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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ - UNIOESTE CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO “STRICTO SENSU” EM ENGENHARIA QUÍMICA – NÍVEL MESTRADO

ESTUDO DO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE PROTEÍNA MICROBIANA

POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO SUBPRODUTOS

DO PROCESSAMENTO DE TRIGO

HUILIAN COLPO

TOLEDO – PR – BRASIL

Fevereiro de 2015

HUILIAN COLPO

ESTUDO DO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE PROTEÍNA MICROBIANA

POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO SUBPRODUTOS

DO PROCESSAMENTO DE TRIGO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química em cumprimento parcial aos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química, área de concentração em Processos Químicos e Bioquímicos.

Orientadora: Profª. Dra. Mônica Lady Fiorese

TOLEDO – PR – BRASIL

Fevereiro de 2015

iii

Aqueles que nunca deixaram de apoiar as decisões tomada,

Valcir e Mairi pai e mãe!

Dedico

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus por todos os dons concedidos, pela coragem e força que me deste

todas as vezes em que precisei enfrentar uma realidade completamente diferente

e distante das pessoas amadas

À TODA a minha família, que sempre me apoiaram e me incentivaram nas

escolhas feitas.

Aos meus pais Valcir e Mairi, e a minha irmã Débora, por todo o apoio e

amor, tão necessário nesses dois anos de dedicação exclusiva ao Mestrado;

A Gercica por me apoiar e fazer a diferença.

À Professora Dra. Mônica L. Fiorese, por toda orientação, atenção,

conselhos, ajuda acadêmica, profissional e paciência neste período.

A empresa Candon Aditivos para Alimentos (Cassandro, Marlise, Fábio,

Sônia, Fabiane, Andréia, Sebastião), enfim a todos os colegas de trabalho que

passavam pelo laboratório incentivando durante as fermentações. Aos diretores

pelo suporte com material e com o espaço, só assim foi possível a realização deste

trabalho.

Ao Amauri e Ivanete (tios) por todo o apoio e visitas durante este período.

Ao estagiário (Tárcio), pela ajuda e suas frases de “motivação”

Aos alunos de iniciação científica, Juliana, Gabriela, Aline e Marco.

A Bárbara por toda a ajuda em ensaios, matérias, protocolos e informações.

Grettya pelas infinitas ajudas no laboratório na estatística.

Aos Professores Dr. Salah e Ms. Fabiano pelo auxílio na estatística e pelas

sugestões.

Aos amigos que deixei em “Catarina” nesses dois anos, Danimar, Rafael,

Ede, Juones, Aladiones, Vande, Edson, Ihan, Luana e Jake. Como diria o poeta

Steve Stifler (que esta festa nunca termine).

v

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

1.1 Objetivos ......................................................................................................... 3

1.2 Objetivos Específicos .................................................................................... 3

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 4

2.1 Trigo, localização, processamento e geração de subproduto ................... 4

2.2 Proteína microbiana (Single Cell Protein) .................................................... 7

2.3 Fermentação em estado sólido ..................................................................... 9

2.4 Levedura Saccharomyces cerevisiae ......................................................... 15

2.5 Hidrólise enzimática ..................................................................................... 18

3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 21

3.1 Substrato e microrganismos ....................................................................... 21

3.2 Caracterização da mescla gérmen e sêmola ............................................. 21

3.2.1 Verificação do pH ........................................................................................ 22

3.2.2 Quantificação de proteína ........................................................................... 22

3.2.3 Quantificação de gordura ............................................................................ 22

3.2.4 Determinação de Cinzas ............................................................................. 22

3.2.5 Determinação de Açúcares não Redutores em Sacarose e carboidratos

totais ............................................................................................................... 22

3.2.6 Determinação umidade ............................................................................... 23

3.2.7 Determinação da Fibra Bruta ...................................................................... 23

3.3 Descrição do Processo fermentativo ......................................................... 23

3.3.1 Planejamento experimental ......................................................................... 23

3.3.2 Microrganismo ............................................................................................. 24

3.3.3. Fermentação .............................................................................................. 24

3.4 Hidrolise enzimática ..................................................................................... 26

3.4.1 Otimização da hidrólise enzimática ............................................................. 28

3.5 Análises estatísticas dos dados ................................................................. 29

3.6 Fermentação com matérial hidrolisado ...................................................... 29

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 30

4.1 Caracterização dos substratos ................................................................... 30

4.2 Avaliação das condições para produção de proteína e crescimento

microbiano .................................................................................................... 33

vi

4.3 Otimização das condições de hidrólise enzimática do amido por Plackett-

Burman .......................................................................................................... 49

4.4 Otimização das condições hidrólise enzimática por DCCR. ................... 54

4.5 Crescimento celular e rendimento proteico com substrato hidrolisado . 64

5 CONCLUSÕES ................................................................................................. 68

5.1 Sugestões para trabalhos futuros .............................................................. 70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 71

APÊNDICE ........................................................................................................... 81

Apêndice A .......................................................................................................... 82

Apêndice B .......................................................................................................... 88

Apêndice C .......................................................................................................... 90

ANEXOS .............................................................................................................. 92

Anexo A ............................................................................................................... 93

Anexo B ............................................................................................................. 101

Anexo C ............................................................................................................. 103

Anexo D ............................................................................................................. 147

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Partes do grão de trigo ........................................................................ 5

Figura 2.2 - Geração de subproduto do trigo.......................................................... 6

Figura 2.3 - Estruturas de uma levedura típica, como as de Saccharomyces

cerevisiae ........................................................................................ 15

Figura 3.1 - Frascos Erlenmeyer utilizado na fermentação com substrato, água e

microrganismos. .............................................................................. 25

Figura 4.1 – Diagrama de Pareto com efeito das variáveis estudadas no

planejamento em blocos- avaliando a adição de água (%), mescla do

substrato e o bloco tempo (h) no enriquecimento de proteico (%). . 36

Figura 4.2 - Perfil da produção de (■) proteína (%), ( ) consumo de açucares

redutores (g 100g-1) e (•)pH, ao longo de 60 horas de fermentação

referentes ao ensaio 8 ..................................................................... 37

Figura 4.3 - Diagrama de Pareto com efeito das variáveis estudadas no

planejamento fatorial completo (23 com triplicata no ponto central)-

avaliando a adição de água (%), mescla do substrato e tempo (h) na

geração da concentração celular (log10 UFC g-1) .......................... 41

Figura 4.4 - (a) Valores preditos x resíduos e (b) Diagrama de dispersão obtidos

no planejamento fatorial 23 para o crescimento celular. .................. 44

Figura 4.5 - (a) Superfície de resposta para as variáveis mescla de substrato e

adição de água (%).(b)Curva de níveis para as variáveis

significativas mescla de substratos e adição de água (%) ............. 45

Figura 4.6 - (a) Perfil do crescimento (log 10(UFCg-1); (b)consumo de substrato

(g100g-1) para as condições referentes aos ■ensaio 1, •ensaio 2,

▲ensaio 3 e ensaio 4 do planejamento experimental completo 46


(g100g-1) para as condições referentes aos ■ensaio 5, •ensaio 6,

▲ensaio 7 e ensaio 8 do planejamento experimental completo 46


(g100g-1) para as condições referentes aos ■ ponto central, • ponto

viii

central 01, ▲ponto central 02, do planejamento experimental

completo. ......................................................................................... 47

Figura 4.9 - Diagrama de Pareto com efeito das variáveis e interações estudadas

do planejamento experimental Plackett-Burman – avaliando a:

Temperatura (°C), Tempo (h), pH, Adição de água (%) e Enzima

(%)) e a média da resposta obtida: Açúcares redutores (g L-1) ....... 51

Figura 4.10 – Cinética de hidrólise enzimática (■) concentração de açúcar (g L-1),

para ensaio 10. ............................................................................... 53

Figura 4.11 - D- Diagrama de Pareto com efeito das variáveis e interações

estudadas do planejamento experimental (DCCR+6PC) – avaliando

a: Temperatura (°C), Adição de água (mL) e Enzima (%)) e a média

da resposta obtida: Açúcares redutores (g L-1) ............................... 56

Figura 4.12 - (a) Diagrama de dispersão e (b)Valores preditos x resíduos, obtidos

no planeja no planejamento delineamento composto central

rotacional (DCCR) para a hidrólise enzimática. .............................. 58

Figura 4.13 - Superfície de Resposta para concentração de açúcares redutores (g

L-1) em função da concentração de enzima e temperatura (°C) ...... 59

Figura 4.14 - Gráfico de controle para concentração de açúcares redutores (g L-1)

em função da concentração de enzima e temperatura (°C) ............ 59


L-1) em função da adição de água e temperatura (°C) .................... 60


em função da adição de água e temperatura (°C) .......................... 60


L-1) em função da adição de água e concentração de enzima. ....... 61


em função da porcentagem de adição de água e concentração de

enzima. ............................................................................................ 61

Figura 4.19 – Evolução da cinética da hidrólise enzimática (■) concentração de

açúcar (g L-1), ao longo do tempo (12 horas) para ensaio 07 ......... 62

Figura 4.20 - Perfil da produção da(□) geração de proteína, (•) consumo de

açúcares, ( ) variação do pH e(Δ) Contagem de células, para

fermentação de 60 horas com substrato hidrolisado ....................... 64

ix

Figura 4.21 – Perfil de (□) geração de proteína, (•) consumo de açúcares, ( )

variação do pH e(Δ) Contagem de células, para fermentação de 30

horas com substrato hidrolisado ..................................................... 66

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - História e desenvolvimento da fermentação em estado sólido ........ 10

Tabela 2.2 - Vantagens e desvantagens da FES ................................................. 11

Tabela 2.3 - Comparação entre o processo de fermentação submersa e

fermentação estado sólido. ............................................................. 13

Tabela 2.4 - Parâmetros físico-químicos da Saccharomyces cerevisiae ............. 15

Tabela 2.5 - Composição da Saccharomyces cerevisiae ..................................... 16

Tabela 3.1 - Variáveis e níveis que compõem a matriz do planejamento

experimental completo 23com triplicata no ponto central e

planejamento em blocos, tendo como resposta crescimento celular

(log10UFCg-1) e enriquecimento proteico (%) .................................. 23

Tabela 3.2 – Matriz do planejamento experimental em blocos, tendo como

resposta enriquecimento proteico(%) .............................................. 24

Tabela 3.3 – Matriz do planejamento experimental completo 23 com triplicata no

ponto central, tendo como resposta crescimento celular (log10(UFCg-

1) . .................................................................................................... 24

Tabela 3.4 - Matriz do planejamento Plackett-Burman, para a hidrólise enzimática

da mescla de substrato 75%sêmola e 25% gérmen ....................... 27

Tabela 3.5 – Variáveis e valores dos níveis referente a hidrólise enzimática para a

mescla de substrato 75% sêmola e 25% gérmen. .......................... 27

Tabela 3.6 - Matriz da otimização do planejamento experimental DCCR com

sextuplicata no ponto central), utilizando a mescla de substrato

75%sêmola e 25%gérmen .............................................................. 28

Tabela 3.7 - Variáveis e seus respectivos valores de nível para otimização do

processo de hidrólise. ..................................................................... 29

Tabela 4.1 - Granulometria (% de retenção) das mesclas dos substratos (75%

gérmen 25% sêmola, 50% sêmola e 50% gérmen e 25% gérmen e

75% sêmola) ................................................................................... 30

Tabela 4.2 - Caracterização do substrato para as diferentes composições de

mescla (75% gérmen 25% sêmola (-1)*, 50% gérmen 50%

sêmola(0)** e 25% gérmen 75% sêmola(+1)***). ............................ 31

Tabela 4.3 - Composição físico-química da sêmola e do gérmen. ...................... 32

Tabela 4.4 - Composição mineral e matéria mineral do gérmen e da sêmola. .... 33

xi

Tabela 4.5 - Matriz do planejamento experimental em blocos, com as variáveis

investigadas (Adição de água (%), mescla do substrato e o bloco

tempo (h)) e a média da resposta obtida: Enriquecimento Proteico

(%)................................................................................................... 34

Tabela 4.6 - Tabela de efeitos e interações utilizando planejamento em blocos

para resposta enriquecimento proteico (%) ..................................... 35

Tabela 4.7 - Tabela ANOVA para planejamento experimental em blocos, tendo

como resposta enriquecimento proteico (%). .................................. 36

Tabela 4.8 - Matriz do planejamento experimental fatorial completo (23 com

triplicata no ponto central), com as variáveis investigadas (Adição de

água (%), mescla do substrato e tempo (h)) e a média da resposta

obtida: Crescimento Microbiano (log10 UFC g-1) .............................. 39

Tabela 4.9 - Tabela de efeitos e interações– tendo como resposta concentração

celular (log10 UFC g-1), utilizando planejamento fatorial completo. 40

Tabela 4.10(a) - Tabela ANOVA para planejamento experimental fatorial completo

(23 com triplicata no ponto central), tendo como resposta

crescimento da levedura Sacharomyces cerevisiae........................ 43

xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ANOVA

FES

SCP

GRAS

RPM

PPM

UV-VIS

Análise de variância

Fermentação em estado sólido

Single Cell Protein

Generally regarded as safe

Rotações por minuto

Parte por milhão

Ultravioleta-visível

xiii

ESTUDO DO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE PROTEÍNA

MICROBIANA POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO

SUBPRODUTOS DO PROCESSAMENTO DE TRIGO

AUTOR: HUILIAN COLPO

ORIENTADORA: PROF. DRA. MÔNICA LADY FIORESE

Dissertação de Mestrado; Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química;

Universidade Estadual do Oeste do Paraná; Rua da Faculdade, 645; CEP: 85.903-

000 – Toledo – PR, Brasil.

RESUMO

Atualmente, com o aumento da demanda por alimentos e consequente

surgimento de novas indústrias e agroindústrias, uma crescente preocupação tem

surgido no que diz respeito ao tratamento adequado e/ou o destino correto para os

resíduos/subprodutos gerados. O segmento dos moinhos de trigo tem como

subprodutos em seu processo o gérmen e a sêmola, os quais se apresentam com

grande potencial para esta finalidade, uma vez que estes, em sua maioria, são

atualmente utilizados apenas como complemento em formulações para ração

animal. Entretanto, por se tratar de dois subprodutos, os quais possuem em sua

composição carboidratos, gorduras, minerais e outros nutrientes, torna-se possível

suas aplicações na produção de alimentos com elevado valor nutricional e rico em

proteínas de origem microbiana, passíveis de utilização não somente para animais,

mas também para consumo humano. Desta forma o objetivo deste estudo foi avaliar

o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae comercial por fermentação

em estado sólido (FES), utilizando como substrato os subprodutos gerados em

moinho de trigo (gérmen e a sêmola), com a finalidade de obter concentrações de

proteína microbiana significativas. Inicialmente, fez-se a caracterização dos

substratos, avaliando os teores de carboidratos, proteínas, fibras, cinzas dentre

outras. A partir deste resultado, foi elaborado um planejamento experimental em

xiv

blocos e outro fatorial completo (23+ 3PC), visando avaliar a influência das variáveis

(adição de água, mescla do substrato e tempo de fermentação) obtendo como

resposta rendimento de proteína e crescimento microbiano respectivamente. O

ensaio com 40% de adição de água, mescla composta por 75% sêmola e 25%

gérmen e 30 horas de fermentação, foi o que obteve as melhores respostas para o

crescimento da levedura (8,0 log10UFCg-1) e o ensaio utilizando 60 horas de

fermentação mescla composta por 75% sêmola e 25% gérmen e 60% de água

(base no peso do substrato), foi o que obteve melhores resultados na obtenção de

proteína microbiana (10,68%). As variáveis significativas foram a mescla do

substrato e o tempo de fermentação para um nível de significância de 5%. Com os

resultados obtidos nesta etapa, foi possível verificar que ocorreu baixa

disponibilidade de fonte de carbono, assim, realizou-se a hidrólise da mescla (75%

sêmola e 25% gérmen), para isso, inicialmente foi aplicado um planejamento

experimental do tipo Plackett-Burman, a partir do direcionamento obtido com a

realização destes ensaios com as variáveis significativas (adição de água em %,

temperatura e quantidade de enzima. Aplicou-se outro planejamento experimental,

do tipo fatorial completo com objetivo de otimizar a condição a ser utilizada na

hidrólise da mescla e liberação de açúcares redutores. Como resposta, obteve-se

137,52 gL-1 de açúcares redutores nas condições pH 6,3, agitação de 100 RPM,

temperatura de 45°C, 10% de enzima com base na massa do substrato e a menor

adição de água 40% com base no substrato. Após hidrólise do substrato, utilizando

as condições que apresentaram melhores resultados com o substrato sem

hidrolisar, foi possível obter um enriquecimento proteico de 13,94% em 60 horas, e

38,6% para a condição de 30 horas de fermentação, demonstrando que a utilização

de subproduto de moinho de trigo com a levedura Saccharomyces cerevisiae é um

potencial para geração de SCP.

Palavras-chave: Trigo, microrganismo, hidrólise, planejamento experimental,

Saccharomyces cerevisiae.

xv

STUDY GROWTH AND PROTEIN PRODUCTION BY MICROBIAL

FERMENTATION IN SOLID USING BY-PRODUCTS OF WHEAT

PROCESSING

AUTHOR: HUILIAN COLPO

SUPERVISOR: PROF. DRA. MÔNICA LADY FIORESE

Master Thesis; Chemical Engineering Graduate Program; Western Paraná State

University; Rua da Faculdade, 645; CEP: 85.903-000 – Toledo – PR, Brazil.

ABSTRACT

Currently, with increasing demand for food and consequent emergence of new

industries and agro-industries, a growing concern has arisen with regard to

appropriate treatment and / or the correct destination for the waste / by-products

generated. The segment of wheat mills has as by-products in the process the germ

and the bran, which present with great potential for this purpose, since they mostly

are currently used only as a supplement in animal feed formulations. However,

because they are two by-products, which have in their composition carbohydrates,

fats, minerals and other nutrients, it becomes possible to their applications in the

production of foods with high nutritional value and rich in microbial protein, which

may be used not only for animals, but also for human consumption. Therefore, the

objective of this study was to evaluate the growth of Saccharomyces cerevisiae by

commercial solid-state fermentation (SSF), using as substrate the by-products

generated in wheat mill (germ and meal), with the purpose of obtaining microbial

protein concentrations significant. Initially, there was the characterization of

substrates, assessing the levels of carbohydrates, protein, fiber, ash and others.

From this result, an experimental design was drawn up on blocks and another full

factorial (23+ 3PC), to evaluate the influence of the variables (addition of water, a

mixture of substrate and fermentation time) obtaining as protein yield response and

microbial growth respectively. The test with 40% added water, a mixture composed

xvi

of 75% and 25% germ meal and 30 hours of fermentation, it was obtained the best

results for growth of the yeast (8.0 log10UFCg-1) and the assay using 60 hours of

fermentation mixture comprised 75% and 25% germ meal and 60% water (based

on the substrate weight), which was obtained best results in achieving microbial

protein (10.68%). Significant variables were the mixture of substrate and

fermentation time for a 5% significance level. With the results obtained in this step,

we observed that there was low carbon source availability, so there was the

hydrolysis of the mixture (75% bran and germ 25%), for this, was initially applied an

experimental design type Plackett -Burman from the direction obtained in these tests

with the significant variables (addition of water in%, temperature and amount of

enzyme. It was applied another experimental design, the full factorial in order to

optimize the condition to be used the hydrolysis mixture and liberation of reducing

sugars. As a response, there was obtained 137.52 g L-1 of reducing sugar in

conditions pH 6.3, 100 RPM agitation, 45 ° C, 10% based on enzyme mass of the

lower substrate and the addition of water 40% based on the substrate. After

hydrolysis of the substrate under conditions that showed the best results with no

substrate hydrolysis was possible to obtain a protein enrichment 13.94% in 60

hours, 38.6% for condition 30 hours of incubation, demonstrating that the use of

wheat mill by-product of the yeast Saccharomyces cerevisiae is a potential for

generating the SCP.

Keywords: Wheat, microorganism, hydrolysis, experimental design,

Saccharomyces cerevisiae.

1

1 INTRODUÇÃO

O cultivo de microrganismo para a geração de proteína microbiana vem

sendo considerado como uma via de produção de alimentos alternativos, o qual

elimina as restrições sazonais e de variações climáticas que existem em muitas

safras agrícolas, uma vez que, a seleção de microrganismos pode ser baseada no

valor nutricional e no conteúdo proteico que o próprio microrganismo pode produzir.

A produção em larga escala de proteína microbiana pode vir a se constituir

numa das soluções ao problema de deficiência alimentar existente hoje (SANTIN,

1996). Deste modo, a produção de células microbianas para a produção de

proteína, vem sendo explorada com a intenção de aumentar a quantidade e a

qualidade desta fonte alimentícia na dieta da população (RABÊLO, 2011).

O enriquecimento proteico de produtos naturais por bioprocesso, e em meio

semi-sólido, tem por objetivo a produção de produtos diferenciados, possibilitando

a utilização dos subprodutos com destino menos nobre, e ou muitas vezes

descartados sem aplicação, em processos secundários acrescendo valor aos

mesmos, além da utilização da matéria-prima de forma integra, contribuindo para

minimizar os problemas de poluição no meio ambiente, além de obter alta produção

de células ricas em proteínas (DÚRAND, 1998; CAMPOS, 2003).

Os bioprocessos vêm sendo utilizados para várias finalidades, bem como:

produção de proteína microbiana, extratos de leveduras, produção de aromas,

realçadores de sabor e enzimas, isto é possível devido à biodisponibilidade de

subproduto para utilização, e a grande quantidade de micro-organismos que podem

ser utilizados para obtenção de diferentes produtos (SABRA et al. 2003).

Uma das indústrias que geram subprodutos decorrentes da obtenção de

produtos primários são as agroindústrias produtoras de farinhas, verifica-se, que

este tipo de segmento possui em seu processo de produção a geração de duas

potenciais fontes de subprodutos, o gérmen e a sêmola.

Em um processo de obtenção de farinha, os grãos de trigo são triturados

entre pares de rolos de ferro fundido, e por peneiramento são separados em

diversos tamanhos e frações, cada fração apresenta características químicas,

físicas e aplicações específicas, e quando misturadas permitem a produção de

2

vários tipos de farinha, com qualidades tecnológicas diferentes (PAGIATO et al.,

1998).

No decorrer do processo de recirculação para obtenção da farinha é gerada

a sêmola ou semolinas que é a parte do farelo com fragmentos de endosperma,

que são separadas nas peneiras de extração, e para ser reduzida a farinha é

direcionada a um sistema de moinhos de rolos de redução.

Outro subproduto comumente encontrado nos moinhos é o gérmen, também

conhecido como o embrião do grão, é segregado durante o processo de moagem,

e destinado a diversas aplicações como na alimentação humana, principalmente

em produtos dietéticos ou produtos integrais (SABALSAGARAY, 1998), porém na

maioria dos casos é destinada a ração animal juntamente com o farelo. Com base

em estudos realizados pela Embrapa (2009), o gérmen representa 2-3% do grão.

De acordo com a CONAB (2014), a expectativa de produção de trigo no

Brasil para a safra 2014/2015 será de 7,67 milhões de toneladas com demanda de

12,2 milhões de toneladas. Com base nestes dados é possível prever uma grande

quantidade de subprodutos (gérmen e sêmola) que estão e/ou serão gerados

durante esta safra.

Estes subprodutos possuem em sua composição carboidratos, gorduras,

cinzas entre outros compostos, o que os torna uma potencial matéria-prima rica em

fonte de nutrientes, podendo ser utilizado para crescimento de microrganismos com

o objetivo de produção de produtos com maior valor agregado e acréscimo de

proteínas.

Um dos microrganismos que pode ser utilizado para esta finalidade é a

Saccharomyces cerevisiae, organismo eucariótico muito estudado, e há vários

séculos utilizado na produção de alimentos e bebidas alcoólicas. É um

microrganismo que tem características favoráveis para sua aplicação em processos

industriais, pois não é patógeno, e é classificado como um organismo generally

regarded as safe (GRAS). Além disso, muito utilizado nos processos de

fermentação e se adéqua facilmente para produção em larga escala, tornando a S.

cerevisiae muito atraente para diversos fins biotecnológicos (OSTERGAARD et al.,

2000).

3

1.1 Objetivos

O objetivo geral deste trabalho foi estudar o crescimento microbiano, e

produção de proteína microbiana por fermentação em estado sólido, utilizando a

levedura Saccharomyces cerevisiae comercial, obtida como fermento biológico e

como substratos dois subprodutos gerados no processamento do trigo, o gérmen e

a sêmola.

1.2 Objetivos Específicos

1. Realizar a caracterização física e química dos constituintes presentes nos

subprodutos.

2. Avaliar a influência: da umidade, tempo de fermentação e proporções dos

substratos (mesclas) gérmen e sêmola, no crescimento e produção de

proteína por S. cerevisiae utilizando fermentações em estado sólido.

3. Avaliar e otimizar o processo de hidrólise enzimática da mescla (75%

sêmola e 25% gérmen), considerando as variáveis: tempo (h), pH,

temperatura (°C), adição de água (mL) e enzima (%), obtendo como

resposta açúcares redutores (g L-1).

4. Empregar a mescla hidrolisada na fermentação (FES) e avaliar o

crescimento celular e produção de proteína microbiana em comparação

com o obtido sem a otimização do processo de hidrólise da mescla.

4

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Trigo, localização, processamento e geração de subproduto

O trigo é um cereal produzido em todos os continentes, sendo na Ásia onde

concentra o maior volume de produção. A época de colheita é distinta em cada

continente, devido sua localização e o comportamento climático. O período entre

junho/setembro é a safra principal, atingindo 75% da produção mundial. A partir de

setembro a safra se inicia no hemisfério sul, primeiro o Brasil com a safra

paranaense e posterior, os países abaixo da linha do equador, sendo os principais

a Argentina e a Austrália. Os países próximos a linha do equador com maior

importância são a Índia, o Oriente Médio e o norte da África (USDA, 2014).

De acordo com o USDA (2014), constantemente ocorrem elevações no

consumo do cereal, este aumento está relacionado com o consumo humano, já

quando empregado na ração animal, ocorre bastante variação, isto é explicado pela

oferta e procura deste cereal. Quando há um aumento da oferta para consumo

humano, ocorre a queda dos preços e consequentemente um aumento da

aplicação deste cereal para o mercado de ração animal. Em contrapartida, quando

a quantidade do cereal diminui ou fica grande parte para consumo humano, tem-se

uma elevação dos preços inviabilizando a utilização do trigo em ração animal,

havendo a substituição do trigo pelo milho.

Quando se trata em consumo deste cereal, tem-se uma variação no

consumo por habitante dependendo da região do país. Segundo dados da

Embrapa, o consumo de trigo é de aproximadamente 60 Kg per capita ao ano. De

acordo com Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria (ABIP),

em média o consumo é de 27 kg de pão e o restante como massas, biscoitos, grãos

integrais e outros usos (BRASIL, 2014).

No Brasil, os dois maiores produtores de trigo são os estados do Paraná e

Rio Grande do Sul. O Paraná desde a década de 1970 se consolidou como o maior

produtor, e deste então, somente em quatro safras teve sua produção inferior ao

Rio Grande do Sul. Segundo Bruns et al. (1999), por estar mais próximo ao centro

consumidor (referindo-se ao estado de São Paulo), produz esse cereal com maior

valor agregado, levando vantagem quando comparado ao estado do Rio Grande

5

do Sul. Na safra de 2010/2011 produziu 56% do total da produção brasileira de

acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2014).

De acordo com a Secretaria de Agricultura e do Abastecimento do Paraná

(SEAB), no ano comercial de 2013/2014, o estado do Paraná produziu 3.801.118

toneladas de trigo. As maiores produtividades foram nas regiões norte e sul do

estado, sendo maior nesta última, devido ao clima mais rígido, com maiores

possibilidades de geadas, não sendo possível substituir o plantio de trigo por outras

culturas (PARANÁ, 2013).

A Figura 2.1 mostra o grão de trigo e seus componentes e mostra a

localização de cada parte no grão.

Figura 2.1 - Partes do grão de trigo Legenda: 1 crease, 2endosperma, 3 farelo, 4 germe, 5 endosperma, 6 aleurona, 7 hialina, 8 testa, 9 células tubulares, 10 células cruzadas, 11 hipoderme, 12 epiderme, 13 germe. Fonte: ABITRIGO (2005).

As principais etapas que envolvem o processamento do trigo são: recepção

e estocagem dos grãos, limpeza, moagem, peneiramento, purificação e

embalagem do produto final (farinha). O grau de separação dos componentes do

grão reflete no rendimento da moagem de farinha, este termo é conhecido como

taxa de extração. A farinha padrão apresenta uma taxa de extração de 74% (EL-

DASH, 1982).

O processo de moagem do trigo tem como alimento comercial primário a

farinha. A moagem tem por objetivo quebrar o grão e retirar o máximo de

endosperma e posterior reduzi-lo a farinha, conseguindo separar o germe e o farelo.

6

A separação é possível devido as diferentes propriedades físicas dos constituintes

do grão. O farelo é resistente devido sua alta concentração de fibras, já o

endosperma é friável, enquanto o germe por conter alto conteúdo de óleo, forma

flocos na passagem pelos rolos de redução.

Além dessas propriedades, a densidade das partículas difere, dependendo

de sua localização no grão. Devido as diferentes propriedades físicas e a densidade

das partículas, a separação se torna possível pelo emprego de correntes de ar.

Para maior eficiência na moagem, o processo de umidificação é de fundamental

importância, pois promove o enrijecimento do farelo e deixa o endosperma mais

macio, facilitando ainda mais a separação das frações (POMERANZ 1987 apud

GUTKOSKI, ANTUNES, ROMAN 1999).

Segundo EMBRAPA (2009) o gérmen, que é considerado o embrião da nova

planta é rico em açúcares e lipídeos e corresponde a 3% do grão. O pericarpo

conhecido como farelo de trigo, com estrutura rica em celulose corresponde a 18%.

E o endosperma rico em amido e proteína é parte, que após o processo de moagem

constitui a farinha, totaliza 79% do grão.

SABALSAGARAY (1998) relata que durante a produção e processamento

do trigo alguns subprodutos são gerados, conforme Figura 2.2.

Figura 2.2 - Geração de subproduto do trigo Fonte: SABALSAGARAY (1998).

Na etapa de colheita é gerado o primeiro subproduto, sendo palhas ricas em

celulose. Os demais são gerados quando os grãos chegam ao moinho para

processamento, na qual 75% de farinha e 25% divide-se em farelo, semolina e

gérmen de trigo. Os três últimos são aplicados em alguns casos para alimentação

animal em rações balanceadas. O farelo e gérmen são utilizados também na

alimentação humana em diversos produtos, como por exemplo: o gérmen, rico em

vitamina E, é utilizado para reduzir o açúcar no sangue (ALIMENTOMEDICINAL,

2014); óleo de gérmen de trigo para cicatrização e resistência física

Trigo

Resíduo de Campo

Silos Processo industrial

Resulta em 25%, utilizável como

subproduto

7

(ZONACEREALISTA, 2014), além de ser fonte de ácidos poli-insaturados que

auxiliam no combate ao colesterol (ADP, 2014). Já a sêmola é comumente utilizada

na fabricação de massas e ou farinha integral (GARIB, 2002).

Apesar de existirem aplicações para estes subprodutos, ainda não há

disponível no mercado uma aplicação que acrescenta valor comercial aos mesmos.

Neste contexto, o emprego destes subprodutos em processos biotecnológicos,

apresenta-se com grande potencial devido a sua composição nutricional ser rica

em carboidratos, proteínas, aminoácidos, lipídios e minerais, essenciais em um

processo envolvendo o crescimento celular e a obtenção de produtos com valor

agregado elevado, como é o caso das proteínas microbianas.

2.2 Proteína microbiana (Single Cell Protein)

O termo Single-Cell-Protein (SCP) foi utilizado pela primeira vez em 1960,

referindo-se à proteína microbiana derivada de leveduras, bactérias, fungos, algas

e cianobactérias que pudesse ser utilizada como alimentação humana ou ração

animal, passando esta designação então a ser admitida de forma universal para

descrever tais proteínas (VASEY& POWELL 1984).

As tecnologias de produção de proteína unicelular (SCP) são muito

promissoras para atender as demandas nutricionais desta fonte proteica em todo o

mundo. Nas últimas duas décadas a sua produção aumentou devido às tecnologias

recombinantes e estratégias de cultivo, que possibilitaram o aumento na taxa de

crescimento destes micro-organismos e elevação no conteúdo proteico (NIGHAN

& SING, 2014).

A utilização de leveduras e bactérias tem sido particularmente importante

para a produção de proteína unicelular, sendo a primeira utilizada para a

alimentação humana e a segunda para a produção de ração animal. Ambos os

microrganismos são adaptáveis a diversos tipos de substratos. As leveduras têm

destaque sobre as bactérias para a produção de SCP, principalmente para o

consumo humano, devido a sua associação com produtos como o pão e a cerveja.

Entretanto, as bactérias possuem maior teor de proteína, rendimentos mais

elevados, mas são menos aceitas para o consumo humano, quando comparada

com a levedura que é mais difundida (GARIBAY et al., 2014).

8

Outros pontos favoráveis para a utilização de microrganismos para o

enriquecimento proteico são o uso de resíduos. DEL BIANCHI et al. (2001) citam

inúmeros estudos já realizados com eficácia na produção de proteína microbiana,

são eles: resíduos de bananas, farinha e resíduos sólidos do processamento de

mandioca, espiga de milho, cana-de-açúcar, bagaço de cana, bagaço de maçã,

melaço, vinhaça, farelo e palha de trigo, grão-de-bico, polpa de café, arroz cozido,

casca de limão, laranja, rejeito da fabricação de polpa congelada de acerola,

maracujá, abacaxi, goiaba, morango e pedúnculo do caju considerados abundantes

no Brasil, além de resíduo da produção de pasta de papel, não havendo diferença

significativa na produção quando comparado com substratos puros, como a glicose.

A utilização de resíduos como substratos, contribui para a recuperação de recursos

e a diminuição do impacto ambiental causado por estes (SWAMINATHAN et al.,

1989; NASSERI et al. 2011).

PELCZAR et al. (1996) ressaltam que, um fator determinante para a

produção de SCP, é devido ao elevado conteúdo de proteínas presentes nas

células microbianas, o qual pode chegar a aproximadamente 60% do seu peso

total, se comparado com a carne (20%) e a soja (35%), tem-se aproximadamente

2 a 3 vezes mais proteína em cultivos de SCP. ANUPAMAA & RAVINDRAB (2000)

destacam ainda que, o valor do alimento ao final do processo de enriquecimento

com SCP, é baseado na matéria-prima que é utilizado para sua composição,

avaliando-se assim o perfil de nutrientes, vitaminas, carboidratos, gordura,

componentes da parede celular, a concentração de proteínas e aminoácidos.

Do ponto de vista de produção de proteína microbiana, o objetivo principal é

obter o máximo de produtividade, observando o coeficiente de rendimento da

biomassa, que é expresso por massa seca do substrato por unidade de biomassa

de substrato. Em contrapartida, o produto deverá possuir alto teor proteico,

incremento na composição de aminoácidos, baixo teor de ácidos nucleicos quando

utilizada para fins de alimentação humana, ser agradável sensorialmente nos

quesitos cor, aroma e textura e estar livre de resíduos tóxicos ou carcinogênicos

(SINSKEY & BATT, 1987 apud VILLAS BÔAS, 2001; VELÁZQUES et al. 2012).

Várias são as formas de fermentação para produção da proteína microbiana

utilizando resíduos de agroindústria, pode-se utilizar fermentação submersa,

9

fermentação em estado semi sólido e/ou fermentação em estado sólido, sendo esta

a mais usual.

2.3 Fermentação em estado sólido

RAIMBAULT (1998) define o termo fermentação em estado sólido (FES, ou

do inglês SSF) ou também conhecida como fermentação semi sólida e\ou meio

semi sólido, como um processo fermentativo que ocorre na ausência ou quase

ausência de água livre, na qual o crescimento microbiano e a formação de produtos

ocorrem na superfície de substratos sólidos. O substrato não deve possuir água

livre ou somente o suficiente para que ocorra o processo, no entanto deve possuir

umidade suficiente para oferecer condições de crescimento e geração do

metabolismo dos microrganismos (PANDEY, 1991; PANDEY et al., 2000, SOCCOL

& VANDENBERGUE, 2003; COUTO & SANROMÁN, 2005; MACIEL, 2006).

Com a evolução das adaptações tecnológicas da fermentação submersa,

por volta de 1940 nos países do ocidente, os processos envolvendo FES foram

quase completamente ignorados. Nesse período, houve o desenvolvimento da

penicilina em fermentação submersa, tornando-se referência, devido sua

importância durante a segunda guerra mundial. A retomada da fermentação em

estado sólido ocorreu de forma lenta, e seu marco foi no período de 1960-1970, e

que surgiram os primeiros relatos de produção de micotoxinas por este tipo de

fermentação. Outro relato importante foi a produção de proteína para

enriquecimento proteico na alimentação de bovinos. Este estudo envolvia a

utilização de subprodutos agroindustriais, tornando-se uma das áreas que mais

gerou interesse, por parte dos pesquisadores nos últimos tempos (HAN et al., 2001;

HADDADIN et al., 2001; YANG et al., 2001; MEDEIROS et al., 2000; PANDEY,

2003).

A tabela 2.1 apresenta a evolução da FES desde seu surgimento 2600 a.C.

10

Tabela 2.1 - História e desenvolvimento da fermentação em estado sólido

Período Desenvolvimento 2600 A.C Egípcios iniciaram o processo de pães Antes do nascimento de Cristo na Ásia

Produção de queijo por Peniciliumroqueforti

2500 BP Fermentação de peixe/ preservação com açúcar, amidos, sais, etc... processo Koji

Século 7 Processo koji na China para Japão por sacerdotes Budistas vinagre a partir da polpa

Século 18 Ácido gálico usado em curtimento, impressão etc 1860-1900 Tratamento de esgotos 1900-1920 Enzimas fúngicas (principalmente amilases), ácido

kójic 1920-1940 Enzimas fúngicas, ácido glucônico, fermentador de

tambor rotativo, ácido cítrico 1940-1950 Desenvolvimento da fermentação industrial.

Produção da penicilina por fermentação em estado sólido e fermentação submersa

1950-1960 Transformação de esteroide por culturas de fungos 1960-1980 Produção de micotoxinas, alimentos enriquecidos por

proteínas 1980-presente Vários outros produtos como álcool, ácido giberélico

Fonte: PANDEY (1991); COUTO & SANROMÁN (2005) – adaptado de AIDOO (1982).

Com a evolução da fermentação em estado sólido Tabela 2.1, a utilização

de resíduos agroindustriais para enriquecimento proteico, passou a ser empregada

em larga escala, pois possibilita o aumento do teor proteico desses materiais,

podendo posteriormente serem utilizados na alimentação humana ou animal,

diminuindo a escassez de alimentos ricos em proteína e com custo reduzido

(RAIMBAULT, 1998; PANDEY, 2003).

A FES é considerada mais natural que outros tipos de fermentações, como,

por exemplo, a fermentação submersa (FSm), uma vez que seus processos

assemelham-se as condições sob as quais a maioria dos microrganismos cresce

na natureza (HESSELTINE, 1987; MACIEL, 2006).

As principais vantagens e desvantagens da FES estão relacionadas na

Tabela 2.2.

11

Tabela 2.2 - Vantagens e desvantagens da FES

Vantagens Desvantagens

O meio de cultivo é simples, na maioria das vezes, natural (Condições próximas dos meios naturais)

Pré-tratamento dos suportes pode ser necessário em alguns casos, podendo modificar negativamente a estrutura do substrato

Efluentes líquidos reduzidos Difícil controle dos parâmetros de cultura (pH, umidade, temperatura, etc.)

Diminuição das contaminações devido à baixa umidade e atividade de água

Risco de elevação excessiva de temperatura (problemas de transferência de calor e de perda de umidade)

Fácil aeração devido à porosidade do material, resultando numa baixa demanda de energia

Difícil automação do processo

Possibilidade de utilização direta dos sólidos fermentados

Em alguns casos a secagem destes materiais, se necessária, pode danificar ou inativar enzimas ou metabólitos produzidos

Volume do fermentador menor com produtividade maior (Extração facilitada pela alta concentração de produtos)

Os extratos podem estar contaminados com componentes indesejáveis do substrato.

Fonte: MACIEL (2006) adaptado de RAIMBAULT (1998).

Além das vantagens apresentadas na Tabela 2.2, a FES permite o emprego

dos subprodutos vegetais, que são classificados como rejeitos das indústrias de

alimentos, por serem classificados como pobres em nutrientes são descartados ou

não mais utilizados nos processos. Apesar de possuírem níveis baixos de proteínas

e vitaminas, muitas vezes esses resíduos são ricos em fibras não digeríveis. A

bioconversão desse resíduo, utilizando microrganismos, comumente conhecida

como fermentação, é uma alternativa para aumentar o valor agregado destes, as

fermentações mais usuais são as envolvendo fungos como microrganismo

conversor (RAHMAT et al., 1995; NASSERI et al., 2011; VELÁZQUES et al., 2012).

De acordo com GERVAIS & MOLIN (2003), alguns parâmetros devem ser

avaliados por exercerem influência sobre o processo fermentativo, destaca-se

como principal a água. Na FES a água possui elevado grau de interação com as

substâncias que compõem a fase sólida, está relacionada com a umidade

expressando a porcentagem de água na massa total do meio e com a atividade de

água (Aw) que diz respeito a quantidade de moléculas livres e disponíveis nas

vizinhanças próximas das partículas do substrato. Para melhor entendimento da

FES, a umidade não exerce tanta influência comparada com a atividade de água,

12

esta última influencia diretamente a síntese de metabolitos e o crescimento

microbiano (PINTO et al., 2005).

Outro parâmetro importante que deve ser avaliado é o tamanho das

partículas, pois partículas de tamanho reduzido oferecem maior área para contato

com o microrganismo, mas ao mesmo tempo, tende a compactar-se com maior

facilidade. Para estas partículas, a respiração e a aeração do sistema são

dificultadas. Partículas maiores, por sua vez, promovem maior espaço

interpartículas, embora possua área superficial menor, com isso, para obter bons

resultados partículas uniformes, ou com diferentes tamanhos pode facilitar a ação

dos microrganismos (SANTOS, 2007).

Existem outros fatores que interferem na FES, a mistura do substrato, por

exemplo: promove uma maior uniformidade e transferência de massa e calor entre

as partículas, resulta em um processo mais uniforme, disponibiliza mais oxigênio

para os microrganismos e ocorre uma maior remoção de CO2 do sistema, favorece

um maior espaçamento entre as partículas. Uma boa homogeneização do substrato

pode impedir um superaquecimento localizado em determinadas regiões do

biorreator e melhora a transferência de água entre as partículas sólidas,

uniformizando o suprimento de nutrientes. Todos esses fatores podem causar

alteração dos metabolismos do microrganismo, diminuindo ou até mesmo

interrompendo seu crescimento e rendimento do produto (WEILAND, 1988).

Segundo WEILAND (1988) e COUTO & SANROMÁN (2005), processos

fermentativos em estado sólido devem ser avaliados em cada sistema com suas

individualidades. Os autores comentam que os principais equipamentos para FES

são: biorreatores de imersão, biorreatores de leito, biorreator tambor rotativo e

biorreator de bandeja. Sendo os sistemas de cultivo em meio sólido caracterizados

como meios heterogêneos, em termos de população microbiana e concentração de

soluto. Um dos problemas relatados nesse tipo de cultivo é quando o sistema

possui alta viscosidade, sendo necessária uma excessiva agitação para obtenção

da homogeneidade do substrato, levando a uma ruptura celular (GERVAIS &

MOLIN, 2003).

Neste contexto, os fungos filamentosos são os mais indicados para este tipo

de processo, pois crescem em sólidos com pouca necessidade de água e tem sua

13

forma de crescimento por meio de hifas, favorecendo a colonização (DURAND,

2003).

Apesar das vantagens da utilização dos fungos filamentosos em

fermentação de sólidos, existem outros microrganismos utilizados para este fim.

Para PALMA (2003), a utilização de bactérias e leveduras também é possível,

porém uma quantidade menor de trabalhos com esses microrganismos é

encontrada na literatura, provavelmente devido a características destes

microrganismos e que requerem altos valores de atividade de água. Mitchell et al.,

(2000), relatam que há estudos utilizando leveduras em FES para produção de

etanol e para enriquecimento proteico em substratos sólidos principalmente de

origem amiláceas.

Há muitas vantagens do uso microrganismos em processos de fermentação

em estado sólido em vários sistemas, sendo tanque agitado, escala de laboratório

ou até mesmo em grande escala. As condições em que os microrganismos

crescem, em alguns casos, são similares as condições no seu ambiente natural, e

o produto desejado, em alguns casos específicos, pode ser separado apenas com

adição de solvente (AIDOO, 1982; PANDEY et al., 2000; MACIEL, 2006; NASSERI

et al., 2011).

A Tabela 2.3 apresenta algumas características e parâmetros para

fermentação em estado sólido e fermentação submersa para produção de SCP.

Tabela 2.3 - Comparação entre o processo de fermentação submersa e fermentação estado sólido.

Parâmetro Fermentação submersa Fermentação em estado sólido

Condição do substrato Requer agitação contínua e substratos solúveis

Não é necessária agitação e polímeros insolúveis como substrato

Umidade Requer em grande quantidade Ausência de água livre

Manutenção das condições aeróbicas

Por agitação Por difusão

Resíduos após fermentação Grandes quantidades, consequentemente polui o meio ambiente

Muito pouco, portanto, não poluente

Espaço Grande Pequeno

Investimento de capital Muito alto Baixo

Condições de assepsia Altamente essencial Não é necessária Fonte: ANUPAMA (2000).

14

A FES é utilizada há muitos séculos pelo homem na fabricação de alimentos,

entretanto até hoje enfrenta alguns problemas no seu emprego, devido à dificuldade

de transferência de calor e massa, aumentando a necessidade de processos mais

elaborados com culturas puras e de alta eficiência, porém de acordo com a Tabela

2.3, em termos de processo possui vantagens quando comparada a fermentação

submersa. (HESSELTINE, 1987; DURAND, 1998; ANUPAMA, 2000).

Os maiores desafios encontrados pelos pesquisadores que utilizam este tipo

de fermentação é o scale-up do processo, a purificação dos produtos finais e a

estimativa da produção de biomassa. Recentemente com o avanço da engenharia

bioquímica, um pequeno número de reatores foi desenvolvido para ser utilizado em

grandes escalas, com suporte de monitoramento instantâneo (on-line) de vários

parâmetros, tendo destaque a transferência de calor e massa (SINGHANIA et al.,

2009).

A separação de biomassa na fermentação em estado sólido em geral é

complexa, porém é essencial para estudos cinéticos, uma alternativa é a utilização

de métodos indiretos, como estimativa proteína por Kjeldahl, estimativa de DNA e

formação de CO2, porém estes apresentam suas limitações. Com o avanço da

tecnologia, tem sido utilizado o processamento de imagem digital que é uma

ferramenta que permite quantificar a produção de biomassa da fermentação em

estado sólido (COURI, 2006).

Apesar de a FES apresentar algumas restrições quanto ao seu uso,

mundialmente ela vem sendo aplicada no enriquecimento proteico de resíduos

agroindustriais, através de microrganismos selecionados que aumentam o teor

proteico desses materiais de modo a serem utilizados na alimentação humana ou

animal. Todavia, na escolha do microrganismo, deve-se levar em consideração a

segurança alimentar. Neste contexto, a aplicação da levedura Saccharomyces

cerevisiae, vem sendo explorada, por ser uma levedura amplamente difundida no

mercado, de baixo custo e também possui afinidade com produtos de origem

amiláceos.

15

2.4 Levedura Saccharomyces cerevisiae

A Saccharomyces cerevisiae é uma levedura classificada como organismo

eucariótico unicelular, pertencente ao reino fungi, possuindo entre 2 a 8

micrômetros de diâmetro e 3 a 15 micrômetros de comprimento, sua reprodução se

dá principalmente por gemação. O protoplasma da célula é envolvido por uma

membrana e esta por uma parede. Sua estrutura é composta por um núcleo, um

grande vacúolo e glóbulos de gordura e numerosas outras estruturas reveladas por

técnicas de coramento e/ou microscopia como visualizado na Figura 2.3.

Referente a composição química das leveduras, elas possuem em suas

células entre 68% a 83% de água, além de substâncias nitrogenadas, carboidratos,

lipídeos, vitaminas, minerais entre outros, conforme dados apresentados na Tabela

2.3 e 2.4). Alguns elementos básicos para seu crescimento e manutenção são

requeridos, como para qualquer outra forma de vida, dentre eles: a água, fonte de

carbono, nitrogênio, oxigênio e minerais estes fatores físicos e químicos são

indispensáveis para o crescimento e reprodução (TORTORA et al., 2002; NASSERI

et al. 2011).

Figura 2.3 - Estruturas de uma levedura típica, como as de Saccharomyces cerevisiae Fonte: COPERSUCAR,1987. Tabela 2.4 - Parâmetros físico-químicos da Saccharomyces cerevisiae

Parâmetros físico-químicos COPERSUCAR, 1987* LIMA E SATO, 2001** Umidade 5 -

Proteína (N*6,25)% 50 30-60 Gordura 6 1-6 Cinzas 7 5-10

*Saccharomyces cerevisiae cultivada em melaço de beterraba ** Composição média encontradas em leveduras

16

Tabela 2.5 - Composição da Saccharomyces cerevisiae

Aminoácidos Vitaminas (µg/g) Componentes inorgânicos

* (g/16gN) **(%) * ** * ** Lisina 8,2 3,33 Tianina 165 92,7 Potássio (%) 2,0 1,67 Valina 5,5 2,52 Riboflavina 100 35,6 Fósforo (%) 1,1 1,40 Leucina 7,9 3,48 Niacina 585 450 Cálcio (%) 0,4 0,12 Isoleucina 5,5 2,37 Piridoxina 20 37,1 Magnésio (%) 0,2 0,25 Treonina 4,8 2,27 Folacina 13 9,6 Enxofre (%) 0,4 0,42 Metionina 2,5 0,79 Pantonetato de cálcio 100 - Sódio (%) 0,2 0,07 Fenilalanina 4,5 1,96 Biotina 0,6 1,01 Zinco (µg/g) 42 39 Triptofano 1,2 0,55 Ácido p-amino

benzoico 106 110,7 Ferro (µg/g) 92 109

Cistina 1,6 0,53 Cloridrato de colina 2710 3949 Cobre (µg/g) 21 33 Histidina 4,0 1,17 Inositol 3000 Chumbo

(µg/g) 2,5 -

Tirosina 5,0 - Manganês (µg/g)

4,0 6,0

Arginina 5,0 - Iodo (µg/g) 1,6 0,36 *Saccharomyces cerevisiae cultivada em melaço de beterraba (COPERSUCAR, 1987). ** Saccharomyces cerevisiae originária de cervejarias (LIMA & SATO, 2001)

De acordo com as Tabelas 2.4 e 2.5 as leveduras possuem alto valor

proteico, variando entre 30 e 60%, é constituída principalmente por aminoácidos e

vitaminas. Os valores nutricionais destas proteínas produzidas são determinados

através de análises de aminoácidos presentes, destacando-se os teores de

aminoácidos essenciais (Tabela 2.4). A levedura Saccharomyces cerevisiae possui

em sua composição uma quantidade satisfatória de aminoácidos essenciais como

lisina, triptofano e treonina; a quantidade de proteína pode superar 45% sendo este

microrganismo de grande interesse nos estudos de produção de proteína

microbiana (LIMA & SATO, 2001).

A S. cerevisiae é um microrganismo facultativo, com capacidade de

crescimento em meios com ou sem a presença de oxigênio, a glicose é

metabolizada para etanol na fase exponencial de crescimento (aproximadamente

1,7 horas). Posteriormente, na fase de latência, o tempo de geração é em torno de

5 a 8 horas, demonstrando uma alta taxa de multiplicação (MORAES, 2001).

É uma levedura considerada como microrganismo seguro, do inglês

“generally regarded as safe” (GRAS) (HENSING et al., 1995; FRENKEN et al.,

2000), tornando possível a utilização desta para produção de alimentos, produtos

farmacêuticos. É uma das leveduras mais aplicadas e estudadas no que tange o

17

enriquecimento proteico de resíduos (HOLANDA et al., 1998; CAMPOS et al., 2003;

ARAÚJO et al., 2005; RABÊLO 2011).

Segundo BONANDER (2005) num processo fermentativo que ocorre o

consumo de substrato, a geração de biomassa e a formação de etanol, a S.

cerevisiae possui vantagens evolutivas, como a fase de produção de etanol

associada a uma maior taxa de crescimento específico quando comparada com a

fase respiratória, proporcionando a ela uma vantagem competitiva em relação aos

microrganismos não produtores de etanol, obtendo máximos rendimentos de

proteína antes que as células atinjam o fim da fase respiro-fermentativo.

As células de S. cerevisiae devem ser separadas imediatamente antes da

mudança desta fase para ocorrer a produção de proteína microbiana. Tem sido

relatado que o monitoramento de saída de gás e a concentração de glucose no

meio de cultura aumentam o rendimento de proteínas solúveis (FERNDAHL et

al.,2010; BONANDER, 2005).

Para DARBY (2012), a Saccharomyces é uma levedura de fácil cultivo, não

necessitando de equipamentos muito sofisticados quando comparado com outros

microrganismos. Além disso, é uma cepa bastante difundida em diversas

aplicações.

Para ARAÚJO et al. (2009), o aumento dos teores de proteína bruta dos

substratos, após o enriquecimento proteico com Saccharomyces cerevisiae tendo

como substrato, resíduos, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores

destes quando comparado a sua forma in natura.

JOSHI & SANDHU (1996) estudaram a produção de ração animal através

da fermentação da polpa de maçã residual de uma indústria de suco por

Saccharomyces cerevisiae, Cândidautilis e Torulautilis. Obtendo um incremento no

teor proteico de 5,8% para 16,8%; 18,5% e 15,7% para cada microrganismo,

respectivamente.

Segundo HOLANDA et al. (1998), para reaproveitamento do pedúnculo de

caju, aplicaram fermentação estado sólido para enriquecimento proteico. Após o

enriquecimento proteico, fazendo uso da levedura Saccharomyces cerevisiae com

uma inoculação de até 10% na pasta úmida do caju (suco + bagaço) concluíram

18

que houve um acréscimo de 20% no teor proteico com um tempo de fermentação

de 24 horas.

Apenas com o pedúnculo de caju, CAMPOS et al. (2003), obtiveram um

aumento proteico, após o processo fermentativo, de 2,5 vezes este resíduo

comparado a forma in natura, em um tempo de fermentação de 24 horas, o mesmo

encontrado por HOLANDA et al. (1998).

ARAÚJO et al. (2005), obtiveram um enriquecimento proteico de 26%,

utilizando como substrato a palma forrageira, sendo esse teor compatível ou maior

do que os concentrados convencionais utilizados como suplemento proteico para a

ração animal.

RABÊLO (2011) avaliando a utilização de algaroba (Prosopis juliflora) para

enriquecimento proteico com utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae,

obteve um fermentado com acréscimo de 17% de proteína, sendo este alcançado

depois de decorridas 96 horas de processo.

Para vacas em lactação, a substituição de 37% da proteína da ração por

proteína de leveduras apresentou maior eficiência digestiva e maior produção de

proteína no leite. Resultados positivos também foram obtidos utilizando 10%

leveduras secas (Saccharomyces cerevisiae) originária de destilaria de álcool de

cana-de-açúcar em matrizes suínas em crescimento, acabamento, gestação e

lactação. A utilização de 10% de leveduras secas, nas rações de pintos e galinhas,

apresentou resultados semelhantes (LIMA & SATO, 2001).

Apesar das inúmeras aplicações para Saccharomyces cerevisiae, muitos

dos resíduos empregados no cultivo e geração de biomassa desta levedura,

necessitam de uma etapa adicional de quebra de carboidratos complexos em seus

monômeros, isto se deve pelo fato de S. cerevisiae não possuir todas as enzimas

necessárias para esta finalidade, necessitando na maioria das vezes o uso de um

processo de quebra via hidrólise, podendo este ser químico ou enzimático. Quando

os substratos são oriundos de matérias primas amiláceas uma alternativa é o

emprego da hidrólise enzimática utilizando enzimas com atividades amilases.

2.5 Hidrólise enzimática

As enzimas são biocatalisadores que aumentam a velocidade das reações

químicas que ocorrem no interior das células, sem sofrer alterações dos agentes

19

envolvidos. São também utilizadas em processos industriais, e são obtidas por

processos fermentativos utilizando bactérias, leveduras e fungos. A atuação da

enzima possui como característica a catalise enzimática, consistindo na ligação

especifica da enzima aos seus substratos, esta reação ocorre no complexo

enzima/substrato (SCIPIONI et al., 2011; FELLOWS, 2006).

As enzimas com ação em cadeias amiláceas principalmente os amidos, são

denominadas amilases. Estas amilases degradam o amido pela hidrólise

glicosídica α-(1,4) e/ou α-(1,6), agindo em qualquer ponto do amido, danificando e

degradando-o, obtendo-se ao final monômeros de glicose, maltose e dextrina,

passiveis de serem utilizados em processos industriais (PANDEY et al., 2005).

A hidrólise dos compostos amiláceos pode ser realizada também com

produtos químicos (ácidos ou álcalis) ou podem pela combinação de produtos

químicos e enzimas (NIBA, 2005). No Brasil, a hidrólise química é bastante

utilizada devido seu baixo custo de investimento. SURMELY et al. (2004), relatam

que apesar da possibilidade de uso da hidrolise por via química, os hidrolisados

obtidos por via enzimática são os mais importantes amidos modificados comercias,

uma vez que este tipo de hidrolise não deixa resíduos tóxicos, ou incompatíveis

com a finalidade de aplicação, como por exemplo a indústria alimentícia. Entretanto

a produção via enzimática apresenta alto custo se comparada a hidrólise ácida.

Porém, apesar de apresentar custo maior quando comparado com hidrólise

química, o processo enzimático permite a fabricação de uma gama de hidrolisados

na mesma linha de equipamentos e para SEVERO et al. (2010), a hidrólise

enzimática apresenta vantagens como a especificidade, que proporciona a

obtenção de produtos com propriedades físicas e químicas definidas.

Já para FELLOWS (2006), as principais vantagens de utilizar a via

enzimática para modificação dos materiais amiláceos, em comparação da

utilização da via química, são as seguintes: as reações envolvendo enzimas

acontecem em condições mais branda de temperatura e pH, sendo altamente

especificas, reduzindo assim, reações indesejáveis. As enzimas demonstram a

capacidade de minimizar problemas ambientais, pois são conhecidas como

tecnologia limpa, e visam substituir gradativamente reações químicas atualmente

utilizadas em processos industriais.

20

De acordo com SPIER et al. (2006), o emprego de enzimas amilolíticas (alfa-

amilase) tem por objetivo modificar matérias-primas amiláceas e/ou obter produtos

específicos. Na indústria de alimentos destaca-se o emprego em modificações de

farinhas utilizadas em panificação para obtenção de açúcares.

Nesse contexto, o estudo da produção de proteína microbiana pelo emprego

da levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando subprodutos de agroindústrias,

por processo de hidrólise enzimática pela enzima alfa-amilase, torna-se alto o valor

nutricional e comercial presente no produto gerado. Além disso, possibilita a

reutilização de resíduos que poderiam gerar impactos ambientais quando

descartados inadequadamente ao meio ambiente.

21

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Substrato e microrganismos

O gérmen e a sêmola, utilizados como substrato, são provenientes do

moinho de trigo Agrícola Horizonte, localizado na região oeste do estado do Paraná.

A definição das mesclas foi realizada de acordo com o planejamento

experimental, sendo as proporções utilizadas: 75% gérmen e 25% sêmola, 50%

gérmen e 50% sêmola e 25% gérmen e 75% sêmola.

Como não existem relatos na literatura referentes ao emprego de sêmola e

gérmen como substratos para fermentação em estado sólido utilizando a levedura

Saccharomyces cerevisiae, nos primeiros ensaios foi testado a adição direta de

enzima aos substratos (75% gérmen 25% sêmola, 50% gérmen 50% sêmola e 25%

gérmen 75% sêmola). Foram adicionados 5000 ppm de enzima alfa-amilase (ficha

técnica Apêndice D), para hidrólise enzimática direta, após a adição a ação da

enzima foi durante o processo de extrusão, o qual consiste em aplicar pressão

(aproximadamente 50 bar), e temperatura (100°C), provocando a inativação dos

microrganismos, além de fazer com que os componentes se fundam formando um

único substrato e melhorando a disponibilidade de nutrientes para o processo.

Após, para a padronização de granulometria entre as mesclas de substrato

realizou-se um processo de moagem em moinho martelo. Após a moagem fez-se

a determinação da granulometria utilizando peneiras com abertura de 14, 20, 48,

80 e 100 Mesh. A determinação da granulometria foi utilizada somente para se

conhecer o tamanho das partículas que compunham o substrato, porém para a

fermentação e hidrólise utilizou-se todo o substrato, indiferente da granulometria,

uma vez que o objetivo desta pesquisa é o reaproveitamento destes subproduto na

integra.

Realizadas estas etapas o substrato foi armazenado em sacos de polietileno

para posteriormente realizar as fermentações em estado sólido.

3.2 Caracterização da mescla gérmen e sêmola

Para conhecer melhor as características dos substratos gérmen e sêmola, e

das diferentes mesclas de substrato os seguintes parâmetros foram analisados: pH,

22

proteína, gordura (extrato etéreo), cinzas (matéria mineral), açúcares não redutores

em sacarose, umidade, fibra bruta e carboidratos totais.

3.2.1 Verificação do pH

A metodologia utilizada para a determinação do pH, foi a proposta por

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008), com adaptações, o pH foi determinado de forma

direta com pHmetro da marca HANNA, modelo pH21, a descrição completa da

metodologia encontra-se no Anexo A.

3.2.2 Quantificação de proteína

Para a determinação da proteína foi utilizada a metodologia descrita por

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008) (Anexo A). A proteína foi quantificada para

caracterizar os substratos, bem como nos ensaios referentes ao planejamento

experimental, descrito no item 3.8.1, a qual foi calculado considerando o rendimento

de proteína inicial e final do processo Equação 3.1.

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 (%) =𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙−𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100 (3.1)

3.2.3 Quantificação de gordura

Para determinação de gordura foi utilizada a metodologia descrita por

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008). Esta análise foi realizada para caracterização

das mesclas dos substratos (Anexo A).

3.2.4 Determinação de Cinzas

A determinação de cinzas foi realizada conforme a metodologia descrita pelo

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008) (Anexo A).

3.2.5 Determinação de Açúcares não Redutores em Sacarose e carboidratos totais

O teor de açúcares não redutores em sacarose para fermentação foi

quantificada empregando o método de Lane-Eynon, descrita na Instrução

Normativa SDA Nº 20, de 21 de julho de 1999 – MAPA. Esta determinação também

23

foi realizada para os ensaios referente ao planejamento experimental item 3.4. Para

a hidrólise enzimática utilizou-se na quantificação de açúcares redutores a

metodologia proposta por MILLER (1959) (Anexo A).

3.2.6 Determinação umidade

A determinação de umidade foi realizada seguindo a metodologia descrita

no INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008) (Anexo A).

3.2.7 Determinação da Fibra Bruta

A determinação da fibra bruta foi realizada conforme metodologia do

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008) (Anexo A).

3.3 Descrição do Processo fermentativo

3.3.1 Planejamento experimental

Visando obter as melhores condições para o crescimento da levedura e

geração de proteína microbiana, foram testadas diferentes composições de mescla

de substrato, tempo de fermentação, e quantidade de água adicionada ao meio,

para isso, utilizou-se um planejamento experimental em blocos para rendimento de

proteína e fatorial completa (2³) com triplicata no ponto central, para crescimento

da levedura. A Tabela 3.1 apresenta as variáveis com seus respectivos níveis.

Tabela 3.1 - Variáveis e níveis que compõem a matriz do planejamento experimental completo 23com triplicata no ponto central e planejamento em blocos, tendo como resposta crescimento celular (log10UFCg-1) e enriquecimento proteico (%)

Variáveis Níveis

-1 0 +1

Adição de água (%)* 40 50 60

Substrato (sêmola / gérmen) 25/75 50/50 75/25

Tempo (h) 30 45 60

* Adição de água em porcentagem com base na massa de substrato

24

O delineamento do planejamento com seus respectivos níveis e fatores são

representados na Tabela 3.2 e 3.3.

Tabela 3.2 – Matriz do planejamento experimental em blocos, tendo como resposta enriquecimento

proteico(%)

Ensaios Adição de água (%) Substrato Tempo (h)

1 40(-1) 75G*-25S*(-1) 30(1) 2 60(1) 75G*-25S* (-1) 30(1) 3 40(-1) 25G*-75S*(1) 30(1) 4 60(1) 25G*-75S*(1) 30(1) 5 40(-1) 75G*-25S*(-1) 60(2) 6 60(1) 75G*-25S* (-1) 60(2) 7 40(-1) 25G*-75S*(1) 60(2) 8 60(1) 25G*-75S*(1) 60(2)

Tabela 3.3 – Matriz do planejamento experimental completo 23 com triplicata no ponto central, tendo como resposta crescimento celular (log10(UFCg-1) .

Ensaios Adição de água (%) Substrato Tempo (h)

1 40(-1) 75G*-25S*(-1) 30(-1) 2 60(1) 75G*-25S* (-1) 30(-1)) 3 40(-1) 25G*-75S*(1) 30(-1) 4 60(1) 25G*-75S*(1) 30(-1) 5 40(-1) 75G*-25S*(-1) 60(1) 6 60(1) 75G*-25S* (-1) 60(1) 7 40(-1) 25G*-75S*(1) 60(1) 8 60(1) 25G*-75S*(1) 60(1)

PC1 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0) PC2 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0) PC3 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0)

3.3.2 Microrganismo

O microrganismo utilizado foi a levedura Saccharomyces cerevisiae,

adquirida na forma de fermento liofilizado comercial, marca Fleischmann®.

3.3.3. Fermentação

As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer com volume de

125 mL, higienizados com álcool 70%, com algodão no bocal para evitar

contaminação e perda de umidade. Conforme Figura 3.1.

25

Figura 3.1 - Frascos Erlenmeyer utilizado na fermentação com substrato, água e microrganismos.

Em cada Erlenmeyer foi adicionado 25 gramas de substrato (mescla) e um

grama de Saccharomyces cerevisiae, representando 3,8% em massa. A adição da

levedura foi realizada diretamente no substrato, e a porcentagem de água destilada

com base na massa do substrato foi acrescida de acordo com o planejamento

experimental (Tabela 3.1).

Para cada ensaio foram utilizados onze frascos, sendo um o ponto zero com

objetivo de fornecer informações referentes ao início das análises, e os outros dez,

retirados a cada 3 horas para fermentação de 30 horas, a cada 4.5 horas para

fermentação de 45 horas e, de 6 em 6 horas para a fermentação de 60 horas. Todos

os ensaios realizados foram incubados a 30°C em estufa (Cielab®).

26

Em cada um dos tempos pré-determinados acima, um frasco era retirado da

estufa, e de forma asséptica, dois gramas de amostra eram retirados para leitura

do pH. O restante da amostra era armazenado em geladeira para posterior

determinação do crescimento celular, açúcares redutores e proteínas conforme

descrito no Anexo A.

3.4 Hidrolise enzimática

Para os ensaios posteriores, utilizou-se um Planejamento Experimental

(Tabela 3.4), aplicou-se o processo de hidrólise enzimática na mescla com

composição de 75% sêmola e 25% gérmen, com o objetivo de disponibilizar uma

maior concentração de açúcares redutores, para posterior fermentação. Para isso,

foi utilizada a enzima alfa-amilase de origem fúngica Grindamyl A14000 produzida

pela Danisco e gentilmente cedida pela empresa Candon Aditivos para Alimentos.

O planejamento experimental tipo Plackett-Burman (1946) foi utilizado, já

que este tipo de planejamento é eficiente em situações que envolvem uma grande

quantidade de variáveis a serem exploradas, foram realizados 12 ensaios com

sextuplicata no ponto central. A Matriz do planejamento Plackett-Burman, para a

hidrólise enzimática é apresentada na Tabela 3.4, sendo as variáveis estudadas:

temperatura, concentração de enzima, pH, tempo e quantidade de água, a Tabela

3.5 apresenta os valores dos níveis para cada fator utilizado nos experimentos,

obtendo como resposta açúcares redutores.

As condições definidas para as faixas de estudo deste planejamento, foram

baseadas e adaptadas de Konsula & Liakopoulou-Kyriakides (2004).

27

Tabela 3.4 - Matriz do planejamento Plackett-Burman, para a hidrólise enzimática da mescla de substrato 75%sêmola e 25% gérmen

Ensaio T (ºC) Tempo (h) pH Adição de água(mL)

Enzima(%)

1 1 -1 1 -1 -1 2 1 1 -1 1 -1 3 -1 1 1 -1 1 4 1 -1 1 1 -1 5 1 1 -1 1 1 6 1 1 1 -1 1 7 -1 1 1 1 -1 8 -1 -1 1 1 1 9 -1 -1 -1 1 1

10 1 -1 -1 -1 1 11 -1 1 -1 -1 -1 12 -1 -1 -1 -1 -1 13 0 0 0 0 0 14 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 16 0 0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0

Tabela 3.5 – Variáveis e valores dos níveis referente a hidrólise enzimática para a mescla de substrato 75% sêmola e 25% gérmen.

Níveis Variável

-1 0 +1

Temperatura (°C) 25 30 35 Tempo (h) 8 16 24

pH 5 6 7 Adição de água em (mL) 70 100 130

Enzimas(%) 1% 3% 5%

O processo de hidrólise enzimática foi realizado utilizando-se um erlenmeyer

graduado de 250 mL, adicionou-se 25 gramas de substrato (mescla 75% sêmola e

25% gérmen), a quantidade de água, concentração de enzima, ajuste do pH,

temperatura e o tempo de hidrólise foram realizados de acordo com a matriz dos

planejamentos experimentais Tabela 3.4. Durante o processo, a agitação foi

realizada em incubadora com agitação orbital (Solab Cientifica, SL222/CFR),

mantida constante em 100 rpm, e a cada 2 horas foi retirado uma amostra com

aproximadamente 3 gramas.

Esta amostra foi centrifugada a 6400rpm por aproximadamente 3 minutos, a

quantificação dos açúcares redutores liberados ao longo do processo de hidrólise,

foi realizada com o sobrenadante obtido aos centrifugação, a metodologia

empregada foi a proposta por MILLER (1959) (Anexo).

28

3.4.1 Otimização da hidrólise enzimática

Para otimização da etapa de hidrólise enzimática, utilizou-se um

planejamento DCCR, sendo seis pontos centrais conforme matriz descrita na

Tabela 3.6, a escolha por este tipo de planejamento deve-se ao fato deste permitir

a sua utilização em estudos voltados para a seleção de fatores, e também por ter

a vantagem relevante de neste tipo de experimento apresentar um maior número

de graus de liberdade para o resíduo. As variáveis e valores de níveis estudados

foram: temperatura, enzima e adição de água, conforme Tabela 3.6. Foi

considerando constante o pH 6,3, a agitação em 100 RPM, tempo de hidrólise em

12 horas. A metodologia para a realização do processo de hidrolise foi a mesma do

item 3.4.

As condições definidas na Tabela 3.7 foram obtidas a partir dos resultados

referente ao planejamento experimental Plackett-Burman (item 3.5), e também

levando-se em consideração o estudo realizado por KONSULA & LIAKOPOULOU-

KYRIAKIDES (2004).

Tabela 3.6 - Matriz da otimização do planejamento experimental DCCR com sextuplicata no ponto

central), utilizando a mescla de substrato 75%sêmola e 25%gérmen

Experimentos Adição de água (mL) Enzima(%) Temperatura (°C)

1 -1 -1 -1

2 1 -1 -1

3 -1 1 -1

4 1 1 -1

5 -1 -1 1

6 1 -1 1

7 -1 1 1

8 1 1 1

9 -1,68 0 0

10 1,68 0 0

11 0 -1,68 0

12 0 1,68 0

13 0 0 -1,68

14 0 0 1,68

PC 0 0 0

PC 0 0 0

PC 0 0 0

PC 0 0 0

PC 0 0 0

PC 0 0 0

29

Tabela 3.7 - Variáveis e seus respectivos valores de nível para otimização do processo de hidrólise.

Variáveis -1,68 -1 0 -1 1,68

Temperatura(°C) 31,6 35 40 35 48,4

Enzima (%) 3,3 5 7,5 5 11,7

Adição de água (mL) 43,6 50 60 50 76,8

3.5 Análises estatísticas dos dados

Os tratamentos estatísticos dos dados de crescimento celular, produção de

proteína microbiana, e açúcares redutores foram feitos através da ANOVA

utilizando o pacote estatístico Statistica® 8.

As respostas dos experimentos obtidas foram crescimento celular (UFCg-1),

rendimento de proteínas (%), açúcares redutores (g L-1).

3.6 Fermentação com matérial hidrolisado

Após obter a melhor condição de hidrólise enzimática, realizou-se duas

fermentações com tempo de 60 horas conforme ensaio 08 do Tabela 3.2, e 30 horas

conforme ensaio 03 planejamento Tabelas 3.3, de acordo com as melhores

condições de rendimento de proteína e crescimento microbiano. As condições de

hidrólise foram: agitação de 100rpm, pH 6,3, temperatura 45°C, enzima 10%,

adição de água de 50%, e o tempo de 12 horas, sendo esta a melhor condição da

hidrólise. Após a hidrólise o substrato foi seco em estufa e moído em moinho

martelo para a fermentação.

30

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Caracterização dos substratos

A Tabela 4.1 apresenta a granulometria média dos substratos utilizados na

fermentação e no processo de hidrólise enzimática.

Tabela 4.1 - Granulometria (% de retenção) das mesclas dos substratos (75% gérmen 25% sêmola, 50% sêmola e 50% gérmen e 25% gérmen e 75% sêmola)

Mesh Abertura (mm)

75% gérmen 25% sêmola

50% sêmola e 50% gérmen

25% gérmen e 75% sêmola

14 1,18 9,06 10,32 10,65 20 0,850 9,15 8.93 8,05 48 0,300 53,04 52,14 50,18 80 0,180 18,45 18.94 19,37 100 0,150 6,33 5,24 4,21

>100 <0,150 3,97 4,43 7,54

Na Tabela 4.1 verifica-se que mais de 65% da quantidade de partículas

presentes nas mesclas dos substratos ficaram retidos nas peneiras com abertura

Mesh inferior a 48 (maiores de 0,300 mm), percebe-se também uma

homogeneidade na granulometria dos substratos nas diferentes mesclas (75%

gérmen 25% sêmola, 50% sêmola e 50% gérmen e 25% gérmen e 75% sêmola), o

que é favorável, pois o tamanho das partículas influencia no processo de

fermentação em estado sólido, o que para fins de comparação das diferentes

mesclas não é um fator que terá influência significativa devido a baixa variação.

Para RABELO (2011), uma variação entre os tamanhos da granulometria do

substrato pode ser considerada como ponto positivo para aplicação da fermentação

em estado sólido. Segundo o mesmo autor, a granulometria do substrato e a

espessura são fatores importantes a serem observados, pois podem gerar

compactação do substrato, diminuir a taxa de aeração e da dissipação de calor

afetando o crescimento do microrganismo.

No estudo realizado por VENDRUSCOLO et al. (2007), investigaram a

fermentação em estado sólido de bagaço de maçã, utilizando fungo filamentoso

Gongronella butleri CCT4274, a granulometria utilizada foi na faixa de 0,85 a

1,7mm, e segundo os autores proporcionou maior produção de proteína solúvel,

atingindo valores médios de 19,24%. SANTOS (2007), utilizando pedúnculo de caju

como substrato, e Aspergillus niger CCT 0916 para a produção de pectinase relata

em seu estudo que, mais de 70% das partículas apresentaram granulometria entre

31

0,42-0,84 mm, e atingiram o pico de produção de proteína microbiana, com 22

horas quando o substrato foi lavado e 30 horas para substrato sem lavar. Já

HENNIES (1996) estudando a produção de proteína microbiana, com Penicillium

italicum e substrato bagaço de laranja em fermentação estado sólido, para

produção de pectinase usou partículas com tamanho aproximado de 0,71 mm, e

obteve melhores resultados em 120 horas de fermentação. Demonstrando que é

possível utilizar substratos com variados tamanhos de partículas para a FES.

A Tabela 4.2 apresenta a caracterização dos substratos em relação a

carboidratos totais, proteína, extrato etéreo, umidade, matéria mineral e fibra bruta,

utilizados nas fermentações, para as mesclas 75% gérmen 25% sêmola, 50%

gérmen 50% sêmola e 25% gérmen 75% sêmola.

Tabela 4.2 - Caracterização do substrato para as diferentes composições de mescla (75% gérmen

25% sêmola (-1)*, 50% gérmen 50% sêmola(0)** e 25% gérmen 75% sêmola(+1)***).

Análise (-1)* (0)** (+1)***

Carboidratos Totais 37,39 46,38 55,37

Proteína 23,52 21,11 16,52

Extrato Etéreo 6,08 5,11 3,5

Umidade 6,12 6,26 4,6

Matéria Mineral 3,5 2,86 1,6

Fibra Bruta 0,82 1,74 2,06

*Nível (-1) do planejamento fatorial completo com variável resposta proteína (%), e crescimento microbiano (log10(UFC g-1)). ** Nível (0) do planejamento fatorial completo com variável resposta proteína (%), e crescimento microbiano (log10(UFC g-1)). *** Nível (+1) do planejamento fatorial completo com variável resposta proteína (%), e crescimento microbiano (log10(UFC g-1)).

A sêmola tem em sua composição, elevados teores de amido e fibras, desta

forma nas mesclas com maiores teores de sêmola são obtidos maiores

concentração de carboidratos totais conforme apresentado na Tabela 4.2. Já o

gérmen, contém maior quantidade de extrato etéreo, matéria mineral e proteína,

parâmetros que influenciam diretamente nas mesclas que possuem em sua

composição maior concentração deste substrato.

De modo geral, observando a Tabela 4.2 verifica-se que os substratos

gérmen e sêmola apresentam em sua composição os nutrientes necessários e

passiveis de serem utilizadas em um processo fermentativo.

32

A Tabela 4.3 apresenta a composição físico-química da sêmola e do gérmen

obtidas no presente estudo comparadas os de NUNES et al. (2001) e CHANG &

FLORES (2004).

Tabela 4.3 - Composição físico-química da sêmola e do gérmen.

Substrato MS% PB% EE% FB%

Triguilho/Sêmola* 88,23 13,33 2,19 7,3

Gérmen de trigo* 88,32 28,22 9,56 2,49

Sêmola** - 14,03 0,51 -

Sêmola 85,03 12,17 0,4 -

Gérmen de trigo 90,05 37,14 9,52 2,58

MS= matéria seca; PB= Proteína bruta; EE= extrato etéreo; FB= fibra bruta *Nunes et al. (2001) **Chang & Flores (2004)

Verifica-se na caracterização dos componentes da sêmola apresentado na

Tabela 4.3, que o presente estudo obteve 12,17% de proteína, valor este menor

que os obtidos por NUNES et al. (2001) (13,33%) e CHANG & FLORES (2004)

(14,03%), já para o gérmen de trigo, o valor obtido para a proteína (37,14 %) foi

maior que o obtido por CHANG & FLORES (2004) (28,22%).

Em relação ao extrato etéreo para o gérmen não houve diferença

significativa entre os resultados obtidos neste estudo (9,52) e os obtidos por

NUNES et al. (2001) (9,56). A sêmola apresentou neste estudo valores para o

extrato etéreo (0,4%) próximos aos obtidos pelos autores CHANG & FLORES

(2004), 0,51%, entretanto divergentes aos obtidos por NUNES et al. (2001) (2,19).

Estas diferenças de composição podem estar diretamente relacionadas com a

cultivar do trigo.

Em relação à matéria seca e fibra bruta, os valores referentes ao subproduto

gérmen apresentaram valores próximos aos obtidos por CHANG & FLORES (2004)

em seu estudo. O mesmo ocorre para a sêmola em relação a matéria seca, cujo

resultados obtidos no presente estudo são próximos ao obtidos pelos autores

NUNES et al. (2001) e CHANG & FLORES (2004).

CHANG & FLORES (2004), relatam que os maiores conteúdos de proteína,

cinzas, lipídios e maior intensidade de cor são apresentados na semolina de trigo

durum, porém no Brasil não está difundido este cultivar de trigo durum, sendo mais

comim o cultivo do trigo da cultivar Triticum aestivum e Triticum compactum

(ABITRIGO, 2014b)

33

NUNES et al. (2001) em seu estudo destacam que além de elevadas

porcentagens de proteína, extrato etéreo, e fibras, a semolina e o gérmen

apresentam, concentrações significativas de minerais, conforme Tabela 4.4.

Tabela 4.4 - Composição mineral e matéria mineral do gérmen e da sêmola.

Substrato MM

%

Ca

%

P

%

Mg

%

K

%

Na

%

Fe

ppm

Cu

ppm

Mn

ppm

Zn

ppm

Triguilho/Sêmola

2,52 0,13 0,43 0,17 0,43 0,02 168,85 26,33 36,49 69,70

Gérmen de trigo

4,01 0,09 0,84 0,22 0,79 0,01 110,62 2,44 119,0 204,3

Fonte: NUNES et al (2001)

Apesar de não ter sido realizado no presente estudo a caracterização dos

componentes minerais presentes na MS, e como os resultados físico-químicos

referentes aos macroelementos (proteína, extrato etéreo, fibra bruta) foram

similares aos obtidos por NUNES et al (2001), é possível correlacionar o presente

estudo com os resultados apresentados na Tabela 4.4, observa-se que ambos os

substratos estão presentes concentrações significativas de minerais, o que

favorece ainda mais a aplicação destes subprodutos em processos fermentativos,

já que contem em sua composição, não somente macroelementos essenciais para

o crescimento de microrganismos, mas também os microelementos responsáveis

pelo funcionamento do organismo, para realização das funções vitais (LOUREDO,

2014).

CAPITANI et al, (2011), destacam ainda que o gérmen contém altos teores

de vitamina E, ácidos graxos poli-insaturados e ácido linoleico, trazendo benefícios

para a saúde quando ingeridos.

4.2 Avaliação das condições para produção de proteína e crescimento

microbiano

A Tabela 4.5 apresenta os resultados obtidos para a matriz do planejamento

fatorial completo com as variáveis reais e codificadas que foram investigadas,

sendo enriquecimento de proteína (%) a resposta obtida.

34

Tabela 4.5 - Matriz do planejamento experimental em blocos, com as variáveis investigadas (Adição de água (%), mescla do substrato e o bloco tempo (h)) e a média da resposta obtida: Enriquecimento Proteico (%)

Ensaios Adição de água (%) Substrato Tempo (h) Enriquecimento

Proteico (%)

1 40(-1) 75G*-25S*(-1) 30(-1) -2,36

2 60(1) 75G*-25S* (-1) 30(-1)) -5,88

3 40(-1) 25G*-75S*(1) 30(-1) -2,73

4 60(1) 25G*-75S*(1) 30(-1) 2,5

5 40(-1) 75G*-25S* (-1) 60(1) 0,00

6 60(1) 75G*-25S* (-1) 60(1) 1,81

7 40(-1) 25G*-75S*(1) 60(1) 4,92

8 60(1) 25G*-75S*(1) 60(1) 10,68 *G=gérmen e S=sêmola

Os resultados do planejamento experimental apresentado na Tabela 4.5,

observa-se que para os ensaios 1 a 3 não houveram enriquecimento proteico, ou

melhor, ocorreu diminuição do teor de proteínas, no tempo no nível inferior (30

horas), somente para o ensaio 4 a proteína final foi maior que a inicial. Já, no nível

de tempo superior (60 horas) se verificou o enriquecimento proteico mais elevado

Observa-se também, na Tabela 4.5 que ocorreram variações na produção

de proteína, sendo que algumas ao final das fermentações apresentaram

variações. SILVA (2007), comenta que durante a fermentação podem surgir

diversos fatores como contaminação do meio, pH, temperatura e a condição de

anaerobiose ou aerobiose em diferentes fases, que podem alterar a produção

desejada (proteína), devido à interferência que causam na atividade celular da

levedura possibilitando a lise celular, e consequente perda de proteína

RABELO (2011), avaliando o enriquecimento proteico de Algaroba com

Saccharomyces cerevisiae também observou um declínio acentuado na quantidade

de proteína, o autor relata em seu estudo que a queda foi ocasionada

possivelmente pelo esgotamento do substrato ou pela produção de proteases, as

quais podem ter agredido a parede celular, promovendo o declínio do teor de

proteína.

ARAUJO et al. (2005), com enriquecimento proteico de Cactus Pear,

utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae em fermentação em estado sólido,

observaram um incremento no teor de proteínas nas primeiras 48 horas de

35

fermentação, com uma posterior queda acentuada até o final da fermentação, de

72 horas. Os autores concluíram que essa queda na porcentagem de proteína pode

ser atribuída a uma provável desnaturação da proteína celular, após as 48 horas

de fermentação, evidenciando que o tempo é um fator a ser considerado em um

processo fermentativo.

Para analisar e avaliar estatisticamente os resultados obtidos neste trabalho

foram utilizados a estimativa dos efeitos principais e de interação das variáveis e

blocos (Tabela 4.6) e gráfico de Pareto (Figura 4.1).

Na Tabela 4.6 encontra-se a estimativa dos efeitos principais e de interação

entre as variáveis e blocos utilizados no planejamento experimental, para um nível

de significância (α=0,05).

Tabela 4.6 - Tabela de efeitos e interações utilizando planejamento em blocos para resposta enriquecimento proteico (%)

Efeito

Erro

padrão P Coef.

Coef. erro

padrão

Media/Interação. 1,118 0,687 0,203 1,625 1,118

Bloco tempo(1) 6,470 1,375 0,018 4,704 3,235 Adição de água (%) 2,320 1,375 0,190 1,687 1,160

(2) Substrato 5,450 1,375 0,028 3,963 2,725 Adição de água (%)

XSubstrato 3,175 1,375 0,104 2,309 1,587

R2=93,88

De acordo com a Tabela 4.6, verifica-se que, dentre as variáveis estudadas,

o substrato e o bloco tempo apresentou significância ao nível de 95% (p-

valor<0,05). A influência das variáveis pode ser melhor observada no gráfico de

Pareto apresentada na Figura 4.1.

36

Figura 4.1 – Diagrama de Pareto com efeito das variáveis estudadas no planejamento em blocos- avaliando a adição de água (%), mescla do substrato e o bloco tempo (h) no enriquecimento de proteico (%).

Os resultados do Diagrama de Pareto (Figura 4.1), para o planejamento

realizado com o intuito de resposta o enriquecimento proteico, a variável substrato

e o bloco tempo tiveram efeito significativo (p>0,05), e positivo, ou seja, com o

aumento de tempo e acréscimo de sêmola no substrato é possível obter maior

rendimento de proteína.

Na Tabela 4.7 observa-se a ANOVA para a resposta enriquecimento de

proteína.

Tabela 4.7 - Tabela ANOVA para planejamento experimental em blocos, tendo como resposta

enriquecimento proteico (%).

SQ GL MQ F-cal p-valor

Blocos 83,722 1 83,722 22,132 0,018

(1) Adição de água (%) 10,765 1 10,765 2,8457 0,190

(2) Substrato 59,405 1 59,405 15,703 0,029

Adição de água (%) XSubstrato 20,161 1 20,161 5,329 0,104

Resíduo 11,349 3 3,782

Total SQ 185,401 7

R2 =93,88

37

A análise dos resultados da ANOVA apresentados na Tabela 4.7, para o

cálculo do teste F com objetivo de validação do modelo para descrever o

enriquecimento proteico, verifica-se que os dados possuem um coeficiente de

determinação (R2) elevado (R2 =93,88).

Neste caso, a variação na geração de proteínas e a discrepância dos valores

encontrados em alguns ensaios (valores negativos), é devido possivelmente

conforme já relatado anteriormente por perdas deste material (proteína) ao longo

do processo fermentativo.

A Figura 4.2 apresenta a melhor cinética (ensaio 08) para a produção de

proteína, sendo o consumo de açucares redutores expresso em (gL-1), a produção

proteína em (%) e pH ao longo de 60 horas de fermentação, neste ensaio foi

utilizando como substrato as concentrações de 75% sêmola e 25 % gérmen e maior

porcentagem de adição de água (60% com base no peso seco).

Figura 4.2 - Perfil da produção de (■) proteína (%), ( ) consumo de açucares redutores (g 100g-1)

e (•)pH, ao longo de 60 horas de fermentação referentes ao ensaio 8

No ensaio cinético (Figura 4.2), observa-se que houve um incremento de

proteína de 11,6% em 48 horas de fermentação com posterior decréscimo até 60

horas (10,68%). Verifica-se também que não ocorreu consumo de açúcares

redutores de forma expressiva, sendo esta, uma hipótese para o baixo incremento

38

de proteína, o substrato não estaria disponibilizando nutrientes (carboidratos) para

que a fermentação ocorre-se.

HOLANDA et al. (1998), utilizando pedúnculo do caju com Saccharomyces

cerevisiae, obtiveram em 24 horas de fermentação 20% de elevação no conteúdo

proteico, os autores comentam que por não ter sido adicionado nitrogênio

inorgânico nos tratamentos, o aumento do percentual de proteína encontrado se

justifica pela diminuição da matéria seca na conversão do substrato em produto

quando parte do carbono é perdido na forma de CO2. CAMPOS et al. (2003),

avaliaram a fermentação bagaço do pedúnculo do caju em fermentação com

Saccharomyces cerevisiae, o intervalo de tempo que proporcionou os maiores

incrementos na quantidade de proteína obtida foi entre 24 e 32 horas de

fermentação, os autores atribuem este tempo pela facilidade de degradação dos

carboidratos contidos no caju.

Observa-se, na figura 4.2, que não houve o esgotamento do substrato

durante o tempo de fermentação. Este comportamento é similar em todos os

ensaios (Apêndice A), sendo que na maioria dos experimentos realizados não

ocorreu formação de conteúdo proteico.

A análise estatística para a produção de proteína, indicou que não houve

uma produção significativa, com base nisso realizou-se novamente a análise

utilizando como resposta o crescimento microbiano.

Segundo SILVA et al., (1997), a contagem de microrganismos em placas

expressa por Unidade Formadora de Colônia (UFC) tem como princípio a

capacidade de que cada célula de microrganismo presente em uma amostra tem

de formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia

visível e isolada, e é na maioria das vezes utilizada como resposta em processos

envolvendo microrganismos.

A Tabela 4.8 apresenta os resultados obtidos para o crescimento microbiano

expressos em log10UFCg-1 para os ensaios da matriz do planejamento fatorial

completo.

39

Tabela 4.8 - Matriz do planejamento experimental fatorial completo (23 com triplicata no ponto central), com as variáveis investigadas (Adição de água (%), mescla do substrato e tempo (h)) e a média da resposta obtida: Crescimento Microbiano (log10 UFC g-1)

Ensaios Adição de água (%) Substrato* Tempo (h) Crescimento microbiano

(log10 UFCg-1)

1 40(-1) 75G*-25S*(-1) 30(-1) 7,03

2 60(1) 75G*-25S* (-1) 30(-1)) 6,93

3 40(-1) 25G*-75S*(1) 30(-1) 8,00

4 60(1) 25G*-75S*(1) 30(-1) 6,84

5 40(-1) 75G*-25S*(-1) 60(1) 5,57

6 60(1) 75G*-25S* (-1) 60(1) 6,91

7 40(-1) 25G*-75S*(1) 60(1) 7,56

8 60(1) 25G*-75S*(1) 60(1) 5,46

PC 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0) 6,33

PC 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0) 6,30

PC 50(0) 50G*-50S*(0) 45(0) 6,99

*G=gérmen e S=sêmola

Verifica-se na Tabela 4.8 que o ensaio 3 foi o que apresentou o maior

crescimento (8 log10 UFCg-1), que corresponde a 10,1x107 UFCg-1, seguido pelo

ensaio 7 (7,56 log10 UFCg-1) correspondente a 3,6x107 UFCg-1, verifica-se que

nestes dois ensaios foi utilizada a mesma quantidade de água (40% sobre massa

seca), e mescla de substratos (75% sêmola e 25% gérmen), sendo apenas o tempo

de fermentação distinto.

Os ensaios 3, 6 e 7 (Tabela 4.8), foram os que apresentaram os valores mais

expressivos para produção de células, é possível verificar que as condições

utilizadas nestes ensaios em relação ao substrato, foram novamente as que

possuíam em sua composição menor concentração de gérmen (25%) e maior

concentração de sêmola (75%). Evidenciando desta forma que maiores

concentrações de sêmola favorecem o crescimento de S. cerevisiae, assim como

a produção de proteína.

Também, verifica-se na Tabela 4.8 que quanto menor o tempo de

fermentação maior é o crescimento celular obtido.

Estas influências (composição da mescla, tempo e umidade) estão melhor

evidenciadas na Tabela 4.9, são demonstradas suas interações, o valor de p-valor,

erro padrão, coeficiente das variáveis para o planejamento e o coeficiente de

determinação (R2) ao nível de significância de 10%(α=0,10).

40

Tabela 4.9 - Tabela de efeitos e interações– tendo como resposta concentração celular (log10 UFC g-1), utilizando planejamento fatorial completo.

Efeito Erro

Padrão

p Coeficiente Erro

Padrão

Media/ interação 6,720 0,161 0,000 6,720 0,161

(1)Adição de água (%) -0,505 0,378 0,253 -0,253 0,189

(2)Mescla de substrato 0,355 0,378 0,401 0,178 0,189

(3)Tempo (h) -0,825 0,378 0,095 -0,413 0,189

(1) Adição de água (%) X Mescla de substrato

-1,125 0,378 0,041 -0,563 0,189

(1) Adição de água (%) X Tempo (h)

0,125 0,378 0,757 0,063 0,189

Mescla de substrato x Tempo (h)

-0,085 0,378 0,833 -0,043 0,189

R2=80,40

De acordo com a tabela 4.9, verifica-se que, entre as variáveis estudadas o

tempo de fermentação e a interação entre a adição de água e mescla de substrato

são significativas, ou seja, possuem influencia na produção de células, dentro do

intervalo de confiança de 90%(p-valor<0,1). Esta significância é melhor observada

no gráfico de Pareto (Figura 4.3).

41

Figura 4.3 - Diagrama de Pareto com efeito das variáveis estudadas no planejamento fatorial completo (23 com triplicata no ponto central)- avaliando a adição de água (%), mescla do substrato e tempo (h) na geração da concentração celular (log10 UFC g-1)

Os resultados do Diagrama de Pareto (Figura 4.3), para a resposta

crescimento microbiana (log10 UFCg-1), observou-se que a interação mescla de

substrato e adição de água e a variável tempo (h) tiveram efeito significativo

positivo, ou seja, a redução da influência destas variáveis levaria a uma maior

produção de células. A variável tempo (h) teve efeito negativo significativo no

intervalo de confiança de 90% o que indica que, em trabalhos futuros um

deslocamento dos níveis de concentração para valores inferiores poderia levar a

um maior aumento na produção de células.

Os maiores valores de crescimento microbiano foram obtidos com a mescla

de substrato onde em sua concentração a maior quantidade era proveniente do

subproduto sêmola, se analisarmos a tabela 4.2 a composição da mescla 25

gérmen e 75% sêmola (+1), apresenta uma concentração de carboidrato, 55,37%,

sendo 17,98% a mais de carboidrato, se quando comparada com a mescla de

menor concentração -1 (37,39%) na mescla 75% gérmen 25% sêmola, verifica-se

que primeira mescla foi a que apresentou a maior quantidade de fonte de carbono

e segundo SCHARMILA et al. (2013), a fonte de carboidrato é um fator limitante na

42

produção de metabolitos microbianos, uma vez que este composto é essencial para

gerar energia para a célula e prover as atividades metabólicas celulares.

De acordo com AQUARONE et al.(2001), divide-se a curva de crescimento

em quatro fases, fase lag ou latência, exponencial, estacionária e declínio ou lise.

A primeira o microrganismo está se adaptando ao meio, nesta fase não a há

crescimento significativo, na segunda fase ocorre o maior crescimento e também o

maior consumo de substrato e geração de biomassa (células das leveduras) até

atingir a fase estacionaria, nesta fase ocorre o esgotamento do substrato ou o meio

não está propício ao desenvolvimento de células, o tempo de duração desta fase é

até quando a autólise se torna superior ao desenvolvimento das leveduras.

BEKATOROU et al. (2006) relata que dependendo das condições do meio a

levedura Saccharomyces cerevisiae tem seu ciclo de reprodução muito rápido

quando comparado com outros microrganismos, podendo alcançar o final da fase

exponencial em até 24 horas, evidenciando que o tempo de fermentação pode

prover a produção de células ou ocasionar a sua morte, sendo este um parâmetro

que deve ser investigado, e definido.

SILVA (2007) relata que em processos fermentativos cujo o objetivo é a

produção de etanol utilizando S. cerevisiae, a duração do experimento é de até 36

horas, pois este microrganismo tem sua reprodução já iniciada após 30 minutos de

fermentação.

As Tabela 4.10 (a) e (b) apresentam a análise de variância (ANOVA) e

cálculo da estatística F para os resultados obtidos do crescimento de leveduras.

43

Tabela 4.10(a) - Tabela ANOVA para planejamento experimental fatorial completo (23 com triplicata no ponto central), tendo como resposta crescimento da levedura Sacharomyces cerevisiae.

Soma quadrática

(SQ)

Graus de liberdade

(GL)

Média Quadrática

(MQ)

F p-valor

(1)Adição de água (%) 0,510 1 0,510 1,780 0,253

(2)Mescla de substrato 0,252 1 0,252 0,880 0,401

(3)Tempo (h) 1,361 1 1,361 4,752 0,094

(1)Adição de água (%)X

Mescla de substrato

2,531 1 2,531 8,836 0,041

(1)Adição de água (%) X

Tempo (h)

0,031 1 0,031 0,109 0,758

Mescla de substrato x Tempo

(h)

0,014 1 0,014 0,050 0,833

Erro 1,146 4 0,286

Total Soma Quadrática 5,846 10

Tabela 4.10(b) - Cálculo da Estatística F para validação do modelo do planejamento experimental fatorial completo (23 com triplicata no ponto central), tendo como resposta crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae

Fonte de variação

Soma quadrática (SQ)

Graus de liberdade

(GL)

Média Quadrática

(MQ)

F calculado

Modelo 4,700 6 0,783 2,72

Resíduo 1,146 4 0,287

Total SQ 5,846 10

R2 =80,40

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 4.10 (a) e (b),

demonstra os parâmetros de F-valor e o coeficiente de determinação (p <0,05).

Segundo MYERS & MONTGOMERY (1995), o coeficiente de correlação (R2) é uma

ferramenta utilizada para verificar a "qualidade do ajuste" entre o experimental e os

resultados previstos, neste caso, como o valor de R2 obtido foi de 0,8040.

De acordo com o nível de confiança de 90% Tabela 4.10(b), a regressão

correspondente não é significativa onde Fcal=2,72 é menor que o Ftab

(6;4;0,1)=4,01 (Anexo B, Tabela B.2) ou seja, o modelo não é considerado validado

para ajustar os dados.

Além disso, segundo BOX et al. (1978), para que uma regressão seja não

apenas significativa, mas também útil para fins preditivos, a relação de

Fcalculado/Ftabelado deve ser superior a três. No caso deste estudo, a relação

para a regressão apresentou um valor de 0,678, ficando abaixo da relação

esperada.

44

Apesar dos resultados obtidos não proporcionarem a geração de um modelo

matemático, é possível obter respostas em relação a tendência deste modelo. A

Figura 4.4 (a) e (b) apresentam as respostas gráficas obtidas referentes aos valores

preditos x resíduo e diagrama de dispersão.

(a) (b)

Figura 4.4 - (a) Valores preditos x resíduos e (b) Diagrama de dispersão obtidos no planejamento fatorial 23 para o crescimento celular.

Observa-se na Figura 4.4 (a) que os pontos estão dispersos aleatoriamente

em torno do zero, já na Figura 4.4 (b) os pontos encontram-se dispersos em torno

da reta, indicando que o modelo descreve adequadamente o processo.

Para as variáveis significativas, é possível perceber as tendências de

crescimento através da superfície de resposta e curva de nível que estão

apresentadas nas Figuras 4.5 (a) e (b)

45

(a)

(b)

Figura 4.5 - (a) Superfície de resposta para as variáveis mescla de substrato e adição de água (%).(b)Curva de níveis para as variáveis significativas mescla de substratos e adição de água (%)

Conforme se verifica nas Figuras 4.5 (a) e (b) para se obter um maior

crescimento celular é necessário um aumento na concentração de sêmola na

mescla e, uma a redução no acréscimo de água ao substrato.

46

As Figuras 4.6 (a) e (b), 4.7 (a) e (b) e 4.8 (a) e (b) apresentam o crescimento

e consumo de substrato pela levedura Saccharomyces cerevisiae ao longo dos

tempos de fermentação estabelecidos no planejamento experimental fatorial

completo (Tabela 4.8), para os ensaios 1, 2, 3 e 4; 5, 6, 7 e 8; e pontos centrais,

respectivamente.

(a) (b)

Figura 4.6 - (a) Perfil do crescimento (log 10(UFCg-1); (b)consumo de substrato (g100g-1) para as

condições referentes aos ■ensaio 1, •ensaio 2, ▲ensaio 3 e ensaio 4 do

planejamento experimental completo

(a) (b)


condições referentes aos ■ensaio 5, •ensaio 6, ▲ensaio 7 e ensaio 8 do

planejamento experimental completo

47

(a) (b)


condições referentes aos ■ ponto central, • ponto central 01, ▲ponto central 02, do planejamento

experimental completo.

Observa-se que os baixos valores de concentração de proteínas obtidos e o

crescimento celular sem elevada multiplicação celular (Figura 4.6 (a), 4.7(a) e 4.8(a)

e um consumo de açúcares não expressivos (Figura 4.6 (b), 4.7(b) e 4.8(b)),

evidenciam que pode ter ocorrido falta de disponibilidade de nutrientes para a

produção (proteína e crescimento celular), podendo estar relacionado ao fato do

amido ser uma cadeia complexa, e o processo utilizado para hidrolisá-lo

inicialmente (item 3.1) não ter sido eficiente ou suficiente.

Ao avaliar a Figura 4.8, verifica-se que o ensaio 03 foi o que apresentou

maior crescimento celular ao longo do tempo de fermentação (inicial 20x106 UFCg-

1 e final 10,1x107 UFCg-1), quando em comparação as demais condições testadas.

Evidenciando o aumento de um ciclo logaritmo (crescimento celular) em relação ao

valor inicial, o que corresponde a 5,05 vezes o valor da concentração inicial

presente no meio. Neste ensaio também é possível verificar que houve um

consumo de açúcares pela levedura, porém não de forma acentuada, percebe-se

que para todas as condições testadas, pouco ou nenhum consumo de fonte de

carbono foi observado, o que pode explicar o baixo crescimento celular obtido nem

todos os ensaios.

Segundo ZANIN et al. (2000), o amido pode não ser diretamente

fermentável, necessitando de uma hidrólise prévia de suas cadeias para a obtenção

de glicose, açúcar que é consumido de forma geral por todos os microrganismos.

48

LIMA & SATO (2001), relatam que a quantidade de açúcares que

Saccharomyces sp consome para sua multiplicação varia de acordo com o meio e

com o grau de aeração. Com aeração e fornecimento de açúcares adequados, elas

consomem aproximadamente 2 g de açúcar para produzir um grama de células,

isso, em meio de aerobiose completa. Mais precisamente, são necessários 100g

de sacarose para obter 50 gramas de leveduras, com 27% de umidade sob

aerobiose. Para produção de células em ausência de aeração este valor cai para 4

% do que é esperado obter-se quando utiliza-se aerobiose total.

Outro ponto que pode ter afetado o consumo de açúcares é a falta de

aeração do meio, que é um ponto crítico em fermentação estado sólido. RABELO

et al (2011), avaliando fermentação estado sólido com pedúnculo de caju, obteve a

maior concentração celular no ensaio que apresentava a menor espessura de

substrato, consequentemente havendo mais contato com o ar. ALBUQUERQUE

(2003) comenta que, o oxigênio disponível no meio estimula o consumo de

açúcares e o crescimento celular das leveduras.

A partir destas conclusões iniciais as etapas posteriores foram estudadas

considerando somente os resultados que foram significativos, ou seja, a mescla

que proporcionou os melhores resultados, foi a que possui em sua formulação

maiores concentrações de sêmola, um menor tempo de fermentação proporciona

aumento no crescimento celular e produção de proteína, e a porcentagem de água

adicionada não demonstrou influenciar no processo para a faixa testada.

Diante do exposto e como etapa subsequente para este trabalho, optou-se

por realizar um estudo de otimização do processo de quebra do amido em

monômeros utilizando a mescla 25% de gérmen e 75% de sêmola, para isso,

realizou-se ensaios utilizando o processo de hidrólise enzimática, que segundo

TORRES et al. (2012), tem sido um processo muito utilizado pelas indústrias que

realizam processos biotecnológicos para produção de etanol a partir de substratos

de origem amiláceas, por ser um processo eficiente e por não gerar interferentes

para o processo fermentativo.

49

4.3 Otimização das condições de hidrólise enzimática do amido por Plackett-

Burman

SCIPIONI (2011) cita que no processo de mistura e obtenção de mesclas de

substratos os grânulos de amidos podem permanecer intactos ou parcialmente

danificados, e para o emprego em bioprocessos estes grânulos devem passar por

um processo de hidrólise para serem rompidos, sem a qual não há acesso à cadeia

da molécula, sendo que hidrólise dos compostos amiláceas consiste na clivagem

do polímero do amido em fragmentos de cadeia, e para a hidrólise ser eficiente

fatores como quantidade de água, temperatura e pH devem ser avaliados com o

objetivo de obter a maior quantidade de cadeias de amidos hidrolisadas.

Desta forma, visando obter um direcionamento para uma condição ideal de

hidrólise enzimática do amido presente na mescla composta por 25% gérmen e

75% sêmola, utilizou-se inicialmente um planejamento experimental do tipo

Plackett-Burman com cinco variáveis estudadas, são elas: temperatura (°C), tempo

(h), pH, adição de água (%) e concentração de enzima alfa-amilase (%), obtendo-

se como resposta açúcares redutores em (gL-1). Ressalta-se que, nos ensaios

preliminares com a adição da enzima alfa-amilase e posterior processo de extrusão,

a quantidade de açúcares redutores presentes no substrato era de apenas 7,42 gL-

1, valor este considerado como quantidade inicial para processo de hidrólise,

utilizando o planejamento experimental Plackett-Burman.

A Tabela 4.11, apresenta a matriz do planejamento e a resposta obtida para

todos os ensaios.

50

Tabela 4.11 - Matriz do planejamento experimental Plackett-Burman, com as variáveis investigadas (Temperatura (°C), Tempo (h), pH, Adição de água (mL) e Enzima (%)) e a média da resposta obtida: Açúcares redutores (gL-1)

Ensaio T (ºC) Tempo (h) pH Adição de água(mL)

Enzima (%)

Açúcares Redutores

(gL-1)

1 1(35) -1(8) 1(7) -1(70) -1(1) 63,73

2 1(35) 1(24) -1(5) 1(130) -1(1) 41,53

3 -1(25) 1(24) 1(7) -1(70) 1(5) 58,91

4 1(35) -1(8) 1(7) 1(130) -1(1) 46,49

5 1(35) 1(24) -1(5) 1(130) 1(5) 50,2

6 1(35) 1(24) 1(7) -1(70) 1(5) 94,91

7 -1(25) 1(24) 1(7) 1(130) -1(1) 22,32

8 -1(25) -1(8) 1(7) 1(130) 1(5) 35,42

9 -1(25) -1(8) -1(5) 1(130) 1(5) 41,32

10 1(35) -1(8) -1(5) -1(70) 1(5) 96,7

11 -1(25) 1(24) -1(5) -1(70) -1(1) 45,43

12 -1(25) -1(8) -1(5) -1(70) -1(1) 59,37

13 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 43,07

14 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 32,45

15 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 47,35

16 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 33,47

17 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 34,78

18 0(30) 0(16) 0(6) 0(100) 0(3) 38,13

Os resultados apresentados na Tabela 4.11, mostram que as maiores

concentrações de açúcares redutores foram encontradas no ensaio 10 seguido pelo

ensaio 06. Percebe-se que estes ensaios (10 e 06), apresentam em comum maior

concentração de enzima, menor quantidade de água e maior temperatura.

Para avaliar e analisar estas respostas estaticamente foi utilizada a

estimativa dos efeitos principais e de interação das variáveis (Tabela 4.12) e gráfico

de Pareto (Figura 4.9).

A Tabela 4.12 apresenta a influência das variáveis, das suas interações, o

p-valor, o coeficiente das variáveis e o erro padrão para o planejamento Plackett-

Burman, além do coeficiente de determinação (R²) com um nível de significância

de 5% (α=0,05). Os valores em negrito indicam que a variável é significativa para o

intervalo de confiança de 95% (p-valor < 0,05).

51

Tabela 4.12 - Tabela de efeitos e interações- para a hidrólise enzimática com a mescla 75%sêmola e 25% gérmen, utilizando o planejamento experimental Plackett-Burman

Efeito Erro

padrão P Coef. Coef. erro padrão

Média/Interação 49,199 2,750 0,000 49,199 2,750

T (ºC) 21,798 6,7367 0,007 10,899 3,368

Tempo (h) -4,955 6,7367 0,476 -2,478 3,368

pH -2,128 6,737 0,757 -1,064 3,368

Adição de água -30,295 6,737 0,001 -15,148 3,368

Enzima 16,432 6,737 0,031 8,216 3,368

R² = 75,65%

De acordo com a Tabela 4.12, comprova-se que, entre as variáveis

estudadas a temperatura, adição de água (%) e concentração de enzima (%) são

significativas, ou seja, possuem influência na hidrólise enzimática e

consequentemente na concentração de açúcares (liberação), dentro do intervalo

de confiança de 95%(p-valor<0,05). Esta significância é melhor observada no

gráfico de Pareto (Figura 4.9)

Figura 4.9 - Diagrama de Pareto com efeito das variáveis e interações estudadas do planejamento experimental Plackett-Burman – avaliando a: Temperatura (°C), Tempo (h), pH, Adição de água (%) e Enzima (%)) e a média da resposta obtida: Açúcares redutores (g L-1)

52

De acordo com a Figura 4.9, é possível observar que, a variável adição de

água teve efeito significativo, porém negativo sobre a resposta, ou seja, para

otimização do resultado é necessário diminuir a adição de água para obter maiores

concentrações de açúcares no meio. Já para as variáveis significativas que tiveram

efeito positivo (temperatura e concentração de enzima), significa dizer que, quanto

maior a temperatura e concentração de enzima, maior será o aumento na

concentração de açúcar redutor disponibilizado no substrato.

LÉVEQUE et al. (2000) e SUVD et al. (2001) relatam que a influência positiva

da enzima alfa amilase está relacionada às amilases, que na maioria dos casos

agem na superfície do grânulo de amido, iniciando na imperfeição estrutural ou

fissura e, depois, estendem se lateralmente formando cavidades cônicas. Esta ação

contínua ocasiona erosão nos grânulos que podem ser, eventualmente, dissolvidos

completamente. Essa dissociação dos grânulos de amido, conhecida como

hidrólise do amido, em um processo de clivagem do polímero libera fragmentos de

cadeia curta, como dextrina e maltose, ou monômeros de glicose, sendo essencial

em muitos aspectos para uso do amido, neste caso, para o emprego em

fermentação com micro-organismos que necessitam de açúcares com cadeia curta

conforme relara SCIPIONI (2011) em seus estudos.

A Figura 4.10 apresenta a cinética relativa hidrólise enzimática para o ensaio

10. As demais cinéticas obtidas para a hidrólise enzimática referente ao

planejamento experimental Plackett-Burman (Tabela 4.11) encontram-se no

apêndice B.

53

Figura 4.10 – Cinética de hidrólise enzimática (■) concentração de açúcar (g L-1), para ensaio 10.

O ensaio 10 (Figura 4.10) tem como condições: temperatura de 35°C, menor

tempo de hidrólise (8 horas), pH de 5,00, menor porcentagem de adição de água

(70% com base no peso seco) e maior concentração de enzima de 5% (com base

no peso do substrato).

As condições utilizadas no ensaio 10, favoreceram a hidrólise,

principalmente pelo fato da menor quantidade de água adicionada e a maior

concentração de enzima alfa-amilase, promovendo assim, maior contato enzima-

substrato liberando desta forma mais açúcares redutores.

A partir dos resultados obtidos com o planejamento Plackett-Burman, foi

possível identificar quais variáveis são significativas (p-valor<0,05) no processo de

hidrólise enzimática do amido, e a partir destes resultados, elaborar um

planejamento fatorial completo somente com as variáveis significativas visando a

otimização do processo de hidrólise.

54

4.4 Otimização das condições hidrólise enzimática por DCCR.

Para otimização da hidrólise enzimática, optou-se por utilizar um

planejamento Delineamento Composto Central Rotacional com o intuito de obter as

melhores condições operacionais do processo em estudo, e desta forma realizar

um menor número de experimentos quando comparado com os processos uni

variados de otimização. O planejamento experimental determina que fatores tem

efeitos relevantes na resposta, e também como o efeito de um fator varia com os

níveis dos outros fatores, além de permitir medir a interação entre os fatores

(BRITO et al., 2003).

As variáveis avaliadas no processo de otimização da hidrólise enzimática do

amido presente na mescla (75% sêmola e 25% sêmola) foram: adição de água em

(%), concentração de enzima e temperatura, e como resposta tem-se açúcares

redutores em gL-1.

A Tabela 4.13 apresenta a matriz do planejamento experimental

(DCCR+6PC) com suas independentes codificadas e reais e, variável resposta

concentração de açúcares redutores obtidos nos processos de hidrólise enzimática.

Para todos os ensaios a agitação foi fixada em 100 rpm, tempo de hidrólise em 12

horas e pH em 6,3. Este valor de pH foi escolhido por ser o pH natural do meio, não

necessitando de adição de ácido ou base para sua correção e também

considerando o estudo realizado por KONSULA & LIAKOPOULOU-KYRIAKIDEs

(2004), que avaliaram o efeito do pH sobre a atividade da enzima alfa-amilase em

sistema de solução tampão, acetato de sódio (pH 4-5,5), fosfato de sódio (pH 5,5-

8,0) e glicina / NaOH (pH 8,5-10,0), constataram que o pH ótimo da amilase é 6,5,

e tem como faixa de aplicação pH entre 5,0-7,5.

55

Tabela 4.13 - Matriz do planejamento experimental DCCR +6PC, com as variáveis investigadas (Temperatura (°C), Adição de água (mL) e Enzima (%)) e a média da resposta obtida: Açúcares redutores (gL-1)

Experimentos Adição de água

(mL) Enzima (%)

Temperatura (°C)

Açúcares redutores(gL-1)

1 -1(50) -1(5) -1(35) 94,09

2 1(70) -1(5) -1(35) 83,73

3 -1(50) 1(10) -1(35) 94,56

4 1(70) 1(10) -1(35) 66,01

5 -1(50) -1(5) 1(45) 115,67

6 1(70) -1(5) 1(45) 86,85

7 -1(50) 1(10) 1(45) 137,52

8 1(70) 1(10) 1(45) 96,76

9 -1,68(43,2) 0(7,5) 0(40) 78,58

10 1,68(76,8) 0(7,5) 0(40) 75,55

11 0(60) -1,68(3,3) 0(40) 60,49

12 0(60) 1,68(11,7) 0(40) 65,73

13 0(60) 0(7,5) -1,68(31,6) 74,45

14 0(60) 0(7,5) 1,68(48,4) 102,64

PC 0 0 0 91,99

PC 0 0 0 86,20

PC 0 0 0 94,19

PC 0 0 0 87,49

PC 0 0 0 92,54

PC 0 0 0 98,14

Analisando a Tabela 4.13 referente a otimização da hidrolise enzimática,

verifica-se que a maior concentração de açúcares redutores obtidos foi 137,52 g L-

1, referente ao ensaio 07, onde as condições utilizadas foram: maior concentração

de enzima e temperatura, e menor adição de água.

Os resultados obtidos na Tabela 4.13 foram avaliados estatisticamente pela

estimativa dos efeitos principais e de interação das variáveis (Tabela 4.14), gráfico

de Pareto (Figura 4.11), análise de variância (ANOVA) (Tabela 4.15) e as

superfícies de resposta e gráfico de controle (Figura 4.13 a 4.18).

A Tabela 4.14 apresenta a influência das variáveis e das suas interações, o

p-valor, o coeficiente das variáveis e o erro padrão para o planejamento, além do

coeficiente de determinação (R²) com um nível de significância de 5% (α=0,05).

56

Tabela 4.14 - Efeitos das variáveis estudadas no processo de hidrólise enzimática da mescla (75% sêmola e 25% gérmen)

Efeito

Erro padrão

P Coef. Coef. erro

padrão

Média /Interação 91,036 6,012 0,000 91,036 6,012

(1)Adição de água (mL)(L) -16,652 7,982 0,064 -8,326 3,991

Adição de água (mL)(Q) -1,247 7,779 0,876 -0,624 3,890

(2)Enzima (%)(L) 3,415 7,982 0,678 1,707 3,991

Enzima (%)(Q) -11,136 7,779 0,183 -5,568 3,890

(3)Temperatura (°C)(L) 21,366 7,982 0,023 10,683 3,991

Temperatura (°C)(Q) 6,885 7,779 0,397 3,442 3,890

Adição de água (mL)L X

Enzima (%)L

-7,528 10,425 0,487 -3,764 5,212

Adição de água (mL)L X

Temperatura (°C)L

-7,666 10,425 0,479 -3,833 5,212

Enzima (%)L X

Temperatura (°C)L

12,256 10,425 0,267 6,128 5,212

R2= 63,33

De acordo com a Tabela 4.14 verifica-se que, entre as variáveis estudadas

e suas interações, somente a temperatura (°C) é significativa, ou seja, possui

influencia no processo de hidrolise enzimática do amido presente na mescla (75%

sêmola e 25% gérmen), dentro do intervalo de confiança de 95%(p-valor<0,05).

Esta influência é melhor observada no gráfico de Pareto (Figura 4.11).

Figura 4.11 - D- Diagrama de Pareto com efeito das variáveis e interações estudadas do planejamento experimental (DCCR+6PC) – avaliando a: Temperatura (°C), Adição de água (mL) e Enzima (%)) e a média da resposta obtida: Açúcares redutores (g L-

1)

57

Pode-se observar, no Diagrama de Pareto (Figura 4.11) que a temperatura,

mostrou-se estatisticamente significativa. Segundo KONSULA & LIAKOPOULOU-

KYRIAKIDES (2004), a temperatura influencia significativamente no processo,

estes autores investigaram a produção da enzima alfa amilase, e a síntese da

mesma, e verificaram que a melhor fase de temperaturas entre 35 e 48 ◦C, sendo

a atividade máxima da amilase no meio de crescimento alcançada em temperatura

de 40 ◦C. Resultado semelhante ao obtido no presente estudo, que obteve a maior

concentração de açúcares na temperatura de 45oC.

Em relação a adição de água, para o ensaio 07 o qual apresentou os

melhores resultados (Tabela 4.13), a adição ocorreu no menor nível, sendo 50 ml

de água para 25 gramas de substrato. Segundo SCIPIONI et al. (2011), as fontes

amiláceas requerem a reação do amido com a água (hidrólise) quebrando o mesmo

em açúcares fermentáveis (sacarificação), porém esta quantidade não precisa ser

elevada se for realizada a agitação. SURMELY et al. (2003) comenta em seu estudo

que é fundamental homogeneizar o meio e assegurar um contato adequado entre

as enzimas e o substrato para que o processo de hidrólise ocorra de forma eficaz.

Na Tabela 4.15, são apresentados os resultados da Análise de Variância

(ANOVA), para a resposta açúcares redutores.

Tabela 4.15 - Análise de variância, para o planejamento delineamento composto central rotacional

(DCCR) para a hidrólise enzimática tendo como resposta a concentração de açúcares redutores (gL-1)

Soma quadrática

(SQ)

Graus de liberdade

(GL)

Média Quadrática

(MQ)

F-cal

Modelo 3753.237 9 417,026 1,91

Resíduo 2173,423 10 217,342

Total SQ 5926,660 19

R2=63,33

Observa-se (Tabela 4.15) que o modelo pode não ser significativo quando

empregado para fins preditivos, uma vez que o mesmo proporcionou um coeficiente

de determinação de R2= 63,33.

A Tabela 4.15 apresenta ainda que o valor de F(calc) = 1,91 foi menor que o

valor de F(tab) (10; 9; 0,05) = 2,42 (BARROS et al., 2010) (Anexo B, Tabela 1),

portanto pode-se afirmar que o modelo proposto não é válido, ou seja, não foi

possível descrever o comportamento da hidrólise enzimática dentro das faixas

58

propostas, para as variáveis temperatura, adição de água e concentração de

enzima, ao nível de 95%, e os parâmetros da equação se ajustam aos dados

experimentais.

Observando os dados apresentados nas Figuras 4.12 (a) e (b), onde se tem

as respostas gráficas obtidas referentes ao diagrama de dispersão e aos valores

preditos x resíduos.

A B

Figura 4.12 - (a) Diagrama de dispersão e (b)Valores preditos x resíduos, obtidos no planeja no planejamento delineamento composto central rotacional (DCCR) para a hidrólise enzimática.

Na Figura 4.12 (a)verifica-se que todos os pontos estão dispersos em torno

da reta, e na Figura 4.12 (b) os pontos estão dispersos aleatoriamente em torno do

zero, demonstrando que, com ajustes nas condições pode-se validar o modelo.

Para a variável significativa, é possível perceber as tendências de

crescimento da concentração de açúcares redutores através da superfície de

resposta e curva de nível que estão apresentadas nas Figuras 4.13 a 4.18.

59

Figura 4.13 - Superfície de Resposta para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da concentração de enzima e temperatura (°C)

Figura 4.14 - Gráfico de controle para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da concentração de enzima e temperatura (°C)

60

Figura 4.15 - Superfície de Resposta para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da adição de água e temperatura (°C)

Figura 4.16 - Gráfico de controle para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da adição de água e temperatura (°C)

61

Figura 4.17 - Superfície de Resposta para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da adição de água e concentração de enzima.

Figura 4.18 - Gráfico de controle para concentração de açúcares redutores (g L-1) em função da porcentagem de adição de água e concentração de enzima.

Analisando as Figuras 4.13 à 4.18 (superfície de resposta e gráfico de

controle), observa-se a influência positiva da temperatura, ou seja, com o acréscimo

da temperatura há uma tendência de elevar a produção de açúcares redutores.

Para as variáveis enzima e adição de água Figura 4.17 e 4.18 é possível verificar

a curva de ponto ótimo, restando a temperatura para novos ensaios para otimização

através da metodologia de superfície de resposta.

A Figura 4.19 apresenta a cinética de hidrólise enzimática para o ensaio 07.

As condições utilizadas neste ensaio foram: temperatura de 45°C; menor

62

porcentagem de adição de água (50% com base no peso seco); concentração de

enzima de 10% (com base no peso do substrato) e condições fixas de tempo 12

horas, pH de 6,30, e 100 rpm de agitação.

As demais cinéticas obtidas referentes ao planejamento experimental

(DCCR) são apresentadas no Apêndice C.

Figura 4.19 – Evolução da cinética da hidrólise enzimática (■) concentração de açúcar (g L-1), ao longo do tempo (12 horas) para ensaio 07

Percebe-se (figura 4.19) que após 12 horas de cinética a hidrólise não

estabilizou e oscilou ao longo do processo. Segundo CEREDA et al. (2004) o tempo

de hidrólise enzimática é uma variável importante, porém possui a particularidade

de cada caso a ser estudada, pois cada material que é hidrolisado e a enzima que

é utilizada apresentam condições ótimas. Os mesmos autores consideram o tempo

de 4 horas como suficiente para completa sacarificação do amido purificado em

várias enzimas comerciais. Segundo PANDEY et al. (2000), utilizando bagaço de

mandioca obtiveram os melhores resultados com 24 horas da ação da enzima.

A quantidade de enzima adicionada também exerce influência,

principalmente na velocidade de conversão, o decréscimo ou variação visto nas

primeiras horas de hidrólise (Figura 4.19), pode estar relacionado pela inibição

exercida por quantidades crescentes de glicose, formadas durante o processo, e

63

ao mesmo tempo a diminuição do substrato presente no meio. REGULY (1996),

comenta que a medida que acumula glicose no meio, ocorre o efeito repressivo,

também chamada de “efeito glicose” ou repressão catalítica.

A repressão catalítica é o mecanismo de indução/repressão próprio do

sistema enzimático, observado na enzimologia, quando grandes quantidades de

substratos ou produtos inibem a biocatálise de reação. SCIPIONI et al. 2011,

comenta que o efeito inibitório da ação da enzima pelos seus substratos ou produto

poderiam ser solucionadas com a adoção de processo de sacarificação contínua,

com a retirada da glicose na medida que se acumula, sendo possível com o uso de

enzimas imobilizadas.

A hidrólise enzimática do amido também pode ser influenciada pela

presença de componentes não amiláceos, por exemplo, lipídios. O grupo de lipídios

não amiláceos compreende todos os lipídeos, que estão presentes no endosperma.

O trigo maduro possui material não amiláceos (lipídeos) presente no endosperma

de grãos, encontrado sob a forma de partículas suspensas na camada de aleurona

do cereal. Os lipídios presentes nestas organelas estão vinculados à reserva

proteínas. Estes lipídeos podem estar ligados a amilose, formando complexos na

superfície dos grânulos do amido e a presença destes complexos torna a amilose

menos suscetível a ação da enzima (NEBESNY et al., 2002).

Em alguns dos ensaios realizados (Tabela 4.13) e (Apêndice C) observou-

se a diminuição dos açúcares redutores, que pode ser explicado pelo risco de

contaminações bacterianas formadas durante o processo, paralelamente à

diminuição gradual da concentração da fonte de carboidratos. A contaminação

microbiana pode ocorrer durante o processo de sacarificação, dependendo do tipo

de hidrolisado produzido e consequentemente da enzima de sacarificação utilizada

(SURMELY et al., 2003).

Após a utilização de dois planejamentos experimentais com o intuito de obter

a concentração máxima de açúcares redutores, ainda não foi possível a otimização

pela metodologia de superfície de resposta.

64

Desta forma, escolheu-se como condição ótima para hidrolise enzimática e

novas fermentações foram realizadas, utilizando o substrato hidrolisado na melhor

condição obtida, verificou-se que o baixo crescimento microbiano e produção de

proteína obtidos inicialmente haviam sido provocados por falta de disponibilidade

de fonte de carbono.

4.5 Crescimento celular e rendimento proteico com substrato hidrolisado

Com base nos resultados obtidos anteriormente, a melhor condição para

enriquecimento proteico Tabela 4.5 foi encontrada no ensaio 08, e para crescimento

microbiano Tabela 4.8, e melhor condição de hidrólise refere-se ao ensaio 07,

Tabela 4.13. Com o intuito de obter resultados mais significativos de crescimento

celular e rendimento de proteína, estas condições foram repetidas com o substrato

hidrolisado, sendo a cinética apresentada na Figura 4.20, e a Figura 4.21.

Figura 4.20 - Perfil da produção da(□) geração de proteína, (•) consumo de açúcares, ( ) variação

do pH e(Δ) Contagem de células, para fermentação de 60 horas com substrato hidrolisado

Na Figura 4.20, verifica-se um consumo significativo do substrato até 36

horas de fermentação, 46% dos açúcares disponíveis foram consumidos, e neste

mesmo tempo, tem-se o pico máximo de enriquecimento proteico, alcançando

65

13,94% de produção. O ensaio 8 anteriormente realizado e sem esta hidrólise,

obteve 10,68% de enriquecimento proteico, desta forma, tem–se um aumento de

3,26% quando comparado ao ensaio 8.

Para YANG et al. (1993), avaliando o enriquecimento proteico em resíduo de

batata doce, com sua composição de 70% de carboidrato e utilizando a levedura

Sacharomyces sp., em temperatura de 30°C encontraram um acréscimo proteico

de 3,2 para 8,4%.

Comparando o ensaio 8 e o ensaio com substrato hidrolisado, tem-se para

o crescimento celular (ensaio 8) inicial de 6,23 log10 UFC g-1 correspondendo à

1,69x105 UFC g-1, e a concentração final de células de 5,46 log10 UFC g-1

correspondendo à 29x104 UFC g-1células viáveis ao final do processo. Já para o

substrato hidrolisado, ao final das 60 horas, as células viáveis iniciais foi de 6,66

log10 UFC g-1 correspondendo à 46x105 UFC g-1, e a concentração final foi de 4,30

log10 UFC g-1 correspondendo a 2x104 UFC g-1, sendo o pico máximo de

crescimento encontrado nas primeiras seis horas de fermentação e posterior as 24

horas uma acentuada queda de células viáveis.

Após 36 horas, ocorreu perda de rendimento de proteína, isso por que,

durante a fermentação podem variar as condições do meio levando a alterar a

produção desejada (proteína), devido à interferência que causam na atividade

celular da levedura possibilitando a lise celular, esgotamento do substrato,

desnaturação da proteína ou pela produção de proteases, as quais podem ter

agredido a parede celular e, consequente perda de proteína (ARAUJO et al., 2005;

SILVA, 2007; RABELO, 2011).

RABELO (2011), estudando o enriquecimento proteico da Algaroba

utilizando Saccharomyces cerevisiae, observou crescimento significativo até 24

horas, obtendo os maiores valores em 48 horas e uma queda significativa após este

tempo, o ensaio que inicio com 3,40x106 alcançando 3,40x107 e ao final do

processo a quantidade de células viáveis foi inferior a inicial.

As perdas de células viáveis durante o processo, podem ser atribuídas a

saturação do substrato, a redução da espessura pode auxiliar durante a

fermentação no reator, pois facilita as trocas de calor e gasosa, em paralelo pode

66

apresentar poucos nutrientes disponíveis para o desenvolvimento do

microrganismo (PERAZZO NETO, 199).

Figura 4.21 – Perfil de (□) geração de proteína, (•) consumo de açúcares, ( ) variação do pH e(Δ)

Contagem de células, para fermentação de 30 horas com substrato hidrolisado

De acordo com a Figura 4.21, a cinética de crescimento em 30 horas de

fermentação, demonstra um consumo gradativo do substrato, e um rendimento de

proteína de 38,6%. Também, observa-se que as células viáveis dos

microrganismos iniciaram com uma quantidade alta, e mantiveram-se constante até

aproximadamente 12 horas, a partir deste ponto ocorre o decaimento do número

de microrganismos ocasionado possivelmente pela fase de lise ou morte celular.

Em comparação com o rendimento proteico ensaio 03 (Tabela 4.5), o

resultado foi mais significativo, pois para o ensaio 03 ao final do processo a

concentração de proteína foi menor que a inicial com o substrato não hidrolisado,

provavelmente ocasionada por perdas já relatadas anteriormente. Para o substrato

hidrolisado, o enriquecimento proteico foi elevado, alcançando 38,6%.

Para ABDULLAH et al. (1985), utilizando fermentação da palha de trigo pelo

Chaetomium cellulolyticum, obtiveram um incremento no teor proteico do material

cultivado de 2,87% no início para 16,4%. E JOSHI & SHANGU (1996), estudaram

67

a produção de ração animal através da fermentação da polpa de maçã residual de

indústria de suco por Saccharomyces cerevisiae incremento no teor proteico de

5,80 para 16,80%.

Comparando com a cinética de fermentação do substrato sem hidrólise

enzimática (ensaio 03), percebe-se que, ao final da fermentação a quantidade de

células viáveis foi de 5,78 log10 UFC g-1, correspondendo a 6,0 x105 UFC g-1. Para

o ensaio com o substrato não hidrolisado, ao final da fermentação a quantidade de

células viáveis era de 8 log10 UFCg-1, que corresponde a 10,1x107 UFC g-1

(Apêndice A, Figura A.3)

Após aplicação do processo de hidrólise enzimática nos substratos, foi

possível obter um rendimento maior de proteína, e quando comparado com o

resultado da primeira hidrólise, é possível perceber que o crescimento da levedura

também é maior no substrato hidrolisado (Figura 4.20 e 4.21).

A produção de SCP através de fermentação estado sólido, pode ser

economicamente viável em conexão com a eliminação de subprodutos de baixo

valor agregado. Existem muitos estudos para produção de SPC para alimentação

animal e humana, utilizando subprodutos com emprego de leveduras por processo

de bioconversão. O gérmen e a sêmola, são mais dois subprodutos que podem ser

utilizados para produção de proteína de origem microbiana para aplicação na

indústria de alimentos, com objetivo de agregar valor nutricional e econômico ao

produto.

68

5 CONCLUSÕES

A levedura Saccharomyces cerevisiae se mostrou viável para a fermentação

em estado sólido para produção de SCP, a partir de subprodutos do processamento

de trigo, As conclusões obtidas neste estudo mostram que:

Utilizando o processo de adição da enzima diretamente ao substrato e

posterior extrusão, ao final do processo fermentativo obtém-se um

acréscimo em torno de 10,68% de proteína para ensaio 08 utilizando 60

horas de fermentação mescla composta por 75% sêmola e 25% gérmen

e 60% de água (base no peso do substrato).

Para o crescimento da levedura, o ensaio que teve a melhor resposta

utilizando o processo de adição da enzima diretamente ao substrato e

posterior extrusão, foi o ensaio 03 com 40% de adição de água (base no

peso do substrato), mescla composta por 75% sêmola e 25% gérmen e

30 horas de fermentação;

Com a utilização de 5000 ppm de enzima alfa-amilase e processo direto

na extrusora, a enzima não agiu de forma eficiente, com isso, empregou-

se análise mais criteriosa nesta etapa, com aplicação de dois

planejamentos experimentais.

Das variáveis estudas no planejamento experimental Plackett-Burman,

para a hidrólise enzimática do amido presente nos substratos sêmola e

gérmen (mescla75% sêmola e 25% gérmen) somente a temperatura,

porcentagem de adição de água e concentração de enzima foram

significativas, as variáveis tempo e pH não apresentaram influência no

processo de hidrólise enzimática, sendo a melhor condição obtida para o

ensaio 10 utilizando a menor adição de água (70ml), pH de 5,00, tempo

de cinética de 8 horas, e maior concentração de enzima (5%);.

Na otimização da hidrólise enzimática com o uso do planejamento

Delineamento Composto Central Rotacional, o ensaio 07, obteve a maior

concentração de açúcares no meio, 137,52 g L-1, as condições utilizadas

foram condições de pH 6,3, agitação de 100 rpm, temperatura de 45°C,

69

10% de enzima com base na massa do substrato e a menor adição de

40% com base no substrato.

O substrato hidrolisado proporcionou um aumento 3,26% quando

comparado com o substrato não hidrolisado, neste ensaio (08) obteve-se

um enriquecimento proteico de 13,94%, as condições utilizadas foram:

60 horas de fermentação, substrato composto por 75% sêmola e 25%

gérmen (mescla hidrolisada) e 60% de adição de água em relação ao

peso do substrato.

Empregando substrato hidrolisado, houve um rendimento proteico de

38,6%, comparada com a mesma condição sem hidrolisar (Ensaio 03),

que não houve a geração de proteína. As condições utilizadas foram: 30

horas de fermentação, 40% de adição de água com base no peso do

substrato e a mescla de substrato (75% sêmola e 25% gérmen)

hidrolisada.

Os substratos utilizados neste trabalho, foram passiveis de utilização pela

levedura Saccharomyces cerevisiae, porém para se obter uma

quantidade significativa de proteína, e crescimento microbiano elevado é

necessário a hidrólise enzimática dos substratos. Com isso, tem-se a

aplicação de mais subprodutos em processos biotecnológicos, deixando

de ser um risco de poluição ao meio ambiente, e tem-se a geração de um

produto novo com alto valor proteico.

70

5.1 Sugestões para trabalhos futuros

Os seguintes itens são sugeridos para a complementação deste trabalho:

Avaliar o efeito de determinados tamanhos de grânulos;

Avaliar a influência da adição de mais inoculo;

Avaliar condições nutricionais: adicionar nutrientes ao meio, para elevar

a produção de SCP;

Realizar ensaios com diferentes temperaturas, para verificar o

comportamento da levedura;

Realizar estudo das possíveis causas da perda de proteína;

Quantificar as concentrações de vitaminas e aminoácidos produzidos

pela levedura;

Realizar fermentação em meio semi-sólido para verificar o crescimento

da levedura;

Avaliar as condições de hidrólise enzimática com maior adição de água

e temperatura;

Aplicar o produto em testes com alimentos para aceitação sensorial.

71

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81

APÊNDICE

82

Apêndice A

Figura A.1 - Acompanhamento da produção de biomassa celular, consumo de açucares redutores e produção proteína ao longo de 30 horas de fermentação (Ensaio 01).


83



84


Figura A.6. - Acompanhamento da produção de biomassa celular, consumo de açucares redutores e produção proteína ao longo de 60 horas de fermentação (Ensaio 06).

85



86

Figura A.9. - Acompanhamento da produção de biomassa celular, consumo de açucares redutores e produção proteína ao longo de 60 horas de fermentação (Ponto Central).

Figura A.10. - Acompanhamento da produção de biomassa celular, consumo de açucares redutores e produção proteína ao longo de 60 horas de fermentação (Ponto Central 01).

87

Figura A.11. - Acompanhamento da produção de biomassa celular, consumo de açucares redutores e produção proteína ao longo de 60 horas de fermentação (Ponto Central 02).

88

Apêndice B

Figura B.1- Cinética de acompanhamento da hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental Plackett-Burman, obtendo como resposta Açúcares redutores (gL-1)

Figura B.2 - Cinética de acompanhamento da hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental Plackett-Burman, obtendo como resposta Açúcares redutores (gL-1)

89

Figura B.3- Cinética de acompanhamento da hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental Plackett-Burman, obtendo como resposta Açúcares redutores (gL-1)

90

Apêndice C

Figura C.1 - Cinética de acompanhamento da hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental DCCR +6PC, obtendo como resposta Açúcares redutores (gL-1)


91


92

ANEXOS

93

Anexo A

Determinação de pH

O pH foi determinado em pHmetro marca HANNA, modelo pH21, pesando-

se 2 gramas de amostra em 100 ml de água destilada, agitando-se em agitador tipo

magnético (Fisatom® 752A) até formar uma solução homogênea. Após, mergulhou-

se o eletrodo do pHmetro, previamente calibrado com as soluções tampão 4,0 e

7,0, diretamente na amostra, evitando-se o contato direto do eletrodo com as

paredes ou o fundo do frasco, de forma a não ocorrer erro de leitura. A leitura é

dada diretamente no visor do equipamento, após a estabilização do mesmo.

Determinação de proteínas

O método baseia-se na determinação de nitrogênio total, realizado pelo

processo de digestão por equipamento Kjeldahl, onde a matéria orgânica é

decomposta e o nitrogênio existente é finalmente transformado em amônia. Sendo

o conteúdo de nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-

se o fator empírico 6,25 para transformar o número de gramas de nitrogênio

encontrado em número de gramas de proteínas (INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2008).

Etapas:

Preparo da solução digestora

Solução digestora: a solução digestora foi preparada em béquer de 2000

mL, a este, adicionou-se 750 mL de água, e aos poucos acrescentou-se 1 L de

ácido sulfúrico P. A., o béquer foi mantido durante a adição do ácido sulfúrico em

um recipiente com água e gelo, evitando assim o superaquecimento da solução. A

esta solução acrescentou-se 20 g de sulfato de cobre, 18 g de selenito e 105 g de

sulfato de sódio (Na2SO4). Depois de dissolvido todos os sais e homogeneizada a

solução, o volume foi transferido para um balão volumétrico de 2000 mL,

completou-se o volume com água destilada.

Digestão: Pesou-se 100 mg da amostra (0,1000 g) e foi adicionado ao tubo

de ensaio com bordas, devidamente identificado; utilizou-se 5 mL da solução

digestora no tubo com a amostra. O tubo foi levado ao bloco digestor começando

94

a aquecer em 50°C aumentando-se gradativamente de 30 em 30 minutos até atingir

450°C, de acordo com a quadro 1.

Quadro 01: temperatura do bloco digestor através do tempo

Temperatura Tempo

50° C 30 minutos

100° C 30 minutos

150° C 30 minutos

250° C 30 minutos

350° C 30 minutos

450° C 30 minutos

Após a digestão, esperou-se esfriar a solução e adicionou-se em cada tubo

cerca de 15 mL de água destilada de forma a finalizar a reação.

Destilação

Para a destilação foi adicionado 10 mL da solução receptora (ácido bórico

0,32 N) em um erlenmeyer de 125 mL.O tubo de ensaio foi acoplado com a amostra

digerida e diluída no equipamento destilador onde adicionou-se 20 mL de hidróxido

de sódio 18 N no aparelho de digestão. Efetuou-se a destilação até que o volume

do erlenmeyer atingi-se cerca de 75 mL. Foi então titulado com ácido sulfúrico 0,02

M, até a solução inicialmente verde atingir coloração rosa, e considerando um

tempo máximo de duas horas após a destilação.

Para o cálculo do teor de proteína aplicou-se a Equação 01:

% 𝑑𝑒 𝑁 = 𝑉 ∗ 𝑁 ∗ 𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟𝑑𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜 ∗ 14 ∗ 100

𝑃𝑒𝑠𝑜𝑑𝑎𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎(𝑚𝑔) (1)

Onde:

V= volume ácido gasto

95

N= normalidade do ácido

P amostra= peso amostra

% de Proteína Bruta = % de N * 6,25

Determinação de lipídeos

A metodologia utilizada para a determinação de lipídios foi a proposta por

INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2008, onde é realizada a extração com solventes, em

sistema de extração contínua em aparelho do tipo Soxhlet, seguida da remoção por

evaporação ou destilação do solvente empregado.

Inicialmente balões de vidro de fundo chato (limpos) foram colocados em

estufa por 2 horas na temperatura de 105º C. Posteriormente os balões foram

retirados com auxílio de um papel toalha e colocados no dessecador até esfriar,

após foram pesados, e o valor do peso anotado. Pesou-se 3 gramas de amostra

em papel-filtro, fez-se a dobradura do papel e fechou-se o mesmo para não ter

perda de amostra. As amostras foram acondicionadas nos balões de vidro de fundo

redondo, adicionou-se a este, o solvente éter de petróleo até cobertura total da

amostra. Os balões foram acoplados ao sistema de extração contínua do tipo

Soxhlet. A amostra permaneceu imersa por 15 minutos a 15°C, posterior foi

aumentando-se a temperatura a cada trinta minutos até atingir 90°C. Terminada a

extração, os balões foram transferidos para estufa (Tecnal®- Estufa de secagem),

com temperatura de 105°C por 30 minutos, para total evaporação do éter, e

posteriormente colocados no dessecador para resfriar, sendo após, realizada a

pesagem do balão (com gordura). Para a determinação da quantidade de lipídeos

foi utilizada a Equação 02.

Cálculo:

% 𝐺𝑜𝑟𝑑𝑢𝑟𝑎 =𝑃𝐺𝐵 − 𝑃𝐵 ∗ 100

𝑃𝐴 (3)

Onde:

PBG = peso do balão com gordura.

PA = peso da amostra.

96

PB = peso do balão

Umidade (matéria seca desengordurada)

Para a determinação da umidade presente na amostra, utilizou-se a

metodologia proposta por INSTITUTO ADOLF LUTZ, 2008. A qual consistiu em

colocar os cadinhos em estufa (Marca: TECNAL Modelo: TE 393/1), por

aproximadamente 2 horas em temperatura de 105 ºC, estes foram identificados e

pesados. Em cada cadinho foi adicionado aproximadamente 2 gramas de amostras,

seu peso foi devidamente anotado. Os cadinhos contendo a amostra foram

colocados em estufa por aproximadamente 8 horas a 105°C ou até estabilização

do peso.

Para o cálculo da matéria seca e matéria seca definitiva utilizou-se a

Equação 03 e Equação 04 respectivamente.

Calculo:

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 = 𝑝𝑒𝑠𝑜𝑎105°𝐶 − 𝑝𝑒𝑠𝑜𝑑𝑜 𝑐𝑎𝑑𝑖𝑛ℎ𝑜 (3)

𝑀𝑎𝑡é𝑟𝑖𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 𝑑𝑒𝑓𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑣𝑎 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 ∗ 100

𝑃𝑒𝑠𝑜𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (4)

Determinação de cinzas

Após a pesagem de matéria seca (105 ºC) conforme item 1.2.6,os cadinhos

foram postos em equipamento mufla (Zezimaq®), na temperatura de 550 ºC por

aproximadamente 4 horas, obtendo-se desta forma a queima total da matéria

orgânica (cinza branca ou cinza claro), decorrido o tempo, retirou-se a amostra e

resfriou-se em dessecador com posterior realização da pesagem. Para a

determinação do peso seco, utilizou-se a Equação 05, para porcentagem de cinzas

foi utilizada a Equação 06 e para determinação do valor da porcentagem de cinzas

foi utilizada a Equação 07.

𝑷𝒆𝒔𝒐 𝑺𝒆𝒄𝒐 = 𝑷𝒆𝒔𝒐𝒂𝟓𝟓𝟎° − 𝑷𝒆𝒔𝒐𝒅𝒐𝒄𝒂𝒅𝒊𝒏𝒉𝒐 (𝟓)

% 𝐶𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠 =𝑃𝑒𝑠𝑜𝑠𝑒𝑐𝑜550°𝐶 ∗ 100

𝑃𝑒𝑠𝑜𝑎105°𝑐 (6)

97

% 𝐶𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠𝑀. 𝑛𝑎𝑡 =(%𝑐𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠 ∗ 𝑚𝑎𝑡é𝑟𝑖𝑎𝑠𝑒𝑐𝑎𝑑𝑒𝑓𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑣𝑎)

100 (7)

Determinação de Açúcares não Redutores em Sacarose e Carboidratos

Totais

Para determinar os açúcares não redutores em sacarose e os carboidratos

totais utilizou-se a metodologia proposta por Lane Enyon para determinação dos

açúcares redutores das fermentações.

Preparo da amostra: pesou-se 25 g de amostra homogeneizada em béquer

de 250 mL, foi adicionado 50 ml de água e 2 ml de ácido clorídrico padrão analítico,

a solução foi autoclavada por 20 minutos a 121°C. Após, esta solução foi resfriada

e neutralizada com hidróxido de sódio a 10%, até atingir pH 7, para controle do pH

foi utilizado papel indicador.

A solução obtida foi transferida para um balão volumétrico de 250ml,

adicionou-se 2 ml de solução de ferrocianeto de potássio a 15% e 2 ml de solução

de sulfato de zinco 30%, agitou-se e completou-se o volume com água destilada,

esta solução ficou sedimentando por aproximadamente 15 minutos. Posteriormente

foi realizada a filtração em papel-filtro, o filtrado foi adicionado a bureta, para

posterior titulação.

A titulação foi realizada em um erlenmeyer de 250 ml contendo 10ml da

solução Fehling A, 10mL da solução Fehling B e 40 ml de água. Este erlenmeyer

foi então aquecido até ebulição. Após iniciou-se o processo gotejamento da

amostra a está solução até obtenção de uma coloração levemente azulada, foi

então adicionado azul de metileno 1% como indicador, até ponto de viragem

completo. A titulação não ultrapassou 3 minutos, e a solução foi mantida em

ebulição durante toda a titulação.

Para o cálculo de carboidratos totais utilizou-se a Equação 08, e a

determinação dos açúcares não redutores em sacarose foi utilizado a Equação 09

% 𝑑𝑒 𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑒, % 𝑑𝑒 𝐺𝑙í𝑐𝑖𝑑𝑒𝑜𝑠𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 =250 ∗ 100 ∗ 𝑇

𝑉 ∗ 𝑝 (8)

% 𝐺𝑙í𝑐𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑛ã𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑡𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑒𝑚 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑒 = (𝑔𝑙í𝑐𝑖𝑑𝑢𝑖𝑠𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 − 𝑑𝑒𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒) ∗ 0,95 (9)

98

Onde:

0,95 = fator de transformação das hexoses em sacarose;

250= volume da solução;

100 = porcentagem;

T = título da solução de Fehling

V = volume da amostra gasto na titulação (mL);

p = massa da amostra em gramas;

% Glicose = resultado do ensaio de glicídios redutores em glicose.

Preparação de reagentes:

Fehling A: Dissolveu-se 69,3g de sulfato de cobre(II) pentahidratado em 1

litro de água deionizada.

Fehling B: Dissolveu-se 346g de tartarato de sódio e potássio e 50 gramas

de hidróxido de sódio em um litro de água deionizada

Determinação da Fibra Bruta

Para determinação de fibra bruta, foi seguida a metodologia proposta por

INSTITUTO ADOLF LUTZ (2008). A qual consistiu em pesar 1 grama de amostra

em pacotes de Tecido Não Tecido (TNT), utilizou-se 20 ml de hexano para

desengordurar a amostra, transferiu-se a amostra para secagem em estufa (Tecnal

TE 393/1) a 105°C. Adicionou-se ácido sulfúrico 1,25% até a última bandeja do

equipamento. A amostra foi então digerida por 30 minutos a partir da ebulição a

90°C. Após, foi realizada dupla lavagem com água deionizada fervente para

neutralizar, posteriormente adicionou-se hidróxido de sódio 1,25%, e a amostra foi

digerida por 30 minutos após início da ebulição.

As amostras foram novamente lavadas, colocadas em contato com álcool

etílico, e posteriormente secas em papel toalha. Para finalizar o procedimento, as

amostras foram colocadas em estufa (Tecnal TE 393/1), a 105°C por

aproximadamente 4 horas. Após formam retiradas e resfriadas em dessecador para

99

posterior pesagem. Para o cálculo da porcentagem de fibra bruta utilizou-se a

Equação 10.

𝑭𝒊𝒃𝒓𝒂 𝒃𝒓𝒖𝒕𝒂 =(𝑨 − 𝑻) ∗ 𝟏𝟎𝟎

𝑷 (𝟏𝟎)

Onde:

A= peso do pacote + resíduos, em gramas

B=Peso do pacote

P=Peso da amostra, em gramas.

Determinação dos açúcares redutores totais

A quantificação de açúcares redutores foi realizada por uma adaptação do

método proposto por MILLER (1959), utilizando o reagente DNS (ácido 3,5-

dinitrosalicílico).

Em um tubo de ensaio foi adicionado 400µL da amostra previamente diluída

e 400µL da solução de DNS. Levou-se ao banho-maria, a 100ºC, por 5 minutos e

resfriou em banho de gelo. Adicionou-se 4 mL de água destilada e homogeneizou-

se.

Foi realizada uma prova em branco, substituindo a amostra por água

destilada e uma curva padrão com com glicose, na faixa de 0,5 - 3,0 g L-1, nas

mesmas condições da amostras, gerando um modelo de regressão linear e o

coeficiente de determinação da glicose em função da absorbância medida.

Todas as leituras foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vis

(ShimadzuUV-1601PC), em um comprimento de onda de 575nm.

Solução DNS:Pesou-se 4g de hidróxido de sódio em aproximadamente

70mL de água destilada. E 75g de tartarato duplo de sódio e potássio em em

aproximadamente 100mL de água destilada. As soluções foram misturadas e

100

acrescentou-se 2,5g de ácido dinitrosalicílico sob agitação. Após dissolução o

volume foi completado para 250 ml utilizando um balão volumetrico.

Determinação do crescimento celular por plaqueamento

O crescimento celular foi determinado por contagem de bolores e levedura,

seguiu-se a metodologia proposta por SILVA, 1997. No processo de preparação da

amostra pesou-se 25 g em frasco estéril, seguindo-se pela transferência de 225 mL

do diluente água salina peptonada a 0,1%, obtendo desta forma a diluição 10-1.

Após homogeneização da amostra foram realizadas as diluições seriadas até 6,

utilizando-se tubos de ensaio com 9 mL do mesmo diluente.

Para o processo de semeadura utilizou-se a técnica de plaqueamento em

superfície, através do uso do meio de cultura Agar Dextrose Batata acidificado

(PDA acidificado) com ácido tartárico 10%, a um pH de 3,5. Pipetou-se 0,1 mL de

cada diluição da amostra em placa de Petri estéril, contendo aproximadamente 20

mL do meio de cultura PDA acidificado solidificado e com uma alça de Drigalski

espalhou-se o inoculo por toda a superfície do meio. Em seguida incubou-se a uma

temperatura de 25ºC ± 1ºC, por um período de 3 a 5 dias. Após este período

realizou-se a quantificação expressa em Unidade Formadora de Colônia por grama

(UFC.g-1).

101

Anexo B

Anexo B.1 - Teste F (BARROS et al.,2010).

102

Anexo B.2 - Teste F (BARROS et al.,2010).

103

Anexo C

Anexo C.1 - Caracterização substrato nível -1 (25% gérmen 75% sêmola)

104

Anexo C.2 - Caracterização substrato nível 01 (50% gérmen 50% sêmola)

105

Anexo C.3 - Caracterização substrato nível +1 (75% gérmen 25% sêmola)

106

Anexo C.4 - Determinação de proteína ensaio 01

107


108


109


110


111


112


113


114

Anexo C.12 - Determinação de proteína ensaio ponto central 01

115


116


117

Anexo C.15 - Determinação de açúcares redutores durante a fermentação ensaio

01

118


02

119


03

120


04

121


05

122


06

123


08

124

Anexo C.23 - Determinação de açúcares redutores durante a fermentação ponto

central 01

125

Anexo C.24 - Determinação de açúcares redutores durante a fermentação ponto

central 02

126

Anexo C.25 - Caracterizações do substrato antes do processo (sêmola)

127

Anexo C.26 - Caracterizações do substrato antes do processo (Gérmen)

128

Anexo C.27 - Fermentação de 30 horas com substrato hidrolisado.

129

Anexo C.28 - Fermentação de 60 horas com substrato hidrolisado.

130

Anexo C.29 - Proteína (%) para ensaio de 30 horas com substrato hidrolisado

tempo de 0 horas.

131

Anexo C.30 - Proteína (%) para ensaio de 30 horas com substrato hidrolisado

tempo de 6 horas

133

Anexo C. 31 - Proteína (%) para ensaio de 30 horas com substrato hidrolisado

tempo de 12 horas.

147

Anexo D

Anexo D.1 - Ficha técnica da enzima utilizada para hidrólise enzimática

universidade estadual do oeste do paranÁ -...

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