MARCOS AURÉLIO DE SANTANA

ISOLAMENTO, PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E ESTUDOS

BIOLÓGICOS DA LECTINA DE SEMENTES DA

Macrotyloma axillare (E. Meyer)

Ouro Preto, março de 2004

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ISOLAMENTO, PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E ESTUDOS

BIOLÓGICOS DA LECTINA DE SEMENTES DA

Macrotyloma axillare (E. Meyer)

AUTOR: MARCOS AURÉLIO DE SANTANA

ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

Ouro Preto, março de 2004

iii

�������������� ���� �������������������������������������

����� �!��"��!��#�$%��#$��%&�'�(��)*+ ��������,) ����� ��� �) -.��/�

!�%� �"�!���������� ������0���� -��(��������%����������+1�� )0�� ���

$��%�"�$� 1��� ����������������)���%�����

iv

����������������� ������ ������������� ���������������������� ������������� ������ ���� �������������

� �������� � �������!�� ��� ��������" � �#�����������������������$�� �� � ����������%����

&�� � ����������� � �� ��&� ��'�( ������) ����� ��* ��%���+ �������( ������) ����� ��* ��%���+ �������( ������) ����� ��* ��%���+ �������( ������) ����� ��* ��%���+ �����������

, � ������������������������� ��+ ���$�- �����$�� ��������������. � ����� � ����������������� ��������� ��/��"�����/��"����

v

////"�� ���������" �� ���������" �� ���������" �� �������������� /� , �� �, �� �, �� �, �� �$� � ��� �� �� ��� �� ���� �� � ��$� &�&������$� ��� ������������� 0 ��������/"�� ������ ����� ����� ����� ��&��" ��� ������&� ���� ��&�������������������� /��+ �����, ��1 ������2 ��� ����* � ���+ �����, ��1 ������2 ��� ����* � ���+ �����, ��1 ������2 ��� ����* � ���+ �����, ��1 ������2 ��� ����* � ����� ��/� �� ��� ��/� �� ��� ��/� �� ��� ��/� �� �$�� ��������������$�� ������������������$�� �������� �$�� ������ ��� �� �$�� ��������������'���� ������ ��������� ������� ���� �� � ��� ������� ��� �� ���$� �� �� �� ���������� � �����!����� ��� �� ������ ���� ���������������

/��� 1 �� �� � ��� ��� + ���� �� ������� �� �� ��+ ���� �� ������� �� �� ��+ ���� �� ������� �� �� ��+ ���� �� ������� �� �� �� �������� � ��!��� �������� � ��!��� �������� � ��!��� �������� � ��!���$� � �� ���� �������&���������"�������� ������� ����������������

/� ��� � " ��� �� /��"�� 3 ������ ) �� ����3 ������ ) �� ����3 ������ ) �� ����3 ������ ) �� ����$� � ���� ���� �� ����� �������� ������ ���� ������������� ����������������/�, ����0 ������) �� ����$��������/�� !����/�, ����0 ������) �� ����$��������/�� !����/�, ����0 ������) �� ����$��������/�� !����/�, ����0 ������) �� ����$��������/�� !����) �� ����$� �� 3 ������ �� �� 3 � ����) �� ����$� �� 3 ������ �� �� 3 � ����) �� ����$� �� 3 ������ �� �� 3 � ����) �� ����$� �� 3 ������ �� �� 3 � ������ ������ ��" � � �� ���!���$� ����"� �� � ��� ���� ��� ������������������&�&��������������$������������ �����"�� ����� ��������

4 ��������� " ��� ���/��"���/��� 1 ����� $� + ����$� , �������/��� 1 ����� $� + ����$� , �������/��� 1 ����� $� + ����$� , �������/��� 1 ����� $� + ����$� , �������� �� 5�������� �����/���2 �����/���2 �����/���2 �����/���2 ������� �������� ������������� ���������

4 �� � � �����3 �"��6����$������ ������� ��. 7�� ��8 �" ��$��9����8 �" ��$�. 7�� ��8 �" ��$��9����8 �" ��$�. 7�� ��8 �" ��$��9����8 �" ��$�. 7�� ��8 �" ��$��9����8 �" ��$�: �����$� : �����$� � ��������; $� . �������$� * ��&����$� : ������$� 3 �����: �����$� : �����$� � ��������; $� . �������$� * ��&����$� : ������$� 3 �����: �����$� : �����$� � ��������; $� . �������$� * ��&����$� : ������$� 3 �����: �����$� : �����$� � ��������; $� . �������$� * ��&����$� : ������$� 3 �������������"� �� � ���� ���� �$� � ���� ���&!&��� �� � ���� �� ���� �� � �� �� ���� &�&������ ������������������ /��� ��� �� " ��� ��� /��"��� �� /��"��� �� 3 ������6���� �� 0 ������" ��� ��) ���!����<� /����� ��$� /��� �$� , ���) �����$� ) �%� ���$� ( ���$� , �������/����� ��$� /��� �$� , ���) �����$� ) �%� ���$� ( ���$� , �������/����� ��$� /��� �$� , ���) �����$� ) �%� ���$� ( ���$� , �������/����� ��$� /��� �$� , ���) �����$� ) �%� ���$� ( ���$� , �������� ����� ��$�* �������$�= ���> �����$�= ��" ���$�1 ������$�1 ������ ����� ��$�* �������$�= ���> �����$�= ��" ���$�1 ������$�1 ������ ����� ��$�* �������$�= ���> �����$�= ��" ���$�1 ������$�1 ������ ����� ��$�* �������$�= ���> �����$�= ��" ���$�1 ������$�1 �����$�����/��� ���&����$��" �� ���� � ���� ���� �� �� �" �� %&��� ���&�&������ � ������ �� ��� ������ ������ /"�� ������� ��������������1 ������1 ������1 ������1 �������� ������ ��������#�������� ���������������������� /�������� ���� ������� �� 3 ������6���� = ��� 2 ���� � �� ) ��"�� � ������= ��� 2 ���� � �� ) ��"�� � ������= ��� 2 ���� � �� ) ��"�� � ������= ��� 2 ���� � �� ) ��"�� � ������ ���� � ������ ���� ������� �� � ������$� �� ?�� � ������� �� ��������� &�������� � " ��� �� ������ �� ���������������������������6������ /������ �� ������ ��� ���"��� �� � ����������� �� 8 �@ �+ �0 �) �$� + ����� , ���+ ����� , ���+ ����� , ���+ ����� , ���2 �����) ��%$�+ ������, ���1 �����3 � ���$�2 �����) ��%$�+ ������, ���1 �����3 � ���$�2 �����) ��%$�+ ������, ���1 �����3 � ���$�2 �����) ��%$�+ ������, ���1 �����3 � ���$� + ������, ����������$+ ������, ����������$+ ������, ����������$+ ������, ����������$���� + ��� ��, ���+ ��� ��, ���+ ��� ��, ���+ ��� ��, ���3 � !�� ( �����3 � !�� ( �����3 � !�� ( �����3 � !�� ( �����$� + ����� , ��� - ���$� + ����� , ��� , �������� ( ������$+ ����� , ��� - ���$� + ����� , ��� , �������� ( ������$+ ����� , ��� - ���$� + ����� , ��� , �������� ( ������$+ ����� , ��� - ���$� + ����� , ��� , �������� ( ������$� * � ���&�$�� * � ���&�$�� * � ���&�$�� * � ���&�$�

vi

1 % ����$� ( %����$� /�����$� � : �" ���$� ( �%� ���1 % ����$� ( %����$� /�����$� � : �" ���$� ( �%� ���1 % ����$� ( %����$� /�����$� � : �" ���$� ( �%� ���1 % ����$� ( %����$� /�����$� � : �" ���$� ( �%� ��� �1 % ����1 % ����1 % ����1 % ����$� ( %����� ���( % ����� ���( % ����� ���( % ����� ���� + �������&�&��������������������������

A ������� � ��� ��������%����( � ��( � ��( � ��( � ��� ���������������������� � ��� ������ ����6�� � �� ��������� � ���� 8 �@ �+ �0 �) �$� �� �� ����� ���� ������ �������� ���� �� � ������$������������������������������� �����������" ��� ��/��"������� /� �� ��� ��� ��� �� ���"��� �� 1 ����� �$� ��� ����������� /������ ��� * �����$�� /������ ��� * �����$�� /������ ��� * �����$�� /������ ��� * �����$�> �� ��$� : �" ���$� 3 ����� �� 1 %����$� 1 �������$� 1 ���� �� B ��!��� �$� = �����> �� ��$� : �" ���$� 3 ����� �� 1 %����$� 1 �������$� 1 ���� �� B ��!��� �$� = �����> �� ��$� : �" ���$� 3 ����� �� 1 %����$� 1 �������$� 1 ���� �� B ��!��� �$� = �����> �� ��$� : �" ���$� 3 ����� �� 1 %����$� 1 �������$� 1 ���� �� B ��!��� �$� = �����) ��" ��$� 2 ������$� 0 � �� �$� 3 �� ��$� 3 � ������ , �������$� 1 ����� ��� * �����$�) ��" ��$� 2 ������$� 0 � �� �$� 3 �� ��$� 3 � ������ , �������$� 1 ����� ��� * �����$�) ��" ��$� 2 ������$� 0 � �� �$� 3 �� ��$� 3 � ������ , �������$� 1 ����� ��� * �����$�) ��" ��$� 2 ������$� 0 � �� �$� 3 �� ��$� 3 � ������ , �������$� 1 ����� ��� * �����$�, �������/�����$�. ������$�= � ������, �������/�����$�. ������$�= � ������, �������/�����$�. ������$�= � ������, �������/�����$�. ������$�= � ������$�C �" ���$����&���C �" ���$����&���C �" ���$����&���C �" ���$����&����������� � ������&���������������" �� %&������&�&������������ ����� /��� � ����������� � , ��� B ������� �� 8 ���������� ( �� ���� �� � , �����������, ��� B ������� �� 8 ���������� ( �� ���� �� � , �����������, ��� B ������� �� 8 ���������� ( �� ���� �� � , �����������, ��� B ������� �� 8 ���������� ( �� ���� �� � , �����������, ���$, ���$, ���$, ���$� �� 3 ������6���� �� : � ����6��� ��� �� � ��� � � �� �� � ���%����D� �/� /�: �E F @ ��&���� � �� � � ����� �� 1 ����� * ������ D@ �� �1 �* �E $�� �������� �$�� ������ �������� �������&����� ��� �� ���������: � ������%������

4 �� ������� " ��� ��� ���"��� �� 3 ������6���� �� : � ����6��� ��F �� �/�� �/�: �#@ �� �1 �* �� /� ���$� ) �����$� ( �%� ��$� , ������� �������/� ���$� ) �����$� ( �%� ��$� , ������� �������/� ���$� ) �����$� ( �%� ��$� , ������� �������/� ���$� ) �����$� ( �%� ��$� , ������� �������3 ����$� 1 ������$� 1 9����� �� 1 �����$3 ����$� 1 ������$� 1 9����� �� 1 �����$3 ����$� 1 ������$� 1 9����� �� 1 �����$3 ����$� 1 ������$� 1 9����� �� 1 �����$� � ���� ���� �� �� � ���� �� ���� � ������ ��� ������������������� ����6��� ����/"�� ������� �������������/� ���$�) ��������1 9������ ������ �������������5�, ������$�, ������$�, ������$�, ������$�� ��������&�����6�� ������� ������ �����

4 �������" ��� �����"���;������G ��� ��1 �����;������G ��� ��1 �����;������G ��� ��1 �����;������G ��� ��1 ��������+ �����, ��$�1 �����+ �����, ��$�1 �����+ �����, ��$�1 �����+ �����, ��$�1 �����( ���( ���( ���( ����� ������ �!������������������������������������������������/"�� ������� ������������� �;�������;�������;�������;������ � ���� ���� �� �� ������������� � ������ ��� �� ���������� ��� 3 ���� ��1 ���������" ��F 8 �@ �+ �0 �) ��

/� + ������ , ���� : � � ��+ ������ , ���� : � � ��+ ������ , ���� : � � ��+ ������ , ���� : � � ��� ����� B ��!��� �B ��!��� �B ��!��� �B ��!��� �� � ������������ �� � ������ ���� � ��������� ����� ������������ ���� ��" �%�������� /������ ��" ��� ���/��"���/� �����$�3 �/� �����$�3 �/� �����$�3 �/� �����$�3 � ����$�/����$�( !����$�2 �� ��$� ����$�/����$�( !����$�2 �� ��$� ����$�/����$�( !����$�2 �� ��$� ����$�/����$�( !����$�2 �� ��$�: �����: �����: �����: �����$�����"������������7����� ��* �� � �������� ��������$������������� ���%���" � ��� � ��9������� �� ���7���������� 4 � ������ ��&�� /��"�� , ���� - � �, ���� - � �, ���� - � �, ���� - � �� � ���� ���� �� �� � ���� ������ ���� ��� ������������������� �� ������������

vii

� /��� ��� �� ���"��� �� ���"��� �� * ������ 1 � ������ �HI � �� �� �� ���'$* ������ 1 � ������ �HI � �� �� �� ���'$* ������ 1 � ������ �HI � �� �� �� ���'$* ������ 1 � ������ �HI � �� �� �� ���'$� ��( ����������� 3 �������$� � ��� � ����&����� ��� ��������� �� �����$� ��������� �� ��������� ����� ������� HI � ������ �" �� ���� � ��� ������ ��� � ��� ������� �� ���� ������ �� �� � ������ ��� ������������� ����������� �� ������� �� ����� � � �������&�� ��1 � ����$����� ������������������������� ��������&� ����� �����$����� ���� ��������&�&������������ /������ �����"���: �� � ��������� ���0 ���� ���?�'�= �� ��$�= % ����$�( �%� ���= �� ��$�= % ����$�( �%� ���= �� ��$�= % ����$�( �%� ���= �� ��$�= % ����$�( �%� ����� B !����� B !����� B !����� B !���$� ����"� �� � ��� �� ��� ������ ����� �� �" �� %&��� ���&�&�����$� � ���� ���������$� � ��������" � �������� ������ ��������� �������� ����� /������ �����"�����#��� ����: �� � ���������1 ��������$�1 ������$�> ���������1 ��������$�1 ������$�> ���������1 ��������$�1 ������$�> ���������1 ��������$�1 ������$�> ���������: � �����$�: � �����$�: � �����$�: � �����$� � � ������ ������������ ���� � ������� � ���������$� �������&�� ����" ��� ���� ���� � ����� ��� ������������� ��������������$� �� ������!���� ��������&� ����� �������

/����� �" ��� �����"�� : �" ���� ��/�� !��� 1 ������: �" ���� ��/�� !��� 1 ������: �" ���� ��/�� !��� 1 ������: �" ���� ��/�� !��� 1 ������$� ����"�� ��� ������� ��( ���" ���� �������� � ��� ���0 ��� � ��'�D0 �0 ���8 ������� ��J � ���6�E $�����������"�����������0 �����$���� ����������" �� ���������� ����������������� �����" ��� ������ �����������

/� ������� ���"��� �� : � � ������ �1 ������#B �����'<� . �����$� : �����$�. �����$� : �����$�. �����$� : �����$�. �����$� : �����$�B �&����$�+ ����������1 ������B �&����$�+ ����������1 ������B �&����$�+ ����������1 ������B �&����$�+ ����������1 �������� ��������� �������&!&��������� ���� /������ �� ���"��� �� ��������<�/��9���� ( �%� ��$� ( ����� 1 ����$� ( %�����/��9���� ( �%� ��$� ( ����� 1 ����$� ( %�����/��9���� ( �%� ��$� ( ����� 1 ����$� ( %�����/��9���� ( �%� ��$� ( ����� 1 ����$� ( %�����) �����$� �%&��$� 2 ����$� 3 ��!���$� = � ������ * ����$� = � � �����$� G �) �����$� �%&��$� 2 ����$� 3 ��!���$� = � ������ * ����$� = � � �����$� G �) �����$� �%&��$� 2 ����$� 3 ��!���$� = � ������ * ����$� = � � �����$� G �) �����$� �%&��$� 2 ����$� 3 ��!���$� = � ������ * ����$� = � � �����$� G ����$� * �������$����$� * �������$����$� * �������$����$� * �������$�0 ������ 0 ����$� 0 ������ 0 ����$� + ���!���� : ������$� : �����$� ������$� : � ��" �$�0 ������ 0 ����$� 0 ������ 0 ����$� + ���!���� : ������$� : �����$� ������$� : � ��" �$�0 ������ 0 ����$� 0 ������ 0 ����$� + ���!���� : ������$� : �����$� ������$� : � ��" �$�0 ������ 0 ����$� 0 ������ 0 ����$� + ���!���� : ������$� : �����$� ������$� : � ��" �$��������$�. �!�$�������$�. �!�$�������$�. �!�$�������$�. �!�$����+ �������������� ��������������������� ��������" �������1 � ����� ��� � ������ ���� ��������������� ��&��" ��� ������������ �����������$����� � ������?� ���������� ������� ��������������&�� ���� ��������" ������ /�� + ����� , ��+ ����� , ��+ ����� , ��+ ����� , ���/� ��1 �� �!���/� ��1 �� �!���/� ��1 �� �!���/� ��1 �� �!����� �����?� ����������������������%������ ��� � ������� �������� ��" ������ ���� ���" ��������� ������ /"�� �������� ���� � ����$� � �� �������������� � ���� ���$��������� !���������������������� ����������������� �� �

viii

SUMÁRIO

Duas frações de uma lectina específica para 2-N-acetil-galactosamina foram isoladas de

sementes da Macrotyloma axillare (LMA) através de uma metodologia alternativa a

cromatografia de afinidade. As frações ativas foram purificadas por precipitação térmica

do extrato bruto a 90°C por 30 min; precipitação com etanol a frio na concentração de

20-60%, seguido de cromatografia de troca iônica em pH 8,3 procedendo-se a eluição

com gradientes crescentes isocráticos de NaCl. As frações de eluição 0,2M e 0,3M de

NaCl apresentaram atividade hemaglutinante sobre hemácias A1. A análise

eletroforética em géis de poliacrilamida-SDS a 12% das frações revela uma banda única

com massa molecular de 29 KDa. Em ensaios de estabilidade pH-dependente, foi

demonstrado que a LMA 0,2M é completamente estável no intervalo de pH de 6,0-8,0 e

a LMA 0,3M, de 5,0-9,0. Através de determinações de massa molecular por

cromatografia de exclusão molecular em pH diferentes, demonstrou-se que ambas as

isoformas 0,2M e 0,3M da LMA tendem a se comportar como tetrâmeras em pH

alcalino (8,3) e como dímeras em pH ácido e neutro (5,0 e 7,0). Ensaios de atividade

sobre hemácias nativas dos grupos sanguíneos A1, A2, B e O confirmaram a

especificidade de ambas as frações por hemácias A1, no entanto o ensaio com hemácias

tripsinizadas demonstrou que a LMA 0,3M perde sua especificidade, aglutinando

hemácias de todos os grupos; a LMA 0,2M permaneceu específica para o grupo A (mas

sem distinção qualitativa de A1 e A2. Estudos de aglutinação de cepas de Escherichia

coli com a LMA 0,2M mostraram cerca de 8% de positividade numa amostra de 103

cepas testadas, com títulos aglutinantes diferenciados, indicando que a 2-N-acetil-

galactosamina mostra-se pouco distribuída nas cepas testadas. Através de estudos de

distribuição de 99mTc-LMA 0,2M em camundongos Swiss em diferentes tempos, pôde-

se observar que a 99mTc-LMA 0,2M se concentra predominantemente nos rins e na urina

após 180 minutos, indicando uma provável ligação da lectina marcada nos rins e

transporte de lectina intacta para urina desses animais. A metodologia proposta foi

eficiente para o isolamento das duas frações ativas (0,2 e 0,3M) da lectina das sementes

da Macrotyloma axillare.

ix

ABSTRACT

Two fractions of a 2-N-acetilgalactosamine (2-NacGal) specific lectin was isolated of

Macrotyloma axillare seeds (LMA) using an alternative methodology to affinity

chromatography. The active fractions was purified by thermal precipitation of the gross

extract at 90°C for 30 minutes; precipitation with 20-60% cold ethanol, followed by ion

exchange chromatography pH 8,3 and elution in step-wise NaCl gradients. The 0,2M

and 0,3M NaCl elution intervals presented hemagglutination activity on red blood cells

A1. A ≅29KDa single band was revealed in the 12% SDS-page electrophoresis analysis.

The stability assays in different pH was demonstrated that 0,2M LMA is completely

stable in 6,0-8,0 and the 0,3M LMA, of 5,0-9,0. The tendency to form tetramers was

demonstrated in both isoforms 0,2M LMA and 0,3M LMA in alkaline pH (8,3) and

dimmer in acid and neutral pH (5,0 and 7,0), it was verified in exclusion

chromatography of molecular mass. The especificificity of both fractions was

demonstrated for red blood cells A1, using activity assays in native red blood cells (A1,

A2, B and O blood group). However, the 0,3M LMA had hemagglutination activity at

all groups of the trypsinizated red blood cells, losing its specificity in contrast with the

0,2M LMA that stayed A group specific, but without qualitative distinction of A1 and

A2. The 0,2M LMA presented positive agglutination in ≅8% of one sample with 103

Escherichia coli strains in agglutination assays. Differentiated agglutinative titles were

observed, indicating that 2-NacGal is not very distributed in the tested strains. In bio-

distribution assays, the radioactivity was detected on kidneys and in the urine after 180

minutes after the 0,2M 99mTc-LMA injections in Swiss mice, indicating a probable

specific binding of the in the kidneys and intact 0,2M 99mTc-LMA transport to the

mice’s urine. The proposed alternative method purified the two active fractions (0,2 and

0,3M) from the seeds of the Macrotyloma axillare.

x

ÍNDICE

Agradecimentos.............................................................................................................v

SUMÁRIO ................................................................................................................ viii

ABSTRACT.................................................................................................................. ix

LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................xiv

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................xv

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ xviii

1. Introdução .................................................................................................................2

1.1. O que são Lectinas? ............................................................................................2

1.2. Nomenclatura de Lectinas...................................................................................3

1.3. Classificação de Lectinas ....................................................................................4

1.3.1. Lectinas de Plantas: Leguminosas ................................................................5

1.3.2. Lectinas de Plantas: Cereais .........................................................................5

1.3.3. Lectinas de Animais: Tipo C........................................................................6

1.3.4. Lectinas Animais: Tipo S .............................................................................6

1.4. Atividades Biológicas das Lectinas .....................................................................7

1.5. Detecção e Pesquisa da Especificidade das Lectinas ...........................................8

1.6. Distribuição e Atividades das Lectinas...............................................................9

1.7. Estruturas Terciária e Quaternária de Lectinas de Leguminosas ........................11

1.7.1 Estrutura do monômero de lectinas de Leguminosas ...................................11

1.7.2. Estrutura Quaternária das Lectinas de Leguminosas ...................................12

1.8. Fundamentos das Interações Envolvidas no Reconhecimento Glicídico ............15

1.8.1. Mecanismos Moleculares Básicos ..............................................................15

1.8.2. A Especificidade Primária, a Seletividade e Multiplicidade de Ligações.....16

1.8.3. Fundamentos da especificidade de lectinas 2-N-acetilgalactosamina

específicas ...........................................................................................................18

1.9. Ocorrência da 2-NacGal e algumas de suas Particularidades Bioquímicas.........20

1.9.1. Expressão de glicoderivados contendo 2-NacGal, relação com processos

tumorais e uso de lectinas para caracterização......................................................21

1.10. Lectinas, Bactérias e Lipopolissacárides .........................................................22

1.11. As lectinas e o Sistema de grupos Sanguíneos ABO ........................................23

1.11.1. Síntese e Bioquímica dos Antígenos do Sistema ABO ..............................23

xi

1.11.2. Subgrupos do Fenótipo A e as Lectinas ....................................................26

1.11.3. Distribuição dos Antígenos em Humanos .................................................27

1.12. Aplicações das Lectinas ..................................................................................28

1.13. Relevância da Pesquisa em Lectinas de Leguminosas e a Lectina da

Macrotyloma axillare ..............................................................................................29

1.13.1. A leguminosa Macrotyloma axillare ........................................................30

1.13.2. Classificação Sistemática da Macrotyloma axillare ..................................31

2. Objetivos .................................................................................................................33

2.1. Objetivos Gerais ...............................................................................................33

2.2. Objetivos específicos ........................................................................................33

3. Materiais e Metodologias.........................................................................................35

3.1. Isolamento e Purificação da LMA.....................................................................35

3.1.1. Obtenção das Sementes da Macrotyloma axillare.......................................35

3.1.2. Preparo do Extrato Bruto a partir das Sementes..........................................35

3.1.3. Precipitação por Tratamento Térmico do EB 20%......................................35

3.1.4. Precipitação por Etanol a Frio ...................................................................36

3.1.5. Cromatografia de Troca Iônica da Fração Ativa 20-60% Etanol .................36

3.1.6. Dessalinização por Exclusão Molecular .....................................................37

3.2. Dosagem de Proteínas.......................................................................................38

3.3. Determinação da Atividade Hemaglutinante e Atividade Específica..................38

3.3.1. Obtenção da Suspensão de Hemácias .........................................................38

3.3.2. Ensaio de Hemaglutinação .........................................................................39

3.3.3. Determinação da Atividade Específica .......................................................39

3.3.4. Construção da Tabela de Purificação..........................................................39

3.4. Caracterização da LMA ....................................................................................40

3.4.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida a 12% em Condições Desnaturantes

............................................................................................................................40

3.4.2. Estabilidade em diferentes concentrações hidrogeniônicas .........................42

3.4.3. Estabilidade Térmica..................................................................................42

3.4.4. Ensaio de Dependência de Íons Cálcio(II) e Manganês(II) .........................43

3.4.5. Determinação da Massa Molecular da Proteína Nativa ...............................43

3.5. Estudos Biológicos da LMA .............................................................................44

xii

3.5.1. Ensaios de Hemaglutinação com Hemácias do Sistema ABO.....................44

3.5.2. Ensaios de Aglutinação com cepas de Escherichia coli ..............................45

3.5.3. Ensaios de Biodistribuição da 99mTc-LMA em Camundongos Swiss...........46

3.5.4. Auto-radiografia de Rins de Camundongos Swiss Injetados com 125I-LMA 49

4. Resultados ...............................................................................................................52

4.1. Isolamento e Purificação da LMA.....................................................................52

4.1.1. Precipitações Iniciais..................................................................................52

4.1.2. Perfis Eletroforéticos de Amostras dos Intervalos de Precipitação por Etanol

............................................................................................................................55

4.1.3. Cromatografia de troca Iônica da Fração 20-60% .......................................56

4.1.4. Análise Eletroforética das Frações Purificadas na Cromatografia de Troca

Iônica ..................................................................................................................57

4.1.5. Quadro geral de Purificação das Duas Frações da LMA .............................57

4.2. Caracterização da LMA ....................................................................................59

4.2.1. Ensaio de Estabilidade dependente do pH ..................................................59

4.2.2. Ensaio de Estabilidade Térmica..................................................................60

4.2.3. Dependência de Íons Cálcio e Manganês....................................................62

4.2.4. Determinação da Massa Molecular da Proteína Nativa ...............................63

4.3. Estudos Biológicos da LMA .............................................................................65

4.3.1. Estudo da Especificidade sobre Hemácias no Sistema ABO .......................65

4.3.2. Aglutinação de Cepas de Escherichia coli pela LMA 0,2M........................66

4.3.3. Estudos de Biodistribuição da 99mTc-LMA 0,2M........................................67

4.3.4. Auto Radiografia dos Rins de Camundongos Swiss ....................................72

5. Discussão ................................................................................................................74

5.1. Purificação da LMA..........................................................................................74

5.2. Caracterização da LMA ....................................................................................79

5.2.1. Ensaios de estabilidade e Dependência de Íons..........................................79

5.2.2. Determinação da Massa molecular e Estado de Agregação.........................80

5.3. Estudos Biológicos ...........................................................................................82

5.3.1. Estudos sobre Hemácias no Sistema ABO ..................................................82

5.3.2. Estudos de Aglutinação com cepas de Escherichia coli ..............................83

5.3.3. Estudos de Biodistribuição da 99mTc-LMA 0,2 M.......................................85

xiii

6. Conclusões ..............................................................................................................89

7. Referências Bibliográficas .......................................................................................92

Apêndice I...................................................................................................................98

Apêndice II .................................................................................................................99

Apêndice III ..............................................................................................................100

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

AgNO3 Nitrato de Prata BSA Soroalbumina Bovina DBL Lectina da Dolichos biflorus EB Extrato Bruto EB TT Extrato Bruto Tratado Termicamente 99mTc-LMA Lectina da Macrotyloma axillare marcada

radioquimicamente com tecnécio 99 metaestável I125-LMA Lectina da Macrotyloma axillare marcada

radioquimicamente com Iodo 125. 99mTcO2

- Tecnécio 99 metaestável “livre” 99mTcO4

- Tecnécio 99 metaestável “hidrolisado” ConA Concanavalina A cpm Contagens por minuto Fuc Fucose Gal Galactose Glc Glicose KDa Kilo Daltons LMA Lectina da Macrotyloma axillare MOPS Ácido Morfolino Propano sulfônico 2-NacGal 2-N-acetil-galactosamina NH4HCO3 Bicarbonato de Amônio NaOH Hidróxido de Sódio NaCl Cloreto de Sódio PMM Padrão de Massa Molecular % p/v Porcentagem peso por volume % v/v Porcentagem volume por volume % p/p Porcentagem peso por peso rpm Rotações por minuto SDS Dodecilssulfato de sódio CuSO4.5H2O Sulfato de Cobre Pentahidratado UAH Unidades de Atividade Hemaglutinante WGA Lectina do gérmen de trigo

xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática de uma hemaglutinação hipotética produzida

por lectinas. ...........................................................................................................7

Figura 2 - Estrutura terciária do monômero da Con A, uma lectina da leguminosa

Canavalia ensiforms Modificado de Loris e cols.(1998). ......................................12

Figura 3 - Representação esquemática da estrutura quaternária da DBL (Hamelryck e

cols., 1999). .........................................................................................................14

Figura 4 - Posições dos íons Ca(II) e Mn(II) nas proximidades do sítio de ligação

glicídico da Concanavalina A (Loris e cols., 1998). .............................................16

Figura 5 - Representação esquemática do sítio de ligação glicídico de um monômero de

lectina com o efeito de ligações multiplas adicionais. Adaptado de Kennedy e cols.

(1995)..................................................................................................................17

Figura 6 - Estruturas químicas da N-acetilgalactosamina e da Galactose. ....................18

Figura 7 - Representação esquemática das ligações de hidrogênio envolvidas no

reconhecimento 2-NacGal-DBL...........................................................................19

Figura 8 - Seqüência esquemática da via de síntese dos antígenos do sistema ABO. ....25

Figura 9 - Macrotyloma axillare; à esquerda, foto da planta adulta e à direita , foto das

sementes, as quais foram utilizadas nesse trabalho para o isolamento da LMA

(FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED

NATIONS, 2003)..................................................................................................30

Figura 10 - Ilustração esquemática da Macrotyloma axillare. (1) ramos de folhas e

caule, (2) flor e (3) vagem com sementes (Better Pastures for the Tropics -

Axillaris.htm, 2003). ............................................................................................31

Figura 11 - Fluxograma de isolamento e purificação das frações ativas 0,2 e 0,3M da

LMA....................................................................................................................37

Figura 12 - Gráfico das atividades hemaglutinantes específicas do Extrato Bruto (EB) a

20% de sementes pulverizadas da Macrotyloma axillare e do Extrato Bruto

Tratado Termicamente a 90°C por 30 minutos (EB TT). ......................................52

Figura 13 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida-SDS a 12% do Extrato Bruto

de sementes da M. axillare (EB) e do Extrato Bruto tratado termicamente a 90°C

por 30 minutos(EB TT)........................................................................................53

xvi

Figura 14 - Gráfico das atividades hemaglutinantes específicas obtidas nas faixas de

precipitação do EBTT por etanol comercial a frio. ...............................................54

Figura 15 - Perfis eletroforéticos em géis de poliacrilamida a 12% das amostras obtidas

na precipitação por etanol do Extrato Bruto das sementes de Macrotyloma axillare.

............................................................................................................................55

Figura 16 - Perfil cromatográfico da fração precipitada a 20-60% de etanol em coluna

de Q-Sepharose pH 8,3; com eluição em gradientes isocráticos de NaCl. ...........56

Figura 17 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida-SDS a 12% das duas frações

ativas da LMA isoladas pela cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose pH

8,3. ......................................................................................................................57

Figura 18 - Gráfico das atividades hemaglutinantes residuais sobre hemácias A1, obtidas

no ensaio de estabilidade dependente do pH.........................................................59

Figura 19 - Ensaio de Estabilidade térmica da Fração de LMA 0,2M..........................60

Figura 20 - Ensaio de Estabilidade térmica da fração 0,3M da LMA...........................61

Figura 21 - Atividade residual de amostras das etapas de purificação em presença de

EDTA e após titulação com íons Cálcio (II) e Manganês (II). .............................62

Figura 22 - Perfis cromatográficos em Sephacryl HR S200 da fração 0,2M da LMA em

pH 8,5 e em pH7,0...............................................................................................63

Figura 23 - Massas moleculares das proteínas nativas LMA 0,2M e 0,3M em pH 5,0;

7,0 e 8,5; realizadas em coluna cromatográfica de exclusão molecular de Sephacryl

HR S200. ...........................................................................................................64

Figura 24 - Atividade aglutinante da LMA fração 0,2M sobre as cepas de Escherichia

coli, com seus respectivos títulos aglutinantes......................................................66

Figura 25 - Gráfico sumário dos ensaios de deslocamento da 99mTc-LMA pela LMA

nativa...................................................................................................................68

Figura 26 - Perfil de eliminação da 99mTc-LMA 0,2M nos órgãos mais significativos. 69

Figura 27 - Perfil cromatográfico em Sephadex G25 do “ pool” de urina dos animais

dos grupos relativos aos tempos de 30 e 60 minutos.............................................70

Figura 28 - Gráfico dos ensaios de biodistribuição da 99mTc – LMA 0,2M nos diferentes

tempos. ................................................................................................................71

Figura 29 - Auto-radiografia dos Rins de camundongos injetados com 125I-LMA 0,2M.

............................................................................................................................72

xvii

Figura 30 - Reta padrão de dosagem de proteínas pelo Método de Lowry. ..................98

Figura 31 - Reta padrão das cromatografias de exclusão molecular..............................99

Figura 32 - Estrutura química sintética do melhor ligante glicídico da DBL (derivado do

Tetrassacáride determinante do antígeno Sda. Modificado de Blanco e cols.(2001).

..........................................................................................................................100

xviii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação de Lectinas do Grupo II em famílias (Sharon, 1993). ...............5

Tabela 2 - Distribuição e atividades das lectinas nos organismos vivos. Adaptado de

Singh e cols., (1999) ..............................................................................................9

Tabela 3 - Principais diferenças qualitativas e quantitativas dos subgrupos A1 e A2.....27

Tabela 4 - Protocolo experimental da avaliação do deslocamento da 99mTc-LMA pela

LMA nativa no ensaio de atividade hemaglutinante. ...........................................48

Tabela 5 - Quadro geral de purificação das duas isoformas da LMA............................58

Tabela 6 - Potência relativa à atividade hemaglutinante sobre hemácias A1 das frações

da LMA 0,2 e 0,3M sobre hemácias nativas e tratadas com tripsina no sistema

ABO. ...................................................................................................................65

Tabela 7 -. Porcentagens de pureza radioquímica dos experimentos de marcação da

LMA 0,2M com 99mTc. ........................................................................................67

Tabela 8 - Pontos da reta padrão utilizados para a dosagem de proteínas......................98

Tabela 9 - Volumes de eluição obtidos dos padrões de massa molecular......................99

�

23�������)-4��

������)-4��

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. O que são Lectinas?

As lectinas são uma classe estruturalmente diversa de proteínas, as quais

possuem a capacidade de se ligarem reversivelmente em carboidratos com considerável

especificidade (Sharon, 1993). São proteínas ligantes de origem não-imune e

oligoméricas, ou seja, são constituídas de monômeros arranjados tridimensionalmente,

formando dímeros, tetrâmeros, heterodímeros, etc. Podem ser monovalentes, um sítio

ligante glicídico por monômero, ou polivalentes mais de um sítio ligante glicídico por

monômero. Devido a essas propriedades ligantes, as lectinas possuem inúmeras

atividades biológicas importantes, tais como a habilidade de aglutinar eritrócitos,

linfócitos, fibroblastos, espermatozóides, fungos, bactérias e células vegetais. Devido à

atividade aglutinante, as lectinas também são referidas como aglutininas. Além do sítio

ligante para o carboidrato específico, algumas lectinas também possuem um segundo

tipo de sítio ligante que se interage com ligantes não-glicídicos, como por exemplo,

bases nitrogenadas (Singh e cols., 1999).

A pesquisa de lectinas originou-se nos fins do século XIX, com o isolamento da

Ricina por Hermann Sttilmark em 1888 (Barondes, 1988). A Ricina, isolada de

sementes de Ricinus communis, tornou-se então a primeira lectina de origem vegetal a

ser descoberta. Essa lectina é uma proteína heterodimérica (2 monômeros não idênticos)

com especificidade de ligação para Galactose e 2-N-acetil-galactosamina (Lord, 1994).

No entanto, o interesse pelas lectinas tornou-se mais evidente na década de 60 do século

XX, período no qual os estudos das propriedades aglutinantes e ligantes dessas

proteínas começaram a chamar a atenção dos pesquisadores. Tais propriedades

tornavam as lectinas reagentes úteis para a detecção, isolamento e caracterização parcial

de glicoproteínas, bem como possibilitar o estudo das mudanças dos padrões glicídicos

que podem ocorrer no glicocálice nas superfícies celulares durante o desenvolvimento,

diferenciação e transformação neoplástica. Já na década de 80 e início dos anos 90 do

século passado, o interesse em lectinas intensificou-se consideravelmente devido ao fato

dessas proteínas estarem envolvidas na mediação do reconhecimento celular em muitos

sistemas biológicos, tais como a adesão de bactérias, vírus e protozoários em células de

hospedeiros (pré-requisito para a infecção); adesão de leucócitos em células do

������)-4��

3

endotélio vascular, o que é um fator decisivo do trânsito dessas células nos sistemas

vivos e também para sua atuação na defesa contra os patógenos (Sharon, 1993).

Por essas particularidades as lectinas podem ser aplicadas nos diversos campos

de interesse clínico e biotecnológico, tais como: tipagem de eritrócitos, transporte de

agentes quimioterápicos, indução de mitose, marcação taxonômica de microrganismos

específicos, entre outros.

1.2. Nomenclatura de Lectinas

As lectinas são normalmente designadas por nomes originados da denominação

científica das espécies das quais foram purificadas. Assim, sempre que possível, a

designação das lectinas deve ser preferida pelo uso do nome científico das espécies das

quais foram isoladas, purificadas ou identificadas. Como exemplo prático, podemos

fazer referência aos nomes de algumas lectinas isoladas e caracterizadas:

• Lectina da Dolichos biflorus , ou DBL (Etzler & Kabat, 1970);

• Concanavalina A ou ConA, proveniente da Canavalia ensiformes (Kennedy e

cols., 1995); entre outras. Normalmente os trabalhos científicos costumam

utilizar uma sigla proveniente do nome completo da lectina para assim referi-la

com maior facilidade, como visto acima.

Os trabalhos bibliográficos também designam as lectinas em função de suas

especificidades glicídicas, como por exemplo Lectina específica para D-galactose da

Zea mays (Martinez-Cruz e cols., 2001).

Devido a possibilidade de ocorrência de lectinas diferentes em uma mesma

espécie, a inclusão do tecido, órgão ou partes da espécie provedora também se torna

necessária, como por exemplo Lectina específica para D-galactose de sementes da

Erythrina speciosa (Konozy e cols., 2003).

Lectinas encontradas em tecidos animais (Lectinas Endógenas) são normalmente

denominadas em função da sua localização nos diversos tipos celulares específicos,

como por exemplo: Lectinas específicas para D-Galactose da parede corporal do

anelídeo Neanthes japonica (Ozeki e cols., 1997).

������)-4��

4

1.3. Classificação de Lectinas

As lectinas podem ser classificadas de acordo com muitos critérios; tais como

similaridade na seqüência de aminoácidos, especificidade glicídica e conformação

tridimensional. Com a finalidade de identificar e agrupar lectinas pela compreensão dos

mecanismos de reconhecimento Lectina-Carboidrato, torna-se conveniente classificar

essas proteínas de acordo com as características topológicas do sítio ligante glicídico.

Essa localização é extremamente importante, uma vez que a topologia define a categoria

de atividade da lectina, pois a acessibilidade do ligante ao sítio de reconhecimento

determina mecanismos de reconhecimento distintos. Sendo assim, tais proteínas podem

ser divididas em dois grupos principais (Elgavish & Shaanan, 1997):

• Grupo I: lectinas de transporte, tais como as proteínas tranportadoras

periplasmáticas bacterianas e as enzimas. Os sítios ligantes glicídicos dessas

proteínas se encontram topologicamente mais internos (“enterrados”, engolfando

o ligante completamente) e apresentam padrões de reconhecimento que lhes são

próprios.

• Grupo II: lectinas que apresentam um sítio ligante glicídico mais externo e

topologicamente raso; formando, na maioria das vezes, uma depressão

superficial molecular que acomoda o carboidrato ligante. Nesse grupo,

encontramos grande parte das lectinas conhecidas, divididas em famílias

clássicas de acordo com sua procedência ou mesmo especificidades glicídicas.

De acordo com o exposto acima, as lectinas do grupo II compreendem proteínas

que, basicamente, se ligam e reconhecem glicídeos sem que haja qualquer mudança

química ou enzimática no ligante após a efetiva ligação. Essa ligação ocorre em um sítio

ligante topologicamente externo e superficial, não ocorrendo um “engolfamento” do

ligante, como ocorre nas lectinas do grupo I. As funções e atividades das lectinas do

grupo II são relacionadas ao reconhecimento e ligação ao seu carboidrato específico.

Essas lectinas podem ser divididas em famílias, as quais são resumidas na tabela

seguinte.

������)-4��

5

Tabela 1 - Classificação de Lectinas do Grupo II em famílias (Sharon, 1993).

Tipo de Lectina

Especificidade Massa Molecular

dos Monômeros

(KDa)

Número de Monômeros

Sítios Ligantes glicídicos

por monômero

Ligações Dissulfeto

Íons Metálicos Coordenados

Lectinas de Plantas

Legumes Diversa 25-30 2 ou 4 1 - Ca+2, Mn+2

Cereais NacGlc

AcNeu

18 2 2 ++ -

Lectinas de Animais

Tipo-C Diversa >>15 Variável 1-8 + Ca+2

Tipo-S Galactose 14-35 ? 1 - -

1.3.1. Lectinas de Plantas: Leguminosas

As lectinas de leguminosas formam uma grande família de proteínas homólogas.

Cerca de 50 lectinas de legumes já foram seqüenciadas e a porcentagem do grau de

homologia determinada foi não muito menor do 35%; ou seja, essas lectinas

apresentam várias regiões homólogas conservadas, mesmo sendo provenientes de

espécies diferentes (Loris e cols., 1998). Membros representantes dessa família já

tiveram suas estruturas tridimensionais estudadas e seus dados cristalográficos já se

encontram depositados no Banco de Dados disponível pela Rede Mundial de

Computadores (Internet).

1.3.2. Lectinas de Plantas: Cereais

A Lectina do Gérmen de Trigo (WGA) é a lectina mais estudada dessa família.

As lectinas desse grupo possuem especificidade para 2-N-Acetilglicosamina e Ácido N-

acetilneuroamínico. Lectinas provenientes do centeio, cevada e algumas gramíneas

também apresentam essas especificidades, bem como homologias estruturais e critérios

químicos e bioquímicos semelhantes. A lectina do Gérmen de Trigo é uma proteína

dimérica, constituída de dois monômeros idênticos, sendo cada monômero formado de

quatro domínios estruturais de quarenta e três aminoácidos. Esses domínios são

������)-4��

6

arranjados e dobrados de maneira similar, apresentando ligações dissulfeto posicionadas

identicamente em cada monômero.

1.3.3. Lectinas de Animais: Tipo C

As lectinas Animais do Tipo C são proteínas de grande interesse. Essa família

inclui receptores endocíticos tais como as lectinas hepáticas; receptores de macrófagos

que funcionam na fagocitose de microorganismos patogênicos; lectinas mediadoras da

adesão de leucócitos às células endoteliais e de leucócitos à tecidos linfóides e sítios de

inflamação (selectinas). Cada uma dessas lectinas contém um ou mais domínios de

reconhecimento para os carboidratos específicos, combinados com outros domínios

responsáveis por outras funções da molécula.

Os domínios de reconhecimento de carboidratos dessas lectinas são compostos

por cerca de cento e vinte aminoácidos, dos quais quatorze são invariáveis e outros

dezoito são mantidos em características estruturais. Todas as lectinas do tipo C

requerem diretamente Cálcio (II) como metal de coordenação ligante no domínio de

reconhecimento dos carboidratos. A especificidade pelo carboidrato, de acordo com a

tabela anterior, é diversa; mas todas essas lectinas exigem a presença de Cálcio (II) no

domínio de ligação glicídico. O papel do Cálcio (II) como ligante direto no sítio de

reconhecimento dessas lectinas difere do papel do Cálcio (II) e do Manganês (II)

observado na família de lectinas de leguminosas. Nessas últimas, como será exposto

posteriormente com mais detalhes, os íons metálicos não se coordenam diretamente ao

carboidrato ligante, mas com os aminoácidos integrantes das imediações do sítio de

reconhecimento, sem que haja nenhuma interação química entre os metais e o

carboidrato ligante.

1.3.4. Lectinas Animais: Tipo S

As lectinas do tipo S, também conhecidas como Galectinas, são lectinas animais

que possuem especificidade por galactose. Essas lectinas não requerem íons metálicos

divalentes para a manutenção direta ou indireta do sítio ligante. Essas lectinas são

importantes na modulação das interações célula-célula, como por exemplo, na regulação

do crescimento celular e nos mecanismos de adesão celular.

������)-4��

7

1.4. Atividades Biológicas das Lectinas

As atividades biológicas das lectinas são usualmente baseadas na ligação

específica aos carboidratos. Como as mesmas são oligoméricas, possuindo monômeros

mono ou polivalentes, as lectinas promovem aglutinação. Essa aglutinação é resultado

da interação de carboidratos com sítios ligantes disponíveis na molécula da lectina. A

lectina oligomérica estabelece uma ponte ligante entre as células, formando uma rede

que se aglutina. Esse fenômeno é umas ferramentas auxiliares na avaliação da atividade

das lectinas, uma vez que a aglutinação pode ser vista facilmente após um período de

incubação adequado. Grande parte das lectinas, com raras exceções, se ligam em

carboidratos presentes na superfície de eritrócitos, promovendo portanto

hemaglutinação quando ensaiadas com suspensões dessas células (Fig.1). Stillmark, em

1888, observou que extratos de Ricinus comunis produziam aglutinação de eritrócitos;

esse foi um dos achados que o levou a descoberta da primeira lectina reportada, a ricina

(Kennedy e cols., 1995; Barondes, 1988).

Figura 1 - Representação esquemática de uma hemaglutinação hipotética produzida por lectinas.

Grande parte das células possui carboidratos em suas superfícies, na forma de

glicoproteínas, glicolípides e polissacarídeos. Esses carboidratos, na maioria das vezes,

possuem a habilidade de codificarem informações biológicas importantes cruciais nos

mecanismos de interação célula-célula (Lis & Sharon, 1984; Lis & Sharon, 1986). A

grande diversidade das estruturas dos carboidratos é devida à configuração anomérica

de suas unidades glicosídicas e a ocorrência de cadeias laterais. Teoricamente, quatro

diferentes monossacárides podem formar 35.560 tetrassacarídeos distintos, enquanto

������)-4��

8

que 4 aminoácidos ou nucleotídeos podem formar apenas 24 arranjos de estruturas

distintas. Outras diversidades estruturais adicionais podem ocorrer devido a ligações

covalentes de diferentes grupos funcionais, tais como grupos sulfato, fosfato, acetil,

entre outros. Tal diversidade dos glicoconjugados, solúveis ou ancorados, pode

modificar efetivamente as atividades de proteínas ligantes desses conjugados; por esse

motivo, as lectinas podem ser úteis como marcadores da diferenciação celular,

desenvolvimento, caracterização de doenças e estados patológicos (Singh e cols., 1999;

Schmidt, 1987).

Além dessas funções relacionadas ao reconhecimento, modificação de atividade

de proteínas ligantes e detecção por aglutinação, as lectinas também podem ser

utilizadas como marcadores químicos. Como são ligantes de carboidratos específicos,

elas podem ser utilizadas para a pesquisa e identificação desses carboidratos em

superfícies celulares. Muitas vezes a presença de determinado carboidrato específico

simples ou complexo pode estar relacionada com uma célula modificada ou

diferenciada, ou mesmo com cepas diferentes, em caso de bactérias ou protozoários.

Assim, as lectinas poderiam ser utilizadas para identificação e caracterização de

determinadas subespécies desses microorganismos, juntamente com procedimentos de

sorotipagem. Dessa maneira, com a combinação da especificidade e afinidade dos

anticorpos e uma informação química específica da constituição glicídica provida por

lectinas, uma identificação pode se tornar bem mais poderosa e efetiva.

1.5. Detecção e Pesquisa da Especificidade das Lectinas

Landstein e Raubischek, em 1908, foram os primeiros a trabalharem a

especificidade de lectinas. Eles observaram que vários extratos de lectinas de legumes

promoviam diferentes propriedades hemaglutinantes quando ensaiados com eritrócitos

de diferentes animais. Alguns desses extratos aglutinavam fracamente ou mesmo não

aglutinavam eritrócitos humanos (Kennedy e cols., 1995).

A atividade ligante das lectinas com especificidade pelos diferentes tipos

sanguíneos pode ser fortemente inibida pelos monossacárides determinantes dos

respectivos grupos sanguíneos; como por exemplo, 2-N-acetilgalactosamina e L-fucose

que inibem as lectinas específicas por eritrócitos do tipo A e O, respectivamente.

������)-4��

9

Em casos de novas lectinas com especificidades ainda indeterminadas, amostras

de diversos carboidratos, células e lectinas de especificidade definida podem ser usados

para a elucidação da natureza de especificidade dessas novas proteínas.

1.6. Distribuição e Atividades das Lectinas

Com o grande avanço da pesquisa em lectinas foi demonstrado que essas

proteínas não eram exclusividades das células vegetais; mas de considerável ubiqüidade

na natureza. A tabela seguinte relaciona as fontes (origem das lectinas) e atividades das

lectinas na natureza, com algumas de suas funções principais e/ou aplicações.

Tabela 2 - Distribuição e atividades das lectinas nos organismos vivos. Adaptado de Singh e cols.(1999)

Origem das

Lectinas

Atividades e Funções

Viral Os vírus possuem glicoproteínas que possibilitam sua interação com

células-alvo, algumas dessas glicoproteínas possuem a capacidade de

aglutinar eritrócitos via interação com o ácido N-acetil-neuroamínico

presente na membrana destas células. Em muitos casos essas interações

são pré-requisitos para a infecção viral.

Bacteriana Muitos membros da família Enterobacteriaceae possuem lectinas em

seus pili que são essenciais para sua adesão no epitélio instestinal,

conduzindo às infecções. Várias lectinas bacterianas de superfície estão

relacionadas com infecções devido ao reconhecimento específico de

carboidratos presentes no hospedeiro.

Protozoários Lectinas estão associadas com a invasão e ruptura da mucosa intestinal

pela Entamoeba histolytica, conduzindo a disenteria em humanos. As

lectinas do protozoário não só facilitam a aderência às células intestinais

durante os estágios iniciais, como podem aumentar a ligação do parasita

a outras células e tecidos ou mesmo a outras bactérias, aumentando

assim a virulência.

������)-4��

10

Fungos

Filamentosos

e Leveduras

Diferenciações de formas fúngicas vegetativas para formas agregadas

podem envolver um reconhecimento específico célula-célula mediado

por lectinas específicas. Algumas leveduras possuem lectinas em suas

paredes celulares que promovem agregação e posterior floculação das

células

Invertebrados Muitas lectinas já foram isoladas da hemolinfa e dos órgãos sexuais de

moluscos e artrópodes. Suas funções têm sido comparadas com as

imunoglobulinas presentes nos vertebrados; no entanto essa analogia

ainda está longe de ser estabelecida; uma vez que as lectinas isoladas,

com exceção de poucas, apresentam especificidades semelhantes

(resíduos de ácido siálico).

Vertebrados Apresentam lectinas solúveis ou ancoradas em membranas. Algumas

foram descobertas recentemente, como as Selectinas, uma família de

moléculas de adesão expressa em plaquetas, células endoteliais e

linfócitos. Muitas funções podem ser relacionadas a essas lectinas, tais

como: adesão de células normais; adesão de células tumorais

(metástases); participação na fagocitose de células (lectinas superficiais

de macrófagos ativados); regulação do crescimento, controle da

diferenciação celular, entre outras.

Lectinas de

Plantas

Primeiras a serem estudadas, sendo isoladas de todas as partes vegetais.

Suas funções nos vegetais estão sendo estudas e algumas já foram

relacionadas com a mediação simbiótica entre bactérias fixadoras de

nitrogênio e raízes de leguminosas. Uma lectina específica envolvida na

interação com os fatores de nodulação dos simbiontes (carboidratos

complexos da superfície bacteriana) foi isolada e estudada (Etzler e

cols., 1999; Kalsi & Etzler, 2000). Essa lectina (isolada de raízes da

Dolichos biflorus) possui especificidade para 2-NacGal e também

apresenta atividade de fosfohidrolase ou apirásica (hidrólise de fosfatos

provenientes de ATP ou ADP). Essa lectina possui estrutura diversa e

não apresenta homologia com as demais lectinas conhecidas, sejam de

plantas, animais ou bacterianas.

������)-4��

11

1.7. Estruturas Terciária e Quaternária de Lectinas de Leguminosas

Nesse trabalho de purificação, isolou-se uma lectina específica para a N-

acetilgalactosamina, proveniente de uma leguminosa; portanto, a seguir serão

abordados temas estruturais moleculares relacionados com as lectinas de leguminosas,

com ênfase em lectinas específicas para 2-N-Acetil-galactosamina e análogas, por

possuírem similaridade e homologia características.

1.7.1 Estrutura do monômero de lectinas de Leguminosas

As estruturas terciárias dos monômeros das lectinas de leguminosas são

estruturalmente bem conservadas. Ela consiste de dois domínios de folhas β-pregueadas

dobradas sobre si mesmas formando uma estrutura globular característica determinante

do sítio de ligação ao carboidrato (especificidade primária). Esse sítio possui uma

“tríade” de aminoácidos relativamente bem conservada dentre as lectinas de

leguminosas: Ácido Aspártico, Asparagina e glicina, os quais discriminam os glicídeos

ligantes através de ligações de hidrogênio entre suas cadeias laterais e as hidroxilas do

carboidrato. Essa constitui uma grande habilidade dessas lectinas: diferenciam seus

ligantes por ligações de hidrogênio estabelecidas com um grupo comum de cadeias

laterais de aminoácidos (Sharon, 1993).

A atividade ligante das lectinas de leguminosas dependem da presença

simultânea do íon Cálcio(II) e de um íon metálico de transição, usualmente

Manganês(II), coordenados próximos ao sítio de ligação ao carboidrato. Dentre os

ligantes que coordenam esses metais, encontramos as cadeias laterais de ácidos

Aspárticos, inclusive aquele pertencente a tríade envolvida diretamente na ligação ao

carboidrato. As cadeias laterais podem coordenar diretamente os íons metálicos através

de seus pares de elétrons disponíveis ou então utilizarem pontes de água para,

indiretamente, estabilizarem a coordenação metálica.

������)-4��

12

Figura 2 - Estrutura terciária do monômero da Con A, uma lectina da leguminosa Canavalia ensiforms

Modificado de Loris e cols.(1998).

Em (A), a estrutura esquemática tridimensional; o íon Mn(II) está em cinza e o íon Ca(II) em preto; o

resíduo de Asp208 indicado é integrante do sítio de ligação glicídico (membro da tríade). Em (B), está o

esquema dos dois domínios de folhas β-pregueadas, o N e o C terminal da cadeia polipeptídica.

1.7.2. Estrutura Quaternária das Lectinas de Leguminosas

Como descrito anteriormente, as lectinas são definidas como proteínas ligantes

de carboidratos de origem não-inune que são capazes de aglutinar células ou precipitar

carboidratos complexos, sem atividade enzimática sob os mesmos. Essa aglutinação é

decorrente de múltiplos sítios de ligação, os quais são obtidos pela organização dos

monômeros em dímeros ou tetrâmeros. Poucas exceções são observadas dentre as

lectinas de leguminosas, tais como aquelas que apresentam uma organização

monomérica, mas com mais de um sítio ligante (monômero polivalente).

������)-4��

13

A grande maioria das lectinas de leguminosas forma uma estrutura quaternária

típica denominada de Dímero Canônico (originalmente do inglês Canonical Legume

Lectin Dimer); o qual foi descrito pela primeira vez para a Concanvalina A e para a

Lectina da Ervilha. Esse dímero canônico constitui uma estrutura razoavelmente

conservada entre essa família de lectinas. O dímero é constituído de doze folhas β-

pregueadas trançadas, resultante da associação de dois monômeros (idênticos ou não)

constituídos de seis folhas β-pregueadas entrelaçadas (Loris e cols., 1998). Antes da

dimerização, processamentos pós-traducionais dos monômeros podem ocorrer para que

as interações entre os monômeros sejam favorecidas.

A lectina da semente da Dolichos biflorus (DBL) é uma lectina tetramérica,

igualmente específica para a 2-N-acetilgalactosamina. A lectina das sementes da

Macrotyloma axillare (LMA) é uma lectina estritamente relacionada com a DBL, com

elevado grau de homologia e também apresenta especificidade pela 2-NacGal (Haylett

& Swart, 1982). O tetrâmero da DBL é formado por um “dímero de dímeros”, cada

dímero é formado por dois monômeros ligeiramente diferentes (heterodímero).

Acredita-se que os monômeros são transcritos idênticos, mas durante a formação dos

dímeros, um dos monômeros sofre clivagem proteolítica na região C-terminal e perde os

aminoácidos responsáveis pela única porção em α-hélice do monômero (processamento

pós-traducional). A clivagem dessa α-hélice é necessária, pois a alocação das duas

hélices desfavorece estericamente a formação do dímero e conseqüentemente do

tetrâmero. Existem algumas evidências que esse processamento pós-traducional é

importante para a obtenção do tetrâmero de DBL ativo, pois as subunidades menores

(processadas) purificadas e agregadas não se ligam à 2-NacGal, enquanto que as

subunidades íntegras (não-processadas) formam oligômeros de massa molecular

anômala, diferente do tetrâmero. Além disso, cristais formados de DBL recombinantes

contendo apenas monômeros intactos, apresentam uma mistura de monômeros intactos

e clivados (Hamelryck e cols., 1999).

A D. biflorus possui uma lectina vegetativa, denominada de DB58, a qual foi

isolada por Talbot & Etzler (1978). Essa lectina é um heterodímero, formado por um

monômero intacto e outro processado; ela está presente nas folhas e em outros tecidos

vegetativos da Dolichos biflorus. Os monômeros da DB58 possuem uma homologia

quase idêntica com os monômeros da DBL, no entanto as poucas substituições de

������)-4��

14

alguns aminoácidos, já são suficientes para que seja desfavorecida a formação de um

tetrâmero a partir de duas DB58. A substituição de apenas um dos aminoácidos

envolvidos na interação do dímero afetam a conformação e a flexibilidade do mesmo, o

que inviabiliza a montagem do possível tetrâmero, pelo menos de uma maneira mais

estável em solução. No entanto essa modificação não proíbe a formação do tetrâmero

em condições adequadas e controladas, o que pode possibilitar sua manipulação com

reagentes de ligação cruzada ou ligantes multivalentes (Buts e cols., 2001).

A montagem da estrutura terciária da DBL e da DB58 determina a formação de

uma cavidade hidrofóbica entre os monômeros. Essa cavidade é ligante de nucleosídeos

de Adenina. Como descrito nos tópicos iniciais, algumas lectinas possuem sítios

ligantes para outras moléculas. Algumas lectinas ligam-se em nucleosídeos de Adenina

e hormônios vegetais derivados de adenina (citocininas). Usualmente esses ligantes não-

glicídicos podem apresentar magnitudes de afinidade muito superiores às de ligação aos

carboidratos. A função exata desse sítio ligante ainda é obscura, no entanto as lectinas

ligantes de Adenina e citicininas podem estar envolvidas no armazenamento desses

hormônios e no crescimento e desenvolvimento vegetal (Hamelryck e cols., 1999).

Figura 3 - Representação esquemática da estrutura quaternária da DBL (Hamelryck e cols., 1999).

Em (a), têm-se o dímero canônico presente no tetrâmero da DBL, ambos os monômeros são idênticos

(AB). Ambos os monômeros são representados em cores diferentes. As α-hélices de ambos os

monômeros (intactos) são representadas em vermelho, elas são ausentes na outra dupla de monômeros (C-

terminal clivados - CD). A extremidade C-terminal do monômero intacto e do clivado está representada

de vermelho e amarelo, respectivamente. Os íons Ca(II) e Mn(II) estão representados pelas esferas cinzas

������)-4��

15

maior e menor , respectivamente. Em (b), estrutura do tetrâmero da DBL ligada às quatro adeninas, duas

por dímero (esferas em azul e verde); os dois tipos de interações entre os dímeros (interfaces ββ e αβ) são

indicados; o dímero AB é indicado com as mesmas cores do que em (a), os íons metálicos também são

indicados como em (a); os quatros sítios de ligação para a 2-NacGal são indicados pelo asterisco.

A DB58, lectina dímera encontrada nas partes vegetativas da Dolichos biflorus,

como o caule e as folhas, possui uma estrutura tridimensional idêntica à metade do

tetrâmero da DBL, delimitada pelas letras AC ou BD, de acordo com a Fig.3.

1.8. Fundamentos das Interações Envolvidas no Reconhecimento Glicídico

1.8.1. Mecanismos Moleculares Básicos

Os carboidratos interagem com as lectinas através de ligações de hidrogênio,

coordenação metálica e interações hidrofóbicas. A disponibilidade de grande número de

grupamentos hidroxila na estrutura dos carboidratos ligantes possibilita a formação de

uma rede complexa de contatos cooperativos lectina-carboidrato, via ligações de

hidrogênio, onde o grupamento hidroxila funciona como aceptor e/ou doador. Os

átomos de cadeias laterais de aminoácidos, tais como Ácido Aspártico e Asparagina,

hidrogênios de ligações amídicas e o oxigênio das carbonilas participam, usualmente,

das ligações de hidrogênios envolvidas na interação com o carboidrato. Outras cadeias

laterais de outros aminoácidos participam com menos freqüência. As ligações de

hidrogênio na interface lectina-carboidrato podem ser diretas ou mediadas por

moléculas de água (Elgavish & Shaanan, 1997).

Os cátions divalentes, tais como o Ca(II) e o Mn(II) nas lectinas de leguminosas,

estão envolvidos indiretamente no mecanismo molecular de reconhecimento glicídico.

Os íons estão localizados coordenados próximos a esse sítio de reconhecimento nas

lectinas de leguminosas. As cadeias laterais dos aminoácidos Ácido Aspártico e

Asparagina coordenam esses cátions, a Asparagina também faz uma ligação de

hidrogênio com o glicídeo ligante. Portanto, além de servirem para a manutenção da

integridade das subunidades dessas lectinas, os íons metálicos ajustam os resíduos de

aminoácidos envolvidos no sítio ligante glicídico, auxiliando-os na interação com o

carboidrato; no entanto não interagem diretamente com mesmo. Nas lectinas animais do

Tipo C, o carboidrato ligante coordena diretamente com íon Cálcio(II) por meio de duas

������)-4��

16

hidroxilas e as demais são estabelecidas com as cadeias laterais dos aminoácidos

Asparagina e Ácido Glutâmico (conservados nas lectinas tipo C), próximos ao sítio de

ligação do carboidrato. As demais ligações de coordenação do íon Cálcio(II) são

estabelecidas com quatro grupamentos carbonila provenientes desses mesmos

aminoácidos citados(Sharon, 1993).

Figura 4 - Posições dos íons Ca(II) e Mn(II) nas proximidades do sítio de ligação glicídico da

Concanavalina A (Loris e cols., 1998).

Apesar da característica hidrofílica dos carboidratos, as interações hidrofóbicas

estabelecem uma função principal no reconhecimento glicídico pelas lectinas. Essas

interações são particularmente notáveis em lectinas específicas para galactose, onde

existe uma formação de carga parcial positiva formada pelos prótons de uma das faces

do anel glicídico com uma carga parcial negativa, formada pelos elétrons π de um

aminoácido com cadeia lateral aromático.

1.8.2. A Especificidade Primária, a Seletividade e Multiplicidade de Ligações

As lectinas, embora sejam ligantes específicas de carboidratos, possuem uma

afinidade relativamente baixa por monossacarídeos (na ordem de mM). A seletividade

das lectinas por seus alvos naturais específicos dá-se em função de múltiplos sítios de

ligação adicionais àqueles que determinam a especificidade. Os sítios determinantes da

especificidade são denominados sítios primários. A multiplicidade de ligações é

proporcionada por subsítios de ligação (ou sítios extendidos) ou por subunidades

multivalentes (Elgavish & Shaanan, 1997).

������)-4��

17

Em ligações que envolvem subsítios, um monossacáride (carboidrato

específico), usualmente terminal, está intimamente ligado no sítio primário da lectina

juntamente com os monossacárides posteriores da cadeia do oligossacáride. Esses

monossacárides se ligam em sub-sítios da lectina, possibilitando uma magnitude

seletiva muito maior do que aquela obtida com o monossacáride sozinho.

Figura 5 - Representação esquemática do sítio de ligação glicídico de um monômero de lectina com o

efeito de ligações multiplas adicionais. Adaptado de Kennedy e cols. (1995).

As linhas cheias representam o sítio de especificidade primária, ou seja, o sítio determinante do

monossacáride específico. As linhas tracejadas representam as interações adicionais entre os subsítios da

lectina e os demais glicídeos que formam o oligossacáride.

Enquanto a seletividade fundamental das lectinas é provavelmente devida aos

mecanismos de múltiplas ligações adicionais, o fator discriminatório mais importante no

reconhecimento glicídico continua sendo a ligação ao sítio primário específico da

lectina. Esse sítio também é indicativo do tipo de oligossacáride ou carboidrato

complexo que poderá ser reconhecido pela lectina. Portanto, lectinas específicas para

manose se ligam em séries de carboidratos complexos portadoras de resíduos de

Manose ou Glicose terminais e lectinas específicas para galactose vão se ligar em séries

de oligossacárides ou cadeias complexas de carboidratos que contenham resíduos

terminais de galactose (Elgavish & Shaanan, 1997). As interações adicionais, aquelas

devidas aos subsítios, serão efetivadas pelos carboidratos posteriores ao carboidrato

ligante terminal no sítio primário (como visto esquematicamente na Fig. 5).

������)-4��

18

1.8.3. Fundamentos da especificidade de lectinas 2-N-acetilgalactosamina específicas

Embora os mecanismos moleculares de reconhecimento glicídico sejam muito

semelhantes e comuns entre as lectinas de leguminosas, cada especificidade de uma

dada família de lectinas envolve uma estereoquímica única e característica, a qual é

determinante do sítio principal de ligação ao carboidrato. Essa estereoquímica

proporciona uma discriminação de ligantes suficientemente efetiva, de forma a

distinguir diferenças sutis em determinadas configurações de átomos da estrutura dos

carbonos assimétricos presentes nos carboidratos. Isso pode ser demonstrado quando se

comparam as lectinas específicas para Manose/Glicose e para Galactose: a única

diferença estrutural entre esses carboidratos é a configuração estereoquímica da

hidroxila do carbono 4 (equatorial na manose/glicose e axial na galactose), o que já é

suficiente para que as lectinas específicas respectivas estabeleçam sua discriminação

(Elgavish & Shaanan, 1997).

Figura 6 - Estruturas químicas da N-acetilgalactosamina e da Galactose.

Para uma melhor compreensão das interações envolvidas no reconhecimento

das lectinas específicas para 2-NacGal, a Lectina da Dolichos biflorus ou DBL é uma

boa ferramenta de estudo. A DBL é uma lectina tetrâmera que possui, dentre todas as

lectinas específicas para 2-NacGal, uma seletividade muito maior para 2-N-

acetilgalactosamina do que para a Galactose (Hamelryck e cols., 1999). A 2- N-

acetilgalactosamina se liga ao sítio de especificidade primária através da tríade de

resíduos de aminoácidos conservada entre as demais lectinas (Asp85, Gly103 e Asn129,

no caso da DBL) e também próxima ao sítio de coordenação com os íons metálicos; os

quais são formados de aminoácidos também conservados entre as demais lectinas. Na

������)-4��

19

figura a seguir tem-se um esquema sumário das ligações de hidrogênio presentes na

ligação da 2-N-acetilgalactosamina no sítio primário da DBL.

Figura 7 - Representação esquemática das ligações de hidrogênio envolvidas no reconhecimento

2-NacGal-DBL.

Em (A) tem-se o padrão de ligações de hidrogênio presentes no sítio de ligação da 2-NacGal à DBL, os

aminoácidos são representados por abreviaturas; em (B) temos uma representação bidimensional da 2-

NacGal (em branco) no sítio ligante da DBL determinado segundo dados de cristalografia, os átomos em

vermelho são Oxigênios e em azul-escuro são Nitrogênios, todas as seqüências de aminoácidos

envolvidos na ligação são representados por letras do alfabeto para melhor visualização do sítio ligante.

Veja as explicações das seqüências coloridas dos aminoácidos no texto. Modificado de Loris e cols.,

(1998) para (A) e de Hamelryck e cols. (1999) para (B).

As interações específicas envolvidas na ligação 2-NacGal-DBL podem assim ser

resumidas: a cadeia lateral do resíduo de Asp85 (precedido de Ala84, ambos em azul na

fig.7), estabelece ligações de hidrogênio com as hidroxilas dos carbonos 3 e 4 da 2-

NacGal; o oxigênio carbonílico da cadeia lateral do resíduo de Asn129 (em amarelo, na

fig.6) auxilia na coordenação do Ca(II) e o átomo de nitrogênio do grupo amida (ligação

peptítica) faz ligação de hidrogênio com a hidroxila no carbono 4; a hidroxila do

carbono 3 da 2-NacGal compartilha ligação de hidrogênio com o nitrogênio do grupo

amida da Gly103 e o hidrogênio desta (cadeia lateral) faz ligação com o oxigênio

������)-4��

20

carbonílico do grupo N-acetil da 2-NacGal. Ligações de hidrogênio adicionais são

observadas entre o oxigênio da cadeia lateral da Ser215 (em verde na fig.6) e a hidroxila

do carbono 6, e entre o nitrogênio amídico da Leu214 (também em verde) e a hidroxila

do carbono 4 da 2-NacGal. O efeito estérico e hidrofóbico da presença da cadeia lateral

da Leu214 é responsável pela preferência da DBL pelos anômeros α da 2-NacGal,

uma vez que as hidroxilas configuradas em β não se interagem com uma cadeia lateral

hidrofóbica como a Leu (Hamelryck e cols., 1999). Os aminoácidos Leu214 e Ser215

(em verde na fig.6) formam o “loop” de especificidade da DBL. Em adição às ligações

de hidrogênio, as Interações Hidrofóbicas exercem um papel importante na ligação

específica: as cadeias laterais de Tyr104 e Trp132 (em laranja e amarelo,

respectivamente na fig.6) formam um “bolso” hidrofóbico que interage com o grupo

metil pertencente ao grupamento N-acetil da 2-NacGal (susbstituinte em C2).

1.9. Ocorrência da 2-NacGal e algumas de suas Particularidades Bioquímicas

As glicoproteínas presentes no tecido conjuntivo, o ácido hialurônico, a

condroitina (cartilagem) são exemplos de moléculas que possuem a 2-NacGal como

parte integrante de seus esqueletos. As mucinas (glicosaminoglicanas) são

glicoproteínas com elevada constituição glicídica secretadas de forma ubíqua na

superfície de epitélios e outros tecidos, tais glicoproteínas também possuem 2-NacGal

em seus esqueletos. Esse aminoaçúcar, em condições normais, está presente nessas

estruturas glicídicas formando estruturas complexas e ramificadas com outros açúcares.

As glicoproteínas, de forma geral, constituem importantes componentes da

comunicação celular nos organismos multicelulares. Em muitos casos a porção glicídica

das glicoproteínas são responsáveis por importantes funções biológicas e além disso, a

glicosilação também estabiliza conformações, protege da proteólise e também modifica

as propriedades físico-químicas das mesmas (Brocke & Kunz, 2002).

������)-4��

21

1.9.1. Expressão de glicoderivados contendo 2-NacGal, relação com processos tumorais

e uso de lectinas para caracterização

Muitos dos antígenos associados aos processos tumorais constituem estruturas

glicídicas expressas na forma de glicoproteínas ou glicolípides na superfície de células

tumorais. Essas estruturas podem ser decorrentes do acúmulo de precursores

glicosilados incompletos (baixa atividade de enzimas produzidas), produção de novos

oligossacarídeos (glicosilação aberrante), mudanças da densidade de unidades glicídicas

nas superfícies celulares e/ou exposição de cadeias glicídicas que normalmente são

ocultas. Em muitos casos, essas mudanças na expressão glicídica podem determinar o

comportamento metastático de células tumorais (perda da adesividade em função de

novos glicídeos e/ou encurtamento das respectivas cadeias). Dentre essas estruturas

glicídicas o Antígeno T (Galβ1→32-NacGalαO-Serina/Treonina) e o Antígeno Tn (2-

NacGalαO-Serina/Treonina) foram identificadas em 90% dos adenocarcinomas,

inclusive aqueles no ovário e mama (Avichezer & Arnon, 1996).

Os antígenos T e Tn foram primeiramente identificados nas mucinas, as quais

são glicoproteínas excessivamente O-glicosiladas. Em condições normais as mucinas

possuem oligossacárides complexos caracterizadas por unidades de 2-NacGal O-ligadas

em serinas ou treoninas. Em células tumorais a expressão das mucinas é aumentada:

cerca de 50% a mais de sítios não usuais de O-glicosilação com 2-NacGal (cadeias

curtas); alterando assim as cadeias de glicídeos, ocorrendo glicosilações imcompletas e

adições prematuras de ácido siálico (Brocke & Kunz, 2002; Roy & Baek, 2002).

Os antígenos T e Tn podem ser reconhecidos por lectinas Gal/2-NacGal

específicas tais como a Lectina da Viccia villosa B4 (VVL B4) e a Lectina da Arachis

hypogaea (PNL). Essas lectinas foram utilizadas como ferramentas de estudo desses

antígenos em células de carcinoma ovariano, sendo significativamente reativas em

linhagens desses carcinomas (Avichezer & Arnon, 1996). Nesses estudos, metodologias

de marcação de lectinas com compostos radioativos, tais como o 125I, foram utilizadas

para procedimento de radioimunoensaios e autoradiografias.

Recentemente a estrutura do complexo Lectina da Viccia villosa B4 (VVLB4) e

o antígeno Tn foi determinada por cristalografia de raios X. O antígeno Tn se liga à

VVLB4 de modo similar a outros complexos de lectinas com Gal/2-NacGal, sem

muitas diferenças (Babino e cols., 2003). As ligações de hidrogênios no sítio de ligação

������)-4��

22

ao carboidrato são mantidas com a tríade típica: Ácido Aspártico 85, Asparagina 129 e

Glicina 103 (da mesma maneira que na DBL).

A lectina da Dolichos biflorus ou DBL possui afinidade muito baixa para a Gal e

muito maior para a 2-NacGal, portanto é capaz de distinguir Gal de 2-NacGal. Mesmo

com essa especificidade a DBL não se liga ao antígeno Tn, no entanto a DBL possui

afinidades de ligação maiores para o Dissacáride de Forssman (D-2-NacGal-α [1→3]-

D-2-NacGal) e para o Antígeno A (sistema ABO, detalhado a seguir); sua ligação com o

antígeno Tn é muito baixa ou inexistente (Wu & Sugii, 1991).

1.10. Lectinas, Bactérias e Lipopolissacárides

As bactérias Gram negativas possuem uma superfície externa recoberta por

lipopolissacárides de baixas massas moleculares (LPS), os quais exibem extensiva

diversidade imunogênica. Muitos espécimes Gram negativos patogênicos podem variar

a expressão dos epitopos terminais da porção oligossacarídica do LPS, o que é uma

vantagem para a sobrevivência desses espécimes quando confrontados em diferentes

ambientes e respostas imunes do hospedeiro durante a fase patogênica. Muitas

estruturas da porção oligossacarídica do LPS têm sido determinadas quimicamente,

como o da Escherichia coli O-101 enterotoxigênica (Staaf e cols., 1997). Essa cepa de

E. coli produz enterotoxinas que são causas de diarréias em animais e também em

humanos. A porção oligossacarídica do LPS dessa cepa é constituída da unidade

dissacarídica repetitiva [→6)-α-D-Glicosamina-(1→4)-α-D-2-N-acetil-galactosamina-

(1→].

Muitas informações da natureza glicídica do LPS de bactérias podem ser obtidas

com uso de lectinas através de estudos de aglutinação. Como as lectinas são específicas

por seus carboidratos ligantes, estas podem servir como ferramentas adicionais de

identificação de cepas de bactérias, pois a variabilidade do LPS pode definir estágios ou

cepas diferentes desses espécimes. Com essa finalidade, muitos estudos de ligação de

lectinas em bactérias já foram realizados, como por exemplo, o estudo da ligação da

ConA em cepas de Streptococcus mutans e seu efeito na aderência do microorganismo

in vitro. A ConA aglutinou 13 dos 15 sorotipos utilizados e sua ligação não interferiu

������)-4��

23

na adesão dessas bactérias in vitro (Hamada e cols., 1977). Essa é uma das aplicações

onde as lectinas podem ser utilizadas como ferramentas bioquímicas tanto de

identificação, como em outros estudos envolvendo o reconhecimento de carboidratos.

Isso é possível porque muitos dos oligossacárides presentes na superfície das bactérias

estão envolvidos na adesão das mesmas em seus hospedeiros, inclusive os LPS.

Além de estudos de aglutinação de células bacterianas, lectinas marcadas

isotopicamente, radioquimicamente, ou com compostos fluorescentes também podem

ser utilizadas para investigação em biologia. Estudos da ligação de isolados de

patógenos bacterianos oculares in vitro foram realizados através do uso de várias

lectinas com diversas especificidades marcadas com fluoresceína. Desses patógenos, as

espécies de Streptococcus foram positivas para a DBL enquanto que os espécimes de

Streptococcus foram negativos (Avni e cols., 1987).

1.11. As lectinas e o Sistema de grupos Sanguíneos ABO

Em 1900, os antígenos glicídicos A e B do sistema de grupos sanguíneos ABO e

seus correspondentes anticorpos foram identificados por Karl Landsteiner, pela

observação de que o soro de certos indivíduos aglutinava os eritrócitos de outros. Esse

achado demonstrou uma característica única desse sistema: o soro de indivíduos normal

quase sempre contém hemaglutininas potentes contra os antígenos que ele não possui.

Essa particularidade não está associada com outros sistemas de antígenos de grupos

sanguíneos.

Existem outros sistemas de grupos sanguíneos baseados em antígenos glicídicos

e outros sistemas baseados em antígenos protéicos, como por exemplo, o Sistema Rh

(fator ou antígeno Rh), sistema MN, Duffy; que também são importantes na

imunohematologia, principalmente o sistema Rh, o qual é sempre determinado na rotina

laboratorial de tipagem sanguínea juntamente com o sistema ABO (Henry, 1996).

1.11.1. Síntese e Bioquímica dos Antígenos do Sistema ABO

Os antígenos do sistema ABO são oligossacárides ligados covalentemente nos

domínios de proteínas integrais, proteínas transmembrana, e nos esfingolípides

������)-4��

24

estruturais das hemácias. As plaquetas e linfócitos também possuem os antígenos desse

sistema, os quais são adquiridos por adsorção passiva de glicolípides do plasma.

A produção dos antígenos ABO depende da ação seqüencial de transferases

específicas codificadas pelos genes H e ABO. Essas enzimas transferem um açúcar

específico de um nucleotídeo doador às cadeias glicídicas do precursor. As

especificidades antigênicas são determinadas pela configuração molecular do açúcar

terminal imunodominante,o qual foi adicionado pela transferase.

Abaixo está esquematizada a via de síntese dos antígenos do sistema ABO:

������)-4��

25

Figura 8 - Seqüência esquemática da via de síntese dos antígenos do sistema ABO.

Modificado de (Mathews & K.E.Van Holde, 1996).

O gene H codifica a fucosil transferase que atua primeiro ligando a L-fucose

(Fuc) ao segundo carbono da galactose terminal do precursor. Após a produção do

antígeno H, as transferases codificadas pelos genes A ou B transferem 2-NacGal ou

Galactose, respectivamente, ao terceiro carbono da galactose terminal; produzindo pois

os antígenos A e B respectivamente.

������)-4��

26

Segundo estudos de clonagem e sequenciamento de DNA, os genes A e B,

possuem largas seções de similaridade, no entanto apresentam quatro substituições de

aminoácidos claras, o que pode explicar a diferença de especificidade dos substratos

dessas enzimas. O gene alelo O é similar à seqüência nucleotídica dos genes A e B, no

entanto possui uma deleção na posição 258, a qual modifica a matriz de leitura durante a

tradução, resultando numa enzima inativa. Portanto, esses estudos comprovam que o

gene O é um gene “silencioso” ou amorfo; de forma similar, técnicas moleculares têm

sido utilizadas para identificar polimorfismos genéticos que explicam a presença do

subgrupo A2 e outros fenótipos raros tais como A3, Ax, e cis-AB.

1.11.2. Subgrupos do Fenótipo A e as Lectinas

Os fenótipos comuns do sistema ABO incluem os grupos A, B, O e AB. O

fenótipo A pode se subdividir, principalmente, em subgrupos A1, A2, os quais ocorrem

em 80% e 20% de toda a população A, respectivamente. Há ainda a ocorrência dos

subgrupos raros A3 e Ax e há também outras subdivisões dentre o fenótipo B, as quais

são vistas ocasionalmente. Essas subdivisões ocasionais são de pouca importância

prática no que diz respeito à transfusão sanguínea.

Os subgrupos principais do fenótipo A podem ser distinguidos pela ausência ou

pela presença de aglutinação com a Lectina Anti-A1 da Dolichos biflorus (DBL), dada a

sua especificidade por resíduos de N-acetilgalactosamina, os quais são determinantes do

grupo A. Mesmo sendo a 2-NacGal o determinante glicídico do grupo A, a diferenciação

dos subgrupos A1 e A2 pode ser realizada devido a algumas diferenças quantitativas e

qualitativas existentes entre esses subgrupos, as quais são resumidas na tabela a seguir.

������)-4��

27

Tabela 3 - Principais diferenças qualitativas e quantitativas dos subgrupos A1 e A2.

Modificado de Henry (1996).

A1 A2

Diferenças Quantitativas

Reação com Anti-A1 diluído ++++ ++

Número de sítios antigênicos

Adulto

Recém-nascido

1.000.000

310.000

250.000

140.000

Diferenças Qualitativas

Reação com DBL anti-A1 ++++ 0 Anti-A1 no soro Não 1-8%

Variantes das cadeias de

glicolípies presentes nos

eritrócitos

Aa, Ab, Ac, Ad

(lineares e ramificadas)

Aa, Ab

(Somente Cadeias lineares)

Atividade da N-acetyl-

galactosaminyltransferase

Atividade Normal

(ótima em pH 6)

Atividade diminuída

(ótima em pH 7)

Tais diferenças quantitativas e qualitativas inviabilizam uma hemaglutinação

visível em condições normais para o subtipo A2.

Estudos cristalográficos da DBL complexada com o trissacáride determinante

do grupo sanguíneo A (2-NacGal-Gal-Fucose) já foram realizados e grande parte da

densidade eletrônica observada na interação do trissacáride com a DBL é devida ao

resíduo de 2-NacGal ligada em seu sítio de especificidade. Os demais constituintes do

trissacáride, Fucα(1→2)Gal, não estão firmemente ligados na DBL, mas as interações

adicionais desses subsítios são significativas (Hamelryck e cols., 1999).

1.11.3. Distribuição dos Antígenos em Humanos

Os antígenos do sistema ABO podem ser detectados em recém-nascidos de 6

semanas; no entanto, a expressão completa desses antígenos assim como a encontrada

nos adultos só irá ocorrer após os 3 anos de idade. Os antígenos do sistema ABO são de

distribuição ubíqua nos tecidos humanos: estão presentes nos epitélios, endotélios e

como substâncias solúveis em secreções e líquidos biológicos. Essa expressiva

distribuição nos tecidos, combinada com a presença de anticorpos potentes pré-

������)-4��

28

formados, torna o Sistema ABO de grande importância nas transfusões sanguíneas e

transplantes de órgãos.

1.12. Aplicações das Lectinas

A disponibilidade de um grande número de lectinas com especificidades

glicídicas diferentes e distintas resultou na utilização dessas proteínas como ferramentas

úteis na pesquisa médica e biológica. As lectinas podem ser utilizadas para explorar a

superfície celular pela ligação nas porções glicídicas de glicoproteínas ou glicolípides

projetados das células. Essas proteínas versáteis são também utilizadas para tipagem de

grupos sanguíneos como mostrado no item anterior; como agentes mitogênicos

(algumas lectinas, como a ConA estimulam a mitose de certos tipos de linfócitos); como

sondas de detecção de alterações durante o crescimento e transformação celular. Tais

proteínas também podem ser imobilizadas em matrizes inertes para produção de colunas

cromatográficas de afinidade para purificação de glicoproteínas. Muitas lectinas com

especificidades distintas já foram ligadas com isotiocianato de fluoresceína e estão

disponíveis comercialmente para trabalhos aplicados nos diferentes ramos de pesquisa

em biologia. Além das lectinas marcadas com fluoresceína, as lectinas também podem

ser prontamente marcadas com isótopos radioativos sem perda de suas capacidades

ligantes (Kennedy e cols., 1995).

Somente como estimativa do uso das lectinas em trabalhos científicos, uma

única busca realizada pela rede mundial de computadores, no sítio do Pubmed

utilizando somente a palavra Lectin, obtiveram-se 65.981 citações nos últimos 30 anos e

com a sigla DBL obtiveram-se 446 citações.

A ampla participação dos carboidratos no reconhecimento celular é uma

demonstração das ações de lectinas in vivo. Assim, os usos dessas moléculas in vitro

mostram que essas proteínas são uma ferramenta fundamental no conhecimento dos

mecanismos que envolvem a codificação glicídica em biomoléculas. Portanto, a

obtenção de lectinas por métodos de purificação a partir de suas fontes é de extrema

importância para a pesquisa científica em biologia. As lectinas podem ser isoladas por

cromatografia de afinidade, a qual é baseada na habilidade destas proteínas em ligar-se

especificamente e reversivelmente aos carboidratos. Outros processos também podem

������)-4��

29

ser utilizados, tais como a precipitação dos extratos iniciais por sais, solventes orgânicos

e por outros processos cromatográficos como os de exclusão molecular e troca iônica

(Kennedy e cols., 1995).

1.13. Relevância da Pesquisa em Lectinas de Leguminosas e a Lectina da

Macrotyloma axillare

As sementes de leguminosas são reconhecidas fontes de lectinas: mais de 70

lectinas de várias plantas leguminosas já foram isoladas e caracterizadas, sendo a maior

parte delas provenientes das sementes (Sharon, 1993). Essas lectinas são sistemas-

modelo de escolha para o estudo dos eventos de reconhecimento proteína-carboidrato,

os quais são de grande importância biológica e biotecnológica, como discutido nos

tópicos iniciais. Essa escolha é baseada na relativa facilidade de purificação e

isolamento de grandes quantidades de lectinas a partir de extratos das sementes. Além

disso essas lectinas apresentam uma grande variedade de especificidades glicídicas,

mesmo possuindo grande homologia entre si. Apesar do pouco conhecimento das

funções das lectinas de leguminosas in vivo, suas especificidades glicídicas variadas

tornaram tais proteínas importantes “reagentes” biotecnológicos na pesquisa em

imunologia e glicobiologia Tais especificidades também permitiram a utilização das

lectinas de leguninosas para o isolamento e caracterização de carboidratos complexos e

glicoconjugados. Assim a função “in vitro” dessas proteínas é bem documentada e as

bases moleculares dessas interações são demonstradas por uma variedade de técnicas

biofísicas, tais como a cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear e

microcalorimetria. Além disso, a propriedade aglutinante das lectinas, devido à sua

oligomerização, é bastante explorada na aglutinação de células e de carboidratos

multivalentes (Loris e cols., 1998).

������)-4��

30

1.13.1. A leguminosa Macrotyloma axillare

A Macrotyloma axillare é uma leguminosa rasteira, perene, constituída de

caules pilosos e com folhas verdes brilhantes trifoliadas. Suas flores são amarelas

esverdeadas e as vagens pilosas são ligeiramente reclinadas, contendo de 7 a 8 sementes

por vagem. A M. axillare é uma planta de origem africana, com distribuição abundante

na África Tropical, podendo assim, ser cultivada em países de clima tropical e

subtropical. (United States Department of Agriculture - Plants Database, 2003). Esta

leguminosa é utilizada normalmente como forragem, ou seja, como pastagem e

alimentação para o gado. Apresentada boa produtividade em solos argilosos ricos em

fosfatos. A M. axillaris cresce vigorosamente no verão, continua crescendo durante o

outono, suportando bem as estações secas, como o inverno e continua crescer na

primavera (Better Pastures for the Tropics - Axillaris.htm, 2003).

Em função da facilidade de obtenção das sementes da Macrotyloma axillare em

grandes quantidades e da importância biotecnológica das lectinas, torna-se evidente o

interesse em desenvolver metodologias de isolamento e purificação mais rentáveis e

preparativas da Lectina da Macrotyloma axillare (LMA). Assim, nesse trabalho foi

proposta uma metodologia de purificação e isolamento da LMA por métodos menos

dispendiosos e que podem ser aplicados em escala industrial.

Figura 9 - Macrotyloma axillare; à esquerda, foto da planta adulta e à direita , foto das sementes, as

quais foram utilizadas nesse trabalho para o isolamento da LMA (FAO - FOOD AND AGRICULTURE

ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, 2003).

������)-4��

31

1.13.2. Classificação Sistemática da Macrotyloma axillare

• Sinonímia: Dolichos axillaris (E. Meyer); Clitoria vividiflora (Boulton);

• Nomes Comuns: Archer (Austrália), Grama de cavalo (Perenial horsegram);

• Informações Taxonômicas (United States Department of Agriculture - Plants

Database, 2003):

o Reino: Plantae - Plantas

o Sub-Reino: Tracheobionta - Traqueófita (plantas vasculares)

o Superdivisão: Spermatophyta - Plantas com sementes

o Divisão: Magnoliophyta - Plantas com Flores

o Classe: Magnoliopsida - Dicotiledôneas

o Sub-classe: Rosidae

o Ordem: Fabales

o Família: Fabaceae - Família das ervilhas

o Gênero: Macrotyloma (Wight & Arnott) Verdc.

o Espécie: Macrotyloma axillare (E. Meyer) Verdc.

Figura 10 - Ilustração esquemática da Macrotyloma axillare. (1) ramos de folhas e caule, (2) flor e (3)

vagem com sementes (Better Pastures for the Tropics - Axillaris.htm, 2003).

53��6�� 1��

��6�� 1���

33

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivos Gerais

Propor uma nova metodologia de isolamento e purificação da lectina das

sementes de Macrotyloma axillare (LMA) e estudar algumas de suas propriedades

físico-químicas e biológicas.

2.2. Objetivos específicos

I. Purificar a LMA através de precipitação por etanol e cromatografia de troca

iônica.

II. Determinação das propriedades físico-químicas: estado de agregação em função

do pH; dependência de íons Cálcio (II) e Manganês (II); estabilidades térmica e

pH-dependente.

III. Estudos de especificidade da LMA sobre hemácias, nativas e tratadas com

tripsina, no sistema de tipagem sanguínea ABO.

IV. Caracterização de cepas de Escherichia coli através da aglutinação pela LMA.

V. Estudo da Biodistribuição da 99mTc-LMA (lectina marcada radioquimicamente

com tecnécio 99 metaestável) em camundongos swiss após administração

intravenosa.

73������ � �����������, ���

����� � �����������, ���

35

3. MATERIAIS E METODOLOGIAS

3.1. Isolamento e Purificação da LMA

3.1.1. Obtenção das Sementes da Macrotyloma axillare

As sementes da M. axillare foram doadas pela EPAMIG (Empresa de Pesquisa

Agropecuária de Minas Gerais).

3.1.2. Preparo do Extrato Bruto a partir das Sementes

As sementes foram pulverizadas em moinho industrial e o pó obtido foi

tamizado e armazenado a –20°C.

Com o objetivo de definir as melhores condições para extração da lectina do pó

das sementes (Extrato Bruto), vários procedimentos de extração foram conduzidos. Os

tempos de extração e as quantidades porcentuais de pó de sementes foram

sistematicamente variados até a obtenção de um extrato bruto com máxima atividade.

Tais condições foram padronizadas e o protocolo de obtenção desse extrato protéico foi

utilizado para todos os lotes de purificação realizados nesse trabalho. O protocolo de

preparação do EB foi assim determinado:

• 20g de pó das sementes foram medidos em um béquer de 200ml, em seguida

completou-se o volume para 100ml com solução de NaCl 0,15M, enriquecida

com MnCl2 0,005M e CaCl2 0,005M (EB a 20% p/v). A suspensão obtida foi

deixada, sem agitação, em repouso por 12 horas a 4°C. Não se utilizou

incubação com agitação pelo fato da ocorrência de desnaturação pela agitação

(formação de espuma). Após a incubação, a suspensão foi filtrada em gaze e o

bagaço retido foi lavado com o veículo extrator até completar o volume de

100ml de EB. O EB assim obtido foi submetido a centrifugação a 6500 rpm por

30 minutos a 4°C para remoção de fibras insolúveis presentes.

3.1.3. Precipitação por Tratamento Térmico do EB 20%

O EB 20% obtido foi submetido a 90°C em um banho-maria por 30 minutos e

em seguida resfriado rapidamente em banho de gelo. O material proveniente desse

����� � �����������, ���

36

tratamento, EB TT, foi submetido a uma centrifugação a 6500rpm por 30 minutos a

4°C.

3.1.4. Precipitação por Etanol a Frio

Procedeu-se a precipitação do EB TT, a 4°C, com adição de volumes

crescentes de etanol (96°GL, a –20°C) perfazendo concentrações finais de 20, 40, 60 e

80% (Scopes, 1987). Após a adição de cada volume de etanol, a solução foi incubada

em banho de gelo por 15 minutos; os precipitados de cada fração foram obtidos por

centrifugação a 4°C por 30 minutos a 6.500 rpm.

Tendo em vista os acréscimos de volume à solução inicial, os volumes de etanol

necessários para a precipitação de cada fração foram calculados segundo a equação:

2

12

100)(1000

)(C

CCmlV

−−

= ; onde:

V, é numericamente igual ao volume de etanol a ser adicionado a uma solução

líquida pronta contendo C1% v/v, para que a concentração se torne C2%, para um litro

de solução inicial.

Esses precipitados foram ressolubilizados em tampão NaHCO3 0,01M pH 8,3 e

em seguida novamente centrifugados para obtenção de uma solução límpida. A

atividade específica de cada fração foi então determinada.

3.1.5. Cromatografia de Troca Iônica da Fração Ativa 20-60% Etanol

O material ressuspendido correspondente à fração 20-60% foi aplicado em uma

coluna cromatográfica (6,0 cm x 1,5 cm) preenchida com resina trocadora de carga

positiva (Q-Sepharose� - Pharmacia LKB Biotechnology) equilibrada em tampão

NH4HCO3 0,01M pH 8,3.

Procedeu-se a eluição por meio de soluções de NaCl tamponadas com NH4HCO3

0,01M pH 8,3 em intervalos de concentrações isocráticas crescentes (0,00; 0,10; 0,20;

0,30; 0,40; 0,50 e 1,00 M). O fluxo cromatográfico foi ajustado para 1ml por minuto,

desde a aplicação da amostra até sua subseqüente eluição, coletando-se frações de 4ml.

As frações coletadas foram monitoradas pela medida da absorvância a 280 nm para

obtenção do cromatograma.

����� � �����������, ���

37

3.1.6. Dessalinização por Exclusão Molecular

As frações correspondentes aos intervalos isocráticos de NaCl (ativas nos

ensaios de hemaglutinação) foram reunidas e dessalinizadas por exclusão molecular em

coluna de Sephadex G25 (Pharmacia – faixa de fracionamento de 1 a 5KDa) com

dimensões de 18cm x 3,5cm. A coluna foi equilibrada com NH4HCO3 0,01M pH 8,3 e

previamente calibrada com Dextrano Azul (MM>>1000KDa). De acordo com a

calibração, para um volume máximo de 40ml de amostra; foi descartado o primeiro

volume de 55ml, recolhendo-se 45ml subseqüentes. Esse material foi submetido ao

processo de secagem por liofilização. Os pós obtidos foram armazenados a –20°C, para

posterior determinação da atividade específica e trabalhos posteriores.

Em todas as etapas de purificação foram retiradas amostras para dosagem de

proteínas, determinação da atividade hemaglutinante e caracterização eletroforética.

Figura 11 - Fluxograma de isolamento e purificação das frações ativas 0,2 e 0,3M da LMA.

����� � �����������, ���

38

3.2. Dosagem de Proteínas

As dosagens de proteínas foram determinadas através do método colorimétrico

utilizando o reagente Folin-Ciocauteau (Lowry e cols., 1951). O padrão de proteína

utilizado como referência foi a soroalbumina bovina (BSA), em soluções de 20 a 100

µg/ml para obtenção de uma reta-padrão.

Protocolo de preparo dos reagentes necessários para a dosagem:

• Reagente A: 0,50g de CuSO4.5H2O e 1,00g de Citrato de Sódio foram

dissolvidos em 100 ml de água destilada.

• Reagente B: 20,00g de Na2CO3 e 4,00g de NaOH foram dissolvidos em 1,00 l

de água destilada.

• Reagente C: para cada 50,00 ml de reagente B, adicionou-se 1,00 ml de

Reagente A.

• Reagente D: para cada 10,00 ml de Reagente Fenol Folin-Ciocalteu adicionou-

se a mesma quantidade de água destilada.

O método foi modificado proporcionalmente para melhor adequação aos

equipamentos disponíveis no laboratório. Assim, para 250µl de solução contendo até

40µg de proteína, são adicionados 1,25ml de Reagente C; transcorrido um intervalo de

5-10 minutos, foram então adicionados 125µl de Reagente D. Assim, após 30 minutos

de incubação à temperatura ambiente, mediu-se a absorvância da mistura reacional a

660nm. Com o valor de absorvância medido, a concentração de proteína foi

determinada através da equação da reta-padrão obtida com as soluções de BSA

(Apêndice I).

3.3. Determinação da Atividade Hemaglutinante e Atividade Específica

3.3.1. Obtenção da Suspensão de Hemácias

Sangues humanos totais de doadores voluntários foram coletados em presença

de Citrato de Sódio a 3,8% p/v como anticoagulante. O sangue foi submetido à

centrifugação por 10 minutos a 4.000 rpm em centrífuga clínica; o plasma foi

descartado e as hemácias foram lavadas com solução de NaCl 0,15M por três ciclos

seguidos de centrifugações a 4.000 rpm, sempre descartando o sobrenadante. As

����� � �����������, ���

39

hemácias lavadas foram guardadas a 4°C até o momento de preparo da suspensão. Essa

suspensão foi preparada na proporção de 2,5% v/v de “concentrado” de hemácias em

volume suficiente de solução de NaCl 0,15M + MnCl2 0,005M e CaCl2 0,005M.

3.3.2. Ensaio de Hemaglutinação

As amostras ativas (100µl) eram diluídas em série em NaCl 0,15M + MnCl2

0,005M e CaCl2 0,005M em placas de microtitulação de 96 × 12 poços com fundo em

V ou U, para possibilitar a visualização do sedimento das hemácias que não se

aglutinavam. Os 100µl da amostra são adicionados no primeiro poço da série; os demais

poços dessa série são preenchidos com 50µl da solução salina acima. Para a diluição

seriada, são tomados 50µl da amostra do primeiro poço e diluindo-se sucessivamente

os demais para a razão 1:2. Após a diluição das amostras, 50µl de suspensão de

hemácias a 2,5%v/v foram adicionados em todos os poços da placa de microtitulação.

Após 60 minutos de repouso à temperatura ambiente a atividade hemaglutinante foi

determinada pela recíproca da maior diluição que preserva hemaglutinação visível

(título). Essa medida representa as unidades de atividade hemaglutinante (UAH).

3.3.3. Determinação da Atividade Específica

A atividade específica foi calculada pela razão numérica entre a Atividade

Hemaglutinante e a massa de proteína em mg (UAH/mg de proteína).

3.3.4. Construção da Tabela de Purificação

O quadro geral de purificação da LMA (frações 0,2M e 0,3M) foi construído em

função do volume das frações (ml), da dosagem de proteínas (mg/ml) e atividade

hemaglutinante. Com esses dados, foram realizados os seguintes cálculos:

• Massa total de Proteína (mg): (volume) × (Dosagem);

• Atividade Hemaglutinante: 1/(título observado);

• Atividade Total: (Atividade Hemaglutinante) × (volume);

• Atividade Específica: (Atividade Total)/(massa total);

• Rendimento: (Atividade Total da Etapa)/(Atividade Total inicial);

• Enriquecimento ou Fator de purificação: (Atividade Específica da

Etapa)/(Atividade Específica Inicial).

����� � �����������, ���

40

3.4. Caracterização da LMA

3.4.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida a 12% em Condições Desnaturantes

Preparação dos Géis de Separação e Concentração

O suporte eletroforético utilizado foi um gel de poliacrilamida de separação a

12% e um de concentração a 5%, preparados em condições desnaturantes (com

dodecilssulfato de sódio ou SDS), segundo o método descrita (Laemmli, 1970).

Assim, para a confecção de 10ml de gel de separação a 12% (volume suficiente

para dois géis), foram utilizados os seguintes reagentes:

• 2,5ml de solução tampão Tris-(hidroximetilamino)-metano a 1,5M pH 8,8;

• 4,0ml de solução estoque de monômero (solução composta de Acrilamida

30%p/v + Bis-Acrilamida 0,8% p/v);

• 0,1ml de Solução de SDS a 10% p/v;

• 50µl de Solução de Perssulfato de Amônio a 10% (preparo recente);

• 5µl de N,N,N’,N’-Tetrametil-etilenodiamina a 99%;

• Água destilada em volume suficiente para 10ml de gel a ser polimerizado.

Para o preparo de 5ml de gel de concentração a 5% (volume suficiente para dois

géis), foram utilizados os seguintes reagentes:

• 1,25ml de solução tampão Tris-(hidroxi-metil-amino)-metano a 0,5M pH 6,8;

• 0,8ml de solução estoque de monômero (solução composta de Acrilamida

30%p/v + Bis-Acrilamida 0,8% p/v);

• 50µl de solução de SDS a 10%;

• 25µl de Solução de Perssulfato de Amônio a 10% (preparo recente);

• 5µl de N,N,N’,N’-Tetrametil-etilenodiamina a 99%;

• Água destilada em volume suficiente para 5ml de gel a ser polimerizado.

����� � �����������, ���

41

Preparo das Amostras para Eletroforese

As amostras provenientes das etapas de purificação foram preparadas em

concentrações finais de aproximadamente 1mg/ml em tampão NH4HCO3 0,01M pH 8,3

e diluídas no tampão da amostra 1:1, contendo tris-hidroximetilamino-metano 0,125M

pH 6,8; azul de bromofenol a 0,002% p/v, SDS 4% p/v e glicerol a 20% v/v. As

amostras foram tratadas em água fervente por 5 minutos para aplicação no suporte

eletroforético (os volumes de aplicação variaram de 5-15µl, de acordo com a dosagem

de proteínas). Como tampão eletroforético utilizou-se uma solução de tris-

hidroximetilamino-metano 0,025M pH 8,2 contendo glicina a 0,192M e SDS a 0,1%

p/v.

Foram utrilizados padrões de massa molecular provenientes da Pharmacia LKB

(Uppsala, Sweden): lactoalbumina (MM=14,4 KDa), inibidor de tripsina (MM= 20,1

KDa), anidrase carbônica (MM= 30,0 KDa), ovoalbumina (MM= 43,0 KDa), albumina

(MM=67,0 KDa) e fosforilase B (MM= 94,0 KDa). Esses padrões primários foram

utilizados para a determinação das massas moleculares das bandas produzidas pelas

diferentes cadeias da Concanavalina A (massas moleculares calculadas de 30, 28, 23, 17

e 13 KDa). Esse perfil de bandas foi utilizado como padrão secundário de massa

molecular em todos os géis corridos. Os procedimentos eletroforéticos foram

conduzidos em corrente elétrica constante (20 mA por placa) durante aproximadamente

90 minutos.

Protocolo de Coloração pelo Nitrato de Prata

Todos os géis de poliacrilamida a 12% corridos foram revelados pelo método

descrito por Wayne Wray e cols. (1981).

Fixação e lavagem dos géis: os géis foram fixados em solução de metanol a 50% v/v

contendo 0,1% v/v de formaldeído por 12 horas. Após a fixação os géis foram lavados

com água destilada por 15 minutos sob agitação e novamente com solução de metanol a

50% durante 15 minutos. A solução metanólica foi descartada e o gel foi re-hidratado

com água destilada por 20 minutos.

Coloração pelo AgNO3: a solução corante foi obtida a partir do preparo recente das

soluções:

����� � �����������, ���

42

• Solução A: 0,80g de AgNO3 foram dissolvidos em 4,00ml de água destilada;

• Solução B: 21,00ml de solução de NaOH 0,36% p/v são adicionados a 1,40 ml

de hidróxido de Amônio concentrado (14,8M).

Adicionou-se gradualmente e sob agitação a Solução A sobre a Solução B em frasco

protegido da luz. Após a mistura das soluções, o volume foi completado para 100 ml

com água destilada. Os géis foram corados por 15 minutos com essa solução em câmara

escura.

Revelação dos géis: a eletroforese foi revelada, tratando-se o gel corado com a solução

reveladora contendo Ácido Cítrico a 0,005% p/v e Formaldeído a 0,02% (preparo

recente), em tempo suficiente para o aparecimento das bandas. A reação de coloração

foi interrompida pela remoção da solução reveladora e adição de solução de metanol a

45% v/v contendo Ácido acético a 10% v/v sobre os géis.

Coloração pelo Coomassie-Blue

Procedeu-se a coloração com solução de Coomassie Blue R-250 a 0,025% em

metanol a 40% e ácido acético a 7% por 3 horas. Os géis foram descorados com

solução de metanol a 40% e ácido acético a 7% até a visualização plena da preparação.

3.4.2. Estabilidade em diferentes concentrações hidrogeniônicas

Para esse ensaio, 250µl de amostras purificadas e ativas da LMA (2,5-2,8

mg/ml) foram dialisadas por 24 horas contra diferentes soluções tampões em pH’s

determinados: pH 2-3 (glicina-HCl 0,1M); pH 5-6 (Acetato de Sódio- Ácido Acético

0,1M); pH 7-9 9 (tris-hidroximetilamino-metano 0,1M); pH 10 e 12 (glicina-NaOH

0,1M); solução de NaCl 0,15M (salina, como controle e referência de 100% de

atividade). Após esse procedimento o pH das amostras foi retornado a 7,4, pela diálise

por 24 horas contra Acetato de Amônio 0,1M pH 7,4. Realizou-se ensaios de atividade

hemaglutinante e os resultados foram expressos em porcentagem de atividade residual

em relação ao controle.

3.4.3. Estabilidade Térmica

Amostras da LMA (1,35-1,40 mg/ml), mantidas em NaCl 0,15M contendo

Cloreto de Cálcio e Cloreto de Manganês a 5mM, foram submetidas ao tratamento

����� � �����������, ���

43

térmico em banhos de água variando-se o tempo e temperatura. As atividades residuais

foram obtidas pelo quociente das atividades hemaglutinantes das amostras tratadas

termicamente e sem tratamento.

3.4.4. Ensaio de Dependência de Íons Cálcio(II) e Manganês(II)

Amostras de EB, fração 20-60% da precipitação com etanol e as frações

purificadas da LMA 0,2 e 0,3M foram diluídas adequadamente para que todas

produzissem a mesma atividade hemaglutinante. A uma alíquota dessas amostras

adicionou-se solução de EDTA pH 9 de modo que a concentração final deste fosse igual

a 5mM (amostras 1); logo após o EDTA foi titulado com uma solução de Cálcio e

Manganês em excesso até que a concentração final dos íons totais se tornasse 10mM

(amostras 2). Paralelamente, foram feitos os controles positivos, que continham as

amostras íntegras, diluídas com solução de NaCl 0,15M ao longo do experimento, de

forma a promover a mesma diluição em todas as amostras. Procedeu-se o ensaio de

atividade hemaglutinante das amostras 1 e 2 (testes) e também dos controles positivos

diluídos com NaCl 0,15M. Excepcionalmente nesse ensaio de atividade, a solução de

NaCl 0,15M utilizada para as diluições não continha os íons divalentes Cálcio(II) e

Manganês(II) a 5mM.

3.4.5. Determinação da Massa Molecular da Proteína Nativa

Para determinação da massa molecular da proteína nativa utilizou-se

cromatografia de exclusão molecular em coluna (0,5 x 150,0 cm). Tal coluna foi

preenchida com Sephacryl HR S-200� (Pharmacia) e equilibrada com tampão

NH4HCO3 0,01M pH 8,3 contendo NaCl 1M e Glicose 0,2M. Foram passados padrões

de massa molecular conhecidos para construção de uma reta-padrão. Foram aplicados

200µl de amostras de proteínas na concentração de 5mg/ml em fluxo cromatográfico

ajustado para 0,25ml/minuto, coletando-se frações de 1,3ml. Após as leituras

espectrofotométricas das frações, os volumes de eluição foram determinados

estatisticamente pelo Programa Origin 6.0, através de um ajuste Gaussiano do gráfico

absorvância × volume de eluição. As abscissas centrais das Gaussianas calculadas foram

assumidas como os volumes de eluição. Esses valores foram utilizados para determinar

a reta-padrão, a qual foi construída utilizando os volumes de eluição dos padrões em

����� � �����������, ���

44

função dos logaritmos das massas moleculares respectivas (volume de eluição x Log da

Massa Molecular) e assim estimar o estado de agregação da proteína nativa.

Os padrões de massa molecular utilizados foram: Dextrano Azul (Sigma�,

MM>>300KDa, para determinação do volume total de exclusão), Desidrogenase

Alcoólica (Sigma�,MM= 150 KDa), Hemoglobina (MM= 64 KDa), Lectina da

Erythrina speciosa (MM = 58 KDa), Tripsina (Sigma�, MM = 24 KDa) e Cloreto de

Cobalto (Merck�, MM << 5 KDa, para determinação do volume total incluído). A reta

padrão obtida encontra-se ilustrada no apêndice II.

Para o estudo do estado de agregação da LMA dependente do pH, foram

realizados procedimentos cromatográficos semelhantes ao descrito acima, variando

apenas os tampões de equilíbrio com seus respectivos potenciais hidrogeniônicos.

3.5. Estudos Biológicos da LMA

Todos os ensaios biológicos utilizados nesse trabalho foram realizadas com a

fração ativa 0,2M da LMA, com exceção do estudo da especificidade sobre o sistema de

grupos sanguíneos ABO. Somente essa fração foi utilizada devido ao seu rendimento

significativo e à sua atividade extringente sobre as hemácias A1.

3.5.1. Ensaios de Hemaglutinação com Hemácias do Sistema ABO

Pesquisa da Especificidade sobre o Sistema ABO

Sangues totais exemplares dos grupos do Sistema ABO (grupos A1, A2, B e O)

foram coletados de doadores voluntários e as hemácias foram separadas de acordo com

item 3.3. As hemácias íntegras, sem qualquer tratamento enzimático, foram testadas

com as amostras ativas da LMA, para a pesquisa da especificidade da lectina purificada

sobre o sistema ABO.

Pesquisa da Especificidade com hemácias ABO tripsinizadas

As hemácias utilizadas para o ensaio de hemaglutinação podem ser submetidas a

tratamentos enzimáticos com tripsina, papaína ou neuraminidase; tais tratamentos visam

����� � �����������, ���

45

aumentar a sensitividade das hemácias sob as lectinas (Kennedy e cols., 1995). Os

tratamentos proteolíticos consistem na remoção de parte das proteínas que poderiam

estar bloqueando, ou mesmo impedindo o acesso do antígeno glicídico ao sítio ligante

da lectina.

Exemplares de cada grupo de hemácias, obtidas de acordo com item 3.3, foram

submetidas ao tratamento proteolítico com tripsina (tripsinização). Para esse processo,

fez-se uma suspensão a 10% de hemácias em solução de NaCl 0,15M e adicionou-se

tripsina (Merck�) em proporção final de 0,1% p/v. A suspensão foi incubada a 37°C

por 70 minutos com agitações periódicas. As hemácias tripsinizadas foram separadas e

lavadas três vezes com solução de NaCl 0,15M por centrifugação a 1500 rpm por 15

minutos. Os sedimentos de hemácias “tripsinizadas” foram utilizados para o preparo das

suspensões necessárias para realização do ensaio de atividade com as amostras

purificadas de LMA, segundo o método descrito no item 3.3.

3.5.2. Ensaios de Aglutinação com cepas de Escherichia coli

Foram utilizadas 101 amostras de Escherichia coli isoladas a partir de pacientes

com diarréia e de água de consumo da cidade de Ouro Preto. As cepas fazem parte da

bacterioteca de pesquisa do Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de

Ouro Preto, estocadas em meio de manutenção a 4°C.

Foram utilizadas, além das 101 cepas isoladas, cepas padrões de Escherichia

coli, a saber:

• Escherichia coli ST 275 (UFOP) e Escherichia coli ST 761 (UNICAMP),

enterotoxigênicas produtoras de toxina termo-estável;

• Escherichia coli LT 40 (UNICAMP), produtora de toxina termo lábil.

As 101 amostras das cepas de Escherichia coli foram devidamente identificadas

através de série bioquímica e crescidas em 2,5 ml de meio TSB (Tryptic Soy Broth -

Sigma�) por 24h a 37ºC. As células foram lavadas por três vezes com 3,0 ml de salina

por centrifugação a 1500rpm/10 min. As suspensões de bactérias foram preparadas a

partir do sedimento de células com 200µl de solução de NaCl 0,15M.

As suspensões foram ensaiadas para a aglutinação em lâmina com LMA a

2mg/ml diluída em séries de 1:2 (20 µl de suspensão de bactérias + 20µl sol. Lectina

����� � �����������, ���

46

diluída ou não). As lâminas foram agitadas em círculos por 5 minutos à temperatura

ambiente e os resultados foram observados visualmente e confirmados em microscopia

com objetiva de aumento de 20 vezes.

3.5.3. Ensaios de Biodistribuição da 99mTc-LMA em Camundongos Swiss

Para os ensaios de biodistribuição, foram utilizados Camundongos Swiss machos

de 25-30g (aproximadamente 6 semanas de idade) fornecidos pelo Biotério da

Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais.

Todas as medidas de radiação foram realizadas em um contador de radiação

gama, modelo ANSR (Abott�). Os resultados das medidas foram expressos em

contagens por minuto por grama de tecido percentuais à dose injetada (% de radiação

específica).

Marcação da LMA com 99mTc

A metodologia de marcação radioquímica foi realizada de acordo com a técnica

proposta por (Alves, 2002; Pauwels e cols., 1993): 2mg de LMA purificada foram

dissolvidas em 1,0 ml de Solução de NaCl 0,15M. A esta solução foram adicionados os

seguintes volumes de agentes redutores:

• 10µl de solução de SnCl2 a 2mg/ml, dissolvido em solução de HCl 0,25M;

• 20µ de solução de NaBH4 a 10mg/ml, dissolvido em solução de NaOH a 0,1M;

Estas soluções foram preparadas no momento da reação de marcação. Após a

adição das mesmas, adicionou-se um volume correspondente a 200µCi de 99mTc na

forma de pertectenato de sódio. A solução de reação (protegida da luz) foi

homogeneizada e deixada por vinte minutos à temperatura ambiente.

Determinação da Pureza Radioquímica: a porcentagem de pureza radioquímica da 99mTc-LMA, foi determinada por dois sistemas de cromatografias: um ascendente para

determinação do 99mTc livre (não reduzido pelo SnCl2) e outro descendente para

determinação do 99mTc hidrolisado pela água (reduzido pelo SnCl2 e não incorporado na

proteína). As cromatografias foram assim procedidas:

����� � �����������, ���

47

• Cromatografia ascendente em camada fina de Sílica: 3µl de amostra de 99mTc-LMA 0,2M foram aplicados em placas de sílica em suporte de alumínio

(Merck�) de 10cm × 1cm. Procedeu-se à eluição com Acetona 100% e após a

corrida as placas foram secas e divididas em 10 partes iguais para contagem no

aparelho contador ANSR. Com este procedimento obteve-se as contagens em

cpm de 99mTc livre (arrastado pela acetona) e determinou-se também o

percentual de 99mTc hidrolisado e de 99mTc-LMA, ambos permaneciam no ponto

de aplicação.

• Cromatografia Descendente em papel: 3µl de amostra de 99mTc-LMA foram

aplicados em folhas de papel Whatman de 20cm x 2cm (previamente embebidas

e secas com solução de Soroalbumina Bovina a 1% p/v). Procedeu-se a eluição

descendente com solução de NaCl 0,15M e após a corrida, as tiras foram

retiradas da cuba e colocadas para secagem. As tiras secas foram divididas em

15 partes iguais a partir do ponto de aplicação e em seguida a radioatividade foi

determinada. Com este procedimento obteve-se as contagens em cpm de 99mTc

hidrolisado (permanece na origem) e determinou-se também o percentual de 99mTc livre e de 99mTc-LMA , ambos arrastados pelo eluente.

A porcentagem de pureza radioquímica (%P.R.) foi assim calculada:

100)().().(

)LMA -Tc(..% 999999

99m

×−++

=LMATccpmohidrolisadTccpmlivreTccpm

cpmRP mmm

A porcentagem de pureza radioquímica recomendada para ensaios de

distribuição de proteínas marcadas com 99mTc deve ser superior a 90% (Alves, 2002).

Nota: Quando o rendimento obtido foi menor que 90%, a solução de marcação foi

filtrada em membrana de éster de celulose Millipore� 0,22µm. Com esse procedimento

removeu-se parte da radioatividade decorrente do 99mTc hidrolisado, um colóide que

fica retido na membrana filtrante. Desta forma, retira-se a impureza devido ao colóide

radioativo, aumentando o teor de pureza radioquímica.

����� � �����������, ���

48

Avaliação da Atividade Hemaglutinante da 99mTc- LMA:

A atividade hemaglutinante sobre hemácias A1 da LMA-99mTc foi avaliada

como descrito no item 3.3. Além do ensaio de atividade convencional, foi avaliada a

capacidade da LMA não marcada em deslocar a 99mTc-LMA no mesmo ensaio de

hemaglutinação por adição de LMA não marcada, de acordo com o protocolo seguinte.

Tabela 4 - Protocolo experimental da avaliação do deslocamento da 99mTc-LMA pela LMA nativa no

ensaio de atividade hemaglutinante.

Volume de Sol de LMA a

1,5mg/ml não marcada (µl)

Massa de LMA não marcada adicionada.

(mg)

Volume de Solução de

NaCl 0,15M (µl)

Volume de LMA-99mTc

(µl)

Volume de Suspensão de Hemácias A1

2,5% (µl) 50 75 200 40 250

100 150 150 40 250

150 225 100 40 250

200 300 50 40 250

Após a adição da suspensão das hemácias, aguardou-se um período de incubação

de 40 minutos e em seguida os tubos foram centrifugados a 1500 rpm por 10 minutos; o

sobrenadante foi devidamente descartado e a radiação do sedimento das hemácias foi

contada no contador ANSR. Em seguida, procedeu-se três lavagens do sedimento de

hemácias com solução de NaCl 0,15M por centrifugação a 1500 rpm por 10 minutos;

em cada lavagem o sobrenadante foi devidamente descartado e a radiação do sedimento

de hemácias foi novamente contada.

Ensaios de Biodistribuição da 99mTc-LMA em Camundongos Swiss

Quantidades equivalentes a 20µCi de 99mTc-LMA (100 µl da solução a 2mg/ml)

foram injetados pela veia caudal em cada animal de um grupo de 5 Camundongos. Cada

grupo de camundongos foi testado em diferentes tempos de exposição à 99mTc-LMA (5,

10, 30, 60 e 180 minutos) e após esses tempos, os camundongos foram sacrificados em

éter etílico. De cada animal, foram recolhidos 100 µl de sangue, o estômago, os rins,

urina (bexiga cheia), o fígado, o baço, os pulmões, o coração e o cérebro. Os órgãos

foram devidamente pesados antes da contagem, para determinação da contagem de

����� � �����������, ���

49

radiação específica (cpm/g de órgão). Os resultados foram expressos em porcentagem

de radiação específica (% da radiação encontrada no órgão em relação a dose

administrada no camundongo por massa de órgão em gramas).

A urina reunida dos grupos de animais correspondentes aos tempos de 30 e 60

minutos foi analisada por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Sephadex

G25 (6,0 cm x 1,5 cm). Aplicou-se 350µl de urina reunida na coluna e procedeu-se a

eluição com solução de NaCl 0,15M. Foram recolhidas 20 frações de 1ml.

3.5.4. Auto-radiografia de Rins de Camundongos Swiss Injetados com 125I-LMA

Marcação da LMA com 125Iodo

A LMA purificada fração 0,2M foi submetida à metodologia de marcação com

I125, utilizando a cloroamina T (McConahey & Dixon, 1980). Assim, 100µl de LMA

purificada a 10mg/ml foram diluídos em 300µl de tampão MOPS (ácido 3-[N-

morfolino]propanossulfônico, Sigma�) pH 7,0 a 0,1M; a esta solução foram adicionados

30µl de 2-NacGal a 0,5M como bloqueador do sítio ligante da LMA. Nesse volume de

reação adicionou-se volume suficiente para 1,33µCi de I125 previamente neutralizado

com solução de HCl 0,1M (proporção de 1:1). A reação de Iodinação foi iniciada com a

adição de 100µl de Cloroamina T a 100mg/ml ao volume total de reação acima

descrito. Todo o procedimento de marcação foi realizado à frio e após 5 minutos de

incubação, o volume total de reação foi aplicado em uma coluna cromatográfica de

exclusão molecular (Sephadex G25�) previamente calibrada para interrupção da reação

e remoção dos reagentes de marcação; utilizou-se solução de NH4HCO3 0,01M pH 8,2

como eluente. O volume de exclusão (proteína marcada) foi recolhido e liofilizado.

Injeção da 125I- LMA em camundongos Swiss

A 125I-LMA liofilizada foi ressuspendida em 750µl de solução de NaCl 0,15M;

400µl dessa solução foram injetados pela veia caudal em um grupo de quatro

camundongos Swiss machos (25-30g), sendo 100µl para cada camundongo. Após um

período de 30 minutos, os camundongos foram sacrificados em éter etílico e seus rins e

urina (bexiga) foram coletados.

����� � �����������, ���

50

Autoradiografia dos Rins

Os rins coletados dos camundongos injetados com LMA-I125 foram congelados e

depois foram seccionados em cortes de 12µm em micrótomo sob refrigeração (criostato)

a -17°. Os cortes dos rins (região central, amostrando medula e córtex) foram colocados

sobre lâminas de microscopia embebidas com gelatina e em seguida levados para

secagem a 4°C. As lâminas secas foram expostas em cassetes com chapa

autoradiográfica (Kodak Biomax MS) com tempo de exposição de 10 dias a -20°C. As

chapas foram reveladas pelo revelador Kodak por três minutos, sendo em seguida

fixadas com fixador Kodak por seis minutos. Após a fixação, as chapas foram lavadas

em água corrente por 10 minutos. Depois de secas, as chapas reveladas foram

digitalizadas.

83���)������

���)������

52

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento e Purificação da LMA

4.1.1. Precipitações Iniciais

Tratamento Térmico

O Extrato bruto (EB) foi tratado termicamente a 90°C por 30 minutos. As

atividades específicas do EB inicial e do extrato bruto tratado termicamente (EB TT)

foram determinadas, conforme a ilustração a seguir.

3,3

4,2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

EB EB TT

Ativ

idad

e E

spec

ífica

(U

AH

/mg

de p

rote

ína)

Figura 12 - Gráfico das atividades hemaglutinantes específicas do Extrato Bruto (EB) a 20% de

sementes pulverizadas da Macrotyloma axillare e do Extrato Bruto Tratado Termicamente a 90°C por

30 minutos (EB TT).

O tratamento térmico possibilitou um aumento de atividade específica em

função da precipitação térmica de parte das proteínas presentes no EB. A eficiência

dessa remoção pode ser demonstrada quando se analisa os perfis eletroforéticos do EB

e do EB TT na ilustração a seguir (Fig. 13).

���)������

53

Perfis Eletroforéticos do EB e do EB TT

Figura 13 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida-SDS a 12% do Extrato Bruto de sementes da

M. axillare (EB) e do Extrato Bruto tratado termicamente a 90°C por 30 minutos(EB TT).

Legenda : PMM, padrão de massa molecular (ConA, 10µg); EB, extrato bruto (10µg); EB TT, extrato

bruto tratado termicamente (10µg).

O EB TT apresenta um perfil mais simplificado de bandas eletroforéticas quando

comparado com o EB. Assim, a adição dessa etapa contribui significativamente para o

isolamento da LMA por produzir uma amostra de EB de composição protéica mais

simples.

���)������

54

Determinação da Concentração Ideal de Etanol para Precipitação Fracionada do

Extrato Bruto Tratado Termicamente

0,3

5,0

17,6

0,00,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

0-20% 20-40% 40-60% 60-80%

Faixas de Concentração de Etanol

Ativ

idad

e E

spec

ífica

(U

AH

/mg

de p

rote

ína)

Figura 14 - Gráfico das atividades hemaglutinantes específicas obtidas nas faixas de precipitação do

EBTT por etanol comercial a frio.

A atividade hemaglutinante foi extremamente mais intensa nos precipitados

obtidos nos intervalos de concentração de 20-40% e 40-60% de etanol. A atividade

hemaglutinate desses intervalos corresponde a 99% em relação aos outros intervalos

testados. Assim a etapa de precipitação por etanol pôde ser resumida na obtenção do

precipitado de 20-60% de concentração de etanol.

As ilustrações a seguir mostram os perfis eletroforéticos das amostras dos

intervalos de precipitação por etanol obtidos e os benefícios proporcionados pela

inclusão do tratamento térmico como etapa de purificação.

���)������

55

4.1.2. Perfis Eletroforéticos de Amostras dos Intervalos de Precipitação por Etanol

A

B

Figura 15 - Perfis eletroforéticos em géis de poliacrilamida a 12% das amostras obtidas na precipitação

por etanol do Extrato Bruto das sementes de Macrotyloma axillare.

No painel A tem-se a análise eletroforética dos precipitados nas várias faixas de precipitação por etanol

(sem tratamento térmico) e no painel B tem-se um pequeno resumo do isolamento da LMA pelos

métodos de precipitação (incluindo o tratamento térmico).

Legenda: PMM, padrão de massa molecular (ConA, 10µg); EB, Extrato Bruto (10µg); EB TT, extrato

Bruto Tratado Termicamente (10µg); 20-60%, Amostras aplicadas em quantidades crescentes da fração

20-60% (2,5; 5 e 10µg).

A análise dos dois painéis mostra que o tratamento térmico seguido da

precipitação na faixa de 20-60% de etanol pôde remover alguns contaminates, como

aqueles logo abaixo da banda de LMA indicados pela seta vermelha no painel A. Esses

benefícios também podem ser observados no painel B, quando se comparam as

canaletas correspondentes ao EB e ao EB TT.

No painel B pode-se também demonstrar a vantagem da precipitação por etanol

como etapa de purificação: qualitativamente a LMA encontra-se praticamente

purificada, como pode ser visto pelas aplicações em quantidades crescentes de amostras

da faixa de 20-60% de etanol.

���)������

56

4.1.3. Cromatografia de troca Iônica da Fração 20-60%

O precipitado obtido na faixa de 20-60% de etanol a partir do EB TT foi

submetido à cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose� pH 8,3; conforme descrito

no item 3.1.4.

O ensaio de atividade hemaglutinante revelou a presença da LMA nos intervalos

de eluição 0,2 e 0,3M de NaCl. As frações correspondentes a esses intervalos foram

“dessalinizadas” em coluna de Sephadex G25�, conforme o item 3.1.6.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 15 29 43 57 71 85 99 113 127 141 155 169 183 197 211 225

Frações (4ml)

Abs

. 280

nm

00,10,20,30,40,50,60,70,80,911,1

[NaC

l]

A280 [NaCl]

Fração 0,2M

Fração 0,3M

Figura 16 - Perfil cromatográfico da fração precipitada a 20-60% de etanol em coluna de Q-Sepharose

pH 8,3; com eluição em gradientes isocráticos de NaCl. Legenda: Em Azul tem-se o perfil segundo a Absorvância a 280nm e em verde tem-se os degraus

isocráticos de NaCl. Os degraus rotulados de vermelho correspondem os intervalos de frações com

atividade hemaglutinante sobre hemácias A1.

De acordo com a análise do cromatograma, pode-se observar que a LMA 0,2M

apresenta-se como uma fração predominante, sua proporção em relação à LMA 0,3M é

bastante significativa. Como poderá ser visto na análise eletroforética das frações

purificadas pela cromatografia de troca iônica (próxima ilustração), essa etapa finaliza o

processo de purificação da LMA.

���)������

57

4.1.4. Análise Eletroforética das Frações Purificadas na Cromatografia de Troca Iônica

Figura 17 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida-SDS a 12% das duas frações ativas da LMA

isoladas pela cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose pH 8,3.

Legenda : PMM, Padrão de Massa molecular (ConA, 10µg); 0,2M e 0,3M , isoformas ativas isoladas da

cromatografia de troca iônica (5µg).

A eletroforese das frações obtidas na cromatografia de troca iônica em pH 8,3

mostra que essa etapa foi eficiente na purificação das duas frações da LMA. Segundo a

análise eletroforética, as frações ativas 0,2M e 0,3M da LMA foram isoladas e

purificadas em banda única com massa molecular de aproximadamente 29 KDa.

4.1.5. Quadro geral de Purificação das Duas Frações da LMA

O quadro geral da purificação é apresentado na tabela a seguir (tabela 5). Pode-

se observar que as diferentes frações purificadas 0,2 e 0,3M da LMA diferem em suas

atividades específicas, sendo a fração 0,3M com atividade específica maior que a 0,2M;

o que reforça a idéia de que ambas são frações diferentes da LMA. Analisando o

rendimento e a massa total de proteína, pode-se confirmar que a fração 0,2M da LMA

predomina em massa quando comparada com a 0,3M; como pôde ser verificado no

perfil cromatográfico da troca iônica.

58

Tabela 5 - Quadro geral de purificação das duas frações da LMA.

Etapas de

Purificação

Volume

(ml)

Dosagem de

Proteínas (mg/ml)

Massa Total de Proteínas

(mg)

Atividade

Hemaglutinante (UAH)

Atividade

Total (UAH)

Atividade Específica (UAH/mg)

Rendimento

(%)

Fator de

Purificação

Extrato Bruto

100,0

9,6

958,0

32

3200

3,3

100

1,0

Extrato Bruto Tratado Termicamente

100,0

7,5

753,0

32

3200

4,3

100

1,3

Fração 20-60%

Etanol

18,5

10,4

191,0

128

2368

12,4

74

3,7

Fração 0,2M

17,5

2,0

34,9

64

1120

32,1

35

9,6

Fração 0,3M

2,5

1,9

4,9

128

320

65,3

10

19,6

���)������

59

4.2. Caracterização da LMA

4.2.1. Ensaio de Estabilidade dependente do pH

A fração 0,2M da LMA apresentou 100% de atividade entre o pH 6 e 8; sua

atividade é reduzida acima e abaixo desse limite, sendo nula em pH 10 e 12.

A fração 0,3M apresentou atividade total ativa num intervalo maior de pH

quando comparado com a faixa de atividade da fração 0,2M. Assim, a fração 0,3M

não perdeu atividade entre o pH 5 e 9. De forma análoga à fração 0,2M, a LMA 0,3M

também apresentou atividades reduzidas acima e abaixo desse faixa, sendo inativa em

pH 2 e pH 10. A figura a seguir sumariza essas observações:

3

13

50

100 100 100 100

50

0 0

100

0

20

40

60

80

100

120

pH 2,

0

pH 3,

0

pH 5,

0

pH 6,

0

pH 6,

4

pH 7,

0

pH 8,

0

pH 9,

0

pH 10

,0

pH 12

,0

Contro

le

% a

itivi

dade

Res

idua

l

Fração 0,2M Fração 0,3M

Figura 18 - Gráfico das atividades hemaglutinantes residuais sobre hemácias A1, obtidas no ensaio de

estabilidade dependente do pH.

���)������

60

4.2.2. Ensaio de Estabilidade Térmica

As frações 0,2M e 0,3M da LMA se mostraram 100% ativas nas temperaturas

de 40 e 50°C em tempos de até 90 minutos.

O extrato bruto tratado termicamente (EB TT) a 90°C por 30 minutos não

sofreu decréscimo significativo em sua atividade hemaglutinante. Por esse motivo,

esse tratamento foi incluído como etapa de purificação, como mostrado anteriormente

(fig. 12).

Quando se testou a estabilidade térmica das frações isoladas observaram-se

pequenas diferenças, como por exemplo, a fração 0,2M da LMA se mostrou mais

sensível termicamente em relação à LMA 0,3M. As ilustrações a seguir sumarizam os

perfis de estabilidade térmica nas diferentes temperaturas e diferentes tempos.

Estabilidade Térmica da Fração 0,2M da LMA

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90

Tempo (min.)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%)

60°C 70°C 80°C 90°C

Figura 19 - Ensaio de Estabilidade térmica da Fração de LMA 0,2M.

���)������

61

Estabilidade Térmica da Fração 0,3M da LMA

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90Tempo ( min.)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%)

60°C 70°C 80°C 90°C

Figura 20 - Ensaio de Estabilidade térmica da fração 0,3M da LMA.

A fração 0,3M se mostrou mais resistente termicamente quando comparada

com a fração 0,2M. As atividades da fração 0,3M da LMA nas temperaturas de 60, 70

e 80°C não sofreram mudanças após 90 minutos de incubação (100% de atividade).

Somente a 90°C houve decréscimo de 50% da atividade para a fração 0,3M da LMA.

De maneira análoga à estabilidade dependente do pH a fração 0,3M se mostrou

mais estável do que a 0,2M.

���)������

62

4.2.3. Dependência de Íons Cálcio e Manganês

As frações ativas 0,2M e 0,3M da LMA se mostraram igualmente dependentes

dos íons divalentes para manutenção de suas atividades. De modo similar, o EB e

fração precipitada 20-60% de etanol também se mostraram dependentes dos íons

divalentes. A incubação com EDTA não aboliu integralmente a atividade, mas seu

decréscimo foi significativo em todas as amostras das etapas de purificação. A adição

de íons Cálcio (II) e Manganês (II) em excesso não reverteu integralmente a atividade

hemaglutinante.

100 100 100 100

25

13 13

50 50

25 2525

0

25

50

75

100

EB Fração 20-60% Fração 0,2M Fração 0,3M

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%)

Controle EDTA Ca(II) e Mn(II) em excesso

Figura 21 – Atividade residual de amostras das etapas de purificação em presença de EDTA e após

titulação com íons Cálcio (II) e Manganês (II).

���)������

63

4.2.4. Determinação da Massa Molecular da Proteína Nativa

Perfil Cromatográfico da LMA em Sephacryl HR S200

A ilustração a seguir mostra o perfil cromatográfico da fração 0,2M em pH 8,5

e em pH 7. O perfil em pH 5 não foi mostrado, pois é muito semelhante ao perfil

cromatográfico em pH 7. Os perfis encontrados para a fração 0,3M também são muito

semelhantes aos da fração 0,2M e por isso também não serão mostrados.

15 20 25 30 35

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

XCX

C

Abs

orvâ

ncia

a 2

80nm

Volume de eluição (ml)

Fração 0,2M pH 8,5 Fração 0,2M pH 7,0

Figura 22 - Perfis cromatográficos em Sephacryl HR S200 da fração 0,2M da LMA em pH 8,5 e em

pH7,0.

Legenda: Xc, abscissa central da regressão gaussiana.

As regressões gaussianas forneceram as abscissas centrais de cada perfil

cromatográfico, as quais são numericamente iguais aos volumes de eluição. Esses

volumes foram substituídos na equação da reta de calibração da coluna cromatográfica

para a determinação da massa molecular de cada amostra testada. A reta-padrão de

calibração foi construída a partir dos volumes de eluição de padrões com massas

moleculares conhecidas ( apêndice II).

���)������

64

Massas Moleculares das Frações da LMA

.A ilustração a seguir sumariza as determinações das massas moleculares

(duplicatas) das frações 0,2 e 0,3M da LMA. Os dados estão apresentados pela média

± desvio padrão.

0

20

40

60

80

100

120

140

5,0 7,0 8,5pH

MM

(KD

a)

LMA 0,2 M LMA 0,3 M

Figura 23 - Massas moleculares das proteínas nativas LMA 0,2M e 0,3M em pH 5,0; 7,0 e 8,5;

realizadas em coluna cromatográfica de exclusão molecular de Sephacryl HR S200.

Em pH alcalino (8,5) tanto a LMA 0,2M como a 0,3M apresentam massas

moleculares condizentes com tetrâmeros (116KDa), enquanto que em pH neutro ou

ácido (5,0) os valores de massa determinados são condizentes com dímeros (58KDa).

Em todas as determinações foram realizados ensaios hemaglutinantes das

amostras de LMA passadas na coluna de exclusão molecular nas várias situações de

pH e em todas elas foram observadas atividades hemaglutinantes nas frações coletadas

após o procedimento cromatográfico.

���)������

65

4.3. Estudos Biológicos da LMA

4.3.1. Estudo da Especificidade sobre Hemácias no Sistema ABO

Para esse estudo foram utilizadas as frações 0,2M e 0,3M da LMA. A potência

relativa à atividade aglutinante em hemácias A1 foi calculada dividindo-se a atividade

obtida para os tipos sanguíneos pela atividade sobre hemácias A1 (potência relativa).

Tabela 6 - Potência relativa à atividade hemaglutinante sobre hemácias A1 das frações da LMA 0,2 e

0,3M sobre hemácias nativas e tratadas com tripsina no sistema ABO.

Potência Relativa à Atividade Hemaglutinante

sobre Hemácias A1

Eritrócitos Nativos LMA 0,2M LMA 0,3M

Hemácias A1 (referência) 1 1

Hemácias A2 - -

Hemácias B - -

Hemácias O - -

Eritrócitos Tripsinizados

Hemácias A1 64 64

Hemácias A2 2 8

Hemácias B 0 4

Hemácias O 0 4

Legenda: O Símbolo (-) indica ausência de atividade hemaglutinante

Como pode ser visto, quando se ensaiaram hemácias nativas, tanto a fração

0,2M como a 0,3M da LMA apresentaram especificidades para o subgrupo A1 do

sistema ABO. Entretanto, quando se utilizou hemácias tripsinizadas, observou-se um

aumento significativo da atividade e somente a LMA 0,2M permaneceu específica

para a grupo A, mas sem distinção dos subgrupos (A1 e A2). A LMA 0,3M aglutinou

indiscriminadamente as hemácias tripsinizadas de todos os grupos do Sistema ABO;

com variações de atividade.

���)������

66

4.3.2. Aglutinação de Cepas de Escherichia coli pela LMA 0,2M

A tabela e o gráfico abaixo representam apenas as cepas positivas das 103

testadas para o ensaio de aglutinação com a LMA 0,2M. Os resultados estão expressos

pela recíproca do título de aglutinação.

32

0

64 64

2

32 32

8

32

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ec ST275

Ec ST761

Ec LT40

Ec 28 Ec 40 Ec 41 Ec 67 Ec 84 Ec 95

Amostras de E. coli (Ec)

Ativ

idad

e A

glut

inan

te (1

/títu

lo)

Figura 24 - Atividade aglutinante da LMA fração 0,2M sobre as cepas de Escherichia coli, com seus

respectivos títulos aglutinantes.

Das 103 cepas analisadas, apenas 8% foram positivas na aglutinação com

LMA 0,2M. Dos padrões testados, o padrão de Escherichia coli enterotoxigênica ST

761 (Unicamp) não apresentou aglutinação, enquanto que os padrões de E. coli ST

(UFOP) e E. coli ST 761 (Unicamp) foram positivos.

���)������

67

4.3.3. Estudos de Biodistribuição da 99mTc-LMA 0,2M

Marcação da LMA 0,2M com 99mTc e Pureza Radioquímica

Foram realizadas um total de 17 marcações da LMA com 99mTc na forma de

pertectenato de sódio. Dessas marcações, somente as 7 ultimas foram destinadas aos

ensaios de distribuição em camundongos; as anteriores foram realizadas para a

padronização da marcação e para avaliação da atividade da lectina marcada após o

procedimento de marcação. A partir das purezas radioquímicas determinadas em

todas as marcações, obtiveram-se os seguintes resultados :

Tabela 7 -. Porcentagens de pureza radioquímica dos experimentos de marcação da LMA 0,2M com 99mTc.

Experimentos de

Marcação

Massa de LMA 0,2M e volume Rendimento de

Marcação (%)

1o. 2mg em 1ml de solução salina 90,1

2o. 2mg em 1ml de solução salina 90,0

3o. 2mg em 1ml de solução salina 94,0

4o. 2mg em 1ml de solução salina 85,0

5o. 2mg em 1ml de solução salina 86,2

6o. 2mg em 1ml de solução salina 90,0

7o. 2mg em 1ml de solução salina 87,2

8o. 2mg em 1ml de solução salina 82,2

9o. 2mg em 1ml de solução salina 87,0

10o. 2mg em 1ml de solução salina 90,1

11o. 2mg em 1ml de solução salina 87,0

12o. 2mg em 1ml de solução salina 88,0

13o. 2mg em 1ml de solução salina 90,0

14o. 2mg em 1ml de solução salina 86,0

15o. 2mg em 1ml de solução salina 87,0

Média Porcentual de Marcação ±±±± desvio padrão 88,0 ±±±± 2,8

���)������

68

Avaliação da Atividade Hemaglutinante da 99mTc-LMA 0,2M

De posse da 99mTc-LMA realizaram-se ensaios de hemaglutinação

convencionais, os quais demonstraram que a 99mTc-LMA não sofreu perda

significativa de atividade hemaglutinante após ter sido submetida ao procedimento de

marcação. O Título hemaglutinante da 99mTc-LMA foi similar à LMA nativa nas

mesmas condições.

Além do ensaio acima, foram realizados testes de avaliação da atividade

hemaglutinante modificados (n = 4), onde se avaliou a capacidade da LMA não

marcada em deslocar a 99mTc-LMA, de acordo com o ítem 3.5.3. Os resultados desses

ensaios estão resumidos no gráfico seguinte:

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

0 75 150 225 300 375

Massa de LMA fração 0,2M nativa (microgramas)

%R

adia

ção

nas

Hem

acia

s A

glut

inad

as

Figura 25 - Gráfico sumário dos ensaios de deslocamento da 99mTc-LMA pela LMA nativa.

As leituras em cpm dos sedimentos de hemácias foram convertidas em porcentuais da radiação total.

Essa radiação foi calculada pelo somatório das contagens (cpm) dos pontos de cada ensaio realizado.

Observa-se pelos resultados, que à medida que aumenta a massa da LMA 0,2M

não marcada, o percentual de ligação entre a 99mTc-LMA 0,2M com as hemácias

diminui significativamente. Isto sugere que o comportamento da 99mTc-LMA 0,2M

frente aos receptores presentes nas hemácias é bastante semelhante a LMA não

marcada, indicando que o processo de marcação não alterou a atividade biológica da

lectina.

���)������

69

Ensaios de Biodistribuição da 99mTc-LMA 0,2M em Camundongos Swiss

Para os ensaios de biodistribuição, a contagem de radiação para cada órgão foi

corrigida pelo seu peso. Desta forma., os resultados foram expressos com percentual

de radioatividade da dose padrão injetada em cada animal (% de radiação específica).

O sumário dos ensaios de distribuição está ilustrado na Fig.28.

O perfil de eliminação dos órgãos mais significativos da 99mTc-LMA 0,2M

está ilustrado a seguir. Os resultados estão expressos em porcentuais relativos às

radiações máximas alcançadas por cada órgão em todo o ensaio de distribuição.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

0 30 60 90 120 150 180Tempos (min.)

% d

a R

adia

ção

Máx

ima

méd

iade

cad

a ór

gão

sangue fígado rim urina

Figura 26 – Perfil de eliminação da 99mTc-LMA 0,2M nos órgãos mais significativos.

Observa-se que a radiação após 180 minutos da injeção encontra-se

concentrada no sistema urinário (rins e bexiga contendo urina). Isto mostra uma

retenção da 99mTc-LMA pelos rins. Por outro lado, observa-se um decaimento da

radioatividade após a primeira hora da administração pelo sangue e fígado. Os demais

órgãos (estômago, baço, fígado, pulmão, coração e cérebro) apresentaram um perfil de

de eliminação bastante semelhante ao obtido pelo fígado e sangue, por isso, não

foram mostrados A variabilidade dos dados referentes à bexiga (urina) foi devida à

dificuldade de remoção da mesma contendo urina. Não era raro o animal urinar

durante a manipulação, resultando em coleta de bexiga com volumes de urina bastante

���)������

70

variáveis, daí a grande dispersão em termos de desvio padrão mostrada pelos

resultados.

Perfil Cromatográfico da Urina dos Animais Injetados com 99mTc-LMA 0,2M

A radiação total presente na urina dos animais dos grupos 30 e 60 minutos foi

encontrada no volume de exclusão (“void”) da cromatografia em Sephadex G25,

sugerindo que a radiação se deve a estruturas radioativas com massas moleculares

superiores a 5KDa. A gráfico a seguir mostra o perfil cromatográfico de

radioatividade da amostra de urina.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Frações (0,5ml)

Meg

a cp

m

Figura 27 - Perfil cromatográfico em Sephadex G25 do “ pool” de urina dos animais dos grupos

relativos aos tempos de 30 e 60 minutos.

O gráfico a seguir mostra a distribuição da radiação em camundongos tratados

com 99mTc-LMA. Como pode ser visto, em todos os tempos de distribuição, a radiação

se concentra predominantemente nos rins e na Urina.

Volume de Exclusão (Void)

Volume Total

71

0

50

100

150

200

250

300

Sangue Estômago fígado baço rim pulmão coração cérebro bexiga

Ativ

idad

e E

spec

ífica

Por

cent

ual à

dos

e 5min 10min 30min 60min 180min.

Figura 28 - Gráfico dos ensaios de biodistribuição da 99mTc – LMA 0,2M nos diferentes tempos.

���)������

72

4.3.4. Auto Radiografia dos Rins de Camundongos Swiss

A auto-radiografia dos rins dos camundongos Swiss injetados com 125I-LMA

0,2M revelou que a radioatividade se concentrou no córtex renal após 30 minutos de

distribuição. As ilustrações a seguir mostram as regiões corticais dos rins, as quais

foram marcadas pela radioatividade.

Figura 29 - Auto-radiografia dos rins de camundongos injetados com 125I-LMA 0,2M.

93�� �')��4��

� �')��4��

74

5. DISCUSSÃO

5.1. Purificação da LMA

A lectina da Macrotyloma axillare foi primeiramente isolada por (Haylett &

Swart, 1982). O procedimento adotado para a purificação foi uma cromatografia de

afinidade, utilizando o antígeno do subgrupo A1 + Substância acoplada a uma matriz

de Sepharose 6B (Pharmacia�). Esse procedimento foi inspirado na técnica utilizada

por Etzler (1970), no qual a DBL foi isolada por cromatografia de afinidade utilizando

o mesmo antígeno A1 acoplado a Sepharose 6B (Etzler & Kabat, 1970).

Os procedimentos de purificação por afinidade são freqüentemente escolhidos

para o isolamento de lectinas, tendo em vista a relativa facilidade de imobilização de

carboidratos em suportes cromatográficos e a afinidade dessas proteínas pelos

mesmos, sem que haja prejuízo da ligação.Assim, procedimentos rápidos e eficientes

podem ser conduzidos para o isolamento de lectinas em uma única etapa, partindo-se

do material bruto. O isolamento por afinidade é possível neste caso, porque as lectinas

não modificam os compostos com os quais se ligam e a afinidade de ligação deve ser

alta o bastante para viabilizar o processo (Lis & Sharon, 1981).

Entretanto, tais processos de afinidade cromatográfica são métodos mais

dispendiosos porque necessitam de materiais específicos para sua confecção: um

ligante especial para garantir afinidade suficiente, processo de imobilização e matrizes

ativadas adequados. Esses materiais são importados e de custos elevados, pois além

das despesas de importação, a própria qualidade desses materiais (grau de pureza ou

tecnologia de produção) eleva substancialmente os seus custos. Assim, a construção

de uma coluna cromatográfica de afinidade pode ser proibitiva para uma indústria.

Além disso, a manutenção de colunas de afinidade é uma tarefa difícil quando se

trabalha com extratos brutos vegetais, pois esses materiais de partida contêm, na

maioria das vezes, muitos corantes e componentes oleosos que podem impregnar a

resina comprometendo sua funcionalidade. Além disso, o ataque de enzimas podem

danificar as ligações químicas da resina ao longo de sua utilização, diminuindo a

eficiência do processo.

� �')��4��

75

A técnica de isolamento da DBL baseada na precipitação por sulfato de

amônio seguida de cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G100 e outra

de troca iônica em Carboximetil Celulose (Font e cols., 1971) poderia constituir uma

alternativa simples para o isolamento industrial da LMA, uma vez que essas proteínas

são relacionadas. Entretanto, esse processo consiste em uma técnica que envolve três

etapas com procedimentos intermediários trabalhosos, necessitando de dessalinizações

e concentração de amostras de grandes volumes.

No presente trabalho adotou-se uma estratégia de purificação com o objetivo

de simplificar e reduzir os custos do processo. Essa estratégia de purificação da LMA

resultou em um procedimento rápido e simples que permite obter grandes quantidades

da lectina. O procedimento proposto consiste em duas etapas de tratamentos físico e

químico (precipitação térmica do EB e precipitação por etanol) de baixíssimo custo e

uma etapa cromatográfica para purificação de isoformas. Segundo a metodologia

proposta, obteve-se aproximadamente 0,2% p/p de rendimento de LMA, levando em

consideração a quantidade de pó de sementes utilizada (tabela 5). Haylett (1981),

quando isolou a LMA por cromatografia de afinidade, obteve um rendimento superior,

cerca de 0,9% p/p. Entretanto, levando-se em conta a grande facilidade de obtenção da

matéria prima, esses dados tornam-se irrelevantes para produção da lectina pura.

A inclusão do tratamento térmico como etapa de purificação, simplificou de

maneira significativa a amostra do EB levada para o processo de precipitação por

etanol; a eficiência desse tratamento pôde ser vista claramente na análise das figuras

12 e 13. Houve um aumento de enriquecimento, embora discreto, devido a remoção de

outras proteínas; assim essa etapa foi mantida para a eliminação desses contaminantes,

pois dificultavam o trabalho de purificação. Quando se prosseguia a purificação sem

esse tratamento não se obtinha a LMA pura por precipitação com etanol, pois algumas

bandas abaixo da lectina foram observadas, como pode ser visto na figura 15A

indicado pelas setas vermelhas.

Antes do estabelecimento da estratégia de purificação, alguns lotes de

purificação foram realizados com precipitação por sulfato de amônio como etapa

inicial. Os precipitados com atividade hemaglutinante desse método apresentaram

perfis eletroforéticos mais complexos e heterogêneos (resultados não mostrados). Até

mesmo o fracionamento por cromatografia de troca iônica não foi suficiente para

� �')��4��

76

isolar completamente a LMA, pois se verificou posteriormente que ambas as

isoformas 0,2M e 0,3M da LMA apresentaram enzimas proteolíticas e inibidores de

protease como contaminantes, respectivamente. Além disso, a troca do sulfato de

amônio pelo etanol comercial possibilitou algumas vantagens experimentais, tais

como a rapidez de decantação dos precipitados (facilidade na centrifugação) e a

supressão do procedimento de diálise dos precipitados (o etanol pode se removido por

evaporação). Em adição às facilidades experimentais da precipitação por etanol, tem-

se o benefício do isolamento quase total da LMA nessa etapa, conforme pode ser visto

na Fig.15B.

Com o isolamento quase completo da LMA pela precipitação por etanol, a

etapa seguinte de fracionamento por cromatografia de troca iônica proporcionou a

separação das duas frações ativas da LMA (0,2M e 0,3M). Como pode ser analisado

no cromatograma (Fig. 16), praticamente a totalidade da amostra protéica fracionada

no procedimento cromatográfico corresponde às frações 0,2M e 0,3M da LMA.

Somente pequenos picos de absorvância a 280nm são observados nos outros

intervalos de eluição do cromatograma. Ao contrário do que se observou nas

tentativas de purificação com Sulfato de Amônio, as isoformas aqui isoladas não

apresentaram proteases ou inibidores de proteases como contaminantes. Etzler (1970)

e Haylett (1982) fracionaram isoformas da DBL e LMA, respectivamente, utilizando

uma coluna de afinidade com ConA imobilizada na matriz de Sepharose 6B . A ConA

é uma lectina específica para manose/glicose; sendo assim as isoformas contendo

glicose/manose são separadas ou fracionadas. Esse procedimento não foi adotado

nesse trabalho pelo fato da necessidade de confecção de outra coluna de afinidade e

além disso, a etapa de cromatografia de troca iônica possibilitou o isolamento de duas

isoformas distintas, conforme será discutido nos ensaios de estabilidade e

especificidade sobre hemácias no sistema ABO.

A LMA 0,3M constitui uma isoforma densamente mais negativa do que a

LMA 0,2M, apresentando-se em menor quantidade do que essa última em termos de

massa, como pode ser visto na tabela de purificação. A fração 0,3M representa,

possivelmente, uma população de LMA com padrão de processamento pós-

traducional diferente da outra fração. Como a adição de um carboidrato na posição N-

terminal subtrai uma carga positiva do balanço total, pode-se aumentar a densidade de

� �')��4��

77

carga negativa da lectina, dependendo do pH do meio e do ponto isoelétrico da

mesma. Sendo a DBL e a LMA glicoproteínas conjugadas com diferentes glicídeos

(Etzler & Kabat, 1970; Font e cols., 1971; Haylett & Swart, 1982), diferenças de carga

no balanço total podem ser produzidas pela conjugação dos mesmos. Tais

processamentos podem também ter refletido nas diferenças observadas entre as duas

isoformas 0,2 e 0,3M da LMA na estabilidade térmica, estabilidade em diferentes pHs

e no estudo de especificidade sobre o sistema ABO.

A análise eletroforética da etapa final de purificação (fig. 17) mostra que as

duas isoformas da LMA apresentam aproximadamente a mesma massa molecular

(29KDa). As bandas de LMA não se coram muito bem com AgNO3, tornando-se mais

evidentes quando coradas subseqüentemente com o Coomassie Blue.

De acordo com o quadro geral de purificação (tabela 5), o rendimento total de

purificação da LMA, considerando o isolamento de ambas as isoformas é de 45%, a

magnitude desse porcentual foi relativamente constante nos lotes de purificação

realizados conforme a metodologia de isolamento proposta. É importante salientar o

bom rendimento e a boa recuperação de atividade obtidos na etapa de precipitação por

etanol: desses 74% de rendimento, grande parte da massa de proteína é devida a LMA,

pois a eletroforese dessa fração mostra basicamente essa lectina (fig.15B). Assim, um

isolamento quase total da LMA pode ser conduzido somente com o tratamento

térmico seguido da precipitação com etanol, com rendimento superior a 70%, a etapa

de troca iônica seria apenas para o isolamento das duas frações 0,2 e 0,3M da LMA.

Em hemocentros, a DBL é utilizada rotineiramente para tipagem de hemácias A1;

como a LMA apresenta grande homologia com a DBL, a LMA poderia ser usada

nessa tipagem com vantagens, pois a DBL é importada e a LMA pode ser facilmente

isolada com rendimento e pureza aceitáveis para essa aplicação. Assim, essa

purificação parcial pode ser extremamente útil, pois constitui uma metodologia muito

menos onerosa do que o procedimento de isolamento por afinidade cromatográfica

As atividades específicas das isoformas 0,2 e 0,3M da LMA são bastante

distintas: a LMA 0,3M apresenta o dobro de atividade específica da LMA 0,2M; o que

contribui para a distinção dessas duas isoformas. Em todos os lotes de purificação a

atividade específica da LMA 0,3M foi bastante superior à LMA 0,2M, entretanto a sua

� �')��4��

78

porcentagem em massa foi sempre inferior, como pode ser verificado no

cromatograma (fig.16) e no próprio quadro de purificação (tabela 5).

Com o procedimento de troca iônica para o isolamento das duas frações ativas

houve uma perda significativa de 29% de rendimento e de massa total em relação à

etapa de precipitação por etanol. Por outro lado, a troca iônica pôde remover grande

parte de substâncias corantes que sempre presentes na etapa de precipitação por

etanol. Esses corantes, muitas vezes interferiam no método de dosagem (Lowry) e

superestimavam a concentração de proteínas, comprometendo pois os dados da tabela

de purificação. Assim as perdas de massa e de rendimento ocorridos entre essas etapas

podem, em parte, serem explicadas por essa interferência. Além disso, o próprio

procedimento experimental cromatográfico pode reduzir a atividade total da LMA, em

função de desnaturação ou perdas provocadas por recuperação incompleta das lectinas

totais fracionadas.

� �')��4��

79

5.2. Caracterização da LMA

5.2.1. Ensaios de estabilidade e Dependência de Íons

Os ensaios de estabilidade mostraram diferenças significativas entre as duas

frações da LMA. A LMA 0,3M se mostrou mais estável numa ampla faixa de pH (5,0-

9,0) e mais estável termicamente (até 90 minutos a 80°C), enquanto que a fração 0,2M

se mostrou mais sensível, tanto termicamente (até 60 minutos a 60°C) quanto numa

faixa menor de pH (6,0-8,0). Sendo a fração 0,2M mais sensível termicamente, a etapa

de tratamento térmico a 90°C por 30 minutos deveria diminuir bastante a atividade da

LMA, no entanto, em todos os lotes de purificação com tratamento térmico não houve

queda significativa de atividade específica, ao contrário obteve-se acréscimo nessa

atividade devido a remoção de proteínas por precipitação térmica. Esse

comportamento pode ser atribuído a componentes protéicos do EB que podem estar

protegendo a fração 0,2M da LMA da desnaturação térmica e preservando sua

atividade (possivelmente carboidratos complexos ligados no sítio de especificidade

primária). Com a purificação da fração 0,2M e conseqüente remoção de outros

componentes (inclusive dos prováveis “protetores”), essa fração se mostra mais

sensível termicamente se submetida nas mesmas condições de tratamento térmico do

EB (90°C por 30 minutos).

Diante dessas diferenças de estabilidade pode-se considerar que a fração 0,3M

da LMA é mais resistente do que a fração 0,2M. Possivelmente a fração 0,3M da

LMA apresenta processamentos pós-traducionais que permitem que esta não perca sua

atividade em condições mais adversas. Tais modificações podem também estar

relacionadas com maior atividade específica dessa fração em relação à LMA 0,2M.

Estudos de isoformas da DBL fracionadas em coluna de afinidade com ConA

imobilizada (Carter & Etzler, 1975) mostraram a presença de duas isoformas com

atividades e especificidades semelhantes, embora com discretas diferenças no

conteúdo de glicídeos. Isoformas da LMA também foram isoladas por esse mesmo

procedimento (Haylett & Swart, 1982), sendo encontradas diferentes constituições

glicídicas para essas isoformas. No entanto nesses estudos não foram realizados

estudos de estabilidade com as diferentes isoformas, como foi feito com as duas

frações isoladas nesse trabalho.

� �')��4��

80

Assim como outras lectinas de leguminosas, a LMA também necessita de íons

divalentes para manutenção do sítio de ligação à 2-NacGal. O ensaio de atividade

hemaglutinante em presença de EDTA demonstrou que a atividade ligante da LMA é

significativamente comprometida e a reversão dessa atividade é incompleta quando se

adicionam íons Cálcio(II) e Manganês(II) em quantidades suficientes para atividade

total. Isso significa que a remoção dos íons de seus locais de coordenação próximos ao

sítio de ligação do carboidrato produz alterações conformacionais que não são

totalmente revertidas quando os íons estão disponíveis, desfavorecendo o retorno total

da atividade ligante. Provavelmente as ligações de coordenação não são

completamente restauradas de forma correta quando a LMA tentar “recuperar” os íons

removidos. Somente esses íons foram analisados pelo fato de estarem, provavelmente,

envolvidos nas interações que estabilizam o sítio de ligação ao carboidrato, o que foi

estudado e comprovado para a DBL (Hamelryck e cols., 1999). Não somente estes

íons podem estar presentes na DBL ou LMA, os íons Magnésio(II) e Zinco(II) foram

detectados nessas lectinas, em proporções diferentes entre ambas (Haylett & Swart,

1982).

5.2.2. Determinação da Massa molecular e Estado de Agregação

As massas moleculares da proteína nativa determinadas em diferentes pHs para

a LMA 0,3M e para a LMA 0,2M revelou um comportamento similar à ConA. Essa

lectina é predominantemente dímera em pH ácido (5,5) e tetrâmera em pH alcalino.

As determinações foram realizadas em condições que inviabilizaram qualquer tipo de

interação com a fase estacionária (presença de Glicose 0,2M +NaCl 1M); assim,

foram feitas duas determinações para cada amostra de LMA em dado pH. Os

resultados obtidos demonstraram que em pH 7 e 5, tanto a LMA 0,2M como a 0,3M

apresentam massas moleculares próximas de dímeros (40-60KDa) e em pH 8,5 ambas

apresentam massas moleculares de tetrâmeros (90-120KDa, fig. 23). A fração 0,3M da

LMA apresenta massa molecular ligeiramente superior à fração 0,2M em todas as

determinações. Esse resultado é condizente com a eletroforese a 12 % das frações 0,2

e 0,3M, a banda dessa última está ligeiramente superior à da LMA 0,2M (Fig.17).

As lectinas podem variar seu estado de agregação em função do pH e manter

numa mesma condição populações de múltiplas desses estados, por isso não é tarefa

� �')��4��

81

fácil estabelecer o predomínio do estado de agregação para um valor de pH.. Para

verificar se o sistema cromatográfico utilizado para a determinação das massas

moleculares da LMA era capaz de fracionar uma solução hipotética de 50% dímero +

50% de monômero; tomou-se o cromatograma típico do tetrâmero (vol. Eluição ≅ 23

ml,) e fez-se aproximação para o volume de eluição de um dímero (vol. eluição ≅ 28

ml) e de um monômero (vol. eluição ≅ 33 ml): a soma dos dois cromatogramas gerou

um gráfico de picos não individualizados (sem resolução) com volume de eluição de

aproximadamente 30,2 ml que equivale a 43,5KDa. Portanto, nessas condições a

coluna não conseguiria fracionar os dímeros dos monômeros, ambos iriam migrar

gerando um pico cromatográfico único mais largo. Assim, os valores de massa

molecular determinados em pH 5 e pH 7, podem estar influenciados por esse

equilíbrio de agregação (dímeros:monômeros:tetrâmeros). Tal equilíbrio poderia ser

analisado numa ultracentrífuga analítica, mas não no sistema cromatográfico aqui

proposto.

Haylett (1982), quando determinou a massa molecular da proteína nativa da

LMA utilizou uma coluna de Sephadex G200 (40,0 × 1,4 cm) e procedeu a

cromatografia em pH 7,4; não sendo realizadas outras determinações em outras

condições de pH. Nesse trabalho, utilizou-se uma coluna de Sephacryl HR S200 com

dimensões 0,5cm x 150 cm, tal coluna possui maior número de equilíbrios de

fracionamento e mesmo assim não foi capaz de fracionar misturas de agregados de

lectinas nos pHs testados.

� �')��4��

82

5.3. Estudos Biológicos

5.3.1. Estudos sobre Hemácias no Sistema ABO

Os ensaios realizados com hemácias nativas representantes dos Grupos A1, A2,

B e O do sistema ABO demonstraram que as frações 0,2 e 0,3M da LMA são

estritamente específicas para o subgrupo A1, assim como a DBL. Como mostrado na

tabela 3, o grupo sanguíneo A possui a 2-NacGal como glicídeo antigênico

determinante, mas diferenças quantitativas e qualitativas desses antígenos, faz com

que esse grupo se subdivida em A1 e A2.

Existe uma diferença quantitativa evidente no perfil de atividade

hemaglutinante nas frações 0,2 e 0,3M da LMA, o que refletiu diretamente na

atividade específica de ambas. A LMA 0,3M apresenta nitidamente uma atividade

específica superior à sua isoforma 0,2M. Essa diferença pode ser visualizada no

quadro geral de purificação (tabela 5).

Quando se utilizaram hemácias tratadas com tripsina, além do aumento da

sensibilidade das mesmas (os títulos aumentaram em todos os testes) observou-se que

a LMA 0,3M perdeu sua especificidade, sendo positiva para outros grupos sanguíneos

(A2, B e O). A LMA 0,2M não perdeu sua especificidade para o Grupo A, no entanto

foi positiva para A1 e A2 quando testada com hemácias “tripsinizadas”. Esse

comportamento seria esperado para ambas as frações de LMA, pois o determinante

antigênico do grupo A é idêntico em A1 e A2 (2-NacGal). Entretanto, a ligação de

LMA 0,3 M em outros grupos sanguíneos, no teste com hemácias “tripsinizadas”,

mostra surpreendentemente, que diferenças moleculares dessas duas frações

determinam diferentes maneiras de interagir com antígenos dos outros grupos

sanguíneos (Gal para B e Fucose para O, ver fig.8). Portanto a LMA 0,2M é uma

fração mais seletiva em sua ligação com a 2-NacGal, pois promoveu aglutinação

somente de hemácias tripsinizadas do grupo A (2-NacGal). O tratamento com tripsina

em hemácias é normalmente utilizado para aumentar a sensibilidade das hemácias às

lectinas, pois a remoção proteolítica de parte das proteínas presentes na membrana do

eritrócito pode expor antígenos ligantes ocultos ou inacessíveis. Assim, ao tratamento

enzimático pode ser relacionado o aumento da sensibilidade, pois tanto a LMA 0,2 e

0,3M tiveram aumento de 64 vezes no título para as hemácias A1. Em contrapartida, a

� �')��4��

83

perda da especificidade da LMA 0,3M em hemácias tripsinizadas pode ser

relacionada a modificações desta fração que permitiram que esta reconhecesse os

determinantes antigênicos dos outros grupos sanguíneos expostos nas hemácias

tripsinizadas.

Esse comportamento da LMA 0,3M sobre hemácias tripsinizadas, juntamente

com as diferenças observadas nos ensaios de estabilidades das duas frações (pH e

temperatura) e com o perfil de eluição na cromatografia de troca iônica demonstram

que a LMA 0,2 e 0,3M são frações ativas da mesma lectina, com propriedades

diferentes. Tais diferenças podem ser devidas à presença de carboidratos (Haylett &

Swart, 1982) ou outros processamentos químicos diferentes não conhecidos entre as

isoformas. Essas diferenças podem estar influenciando o sítio de ligação ao

carboidrato da LMA de forma que o mesmo possa reconhecer de maneira diferente,

superfícies contendo outros carboidratos; além disso, essas diferenças moleculares da

LMA 0,3M podem também estar influenciando na estabilidade molecular dessa

lectina, uma vez que esta se mostrou mais resistente nos ensaios de estabilidade.

5.3.2. Estudos de Aglutinação com cepas de Escherichia coli

Das 103 cepas de E. coli estudadas, a aglutinação pela LMA 0,2M foi positiva

num grupo muito pequeno constituído pelas cepas padrões ST 275 e LT e as amostras

de cepas número 40, 28, 40, 41, 67, 84 e 95.

Esses resultados são consistentes com a presença de resíduos 2-NacGal na

superfície externa das bactérias positivas, assumindo-se a especificidade preferencial

da LMA por tal resíduo (Blanco e cols., 2001; Wu & Sugii, 1991). Considerando que

a amostragem empregada nos testes de aglutinação foi bastante abrangente, no que diz

respeito a utilização de cepas isoladas em amostras de água consumida pela população

carente da Cidade de Ouro Preto, MG, pode-se concluir que a 2-NacGal apresenta-se

fracamente distribuída na superfície das cepas estudadas

As cepas de Escherichia coli podem ser sorotipadas de acordo com a

constituição dos lipopolissacárides na membrana externa através de soros comerciais

(Tortora e cols., 2000) As cepas positivas para o ensaio de aglutinação com LMA

� �')��4��

84

foram assim sorotipadas por meio de soros polivalentes contra antígenos do tipo K e O

(E.coli enteropatogênica clássica A; E.coli enteropatogênica clássica B; E.coli

enteropatogênica clássica C; E.coli enteroinvasora A; E.coli enteroinvasora B; E.coli

enterohemorrágica) e pelo ensaio biológico para caracterização de E. coli

enterotoxigênica (resultados não mostrados). Portanto, torna-se difícil fazer uma

análise conclusiva sobre a ocorrência da 2-NacGal nas subespécies, diante de um

número tão reduzido de exemplares identificados. De qualquer forma, os resultados

mostraram dados interessantes das cepas positivas para a LMA (10 em 103), pois

pode-se distinguir subgrupos em função dos diferentes títulos: duas amostras que

apresentaram título de 1/64; quatro com título de 1/32 e apenas duas entre 1/8 e 1/4. A

estrutura polissacarídea sintética que melhor interage com a lectina Dolichos biflorus,

promovendo um aumento de 10 vezes na constante de associação, é contituída de β-D-

2-NacGal-(1→4)-3-O-(CH2COOH)-ββββ-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→O)-(CH2)5-

NH2 (Jimenez Blanco e cols., 2001; veja estrutura no anexo III). Este protótipo

molecular demonstra que a Gal substituída em C3 (mostrada em negrito) promove

uma melhor adaptação à estrutura da DBL, o que também deve ser esperado para a

LMA. Desta maneira, pode-se admitir que na estrutura glicídica externa exista uma

situação semelhante para as amostras de E. coli que apresentaram os maiores títulos.

Contudo para se estabelecer uma correlação entre a estrutura glicídica e os títulos,

seriam necessários o isolamento e a elucidação da estrutura química dos antígenos

glicídicos dos lipopolissacárides dessas cepas.

Os resultados encontrados para as duas cepas padrões de E. coli ST (275 e

761) demonstram a impossibilidade da identificação dessas subespécies pela

superfície antigênica glicídica, uma vez que ambas não tiveram resultados

concordantes na aglutinação; mesmo sendo ambas padrões de E. coli

enterotoxigênicas produtoras de toxina termoestável (ST). Isso demonstra que existem

diferenças na composição dos antígenos glicídicos em cepas caracterizadas pela

produção da mesma toxina. De fato, os métodos propostos para o diagnóstico dessas

bactérias utilizam outras estratégias para identificá-las e, além disso, a literatura

registra uma grande diversidade de antígenos dentre os sorotipos O, K e H (antígenos

da porção oligossacarídica provenientes do LPS, cápsula e do flagelo

respectivamente).

� �')��4��

85

Portanto, para uma identificação detalhada dessas cepas, é importante

caracterizá-las de acordo com soros específicos dirigidos à porção polissacarídica. Por

meio de outras abordagens, os antígenos dos lipopolissacárides tiveram suas estruturas

químicas elucidadas após seus isolamentos e análises de dados de ressonância

magnética nuclear. Esses trabalhos visam, conhecer propriedades bioquímicas dessa

importante estrutura antigênica, mas empregam procedimentos trabalhosos para

analisar de modo abrangente os diversos sorotipos existentes. Uma das vantagens do

uso de lectinas, tal como a LMA para caracterizar os antígenos O, K e H, seria a

possibilidade de constatar a presença de resíduos 2-NacGal e agrupar os antígenos

semelhantes quimicamente pela análise dos títulos.

5.3.3. Estudos de Biodistribuição da 99mTc-LMA 0,2 M

Muitos procedimentos de marcação de proteínas e até mesmo células vivas

íntegras com 99mTc já foram padronizados, utilizando metodologias rápidas e

eficientes. O 99mTc é um radionuclídeo com energia de radiação relativamente baixa

(140 Kiloelétron-voltz). Um radiotraçador é um radioisótopo introduzido em

determinado meio a se estudar para seguir o caminho que ele percorre no dado

sistema, através da detecção da radiação por ele emitida (Rocha e cols., 1971).

Segundo a metodologia proposta por Alves (2002), a LMA 0,2M foi marcada

adequadamente com o 99mTc, utilizando uma combinação de dois agentes redutores

cloreto estanoso e boridreto de sódio. Desta forma obteve-se um teor de pureza

radioquimica de 88%. Isto significa que 88% dos átomos de tecnécio adicionados em

reação se ligaram a molécula de LMA. Portanto, apenas 12% de impureza foram

encontrados devido ao tecnécio livre que não se incorporou e ao tecnécio hidrolisado.

Este padrão de marcação está de acordo com aquele estipulado pela Farmacopéia

Norte-Americana para radiofármacos. Desta forma, o produto marcado (99mTc-LMA)

poderia ser utilizado para estudos de biodistribuição.

Quando se marca uma estrutura torna-se necessário assegurar que suas

propriedades quimica e biológica não foram alteradas pela presença do átomo

radioativo na molécula. Assim, estudos de bioatividade foram realizados utilizando

hemácias A1 para testar a atividade hemaglutinante da 99mTc-LMA. Os resultados

� �')��4��

86

mostraram que não houve diferença significativa entre os ensaios realizados com a

LMA e a 99mTc-LMA.

Os ensaios realizados em diferentes tempos demonstraram que as

radioatividades medidas foram predominantes nos rins e na urina (bexiga) dos animais

injetados com 99mTc-LMA 0,2 M pela via caudal. Essa predominância se instituiu

desde os primeiros 5 minutos e prevaleceu até os 180 minutos. De acordo com a fig.

26, observa-se que o sangue e o fígado apresentam perfis de eliminação semelhantes;

o cérebro, estômago, baço, pulmão e coração mostraram perfis de eliminação

similares ao sangue, no entanto com decréscimos suaves. Essa semelhança sugere que

a radiação medida nesses órgãos é decorrente da perfusão sanguínea, sem que haja

evento de ligação específica da 99mTc-LMA 0,2 M. As radiações máximas alcançadas

nesses órgãos foram observadas nos primeiros 10 minutos após a injeção da LMA

marcada, com decréscimos suaves até os 180 minutos.

Proteínas do tamanho da albumina (69KDa) não passam facilmente pelos

glomérulos renais, no entanto, solutos com massa molecular abaixo de 5 KDa

possuem livre trânsito através da membrana filtrante do glomérulo. As

macromoléculas de 17 KDa são filtradas com certa dificuldade, de acordo com sua

carga ou forma (Aires, 1991). Assim, a 99mTc-LMA 0,2 M (120KDa) não poderia

passar livremente na membrana filtrante do glomérulo. Portanto, a verificação da

elevada radioatividade na urina (com massa superior a 5KDa, de acordo com a fig. 26)

pode ser devido a frações menores da 99mTc-LMA 0,2 M metabolizadas in vivo. No

entanto, se a lectina poderia estar sendo eliminada de forma intacta se a mesma

pudesse estar ativando mecanismos de endo e exocitose nas células glomerulares

através do reconhecimento glicídico.

A radioatividade nos rins é prevalente e permanece razoavelmente constante

após 180 minutos decorridos da biodistribuição. Supondo que os rins estejam filtrando

a 99mTc-LMA 0,2M; é improvável que após 180 minutos ainda exista proteína

marcada a ser filtrada, uma vez que nesse tempo de biodistribuição o sangue já não

apresenta radioatividade tão significativa como a dos rins. Assim é provável que esteja

ocorrendo uma ligação da 99mTc-LMA 0,2 M no tecido renal. As células parietais do

ramo ascendente da alça de Henle produzem e excretam normalmente na urina uma

glicoproteína denominada Proteína de Tam-Horsfall (PTH). Essa proteína possui cerca

� �')��4��

87

de 30% em massa de glicídeos e dentre eles encontramos a 2-NacGal como parte

desses carboidratos (Williams e cols., 1984; Cavallone e cols., 2001). A 2-NacGal

presente na PTH é componente do antígeno Sda, um antígeno de elevada afinidade

pela DBL (esse glicídeo é um tetrassacáride muito semelhante à estrutura mostrada no

apêndice IV). Portanto, a presença da PTH nas células renais e na urina pode estar

relacionada com a elevada radioatividade observada na urina, e principalmente nos

rins dos animais injetados com 99mTc-LMA 0,2 M; uma vez que essa lectina pode

estar ligando especificamente na PTH presente nas células renais. Se a 99mTc-LMA

0,2 M está alcançando as células renais produtoras de PTH, é possível que esta esteja

sendo eliminada pela urina ligada na 99mTc-LMA 0,2 M, o que explicaria a elevada

radioatividade na urina. A PTH é excretada de forma íntegra na urina e o mecanismo

de excreção ainda é obscuro.

A autoradiografia dos rins de camundongos Swiss injetados com 125I-LMA 0,2

M demonstra que a radioatividade se concentra no córtex renal, onde se encontram os

glomérulos renais em sua maior parte. Os dados obtidos com a biodistribuição

utilizando a 99mTc-LMA 0,2 M corroboram com os resultados obtidos nas

autoradiografias (fig.28). Assim é provável que estejam ocorrendo ligações

específicas entre a LMA 0,2M e as células do tecido renal, e que a radiação detectada

nos rins após 180 minutos da biodistribuição com 99mTc-LMA 0,2 M seja devido à

lectina marcada ligada. Além da presença de radioatividade elevada nos rins após 180

minutos, a radioativiadade encontrada na urina foi em grande parte excluída em

coluna de Sephadex G25, indicando que os elementos radioativos excluídos são

maiores que 5KDa. Essa observação exclui a possibilidade de uma ligação

inespecífica de átomos de 99mTc no tecido renal, provenientes de uma possível

metabolização da 99mTc-LMA 0,2M em partículas menores. Nesse caso, a

radioatividade da urina seria retida pela coluna de Sephadex G25 e seu volume de

eluição seria maior que o volume vazio dessa coluna, o que não foi observado.

:3�!��')�.���

!��')�.���

89

6. CONCLUSÕES

• Duas frações ativas da LMA foram purificadas do extrato salino de sementes

da Macrotyloma axillare pela metodologia proposta. Grande parte da LMA

ativa pôde ser isolada apenas pelas duas etapas iniciais de precipitação do

extrato bruto (tratamento térmico e precipitação por etanol). As duas frações

ativas 0,2 e 0,3M da LMA foram purificadas por uma etapa cromatográfica de

troca iônica em Q-Sepharose pH 8,3.

• A metodologia de purificação proposta possibilitou o isolamento das frações

0,2M e 0,3M da LMA, com bons rendimentos.

• As duas frações das lectinas isoladas apresentaram diferenças dos ensaios de

estabilidade térmica e na dependência de pH. Os resultados obtidos para a

LMA 0,3M sugerem que essa fração é mais resistente termicamente e mantém

sua atividade total numa faixa maior de pH, comparando com a fração 0,2M.

• As frações de lectinas isoladas, assim como a maioria das lectinas de

leguminosas, mostraram-se dependentes dos íons Cálcio(II) e Manganês(II)

para a manutenção da atividade máxima.

• A massa molecular dos monômeros de ambas as isoformas foi determinada em

eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 12% como sendo de 29 KDa. As

determinações da massa molecular da proteína nativa das frações da LMA

purificadas mostraram massas moleculares indicativas de tetrâmeros (90-

120KDa) em pH 8,5 e massas moleculares condizentes com dímeros (40-

50KDa) em pH 5,0 e 7,0.

• As frações ativas 0,2 e 0,3M da LMA apresentam especificidades para

hemácias nativas do subgrupo A1. O estudo com hemácias tratadas com

tripsina demonstrou que a fração 0,2M preserva sua especificidade pelo grupo

sanguíneo A (A1, A2), enquanto que a LMA 0,3M perde sua especificidade,

sendo positiva para as hemácias A1, A2, B e O.

• Os ensaios de aglutinação com cepas isoladas de Escherichia coli

demonstraram que o resíduo 2-NacGal é relativamente raro na população

analisada (cerca de 8% de aglutinação positiva). Os resultados mostraram que

os padrões de cepas semelhantes quanto a produção de toxinas termoestáveis

!��')�.���

90

de procedências diferentes (padrões de Escherichia coli ST Ufop e Unicamp),

podem conter diferenças na constituição glicídica, pois somente um dos

padrões foi positivo (E. coli ST Ufop).

• Os ensaios de biodistribuição demonstraram que a radioatividade da 99mTc-

LMA 0,2M se concentra nos rins e na urina em 5 minutos de distribuição e

permanece predominante até 180 minutos nos rins e também na urina. A

predominância de grande parte da radioatividade nos rins pode indicar que

existe ligação da 99mTc-LMA 0,2M no tecido renal, com eliminação da mesma

pela urina. As auto-radiografias de camundongos injetados com 125I-LMA

0,2M demonstraram radioatividade na região do córtex renal, o que apóia a

hipótese de estar havendo ligação da lectina nas células renais. Essa ligação

específica pode representar a descoberta de uma ferramenta para estudos de

fisiologia renal.

;3������<�' ���� � �,�=� '���

�����<�' ���

92

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AIRES M.M. (1991) Fisiologia. 1a. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A. pp. 495-565.

Alves, A. C. Biodistribuição em camundongos de 99mTc - Ovalbumina e encapsulada em lipossomas após administração oral. 1-80. 2002. Faculdade de Farmácia/Universidade Federal de Minas Gerais; Belo Horizonte,MG. (Dissertação de Mestrado)

AVICHEZER D. & ARNON R. (1996) Differential reactivities of the Arachis hypogaea (peanut) and Vicia villosa B4 lectins with human ovarian carcinoma cells, grown either in vitro or in vivo xenograft model. FEBS Letters 395, 103-108.

AVNI I., ARFFA R.C., ROBIN J.B. & RAO N.A. (1987) Lectins for the identification of ocular bacterial pathogens. Metab Pediatr.Syst.Ophthalmol. 10, 45-47.

BABINO A., TELLO D., ROJAS A., BAY S., OSINAGA E. & ALZARI P.M. (2003) The crystal structure of a plant lectin in complex with the Tn antigen. FEBS Letters 536, 106-110.

BARONDES S.H. (1988) Bifunctional properties of lectins: lectins redefined. Trends in Biochemical Sciences 13, 480-482.

BETTER PASTURES FOR THE TROPICS AND SUBTROPICS. Macrotyloma axillare - http://www.tropicalgrasslands.asn.au/pastures/axillr.htm. (2003). (Sítio da Internet)

BLANCO J.L.J., HASELEY S.R., KAMERLING J.P. & VLIEGENTHART J.F.G.

(2001) Analysis of the interaction between lectins and tetra- and tri-saccharide mimics of the Sda determinant by surface plasmon resonance detection. Biochimie 83, 653-658.

BROCKE C. & KUNZ H. (2002) Synthesis of Tumor-Associated Glycopeptide Antigens. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 3085-3112.

BUTS L., DAO-THI M.H., LORIS R., WYNS L., ETZLER M. & HAMELRYCK T. (2001) Weak Protein-Protein Interactions in Lectins: The Crystal Structure of a Vegetative Lectin from the Legume Dolichos biflorus. Journal of Molecular Biology 309, 193-201.

CARTER W.G. & ETZLER M.E. (1975) Isolation and characterization of subunits from the predominant form of Dolichos biflorus lectin. Biochemistry 14, 2685-2689.

�����<�' ���

93

CAVALLONE D., MALAGOLINI N. & SERAFINI-CESSI F. (2001) Mechanism of Release of Urinary Tamm-Horsfall Glycoprotein from the Kidney GPI-Anchored Counterpart. Biochemical and Biophysical Research Communications 280, 110-114.

ELGAVISH S. & SHAANAN B. (1997) Lectin-Carbohydrate interactions: different folds, commom recognition principles. Trends in Biochemical Sciences 22, 462-467.

ETZLER M.E. & KABAT E.A. (1970) Purification and characterization of a lectin (plant hemagglutinin) with blood group A specificity from Dolichos biflorus. Biochemistry 9, 869-877.

ETZLER M.E., KALSI G., EWING N.N., ROBERTS N.J., DAY R.B. & MURPHY J.B. (1999) A nod factor binding lectin with apyrase activity from legume roots. PNAS 96, 5856-5861.

FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS. www.fao.org/ag/AGP/AGPC/doc/gallery/pictures/macaxi.jpg. 2003. (Sítio da Internet)

FONT J., LESENEY A.M. & BOURRILLON R. (1971) Isolation and properties of an

anti A 1 phytohaemagglutin from Dolichos biflorus seeds. Biochim.Biophys.Acta 243, 434-446.

HAMADA S., GILL K. & SLADE H.D. (1977) Binding of lectins to Streptococcus mutans cells and type-specific polysaccharides, and effect on adherence. Infect.Immun. 18, 708-716.

HAMELRYCK T.W., LORIS R., BOUCKAERT J., DAO-THI M.H., STRECKER G., IMBERTY A., FERNANDEZ E., WYNS L. & ETZLER M.E. (1999) Carbohydrate Binding, Quaternary Structure and a Novel Hydrophobic Binding Site in Two Legume Lectin Oligomers from Dolichos biflorus. Journal of Molecular Biology 286, 1161-1177.

HAYLETT T. & SWART L.S. (1982) Isolation and characterization of an anti-A1 lectin from Macrotyloma axillare. 35, 33 (1982). L. S. Swart, National Chemical Research laboratory, CSIR, P.O. Box 395, Pretoria 0001, Republic of South Africa. South African J.Chem - Toxicon 35, 33-36.

HENRY J.B. (1996) Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 19 Ed. New York: W.B. Saunders Company. pp. 3-1556.

JIMENEZ BLANCO J.L., HASELEY S.R., KAMERLING J.P. & VLIEGENTHART J.F. (2001) Analysis of the interaction between lectins and tetra- and tri- saccharide mimics of the Sd(a) determinant by surface plasmon resonance detection. Biochimie 83, 653-658.

�����<�' ���

94

KALSI G. & ETZLER M.E. (2000) Localization of a Nod Factor-Binding Protein in Legume Roots and Factors Influencing Its Distribution and Expression. Plant Physiol. 124, 1039-1048.

KENNEDY J.F., PALVA P.M.G., CORELLA M.T.S., CAVALCANTI M.S.M. & COELHO L.C.B.B. (1995) Lectins, versatile proteins of recognition: a review. Carbohydrate Polymers 26, 219-230.

KONOZY E.H.E., BERNARDES E.S., ROSA C., FACA V., GREENE L.J. & WARD R.J. (2003) Isolation, purification, and physicochemical characterization of a galactose binding lectin from seeds of Erythrina speciosa. Archives of Biochemistry and Biophysics 410, 222-229.

LAEMMLI U.K. (1970) Cleavage of Structural Proteins During Assembly of Head of Bacteriophage-T4. Nature 227, 680-681.

LIS H. & SHARON N. (1984) Biology of Carboidrates. New York: Eds., Wiley. pp. 1-85.

LIS H. & SHARON N. (1986) Lectins as molecules and as Tools. Ann.Rev.Biochem 55, 35-67.

LIS H. & SHARON N. (1981) Affinity chromatography for the purification of lectins (a review). Journal of Chromatography 215, 361-372.

LORD J.M.e.c. (1994) Ricin: structure, mode of action and some current applications. FASEB J. 8, 201-208.

LORIS R., HAMELRYCK T., BOUCKAERT J. & WYNS L. (1998) Legume lectin structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1383, 9-36.

LOWRY O.H., ROSENBROUGH N.J., FARR A.L. & RANDALL R.J. (1951) Protein measurement with the Folin Phenol Reagent. J.Biol.Chem. 193, 265-275.

MARTINEZ-CRUZ M., ZENTENO E. & CORDOBA F. (2001) Purification and characterization of a galactose-specific lectin from corn (Zea mays) coleoptyle. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1568, 37-44.

MATHEWS C.K. & K.E.VAN HOLDE (1996) Biochemistry. 2nd Ed. New York: The Benjamin/Cummings Publishing Company, INC. pp. 2-1159.

McConahey, P. J. and Dixon, F. J. Radioiodination of Proteins by the Use of the Chloramine-T Method. Colowich, S. P. (70), 210-213. 1980. Methods in Enzymolgy.)

�����<�' ���

95

OZEKI Y., TAZAWA E. & MATSUI T. (1997) D-Galactoside-Specific Lectins from the Body Wall of an Echiuroid (Urechis unicinctus) and Two Annelids (Neanthes japonica and Marphysa sanguinea). Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 118, 1-6.

Pauwels, E. K., Welling, M. M., Feitsma, R. I., Atsma, D. E., and Nieuwenhuizen, W.(1993) The labeling of proteins and LDL with 99mTc: a new direct method employing KBH4 and stannous chloride. Nuclear Medicine and Biology 7, 825-833. 20-10-1993.

PURI K.D., GOPALAKRISHNAN B. & SUROLIA A. (1992) Carbohydrate binding

specificity of the Tn-antigen binding lectin from Vicia villosa seeds (VVLB4). FEBS Letters 312, 208-212.

ROCHA A.F.G., MACIEL O.S. & GVION R. (1971) Traçadores Radioativos. In Medicina Nuclear. AnonymousGuanabara Koogan. pp. 111-133.

ROY R. & BAEK M.G. (2002) Glycodendrimers: novel glycotope isosteres unmasking sugar coding. Case study with T-antigen markers from breast cancer MUC1 glycoprotein. Reviews in Molecular Biotechnology 90, 291-309.

SCHMIDT R.R. (1987) Stereochemistry of Organic and Bioorganic Transformations. VCH, Republic of Germany: pp. 169-189.

SCOPES R.K. (1987) Protein Purification. 2 Ed. New York: Springer Advanced Texts in Chemistry. pp. 1-329.

SHARON N. (1993) Lectin-carbohydrate complexes of plants and animals: an atomic view. Trends in Biochemical Sciences 18, 221-226.

SINGH R.S., TIWARY A.K. & KENNEDY J.F. (1999a) Lectins: Sources, Activities and Applications. Critical Reviews in Biotechnology 19, 145-178.

STAAF M., URBINA F., WEINTRAUB A. & WIDMALM G. (1997) Structure determination of the O-antigenic polysaccharide from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) O101. Carbohydrate Research 297, 297-299.

TALBOT C.F. & ETZLER M.E. (1978) Isolation and characterization of a protein from leaves and stems of Dolichos biflorus that cross reacts with antibodies to the seed lectin. Biochemistry 17, 1474-1479.

TORTORA G.J., FUNKE B.R. & CASE C.L. (2000) Microbiologia. 6a. Ed. Artes Médicas. pp. 80-87.

United States Department of Agriculture - Plants Database. Plants Database - Macrotyloma axillare. http://plants.usda.gov/index.html . 2003. (Sítio da Internet)

�����<�' ���

96

WAYNE WRAY, TENI BOULIKAS, VIRGINIA P.WRAY & RONALD HANCOCK (1981) Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels. Anal.Biochem. 118, 197-203.

WILLIAMS J., DEREK MARSHALL R., VAN HALBEEK H. & VLIEGENTHART J.F.G. (1984) Structural analysis of the carbohydrate moieties of human Tamm-Horsfall glycoprotein. Carbohydrate Research 134, 141-155.

WU A.M. & SUGII S. (1991) Coding and classification of D-Galactose, 2-N-acetyl-D-galactosamine, and �-D-Galp-[1→3(4)]-�-D-GlcpNac specificities of applied lectins. Carbohydrate Research 213, 127-143.,

�0<�� '���

98

APÊNDICE I Dados da reta-padrão de dosagem de proteínas pelo método de Lowry:

Vol.(µl) [BSA]µg/ml A660 (n=3) Média A660

5 20 0,035/0,034/0,034 0,034

10 40 0,067/0,066/0,066 0,066

15 60 0,099/0,103/0,105 0,102

20 80 0,140/0,134/0,132 0,135

25 100 0,161/0,165/0,172 0,166

Tabela 8 - Pontos da reta padrão utilizados para a dosagem de proteínas.

y = 0,0017x + 0,0012R2 = 0,9958

00,020,040,060,08

0,10,120,140,160,18

0,2

0 25 50 75 100

[BSA] microgramas/ml

A66

0

Figura 30 - Reta padrão de dosagem de proteínas pelo método de Lowry.

A reta padrão foi construída a partir da média da triplicata de cada ponto

considerado. Os volumes foram tomados de uma solução de Soroalbumina Bovina a

1mg/ml

99

APÊNDICE II

Reta-padrão das determinações de massa molecular em Sephacryl HR S200

y = -0,0751x + 6,9106R2 = 0,992

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00

VOLUMES DE ELUIÇÃO (ml)

LOG

MM

AB

C DE

F

Figura 31 – Reta padrão das cromatografias de exclusão molecular.

Padrões MM LogMM Vol. Eluição

(ml)

A – Dextrano Azul >>300.000 5,48 19,37

B - Desidrogenase Alcoólica 150.000 5,18 24,00

C - Hemoglobina 64.000 4,80 27,14

D - Lectina da Erthryna especiosa 58.000 4,76 28,51

E - Tripsina 24.000 4,38 32,86

F - CoCl2 <<5.000 3,70 43,37

Tabela 9 – Volumes de eluição obtidos dos padrões de massa molecular.

MM: Massa molecular

100

APÊNDICE III

Figura 32 - Estrutura química sintética do melhor ligante glicídico da DBL (derivado do

Tetrassacáride determinante do antígeno Sda. Modificado de Blanco e cols.(2001).