universidade estadual do norte fluminense darcy … · onde houver trevas, que eu leve a luz. ......

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO

CLÁUDIO FERNANDES SANTOS

LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA NA REGIÃO NORTE

FLUMINENSE: BIOQUÍMICA SÉRICA DE ANIMAIS SOROPOSITIVOS

E SORONEGATIVOS

Campos dos Goytacazes 2009




E SORONEGATIVOS

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal, na área de concentração de Sanidade Animal, linha de pesquisa Ensaios Farmacológicos, Afecções Clínicas e Cirúrgicas dos Animais.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Claudio Baptista de Carvalho

Campos dos Goytacazes 2009

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 033/2009

Santos, Cláudio Fernandes

Leucose enzoótica bovina na região Norte Fluminense : bioquímica sérica de animais soropositivos e soronegativos / Cláudio Fernandes Santos. – 2009. 68 f. : il.

Orientador: Claudio Baptista de Carvalho Tese (Doutorado em Ciência Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2009. Bibliografia: f. 57 – 68.

1. Leucose 2. Bovino 3. Bioquímica sérica 4. Histopatologia I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título.

CDD – 636.2089




E SORONEGATIVOS

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal, na área de concentração Sanidade Animal, e linha de pesquisa Afecções Clínicas e Cirúrgicas dos Animais.

Aprovada em 14 de abril de 2009

BANCA EXAMINADORA

Milton Masahiko Kanashiro (D.Sc., Biociências-Biotecnologia) - UENF

Bianca Brand Ederli (D.Sc., Produção Animal) – Médica Veterinária Autônoma

Prof. Carlos Eurico Pires Travassos (D. Sc., Microbiologia) – UENF

Prof. Claudio Baptista de Carvalho (D. Sc. Clínica Médica) - UENF (Orientador)

A meu avô, Claudio Fernandes Luiz, que, no início de minha

vida, ensinou-me a cuidar e amar os animais

A minha querida mãe Terezinha Fernandes Santos, pelo

exemplo de mulher, por todo apoio, incentivo e amor.

A Elenir Cruz Cabral, que nos deixou e de quem nunca

esquecerei.

A minha noiva Geanne Merys Cruz Cabral,

com todo o carinho.

DEDICO.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as bênçãos e graças que me fizeram chegar até aqui.

A minha família, pelo apoio, incentivo, compreensão e amor.

A meu orientador, Prof. Cláudio Baptista de Carvalho, pela confiança em mim

depositada, incentivo e amizade.

Aos colegas, Josias Alves Machado e Orlando Augusto Melo Júnior, pelo auxílio

sempre presente e amizade.

Ao Professor Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos e Iliani Bianchi, pela concessão

do material de trabalho.

Ao Professor Antonio Peixoto Albernaz, pelo auxílio na elaboração do Projeto de

Pesquisa.

Ao Professor Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho e Lio Moreira, pelo auxílio nas

análises histopatológicas.

À UENF/FAPERJ, pela concessão de bolsa de estudo.

À UENF, pela oportunidade de aprimoramento de meus conhecimentos.

Ao programa de Pós-Graduação em Produção Animal, que nos acolheu em seu

quadro, dando-nos a oportunidade do aperfeiçoamento. E ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Animal, que concretizou a nossa formação;

À Professora Célia Raquel Quirino e Professor Rogério Figueiredo Daher, pelo

auxílio no desenvolvimento das análises estatísticas.

Aos mestres que verdadeiramente contribuíram para a minha formação profissional

e pessoal.

À EMATER RIO/CENTERJ do município de Cordeiro, pela cessão dos animais

destinados ao estudo histopatológico.

Ao meu amor, pelo apoio e compreensão durante a realização deste trabalho.

Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para esta realização.

Meus sinceros agradecimentos.

Oração de São Francisco de Assis

Senhor, fazei de mim instrumento de vossa paz.

Onde houver ódio, que eu leve o amor;

Onde houver ofensa, que eu leve o perdão;

Onde houver discórdia, que eu leve a união;

Onde houver dúvida, que eu leve a fé;

Onde houver erro, que eu leve a verdade;

Onde houver desespero, que eu leve a esperança;

Onde houver tristeza, que eu leve a alegria;

Onde houver trevas, que eu leve a luz.

Ó Mestre, fazei que eu procure mais

consolar, que ser consolado;

compreender, que ser compreendido;

amar, que ser amado.

Pois, é dando que se recebe,

é perdoando que se é perdoado,

e é morrendo que se vive para a vida eterna.

RESUMO

SANTOS, Cláudio Fernandes, D.Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro. Abril de 2009. Leucose Enzoótica Bovina na Região Norte

Fluminense: bioquímica sérica de animais soropositivos e soronegativos. Orientador:

Prof. Claudio Baptista de Carvalho.

Objetivou-se fornecer dados auxiliares ao estudo da fisiopatologia da leucose

enzoótica bovina (LEB). Foram examinadas amostras sorológicas de 240 fêmeas

bovinas, sendo 120 soropositivas para a LEB e 120 soronegativas, e necropsiadas

duas fêmeas da raça jersey, soropositivas que apresentavam lesões. No soro

sanguíneo, foram investigados os seguintes parâmetros: proteínas séricas totais

(PT), albumina (ALB), globulinas (GLO), razão albumina/globulina (A/G), aspartato

aminotransferase (AST), gamaglutamiltransferase (γGT), alanina aminotransferase

(ALT), ureia (URE), e creatinina (CRE), obtendo-se os seguintes valores para o

grupo de soropositivos: PT (7,81±1,32g/dl), ALB (2,29±0,48g/dl), GLO (5,52±1,1g/dl),

A/G (0,42±0,1), AST (46,37±17,82U/L), γGT (25,72±9,68U/L), ALT (11,57±4,93U/L),

URE (30,12±12,58mg/dl), CRE (1,11±0,29mg/dl); e para o grupo de soronegativos:

PT (7,14±0,82g/dl), ALB (2,45±0,38g/dl), GLO (4,69±0,68g/dl), A/G (0,53±0,1), AST

(33,38±13,96U/L), γGT (20,48±6,35U/L), URE (34,81±11,47 mg/dl), CRE

(1,13±0,39mg/dl). Concluiu-se que a LEB foi capaz de produzir alterações de

pequena magnitude na maioria dos parâmetros bioquímicos séricos avaliados,

quando comparados aos dos animais soronegativos. Os animais necropsiados

apresentaram características típicas de LEB nos linfonodos, fígado, cerebelo e dura-

máter da medula espinhal, associadas à forma leucêmica da doença.

Palavras-chave: Leucose, bovinos, bioquímica sérica, histopatologia.

ABSTRACT

SANTOS, Cláudio Fernandes, D.Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro. April, 2009. Enzootic Bovine Leukosis in North Fluminense Region:

serum biochemical profile of animals serum positive and serum negatives. Advisor:

Prof. Claudio Baptista de Carvalho.

It was aimed to supply auxiliary data to the study of the fisiopathology of the enzootic

bovine leukosis (EBL). Serological samples of 240 bovine females were examined,

with 120 serum positives for EBL and 120 serum negatives, and additionally two

jersey breed females, serum positives presenting lesions were necropsied. From

blood serum, the following parameters were investigated: total serum protein (PT),

albumin (ALB), globulins (GLO), reason albumin / globulin (A/G), aspartate

aminotransferase (AST), gamma glutamyltransferase (γGT), alanine

aminotransferase (ALT), urea (URE), and creatine (CRE), being obtained the

following values for the serum positives group: PT (7,81 ± 1,32g / dl), ALB (2,29 ±

0,48g / dl), GLO (5,52 ± 1,1g / dl), A/G (0,42 ± 0,1), AST (46,37 ± 17,82U /L), γGT

(25,72 ± 9,68U /L), ALT (11,57 ± 4,93U /L), URE (30,12 ± 12,58mg / dl), CRE (1,11 ±

0,29mg / dl); and for the serum negatives group: PT (7,14 ± 0,82g / dl), ALB (2,45 ±

0,38g / dl), GLO (4,69 ± 0,68g / dl), A/G (0,53 ± 0,1), AST (33,38 ± 13,96U /L), γGT

(20,48 ± 6,35U /L), URE (34,81 ± 11,47 mg / dl), CRE (1,13 ± 0,39mg / dl).

Concluding, EBL was able to produce alterations of small magnitude in most of the

serum biochemical parameters evaluated when compared to serum negatives

animals. The necropsy data showed that animals presented typical characteristics of

EBL in the lymph nodes, liver, cerebellum and dura mater of spinal marrow

associated to the leukemic form of the disease.

Key-Words: leukosis, bovine, serum biochemistry, histopathology.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.........................................................................................

10

2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................... 12

2.1 Descrições da Leucose Enzoótica Bovina................................................ 12

2.2 Etiologia e propriedades gerais................................................................ 12

2.3 Epidemiologia........................................................................................... 13

2.4 Patogenia................................................................................................. 15

2.5 Manifestações clínicas............................................................................. 16

2.6 Diagnóstico clínico-laboratorial................................................................. 17

2.7 Controle e profilaxia..................................................................................

2.8 Importância econômica e sanitária...........................................................

19

20

2.9 Aspectos bioquímicos...............................................................................

2.9.1 Proteínas séricas totais (PT)....................................................................

2.9.2 Albumina...................................................................................................

2.9.3 Globulinas.................................................................................................

2.9.4 Aspartato aminotransferase – AST..........................................................

2.9.5 Gamaglutamiltransferase - γGT................................................................

2.9.6 Alanina Aminotransferase – ALT..............................................................

2.9.7 Uréia.........................................................................................................

2.9.8 Creatinina.................................................................................................

3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................

21

22

25

27

29

31

33

33

35 37

3.1 Animais..................................................................................................... 37

3.2 Análise laboratorial................................................................................... 37

3.3 Anatomopatologia..................................................................................... 38

3.3.1 Macroscopia............................................................................................

3.3.2 Histopatologia...........................................................................................

3.3.3 Imunoistoquímica.....................................................................................

3.4 Análise estatística.....................................................................................

39

39

39

40

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................... 41

4.1 Análises estatísticas................................................................................. 41

4.2 Aspectos bioquímicos séricos.................................................................. 45

4.2.1 Proteínas séricas totais (PT)....................................................................

4.2.2 Albumina e razão albumina/globulina (A/G).............................................

4.2.3 Globulina..................................................................................................

4.2.4 Aspartato aminotranferase – AST............................................................

4.2.5 Gamaglutamiltranferase - γGT..................................................................

4.2.6 Alanina Aminotransferase – ALT..............................................................

4.2.7 Ureia.........................................................................................................

4.2.8 Creatinina.................................................................................................

4.3 Anatomopatologia.....................................................................................

45

46

47

48

48

49

49

50

51

5 CONCLUSÕES........................................................................................ 56

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGÁFICAS.......................................................... 57

10

1 INTRODUÇÃO

A Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma enfermidade de caráter

infectocontagioso causada por um vírus RNA, envelopado, medindo de 80 a 120 nm

de diâmetro, da família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero

Deltaretrovirus.

A doença pode manifestar-se de duas formas, sendo elas: linfocitose

persistente e/ou linfossarcoma em bovinos adultos. Na primeira, o animal portador

da doença apresenta um aumento do número absoluto de linfócitos, o que ocorre em

29% dos casos. Já o linfossarcoma ocorre em torno de 5% dos animais infectados

pelo Vírus da Leucose Enzoótica Bovina (VLB), cujos sinais clínicos variam

dependendo da localização das massas tumorais no organismo dos animais, que

apresentam seus linfonodos superficiais, em geral, tumefeitos.

A LEB acomete, principalmente, animais de rebanho leiteiro com mais de

quatro anos de idade, fato este que, provavelmente, esteja relacionado ao manejo

neste tipo de exploração e à demorada soroconversão em alguns animais.

O VLB acomete, de forma natural, bovinos, ovinos, bubalinos e capivaras, e,

experimentalmente, caprinos, coelhos, suínos, gatos, cervídeos e chipanzés.

A infecção causada pelo VLB tem distribuição mundial. No Brasil, esta

patologia já foi descrita em várias regiões, tendo diferentes prevalências.

Em relação às vias de transmissão, a principal é a horizontal, principalmente

por exposição direta aos fluídos biológicos contaminados com linfócitos infectados,

como os que ocorrem com agulhas e instrumentos cirúrgicos contaminados com

sangue. A via de transmissão vertical ou transplacentária ocorre em menores

proporções. Um bovino, uma vez infectado, torna-se fonte de disseminação do VLB

por toda a sua vida.

Várias são as perdas econômicas produzidas pela Leucose Enzoótica

Bovina, dentre elas, podem-se citar: queda na produção leiteira, aumento no

intervalo entre partos e restrições ao comércio internacional.

O diagnóstico da LEB pode ser realizado por imunodifusão em gel de ágar

(IDGA), que é o teste recomendado pelo OIE (Office International des Epizooties), e

pelo enzime-linked immunosorbent assay (ELISA).

Devido à inexistência de vacinas e de um tratamento efetivo, os programas

de controle concentram-se em medidas de profilaxia sanitária que inibem a

11

disseminação do VLB, e, para tal é necessário o conhecimento da condição

sorológica do rebanho frente ao vírus. Entretanto, os criadores não têm acesso ao

diagnóstico.

Há varias décadas, as enzimas séricas têm sido mensuradas para

diagnosticar, monitorar e prognosticar os processos mórbidos. A despeito de nossa

familiaridade com o uso clínico empírico de enzimas séricas, as razões

patofisiológicas para as alterações observadas são muito pouco entendidas.

Algumas enzimas mitocondriais, normalmente, aparecem no sangue após uma lesão

severa, já que, aprisionadas, precisam atravessar duas ou mais membranas.

Quando há lesão tecidual, há aumento na liberação de algumas enzimas. A

importância do aumento depende de vários fatores: concentração tecidual da enzima

(que é variável com o tecido e a espécie), localização celular da enzima, quantidade

do tecido lesado, tipo de lesão tecidual e velocidade de remoção enzimática do soro.

Os objetivos do presente trabalho foram fornecer dados auxiliares ao estudo

da fisiopatologia da Leucose Enzoótica Bovina por meio da avaliação bioquímica

sérica dos animais soropositivos, devido ao fato de serem escassos os trabalhos

relativos a esse tema, bem como descrever os achados necroscópicos em dois

animais soropositivos.

12

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Descrições da Leucose Enzoótica Bovina

A primeira descrição da LEB foi publicada na Alemanha em 1871, sendo,

posteriormente, em 1969, descoberto o agente causal, utilizando o método de

isolamento e identificação por microscopia eletrônica. (MILLER et al., 1969;

LEISEREING, 1871 apud OLSON e MILLER, 1987).

No Brasil, a LEB foi citada inicialmente em 1943 (RANGEL; MACHADO,

1943 apud BIRGEL JUNIOR et al., 1995; LEITE et al., 2001), porém o primeiro

diagnóstico clínico da doença foi publicado em 1959 (MERKT et al., 1959, apud

LEITE et al., 2001).

A presença do vírus da LEB em células linfocitárias foi evidenciado em 1982,

mediante a microscopia eletrônica (ALENCAR FILHO et al.,1982 apud BIRGEL

JUNIOR et al., 1995), contudo, o isolamento viral só foi realizado, pela primeira vez

no Brasil, em 1985 (ANGELO et al., 1985).

O Vírus da Leucose Enzoótica Bovina (VLB) está mundialmente distribuído

(ONUMA, 1989; JONHSON; KANEENE, 1991). A provável introdução do VLB na

América do Sul foi proveniente da importação de bovinos contaminados vindos da

Europa e dos EUA (BRAGA et al., 1998b).

A prevalência do VLB varia tanto de um país a outro como também entre

regiões e/ou estados de um mesmo país (MODENA et al., 1984; ABREU et al., 1990;

BIRGEL JUNIOR et al., 1995; MORAES et al., 1996; BRAGA et al., 1998b).

2.2 Etiologia e propriedades gerais

Segundo o International Commitee on Taxonomy of Viruses (ICTV), o VLB

está classificado na família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae, gênero

Deltaretrovirus.

O VLB é um vírus envelopado medindo de 80 a 120nm de diâmetro, com

genoma diploide formado por fitas idênticas de RNA simples, de polaridade positiva,

contidas em um capsídeo de simetria icosaédrica (MURPHY et al., 1999).

13

O envelope viral possui projeções (glicoproteínas de superfície)

responsáveis pela interação do vírus com a superfície dos linfócitos (FAVA, 1995;

BRAGA et al., 1998a). A gp51 e p24 destacam-se entre as principais proteínas virais

(FAVA, 1995; BRAGA et al., 1998a; OLIVEIRA, 2000).

A inativação do VLB é possível com a utilização de detergentes e solventes

lipídicos, como álcool, clorofórmio e éter, sendo também inativados a 56ºC por 30

min, não resistindo também a sucessivos congelamentos e descongelamentos. Os

retrovírus possuem maior resistência aos raios ultravioleta e radiações X do que os

outros vírus, fato este que, provavelmente, seja devido ao seu genoma diploide

(FENNER et al.,1993).

2.3 Epidemiologia

A LEB já foi diagnosticada, com diferentes prevalências, em vários estados

do Brasil, sendo os de maior prevalência: Minas Gerais, Rio de Janeiro, Pará,

Paraná, Goiás, São Paulo, Rio Grande do Sul, Roraima (GARCIA LIMA, 1980;

KANTEK et al., 1982; MODENA et al., 1983; LEITE et al., 1984; BIRGEL JUNIOR et

al., 1995; SARDI et al., 2002; POLETTO et al., 2004; SPONCHIADO, 2008), como

demonstrado na Tabela 1.

14

Tabela 1. Prevalência do VLB em diferentes estados do Brasil, segundo diversos autores. Local Prevalência Autor

Rio de Janeiro 53,25% ROMERO ; ROWE, 1981

Paraná 18,33% KANTEK et al., 1982

Rio de Janeiro 26,94% CUNHA et al., 1982

Minas Gerais

Rondônia

Acre

Bahia

Goiás

70,87%

23,02%

9,72%

16,1%

35,67%

LEITE et al., 1984

ABREU et al., 1990

ABREU et al., 1990

TÁVORA, 1990

ANDRADE; ALMEIDA, 1991

Pernambuco 13,85 MELO, 1991

São Paulo 16,23% ARITA et al., 1992

Ceará 9,15% ABREU, 1993

Rio Grande do Sul 12,0% MORAES et al., 1996

Pará 49,8% MOLNÁR et al., 1999

Bahia 7,5% SARDI et al., 2002

Campos - RJ 17,30% BIANCHI, 2003

Serra do Botucatu - SP 51,80% MEGID et al., 2003

Amazonas 9,6% CARNEIRO et al., 2003

Passo Fundo - RS 23,52% POLETTO et al., 2004

Paraná 49,04% SPONCHIADO, 2008

Atribui-se a entrada do VLB à importação de animais infectados, o que

persiste até os dias de hoje (BRAGA et al., 1998b).

Demonstrou-se que o percentual de animais reagentes tende a aumentar

proporcionalmente com a idade, variando de 24,6% em animais de um a dois anos

para 86,2% em animais com mais de seis anos (BIRGEL JUNIOR et al., 1995) .

Em rebanhos leiteiros, uma maior prevalência da LEB tem sido observada,

principalmente naqueles estabelecimentos de criação intensiva e altamente

tecnificados, devido ao maior contato entre os animais e à maior utilização de

equipamentos susceptíveis à contaminação com sangue ou outro espécime

biológico que contenha linfócitos infectados, como o colostro e o leite, facilitando a

disseminação da doença. (LORENTZ; STRAUB, 1987 apud FAVA, 1995; OLIVEIRA

et al., 1999; VAN DER LAAN et al., 1999).

15

O desenvolvimento do linfossarcoma ocorre em animais com média de idade

de cinco anos, acometendo, devido ao tipo de manejo, mais ao gado leiteiro.

(OLIVEIRA et al., 1999).

2.4 Patogenia

O VLB pode ser transmitido de duas formas: vertical e horizontalmente

(BRAGA et al., 1998a), sendo que a transmissão vertical pode ocorrer em vacas

prenhes ou na passagem do feto pelo canal do parto (MOULTON,1990; JAIN, 1993).

O colostro e o leite também são vias de transmissão vertical (BIRGEL, 1982;

STRAUB et al., 1987 apud FAVA, 1995).

Os fômites e seringas, agulhas, instrumentos cirúrgicos, luvas, tatuadores e

material utilizado para a descorna contaminados com sangue são as principais

formas de transmissão horizontal (FAVA, 1995), que é a mais frequente (OLIVEIRA

et al., 1994; BRAGA et al., 1998a ).

A hipótese da contaminação pelo sêmen é aceita por alguns autores

(LUCAS et al., 1980). Tal contaminação é provável devido à presença de linfócitos

infectados no fluido seminal que ocorre com frequência nas doenças do trato genital

(THURMONT; BURRIDGE, 1982 apud BRAGA et al., 1998a). A disseminação do

VLB pode ocorrer em premunições contra anaplasma e babésia quando os animais

doadores estão infectados (FLORES et al.,1992; VAN DER LANN et al., 1999). A

transmissão via inseto hematófago também pode ocorrer (BIRGEL JUNIOR et al.,

1995; BRAGA et al., 1998b e VAN DER LANN et al., 1999).

A Leucose Enzoótica Bovina é uma doença infecciosa de caráter crônico e,

após a infecção do animal, este pode levar de três a 24 meses para que ocorra a

soroconversão e, uma vez infectado, o animal torna-se fonte de infecção por toda

sua vida (BIRGEL, 1982).

A principal célula sanguínea pela qual o VLB tem afinidade é o linfócito B, e,

uma vez tais células infectadas, infiltram-se nos tecidos linfoides do organismo do

animal, produzindo, assim, o linfossarcoma (BRAGA et al., 1998a).

O VLB tem também a capacidade de infectar, em menores proporções,

linfócitos T, monócitos e granulócitos (SCHWARTZ et al., 1999).

Há evidência de que linfócitos CD4 ativados, durante a infecção pelo VLB

promovem o desenvolvimento da Linfocitose Persistente (LP). Ainda não está

16

totalmente esclarecida a forma como os linfócitos CD4 são ativados pela infecção

pelo VLB. Foi observado que linfócitos T de bovinos com LP proliferam na presença

de células mononucleadas irradiadas e autólogas do sangue periférico. No entanto,

nenhuma proliferação foi observada em culturas de células de animais soropositivos

sem LP. A proliferação requereu contato direto entre as células, mas não foi

associada com a expressão de proteína viral ou inibida por anticorpos contra o VLB.

Estas observações e a magnitude da resposta proliferativa sugerem que a ativação

seja policlonal e envolva mecanismos diferentes da ativação antígeno-específica

causada pelo VLB (STONE et al., 2000).

Atualmente, existem evidências de que a expressão do VLB por um linfócito

infectado aumenta a sobrevivência desta célula por estacionar o ciclo celular em

G0/G1. Esta ação atrasa a apoptose fisiológica que, na ausência de estímulos

externos, ocorre na fase G2. O VLB pode ainda promover a proliferação de linfócitos

B não infectados devido à ação de proteínas virais em linfócitos T CD4+. Esta ação

aumenta os níveis de interleucina 2 (IL2), responsável pela proliferação dos linfócitos

B. Esta estratégia viral garante o sucesso da infecção por aumentar a produção de

partículas virais, prolongando a vida da célula infectada. Paralelamente, a

proliferação de linfócitos B não infectados aumenta a população de células-alvo. O

conjunto destes efeitos leva o animal a apresentar o quadro de LP, sendo esta a

principal via de transmissão do vírus aos animais não infectados (STONE et al.,

2000).

2.5 Manifestações clínicas

A maioria dos animais infectados não apresenta sinais clínicos

característicos, porém alguns podem desenvolver linfocitose persistente (VAN DER

LANN et al., 1999). Os sinais clínicos provenientes do linfossarcoma variam,

dependendo da sua localização, e a metástase pode comprometer vários órgãos


O principal sinal clínico observado entre os animais clinicamente afetados é

o aumento no volume dos linfonodos periféricos. Outras observações relacionadas

com a leucose em rebanhos afetados são: anorexia, diminuição na produção de

leite, perda de peso e exoftalmia, dependendo do local de aparecimento dos

tumores e dos órgãos afetados (COELHO et al., 1998; BARROS, 2007), podendo

17

ocorrer, em alguns casos, pico febril, aumento dos linfonodos com o

comprometimento do coração, abomaso e intestino . À necropsia, são encontradas

formações tumorais em tecidos linfoides, no átrio direito do coração, na parede do

abomaso e útero, linfonodos aumentados com tecido neoplásico firme e branco,

muitas vezes, circundando um foco necrótico translúcido e amarelado e,

ocasionalmente, os rins e ureteres são afetados (OLIVEIRA et al., 1999). Observam-

se também aumento generalizado dos linfonodos superficiais e internos, superfície

de corte protrusa apresentando colorações variadas, entre branco-amarelado a

vermelho escuro (REIS et al., 2002; PEIXOTO et al., 2008).

São descritas também massas tumorais esbranquiçadas de consistência

firme a macia, com formações nodulares ou difusas nos diferentes órgãos, como

coração, rúmen, útero, pulmão, medula, cérebro, fígado, cadeia de linfonodos

mesentéricos, rins e tecido retrobulbar do globo ocular (YAMAMOTO, 1982;

REBHUN, 1984; SHERMANN, 1987; FIGHERA; BARROS, 2004; SILVA et al.,

2008).

O curso da doença é variável, podendo levar de algumas semanas a vários

meses, sendo que se tem, na insuficiência cardíaca, a principal causa-morte


Uma das características dos animais infectados pelo VLB é a produção

persistente de anticorpos, sugerindo uma constante ou periódica estimulação do

sistema imunológico por antígenos virais (HEENEY et al., 1992 apud LEUZZI Jr. et

al., 2001).

2.6 Diagnóstico clínico-laboratorial

O diagnóstico da Leucose Enzoótica Bovina, inicialmente, era feito pela

observação das manifestações clínicas, baseando-se no aumento dos linfonodos e

na presença do linfossarcoma. Posteriormente, observou-se a ocorrência de

alterações hematológicas caracterizadas por linfocitose, ocorrendo tanto na

linfocitose persistente quanto no linfossarcoma. Visando ao diagnóstico precoce da

Leucose Enzoótica Bovina, foi elaborada uma chave leucométrica, buscando

combatê-la sistemicamente (GÖTZE et al., 1954 apud FAVA, 1995). Após o

isolamento viral em 1969, teve início a busca por metodologias diagnósticas mais

eficazes para a LEB (MILLER et al., 1969).

18

Atualmente, estão disponíveis vários métodos diagnósticos: leucograma

(GARCIA et al., 1991), histopatologia (COELHO et al., 1998), citologia (OLIVEIRA et

al., 1999), fixação de complemento (FC), radioimunoensaio (RIE), (MILLER; VAN

DER MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995), imunofluorescência (IF) (GARCIA LIMA,

1980), ELISA (SIMARD et al., 2000a) e imunodifusão em gel de ágar (IDGA)

(SIMARD et al., 2000b).

A variação do leucograma, apesar de não muito utilizada, é capaz de

identificar um quadro de linfocitose persistente, precisando ser diferenciado de duas

outras linfocitoses: uma decorrente da passagem de linfócitos neoplásicos atípicos

para o sangue que ocorre em um linfossarcoma e as linfocitoses transitórias não

relacionadas ao VLB. Faz-se necessário, para diagnosticar a linfocitose persistente,

a realização de duas contagens de linfócitos em pelo menos duas amostras com

intervalo mínimo de três meses (OLIVEIRA et al., 1999).

Para exame citológico (método auxiliar para o diagnóstico da LEB), é

necessária a presença de uma massa neoplásica já instalada ou que os linfonodos

já estejam aumentados (locais da coleta do material), quando será possível

diferenciar um processo inflamatório de um processo neoplásico (OLIVEIRA et al.,

1999).

Ao exame histopatológico, observam-se infiltrações nodulares ou difusas de

células linfoides nos órgãos atingidos. Com base na morfologia celular, o

linfossarcoma é classificado como um tumor de células redondas. Neste grupo, as

células não possuem junções intercelulares, dispondo-se isoladamente. As células

neoplásicas malignas exibem uma ou mais das seguintes características: aumento

da relação núcleo/citoplasma, cromatina frouxa, presença de macronúcleo

(usualmente múltiplos), homogeneidade morfológica, pleomorfismo (presença de

células em um mesmo estágio de desenvolvimento, apresentando diferentes

formas), vacuolização intranuclear, anisocitose (presença de células em diferentes

tamanhos) e anisocariose (presença de células com núcleos de diferentes tamanhos

(CORDEIRO et al., 1994; OLIVEIRA et al., 1999). Deve-se coletar o material dos

órgãos que apresentarem tumorações e enviá-los em formalina a 10% para o

laboratório de histopatologia (LEITE et al.,2001). A histopatologia dos linfonodos

revela linfócitos com citoplasma escasso, fracamente eosinofílico, com contornos

irregulares e núcleos pleomórficos, por vezes, hipercromáticos com nucléolos

19

evidentes e frequentes figuras de mitose; há também alterações da arquitetura

normal do linfonodo e ocasionais áreas de necrose (PEIXOTO et al., 2008).

Simões (2007) e Tajima et al. (1998), ao estudarem bovinos com leucose

enzoótica, encontraram a expressão do p53 (proteína que se acumula devido a

mutações do DNA da célula neoplásca) em torno de 50% dos animais estudados.

O Radioimunoensaio é um teste mais sensível, que tem como fundamento

detectar anticorpos, porém é necessário a utilização de equipamentos altamente

especializados, o que torna este tipo de teste dispendioso (MILLER; VAN DER

MAATEN, 1974 apud FAVA, 1995).

As técnicas recomendadas pela OIE, para o diagnóstico da Leucose

Enzoótica Bovina, são o IDGA e o ELISA, o primeiro é menos sensível que o

segundo, porém devido à facilidade, praticidade, simplicidade de realização e

vantagens econômicas, tornou-se o teste-padrão a ser adotado, já tendo sido

utilizado com sucesso em programas de eliminação da LEB em alguns países


O teste de IDGA atua detectando a presença de anticorpos para as

principais glicoproteínas do envelope viral, o que indica a infecção. Tal teste foi

desenvolvido utilizando como antígeno o polipeptídeo p24 que, depois, foi

substituído pela glicoproteína gp51, pois foi demonstrado que os animais portadores

da doença desenvolviam títulos de anticorpos mais elevados contra esta

glicoproteína (FAVA, 1995).

2.7 Controle e profilaxia

As medidas mundialmente adotadas no controle da Leucose Enzoótica

Bovina baseiam-se na identificação e eliminação de animais soropositivos. Todavia,

a conduta em um programa de controle dependerá da prevalência encontrada:

quando esta for baixa, a eliminação dos animais é recomendável, porém, quando a

infecção é encontrada em larga escala, torna-se mais viável separar os animais

soropositivos e mantê-los distante o suficiente para que não seja possível a

transmissão do vírus por meio de insetos hematófagos. Também é indispensável o

cuidado com as práticas de manejo adotadas na propriedade rural para o controle

e/ou eliminação do VLB no rebanho (BRAGA et al., 1998a).

20

Algumas medidas podem e devem ser tomadas para evitar a disseminação

da Leucose em um rebanho, tais como: o controle de insetos vetores, o uso de luvas

individuais na palpação retal de vacas, atenção especial na utilização de

equipamentos para descorna, castração, utilização de agulhas e seringas

(RADOSTITS et al., 2002).

Atualmente, são grandes os esforços de vários grupos de pesquisas em

desenvolver uma vacina eficaz, capaz de proteger bovinos contra a infecção e

mesmo contra o desenvolvimento de Linfocitose Persistente e/ou linfossarcoma.

Entretanto, apesar de estarem sendo empregadas diferentes metodologias, tanto

tradicionais quanto moleculares, até o momento não há disponibilidade comercial de

uma vacina para o controle da LEB (LEUZZI Jr. et al., 2001).

2.8 Importância econômica e sanitária

A importância econômica da leucose vem aumentando nos últimos anos

(VAN DER LAAN et al., 1999). As perdas econômicas relacionadas à leucose em um

plantel afetado são elevadas, muito embora, frequentemente, afete os animais de

forma subclínica, causando: queda significativa na produção de leite (BRENNER et

al., 1989), restrições de comercialização no mercado internacional (JOHNSON;

KANEENE, 1991; BRAGA et al., 1997), aumento do intervalo entre partos

(BRENNER et al., 1989; HEALD et al., 1992) e mortalidade dos animais (BRAGA et

al., 1997). Em rebanhos leiteiros severamente afetados, a mortalidade anual chega a

2%, podendo atingir até 5% (RADOSTITIS et al, 2002).

Para importação dos animais, muitos países exigem o teste sorológico

negativo, inclusive o Brasil, porém não temos um programa oficial de controle desta

doença (BRAGA et al., 1997).

Em animais soropositivos, foi observada, no Brasil, uma diminuição na

produção leiteira da ordem de 11% (D’ANGELINO et al., 1998).

Foi estimada, nos EUA, uma perda financeira de 86 milhões de dólares por

ano em animais soropositivos que apresentavam linfocitose persistente por três anos

consecutivos, quando levado em conta fatores como: queda na produção leiteira e

diminuição nos teores de gordura no leite (DA et al., 1993).

Devido ao fato de já terem sido encontradas partículas virais no leite

(OLIVEIRA, 2000) - alimento básico na dieta de humanos e animais - têm-se a

21

preocupação que, além das perdas econômicas já citadas, outra questão vem sendo

objeto de estudo na virologia atual: o risco em potencial da transmissão do vírus a

humanos e outros animais nos quais a doença não ocorre naturalmente.

2.9 Aspectos bioquímicos

É fundamental a existência de parâmetros para avaliação dos resultados

obtidos num perfil bioquímico, o que só é possível diante de um número significativo

de amostras de uma população. Nesse sentido, teoricamente, 95% dos valores

populacionais saudáveis encontram-se situados ao redor de uma média, não

descartando a possibilidade de um outro valor fora deste intervalo ser absolutamente

normal. Indicam, ainda, que um teste nunca deve ser interpretado de forma isolada,

e sim avaliado de acordo com outros resultados obtidos e com as alterações clínicas

encontradas no animal em questão (ROUSSEL et al., 1997).

Inúmeros são os fatores, referidos na bibliografia especializada, que podem

influir sobre os parâmetros fisiológicos de um animal sadio, causando significativa

variabilidade. Entre estes, podemos destacar: a espécie animal; a raça; a idade; o

sexo; as condições de aclimatação; o manejo de criação e as normas de

alimentação. No caso específico dos bovinos, quer sejam taurinos ou zebuínos,

deve-se ressaltar a influência de doenças que determinam infecção latente ou

mesmo de enzootias, como o Vírus da Leucose dos Bovinos (GREGORY et al.,

2004).

Os médicos veterinários têm procurado meio auxiliares para avaliação e

diagnóstico que ofereçam informações cada vez mais precisas com menor

transtorno ao animal e seu proprietário. A enzimologia tem-se apresentado como

uma boa alternativa quando usada em conjunto com outros exames, ou mesmo

isoladamente (SCHEFFER, 2003).

As provas bioquímicas realizadas no soro sanguíneo dos animais

domésticos apresentam resultados que constituem excelente subsídio ao

diagnóstico clínico das enfermidades do fígado, sendo esses exames reunidos em

baterias de provas, referidas como avaliadoras da função hepática. Como rotina

clínica, recomenda-se, para essa avaliação, a realização das seguintes provas:

22

proteinograma, atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e

gamaglutamiltransferase (GGT) (SOUZA et al., 2004).

2.9.1 Proteínas séricas totais (PT)

A proteína é um composto de alto peso molecular, constituído primariamente

de cadeia de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. A albumina é a menor das

proteínas plasmáticas, tem peso molecular de 69.000 dáltons; as alfaglobulinas, de

200.000 a 300.000 dáltons; as betaglobulinas de 150.000 a 350.000 dáltons; as

gamaglobulinas de 150.000 a 300.000 dáltons; e o fibrinogênio cerca de 400.000

daltons (COLES, 1984). O mesmo autor afirma ainda que, embora haja considerável

número de informações disponíveis sobre as propriedades químicas das proteínas

plasmáticas, somente nos últimos 20 anos essas propriedades e funções foram

associadas a um possível significado clínico-patológico.

O decréscimo na concentração das proteínas do sangue deve-se a:

requerimento insuficiente na dieta, má absorção proteica, deficiência na síntese de

albumina pelo fígado, evasão da albumina para o espaço tecidual, com o aumento

da permeabilidade capilar nos processos inflamatórios agudos, e nas enfermidades

crônicas como nas neoplasias, além do estado fisiológico do animal que influi na

variação do proteinograma (COLES 1984). Somente a determinação da proteína

total não reflete com precisão o estado do metabolismo proteico, sendo de particular

importância a determinação da albumina e da globulina (COLES 1984).

Ocasionalmente, uma destas proteínas pode apresentar valores diminuídos, como

hipoalbuminemia nas infestações parasitárias, e elevação da concentração de

globulinas nos processos infecciosos. Dados obtidos sobre o proteinograma de

vacas com diferentes enfermidades, inclusive a leucose, mostram alterações nas

concentrações proteicas (LIBERG, 1977; FERREIRA et al., 2001).

Com o conhecimento da razão albumina/globulina, os erros de interpretação

dos valores plasmáticos de proteínas são minimizados (HERZ; HOD 1969).

Analisando amostras de soro sanguíneo de 32 fêmeas zebuínas da raça

Haryana, criadas na Índia, com a finalidade de conhecer mais sobre as proteínas

séricas, encontraram-se valores variando de 6,46 a 6,74 g/dl, não sendo observadas

diferenças significativas entre resultados obtidos em novilhas e vacas, tanto no início

quanto no final da lactação (MURTUZA, 1977 apud BARROS FILHO, 1995). Porém,

23

outros autores afirmam que existem notáveis variações nas concentrações séricas

de proteínas totais de acordo com a idade, tipo de alimentação, condição fisiológica,

hereditariedade, raça e estados patológicos (BARROS FILHO, 1995).

Encontram-se, na literatura, trabalhos que citam diferenças significativas

entre os teores de proteínas séricas totais em novilhas taurinas (8,10 g/dl) e

zebuínas (7,00 g/dl), e que, em animais adequadamente alimentados, os níveis de

proteína sérica total eram maiores nos machos (SOUZA, 1997).

O primeiro relato no Brasil sobre os teores de proteína sérica total em

bovinos, mais especificamente no estado do Rio de Janeiro, informa que os valores

médios para as raças Nelore e Guzerá são, respectivamente, de 7,01± 1,23 g/dl e

7,23± 1,14 g/dl (VOGUEL et al., 1957 apud SOUZA, 1997).

Na década de 60, havia dificuldades em se estabelecer os padrões de

referência para proteína total em bovinos, devido à diversidade dos resultados

citados, ocasionados pela não consideração da influência de inúmeros fatores que

causavam variabilidade como: ambiente, sistema de criação, alimentação, idade e

sexo, bem como pelo método utilizado para as determinações (SOUZA, 1997).

Em sete novilhas soropositivas para a Leucose Enzoótica Bovina, obteve-se

para proteínas séricas totais, o valor médio de 8,7± 0,9 g/dl em três coletas

sucessivas realizadas em 2001, em diferentes fases reprodutivas, o que levou a

conclusão de que os animais permaneceram hiperproteinêmicos em todas as fases

(FERREIRA et al., 2001).

Em estudos com 30 fêmeas holandesas com idade entre três e 12 anos,

sendo 10 soronegativas para a LEB, 10 soropositivas e 10 soropositivas com

linfocitose persistente, obtiveram-se, respectivamente, os seguintes valores em g/dl

para proteínas séricas totais: 8,24, 6,75 e 6,69 (OLIVEIRA et al., 2001).

Em estudos com 60 fêmeas holandesas, sendo 20 soropositivas para a LEB

e com linfocitose, 20 soropositivas para a LEB sem linfocitose e 20 soronegativas,

obtiveram-se, respectivamente, os seguintes valores em g/dl para proteínas séricas

totais: 7,85 ± 0,44, 8,02 ± 0,55 e 8,01 ± 0,55, não sendo detectadas diferenças

significativas entre os três grupos (BIRGEL JUNIOR et al., 2001).

A seguir, na tabela 2, são apresentados valores normais de proteínas

séricas totais na espécie bovina, segundo diferentes autores.

24

Tabela 2 – Valores normais de proteínas séricas totais na espécie bovina, segundo diversos autores

Autores g/ dl

BRADISH et al., 1954 6,44 a 7,50

CARROL e KANEKO, 1967 6,92 a 7,28

AKIOSHI e GERSZTEIN, 1962 5,70 a 8,40

VIANA e CAMPOS, 1973 7,99 a 9,69

ALENCAR FILHO, 1976 5,70 a 8,40

IRFAN, 1982 7,16

MATOS et al., 1983 7,17 a 8,21

BLOOD et al., 1988 6,00 a 8,50

KANEKO, 1989 6,74 a 7,46

REKWOT et al., 1989 6,81

BIRGEL et al., 1991 5,97 a 7,30

MEYER et al., 1992 6,70 a 7,50

MUTURZA, 1977 apud BARROS FILHO, 1995

6,46 a 6,74

VILELA et al.,1971 apud BARROS FILHO, 1995

7,28 a 9,78

BRAUN et al., 1983 apud SOUZA, 1997 6,80 a 7,30

OLBRICH et al., 1971 apud SOUZA, 1997 7,00 a 8,10

GARNER, 1952 apud SOUZA, 1997 8,42 a 10,38

VOGEL et al., 1957 apud SOUZA, 1997 5,78 a 8,24

LOPES et al., 1996 6,76 a 7,46

NEIRA et.al.,1982 apud FERREIRA et al., 2001

7,6

FERREIRA et al., 2001 7,8 a 9,6

BIRGEL JUNIOR et al., 2001 7,46 a 8,56

SOUZA et al., 2004 5,66 a 7,52

CAMPOS et al., 2007 6,31 a 6,91

25

2.9.2 Albumina

Evidenciou-se que a taxa de albumina é maior em vacas quando comparada

com a de bezerras, recém natos e novilhas (MYLREA ; BAYFIELD, 1968).

Os principais contribuintes da pressão osmótica do plasma sanguíneo são

os íons sódio, potássio, cloro, bicarbonato e cálcio, havendo uma pequena

contribuição das proteínas plasmáticas (albumina e globulinas). Determinando a

quantidade de cada fração das citadas proteínas, obtemos a relação

Albumina/Globulina (A/G) que, na maioria das espécies domésticas, varia de 0,5 a

1,5. A albumina é sintetizada no fígado, portanto, qualquer processo que afete a

síntese de proteínas poderá afetar a relação A/G. Assim ocorre na fibrose hepática

ou mesmo na deficiência de aminoácidos (MEDWAY et al., 1973).

A albumina é a menor das proteínas plasmáticas, tem peso molecular de

69.000 dáltons e, no plasma dos animais sadios, constitui 40 a 60% da concentração

total das proteínas séricas. Sua concentração média varia de espécie para espécie,

atuando na manutenção da pressão osmótica, fonte primária de aminoácidos e

possuindo capacidade de ligação com uma série de substâncias (COLES, 1984).

A albumina constitui cerca de 35 a 50% do total de proteínas plasmáticas, é

sintetizada no fígado e catabolizada por todo os tecidos metabolicamente ativos e

sua deficiência causa o chamado edema hipoalbominêmico (KANEKO, 1989).

A relação Albumina/Globulina deve ser evidenciada em distúrbios variados,

como, por exemplo, nas desidratações e, em bovinos, esta relação varia de 0,8 a 0,9

(CARLSON, 1990).

As proteínas totais são responsáveis pela manutenção da homeostasia

corporal, participam da hemostasia, da resistência a infecções, do equilíbrio ácido-

base e carreiam constituintes plasmáticos. A albumina, globulinas (αglobulinas,

βglobulinas e γglobulinas) e o fibrinogênio constituem as frações que compõem as

proteínas totais. O mesmo autor informa que a desidratação é responsável pela

hiperproteinemia, citando, entre outras causas, a diarréia, indigestão vagal,

parasitismo e a pneumonia crônica. A hipoalbuminemia tem como principais causas

o decréscimo na sua produção e sua perda via aparelho digestivo e urinário

(JOHNSTON, 1990)

A hipoalbuminemia está associada a distúrbios hepáticos e renais, entre

outras causas, e a meia vida da albumina sérica em bovinos é de 16,5 dias. A

26

hipoalbuminemia é observada em forma conjunta com a perda de peso em animais

de grande porte (MAAS, 1990).

A fração albumina em animais mais velhos apresentou valores

significativamente inferiores aos obtidos nos animais mais jovens (BIRGEL et al.,

1991 apud BARROS FILHO, 1995).

No estado do Rio de Janeiro, foi descrito, para a albumina sérica, os valores

de 3,33 ± 0,38 g/dl em zebuínos da raça Nelore (VOGEL et al., 1957 apud BARROS

FILHO, 1995).

A albumina é a proteína primariamente responsável pela manutenção da

pressão oncótica no plasma e a hiperproteinemia pode ser causada por um aumento

de albumina, globulina ou de ambas, porém a única causa da hiperalbuminemia é a

desidratação, sendo que a hiperproteinemia, na ausência de desidratação, é

resultado de uma hiperglobulinemia. Em bovinos com doença hepática crônica, o

decréscimo na concentração de albumina pode ser severo. Os mesmos autores

afirmaram que a perda da albumina pode estar relacionada a uma doença renal,

particularmente, à doença glomerular, desordem gastrintestinal ou hemorragia

(ROUSSEL et al., 1997)

Em sete novilhas soropositivas para a Leucose Enzoótica Bovina, obteve-se,

para albumina, o valor médio de 4,02 ± 0,43 g/dl em três coletas sucessivas,

realizadas em diferentes fases reprodutivas. E, para a razão albumina/globulina, o

valor médio de 0,90 ± 0,24 (FERREIRA et al., 2001).




para albumina: 3,14, 2,76 e 3,37, não sendo detectadas diferenças significativas

entre os três grupos. E para razão albumina/globulina, respectivamente, 0,63, 0,67,

0,88 (OLIVEIRA et al., 2001).



obtiveram-se, respectivamente, os seguintes valores em g/dl para albumina: 3,41 ±

0,39, 3,50 ± 0,30 e 3,46 ± 0,43, não sendo detectadas diferenças significativas entre

os três grupos. E, para a razão albumina/ globulina, respectivamente, 0,78 ± 0,16,

0,79 ± 0,14 e 0,78 ± 0,18 (BIRGEL JUNIOR et al., 2001).

27

Na tabela 3, são apresentados os valores normais da albumina sérica na

espécie bovina, segundo diferentes autores.

Tabela 3 – Valores normais de albumina sérica na espécie bovina, segundo diversos autores

Autores g/dl

BRADISCH et al., 1954 3,20

AKIOSHI e GERSZTEIN, 1962 3,50 a 3,71

VIANA; CAMPOS, 1973 2,79 a 3,63

ALENCAR FILHO, 1976 3,50 a 3,70

DIRKSEN et al., 1983 3,00 a 4,00

KOLB, 1984 2,78 a 4,00

BLOOD et al., 1988 2,10 a 3,60

FAGLIARI et al, 1988 2,00 a 2,07

KANEKO, 1989 3,03 a 3,55

CARLSON, 1990 3,03 a 3,55

JOHNSTON, 1990 3,03 a 3,55

MEYER et al., 1992 3,00 a 3,60

LOPES et al., 1996 3,03 a 3,55


SOUZA et al., 2004 2,90 a 3,42

CAMPOS et al., 2007 2,16 a 2,98

2.9.3 Globulinas

As globulinas são subdivididas em três frações α, β e γ. As α globulinas

constituem a fração que mais rapidamente migra das globulinas, por isso recebe o

nome “alfa”, possuindo duas frações α1 e α2, atuando no transporte de um grande

número de substâncias. As β globulinas atuam no transporte de ferro e lipídios, as

frações C3 e C4 constituem fatores do complemento; e o fibrinogênio, cujo aumento

28

indica processo inflamatório agudo, é precursor da fibrina. As γ globulinas têm

função na imunidade humoral, compõem-se das imunoglobulinas e suas frações IgA,

IgG, IgM, IgE, (LOPES et al., 1996)

Raramente, há uma diminuição da concentração globulínica total, embora

possa ocorrer queda na concentração de frações individuais, que se deve ao fato de

que outras globulinas podem estar simultaneamente aumentadas para compensar a

queda de um componente atingido, ainda que existam casos de hipoglobulinemia

em animais privados de colostro. Raramente, são observadas reduções das α-

globulinas nos estados patológicos dos animais domésticos, entretanto, as

elevações nas concentrações plasmáticas são frequentes nas reações inflamatórias

(COLES, 1984). O componente α-2 das α-globulinas está significativamente

aumentado nas infecções bacterianas e virais (MEBUS; COLES 1977 apud COLES

1984).

Um aumento nas concentrações de β-globulinas pode estar associado a um

aumento das β-lipoproteínas, como ocorre em casos de hiperlipemia.

(DIMOPOULOS et al., 1968 apud COLES, 1984; MEBUS; COLES, 1977 apud

COLES 1984).

Não há variações significativas de algumas frações proteicas do soro de

bovinos que possam ser atribuídas à influência de fatores etários, pois a diferença

dos resultados obtidos em novilhas e vacas prenhes não diferem significativamente

dos valores das frações albumina, alfa e betaglobulinas. Comparando, entretanto, o

teor sérico de gamaglobulinas, os resultados são significativamente maiores nas

novilhas (MURTUZA, 1977 apud SOUZA, 1997).

Em sete novilhas soropositivas para a Leucose Enzoótica Bovina, obteve-se,

para globulina, o valor médio de 4,62 ± 0,96 g/dl em três coletas sucessivas,

realizadas em diferentes fases reprodutivas (FERREIRA et al., 2001).




para globulina: 4,97, 2,76 e 3,37 (OLIVEIRA et al., 2001).



obtiveram-se, respectivamente, os seguintes valores em g/dl para globulina: 4,44 ±

29

0,29, 4,52 ± 0,30 e 4,55 ± 0,37, não sendo detectadas diferenças significativas entre

os três grupos. (BIRGEL JUNIOR et al., 2001).

Na tabela 4, são apresentados os valores normais de globulinas séricas

totais na espécie bovina, segundo diferentes autores.

Tabela 4. Valores normais de globulina sérica, segundo diversos autores

Autores g/dl

BRADISCH et al., 1954 3,77

VIANA E CAMPOS, 1973 5,63

ALENCAR FILHO, 1976 3,54

IRFAN, 1982 4,08

MATOS et al., 1983 4,40

FAGLIARI et al., 1988 3,22

KANEKO, 1989 3,00 a 3,48

MEYER et al., 1992 3,00 a 3,50

LOPES et al., 1996 3,00 a 3,48

FERREIRA et al., 2001 3,66 a 5,58


SOUZA et al., 2004 2,53 a 4,33

CAMPOS et al., 2007 3,56 a 4,51

2.9.4 Aspartato aminotransferase – AST

A atividade da AST é mais intensa nos equinos, porém encontrou-se

atividade considerável em vários órgãos e nas mais variadas espécies; o fígado, o

coração, rins e músculo esquelético são os locais onde a enzima apresenta maior

atividade (MEDWAY et al., 1973).

30

O aumento da AST sérica em bovinos ocorre na gestação adiantada, no

dano degenerativo e necrótico agudo do parênquima hepático e nas lesões agudas

do miocárdio e músculo esquelético (DIRKSEN et al., 1983).

Os valores da AST em fêmeas bovinas não sofrem diferenças estatísticas a

partir dos 24 meses de idade (GREGORY et al., 1999).

Os níveis séricos da AST podem estar aumentados nas hepatopatias,

praticamente, em todas as espécies, entretanto, não é um teste específico para

lesões hepáticas. A AST ocorre em concentrações elevadíssimas no músculo

esquelético e cardíaco e sua mensuração sérica é valiosa na confirmação do

diagnóstico de degeneração muscular, o que propicia o extravasamento de

quantidades significativas dessa enzima para a circulação. Em casos de necrose

hepatocelular, seus níveis podem estar extremamente aumentados (COLES, 1984).

A presença da AST em poucos tecidos faz com que ela seja um bom

indicador para danos teciduais específicos, observados na mensuração de seus

níveis séricos (KANEKO, 1989).

Aproximadamente 60 a 80% da AST estão no interior do hepatócito

associada à mitocôndria, enquanto o restante fica na forma solúvel no citoplasma;

em doenças hepáticas severas em estágio avançado, por exemplo, cirrose, os níveis

séricos da AST podem estar normais ou apenas pouco aumentados, provavelmente,

devido a uma diminuição da massa hepática viável e pela alteração da arquitetura

hepática (MEYER et al., 1992).

Em 47 bovinos da raça Jersey, soropositivos para a LEB, criados no estado

de São Paulo, obtiveram-se os seguintes valores para AST: 36,95 ± 10,18 U/l, que

não diferiram do grupo dos animais soronegativos, no qual se obteve o valor, para

AST, de 33,89 ± 5,51 U/l (GREGORY et al., 1999).

Em estudos com 118 fêmeas bovinas soropositivas para LEB, obtiveram-se

os valores para AST que variaram entre 26 a 40U/L (HAGIWARA et al., 1986 apud

GREGORY et al., 1999).

Nas condições brasileiras, o valor da atividade sérica da AST, em bovinos

sadios, não deveriam exceder 50U/l (GREGORY et al., 1999).

Na tabela 5, os valores normais de AST sérica na espécie bovina, segundo

diferentes autores, são apresentados.

31

Tabela 5 – Valores normais de AST sérica na espécie bovina, segundo diversos autores

Autores U/L

MEDWAY, et al., 1973 42 a 70

DIRKSEN et al., 1983 10 a 50

BLOOD et al., 1988 50 a 150

KANEKO, 1989 78 a 132

CARLSON, 1990 78 a 132

MEYER et al., 1992 78 a 132

LOPES et al., 1996 20 a 34

GREGORY et al., 1999 23 a 45

CAMPOS et al., 2007 39 a 73

2.9.5 Gamaglutamiltransferase - γγγγGT

É uma carboxipeptidase que cliva os grupos glutamil terminal C e os

transfere para peptídeos (COLES, 1984).

As maiores quantidades de γGT celular estão nos rins e no epitélio do ducto

biliar. A γGT renal é a fonte da γGT urinária e é um indicador de nefrotoxicidade,

juntamente com a fosfatase alcalina urinária. Desordens colestáticas, em todas as

espécies examinadas, resultaram em um aumento sérico da γGT (BRAUN et al.,

1987).

Com exceção do músculo, todas as células têm alguma participação da γGT

em suas atividades de membrana ou no citosol. Estima-se que seu peso molecular

varie de 90.000 a 350. 000 dáltons (KANEKO, 1989).

Não houve diferença significativa entre os níveis séricos de γGT obtidos em

machos e fêmeas, em estudo com bezerros das raças Frísia Piednoir, Garonnaise e

Pardo Suíço, criados na França, com idade variando entre quatro e seis meses de

idade (BRAUN et al., 1977 apud BARROS FILHO, 1995).

A mensuração da γGT representa um dos testes mais específicos para a

avaliação da função hepática na veterinária (ROUSSEL et al., 1997). Afirmaram

ainda que o nível de γGT aumenta exageradamente em doenças tubulares renais.

Os mesmos autores informaram que, após o consumo do colostro, que é rico em

γGT, os bezerros apresentaram um rápido aumento dos níveis séricos dessa

32

enzima, chegando a ser 50 a 100 vezes maior quando comparados aos níveis de

bezerros que não tiveram contato com colostro.

Avaliando bovinos recém natos das raças Nelore (Bos taurus indicus) e

Holandesa (Bos taurus taurus), e de bubalinos (Bubalus bubalis) da raça Murrah, foi

verificado que a atividade de γGT foi maior no dia do nascimento, com acentuado

decréscimo com o avanço da idade. Afirmaram, ainda, que há uma queda da

atividade enzimática ao longo do tempo (FAGLIARI et al., 1998).

Os valores da γGT em fêmeas bovinas não sofrem diferenças estatísticas a


Em 47 bovinos da raça Jersey, soropositivos para a LEB, criados no estado

de São Paulo, obtiveram-se os seguintes valores para γGT: 12,56 ± 7,78 U/l, que

não diferiram grupo dos animais soronegativos, no qual se obteve o valor para γGT

de 11,32 ± 4,20 U/l (GREGORY et al., 1999).

Em estudos com 118 fêmeas bovinas soropositivas para LEB, obtiveram-se

os valores para γGT que variaram entre 6 a 17U/L (HAGIWARA et al., 1986 apud

GREGORY et al., 1999).

Nas condições brasileiras, o valor da atividade sérica da γGT em bovinos

sadios não deveriam exceder 25 U/l (GREGORY et al., 1999).

Na tabela 6, são apresentados os valores séricos de γGT, considerados

normais em bovinos, segundo diversos autores.

Tabela 6 – Valores normais de γGT sérica na espécie bovina, segundo diversos autores

Autores U/L

SIMENSEN; NANSEN, 1974 17,47

BRAUN et al., 1977 11,6 a 19,0

MÁRQUEZ et al., 1977 12,0 a 22,7

BOTELHO et al., 1980 12,025

DIRKSEN et al., 1983 10,0 a 20,0

KANEKO, 1989 6,1 a 17,4

MEYER et al., 1992 11,0 a 24,0

BARROS FILHO, 1995 7,83 a 15,23

LOPES et al., 1996 6,1 a 17,4

GREGORY et al., 1999 13,21 ± 12,72

CAMPOS et al., 2007 7,43 a 17,12

33

2.9.6 Alanina Aminotransferase - ALT

O aumento da ALT ocorre em lesões do músculo cardíaco e esquelético e

necrose grave de hepatócitos (DIRKSEN et al., 1983).

O citoplasma do hepatócito é rico em ALT no cão, gato e primatas; os

equinos e ruminantes são notáveis exceções. Uma agressão (toxina, hipoxia) à

membrana hepatocelular resulta em um aumento da ALT sérica. De forma aguda

(horas ou dias), a magnitude do aumento torna-se mais ou menos paralela ao

número de hepatócitos com a permeabilidade da membrana alterada. Segundo os

mesmos autores, a atividade marcadamente aumentada das enzimas ALT e AST

circulante sugere um insulto hepático severo e difuso, especialmente se a icterícia

estiver presente. A meia vida plasmática da ALT é de aproximadamente 60 horas;

caso a injúria permaneça por alguns dias, os níveis séricos da ALT decrescerão

(MEYER et al.,1992).

A atividade da ALT requer o cofator piridoxal 5’-fosfato, o metabólito ativo da

vitamina B6, uma deficiência desta vitamina resulta na diminuição da atividade

enzimática (MEYER et al.,1992).

O valor médio para bovinos adultos saudáveis é de 10 U/l, podendo variar de

7 a 14 U/l (DIRKSEN et al., 1983). Segundo Kaneko (1989), o valor da ALT em

bovinos pode variar de 11 a 40 U/l (27±14); de 14 a 38 U/l (LOPES et al, 1996); de

18 a 47 UI/l (CAMPOS et al., 2007).

2.9.7 Ureia

A ureia é um composto orgânico relativamente simples produzido pelos

mamíferos. No fígado, como produto final do catabolismo de proteínas, é uma das

substâncias mais difusíveis pelo corpo e se encontra em todos os líquidos orgânicos

e é eliminada principalmente pelos rins. Ao se avaliarem os níveis séricos de ureia,

observam-se possíveis transtornos renais. Por exemplo, as tetraciclinas produzem

aumento nos níveis de ureia. Em ruminantes, a determinação de ureia sérica não

tem tanta importância na avaliação do funcionamento renal, pois há reciclagem da

ureia sanguínea no rúmen. Há variação que ocorre praticamente em todos os

34

herbívoros que demonstra que os níveis de ureia tornam-se mais elevados na

primavera (MEDWAY et al, 1973).

Existem variações dos teores de ureia na dependência do tipo de

alimentação, bem como diferenças significativas, conforme categorização etária dos

grupos experimentais ou de acordo com o estado fisiológico dos bovinos (BOSE,

1983; BOTELHO et al., 1984 ).

A ureia é proveniente das proteínas, hidrolisadas no intestino, em

aminoácidos e estes absorvidos pelas células da mucosa intestinal. Bactérias

intestinais podem degradar os aminoácidos em amônia. Os aminoácidos e a amônia

são transportados para o fígado via circulação portal. Aproximadamente 75% dos

aminoácidos (ou amônia) são transportados através da membrana celular hepática

até as mitocôndrias. Nestas, existem mecanismos de desaminação, um processo

cíclico chamado de ciclo da ureia. A excreção da ureia pelos rins representa a maior

rota de excreção de nitrogênio. A ureia foi introduzida como aditivo alimentar para

ruminantes na forma de um substituto barato de proteína (BLOOD et al., 1988).

Ruminantes intoxicados por ureia morrem rapidamente. Animais com doença

hepática difusa têm reduzida capacidade de sintetizar a ureia. Nesses casos, os

níveis séricos dos precursores da ureia, como aminoácidos e amônia, são

geralmente elevados (KANEKO, 1989).

O ciclo da ureia fica completamente alterado diante da cirrose hepática.

Nesses casos, a ureia sérica pode apresentar-se em baixas concentrações e passa

a ser excretada pela urina também em concentrações mais baixas. (KANEKO,

1989).

Com o avançar da idade, há tendência de aumento da ureia sanguínea,

além de outros fatores que poderiam influenciar as variações da taxa de ureia no

organismo animal: o manejo, a dieta, a raça e o sexo (GREATOREX, 1955 apud

BARROS FILHO, 1995).

Com o avançar da idade, há pequena diminuição da ureia sanguínea e, em

estudos realizados no estado do Rio Grande do Sul, em 1976, foram observadas

diferenças significativas nos níveis obtidos nos machos e fêmeas bovinas (LANE et

al., 1977 apud BARROS FILHO, 1995).

Os valores de ureia em fêmeas bovinas não sofrem diferenças estatísticas a


35

Em estudos com fêmeas bovinas da raça Jersey soropositivas para a LEB,

criadas no estado de São Paulo obtiveram-se os seguintes valores para a ureia de

29,39 ± 11,76 mg/dl, que não diferiram do grupo dos animais soronegativos, no qual

se obteve o valor para uréia de 28,34 ± 11,16 mg/dl (GREGORY et al., 2004).

Na Tabela 7, os valores normais de ureia sérica na espécie bovina são

apresentados, segundo diversos autores.

Tabela 7 - Valores normais de ureia sérica na espécie bovina, segundo diversos autores

Autores mg/dl

DIRKSEN et al., 1983 10 a 40

COLES, 1984 6 a 27

KOLB, 1984 20 a 40

BLOOD et al., 1988 6 a 27

KANEKO, 1989 20 a 30

MEYER et al., 1992 19,89 a 29,98

LOPES et al., 1996 42,8 a 64,2

GREGORY et al., 2004 17,41 a 39,29

CAMPOS et al., 2007 16,05 a 29,21

2.9.8 Creatinina

A creatinina é formada durante o metabolismo da creatina e fosfocreatina

muscular. Como ocorre com a ureia, a creatinina é um índice grosseiro da filtração

glomerular. A creatinina sérica não é marcadamente influenciada pela dieta ou por

hemorragias intestinais. Uma severa perda muscular poderá reduzir a quantidade de

creatinina formada. O seu aumento na circulação sanguínea ocorre mais

tardiamente nos estados de insuficiência renal, quando comparado com a uréia

sanguínea, por ser facilmente eliminada (MEYER et al., 1992; LOPES et al., 1996).

De forma semelhante à ureia, uma redução na taxa de filtração glomerular

aumenta a concentração sérica de creatinina. Os mesmos fatores pré-renal, renal e

pós-renal, que influenciam a uréia, influenciam também a creatinina sérica

(desidratação, doença cardiovascular, choque (séptico ou traumático), doença renal,

36

causando destruição dos néfrons, obstrução ou ruptura do trato urinário) (MEYER et

al., 1992).

O valor médio normal da creatinina no soro de bovinos adultos é de 1,19 (1-

1,5) mg/dl, (touros: maior ou igual a 2,82 mg/dl), e em bezerros é de 1,47 (1,24 a

2,03) mg/dl (DIRKSEN et al., 1983). O valor médio da creatinina em bovinos é de 1,0

a 2,0 mg/dl (KANEKO, 1989), 1,0 a 2,0 mg/dl (LOPES et al., 1996) e 1,14 a 1,56

mg/dl (GREGORY et al., 2004), 0,79 a 1,67 mg/dl (CAMPOS et al., 2007).

Os valores de creatinina, em fêmeas bovinas, não sofrem diferenças

estatísticas a partir dos 24 meses de idade (GREGORY et al., 2004).

Em estudos com fêmeas bovinas da raça Jersey soropositivas para a LEB,

criadas no estado de São Paulo, obtiveram-se os valores para creatinina de 1,42 ±

0,18 mg/dl, que não diferiram dos valores do grupo dos animais soronegativos, no

qual se obteve o valor para creatinina de 1,36 ± 0,15 mg/dl (GREGORY et al.,

2004).

37

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados soros de 120 fêmeas bovinas soropositivas para a Leucose

Enzoótica Bovina e soros de 120 fêmeas soronegativas (grupo controle). Em ambos

os grupos, as fêmeas eram mestiças com idade superior a quatro anos, provenientes

de 18 propriedades localizadas na região Norte Fluminense, criadas a campo, cujas

amostras foram coletadas por punção da veia jugular em tubos “vacutainer” de 10

ml. No Laboratório de Sanidade Animal (LSA-CCTA/UENF), as amostras de sangue

foram mantidas à temperatura ambiente até a dessoragem completa; em seguida,

centrifugadas a 600 g por 5 min. Os soros obtidos foram fracionados em duas

alíquotas e armazenados em microtubos tipo “Eppendorf” e congelados a -20 ºC, até

a realização do teste sorológico de IDGA. Para a verificação de anticorpos no soro,

foi utilizado um kit comercial proveniente da Sanofi/França, que consta de soro-

controle positivo e antígeno gp51. Todos os animais foram protocolados em fichas

individuais, com informações sobre: idade, sexo, raça e manejo realizado na

propriedade.

3.2 Análise laboratorial

Foi realizada análise espectrofotométrica com o Labmax Plenno®, um

analisador bioquímico automático, multiparamétrico de acesso aleatório da marca

Labtest Diagnóstica S/A em todas as 240 amostras; resultando em um total de 1680

análises. Nas referidas análises, foram utilizados kits comerciais específicos para

cada analito, e os controles de qualidade Qualitrol 1 e Qualitrol 2 foram empregados

antes do início de cada bateria de testes, todos da marca Labtest Diagnóstica S/A,

seguindo os protocolos de automação do equipamento.

Os seguintes analitos foram mensurados:

-PROTEÍNAS SÉRICAS TOTAIS (PT);

-ALBUMINA;

-ASPARTATO AMINOTRANSFERASE (AST);

-GAMAGLUTAMILTRANSFERASE (γGT);

38

-ALANINA AMINOTRANSFERASE (ALT);

-UREIA;

-CREATININA.

As técnicas seguidas foram disponibilizadas nos próprios kits reagentes,

seguindo os protocolos de automação para o Labmax Plenno®.

O valor da Globulina foi obtido pela diferença entre a proteína sérica total e a

albumina de cada amostra.

O valor da razão albumina/globulina (A/G) foi obtido dividindo-se o valor

obtido da albumina pelo da globulina de cada amostra.

3.3 Anatomopatologia

Realizou-se exame clínico de rotina para grandes animais preconizado por

Dirksen et al. (1983).

Paralelamente ao exame clínico, foram coletados 5 ml de sangue total da

veia jugular, que foram acondicionados em tubos plásticos contendo EDTA 10%.

Tais tubos foram transportados em caixa isotérmica, contendo gelo reciclável, para

posterior realização do hemograma.

As amostras de sangue total para a realização do hemograma foram

processadas utilizando-se o contador hematológico de células MS4® (Melet

Schloesing Laboratories, France), sendo avaliados: hematócrito, hematimetria,

hemoglobinometria, volume corpuscular médio (VCM), concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM), hemoglobina corpuscular média (HCM),

leucometria global e plaquetometria. A determinação da leucometria específica foi

realizada no esfregaço sanguíneo confeccionado com a amostra de sangue total

colhido.

Foram eutanasiadas duas fêmeas da raça Jersey soropositivas ao VLB, com

18 meses de idade, pertencentes à EMATER RIO, CENTERJ do município de

Cordeiro, utilizando-se sedação com xilazina, seguida de superdosagem de

barbitúricos (tiopental sódico) e, após obtenção da anestesia, foi aplicada a solução

saturada de cloreto de potássio, atendendo ao recomendado pelo Conselho Federal

de Medicina Veterinária.

39

3.3.1 Macroscopia

Procedeu-se à necropsia de rotina, quando se observaram os órgãos do

sistema linfático (baço, linfonodos, timo), do sistema digestório (esôfago, pré-

estômagos, estômago e fígado), além dos rins, coração, pulmões, traqueia e sistema

nervoso central (encéfalo e medula).

3.3.2 Histopatologia

Foram coletadas amostras com cerca de 5 cm de comprimento e 0,5 cm de

diâmetro dos órgãos citados no item 3.3.1., subsequentemente fixados em formol

neutro tamponado a 10% e submetidos a processamento tecidual por inclusão em

parafina e coloração pela hematoxilina e eosina (com exceção do decalque de

superfície de corte do linfonodo pré-escapular que foi fixado em álcool a 70% e,

posteriormente, corado pelo HE), no setor de morfologia e anatomia patológica da

UENF.

As amostras foram microtomizadas com 5 µm de espessura e coletadas em

banho-Maria, a 38ºC, em lâminas histológicas para microscopia óptica de luz branca.

3.3.3 Imunoistoquímica

Seções em parafina de quatro µm foram obtidas das amostras selecionadas

e colhidas em lâminas histológicas silanizadas (Silano, Sigma-Aldrich, MO, USA),

submetidas à desparafinização em cinco banhos em xilol (10 min) e reidratação em

cinco banhos de alcoóis graduados (5 min) e três banhos em água deionizada (5

min). A seguir, os espécimes foram tratados com solução aquosa de peróxido de

hidrogênio 30V (Vetec, RJ, Brasil) a 30% por 30 min para bloqueio da peroxidase

endógena. Posteriormente, eram colocadas em banho-maria a 98oC em tampão

citrato (Vetec, RJ, Brasil), por 30 min para recuperação antigênica, e mantidas em

temperatura ambiente por 20 min. Subsequentemente, as lâminas foram

cuidadosamente enxutas com papel toalha, os cortes envolvidos circularmente com

40

Dako pen® (Dako, CA, USA), e os espécimes incubados por 1 hora com solução

para bloqueio de ligações inespecíficas Trisma NaCl (Vetec, RJ, Brasil) com 1% de

soroalbumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA – Sigma-Aldrich, MO, USA)

e 1% de leite em pó desnatado (MolicoTM – Nestlé, SP, Brasil). Depois de descartada

a solução de bloqueio, as seções foram incubadas com anticorpo monoclonal

anticitoqueratinas (Dako, CA, USA, clone AE1/AE3) (fígado) e anti-p53 (Calbiochem,

USA, clone Ab-3, mutant) para todas as amostras citadas no item 3.3.1. Os

anticorpos foram diluídos 1:100 e incubadas “overnight” a 4oC em câmara úmida. No

dia seguinte, as lâminas foram lavadas com solução salina de Trisma com tween 20-

TBS (Vetec, RJ, Brasil) por 5 min e tratadas com kit LSAB-HRP+ (Dako, CA, USA),

lavadas por 5 min com TBS e reveladas com Kit cromógeno DAB (Dako, CA, USA);

contra-coradas com hematoxilina de Harris, desidratadas em banhos de alcoóis (1

min) e montadas com Permount® (Sigma-Aldrich, MO, USA) e, posteriormente,

analisadas em microscópio óptico visando observar as imunomarcações.

3.4 Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas por meio de intervalo de confiança

para os valores das variáveis (COCHRAN, 1955), com auxílio do programa

computacional GENES, versão 2006.4.1 (CRUZ, 2006), considerando o nível de

significância α igual a 5%, admitindo-se uma amostra representativa de uma

população infinita de bovinos da região Norte Fluminense, RJ.

41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análises estatísticas

Realizou-se a análise descritiva contendo média e desvio-padrão para os

grupos de bovinos soropositivos e soronegativos (tabela 8). Subsequentemente as

comparações entre as médias foram feitas pela sobreposição ou não dos intervalos

de confiança (probabilidade de conter a média da população igual a 95%). Caso

houvesse diferença significativa, os intervalos de confiança não se sobreporiam

(figuras 1 a 6).

Tabela 8 – Bioquímica sérica de bovinos da região Norte Fluminense soropositivos e soronegativos para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, 2008. Número de amostras Média Desvio-Padrão

+ - + - + -

Proteínas Totais (g/dl)

120

120

7,81

7,14

1,32

0,82

Albumina (g/dl) 120 120 2,29 2.45 0,48 0,38

Globulinas (g/dl) 120 120 5,52 4,69 1,1 0,68

AST (U/L) 1 120 120 46,37 33,38 17,82 13,96

ALT(U/L) 2 120 120 11,57 9,87 4,93 3,44

γγγγGT (U/L) 3 120 120 25,72 20,48 9,68 6,35

Creatinina (mg/dl) 120 120 1,11 1,13 0,29 0,39

Ureia (mg/dl) 120 120 30,12 34,81 12,58 11,47

Razão A/G 120 120 0,42 0,53 0,10 0,10

1. Aspartato aminotransferase

2. Alanina aminotransferase

3.Gamaglutamiltranferase

+. Soropositivos

-. Soronegativos

Se utilizarmos, para comparação, a amplitude de variação de um desvio-

padrão para cada parâmetro mensurado no grupo soropositivo e soronegativo,

verificaremos que, em nenhum dos parâmetros mensurados, será possível observar

diferenças significativas, pois sempre observaremos sobreposição dos valores

quando consideramos média ± desvio-padrão como amplitude de variação.

A seguir, as figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 mostram a média e os intervalos de

confiança obtidos para os parâmetros mensurados.

42

Figura 1. Médias e intervalos de confiança de proteínas totais (PT), globulinas (GLO) e albuminas (ALB) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

Figura 2. Médias e intervalos de confiança da razão albumina/globulina (A/G) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

7,81558

7,14358

5,52767

4,69108

2,28792 2,4525

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Co

nce

ntr

açã

o s

éri

ca g

/dL

PT GLO ALB

PT+

PT-

GLO+

GLO-

ALB+

ALB-

0,42481

0,53154

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Re

sult

ad

o A

/G

Albumina/Globulina

A/G+

A/G-

43

Figura 3. Médias e intervalos de confiança de aspartato aminotransferase (AST), γ-glutamiltransferase (GGT) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

Figura 4. Médias e intervalos de confiança de alanina aminotransferase (ALT) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

46,36666

33,38334

25,71667

20,48333

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Co

nce

ntr

açã

o s

éri

ca U

/L

AST GGT

AST+

AST-

GGT+

GGT-

11,575

9,875

0

2

4

6

8

10

12

14

Co

nce

ntr

açã

o s

éri

ca U

/L

ALT

ALT+

ALT-

44

Figura 5. Médias e intervalos de confiança de ureia (URE) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

Figura 6. Médias e intervalos de confiança de creatinina (CRE) nos grupos soropositivos (+) e soronegativos (-) (há sobreposição dos intervalos de confiança), para o vírus da Leucose Enzoótica Bovina, na região Norte Fluminense, 2008.

30,11667

34,80833

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Co

nce

ntr

açã

o s

éri

ca m

g/d

L

Ureia

URE+

URE-

1,1111,13317

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

1,2

1,3

Co

nce

ntr

açã

o m

g/d

L

Creatinina

CRE+

CRE-

45

4.2 Aspectos bioquímicos séricos

4.2.1 Proteínas séricas totais (PT)

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração das proteínas

séricas totais foram de 7,81 ± 1,32 g/dl para o grupo de soropositivos e de 7,14 ±

0,82 g/dl para o grupo de soronegativos. Resultados semelhantes foram obtidos por

Ferreira et al. (2001) e Neira et al. (1982) apud Ferreira et al. (2001), que também

encontraram valores de proteínas séricas totais maiores em animais soropositivos

quando comparados aos dos soronegativos, atribuindo a esse resultado o fato de

ocorrer produção de paraproteínas pelos animais leucóticos.

O valor médio obtido para o grupo soropositivo, por estar dentro da

amplitude de variação de um desvio padrão (entre 6,49 e 9,13 g/dl), é considerado

normal, segundo Bradisch et al. (1954); Carroll, Kaneko (1967); Akioshi, Gersztein

(1962); Viana, Campos (1973); Alencar Filho (1976); Irfan (1982); Matos et al.

(1983); Blood et al. (1988); Kaneko (1989); Rekwot et al. (1989); Birgel et al. (1991);

Meyer et al. (1992); Muturza (1977) apud Barros Filho (1995); Vilela et al. (1971)

apud Barros Filho (1995); Braun et al. (1983) apud Souza (1997); Olbrich et al.

(1971) apud Souza (1997); Garner (1952) apud Souza (1997); Vogel et al (1957)

apud Souza (1997); Lopes et al. (1996); Neira et al. (1982) apud Ferreira et al.

(2001); Ferreira et al. (2001); Birgel Junior et al. (2001) e Campos et al. (2007).

Considerando os estudos realizados por outros autores que também

trabalharam com animais soropositivos para LEB, os valores obtidos, no presente

estudo para o grupo soropositivo, foram considerados normais, segundo os dados

de Oliveira et al. (2001), Ferreira et al. (2001), Birgel Junior et al. (2001).

O valor médio obtido para o grupo soronegativo, por estar dentro da

amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 6,32 e 7,96 g/dl), está dentro da

normalidade, segundo Bradisch et al. (1954); Carroll, Kaneko (1967); Akioshi,

Gersztein (1962); Alencar Filho (1976); Irfan (1982); Matos et al. (1983); Blood et al.

(1988); Kaneko (1989); Rekwot et al. (1989); Birgel et al. (1991); Meyer et al. (1992);

Muturza (1977) apud Barros Filho (1995); Vilela et al. (1971) apud Barros Filho

(1995); Braun et al. (1983) apud Souza (1997); Olbrich et al.(1971) apud Souza

(1997); Vogel et al. (1957) apud Souza (1997); Lopes et al. (1996); Neira (1982)

46

apud Ferreira et al. (2001); Ferreira et al. (2001); Birgel Junior et al. (2001) e

Campos et al. (2007); e abaixo do normal segundo Viana, Campos (1973) e Garner

(1952) apud Souza (1997).

4.2.2 Albumina e razão albumina/globulina (A/G)

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da albumina

sérica foram de 2,29 ± 0,48 g/dl para o grupo de soropositivos, e de 2,45 ± 0,38 g/dl,

para o grupo de soronegativos.


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 1,81 e 2,77 g/dl), é considerado

normal, segundo Blood et al. (1988); Fagliari et al. (1988); Campos et al. (2007); e

abaixo do normal segundo Bradisch et al. (1954); Akioshi, Gersztein (1962); Viana,

Campos (1973); Alencar Filho (1976); Dirksen et al. (1983); Kolb (1984); Kaneko

(1989); Carlson (1990); Johnston (1990); Meyer et al. (1992); Lopes et al. (1996);

Birgel Junior et al. (2001) e Souza et al. (2004).



estudo, para o grupo soropositivo foram considerados normais, segundo os dados

de Oliveira et al. (2001); e abaixo do normal segundo, Ferreira et al. (2001) e Birgel

Junior et al. (2001).



normal segundo Viana, Campos (1973); Kolb (1984); Blood et al.(1988); Fagliari et

al. (1988); Campos et al. (2007); e abaixo do normal, segundo Bradisch et al. (1954);

Akioshi, Gersztein (1962); Alencar Filho (1976); Dirksen et al. (1983); Kolb (1984);

Kaneko (1989); Carlson (1990); Johnston (1990); Meyer et al. (1992); Lopes et al.

(1996); Birgel Junior et al. (2001) e Souza et al. (2004).

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da razão

albumina/globulina foram de 0,42 ± 0,10 para o grupo de soropositivos, e de 0,53 ±

0,10, para o grupo de soronegativos.


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 0,32 e 0,52), é considerado

47

normal, segundo Medway et al. (1973); e abaixo do normal, segundo Carlson (1990);

Birgel Junior et al. (2001); Oliveira et al. (2001) e Ferreira et al. (2001).


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 0,43 e 0,63), é considerado

normal, segundo Medway et al. (1973); Oliveira et al. (2001); Birgel Junior et al.

(2001); e abaixo do normal, segundo Carlson (1990) e Ferreira et al. (2001).

4.2.3 Globulina

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da globulina

sérica foram de 5,52 ± 1,1 g/dl para o grupo de soropositivos e, de 4,69 ± 0,68 g/dl,

para o grupo de soronegativos.



normal, segundo Viana, Campos (1973); Ferreira et al. (2001); Birgel Junior et al.

(2001); e Campos et al. (2007); e acima do normal segundo Bradisch et al. (1954);

Alencar Filho (1976); Irfan (1982); Matos et al. (1983); Fagliari et al.(1988); Kaneko

(1989); Meyer et al. (1992); Lopes et al. (1996), Birgel Junior et al. (2001) e Souza et

al. (2004).



estudo, para o grupo soropositivo, foram considerados normais, segundo os relatos

de Ferreira et al. (2001) e Birgel Junior et al. (2001); e acima do normal, segundo

Oliveira et al. (2001).


amplitude de variação de um desvio padrão (entre 4,01 e 5,37 g/dl), é considerado

normal, segundo Irfan (1982); Matos et al. (1983); Ferreira et al. (2001); Birgel Junior

et al. (2001); Souza et al. (2004) e Campos et al. (2007); e acima do normal,

segundo Bradisch et al. (1954); Alencar Filho (1976); Fagliari et al.(1988); Kaneko

(1989); Meyer et al. (1992); Lopes et al. (1996); e considerado abaixo do normal

segundo Viana, Campos (1973).

48

4.2.4 Aspartato aminotransferase – AST

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da aspartato

aminotransferase foram de 46,37 ± 17,82 U/L para o grupo de soropositivos e, de

33,38 ± 13,96 U/L, para o grupo de soronegativos.


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 28,55 e 64,19 U/L), é considerado

normal, segundo Medway et al. (1973); Dirksen et al. (1983); Blood et al. (1988);

Lopes et al. (1996); Gregory et al. (1999); Campos et al. (2007); e considerado

abaixo do normal, segundo Kaneko (1989); Carlson (1990) e Meyer et al. (1992).


trabalharam com animais soropositivos para LEB, os valores obtidos no presente

estudo para o grupo soropositivo foram considerados normais, segundo as

pulicações de Hagiwara et al. (1986) apud Gregory et al. (1999); e Gregory et al.

(1999).



normal, segundo Medway et al. (1973); Dirksen et al. (1983); Lopes et al. (1996);

Gregory et al. (1999); Campos et al. (2007); e considerado abaixo do normal,

segundo Blood et al. (1988); Kaneko (1989); Carlson (1990) e Meyer et al. (1992).

4.2.5 Gamaglutamiltransferase - γγγγGT

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da

gamaglutamiltransferase foram de 25,72 ± 9,68 U/L para o grupo de soropositivos e,

de 20,48 ± 6,35 U/L, para o grupo de soronegativos.



normal, segundo Simensen, Nansen (1974); Braun et al. (1977); Márquez et al.

(1977); Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); Meyer et al. (1992); Lopes et al. (1996);

Gregory et al. (1999); Campos et al. (2007); e acima do normal, segundo Botelho et

al. (1980); e Barros Filho (1995).

49



estudo, para o grupo soropositivo, foram considerados normais, segundo

informações de Hagiwara et al. (1986) apud Gregory et al. (1999); e Gregory et al.

(1999).



normal, segundo Simensen, Nansen (1974); Braun et al. (1977); Márquez et al.

(1977); Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); Meyer et al. (1992); Barros Filho

(1995); Lopes et al. (1996); Gregory et al. (1999); Campos et al. (2007); e acima do

normal, segundo Botelho et al. (1980).

4.2.6 Alanina aminotransferase - ALT

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da alanina

aminotransferase foram de 11,57 ± 4,93 U/L para o grupo soropositivo e, de 9,87 ±

3,44 U/L, para o grupo soronegativo.



normal, segundo Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); Lopes et al. (1996); e abaixo

do normal, segundo Campos et al. (2007); não sendo encontrado estudos na

literatura que mensurem ALT em animais soropositivos para LEB.



normal, segundo Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); e abaixo do normal, segundo

Lopes et al. (1996) e Campos et al. (2007).

4.2.7 Ureia

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da ureia sérica

foram de 30,12 ± 12,58 mg/dl para o grupo soropositivo e, de 34,81 ± 11,47 mg/dl,

para o grupo soronegativo.

50


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 17,54 e 42,70 mg/dl), é

considerado normal, segundo Dirksen et al. (1983); Coles (1984); Kolb (1984); Blood

et al. (1988); Kaneko (1989); Meyer et al. (1992); Gregory et al. (2004); Campos et

al. (2007); e abaixo do normal, segundo Lopes et al. (1996).



estudo, para o grupo soropositivo, foram considerados normais segundo os estudos

de Gregory et al. (2004).


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 23,34 e 46,28 mg/dl), é

considerado normal, segundo Dirksen et al. (1983); Coles (1984); Kolb (1984); Blood

et al. (1988); Kaneko (1989); Meyer et al. (1992); Gregory et al. (2004); Campos et

al. (2007) e Lopes et al. (1996).

4.2.8 Creatinina

Os valores médios e desvios-padrão obtidos na mensuração da creatinina

sérica foram de 1,11 ± 0,29 mg/dl para o grupo soropositivo e, de 1,13 ± 0,39 mg/dl,

para o grupo soronegativo.


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 0,82 e 1,40 mg/dl), é considerado

normal, segundo Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); Lopes et al. (1996); Gregory

et al. (2004); Campos et al. (2007).



estudo, para o grupo soropositivo, foram considerados normais, segundo os relatos

de Gregory et al (2004).


amplitude de variação de um desvio-padrão (entre 0,74 e 1,52 mg/dl), é considerado

normal, segundo Dirksen et al. (1983); Kaneko (1989); Lopes et al. (1996); Gregory

et al. (2004); Campos et al. (2007).

51

4.3 Anatomopatologia

Os linfonodos pré-escapulares, pré-crurais, submandibulares e mesentérios

exibiram megalia e consistência firme. Os linfonodos pré-escapulares (Prancha 1A),

ao corte longitudinal, revelaram protusão do parênquima para superfície de corte,

nodulações em seu interior de coloração que variou de branco a amarelo-cinza, com

perda da arquitetura tecidual e do limite córtico-medular (Prancha 1B). Estes

achados estão de acordo com aqueles encontrados por Oliveira et al. (1999); Reis et

al. (2002); Barros et al. (2007); Silva et al. (2008). Contudo, Peixoto et al. (2008)

também encontraram coloração branca e amarelada, mas também áreas vermelho-

escuras intercaladas.

O exame macroscópico revelou aumento de volume discreto do baço em

ambos os animais (Prancha1C), fato que, possivelmente, tenha ocorrido devido ao

método de eutanásia empregado no presente estudo.

À microscopia dos linfonodos aqui estudados, observou-se população celular

representada por linfócitos anisocarióticos que, em algumas vezes, revelavam

hipercromatismo e mitoses bizarras (Prancha 1D). Essas observações coincidem

com as de Oliveira et al. (1999), Peixoto et al. (2008) e Cordeiro et al. (1994).

Seções teciduais hepáticas, desta investigação, mostraram moderada

população de linfócitos anisocarióticos, polimórficos e hipercromáticos no tecido

conjuntivo e interior dos vasos do espaço-porta, e entre os sinusoides hepáticos

(Prancha 1E).

Yamamoto (1982) afirma que a ocorrência de linfócitos neoplásicos no

espaço-porta hepático é compatível com a manifestação leucêmica desta

enfermidade em bovinos. Essa afirmação corrobora os achados do presente

experimento, que apresentou linfócitos atípicos no sangue periférico, com

leucocitose e linfocitose absoluta, observadas no hemograma deste animal

necropsiado (Leucócitos: 20.900/µl; linfócitos: 13.617/µl). Comparados aos valores

de referência, segundo Lopes et al. (1996): Leucócitos: 4.000 a 12.000/µl; Linfócitos:

2.500 a 7.500/µl).

Yamamoto (1982) ainda descreve que a lesão hepática é caracterizada pela

ploriferação neoplásica nas tríades do espaço-porta, o que também foi observado

nesta investigação (Prancha 1E).

52

Os dutos biliares da tríade portal foram melhores evidenciados pela

imunomarcação com a pancitoqueratina, o que permitiu uma visualização plena dos

linfócitos proliferados e entremeados no tecido conjuntivo do espaço-porta e entre os

sinusoides hepáticos aqui investigados (Prancha 1F).

A citopatologia, em decalque da superfície de corte do linfonodo pré-

escapular, revelou linfócitos anisocarióticos e pleomórficos, compatíveis com a

leucose bovina (Prancha 2 A).

Os vasos sanguíneos da dura-máter da medula espinhal apresentaram, à

microscopia em HE, manguitos de células linfoides, que exibiam atipias e

hipecromasia, compatíveis com aquelas encontradas na leucose enzoótica bovina

(Prancha 2B). Ao passo o que, em seções teciduais cerebelares, foram mostrados

manguitos perivasculares, representados por células compatíveis com aquelas

acima descritas (Prancha 2C/D).

Os infiltrados de linfócitos neoplásicos na membrana dura-máter da medula

espinhal e cerebelares explicam os sinais percebidos no exame clínico, e estes

incluíam incoordenação e ataxia dos membros posteriores. Esse animal tinha, na

leucometria global, um total de 26.700 leucócitos/µl de sangue e contagem de

linfócitos de 17.889/µl, revelando um quadro de leucocitose com linfocitose absoluta,

segundo Lopes et al. (1996).

A ocorrência de linfossarcomas intracerebrais e no canal vertebral

comprimindo a medula espinhal causa quadro clínico de disfunção medular

(REBHUN, 1984; SHERMANN, 1987; FIGHERA, 2004; BARROS, 2004). A

localização intracraniana de linfossarcomas é relatada como sendo incomum por

Summers et al. (1995). A compressão da medula espinhal por linfossarcomas

localizados no canal vertebral, causando sinais clínicos, também foi descrita por Valli

(1993). Apesar de não terem sido observadas massas tumorais pronunciadas no

cerebelo e medula espinhal, nos cortes realizados no animal eutanasiado neste

experimento, que apresentava sintomatologia nervosa, acredita-se que este quadro

tenha sido desencadeado pelo infiltrado linfocitário.

Não houve imunomarcação para o antígeno p53 nas seções teciduais dos

animais necropsiados no presente trabalho. Simões (2007) e Tajima et al. (1998), ao

estudarem bovinos com leucose enzoótica, a expressão do p53 foi detectada em

torno de 50% dos animais estudados. Portanto, é provável que nem em todos os

casos de leucose enzoótica bovina ocorra a expressão e o acúmulo da proteína p53

53

estável, o que pode ter ocorrido nesta investigação, o que explica os valores

negativos encontrados nas amostras analisadas. Além do que, a leucose enzoótica

bovina tem progressão crônica, caracterizada pelo aparecimento lento de massas

tumorais, que somente são percebidas nos animais mais velhos. Os infiltrados

linfocitários, observados em amostras dos animais aqui estudados, eram discretos e

incipientes, talvez fosse interessante realizar análise do p53 em massas tumorais

mais evoluídas.

Prancha 1. Leucose enzoótica bovina. A) Linfadenomegalia préSuperficie de corte do material Aregiões cortical e córticotecidual de linfonodo préanômalas. HE, obj.100x. E) Linfocitose em vaso portae anisocariose. HE, 40x. F) Ductos biliares, imunomarcados para pancitoqueratina, em meio àno espaço-porta hepático. Perceba linfócitos atípicos, obj. 100x e 20x, HE.Setor de Morfologia e Anatomia Patológica/LSA/CCTA/UENF, 2008.

A

C

E

Leucose enzoótica bovina. A) Linfadenomegalia préuperficie de corte do material A, com formações circulares protrusas nas

regiões cortical e córtico-medular. C) Baço com megalia discreta. D) Stecidual de linfonodo pré-escapular com anisocariose, polimorfismo e mitoses anômalas. HE, obj.100x. E) Linfocitose em vaso porta-hepático, pleomoe anisocariose. HE, 40x. F) Ductos biliares, imunomarcados para

oqueratina, em meio à proliferação fibroblástica e infiltrado leucocitário porta hepático. Perceba linfócitos atípicos, obj. 100x e 20x, HE.

Anatomia Patológica/LSA/CCTA/UENF, 2008.

B

D

F

54

Leucose enzoótica bovina. A) Linfadenomegalia pré-escapular. B) formações circulares protrusas nas o com megalia discreta. D) Seção

escapular com anisocariose, polimorfismo e mitoses hepático, pleomorfismo

e anisocariose. HE, 40x. F) Ductos biliares, imunomarcados para filtrado leucocitário

porta hepático. Perceba linfócitos atípicos, obj. 100x e 20x, HE. Anatomia Patológica/LSA/CCTA/UENF, 2008.

55

Prancha 2. Leucose enzoótica bovina, HE. A) Decalque de superfície de corte de linfonodo pré-escapular, exibindo linfócitos anisocarióticos e polimórficos, obj.100x. B) Dura-máter da medula espinhal infiltrada por linfócitos neoplásicos (com atipias), obj. 20x. C/D) Vaso cerebelar com manguito de linfócitos neoplásicos (anisocarióticos, hipercromáticos e polimórficos, objetivas 40x e 100x. Setor de Morfologia e Anatomia Patológica/LSA/CCTA/UENF, 2008.

A B

C D

56

5 CONCLUSÕES

Não houve imunomarcação para o antígeno p53 nas lesões dos animais

soropositivos necropsiados.

A LEB foi capaz de produzir alterações de pequena magnitude na maioria

dos parâmetros bioquímicos séricos avaliados, incluindo a ALT ainda não estudada.

Os animais necropsiados apresentaram características típicas da leucose

enzoótica bovina nos linfonodos, fígado, cerebelo e dura-máter da medula espinhal

associados à forma leucêmica da doença.

Estudos da LEB devem ser incentivados.

Deverá ser estimulado o desenvolvimento de um programa de controle e

erradicação da Leucose Enzoótica Bovina no rebanho brasileiro.

Há necessidade de se estabelecer valores bioquímicos séricos regionais.

57

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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universidade estadual do norte fluminense darcy … · onde houver trevas, que eu leve a luz. ......

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