universidade estadual de santa cruz uesc...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO
VEGETAL – PPGPV
JUNEA LEANDRO DO NASCIMENTO
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS,
MOLECULARES E ULTRAESTRUTURAIS DE PLANTAS
JOVENS DE CACAU À TOXICIDADE POR Cr3+
e Cr6+
ILHÉUS – BAHIA 2018
JUNEA LEANDRO DO NASCIMENTO
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS,
MOLECULARES E ULTRAESTRUTURAIS DE PLANTAS
JOVENS DE CACAU À TOXICIDADE POR Cr3+
e Cr6+
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Vegetal.
Linha de Pesquisa: Cultivos em Ambiente Tropical Úmido
Orientador: Alex-Alan Furtado de Almeida
ILHÉUS – BAHIA 2018
DEDICATÓRIA
Ao meu companheiro Marison Duarte de Araújo, pela
paciência e apoio incondicional, sempre me
incentivando a seguir em frente, persistir e a perseguir
meus sonhos. E a minha pequena Alice, por me ensinar
todos os dias o sentido da vida e por torna-la cheia
amor, leveza, alegria.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, PAI, por me proporcionar o dobro de força diante de
todas as dificuldades. Sou grata a ELE por mais essa conquista em minha vida.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), em especial ao Programa de
Pós-Graduação em Produção Vegetal, pela oportunidade concedida.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de estudo.
Ao professor Alex-Alan Furtado de Almeida pela orientação, amizade,
ensinamentos, apoio, confiança, incentivo e pelo exemplo de profissionalismo.
Aos meus pais Armindo e Cleonice, pelo exemplo de caráter, pelo apoio e
amor incondicionais, incentivo, ajuda, amizade, compreensão e presença, mesmo
com toda dificuldade e distância.
Ao Joedson Pinto Barroso pela paciência, amizade, parceria e grande
colaboração na realização deste trabalho.
Aos colegas do grupo da Fisiologia Vegetal que de alguma forma me
ajudaram, apoiaram e compartilharam ensinamentos ao longo de todo o trabalho.
A todos os colegas do Centro de Biotecnologia e Genética (CBG) pelo apoio,
troca de informações e empréstimo de materiais.
Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica, Lucas Ribeiro e Larissa
Simões pela dedicação e ajuda nas análises de microscopia, fundamentais para o
meu trabalho.
E a todos aqueles que direta оu indiretamente fizeram parte dа minha
formação, о meu muito obrigado.
SUMÁRIO
RESUMO ...................................................................................................................06
ABSTRACT ...............................................................................................................08
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................10
Referências ..............................................................................................................16
2 CAPITULO I - PHYSIOLOGICAL, ULTRASTRUCTURAL, BIOCHEMICAL AND
MOLECULAR RESPONSES OF YOUNG COCOA PLANTS TO THE TOXICITY OF
Cr (III) IN SOIL...........................................................................................................21
Abstract ....................................................................................................................22
Introdução ................................................................................................................23
Material e Métodos ..................................................................................................25
Resultados................................................................................................................32
Discussão..................................................................................................................44
Conclusões ..............................................................................................................51
Referências ..............................................................................................................52
3 CAPITULO II - RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, ULTRAESTRUTURAIS,
BIOQUÍMICAS E MOLECULARES DE PLANTAS JOVENS DE CACAU À
TOXICIDADE DE Cr (VI) NO SOLO..........................................................................59
Abstract ....................................................................................................................60
Introdução ................................................................................................................61
Material e Métodos ..................................................................................................64
Resultados................................................................................................................72
Discussão .................................................................................................................84
Conclusões ..............................................................................................................92
Referências ..............................................................................................................92
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, MOLECULARES E
ULTRAESTRUTURAIS DE PLANTAS JOVENS DE CACAU À
TOXICIDADE POR Cr3+ e Cr6+
RESUMO
Theobroma cacao L. é uma planta tropical de alta importância, devido ao valor comercial de suas amêndoas, que são utilizadas na fabricação de chocolate. A presença de Cromo (Cr) em amêndoas e em subprodutos de cacau tem sido relatada. O Cr em baixas concentrações pode promover efeitos benéficos em algumas espécies de plantas, mas em alta concentração promove vários desequilíbrios fisiológicos, bioquímicos e ultraestruturais nas plantas, sendo o Cr6+ considerado carcinogênico para os seres humanos. O objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade de Cr em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 expostas a diferentes concentrações de Cr3+ (0, 100, 200, 400 e 600 mg kg-1) e Cr6+ (0, 20, 40,60 e 80 mg kg-1) no solo, através de alterações fisiológicas, ultraestruturais, antioxidantes e moleculares. No estudo com o Cr3+, observou-se que os tratamentos com 400 e 600 mg Cr3+ kg-1 solo afetaram severamente as trocas gasosas foliares, devido aos danos ultraestruturais promovidos nos cloroplastos e à maquinaria fotosintética evidenciada pela diminuição da fixação de CO2. Diminuição da expressão de genes psbA e psbO, alterações na atividade enzimática e peroxidação lípidica também afetaram as trocas gasosas foliares. Na dose de 100 mg Cr3+ kg-1
solo foi observado efeito hormesis para a atividade fotossintética. O aumento da concentração de Cr6+ no solo alterou severamente as trocas gasosas foliares em todos os tratamentos avaliados nas primeiras 24h de exposição ao metal, com menor recuperação as 96h apenas na maior dose avaliada. Os danos à maquinaria fotossintética foram evidenciados pela redução da fixação de CO2 devido a menor gs e a repressão de genes psbA e psbO nas doses mais elevadas de Cr6+ no solo. Alterações no conteúdo de pigmentos fotossintéticos no sistema antioxidante celular e danos ultraestruturais no cloroplasto foram observados. Como resposta de exclusão e tolerância ao metal, as raízes das plantas de cacau imobilizaram, em média, 75% do Cr total absorvido nos tratamentos com Cr3+ e 97% do Cr total absorvido nos tratamentos com Cr6+, evidenciando baixa mobilidade para a parte aérea. Alterações ultraestruturais no mesofilo foliar e nas raízes, devido a toxicidade do Cr3+ e Cr6+ no solo foram evidenciado. Deposição de material eletrodenso, destruição de mitocôndrios, desorganização das membranas dos tilacóides, deformação de cloroplastos e plasmólise foram observados nos dois estudos. Contudo em Cr3+ foi observado a formação de vesículas, que podem estar relacionados a autofagia promovido pelo excesso de ROS. Enquanto que em Cr6+ foi observado condensação de cromatina e deformações na dupla membrana nuclear das raízes, o que pode evidenciar a ocorrência de morte celular programada. No estudo com Cr3+, a atividade das enzimas antioxidantes SOD, APX, GPX e CAT e do aminoácido prolina coincidiu com a maior expressão do gene sod cyt demonstrando sincronicidade na eliminação das ROS. Porém, no estudo com Cr6+ foi observada inativação do sistema antioxidativo, nas primeiras 96 h de avaliação, evidenciados
pela redução da atividade das enzimas SOD, CAT e GR, além do aumento da peroxidação lipídica. Além disso, o aumento da expressão de sod cyt não foi suficiente para ativar a produção de SOD ocasionando alterações na homeostase redox nas células, no período avaliado. A repressão do gene Phyt paralela a baixa ativação de GR, em todos os tratamentos com Cr6+, pode evidenciar redução da tolerância à toxicidade de Cr6+. Por outro lado, a ativação da APX e GPX em todos os horários de avaliação, aliado ao aumento da concentração de prolina nas maiores doses de Cr6+ no solo durante e após 24 h de exposição ao metal foram os principais responsáveis pela desintoxicação de ROS nas plantas de cacau. Concluiu-se, portanto, que a tolerância das plantas de cacau à toxicidade de Cr3+ e Cr6+ é dependente da concentração dos metais no solo e do tempo de exposição aos mesmos. Doses elevadas do Cr3+ e Cr6+ no solo promoveram danos irreversíveis na maquinaria fotossintética e na ultraestrutura celular, interferindo nos sistemas enzimáticos e não enzimáticos relacionados ao estresse oxidativo e na expressão gênica. Contudo, a baixa mobilidade do metal para a parte aérea, apresenta-se como uma estratégia de tolerância a toxicicdade do Cr.
Palavras chave: Theobroma cacao; Estresse oxidativo; Expressão gênica;
Hormesis; Prolina; Autofagia.
PHYSIOLOGICAL, BIOCHEMICAL, MOLECULAR AND ULTRASTRUCTURAL RESPONSES OF YOUNG COCOA PLANTS TO
THE TOXICITY OF Cr3+ AND Cr6+
ABSTRACT
Theobroma cacao L. is a tropical crop of high importance due to the commercial value of its beans, which are used in the manufacture of chocolate. The presence of Chromium (Cr) in beans and in cocoa byproducts has been reported. Cr in low concentrations may promote beneficial effects in some plant species. But in high concentration it promotes several physiological, biochemical and ultrastructural imbalances in the plants, being Cr6+ considered carcinogenic for humans. The objective of this study was to evaluate the Cr toxicity in young plants of the CCN 51 cacao genotype exposed to different concentrations of Cr3+ (0, 100, 200, 400 and 600 mg kg-1) and Cr6+ (0, 20, 40, 60 and 80 mg kg-1) in the soil through physiological, ultrastructural, antioxidant and molecular changes. In the study with Cr3+, we can observe that the treatments with 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil severely affected foliar gas exchanges, due to the ultrastructural damages promoted in the chloroplasts and the photosynthetic machinery evidenced by the decrease of CO2 fixation. Decreased expression of psbA and psbO genes, changes in enzymatic activity and lipid peroxidation also affected leaf gas exchange. At dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil was observed hormesis effect for the photosynthetic activity. The increase in Cr6+ concentration in the soil also severely altered foliar gas exchange in all treatments evaluated in the first 24 hours of exposure to the metal, with less recovery at 96 hours only in the highest evaluated dose. Damage to the photosynthetic machinery was evidenced by reduction of CO2 fixation due to lower gs and repression of psbA and psbO genes at higher doses of Cr6+ in soil. Changes in the content of photosynthetic pigments in the cellular antioxidant system and ultrastructural damages in the chloroplast were also observed. As an exclusion and tolerance response to the metal, the roots of the cacao plants immobilized, on average, 75% of the total Cr absorbed in the treatments with Cr3+ and 97% of the total Cr absorbed in the treatments with Cr6+, showing low mobility for the aerial part. Ultrastructural changes in leaf mesophyll and roots, due to the toxicity of Cr3+ and Cr6+ in the soil was evidenced. Deposition of electrodensing material, destruction of mitochondria, disorganization of thylakoid membranes, deformation of chloroplasts and plasmolysis were observed in both studies. However in Cr3+ vesicles formation was observed, which may be related to autophagy promoted by excess ROS. While in Cr6+ chromatin condensation and deformations in the nuclear double membrane of the roots were observed, which may show the occurrence of programmed cell death. In the Cr3+ study, the activity of the antioxidant enzymes SOD, APX, GPX and CAT and the amino acid proline coincided with the greater expression of the sod cyt gene demonstrating synchronicity in the elimination of ROS. However, in the Cr6+ study, a weakening of the antioxidative system was observed in the first 96 h of evaluation, evidenced by the reduction in the activity of SOD, CAT and GR enzymes, besides the increase of lipid peroxidation. In addition, increased expression of sod cyt was not sufficient to activate the production of SOD causing changes in redox
homeostasis in the cells, during the period evaluated. Repression of Phyt expression parallel to low GR activation in all Cr6+ treatments may evidence a reduction in tolerance to Cr6+ toxicity. On the other hand, the activation of APX and GPX at all times of evaluation, together with the increase of the proline concentration in the higher doses of Cr6+ in the soil during and after 24 h of exposure to the metal were the main responsible for the detoxification of ROS in the plants of cocoa. It was concluded, therefore, that the tolerance of the cocoa plants to the toxicity of Cr3+ and Cr6+ is depends on the concentration of the metals in the soil and the time of exposure to them. High doses of Cr3+ and Cr6+ in the soil promoted irreversible damage in the photosynthetic machinery and the cellular ultrastructure, interfering in the enzymatic and non-enzymatic systems related to oxidative stress and gene expression. However, the low mobility of the metal to the shoot is presented as a strategy of tolerance to Cr toxicity.
Keywords: Theobroma cacao; Oxidative stress; Gene Expression; Hormesis;
Proline; Autophagy.
10
1. INTRODUÇÃO
Nativo das florestas úmidas da bacia Amazônica, a cultura do cacau possui
alta importância no mercado mundial, devido principalmente ao valor comercial de
suas amêndoas (ALMEIDA et al., 2014). Theobroma cacao L. é uma espécie
lenhosa perene, preferencialmente alógama, pertencente à família Malvaceae e seu
centro de diversidade estende-se por toda região da América central (MOTAMAYOR
et al., 2008; MULLER; VALLE, 2012; PURDY; SCHMIDT, 1996). O processamento
de suas amêndoas destina-se ao preparo de derivados e subprodutos do cacau
como manteiga de cacau, geleias, licores, cosméticos, chocolate, etc. (ALMEIDA;
VALLE, 2007; 2009). Devido à alta concentração de gorduras, carboidratos e
polifenóis, responsáveis pelas propriedades antioxidantes do cacau, seu consumo
moderado é indicado por promover diversos benefícios para a saúde (ARÉVALO-
GARDINI et al., 2017; BERTOLDI et al., 2016), chegando a ser considerado artigo
de luxo (BERTOLDI et al., 2016). T. cacao além de ser um dos principais
componentes econômicos nas regiões onde é cultivado, exerce também um
importante papel na preservação ambiental, pois seu cultivo é realizado sob a
sombra de árvores nativas da Mata Atlântica, sistemas agroflorestais “cabruca”, ou
sob a sombra de outras árvores de valor econômico, sendo considerada uma cultura
sustentável (ALMEIDA; VALLE, 2007; DIAS, 2001).
A propagação do cacaueiro pode ser feita de forma sexuada ou assexuada.
Contudo, a propagação sexuada (via sementes) não garante uma uniformidade
genética dos cultivos (ENRÍQUEZ, 1985). Assim, a propagação das plantas de
cacau tem se baseado nos métodos assexuais clássicos, como a estaquia e a
enxertia. A seleção de cacau clonal visa a obtenção, em massa, de variedades
melhoradas geneticamente, especialmente aquelas relacionadas com resistência,
sendo considerado um método rápido e eficaz para obtenção de plantas (MILLER;
GUILTINAN, 2003).
Após a chegada da vassoura de bruxa na região sul do estado da Bahia,
Brasil, vários clones de cacau foram liberados aos produtores, incluindo o CCN 51
(MONTEIRO; AHNERT, 2012). Nos ultimos anos o cultivo do clone de cacau
“Colección Castro Naranjal 51” (CCN-51) aumentou entre os produtores de cacau
tornando-se a variedade preferida em função de sua alta produtividade, tolerância a
variações climáticas e a patógenos e por possuir alta concentração de gordura em
11
suas amêndoas (BOZA et al., 2014; HERRMANN et. al., 2014, 2015). Resultado de
um cruzamento do híbrido IMC-67 x ICS-95 com um cultivar equatoriano conhecido
como "Canellos", o CCN51 tem sido amplamente utilizada no Equador e em muitos
programas de melhoramento e seleção de cacau em outros países (BOZA et al.,
2014).
Estudos recentes detectaram a presença de traços de vários metais pesados,
incluindo o cromo (Cr) em amêndoas de T. cacao (ARÉVALO-GARDINI et al., 2017;
BERTOLDI et al., 2016; YANUS et al., 2014) e em seus subprodutos, como a
manteiga de cacau, o cacau em pó e o chocolate (BERTOLDI et al., 2016; YANUS et
al., 2014). No produto final, uma correlação linear positiva entre as concentrações de
chumbo (Pb) e Cr nas amêndoas com seus teores nos subprodutos de cacau foi
relatada (YANUS et al., 2014). A presença de metais pesados em amêndoas de
cacau representa uma ameaça para os consumidores podendo promover efeitos
deletérios a saúde (YANUS et al., 2014), bem como aos produtores de cacau, uma
vez que altos teores de metais podem interferir na qualidade do produto final,
afetando sua exportação (ARÉVALO-GARDINI et al., 2017).
O Cr é considerado o segundo metal, mais abundante, presente em água
subterrânea, em sedimentos e no solo agrícola (SINGH et. al., 2013). Na solução do
solo, o Cr torna-se disponível às plantas por intemperização da rocha de origem
(GOMES et al., 2017). Mas o aumento de sua concentração e disponibilidade ocorre
por ações antropogênicas, como a produção de ligas metálicas, papel e celulose,
couro, galvanoplastia, pigmentos e na geração de energia (HASAN et al., 2017).
Além disso, o aumento na utilização de fertilizantes químicos e o aproveitamento de
lodos de esgoto como alternativa de adubação (HAYAT et al., 2012; SRIVASTAVA
et al., 2017) colaboram na deposição de Cr em solos agrícolas. O teor de Cr
encontrado nos solos em todo o mundo varia de 10 a 100 mg kg-1, dependendo da
rocha de origem (SHAHID et al., 2017). No Brasil, o Conselho Nacional do Meio
Ambiente (CONAMA) no Anexo II da Resolução nº 420, define que o limite máximo
de prevenção e de investigação desse metal no solo, é de 75 e 150 mg Cr kg-1 de
solo seco, respectivamente.
Naturalmente, as formas mais comuns e estáveis de Cr encontrados nos
solos são Cr3+ (trivalente) e Cr6+ (hexavalente) (MARTÍNEZ-TRUJILLO; CARREÓN-
ABUD, 2015). No entanto, existem outros estados de valência, considerados
instáveis (KUMAR et al, 2014; SHANKER et al., 2005;). As formas Cr3+ e Cr6+
12
diferem entre si quanto a biodisponibilidade, mobilidade no solo, toxicidade às
plantas e capacidade de oxidação (ASHRAF et al., 2017; PANDA; CHOUDHURY,
2005). O Cr3+ é a forma predominante, e por ser menos solúvel em água, apresenta-
se mais estável, menos tóxico e com baixa mobilidade no solo, devido sua
precipitação com óxidos e hidróxidos em pH superior a 5,0 (RAI, et al., 1989).
Apesar de não ter sido relatado na literatura, mecanismos específicos de absorção
pelas plantas (OLIVEIRA, 2012), infere-se que o Cr3+ é absorvido passivamente por
troca de cátions ou osmose (SHANKER et al., 2005). Por outro lado, o Cr6+,
apresenta-se como a forma mais tóxica, devido à sua alta solubilidade em água e
maior potencial de oxidação. O Cr6+ é ativamente absorvido pelas plantas,
juntamente com íons essenciais, sendo inferido que os carreadores de sulfato ou
ferro participam desta incorporação (SINGH et al., 2013). No solo, a incapacidade de
retenção do Cr6+ por seus constituintes, se dá em função da carga negativa de suas
superfícies, mantendo o Cr6+ altamente móvel (DHAL et al., 2013).
Sabe-se que Cr pode ser absorvido pelas plantas tanto como Cr3+ quanto Cr6+
(OLIVEIRA, 2012; SINGH et al., 2013). Além disso, tem sido relatado que o Cr6+
após absorvido pelas raízes é prontamente reduzido, para a forma menos tóxica
Cr3+, no citoplasma e vacúolos, sendo esta reação catalisada pela enzima redutase
do Fe (III) (ZAYED et al., 1998). Santana et al., (2012) relataram que independente
do íon utilizado como tratamento (Cr3+ ou Cr6+) apenas Cr3+ foi detectado em
diferentes órgãos de plântulas de Genipa americana. Tal mecanismo pode ser
considerado uma medida protetiva desenvolvida pelas plantas, visando sua
desintoxicação (SHANKER et al., 2005).
Não existem evidências de que o Cr3+ e o Cr6+ desempenhe alguma função
essencial no metabolismo das plantas ou participe de alguma rota metabólica
(OLIVEIRA, 2012). Apesar de haver vários estudos associando o Cr3+ ao
metabolismo de lípideos e açucares, como um oligoelemento essencial para a saúde
humana e animal, recentemente sua essencialidade passou a ser questionada
(VICENT, 2013, 2017). Este autor relata que, para saúde húmana, o Cr3+ só pode
ser considerado como um elemento farmacologicamente ativo, ou seja, que propõe
efeitos benéficos e não um elemento essencial. Por outro lado, os oxiânions de Cr6+
são considerados carcinogênicos para humanos e contaminantes prioritários do
ecossistema (PRADO et al., 2016).
13
A contaminação por Cr e sua biodisponibilidade para as plantas é afetada por
fatores como a concentração e a especiação química do metal no solo, a
composição, a textura e o pH do solo, a espécie e o genótipo vegetal (SRIVASTAVA
et al., 2017). Em algumas espécies de plantas baixas concentrações Cr têm sido
relatadas por conferir efeitos benéficos (PAIVA et al., 2009; PATNAIK et al., 2013;
PRASAD et al., 2010; UDDIN et al., 2015). Por outro lado, em concentrações
elevadas o Cr pode se acumular nos tecidos vegetais, preferencialmente nas raízes
(SHANKER et al., 2005), promovendo efeitos tóxicos. Essa variação pode estar
relacionada a um processo bifásico de dose-resposta chamado hormesis (SHAHID,
et al., 2017). A hormesis preconiza que uma substância contaminante aplicada em
baixa dose pode exercer ação benéfica ou estimulatória, enquanto que, aplicado em
doses elevadas exercerá ação deletéria e inibitória (CALABRESE, 2015;
CALABRESE; BLAIN, 2009; POSCHENRIEDER et. al., 2013), sendo que a menor
dose pode ser considerada uma reação adaptativa da espécie (CALABRESE;
MATTSON, 2011).
Altas concentrações de Cr nos tecidos vegetais exerce uma ampla gama de
efeitos tóxicos no crescimento e metabolismo das plantas (HAYAT et. al., 2012;
SINGH et al., 2013). Sua acumulação interfere nos processos fisiológicos e
bioquímicos, promovendo alterações ultraestruturais. Consequentemente danos às
membranas celulares, alteração dos cloroplastos, reduções da atividade
fotossintética, do crescimento e da biomassa, degradação de pigmentos
cloroplastídicos e desequilibrio nutricional são observados, podendo levar a planta a
morte (AFSHAN et al., 2015; DING et al., 2016; MANGABEIRA et al., 2011,
SANTANA et al., 2012; SCOCCIANTI et al., 2016). Também, elevadas
concentrações de Cr podem induzir estresse oxidativo, em função da formação
excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROS) (SHAHID et al., 2017). Além
disso, o Cr6+ tem alto potencial redox atuando como oxidante, e sua redução
intracelular para a forma menos tóxica Cr3+ (SANTANA et al., 2012) promove a
produção EROS (BASHRI et al., 2016; SINGH et al., 2013). Aumento de EROS
promove a redução da homeostase celular, peroxidação lipídica (SHAHID et al.,
2017) e em alguns casos autofagia (FARAH et al., 2016). Por outro lado, EROS atua
como sinalizadores biológicos na regulação de estresses (HOSSAIN et al., 2012)
desencadeando a expressão de vários genes que codificam proteínas envolvidas na
14
sua produção, percepção e eliminação nas células (MITTLER, 2017; VAAHTERA et
al., 2014).
A autofagia consiste de um mecanismo sofisticado de adaptação,
desenvolvido pelas plantas, visando à reciclagem de constituintes intracelulares
danificados e, ou materiais celulares indesejados (LI; VIERSTRA, 2012; LIU;
BASSHAM, 2012). Na autofagia, os autofagossomos (organelas especializadas)
sequestram componentes citoplasmáticos incluindo metais pesados, formando
vesículas, que se fundem ao vacúolo (HASAN et al., 2017). Porém, se induzido em
grande quantidade pode atuar como iniciador ou executor de morte celular
programada (MININA et al., 2014).
O EROS, tais como radicais superóxido (O2-•), peróxido de hidrogênio (H2O2),
radicais hidroxílicos (OH•) e oxigênio singleto (1O2), formam-se naturalmente, em
pequenas quantidades, nos cloroplastos, mitocôndrios e peroxissomos, como
subprodutos do metabolismo aeróbio (CHOUDHURY et al., 2013; TAIZ et al., 2017).
Para se protegerem do estresse oxidativo, diante de uma superprodução de EROS,
as plantas desenvolveram um sistema antioxidante complexo, como um mecanismo
de eliminação e desintoxicação de EROS, visando manter a homeostase celular.
Superóxido dismutase (SOD, CE 1.15.1.1), peroxidase do ascorbato (APX, EC
1.11.1.11) peroxidase do guaicol (GPX, EC 1.11.1.7), catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e
redutase da glutationa (GR, EC 1.8.1.7), são as principais enzimas antioxidativas
exploradas em plantas sob estresse (GOMES et al., 2017; SHAHID et al.,2017). Por
outro lado, a ativação da síntese e acumulação de aminoácidos livres como a
prolina, tem sido relatada como um agente antioxidante não enzimático, frente ao
estresse por Cr6+ (PRADO et al., 2012). A prolina possui múltiplas funções, tais
como regulador da pressão osmótica, redutor de radicais livres, estabilizador de
enzimas, de membranas e de estruturas protéicas. Além disso, a prolina mantém o
pH citosólico ajudando a equilibrar o estado de reações redox da célula (ASLAN et
al., 2017).
Outro mecanismo importante, de desintoxicação e tolerância desenvolvido
pelas plantas, frente ao estresse por Cr e outros metais pesados é a quelação do
metal, a peptídeos como as fitoquelatinas (phyt) (DIWAN et al., 2010; SRIVASTAVA
et al., 2017) e metalotioneínas (Mt2b) (HASAN et al., 2017; SRIVASTAVA et al.,
2017). A biossíntese de ambos peptídeos é estimulada em função da concentração
de metal livre nas células, contudo a síntese de fitoquelatina ocorre mais
15
rapidamente em resposta ao estresse. As fitoquelatinas são sintetizadas no citosol
pela enzima fitoquelatina sintase (phyt) utilizando como substrato a glutationa
reduzida (GSH) (HASAN et al., 2017; TAIZ et al., 2017; YADAV, 2010). As
metalotioneínas, assim como as fitoquelatinas, são uma família de proteínas de
baixo peso molecular, ricas em cisteína, que apresentam uma forte correlação entre
sua expressão e a concentração de metais no ambiente, devido à alta afinidade por
íons metálicos. As metalotioneínas são produtos da tradução de mRNA e são
expressas em resposta a diferentes tipos de estresses abióticos (GOMES et al.,
2017; HASAN et al., 2017; SHAHID et al.,2017). Tanto as fitoquelatinas quanto as
metalotioneínas atuam no sequestro do Cr, inativando o metal no citoplasma e
transportando os complexos proteínas-Cr para os vacúolos, onde são
compartimentados (GOMES et al., 2017; HASAN et al., 2017; SHAHID et al.,2017).
Dessa forma, protejem as plantas proporcionando resistência ao efeito deletério dos
metais pesados, restringindo sua acumulação na parte aérea das mesmas (YADAV,
2010).
Este estudo teve como objetivos principais: (i), avaliar os efeitos do Cr3+ e Cr6+
sobre as trocas gasosas, e concentração de pigmentos cloroplastídicos em nível
foliar; (ii) determinar o teor de Cr total nos diferentes tecidos vegetais; (iii) avaliar a
ultraestrutura celular em folhas e raízes utilizando microscopia eletrônica de
transmissão (TEM); (iv) avaliar os produtos resultantes da peroxidação lipídica em
nível foliar; (v) determinar a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo
antioxidativo; (vi) determinar a concentração de prolina, osmólito não enzimáticos
relacionados ao metabolismo antioxidativo; (vii) analisar os padrões de expressão
de genes envolvidos na biossíntese de enzimas antioxidativas (Sod cyt e Sod chl),
das proteínas do fotossistema 2 (psbA e psbO), do polipeptídeo metalotioneína
(Mt2b) e da sintase da fitoquelatina (phyt).
16
REFERÊNCIAS
AFSHAN S. et al. Citric acid enhances the phytoextraction of chromium, plant growth, and photosynthesis by alleviating the oxidative damages in Brassica napus L. Environ Sci Pollut Res Int., v. 22, p. 11679-89. 2015.
ALMEIDA A.-A.F.; VALLE R.R. Ecophysiology of the cacao tree. Braz. J. Plant Physiol. v. 19, p. 425–448. 2007.
ALMEIDA A.-A.F.; VALLE R.R. Cacao: ecophysiology of growth and production. In: DaMatta F.M. (Ed.), Ecophysiology of Tropical Tree Crops. Nova Science Publishers Inc., Hauppauge, Andersen, p. 37–70. 2009.
ALMEIDA A.-A.F. et al. Leaf gasexchange in species of the Theobroma genus. Photosynthetica. v. 52, p. 16–21. 2014.
ARÉVALO-GARDINI E. et al. Heavy metal accumulation in leaves and beans of cacao (Theobroma cacao L.) in major cacao growing regions in Peru. Science of The Total Environment. v. 605, p. 792-800. 2017.
ASHRAF A., et al. Chromium(VI) sorption efficiency of acid-activated banana peel over organo-montmorillonite in aqueous solutions. Int J Phytoremediation. v. 19, p. 605-613. 2017.
ASLAM M., et al. Specific role of proline against heavy metals toxicity in plants. Int. J. Pure App. Biosci. v. 5, p. 27-34. 2017.
BASHRI G. et al. Physiological and biochemical characterization of two Amaranthus species under Cr (VI) stress differing in Cr (VI) tolerance. Plant Physiol Biochem. v. 108, p. 12-23. 2016.
BERTOLDI, D. et al. Multielemental fingerprinting and geographic traceability of Theobroma cacao beans and cocoa products. Food Control. v. 65, p. 46–53. 2016.
BOZA E.J. et al. Genetic characterization of the cacao cultivar CCN 51: its impact and significance on global cacao improvement an production. J. Amer. Soc. Hort. Sci. v. 139, p. 219-229. 2014.
CALABRESE, E.J. Hormesis within a mechanistic context. Homeopathy. v. 104, p. 90-96. 2015.
CALABRESE, E.J.; BLAIN, R.B. Hormesis and plant biology. Environ. Pollut. v. 157, p. 42-48. 2009.
CALABRESE E.J.; MATTSON M.P. Hormesis provides a generalized quantitative estimate of biological plasticity. J. Cell Commun. Signal. v. 5, p. 25-38. 2011.
CHOUDHURY S. et al. Reactive oxygen species signaling in plants under abiotic stress, Plant Signal Behav. v. 8, p. 23681. 2013.
17
CONSELHO NACIONAL DE MEIO AMBIENTE (CONAMA). Resolução CONAMA nº 420 de 28 de Dezembro de 2009. Disponível em http://www.mma.gov.br/port/conama. Acesso em 06/2017.
DHAL B. et al. Chemical and microbial remediation of hexavalent chromium from contaminated soil and mining/metallurgical solid waste: A review. J. hazard. Mater. v. 250–251. p. 272–291. 2013.
DIAS, L. A. S. Melhoramento Genético do Cacaueiro. 1 ed. Viçosa: Editora Folha de Viçosa Ltda., 2001 p. 578
DING H. et al. Physiological responses and tolerance of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) exposed to chromium. Ecotoxicol Environ Saf. v. 133, p. 509-518. 2016.
DIWAN H. et al. Induction of phytochelatins and antioxidant defence system in Brassica juncea and Vigna radiata in response to chromium treatments. Plant Growth Regul v. 61, p. 97. 2010.
ENRIQUEZ, G. A. Curso sobre el cultivo del cacao. Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza, Turrialba, Costa Rica. 1985.
FARAH M.A. et al. Silver nanoparticles synthesized from Adenium obesum leaf extract induced DNA damage, apoptosis and autophagy via generation of reactive oxygen species. Colloids Surf. B. Biointerfaces. v. 141, p. 158–169. 2016.
GOMES M.A.C. et al. Plant chromium uptake and transport, physiological effects and recente advances in molecular investigations. Ecotoxicol Environ Saf. v. 140, p. 55-64. 2017.
HASAN M.K. et al. Responses of Plant Proteins to Heavy Metal Stress—A Review. Front. Plant Sci. v. 8, p. 1492. 2017.
HAYAT S. et al. Physiological changes induced by chromium stress in plants: an overview. Protoplasma. v. 249, p. 599–611. 2012.
HERRMANN L. et al. DNA-based differentiation of the Ecuadorian cocoa types CCN-51 and Arriba based on sequence differences in the chloroplast genome. J. Agric. Food Chem. v. 63, p. 4539-4544. 2014.
HERRMANN L. et al. Food Profiling: Characterization of the Ecuadorean Type CCN-51 of Theobroma cacao L. using microsatellite markers. J. Agric. Food Chem. v. 63, p. 4539-44. 2015.
HOSSAIN M.A. et al. Molecular mechanism of heavy metal toxicity and tolerance in plants: central role of glutathione in detoxification of reactive oxygen species and methylglyoxal and in heavy metal chelation. J. Bot.v. 1 p. 37. 2012.
KUMAR, K. S. et al. Algal photosynthetic responses to toxic metals and herbicides assessed by chlorophyll a fluorescence. Ecotoxicology and Environmental Safety. v. 104, p. 51–71, 2014.
18
LI F.; VIERSTRA R.D. Autophagy: a multifaceted intracelular system for bulk and selective recycling. Trends Plant Sci. v.17, p. 526–537. 2012.
LIU Y.; BASSHAM D.C. Autophagy: pathways for self-eating in plant cells. Annu Rev Plant Biol. v. 63, p. 215–237. 2012.
MANGABEIRA P.A. et al., Compartmentalization and ultrastructural alterations induced by chromium in aquatic macrophytes. Biomet. Int. J. Role Met. Ions Biol. Biochem. Med. v. 24, p. 1017-1026. 2011.
MARTÍNEZ-TRUJILLO M.; CARREÓN-ABUD Y. Effect of mineral nutrients on the uptake of Cr (VI) by maize plants. New Biotechnology. v. 32, p. 396-402. 2015.
MILLER, C. R.; GUILTINAN, M. J. Perspectives on rapid vegetative multiplication for orthotropic Scion and rootstock varieties of cocoa. In: International workshop on cocoa breeding form improved production systems. Accra, p.189-194. 2003.
MININA E.A.; BOZHKOV P.V.; HOFIUS D. Autophagy as initiator or executioner of cell death. Trends Plant Sci. v. 19, p. 692-697. 2014.
MITTLER R. ROS Are Good. Trends Plant Sci. v. 22, p. 11-19. 2017.
MONTEIRO, W. R.; AHNERT, D. Melhoramento genético do cacaueiro. In: VALLE, R. R. (Ed). Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro. 2ª Ed. Brasília, DF, p. 1-29. 2012.
MOTAMAYOR, J. C. et al. Geographic and Genetic Population Differentiation of the Amazonian Chocolate Tree (Theobroma cacao L.). PLoS ONE, v. 3, n. 10, p. 3311. 2008.
MULLER, M. W.; VALLE, R. R. M. Ecofisiologia do cacaueiro. In R. R. M. Valle (Ed.), Ciência, tecnologia e manejo do cacaueiro, 2ª Ed., pp. 31-66. Ilhéus, 2012.
OLIVEIRA H. Chromium as an environmental pollutant: insights on induced plant toxicity. J. Bot. Article. v. 2012, 8p. ID 375843. 2012.
PAIVA L.B. et al. Ecophysiological responses of water hyacinth exposed to Cr3+ and Cr6+. Environ Exp Bot. v. 65, p. 403–409. 2009.
PANDA S.K.; CHOUDHURY S. Changes in nitrate reductase activity and oxidative stress response in the moss polytrichum commune subjected to chromium, copper and zinc phytotoxicity. Braz. J. Plant Physiol. v. 17, p. 191-197. 2005.
PATNAIK A.R.; ACHARY V.M.M.; PANDA B.B. Chromium (VI)-induced hormesis and genotoxicity are mediated through oxidative stress in root cells of Allium cepa L. Plant Growth Regul. v. 71, p. 157-170. 2013.
19
POSCHENRIEDER C. et al. Do toxic ions induce hormesis in plants? Plant Sci. v. 212, p. 15-25. 2013.
PRADO C. et al. Detoxification of Cr (VI) in Salvinia minima is related to seasonal-induced changes of thiols, phenolics and antioxidative enzymes. J Hazard Mater. v. 239–240, p. 355–361. 2012.
PRADO C. et al. Differential physiological responses of two Salvinia species to hexavalent chromium at a glance. Aquat. Toxicol. v. 175, p. 213–221. 2016.
PRASAD A. et al. Effect of chromium and lead on yield, chemical composition of essential oil, and accumulation of heavy metals of mint species. Commun. Soil Sci. Plant Anal. v. 41, p. 2170-2186. 2010.
PURDY, L. H.; SCHMIDT, R. A. Status Of Cacao Witches' Broom: Biology, Epidemiology, and Management. Annual Review Phytopathology. v. 34, p. 573–594, 1996.
RAI, D.; EARY, L.; ZACHARA, E. Environmental chemistry of chromium. Sci. Total Environ., v.86, p. 15-23,1989.
SANTANA K.B. et al. Physiological analyses of Genipa americana L. reveals a tree with ability as phytostabilizer and rhizofilterer of chromium ions for phytoremediation of polluted watersheds. Environ Exp Bot v. 80, p. 35–42. 2012.
SCOCCIANTI V. et al. Oxidative stress and antioxidant responses to increasing concentrations of trivalent chromium in the Andean crop species Chenopodium quinoa Willd. Ecotoxicol. Environ. Saf. v. 133, p. 25-35. 2016.
SHAHID M. et al. Chromium speciation, bioavailability, uptake, toxicity and detoxification in soil-plant system: A review. Chemosphere. v. 178, p. 513-533. 2017.
SHANKER A.K. et al. Chromium toxicity in plants. Environ. Int. v. 31, 739-753. 2005.
SINGH H.P. et al. Chromium toxicity and tolerance in plants. Environ. Chem. Lett. v. 11, p. 229–254. 2013.
SRIVASTAVA V. et al. Agroecological Responses of Heavy Metal Pollution with Special Emphasis on Soil Health and Plant Performances. Front. Environ. Sci. v. 5, p. 64. 2017.
TAIZ L. et al., Fisiologia e desenvolvimento, 6. ed. – Porto Alegre : Artmed, 2017.
UdDIN I., BANO A., MASOOD S. Chromium toxicity tolerance of Solanum nigrum L. and Parthenium hysterophorus L. plants with reference to ion pattern, antioxidation activity and root exudation. Ecotoxicol. Environ. Saf. v. 113, 271-278. 2015.
VAAHTERA L. et al. Specificity in ROS signaling and transcript signatures. Antioxid. Redox Signal. v. 21, 1422–1441. 2014.
20
VICENT J.B. Chromium: is it essential, pharmacologically relevant, or toxic? Met Ions Life Sci. v. 13, 171-98. 2013.
VICENT J.B. New Evidence against Chromium as an Essential Trace Element. J Nutr. v. 147, 2212-2219. 2017.
YADAV S.K. et al. Differential antioxidative enzyme responses of Jatropha curcas L. to chromium Stress. J. hazard. Mater. v. 180, 609–615. 2010.
YANUS R.L. et al. Trace elements in cocoa solids and chocolate: an ICPMS study. Talanta. v. 119, 151-154. 2014.
ZAYED, A. et al. Chromium accumulation, translocation and chemical speciation in vegetable crops. Planta v. 206, 293–299. 1998.
21
2. CAPÍTULO I
(Artigo submetido ao periódico “Ecotoxicology and Environmental Safety”)
PHYSIOLOGICAL, ULTRASTRUCTURAL, BIOCHEMICAL AND MOLECULAR RESPONSES OF YOUNG COCOA PLANTS TO THE TOXICITY OF Cr (III) IN SOIL.
Junea Leandro do Nascimentoa; Alex-Alan Furtado de Almeidaa,*; Joedson P. Barrosoa; Pedro A.O. Mangabeiraa; Dário Ahnerta; Artur G.R. Souzaa; José Vitor S. Silvaa; Virupax C. Baligarb
a State University of Santa Cruz, Department of Biological Sciences, Rodovia Jorge Amado, km 16, 45662-900, Ilhéus, BA, Brazil b USDA-ARS-Beltsville Agricultural Research Center, Beltsville, MD, USA *Corresponding author. E-mail addresses: [email protected] (A.-A. Furtado de Almeida).
22
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate Cr toxicity in young plants of the CCN 51
Theobroma cacao genotype at different concentrations of Cr3+ in the soil (0, 100,
200, 400 and 600 mg kg-1) through physiological, ultrastructural, antioxidant and
moleculer changes. Doses of 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil severely affected foliar
gas exchange, promoted by damages in photosynthetic machinery evidenced by the
decrease in CO2 fixation. Decreased expression of psbA and psbO genes, changes
in enzymatic activity and lipid peroxidation also affected leaf gas exchange. A
hormesis effect was observed at 100 mg Cr3+ kg-1 soil for the photosynthetic activity.
As a metal exclusion response, the roots of the cocoa plants immobilized, on
average, 75% of the total Cr absorbed. Ultrastructural changes in leaf mesophyll and
roots, with destruction of mitochondria, plasmolysis and formation of vesicles, were
related to the oxidative stress promoted by excess ROS. The activity of the
antioxidant enzymes SOD, APX, GPX and CAT and the amino acid proline coincided
with the greater expression of the sod cyt gene demonstrating synchronicity in the
elimination of ROS. It was concluded, therefore, that the tolerance of the cocoa
plants to the toxicity of Cr3+ depends on the concentration and time of exposure to
the metal. Higher doses of Cr3+ in the soil promoted irreversible damage to the
photosynthetic machinery and the cellular ultrastructure, interfering in the enzymatic
and non-enzymatic systems related to oxidative stress and gene expression.
However, the low mobility of the metal to the leaf is presented as a strategy of
tolerance to Cr3+.
Keywords: Theobroma cacao; Oxidative stress; Gene Expression; Hormesis; Proline; Autophagy.
23
1. INTRODUCTION
Theobroma cacao L. is a tropical crop of high importance, mainly due to the
commercial value of its beans. The beans are ground for the preparation of products
such as cocoa butter, jellies, liqueurs, cosmetics, chocolate, etc. (Almeida et al.,
2014; Almeida and Valle, 2009). Due to the high concentration of fats, carbohydrates,
polyphenols and antioxidants, in addition to benefits provided to human health, cocoa
by-products are much appreciated and even are considered as a luxury items
(Bertoldi et al., 2016). The CCN 51 (Colección Castro Naranjal) cultivar has become
the preferred one among the producers due to its high productivity, tolerance to
climatic variations and pathogens (Boza et al., 2014; Herrmann et. al., 2015). Recent
studies have reported the presence of traces of various heavy metals, including
chromium (Cr) in beans and cocoa by-products such as chocolate (Arévalo-Gardini et
al., 2017; Bertoldi et al., 2016; Yanus et al., 2014), with a positive linear correlation
between Cr concentration in the beans and by-products (Yanus et al., 2014).
The most common and stable forms of Cr on the Earth's surface are Cr3+
(trivalent) and Cr6+ (hexavalent), which differ from each other in terms of soil mobility,
bioavailability and toxicity to plants (Ashraf et al., 2017; Panda and Choudhury ,
2005). In the soil solution, Cr is made available to plants by weathering the original
rock and is around 10 e100 mg kg-1 soil (Kabata-Pendias, 2011). However, the
increase of its concentration in soil and availability also occurs by anthropogenic
actions, such as the production of metallic alloys, leather, electroplating and
pigments (Gomes et al., 2017; Hasan et al., 2017), as well as chemical fertilizers and
sewage sludge (Hayat et al., 2012; Srivastava et al., 2017).
There are no reports that Cr3+ has any essential function in plant metabolism or
on its specific mechanisms of absorption (Oliveira, 2012). Recently its essentiality in
human and animal health has been questioned (Vicent, 2017). However, at low
concentrations beneficial effects have been reported in some plant species such as
Allium cepa, Mentha citrata and Solanum nigrum (Patnaik et al., 2013; Prasad et al.,
2010; UdDin et al., 2015). At high soil concentrations, Cr can accumulate in plant
tissues, preferably in the roots (Shanker et al., 2005), promoting toxic effects and
thus establishing a bi-phasic dose-response process called hormesis. According to
hormesis concepts a contaminating substance applied at low doses may exert a
beneficial or stimulatory action, whereas, applied at high doses, it will exert a
24
deleterious and inhibitory action (Calabrese and Blain, 2009; Calabrese, 2015;
Poschenrieder et al. 2013).
High dosages of Cr3+ in plant tissues may promote molecular, biochemical and
ultrastructural changes. As a result of the damage to cell membranes, alteration of
chloroplasts, reductions in photosynthetic activity, degradation of chloroplastidic
pigments and induction oxidative stress with excessive formation of reactive oxygen
species (ROS) are observed, which can lead to senescence (Afshan et al., 2015;
Scoccianti et al., 2016). Overproduction of ROS may result in imbalance in cellular
homeostasis, inducing the formation of antioxidative enzymes, preferably at their
sites of production (Hossain et al., 2012), as a mechanism of ROS elimination and
cellular detoxification (Gomes et al. 2017). In addition, may promote lipid peroxidation
(Shahid et al., 2017) and in some cases autophagy (Farah et al., 2016). In
autophagy, autophagosomes (specialized organelles) sequester cytoplasmic
components including metals, forming vesicles, which fuse with the vacuole (Hasan
et al., 2017). However, if induced in large quantities autophagosomes can act as
initiator or executor of programmed cell death (Minina et al., 2014). In addition to
enzymes, increases in the synthesis and accumulation of non-enzymatic osmolytes,
such as proline, have also been reported in the elimination of ROS induced by heavy
metals (Tripathi et al., 2013) and also by Cr3+ (Anjum et al., 2017; Tang et al., 2012).
Proline has multiple functions, such as free radical scavenger, enzyme, membrane
and protein structure stabilizer and helps to maintain the cytosolic pH and the
equilibrium of the redox reactions of the cells (Aslam et al., 2017).
Another important mechanism of detoxification and tolerance of plants against Cr
and other heavy metals stress is chelation of the metal, with peptides such as
phytochelatins (phyt) and metallothioneins (Mt2b) (Hasan et al., 2017; Srivastava et
al., 2017). The biosynthesis of both peptides is stimulated as a function of the free
metal concentration in the cells, however phytochelatin synthesis occurs more rapidly
in response to stress. Both acts in the Cr sequester, inactivating the metal in the
cytoplasm and transporting the Cr-protein complexes to the vacuoles, where they are
compartmentalized, making them incapable of damaging the plants (Gomes et al.,
2017; Hasan et al., 2017). Phytochelatins are synthesized by the enzyme
phytochelatin synthase using reduced glutathione (GSH) as a substrate (Taiz et al.,
2017). Metallothioneins are low-molecular-weight, cysteine-rich proteins, which give
them high affinity for metal ions (Hasan et al., 2017; Shahid et al., 2017).
25
The purpose of this work was to describe the main defense mechanisms to stress
of Cr3+ in clonal CCN 51 plants grown in soil as substrate. Contribute to elucidate the
intoxication process, aiming to reduce health risks due to the accumulation of Cr in
the plants of T. cacao and consequent contamination of the food chain by this metal.
We examined (i) the physiological changes in plants after exposure to different Cr
concentrations, (ii) explored Cr uptake and translocation, (iii) changes in cell
ultrastructure in leaves and roots, (iv) the role of cellular antioxidant activities
(enzymatic and non-enzymatic) in protecting the plants from Cr-toxicity, (v) the
expression of genes associated with the biosynthesis of proteins involved in
antioxidative metabolism and in metal chelation. The results may be used in future
programs of genetic enhancement.
2. MATERIAL AND METHODS
The experiment was conducted in a greenhouse at the State University of Santa
Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brazil (14 ° 47 'S, 39 ° 13' W) in the period from 24 July
2015 to 14 January 2016. Clonal plants of the CCN 51 cacao cultivar were grown on
sandy soil as substrate in pots with a capacity of 15 L. The soil was previously liming
(pH 5.6) and the plants were fertilizer during planting and biweekly coverage after
planting. Treatments without addition of Cr3+ (control) and with addition of Cr3+ were
applied in the form of chromium chloride hexahydrate (CrCl3∙6H2O), in the
concentrations of 100, 200, 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil, (Han et al., 2004; Tang et
al., 2012). The plants were obtained by rooting stem cuttings of plagiotropic
branches. The stem cuttings were collected from plants with 5 to 10 years of age, at
the Biofábrica de Cacau Institute (IBC, Banco do Pedro, Ilhéus, BA). The treatments
with concentrations of Cr3+ (100, 200, 400 and 600 mg kg-1 soil) were applied in
solution (100 mL per pot) on 14/12/2015 in one-year-old T. cacao plants. During the
acclimation period [24/07/2015 to 13/12/2015] and during the period of exposure to
treatments with Cr3+ [14/12/2015 to 13/01/2016], the plants were irrigated with
rainwater, aiming to keep the soil close to field capacity. During the experimental
period, photosynthetically active radiation (PAR) was recorded using Hobo S-LIA-
M003 light radiation sensors coupled to the Hobo Micro Station Data Logger (Onset
Computer, Bourne, MA, USA). Air temperature (T °C) and relative humidity (RH %)
were recorded by means of Hobo H8 Pro sensors (Onset, Computer, Bourne, MA,
26
USA) for characterization of cropping environments (Figure S1). Soil characterization
and recommended fertilization were described in Table S1.
Fig. S1. Microclimatic conditions inside the greenhouse. (A) Daily values of photosynthetically active radiation (PAR); (B) air temperature (T) in degrees Celsius and relative humidity (RH).
27
Table S1. Physical and chemical characteristics of the soil used for growing young T. cacao plants. Fertilized at planting and as a top dressing. P, Na, K, Fe, Zn, Mn and Cu (extracted by Mehlich 1), Ca, Mg and Al (extracted by KCl, 1 M), H + Al (extracted by 0.5 M calcium acetate, pH 7.0), B (extracted by hot water) and S (extracted by monocalcium phosphate in acetic acid). SB, sum of bases; t, effective cation exchange capacity; T, cation exchange capacity (pH 7.0); V, base saturation; m, saturation by Al; OM, organic matter = Org C. × 1724; P-rem: remaining phosphorus.
Physical and chemical characteristics soil
pH --- 5.1 K [mg (dm
3)-1
] 29.0 P [mg (dm
3)-1
] 10.4
Na [mg (dm3)-1
] --- Zn [mg (dm
3)-1
] 2.2 Fe [mg (dm
3)-1
] 165.0 Mn [mg (dm
3)-1
] 23.7 Cu [mg (dm
3)-1
] 1.1 B [mg (dm
3)-1
] 0.2 S [mg (dm
3)-1
] 10.9 Ca [cmolc (dm
3)-1
] 1.1 Mg [cmolc (dm
3)-1
] 0.4 Al [cmolc (dm
3)-1
] 0.5 H + Al [cmolc (dm
3)-1
] 3.3 SB [cmolc (dm
3)-1
] 1.5 T [cmolc (dm
3)-1
] 2.0 T [cmolc (dm
3)-1
] 4.8 O.M. (dag kg
-1) 0.5
V (%) 31.5 M (%) 24.8 P-Rem (mg L
-1) 41.0
Sandy --- texture Soil classification --- Type 1 soil Clay (g kg
-1) 79.0
Silt (g kg-1
) 91.0 Coarse sand (g kg
-1) 322.0
Fine sand (g kg-1
) 509.0
Liming (Ca:Mg = 2:1)
CaCO3 (g vaso-1
) 7.4 MgCO3 (g vaso
-1) 3.1
Planting fertilizer
P and N - MAP purified (g vaso-1
) 11.5 K – KCl (mg vaso
-1) 1430.0
B - H3BO3 (mg vaso-1
) 51.5 Cu - CuSO4.5H2O (mg vaso
-1) 88.4
Zn - ZnSO4.7H2O (mg vaso-1
) 263.9 Mo - (NH4)6Mo7O24.4H2O (mg vaso
-1) 4.1
Cover fertilizer
K – KCl (mg vaso-1
) 146.5 S - K2SO4 (mg vaso
-1) 163.1
N – Urea (mg vaso-1
) 667.0
28
2.2. Leaf gas exchanges
During the experimental period, the net photosynthetic rate per unit leaf area (PN),
stomatal conductance to water vapor (gs) and leaf transpiration (E) were monitored
at 1, 4, 8, 15, 21 and 28 days after application of the treatments (AAT) in a
completely expanded and mature leaf. Four plants were evaluated per treatment,
between 7 and 11 h, using a portable LI-6400 photosynthetic measurement system
(Li-Cor, Nebraska, USA) equipped with a 6400-02B RedBlue artificial light source.
During the measurements the PAR value was set at 800 μmol photons m-2 s-1, above
the saturation irradiance without photoinhibition, and the leaf temperature at 26 °C
(Rehem et al., 2011). The readings were recorded in the range of 2-3 min (coefficient
of variation <0.3%). The values of PN, gs and E were used to calculate the intrinsic
water use efficiency (WUEi) and instantaneous water use efficiency (WUE).
2.3. Photosynthetic Pigments
Mature leaves (2nd or 3rd from the apex) of the plants of the various treatments
were collected 96 h AAT. Immediately after, they were immersed in liquid nitrogen,
stored in ultrafreezer - 80ºC and later lyophilized. Subsequently, the leaves were
macerated in liquid nitrogen, 50 mg of leaf tissue was weighed into eppendorf tubes
and 2 mL of 80% acetone was added for the extraction of the photosynthetic
pigments, according to methodology described by Torres et al. (2006). The
absorbances of the extracts were determined using a microplate spectrophotometer
(SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Device, USA), at
wavelengths corresponding to 646 nm, 663 nm and 470 nm, for the determination of
the concentrations of Chl a, Chl b and Car, respectively, using the equations
described by Lichtenthaler and Wellburn (1983) for 80% acetone extracts.
2.4. Total Cr Determination
At 30 days AAT, the total Cr concentration was determined in the leaves and
roots of the treatments without and with Cr3+ at doses of 100 and 200 mg Cr3+ kg-1
soil and at 4 days AAT at doses 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil. Ten plants were
collected per treatment and separated into roots and shoot. The roots were submitted
to the following washing sequence: running water, 0.1% neutral detergent solution,
distilled water, 3% HCl and distilled water (Souza Junior et al., 2011), aiming at the
29
removal of metals at the root surface and in apparent free space. Soon after, the
plants were conditioned in paper bags and taken to a forced air circulation oven at
70º C until reaching a constant mass. Subsequently, the dry and ground vegetable
material was subjected to nitro-perchloric digestion (3: 1 v.v.). After digestion, total Cr
was determined by an Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer
(ICP-OES) in a “Varian 710-ES” model (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
2.5. Antioxidant Metabolism
The enzymatic assays were performed in foliar tissue (2nd or 3rd leaf from the
apex) collected at 3, 6, 12, 24, 48 and 96 h AAT intervals. Immediately after
collection, the leaves were immersed in liquid nitrogen, stored in ultrafreezer -80 ºC
and then lyophilized. The activity of the enzymes guaiacol peroxidase (GPX, EC
1.11.1.7), ascorbate peroxidase (APX, EC 1.11.1.11), superoxide dismutase (SOD,
EC 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.11.1.6) and glutathione reductase (GR, EC
1.8.1.7), was determined according to Carlberg and Mannervik (1985), Gianopolitis
and Ries (1977), Havir and Mchale (1987), Nakano and Asada (1981), Pirovani et al.
(2008), respectively.
2.6. Determination of malondialdehyde (MDA)
The lipid peroxidation was obtained by determining the content of reactive
substances to thiobarbituric acid, mainly malondialdehyde (MDA), performed
according to the protocol described by Cakmak and Horst (1991), with some
modifications (Souza et al., 2014). We used part of the collected and lyophilized leaf
samples for the determination of the antioxidative metabolism. Absorbance reading
was performed at 532 and 600 nm wavelengths on a microplate spectrophotometer
(SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Device, USA). The
correction for non-specific turbidity was made by subtracting the absorbance at 600
nm. The MDA concentration was calculated using the absorbance coefficient for the
MDA of 155 mM cm-1.
2.7. Proline
The free proline in the leaves of the plants of the various treatments was
extracted by the sulfosalicylic acid method and determined in a 520 nm wavelength
30
spectrophotometer according to a protocol described by Bates et al. (1973), with
modifications (Khedr et al., 2003). Were used part of the collected and lyophilized
leaf samples for the determination of the antioxidative metabolism. Absorbance
reading was performed at 520 nm wavelength on a spectrophotometer. The results
were expressed as µmoles g-1 DW.
2.8. Real-time quantitative PCR
From the results of the analysis of antioxidative metabolism, lipid peroxidation and
proline, two collection intervals were selected [24 h and 96 h AAT], where the highest
responses of these variables were observed in the different treatments for the
analysis of the gene expression. Were used part of the collected and lyophilized leaf
samples for the determination of the antioxidative metabolism. RNA extraction was
performed using the RNAqueous® kit (Ambion). The RNA samples were treated with
DNase I (Thermo Scientific), incubated at 37 °C for 30 min and quality of the RNA
was evaluated by electrophoresis in 1% agarose gel. The quantification of RNA (μg
mL-1), was performed in spectrophotometer (NanoDrop 2000c UV-Vis
Spectrophotometer Thermo Scientific), at wavelengths of 260 and 280 nm. Dnase I-
treated RNA samples were used for cDNA synthesis using the High Capacity RNA-
to-cDNA kit (Applied Biosystems, CA, USA) according to the manufacturer's
instructions. The qPCR was performed on an "Applied Biosystems 7500 Real-Time
PCR System" thermocycler using non-specific detection sequence (fluorophore)
SYBR Green I. The abundance of transcripts was analyzed using specific primers
described previously by Araujo et al. (2017), related to the biosynthesis of
photosystem 2 (PS2) proteins of the photochemical phase of photosynthesis (psbA
and psbO), antioxidative enzymes (Cu-Zn sod cyt and Cu-Zn sod chl), biosynthesis
of the metallothionein polypeptide (Mt2b) and biosynthesis of phytochelatin synthase
(phyt). Reaction mix was composed of 50 ng of cDNA as template, 5 μM of each
primer and 6.25 μL of Power SYBR® Green PCR Master Mix. The relative
expression numbers of the genes were calculated as the number of times in relation
to the control plant using the 2-ΔΔCt method (Livak and Schmittgen, 2001), with the
actin and β-tubulin genes as references.
2.9. Transmission Electron Microscopy (TEM)
31
Ultrastructural analyzes of cellular organelles in transmission electron microscopy
(TEM) were conducted at the Electronic Microscopy Center of the State University of
Santa Cruz. At 30 days AAT, ends of primary roots and middle part of mature leaves
of control treatments and Cr3+ treatments at the concentration of 200 mg Cr3+ kg-1 soil
and at 4 days AAT at the concentration of 600 mg Cr3+ kg-1 soil were sectioned,
collected and prefixed in 2.5% glutaraldehyde, prepared in 0.1M sodium cocodylate
(pH 7.2). Subsequently, sections of roots and leaves were fixed in osmium tetroxide,
prepared in the same buffer for 1 h, followed by dehydration in an ethanolic series
and included in LR White resin following the methodology described by Castro et al.
(2015). Subsequently, ultra-thin sections were obtained using ultramicrotome (Model
MS UC6 LEICA Microsystems) and analyzed in TEM Morgani TM-model 268 D (FEI
Company).
2.10. Statistical analysis
The experimental design was completely randomized, with 5 treatments, 20
plants per experimental unit (one plant per pot), making a total of 100 plants. The
MDA content, proline, enzymes and expression gene data were submitted two-way
factorial analyses of variance (ANOVA) with sampling time and treatments as main
factors. One-way ANOVA was used to test the treatment effects on leaf gas
exchange, photosynthetic pigments and Cr total. Significant differences between
means were compared by the Tukey test (p <0.01 and p <0.05) using the “SISVAR”
software version 5.6. The data are the means ± SE of four replicates for analyses of
foliar gas exchanges, Cr total, enzyme activity and proline, three for ultrastructural
analyses, five for malondialdehyde, and six repetitions for the photosynthetic
pigments and expression gene. Increases in treatments were calculated according to
Abbott (1925).
32
3. RESULTS
3.1. Leaf gas exchange
Leaf gas exchanges of the CCN 51 cocoa plants were severely affected by Cr3+
toxicity in the first 24 h AAT (Fig. 1). At the doses of 200, 400 and 600 mg Cr3+ kg-1
soil, there were significant reductions (p <0.01) of 77%, 98% and 97% for the
photosynthetic rate (PN) (Fig.1A), of 36%, 59% and 74% for stomatal conductance
(gs) (Fig. 1B) and 16%, 59% and 73% for transpiration (E) (Fig. 1C), respectively,
when compared to the control treatment. At the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil the
values of PN and gs were significantly higher than the control. At 4 days AAT,
significant increase and recovery of PN, gs and E at the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil
were observed, becoming similar to the control (Fig. 1). On the other hand, in the
doses corresponding to 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil, the values of PN were
significantly lower than the control with reductions of 73% and 100%, respectively
(Fig. 1A). Due to the low recovery of the photosynthetic activity and the low survival
rate of the plants (data not shown), the treatments at doses of 400 and 600 mg Cr3+
kg-1 soil were finalized at 4 days AAT, followed by collecting of plant material for the
other analysis. At 15 days AAT, the values of PN and gs were significantly higher in
treatment with 100 mg Cr3+ kg-1 soil (82% and 14%), and lower in the dose of 200 mg
Cr3+ kg-1 soil (34% and 21%) (Fig. 1A). At 21 days AAT, significant increases of gs
and E were observed in the treatment with 100 mg Cr3+ kg-1 soil, with increases of
39% and 48%, respectively. Significant differences (p <0.01) for the intrinsic (WUEi)
(Fig. 1D) and instantaneous (WUE) (Fig. 1E) efficiency of water use were observed in
day 1 AAT up to day 15 AAT assessments. On day 1 AAT treatments with 200, 400
and 600 mg Cr3+ kg-1 soil reduced the WUEi and WUE by up to 90%. At 4 days AAT
all treatments with Cr3+ reduced the WUEi and WUE by up to 100% when compared
to the control treatment. In addition, at 8 days AAT for the WUEi values the treatment
at the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil had a reduction of 48%. For WUE at doses of
100 and 200 mg Cr3+ kg-1 soil there were reductions of 35% and 50%, respectively.
At 15 days AAT the treatment of 100 mg Cr3+ kg-1 soil obtained a 36% and 53%
increment and the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil reductions of 29% and 30% for WUEi
and WUE, respectively. In contrast, no significant difference (p <0.01) was observed
between treatments at 21 and 28 days AAT (Fig. 1D and E).
33
Fig.1. (A) Photosynthetic rate per unit leaf area (PN), (B) stomatal conductance to water vapor (gs), (C) transpiration (E), (D) intrinsic water use efficiency (WUEi) and (E) instantaneous water use efficiency (WUE) on plant leaves of the clonal CCN 51 cacao genotype submitted to Cr
3+ stress in the
soil for 28 days. Mean values of four biological replicates ± SE. Capital letters indicate averages comparisons between treatments by the Tukey test (p <0.01).
34
3.2. Photosynthetic pigments
A small significant difference (p<0.05) was observed for the photosynthetic
pigments evaluated in leaves of the CCN 51 cacao plants, submitted to different
doses of Cr3+ in the soil (Fig. 2A and B). The content of Chl b and Chl (a+b) at the
dose of 400 mg Cr3+ kg-1 soil, obtained reduction of 30% and 14%, respectively.
While the carotenoid content and the Chl (a/b) and car / Chl (a+b) ratios, the dose of
400 mg Cr3+ kg-1 soil obtained increments of 40%, 52% and 75%, respectively. No
significant differences were observed between the other treatments evaluated with
the increase of Cr3+ doses in the soil (Fig. 2A and B).
3.3. Total Cr accumulation
The total Cr concentration in the leaves and roots of the CCN 51 cacao plants
increased significantly (p<0.01) at the highest doses of Cr3+ applied to the soil (Fig.
2C). In the leaves, the treatments with 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil were
significantly different from each other and higher than the doses of 100 and 200 mg
Cr3+ kg-1 soil and the control. In the roots, treatments with 200, 400 and 600 mg Cr3+
kg-1 soil were significantly different from each other and higher than the dose of 100
mg Cr3+ kg-1 soil and the control. The highest accumulation of Cr, regardless of
treatment, occurred in the roots. On average, 75% of the total Cr absorbed by the
plants was retained in the roots and 25% was translocated to the leaves (Fig. 2C).
35
Fig. 2. Leaf photosynthetic pigment content and total Cr accumulation in the roots and leaves of CCN 51 clonal genotype plants submitted to five increasing doses of Cr3+ in soil. Mean values of six biological replicates ± SE for photosynthetic pigments and four biological replicates ± SE for Cr total. Capital letters indicate averages comparisons between treatments by the Tukey test (p <0.01). * Determined at 96 h after application of treatments (AAT); ** determined at 28 days AAT, except treatments of 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil that were closed at 4 days AAT.
36
3.4. Ultrastructural analyzes of leaf mesophyll and root
The application of Cr3+ in the soil caused changes in the cellular ultrastructure of
the leaf mesophyll and the roots of the plants (Fig. 3). In the foliar mesophyll
treatment with the dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil, vesicles formed with deposition of
electrodense material and widely spaced thylakoids (Fig. 3D), large deposition of
electrodense material in the central xylem (Fig. 3E), disorganization of thylakoid
membranes with destruction of chloroplasts and deposits of electrodense material in
the leaf mesophyll (Fig. 3F). In the control treatment (Fig. 3A) and in the dose of 200
mg Cr3+ kg-1 soil (Fig. 3B and C), nucleus, mitochondria, chloroplasts with starch
grains and cell wall were observed. In contrast, at the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil,
there was a large deposition of electrodense material in the cell vacuole (Fig. 3B and
C). On the other hand, in the roots, the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil, promoted
retraction of the protoplasm (Fig. 3H), formation of vesicles, deposition of
electrodense material on xylem cells (Fig. 3I) and rupture of cell walls with of the
protoplasm (Fig. 3J) were observed. However, at the dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil,
there was irreversible destruction of mitochondria (Fig. 3K), accumulation of
electrodense material in the cell wall and retraction of protoplasm due to plasmolysis
(Fig. 3L), when compared to the control treatment, whose cells of the root system
remained intact (Fig. 3G).
37
Fig. 3. Microphotographs (TEM) of transverse sections of the leaf mesophyll (A-F) and root (G-L) cross sections of plants of the clonal cacao genotype CCN 51 submitted to five increasing doses of Cr
3+ in
the soil. Leaves: control (A), 200 mg Cr3+
kg-1
soil (B and C) and 600 mg Cr3+
kg-1
soil (D, E and F). Roots: control (G), 200 mg Cr
3+ kg
-1 soil (H, I and J) and 600 mg Cr
3+ kg
-1 soil (K and L). Arrows
indicate deposition of electrodense material in the vacuoles (B and C); formation of vesicles (D and I); deposition of electrodense material in the central xylem (E); disorganization of thylakoid membranes, destruction of chloroplasts and deposition of electrodense material (F); ultra-retraction of protoplasm (H); rupture of cell wall (J) and accumulation of electrodense material in the cell wall (L). n: nucleus, m: mitochondrion, cw: cell wall, chl: chloroplast, sg: starch grains, x: xylem. Bars = 1 μm (A, C, G and K), 2 μm (B, D, E, H and I) and 0.5 μm (F, J and L).
38
3.5. Malondialdehyde (MDA)
Increases in the MDA content were observed after 12 h AAT in the treatment with
100 mg Cr3+ kg-1 soil (30%), when compared to the control. In the 24 h period AAT,
the doses of 100, 200 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil promoted increases of 13%, 21%
and 15%, respectively. In the 48 h AAT period, there was a 12% increase in MDA
content only at the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil. On the contrary, in the 96 h AAT
period, there were increases of 38%, 16% and 10% in the doses of 200, 400 and 600
mg Cr3+ kg-1 soil, respectively (Fig. 4A).
Fig. 4. (A) Concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and (B) proline in leaves of plants of the clonal cacao genotype CCN 51 submitted to five increasing doses of Cr
3+ in the soil.
Mean values of four biological replicates ± SE. Capital letters indicate mean comparisons between Cr
3+ treatments in soil. Small letters indicate averages comparisons between the evaluation intervals
by the Tukey test (p <0.01)
39
3.6. Proline
The proline content in leaves of the CCN 51 plants increased significantly (p
<0.01) with the time of exposure to Cr3+ treatments at doses of 200, 400 and 600 mg
Cr3+ kg-1 soil (Fig. 4B). The highest concentrations were observed at 48 h and 96 h
AAT intervals. The treatments with 200, 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil increased the
proline content at 19, 40 and 74 times in relation to the control at 96 h AAT (Fig. 4B).
3.7. Antioxidant Metabolism
A significant increase (p <0.01) in the activity of the antioxidative metabolism
enzymes was observed between the treatments with Cr3+ applied to the soil and the
exposure times to the metal (Fig. 5). Higher ascorbate peroxidase activity (APX) (Fig.
5A) was observed at the dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil at all evaluated intervals. This
treatment promoted an increase in APX activity that varied from 198% at 3 h AAT to
526% at 96 h AAT, when compared to the control treatment. The evaluation intervals
of 6 h and 96 h AAT were significantly higher than the other evaluation periods for
the dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil. At the doses corresponding to 100, 200 and 400
mg Cr3+ kg-1 soil, the APX activity was similar to or lower than the control and there
were no significant differences between the exposure times to the metal (Fig. 5A).
Higher activity of the catalase enzyme (CAT) (Fig. 5B) was observed among all
treatments at 96 h AAT, whose increments ranged from 53% to 123%, when
compared to the control. At 48 h AAT significantly higher activity was observed in
treatments with 100, 200 and 400 mg Cr3+ kg-1 soil in increments of 52%, 28% and
33%, respectively. On the other hand, the dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil promoted an
increase of 24% at 3 h AAT, while the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil promoted a 21%
increase at 24 h AAT. In the other times of metal exposure, there were reductions in
CAT activity up to 32% (Fig. 5B).
For the guaiacol peroxidase activity (GPX) (Fig. 5C), a significant increase was
observed in relation to the control for all doses of Cr3+ applied to the soil and time of
exposure to the metal. At doses of 100 and 200 mg Cr3+ kg-1 soil there were greater
increases in GPX activity at 3, 6 and 12 h AAT; while at doses of 400 and 600 mg
Cr3+ kg-1 soil the highest increases in activity were observed at 3, 6, 12 and 48 h AAT
(Fig. 5C).
40
There was a significant increase in glutathione reductase activity (GR), ranging
from 23% at 3 h AAT to 101% at 96 h AAT, in the treatment with 100 mg Cr3+ kg-1 soil
at all times of exposure to metal (Fig. 5D). In addition, at 200 mg Cr3+ kg-1 soil, GR
increased at 3, 6, 24 and 96 h AAT, with increases of 24%, 89%, 84% and 164%,
respectively. On the other hand, the dose of 400 mg Cr3+ kg-1 soil promoted an
increase in GR activity, at 3 and 96 h AAT, of 30% and 70%, respectively, when
compared to the control treatment (Fig. 5D).
Greater activity of the superoxide dismutase (SOD) (Fig. 5E) was observed in the
treatment with 400 mg Cr3+ kg-1 soil in the 3, 6 and 12 h AAT intervals, increasing by
2.83%, 2.79% and 1.4%, respectively. The dose of 600 mg Cr3+ kg-1 soil promoted
increases in the intervals of 3 h AAT (1.57%), 6 h AAT (1.92%), 12 h AAT (1.56%),
24 h AAT (1.61%) and 96 h AAT (1.42%). On the other hand, at the dose of 100 mg
Cr3+ kg-1 soil there was greater activity of SOD (1.5%) at 6 h AAT. At the dose of 200
mg Cr3+ kg-1 soil, in the 96 h AAT interval, with an increase of 2.5%, when compared
to the control (Fig. 5E).
41
Fig. 5. Activity of the enzymes of the antioxidative metabolism. (A) APX - ascorbate peroxidase, (B) CAT - catalase, (C) GPX - guaiacol peroxidase, (D) GR - glutathione reductase and (E) SOD - dismutase superoxide in plant leaves of the clonal genotype of cacao CCN 51 submitted to five increasing doses of Cr
3+ in the soil. Mean values of four biological replicates ± SE. Capital letters
indicate mean comparisons between Cr3+
treatments in soil. Small letters indicate mean comparisons between the evaluation intervals by the Tuckey test (p <0.01).
42
3.8. Gene expression
A significant difference (p <0.01) in the expression of the evaluated genes (psbA,
psbO, Mt2b, phyt, sod cyt and sod chl) was observed as a function of the Cr3+ doses
applied to the soil and the exposure time to the metal (Fig. 6). In the 24 h AAT period,
the highest expressions of the psbA, psbO, Mt2b and sod chl genes (Fig. 6A, B, C
and F) occurred in the treatment of 200 mg Cr3+ kg-1 soil, with increases of 254%,
394%, 204% and 1044%, respectively. However, at the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil,
there was an increase of 1032%, 104%, 135% and 319% in expression of the sod
chl, psbA, psbO and Phyt genes (Fig. 6F, A, B and D). The highest phyt and sod cyt
genes expression (Fig. 6D and E) were observed at doses of 400 and 600 mg Cr3+
kg-1 soil, with increments of 1466% and 571%, respectively. In addition, doses of 400
and 600 mg Cr3+ kg-1 soil also promoted expression of psbA (139% and 62%) and
psbO (237 and 56%), (Fig. 6A and B) respectively. On the other hand, treatments
with 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil repressed Mt2b gene expression (Fig. 6C) in 82%
and 40%, respectively. A significant increase of 407% and 565% were also observed
in phyt gene expression (Fig. 6D), in treatments with 200 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil,
respectively.
At the 96 h AAT exposure time, the highest expressions of psbA, phyt and sod cyt
genes (Fig. 6A, D and E) were observed in the treatment with 600 mg Cr3+ kg-1 soil,
with increases of 73%, 638% and 1357%, respectively. In addition, the dose of 600
mg Cr3+ kg-1 soil promoted a 63% increase in Mt2b expression (Fig. 6C). On the
other hand, the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil promoted an increase in the expression
of the psbO, Mt2b and phyt genes (Fig. 6B, C and D) of 245%, 253% and 371%,
respectively. The treatment with 200 mg Cr3+ kg-1 soil promoted increases of 58% in
psbA gene expression, 212% in psbO and 484% in phyt expression (Fig. 6A, B and
D). In contrast, the treatment with 400 mg Cr3+ kg-1 soil promoted increases of 102%,
318% and 292% in expression of the Mt2b, sod chl and sod cyt genes (Fig. 6),
respectively.
43
Fig. 6. Relative expression of genes coding for protein biosynthesis psbA (A), psbO (B), metallothioneins - Mt2b (C), phytochelatins - phyt (D), cytoplasmic superoxide dismutase - sod cyt (E), and chloroplast superoxide dismutase - sod chl (F) in plant leaves of the clonal CCN 51 cocoa genotype subjected to five increasing doses of Cr
3+ in soil. Mean values of three biological replicates and two technical replicates ± SE. Capital letters indicate mean comparisons
between treatments of Cr3+
in the soil by the Tukey test (p <0.01). Statistical significance among the evaluated intervals was determined by ANOVA, followed by the t-test (* p <0.01).
44
4. DISCUSSION
Leaf gaseous exchanges (PN, gs and E) in the CCN 51 cacao clonal cultivar were
severely affected by Cr3+ treatments at doses of 200, 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil,
1 day AAT (Fig. 1), due to damage caused in the photosynthetic apparatus and
changes influenced in the stomata mainly by the increase of Cr3+ in leaf at higher
doses of applied Cr and the time of exposure to the metal. These changes can be
explained by several factors such as ultrastructural damage in the chloroplast,
decrease of CO2 fixation due to reduction of gs and decrease of expression of genes
like psbA and psbO, besides changes in enzymatic activity and MDA content (Panda
and Choudhury, 2005, Shahid et al., 2017). Severe changes in leaf gas exchange
have also been reported for the macrophytes Alternanthera philoxeroides, Borreria
scabiosoides, Polygonum ferrugineum and Eichhornia crassipes (Mangabeira et al.,
2011), for Genipa americana (Santana et al., 2012) subjected to Cr3+ stress in
nutrient solution.
The recovery of photosynthetic activity at the dose of 200 mg Cr3+ kg-1 soil, at 4
days AAT (Fig. 1A), can be explained in part by the maintenance of the
photosynthetic pigment contents (Fig. 2), and by the increase of the expression of the
psbA (Fig. 6A) in the 24 h AAT, and psbO genes (Fig. 6B) in the 24 h and 96 h AAT
intervals. The function of photosynthetic pigments is to absorb light energy and
transferring it to electrons (Taiz et al., 2017). The psbA gene is responsible for
electron transfer during photosynthetic activity. However, the psbO gene is
responsible for the proper functioning of the oxygen evolution complex (Cheng et al.,
2016) during the oxidation process of the water molecule. Variations in psbO
concentration, directly influences photosynthesis and plant growth (Rehem et al.,
2011). Studies with plants of T. cacao subjected to Cd toxicity have shown that the
repression of psbO expression is a mechanism to protect protein D1, as a function of
oxidative stress mediated by ROS, preventing damage to PS2 (Araújo et al., 2017).
Thus, greater expressions of psbA and psbO genes (Fig. 6A and B) ensure the
maintenance of PS2 functions.
The highest activity of the foliar gas exchange at the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil
(Fig. 1A, B and C) can be explained by the biphasic dose-response process called
hormesis (Poschenrieder et al., 2013, Shahid et al., 2017). Chromium, applied at low
doses, can induce positive hormonal effects, depending on the plant species and the
45
valence in which it occurs, but at high doses it is phytotoxic (Shahid et al., 2017).
Some studies have reported the occurrence of beneficial events in the application of
low doses of Cr3+ in plants, such as increased carbon assimilation in Eichhornia
crassipes (Paiva et al., 2009), stimulation of root growth in Allium cepa bulbs (Patnaik
et al., 2013), increased essential oil production and fresh biomass of shoot and root
in Mentha citrata (Prasad et al., 2010) and increased dry biomass of roots and shoot
of Solanum nigrum (UdDin et al., 2015). Thus, the increase in photosynthetic activity
at the dose of 100 mg Cr3+ kg-1 soil (Fig. 1A, B and C) may be due to a hormesis
effect, along with maintenance of chloroplastidic pigment contents (Fig. 2A and B),
and to the increase in expression of the psbA genes (Fig. 6A), in the 24 h period
AAT, and psbO (Fig. 6B) in the period of 24 and 96 h AAT.
The intrinsic (WUEi) (Fig. 1D) and instantaneous (WUE) (Fig. 1E) water use
efficiencies were significantly (p <0.01) affected as a function of the increase in Cr3+
concentration in the soil and the time of exposure to metal. Such changes indicate
that treatments with Cr3+ interfered in the ability of the leaves to regulate the loss of
water via gs and E associated to PN. When PN and gs vary proportionally and
linearly, WUEi and WUE decrease with the reduction of gs, causing a reduction in
photosynthetic efficiency during the stress event (Taiz et al., 2017). WUE has greater
environmental influence because E is dependent on stomatal opening and vapor
pressure deficit (DPV) in the leaf boundary air layer. While WUEi depends only on
the stomatal opening excluding the environmental effect, ie the evaporative demand
on the water flows out of the leaf (Fischer and Turner, 1978).
Alterations of chloroplastidic pigments in plants submitted to stress by Cr3+ has
been reported in the literature for some species such as Brassica napus (Afshan et
al., 2015), Hibiscus cannabinus (Ding et al., 2016) and Chenopodium quinoa
(Scoccianti et al., 2016). In our study, we observed small significant changes in
chloroplastidic pigment levels in the treatment with 400 mg Cr3+ kg-1 soil (Fig. 2). The
decrease in Chl levels can be explained by the inhibition of enzymes involved in
chlorophyll biosynthesis, confirming that cocoa plants are more intolerant to Cr3+
stress. While the increase in carotenoid content may be related to its antioxidant
function in the inactivation of reactive oxygen species (ROS) (Taiz, et al., 2017)
under stress conditions. Similar results have been reported in Chenopodium quinoa
(Scoccianti et al., 2016).
46
The highest concentrations of total Cr were detected in the roots (Fig. 2C). On
average, the roots of the cocoa plants accumulated 75% of total Cr absorbed by the
plants, demonstrating root efficiency in the retention of absorbed Cr, preventing its
translocation to the leaves. Our results are in agreement with the study of Ding et al.
(2016) whose concentration of Cr in the roots of Hibiscus cannabinus was 30 times
higher than in the aerial part and with the study of López-Luna et al. (2009), which
verified high levels of Cr in the roots of Sorghum dependent on the increase of
concentrations of Cr3+ in the soil.
Excessive Cr accumulation in the roots has been evaluated as an exclusion
response of the tolerant plants, with the objective of avoiding their transport to the
aerial part (Caldelas et al., 2012). Alterations related to the accumulation of
electrodense material as a function of Cr have been considered by many researchers
as a mechanism of detoxification or even tolerance developed by plants (Shahid, et
al., 2017; Singh et al., 2013). Restriction in the absorption by immobilization of the
metal in the cell wall of the roots, reduction of plasma membrane translocation,
complexation of the metal with organic acids and amino acids and chelation with
peptides (metallothioneins and phytochelatins) in the roots and leaf vacuoles are part
of this mechanism (Gomes et al. al., 2017). In our work, this mechanism can be
observed in cocoa plants submitted to doses of 200 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil, with
accumulation of electrodense material in the root vacuoles, very close to the cell wall
(Fig. 3H and L). It was also observed that an accumulation of electrodense material
in the xylem of the roots and leaves, corroborating with the findings described in the
literature, demonstrating that Cr, after absorption by the root system, is transported to
the aerial part of the plants via xylem (Hayat et al. 2012).
The presence of vesicular bodies in the leaf vacuoles (Fig. 3D) and root xylem
(Fig. 3I) may also be related to a detoxification mechanism, called macroautophagia,
being this, the best explored type of autophagy in plants (Taiz et al., 2017).
Autophagy is considered a sophisticated mechanism for the recycling of damaged or
unwanted intracellular constituents (Li and Vierstra, 2012). Induction of autophagy
due to heavy metal stress were reported in plants of Theobroma cacao subjected to
Cd (Araujo et al., 2017) and Lespedeza chinensis and Lespedeza davidii treated with
Pb (Zheng et al. 2012).
47
Another important mechanism developed by plants for detoxification and
tolerance to heavy metals is the chelation of metals by high-affinity ligands such as
phytochelatins (phyt) and metallothioneins (Mt2b) (Srivastava et al., 2017). The
increase of the phyt expression with the increase of the dose of Cr3+ in the soil (Fig.
6D) and Mt2b (Fig. 6C) contributes to the reduction of metal concentration in the
cytosol by Cr3+ sequestration, inactivating the metal in the cytoplasm and
compartmentalizing the Cr-protein complex in the vacuoles (Hasan et al., 2017). Phyt
biosynthesis is rapidly activated in the presence of heavy metals, using reduced
glutathione (GSH) as the substrate. Similar phytochelatins induction results were
obtained by Diwan et al. (2010), when evaluating plants of Vigna radiata and
Brassica juncea submitted to Cr stress. On the other hand, the increase in Mt2b
expression was greater at the 96 h AAT exposure time, except for the dose 200 mg
Cr3+ kg-1 soil, which occurred 24 h AAT (Fig. 6C). Metallothioneins are induced in the
presence of heavy metals and are involved in the homeostasis of essential and toxic
elements present in excess in plants. Studies with Theobroma cacao plants
submitted to Cu toxicity showed that the induction of the expression of Mt2b at 12 h
AAT, may be a protective tolerance strategy to accumulate a higher Cu content in the
roots, aiming to maintain the metabolic process in the leaves (Souza et al., 2014).
Increased expression of phyt and Mt2b in cocoa plants subjected to heavy-metal
stress has been reported by several authors (Araujo et al., 2017; Castro et al., 2015;
Reis et al., 2015; Souza, et al. , 2014).
Disorganization of thylakoid membranes with destruction of chloroplasts, widely
spaced thylakoids, plasmolysis, rupture of cell walls and destruction of mitochondria
in the roots are related to the oxidative stress promoted by excess of ROS (Fig. 3).
The increase of ROS induced by Cr is an important mechanism that may contribute
to the observed changes in the photosynthetic activity, since they damage
polyunsaturated fatty acids and structural proteins (Rodriguez et al., 2011). In
addition, excessive accumulation of ROS may alter cellular homeostasis causing
various cell lesions that can lead to programmed cell death and autophagy (Hasan et
al., 2017). The irreversible chloroplast damages of the cocoa plants subjected to a
higher dose of Cr3+ (600 mg Cr3+ kg-1 soil) may be responsible for the severe
reduction of foliar gas exchange due to the low recovery of PN at 4 days AAT. Similar
ultrastructural results have also been reported in other species subjected to Cr3+
48
(Mangabeira et al., 2011), as well as in cocoa plants subjected to Al, Cd, Pb and Cu
(Almeida et al., 2015, Araujo et al., 2017, Castro et al., 2015, Souza et al. al., 2014).
CCN 51 plants exposed to Cr3+ toxicity in the soil, triggered not only alterations in
physiological processes, but also significant changes in MDA content of cell
membranes (Fig. 4), induced by the increase of reactive oxygen species (ROS ). Our
findings differed from other results found in the literature, where the higher
concentrations of Cr provide higher levels of MDA (Afshan et al., 2015; Anjum et al.,
2017). In T. cacao, higher peaks of MDA were observed in treatments with 100 and
200 mg Cr3+ kg-1 soil and exposure times of 12 and 24 h AAT and 24, 48 and 96 h
AAT, respectively. On the other hand, the treatments with higher doses had little
alteration in the contents of MDA when compared to the control (Fig. 4). These
results may be explained by changes in the activity of the antioxidative enzymes
(Afshan et al., 2015, Anjum et al., 2017). The lower activity of the SOD, APX and
CAT (Fig. 5) enzymes were observed in the same exposure times to treatments of
100 and 200 mg Cr3+ kg-1 soil. On the other hand, in the treatments with higher doses
of Cr3+ in the soil, greater activities of the SOD, APX, GPX and CAT enzymes (Fig. 5)
corresponded to lower levels of MDA (Fig. 4). Thus, we can deduce that higher
concentrations of MDA, as indicative of the maintenance of oxidative stress (Dey et
al., 2007), are related to lower enzymatic activity in plants of the clonal cacao
genotype CCN 51.
Antioxidant enzymes present as the main line of defense against ROS, work in
synchrony to eliminate them (Choudhury et al., 2013; Shahid et al., 2017). In
addition, plants with higher enzymatic activity are more tolerant to different types of
stress. In our findings, higher SOD activity was observed (Fig 4E) in the treatments
with the highest concentrations of Cr3+ in the soil, demonstrating a rapid activation of
defense mechanisms in practically all exposure times evaluated. SOD found in
almost all cellular compartments, is the first antioxidant enzyme to act against ROS-
mediated oxidative stress (Taiz et al., 2017).
At lower doses of Cr3+ in the soil, low activation of SOD (Fig 4E) was observed in
the leaves at the evaluated exposure times, thus maintaining the balance between
generation and removal of ROS (Shahid et al., 2017). However, greater activation of
GPX (Fig. 5C) was observed in the three initial times of exposure evaluated and CAT
(Fig. 5B) at the three final exposure times, whereas APX (Fig. 5A) was not activated
49
at low dosages of Cr3+ in soil. The activity of some antioxidant enzymes can be
suppressed when plants are subjected to an abiotic stress, and when this occurs,
positive induction of other enzymes becomes essential in order to maintain redox
homeostasis in plants (Choudhury et al. 2013; Vaahtera et al., 2014).
In our study, we observed that there was a synchronized action of the antioxidant
enzymes evaluated, aiming to limit oxidative stress in cocoa plants, and that
peroxidases were more efficient in H2O2 detoxification in the presence of high
concentration of Cr3+ in the soil. At higher doses of Cr3+ in the soil, greater activation
of GPX (Fig. 5C) occurred at all evaluated exposure times, whereas for CAT (Fig. 5B)
it occurred in the last two exposure times, whereas APX activation (Fig. 5A) occurred
only at the highest Cr3+ dose at all exposure times evaluated. The increase in APX
and GPX activity may be related to the reduction of foliar gas exchange in the
treatments with higher doses of Cr3+ in the soil. Its increase may indicate the
physiological state of plants, since ROS are by-products of photosynthesis and
respiration, produced in chloroplasts and mitochondria, respectively (Mittler, 2017).
Increased SOD activity, induced by Cr3+ stress, has been reported in Parthenium
hysterophorus (UdDin et al., 2015) and Zea mays (Anjum et al., 2017). Similar results
for CAT, APX and GPX were found in Salvinia natans (Dhir et al., 2009). In
Theobroma cacao, increased activation of SOD and GPX when plants were
submitted to Cd stress (Araujo et al., 2017) and GPX activation in leaves and roots
by Pb (Reis et al., 2015) were reported.
Glutathione reductase (GR) (Fig. 5D) is one of the antioxidant enzymes that have
the function of regulating the redox state of cells (Choudhury et al., 2013). GR
participates in the maintenance reactions of the reduced glutathione levels (GSH)
(Foyer and Noctor, 2011), with the chloroplasts being the place of its greater activity
(Pandey et al., 2009). Higher concentrations of GR in the treatments with the lowest
doses of Cr3+ in the soil (Fig. 5D), indicate the occurrence of redox balance
maintenance, as a way of reducing and protecting cocoa plants from oxidative stress.
On the other hand, the lower activity of GR in high concentration of Cr3+ in the soil
indicates that there was alteration in redox homeostasis in these treatments. Similar
results were reported by Pandey et al. (2009).
In addition to the antioxidant enzymes, the accumulation of amino acids such as
proline has been well reported in the literature in the fight against oxidative stress
50
promoted by heavy metals, including Cr (Anjum et al., 2017, Dey and Mondal, 2016,
UdDim et al., 2015). In our study, proline levels were higher at higher doses of Cr3+ in
the soil during and after 48 h exposure to the metal (Fig. 4). In addition, the increase
in proline content coincided with increased activity of GPX peroxidases (Fig. 5C) and
APX (Fig. 5A). The results of our work agree with the results reported in Solanum
nigrum, where this correspondence was also found in high doses of Cr3+ in soil
(UdDin et al., 2015). According to Mourato et al. (2012), high levels of proline, under
abiotic stress, can increase the resistance of plants to the stress factor, activating
antioxidant enzymes, participating in the maintenance of redox homeostasis and
eliminating ROS (Mittler, 2017).
Studies suggest that ROS act as biological indicators in the regulation of stress
(Hossain et al., 2012), triggering the expression of several genes that encode
proteins involved in the production, perception and elimination of ROS in cells (Mittler
, 2017, Vaahtera et al., 2014). The increase in the expression of sod Cyt (Fig. 6E), at
doses of 200, 400 and 600 mg Cr3+ kg-1 soil, coincided with the increase in the
activity of the main enzymes of the antioxidative system (Fig. 5), and with the
increase of the proline content (Fig. 4B). Increased expression of genes encoding
antioxidant enzymes contributes to the maintenance of the activity of antioxidant
compounds, aiming for the elimination of ROS and reinforcing the antioxidant
defense system. In addition, the immediate elimination of ROS, due to increased
oxidative stress, occurs preferentially at its production sites, by the activation of
antioxidant substances present at this site (Hossain et al., 2012). The accumulation
of higher proline levels (Hayat et al., 2012) and the activation of APX, GPX, CAT
(Mittler 2017) and SOD (Choudhury et al., 2013) also occur in the cytoplasm,
supporting the theory previously discussed that there was a synchronized action to
eliminate ROS. Increased expression of sod Cyt in cocoa leaves has been reported
in the highest doses of Al3+, Cd, Pb, and Cu (Almeida et al., 2015, Araujo et al., 2017,
Castro et al., 2015; Reis et al., 2015; Souza et al., 2014). On the other hand,
increases in the expression of sod Chl (Fig. 6F), were observed at doses of 100 and
200 mg Cr3+ kg-1 soil, 24 h AAT, coinciding with increases in the activation of SOD in
the treatment with 100 mg Cr3+ kg-1 soil, and at 96 h AAT in the treatment 200 mg
Cr3+ kg-1 soil. Given the previously discussed hypothesis that in the lower doses of
Cr3+ in soil occur maintenance of the balance between generation and removal of
51
ROS (Shahid et al., 2017), since ROS act as signaling genes for the induction of
biosynthesis of antioxidant enzymes.
5. CONCLUSIONS
The tolerance of the CCN 51 clonal plants to Cr3+ toxicity depends on its
concentration in plant and time of its exposure to this metal. Among the tested doses,
100 mg Cr3+ kg-1 soil showed the best performance under metal stress condition,
operating a prompt, multiple response at enzymatic, molecular and physiological
levels. Doses of Cr3+ equal to or greater than 200 mg Cr3+ kg-1 soil appear to be very
toxic, remarkably interfering with the overall metabolism of this species. High content
of Cr in soil promoted serious ultrastructural changes, which can lead to death. All
alterations observed in T. cacao plants subjected to increasing levels of Cr3+ suggest
that plants grown in soils with high levels of Cr can be negatively affected in their
growth and metabolism. As a strategy for tolerance to Cr3+ toxicity in the soil, cacao
retained on an average 75% of the total Cr absorbed in the roots indicating a low
mobility within the plant. These results also indicate Cr is more relevant to
phytotoxicity than to food safety risk assessments, since the addition of Cr to soil
promoted physiological and the ultrastructural changes in plants of T. cacao.
ACKNOWLEDGEMENTS
The second author gratefully acknowledges Brazil’s National Council for Scientific
and Technological Development (CNPq), Brazil, for the concession of a fellowship of
scientific productivity. Junea Leandro do Nascimento was supported by CAPES
(Coordination of Superior Level Staff Improvement). We thank Dr. M. Elson for
excellent review of this paper.
52
REFERENCES
Abbott W.S., 1925. A method of computing the effectiveness of on insecticide. J Econ Entomol., 18, 265-267. DOI: https://doi.org/10.1093/jee/18.2.265a
Afshan S., Ali S., Bharwana S.A., Rizwan M., Farid M., Abbas F., Ibrahim M., Mehmood M.A., Abbasi G.H., 2015. Citric acid enhances the phytoextraction of chromium, plant growth, and photosynthesis by alleviating the oxidative damages in Brassica napus L. Environ Sci Pollut Res Int., 22, 11679-89. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-015-4396-8
Almeida A.-A.F., Valle R.R., 2009. Cacao: ecophysiology of growth and production. In: DaMatta F.M. (Ed.), Ecophysiology of Tropical Tree Crops. Nova Science Publishers Inc., Hauppauge, Andersen, pp. 37–70.
Almeida A.-A.F., Gomes F.P., Araujo R.P., Santos R.C., Valle R.R., 2014. Leaf gas exchange in species of the Theobroma genus. Photosynthetica 52, 16–21. DOI: http://dx.doi.org/10.1007/s11099-013-0048-8.
Almeida N.M., Almeida A.-A.F., Mangabeira P.A.O., Ahnert D., Reis G.S.M., Castro A.V., 2015. Molecular, biochemical, morphological and ultrastructural responses of cacao seedlings to aluminum (Al3+) toxicity. Acta Physiol Plant. 37: 5. DOI: https://doi.org/10.1007/s11738-014-1732-4.
Anjum S.A., Ashraf U., Khan I., Tanveer M., Shahid, M., Shakoor A., Wang L., 2017. Phyto-Toxicity of Chromium in Maize: Oxidative Damage, Osmolyte Accumulation, Anti-Oxidative Defense and Chromium Uptake. Pedosphere 27, 262–273. DOI: https://doi.org/10.1016/S1002-0160(17)60315-1
Araújo R.P., Almeida A.-A.F., Pereira L.S., Mangabeira P.A.O., Souza J.O., Pirovani C.P., Ahnert D., Baligar V.C., 2017. Photosynthetic, antioxidative, molecular and ultrastructural responses of young cacao plants to Cd toxicity in the soil. Ecotoxicol Environ Saf. 144, 148-157. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.06.006.
Arévalo-Gardini E., Arévalo-Hernández C.O., Baligar V.C., He Z.L., 2017. Heavy metal accumulation in leaves and beans of cacao (Theobroma cacao L.) in major cacao growing regions in Peru. Science of The Total Environment. 605, 792-800. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.06.122
Ashraf A., Bibi I., Niazi N.K., Ok Y.S., Murtaza G., Shahid M., Kunhikrishnan A., Mahmood, T., 2017. Chromium(VI) sorption efficiency of acid-activated banana peel over organo-montmorillonite in aqueous solutions. Int J Phytoremediation. 19, 605-613. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/15226514.2016.1256372.
Aslam M., Saeed M.S., Sattar S., Sajad S., Sajjad M., Adnan M., Iqbal M., Sharif M.T., 2017. Specific role of proline against heavy metals toxicity in plants. Int. J. Pure App. Biosci. 5, 27-34. DOI: http://dx.doi.org/10.18782/2320-7051.6032
Bates, I.S., Waldern, R.P., Teare, I.D.,1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil 39, 205–207. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00018060
53
Bertoldi, D., Barbero, A., Camin, F., Caligiani, A., Larcher, R., 2016. Multielemental fingerprinting and geographic traceability of Theobroma cacao beans and cocoa products. Food Control. 65, 46–53. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.01.013
Boza E.J., Motamayor J.C., Amores F.M., Cedeño-Amador S., Tondo C.L., Livingstone III D.S., Schnell R. J., Gutiérrez O.A., 2014. Genetic characterization of the cacao cultivar CCN 51: its impact and significance on global cacao improvement an production. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 139,219-229. DOI: http://journal.ashspublications.org/content/139/2/219.full.
Cakmak I., Horst W. J., 1991. Effect of aluminum on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Physiol Plant, 83, 463-468. DOI:10.1111/j.1399-3054.1991.tb00121.x
Calabrese, E.J., 2015. Hormesis within a mechanistic context. Homeopathy. 104, 90-96. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.homp.2015.01.002.
Calabrese, E.J., Blain, R.B., 2009. Hormesis and plant biology. Environ. Pollut. 157, 42-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envpol.2008.07.028
Caldelas C., Bort J., Febrero A. 2012. Ultrastructure and subcellular distribution of Cr in Iris pseudacorus L. using TEM and X-ray microanalysis. Cell Biol. Toxicol. 28, 57-68. DOI: https://doi.org/10.1007/s10565-011-9205-7.
Carlberg C., Mannervik B. 1985. Glutathione reductase. Methods Enzymol., 113, 488-495, https://doi.org/10.1016/S0076-6879(85)13062-4.
Castro A.V., Almeida A.-A.F., Pirovani C.P., Reis G.S.M., Almeida N.M., Mangabeira P.A.O., 2015. Morphological, biochemical, molecular and ultrastructural changes induced by Cd toxicity in seedlings of Theobroma cacao L. Ecotoxicol. Environ. Saf. 115, 174–186. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2015.02.003
Cheng D.-D., Zhang Z.-S., Sun X.-B., Zhao M., Sun G.-Y., Chow W.S., 2016. Photoinhibition and photoinhibition-like damage to the photosynthetic apparatus in tobacco leaves induced by Pseudômonas syringae pv. Tabaci under light and dark conditions. BMC Plant Biology 16:29. DOI: https://doi.org/10.1186/s12870-016-0723-6
Choudhury S., Panda P., Sahoo L., Panda S.K., 2013. Reactive oxygen species signaling in plants under abiotic stress, Plant Signal Behav., 8, 23681. DOI: https://doi.org/10.4161/psb.23681
Dey S.K., Dey J., Patra S., Pothal D., 2007. Changes in the antioxidative enzyme activities and lipid peroxidation in wheat seedlings exposed to cádmium and lead stress. Braz. J. Plant Physiol. 19,1. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S1677-04202007000100006.
Dey U., Mondal N.K., 2016. Ultrastructural deformation of plant cell under heavy metal stress in Gram seedlings. Cogent Environ. Sci. 2, 1196472. DOI: https://doi.org/10.1080/23311843.2016.1196472
54
Dhir B., Sharmila P., Saradhi P.P., Nasim S.A., 2009. Physiological and antioxidant responses of Salvinia natans exposed to chromium-rich wastewater. Ecotoxicol. Environ. Saf. 72, 1790-1797. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2009.03.015
Ding H., Wang G., Lou L., Lv J. 2016. Physiological responses and tolerance of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) exposed to chromium. Ecotoxicol Environ Saf. 133, 509-518. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2016.08.007.
Diwan H., Khan I., Ahmad A., Iqbal M., 2010. Induction of phytochelatins and antioxidant defence system in Brassica juncea and Vigna radiata in response to chromium treatments. Plant Growth Regul 61, 97. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-010-9454-0.
Farah M.A., Ali M.A., Chen S.M., Li Y., Al-Hemaid F.M., Abou-Tarboush F.M., Al-Anazi K.M., Lee J., 2016. Silver nanoparticles synthesized from Adenium obesum leaf extract induced DNA damage, apoptosis and autophagy via generation of reactive oxygen species. Colloids Surf. B. Biointerfaces 141, 158–169. DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2016.01.027
Fischer R.A.; Turner N.C., 1978. Plant productivity in arid and semiarid zones. Ann. Rev. Plant Physiol. 29, 277-317. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.pp.29.060178.001425
Foyer C.H., Noctor G., 2011. Ascorbate and glutathione: the heart of the redox hub. Plant Physiol. 155, 2-18. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.110.167569
Giannopolitis C.N., Ries S.K., 1977. Superoxide dismutases I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 59, 309–314. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.59.2.309
Gomes M.A.C., Hauser-Davis R.A., Suzuki M.S., Vitória A.P. 2017. Plant chromium uptake and transport, physiological effects and recent advances in molecular investigations. Ecotoxicol Environ Saf. 140, 55-64. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.01.042
Han F.X., Su Y., Sridhar B.B.M., Monts D.L., 2004. Distribution, transformation and bioavailability of trivalent and hexavalent chromium in contaminated soil Plant Soil. 265, 243. DOI: https://doi.org/10.1007/s11104-005-0975-7
Hasan M.K., Cheng Y., Kanwar M.K., Chu X.-Y., Ahammed G.J., Qi Z.-Y. 2017. Responses of plant proteins to heavy metal stress—A review. Front. Plant Sci. 8, 1492. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01492
Havir, E. A., Mchale, N. A. 1987. Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves. Plant Physiol. 84, 450-455. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.84.2.450
Hayat S., Khalique G., Irfan M., Wani A.S., Tripathi B.N., Ahmad A., 2012. Physiological changes induced by chromium stress in plants: an overview. Protoplasma. 249, 599–611. DOI: https://doi.org/10.1007/s00709-011-0331-0.
55
Herrmann L., Felbinger C., Haase I., Rudolph B., Biermann B., Fischer M., 2015. Food Profiling: Characterization of the Ecuadorean Type CCN-51 of Theobroma cacao L. using microsatellite markers. J. Agric. Food Chem. 63, 4539-44. DOI: https://10.1021/acs.jafc.5b01462
Hossain M.A., Piyatida P., da Silva J.A.T., Fujita M., 2012. Molecular mechanism of heavy metal toxicity and tolerance in plants: central role of glutathione in detoxification of reactive oxygen species and methylglyoxal and in heavy metal chelation. J. Bot. 1–37. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2012/872875
Kabata-Pendias, A., 2011. Trace elements in soils and plants. CRC Press, Boca Ratón, Florida. 561.
Khedr A.H., Abbas M.A., Wahid A.A., Quick W.P., Abogadallah G.M., 2003. Proline
induces the expression of salt‐stress‐responsive proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt‐stress. J Exp Bot. 54, 2553–2562. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/erg277
Li F., Vierstra R.D. 2012. Autophagy: a multifaceted intracelular system for bulk and selective recycling. Trends Plant Sci. 17, 526–537. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2012.05.006
Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R., 1983. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in diferente solventes. Biochem Soc Trans., 11, 591-592, DOI: 10.1042/bst0110591
Liu Y., Bassham D.C. 2012. Autophagy: pathways for self-eating in plant cells. Annu Rev Plant Biol. 63, 215–237. DOI: 10.1146/annurev-arplant-042811-105441
Livak, K.J., Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods, 25, 402–408. DOI: https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
Lopez-Luna J., Gonzalez-Chavez M., Esparza-Garcia F., Rodriguez-Vazquez R., 2009. Toxicity assessment of soil amended with tannery sludge, trivalent chromium and hexavalent chromium, using wheat, oat and sorghum plants. J. Hazard. Mater. 163, 829-834. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2008.07.034.
Mangabeira P.A., Ferreira A.S., Almeida A.-A.F., Fernandes V.F., Lucena E., Souza V.L., Santos Júnior A.J., Oliveira A.H., Grenier-Loustalot M.F., Barbier F., 2011. Compartmentalization and ultrastructural alterations induced by chromium in aquatic macrophytes. Biomet. Int. J. Role Met. Ions Biol. Biochem. Med. 24, 1017-1026. DOI: https://doi.org/10.1007/s10534-011-9459-9
Minina E.A., Bozhkov P.V., Hofius D., 2014. Autophagy as initiator or executioner of cell death Trends Plant Sci. 19, 692-7. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2014.07.007
Mittler R., 2017. ROS Are Good. Trends Plant Sci. 22, 11-19. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2016.08.002
56
Mourato M., Reis R., Martins L.L., 2012. Characterization of plant antioxidative system in response to abiotic stresses: A focus on heavy metal toxicity. In: Montanaro G., (Ed.), Advances in Selected Plant Physiology Aspects. InTech, DOI: 10.5772/34557.
Nakano Y., Asada K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867–880. DOI: https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.pcp.a076232
Oliveira H., 2012. Chromium as an environmental pollutant: insights on induced plant toxicity. J. Bot. Article. ID 375843. http://dx.doi.org/10.1155/2012/375843.
Paiva L.B., de Oliveira J.G., Azevedo R.A., Ribeiro D.R., da Silva M.G., Vitỏria A.P., 2009. Ecophysiological responses of water hyacinth exposed to Cr3+ and Cr6+. Environ Exp Bot. 65, 403–409. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2008.11.012
Panda S.K., Choudhury S., 2005. Chromium stress in plants. Braz. J. Physiol. 17, 95–102. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S1677-04202005000100008
Pandey V., Dixit V., Shyam R. 2009. Chromium effect on ROS generation and detoxification in pea (Pisum sativum) leaf chloroplasts. Protoplasma 236, 85-95. DOI: https://doi.org/10.1007/s00709-009-0061-8.
Patnaik A.R., Achary V.M.M., Panda B.B., 2013. Chromium (VI)-induced hormesis and genotoxicity are mediated through oxidative stress in root cells of Allium cepa L. Plant Growth Regul. 71, 157-170. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-013-9816-5
Pirovani C.P., Carvalho H.A.S., Machado R.C.R., Gomes D.S., Alvim F.C., Pomella A.W.V., Gramacho K.P., Cascardo J.C.D.M., Pereira G.A.G., Micheli F., 2008. Protein extraction for proteome analysis from cacao leaves and meristems, organs infected by Moniliophthora perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease. Electrophoresis 29, 2391–2401. DOI: 10.1002/elps.200700743
Poschenrieder C., Cabot C., Martos S., Gallego B, Barceló J., 2013. Do toxic ions induce hormesis in plants? Plant Sci. 212, 15-25. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2013.07.012
Prasad A., Singh A.K., Chand S., Chanotiya C., Patra D., 2010. Effect of chromium and lead on yield, chemical composition of essential oil, and accumulation of heavy metals of mint species. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 41, 2170-2186. DOI: https://doi.org/10.1080/00103624.2010.504798
Rehem B.C., Almeida A.-A.F., Santos I.C., Gomes F.P., Pirovani C.P., Romero P., Botía P., 2011. Daily and seasonal patterns of leaf water relations and gas exchange of regulated deficit-irrigated almond trees under semiarid conditions. Environ. Exp. Bot. 56, 158–173. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.envexpbot.2005.01.012.
Rehem, B.C.; Almeida, A-A.F.; Santos, I.C.; Gomes, F.P.; Pirovani, C.P.; Mangabeira, P.A.O.; Corrêa, R.X.; Yamada, M.M.; Valle, R.R., 2011. Photosynthesis, chloroplast ultrastructure, chemical composition and oxidative stress in Theobroma cacao hybrids with the lethal gene Luteus-Pa mutante.
57
Photosynthetica 49 (1), 127-139. DOI: DOI: 10.1007/s11099-011-0021-3
Reis G.S.M., Almeida A.-A.F., Almeida N.M., Castro A.V., Mangabeira P.A.O., Pirovani C.P., 2015. Molecular, Biochemical and ultrastructural changes induced by Pb toxicity in seedlings of Theobroma cacao L. PLoS ONE 10, e 0129696. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129696
Rodriguez E., Azevedo R., Fernandes P., Santos C., 2011. Cr (VI) induces DNA damage, cell cycle arrest and polyploidization: a flow cytometric and comet assay study in Pisum sativum. Chem. Res. Toxicol. 24, 1040-1047. DOI: 10.1021/tx2001465.
Santana K.B., de Almeida A.-A.F., Souza V.L., Mangabeira P.A.O., Silva D.D., Gomes F.B., Dutruch L., Loguercio L.L., 2012. Physiological analyses of Genipa americana L. reveals a tree with ability as phytostabilizer and rhizofilterer of chromium ions for phytoremediation of polluted watersheds. Environ Exp Bot 80,35–42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2012.02.004
Scoccianti V., Bucchini A.E., Lacobucci M., Ruiz K.B., Biondi S., 2016. Oxidative stress and antioxidant responses to increasing concentrations of trivalent chromium in the Andean crop species Chenopodium quinoa Willd. Ecotoxicol. Environ. Saf. 133, 25-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2016.06.036
Shahid M., Shamshad S., Rafiq M., Khalid S., Bibi I., Niazi N.K., Dumat C., Rashid M.I. 2017. Chromium speciation, bioavailability, uptake, toxicity and detoxification in soil-plant system: A review. Chemosphere. 178, 513-533. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.03.074
Shanker A.K., Cervantes C., Loza-Tavera H., Avudainayagam S., 2005. Chromium toxicity in plants. Environ. Int. 31, 739-753. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envint.2005.02.003
Singh H.P., Mahajan P., Kaur S., Batish D.R., Kohli R.K., 2013. Chromium toxicity and tolerance in plants. Environ. Chem. Lett. 11, 229–254. DOI: https://doi.org/10.1007/s10311-013-0407-5
Souza L.V., Almeida A.-A.F., Souza J.S., Mangabeira P.A.O., Jesus R.M., Pirovani C.P., Ahnert D., Baligar V., Loguercio L.L., 2014. Altered physiology, cell structure, and gene expression of Theobroma cacao seedlings subjected to Cu toxicity. Environ. Sci. Pollut. Res. 21, 1217. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-013-1983-4
Souza Júnior J.O., Carmello Q.A.C., Sodré G.A., 2011. Substrato e adubação fosfatada para a produção de mudas clonais de cacau. Rev. Bras. Ciênc. Solo [online]. 35, 151-159. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832011000100014.
Srivastava V., Sarkar A., Singh S., Singh P., de Araujo A.S.F., Singh R.P., 2017. Agroecological responses of heavy metal pollution with special emphasis on soil health and plant performances. Front. Environ. Sci. 5,64. DOI: https://doi: 10.3389/fenvs.2017.00064.
58
Taiz L., Zeiger E., Møller I.M., Murphy A. 2017. Fisiologia e desenvolvimento, 6. ed. – Porto Alegre : Artmed.
Tang J., Xu J., Wu Y., Li Y., Tang Q., 2012. Effects of high concentration of chromium stress on physiological and biochemical characters and accumulation of chromium in tea plant (Camellia sinensis L.) Afr. J. Biotechnol. 11, 2248-2255 DOI: 10.5897/AJB11.2402
Torres C.A., Andrews P.K., Davies N.M., 2006. Physiological and biochemical responses of fruit exocarp of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) mutants to natural photo-oxidative conditions J Exp Bot. 57, 1933-47. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/erj136
Tripathi B.N., Singh V., Ezaki B., Sharma V., Gaur J.P., 2013. Mechanism of Cu-and Cd-induced proline hyperaccumulation in Triticum aestivum (wheat). J. Plant Growth Regul. 32, 799–808. DOI: https://doi.org/10.1007/s00344-013-9343-7
UdDin I., Bano A., Masood S., 2015. Chromium toxicity tolerance of Solanum nigrum L. and Parthenium hysterophorus L. plants with reference to ion pattern, antioxidation activity and root exudation. Ecotoxicol. Environ. Saf. 113, 271-278. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2014.12.014
Vaahtera L. Brosché M., Wrzaczek M., Kangasjärvi J., 2014. Specificity in ROS signaling and transcript signatures. Antioxid. Redox Signal. 21, 1422–1441. DOI: 10.1089/ars.2013.5662
Vicent J.B., 2017. New Evidence against chromium as an essential trace element. J Nutr. 147, 2212-2219. DOI: 10.3945/jn.117.255901.
Yanus R.L., Sela H., Borojovich E.J.C., Zakon Y., Saphier M., Nikolski A., Gutflais E., Lorber A., Karpas Z., 2014. Trace elements in cocoa solids and chocolate: an ICPMS study. 119, 151-4. DOI: https://doi.org/10.1016/j.talanta.2013.10.048
Zheng L., Peer T., Seybold V., Lütz-Meindl, U. 2012. Pb-induced ultrastructural alterations and subcellular localization of Pb in two species of Lespedeza by TEM-coupled electron energy loss spectroscopy. Environ. Exp. Bot. 77, 196–206. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2011.11.018
59
3. CAPÍTULO 2
(Artigo redigido conforme normas do periódico “Ecotoxicology and
Environmental Safety”)
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS, ULTRAESTRUTURAIS, BIOQUÍMICAS E
MOLECULARES DE PLANTAS JOVENS DE CACAU À TOXICIDADE DE Cr (VI)
NO SOLO.
Junea Leandro do Nascimentoa; Alex-Alan Furtado de Almeidaa,*; Joedson P.
Barrosoa; Ivanildes C. dos Santosa; Pedro A.O. Mangabeiraa; Dário Ahnerta; Artur
G.R. Souzaa; Virupax C. Baligar b
a State University of Santa Cruz, Department of biological sciences, Rodovia Jorge
Amado, km 16, 45662-900, Ilhéus, BA, Brazil b USDA-ARS-Beltsville Agricultural Research Center Beltsville, MD, USA
*Corresponding author.
E-mail addresses: [email protected] (A.-A. Furtado de Almeida).
60
RESUMO
A toxicidade por Cr6+ promove vários desequilíbrios fisiológicos, bioquímicos e ultraestruturais nas plantas, sendo considerado carcinogênico para os seres humanos e um grave contaminante ao meio ambiente. A detecção de resíduos de Cr em amêndoas e subprodutos de Theobroma cacao têm sido relatados. O objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade de Cr em plantas jovens do genótipo de cacau CCN 51 em diferentes concentrações de Cr6+ no solo (0, 20, 40,60 e 80 mg kg-1) através de alterações fisiológicas, ultraestruturais, antioxidantes e moleculares. O aumento da concentração de Cr6+ no solo alterou severamente as trocas gasosas foliares (PN, gs e E) em todos os tratamentos nas primeiras 24h de exposição ao metal, com menor recuperação as 96h apenas na maior dose avaliada. Os danos à maquinaria fotossintética foram evidenciados pela redução da fixação de CO2 devido a menor gs e a repressão de genes psbA e psbO nas doses mais elevadas de Cr6+ no solo. Alterações no conteúdo de pigmentos fotossintéticos no sistema antioxidante celular e danos ultraestruturais no cloroplasto também foram observados. Como estratégia de tolerância ao Cr6+ no solo, em média, 97% do Cr total acumulado pelas plantas de cacau foi estabelecida na raíz, com baixa mobilidade para a parte aérea. Contudo, alterações ultraestruturais no mesofilo foliar e nas raízes, devido a toxicidade do Cr6+ no solo, evidenciado pela deposição de material eletrodenso, promoveram, destruição de mitocôndrios, desorganização das membranas tilacóides e deformação de cloroplastos em folhas. Além de condensação de cromatina, deformações na carioteca e plasmólise nas raízes. Foram observados danos ao sistema antioxidativo, nas primeiras 96 h de avaliação, evidenciados pela redução da atividade das enzimas SOD, CAT e GR, além do aumento da peroxidação lipídica. Além disso, o aumento da expressão de sod cyt não foi suficiente para ativar a produção de SOD ocasionando alterações na homeostase redox nas células, no período avaliado. Repressão da expressão de Phyt paralela a baixa ativação de GR pode evidenciar redução da tolerância à toxicidade de Cr6+. Por outro lado, a ativação da APX e GPX em todos os horários de avaliação, aliado ao aumento da concentração de prolina nas maiores doses de Cr6+ no solo durante e após 24 h de exposição ao metal foram os principais responsáveis pela desintoxicação de ROS nas plantas de cacau. Concluiu-se, portanto, que tolerância das plantas clonais de cacau CCN 51 à toxicidade de Cr6+
depende da concentração e do tempo de exposição ao metal. A maior dose de Cr6+ no solo promoveu danos irreversíveis na maquinaria fotossintética e na ultraestrutura celular, interferindo nos sistemas enzimáticos e não enzimáticos relacionados ao estresse oxidativo e na expressão gênica.
Palavras-Chave: Theobroma cacao; TEM; Peroxidação lipídica; Extresse oxidativo;
Prolina; Metalotioneína.
61
1. INTRODUÇÃO
O Cromo (Cr) é considerado o segundo metal, mais abundante, presente na
água subterrânea, em sedimentos e no solo agrícola (Singh, et. al., 2013). Isto se
deve ao fato da sua vasta aplicação industrial como a produção de ligas e aço
inoxidável, couro, pigmentos (Hasan et al., 2017), além da utilização de fertilizantes
químicos e lodos de esgoto (Hayat et al., 2012; Srivastava et al., 2017). A
biodisponibilidade de Cr para as plantas é afetata por fatores como a concentração e
a especiação química do metal no solo, a composição, a textura e o pH do solo, a
espécie e o genótipo vegetal (Srivastava et al., 2017). No solo, Cr é encontrado
principalmente em duas formas estáveis, a trivalente Cr3+ (imobilizada) e a
hexavalente Cr6+ (móvel), considerada a mais tóxica (Martínez-Trujillo; Carreón-
Abud, 2015). A incapacidade de retenção do Cr6+ pelos constituintes do solo, em
função da carga negativa de suas superfícies, é responsável pela alta mobilidade do
Cr6+. Além disso, o Cr6+ é altamente solúvel em água e prontamente absorvido pelas
plantas (Dhal et al., 2013). Por outro lado, o Cr6+ é um elemento não essencial no
metabolismo plantas e por este motivo não existem mecanismos específicos de
absorção (Oliveira, 2012). Contudo, pode ser absorvido juntamente com outros
elementos essenciais através de transportadores de sulfato promovendo vários
desequilíbrios fisiológicos, bioquímicos e ultraestruturais nas plantas (Hayat et al.,
2012; Singh et al., 2013). Os oxiânions de Cr6+ são considerados carcinogênicos
para humanos e contaminantes prioritários do ecossistema (Prado et al., 2016).
A toxicidade de Cr6+ exerce uma ampla gama de efeitos tóxicos no
crescimento e metabolismo das plantas (Singh et al., 2013). Sua acumulação
interfere nos processos fisiológicos e bioquímicos, reduzindo o acúmulo de
biomassa, inibindo a fotossíntese e a respiração, degradando pigmentos
cloroplastídicos, interferindo na absorção mineral e promovendo danos irreversíveis
às estruturas celulares, podendo levar a planta a senescência (Ding et al., 2016;
Mangabeira et al., 2011; Scoccianti et al., 2016). Além disso, o Cr6+ tem alto
potencial redox atuando como oxidante, e sua redução intracelular para a forma
menos tóxica Cr3+ (Santana et al., 2012) aumenta a geração de espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Bashri et al., 2016; Singh et al., 2013), induzindo o estresse
62
oxidativo, promovendo redução da homeostase celular e peroxidação lipídica
(Shahid et al., 2017).
As ROS, tais como radicais superóxido (O2-•), peróxido de hidrogênio (H2O2),
radicais hidroxílicos (OH•) e oxigênio singleto (1O2), formam-se naturalmente, em
pequenas quantidades, nos cloroplastos, mitocôndrios e peroxissomos, como
subprodutos do metabolismo aeróbio (Choudhury et al., 2013; Taiz et al., 2017).
Além disso, as ROS atuam como sinalizadores biológicos na regulação de estresses
(Hossain et al., 2012). Para se protegerem do estresse oxidativo, diante de uma
superprodução de ROS, as plantas desenvolveram um sistema antioxidante
complexo, como um mecanismo de eliminação e desintoxicação de ROS, visando
manter a homeostase celular. Superóxido dismutase (SOD, CE 1.15.1.1), peroxidase
do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11) peroxidase do guaicol (GPX, EC 1.11.1.7),
catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e redutase da glutationa (GR, EC 1.8.1.7), são as
principais enzimas antioxidativas analisadas em plantas sob estresse (Gomes et al.,
2017; Shahid et al.,2017). Por outro lado, a ativação da síntese e acumulação de
aminoácidos livres como a prolina, tem sido relatado como um agente antioxidante
não enzimático, frente ao estresse por Cr6+ (Prado et al., 2012). A prolina possui
múltiplas funções, tais como regulador da pressão osmótica, redutor de radicais
livres, estabilizador de enzimas, de membranas e de estruturas protéicas. Além
disso, a prolina mantém o pH citosólico ajudando a equilibrar o estado de reações
redox da célula (Aslan et al., 2017).
Outro mecanismo adotado pelas plantas de desintoxicação a metais pesados
é a quelação dos íons metalicos utilizando fitoquelatina e metalotioneína (Hasan et
al., 2017). As fitoquelatinas, induzidas apenas na presença do metal, são
sintetizadas no citosol utilizando como substrado a glutationa reduzida (GSH) pela
ativação da síntese da fitoquelatina sintetase (Phyt). Geralmente, em altas
concentrações de metais pesados, sua síntese é ativada rapidamente (Hasan et al.,
2017; Yadav, 2010). Por outro lado, as metalotioneínas (Mt2b) são uma família de
proteínas de baixo peso molecular, que apresentam uma forte correlação entre sua
expressão e a concentração de metais no ambiente, devido à alta afinidade por íons
metálicos. As metalotioneínas são produtos da tradução de mRNA e são expressas
em resposta a diferentes tipos de estresses abióticos (Gomes et al., 2017; Hasan et
al., 2017). As fitoquelatinas e as metalotioneínas formam complexos com íons
63
metálicos tóxicos no citosol e posteriormente os transportam para a vacúolo,
imobilizando-o (Gomes et al., 2017; Shahid et al.,2017). Portanto, protejem as
plantas proporcionando resistência ao efeito deletério dos metais pesados,
restringindo sua acumulação na parte aérea das plantas (Yadav, 2010).
Recentemente foram detectados a presença de Cr e vários outros metais
pesados em amêndoas e subprodutos de cacau, como a manteiga de cacau, o
cacau em pó e o chocolate (Arévalo-Gardini et al., 2017; Yanus et al., 2014). No
produto final, uma correlação linear positiva entre concentração de Cr nas amêndoas
com seu teor nos subprodutos de cacau foi relatada (Yanus et al., 2014). Theobroma
cacao L., originário das florestas tropicais da América do Sul, é uma espécie
economicamente importante, devido suas amêndoas serem exploradas
comercialmente para a fabricação de licor de cacau, manteiga de cacau e chocolate,
dentre outros (Almeida; Valle, 2009). Devido ao seu alto teor de polifenóis
responsáveis pelas propriedades antioxidantes do cacau, seu consumo moderado é
indicado por promover diversos benefícios para a saúde (Arévalo-Gardini et al.,
2017; Bertoldi et al., 2016). O cultivo do clone de cacau “Colección Castro Naranjal
51” (CCN-51) nos ultimos anos aumentou entre os produtores de cacau devido sua
maior produtividade e resisitência as doenças e variações climaticas (Boza et al.,
2014; Herrmann et. al., 2014).
O objetivo deste trabalho foi descrever os principais mecanismos de defesa ao
estresse por Cr6+ em plantas clonais do genótipo de cacau CCN 51 cultivadas em
solo como substrato. Contribuir para elucidar o processo de intoxicação, visando
reduzir os riscos à saúde devido ao acúmulo de Cr nas plantas de T. cacao e
consequente a contaminação da cadeia alimentar por este metal. Examinamos (i) as
alterações fisiológicas em plantas após exposição a diferentes concentrações de
Cr6+, (ii) exploramos a absorção e translocação de Cr, (iii) alterações na
ultraestrutura celular de folhas e raízes; (iv) o papel da atividade antioxidante celular
(enzimática e não enzimática) na proteção das plantas contra a toxicidade de Cr6+;
(v) a expressão de genes associados à biossíntese de proteínas envolvidas no
metabolismo antioxidante e na quelação de metais. Os resultados podem ser usados
em futuros programas de melhoramento genético.
64
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Material vegetal e condições de cultivo
O experimento foi conduzido em casa de vegetação na Universidade Estadual
de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (14°47′ S, 39°13′ W) no período de 24
de Julho de 2015 a 14 de Janeiro de 2016. Plantas clonais do genótipo de cacau
CCN 51 foram cultivadas em solo arenoso como substrato em vasos com
capacidade de 15 L. O solo foi previamente corrigido (pH 5.6) e as plantas foram
fertilizadas durante o plantio e quinzenalmente em cobertura, após o plantio. A
caracterização do solo e a adubação recomendada foram descritas (Tabela S1). Os
tratamentos sem adição de Cr6+ (controle) e com adição de Cr6+ foram aplicados na
forma de dicromato de potássio (K2Cr2O7), nas concentrações de 20, 40, 60 e 80 mg
Cr6+ kg-1 de solo (Amin et al., 2013; Yadav et al., 2010). As plantas foram obtidas a
partir do enraizamento de estacas caulinares de extremidades de ramos
plagiotrópicos, retirados de plantas matrizes com 5 a 10 anos de idade, no Instituto
Biofábrica de Cacau (IBC, Banco do Pedro, Ilhéus, BA). Os tratamentos com as
concentrações de Cr6+ (20, 40, 60 e 80 mg kg-1 solo) foram aplicados em solução
(100 mL por vaso) no dia 14/12/2015, em plantas de T. cacao de um ano de idade.
Durante o período de aclimatação [24/07/2015 a 13/12/2015] e no período de
exposição aos tratamentos com Cr6+ [14/12/2015 a 13/01/2016], as plantas foram
irrigadas com água de chuva, visando manter o solo próximo a capacidade de
campo. Durante o período experimental foram registrados a radiação
fotossinteticamente ativa (PAR) utilizando sensores de radiação luminosa S-LIA-
M003 acoplados a estação climatológica Hobo Micro Station Data Logger (Onset
Coputer, Massachusetts, EUA), e temperatura (TºC) e umidade relativa do ar
[RH(%)] por meio de sensores Hobo H8 Pro (Onset, Coputer, Massachusetts, EUA)
para caracterização dos ambientes de cultivo (Fig. S1).
65
Fig. S1. Condições microclimáticas dentro da casa de vegetação. (A) Valores diários da radiação fotossinteticamente ativa (PAR); (B) temperatura do ar (T) em graus célsius e umidade relativa do ar (RH).
66
Tabela 1. Características físicas e químicas do solo de crescimento das plantas jovens de T. cacao e fertilização de plantio e cobertura. P, Na, K, Fe, Zn, Mn e Cu (extraídos por Mehlich 1), Ca, Mg e Al (extraídos por KCl, 1 M), H + Al (extraído por acetato de cálcio 0.5 M, pH 7.0), B (extraído por agua quente) e S (extraído por fosfato monocálcico em ácido acético). SB, soma de bases; t, capacidade de troca catiônica efetiva; T, capacidade de troca catiônica (pH 7.0); V, saturação por bases; m, saturação por Al; OM, matéria orgânica = Org C. × 1.724; P-rem, fósforo remanescente.
Physical and chemical characteristics soil
pH --- 5.1 K [mg (dm
3)-1
] 29.0 P [mg (dm
3)-1
] 10.4
Na [mg (dm3)-1
] --- Zn [mg (dm
3)-1
] 2.2 Fe [mg (dm
3)-1
] 165.0 Mn [mg (dm
3)-1
] 23.7 Cu [mg (dm
3)-1
] 1.1 B [mg (dm
3)-1
] 0.2 S [mg (dm
3)-1
] 10.9 Ca [cmolc (dm
3)-1
] 1.1 Mg [cmolc (dm
3)-1
] 0.4 Al [cmolc (dm
3)-1
] 0.5 H + Al [cmolc (dm
3)-1
] 3.3 SB [cmolc (dm
3)-1
] 1.5 t [cmolc (dm
3)-1
] 2.0 T [cmolc (dm
3)-1
] 4.8 O.M. (dag kg
-1) 0.5
V (%) 31.5 m (%) 24.8 P-Rem (mg L
-1) 41.0
Sandy --- texture Soil classification --- Type 1 soil Clay (g kg
-1) 79.0
Silt (g kg-1
) 91.0 Coarse sand (g kg
-1) 322.0
Fine sand (g kg-1
) 509.0
Liming (Ca:Mg = 2:1)
CaCO3 (g vaso-1
) 7.4 MgCO3 (g vaso
-1) 3.1
Planting fertilizer
P and N - MAP purified (g vaso-1
) 11.5 K - KCl (mg vaso
-1) 1430.0
B - H3BO3 (mg vaso-1
) 51.5 Cu - CuSO4.5H2O (mg vaso
-1) 88.4
Zn - ZnSO4.7H2O (mg vaso-1
) 263.9 Mo - (NH4)6Mo7O24.4H2O (mg vaso
-1) 4.1
Cover fertilizer
K - KCl (mg vaso-1
) 146.5 S - K2SO4 (mg vaso
-1) 163.1
N - Urea (mg vaso-1
) 667.0
67
2.2. Trocas gasosas foliares
Durante o período experimental, a taxa fotossintética líquida por unidade de área
foliar (PN), a condutância estomática ao vapor de água (gs) e a transpiração foliar (E)
foram monitoradas ao 1, 4, 8, 15, 21 e 28 dias após aplicação dos tratamentos
(AAT), em uma folha completamente expandida e madura. Foram avaliadas três
plantas por tratamento, entre 7 e 11 h, por meio de um sistema portátil de medição
de fotossíntese LI-6400 (Li-Cor, Nebraska, EUA), equipado com uma fonte de luz
artificial 6400-02B RedBlue. Durante as medições o valor de PAR foi fixado em 800
μmol fótons m-2 s-1, acima da irradiância de saturação sem que haja fotoinibição, e a
temperatura da folha em 26 ºC. As leituras foram registradas no intervalo de 2-3 min
(coeficiente de variação < 0.3%). Os valores de PN, gs e E foram utilizados para o
cálculo da eficiência intrínseca (WUEi) e eficiência instantânea de uso da água
(WUE).
2.3. Pigmentos Fotossintéticos
Folhas maduras (2ª ou 3ª a partir do ápice) das plantas dos diversos tratamentos
avaliados foram coletadas 4 dias AAT. Imediatamente após, foram imersas em
nitrogênio líquido, armazenadas em ultrafreezer - 80ºC e posteriormente liofilizadas.
Posteriormente, 50 mg de tecido foliar foram maceradas em nitrogênio líquido,
transferidas para tubos eppendorf e adicionado 2 mL de acetona a 80% para a
extração dos pigmentos fotossintéticos, segundo metodologia descrita por Torres et
al., (2006). As absorbâncias dos extratos foram determinadas em espectrofotômetro
de microplacas (SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader, Molecular
Device, USA), nos comprimentos de onda correspondentes a 646 nm, 663 nm e 470
nm, para a determinação das concentrações de clorofila a (Chl a), clorofila b (Chl b)
e carotenoides (Car), respectivamente, utilizando as equações descritas por
Lichtenthaler e Wellburn (1983) para extratos de acetona a 80%.
2.4. Determinação Cr total
Aos 30 dias AAT, a concentração do Cr total foi determinada nas folhas e
raízes dos tratamentos sem e com Cr6+ nas doses de 20, 40 e 60 mg kg-1 solo e aos
68
4 AAT na dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo. Foram coletadas 10 plantas por tratamento e
separadas em raízes e folhas. As raízes foram submetidas à seguinte sequencia de
lavagem: água corrente, solução de detergente neutro a 0.1%, água destilada, HCl a
3% e água destilada (Souza Junior et al., 2011), visando a eliminação de metais na
superfície das raízes e no espaço livre aparente. Logo após, as plantas foram
acondicionadas em sacos de papel e levadas a estufa de circulação forçada de ar a
70º C até atingirem massa constante. Posteriormente, o material vegetal seco e
moído foi submetido à digestão nitro-perclórica (3:1 v.v.). Após a digestão, o Cr total
foi determinado em um Inductively-Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer
(ICP-OES), modelo Varian 710-ES (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
2.5. Metabolismo Antioxidativo
Os ensaios enzimáticos foram realizados em tecido foliar (2ª ou 3ª a partir do
ápice) coletado nos intervalos de 3, 6, 12, 24, 48 e 96 h AAT. Imediatamente após a
coleta, as folhas foram imersas em nitrogênio líquido, armazenados em ultrafreezer -
80ºC e posteriormente liofilizadas. A atividade das enzimas peroxidase do guaiacol
(GPX, EC 1.11.1.7), peroxidase do ascorbato (APX, EC 1.11.1.11), dismutase do
superóxido (SOD, EC 1.15.1.1), catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e redutase da
glutationa (GR, EC 1.8.1.7) foram determinadas de acordo com Pirovani et al.
(2008), Nakano e Asada (1981), Gianopolitis e Ries (1977), Havir e Mchale (1987),
Carlberg e Mannervik (1985), respectivamente.
2.6. Peroxidação Lipídica
A peroxidação lipídica foi obtida pela determinação do teor de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), principalmente malondialdeído (MDA),
realizada de acordo com o protocolo descrito por Cakmak e Horst (1991), com
algumas modificações (Souza et al., 2013). Utilizou-se parte das amostras foliares
coletadas e liofilizadas para a determinação do metabolismo antioxidativo. A leitura
da absorbância foi realizada em comprimentos de onda de 532 e 600 nm em
espectofotômetro de microplacas (SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate
Reader, Molecular Device, USA). A correção para turbidez inespecífica foi feita pela
69
subtração da absorbância a 600 nm. A concentração de TBARS foi calculada
utilizando o coeficiente de absortividade para o MDA de 155 mM cm-1.
2.7. Prolina
A prolina livre nas folhas das plantas dos diversos tratamentos foi extraída
pelo método do ácido sulfossalicílico e determinada em espectrofotômetro em
comprimento de onda de 520 nm, segundo protocolo descrito por Bates et al. (1973),
com modificações (Khedr et al., 2003). Foi utilizada parte das amostras foliares
coletadas e liofilizadas para a determinação do metabolismo antioxidativo. Após
maceradas em nitrogênio liquido, as amostras foram pesadas em tubos de 2 mL,
sendo 50 mg do tratamento controle e 15 mg dos tratamentos com Cr6+. Logo após,
foi adicionado em cada tubo 1 mL de ácido sulfossalicílico a 3%, seguido de
agitação em vortex e de centrifugação a 10000 g por 10min. Imediatamente após,
coletou-se 0.2 mL do extrato bruto (sobrenadante) e transferiu para tubos de ensaio
de vidro com tampa rosqueada, que continham 0.2 mL de ninhidrina ácida e 0.2 mL
de ácido acético glacial concentrado. Em seguida, os tubos foram fechados,
agitados em vortex e incubados em banho-maria a 100ºC por 1 h. Após esse
período, a reação foi interrompida em gelo. Imediatamente após, foram adicionados
em cada tubo 1,5 mL de tolueno, seguido de agitação em vortex por 20 s, para
separação das fases. Após a solução atingir a temperatura ambiente, recuperou-se
a fase aquosa superior (cromóforo + tolueno), com auxílio de pipeta de Pasteur de
vidro, e a transferiu para uma microcubeta de quartzo, para leitura em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 520 nm. Os valores da concentração
de prolina foram obtidos por uma curva de calibração y= 0.219x – 0.0163 (onde: y=
absorbância; x= concentração de prolina; R2= 0.996). Os resultados foram expressos
em µmoles g-1 DW.
2.8. PCR quantitativo em tempo real
A partir dos resultados das análises do metabolismo antioxidativo,
peroxidação lipídica e prolina foram selecionados dois intervalos de coleta [24 h e 96
h AAT], onde foram observadas as maiores respostas destas variáveis nos diversos
70
tratamentos, para a realização da análise da expressão gênica. O estudo da
expressão gênica foi realizado por PCR em tempo real utilizando pares de primers
de genes específicos descritos por (Araujo et al., 2017), relacionados à biossíntese
das proteínas do fotossistema 2 (PSII) da fase fotoquímica da fotossíntese (psbA e
psbO), as enzimas antioxidativas (Cu–Zn sod cyt e Cu–Zn sod chl), a biossíntese do
polipeptídeo metalotioneína (Mt2b) e a biossíntese da sintase da fitoquelatina (phyt).
Utilizou-se, para análise de expressão gênica, parte das amostras foliares
coletadas e liofilizadas para a determinação da atividade das enzimas envolvidas no
metabolismo antioxidativo. Amostras dos tratamentos sem e com Cr6+, nas doses de
20, 40, 60 e 80 mg kg-1 de solo, de cada intervalo selecionado, foram maceradas em
nitrogênio líquido e pesada, aproximadamente, 20 mg de tecido de cada amostra
foliar. Para extração de RNA foi utilizado o kit RNAqueous® (Ambion), seguindo as
recomendações do fabricante. As amostras de RNA foram tratadas com DNase I
(Thermo Scientific) e incubadas a 37ºC por 30 min, seguido pela adição de EDTA a
50mM e incubados a 65ºC por 10min. A qualidade do RNA foi avaliada por
eletroforese em gel de agarose a 1% e a quantificação de RNA, expressa em µg mL-
1, foi realizada em espectrofotômetro (NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer
Thermo Scientific,), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.
As amostras de RNA tratadas com Dnase I foram utilizadas para a síntese do
cDNA utilizando o High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, CA, EUA),
de acordo com as instruções do fabricante. As reações foram incubadas a 37ºC por
60 min, 95ºC por 5min e 4ºC por 1 min. Os pares de primers foram desenhados após
a análise de sequências conservadas em T. cacao. A qPCR foi realizada em um
termociclador da “Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System”, usando
sequência de detecção (fluoróforo) não específica SYBR Green I. O mix para a
reação foi composto por 50 ng de cDNA como molde, 5 μM de cada primer e 6.25 μL
de Power SYBR® Green PCR Master Mix. Todas as reações foram realizadas em
três repetições biológicas e duas repetições técnicas. Os números da expressão
relativa dos genes foram calculados como o número de vezes em relação à planta
controle, utilizando o método 2–ΔΔCt (Livak e Schmittgen, 2001), tendo os genes
actina e β-tubulina como referências.
71
2.9. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
As análises ultraestruturais de orgânulos celulares em microscópio eletrônico
de transmissão (MET) foram conduzidas no Centro de Microscopia Eletrônica da
Universidade Estadual de Santa Cruz. Aos 30 dias AAT, extremidades de raízes
primárias e parte mediana de folhas maduras dos tratamentos controle e de Cr6+ na
concentração de 40 mg kg-1 de solo e aos 4 dias AAT na concentração de 80 mg
Cr6+ kg-1 de solo, foram seccionadas, coletadas e prefixadas em glutaraldeído a
2.5%, preparado em tampão cocodilato de sódio a 0.1M (pH 7.2). Posteriormente, as
secções de raízes e folhas foram fixadas em tetróxido de ósmio, preparado no
mesmo tampão por 1 h, seguido por desidratação em série etanólica e incluídas em
resina LR White seguindo metodologia descrita por Castro et al. (2015).
Posteriormente, foram obtidos cortes ultrafinos utilizando ultramicrótomo (Modelo EM
UC6 LEICA Microsystems), que foram depositados em grades de cobre de 300
mesh e analisados em MET Morgani TM-modelo 268 D (FEI Company).
2.10. Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco
tratamentos, 20 plantas por unidade experimental (uma planta por vaso), perfazendo
um total de 100 plantas. Os dados de TBARS, prolina, enzimas e expressão gênica
foram submetidos à análise de variância fatorial two-way (ANOVA), onde o intervalo
de amostragem e tratamentos com Cr6+ foram os fatores principais. ANOVA one-way
foi usada para testar os efeitos do tratamento nas trocas gasosas foliares, pigmentos
fotossintéticos e Cr total. Diferenças significativas entre as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey (p <0,01 ep <0,05) utilizando o software “SISVAR”
versão 5.6. Os dados obtidos são a média ± SE de quatro repetições para análises
de Cr total, atividade enzimática e prolina, três para trocas gasosas foliares e
análises ultraestruturais, cinco para TBARS e seis repetições para os pigmentos
fotossintéticos e expressão genica. Os incrementos nos tratamentos foram
calculados de acordo com Abbott (1925).
72
3. Resultados
3.1. Trocas gasosas foliares
As trocas gasosas foliares das plantas do genótipo de cacau CCN 51 foram
significativamente (p<0.05) afetadas nas primeiras 24 h AAT, em todos os
tratamentos, pela toxicidade de Cr6+ (Fig. 1). Comparadas ao tratamento controle, as
doses de 20, 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo, reduziram em 34%, 77%, 61% e 75% a
taxa fotossintética (PN) (Fig.1A), em 25%, 47%, 54% e 55% a condutância
estomática (gs) (Fig. 1B) e em 25%, 48%, 52% e 56% a transpiração (E) (Fig. 1C),
respectivamente. Aos 4 dias AAT foi observada recuperação da PN nas doses de 20,
40 e 60 mg Cr6+ kg-1 solo. O tratamento com 60 mg Cr6+ kg-1 solo, foi
significativamente superior ao controle, com incremento na PN de 20%, enquanto
que as doses de 20 e 40 mg Cr6+ kg-1 solo foram semelhantes ao controle (Fig.1A).
Por outro lado, na dose correspondente a 80 mg Cr6+ kg-1 solo foi observada
redução sugnificativa na PN no valor 18% quando comparado ao tratamento controle
(Fig.1A). Houve recuperação da gs e da E em todos os tratamentos avaliados com
incrementos de até 46% e 35% (Fig. 1B e 1C), respectivamente. Apesar da
recuperação apresentada pelas plantas do tratamento com 80 mg Cr6+ kg-1 solo, foi
observado baixo índice de sobrevivência (dados não apresentados), assim, o
tratamento na dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo foi finalizado aos 4 dias AAT, seguido de
coleta de material vegetal para as demais análises. Aos 8, 15, 21 e 28 dias AAT
foram observadas poucas diferenças significativas nos valores de trocas gasosas
foliares para as doses de 20, 40 e 60 mg Cr6+ kg-1 solo, quando comparados ao
controle (Fig. 1A, 1B e 1C). As eficiências intrínsecas (WUEi) (Fig. 1D) e
instantâneas (WUE) (Fig. 1E) do uso de água, aos 1, 4 e 8 dias AAT, apresentaram
reduções significativas com o aumento da dose de Cr6+ no solo. Comparadas ao
tratamento controle, para WUEi foram observadas nas doses de 20, 40, 60 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo reduções de até 46%, 33% e 48% (Fig. 1D), e para WUE reduções de
até 45%, 37% e 49% (Fig. 1E), aos 1, 4 e 8 dias AAT respectivamente. Em
contrapartida, pouca diferença significativa foi observada entre os tratamentos aos
15, 21 e 28 dias AAT (Fig. 1D e E).
73
Fig. 1. (A) Taxa fotossintética por unidade de área foliar (PN), (B) condutância estomática ao vapor de água (gs), (C) transpiração (E), (D) eficiência intrínseca do uso da água (WUEi) e (E) eficiência instantânea do uso da água (WUE) em folhas de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas ao estresse por Cr
6+ no solo por 28 dias. Valores médios de quatro repetições biológicas
± SE. Letras maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos pelo teste Tukey (p<0.05).
74
3.2. Pigmentos fotossintéticos
Foram observadas diferenças significativas (p<0.01) para os pigmentos
fotossintéticos avaliados em folhas do genótipo de cacau CCN 51, submetidos a
diferentes doses de Cr6+ no solo (Tabela 1). O teor de Chl a, foi significativamente
inferior na dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo, com redução de 5% quando comparado ao
controle (Tabela 1). Já o teor de Chl b obteve incremento de 21% e 14% nas doses
de 20 e 40 mg Cr6+ kg-1 solo e reduções de 15% e 24% nas doses de 60 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo, respectivamente, diferindo significativamente do tratamento controle
(Tabela 1). Isto, por sua vez, contribuiu para que houvesse variações significativas
para os teores de Chl (a+b) e carotenoides e nas razões Chl (a/b) e car/Chl (a+b).
Foram observados incrementos de 8% e reduções de 13%, para Chl (a+b), nas
doses de 20 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo, respectivamente. Já para os carotenóides foram
observados reduções de 40% e incrementos de 50%, nas doses de 20 e 80 mg Cr6+
kg-1 solo, respectivamente, quando comparados ao tratamento controle (Tabela 1).
3.3. Acumulação de Cr total
A concentração de Cr total nas raízes do genótipo de cacau CCN 51 aumentou
significativamente (p<0.01) com o incremento das doses de Cr6+ no solo (Tabela 1).
O maior acúmulo de Cr total, em média 97%, ocorreu nas raízes,
independentemente de tratamento. A acumulação média de Cr total nas folhas foi de
3%. No tratamento de 80 mg Cr6+ kg-1 solo foi observado as maiores concentrações
de Cr total nas folhas e raízes, cujos valores foram de 997 e 13516 mg Cr kg-1 DW,
respectivamente, sendo significativamente superiores aos demais tratamentos
(Tabela 1).
75
Tabela 1. Teor de pigmentos fotossintéticos em folhas e acúmulo de Cr total nas raízes e folhas de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas
a cinco doses crescentes de Cr6+
no solo. Valores médios de quatro repetições biológicas ± SE. Letras maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos pelo teste Tukey (p<0.01). * Determinados aos 4 dias AAT; ** Determinados aos 30 dias AAT, exceto o tratamento de 80 mg Cr
6+ kg
-1 solo que
foi encerrados aos 4 dias AAT.
Parameter Cr6+ (mg kg-1 soil)
0 20 40 60 80
Pigment (mg kg-1 DW)*
Chl a 2.088±0.008A 2.058±0.006A 2.059±0.010A 2.052±0.018A 1.986±0.037B
Chl b 1.402±0.116BC 1.706±0.129A 1.604±0.153AB 1.188±0.077CD 1.065±0.102D
Chl (a+b) 3.490±0.120BC 3.764±0.123A 3.663±0.148AB 3.240±0.094CD 3.051±0.122D
Chl (a/b) 1.524±0.127BC 1.236±0.119C 1.331±0.151C 1.750±0.109AB 1.916±0.167A
Car 0.334±0.049BC 0.201±0.053D 0.249±0.066CD 0.422±0.029AB 0.503±0.036A
Car/Chl (a+b) 0.098±0.018BC 0.055±0.017D 0.071±0.022CD 0.132±0.013AB 0.167±0.018A
Cr (mg kg-1 DW)**
Leaf 13.23±1.18B 27.60±2.25B 71.75±1.81B 77.02±6.81B 997.38±124.40A
Root 42.85±3.47D 1905.33±79.29C 3596.67±132.56C 8416.67±142.96B 13516.25±915.75A
76
3.4. Análise ultraestrutural do mesofilo foliar e raízes
A aplicação de Cr6+ no solo causou mudanças na ultraestrutura celular do
mesofilo foliar e nas raízes do genótipo clonal de cacau CCN 51 (Fig. 2). No
tratamento controle (Fig. 2A), observou-se no mesofilo foliar núcleo, mitocôndrios,
cloroplastos com grãos de amido e parede celulares normais. Em contrapartida, na
dose de 40 mg Cr6+ kg-1 solo, verificou-se deposição de material eletrodenso no
vacúolo celular (Fig. 2B) e deformação dos cloroplastos com destrição das
membranas tilacóides (Fig. 2C). No mesofilo foliar, na dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo,
foi observado deposição de material eletrodenso no vacúolo (Fig. 2D) e no sistema
vascular, pricipalmente no xilema (Fig. 2E), desorganização das membranas
tilacóides com aumento do espaço intertilacoidal e destruição de mitocôndrios (Fig.
2F). Por outro lado, as células do sistema radicular do tratamento controle
permaneceram intactas (Fig. 2G). Já na dose de 40 mg Cr6+ kg-1 solo, houve
retração do citoplasma devido a plasmólise, além de acúmulo de material
eletrodenso nos vacúolos e na parede celular (Fig. 2H) e no sistema vascular,
principalmente nas células subjacentes ao xilema (Fig. 2I). Enquanto que nas células
radiculares da dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo foram observados ocorrência de
plasmólise, evidenciado pela retração do citoplasma (Fig. 2J) e da membrana
plasmática (Fig. 2L), alteração nos núcleos mostrando condensação da cromatina
(Fig. 2K) e deformação da carioteca como indicativo de núcleo apoptótico (Fig. 2L).
77
Fig. 2. Microfotografias (TEM) de secções transversais do mesofilo foliar (A–F) e das raízes (G-L) de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas a cinco doses crescentes de Cr
6+ no solo.
Folhas: controle (A), 40 mg Cr6+
kg−1
solo (B e C) e 80 mg Cr6+
kg−1
solo (D, E e F). Raízes: controle (G), 40 mg Cr
6+ kg
−1 solo (H e I) e 80 mg Cr
6+ kg
−1 solo (J, K e L). Setas indicam deposição de
material eletrodenso nos vacúolos (B, D, F e H); deposição de material eletrodenso no sistema vascular (E e I); destruição de cloroplasto (C); desorganização das membranas tilacóides, destruição do cloroplasto e do mitocondrio (F); retração do citoplasma (H, J e L); condensação de cromatina (K) e núcleo apoptótico (L). n: núcleo, m: mitocôndrio, cw: parede celular, Chl: cloroplasto, sg: grãos de amido, x: xilema. Bars = 1 μm (A, C, G e K), 2 μm (B, D, E, H e I) e 0.5 μm (F, J e L).
78
3.5. Substâncias reativas ao ácido tiobarbiturico
Foram observadas diferenças significativas (p<0.01) entre as doses crescentes
de Cr6+ aplicadas no solo e o tempo de exposição ao metal, em folhas do genótipo
clonal de cacau CCN 51 (Fig. 3A). Incrementos no teor de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram observados principalmente a partir das 12 h AAT,
quando comparado ao controle (Fig. 3A). Entretanto, 3 h AAT com 20 e 80 mg Cr6+
kg-1 solo ocorreu um aumento significativo (p<0.01) no teor de TBARS de 4% e 29%,
respectivamente, quando comparados ao controle. No intervalo de 12 h, nas doses
de 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo, houveram incrementos de 9%, 11% e 4%,
respectivamente, ao passo que no intervalo de 24 h AAT, as doses de 20, 40, 60 e
80 mg Cr6+ kg-1 solo, obtiveram incrementos de 26%, 41%, 15% e 26%,
respectivamente (Fig. 3A). Já no período de 48 h AAT, houve incrementos de 38% e
9% no teor de TBARS nas doses de 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo. Enquanto que, no
período de 96 h AAT, nas doses de 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo houveram
incrementos de 17%, 46% e 25%, respectivamente, quando comparado ao controle
(Fig. 3A).
3.6. Prolina
O teor de prolina em folhas do genótipo clonal de cacau CCN 51 aumentou
significativamente (p<0.01) com o aumento das doses de Cr6+ aplicadas no solo (Fig.
3B), sendo as maiores concentrações observadas nos tratamentos de 40, 60 e 80
mg Cr6+ kg-1 solo (Fig. 3B). Além disso, foram observadas diferenças significativas
entre os intervalos de tempo avaliados. Para os tratamentos de 40, 60 e 80 mg Cr6+
kg-1 solo, maiores concentrações foram observadas no intervalo de 96 h AAT, sendo
o teor de prolina 17, 24 e 35 vezes maiores que o tratamento controle,
respectivamente (Fig. 3B).
79
Fig. 3. (A) Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de (B) prolina em folhas de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas a cinco doses crescentes de Cr
6+
no solo. Valores médios de quatro repetições biológicas ± SE. Letras maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos de Cr
6+ no solo. Letras minúsculas indicam
comparações de médias entre os intervalos de avaliação, pelo teste Tukey (p<0.01)
3.7. Metabolismo Antioxidativo
Foi verificado alterações significativas (p<0.01) na atividade das enzimas do
metabolismo antioxidativo, entre os tratamentos com Cr6+ aplicado no solo e os
tempos de exposição ao metal (Fig. 4). Aumento significativo da atividade da
peroxidase do ascorbato (APX) (Fig. 4A) foi observado em todas as doses de Cr6+
avaliadas e em todos os intervalos avaliados. Foram observados incrementos de até
80
426%, 351% 394% e 490% nos tratamentos com 20, 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo,
respectivamente, quando comparados ao tratamento controle (Fig. 4A).
Na avaliação da atividade da catalase (CAT) (Fig. 4B) foi observado aumento
significativo entre os tratamentos com Cr6+ somente às 96 h AAT, com incrementos
de 91%, 54%, 29% e 4% nas doses de 20, 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo,
respectivamente, quando comparados ao tratamento controle. Nos demais tempos
de exposição ao metal, houve reduções significativas na atividade de CAT de até
29% comparados ao controle (Fig. 4B).
Para atividade da peroxidase do guaiacol (GPX) (Fig. 4C) foi observado aumento
significativo em todas as doses de Cr6+ e em todos os intervalos avaliados. Os
maiores incrementos foram observados as 24 h AAT com aumento de 344%, 238%,
273% e 215% nos tratamentos com 20, 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo,
respectivamente, quando comparados ao tratamento controle (Fig. 4C).
Em relação à redutase da glutationa (GR) (Fig. 4D), foi observado aumento
significativo entre os tratamentos com Cr6+ somente às 96 h AAT, com incrementos
de 116%, 4%, 88% e 36% nas doses de 20, 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo,
respectivamente, quando comparados ao tratamento controle. Nos demais tempos
de exposição ao metal, houve reduções significativas na atividade de GR de até
77%, 65%, 78%, 58% e 36% nos intervalos de 3, 6, 12, 24 e 48 h ATT,
respectivamente, quando comparados ao controle (Fig. 4D).
Ao analisar a dismutase do superoxido (SOD) (Fig. 4E), observou-se que houve
atividade significativamente (p<0.01) maior de SOD nos horários de 3 e 24 h ATT.
Foram observados incrementos de 2.4%, 2% e 1.8% nos tratamentos com 20, 40 e
80 mg Cr6+ kg-1 solo, respectivamente, no intervalo de 3 h AAT. Já no intervalo de 24
h AAT houve incremento de 3% no tratamento de 80 mg Cr6+ kg-1 solo, quando
comparados ao tratamento controle (Fig. 4E).
81
Fig. 4. Atividade das enzimas do metabolismo antioxidativo. (A) APX – peroxidase do ascorbato, (B) CAT – catalase, (C) GPX - peroxidase do guaiacol, (D) GR - redutase da glutationa e (E) SOD – dismutase do superoxide em folhas de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas a cinco doses crescentes de Cr
6+ no solo. Valores médios de quatro repetições biológicas ± SE. Letras
maiúsculas indicam comparações de médias entre os tratamentos de Cr6+
no solo. Letras minúsculas indicam comparações de médias entre os intervalos de avaliação, pelo teste Tukey (p<0.01).
82
3.8. Expressão Gênica
Foram observadas diferenças significativas (p<0.01) na expressão de todos
os genes avaliados (psbA, psbO, Mt2b, phyt, sod cyt e sod chl) em função das doses
de Cr6+ aplicadas no solo e do tempo de exposição ao metal (Fig. 5). No intervalo de
24 h AAT, aumento significativo na expressão dos genes psbA (Fig. 5A), sod cyt
(Fig. 5E) e sod chl (Fig. 5F) foram observadas nos tratamentos com 20, 40 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo. A expressão do gene psbA (Fig. 5A) foi 6, 3 e 2 vezes maiores que o
controle, enquanto que o sod cyt (Fig. 5E) foi de 2.7, 3, e 4.7, e o sod chl (Fig. 5F) 3,
1.7 e 1.5 vezes maiores que o controle, para os tratamentos com 20, 40 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo, respectivamente. Aumento significativo na expressão do gene psbO (6
e 4 vezes em relação ao controle) (Fig. 5B) foram observadas nos tratamentos com
20 e 40 mg Cr6+ kg-1 solo, respectivamente. Enquanto que para o gene Mt2b (Fig.
5C) a expressão significativamente maior ocorreu nos tratamentos com 40 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo, sendo 1.4 e 2.4 vezes maiores que o tratamento controle,
respectivamente. No intervalo de 96 h AAT aumento significativo na expressão dos
genes psbA (Fig. 5A) e psbO (Fig. 5B) foram observadas nos tratamentos
correspondentes a 20 e 40 mg Cr6+ kg-1 solo, sendo (psbA) 4 e 2 e (psbO) 3 e 2
vezes maior que o controle. Aumento significativo da expressão dos genes Mt2b
(Fig. 5C) e sod cyt (Fig. 5E) foram observadas em todos os tratamentos com Cr6+. A
expressão do gene Mt2b (Fig. 5C) foi 2.4, 1.7, 2.5 e 1.8, e do gene sod cyt (Fig. 5E)
6, 8, 18 e 21 vezes maior que o controle nos tratamentos com 20, 40, 60 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo, respectivamente. Redução significativa (p<0.01) e (p<0.05) na
expressão do gene phyt (Fig. 5D) foi observado em ambos intervalos de avaliação,
em comparação tratamento controle.
83
Fig. 5. Expressão relativa de genes que codificam para a biossíntese de proteína psbA (A), proteína psbO (B), metalotioneínas – Mt2b (C), fitoquelatinas - phyt (D), dismutase do superóxido citoplasmática - sod cyt (E), e dismutase do superóxido cloroplastídica sod chl (F) em folhas de plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 submetidas a cinco doses crescentes de Cr
6+ no solo. Valores médios de três repetições biológicas e duas repetições técnicas ± SE. Letras maiúsculas indicam
comparações de médias entre os tratamentos de Cr6+
no solo pelo teste Tukey (p<0.01). Significância estatística entre os intervalos avaliados foi determinada por ANOVA, seguindo pelo teste-t (*p<0.01).
84
4. DISCUSSÃO
A exposição das plantas do genótipo clonal de cacau CCN 51 a todos os
tratamentos com Cr6+ afetou severamente as trocas gasosas foliares, como indicado
pelo declínio acentuado de PN, gs e E, 24 h AAT (Fig. 1). As alterações causadas no
aparelho fotossintético e nos estômatos foram influenciadas pelo aumento das
concentrações de Cr6+ no solo e pelo tempo de exposição ao metal. Estas alterações
podem estar relacionadas principalmente a diminuição da fixação de CO2 devido a
redução de gs (Fig. 1B), evidenciado pelas reduções paralelas da PN e E (Liu et al.,
2008). Além disso, é possível associar aos danos ultraestruturais dos cloroplastos, a
inibição do transporte de elétrons, ao aumento da peroxidação lípidica e a alterações
na atividade enzimática. Já nos tratamentos nas duas maiores doses de Cr6+, lesões
no centro de reação de PSII, evidenciados pela pouca expressão do gene psbA e
repressão do gene psbO podem estar relacionados a diminuição das trocas gasosas
(Gomes et al., 2017; Panda e Choudhury, 2005). Os efeitos inibitórios do excesso de
Cr nas trocas gasosas foliares foram investigados em diferentes espécies de plantas
como Amaranthus viridis, Amaranthus cruentus e Genipa americana (Bashri et al
2016; Liu et al 2008; Santana et al., 2012).
A recuperação da PN dos tratamentos com 20, 40 e 60 mg Cr6+ kg-1, aos 4
dias AAT (Fig. 1A), pode ser explicada pela recuperação da gs, nestes tratamentos.
Além disso, a manutenção dos teores de clh a (Tabela 1), e o aumento no teor de
chl b, aliados a maior expressão dos genes psbA (Fig. 5A) e de psbO (Fig. 5B) nas
doses de 20 e 40 mg Cr6+ kg-1, nos intervalos de 24 e 48 h AAT, auxiliaram na
recuperação das trocas gasosas destes tratamentos. A Chl a é o pigmento utilizado
durante a fotoquímica, enquanto que os demais pigmentos possuem funções de
absorção de energia luminosa e transferencia de energia e eletróns (Taiz et al.,
2017). Já o gene psbA, que tem como produto a proteína D1 do PSII, é responsável
pela transferência de elétrons durante a atividade fotossintética (Cheng et al., 2016).
Enquanto que maior expressão do gene psbO, que tem como produto uma proteína
extrínseca ao PSII, tem a função de modular os requisitos fisiológicos de cloreto e
cálcio otimizando a evolução do oxigênio durante a fase fotoquímica da fotossíntese
(Bricker et al., 2012). Dessa forma, a manutenção do teor de Clh a e o aumento na
expressão dos genes psbA e psbO (Fig. 5A e B) garantiram a manutenção das
funções de PSII. Por outro lado, a menor recuperação da PN no tratamento com 80
85
mg Cr6+ kg-1 solo pode ser explicado em função da degradação das clorofilas, bem
como da baixa expressão do gene psbA e da repressão do gene psbO nos
intervalos de 24 e 48 h AAT. As eficiências intrínsecas (WUEi) (Fig. 1D) e
instantâneas (WUE) do uso da água (Fig. 1E) foram significativamente (p<0.05)
afetadas nas doses de 40, 60 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo e em função do tempo de
exposição ao metal. Os tratamentos com Cr6+ reduziram os valores de PN, gs e E
devido ao fechamento estomático, promovendo uma absorção ineficiente de água
pelas raízes (Souza et al., 2013). Os resultados demonstraram que o Cr6+ afetou a
capacidade das plantas de cacau de regular as taxas de perda de água (gs e E)
associadas à PN, provocando redução na eficiência fotossintética, durante o evento
de estresse (Rodriguez et al., 2012; Taiz et al., 2017).
Os teores de clorofila (Chl) encontrados em T. cacao mostraram que a
toxicidade de Cr6+ teve impacto negativo no tratamento com dose de 80 mg Cr6+ kg-1
solo quando comparado ao tratamento controle (Tabela 1). A demonstração de
intolerancia das plantas de cacau a doses mais elevadas de Cr6+ devido a
deterioração dos parâmetros de Chl pode estar relacionada a inativação de enzimas
envolvidas na biossintese da clorofila (Shanker et al., 2005). Por outro lado, os
teores de carotenóides aumentaram significativamente neste tratamento. O que
pode ser explicado devido a sua função de proteção das moléculas de chl contra o
estresse oxidativo produzido por ROS. Além disso, os carotenóides estabilizam a
bicamada lipídica das membranas celulares prevenindo a peroxidação lipídica
(Ramel et al., 2013). Alterações dos pigmentos cloroplastídicos, devido a toxicidade
ao Cr6+ têm sido relatada para algumas espécies tais como Triticum aestivum,
Hibiscus esculentus e Brassica napus (Adrees et al., 2015; Amin et al., 2013; Gill et
al., 2015).
O aumento observado nos teores de chl b e chl (a+b) na dose de 20 mg Cr6+
kg-1 solo, foram semelhantes ao encontrado por Rodriguez et al., (2012) que
observaram um aumento do teor de chl b em plantas de Pisum sativum,
concomitante ao aumento significativo da acumulação de Mg, Fe e Zn em folhas,
elementos diretamente envolvidos na biossíntese de clorofila. Estes autores
inferiram que o acumulo destes elementos poderia ser uma estratégia para
minimizar os efeitos negativos do Cr6+ sobre os pigmentos cloroplastídicos,
aumentando a síntese de clorofila (Fe e Mg), protegendo a planta do estresse (Zn).
86
A acumulação preferencial de maiores concentrações de Cr total em raízes de
plantas submetidas ao estresse por Cr6+ tem sido bem relatada na literatura (Mallick
et al., 2010; Santana et al., 2012; Yadav et al., 2010). A concentração de Cr total
nas raízes aumentou com o incremento das doses de Cr6+ no solo (Tabela 1).
Contudo, houve baixa translocação para as folhas, em média, 3% do Cr total
absorvido pelas plantas. Infere-se que o maior acúmulo de Cr nas raízes das plantas
pode ser devido a sua imobilização nos vacúolos das células da raiz (Oliveira, 2012).
Com isso, a toxicidade do metal diminui, uma vez que, após atravessar a endoderme
via simplasto o Cr6+ nas células, provavelmente é prontamente reduzido a Cr3+, e
retido nas células do córtex radicular (Hayat et al., 2012). Assim, grande parte do Cr
absorvido torna-se indisponível para translocação a parte aérea (Caldelas et al.,
2012). Entretanto, a pequena proporção de Cr que translocou para as folhas é
provavelmente a responsável pelos danos ultraestruturais observados nas folhas de
T. cacao (Fig. 2). Em nosso trabalho, podemos inferir que o mecanismo de retenção
de Cr pelas raízes ocorreu nos tratamentos com 40 mg Cr6+ kg-1 solo, onde o
acúmulo de material eletrodenso nos vacúolos e na parede celular das raízes (Fig.
2H), pode ser observado.
Mudanças ultraestruturais devido à toxicidade do Cr6+ afetaram o mesofilo
foliar e as raízes do genótipo de cacau CCN 51 (Fig. 2). O acúmulo de material
eletrodenso em compartimentos subcelulares na presença do Cr tem sido
considerado por muitos pesquisadores como um dos primeiros mecanismos
celulares contra a toxicidade do metal e de tolerância desenvolvido pelas plantas
(Gomes et al., 2017; Singh et al., 2013). Complexação do metal com aminoácidos,
quelação com peptídeos (metalotioneínas e fitoquelatinas), imobilização do metal na
parede celular das raízes e redução da translocação via membrana plasmática,
fazem parte deste mecanismo (Gomes et al., 2017).
O estresse oxidativo mediado por Cr6+ foi correlacionado com as alterações
ultraestruturais nas células do mesofilo foliar e nas raízes das plantas de T. cacao. A
produção de ERO’s induzida por Cr6+ evidenciado pelo aumento das enzimas
relacionadas ao estresse oxidativo, pode ser responsável pelo aumento do espaço
intertilacoidal, destruição de mitocôndrios, deformação de cloroplastos, rompimento
das membranas tilacóides, condensação da cromatina e apoptose (Fig. 2). Além
disso, o acúmulo excessivo de ERO’s pode alterar a homeostase celular,
87
ocasionando em morte celular programada (Hasan et al., 2017). Resultados
semelhantes foram encontrados em T. cacao submetidos a toxicidade por Cd e Cu
(Araújo et al., 2017; Castro et al., 2015; Souza et al., 2013).
Alterações significativas na peroxidação lipídica de membranas celulares (Fig.
3) foram observadas nas plantas de cacau CCN 51 submetidas à toxicidade de Cr6+
no solo. A desestabilização da membrana geralmente é atribuída ao aumento de
espécies reativas de oxigênio (ERO’s) que consequentemente induzem o estresse
oxidativo (Ma et al 2016; Shahid et al., 2017). Nossos resultados estão de acordo
com os demais resultados encontrados na literatura, onde as maiores concentrações
de Cr proporcionaram maiores teores de TBARs (Afshan et al., 2015; Anjum et al.,
2017), quando comparados ao tratamento controle. A manutenção de teores
elevados de TBARs pode ser explicada devido a baixa atividade da SOD e da CAT
em todos o período de avaliação. Pouca atividade da SOD bem como a diminuição
da CAT indica a ocorrência de danos no sistema de eliminação da superóxido e
H2O2 devido ao estresse ocasionado por Cr, nas primeiras 96 h AAT (Anjum et al.,
2017; Dey et al., 2007). Assim, podemos inferir que o aumento de TBARs, paralelo a
diminuição de enzimas antioxidantes evidenciam a prevalência do estresse oxidativo
nas plantas de cacau avaliadas.
Mecanismos adaptativos específicos que visam mitigar e reparar os danos
causados pelo estresse oxidativo induzido por metais pesados, como o Cr, foram
desenvolvidos pelas plantas através da ativação de enzimas antioxidantes (Adrees
et al., 2015). Tais enzimas são consideradas a principal linha de defesa contra ROS,
e geralmente trabalham em sincronia para eliminá-las (Choudhury et al., 2013;
Shahid et al., 2017). Em nosso estudo observamos pouca atividade de SOD (Fig 4E)
e CAT (Fig 4B) em todos os tratamentos com Cr6+ no solo e em todos os intervalos
de tempo avaliados, indicando a ocorrência de danos ao sistema de eliminação de
EROS nas primeiras 96 h AAT, devido ao estresse por Cr6+ (Dey et al., 2007). Por
outro lado, menor ativação de enzimas do metabolismo antioxidativo pode ser um
indício de que houve um equilíbrio entre a geração e a remoção de ROS (Shahid et
al., 2017).
Plantas expostas a estresses abióticos podem ter a atividade de algumas
enzimas antioxidantes suprimidas, em detrimento da indução positiva de outras
enzimas. Tal mecanismo tem a finalidade de manter a homeostase redox nas
88
plantas (Choudhury et al., 2013; Vaahtera et al., 2014). Observamos em nosso
trabalho, ativação significativamente superior das peroxidases APX (Fig. 4A) e GPX
(Fig. 4C) em todos os intervalos avaliados, quando comparados ao tratamento
controle. A ativação das peroxidases e a atividade reduzida da CAT em T. Cacao
nos levaram a inferir que a desintoxicação do H2O2 em todos os tratamentos com
Cr6+ no solo foi realizada mais ativamente por APX e GPX. Alterações na ativação
de enzimas antioxidantes podem ser decorrentes da síntese de novas isoenzimas ou
aumento dos níveis de enzimas pré-existentes para o metabolismo de ROS (Bashri
et al., 2016).
Reduções da atividade da SOD e CAT, induzido por exposição ao Cr6+, foi
relatado em Amaranthus viridis (Bashri et al., 2016). Resultados semelhantes para
GPX foram encontrados em Matricaria chamomilla (Kovácik et al., 2014) e para APX
em Jatropha curcas (Yadav et al., 2010). Já em folhas de T. cacao, aumento da
ativação de GPX foram observadas quando as plantas foram submetidas ao
estresse por Al3+, Cd e Pb (Araujo et al., 2017; Reis et al., 2015).
O estado redox das células é regulado por diferentes antioxidantes
enzimáticos entre eles a redutase da glutationa (GR). GR desempenha um papel
importante na desintoxicação de ROS, conferindo tolerância a estresses abióticos
(Gill et al., 2013), além de estar envolvido na regeneração do nível de glutationa
reduzida (GSH) nas células vegetais (Choudhury at al., 2013). O conteúdo de GSH e
a atividade de GR estão intimamente relacionados sendo modulados em função do
estressor (Gill et al., 2013). Em nosso estudo, ao ser exposto ao estresse por Cr6+ as
plantas de T. Cacao apresentaram pouca ativação da GR nas primeiras 96 h AAT.
Ding et al. (2012) trabalhando com Nicotiana tabacum observaram que
plantas transgênicas com atividade severamente reduzida de GR acumularam alta
concentração de H2O2 nos cloroplastos prejudicando severamente a atividade do
PSII. Os mesmos autores sugeriram que a GR poderia auxiliar na proteção das
funções do PSII, mantendo o transporte de elétrons no lado aceptor e estabilizando
os complexos do PSII sob o estresse. Em outro estudo, uma super ativação da GR
promoveu um aumento na atividade antioxidante das plantas (Foyer et al., 1995).
Observamos em nosso trabalho alta atividade de APX e GPX indicando que houve
um aumento na produção H2O2, um sub-produto da fotossíntese e respiração
(Mittler, 2017). Por outro lado, a baixa ativação da GR alterou a homeostase redox
89
nas células, indicando que houve uma redução da atividade antioxidante nas plantas
de cacau, evidenciados pela redução da SOD e da CAT. Além disso, as alterações
destas enzimas podem estar relacionadas com a redução das trocas gasosas
foliares nos tratamentos com Cr6+ no solo, uma vez que a ativação da GR auxilia na
proteção e estabilização dos complexos do PSII (Ding et al., 2012) e o incremento
de APX e GPX pode indicar o estado fisiologico das plantas (Mittler, 2017).
Outro mecanismo ativado por muitas plantas frente à exposição a metais
pesados é o acumulo de aminoácidos livres, como a prolina. Aumento no teor de
prolina tem sido relatado na literatura no combate ao estresse oxidativo promovido
pelo Cr (Sinha et al., 2009; Muslu e Ergum, 2013; Tripathi et al., 2013). Em nosso
estudo, os teores de prolina foram mais elevados nos tratamentos de 40, 60 e 80 mg
Cr6+ kg-1 solo durante e após 24 h de exposição ao metal (Fig. 3). Além disso, o
aumento do teor de prolina aliado ao aumento da atividade de GPX (Fig. 4C) e APX
(Fig. 4A) auxiliaram as plantas de T. cacao na desintoxicação de ROS. A prolina
possui múltiplas funções, tais como regulador da pressão osmótica, redutor de ROS,
estabilizador de enzimas e de membranas. Além disso, a prolina desempenha um
papel de estabilização de estruturas protéicas, mantendo o pH citosólico, ativando
enzimas antioxidantes e ajudando a equilibrar o estado de reações redox da célula
(Aslan et al., 2017; Mittler, 2017).
O PSII das plantas de cacau CCN 51, apresentaram semelhança no padrão de
expressão dos genes psbA (Fig. 5A) e psbO (Fig. 5B) em todos os tratamentos com
Cr6+ no solo. A repressão dos genes psbA e psbO na dose de 80 mg Cr6+ kg-1 solo
sugerem que as trocas gasosas foliares foram severamente afetadas neste
tratamento evidenciado pela redução da PN, gs e E no intervalo de 24 h AAT e da
menor recuperação da PN no intervalo de 96 h AAT (Fig. 1). A inibição do transporte
de eletrons durante a fotossíntese pode estar relacionada à degradação da proteína
D1, sendo esta codificada pelo gene psbA e considerada componente central do
complexo proteico do PSII (Cheng et al., 2016). Por outro lado, o gene psbO,
componente central do complexo evolução de oxigênio, codifica uma proteína que é
extrínseca a esse complexo localizado no PSII, e é considerada a principal proteína
responsável pela fotólise da água (Bricker et al., 2012). Araújo et al. (2017)
demonstrou que a repressão da expressão de psbO em T. cacao expostas à
toxicidade de Cd é um mecanismo de proteção a proteína D1, prevenindo danos ao
90
PSII. Além disso, a recuperação da atividade fotossintética nas doses de 20, 40 mg
Cr6+ kg-1 solo aos 4 dias AAT podem estar relacionados a maior expressão de psbA
e psbO nos intervalos de 24 e 96 h ATT (Fig. 1), uma vez que, o aumento na
expressão desses genes significa que as funções do PSII foram preservadas diante
do fator estressor.
O incremento da concentração de ROS frente a estresses abióticos tem sido
relatado na literatura como um sinalizador biológico de transcrição e indução de
genes que codificam proteínas envolvidas na produção, percepção e eliminação de
ROS nas células (Choudhury et al., 2013; Hossain et al., 2012). Em nosso estudo,
no intervalo de 24 h AAT, observamos aumento significativo da expressão de sod
Cyt (Fig. 5e) e sod Chl (Fig. 5F) nos tratamentos com 20, 40 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo.
Enquanto que, no intervalo e 96 h AAT o aumento da expressão de sod Cyt
acompanhou o aumento da concentração de Cr6+ solo.
O aumento da expressão de sod Cyt e sod Chl no intervalo de 24 h AAT, e
na expressão de sod Cyt no intervalo de 96 h AAT coincidiu com o aumento
significativo da atividade das enzimas APX e GPX e de redução na atividade da
SOD e da CAT (Fig. 4) em todos os tratamentos avaliados. Além disso, um aumento
significativo do teor de prolina (Fig. 3) foi observado nos tratamentos com 40, 60 e
80 mg Cr6+ kg-1 solo, às 24 e 96 h AAT, e aumento do conteúdo de carotenóides no
tratamento com 80 mg Cr6+ kg-1 solo.
De acordo com Hossain et al. (2012) o aumento da expressão de genes que
codificam enzimas antioxidantes, além da participação no metabolismo antioxidativo,
auxiliam também na manutenção e ativação destas enzimas reforçando o sistema
de defesa antioxidante. Contudo em nosso trabalho, observamos uma redução do
equilibrio entre a geração e a remoção de ROS, evidenciados pela redução das
enzimas GR, SOD e CAT suportando a hipótese discutida anteriormente de que os
tratamentos com Cr6+ no solo promoveu alterações na homeostase redox nas células
nas primeiras 96 h AAT. Resultados semelhantes do aumento da expressão de sod
Cyt foram relatados em folhas de T. cacao expostas a doses elevadas de Cd, Pb, e
Cu (Araujo et al., 2017; Castro et al., 2015; Reis et al., 2015; Souza et al., 2013).
Outro importante mecanismo de desintoxicação e tolerância aos metais
pesados, desenvolvido pelas plantas é a quelação dos íons metálicos por ligantes de
alta afinidade, como a prolina (aminoácidos), as fitoquelatinas (phyt) e as
91
metalotioneínas (Mt2b) (peptídeos) (Hasan et al., 2017; Srivastava et al., 2017). Os
compostos quelantes atuam no sequestro dos íons metálicos, inativando-os no
citoplasma ou transferindo-os para os vacúolos. Desta forma, reduzem sua
reatividade, solubilidade e aparecimento de efeitos tóxicos nas plantas (Hasan et al.,
2017). Em nosso estudo, a expressão de phyt em todos os tratamentos foi suprimida
devido à exposição das plantas de T. cacao a doses crescentes de Cr6+ no solo.
Essa supressão coincidiu com a menor ativação da GR. A diminuição da atividade
de GR pode estar relacionada a ativação da GSH e a repressão da expressão de
phyt. Diwan et al. (2010) infere que o aumento da atividade de GR promove a
redução do teor de GSH, após a exposição ao Cr, e que essa redução aponta para a
formação de fitoquelatinas, uma vez que a GSH atua como substrato para sua
síntese. Dessa forma, a redução paralela de GR e phyt nas plantas de cacau, pode
representar uma redução da tolerância e no combate à toxicidade de Cr6+. Por outro
lado, também podemos inferir que a diminuição da atividade de GR visando manter
maior teor de GSH, pode ter ocorrido para que a GSH atuasse como agente
antioxidante, e que por isso, não foi utilizado como precursor da síntese de
fitochelatinas (Yadav, 2010). Estudos demonstrando repressão da síntese de
fitoquelatinas em plantas expostas ao estresse por Cr6+ tem sido relatado para Oryza
sativa e Lycopersicon esculentum (Kabir, 2016; Sanita` di Toppi, et al., 2002).
Assim como as fitoquelatinas, as metalotioneínas se apresentam como
importante mecanismo de resistência à toxicidade por metais. O aumento da
expressão de Mt2b (Fig. 5C) com o aumento da concentração de Cr6+ no solo
contribuiu para a redução da concentração do metal no citosol. Em nosso estudo,
observamos maior expressão de Mt2b no intervalo de 96 h AAT em todos os
tratamentos avaliados, enquanto que no intervalo de 24 h o aumento da expressão
ocorreu nos tratamentos com 40 e 80 mg Cr6+ kg-1 solo. A presença de material
eletrodenso no vacúolo das células do tecido foliar (Fig. 2), observada nestes
mesmos tratamentos, nos leva a inferir que possa ser a compartimentalização de
complexos proteína-Cr. As metalotioneínas atuam no sequestro de Cr6+, inativando-o
no citoplasma e imobilizando-o nos vacúolos (Hasan et al., 2017). Além disso, a
maior expressão de Mt2b, 96 h AAT, pode ser considerada uma estratégia protetiva
de tolerância, desenvolvida pelas plantas de cacau, visando reter maior
concentração de metal nas raizes, preservando o processo metabólico nas folhas
92
(Souza et al., 2013). Aumento na expressão de Mt2b em plantas de cacau expostas
a toxicidade de Cd e Cu foram relatadas (Araujo et al., 2017; Castro et al., 2015;
Souza et al., 2013).
5. Conclusões
A tolerância das plantas clonais do genótipo de cacau CCN 51 à toxicidade de
Cr6+ depende da concentração e do tempo de exposição ao metal. Como estratégia
de tolerância ao Cr6+ no solo, 97% do Cr total, em média, foram acumulados nas
raízes, com baixa mobilidade para as folhas. Doses de Cr6+ igual ou superior a 40
mg kg-1 solo, interferiram notavelmente no metabolismo desta espécie, promovendo
danos irreversíveis na maquinaria fotossintética e na ultraestrutura celular,
peroxidação lipídica, interferiram nos sistemas enzimáticos e não enzimáticos
relacionados ao estresse oxidativo e na expressão gênica, que podem levar a
planta a morte. Todas as alterações observadas em plantas de T. cacao submetidas
a níveis crescentes de Cr6+ sugerem que plantas cultivadas em solos com altos
níveis de Cr podem ser afetadas negativamente em seu crescimento e metabolismo.
Estes resultados também indicam que o Cr é mais relevante para a fitotoxicidade do
que para as avaliações do risco de segurança alimentar, uma vez que a adição de
Cr ao solo promoveu alterações fisiológicas e ultraestruturais nas plantas de T.
cacao.
6. Referências
Abbott W.S., 1925. A method of computing the effectiveness of on insecticide. J Econ Entomol., 18, 265-267. DOI: https://doi.org/10.1093/jee/18.2.265a
Adrees M., Ali S., Iqbal M., Bharwana S.A., Siddiqi Z., Farid M., Ali Q., Saeed R., Rizwan M., 2015. Mannitol alleviates chromium toxicity in wheat plants in relation to growth, yield, stimulation of anti-oxidative enzymes, oxidative stress and Cr uptake in sand and soil media. Ecotoxicol Environ Saf. 122, 1–8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2015.07.003
Afshan S., Ali S., Bharwana S.A., Rizwan M., Farid M., Abbas F., Ibrahim M., Mehmood M.A., Abbasi G.H., 2015. Citric acid enhances the phytoextraction of chromium, plant growth, and photosynthesis by alleviating the oxidative damages in
93
Brassica napus L. Environ Sci Pollut Res Int., 22, 11679-89. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-015-4396-8
Almeida A.-A.F., Valle R.R., 2009. Cacao: ecophysiology of growth and production. In: DaMatta F.M. (Ed.), Ecophysiology of Tropical Tree Crops. Nova Science Publishers Inc., Hauppauge, Andersen, pp. 37–70.
Amin H., Arain B.A., Amin F., Surhio M.A., Phytotoxicity of chromium on germination, growth and biochemical attributes of Hibiscus esculentus L., 2013. Am J Plant Sci. 4, 2431-2439. DOI: http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2013.412302
Anjum S.A., Ashraf U., Khan I., Tanveer M., Shahid, M., Shakoor A., Wang L., 2017. Phyto-toxicity of chromium in maize: oxiaative damage, osmolyte accumulation, anti-oxidative defense and chromium uptake. Pedosphere. 27, 262–273. DOI: https://doi.org/10.1016/S1002-0160(17)60315-1
Araújo R.P., Almeida A.-A.F., Pereira L.S., Mangabeira P.A.O., Souza J.O., Pirovani C.P., Ahnert D., Baligar V.C., 2017. Photosynthetic, antioxidative, molecular and ultrastructural responses of young cacao plants to Cd toxicity in the soil. Ecotoxicol Environ Saf. 144, 148-157. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.06.006.
Arévalo-Gardini E., Arévalo-Hernández C.O., Baligar V.C., He Z.L., 2017. Heavy metal accumulation in leaves and beans of cacao (Theobroma cacao L.) in major cacao growing regions in Peru. Science of The Total Environment. 605, 792-800. DOI: https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.06.122
Aslam M., Saeed M.S., Sattar S., Sajad S., Sajjad M., Adnan M., Iqbal M., Sharif M.T., 2017. Specific role of proline against heavy metals toxicity in plants. Int. J. Pure App. Biosci. 5, 27-34. DOI: http://dx.doi.org/10.18782/2320-7051.6032
Bashri G., Parihar P., Singh R., Singh S., Singh V.P., Prasad S.M., 2016. Physiological and biochemical characterization of two Amaranthus species under Cr (VI) stress differing in Cr (VI) tolerance. Plant Physiol Biochem. 108, 12-23. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2016.06.030
Bates, I.S., Waldern, R.P., Teare, I.D., 1973. Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil. 39, 205–207. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00018060
Bertoldi, D., Barbero, A., Camin, F., Caligiani, A., Larcher, R., 2016. Multielemental fingerprinting and geographic traceability of Theobroma cacao beans and cocoa products. Food Control. 65, 46–53. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2016.01.013
Boza E.J., Motamayor J.C., Amores F.M., Cedeño-Amador S., Tondo C.L., Livingstone III D.S., Schnell R. J., Gutiérrez O.A., 2014. Genetic characterization of the cacao cultivar CCN 51: its impact and significance on global cacao improvement an production. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 139,219-229. DOI: http://journal.ashspublications.org/content/139/2/219.full.
94
Bricker T.M., Roose J.L., Fagerlund R.D., Frankel L.K., Eaton-Rye J.J., 2012. The extrinsic proteins of Photosystem II. Biochim. biophys. Acta. 1817, 121–142. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2011.07.006
Cakmak I., Horst W. J., 1991. Effect of aluminum on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Physiol Plant. 83, 463-468. DOI:10.1111/j.1399-3054.1991.tb00121.x
Caldelas C., Bort J., Febrero A., 2012. Ultrastructure and subcellular distribution of Cr in Iris pseudacorus L. using TEM and X-ray microanalysis. Cell Biol. Toxicol. 28, 57-68. DOI: https://doi.org/10.1007/s10565-011-9205-7.
Carlberg C., Mannervik B. Glutathione reductase., 1985. Methods Enzymol., 113, 488-495, https://doi.org/10.1016/S0076-6879(85)13062-4.
Castro A.V., Almeida A.-A.F., Pirovani C.P., Reis G.S.M., Almeida N.M., Mangabeira P.A.O., 2015. Morphological, biochemical, molecular and ultrastructural changes induced by Cd toxicity in seedlings of Theobroma cacao L. Ecotoxicol. Environ. Saf. 115, 174–186. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2015.02.003
Cheng D.-D., Zhang Z.-S., Sun X.-B., Zhao M., Sun G.-Y., Chow W.S., 2016. Photoinhibition and photoinhibition-like damage to the photosynthetic apparatus in tobacco leaves induced by pseudômonas syringae pv. Tabaci under light and dark conditions. BMC Plant Biology 16:29. DOI: https://doi.org/10.1186/s12870-016-0723-6
Choudhury S., Panda P., Sahoo L., Panda S.K., 2013. Reactive oxygen species signaling in plants under abiotic stress, Plant Signal Behav., 8, 23681. DOI: https://doi.org/10.4161/psb.23681
Dey S.K., Dey J., Patra S., Pothal D., 2007. Changes in the antioxidative enzyme activities and lipid peroxidation in wheat seedlings exposed to cádmium and lead stress. Braz. J. Plant Physiol. 19,1. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S1677-04202007000100006.
Dhal B., Thatoi H.N., Das N.N., Pandey B.D., 2013. Chemical and microbial remediation of hexavalent chromium from contaminated soil and mining/metallurgical solid waste: A review. J. hazard. Mater. 250–251. 272–291. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2013.01.048
Ding H., Wang G., Lou L., Lv J., 2016. Physiological responses and tolerance of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) exposed to chromium. Ecotoxicol Environ Saf. 133, 509-518. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2016.08.007.
Ding S., Lei M., Lu Q., Zhang A., Yin Y., Wen X., Zhang L., Lu C., 2012. Enhanced sensitivity and characterization of photosystem II in transgenic tobacco plants with decreased chloroplast glutathione reductase under chilling stress. Biochim Biophys Acta. 1817, 1979–1991. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2012.06.003
Diwan H., Khan I., Ahmad A., Iqbal M., 2010. Induction of phytochelatins and antioxidant defence system in Brassica juncea and Vigna radiata in response to
95
chromium treatments. Plant Growth Regul. 61, 97. DOI: https://doi.org/10.1007/s10725-010-9454-0.
Foyer C.H., Souriau N., Perret S., Lelandais M., Kunert K.-J., Pruvost C., Jouanin L., 1995. Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in Poplar Trees. Plant Physiol. 109, 1047-1057. DOI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC161408/
Giannopolitis C.N., Ries S.K., 1977. Superoxide dismutases I. Occurrence in higher plants. Plant Physiol. 59, 309–314. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.59.2.309
Gill R.A., Ali B., Islam F., Farooq M.A., Gill M.B., Mwamba T.M., Zhou W., 2015. Physiological and molecular analyses of black and yellow seeded Brassica napus regulated by 5-aminolivulinic acid under chromium stress. Plant Physiol and Biochem. 94, 130-143. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2015.06.001
Gill S.S., Anjum N.A., Hasanuzzaman M., Gill R., Trivedi D.K., Ahmad I., Pereira E., Tuteja N., 2013. Glutathione and glutathione reductase: A boon in disguise for plant abiotic stress defense operations. Plant Physiol Biochem. 70, 204-212. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2013.05.032
Gomes M.A.C., Hauser-Davis R.A., Suzuki M.S., Vitória A.P. 2017. Plant chromium uptake and transport, physiological effects and recente advances in molecular investigations. Ecotoxicol Environ Saf. 140, 55-64. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2017.01.042
Hasan M.K., Cheng Y., Kanwar M.K., Chu X.-Y., Ahammed G.J., Qi Z.-Y. 2017 Responses of Plant Proteins to Heavy Metal Stress — A Review. Front. Plant Sci. 8,1492. DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01492
Hayat S., Khalique G., Irfan M., Wani A.S., Tripathi B.N., Ahmad A., 2012. Physiological changes induced by chromium stress in plants: an overview. Protoplasma. 249, 599–611. DOI: https://doi.org/10.1007/s00709-011-0331-0.
Havir, E. A., Mchale, N. A. 1987. Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves. Plant Physiol. 84, 450-455. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.84.2.450
Herrmann L., Haase I., Blauhut M., Barz N., Fischer M., 2014. DNA-based differentiation of the Ecuadorian cocoa types CCN-51 and Arriba based on sequence differences in the chloroplast genome. J. Agric. Food Chem. DOI: 62, 12118–12127. DOI: 10.1021/jf504258w.
Hossain M.A., Piyatida P., da Silva J.A.T., Fujita M., 2012. Molecular mechanism of heavy metal toxicity and tolerance in plants: central role of glutathione in detoxification of reactive oxygen species and methylglyoxal and in heavy metal chelation. J. Bot. 1–37. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2012/872875
96
Kabir A. H., 2016. Biochemical and molecular changes in rice seedlings (Oryza sativa L.) to cope with chromium stress. Plant Biol. 18, 710-719. DOI: 10.1111/plb.12436.
Khedr A.H., Abbas M.A., Wahid A.A., Quick W.P., Abogadallah G.M., 2003. Proline
induces the expression of salt‐stress‐responsive proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt‐stress. J Exp Bot. 54, 2553–2562. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/erg277
Kovácik J., Babula P., Hedbavny J., Klejdus B., 2014. Hexavalent chromium damages chamomile plants by alteration ofantioxidants and its uptake is prevented by calcium. J. Hazard Mater. 273, 110–117. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2014.03.040
Lichtenthaler H.K., Wellburn A.R., 1983. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in diferente solventes. Biochem Soc Trans., 11, 591-592, DOI: 10.1042/bst0110591
Liu D., Zou J., Wang M., Jiang W. 2008. Hexavalent chromium uptake and its effects on mineral uptake, antioxidant defence system and photosynthesis in Amaranthus viridis L. Bioresour. Technol. 99, 2628–2636. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.04.045
Livak, K.J., Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods, 25, 402–408. DOI: https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
Ma J., Lv C., Xu M., Chen G.. Lv C., Gao Z., 2016. Photosynthesis performance, antioxidant enzymes, and ultrastructural analyses of rice seedlings under chromium stress. Environ Sci Pollut Res. 23, 1768–1778. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-015-5439-x
Mallick S., Sinam G., Mishra R.K., Sinha S., 2010. Interactive effects of Cr and Fe treatments on plants growth, nutrition and oxidative status in Zea mays L Ecotoxicol. Environ. Saf. 73, 987–995. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2010.03.004
Mangabeira P.A., Ferreira A.S., Almeida A.-A.F., Fernandes V.F., Lucena E., Souza V.L., Santos Júnior A.J., Oliveira A.H., Grenier-Loustalot M.F., Barbier F., 2011. Compartmentalization and ultrastructural alterations induced by chromium in aquatic macrophytes. Biomet. Int. J. Role Met. Ions Biol. Biochem. Med. 24, 1017-1026. DOI: https://doi.org/10.1007/s10534-011-9459-9
Martínez-Trujillo M., Carreón-Abud Y., 2015. Effect of mineral nutrients on the uptake of Cr (VI) by maize plants. New Biotechnology. 32, 396-402. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nbt.2015.03.009
Mittler R., 2017. ROS Are Good. Trends Plant Sci. 22, 11-19. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2016.08.002
97
Muslu A., Ergün N., 2013. Effects of copper and chromium and high temperature on growth, proline and protein content in wheat seedlings. Bangladesh J. Bot. 42, 105–111. DOI: http://dx.doi.org/10.3329/bjb.v42i1.15871
Nakano Y., Asada K., 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22, 867–880. DOI: https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.pcp.a076232
Oliveira H., 2012. Chromium as an environmental pollutant: insights on induced plant toxicity. J. Bot. Article. ID 375843. http://dx.doi.org/10.1155/2012/375843.
Panda S.K., Choudhury S., 2005. Chromium stress in plants. Braz. J. Physiol. 17, 95–102. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S1677-04202005000100008
Pirovani C.P., Carvalho H.A.S., Machado R.C.R., Gomes D.S., Alvim F.C., Pomella A.W.V., Gramacho K.P., Cascardo J.C.D.M., Pereira G.A.G., Micheli F., 2008. Protein extraction for proteome analysis from cacao leaves and meristems, organs infected by Moniliophthora perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease. Electrophoresis 29, 2391–2401. DOI: 10.1002/elps.200700743
Prado C., Pagano E., Prado F., Rosa M., 2012. Detoxification of Cr (VI) in Salvinia minima is related to seasonal-induced changes of thiols, phenolics and antioxidative enzymes. J Hazard Mater. 239–240, 355–361. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2012.09.010
Prado C., Ponce S.C., Pagano E., Prado F.E., Rosa M., 2016. Differential physiological responses of two Salvinia species to hexavalent chromium at a glance. Aquat. Toxicol. 175, 213–221. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aquatox.2016.03.027
Ramel F., Mialoundama A.S., Havaux M., 2013. Nonenzymic carotenoid oxidation and photooxidative stress signalling in plants. J Exp Bot. 64, 799–805. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/ers223
Reis G.S.M., Almeida A.-A.F., Almeida N.M., Castro A.V., Mangabeira P.A.O., Pirovani C.P., 2015. Molecular, biochemical and ultrastructural changes induced by Pb toxicity in seedlings of Theobroma cacao L. PLoS ONE 10, e 0129696. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0129696
Rodriguez E., Santos C., Azevedo R., Moutinho-Pereira J., Correia C., Dias M.C., 2012. Chromium (VI) induces toxicity at different photosynthetic levels in pea. Plant Physiol Biochem 53, 94–100. DOI: https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2012.01.013
Sanita` di Toppi L., Fossati F., Musetti R., Mikerezi I., Favali M. A. 2002. Effects of hexavalent chromium on maize, Tomato, and cauliflower plants. J Plant Nutr. 25. 01-717. DOI: http://dx.doi.org/10.1081/PLN-120002953
Santana K.B., de Almeida A.-A.F., Souza V.L., Mangabeira P.A.O., Silva D.D., Gomes F.B., Dutruch L., Loguercio L.L., 2012. Physiological analyses of Genipa americana L. reveals a tree with ability as phytostabilizer and rhizofilterer of chromium ions for phytoremediation of polluted watersheds. Environ Exp Bot 80,35–42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2012.02.004
98
Shahid M., Shamshad S., Rafiq M., Khalid S., Bibi I., Niazi N.K., Dumat C., Rashid M.I. 2017. Chromium speciation, bioavailability, uptake, toxicity and detoxification in soil-plant system: A review. Chemosphere. 178, 513-533. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2017.03.074
Shanker A.K., Cervantes C., Loza-Tavera H., Avudainayagam S., 2005. Chromium toxicity in plants. Environ. Int. 31, 739-753. DOI: https://doi.org/10.1016/j.envint.2005.02.003
Singh H.P., Mahajan P., Kaur S., Batish D.R., Kohli R.K., 2013. Chromium toxicity and tolerance in plants. Environ. Chem. Lett. 11, 229–254. DOI: https://doi.org/10.1007/s10311-013-0407-5
Sinha S., Singh S., Mallick S., Sinam G., 2009. Role of antioxidants in Cr tolerance of three crop plants: Metal accumulation in seeds. Ecotoxicol Environ Saf. 72, 1111–1121. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2008.09.024
Souza L.V., Almeida A.-A.F., Souza J.S., Mangabeira P.A.O., Jesus R.M., Pirovani C.P., Ahnert D., Baligar V., Loguercio L.L., 2013. Altered physiology, cell structure, and gene expression of Theobroma cacao seedlings subjected to Cu toxicity. Environ. Sci. Pollut. Res. 21, 1217. DOI: https://doi.org/10.1007/s11356-013-1983-4
Souza Júnior J.O., Carmello Q.A.C., Sodré G.A., 2011. Substrato e adubação fosfatada para a produção de mudas clonais de cacau. Rev. Bras. Ciênc. Solo [online]. 35, 151-159. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832011000100014.
Srivastava V., Sarkar A., Singh S., Singh P., de Araujo A.S.F., Singh R.P., 2017. Agroecological responses of heavy metal pollution with special emphasis on soil health and plant performances. Front. Environ. Sci. 5,64. DOI: https://doi: 10.3389/fenvs.2017.00064.
Taiz L., Zeiger E., Møller I.M., Murphy A. Fisiologia e desenvolvimento, 6. ed. – Porto Alegre : Artmed, 2017.
Torres C.A., Andrews P.K., Davies N.M., 2006. Physiological and biochemical responses of fruit exocarp of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) mutants to natural photo-oxidative conditions. J Exp Bot. 57, 1933-1947. DOI: https://doi.org/10.1093/jxb/erj136
Tripathi B.N., Singh V., Ezaki B., Sharma V., Gaur J.P., 2013. Mechanism of Cu and Cd induced proline hyperaccumulation in Triticum aestivum (wheat). J. Plant Growth Regul. 32, 799–808. DOI: https://doi.org/10.1007/s00344-013-9343-7
Vaahtera L. Brosché M., Wrzaczek M., Kangasjärvi J., 2014. Specificity in ROS signaling and transcript signatures. Antioxid. Redox Signal. 21, 1422–1441. DOI: 10.1089/ars.2013.5662
Yadav S.K., Dhote M., Kumar P., Sharma J., Chakrabarti T., Juwarkar A.A., 2010. Differential antioxidative enzyme responses of Jatropha curcas L. to chromium Stress. J. hazard. Mater. 180, 609–615. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2010.04.077
99
Yanus R.L., Sela H., Borojovich E.J.C., Zakon Y., Saphier M., Nikolski A., Gutflais E., Lorber A., Karpas Z., 2014. Trace elements in cocoa solids and chocolate: an ICPMS study. 119, 151-4. DOI: https://doi.org/10.1016/j.talanta.2013.10.048