramétrico de Mann-Whitney-U. Em caso de apenas normalidade, 250
foi realizado o teste T de Welch para variâncias não equivalentes. 251
As matrizes das variáveis abióticas (vegetação e pesticidas) e bióticas (ChE, 252
catalase, lipoperoxidação, superóxido dismutase) foram analisadas por meio da análise 253
de componentes principais (PCA), utilizando o pacote Psych (Revelle, 2015). Para 254
aplicação desta análise, inicialmente foi verificada a normalidade multivariada dos dados 255
pelo teste de Márdia, utilizando o pacote MVN (Korkmaz et al., 2014). Uma vez que tal 256
pressuposto não fora atendido, a análise foi realizada aplicando uma matriz de correlação 257
de Spearman. As cargas fatoriais resultantes dos componentes principais foram avaliadas 258
quanto sua significância por meio da Análise da Variância (Anova) fator duplo, 259
considerando os locais e as estações como fatores fixos. A análise foi realizada utilizando 260
o pacote Agricolae (Mendiburu, 2016), após a verificação do padrão de normalidade dos 261
46
resíduos. O teste de acompanhamento utilizado foi o Least Significant Difference (LSD). 262
Em todos os testes estatísticos o nível de significância utilizado foi de 0.05. 263
3. Resultados 264
265
3.1 Período de plantio nas regiões próximas aos locais de coleta 266
A partir das informações obtidas pela SEAB, foi verificado que o maior percentual 267
de área em plantio ocorreu nos meses de março e abril de 2015, atingindo 79% do total 268
da área destinada ao plantio na região oeste do estado do Paraná (Fig. 2). 269
270
Fig. 2. Percentual de área de plantio na região oeste do Paraná. SEAB, 2016. 271
272
3.2 Variáveis abióticas e análise de água dos riachos 273
As variáveis abióticas analisadas encontraram-se em acordo com os parâmetros 274
de águas Classe 1 estabelecidos pela resolução Nº 357/2005 do CONAMA. A única 275
exceção foi para a variável DBO do rio Manoel Gomes, que apresentou valores elevados 276
quando comparados ao valor de referência. Para esta variável, este riacho foi classificado 277
em águas de Classe III, as quais podem ser destinadas ao abastecimento para consumo 278
humano, após tratamento convencional ou avançado; à irrigação de culturas arbóreas, 279
cerealíferas e forrageiras; à pesca amadora; à recreação de contato secundário; e à 280
dessedentação de animais (Tabelas 1 e 2). 281
47
Tabela 1 282 Análise de parâmetros físicos e químicos das águas dos riachos obtidos nas estações de 283 Outono e Inverno. 284
VARIÁVEIS P1 P2 P3 VR
Outono Inverno Outono Inverno Outono Inverno
TEMPERATURA 15,73 18,85 16,34 17,18 16,46 17,15 na
PH 7,07 6,9 6,37 7,02 6,53 7,10 6,0-9,0
OD (MG L-1) 9,37 9,20 12,25 9,17 10,47 10,95 6,0
ST (G L-1) 0,027 0,03 0,00 0,019 0,019 0,013 na
P1 – Rio Manoel Gomes. P2 – Arroio Pedregulho. P3 – Córrego Arquimedes. VR - Valores de Referência 285 da Resolução n. 357/2005 do CONAMA para águas classe I – destinadas ao abastecimento para consumo 286 humano, após tratamento simplificado. OD- Oxigênio Dissolvido; ST- Sólidos Totais. na – valor de 287 referência ausente. 288 289 Tabela 2 290 Análise de parâmetros físicos e químicos das águas dos riachos obtidos no Inverno. 291
VARIÁVEIS P1 P2 P3 VR
FÓSFORO (MG.L-1) 0 0,071 0 0,1
NITRITO (MG.L-1) 0,0025 0,0070 0,0060 1,0
DUREZA (MG.L-1) 17,3 12,7 9,6 na
ALCALINIDADE (MG.L-1) 31,3 22,1 31,6 na
DBO(MG.L-1) 8* 0,2 0,2 3,0
STV (MG.L-1) 10 58 28 na
STF (MG.L-1) 60 12 50 na
STD (MG.L-1) 38 70 48 500mg
SS (MG.L-1) 31 0 30 na
P1 – Rio Manoel Gomes. P2 – Arroio Pedregulho. P3 – Córrego Arquimedes. VR - Valores de Referência 292 da Resolução n. 357/2005 do CONAMA para águas classe I – destinadas ao abastecimento para consumo 293 humano, após tratamento simplificado. DBO – Demanda Bioquímica de Oxigênio; STV- Sólidos Totais 294 Voláteis; STF- Sólidos Totais Filtrados; STD- Sólidos Totais Dissolvidos; SS- Sólidos Suspensos. na – 295 valor de referência ausente. 296 297
3.3 Análise de sedimento dos riachos 298
Dentre os pesticidas analisados foram identificados os organofosforados 299
Disulfoton, Metil Paration e Ronnel Fenclorfos. O local com maior concentração de 300
pesticidas foi o rio Manoel Gomes (P1), o qual se localiza no interior do Parque Nacional 301
do Iguaçu, seguido pelo Córrego Arquimedes (P2), localizado em área rural. O arroio 302
Pedregulho (P3), localizado em uma unidade de conservação particular, não apresentou 303
contaminação por pesticidas (Tabela 3). 304
48
Tabela 3 305 Análise da concentração de pesticidas nas amostras de sedimento dos riachos. 306
AGROTÓXICO (PPB) P1 P2 P3
DISULFOTON 6,81 0 0
METIL PARATION 6,35 0 6,31
RONNEL FENCLORFOS 0,83 0 0
TOTAL 13,99 0 6,31
P1 – Rio Manoel Gomes. P2 – Arroio Pedregulho. P3 – Córrego Arquimedes. 307
308
3.4 Caracterização das variáveis biométricas 309
Em cada uma das localidades em estudo, foi possível verificar que os animais 310
coletados apresentaram valores semelhantes quanto ao comprimento total, comprimento 311
padrão, peso total, peso das vísceras e peso das gônadas (Tabela 4). Apenas os exemplares 312
coletados no rio Manoel Gomes, na estação de Inverno (1,65±0,83 g), apresentaram pesos 313
das gônadas significativamente maiores do que os exemplares coletados no Outono 314
(0,27±0,30 g) (W=4; p=0,0007). 315
316 Tabela 4 317 Médias e Desvios-Padrão das variáveis biométricas de R. branneri. 318
Rio Manoel Gomes Arroio Pedregulho Córrego Arquimedes p
Outono Inverno Outono Inverno Outono Inverno
CT (cm) 13,7±3,65 12,4±3,03 14,1±4,77 16,4±1,62 12,0±4,24 9,8±3,31 > 0,05
CP (cm) 11,4±3,00 10,4±2,60 10,8±3,71 13,8±1,34 10,1±3,67 8,3±2,74 > 0,05
PT (g) 27,1±23,72 23,0±14,24 29,8±27,59 43,2±16,62 18,6±17,54 12,0±14,32 > 0,05
PV (g) 2,5±2,40 3,6±2,20 3,4±3,23 7,1±5,58 2,3±2,88 1,5±2,07 > 0,05
PG (g) 0,3±0,30 1,6±0,83* 0,4±0,55 3,3±3,77 0,6±0,38 0,9±1,35
0,000
7
n 13 10 7 2 15 15 62
CT: Comprimento total; CP: Comprimento padrão; PT: Peso total; PV: Peso visceral; PG: Peso gonadal. 319 * p<0,05 no teste Mann-Whitney-U. 320 321
3.5 Análise enzimática da neurotoxicidade e estresse oxidativo de R. branneri 322
Ponto 1 – rio Manoel Gomes: no outono, houve uma baixa atividade da ChE tanto do 323
cérebro (t=-7,73, p=0,0001) quanto do músculo (W=3, p<0,0001). No músculo também 324
foi observado baixa atividade da GR (W=11, p=0,0068), altos níveis de LPO (W=4, 325
p=0,00075) e da atividade da SOD (t=5,53, p<0,001). Já a atividade da catalase (W=43, 326
p=0,53) e da GST (W=58, p=0,12) não apresentaram diferença significativa entre as 327
estações (Fig. 3). 328
49
Ponto 2 – Arroio Pedregulho: houve diminuição significativa na atividade 329
colinesterásica muscular no outono (W=3, p<0,001). Não houve diferença significativa 330
para a ChE do cérebro (W=0, p=0,055), GR (W=2, p=0,8), LPO (W=2, p=0,75), Catalase 331
(W=4, p=0,5) e GST (W=10, p=0,095) entre as estações. Vale ressaltar a significância 332
limítrofe da variável SOD (W=14, p=0,055) (Fig. 3). 333
Ponto 3 – Córrego Arquimedes: no outono houve baixa atividade da ChE para cérebro 334
(t=-4,73, p=0,0002) e músculo (t=-6,345, df=25, p<0,001) e também da atividade da GR 335
(W=4, p=0,00068), e alta atividade da SOD (t=16,237, df=14,291, p<0,001). As análises 336
de LPO, Catalase e GST não apresentaram diferenças significativas entre as estações 337
(W=36, p=0,80; W=81,5, p=0,47; t=1,08, df=21, p=0,29 respectivamente) (Fig. 3). 338
339
Por meio da análise multivariada, foi verificada a associação entre os 340
biomarcadores e os locais nas estações de Inverno e Outono a partir da interpretação dos 341
componentes principais. Nesta análise são definidas cargas fatoriais, as quais são 342
correlações de cada variável com componente principal, sendo este uma nova variável 343
definida pelo conjunto destas associações. 344
O primeiro componente principal foi definido como a variação dos Biomarcadores 345
em função das Estações do Ano (Autovalor=2,71; Variabilidade=30%). Os escores 346
negativos do primeiro componente principal representam os valores obtidos no Outono, 347
sendo que a reação de LPO e a atividade da SOD e GST foram mais elevados, enquanto 348
os valores de ChE, tanto do cérebro quanto do músculo, foram mais baixos em todos os 349
pontos de coleta. Vale ressaltar que a atividade da GR foi menor para o rio Manoel Gomes 350
e para o córrego Arquimedes. Os escores positivos representam os valores observados no 351
Inverno, sendo, portanto, um cenário oposto ao observado no outono (Tabela 5 e Fig.4). 352
O segundo componente principal representa a associação com ocorrência de 353
Pesticidas (Autovalor=2,17; Variabilidade=24%). Pode-se notar que o rio Manoel Gomes 354
apresentou forte associação com valores altos de pesticida, sendo o local com maior % de 355
vegetação em suas margens (Fig. 4). 356
357
50
358
Fig. 3. Box plots dos biomarcadores avaliados no rio Manoel Gomes, Arroio Pedregulho 359 e Córrego Arquimedes. A) Colinesterase Cerebral; B) Colinesterase Muscular; C) 360 Glutationa Redutase; D) Lipoperoxidação; E) Superóxido Dismutase; F) Catalase; G) 361 Glutationa Transferase. 362
51
Tabela 5 363 Autovalores e variâncias acumuladas para cada eixo, e respectivas cargas fatoriais. 364
CP1 CP2
LPO -0.25 0.22
CAT 0.31 0.24
ChE_C 0.83 0.06
ChE_M 0.82 -0.15
SOD -0.68 -0.57
GST -0.46 0.31
GR 0.67 0.18
Pesticidas -0.18 0.91
Vegetação -0.17 0.87
Autovalor 2,71 2,17
% variância acumulada 30% 54%
As variáveis que foram mais importantes para a interpretação estão destacadas em negrito 365
366
367
Fig. 4. Diagrama de Ordenação das variáveis bióticas (biomarcadores) e abióticas 368 (Vegetação e Pesticida) derivadas da análise de componentes principais. LPO – 369 Lipoperoxidação; CAT – Catalase; ChE_C – Colinesterase cerebral; ChE_M – 370 Colinesterase muscular; SOD – Superóxido Dismutase. Go – rio Manoel Gomes; Pe – 371 Arroio Pedregulho; Ar – Córrego Arquimedes. O – Outono; I – Inverno. 372
52
As cargas fatoriais do componente principal 1, que representa as variações dos 373
biomarcadores em função das estações, apresentaram diferenças significativas para as 374
estações (F=286,0; p<0,0001) e para os locais (F=6,238; p=0,004), não havendo interação 375
entre local e estação (F=2,701; p=0,076) (Fig. 5A). As cargas fatoriais do componente 376
principal 2, que representam a distribuição de pesticidas, apresentaram diferenças 377
significativas para as estações (F=32,01; p<0,0001), entre os locais (F=405,54; p<0,0001) 378
e a interação entre local e estação (F=10,91; p=0,0001) (Fig. 5B). 379
380 381
382
Fig. 5. Médias e Desvios Padrão das cargas fatoriais do primeiro e segundo componente 383 principal. Letras indicam diferenças estatísticas entre as localidades avaliadas nas 384 respectivas estações (LSD-Fisher; p<0,05). 385
386
387 4. Discussão 388
389 Nas amostras de solo analisadas foram encontrados os organofosforados 390
Disulfoton, Metil Paration, Ronnel Fenclorfos. O Disulfoton (C8H19O2PS3) é um 391
organofosforado de elevada toxicidade, seu efeito residual é longo, comparado a outros 392
organofosforados, agindo cerca de 40 dias (Nakano et al., 1992). O Metil Paration 393
(C8H10NO5PS) é um dos inseticidas mais antigos, sendo instável em meio alcalino 394
(Nakano et al., 1992). Dentro da classificação toxicológica de acordo com a Portaria da 395
Secretaria Nacional de Vigilância Sanitária (SNVS) nº10 de 1985, está enquadrado como 396
muito tóxico (Ferreira et al., 2010) (Ferreira et al., 2010). Já o Ronnel Fenclorfos 397
(C8H8Cl3O3PS) tem sido utilizado para controlar artrópodes ecto e endoparasitas, 398
apresentando risco semelhante a todos os demais organofosforados (PubChem, 2016). 399
53
Foi evidenciado que os meses de março e abril apresentaram maior área de plantio. 400
A realização de controle químico contra pragas vegetais depende de uma série de 401
características do próprio patógeno, como por exemplo, pico populacional de adultos 402
(Silveira-Neto et al., 1992) e abundância por área de plantio (EMBRAPA, 2005). 403
Contudo, é fato que a partir do momento do plantio e desenvolvimento do cultivar, se 404
inicia a aplicação de agroquímicos. 405
Os três riachos avaliados apresentaram diferenças quanto as características físicas 406
e químicas. Enquanto o rio Manoel Gomes está localizado em uma Unidade de 407
Conservação, contendo 100% de área vegetal no entorno de sua microbacia, também foi 408
o riacho com maior concentração de agrotóxicos em seu sedimento (14 ppb). O arroio 409
Pedregulho também está em uma Unidade de Conservação (RPPN), com 75% de área 410
vegetal no entorno de sua microbacia, porém sem a detecção de pesticidas. Por fim, o 411
córrego Arquimedes apresenta a menor área de vegetação em sua microbacia (66%), com 412
a detecção de 6,31 ppb de Metil Paration. Estas observações, bem como as características 413
de aplicação de agrotóxicos nos períodos estudados serão a base de argumentação para 414
os resultados encontrados no presente estudo. 415
Dentre os biomarcadores avaliados, foi possível verificar menor atividade 416
colinesterásica, tanto no cérebro quanto no músculo, durante o outono em todos os locais 417
de coleta. O fato de apresentar baixos níveis da atividade das enzimas colinesterases, 418
independentemente da estrutura dos locais, pode estar relacionado à contaminação 419
provinda da aplicação de pesticidas nos arredores dos locais em estudo, a qual se dá 420
principalmente nos meses de março e abril (Outono). Por meio da lixiviação no solo, estes 421
agrotóxicos podem atingir o leito de riachos, promovendo a reação de inibição de 422
atividade enzimática das colinesterases em organismos não alvo (Fonseca et al., 2008; 423
Nakano et al., 1992; Pessoa et al., 2011; Silva et al., 2013; Sturm et al., 1999). Pesquisas 424
demonstraram resultados de inibição da atividade das enzimas colinesterásicas em 425
espécies de jundiás (Cattaneo et al., 2008; Crestani et al., 2007), assim como em 426
Prochilodus lineatus expostos a água de rios com maiores níveis de pesticidas (Vieira et 427
al., 2016). 428
Ainda no período de Outono, os animais coletados no rio Manoel Gomes 429
apresentaram maior atividade de reação de lipoperoxidação, fato que não foi observado 430
nos demais riachos. Uma grande variedade de espécies reativas de oxigênio atinge os 431
lipídeos celulares promovendo a reação de lipoperoxidação. O radical hidroxil (OH.), por 432
exemplo, pode ser gerado fora da membrana e atuar sobre os carboidratos e as proteínas 433
54
extrínsecas (ex. glicoproteínas da superfície de membrana), bem como nas porções 434
polares fosfolipídicas. A partir do início da lipoperoxidação ocorre uma reação em cadeia 435
de radicais livres. Certamente este dano oxidativo no glicocálix pode afetar a função 436
celular e contribuir com inúmeras patologias (Halliwell, Gutteridge, 2015). 437
Inúmeros são os registros de lipoperoxidação causado pela contaminação por 438
agrotóxicos. Jundiás expostos aos herbicidas glifosato (Menezes et al., 2011a) e 439
Clomazone (Menezes et al., 2011b) tiveram os níveis de TBARS aumentados, tanto no 440
músculo quanto no fígado, assim como àqueles expostos ao Metil Paration (Ferreira et 441
al., 2010; Isik and Celik, 2008; Monteiro, 2006) e Tebuconazole (Ferreira, 2010). Bueno-442
krawczyk et al. (2015) e Vieira et al. (2016) alegaram que o aumento das reações de 443
lipoperoxidação está associado a contaminação com pesticidas em ambientes rurais, o 444
que também é observado no presente estudo. 445
No rio Manoel Gomes e no córrego Arquimedes, a atividade da SOD apresentou 446
valores elevados durante os meses de Outono. Ressalta-se que no arroio Pedregulho 447
também foi evidenciado tal fato, porém com significância limítrofe (p<0,10). A enzima 448
SOD apresenta papel fundamental no sistema antioxidante, uma vez que realiza a 449
dismutação sobre a espécie reativa ao oxigênio superóxido. O peróxido resultante desta 450
reação pode desencadear inúmeras outras reações, como por exemplo a ação da enzima 451
catalase e da glutationa peroxidase, as quais realizam a transformação de H2O2 em água 452
e oxigênio (Halliwell and Gutteridge, 2015). 453
Duas questões podem estar relacionadas aos resultados encontrados: a indução da 454
SOD pela presença de agrotóxicos e outros poluentes ambientais, ou indução pela 455
variação da temperatura da água. Existem registros bastante variados da ação de 456
agroquímicos sobre a atividade da SOD. Em Oncorhynchus mykiss, Paration Metílico não 457
altera a atividade da SOD muscular, enquanto o organofosforado Diazinon causa 458
oscilação na atividade desta enzima (Isik e Celik, 2008). Em Brycon cephalus, Paration 459
Metílico elevou a atividade da SOD (Monteiro, 2006) e em Rhamdia quelen, o glifosato 460
não demonstrou influenciar a SOD muscular (Menezes et al., 2011a). Em situações com 461
temperaturas mais elevadas observa-se aceleração do sistema de defesa antioxidante 462
enzimática, elevando-se a atividade da SOD para a espécie Oryzias latipes quando 463
acondicionado a 30oC (Hemmer-Brepson et al., 2014), para Heteropneustes fossilis a 464
37oC (Prakash et al., 1998) e para Pimephales promelas a 25oC (Clotfelter et al., 2013). 465
Porém, Radovanović et al. (2010) demonstraram que houve aumento da atividade da SOD 466
em temperaturas mais amenas de primavera quando comparadas às temperaturas de verão 467
55
para a espécie de peixe Barbus barbus. O estresse promovido por temperaturas mais 468
elevadas pode inibir a atividade da enzima, sendo a temperatura de inibição enzimática é 469
uma característica intrínseca de cada espécie (Bueno-krawczyk et al., 2015; Pavlović et 470
al., 2013). 471
A enzima GR apresentou menor atividade nos rios Manoel Gomes e córrego 472
Arquimedes nos meses de Outono. Esta enzima atua na redução de glutationa oxidada 473
(GSSG) a glutationa reduzida (GSH) às custas da presença de NADPH (van der Oost et 474
al., 2003). A inibição da GR na presença de agrotóxicos é fato já relatado na literatura 475
(Ballesteros et al., 2009; Zhang et al., 2004). Estas respostas inibitórias podem ser 476
resultado do feedback negativo promovido pelo aumento de GSH (Tekman et al., 2008) 477
ou ainda, pode ocorrer a inibição de sua atividade pela presença de aldeídos endógenos, 478
resultantes da peroxidação lipídica, potencializando o dano oxidativo já em processo 479
(Vander Jagt et al., 1997). 480
Apesar da atividade da catalase e GST não apresentarem diferenças significativa 481
neste trabalho, na análise de componentes principais observa-se que há valores 482
diminuídos para a catalase e aumentados para GST. Em relação a catalase, situação 483
semelhante foi relatado por Zhang et al. (2004), quando observou indução da atividade 484
da SOD e inibição da catalase. Este fato pode ser decorrência dos elevados valores de 485
H2O2 resultantes da dismutação do superóxido, que consequentemente levam a inibição 486
da CAT (Kono and Fridovich, 1982); a reação de degradação de H2O2 pode, 487
primeiramente, ser desempenhada pela GPx, ou ainda ser inibida por ação direta de algum 488
xenobiótico (Arbo et al., 2006). Já a GST está relacionada com a defesa do DNA e 489
lipídios, bem como com a catálise da conjugação dos compostos eletrofílicos com a GSH 490
(van der Oost et al., 2003). Esta enzima pode ser inibida por xenobióticos durante o 491
processo detoxificação, devido a sua interação com estes compostos durante processo de 492
conjugação da GSH por ela catalisado (Al-Ghais e Ali, 1999; Frasco e Guilhermino, 493
2002). 494
O sistema antioxidante funciona em uma reação em cadeia que pode ser induzido 495
como uma resposta compensatória a um pequeno estresse, como também pode ter a 496
atividade das enzimas suprimidas por um severo estresse, em função dos danos e perdas 497
do mecanismo compensatório (Zhang et al., 2004). No presente estudo, foram observados 498
elevados valores para LPO e SOD concomitantes à inibição da GR em períodos de 499
Outono, quando há alta aplicação de pesticidas e no rio Manoel Gomes, onde foram 500
detectadas as maiores concentrações de pesticidas no sedimento. 501
56
O conhecimento das relações entre as diferentes vias do sistema antioxidante 502
enzimático pode auxiliar na explicação dos resultados encontrados. O influxo de 503
compostos geradores de superóxido, assim como outras espécies reativas podem estar 504
relacionadas a estes resultados, atuando em diferentes pontos do equilíbrio do 505
metabolismo oxidante/antioxidante. Altos níveis de superóxidos induzem a atividade da 506
SOD gerando peróxido de hidrogênio, que em altas concentrações poderiam impedir o 507
aumento concomitante da atividade catalase. O alto nível de LPO, pode atuar na geração 508
de 4-hidroxinonenal, modificando os resíduos redox-ativo de cisteína que participam no 509
sítio catalítico da GR (Vander Jagt et al., 1997) explicando, por sua vez, os baixos níveis 510
de atividade da GR. 511
Observando a resposta dos biomarcadores apresentadas neste trabalho, 512
verificamos que, apesar de haver forte indicação da alteração da SOD estar relacionada à 513
variação temporal (SOD), a resposta dos demais biomarcadores (ChE Muscular, ChE 514
Cerebral, LPO) demonstram forte evidência da interação do período de coleta com à 515
exposição desses animais à compostos agroquímicos. 516
517
5. Conclusão 518
519
As análises de biomarcadores de estresse oxidativo e de efeitos neurotóxicos 520
demonstraram que exemplares de Rhamdia branneri, espécie considerada endêmica para 521
a bacia do baixo rio Iguaçu, apresentaram diferentes comportamentos em função das 522
estações do ano, apresentando evidências de estarem em contato com agentes oxidantes 523
e anticolinesterásicos, principalmente no Outono. Apesar dos riachos estarem localizados 524
em regiões com ampla vegetação circundante e em áreas de proteção ambiental, as 525
análises de solo mostram que resíduos de pesticidas ainda assim atingem estas 526
localidades. 527
Uma vez que uma espécie bioindicadora apresenta alterações em seu sistema 528
antioxidante, bem como efeitos de neurotoxicidade, em função da sazonalidade e da 529
presença de agroquímicos em regiões com vegetação amplamente preservada, tais 530
resultados alertam para se ter atenção redobrada no sentido de fiscalização de uso de 531
produtos químicos em regiões próximas a áreas de preservação ambiental. 532
533
534
535
57
Agradecimentos 536
À agência de fomento Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – 537
CAPES. 538
539
Referências 540 541 Abucarma, M., Martins-Santos, I.C., 2001. Karyotype and B Chromosome of Rhamdia 542
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