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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
KAREN PRISCILA DE LIMA
AVALIAÇÃO DA POTENCIALIDADE DA CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO
SUPERCRÍTICO DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA (UHPSFC) ALIADA À MÉTODOS
QUIMIOMÉTRICOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DE RESÍDUOS DE
AGROTÓXICOS APLICADOS EM ALFACE
CAMPINAS
2017
KAREN PRISCILA DE LIMA
AVALIAÇÃO DA POTENCIALIDADE DA CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO
SUPERCRÍTICO DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA (UHPSFC) ALIADA À MÉTODOS
QUIMIOMÉTRICOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DE RESÍDUOS DE AGROTÓXICOS
APLICADOS EM ALFACE
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Química, na área de Química Analítica
Orientadora: Profa. Dra. Marcia Cristina Breitkreitz
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA KAREN PRISCILA DE LIMA, E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. MARCIA CRISTINA BREITKREITZ.
CAMPINAS
2017
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por todas as coisas boas que acontecem diariamente.
Aos meus pais, Antonio e Eleni, pelo carinho, paciência e incentivo.
À Professora Dra. Márcia Cristina Breitkreitz pela orientação e aprendizado.
À Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim pelas contribuições a este trabalho.
A todos os familiares que sempre me apoiaram.
Aos colegas de laboratório de cromatografia, Fabi, Leandro, Hery, Luciana, Paula,
Fernando e Claudio.
Agradeço especialmente a Luana Macedo por ter me ajudado muito com a parte de
validação de métodos. Agradeço também a Lucilia por ser uma pessoa especial e que
sempre me ajudou, em tudo.
As boas amizades que eu fiz em Campinas – Na, Jordana e Tati.
À Patrícia Valderrama por sempre ter acreditado em mim e por ter me ajudado a
chegar até aqui.
Enfim, obrigada a todos que de certa forma contribuíram com a minha formação
pessoal e acadêmica, porque todo aprendizado é válido!
RESUMO
A Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC) é uma
técnica recente, que vem despertando interesse na Química Analítica por promover
separações rápidas, eficientes e com a mínima geração de resíduos, porém seu uso
ainda é limitado, principalmente para a análise de agrotóxicos. Nesse contexto, foi
avaliada a potencialidade da técnica para quantificação multirresíduo de 10 agrotóxicos
que podem ser aplicados em cultura da alface, em comparação com um método usando
Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC). Para efeito de comparação,
buscou-se usar alguns fatores comuns aos métodos, como o mesmo modificador
orgânico da fase móvel e diluente da amostra, por exemplo. Em UHPSFC, devido a
quantidade de variáveis experimentais inter-relacionadas, o desenvolvimento e a
otimização do método para separação completa dos analitos com resolução igual ou
maior que 2 foram obtidos com o uso de um planejamento fatorial 24 com ponto central,
envolvendo os fatores pressão, temperatura, fase estacionária e porcentagem de
modificador orgânico na fase móvel. Para preparo das amostras de alface foi utilizado
o método QuEChERS Citrato. Os métodos desenvolvidos em ambas técnicas
cromatográficas foram validados de acordo com as figuras de mérito seletividade,
linearidade, limite de quantificação (LQ), exatidão (em termos de recuperação) e
precisão (repetibilidade e precisão intermediária). Dos 10 agrotóxicos estudados,
obteve-se seletividade para sete analitos em UHPSFC e para oito em UHPLC. A curva
analítica para cada analito foi linear na faixa de concentração de 0,2-1,5 mg kg-1
(UHPSFC) e de 0,1-1,2 mg kg-1 (UHPLC) com coeficientes de correlação na faixa de
0,991-1,000 para UHPSFC e 0,991-0,997 para UHPLC. Os valores médios de
recuperação obtidos para três níveis de fortificação (0,8, 1,0 e 1,1 mg kg-1) foram 72-
122% para UHPSFC e 76-140% para UHPLC, com precisão menor que 20% em ambas
as técnicas. Comparando a UHPSFC com a UHPLC, que é uma técnica já estabelecida
no campo da ciência de separação, percebe-se que os limites de quantificação,
exatidão e precisão em ambas foram similares nos métodos desenvolvidos. Além disso,
na técnica de UHPSFC foi utilizado um volume reduzido de solvente orgânico (0,975
mL x 2,100 mL para UHPLC) e o tempo de análise foi menor do que o obtido em UHPLC
(5,1 min x 16,1 min em UHPLC), gerando menor quantidade de resíduos.
ABSTRACT
Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC) is a recent
technique that has risen interest in Analytical Chemistry for promoting rapid and efficient
separations and minimum residue generation, but it is not largely used up to the
moment, especially in the analysis of pesticides. In this context, the potential of the
technique for multiresidue quantification of 10 pesticides that can be applied to the
lettuce culture was evaluated in comparison to a method using Ultra High Performance
Liquid Chromatography (UHPLC). For the purpose of comparison, common parameters
were used in both methods, such as the same organic modifier in mobile phase and
injection solvent. In UHPSFC, due to the number of interrelated experimental variables,
the development and optimization of the method for complete separation of the analytes
with resolution equal or higher than to 2 were obtained with the use of a 24 factorial
design with central point in triplicate to study the factors pressure, temperature,
stationary phase and percentage of organic modifier in the mobile phase. To prepare
the lettuce samples, the QuEChERS Citrate method was used. The methods developed
using both chromatographic techniques were validated according to the figures of merit:
selectivity, linearity, quantification limit (LQ), accuracy (in terms of recovery) and
precision (repeatability and intermediate precision). Selectivity was obtained for seven
pesticides in UHPSFC and eight in UHPLC, out of the 10 analyzed. The analytical curve
for each analyte was linear over the concentration range of 0.2–1.5 mg/kg (UHPSFC)
and of 0.1–1.2 mg/kg (UHPLC) with correlation coefficients in the range of 0.991-1.000
for UHPSFC and 0.991-0.997 for UHPLC. The average recoveries obtained for the three
fortification levels (0.8, 1.0 and 1.1 mg/kg) were 72-118% for UHPSFC and 76-140% for
UHPLC, with RSD < 20% for precision in both techniques. Comparing UHPSFC with
UHPLC, which is a technique already established in the field of the separation sciences,
it is possible to conclude that the limits of quantification, accuracy and precision in both
were similar for the developed method. In addition, in UHPSFC it was used a reduced
volume of organic solvent (0.975 mL x 2.100 mL for UHPLC), and the method was faster
than in UHPLC (5.1 min x 16.1 min in UHPLC), generating lower amounts of residues.
Lista de Figuras
Figura 1: Representações das mudas de alfaces atingidas pela doença tombamento. ........... 26
Figura 2: Representações de folhas de alfaces atingidas pela doença míldio. ......................... 27
Figura 3: Representações de alfaces atingidas pela doença septoriose. ................................... 27
Figura 4: Representações de alfaces atingidas pela doença podridão-de-esclerotínia. .......... 28
Figura 5: Fluxograma representativo do método QuEChERS Original. ...................................... 30
Figura 6: Estrutura do sorvente PSA. ............................................................................................... 33
Figura 7. Fluxograma representativo do método QuEChERS Acetato. ...................................... 34
Figura 8. Fluxograma representativo do método QuEChERS Citrato. ........................................ 35
Figura 9. Gráfico mostrando o aumento de pressão e temperatura com o aumento da
porcentagem do modificador orgânico, MeOH, na FM. Adaptado da referência 12. ................. 40
Figura 10. Curvas de van Deemter obtidas para o butilparabeno utilizando sistemas para
cromatografia líquida (HPLC e UHPLC) e cromatografia com fluido supercrítico (SFC e
UHPSFC). Adaptado da referência 87. .............................................................................................. 42
Figura 11. Diagrama de aranha para classificação das FE em UHPSFC. Adaptado da
referência 12. ......................................................................................................................................... 46
Figura 12. Representação esquemática de um cromatógrafo de ultra alta eficiência com fluido
supercrítico. Adaptado de Waters Corporation. ............................................................................... 47
Figura 13. Estruturas químicas dos agrotóxicos selecionados para estudo. .............................. 60
Figura 14. Curvas usadas em eluição por gradiente ...................................................................... 62
Figura 15. Cromatogramas obtidos por UHPSFC na separação dos agrotóxicos estudados
usando eluição isocrática. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C,
FM: constituída por solvente A, como CO2, e solvente B, como metanol, na proporção de
92,5:7,5 (v/v de A:B), eluição isocrática, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1.
Detecção UV em 220 nm ..................................................................................................................... 74
Figura 16. Cromatogramas obtidos por UHPSFC na separação dos agrotóxicos estudados
usando gradiente linear, com variação de porcentagem de solvente B de 0 a 20%. Condições
cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2 como solvente A e MeOH
como solvente B, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção: 220 nm.
Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5.
Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10.
Imidacloprido. ......................................................................................................................................... 76
Figura 17. Cromatogramas obtidos com a coluna Fluorofenil para ilustrar a falta de
repetibilidade no tR e mudança no formato dos picos. Condições cromatográficas: pressão:1500
psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2:MeOH, eluição por gradiente, volume de injeção: 1,0 µL,
vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. ..................................................................................... 77
Figura 18. Equação química da reação entre os silanóis com o metanol com formação do silil
éter, e eliminação de uma molécula de água. .................................................................................. 78
Figura 19. Cromatogramas obtidos na separação dos agrotóxicos estudados usando 5 % de
água como aditivo da FM. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C,
FM: constituída de CO2 solvente A e MeOH:H2O 95:5 (v/v) solvente B, eluição por gradiente,
programação do gradiente: variação do solvente B de 0 a 20%, volume de injeção: 1,0 µL,
vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2.
Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol,
8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. ............................................................... 79
Figura 20. Comparação dos cromatogramas obtidos nas colunas Fluorofenil, 2-PIC e C18 com
e sem a adição de água ao modificador orgânico (solvente B) da FM. Condições
cromatográficas: pressão: 1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: modificador orgânico:CO2, eluição
por gradiente linear, com variação da porcentagem de modificador orgânico de 0 a 20%, volume
de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. ................................................... 82
Figura 21. Cromatogramas da mistura de agrotóxicos estudados, na concentração de 0,05 mg
mL-1, mostrando a influência do volume de injeção, usando como diluente a ACN. Coluna:
ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolylamine) 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm. Condições
cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2, solvente A e MeOH:H2O 95:5
(v/v), solvente B, eluição por gradiente, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. ............. 84
Figura 22. Cromatogramas da mistura de agrotóxicos estudados, na concentração de 0,05 mg
mL-1, mostrando a influência da variação do diluente. Condições cromatográficas: coluna:
ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolylamine) 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm, pressão:1500 psi,
temperatura: 40 °C, FM: CO2 como solvente A e MeOH:H2O 95:5 (v/v) como solvente B, eluição
por gradiente, volume de injeção: 1,5 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. .......... 86
Figura 23. Cromatogramas mostrando as mudanças na retenção e na seletividade quando se
altera o modificador orgânico utilizado na fase móvel. Diluente da amostra: ACN. A) coluna
Fluorofenil. B) coluna 2-PIC. C) coluna C18. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi,
temperatura: 40 °C, FM: CO2,solvente A e modificador orgânico:H2O (95:5 v/v), solvente B,
eluição por gradiente linear (0 a 20% de solvente B), vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220
nm. ........................................................................................................................................................... 91
Figura 24. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico lambda-cialotrina. ..................... 94
Figura 25. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico mandipropamida. ..................... 94
Figura 26. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico imidacloprido. ............................ 95
Figura 27. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico
mandipropamida. ................................................................................................................................... 96
Figura 28. Gráficos de resíduos padronizados para o analito mandipropamida: A) gráfico de
valores previstos vs resíduos padronizados e B) gráfico de experimento vs resíduos
padronizados. ......................................................................................................................................... 97
Figura 29. Superfícies de resposta para a retenção do agrotóxico mandipropamida em função
da temperatura, pressão, modificador orgânico e FE. .................................................................... 98
Figura 30. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par
atrazina e fluopicolida. .......................................................................................................................... 99
Figura 31. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par
fenarimol e azoxistrobina. .................................................................................................................. 100
Figura 32. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par
fenarimol e mandipropamida. ............................................................................................................ 100
Figura 33. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par
difenoconazol e azoxistrobina. .......................................................................................................... 101
Figura 34. Gráficos de sobreposição. Resolução simultânea para os pares fenarimol e
mandipropamida e atrazina e fluopicolida. A) Coluna Fluorofenil com variação da temperatura
de 25 para 50 °C. B) Coluna 2-PIC com variação da temperatura de 25 para 50 °C. ............. 103
Figura 35. Superfícies de desejabilidade para a região compreendida entre resolução mínima
de 2 e o maior valor de resolução observado para cada par de compostos na coluna 2-PIC. A)
25 °C. B) 50 °C. ................................................................................................................................... 104
Figura 36. Superfícies de desejabilidade para a região compreendida entre resolução mínima
de 2 e o maior valor de resolução observado para cada par de compostos na coluna Flourfenil.
A) 25 °C. B) 50 °C ............................................................................................................................... 105
Figura 37. Superfícies de resposta para a resolução dos quatro pares críticos na coluna 2-PIC,
com temperatura de 50 °C e resolução maior que 2. .................................................................... 106
Figura 38. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico
clorantraniliprol. .................................................................................................................................... 107
Figura 39. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico
Imidacloprido. ....................................................................................................................................... 107
Figura 40. Cromatograma obtido na melhor condição de separação fornecida pelo
planejamento experimental, na separação da mistura de agrotóxicos estudados, na
concentração de 0,05 mg mL-1. Condições cromatográficas: diluente da amostra: ACN, coluna:
2-PIC, pressão:1500 psi, temperatura: 50 °C, FM: CO2 como solvente A e EtOH:H2O 95:5 (v/v)
como solvente B, eluição por gradiente com variação do solvente B de 0 a 25%, volume de
injeção: 1,5 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. 1. Lambda-Cialotrina, 2.
Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol,
8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. ............................................................. 108
Figura 41. Cromatogramas obtidos na separação dos agrotóxicos estudados empregando
UHPLC e 2 tipos de colunas, fluorofenil e C18 com variação de porcentagem de etanol de 15 a
70%. Condições cromatográficas: temperatura: 40 °C, FM: água como solvente A e etanol como
solvente B, eluição por gradiente com variação da porcentagem do solvente B (etanol) de 15 a
70% de 0 a 10 minutos, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 0,3 mL min-1. Solvente de injeção:
ACN. Detecção em 220 nm. 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5.
Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10.
Imidacloprido ........................................................................................................................................ 110
Figura 42. UHPSFC-DAD. A) ____ Cromatogramas dos extratos do método de extração
QuEChERS Citrato, obtidos usando UHPSFC-DAD. ____ Cromatograma da mistura de
agrotóxicos em solvente. B) Extrato da matriz isenta de agrotóxicos (branco de referência).
Condições cromatográficas semelhantes à Figura 40. Identificação dos picos: 1. Lambda-
Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7.
Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. λ = 220 nm. (*)
Interferente. .......................................................................................................................................... 112
Figura 43. UHPLC-DAD. A) ____ Cromatogramas dos extratos do método de extração
QuEChERS Citrato, obtidos usando UHPSFC-DAD. ____ Cromatograma da mistura de
agrotóxicos em solvente. B) Extrato da matriz isenta de agrotóxicos (branco de referência).
Condições cromatográficas semelhantes à Figura 41. Identificação dos picos: 1. Lambda-
Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7.
Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. λ = 220 nm. (*)
Interferente. .......................................................................................................................................... 113
Figura 44. Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS Citrato para extração dos
agrotóxicos em cultura de alface, utilizando UHPSFC-DAD. 1. Atrazina; 2. Azoxistrobina; 3.
Difenoconazol; 4. Fluopicolida; 5. Imidacloprido; 6. Mandipropamida e 7. Tiametoxam. ........ 114
Figura 45. Efeito matriz dos analitos utilizando a UHPSFC-DAD. Curvas analíticas construídas
a partir de soluções padrão de agrotóxicos no extrato da matriz e em solvente. ..................... 116
Figura 46. Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS Citrato para extração dos
agrotóxicos em cultura de alface utilizando UHPLC-DAD. 1. Azoxistrobina; 2. Clorantraniliprol;
3. Difenoconazol; 4. Fenarimol; 5. Fluopicolida; 6. Imidacloprido; 7. Mandipropamida e 8.
Tiametoxam. ......................................................................................................................................... 116
Figura 47. Efeito matriz dos analitos utilizando UHPLC-DAD. Curvas analíticas construídas a
partir de soluções padrão de agrotóxicos no extrato da matriz e em solvente. ........................ 118
Figura 48. Cromatograma da FM usando UHPLC-DAD na avaliação da seletividade. Condições
cromatográficas idênticas a da Figura 41. ...................................................................................... 120
Figura 49. Gráfico dos resíduos estatísticos, apresentado em termos de erros relativos, para o
agrotóxico Mandipropamida. ............................................................................................................. 122
Lista de Tabelas
Tabela 1. Classificação e efeitos e/ou sintomas agudos e crônicos decorrentes da intoxicação
por agrotóxicos. ..................................................................................................................................... 20
Tabela 2. Valores nutricionais para cada 100 g da parte comestível da alface.......................... 22
Tabela 3. Agrotóxicos usados na cultura da alface e seus valores de LMR quando autorizados.
.................................................................................................................................................................. 24
Tabela 4. Produtos fitossanitários registrados no MAPA para o controle de doenças da alface
e de insetos-vetores de vírus38. ........................................................................................................... 25
Tabela 5. Agrotóxicos selecionados para o estudo em amostra de alface e seus respectivos log
P, pKa, quiralidade, grupo químico, classe agrônoma e LMR. ....................................................... 58
Tabela 6. Fatores e níveis empregados no planejamento experimental. .................................... 64
Tabela 7. Valores máximos de absorção para os agrotóxicos estudados .................................. 72
Tabela 8. Avaliação da variação do tempo de retenção após sete dias de uso da FE, com adição
de 5% de água ao metanol. ................................................................................................................. 80
Tabela 9. Volumes máximos que podem ser injetados para cada diluente avaliado. ............... 87
Tabela 10. Valores previstos para o modelo vs valores obtidos experimentalmente para dois
pontos dentro da região amarela da Figura 34-B, para a coluna 2-PIC. ................................... 102
Tabela 11. Valores de assimetria previstos para o modelo vs valores obtidos experimentalmente
para dois pontos dentro da região amarela da Figura 34-B, para a coluna 2-PIC. ................. 108
Tabela 12. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido utilizando
UHPSFC-DAD ...................................................................................................................................... 120
Tabela 13. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido utilizando
UHPLC-DAD ........................................................................................................................................ 121
Tabela 14. Equação da reta das curvas analíticas para os agrotóxicos estudados usando
UHPSFC-DAD e valores dos erros relativos (%) obtidos através dos cálculos dos resíduos
estatísticos. ........................................................................................................................................... 122
Tabela 15. Equação da reta das curvas analíticas para os agrotóxicos estudados usando
UHPLC-DAD e valores dos erros relativos (%) obtidos através dos cálculos de resíduos
estatísticos. ........................................................................................................................................... 123
Lista de Abreviaturas
ABCSEM - Associação Brasileira de Comércio de Sementes e Mudas
ABPR - regulador automático de contra pressão (Automatic Back Pressure Regulator)
ANOVA - análise da variância
Anvisa - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC - Association of Offical Analytical Chemists
A-QbD - Analytical Quality by Design
BPR - regulador de contra pressão
C18 – octadecilsilano
CEN - Comité Européen de NormalisationCO2 – Dióxido de Carbono
CV – Coeficiente de variação
DAD – detector por arranjo de diodos (Diode Array Detector)
D – Desejabilidade global
DOE - Planejamento Experimental (Design of Experiments)
DPR – Desvio padrão relativo
d-SPE - Extração em Fase Sólida Dispersiva (Dispersive Solid Phase Extraction)
ELSD - detector por espalhamento evaporativo de luz (Evaporative Light Scattering
Detector)
Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuárias
FDA - Food and Drug Administration
FE – Fase estacionária
FM - Fase móvel
GAP - Boas Práticas Agrícolas (Good Agricultural Practices)
GBC - carbono grafitizado
GC - Cromatografia Gasosa (Gas Chromatogaphy)
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid
Chromatography)
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICH - Comitê Internacional de Harmonização (International Conference on
Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)
LC - Cromatografia líquida (Liquid chromatography)
LD – Limite de detecção
LMR – Limite máximo de resíduo
LQ - Limite de Quantificação (Limit of Quantification)
LSER - relação de energia linear de solvatação (Linear solvation energy relationships)
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MQExp – Média quadrática do erro puro
MQfaj – Média quadrática da falta de ajuste
MQR – Média quadrática da regressão
MQr – Média quadrática dos resíduos
MRM - métodos multirresíduos (Multiresidue Methods)
MS - Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry)
PARA - Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos
POPs - poluentes orgânicos persistentes (Persistent Organic Pollutants)
PSA - amina primária e secundária
QbD - Quality by Design
QuEChERS - Método rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro (Quick, Easy,
Cheap, Effective and Rugged and Safe)
RLM - Regressão Linear Múltipla
SFC - Cromatografia com Fluido Supercrítico
SQ – Somas quadráticas
UHPLC - Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (Ultra High Performance Liquid
Chromatography)
UHPSFC - Cromatografia Com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (Ultra High
Performance Supercritical Fluid Chromatography)
UPC2 - Cromatografia de Convergência de Ultra Eficiência (Ultra Performance
Convergence Chromatography)
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 17
1.1 Uso, Impacto e Monitoramento de Agrotóxicos no Brasil ....................................... 18
1.2 Cultura da Alface ................................................................................................................. 21
1.3 Doenças e Pragas na Cultura de Alface e o Emprego de Agrotóxicos em seu
Controle ............................................................................................................................................. 25
1.3.1 Tombamento ................................................................................................................. 26
1.3.2 Míldio .............................................................................................................................. 26
1.3.3 Septoriose ..................................................................................................................... 27
1.3.4 Podridão-de-esclerotínia ........................................................................................... 28
1.4 Métodos Analíticos para Determinação Multirresíduo de Agrotóxicos ................ 28
1.4.1 Preparo de amostras .................................................................................................. 29
1.4.2 O método de extração QuEChERS ......................................................................... 30
1.4.3 Cromatografia como técnica analítica para determinação multirresíduo de
agrotóxicos em alimentos ......................................................................................................... 35
1.4.4 Cromatografia com fluido supercrítico de ultra alta eficiência (UHPSFC) .. 36
1.4.5 Instrumentação em UHPSFC .................................................................................... 46
1.5 Análise de agrotóxicos empregando UHPSFC ........................................................ 49
1.6 Planejamento Experimental .............................................................................................. 51
1.7 Validação de Métodos Analíticos .................................................................................... 54
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 55
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................................... 55
2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 55
3. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................................ 56
3.1 Materiais e métodos ........................................................................................................... 56
3.1.1 Reagentes e padrões analíticos .............................................................................. 56
3.1.2 Equipamentos e colunas cromatográficas ........................................................... 57
3.1.3 Amostras de alface ..................................................................................................... 57
3.2 Método .................................................................................................................................... 58
3.2.1 Seleção dos agrotóxicos a serem analisados ..................................................... 58
3.2.2 Preparo e armazenamento das soluções analíticas dos agrotóxicos .......... 61
3.2.3 Confirmação dos agrotóxicos .................................................................................. 61
3.2.4 Seleção do modo de eluição dos agrotóxicos e da fase estacionária em
UHPSFC ......................................................................................................................................... 62
3.2.5 Seleção do diluente e volume de injeção em UHPSFC ..................................... 63
3.2.6 Seleção da fase móvel em UHPSFC ....................................................................... 63
3.2.7 Planejamento experimental em UHPSFC .............................................................. 64
3.2.8 Separação dos agrotóxicos em UHPLC ................................................................ 64
3.2.9 Armazenamento das amostras de alface .............................................................. 65
3.2.10 Extração dos agrotóxicos da alface usando o método QuEChERS .............. 65
3.2.11 Quantificação e validação do método ................................................................... 66
3.2.11.1 Efeito matriz .............................................................................................................. 66
3.3 Aplicação do método desenvolvido em amostras de alface obtidas no comércio
72
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 72
4.1 Seleção do modo de eluição dos agrotóxicos e da fase estacionária em
UHPSFC ............................................................................................................................................. 73
4.2 Seleção do volume de injeção em UHPSFC e do diluente ....................................... 83
4.3 Seleção da fase móvel em UHPSFC ............................................................................... 88
4.4 Planejamento experimental em UHPSFC ...................................................................... 92
4.4.1 Resultados para a modelagem dos fatores de retenção .................................. 93
Resultados para resolução ....................................................................................................... 99
4.4.2 Assimetria ................................................................................................................... 106
4.5 Separação dos agrotóxicos usando UHPLC .............................................................. 109
4.6 Extração dos agrotóxicos da alface usando o método QuEChERS .................... 111
4.7 Efeito Matriz ........................................................................................................................ 114
4.7.1 Efeito matriz em UHPSFC-DAD .............................................................................. 114
4.7.2 Efeito matriz em UHPLC-DAD ................................................................................ 116
4.8 Quantificação e Validação dos Métodos ..................................................................... 118
4.9 Aplicação do método desenvolvido em amostras de alface ................................. 123
5. CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 124
6. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 127
17
1. INTRODUÇÃO
O cultivo de alface é bastante suscetível ao ataque direto de pragas, que
precisam ser controladas, o que exige o emprego de agrotóxicos. Agrotóxicos são
compostos usados no controle de doenças, pragas e plantas daninhas com a intenção
de reduzir perdas na plantação e aumentar a produtividade. Entretanto, se os
agrotóxicos forem aplicados de maneira exacerbada e/ou equivocada podem gerar
contaminantes ao meio ambiente e resíduos cumulativos capazes de prejudicar a saúde
do consumidor e do agricultor.1,2,3 Por isso, monitorar os resíduos de agrotóxicos em
alimentos, águas e solos é de importância fundamental para avaliar adequadamente o
impacto destes compostos sobre o ecossistema.
As diversas classes de agrotóxicos utilizadas apresentam características
variadas, como ampla faixa de polaridade, diferentes constantes de ionização e baixa
estabilidade térmica.4 Atualmente, as análises qualitativa e quantitativa de agrotóxicos
são realizadas empregando-se técnicas como Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(High Performance Liquid Chromatography, HPLC), Cromatografia Líquida de Ultra Alta
Eficiência (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) ou Cromatografia
Gasosa (Gas Chromatogaphy, GC), todas acopladas com a Espectrometria de Massas
(Mass Spectrometry, MS).5,6 Todavia, é preciso considerar que o volume de resíduos
gerado na cromatografia líquida é considerável e a cromatografia gasosa permite
analisar somente compostos voláteis e termicamente estáveis, sem que se faça a
derivatização.7,8
Diante da necessidade mundial por métodos analíticos rápidos, eficientes e
com a mínima geração de resíduos para a determinação de agrotóxicos, uma
alternativa interessante é a Cromatografia Com Fluído Supercrítico de Ultra Alta
Eficiência (Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography, UHPSFC) que
vem despertando interesse na Química Analítica, devido às suas vantagens. A
UHPSFC, também chamada de Cromatografia de Convergência de Ultra Eficiência
(Ultra Performance Convergence Chromatography, UPC2, termo patenteado pela
empresa Waters), é uma técnica recente que emprega como fase móvel (FM) um fluido
supercrítico, sendo o CO2 o mais usado devido às suas vantagens de ser um gás inerte,
não tóxico, com valores moderados de pressão e temperatura crítica (72,9 atm e 31,3
°C), o que reduz o aquecimento instrumental e permite a análise de compostos
18
termicamente instáveis, e de modificação de polaridade fácil quando combinado com
uma pequena porcentagem de solvente orgânico (tipicamente 5-25 %). Devido à
quantidade reduzida de solvente orgânico na fase móvel e ao tempo de análise curto,
esta técnica apresenta baixa geração de resíduos e está, portanto, de acordo com os
preceitos da Química Verde9. Devido à possibilidade de usar diferentes solventes
orgânicos na fase móvel, o que permite uma grande variação na seletividade, a técnica
tem demonstrado potencialidade para a análise de uma ampla variedade de
compostos.10,11,12,13
No entanto, nesta técnica existem muitas variáveis experimentais que estão
intimamente relacionadas, tais como diluente da amostra, fase estacionária,
temperatura, pressão, porcentagem e tipo de modificador orgânico, sendo que os três
últimos determinam a densidade do fluído, fator importante na retenção e,
consequentemente, na separação dos compostos. Devido às interações entre estas
variáveis é interessante o uso de métodos de planejamento e otimização experimental
para o desenvolvimento do método cromatográfico de maneira mais eficiente e robusta.
Com o emprego da Quimiometria, é possível, com um mínimo de experimentos,
construir superfícies de resposta e obter informações relevantes sobre a separação dos
agrotóxicos, com economia de tempo e de reagentes.14
1.1 Uso, Impacto e Monitoramento de Agrotóxicos no Brasil
Atualmente, a produção agrícola no Brasil está cada vez mais sujeita ao uso
de agrotóxicos e fertilizantes15 com o intuito de combater perdas e aumentar a
produção. Segundo o Decreto n° 4.074, de 4 janeiro de 2002, são considerados
agrotóxicos:
“produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento;” 16
19
O mercado de agrotóxicos no país teve um crescimento significativo17, de
modo que, atualmente, o Brasil ocupa a posição de maior consumidor mundial de
agrotóxicos.18 Esse aumento no consumo de herbicidas, inseticidas e fungicidas pode
estar relacionado a fatores como ampliação da monocultura; resistência de insetos,
fungos e ervas daninhas, o que exige o emprego de maior quantidade de agrotóxicos.19
No que diz respeito à cultura de hortaliças no Brasil, a aplicação de
fungicidas por área cultivada pode chegar entre oito e 12 vezes a quantia aplicada por
hectare nas plantações de soja, o que equivale a cerca de quatro a oito litros de
agrotóxico por hectare de hortaliça (enquanto a lavoura de soja demanda
aproximadamente 0,5 litros).20 Apesar do uso de agrotóxicos ser regulamentado e ser
vantajoso para o desenvolvimento agrícola, seu emprego de forma indiscriminada, sem
obedecer às recomendações das Boas Práticas Agrícolas (Good Agricultural Practices
– GAP), pode trazer efeitos indesejáveis, no que diz respeito à contaminação do meio
ambiente e à sua acumulação em alimentos, o que prejudica e põe em risco a saúde
humana e animal.21
Os agrotóxicos, em grande parte, são compostos químicos nocivos à saúde
humana e de outros animais, pois, devido às suas elevadas lipoficilidades, se
acumulam nos tecidos dos organismos, podendo ocasionar diversos sintomas
negativos à saúde humana, como pode ser visto na Tabela 1. Além disso, alguns deles
pertencem ao grupo de poluentes orgânicos persistentes (Persistent Organic Pollutants
– POPs) por apresentarem elevado tempo de meia vida, alta toxidade decorrente da
resistência a degradação e bioacumulação, através de alimentos contaminados.22
Devido a essas características, é importante um monitoramento completo e cuidadoso
dos resíduos de agrotóxicos em alimentos.
20
Tabela 1. Classificação e efeitos e/ou sintomas agudos e crônicos decorrentes da intoxicação por agrotóxicos.15
Classe
agronômica
Grupo químico Sintomas de
intoxicação aguda
Sintomas de
intoxicação crônica
Inseticidas
Organofosforados
e carbamatos
Fraqueza, cólicas
abdominais, vômitos,
espasmos
musculares e
convulsões
Efeitos neurotóxicos
retardados, alterações
cromossomiais e
dermatites de contato
Organoclorados
Náuseas, vômitos,
contrações
musculares
involuntárias
Lesões hepáticas,
arritmias cardíacas,
lesões renais e
neuropatias periféricas
Piretroides
sintéticos
Irritações das
conjuntivas, espirros,
excitação, convulsões
Alergias, asma
brônquica, irritações
nas mucosas,
hipersensibilidade
Fungicidas
Ditiocarbamatos
Tonteiras, vômitos,
tremores musculares,
dor de cabeça
Alergias respiratórias,
dermatites, doença de
Parkinson, cânceres
Fentalamidas - Teratogeneses
Herbicidas
Dinitroferóis e
pentaciclorofenol
Difculdade
respiratória,
hipertermia,
convulsões
Cânceres (PCP-
formação de dioxinas),
cloroacnes
Fenoxiacéticos
Perda de apetite,
enjôo, vômitos,
fasciculação
muscular
Indução da produção
de
enzimas hepáticas,
cânceres,
teratogeneses
Dipiridilos
Sangramento nasal,
fraqueza, desmaios,
conjuntivites
Lesões hepáticas,
dermatites de contato,
fibrose pulmonar
21
Com o intuito de promover e avaliar a segurança dos alimentos consumidos
pela população brasileira em relação aos resíduos de agrotóxicos, a Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (Anvisa) criou, em 2001, o Programa de Análise de Resíduos de
Agrotóxicos em Alimentos (PARA). O PARA monitora a qualidade dos alimentos
vendidos nos 27 estados brasileiros, em culturas distintas, com a intenção de verificar
se os níveis de resíduos de agrotóxicos estão dentro do limite máximo de resíduo (LMR)
estabelecido pela Anvisa, conferir se os agrotóxicos empregados nas culturas estão
registrados no país e se foram aplicados nos alimentos para os quais têm autorização;
além de avaliar o risco decorrente à exposição de resíduos de agrotóxicos em alimentos
de origem vegetal. Tais informações fornecem ao Poder Público subsídios para
executar ações regulatórias, fiscalizatórias e educativas.23
Das 12.051 amostras analisadas pelo PARA 201623, de um total de 25 tipos
diferentes de alimentos, 2.371 (19,7%) apresentaram resultados considerados
insatisfatórios por apresentarem resíduos acima do LMR permitido ou por conterem
resíduos de agrotóxicos não autorizados para a cultura. Quanto a cultura da alface, de
acordo com os resultados dos últimos anos, cerca de 40% das amostras analisadas
apresentaram irregularidades.
1.2 Cultura da Alface
As hortaliças compõem um grupo de plantas usadas para alimentação, que
se destacam pela qualidade nutritiva. Entre estas, a alface (Lactuca sativa), hortaliça
folhosa, é a mais consumida no Brasil; além de ser uma das mais cultivadas no território
nacional, devido ao seu curto ciclo de produção e rápido retorno financeiro.24,25
Na alimentação humana, a alface tem papel de destaque por ser fonte de
vitaminas (A, B1, B2, E e C), sais minerais (como cálcio e ferro)21,26, antioxidantes27 e
por possuir reduzido valor calórico, como pode ser observado na Tabela 2. Atualmente,
a alface crespa é a mais consumida no país, representando cerca de 70% do
mercado25, porém outros tipos da hortaliça, como americana, lisa, mimosa, romana,
roxa e vermelha, são cultivados no Brasil e no mundo28 com o intuito de atender todos
os paladares e satisfazer as condições climáticas vigentes.
22
Tabela 2. Valores nutricionais para cada 100 g da parte comestível da alface.29
Componente Quantidade
Água (%) 96,00
Energia (kcal) 15,00
Proteína (g) 1,36
Lipídios totais (g) 0,15
Carboidratos (g) 2,79
Fibra alimentar total (g) 1,30
Açúcar total (g) 0,79
Cálcio (mg) 36,00
Magnésio (mg) 13,00
Manganês (mg) 0,25
Fósforo (mg) 29,00
Ferro (mg) 0,86
Sódio (mg) 28,00
Potássio (mg) 194,00
Cobre (mg) 0,03
Zinco (mg) 0,18
Selênio (mcg) 0,6
Vitamina A (mcg) 370,25
Vitamina B1 (mg) 0,07
Vitamina B2 (mg) 0,08
Vitamina E (mg) 0,31
Vitamina C (mg) 18,00
Segundo o Manual de Boas Práticas Agrícolas na Produção de Alface25 a
cultura desta folhosa se limitava, até o final da década de 70, às regiões de clima
temperado, todavia o desenvolvimento de espécies resistentes ao calor, à alguns vírus
e ao apodrecimento e florescimento precoce30, propiciou o cultivo da alface por todo o
território nacional. Apesar das melhorias genéticas, o tempo de vida pós-colheita da
alface é relativamente curto, de modo que as regiões produtoras estão situadas
próximas ao perímetro urbano ou nos cinturões verdes de grandes cidades.31
23
Os estabelecimentos agropecuários produziram juntos, em 2011, cerca de
1,276 milhões de tonelada de alface31 e, nos últimos anos, a produção ultrapassou 1,5
milhões de toneladas, sendo responsável pela movimentação de 8 bilhões de reais no
varejo.32 As regiões Sudeste e Sul são as maiores produtoras de hortaliças. O estado
de São Paulo se sobressai como maior mercado produtor e consumidor de olerícolas
do Brasil, sendo capaz de produzir cerca de 207.060 toneladas da alface. O cinturão
verde do estado de São Paulo, que compreende as regiões da Grande São Paulo, Mogi
das Cruzes, Sorocaba e Campinas, cultivam verduras e legumes o ano todo e a alface
se destaca como a folhosa de maior área plantada (10.508 hectares).31
Como a alface é uma espécie sensível, bastante suscetível ao ataque de
pragas e doenças26 e possui um tempo de vida curto após a colheita, são aplicados
agrotóxicos, algumas vezes em quantidades acima do recomendado, com o propósito
de manter a boa aparência da folha, de maneira a garantir o valor comercial da hortaliça
e de inibir os danos ocasionados por insetos e/ou micro-organismos patogênicos.33
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)34, 70% dos
produtores empregam agrotóxicos de origem química ou orgânica no plantio da alface.
De acordo com o levantamento de dados socioeconômicos da cadeia
produtiva de hortaliças no Brasil, referente ao ano de 2012, publicado pela Associação
Brasileira de Comércio de Sementes e Mudas (ABCSEM)32, a produção da alface
movimentou cerca de 57,4 milhões de reais em agrotóxicos. Embora o uso de
agrotóxicos seja considerado importante no modelo de desenvolvimento da agricultura
nacional35 por demonstrar vantagens em relação ao aumento da produtividade e
combate às doenças e pragas, a aplicação destes, de maneira desmedida e
indiscriminada, põe em risco a saúde do trabalhador rural, do consumidor e do meio
ambiente.
Segundo dados do monitoramento de resíduos realizado pelo Programa de
Análise de Resíduos de Agrotóxicos (PARA)36, referente a 2012, das 240 amostras de
alface recolhidas em diferentes estados e analisadas, 45% apresentaram
irregularidades, sendo que 93 amostras continham princípios ativos não autorizado, 2
amostras com quantidade de agrotóxicos acima do limite máximo de resíduos permitido
(LMR – quantidade máxima de resíduo de agrotóxico aceita no alimento em mg kg-1) e
12 com agrotóxicos não autorizados e acima do LMR. O PARA23, relativo ao período
de 2013 a 2015, analisou 448 amostras e constatou que 42% delas apresentaram
24
irregularidades nos resultados (153 amostras tinham agrotóxicos não autorizados para
a cultura de alface e 37 possuíam agrotóxicos em quantidades acima do LMR). Na
Tabela 3 podem ser vistos os agrotóxicos encontrados na cultura da alface e seus
respectivos valores de LMR, quando autorizados, de acordo com o relatório PARA
publicado em 2016.
Tabela 3. Agrotóxicos usados na cultura da alface e seus valores de LMR quando autorizados.23
Agrotóxico LMR (mg/kg)
Azoxistrobina 1,00
Clorotalonil 6,00
Clotianidina 0,100
Difenoconazol 0,500
Fenamidona 2,00
Imidacloprido 0,50
Indoxacarbe 0,02
Iprodiona 1,00
Lambda-cialotrina 1,00
Malationa 8,00
Procimidona 5,00
Tiametoxam 1,00
Abamectina, Acefato, Acetamiprido, Atrazina, Boscalida,
Buprofenzina, Carbendazim, Carbofurano, Ciromazina,
Clorfenapir, Clorpirifos, Cresoxim-metilico, Deltametrina,
Dimetoato, Ditiocarbamato (CS2), Espinosade, Espiromesifeno,
Etofenproxi, Fenarimol, Linurom, Metalaxil-m, Metamidofós,
Metconazol, Metomil, Pendimetalina, Piraclostrobina, Pirifenoxi,
Piriproxifem, Tebuconazol, Trifloxistrobina
NA
NA – não autorizado
Como muitos agrotóxicos são considerados potencialmente tóxicos para os
seres humanos e, por possuírem alta lipofilicidade, podem se acumular nos tecidos dos
organismos vivos37, torna-se necessário o desenvolvimento de métodos analíticos
multirresíduos (Multiresidue Methods – MRM) rápidos, eficientes, com a mínima
geração de resíduos9 e com baixos limites de quantificação para avaliar e quantificar
25
resíduos de agrotóxicos em alface, de modo a promover a segurança alimentar da
população.
1.3 Doenças e Pragas na Cultura de Alface e o Emprego de Agrotóxicos em seu
Controle
Segundo a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), já
foram relatadas no mundo mais de 75 doenças causadas por parasitas, como bactérias,
fungos, nematoides e vírus, que afetam a cultura da alface. Para evitar os prejuízos
causados por esses micro-organismos e insetos, garantir boa formação das plantas e
manter a boa aparência das folhas o produtor aplica agrotóxicos. A seguir serão
descritas as principais doenças da alface controladas por agrotóxicos.
A Tabela 4 apresenta os agrotóxicos registrados no Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA) e autorizados para serem aplicados no controle de
doenças na cultura da alface e de insetos-vetores de vírus.38
Tabela 4. Produtos fitossanitários registrados no MAPA para o controle de doenças da alface e de insetos-vetores de vírus38.
Doença Patógeno Princípios Ativos
Tombamento Rhizoctonia solani Pencicurom
Míldio Bremia lactucae Fenamidona e Mandipropamida
Septoriose Septoria lactucae Azoxistrobina e Difenoconazol
Podridão-de-
esclerotínia
Sclerotinia
sclerotiorum
Procimidona e Iprodiona
Insetos-vetores Nome Científico Princípios Ativos
Pulgão-verde Myzus persicae Imidacloprido, Tiacloprido,
Clotianidina, Tiametoxam e
Azadiractina
Tripes Frankliniella schulzei Imidacloprido
Lagarta-rosca Agrotis ipsilon Beta-ciflutrina
Mosca-branca Bemisia tabaci raça B Imidacloprido
Pulgão-da-alface Dactynotus sonchi Imidacloprido
Tripes do fumo Thrips tabaci Imidacloprido e Tiacloprido
26
1.3.1 Tombamento
O tombamento é uma doença causada por fungos e é altamente dependente
do excesso de umidade no solo. No campo, a incidência dessa doença está associada
aos solos encharcados e/ou mal preparados. Seu principal sintoma é a destruição dos
tecidos jovens, causando apodrecimento antes ou após a emergência da alface, o que
afeta a produção de mudas e provoca perdas em grandes escalas quando a doença
não é controlada. Já em culturas hidropônicas o aparecimento desta doença é raro.38
Pode-se observar na Figura 1 o aspecto da alface quando atingida pelo
tombamento.
Figura 1: Representações das mudas de alfaces atingidas pela doença tombamento.38
1.3.2 Míldio
Esta é uma das principais doenças que atinge a alface cultivada tanto no
solo quanto em hidroponia, em todos os estágios de desenvolvimento e está associada
à alta umidade e à baixa temperatura. O míldio é causado por fungos e ocasiona
manchas amareladas ou verde-claras nas folhas da planta, todavia, o ataque severo à
invasão sistêmica do fungo causa escurecimento do tecido interno do caule.38
O aspecto da alface quando acometida pelo míldio pode ser observado na
Figura 2.
27
Figura 2: Representações de folhas de alfaces atingidas pela doença míldio.39
1.3.3 Septoriose
A septoriose é uma doença ocasionada por fungos e é relevante em cultivos
irrigados por aspersão e em períodos chuvosos, porém, em localidades cujas
temperaturas são elevadas, o aparecimento da doença é raro. Essa doença acomete a
parte aérea da alface e os sintomas são observados primeiramente em folhas mais
velhas. Existe, também, a formação de lesões marrom-claras com bordas pouco
definidas que podem se expandir formando lesões maiores.38
Na Figura 3 é possível visualizar a aparência da alface atingida pela
septoriose.
Figura 3: Representações de alfaces atingidas pela doença septoriose.38
28
1.3.4 Podridão-de-esclerotínia
A podridão-de-esclerotínia, doença causada por fungos, é bastante comum
em ambientes frios e úmidos. Os sintomas da doença surgem nas plantas próxima da
colheita, em que as folhas mais velhas que estão em contato com o solo murcham e
apodrecem. A doença evolui para as folhas internas da alface promovendo a murcha
de toda a planta que, antes de apodrecer completamente, pode se tornar amarelada.38
Pode-se observar, na Figura 4, o aspecto da alface quando atingida pela
podridão-de-esclerotínia.
Figura 4: Representações de alfaces atingidas pela doença podridão-de-esclerotínia.38
1.4 Métodos Analíticos para Determinação Multirresíduo de Agrotóxicos
Um método analítico para separação, identificação e quantificação de
multirresíduos deve ser capaz de analisar, concomitantemente, ingredientes ativos
distintos em uma mesma amostra, de forma rápida, eficiente, seletiva, de fácil
execução, além de demandar pequenas quantidades de amostra e solventes, de modo
a reduzir tempo, custo e impacto ambiental decorrente do seu emprego. 23, 40
Usualmente, o desenvolvimento de metodologias de análise multirresíduos
de agrotóxicos contempla etapas de preparo de amostra, que são realizadas para
extrair os analitos de matrizes complexas, eliminar os interferentes e concentrar ou diluir
29
os analitos, quando necessário, de determinação qualitativa e quantitativa empregando
uma técnica instrumental de análise e de validação41.
1.4.1 Preparo de amostras
Com o propósito de aumentar a seletividade e a detectabilidade de
agrotóxicos presentes nas amostras em nível de traços são realizados alguns
tratamentos antes da análise instrumental.
Por volta da década de 1960, foi desenvolvida a primeira técnica de preparo
de amostra para extração multirresíduo de agrotóxicos apolares de alimentos
gordurosos42. Porém, com o surgimento e emprego de agrotóxicos polares esta
precisou ser substituída por outras que englobassem compostos de diferentes
polaridades. Apesar da grande contribuição para o ramo da ciência de separações,
essas técnicas de extração, que envolvem os métodos de Mills e Luke, por exemplo,
requerem grande quantidade de amostra e solvente.
Com a propagação da Química Verde no início dos anos de 1990, houve a
introdução de valores e conceitos que buscavam desenvolver processos industriais e
atividades científicas de modo sustentável e ambientalmente correto.43 Diante disso,
nos últimos anos, desenvolveram-se métodos alternativos para o preparo de amostra
que se baseiam em técnicas que reduzem o emprego de solventes orgânicos usados
na etapa de extração dos agrotóxicos.
De acordo com dados da literatura, os métodos mais aplicados para extração
de agrotóxicos em água, frutas e verduras são o método QuEChERS (do inglês Quick,
Easy, Cheap, Effective and Rugged and Safe)44,45,46, extração líquido-líquido47,
extração em fase sólida48, microextração em fase sólida48,49 , dispersão da matriz em
fase sólida, extração em fase sólida dispersiva50 e extração por micro-ondas51.
Neste trabalho, o método QuEChERS foi usado para extração dos resíduos
de agrotóxicos da alface e para remoção dos interferentes, por ser rápido, robusto e
garantir recuperações satisfatórias para os analitos estudados.
30
1.4.2 O método de extração QuEChERS
O método QuEChERS para extração multirresíduo de agrotóxicos foi
proposto em 2003 por Anastassiades et al.52. Este método, como mostrado na Figura
5, se baseia na extração, em uma única fase, com acetonitrila, seguido de partição
líquido-líquido ocasionada pela adição de sulfato de magnésio (MgSO4) anidro e cloreto
de sódio (NaCl) e posterior etapa de limpeza e remoção de água usando extração em
fase sólida dispersiva (d-SPE), na qual se emprega uma mistura de MgSO4 e amina
primária e secundária (PSA) para remover os componentes polares da matriz.
Figura 5: Fluxograma representativo do método QuEChERS Original.53
Atualmente, o método QuEChERS tem sido usado por órgãos oficiais como
Anvisa23, Association of Official Analytical Chemists54 e o European Committee for
Standardization55, para extração dos resíduos de agrotóxicos das matrizes alimentícias,
por apresentar diversas vantagens. Entre os pontos positivos, pode-se destacar a
extração de agrotóxicos em ampla faixa de polaridade, obtenção de maiores
porcentagens de recuperação para agrotóxicos de polaridade e volatilidade distintas
31
em matrizes de diversas naturezas, geração de poucos resíduos devido ao baixo
consumo de solventes orgânicos e emprego de equipamentos simples, de baixo custo
e de fácil operação, como balança analítica, vórtex e centrifuga.52
Geralmente, a versão original do método QuEChERS fornece resultados
satisfatórios para diferentes tipos de amostras, contudo, dependendo do pH da matriz,
alguns compostos apresentam problemas de estabilidade e/ou recuperação. Diante
disso, podem ser propostas modificações em variáveis como massa da amostra,
solvente extrator (acetato de etila, acetona, acetonitrila), tipos e quantidades de sais
empregados na etapa de partição (MgSO4 e NaCl, tampão acetato, citrato), modo e
velocidade de agitação, ajuste do pH da amostra e composição do sorvente usado na
etapa de limpeza, de modo a otimizar o preparo de amostra e remover a maior quantia
de interferentes da matriz estudada.21,56
1.1.1.1 Etapa de extração: seleção do solvente
A escolha do solvente de extração é de fundamental importância no
desenvolvimento de métodos de extração multirressíduo.53 O solvente selecionado
deve ser compatível com a técnica cromatográfica que será utilizada, ser capaz de
extrair analitos com ampla faixa de polaridade, ser seletivo, seguro e,
preferencialmente, ter baixo custo. Para a extração de agrotóxicos empregando o
método QuEChERS, acetonitrila, acetona e acetato de etila são os solventes mais
usados.21, 40
O acetato de etila é um solvente parcialmente miscível com a água que
apresenta a vantagem de extrair agrotóxicos de várias classes, em diversos tipos de
amostras, no entanto, analitos de caráter básico (pKa ˃ 4) podem sofrer degradação e
apresentar baixa recuperação57. Acetona e acetonitrila são miscíveis em água e
propiciam a extração dos agrotóxicos em uma única fase, porém quando se emprega
acetona na etapa de extração torna-se necessário a adição de solventes apolares para
separar a fase orgânica da fase aquosa e quando se usa acetonitrila, a adição de sais
ao extrato é suficientemente capaz de causar a separação das fases. Apesar da
considerável toxidade da acetonitrila, a utilização desta como solvente extrator no
método QuEChERS permite a extração de baixas quantidades de coextrativos
32
lipofílicos da amostra, como gorduras e ceras, além de possibilitar a obtenção de altas
porcentagens de recuperação de agrotóxicos de polaridades distintas e ser compatível
com a cromatografia líquida.58
1.1.1.2 Etapa de partição: adição dos sais
Na etapa de partição do método QuEChERS, a adição de sais, como NaCl,
tem sido usada para promover o efeito salting-out53 que diminui a solubilidade dos
analitos na fase aquosa e, consequentemente, aumenta a distribuição dos mesmos na
fase orgânica. Além disso, a adição de sais secantes reduz a quantidade de água na
fase orgânica e melhora a recuperação dos agrotóxicos.59
Andersson e Pâlsheden60 descreveram o emprego de sulfato de sódio
(Na2SO4) para aumentar a recuperação de agrotóxicos polares, todavia a maior parte
dos trabalhos encontrados na literatura usa sulfato de magnésio (MgSO4), devido a sua
capacidade de remoção de água ser superior à de outros sais, uma vez que sua
hidratação é exotérmica e causa aquecimento da amostra entre 40 e 45 °C, o que
favorece a extração dos compostos, principalmente daqueles de menor polaridade.59
1.1.1.3 Etapa de limpeza da amostra
O método QuEChERS emprega a Extração em Fase Sólida Dispersiva (d-
SPE) para obtenção de extratos mais limpos para análise multirresíduo de
agrotóxicos.61 Esta etapa consiste na agitação vigorosa do extrato com o sorvente. O
sorvente serve como filtro químico para retenção dos coextrativos da matriz, como
pigmentos e gorduras, por exemplo, e a agitação auxilia na completa interação do
sorvente com a matriz, de modo a tornar o processo de limpeza eficiente.
Dependendo do tipo de matriz analisada, diversas combinações de
sorventes podem ser usadas, sendo que os principais sorventes utilizados são amina
primária secundária (PSA), octadecilsilano (C18) e carbono grafitizado (GBC). Nesta
etapa de clean-up, também se adiciona MgSO4 juntamente com o sorvente com o intuito
33
de remover a água residual e facilitar a precipitação de coextrativos polares, resultando
em um extrato final de menor polaridade.52, 53
O PSA é um sorvente trocador aniônico com elevado efeito quelante que,
conforme a Figura 6, apresenta uma estrutura bidentada devido aos grupos
etilenodiamina-N-propil ligados à sílica. Graças ao efeito quelante e a capacidade de
realizar ligações de hidrogênio ou dipolo-dipolo, o PSA pode interagir com os
componentes da matriz e remover, eficazmente, vários coextrativos, como açúcares e
ácidos graxos livres. Por outro lado, o PSA não é eficiente para remoção de gorduras.53,
61 Visando uma limpeza mais eficiente do extrato final, C18 e GCB têm sido usados
associados ao PSA.
Figura 6: Estrutura do sorvente PSA.
Matrizes que contêm mais que 2% de gordura em sua composição são
limpas de forma mais efetiva com a adição de C18.62 Esse sorvente de fase reversa
com base de sílica interage bem com lipídios ou outras substâncias apolares.
Para matrizes que contêm elevada quantidade de pigmentos, como
carotenoides e clorofila, o uso de GCB permite a remoção satisfatória destes compostos
do extrato final, devido à sua grande área superficial e à presença de grupos altamente
polares em sua superfície, que possuem potencial para formação de ligação de
hidrogênio. Apesar de auxiliar positivamente na etapa de clean up, devido às
características do carbono grafitizado, este pode interferir na recuperação de analitos
planares que apresentem grupos ativos em sua estrutura.63, 64
34
1.1.1.4 Modificações no método QuEChERS: efeito do tamponamento
Como o pH de extração também influencia diretamente na porcentagem de
recuperação dos agrotóxicos e na sua capacidade de degradação, o uso de tampões
salinos pode tornar o processo de extração mais eficiente. Com o intuito de garantir boa
recuperação e estabilidade para os agrotóxicos de caráter ácido e/ou básico se
recomenda um pH de extração na faixa de 4 a 5. Frente a isso, Lehotay et al.65 e
Anastassiades et al.66 propuseram modificações no método QuEChERS Original
(Figura 7 e Figura 8) e avaliaram o efeito do tamponamento das amostras durante a
etapa de extração.
O método QuEChERS Acetato foi desenvolvido por Lehotay e
colaboradores65. Este promove o tamponamento do extrato em pH 4,8 e se tornou o
método oficial da AOAC (Association of Offical Analytical Chemists) para a
determinação de agrotóxicos em alimentos em 2007.54 Já o método QuEChERS Citrato
foi proposto por Anastassiades e colaboradores66 e ajusta o pH da amostra em 5,0 e
se tornou o método oficial da comunidade europeia em 2008, pelo Comité Européen de
Normalisation (CEN).55
Figura 7. Fluxograma representativo do método QuEChERS Acetato.
35
Figura 8. Fluxograma representativo do método QuEChERS Citrato.
1.4.3 Cromatografia como técnica analítica para determinação multirresíduo de
agrotóxicos em alimentos
A cromatografia é uma técnica de separação baseado na migração
diferencial dos analitos na fase móvel e na fase estacionária. Ela é amplamente usada
em diversas áreas para identificação e quantificação dos componentes de uma
mistura.67 Para determinação de multirresíduos de agrotóxicos, a Cromatografia
Gasosa (GC) acoplada a diversos detectores foi bastante utilizada, todavia, com o
surgimento e uso de agrotóxicos polares e instáveis termicamente, o uso da
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) ganhou destaque.
Atualmente, a Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) tem
sido empregada para determinação de resíduos de agrotóxicos em alimentos por
apresentar vantagens em relação à HPLC. Devido a introdução de partículas de FE
com tamanho inferior a 2 µm, redução do diâmetro interno e comprimento da coluna e
emprego de um sistema robusto de bombeamento capaz de suportar pressões de até
36
15000 psi, houve redução significativa no tempo de análise, graças à maior velocidade
linear de fase móvel que pode ser alcançada, maior resolução, eficiência e
detectabilidade dos analitos, decorrentes da formação de picos mais estreitos e
simétricos e menor consumo de solventes se comparada à HPLC.8, 68
Apesar da técnica de UHPLC representar o estado da arte em termos de
cromatografia líquida, ser muito robusta e apresentar vários pontos positivos, no campo
da ciência de separações, sempre há a necessidade de desenvolvimentos de métodos
analíticos rápidos, eficientes e com a mínima geração de resíduos. Frente a isso, a
Cromatografia Com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC) vem
despertando interesse na Química Analítica pelas vantagens que apresenta.
1.4.4 Cromatografia com fluido supercrítico de ultra alta eficiência (UHPSFC)
1.4.4.1 Evolução da técnica de UHPSFC
O fluido supercrítico é o estado que ocorre quando qualquer substância que
teve sua pressão e temperatura elevadas acima do ponto crítico passa a ter
propriedades intermediárias entre um gás e um líquido. Na condição crítica, a interface
gás-líquido deixa de existir e as propriedades do gás e do líquido convergem para o
mesmo ponto, de modo que o fluido supercrítico passa a ter densidade e poder de
solvatação semelhantes ao de um líquido e viscosidade e difusividade de um gás.13, 69,
70
Devido ao fato de o fluido supercrítico ter propriedades intermediárias a de
um gás e de um líquido, ele propicia boa solubilidade e bom transporte dos analitos13,
o que cromatograficamente, o caracteriza como uma fase móvel (FM) com potencial
para fornecer o melhor da Cromatografia Líquida e da Cromatografia Gasosa. Ao utilizar
a Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC), a geração
de resíduos é minimizada, pois a quantidade de solventes orgânicos utilizada é muito
pequena uma vez que se emprega CO2 como maior constituinte da FM, sendo possível
analisar compostos de ampla faixa de polaridade, sejam eles estáveis ou instáveis
termicamente sem a necessidade de derivação, como em GC.
37
A elevada capacidade de solvatação dos fluidos supercríticos foi descoberta
a partir de um estudo sobre a solubilidade de cloretos metálicos em etanol no estado
supercrítico, por Hannay e Hogarth, em 1879.71 Em 1962 Klesper, Corwin e Turner
demonstraram o uso de fluido supercrítico como FM para separar uma mistura de
porfirinas.72 Sie e Rijnders, em 1967, realizaram um estudo para avaliar parâmetros
como o efeito da pressão no coeficiente de partição e a permeabilidade e eficiência de
colunas, em sistemas cromatográficos usando fluido supercrítico como FM.73, 74, 75
Com a introdução das colunas capilares em 1981 por Novotny e
colaboradores76, 77 houve um incremento nas vendas de equipamentos de SFC que
eram semelhantes aos cromatógrafos a gás. A principal vantagem do uso de colunas
capilares era a possibilidade de fazer um gradiente de pressão, porém, nesse sistema,
não era possível alterar a pressão sem modificar a vazão da FM, o que poderia
ocasionar deformações nos picos. Como esses sistemas não eram muito robustos e se
limitavam ao uso de CO2 puro, que permitia basicamente a análise de compostos
lipofílicos, entre as décadas de 1980 e 1990 houve diminuição drástica no uso da
técnica13, que só sobreviveu a esse declínio devido à eficiência na separação de
enantiômeros, com alta resolução e rapidez, quando comparada à HPLC.12
Gere et al.78, em 1982, contribuíram imensamente para o ressurgimento da
SFC, pois, ao modificarem um equipamento de HPLC em laboratório, adicionando um
regulador de contra-pressão e usando colunas recheadas, tornaram possível o controle
individual da pressão e da vazão da FM, de modo a obter um gradiente de pressão,
sem alteração da vazão da FM, permitindo o emprego de modificadores orgânicos e
aditivos na FM, o que propiciou a análise de compostos com ampla faixa de polaridade.
Trabalhos como este e os de Cui e Olesik79, que estudaram os efeitos da mistura CO2,
metanol e água como FM, e de Lee e Olesik80, que avaliaram o uso de n-hexano e CO2,
em 1995, auxiliaram a impulsionar a técnica e conduzir o desenvolvimento de novos
equipamentos.
Atualmente, a Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência
(UHPSFC) e o cromatógrafo Waters ACQUITY UPC2 (Ultra Performance Convergence
Chromatography) representam o estado da arte em termos de técnica e equipamento,
respectivamente. O UPC2 foi inserido comercialmente em 2012 pela Waters
Corporation juntamente com fases estacionárias (FE) com partículas de diâmetro sub-
2 µm que, associadas ao uso de modificadores orgânicos e de aditivos, permitem a
38
separação de uma vasta gama de compostos, de forma rápida e eficiente. Além disso,
este equipamento garante repetibilidade das análises por meio do resfriamento da
cabeça das bombas de CO2 – que aumenta a eficácia de compressão da FM,
removendo o calor produzido, e do controle efetivo da pressão de retorno do sistema,
com um novo regulador de contra pressão (BPR), que mantém a pressão constante
mesmo usando gradiente.13, 69
1.4.4.2 Fatores que influenciam a análise empregando UHPSFC
Fase móvel e modificadores
Atualmente, o CO2 é a FM mais empregada em UHPSFC por ser inerte, não
tóxico, ter ponto crítico em 74 bar e 31 °C, o que permite obter o fluido com um
aquecimento instrumental mínimo, evitando o desgaste do sistema e a degradação de
compostos instáveis termicamente, ser miscível com muitos solventes orgânicos e ter
baixa absorção no UV.
Quando o CO2 é usado puro, como FM, a densidade do fluido é o principal
fator que afeta a solubilidade do analito81 e, consequentemente, sua separação na
coluna cromatográfica. Modificações na temperatura e pressão com o intuito de
aumentar a densidade da FM permitem maior contato entre as moléculas, o que
favorece a solubilidade e diminui o tempo de retenção dos compostos. Mantendo a
temperatura constante, o aumento da pressão aumenta a densidade, e em pressões
menores que 150 bar (ou 2175 psi) a diminuição da temperatura também aumenta a
densidade. Em valores de densidade entre 0,2 e 0,5 g mL-1, que caracterizam uma
proximidade com o estado gasoso, diminuir a temperatura reduz o tempo de retenção.
Já em valores de densidade entre 0,6 e 0,9 g mL-1, ao abaixar a temperatura tem-se
um aumento na retenção, porque com esses valores de densidade a FM se comporta
como líquido e, portanto, a solubilidade dos compostos tende a diminuir com a
diminuição da temperatura.
Considerando que o uso de CO2 puro na FM permite apenas a separação
de analitos apolares, boa parte das análises é realizada utilizando um modificador
orgânico ou cossolvente, que além permitir a eluição de compostos polares também
39
ajuda a melhorar a solubilidade dos analitos, evitando a precipitação dos mesmos na
coluna. Estes modificadores alteram a densidade e a polaridade da FM, gerando picos
com melhor formato e reduzindo interações indesejadas entre os analitos e os grupos
silanóis residuais da FE.12 Metanol (MeOH), etanol (EtOH), isopropanol (IPA),
acetonitrila (ACN) e tetraidrofurano (THF) são os modificadores de alta a média força
de eluição mais empregados em UHPSFC. No entanto, é preferível, quando possível,
que etanol seja escolhido como modificador, uma vez que este é considerado um
solvente que pode ser obtido de fontes renováveis e é menos tóxico para o analista
quando comparado aos demais.69, 82
Com a adição de um modificador à FM, o tempo de retenção e a separação
de um composto não são afetados apenas pela densidade, é necessário considerar
também as interações dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio causadas pelo
cossolvente.83 Empregar modificador orgânico, mesmo em quantidade pequena, afeta
de forma significativa a retenção dos compostos, sendo que quanto menor a quantidade
de cossolvente na FM, maior é a retenção, visto que a energia de adsorção do soluto
nos silanóis livres recobertos por CO2 é maior do que nos silanóis recobertos pelo
modificador.69, 84
Estado subcrítico
O aumento da porcentagem de modificador na fase móvel causa um
aumento na geração de resíduos e também altera os valores críticos de temperatura e
pressão necessários para atingir o estado supercrítico, aumentando a probabilidade de
ocorrer separação de fases se o ponto crítico não for alcançado.85, 86 Isso pode ser
confirmado pelos diagramas de fase, mostrado na Figura 9, onde o aumento da quantia
de modificador na FM eleva a pressão e temperatura críticas. Todavia, apesar de o
equipamento suportar pressões de até 413,7 bar (6000 psi), as fases estacionárias
podem ser danificadas em temperaturas acima de 60 °C (fases estacionárias em que
grupos polares ou apolares estão quimicamente ligados à sílica pura, através dos
grupos silanóis, sofrem rápida degradação em temperaturas elevadas), assim, a maior
parte das separações acontece no modo subcrítico.12, 13
40
Figura 9. Gráfico mostrando o aumento de pressão e temperatura com o aumento da porcentagem do modificador orgânico, MeOH, na FM. Adaptado da referência 12.12
No estado subcrítico, quando se trabalha em temperatura abaixo do valor
crítico e pressão acima deste valor nunca se observou separação de fases83 e, com a
vantagem de se evitar os inconvenientes dos fluidos compressíveis, como variações de
densidade.12 Por isso, alguns autores acreditam que pressão e temperatura não devem
ser empregados como parâmetros para modificar a retenção, o que acarretaria na
simplificação no desenvolvimento de um método.12 No entanto, esses fatores e outros,
como diluente da amostra, volume de injeção, FE, vazão, aditivos e modificadores
orgânicos, afetam a separação e devem ser considerados, uma vez que o efeito
conjunto deles é complexo e não está bem elucidado. Uma forma de otimizar o
desenvolvimento do método é usar técnicas quimiométricas de planejamento
experimental.
Na condição subcrítica, o fluido tem densidade maior que 1 g mL-1 e
propriedades próximas das de um líquido em termos de força de eluição e de coeficiente
de difusão.83 No entanto, mesmo com esse comportamento, os princípios da CL não
podem ser usados para a compreensão dos fenômenos que ocorrem em UHPSFC,
devido aos mecanismos distintos de retenção nas duas técnicas. Além disto, os
mecanismos envolvidos nas separações quando o fluído está no estado subcrítico
ainda não estão bem compreendidos.
41
Embora não se conheça muito profundamente sobre o mecanismo de
separação e retenção, sabe-se que as separações usando o estado subcrítico são
muito mais eficientes que as no estado líquido. Isso pode ser justificado pela equação
de van Deemter (Equação 1):
H = A + (B/u) + (C.u) (1)
na qual o termo A se refere ao alargamento dos picos devido aos diferentes caminhos
seguidos pelas moléculas do analito. Este pode ser minimizado com o uso de colunas
de tamanho reduzido, com diâmetros internos menores, com enchimentos eficientes e
partículas pequenas e uniformes. O termo B está relacionado à difusão longitudinal do
soluto na FM e este, pode ser minimizado com o emprego de altas velocidades lineares
da FM. O termo C descreve a transferência de massa do analito entre a FM e a FE e
pode ser reduzido com o uso de vazões menores da FM.67
Como a elevada densidade do fluido subcrítico é responsável pela redução
da difusibilidade dos analitos na FM o que, consequentemente, favorece maior
interação molecular, e a baixa viscosidade do fluido propicia um aumento da velocidade
linear da FM, verifica-se, através da equação de van Deemter, uma redução nos valores
dos termos B e C que resulta em eficiências mais elevadas e análises mais rápidas.
Como dito anteriormente, em termos de eficiência, a cromatografia com
fluido supercrítico (SFC) se sobressai à cromatografia líquida (HPLC). Isto pode estar
relacionado ao tamanho das partículas usadas na FE e com as diferentes propriedades
entre o estado líquido e o estado supercrítico/subcrítico e podem ser confirmadas na
Figura 10. Examinando a mesma, percebe-se que a HPLC apresenta um desempenho
muito inferior às demais, devido à baixa velocidade linear ideal e alto valor de prato;
enquanto a SFC se mostrou mais vantajosa que esta. A superioridade de SFC sobre
HPLC se dá devido à redução significativa da densidade do fluido em comparação com
a FM líquida, que melhora os coeficientes de difusão, levando a um aumento da
velocidade linear. Confrontado as curvas de van Deemter para HPLC e UHPLC, é nítida
a redução da altura do prato e aumento da velocidade linear por causa da diminuição
do tamanho da partícula da FE. Avaliando a curva relativa ao UHPSFC nota-se que
esta apresenta a maior velocidade linear ótima e um dos menores valores de prato; isso
resulta da combinação das vantagens das técnicas de SFC e UHPLC, que são o uso
42
de fluido supercrítico/subcrítico e de FE com partículas de tamanho reduzido (sub-2
µm).
Figura 10. Curvas de van Deemter obtidas para o butilparabeno utilizando sistemas para cromatografia líquida (HPLC e UHPLC) e cromatografia com fluido supercrítico (SFC e UHPSFC). Adaptado da referência 87.87
Aditivos
Quando a adição de um modificador orgânico na FM não é suficiente para
garantir a eluição com bom formato de pico é necessário adicionar um aditivo. Estes,
geralmente, são adicionados em menores quantidades, diretamente no modificador
orgânico e são bombeados juntos como uma fase única capaz de revestir a FE, devido
a sua forte adsorção a esta, e atuar como parte dela.88
De acordo com Berger e Deye89 os aditivos apresentam pelo menos cinco
funções na cromatografia com fluido supercrítico: 1) cobrir os sítios ativos (silanóis
residuais) do suporte sólido, 2) mudar a polaridade da FM, 3) suprimir a ionização do
analito, 4) aumentar a formação do par iônico com o analito e 5) aumentar o poder de
solvatação da FM.
43
Os aditivos possuem caráter polar e os mais comuns incluem ácidos, bases
e compostos iônicos90, 91, que são adicionados à FM para melhorar o formato dos picos
e a seletividade de compostos ácidos, básicos e iônicos, respectivamente. Assim, a
eluição de ácidos orgânicos pode ser melhorada com adição de ácido fórmico, ácido
trifluoracético ou ácido cítrico, enquanto que a eluição de compostos básicos pode ser
aperfeiçoada com a adição de aminas alifáticas, como isopropilamina, dietilamina,
etildimetilamina ou trietilamina. Em alguns casos, são adicionados compostos iônicos,
como acetato de lítio, acetato de tetrametilamônio ou cloreto de amônio. Amônia e
tampões voláteis, como formato, acetato e carbonato de amônio, são utilizados, com
sucesso, como aditivos em análise de compostos básicos, com a vantagem de serem
compatíveis com a técnica de espectrometria de massas. Atenção especial deve ser
dada à adição de aditivos na fase móvel quando se emprega o espectrômetro de
massas, pois, de um modo geral, os aditivos além de influenciar na retenção e no
formato do pico cromatográfico, também afetam a ionização e detectabilidade de
determinados compostos.
O uso de água como aditivo ressurgiu nos últimos anos graças a sua
habilidade para eluir e melhorar o formato de picos de analitos polares. Ela deve ser
sempre utilizada em conjunto com algum solvente orgânico, que a torna, então, miscível
em CO2. Ela é mais polar que o metanol e possui dois grupamentos que realizam
ligações de hidrogênio, o que aumenta o poder de solvatação da fase móvel, causa
pequenas mudanças na seletividade, favorece a separação de misturas complexas12 e
é compatível com a espectrometria de massas.
Apesar do mecanismo de ação dos aditivos não estar bem elucidado, alguns
compostos usados como aditivos cancelam interações entre os solutos e os grupos
silanóis, reduzindo o tempo de análise, enquanto outros podem criar sítios de interação
suplementar que causam aumento na retenção.12, 13, 69 Os trabalhos de Khorassani e
Taylor92, Nováková et al.13, Samimi et al.91, ilustram bem o que ocorre quando se
acrescentam aditivos ácidos, básicos, iônicos e água. A partir deles pode-se verificar
que alguns aditivos sozinhos podem aumentar o tempo de retenção para alguns
compostos, mas o uso de água (solvente anfiprótico, capaz de atuar como ácido ou
base) combinado com algum sal de amônio (composto iônico, volátil quando
solubilizado na FM) pode propiciar melhora na simetria dos picos, boa seletividade e
44
redução do tempo de análise. Somado a isto a água é um solvente que não causa
impactos negativos ao ambiente.
Embora os aditivos tenham seus benefícios, eles devem ser usados em
quantidades muito baixas na FM, como cerca de 1 a 5%, e com prudência, pois mesmo
com a lavagem do sistema cromatográfico, a retirada dos aditivos nem sempre é
assegura, uma vez que eles podem interagir de forma muito intensa e por tempo
prolongado, saturando a FE, o que pode alterar a repetibilidade dos resultados. Alguns
aditivos também podem eluir durante a análise, causando um aumento no ruído da linha
de base.89
Diluente da amostra
A escolha do diluente da amostra também é importante para análise a fim de
evitar distorções nos picos, desse modo, o ideal é solubilizar os analitos na própria FM.
Todavia, isso é impossível em UHPSFC, porque a FM é constituída majoritariamente
por dióxido de carbono. Uma alternativa é empregar um solvente de força igual ou
menor que a FM.93 Solventes com polaridade semelhante ao CO2 originam picos com
formato adequado, porém limitam a solubilidade para alguns compostos e evaporam
com facilidade, ocasionando concentração da amostra no vial de injeção. Uma opção
para esse problema é misturar solventes polares e apolares, contudo, isso deve ser
feito com cautela para evitar problemas de imiscibilidade entre os diluentes.13
Segundo Fairchild et al.93, o emprego de diluentes muito polares, como o
metanol e dimetilsulfóxido, ocasionam deformações nos picos, mesmo em pequenos
volumes de injeção, devido ao efeito do solvente forte. Abrahamssom e Sandahl94
mostraram em seu trabalho que o diluente não interage apenas como a amostra, mas
também com a FE, dessa forma, os diluentes se comportam de maneira distinta em
fases polares (sílica pura) e em fases apolares (C18). Em colunas polares, o emprego
de diluentes com alta constante dielétrica, elevado momento de dipolo e capacidade de
realizar ligação de hidrogênio, está relacionado com eficiência baixa, principalmente na
análise de compostos polares, visto que o solvente minimiza as interações entre analito
e grupos silanóis. Em colunas apolares, solventes com estas características favorecem
a análise. O uso de solventes apróticos, como a acetonitrila, em diferentes FE, tem-se
45
mostrado vantajoso, já que fornece bom formato de pico, permite solubilizar grande
variedade de compostos e não é retido em UHPSFC, o que não interfere nos compostos
analisados.13
Volume de injeção
A literatura sugere que o volume de injeção a ser utilizado em UHPSFC para
evitar alargamento e/ou distorção do pico cromatográfico seja em torno de 0,1 a 0,5%
do volume da coluna, valores estes inferiores aos utilizados em UHPLC, na qual,
geralmente são injetados volumes na faixa de cerca de 1,0% do volume da coluna
cromatográfica.13, 93
Fases estacionárias
As fases estacionárias (FE) para Cromatografia com Fluído Supercrítico têm
se assemelhado bastante àquelas empregadas em cromatografia líquida95, de modo
que todas as FE para HPLC, sejam elas polares ou apolares, podem ser usadas em
UHPSFC com a mesma FM, devido à ausência de água. Desde que todos os
compostos analisados sejam solúveis na FM rica em CO2, as possibilidades de FE a
serem empregadas são praticamente ilimitadas.13
Uma maneira de comparar as FE e determinar qual é a coluna com maior
seletividade para a separação desejada é o “diagrama de aranha” (Spyder diagram),
que é um sistema de classificação baseado no modelo de parâmetro de solvatação,
também denominado de relação de energia linear de solvatação (LSER). Este modelo
usa cinco descritores [E (transferência de carga), S (dipolo-dipolo), a (ligação aceptora
de hidrogênio), b (ligação doadora de hidrogênio), v (dispersão)], que estão
relacionados com o tipo de interação do soluto com a FE e projeta estas cinco
dimensões em um plano. Neste plano, cada ponto é colocado na extremidade do vetor
de solvatação descrito pelos cinco coeficientes LSER e o tamanho do ponto
(representação da interação FE – soluto) está relacionado com as forças das
interações.13 Desse modo, quando se tem uma FE apolar, como C18, compostos
46
aromáticos e hidrofóbicos são mais retidos (E e v são positivos), enquanto os polares
são menos retidos (s, a e b são negativos), quando se tem uma FE polar, sílica pura ou
sílica ligada à ligantes polares, as espécies mais polares são mais retidas (E, S, a e b
são positivo), enquanto as espécies hidrofóbicas vão eluir primeiro (v é negativo), o que
se assemelham com os padrões de retenção em HPLC com fase normal. Quando se
emprega FE de polaridade mista (que contém grupos polares e apolares), os padrões
de retenção não são de fase reversa e nem de fase normal, eles são exclusivos da
UHPSFC, com todos os cinco coeficientes positivos.12 Na Figura 11 pode ser
visualizado o diagrama de aranha.
Figura 11. Diagrama de aranha para classificação das FE em UHPSFC. Adaptado da referência 12.12
1.4.5 Instrumentação em UHPSFC
Os sistemas cromatográficos empregados em UHPSFC, devido ao pequeno
tamanho das partículas, operam sob condições de pressão elevada, devendo serem
capazes de suportar as mesmas, apresentam rápida resposta aos comandos de
alteração de pressão, se mantêm em níveis constantes com baixas flutuações no
bombeamento do eluente e garantem introdução reprodutível e conveniente da amostra
por meio de injetores automáticos, entre outros.
47
Na Figura 12 pode-se visualizar o esquema de um cromatógrafo com fluido
supercrítico.
Figura 12. Representação esquemática de um cromatógrafo de ultra alta eficiência com
fluido supercrítico. Adaptado de Waters Corporation.96
1.4.5.1 Sistemas de pressurização e bombeamento
Em UHPSFC se emprega um sistema de bombeamento binário de solventes,
um para o CO2 e outro para o modificador orgânico, que pode ou não conter aditivos,
sendo que eles são combinados no misturador. Isso possibilita a operação com fases
móveis de diferentes polaridades e, consequentemente, permite que analitos com
polaridades variadas sejam eluídos.
Embora ambas as bombas sejam semelhantes às de UHPLC, uma delas
sofreu modificação para bombear especificamente CO2 líquido e possui refrigeração de
dois estágios. A remoção do calor produzido aumenta a eficácia da compressão da fase
48
móvel. Além disso, o sistema de bombeamento é capaz de medir com a mesma
precisão a quantidade tanto de CO2 líquido, que é compressível, quanto do cossolvente
não compressível, que entram no misturador.97
Os sistemas de UHPSFC também contam com um controle efetivo da
pressão de retorno pela introdução de um regulador de contrapressão, denominado
BPR (Back Pressure Regulator). Tal dispositivo é colocado após o detector para manter
a uniformidade do fluido através de todo sistema cromatográfico, controlando a
densidade do fluido e garantindo repetibilidade nos tempos de retenção e baixo nível
de ruído. Recentemente, um novo design de BPR, denominado ABPR (Automatic Back
Pressure Regulator) foi introduzido nos sistemas de UHPSFC (Fabricantes Waters e
Agilent) com intuito de aumentar ainda mais a repetibilidade da técnica.97, 98
O sistema de bombeamento com capacidade de refrigeração para CO2
aliado ao controle eficaz da pressão de retorno garantem repetibilidade das análises,
desempenho confiável e robustez da técnica.
1.4.5.2 Sistema de injeção
As válvulas de amostragem utilizadas em UHPSFC com colunas recheadas
são as mesmas usadas em UHPLC, sendo empregada a válvula de seis portas. Este
tipo de injetor apresenta alto desempenho em pressões elevadas, além de exatidão,
precisão e boa reprodutibilidade de amostragem na faixa de volume de 0,1 a 50 μL.97
1.4.5.3 Forno da coluna
O controle da temperatura é um parâmetro muito importante nesta técnica,
pois a variação da temperatura acarreta mudança na densidade do fluido e,
consequentemente, influencia na partição, na volatilização dos analitos e na
seletividade na região próxima ao ponto crítico. Nesta região, o controle de temperatura
deve ser mais eficiente possível para manter a densidade do fluido constante. Nos
equipamentos mais recentes de UHPSFC, consegue-se elevado controle térmico no
forno, de modo que estes podem chegar até 90 °C com incrementos de 0,1 °C. O forno
49
pode conter número variado de colunas, de 2, 4, 6, 8 e 15, o que facilita o
desenvolvimento de métodos, minimizando o tempo gasto na troca e no reequilíbrio das
mesmas.97
1.4.5.4 Sistema de detecção
Devido às características do fluido supercrítico, qualquer detector
convencional utilizado em cromatografia líquida ou cromatografia gasosa pode ser
usado em UHPSFC sem que, para isso, seja necessária significativa modificação
instrumental. Atualmente, os detectores mais empregados em técnicas que utilizam
cromatografia com fluido supercrítico são: utravioleta-vísivel (UV-Visible), por arranjo
de diodos (DAD – Diode Array Detector), por espalhamento de luz (ELSD – Evaporative
Light Scattering Detector) e, mais recentemente, por espectrometria de massas (MS –
Mass Spectrometry).
Em especial, o detector por arranjo de diodos possui uma lente de sílica de
alta resistência que compensa as diferenças nos índices de refração entre o CO2 e o
modificador orgânico, resultando em redução significativa do ruído da linha de base.97
A cela de detecção de baixo volume apresenta alta sensibilidade e garante picos
estreitos, de modo a manter desempenho espectral ideal.97
1.5 Análise de agrotóxicos empregando UHPSFC
Atualmente, estudos empregando a técnica de UHPSFC para a análise de
agrotóxicos ainda são limitados, porém, devido às vantagens já discutidas, espera-se
que a técnica se popularize no monitoramento de resíduos de agrotóxicos. Os estudos
encontrados até o momento são referentes às análises de compostos quirais, não tendo
sido encontrados trabalhos para separação de multirresíduo de agrotóxicos em
matrizes diversas.
Liu et al.99 desenvolveram um método para determinação enantiosseletiva
de enantiômeros do fungicida tebuconazol em água e em peixes-zebra usando UPC2-
MS. As melhores separações foram obtidas usando coluna quiral do tipo Chiralpak IA-
50
3, fase móvel CO2:MeOH 83:17, pressão de 2200 psi, temperatura de 30 °C, vazão de
2 mL min-1 e volume de injeção de 1 µL. Nestas condições, o tempo de retenção foi de
3,26 minutos para o isômero S e 3,60 minutos para o R, os limites de detecção (LD)
foram de 0,3-0,4 µg kg-1 e os limites de quantificação (LQ) foram de 1,0-1,32 µg kg-1.
Tao et al.100 separaram os enantiômeros do fungicida flutriafol em vegetais (tomate e
pepino), frutas (maçã e uva) e solos empregando como detector o espectrômetro de
massas. As condições experimentais usadas foram semelhantes às empregadas por
Liu et al.99, com exceção da porcentagem de modificador na FM CO2:MeOH 88:12. O
tempo de retenção para o isômero R foi de 2,95 minutos e para o S foi de 3,32 minutos
e os LD foram de 0,12-0,35 µg kg-1 e os LQ foram de 0,41-1,18 µg kg-1.
Twohig et al.101 fizeram a separação enantiomérica e diastoisomérica de 12
agrotóxicos da classe dos triazóis empregando detecção UV-Vis e colunas quirais
Trefoil AMY1 e CEL1. Triadimefom, tetraconazol, fenbuconazol, diniconazol,
tebuconazol, flutriafol e propiconazol foram separados usando coluna Trefoil AMY1 e
gradiente de metanol. Uniconazol, penconazol, hexaconazol ciproconazol e
bromuconazol foram resolvidos usando a coluna Trefoil AMY1 e gradiente de 2-
propanol:etanol 50:50 (v/v).
Chen et al.102 também fizeram a separação e a determinação quiral dos
estereoisomêros de sulfoxaflor em vegetais (tomate e pepino) e em solo usando UPC2-
MS/MS. Foi utilizada uma coluna Chiralpak IA-3 com isopropanol:acetonitrila 2:3 (v/ v)
como cossolventes, a 40 °C e a pressão de 2500 psi. Os LQ foram de 1,28-1,68 µg kg-
1 para o pepino, 1,34-1,83 µg kg-1 para o tomate e 1,21-1,58 µg kg-1 para as amostras
de solo.
Atualmente, a avaliação tradicional de risco de agrotóxicos quirais não
discrimina entre os enantiômeros, levando à subestimação dos seus efeitos no
ambiente.99 Assim, a rápida separação enantiomérica, propiciada pelo uso da
cromatografia de convergência, é importante para o controle de resíduos de agrotóxicos
quirais, pois se pode conhecer individualmente a atividade de um enantiômero em
termos de bioatividade, toxicidade, metabolismo ou excreção quando submetidos a um
sistema químico ou biológico assimétrico102, de modo que essa informação possa
ajudar na redução parcial ou total da aplicação do mesmo.101
51
Li-Ting et al.103 determinaram a presença de bifentrina em amostras de chá
empregando as técnicas de UHPSFC-UV e CG-MS. Nesta análise, foi empregada uma
coluna ACQUITY UPC2 TM BEH, acetonitrila como modificador e vazão de 1,5 mL min-
1. A técnica de UHPSFC se mostrou mais rápida (tR UPC2 = 0,95 minutos e tR CG = 18
minutos), porém apresentou pior limite de detecção (LDUPC2 = 20 µg L-1 e LD CG = 10 µg
L-1), visto que o detector MS possui melhor detectabilidade, informa a massa molar e a
estrutura dos analitos, mesmo em pequenas concentrações, e possui maior
seletividade que o UV.104
Salvatierra-Stamp et al.105 usaram UPC2-DAD para separação de sete
contaminantes emergentes em amostras de água, dentre eles o agrotóxico diuron. A
separação dos compostos foi feita em 10 minutos, usando a coluna Viridis BEH 2-EP,
40° C, eluição por gradiente, acetonitrila como modificador, 2000 psi, e vazão de 1,4
mL min-1. Os limites de detecção foram de 0,1-1,59 µg L-1 e os LQ foram de 0,31-4,83
µg L-1. A partir destes dados, conclui-se que o detector por arranjo de diodos (DAD) é
mais eficiente que o UV, onde a leitura é feita em um único cumprimento de onda, pois
possibilita menores LD e LQ, no entanto, o espectrômetro de massas é ainda mais
eficiente que o DAD.
Twohig et al.106 analisaram estereoisomêros de propiconazol usando UPC2
– DAD/MS. Eles também comparam a eficiência de uma coluna quiral (Amylose Chiral)
e uma aquiral (ACQUITY UPC2 BEH) na separação dos compostos. A coluna aquiral
possibilitou a separação do propiconazol, todavia, a coluna quiral se mostrou mais
seletiva. Os autores também mostraram que a combinação dos detectores DAD e MS
permitiu a determinação de uma gama de analitos em uma única corrida, com elevado
nível de confiança.
1.6 Planejamento Experimental
O Planejamento Experimental (Design of Experiments, DOE) é uma vertente
da Quimiometria que engloba diversas ferramentas multivariadas que permitem a
otimização das condições de um método, processo ou produto, por meio do
entendimento da relação que existe entre as variáveis experimentais e as propriedades
de interesse do sistema.14, 107, 108
52
Basicamente, o procedimento multivariado consiste em estabelecer e
conduzir o menor número de experimentos necessários para extrair o máximo de
informação dos dados coletados, de modo a avaliar e/ou otimizar um produto ou
processo, alterando-se todos os fatores relevantes de forma simultânea em um
conjunto de experimentos pré-determinados. Os resultados são tratados
estatisticamente e utilizados para a construção de modelos matemáticos que
descrevem o comportamento do sistema dentro do domínio experimental investigado.
Além de permitir ao pesquisador sistematizar seu trabalho de forma mais objetiva, este
procedimento apresenta diversas vantagens em relação ao método univariado, tais
como a possibilidade de detecção de interações entre as variáveis experimentais, muito
comuns na maioria dos sistemas, e a capacidade de previsão da propriedade de
interesse por meio dos modelos matemáticos construídos. No método univariado são
obtidas informações apenas nos pontos onde os experimentos foram de fato realizados,
não havendo informações sobre o sistema como um todo.107
Existem diferentes métodos de planejamento experimental e a seleção do
mais apropriado depende do objetivo do pesquisador e do tipo de variáveis envolvidas.
Se os níveis das variáveis podem ser ajustados de forma independente, podem ser
utilizados planejamentos fatoriais em dois ou mais níveis e também planejamentos do
tipo Composto Central (Central Composite Design, CCD) ou Box-Behnken. Caso os
níveis das variáveis não possam ser ajustados de forma independente, como por
exemplo, no estudo da proporção dos componentes de uma formulação, devem ser
utilizados preferencialmente planejamentos de misturas.108
O Planejamento fatorial em dois níveis para avaliação do sistema permite a
avaliação de vários fatores experimentais (x) que afetam o sistema por meio de
modelos lineares que relacionam os mesmos às variáveis dependentes ou respostas
(y), que são as propriedades de interesse. Os modelos lineares são obtidos por
Regressão Linear Múltipla (RLM) e devem ser avaliados quanto à significância da
regressão e adequação para representação dos resultados experimentais (falta de
ajuste) e então podem ser empregados para construir superfícies de resposta, as quais
permitem avaliar de forma visual como se dá a variação das respostas dentro do
domínio experimental e encontrar condições ótimas para uma ou mais respostas.
Uma das maneiras mais usuais de avaliar a significância da regressão (isto
é, se existe de fato variação nas respostas conforme são alterados os níveis das
53
variáveis experimentais) é por meio da utilização da análise da variância (ANOVA).108
Na análise da variância, divide-se a variabilidade total das observações em seus
componentes. Então, são calculadas as Somas Quadráticas (SQ), que representam a
variabilidade atribuída à regressão e, também, aquela devida aos resíduos. Para
verificação da significância estatística da regressão, realiza-se um teste F por meio da
comparação do valor da razão da Média Quadrática da Regressão (MQR) com a Média
Quadrática dos resíduos (MQr), gerando o valor de Fcalc, que é comparado com o valor
da distribuição F tabelada (Ftab), com (p-1, n-p) graus de liberdade, sendo p o número
de parâmetros no modelo e n o número total de experimentos. Se Fcalc > Ftab conclui-
se que de fato as variações experimentais causam variação na resposta. Neste caso,
deve-se avaliar todos os fatores de forma individual para identificar qual deles é
responsável pela significância da regressão.
Após confirmada a significância da regressão, deve-se avaliar a adequação
do modelo proposto para representar os dados experimentais. Isto pode ser feito
empregando-se o teste F de falta de ajuste, o qual é feito pela comparação da razão da
Média Quadrática de Falta de Ajuste (MQfaj) com a Média Quadrática do Erro Puro
(MQep), gerando o valor de Fcalc, o qual é comparado com o valor da distribuição F
tabelada (Ftab), com (m-p, n-m) graus de liberdade, sendo m o número de níveis do
planejamento. Se Fcalc > Ftab conclui-se que o modelo proposto não é adequado para
representar os resultados experimentais. Este teste pode, no entanto, apresentar
resultados falhos, no caso da MQep ser muito pequena.109 Por este motivo, normalmente
são utilizadas outras ferramentas de diagnóstico, como a análise dos resíduos e
comparação dos valores previstos pelo modelo com os valores obtidos
experimentalmente.
Nos últimos anos, metodologias multivariadas de Planejamento
Experimental vêm ganhando destaque em várias áreas da pesquisa e da indústria,
especialmente após o órgão regulador de medicamentos e alimentos dos Estados
Unidos, o Food and Drug Administration (FDA) e o Comitê Internacional de
Harmonização (International Conference on Harmonization of Technical Requirements
for Pharmaceuticals for Human Use, ICH) terem lançado a abordagem para o
desenvolvimento de produtos e processos, denominada “Quality by Design” (QbD) a
qual foi, posteriormente, adaptada para o desenvolvimento de métodos analíticos nos
laboratórios de indústrias farmacêuticas e recebeu o nome de Analytical Quality by
54
Design (A-QbD). Este conceito baseia-se em uma abordagem científica que busca
identificar os riscos envolvidos em cada etapa do desenvolvimento e compreendê-
los/quantificá-los empregando ferramentas multivariadas de planejamento de
experimentos.110, 111, 112
Devido à técnica de UHPSFC apresentar muitos fatores (diluente da
amostra, volume de injeção, FE, vazão, aditivos tipo e porcentagem de modificadores
orgânicos, tipo de fase estacionária, pressão e temperatura), cujo efeito conjunto é
complexo, não está completamente elucidado e interferem significativamente na
obtenção de uma separação cromatográfica adequada, o uso ferramentas
quimiométricas de planejamento experimental pode auxiliar bastante no
desenvolvimento e otimização do método. Não existem muitos trabalhos na área de
UHPSFC que utilizam a metodologia multivariada. Dispas et al.113 estudaram a
influência de condições cromatográficas e de natureza solvente de injeção no âmbito
da determinação quantitativa de produtos farmacêuticos por UHPSFC-PDA. Para isso,
realizaram a combinação de diferentes fases estacionárias, diferentes composições de
fase móvel e diferentes solventes para injeção a fim de refletir a prática atual dos
analistas utilizando-se a ferramenta quimiométrica de planejamento experimental
(DoE). Além desta, para interpretação dos dados também foi empregada a análise de
clusters (HCA). A partir do uso da Quimiometria os autores destacaram que tal
abordagem forneceu objetivamente algumas condições ideais para separação dos
analitos e sublinharam os altos desempenhos cromatográficos que podem ser obtidos
quando se trabalha em condições contraintuitivas, como no caso do solvente de injeção
em que, independentemente da FE ou analito, o uso de acetonitrila apresentou os
melhores formatos de picos.
1.7 Validação de Métodos Analíticos
Depois do desenvolvimento e otimização de um método analítico e avaliação
do efeito matriz, o mesmo deve passar por uma etapa de estudo experimental
denominada validação, que serve para avaliar a confiabilidade dos resultados obtidos
e sua aplicabilidade na análise de amostras reais. A validação pode ser feita com base
em resoluções, que são documentos com poder de lei, cujas recomendações devem
55
ser seguidas, ou em guias, que são documentos capazes de conferir maior flexibilidade
ao analista visto que sugerem uma linha a ser seguida.114
O guia SANTE / 11945/2015115 foi elaborado pela comunidade europeia e
descreve os requisitos para validação e aceitação de um método analítico para análise
de agrotóxicos em alimentos, visando garantir a saúde dos consumidores. Os principais
parâmetros analíticos ou figuras de méritos a serem utilizados serão seletividade, faixa
linear, linearidade, limite de quantificação, exatidão (em termos de recuperação),
precisão (repetibilidade e precisão intermediária) e robustez.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho é a avaliação da potencialidade da Cromatografia
com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência no desenvolvimento e validação de um
método para a determinação de multirresíduos de agrotóxicos comumente aplicados
em alface, fazendo uso de ferramentas quimiométricas de planejamento e otimização
experimental, e comparação com o método desenvolvido e validado empregando a
Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência.
2.2 Objetivos Específicos
Estabelecer um método de separação cromatográfica empregando
Cromatografia com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência a partir do estudo dos
parâmetros: volume de injeção, diluente da amostra, tipo de coluna cromatográfica, tipo
de eluição (isocrática ou por gradiente, tipo e porcentagem de modificador orgânico na
FM, uso de aditivos, pressão e temperatura;
Otimização do método de separação desenvolvido usando planejamento
experimental;
Avaliação do método QuEChERS citrato, para extração dos agrotóxicos
estudados da alface;
56
Validação do método desenvolvido usando UHPSFC;
Aplicação do método desenvolvido e validado na análise de amostras de alface
adquiridas no mercado local;
Desenvolvimento e validação de um método por UHPLC para determinação dos
mesmos analitos;
Comparação e avaliação crítica dos resultados em relação à um método
desenvolvido por UHPLC para a quantificação dos mesmos analitos.
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Materiais e métodos
3.1.1 Reagentes e padrões analíticos
Foram utilizados os padrões Atrazina (98,0% m/m) da Chem Service,
Azoxistrobina (99,4% m/m) e Clorantraniliprol (99,2%) da Sigma-Aldrich, Fenarimol
(99,8% m/m) da Riedelde-Haën e Difenoconazol (97,0% m/m), Fluopicolida (99,9%
m/m), Imidacloprido (99,9% m/m), Lambda-Cialotrina (97,8% m/m), Mandipropamida
(99,1% m/m), Tiametoxam (99,7% m/m) da Fluka.
Para diluição das soluções estoques, foram empregados acetonitrila,
isopropanol e hexano da Panreac, metanol da J. T. Baker e tetraidrofurano da Tédia,
todos de grau HPLC.
Para a fase móvel, foram empregados CO2 (99,9% de pureza), fornecido
pela Air Products, acetonitrila e etanol da Panreac e metanol, todos de grau HPLC,
água purificada pelo sistema Milli-Q, Millipore.
Para realização do preparo de amostras com o método QuEChERS, foi
empregado sulfato de magnésio, do fornecedor J. T. Baker, cloreto de sódio da Synth,
hidrogenocitrato dissódico sesquiidratado e PSA da Sigma Aldrich, citrato trissódio
diidratado da Vetec Quimica fina e carbono grafitizado da Agilent Technologies.
57
3.1.2 Equipamentos e colunas cromatográficas
Para realização das separações cromatográficas, foram empregados os
equipamentos UPC2 (para separações por UHPSFC) e UPLC (para separações por
UHPLC), ambos da empresa Waters Corporation. Ambos os sistemas são equipados
com injetores automáticos de amostras, sistema binário de bombeamento da fase
móvel e detector por arranjo de diodos (DAD). Para obtenção e tratamento dos dados
foi empregado o software Empower Pro.
Foi empregado também um sistema de filtração de fase móvel (Millipore),
membrana de polietileno (0,22 µm), balança analítica (Sartorius CP225D), bomba a
vácuo (Vacuubrand1C), banho ultrassom (Ultrasonic Cleaner – LS Logen Scientific),
centrífuga (Fisher Scientific, modelo 225), tubos do tipo Falcon (50 mL) para
centrifugação, vórtex (Phoenex, modelo AP56) e micropipetas (volumes: 10 - 100 µL,
100-1000 µL e 1 - 5 mL (Eppendorf Research).
Para a separação dos agrotóxicos no UPC2 foram avaliadas as colunas
ACQUITY UPC2 BEH 1,7µm 2,1 mm X 100 mm, ACQUITY UPC2 HSS C18 SB, 1,8 µm,
2,1 mm X 50 mm, ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolylamine) 1,7 µm, 2,1 mm X 50
mm e ACQUITY UPC2 CSH FluoroPhenyl, 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm. Para separação
no UPLC foram empregadas as colunas ACQUITY UPLC HSS C18 SB, 1,8 µm, 2,1 mm
X 100 mm e ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl, 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm. Todas
precedidas por suas respectivas colunas de guarda e adquiridas da Waters
Corporation.
3.1.3 Amostras de alface
Para a validação do método de determinação por UHPSFC-DAD e UHPLC-
DAD, foi utilizada alface orgânica (amostra branco de referência) crespa obtida no
comércio de Campinas/SP, que foi fortificada com os agrotóxicos estudados em
diferentes concentrações para o preparo de amostra.
58
3.2 Método
3.2.1 Seleção dos agrotóxicos a serem analisados
No presente trabalho, foram selecionados 5 agrotóxicos permitidos para
aplicação em cultivo da alface, de acordo com a ANVISA. Também foram avaliados 5
agrotóxicos não permitidos, contudo encontrados em amostras de alface analisadas
pelo PARA. Os agrotóxicos selecionados, seus valores de log P, pKa, quiralidade, grupo
químico aos quais pertencem, classe agrônoma e seus respectivos valores de LMR
aceitos pela ANVISA estão apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Agrotóxicos selecionados para o estudo em amostra de alface e seus respectivos log P, pKa, quiralidade, grupo químico, classe agrônoma e LMR.
pKa: cologaritmo da constante de acidez (temperatura = 25 ºC);
LMR: limite máximo de resíduo;
NA: Não autorizada à utilização do agrotóxico em cultura de alface.
Agrotóxicos
Log P
pka
Quiral
Grupo Químico
Classe
Agrônoma
LMR
(PARA
2016)
mg kg-1
Atrazina 2,7 1,7 Não Triazina Herbicida NA
Azoxistrobina 2,5 ND Não Estrobilurina Fungicida 1
Clorantraniliprol 2,86 10,88 Não Antranilamida Inseticida NA
Difenoconazol 4,36 1,07 Sim Triazol Fungicida 0,5
Fenarimol 3,69 ND Sim Pirimidinil
carbinol
Fungicida NA
Fluopicolida 2,9 ND Não Benzamida
piridina
Fungicida NA
Imidacloprido 0,57 ND Não Neonicotinóide Inseticida 0,5
ʎ-Cialotrina 5,5 ND Não Piretróide Inseticida 1
Mandipropamida 3,2 ND Sim Éter
mandelamida
Fungicida NA
Tiametoxam -0,13 ND Não Neonicotinóide Inseticida 1
59
Na Figura 13 podem ser vistas as estruturas químicas dos agrotóxicos
selecionados para estudo.
Atrazina
Azoxistrobina
Difenoconazol
Clorantraniliprol
60
Fluopicolida
Fenarimol
Imidacloprido
Lambda- Cialorina
Tiametoxam
Mandipropamida
Figura 13. Estruturas químicas dos agrotóxicos selecionados para estudo.
61
3.2.2 Preparo e armazenamento das soluções analíticas dos agrotóxicos
As soluções estoques, na concentração de 1 mg mL-1, foram preparadas
individualmente empregando solventes de grau HPLC, nos quais os compostos
apresentassem alta solubilidade, sendo eles: acetona (Clorantraniliprol,
Mandipropamida, Tiametoxam), acetonitrila (Atrazina, Fenarimol, Fluopicolida,
Imidacloprido), etanol (Difenoconazol) e metanol (Azoxistrobina, Lambda-Cialotrina).
Considerando-se o grau de pureza dos agrotóxicos de trabalho, foram
pesados cerca de 10,0 mg de cada analito, em balança de alta precisão, com o auxílio
de navículas, e a massa pesada foi transferida para um balão volumétrico de 10 mL,
utilizando-se o solvente no qual o composto apresenta maior solubilidade.
As soluções estoque foram armazenadas em freezer, em frascos âmbar,
envoltos por papel alumínio, durante um período máximo de 6 meses.
A partir das soluções estoque foram feitas diluições em concentrações
adequadas para preparar as soluções de trabalho empregadas nos testes realizados.
As soluções mais diluídas também foram armazenadas em freezer, porém foram
usadas em um curto período de tempo, cerca de 7 dias.
3.2.3 Confirmação dos agrotóxicos
Os agrotóxicos estudados foram identificados a partir da comparação do
tempo de retenção do analito com seu padrão analítico e dos espectros de absorção
no ultravioleta, com o emprego do detector por arranjo de diodos, na faixa espectral de
200 a 500 nm, obtidos em três pontos distintos do pico cromatográfico (início, meio e
fim).
62
3.2.4 Seleção do modo de eluição dos agrotóxicos e da fase estacionária em
UHPSFC
Preparou-se uma mistura, na concentração de 0,05 mg mL-1, contendo os
10 agrotóxicos selecionados, usando acetonitrila como diluente. Esta mistura foi
injetada, em triplicata, tanto no modo de eluição isocrática quanto por gradiente em
todas as fases estacionárias (FE) escolhidas. As condições de análise foram baseadas
em dados da literatura.
As condições cromatográficas empregadas na eluição no modo isocrático
foram: fase móvel (FM) constituída por solvente A, CO2, e solvente B, metanol, na
proporção de 92,5:7,5 (v/v de A:B), pressão de 1500 psi, temperatura de 40,0 °C, vazão
de 1,5 mL min-1, volume de injeção de 1,0 µL, detecção em 220 nm e tempo de corrida
de 6,0 minutos. Para a eluição no modo gradiente, foi empregado um gradiente linear
(inclinação 6 da Figura 14), com programação da fase móvel variando de 0 a 20% do
solvente B (metanol neste caso) de 0 a 3 minutos e de 20 a 0% de 3 a 5 minutos,
pressão de 1500 psi, temperatura de 40,0 °C, vazão de 1,5 mL min-1, volume de injeção
de 1,0 µL, detecção em 220 nm e tempo de corrida de 5,1 minutos. Entre cada injeção
foi feito um equilíbrio de 5,0 minutos na condição inicial do gradiente.
Figura 14. Curvas usadas em eluição por gradiente
63
Como após aproximadamente uma semana de uso da FE sempre havia
variação no tempo de retenção dos compostos para valores menores, foi adicionado
5% de água ao frasco de metanol (solvente B) e repetiram-se as injeções no modo
gradiente, empregando as colunas que apresentaram as melhores separações para os
compostos estudados (colunas ACQUITY UPC2 HSS C18 SB, ACQUITY UPC2 Torus
2-PIC e ACQUITY UPC2 CSH FluoroPhenyl).
3.2.5 Seleção do diluente e volume de injeção em UHPSFC
Preparou-se uma mistura, na concentração de 0,05 mg mL-1, contendo os
10 agrotóxicos estudados, usando como diluente os solventes acetonitrila (ACN),
isopropanol (IPA), metanol (MeOH), hexano e tetraidrofurano (THF). Injetaram-se no
cromatógrafo, em triplicata, os volumes de 0,5, 1,0, 1,5, 2,5, 3,5 e 5,0 µL das misturas
preparadas, para verificar o volume de injeção e o diluente que proporcionassem
formato de pico adequado. Para isto, foi empregada eluição por gradiente, conforme as
condições descritas no item 3.2.4, com as colunas ACQUITY UPC2 HSS C18 SB,
ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC e ACQUITY UPC2 CSH FluoroPhenyl e adição de
5% de água no metanol, usado como cossolvente na fase móvel.
3.2.6 Seleção da fase móvel em UHPSFC
Usando uma mistura contendo os 10 agrotóxicos, na concentração de 0,05
mg mL-1, preparada em ACN, foram avaliadas as fases móveis constituídas por solvente
A (CO2) e B (o solvente B pode ser composto por metanol:água 95:5 (v/v) ou acetonitrila
ou etanol:água 95:5 (v/v)). A escolha da fase móvel mais apropriada foi feita usando
eluição por gradiente, segundo as condições descritas no item 3.2.4, com as colunas
ACQUITY UPC2 HSS C18 SB, ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC e ACQUITY UPC2 CSH
FluoroPhenyl.
64
3.2.7 Planejamento experimental em UHPSFC
Realizou-se um planejamento fatorial 24 com os fatores: porcentagem de
etanol na FM ao final do gradiente, pressão, temperatura e tipo de FE. As três primeiras
variáveis são contínuas e a última é discreta. Foi realizada triplicata no ponto central
para a combinação das variáveis contínuas, em cada nível da variável discreta. Os
níveis dos fatores são mostrados na Tabela 6. para determinar as melhores condições
para separação cromatográfica e a coluna mais adequada. O planejamento continha
22 pontos que foram injetados em triplicata.
Tabela 6. Fatores e níveis empregados no planejamento experimental.
Fator Nível - Nível +
EtOH:H2O (%) 15 25
Pressão (psi) 1500 2500
Temperatura (°C) 25 50
Fase estacionária Fluorofenil 2-PIC
3.2.8 Separação dos agrotóxicos em UHPLC
Com o intuito de comparar a UHPSFC com a UHPLC (uma técnica
cromatográfica bem consolidada), foram desenvolvidos e validados, em cada técnica,
métodos analíticos para separação da mistura de agrotóxicos selecionados.
Empregando UHPLC, estudaram-se as colunas ACQUITY UPLC HSS C18
SB e ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl e optou-se pela eluição por gradiente.
As condições cromatográficas empregadas foram: gradiente linear
(inclinação 6 da Figura 14), fase móvel H2O:EtOH (sendo água solvente A e etanol o
B), programação do gradiente com porcentagem de solvente B variando de 15 a 70%
de 0 a 10 minutos e de 70 a 15% de 10 a 16 minutos, temperatura de 40,0 °C, vazão
de 0,3 mL min-1, volume de injeção de 1,0 µL, detecção em 220 nm e tempo de corrida
de 16,1 minutos. Entre cada injeção foi realizado um equilíbrio de 10 minutos na
65
condição inicial do gradiente. As injeções foram feitas em triplicatas utilizando
acetonitrila como diluente.
Após a seleção da coluna ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl como FE,
avaliaram-se os volumes de injeção de 1,0, 1,2 e 1,5 µL.
3.2.9 Armazenamento das amostras de alface
As amostras de alface isentas de agrotóxicos foram obtidas no comércio
local da região de Campinas - SP e processadas adequadamente, para evitar possíveis
contaminações. As amostras de alface, lavadas com água da torneira e secas em
temperatura ambiente, foram homogeneizadas em multiprocessador doméstico e
mantidas em frascos de vidro em freezer, a baixa temperatura (aproximadamente 4°C),
a fim de assegurar suas características.
3.2.10 Extração dos agrotóxicos da alface usando o método QuEChERS
Para preparo da amostra e extração dos agrotóxicos estudados foi utilizado
o método QueChERS Citrato, conforme as condições otimizadas e descritas no
trabalho de Konatu, 2017.21, 116
A amostra de alface crespa triturada foi diluída em 10,0 mL de acetonitrila,
solvente usado na etapa de extração. Após agitação em vortex por 1,0 minuto, foram
adicionados 4,000 g de sulfato de magnésio (MgSO4), 1,000 g de cloreto de sódio
(NaCl), 1,000 g de citrato trissódico diidratado (C6H5Na3O7.2H2O) e 0,500 g de
hidrogenocitrato sesquiidratado (C6H5Na2O7.1,5H2O), que são os sais responsáveis
pela etapa de partição e pelo ajuste do pH. A mistura foi agitada em vortex por 1,0
minuto e centrifugada a 5000 rpm por 5,0 minutos. Posteriormente, 7,0 mL do
sobrenadante foram transferidos para um frasco contendo 0,175 g de PSA, 0,035 g de
carbono grafitizado (GCB) – sorventes para limpeza da amostra e 1,050 g de MgSO4,
66
e agitados em vortex por 1,0 minuto e centrifugados a 5000 rpm por 5,0 minutos. Após
a etapa de limpeza, 5,0 mL do sobrenadante foram submetidos ao fluxo de gás
nitrogênio até a secura, ressuspendido em 0,5 mL de ACN, agitado em vortex por 1,0
minuto, sonicado em banho de ultrassom por 10 segundos, filtrado com filtro de seringa
0,22 µm e armazenado em frasco de vidro, no freezer, até o momento da análise. As
injeções foram realizadas em triplicata.
3.2.11 Quantificação e validação do método
A padronização externa com superposição na matriz foi usada para a
quantificação dos analitos. Este se fundamenta na adição de soluções padrões de
concentração conhecida, em diferentes níveis, na matriz branco, abrangendo os limites
máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pela Anvisa.
A validação dos métodos desenvolvidos por UHPSFC e UHPLC se baseou
nas normas do guia SANTE 11945/2015115, determinando o efeito matriz e as principais
figuras de mérito: seletividade, faixa linear, linearidade, limite de quantificação, exatidão
(em termos de recuperação), precisão (repetibilidade e precisão intermediária) e
robustez.
3.2.11.1 Efeito matriz
Avaliar o efeito matriz é uma etapa importante durante o desenvolvimento e
validação de um método analítico, porque componentes da matriz presentes no extrato
final podem causar aumento ou diminuição da resposta cromatográfica, de modo a
interferir significativamente na exatidão e precisão da metodologia.21, 117 Apesar do
mecanismo envolvido no aumento ou diminuição da intensidade do sinal não estar bem
elucidado, sabe-se que o efeito matriz depende das propriedades físico-químicas dos
analitos estudados, das características dos componentes da matriz, como polaridade e
tamanho das moléculas118, por exemplo, e até mesmo do tipo de detector empregado
na análise.
O efeito matriz na quantificação de resíduos de agrotóxicos pode ser
minimizado com o emprego de algumas estratégias como preparo de amostra, diluição
67
da amostra, uso de protetores de analitos, adição padrão ou padronização externa com
superposição na matriz.117, 119
Durante a etapa de validação, ao realizar o teste para avaliar a linearidade
do método, é possível fazer a determinação da interferência da matriz nos resultados,
a partir da sobreposição de curvas obtidas no solvente e na matriz, por padronização
externa.
O efeito matriz foi avaliado empregando o método de adição dos agrotóxicos
após realizar o procedimento de extração. Obtiveram-se os valores de efeito matriz (%)
por meio da comparação das inclinações das curvas analíticas dos analitos no extrato
da matriz (amostra branco fortificada) e em solvente, como mostra a Equação 2. As
curvas analíticas para cada analito foram construídas usando cinco níveis de
concentração.
𝐸𝑓𝑒𝑖𝑡𝑜 𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧 (%) = (𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑛𝑎 𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧
𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑛𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒− 1) × 100 (2)
Os valores do efeito matriz indicam como os componentes intrínsecos da
alface influenciam na resposta do detector. Resultados negativos indicam que
há redução do sinal analítico e resultados positivos mostram aumento do sinal analítico
dos analitos estudados. Se os valores observados estão próximos de zero não há efeito
matriz.120
O efeito matriz também foi avaliado pela sobreposição das curvas obtidas na
matriz e no solvente. Se as retas obtidas são paralelas não existe interferência da matriz
no sinal do analito, contudo, se as retas se cruzam a matriz interfere na quantificação
do analito.
3.2.11.2 Seletividade
A seletividade consiste na capacidade do método em avaliar de maneira
inequívoca os analitos de interesse na presença dos componentes da amostra, como
impurezas e produtos de degradação, por exemplo, que possam interferir na análise.
68
Em cromatografia, a seletividade garante que o pico de resposta em um determinado
tempo de retenção seja estritamente do composto de interesse e não de outros
constituintes da amostra.114
A seletividade pode ser avaliada pela comparação dos cromatogramas
obtidos com injeções da amostra branco, matriz sem os analitos estudados, dos
padrões dos compostos de interesse ou da amostra branco fortificada com os padrões.
Para que o método cromatográfico seja classificado com seletivo, não devem existir
picos de componentes da matriz no mesmo tempo de retenção (tR) dos analitos, ou se
existirem, estes devem possuir área inferior a 30% da área do analito de interesse.
Quando pertinente, é interessante realizar estudos de degradação forçada do analito
para garantir que possíveis produtos de degradação não coeluam com o analito.121
Neste trabalho, se avaliou a seletividade através da comparação dos
cromatogramas obtidos pela injeção da FM, do solvente de injeção, da matriz branco e
dos analitos individuais.
3.2.11.3 Linearidade
A linearidade representa a habilidade de o método prover respostas (como
área do pico, volume de titulante, absorbância, entre outros) diretamente proporcionais
à concentração do analito de interesse na amostra, dentro de um intervalo específico,
que pode ser entendido como o intervalo entre o nível superior e inferior em que as
concentrações dos analitos possam ser determinadas com exatidão, precisão e
linearidade.
A correlação entre a concentração do analito e o sinal medido pode ser
determinada de forma experimental através de uma curva analítica, representada pela
equação da reta (Equação 3):
y = ax + b (3)
Usando-se um conjunto de medidas experimentais (y) e o método de
regressão linear baseado em Mínimos Quadrados, pode-se estimar o valor dos
69
coeficientes da equação 1 por meio da equação matricial (XtX)-1Xty, onde a matriz X
contém os níveis da variável dependente x.14
Como a linearidade e faixa linear são determinados a partir da curva
analítica, é importante que, após a elaboração da mesma, sua qualidade seja avaliada
pelo gráfico dos resíduos (gráfico que representa a diferença entre valor previsto pela
curva analítica e valor experimental) e pelo coeficiente de correlação (valor que mostra
o quanto uma variável dependente (x) está correlacionada com uma variável
independente (y)).
A linearidade do método foi avaliada pela análise de amostras de
alface branco de referência fortificadas com soluções padrões de agrotóxicos em cinco
níveis de concentrações. Usando cálculos de regressão linear das curvas obtiveram-se
os valores dos coeficientes angular (termo a) e linear (termo b) da equação da reta. A
figura de mérito linearidade foi avaliada pelo coeficiente de correlação (r ≥ 0,9900) e
pela distribuição dos resíduos (dados em termos de erro relativo).
3.2.11.4 Limite de quantificação (LQ)
O limite de quantificação (Limit of Quantification, LQ), também denominado
de limite de determinação, representa a menor concentração do analito que pode ser
quantificada usando as condições experimentais adotadas, com níveis de precisão e
exatidão aceitáveis.114
Determinou-se o limite de quantificação a partir de extrações de amostras de
alface fortificadas com soluções dos agrotóxicos em concentrações decrescentes. O
LQ foi considerado como a menor quantidade de um analito em uma amostra que pôde
ser determinada com precisão (CV ˂ 20%) e exatidão (recuperação entre 60 –
140%).131
70
3.2.11.5 Exatidão
A exatidão de um método representa o quanto os resultados individuais em
um conjunto de medições concordam com um valor de referência considerado como
verdadeiro. Os ensaios de recuperação representam uma maneira de se avaliar este
parâmetro. A porcentagem de recuperação pode ser entendida como a quantia da
substância de interesse, que foi adicionada a matriz estudada e foi extraída, sendo
passível de quantificação.114
A exatidão foi avaliada por meio de ensaios de recuperação, nos quais as
amostras foram fortificadas em três níveis de concentração, em triplicatas e os extratos
foram analisados. A exatidão foi estimada a partir de valores de concentração obtidos
após interpolação nas curvas analíticas e pela Equação 4 e o intervalo aceito na
literatura é de 60 - 140%.115
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜 (%) = (𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎 𝑛𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑛𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜) × 100 (4)
3.2.11.6 Precisão
A precisão representa a proximidade entre resultados de testes que foram
independentemente repetidos para amostra, em condições de análise definidas, com
seu valor médio. A precisão é expressa como coeficiente de variação (CV) ou estimativa
de desvio padrão relativo (DPR). Durante a validação de um método a repetitividade e
precisão intermediária são empregadas para avaliar a precisão.
A repetitividade descreve o grau de concordância entre os resultados
obtidos nas mesmas condições de medição. A precisão intermediária avalia a precisão
do método em um mesmo laboratório considerando dias, analistas e equipamentos
diferentes ou uma combinação destes fatores.114
71
3.2.11.6.1 Repetibilidade
Avaliou-se a repetibilidade do método pelo preparo, injeção e análise, no
mesmo dia, de seis extratos de amostras de alface fortificadas com os agrotóxicos no
nível 100% de concentração (concentração intermediária). A precisão foi expressa pelo
coeficiente de variação (CV) calculado através da Equação 5:
𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑉𝑎𝑟𝑖𝑎çã𝑜 (%) = (𝐸𝑠𝑡𝑖𝑚𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑑𝑜 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑜 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑂𝑏𝑡𝑖𝑑𝑎) × 100 (5)
Não são admitidos valores de CV superiores a 20%.
3.2.11.6.2 Precisão intermediária
A precisão intermediária também foi expressa em termos de coeficientes de
variação (CV), que foram obtidos nas análises de extratos de seis amostras brancos de
alface, fortificadas com os agrotóxicos em estudo, no nível 100% de concentração, em
dois dias.
3.2.11.7 Robustez
A robustez mede a sensibilidade do método frente à pequenas variações
experimentais, passíveis de ocorrência no dia a dia de execução do método ou na
transferência do mesmo para outros laboratórios. Em Cromatografia Líquida, tal
parâmetro pode ser avaliado por pequenas e deliberadas variações de temperatura,
composição e pH da FM, lotes e fornecedores de colunas. Caso o método se mostre
insensível a estas pequenas mudanças o mesmo é considerado robusto.114
Em UHPSFC a robustez foi avaliada durante o desenvolvimento do método,
a partir dos resultados das variações realizadas no planejamento experimental e em
72
UHPLC avaliou-se este parâmetro apenas pelo aumento na variação da temperatura
da coluna de ± 2 °C para ± 5 °C.
3.3 Aplicação do método desenvolvido em amostras de alface obtidas no
comércio
Após a validação dos métodos desenvolvidos por UHPSFC-DAD e UHPLC-
DAD, os mesmos foram utilizados na análise multirresíduo em cinco amostras de alface
adquiridas no comércio de Campinas/São Paulo.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, foi realizado um levantamento das seguintes características
dos agrotóxicos selecionados para estudos: log P (uma medida da sua afinidade por
solventes lipofílicos e hidrofílicos) e pKa, cujos valores se encontram na Tabela 5; e
espectro de absorção no UV-vis, cujos máximos de absorção podem ser vistos na
Tabela 7.
Tabela 7. Valores máximos de absorção para os agrotóxicos estudados
Agrotóxicos Máximos de absorção (nm)
Atrazina 222,5 / 263,9
Azoxistrobina 202,6 / 242,7 / 295,0
Clorantraniliprol 202,0 / 290,0
Difenoconazol 215,0 / 235,0 / 275,0
Fenarimol 205,0 / 221,0
Fluopicolida 203,0 / 271,0
Imidacloprido 212,0 / 270,0
Lambda-Cialotrina 201,0 / 278,0
Mandipropamida 223,0 / 276,0
Tiametoxam 211,0 / 252,0
73
Analisando os valores da Tabela 5, verifica-se que os agrotóxicos
selecionados apresentam log P entre -2 e 9, que é um requisito para análise por
UHPSFC10, visto que esta técnica, devido a adição de um cossolvente à fase móvel
(metanol é o cossolvente polar de uso mais comum10), possibilita a análise de
compostos polares e apolares.122 O pKa pode ajudar verificar a necessidade de adição
de aditivos à fase móvel (FM), de modo a melhorar o formato do pico. Dos agrotóxicos
em estudo, a maioria (7 compostos) não sofre ionização, enquanto três deles variam
de caráter ácido a básico. Como o equipamento utilizado emprega um detector por
arranjo de diodos (DAD) é necessário que os agrotóxicos absorvam na região do UV-
Vis para que possam ser detectados e que apresentem espectros de absorção no UV-
Vis diferentes para poderem ser identificados, o que de fato ocorre para esta mistura.
4.1 Seleção do modo de eluição dos agrotóxicos e da fase estacionária em
UHPSFC
A Figura 15 mostra os cromatogramas obtidos com as quatro colunas avaliadas
no modo isocrático e indica que os analitos eluiram em região próxima do tempo de
retardamento, na forma de picos sobrepostos e mal resolvidos. Essa coeluição indica
que a forma isocrática não é apropriada e nem eficiente para a separação, devido à
grande diferença de polaridade entre os 10 agrotóxicos estudados.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Fluorofenil
Figura 15. Continua na página seguinte.
74
Figura 15. Cromatogramas obtidos por UHPSFC na separação dos agrotóxicos estudados usando eluição isocrática. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: constituída por solvente A, como CO2, e solvente B, como metanol, na proporção de 92,5:7,5 (v/v de A:B), eluição isocrática, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV em 220 nm
Devido à variação nos valores de log P, optou-se, então, pelo modo de
eluição por gradiente. Usando essa condição houve uma melhora significativa na
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
Minutes
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Minutes
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00
BEH
2-PIC
C18
75
separação dos analitos, como mostra a Figura 16, todavia, houve alteração na ordem
de eluição dos compostos, dependendo da FE empregada. A coluna C18 apresentou
separação de todos os compostos (inclusive apresentou separação completa para os
enantiômeros do difenoconazol, que estão representados pelo número 7); seguida pela
2-PIC, que apesar de não ter separado todos os compostos, resultou em um bom
formato de pico e resolução; seguida pela Fluorofenil. A coluna BEH forneceu os piores
resultados em termos de formato de pico e de separação dos compostos, logo, esta
coluna não foi utilizada para os testes posteriores.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
1
2
3
45
6
7
8
910
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20
1
3
2
4
7
5 e 6
810 9
Fluorofenil
BEH
Figura 16. Continua na página seguinte
76
Figura 16. Cromatogramas obtidos por UHPSFC na separação dos agrotóxicos estudados usando gradiente linear, com variação de porcentagem de solvente B de 0 a 20%. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2 como solvente A e MeOH como solvente B, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção: 220 nm. Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido.
Apesar dos bons resultados obtidos com estas colunas, começaram a
ocorrer variações nos tempos de retenção (tR) dos compostos, que passaram a não se
repetirem depois de um certo tempo de uso, assim como mudanças na seletividade da
FE. A Figura 17 mostra os cromatogramas obtidos com a coluna Fluorofenil, sendo que
os cromatogramas 1, 2 e 3 foram obtidos uma semana após aos cromatogramas 4, 5 e
6. Como pode ser visto nos cromatogramas 1, 2 e 3, na parte superior da Figura 17,
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20
1
3
2 7
6
4 5
8 e 9
10
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00
1
2
3
5
64
7 78
10 9
2-PIC
C18
77
após uma semana de uso, sempre ocorria uma diminuição no tR. Essa falta de
repetibilidade constitui em um problema relevante, pois impossibilita a validação de um
método, uma vez que confere falta de precisão. Além disso, houve alteração no formato
dos picos, como destacado com a elipse em vermelho na Figura 17, sendo que no início
havia separação dos isômeros da Lambda-Cialotrina, com picos pequenos, e, após
uma semana, houve junção dos picos.
Figura 17. Cromatogramas obtidos com a coluna Fluorofenil para ilustrar a falta de repetibilidade no tR e mudança no formato dos picos. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2:MeOH, eluição por gradiente, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
Durante aproximadamente 17 meses essas variações, muitas vezes maiores
que 10% do tR, ocorreram sem causa determinada. Foram feitos vários testes para
solucionar esse problema, aumentou-se o tempo de condicionamento da FE, reduziu-
se a temperatura da sala onde estava alocado o equipamento, foram feitas limpezas no
sistema cromatográfico, não se usou aditivos nas colunas, aumentou-se o tempo de
78
equilíbrio entre as injeções, mas nenhuma dessas medidas foi capaz de resolver este
problema.
Após uma extensa pesquisa bibliográfica foi encontrado um artigo que
relatava que a adição de uma pequena porcentagem de água ao cossolvente minimiza
essas variações no tR e no formato dos picos.123 Segundo os autores, a passagem de
metanol através da FE acarreta alteração na estrutura da sílica e formação do silil éter
é o agente responsável pela variação nos tR e modificações na seletividade da FE. Em
cromatografia líquida, esse fenômeno não é observado devido ao uso de FM aquosa.
Assim, ao se acrescentar cerca de 5% de água ao metanol em UHPSFC, é possível
deslocar para esquerda o equilíbrio de formação do silil éter que ocorre entre os silanóis
e o metanol, como mostrado na Figura 18 123, causando a regeneração dos silanóis do
suporte cromatográfico, de modo a reduzir, ou até mesmo eliminar, a falta de
repetibilidade em cromatografia com fluido supercrítico.
Figura 18. Equação química da reação entre os silanóis com o metanol com formação do silil éter, e eliminação de uma molécula de água.123
Optou-se então por adicionar 5% de água ao metanol usado como FM e
repetiram-se os testes para seleção da FE usando as colunas Fluorofenil, 2-PIC e C18.
Conforme a Figura 19 e a Figura 20, o emprego de água alterou a seletividade e
aumentou o tempo de retenção na FE de alguns analitos. Além disso, comparando-se
a Figura 19 e a Figura 16 verifica-se que com a coluna Fluorofenil houve a separação,
com boa resolução, do fenarimol e mandipropamida (sem adição de água ao
modificador orgânico eles coeluiam), porém, houve a coeluição da azoxistrobina e
difenoconazol (sem água eles estavam separados). Com a coluna 2-PIC, tornou-se
possível a separação completa de todos os agrotóxicos (o que não acontecia sem a
adição de água ao modificador). A coluna C18 forneceu a melhor separação de todos
os compostos sem o uso de água no modificador orgânico da FM, porém com a adição
de água houve coeluição da azoxistrobina e do fenarimol.
79
Figura 19. Cromatogramas obtidos na separação dos agrotóxicos estudados usando 5 % de água como aditivo da FM. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: constituída de CO2 solvente A e MeOH:H2O 95:5 (v/v) solvente B, eluição por gradiente, programação do gradiente: variação do solvente B de 0 a 20%, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20
1
2
3
45
6 e 7
8
9 10
Fluorofenil A
U
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
1
3
2 76 4
5 89
10
2-PIC
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80
1
2
3
5
4 e 6
7 78
910
C 18
80
Com o intuito de averiguar se a adição de 5% de água ao modificador
orgânico realmente era eficiente para evitar variações maiores que ±10% no tR dos
analitos, após sete dias de uso da FE avaliou-se a repetibilidade e verificou-se que não
houve variações significativas após a adição de água ao modificador orgânico da FM,
conforme mostram os resultados da Tabela 8.
Tabela 8. Avaliação da variação do tempo de retenção após sete dias de uso da FE, com adição de 5% de água ao metanol.
Pico tR dia 1 (min) tR dia 7 (min) % de variação
1 0,413 0,416 0,73
2 0,980 0,970 1,0
3 1,123 1,087 3,2
4 1,270 1,215 4,3
5 1,352 1,281 5,3
6 1,398 1,323 5,4
7 1,681 1,573 6,4
8 2,270 2,181 3,9
9 2,337 2,249 3,8
Dados obtidos empregando-se as seguintes condições cromatográficas: coluna: ACQUITY UPC2 CSH FluoroPhenyl, 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm, eluição por gradiente linear, programação do gradiente: variação MeOH:H2O 95:5 (v/v) de 0 a 20%, pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
Sendo assim, seguiram-se os testes para seleção do volume de injeção e do diluente
da amostra usando as colunas Fluorofenil, 2-PIC e C 18 e 5% de água no modificador
orgânico da FM.
81
Figura 20. Continua na página seguinte
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60
Fluorofenil
2-PIC _________ Modificador orgânico: MeOH:H2O 95:5 (v/v)
_________ Modificador orgânico: MeOH
_________ Modificador orgânico: MeOH:H2O 95:5 (v/v)
_________ Modificador orgânico: MeOH
82
Figura 20. Comparação dos cromatogramas obtidos nas colunas Fluorofenil, 2-PIC e C18 com e sem a adição de água ao modificador orgânico (solvente B) da FM. Condições cromatográficas: pressão: 1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: modificador orgânico:CO2, eluição por gradiente linear, com variação da porcentagem de modificador orgânico de 0 a 20%, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90
C 18 _________ Modificador orgânico: MeOH:H2O 95:5 (v/v)
_________ Modificador orgânico: MeOH
83
4.2 Seleção do volume de injeção em UHPSFC e do diluente
Um diluente adequado precisa ser mais fraco que a FM13, dessa forma,
como o metanol foi escolhido como modificador orgânico da FM, seguindo a série
eluotrópica, hexano, THF, ACN, IPA e o próprio metanol seriam bons candidatos a
diluentes das amostras de agrotóxicos. Dessa forma, testaram-se estes solventes no
preparo da mistura de agrotóxicos, na concentração de 0,05 mg mL-1.
A Figura 21 mostra a influência do volume de injeção utilizando a ACN
como diluente da amostra. Verifica-se que volumes de injeção muito grandes causam
distorção no formato dos picos, independente do diluente usado. Pode-se associar
isto ao efeito do solvente, em que o mesmo não é fraco o suficiente para manter os
analitos retidos na coluna. Por isso, para evitar deformações dos picos
cromatográficos, é interessante injetar sempre o menor volume possível,
considerando sempre a repetibilidade e os limites de detecção13, porém este volume
não pode ser muito baixo por se tratar de análises em níveis traços. Os resultados
obtidos confirmam a afirmação de que o volume máximo a ser injetado deve ser de
cerca de 0,1 a 0,5% do valor do volume da coluna. Dessa forma, para as colunas de
dimensão de 100 x 2,1 d.i. mm o volume de injeção deve ser de cerca de 1,73 µL e
para a coluna de 50 x 2,1 d.i. o volume é de aproximadamente 0,86 µL. Portanto,
devem ser estudados volumes de injeção próximos aos calculados.
A escolha do diluente da amostra é muito importante a fim de evitar
distorções nos picos. Desse modo, o ideal é solubilizar os analitos na própria FM.
Todavia, isso é praticamente impossível em UHPSFC, porque a FM é constituída
majoritariamente por dióxido de carbono. Uma alternativa é empregar um solvente de
força igual ou menor que a FM.124 Solventes com polaridade semelhante ao CO2
originam picos com formato adequado, porém limitam a solubilidade de alguns
compostos e evaporam com facilidade, ocasionando concentração da amostra no vial
de injeção. Uma opção para solucionar esse problema é misturar solventes polares e
apolares, contudo, isso deve ser feito com cautela para evitar problemas de
imiscibilidade entre os diluentes.13
84
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60
____ 1,0 µL
____ 1,5 µL
____ 1,0 µL
____ 2,5 µL
Figura 21. Cromatogramas da mistura de agrotóxicos estudados, na concentração de 0,05 mg mL-1, mostrando a influência do volume de injeção, usando como diluente a ACN. Coluna: ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolylamine) 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2, solvente A e MeOH:H2O 95:5 (v/v), solvente B, eluição por gradiente, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
85
Segundo Fairchild et al.124, o emprego de diluentes muito polares, como o
metanol e dimetilsulfóxido, ocasionam deformações nos picos, mesmo com pequenos
volumes de injeção, devido ao efeito do solvente forte. Tal situação pode ser vista na
Figura 22, onde são comparados os resultados adquiridos usando a mesma FE e
variando o diluente da amostra, com volume de injeção de 1,5 µL.
Figura 22. Continua na página seguinte
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
ACN
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
IPA
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
MeOH
86
fgh
Abrahamsson e Sandahl125 mostraram em seu trabalho que o diluente não
interage apenas com a amostra, mas também com a FE, dessa forma, os diluentes se
comportam de maneiras distintas em fases polares (sílica pura) e em fases apolares
(C18). Em colunas polares, o emprego de diluentes com alta constante dielétrica,
elevado momento de dipolo e capacidade de formar ligação de hidrogênio resulta em
eficiência baixa, principalmente para análise de compostos polares, visto que o
solvente minimiza as interações entre analito e grupos silanóis. Em colunas apolares,
solventes com estas características favorecem a análise. O uso de solventes
apróticos, como a acetonitrila, em diferentes FE, tem-se mostrado vantajoso, já que
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
Hexano A
U
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
THF
Figura 22. Cromatogramas da mistura de agrotóxicos estudados, na concentração de 0,05 mg mL-1, mostrando a influência da variação do diluente. Condições cromatográficas: coluna: ACQUITY UPC2 Torus 2-PIC (2-Picolylamine) 1,7 µm, 2,1 mm X 50 mm, pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2 como solvente A e MeOH:H2O 95:5 (v/v) como solvente B, eluição por gradiente, volume de injeção: 1,5 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
87
fornece bom formato de pico, permite solubilizar grande variedade de compostos e
não é retido em UHPSFC, o que não interfere nos compostos analisados.13
O volume de injeção depende diretamente do diluente e da FE. Isso pode
ser confirmado na Figura 22 e pelos dados da Tabela 9 que mostra o volume máximo
a ser injetado para cada diluente avaliado, em diferentes colunas.
Tabela 9. Volumes máximos que podem ser injetados para cada diluente avaliado.
Coluna Diluente Volume máximo que pode ser injetado
(µL)
Fluorofenil
ACN 1,0
IPA 1,0
MeOH 0,5
Hexano 1,0
THF 1,0
2-PIC
ACN 1,5
IPA 1,0
MeOH 0,5
Hexano 1,5
THF 1,5
C 18
ACN 1,5
IPA 1,0
MeOH 1,0
Hexano 1,5
THF 1,5
Assim, os volumes máximos de injeção escolhidos foram 1,5 µL para as
colunas 2-PIC e C18 e 1,0 µL para a Fluorofenil.
Quanto aos diluentes, o IPA foi descartado por permitir o volume máximo
de injeção de 1,0 uL e demandar a ressuspensão após o uso do método Quechers
O hexano, apesar de permitir a injeção do mesmo volume que a ACN, foi
rejeitado por ser muito volátil e concentrar a amostra no vial. O THF foi descartado
88
pelo fato do pico do solvente ser muito intenso independente do volume injetado. Além
disso, ele é considerado um solvente muito forte, cujo uso deve ser evitado para
preservar o sistema cromatográfico e a coluna. A ACN foi escolhida como diluente da
amostra pelas razões citadas, por ser o solvente usado na etapa de extração do
método QuEChERS e por possibilitar a injeção de um maior volume sem causar
distorções nos picos, já que para análise de compostos presentes em nível de traços
quanto maior o volume injetado melhor a detectabilidade.
4.3 Seleção da fase móvel em UHPSFC
Considerando que o uso de CO2 puro na FM permite apenas a separação
de analitos apolares, boa parte das análises é realizada utilizando um modificador
orgânico ou cossolvente, que além de permitir a resolução de compostos polares
também ajuda a melhorar a solubilidade dos analitos, evitando a precipitação dos
mesmos na coluna. Estes modificadores alteram a densidade e a polaridade da FM,
gerando picos com melhor formato e reduzindo as interações indesejadas entre os
analitos e os grupos silanóis residuais da FE.12 MeOH, etanol (EtOH), IPA, ACN e THF
são os modificadores de alta a média força de eluição mais empregados em UHPSFC.
No entanto, é preferível, quando possível, que etanol seja escolhido como
modificador, uma vez que este é considerado um solvente que pode ser obtido de
fontes renováveis e é menos tóxico para o analista quando comparado aos
demais.69,126
Como a FM de partida era constituída de CO2 como solvente A e
MeOH:H2O 95:5 (v/v) como solvente B, esta foi usada para comparação com as
demais FM estudadas. Na Figura 23 podem ser visualizados os cromatogramas que
mostram a influência do modificador orgânico utilizado na fase móvel.
89
Figura 23. Continua na página seguinte. A) Coluna Fluorofenil.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60
____ MeOH:H2O
____ ACN
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40
____ MeOH:H2O
____ EtOH:H2O
A)
90
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
Figura 23. Continua na página seguinte. B) Coluna 2-PIC
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80
____ MeOH:H2O
____ ACN
B)
____ MeOH:H2O
____ EtOH:H2O
91
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60
____ MeOH:H2O
____ ACN
C)
____ MeOH:H2O
____ EtOH:H2O
Figura 23. Cromatogramas mostrando as mudanças na retenção e na seletividade quando se altera o modificador orgânico utilizado na fase móvel. Diluente da amostra: ACN. A) coluna Fluorofenil. B) coluna 2-PIC. C) coluna C18. Condições cromatográficas: pressão:1500 psi, temperatura: 40 °C, FM: CO2,solvente A e modificador orgânico:H2O (95:5 v/v), solvente B, eluição por gradiente linear (0 a 20% de solvente B), vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm.
92
Analisando a Figura 23, verifica-se que a seletividade e a retenção foram
alteradas pela mudança do modificador orgânico usado na FM. Apesar de se ter
vantagens no uso de ACN como diluente da amostra, o mesmo quando empregado
como cossolvente apresentou os piores resultados (Figura 23-A e Figura 23-C), que
são corroborados pelos picos com cauda e pela incapacidade de separar a mistura
contendo os 10 analitos de interesse. Isso pode ser explicado pelo fato da ACN ser
um solvente aprótico dipolar (doa pares de elétrons)127, que gera forças direcionais
muito mais fracas que de solventes próticos. Dessa maneira, solventes apróticos
dipolares, neste caso, são incapazes de eluir os analitos apolares que interagem
fortemente com as FE que também são apolares. Na Figura 23-B, a ACN não mostrou
desempenho cromatográfico tão insatisfatório, porque foi capaz de eluir, mesmo com
cauda, analitos apolares. Isso demonstra que dependendo da polaridade da FE usada
e dos analitos a serem separados, a ACN pode fornecer bons resultados.
Para a mistura de agrotóxicos estudada, o uso de álcoois, que são
solventes próticos, altamente polares e com capacidade de formar ligação de
hidrogênio, como modificadores orgânicos, mostrou-se bastante satisfatório,
independente da FE empregada. Os resultados (Figura 23) revelaram ainda que é
possível substituir metanol por etanol, o que é interessante, por se tratar de um
solvente ambientalmente correto.69 Sendo assim, o etanol foi escolhido como
modificador orgânico da FM.
4.4 Planejamento experimental em UHPSFC
O planejamento experimental é uma ferramenta usada para verificar e
quantificar o efeito conjunto de algumas variáveis (fatores) passíveis de serem
controladas sobre uma resposta de interesse.14
No planejamento fatorial 24 com Ponto Central, foram consideradas as
seguintes respostas: fatores de retenção (k), na forma de log k128, resolução (Rs) e
fator de separação () entre os pares críticos atrazina/fluopicolida,
fenarimol/madipropamide e difenoconazol/azoxistrobina e assimetria dos compostos
clorantraniliprole, tiametoxan e imidacloprido.
93
Os efeitos significativos foram selecionados com base no gráfico de
probabilidade Normal e incluídos no modelo obtido por regressão linear múltipla, os
quais podem ser representados, de uma maneira geral, pela Equação 6. Vale
ressaltar que foram incluídos nos modelos apenas os coeficientes significativos e
aqueles necessários para manter a hierarquia, ou seja, nem todos os modelos
apresentaram todos os coeficientes mostrados na Equação 6.
43211234432234
431134421124321123433442243223
4114311321124433221104321 ),,,(ˆ
xxxxbxxxb
xxxbxxxbxxxbxxbxxbxxb
xxbxxbxxbxbxbxbxbbxxxxy
(6)
onde bi representa os coeficientes correspondentes aos efeitos dos fatores e bij, bijk e
bijkl os efeitos de interação binária, terciária e quaternária, respectivamente.
4.4.1 Resultados para a modelagem dos fatores de retenção
Os modelos construídos com os efeitos selecionados foram avaliados
empregando-se Análise da Variância (ANOVA), quanto à significância de regressão,
sendo que todos os modelos apresentaram regressão significativa, ou seja, a
alteração dos fatores experimentais acarreta de fato uma alteração nas respostas
estudadas.
Os fatores significativos foram identificados por meio do gráfico de
Probabilidade Normal.
São mostrados nas Figura 24, Figura 25 e Figura 26 os gráficos de
probabilidade Normal para a modelagem de retenção de três analitos: um composto
pouco retido (lambda-cialotrina), um com retenção intermediária (mandipropamida) e
um composto mais retido (imidacloprido).
94
Figura 24. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico lambda-cialotrina.
Figura 25. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico mandipropamida.
95
Figura 26. Gráfico de probabilidade normal para o agrotóxico imidacloprido.
No gráfico de Probabilidade Normal dos Efeitos, quanto mais longe da reta
centrada em zero mais significativo é o efeito. Desta maneira, como é possível
observar nas Figuras 24 a 26 para alguns analitos, apenas os efeitos principais foram
significativos, enquanto para outros as interações também se apresentaram
significativas, o que justifica o uso de métodos de planejamento experimental para a
otimização do sistema.
De uma maneira geral, o modificador orgânico apresentou um efeito
negativo, ou seja, diminui a retenção quando se aumenta a sua quantidade na fase
móvel (isso decorre do fato de que o modificador orgânico em grande quantidade
recobre os silanóis residuais reduzindo a energia de interação com os analitos e,
consequentemente, diminui a retenção), a temperatura apresentou um efeito positivo,
ou seja, a retenção é aumentada quando a temperatura é elevada (como em altas
temperaturas existe aproximação do estado gasoso, a densidade da FM é pequena,
o que reduz a solubilidade dos analitos e aumenta sua retenção na FE) e a pressão
apresentou um efeito negativo, ou seja, diminui a retenção, pois ao se elevar a pressão
mantendo a temperatura constante o fluído se torna mais denso e tende a favorecer
96
a solubilidade dos analitos na FM. Foi observado também que a fase estacionária
afetou de forma muito significativa a retenção da maioria dos compostos, devido à
alteração de seletividade.
A capacidade de previsão dos modelos foi avaliada pelos gráficos de
valores previstos vs valores reais, gráfico de resíduos e ajuste dos pontos às
superfícies de resposta. Tais gráficos servem para demonstrar a qualidade das
previsões e do ajuste na regressão. As Figuras 27 e 28 mostram, respectivamente,
os gráficos de valores previstos vs valores reais e os gráficos de resíduos para o
analito mandipropamida, de retenção intermediária, de forma a ilustrar como foi
realizada a avaliação dos modelos. De acordo com estas figuras o modelo tem boa
capacidade preditiva, além disso os resíduos apresentam uma distribuição aleatória
próxima do zero, o que demonstra ajuste do modelo e confirma que as previsões
realizadas pelo mesmo estimarão os coeficientes com variância mínima e
constante.129
Figura 27. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico mandipropamida.
97
Figura 28. Gráficos de resíduos padronizados para o analito mandipropamida: A) gráfico de valores previstos vs resíduos padronizados e B) gráfico de experimento vs resíduos padronizados.
A Figura 29 mostra as superfícies de resposta para a retenção deste
analito em função das diversas variáveis experimentais.
A)
B)
98
A) Etanol: 15 %
Coluna 2-PIC
B) Etanol: 25 %
Coluna 2-PIC
C) Etanol: 15 %
Coluna Fluorofenil
D) Etanol: 25 %
Coluna Fluorofenil
Figura 29. Superfícies de resposta para a retenção do agrotóxico mandipropamida em função da temperatura, pressão, modificador orgânico e FE.
99
Comparando-se os gráficos A e B da Figura 29 é possível verificar que
conforme a porcentagem de modificador aumenta a retenção diminui, conforme já
discutido. Pela comparação dos gráficos A e C e de B e D da Figura 29 pode-se
verificar que também existe alteração na retenção causada pela mudança de fase
estacionária.
Resultados para resolução
Da mesma maneira que para a retenção dos analitos, também foram
construídos modelos para descrever a separação dos mesmos, por meio dos valores
de Resolução e Fator de Separação (α) dos pares críticos. A Análise da Variância
apresentou regressão significativa para todos os modelos. Os gráficos de valores
previstos vs valores reais são mostrados nas Figuras 30 a 33.
Figura 30. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par atrazina e fluopicolida.
100
Figura 31. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par fenarimol e azoxistrobina.
Figura 32. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par fenarimol e mandipropamida.
101
Figura 33. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para resolução do par difenoconazol e azoxistrobina.
Os modelos para resolução apresentaram melhor ajuste do que aqueles
construídos com os fatores de separação (α) e, por este motivo os últimos não serão
mostrados. Após a avaliação dos modelos para a resolução dos pares críticos, foi
adotado o procedimento de otimização simultânea de mais de uma resposta, por meio
da sobreposição dos mapas de contorno e funções de desejabilidade de Derringer e
Suich para encontrar a condição experimental que levasse à separação necessária.
O procedimento de sobreposição de mapas de contorno baseia-se na
delimitação de regiões aceitáveis para cada resposta e na intersecção destas regiões
para todas as respostas de modo a gerar um mapa que indique as condições
experimentais que satisfaçam todas as respostas. Dependendo do objetivo do
experimento e do comportamento das respostas pode não ser possível encontrar uma
região comum. O procedimento de Derringer e Suich envolve o conceito de
desejabilidade para a otimização simultânea de várias respostas.130 Cada resposta yi
tem associado um valor de desejabilidade parcial, di. Este valor varia de 0 a 1 de
acordo com a proximidade com o valor desejado da resposta. Primeiramente o valor
de cada resposta é calculado a cada ponto do domínio experimental através das
equações dos modelos. Então, se empregando funções pré-determinadas de acordo
102
com o objetivo do experimento (maximização/minimização/região aceitável, alvo, etc)
o valor de desejabilidade parcial é calculado para todos os pontos do domínio
experimental. Finalmente, os valores individuais de desejabilidade são combinados
em uma função de desejabilidade global (D) através da média geométrica e o
problema torna-se então maximizar este número. É importante ressaltar que todo o
procedimento de busca do ótimo é realizado empregando-se as equações dos
modelos construídos para cada uma das respostas e, desta maneira, é importante que
eles tenham sido obtidos através de um planejamento estatisticamente fundamentado
e que tenham sido avaliados quanto à significância de regressão e falta de ajuste.
O gráfico de sobreposição é mostrado na Figura 34. Neste gráfico, a área
em cinza indica que a resolução simultânea de todos os pares de compostos não foi
alcançada. A região em amarelo indica que a resolução simultânea foi alcançada,
empregando as condições experimentais que delimitam a região. É possível verificar
que na coluna Fluorofenil não existe nenhuma condição que leve à separação
completa de todos os analitos. Na coluna 2-PIC, não existe uma região em amarelo
quando se trabalha a 25 ºC, e esta região aumenta conforme se aumenta a
temperatura, alcançando-se uma região ampla a 50 ºC e abaixo de 1900 psi. Dentro
desta região, a porcentagem final do modificador não causa diminuição da resolução
para valores inferiores a 2 e, portanto, pode ser considerada uma região robusta de
trabalho. A Tabela 10 mostra os valores previstos para o modelo vs valores obtidos
experimentalmente para dois pontos dentro da região amarela.
Tabela 10. Valores previstos para o modelo vs valores obtidos experimentalmente para dois pontos dentro da região amarela da Figura 34-B, para a coluna 2-PIC.
15% EtOH
1500 psi
25% EtOH
1500 psi
Resolução Previsto Experimental Previsto Experimental
Atrazina/fluopicolida 3,05 2,99 2,95 3,44
Fenarimol/azoxistrobina 2,25 2,16 2,37 2,34
Fenarimol/mandipropamide 4,91 5,14 4,02 4,24
Difenoconazol/azoxistrobina 4,46 4,41 4,17 4,13
103
A) Fluorofenil
B) 2-PIC
Figura 34. Gráficos de sobreposição. Resolução simultânea para os pares fenarimol e mandipropamida e atrazina e fluopicolida. A) Coluna Fluorofenil com variação da temperatura de 25 para 50 °C. B) Coluna 2-PIC com variação da temperatura de 25 para 50 °C.
25 °C
25 °C
50 °C
50 °C
104
As Figura 35 e 36 mostram as superfícies de desejabilidade, considerando
igual aceitação para a região compreendida entre resolução mínima de 2 e o maior
valor de resolução observado para cada par de compostos. Nestas figuras pode-se
inferir que para a coluna 2-PIC, com o aumento da temperatura para região de
aproximadamente 50 °C é possível alcançar separação com resolução maior que 2
para os pares críticos. Já para a coluna Fluorofenil, Figura 36, independentemente de
mudanças no fator temperatura, por exemplo, não é possível separação completa dos
pares críticos com resolução igual ou acima do determinado.
Figura 35. Superfícies de desejabilidade para a região compreendida entre resolução mínima de 2 e o maior valor de resolução observado para cada par de compostos na coluna 2-PIC. A) 25 °C. B) 50 °C.
A)
B)
105
A Figura 37 mostra as superfícies de resposta para a resolução dos quatro
pares de compostos na coluna 2-PIC, com temperatura de 50 °C, ilustrando que de
fato a resolução > 2 foi alcançada nestas condições.
Figura 36. Superfícies de desejabilidade para a região compreendida entre resolução mínima de 2 e o maior valor de resolução observado para cada par de compostos na coluna Flourfenil. A) 25 °C. B) 50 °C
106
4.4.2 Assimetria
Também se avaliou o parâmetro assimetria. Para isso foi considerado o
limite de até 1,25, que é um valor onde o Design Space não muda e existe assimetria
aceitável para os compostos clorantraniliprol e Imidacloprido, cujos valores reais
concordam com os previstos pelo modelo, como mostram as Figuras 38 e 39. Para o
tiametoxam a regressão não é significativa, de modo que ao variar dos fatores do
planejamento a assimetria não é afetada.
Figura 37. Superfícies de resposta para a resolução dos quatro pares críticos na coluna 2-PIC, com temperatura de 50 °C e resolução maior que 2.
107
Figura 38. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico clorantraniliprol.
Figura 39. Gráfico de valores previstos pelo modelo vs valores reais para o agrotóxico Imidacloprido.
108
A Tabela 11 mostra os valores previstos para o modelo vs valores obtidos
experimentalmente para assimetria dos compostos clorantraniliprol e imidiclorido para
dois pontos dentro da região amarela da Figura 34-B.
Tabela 11. Valores de assimetria previstos para o modelo vs valores obtidos experimentalmente para dois pontos dentro da região amarela da Figura 34-B, para a coluna 2-PIC.
15% EtOH
1500 psi
25% EtOH
1500 psi
Fator de assimetria Previsto Experimental Previsto Experimental
Clorantraniliprol 1,21 1,20 1,20 1,20
Imidacloprido 1,12 1,10 1,19 1,18
Após a avaliação das respostas do planejamento experimental observa-se,
na Figura 40, o cromatograma com a separação completa dos analitos estudados.
Desta forma, está condição foi usada para a validação do método em UHPSFC.
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60
2
3
7
6 4
5
8
9 10
1
Figura 40. Cromatograma obtido na melhor condição de separação fornecida pelo planejamento experimental, na separação da mistura de agrotóxicos estudados, na concentração de 0,05 mg mL-1. Condições cromatográficas: diluente da amostra: ACN, coluna: 2-PIC, pressão:1500 psi, temperatura: 50 °C, FM: CO2 como solvente A e EtOH:H2O 95:5 (v/v) como solvente B, eluição por gradiente com variação do solvente B de 0 a 25%, volume de injeção: 1,5 µL, vazão: 1,5 mL min-1. Detecção UV: 220 nm. 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido.
109
4.5 Separação dos agrotóxicos usando UHPLC
Com o intuito de verificar a potencialidade da técnica de UHPSFC, buscou-
se desenvolver um método de separação empregando a técnica de UHPLC, que
contemplasse as mesmas condições de análise, ou seja, o mesmo diluente da
amostra, o mesmo modificador orgânico e temperaturas de coluna próximas. Em
cromatografia líquida, os modificadores orgânicos mais utilizados são MeOH e ACN,
devido às suas altas purezas, disponibilidades comerciais e baixas viscosidades
quando misturados com a água. Todavia, outros solventes, como o EtOH, merecem
destaque e utilização como modificadores, porque são menos tóxicos e podem
promover separações eficientes e com boa resolução para diversos compostos.
Na Figura 41 podem ser visualizados os cromatogramas obtidos usando a
UHPLC e etanol como modificador orgânico. Observando-se esta figura verifica-se,
em ambas FE utilizadas, uma inversão na ordem de eluição de alguns picos em
relação às análises realizadas empregando UHPSFC. Além disso, empregando o
mesmo programa de gradiente, a coluna Fluorofenil apresentou um desempenho
cromatográfico superior ao da coluna C18, com resolução maior que 1,5 para todos
os agrotóxicos.
Em cromatografia líquida, tanto em fase normal quanto em fase reversa, é
possível prever a ordem de eluição dos compostos analisando os valores do log P, de
modo que quanto mais polar for o analito mais retido ele será em uma FE polar.
Entretanto, analisando a ordem de eluição dos agrotóxicos em UHPSFC, observa-se,
em todas as FE testadas, um comportamento contrário ao da CL. Em UHPSFC ocorre
primeiramente a separação dos compostos apolares, que provavelmente interagem
de maneira mais intensa com a FM rica em CO2, do que com a FE, seguida pela
separação dos agrotóxicos mais polares, capazes de interagir fortemente com a FE,
possivelmente devido à presença dos grupos silanóis residuais, demandando o
aumento da polaridade da FM para serem eluídos. Apesar de os agrotóxicos apolares
terem ficado menos retidos nas colunas testadas do que os polares, em UHPSFC não
é trivial determinar a ordem de eluição com base no log P (valores mostrados na
Tabela 5) da mesma maneira que em Cromatografia Líquida, visto que na
cromatografia com fluido supercrítico a separação é influenciada, principalmente, pela
110
densidade da FM, interações dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio resultantes da
interação do cossolvente na FM com os analitos e com a FE.83
Figura 41. Cromatogramas obtidos na separação dos agrotóxicos estudados empregando UHPLC e 2 tipos de colunas, fluorofenil e C18 com variação de porcentagem de etanol de 15 a 70%. Condições cromatográficas: temperatura: 40 °C, FM: água como solvente A e etanol como solvente B, eluição por gradiente com variação da porcentagem do solvente B (etanol) de 15 a 70% de 0 a 10 minutos, volume de injeção: 1,0 µL, vazão: 0,3 mL min-1. Solvente de injeção: ACN. Detecção em 220 nm. 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido
Como a coluna Fluorofenil se mostrou mais adequada para a separação
dos 10 agrotóxicos, foram avaliados os volumes de injeção que poderiam ser
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
9 10
3
8
6
27
14
5
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
9 10
3
6
8 5
71
2 e 4
Fluorofenil
C18
111
utilizados e, baseado nos resultados obtidos, verificou-se que 1,2 µL é o volume
máximo que pode ser injetado na coluna sem causar distorção dos picos.
De modo geral, a técnica de UHPLC comprovou ser apta a empregar
modificadores orgânicos de baixa toxicidade e proporcionou uma excelente separação
para os compostos selecionados. No entanto, quando comparada com a técnica de
UHPSFC, a UHPLC apresentou maior tempo análise, praticamente o triplo, e gerou
volumes de resíduos maiores.
4.6 Extração dos agrotóxicos da alface usando o método QuEChERS
O método de extração descrito por Konatu21,116 e empregado no preparo
das amostras de alface apresentou um fator de concentração de 10 vezes, o que
possibilitou a quantificação dos resíduos de agrotóxicos em concentrações iguais ou
abaixo do LMR permitido.
Após a aplicação do método de extração, avaliou-se a seletividade do
mesmo em UHPSFC-DAD e UHPLC-DAD, a partir da comparação do cromatograma
obtido para uma amostra de alface fortificada com os 10 agrotóxicos estudados com
o do extrato da matriz isenta dos analitos (amostra branco).
Examinando os cromatogramas obtidos por UHPSFC (Figura 42), nota-se
a eluição de interferentes nos tempos de retenção da Lambda-Cialotrina, Fenarimol e
Clorantraniliprol. Para UHPLC (Figura 43), observa-se a eluição de interferentes no
tempo de retenção da Atrazina e também da Lambda-Cialotrina. Essa diferença de
interferentes em UHPSFC e UHPLC pode ser explica pela inversão na ordem de
eluição que ocorreu, de modo que em UHPSFC primeiramente eluiram os analitos
apolares e em UHPLC com fase reversa (FR) foi o contrário. Apesar do método
propiciar a extração de todos os analitos estudados e gerar extratos relativamente
limpos, o mesmo não foi capaz de eliminar completamente a interferência da matriz.
Sendo assim, os analitos Lambda-Cialotrina, Fenarimol e Clorantraniliprol
e Lambda-Cialotrina e Atrazina, analisados respectivamente por UHPSFC e UHPLC,
foram excluídos da etapa de avaliação do efeito matriz e validação do método, por
apresentarem interferências, oriundas da matriz, superiores a 30%.
112
AU
-0.06
-0.04
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Minutes
0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
1*
2
3 7
2 4*5
8* 910
A)
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Minutes
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
B)
Figura 42. UHPSFC-DAD. A) ____ Cromatogramas dos extratos do método de extração QuEChERS Citrato, obtidos usando UHPSFC-DAD. ____ Cromatograma da mistura de agrotóxicos em solvente. B) Extrato da matriz isenta de agrotóxicos (branco de referência). Condições cromatográficas semelhantes à Figura 40. Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. λ = 220 nm. (*) Interferente.
113
AU
-0.10
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Minutes
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50
9 10
3*
8
6 4
5 2
7 1*
A)
AU
-0.08
-0.06
-0.04
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
B)
Figura 43. UHPLC-DAD. A) ____ Cromatogramas dos extratos do método de extração QuEChERS Citrato, obtidos usando UHPSFC-DAD. ____ Cromatograma da mistura de agrotóxicos em solvente. B) Extrato da matriz isenta de agrotóxicos (branco de referência). Condições cromatográficas semelhantes à Figura 41. Identificação dos picos: 1. Lambda-Cialotrina, 2. Fluopicolida, 3. Atrazina, 4. Fenarimol, 5. Mandipropamida, 6. Azoxistrobina, 7. Difenoconazol, 8. Clorantraniliprole, 9. Tiametoxam e 10. Imidacloprido. λ = 220 nm. (*) Interferente.
114
4.7 Efeito Matriz
Posteriormente à etapa de otimização dos métodos empregando UHPSFC-
DAD e UHPLC-DAD, realizou-se a avaliação do efeito matriz. Obtiveram-se os valores
do efeito matriz (%) baseados na comparação das inclinações das curvas analíticas
dos analitos (Equação 2), construídas em cinco níveis de concentração, em solvente
e no extrato da matriz (branco fortificado).
4.7.1 Efeito matriz em UHPSFC-DAD
Conforme mostrado no gráfico da Figura 44, como os valores foram
inferiores a ±20%131 o efeito matriz pode ser considerado irrelevante.
Figura 44. Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS Citrato para extração dos agrotóxicos em cultura de alface, utilizando UHPSFC-DAD. 1. Atrazina; 2. Azoxistrobina; 3. Difenoconazol; 4. Fluopicolida; 5. Imidacloprido; 6. Mandipropamida e 7. Tiametoxam.
Ao se observar a sobreposição das curvas analíticas obtidas no solvente e
na matriz (Figura 45), percebe-se o efeito matriz em UHPSFC não foi relevante,
porém, as quantificações foram feitas com superposição na matriz, já que se usaram
as mesmas amostras em UHPLC.
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Efe
ito
Mat
riz
(%)
Agrotóxicos
1 2 3 4 5 6
1
7
115
Figura 45. Continua na página seguinte
y = 72771x - 1758,5R² = 0,9999
y = 72929x + 6720,6R² = 0,9992
0
20000
40000
60000
80000
100000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Atrazina
y = 23244x - 149,93R² = 0,9977
y = 22331x + 416,07R² = 0,9968
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Difenoconazol
y = 37190x - 862,67R² = 0,999
y = 38046x - 284,87R² = 0,9987
5000
15000
25000
35000
45000
55000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Imidacloprida
y = 34773x - 1271,5R² = 0,9997
y = 32568x + 4883,1R² = 0,9825
0
12000
24000
36000
48000
60000
0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Azoxistrobina
y = 18320x - 429,13R² = 0,9994
y = 17748x - 922,6R² = 0,9997
0
5000
10000
15000
20000
25000
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Fluopicolida
y = 18189x - 808,2R² = 0,9999
y = 17285x + 1675,2R² = 0,9867
0
5000
10000
15000
20000
25000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Mandipropamida
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
116
Figura 45. Efeito matriz dos analitos utilizando a UHPSFC-DAD. Curvas analíticas construídas a partir de soluções padrão de agrotóxicos no extrato da matriz e em solvente.
4.7.2 Efeito matriz em UHPLC-DAD
Para o UHPLC-DAD, os valores de efeito matriz também ficaram abaixo de
±20% (Figura 46), todavia foram mais pronunciados que em UHPSFC-DAD para os
compostos Azoxistrobina e Fenarimol.
Figura 46. Percentual do efeito matriz (%) empregando QuEChERS Citrato para extração dos agrotóxicos em cultura de alface utilizando UHPLC-DAD. 1. Azoxistrobina; 2. Clorantraniliprol; 3. Difenoconazol; 4. Fenarimol; 5. Fluopicolida; 6. Imidacloprido; 7. Mandipropamida e 8. Tiametoxam.
y = 22153x - 716,53R² = 0,9984
y = 24272x + 3735,5R² = 0,9981
500
8500
16500
24500
32500
40500
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Tiametoxam
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Efe
ito
Mat
riz
(%)
Agrotóxicos
Solvente
Matriz
1 2 3 4 5 6 7 8
117
Analisando a sobreposição das curvas analíticas obtidas no solvente e na
matriz (Figura 47), percebe-se que as curvas dos analitos Azoxistrobina, Fenarimol e
Imidacloprida se cruzam.
Figura 47. Continua na página seguinte
y = 179934x - 5511,7R² = 0,9992
y = 204305x - 18493R² = 0,9945
0
50000
100000
150000
200000
250000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Azoxistrobina
y = 125464x - 2631,4R² = 0,9998
y = 128729x + 4444,5R² = 0,9818
0
30000
60000
90000
120000
150000
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Difenoconazol
Solvente
Matriz
y = 21046x - 676,4R² = 0,9987
y = 22753x - 1920,9R² = 0,9926
0
6000
12000
18000
24000
30000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Fluopicolida
y = 180357x - 644,29R² = 0,9994
y = 197318x - 1928,5R² = 0,9944
0
35000
70000
105000
140000
175000
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Imidacloprida
y = 111596x - 1703,9R² = 0,9996
y = 115006x - 3950,8R² = 0,9905
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Clorantraniliprol
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
y = 34330x - 722,6R² = 0,9996
y = 39796x - 1359,3R² = 0,9848
0
12000
24000
36000
48000
60000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Fenarimol
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
Solvente
Matriz
118
O cruzamento das retas confirma a existência de efeito matriz21 que foi
muito mais pronunciado em UHPLC-DAD que em UHPSFC-DAD, que leva a crer que
tal efeito não depende apenas do detector empregado (apesar de existirem poucos
estudos, sabe-se que não apenas o detector pode causar efeito matriz), mas também
da técnica cromatográfica empregada, da coluna e/ou das conexões entre coluna e
detector.132, 133
Apesar dos valores de efeito matriz tanto em UHPSFC como em UHPLC,
terem sido inferiores a ±20%131, decidiu-se realizar a quantificação dos agrotóxicos
usando o método por superposição da matriz em ambas as técnicas cromatográficas,
para maior confiabilidade nos resultados, uma vez que para três agrotóxicos em
UHPLC ocorreu o cruzamento das suas curvas analíticas feitas em solvente e na
matriz.
4.8 Quantificação e Validação dos Métodos
Os métodos de separação multirresíduos para quantificação de alguns
agrotóxicos aplicados na cultura da alface, empregando UHPSFC-DAD e a UHPLC-
DAD foram validados de acordo com os parâmetros sugeridos pelo guia internacional
de validação SANTE/11945/2015.115 Nesta etapa, avaliaram-se os parâmetros
y = 84720x - 642,6R² = 0,9996
y = 81136x + 23746R² = 0,9858
0
30000
60000
90000
120000
150000
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Tiametoxam
y = 20354x - 318,47R² = 0,9995
y = 20545x - 3795R² = 0,9924
0
6000
12000
18000
24000
30000
0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Áre
a
Concentração (mg kg-1)
Mandipropamida
Solvente
Matriz Solvente
Matriz
Figura 47. Efeito matriz dos analitos utilizando UHPLC-DAD. Curvas analíticas construídas a partir de soluções padrão de agrotóxicos no extrato da matriz e em solvente.
119
seletividade, linearidade, limite de quantificação (LQ), exatidão (dada em termos de
recuperação) e precisão (repetibilidade e precisão intermediária).
A seletividade foi avaliada em ambos os métodos, pela comparação dos
cromatogramas obtidos após análises da amostra branca de alface, da amostra
fortificada, dos analitos no solvente, da FM e do solvente de injeção.
Para UHPSFC-DAD, a presença de interferentes (Figura 42) com
intensidade superior a 30% ao LQ ocasionou a exclusão dos analitos Clorantraniliprol,
Fenarimol e Lambda-Cialotrina do processo de validação. Para os demais agrotóxicos
estudados não se observou interferência significativa, usando para detecção o
comprimento de onda de 220 nm. Todavia, o método para Imidacloprido foi validado
em 270 nm, uma vez que este comprimento de onda corresponde ao de maior
absorção.
Para UHPLC-DAD observou-se a presença de interferentes originários da
matriz no mesmo tempo de retenção dos agrotóxicos Atrazina e Lambda-Cialotrina
(Figura 43). Além disso, quando se injeta apenas FM percebe-se entre o tempo de
6,5 a 7,5 minutos um pico alargado, em 220 nm, com uma absorção igual ou maior
que a dos analitos que eluem neste tR, como mostra a Figura 48. Como em
comprimentos de onda maiores que 240 nm não se observou tal acontecimento, os
métodos para Fenarimol e Mandipropamida foram validados empregando-se o
comprimento de onda de 240 nm, e para Fluopicolida em 270 nm. Por uma maior
detectabilidade, Imidacloprido e Tiametoxam foram validados usando os
comprimentos de onda de 270 nm e 210 nm, respectivamente.
120
Figura 48. Cromatograma da FM usando UHPLC-DAD na avaliação da seletividade. Condições cromatográficas idênticas a da Figura 41.
A Tabela 12 e a Tabela 13 apresentam os resultados obtidos na validação
dos métodos desenvolvidos empregando UHPSFC e UHPLC, respectivamente.
Tabela 12. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido utilizando UHPSFC-DAD
Exatidão RRepetividade
Precisão
intermediária
Agrotóxicos
Faixa
linear* (mg
kg-1) Recuperação (%) CV (%) CV (%) r
Nível 1 Nível 2 Nível 3 Nível 2 Nível 2
Atrazina 0,2 -1,0 86 91 100 4 5 1,000
Azoxistrobina 0,6 - 1,5 111 122 118 3 11 0,991
Difenoconazol 0,4 - 1,2 84 91 84 8 4 0,998
Fluopicolida 0,4 - 1,2 106 114 112 6 12 1,000
Imidacloprido 0,4 - 1,2 100 112 109 4 7 0,999
Mandipropamida 0,4 - 1,2 88 102 103 4 4 0,993
Tiametoxam 0,4 - 1,2 72 82 87 5 8 0,999
*curvas analíticas obtidas por padronização externa com superposição da matriz
AU
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
121
Tabela 13. Resultados dos parâmetros de validação do método desenvolvido utilizando UHPLC-DAD
Exatidão RRepetividade
Precisão
intermediária
Agrotóxicos
Faixa
linear* (mg
kg-1) Recuperação (%) CV (%) CV (%) r
Nível 1 Nível 2 Nível 3 Nível 2 Nível 2
Azoxistrobina 0,4 - 1,2 96 101 100 1 8 0,997
Clorantraniliprole 0,2 - 1,0 92 100 97 3 3 0,995
Difenoconazol 0,2 - 1,0 127 111 123 3 5 0,991
Fenarimol 0,4 - 1,2 76 79 77 5 6 0,992
Fluopicolida 0,4 - 1,2 88 93 93 3 5 0,996
Imidacloprido 0,1 - 0,8 94 104 104 3 3 0,997
Mandipropamide 0,4 - 1,2 105 104 99 2 3 0,996
Tiametoxam 0,4 - 1,2 140 94 115 5 3 0,993
*curvas analíticas obtidas por padronização externa com superposição da matriz
Nas Tabelas 12 e 13, o LQ equivale ao limite inferior da faixa linear. Os
níveis 1, 2 e 3 correspondem a fortificações no nível baixo, 0,8 mg kg-1, médio, 1,0 mg
kg-1 e alto, 1,1 mg kg-1.
Analisando a Tabela 12 e a Tabela 13 tem-se que as curvas analíticas para
cada analito foram lineares na faixa de concentração de 0,2-1,5 mg kg-1 (UHPSFC) e
de 0,1-1,2 mg kg-1 (UHPLC), com coeficientes de correlação na faixa de 0,991-1,000
para UHPSFC e 0,991-0,997 para UHPLC. As recuperações médias obtidas nos três
níveis de fortificação foram 72-122% para UHPSFC e 76-140% para UHPLC, com CV
<20% para precisão em ambas as técnicas.
Também foram feitos os cálculos dos resíduos estatísticos para as curvas
analíticas obtidas para os agrotóxicos avaliados por UHPSFC e UHPLC. Como
exemplificado na Figura 49 para o Mandipropamida, os resíduos estão distribuídos
aleatoriamente em torno do zero e com erro relativo menor que ±20%.131
122
Figura 49. Gráfico dos resíduos estatísticos, apresentado em termos de erros relativos, para o agrotóxico Mandipropamida.
A equação da reta das curvas analíticas empregadas e os valores de erro
relativo para todos os analitos avaliados por UHPSFC e UHPLC estão mostrados na
Tabela 14 e na Tabela 15.
Tabela 14. Equação da reta das curvas analíticas para os agrotóxicos estudados usando UHPSFC-DAD e valores dos erros relativos (%) obtidos através dos cálculos dos resíduos estatísticos.
Agrotóxicos Equação da reta Erro Relativo (%)
Atrazina y = 7292850,0x + 6720,6 -2,1 a 1,4
Azoxistrobina y = 3256771,9x + 4883,2 -7,3 a 3,5
Difenoconazol y = 2233100,0x + 416,1 -3,3 a 1,9
Fluopicolida y = 1774816, 7x - 922,6 -1,4 a 0,7
Imidacloprido y = 3804600,0x - 284,9 -2,6 a 2,2
Mandipropamida y = 1728516,7x + 1.675,2 -7,7 a 4,1
Tiametoxam y = 2427200,0x + 3735,5 -2,6 a 1,1
-10
-5
0
5
10
15
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Err
o R
ela
tivo (
%)
Concentração (mg kg-1)
123
Tabela 15. Equação da reta das curvas analíticas para os agrotóxicos estudados usando UHPLC-DAD e valores dos erros relativos (%) obtidos através dos cálculos de resíduos estatísticos.
Agrotóxicos Equação da reta Erro Relativo (%)
Azoxistrobina y = 20430450,0x - 18493,4 -3,7 a 4,1
Clorantraniliprole y = 11500600,0x - 3950,8 -9,0 a 15,0
Difenoconazol y = 12872850,0x + 4444,5 -12,6 a 8,1
Fenarimol y = 3979550,0x - 1359,3 -6,6 a 7,2
Fluopicolida y = 2275333,3x - 1920,9 -4,7 a 4,5
Imidacloprido y = 19731778,5x - 1928,5 -4,8 a 9,7
Mandipropamide y = 2054450,0x - 3795,0 -8,3 a 12,9
Tiametoxam y = 8113566,7x + 23745,7 -7,1 a 4,1
De modo geral, o uso do método QuEChERS Citrato com as condições
descritas por Konatu21,116 permitiu, tanto usando UHPSFC como UHPLC, a obtenção
de limites de quantificação abaixo do LMR para todos os agrotóxicos estudados que
tinham estes valores estabelecidos.
4.9 Aplicação do método desenvolvido em amostras de alface
O método desenvolvido foi utilizado para investigar a ocorrência de
agrotóxicos em cinco amostras de alface (duas cultivadas em solo e três cultivadas
em hidroponia) compradas nos mercados de Campinas/São Paulo.
Nas amostras de alface cultivadas no solo, nenhum dos analitos analisados
foi detectado. Já nas alfaces provenientes de cultura hidropônica, resíduo do
agrotóxico Imidacloprido foi detectado em apenas uma amostra e nas outras duas
amostras, os resíduos de Imidacloprido foram determinados na faixa de 0,8 a 2,6 mg
kg-1, que está acima do LMR de 0,5 mg kg-1, permitido para este agrotóxico.
124
5. CONCLUSÃO
A avaliação da potencialidade da Cromatografia com Fluido Supercrítico de
Ultra Alta Eficiência para quantificação multirresíduo de agrotóxicos aplicados à alface
foi feita comparando-se o método desenvolvido e validado por UHPSFC com aquele
desenvolvido por UHPLC, que é uma técnica estabelecida. Os resultados obtidos
mostraram que, tanto em UHPSFC quanto em UHPLC, devido às diferentes
polaridades dos agrotóxicos estudados, a eluição isocrática não foi adequada, sendo
mais indicado a eluição por gradiente.
Em UHPSFC, apesar do uso de grandes quantidades de água não ser
possível, devido à diferença da sua polaridade com o CO2, o emprego de uma
pequena porcentagem de água juntamente com o modificador orgânico foi de
fundamental relevância para obtenção de repetibilidade nos resultados. Devido a
utilização de água como componente da FM em UHPLC, o problema da formação do
silil éter que ocorre na ausência de água é evitado.
Em ambas as técnicas, solventes apróticos como a ACN se mostraram
adequados para serem usados como diluentes, porque permitiram a injeção de um
volume de amostra razoável, nem muito grande para distorcer os picos e nem muito
pequeno por se tratar de análise em nível de traços.
O emprego do planejamento experimental fatorial 24 com ponto central
permitiu compreender a influência dos fatores experimentais na retenção dos analitos
e obter as condições que levaram à separação completa dos mesmos na mistura por
UHPSFC. Além disso, possibilitou a avaliação da robustez do método durante seu
desenvolvimento.
Os resultados obtidos mostraram que a técnica de UHPSFC é promissora
para a separação da mistura de agrotóxicos estudada, pois se utilizou um volume
reduzido de solvente orgânico (0,975 mL x 2,100 mL para UHPLC), gerou-se baixa
quantidade de resíduos e o tempo de análise foi muito menor do que o obtido em
UHPLC (5,1 min x 16,1 min em UHPLC).
A técnica de UHPSFC opera a pressões muito inferiores à de UHPLC, o
que causa menor desgaste do sistema cromatográfico e pode aumentar a vida útil das
FE empregadas. Em UHPSFC, independentemente do tipo de coluna utilizada,
125
primeiramente eluem os compostos menos polares e depois os mais polares, ordem
de eluição contrária à obtida em UHPLC. Ademais, em UHPLC, tanto em fase normal
quanto em fase reversa, pode-se prever a ordem de eluição dos compostos
analisando os valores do log P, o que não se consegue em UHPSFC. Usando FR em
UHPLC, quanto mais polar for o analito menos retido ele será em uma FE apolar.
Os métodos de separação multirresíduo desenvolvidos empregando
UHPSFC e UHPLC foram validados de acordo com as figuras de mérito seletividade,
linearidade, limite de quantificação (LQ), exatidão (em termos de recuperação) e
precisão (repetibilidade e precisão intermediária). Dos 10 agrotóxicos estudados,
obteve-se seletividade para sete analitos em UHPSFC e para oito em UHPLC. A curva
analítica para cada analito foi linear na faixa de concentração de 0,2-1,5 mg kg-1
(UHPSFC) e de 0,1-1,2 mg kg-1 (UHPLC) com coeficientes de correlação na faixa de
0,991-1,000 para UHPSFC e 0,991-0,997 para UHPLC. As recuperações médias
obtidas para três níveis de fortificação (0,8, 1,0 e 1,1 mg kg-1) foram 72-122% para
UHPSFC e 76-140% para UHPLC, com precisão menor que 20% em ambas as
técnicas. Isso mostra que os limites de quantificação, exatidão e precisão de UHPSFC
são similares aos obtidos por UHPLC e ambas as técnicas podem ser empregadas na
análise multirresíduo de agrotóxicos em amostras de alface.
Após a validação dos métodos, os resultados obtidos na análise de cincos
amostras de alface adquiridas no comércio de Campinas/SP, usando a UHPSFC e a
UHPLC, foram concordantes e revelaram que das cinco amostras estudadas, duas
continham resíduos de Imidacloprido acima do LMR (na faixa de 0,8 a 2,6 mg kg-1).
Como os resíduos de agrotóxicos acima do LMR permitido podem causar efeitos
nocivos à saúde do consumidor em longo prazo, é imprescindível o monitoramento
dessas culturas, afim de que produtos de qualidade sejam disponibilizados e a
UHPSFC, devido ao seu rápido tempo de análise e baixa geração de resíduos pode
ser uma alternativa viável às técnicas de análise usuais.
Apesar dos avanços, é necessário expandir estudos envolvendo a técnica
de UHPSFC, visto que muitos mecanismos envolvidos nas separações ainda não
estão elucidados. O uso da ferramenta de planejamento experimental é muito
importante, pois permite a quantificação dos efeitos dos fatores e suas, gerando uma
ampla compreensão do sistema e sua otimização efetiva.
126
A UHPSFC se mostrou uma técnica com grande potencial de separação,
rápida, com baixa geração de resíduo e complementar às técnicas de cromatografia
líquida e gasosa. O método desenvolvido e validado atende a seis dos 12 princípios
da Química Analítica Verde134, pois dispensa a derivação, gera pouco resíduo, é um
método multirresíduo, emprega solventes de fontes renováveis, o uso de reagentes
tóxicos foi eliminado ou substituído e existe aumento da segurança do operador. Isto
reduz o impacto negativo da análise química e torna o método mais favorável ao meio
ambiente. Além disso, o método desenvolvido se mostrou inovador, uma vez que,
como descrito no item 1.5, não há relatos na literatura de separação multirresíduo de
agrotóxicos empregando a técnica de UHPSFC e nem da utilização de ferramentas
quimiométricas para sua otimização.
127
6. REFERÊNCIAS
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