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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

ANDRESSA BRUSCATO

ANÁLISE PROTEÔMICA DO METABOLISMO DE CARBOIDRATOS DE ISOLADOS

DE TRYPANOSOMA CRUZI DE PACIENTES PORTADORES DE DIFERENTES FORMAS

CLÍNICAS DA DOENÇA DE CHAGAS

PROTEOMIC ANALYSIS OF CARBOHYDRATE METABOLISM OF

TRYPANOSOMA CRUZI ISOLATES FROM PATIENTS BEARING DISTINCT CHAGAS

DISEASE CLINICAL FORMS

CAMPINAS

2018

ANDRESSA BRUSCATO

ANÁLISE PROTEÔMICA DO METABOLISMO DE CARBOIDRATOS DE ISOLADOS

DETRYPANOSOMA CRUZI DE PACIENTES PORTADORES DE DIFERENTES FORMAS

CLÍNICAS DADOENÇA DE CHAGAS

PROTEOMIC ANALYSIS OF CARBOHYDRATE METABOLISM OF

TRYPANOSOMA CRUZI ISOLATES FROM PATIENTS BEARING DISTINCT CHAGAS

DISEASE CLINICAL FORMS

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra

em Biologia Funcional e Molecular, na área de

Bioquímica

Dissertation presented to the Institute of Biology of the

University of Campinas in partial fulfillment of the

requirements for the degree of Functional and

Molecular Biology, Biochemistry area

Orientador: Prof.ª Drª Fernanda Ramos Gadelha

CAMPINAS

2018

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

PELA ALUNA ANDRESSA BRUSCATO E

ORIENTADA PELA PROFª. DRª. FERNANDA

RAMOS GADELHA

Campinas, 03 de Agosto de 2018.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof.ª Drª Fernanda Ramos Gadelha

Prof.ª Drª Beatriz Simonsen Stolf Carboni

Prof.ª Drª Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no

processo de vida acadêmica do aluno.

AGRADECIMENTOS

Chegar até aqui não foi um caminho fácil. Ninguém disse que seria, entretanto, nunca

imaginei tantas curvas sinuosas. Mas, durante tal trajeto houve muito aprendizado,

autoconhecimento, superação e companheiros que, já levava, levarei para toda vida.

Sabe-se que toda criança por si é um cientista, afinal realiza todas as etapas do método

científico para descobrir o mundo a sua volta. Observa algo novo, fica intrigado sobre o que pode ser,

literalmente, experimenta seu questionamento e, rapidamente, tem uma resposta para aquilo. Os

principais responsáveis por esse texto de dissertação são meu apoio e incentivo, aqueles que nunca

deixaram a criança presente em mim morrer, meus pais.

Já dizia o ditado que “se uma maritaca sozinha faz barulho, imagine um bando?” (sempre

achei andorinhas supervalorizadas). Aqui não me caberão agradecimentos e gratidão pela presença,

apoio e paciência. Vocês nem imaginam o que um simples “vai ficar tudo bem” impactou na minha

caminhada. Aos amigos, que independente do tempo que os conheço, estão comigo por uma vida:

Amanda, Ana, Aline, André, Atos, César, Felipe, Guilherme, Giulia, Isabella, Juliana, Karen,

Marianne, minhas Natálias: Gomes e Moncks, Patrícia e Rodrigo, Tabata. Muito obrigada, mesmo.

Aqui soarei repetitiva, porém, dizia outro ditado: “Lab partners has no end”, ô Isabel(la),

Giu(lia), Karen(zitcha), Stephanie e Tab(s)ata. Apenas agradecimentos por todas as calorias ingeridas

seja em um café da manhã, seja na feirinha e tudo o que pude aprender com cada uma de vocês. Giu

com quem dividi o período de altas emoções, em ambas dissertações. Karen, você sabe né, o que é

seu é meu e o que é nosso é nosso. Isabella e Tabata, a cada dia que passou eu vi o quanto vocês

cresceram e o quanto se tornaram incríveis profissionais, vocês nem imaginam o orgulho imenso que

tenho de vocês. Stephanie, com quem cruzei o caminho por diversas vezes durante meu tempo de

Unicamp, agradeço muito pelas palavras de conforto e sapiência técnica, em todas as ocasiões, tack.

À Drª Daianne e Melina, por ajudarem a reencontrar a motivação e o desejo de sempre ir

em frente. A retomar a confiança em meu trabalho e que adversidades ocorrem para nos deixar mais

fortes e não o contrário.

Ao professor Daniel Martins-de-Souza e seu aluno de pós-doc, Adriano Aquino, não

tenho palavras para agradecer todo o suporte e apoio durante o primeiro ano do mestrado.

À Adriana Paes Leme e Bianca Alves Pauletti, é imensurável o quanto sou grata a vocês.

Todo o apoio, esclarecimentos e cuidado com as amostras e conosco. Não tenho palavras para

agradecer, esse projeto não seria possível sem vocês.

E por último, porém não menos importante, à orientadora, professora Fernanda. Obrigada

pelo apoio, pelos dias na bancada, pelas oportunidades e por sempre estimular o cientista interior e

sempre incentivar que o ambiente (afinal, sou bióloga), seja questionado.

À Unicamp pelo espaço cedido.

À CAPES pela bolsa concedida e FAPESP pelo financiamento do projeto.

“Passe adiante o que aprendeu. Força, domínio. Mas fraqueza, tolice e fracasso também.

Fracasso, o mais importante. O maior professor, o fracasso é. Nós somos o que eles superam. Este

é o verdadeiro fardo de todos os Mestres”.

Mestre Yoda, para Luke Skywalker, Star Wars: The Last Jedi, 2017

RESUMO

A doença de Chagas, cujo agente etiológico é o Trypanosoma cruzi, apresenta diferentes

manifestações clínicas, isto é, indeterminada, cardíaca, digestiva e cardiodigestiva. A distribuição

geográfica da doença de Chagas sugere que a diversidade genética do parasita, associada ou não à do

hospedeiro, é importante para o estabelecimento das diferentes manifestações clínicas. Visando

esclarecer a contribuição do parasita para a patogênese, o objetivo desse trabalho foi comparar a

proteômica de oito isolados de pacientes portadores de diferentes formas clínicas (dois de cada forma)

com foco nas proteínas envolvidas no metabolismo de carboidratos e bioenergético. Os extratos

proteicos dos isolados foram obtidos, processados e, posteriormente, analisados em espectrômetro de

massas Orbitrap Velos. Os resultados foram tratados estatisticamente a partir de testes t-student e

ANOVA e as proteínas identificadas pelos softwares DAVID, KEGG e UNIPROT. As curvas de

proliferação desses isolados mostram um perfil semelhante entre aqueles da mesma forma clínica e,

em alguns casos, a história pregressa do paciente foi importante para explicar o comportamento do

isolado. No geral, comparando isolados dos pacientes indeterminados com as formas sintomáticas,

nota-se que há diferença na abundância das proteínas envolvidas no metabolismo bioenergético

(relacionadas à cadeia respiratória) e à estruturação das cristas mitocondriais. Interessantemente há

também diferença na abundância da anidrase carbônica e de um membro da família dos carreadores

mitocondriais, que aparentemente está relacionado ao transporte de glicose no glicossomo. Este fato

é corroborado pela análise das curvas de proliferação onde os isolados que apresentam uma queda

abrupta na fase estacionária, i.e. indeterminados e cardíacos, mostraram maior prevalência dessas

proteínas. Isso conferiria à célula uma maior dependência de glicose e maior utilização do piruvato

pelo Ciclo de Krebs. Com relação aos isolados das formas sintomáticas, quando comparados aos da

forma indeterminada, há prevalência de proteínas envolvidas no metabolismo da glicose, como a

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, uma enzima que já foi apontada como alvo para

desenvolvimento de fármacos. Foram encontradas, também, diferentes isoformas da trans-sialidase.

Em conjunto, os resultados apontam uma diferença no metabolismo dos isolados que podem estar

associados às diferentes formas clínicas da doença de Chagas.

ABSTRACT

Chagas disease, whose etiologic agent is Trypanosoma cruzi, presents different clinical

manifestations, that is, indeterminate, cardiac, digestive and cardiodigestive. The geographic

distribution of Chagas disease suggests that the genetic diversity of the parasite, associated or not to

that of the host, is important for the establishment of different clinical manifestations. In order to

clarify the contribution of the parasite to the pathogenesis, the objective of this work was to compare

the proteomics of eight isolates of patients with different clinical forms (two of each form) focusing

on proteins involved in carbohydrate and bioenergetic metabolism. Protein extracts from the isolates

were obtained, processed and later analyzed in Orbitrap Velos mass spectrometer. The results were

treated statistically from t-student and ANOVA tests and the proteins identified by the DAVID,

KEGG and UNIPROT software. The proliferation curves of these isolates show a similar profile

among those in the same clinical form and, in some cases, the patient's previous history was important

to explain the behavior of the isolate. In general, comparing isolates from indeterminate patients with

symptomatic forms, there is a difference in the abundance of proteins involved in bioenergetic

metabolism (related to the respiratory chain) and in the structure of mitochondrial ridges.

Interestingly, there is also a difference in the abundance of carbonic anhydrase and a member of the

mitochondrial carrier family, which is apparently related to the transport of glucose in the glycosome.

This fact is corroborated by the analysis of the proliferation curves where the isolates that show an

abrupt drop in the stationary phase, i.e. indeterminate and cardiac, showed a higher prevalence of

these proteins. This would give the cell increased glucose dependence and increased use of pyruvate

by the Krebs Cycle. Regarding the isolates of the symptomatic forms, when compared to those of the

indeterminate form, there is a prevalence of proteins involved in glucose metabolism, such as

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, an enzyme that has already been targeted as a drug

development target. Different isoforms of trans-sialidase have also been found. Together, the results

point to a difference in the metabolism of the isolates that may be associated with the different clinical

forms of Chagas' disease.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 12

1.1. Doença de Chagas e seu agente etiológico .................................................................................... 12

1.2. Metabolismo de carboidratos em Trypanosoma cruzi ................................................................... 18

1.3. Proteômica ..................................................................................................................................... 20

2. OBJETIVO E JUSTIFICATIVA ............................................................................................................ 21

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 22

3.1. Seleção dos Pacientes .................................................................................................................... 22

3.2. Coleta de sangue dos pacientes ..................................................................................................... 22

3.3. Transformação das formas tripomastigotas para as epimastigotas ................................................ 22

3.4. Cultura de células .......................................................................................................................... 23

3.5. Determinação dos parâmetros de proliferação .............................................................................. 23

3.6. Determinação da EC50 dos parasitos para o benzonidazole (BNZ) ............................................... 23

3.7. Preparo do extrato proteico............................................................................................................ 24

3.8. Digestão in solution e dessalting ................................................................................................... 24

3.9. Análise de espectrometria de massa .............................................................................................. 25

3.10. Análise estatística .......................................................................................................................... 29

3.11. Análise das proteínas a partir dos softwares .................................................................................. 30

4. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 31

Parte I: Uma história contada de trás para frente: o histórico dos pacientes .................................................. 31

Parte II: “Pois aqui, como vê, você tem que correr o mais que pode para continuar no mesmo lugar”: a

estratégia do parasita para se adaptar ao ambiente de seu hospedeiro. ............................................................ 33

Parte III: “Um doce” questionamento: seria o metabolismo de carboidratos o protagonista? ...................... 37

4.1. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Cardíaca .......................................................... 38

4.2. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Digestiva ......................................................... 46

4.3. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Cardiodigestiva ............................................... 51

4.4. Isolados da forma Cardíaca vs os da forma Cardiodigestiva ........................................................ 54

4.5. Isolados da forma Digestiva vs os da forma Cardiodigestiva ....................................................... 56

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................................. 59

Parte I: Uma história contada de trás para frente: o histórico dos pacientes .................................................. 59

Parte II: “Pois aqui, como vê, você tem que correr o mais que pode para continuar no mesmo lugar”: a

estratégia do parasita para se adaptar ao ambiente de seu hospedeiro. ............................................................ 60

Parte III: Um doce questionamento: seria o metabolismo de carboidratos o protagonista? .......................... 63

6. CONCLUSÃO .......................................................................................................................................... 74

7. IMPLICAÇÕES DOS ACHADOS NO PRESENTE TRABALHO .................................................... 74

ANEXO I ........................................................................................................................................................ 85

ANEXO II .......................................................................................................................................................88

ANEXO III ..................................................................................................................................................... 89

12

1. INTRODUÇÃO

1.1. Doença de Chagas e seu agente etiológico

No continente americano, mais precisamente na América do Sul (Argentina, Brasil, Chile,

Uruguai e Venezuela), a doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909),

constitui um grave problema de saúde pública (SCHMUNIS, 2000). Segundo dados da Organização

Mundial da Saúde, a doença de Chagas atinge entre 6 e 7 milhões de pessoas no mundo e causa

aproximadamente 10 mil mortes (WHO, 2018; SOPRANO et al., 2018)

Em relação ao perfil epidemiológico, a transmissão do T.cruzi pode ocorrer por via

vetorial, oral, transfusão de sangue, transplantes de órgãos, congênita, ou acidentalmente em

laboratórios (COURA; VIÑAS, 2010; MANNE-GOEHLER, 2017; MEYMANDI et al., 2017). Com

relação à transmissão vetorial, países como Argentina, Chile, Bolívia, Paraguai, Uruguai e Brasil, que

fazem parte do habitat natural dos vetores insetos apresentam quadros epidemiológicos mais graves.

Em regiões não endêmicas, como Estados Unidos, Canadá, Japão, Austrália e Europa, estima-se que

em decorrência da migração dos indivíduos, cerca de 400 mil estejam infectados (COURA; VIÑAS,

2010). Nessas regiões, as vias de transmissão independentes do vetor tem maior importância

(COURA; VIÑAS, 2010; MANNE-GOEHLER, 2017; MEYMANDI et al., 2017).

O perfil epidemiológico da doença de Chagas sofreu alterações ao longo dos anos e

atualmente em países como Brasil, Colômbia e Venezuela, a via de transmissão oral tem sido

responsável por surtos de infecção e, em alguns casos, óbito (PEREIRA et al., 2009; SHIKANAI-

YASUDA; CARVALHO, 2012; SILVA-DOS-SANTOS et al., 2017). A transmissão oral ocorre

devido à falta de higienização dos frutos utilizados para consumo, que podem encontrar-se

contaminados com material fecal de insetos triatomíneos infectados, bem como pela trituração dos

próprios insetos no processamento do alimento. O consumo direto dos frutos contaminados ou o

preparo de sucos ou polpas desses frutos sem higienização pode levar à ingestão de alta carga

parasitária, desencadeando crise aguda da doença de Chagas, podendo até levar a óbito (SANCHES

et al., 2014; TOSO M; VIAL U; GALANTI, 2011; VAZQUEZ et al., 2015) (Figura 1). Em 2005, no

Brasil, houve um surto em Santa Catarina pela ingestão de caldo de cana contaminado, em virtude da

presença de vetores infectados durante a moagem (ANDRADE et al., 2011; STEINDEL et al., 2008)

13

e recentemente, em 2015, no Amazonas pela ingestão de suco de açaí contaminado (BARBOSA et

al., 2015). Entre os anos de 2009 e 2010, também foram reportados surtos na Colômbia e Venezuela

relacionados com a ingestão de sucos de frutas como laranja, tangerina e caldo de cana contaminados

(SHIKANAI-YASUDA; CARVALHO, 2012).

Figura 1. Mecanismos de transmissão oral da doença de Chagas. A. Vetor

triatomíneo em seu habitat natural, próximo aos frutos. B. Frutos recolhidos para

produção de polpas, quando não higienizados corretamente podem conter material

fecal do inseto vetor contendo os parasitas; ou até mesmo o vetor ser moído durante

o preparo de sucos (ex: caldo de cana) C. O consumidor ingere o alimento

contaminado levando à infecção com o T. cruzi.

O ciclo de vida do T. cruzi é heteroxeno, ocorrendo entre um hospedeiro vertebrado

(homem, animais domésticos e silvestres) e um hospedeiro invertebrado insetos triatomíneos (tais

como Triatoma infestans, Triatoma sordida, Triatoma brasiliensis e Panstrongylus megistus)

(BERN, 2015; STEVENS et al., 2011). Durante o ciclo de vida, há quatro formas do parasita que

diferem morfologicamente e bioquimicamente (STEVENS et al., 2011). Conforme observado na

Figura 2, a transmissão do T. cruzi se dá quando um inseto triatomíneo ingere sangue contaminado

com T. cruzi. Em seu estômago, os tripomastigotas sanguíneos que estavam presentes na circulação

sanguínea do hospedeiro mamífero se diferenciam em epimastigotas. No intestino posterior, os

epimastigotas aderem às membranas perimicroviliares e multiplicam-se. Na porção retal do inseto,

os epimastigotas associam-se à camada serosa do tecido, interação essa que pode contribuir para

diferenciação na forma tripomastigota metacíclica (GARCIA et al., 2010).

14

Figura 2. Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi (BERN, 2015)

No momento do repasto sanguíneo, os insetos defecam devido à pressão gerada pela

entrada do sangue no intestino. Ao defecar, os parasitas, epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos,

presentes no reto, são excretados juntamente com as fezes. O hospedeiro mamífero ao coçar as

proximidades da “picada” acaba por empurrar as fezes ao local da ferida, permitindo, assim, que o T.

cruzi entre em contato com o sangue (BERN, 2015; STEVENS et al., 2011). As formas epimastigotas

possuem proteínas de membrana (como associadas a mucina), que são identificadas pelo sistema

complemento do hospedeiro mamífero, sendo destruídas (NORRIS; SCHRIMPF, 1994). Entretanto,

as formas tripomastigotas possuem a trans-sialidase em sua membrana que catalisa a transferência de

resíduos de ácido siálico do hospedeiro para glicoconjugados do parasita, auxiliando-o a não ser

reconhecido pelo sistema imune inato (NARDY et al., 2016). Assim, as formas tripomastigotas

invadem células nucleadas onde iniciam sua diferenciação para a forma amastigota, não flagelada e

replicativa (BERN, 2015).

15

No hospedeiro humano, após a infecção (período entre sete e quinze dias), há alta

parasitemia e sintomas semelhantes a uma gripe comum, caracterizando assim a chamada fase aguda

da doença. Nas 4 a 8 semanas seguintes, o paciente tem uma queda brusca na parasitemia e apresenta-

se assintomático, encontrando-se na fase crônica da doença. Alguns pacientes permanecem

assintomáticos (ou na forma indeterminada) pelo resto da vida, enquanto outros (10-40%), após vários

anos de início da fase crônica, podem apresentar quadros clínicos cardíacos, digestivos ou

cardiodigestivos, caracterizando, assim, as quatro formas clínicas conhecidas da doença de Chagas

(uma assintomática e três sintomáticas) (BERN, 2015).

Os pacientes assintomáticos (forma indeterminada) são diagnosticados pela sorologia,

que deve ser realizada utilizando-se dois testes com princípios metodológicos diferentes

(MESSENGER; MILES; BERN, 2015). Tal fato deve ser levado em consideração devido a uma única

análise não possuir alta sensibilidade e/ou especificidade (MESSENGER; MILES; BERN, 2015). Em

geral é realizada a detecção sorológica de IgG por ELISA, ou imunofluorescência indireta ou

hemaglutinação (WHO, 2015). Em contrapartida, pacientes acometidos pelas formas sintomáticas

têm seu diagnóstico a partir dos acometimentos clínicos. Mais da metade dos pacientes é

diagnosticada a partir de eletrocardiogramas, radiografias da região peitoral e exame de contraste de

bário para lesões no esôfago e cólon (ALVES et al., 2016). O diagnóstico cardíaco é acompanhado

por lesões no miocárdio que desestabilizam a estrutura celular, bem como arquitetura histológica, ao

passo que os ninhos parasitários geram lesões teciduais que, posteriormente, são substituídas por

fibroses levando a arritmias e cardiomegalias (CASTELLANI; RIBEIRO; FERNANDES, 1967;

RIBEIRO et al., 2012). Casos de morte súbita são raros, porém presentes quando o paciente passa a

apresentar arritmias e extrassístoles ventriculares mais frequentes. Para os pacientes portadores da

forma digestiva da doença, há o aumento das vísceras, principalmente do esôfago (megaesôfago) e

do cólon (megacólon). Tais acometimentos comprometem principalmente a capacidade de deglutição

dos pacientes, disfagia e megaesôfago, e podem contribuir para constipação e inflamações intestinais,

devido ao distúrbio da movimentação visceral (megacólon) (PINAZO et al., 2014).

No cenário brasileiro, a forma indeterminada é predominante (60-70%), seguida pelas

manifestações cardíacas (20-30%) e digestivas (8-10%), respectivamente, enquanto a forma

cardiodigestiva é rara (MACEDO et al., 2004). Na região central do Brasil e no Chile a forma

digestiva é prevalente, enquanto na Argentina corresponde a 3,5% (DIAS, 1992). A razão para essa

distribuição geográfica heterogênea e o porquê de os pacientes desenvolverem diferentes formas

16

clínicas ainda não foi totalmente elucidada, mas a variação genética do parasita e o sistema imune do

hospedeiro têm sido considerados protagonistas nessa questão (MACEDO et al., 2004).

Com o intuito de caracterizar e agrupar os isolados de T. cruzi, os zimodemas foram

determinados a partir de isoenzimas, que permitiram a classificação dos parasitas em três grupos

principais, sendo os chamados Z1 e Z3 associados ao ciclo selvagem (aquele que inclui o inseto vetor

e mamíferos silvestres) e Z2 ao ciclo doméstico (que inclui o hospedeiro humano no ciclo biológico)

(BRISSE; BARNABÉ; TIBAYRENC, 2000). Com os avanços nas técnicas de análises moleculares,

tais como o PCR e de éxons e DNAs satélites, novas caracterizações foram propostas. Em 2009,

durante a comemoração do centenário da descoberta da doença de Chagas chegou-se a um consenso

que agrupou os parasitos em seis diferentes grupos (ZINGALES et al., 2009). Essa abordagem mais

recente é feita a partir das DTUs (discrete typing units), nas quais os grupos são diferenciados por

marcadores moleculares (genes conservados como 24SrDNA, sequência líder (SL) e 18S rDNA) e

fatores ecoepidemiológicos (distribuição geográfica, vetor, hospedeiro silvestre, ecótopo e

associações da doença) (ZINGALES et al., 2012) (Figura 3).

Figura 3: Distribuição geográfica dos grupos de classificação de

Trypanosoma cruzi na América do Sul (ZINGALES, 2011).

Há dois grupos bem definidos TcI e TcII, que correspondem aos grupos Z1 e Z2. O TcII

é mais comumente associado ao ciclo doméstico e leva a quadros mais patogênicos. A distribuição

17

geográfica, demonstrada na Figura 3, dos grupos associados aos casos relatados reforça a teoria de

que diferentes genótipos conferem determinadas formas clínicas (ZINGALES, 2011). Dentre os

grupos, apenas nos grupos TcI, TcII e TcV é possível estabelecer uma correlação com a manifestação

clínica da doença. O grupo TcI, presente na porção acima da linha do Equador da América Latina, é

associado às formas indeterminada e cardíaca. TcII, juntamente com o TcV, tem maior notoriedade

mais ao sul da América Latina, sendo principalmente associados à forma digestiva (BUSCAGLIA;

DI NOIA, 2003; CARRANZA et al., 2009). Além destes, há também TcBat, originalmente

encontrada apenas em morcegos no Panamá e na Colômbia (LIMA et al., 2015). Era considerada

uma DTU rara e irrelevante até que em 2013, foram encontrados vestígios de seu DNA em corpos

mumificados no Chile (GUHL; AUDERHEIDE; RAMÍREZ, 2014) e no diagnóstico de uma criança

colombiana de 5 anos de idade (RAMÍREZ et al., 2013). No Brasil, a localização desta DTU é

bastante restrita (LIMA et al., 2015).

Com relação ao tratamento da doença de Chagas este é baseado em dois compostos

nitroheterocíclicos (caracterizados por possuírem um grupo nitro ligado a um anel aromático):

benzonidazol (BNZ) e o nifurtimox (NF). Ambos foram introduzidos na clínica nas décadas de 60-

70 do século passado, sendo que o último teve sua produção descontinuada na década de 80, tendo

sido reintroduzido na clínica e distribuído pela Organização Mundial de Saúde em casos de resistência

ao BNZ (URBINA; DOCAMPO, 2003; WHO, 2011). Embora o BNZ seja eficiente contra a fase

aguda da doença, com taxas de 50-80% de cura (RASSI; RASSI; MARIN-NETO, 2010), tem pouca

eficiência na fase crônica, para a qual as taxas de cura perfazem 20-50% (RASSI; RASSI; MARIN-

NETO, 2010). Especula-se que devido à farmacocinética do BNZ, ele seja pouco eficaz no alcance

das formas amastigotas presentes em tecidos na forma crônica da doença (URBINA, 2002). Este

fármaco atua como um pró-fármaco, ou seja, há necessidade de sua ativação para que ocorra o efeito

esperado. No hospedeiro mamífero, a ativação é feita pelo citocromo P450 (HALL; WILKINSON,

2012), com a formação de um composto nitroso e a hidroxilamina, que exercem interação direta com

moléculas, como o DNA, lipídios e proteínas. No parasita, essa ativação é feita pela nitroredutase,

levando a formação do glioxal que parece ser responsável pelas interações anteriormente descritas

para o hospedeiro mamífero (HALL; WILKINSON, 2012). Vários compostos já foram testados para

o tratamento para doença de Chagas, entretanto, o BNZ continua sendo o fármaco de escolha, tendo

como grande avanço uma nova formulação pediátrica (DNDi, 2016).

Pode-se observar que um grande desafio no tratamento da doença de Chagas é a

inespecifidade das drogas de escolha. A fim de desenvolver terapias mais específicas, portanto, menos

18

tóxicas ao hospedeiro, as enzimas do metabolismo do T. cruzi tornam-se interessantes candidatas a

alvos de tratamento.

Nesse sentido, a busca por alvos específicos no metabolismo de carboidratos como os

glicomarcadores torna-se interessante (VERLINDE et al., 2001). Sabe-se que a Gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase (GAPDH) do T. cruzi possui diferenças estruturais quando comparada a de

humanos (MERCALDI et al., 2016), e assim tem sido apontada como um alvo para o

desenvolvimento de uma terapia mais específica para o tratamento da doença de Chagas..

1.2. Metabolismo de carboidratos em Trypanosoma cruzi

O complexo ciclo de vida do T. cruzi demanda uma adaptação aos nutrientes encontrados

no meio (SILBER et al., 2009). A disponibilidade de carboidratos irá variar conforme o meio e, desse

modo, a adaptação metabólica, por exemplo: epimastigotas e tripomastigotas encontram-se em

ambiente abundante em glicose e frutose, desse modo apresentam transportadores para essas

macromoléculas (SILBER et al., 2009). Já os amastigotas, confinados ao interior da célula de seu

hospedeiro mamífero , estão expostos à escassez de glicose no meio, o que pode justificar a ausência

de transportadores de glicose, levando ao favorecimento do metabolismo de aminoácidos

(MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

Diferentemente do encontrado nos hospedeiros mamíferos, há compartimentalização da

glicólise em T. cruzi (MICHELS et al., 2006). As 6 primeiras enzimas da glicólise (Hexoquinase

(HK) e glicoquinase (GK); Fosfoglico isomerase; Fosfofrutoquinase (PFK); Aldolase; Triose fosfato

isomerase e a GAPDH) encontram-se em uma organela semelhante ao peroxissomo, denominada

glicossomo (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011). No glicossomo também se encontram as

enzimas da via das pentoses fosfato, presentes também no citosol, relacionada com o metabolismo de

carboidratos. O restante do metabolismo da glicose ocorre no citosol, até piruvato, que é encaminhado

à mitocôndria para o ciclo do ácido tricarboxílico e subsequente envio de seus equivalentes reduzidos

à cadeia transportadora de elétrons para a produção de ATP pela fosforilação oxidativa (MAUGERI;

CANNATA; CAZZULO, 2011).

Diferentemente do encontrado no metabolismo humano, no qual há três enzimas

regulatórias da via glicolítica, HK, PFK e a Fosfoenolpiruvato quinase (PEP), em T. cruzi, a HK não

19

é modulada negativamente pelo aumento de seu substrato (glicose-6-fosfato) e a PFK não é

fortemente inibida pela presença de ATP, sendo regulada pela Frutose-6-fosfato (MAUGERI;

CANNATA; CAZZULO, 2011). Outra molécula que exerce regulação diferente, cuja influência

aparece nas etapas iniciais da glicólise é a frutose-2,6-bisfosfato. Em humanos ela atua como

modulador positivo da PFK, porém no parasita ela atua como moduladora apenas da piruvato quinase

(PK). A frutose-2,6-bisfosfato exerce uma influência moduladora positiva sobre a PK, enquanto o

ATP e o Pi modulam negativamente essa enzima. (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

A falta de modulação negativa na HK/GK e PFK faz com que a hipóxia não interfira no

consumo de oxigênio do parasita, causando o efeito Pasteur reverso, ou seja o consumo de glicose

mantêm-se menor em condições anaeróbias quando comparado com condições aeróbias (MAUGERI;

CANNATA; CAZZULO, 2011).

Uma outra diferença em relação ao hospedeiro mamífero é que em T. cruzi há excreção

de metabólitos não totalmente reduzidos, ou seja, essas moléculas ainda possuem potencial redutor

(energético) (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011). Tal fato pode justificar o succinato ser o

substrato preferencial para cadeia respiratória mitocondrial. Esse argumento ganha destaque quando

observamos que o complexo I da cadeia respiratória aparenta não contribuir para a produção de ATP,

podendo atuar como um suporte supramolecular para os outros complexos (MAUGERI; CANNATA;

CAZZULO, 2011; SILVA et al., 2011). Esses metabólitos não reduzidos podem contribuir para o

balanço do NADH+H+ glicolítico através de outros processos metabólicos, como a fermentação ou

como atividade diferenciada de enzimas que utilizam a coenzima em sua reação, como a GAPDH

(MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

A via das pentoses fosfato, que se encontra no citosol e compartimentada no glicossomo,

além da produção de ribose-5-fosfato, é importante para produção de NADPH+H+ que, por sua vez,

é essencial para detoxificação de hidroperóxidos centrada na tripanotiona (DIAS et al., 2018).

Durante o ciclo de vida, nos diferentes ambientes: intestino do inseto triatomíneo, fagossomo e

interior da célula hospedeira, o parasito estará exposto a estresse oxidativo (além do produzido por

seu próprio metabolismo) (SILBER et al., 2009).

Há ainda a síntese de galactose, que é produzida a partir da glicose-6-fosfato intracelular,

que será utilizada como UDP-glalactose para a síntese de vitamina C. A gliconeogênese não é muito

estudada nesse parasito, porém, a sequência para o gene da Frutose-2,6-bifosfatase está anotada no

genoma do mesmo (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

20

Como mencionado acima, o metabolismo de carboidratos do parasita apresenta diferenças

significativas em relação ao hospedeiro mamífero. Assim, a partir de análises proteômicas, é possível

obter informações de expressão, concentração relativa e alterações pós- traducionais das proteínas.

Dessa maneira, as técnicas de proteômica auxiliam na montagem de um perfil metabólico, de

sinalização e regulação de amostras vinda de organismos variados (WILKINS et al., 1996, 2006).

1.3. Proteômica

O termo "proteoma" foi criado por Marc Wilkins, em 1994 (WILKINS et al., 1996) E

corresponde ao conteúdo proteico expresso em um organismo. Diferentemente do genoma, que

permanece predominantemente estável durante o tempo de vida do indivíduo, o proteoma é variável.

Variações do ambiente podem levar à respostas adaptativas imediatas, como a alteração nos padrões

de expressão gênica e perfil protéico (WILKINS et al., 1996, 2006).

Além disso, a melhor compreensão da proteômica do T. cruzi pode auxiliar na

identificação de padrões determinantes para o aparecimento de cada forma clínica. Jaime Paba e

colaboradores foram pioneiros na demonstração da diferença no perfil proteico e metabólico entre as

três fases biológicas do ciclo de vida do tripanossomatídeo (PABA et al., 2004).

Não só a genética do parasita, mas também sua epigenética, pode ter características

diferenciadas de acordo com a adaptação ao ambiente fisiológico do hospedeiro (ELIAS; FARIA,

2009; GALVANI, 2003; MCCALL et al., 2015). Essas adaptações, a partir de diferenças proteicas e,

consequentemente, metabólicas, podem favorecer a colonização de tecidos cardíacos e/ou de tecidos

do trato digestório ou até mesmo a ausência de sintomatologia. Porém, até o momento não está claro

qual(is) marcador(es) do parasita ou do hospedeiro humano poderiam ser utilizados para estimar qual

forma clínica um paciente infectado com o T. cruzi virá a desenvolver.

21

2. OBJETIVO E JUSTIFICATIVA

Realizar a análise proteômica comparativa de oito isolados de T. cruzi provenientes de

pacientes portadores de formas clínicas distintas da doença de Chagas (indeterminada, cardíaca,

digestiva e cardiodigestiva).

Um estudo comparativo do perfil proteômico visando o perfil metabólico dos parasitas

causadores das diversas manifestações clínicas da doença de Chagas poderá levar a uma melhor

compreensão das características bioquímicas dos mesmos e ao estabelecimento de uma correlação

dessas com cada forma clínica da doença.

22

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Seleção dos Pacientes

Foram selecionados, junto ao GEDoCh (Grupo de Estudos em Doença de Chagas) no

Hospital de Clínicas da UNICAMP, oito pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença

de Chagas (indeterminada, cardíaca, digestiva e cardiodigestiva), sendo dois pacientes de cada forma

clínica. Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética (CAAE: 30843714.0.0000.5404) (Anexo I -

TCLE).

3.2. Coleta de sangue dos pacientes

O sangue dos pacientes foi coletado no momento da realização de exames de rotina. Uma

amostra do sangue foi encaminhada para os procedimentos de obtenção das formas epimastigotas de

T.cruzi.

3.3. Transformação das formas tripomastigotas para as epimastigotas

O sangue coletado foi adicionado ao meio LIT (NaCl 76 mM, KCl 5,9 mM, glicose 12,3

mM, Na2HPO4 78,5 mM, triptose 0,56%, infusão de fígado 0,56%, hemina 20 mg.L-1, pH 7,4)

(CASTELLANI; RIBEIRO; FERNANDES, 1967), suplementado com 10% soro fetal bovino e 0,02

U.I/mLpencilina/streptomicina (LIT completo), e mantido à 28ºC em um período de 8 a 30 dias. A

cultura foi submetida à análise por microscopia ótica, a cada 3 dias, para confirmação da

transformação.

23

3.4. Cultura de células

Epimastigotas de T .cruzi (5,2 x 106/ml) foram cultivados em meio LIT completo, a 28ºC

(CASTELLANI; RIBEIRO; FERNANDES, 1967). Ao atingir o início da fase estacionária, específica

para cada isolado, as células foram coletadas por centrifugação (1,000 g a 4ºC por 5 minutos), lavadas

e ressuspensas em PBS (NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4). O número de células

foi determinado utilizando-se uma câmara de Neübauer.

3.5. Determinação dos parâmetros de proliferação

Alíquotas da cultura de células de cada isolado foram retiradas diariamente durante sete

dias, e o número de células foi determinado utilizando-se uma câmara de Neübauer. O tempo de

duplicação (TD) e o tempo de crescimento (TC) foram determinados utilizando as seguintes

equações, conforme descrito em (FINZI et al., 2004):

Nas quais, T2: tempo (horas) relativo para o final da fase log; T1: tempo (h) relativo

para o início da fase log; N1: número de células em T2 e N0: número de células em T1. Número

final de células no último dia da contagem e Número inicial de células no primeiro dia da contagem

3.6. Determinação da EC50 dos parasitos para o benzonidazole (BNZ)

Para determinação da EC50, os parasitas foram centrifugados à 1,000 g 4°C por 5 minutos,

e ressupensos em meio LIT completo. Em placas de 96 orifícios, foram incubadas 5,2 x 106céls/mL

na presença de diferentes concentrações de BNZ e no início da fase estacionária de cada isolado foi

adicionado 50μL MTT (5 mg/mL). Após 3 horas de incubação a 28°C, adicionou-se 50 μL SDS 20%

e, após 30 min, a absorbância foi determinada em espectrofotômetro (Biotek® Cytation™5)

(MIGUEL et al., 2011). A EC50 foi determinada no software Mathematica 11.1.

24

3.7. Preparo do extrato proteico

Os parasitas em início de fase estacionária foram centrifugados a 1000 g, 4°C por 5

minutos, lavados 3x com PBS pH 7,4 e o pellet foi congelado a -80°C, até o dia de realização do

experimento. O pellet foi ressuspenso em tampão de lise (ureia 8M, NaCl 75mM, Tris-HCl 50mM

pH 8,2, 5% coquetel inibidor de proteases (Sigma P8340), NaF 1mM, β-glicerofosfato 1mM,

ortovanadato de sódio 1mM, pirofosfato 10mM e PMSF 1mM. As amostras foram sonicadas em

banho de gelo por 10 ciclos a 50% de energia, com pausas de 1 minuto (Bandelin Sonoplus HD2200).

Em seguida, foram centrifugadas a 1,000 g, 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi reservado para

dosagem de proteínas a partir do método de Bradford (BioRad), conforme descrito em (BRADFORD,

1976), utilizando soro de albumina bovina (Sigma) como padrão (Figura 4).

3.8. Digestão in solution e dessalting

Após a dosagem proteica (50 μg), as amostras foram preparadas para digestão com

tripsina, de acordo com o descrito abaixo (VILLÉN; GYGI, 2008) (Figura 4):

a. Redução: adicionou-se 5 mM ditiotreitol (DTT) e incubou-se as amostras durante 25

minutos a 56°C.

b. Alquilação: adicionou-se iodoacetamida (IAA) 14 mM e as amostras foram incubadas

durante 30 minutos a temperatura ambiente e protegidas da luz. O quench da IAA, foi

feito adicionando-se DTT 5 mM, incubado-se por 15 minutos, temperatura ambiente

(protegidas da luz).

c. As amostras foram diluídas na proporção de 1:5 em 50 mM de bicarbonato de sódio, afim

de reduzir a concentração de ureia para 1,6M.

d. Em seguida adicionou-se a solução CaCl2 1mM e a solução de tripsina (10ng/uL), na

proporção 1:20. A digestão ocorreu por 17 horas a 37°C.

e. A parada da reação enzimática foi feita com 0,4% de ácido trifluoroacético (TFA), Em

seguida, centrifugou-se as amostras a 2500 g, por 10 minutos a temperatura ambiente. Os

25

sobrenadantes, com os peptídeos diluídos, foram reservados e separados em três alíquotas

por amostra.

Os peptídeos em solução foram dessalinizados com colunas de dessalinização SepPack

(Waters, C18) (RAPPSILBER; MANN; ISHIHAMA, 2007):

a. Preparo da StageTip C18: 100μL de metanol puro.

b. Ajuste de pH da coluna: 0,1% de ácido fórmico.

c. As colunas foram carregadas com as amostras após digestão proteica. Por dois ciclos

foram centrifugadas a 1,000 g, 2 minutos a temperatura ambiente. O conteúdo filtrado

foi reservado. As colunas foram lavadas (e centrifugadas sob as mesmas condições

anteriormente descritas) 10 vezes com 0,1% de ácido fórmico para retirar algum

peptídeo que ainda estivesse preso ao filtro.

d. Os peptídeos resultantes foram eluídos em 100 μL de solução de 80% acetonitrila e

0,1% de ácido fórmico. As amostras foram secas em speedvac e congeladas a -80°C

até o momento de análise no espectrômetro de massas.

3.9. Análise de espectrometria de massa

NanoflownLC-MS / MS

Uma alíquota de 4,5 μL (aproximadamente 2 μg) de mistura de peptídeos foi analisada

no espectrômetro de massa Orbitrap Velos habilitado para ETD (Thermo Fisher Scientific, Waltham,

MA, EUA) conectado ao sistema EASY-nLC (ProxeonBiosystem, West Palm Beach, EUA) através

de uma fonte de íons nano electrospray Proxeon. Os peptídeos foram separados por um gradiente de

acetonitrila de 2-30% em ácido fórmico a 0,1% usando uma coluna analítica (20 cm x ID75 μm,

tamanho de partícula de 5 μm, New Objective) a um caudal de 300 nL /min ao longo de 173 minutos.

A tensão de nano electrospray foi ajustada para 2,2 kV e a temperatura da fonte foi de 275 ° C. Todos

os métodos do instrumento foram configurados no modo de aquisição dependente de dados. Os

espectros de MS de varredura completa (m/z 300-1.600) foram adquiridos no analisador Orbitrap

após acumulação para um valor alvo de 1 × 106. A resolução no Orbitrap foi ajustada para r = 60.000

26

e os 20 íons peptídicos mais intensos com carga. Os estados ≥2 foram isolados sequencialmente para

um valor alvo de 5.000 e fragmentados na armadilha de íons linear usando CID de baixa energia

(energia de colisão normalizada de 35%). O limite de sinal para desencadear um evento MS/MS foi

definido para 1.000 contagens. A exclusão dinâmica foi ativada com uma lista de tamanho de

exclusão de 500, duração de exclusão de 60 s e uma contagem de repetição de 1. Foi utilizada uma

ativação q = 0,25 e tempo de ativação de 10 ms (KAWAHARA et al., 2014). Para evitar o viés durante

as medições, os dados foram randomizados para todos os grupos, conforme descrito no estudo

anterior (OBERG; VITEK, 2009) usando o ambiente R (v3.4.0). A randomização foi aplicada para

cada conjunto das três repetições técnicas usando os mesmos parâmetros do instrumento como

descrito acima.

Figura 4: Esquema da extração e digestão de proteínas para análise

proteômica

27

Análise de dados LC-MS/MS Raw

A identificação de proteínas foi realizada em MaxQuant v.1.3.0.3 (COX; MANN, 2008)

contra o banco de dados Uniprot contendo sequências canônicas e isoformas (liberação de sequências

de maio de 2017, 29737, 14784122 resíduos, concatenada com T. cruzi marinkellei e T. cruzi CL

Brener) usando o motor de busca Andromeda (COX et al., 2011). Os parâmetros de busca, uma

tolerância de 6 ppm foi considerada para íons precursores (MS search) e 0,5 Da para íons

fragmentados (pesquisa MS/MS), com um máximo de 2 clivagens perdidas. A carbamidometilação

da cisteína foi considerada a modificação fixa e oxidação da metionina e acetilação N-terminal como

modificações variáveis. O máximo de 1% da taxa de descoberta falsa (FDR) foi definido para a

identificação de proteínas e peptídeos. Uma quantificação foi realizada usando o algoritmo de

quantificação livre de etiqueta (LFQ) implementado no ambiente MaxQuant, com 1 contagem de

razão mínima e uma janela de 2 minutos para correspondência entre corridas.

A análise estatística foi realizada com o software Perseus v1.2.7.4 (COX; MANN, 2008),

disponível no pacote MaxQuant. Primeiro, as entradas reversas e "apenas identificadas pelo site"

foram excluídas da análise posterior. A quantificação livre de rótulos foi realizada utilizando as

intensidades de proteína espectral (LFQ). As proteínas exclusivas e comuns de cada fase clínica são

representadas pelo diagrama de Venn realizado pela ferramenta InteractiVenn (HEBERLE et al.,

2015). O critério de seleção dos peptídeos encontra-se representado na figura 5. A interpretação dos

resultados obtidos foi feita de acordo com o esquema representado na Figura 6.

28

Figura 6: Esquema de análise das proteínas e seleção das proteínas abundantes

de cada isolado. Para cada duplicata amostral, foram realizas triplicatas técnicas.

Após análise dos resultados provenientes do MS/MS, foram consideradas proteínas

abundantes da forma clínica apenas aquelas que aparecerem em pelo menos 5 das 6

corridas.

29

Figura 5: Esquema de análise das proteínas encontradas. As proteínas

encontradas de cada isolado formaram um padrão relativo às formas clínicas. Os

padrões das formas clínicas foram analisados, tendo a forma Indeterminada

(Assintomática) como “controle” a fim de observar-se as particularidades de cada

forma clínica, independentemente do hospedeiro.

3.10. Análise estatística

O teste t de Student foi aplicado (p<0,05) para a análise de proteínas diferencialmente

expressas, no mínimo 5 (Figura 6) valores válidos em cada grupo. A anotação de processos biológicos

utilizando Gene Ontology (GO) para proteoma de grupos de pacientes foi realizada utilizando Enrichr

(CHEN et al., 2013; KULESHOV et al., 2016) com um limiar significativo definido em p<0,05.

30

3.11. Análise das proteínas a partir dos softwares

A primeira análise para a determinação das proteínas foi realizada pelo software DAVID

(https://david.ncifcrf.gov). As análises para determinação das proteínas em suas respectivas vias

metabólicas foram realizadas pelo software KEGG (http://www.kegg.jp/). Apesar de ser uma ótima

ferramenta, o software não foi capaz de alocar todas as proteínas. A tabela de comparação entre

formas clínicas encontradas na Parte III, refere-se aos dados encontrados pelo KEGG e apuração das

proteínas não encontradas por este primeiro software. As proteínas não alocadas em metabolismos,

de acordo com o KEGG, ou dadas como hipotéticas, foram analisadas com o software UniProt.

https://david.ncifcrf.gov/

31

4. RESULTADOS

Parte I: Uma história contada de trás para frente: o histórico dos pacientes

Para alcançar nosso objetivo, o primeiro passo foi isolar os parasitas de pacientes

portadores da doença de Chagas selecionados aleatoriamente. Oito isolados foram estudados: MFS e

MJFL representam pacientes com a forma indeterminada; MAMA e MHBL forma cardíaca, MSLS

e MAB forma digestiva e AP e SAO forma cardiodigestiva da doença de Chagas. Em seguida, as

informações do prontuário desses pacientes no Hospital de Clínicas da Unicamp foram analisadas

juntamente com a equipe do GEDoCH (Tabela I). MFS contraiu a doença com apenas três dias de

idade, a partir de uma transfusão de sangue tendo passado por vários ciclos de tratamento com o BNZ,

cetoconazol e o itraconazol. O paciente mostrou-se resistente ao fármaco de escolha, o BNZ. Até o

momento da análise de dados, contrariando o descrito em clínica, o paciente, na época com 27 anos,

não apresentou cura da doença e permanece na forma indeterminada da doença (Tabela I).

Ainda sobre tratamentos, observou-se que nem todos os pacientes relataram a

administração de BZN. Nos registros analisados apenas três pacientes confirmaram tratamento: MFS

(indeterminado), MAMA (cardíaco) e MSLS (digestivo). Apenas para um paciente, SAO

(cardiodigestivo), foi possível traçar o histórico de evolução da doença. Em seu prontuário, o paciente

relata as datas de diagnóstico, fato que foi interessante para traçar paralelos entre as formas clínicas

(Tabela I). Três pacientes provenientes das áreas endêmicas de Minas Gerais e Pernambuco podem

ter contraído a doença a partir da transmissão vetorial e relataram ter outros familiares com a doença.

A existência de casos na família levanta um ponto interessante na divergência de forma clínica

apresentada pelos integrantes, como acontece nos casos dos pacientes: MHBL (indeterminado) e

MAB (digestivo) (Tabela I).

Analisando a sorologia e tratamento, temos os exames comumente realizados,

imunoflorescência e ELISA, com um achado interessante no paciente MSLS (digestivo) cujos exames

não são reativos. Em tratamento, não foi considerado nenhum medicamento de uso contínuo ou para

comorbidades, apenas se o paciente fez uso específico de algum fármaco para tratamento, exclusivo,

da doença de Chagas.

32

Tabela I: Histórico dos pacientes dos quais os isolados de Trypanosoma cruzi foram obtidos

Prontuários dos pacientes dos quais os isolados de Trypanosoma cruzi foram obtidos. F e M: Feminino e Masculino, respectivamente; SD: sem dado

encontrado no prontuário, BNZ: Paciente relatou tratamento prévio com Benzonidazol. Não Relevante: o paciente não relatou uso de fármacos

específicos para o tratamento da doença de Chagas.

Isolado Sexo Cidade Natal Forma Clínica Evolução Sorologia Histórico Familiar Transmissão Tratamento BNZ

MFS F Campinas - SP Indeterminada SDELISA reagente; IFI 1/40 e

XenodiagnósticoSD Transfusional

Benzonidazol

(Resistente); Itraconazol e

Ketoconazol

Sim

MJFL F Ibimirin - Pernambuco IndeterminadaHá suspeita de evolução para

forma Digestiva

ELISA reagente e

IFI 1/360

Irmã (sorologia não

reagente)

Área rural e agente

etiológico encontrado

na residência

SD SD

MAMA F Bambuí - Minas Gerais Cardíaca SD IFI 1/40 Irmão

Provável contato com

agente etiológico na

residência, vive em área

endêmica

Não relevante Não

MHBL F Uberaba - Minas Gerais Cardíaca SD IFI 1/640Mãe e irmão

(digestivos)

Provável contato com

agente etiológico na

residência, vive em área

endêmica

Benzonidazol (33 dias) Sim

MSLS F Banzae - Bahia Digestiva SD ELISA e IFI não reagentes SD SD Benzonidazol Sim

MAB F Luz - Minas Gerais Digestiva SD ELISA reagente e IFI 1/80Pai (cardíaco) e irmã

(cardíaca)SD Não relevante SD

AP M Caraponga - São Paulo Cardiodigestivo SD ELISA reagente e IFI 1/40 SD SD Não relevante SD

SAO M Tanabi - São Paulo Cardiodigestivo

Antes de 1990 - Indeterminado;

1990 - Cardíaco;

2013 - Cardiodigestivo

IFI 1/40 Irmão e Irmã SD Não relevante SD

33

Parte II: “Pois aqui, como vê, você tem que correr o mais que pode para continuar no mesmo

lugar”1: a estratégia do parasita para se adaptar ao ambiente de seu hospedeiro.

Após a coleta do sangue dos pacientes, os parasitas foram isolados e diferenciados da

forma tripomastigota (forma infectiva, não replicativa) para a epimastigota (forma não infectiva e

replicativa). Essa diferenciação demorou em média cerca de três semanas. Após a diferenciação, as

formas epimastigotas foram mantidas em meio de cultura por no máximo 3 meses. É importante

ressaltar que esse procedimento foi feito para que as células não se adaptassem ao meio de cultura e

assim, possuíssemos amostras com características mais próximas de parasitas isolados dos pacientes.

Para sobreviverem, os parasitas têm que se adaptar ao hospedeiro no qual se encontram.

Isso pode refletir em sua proliferação e até mesmo em sua estrutura morfológica (MESQUITA et al.,

2015). Assim, o primeiro parâmetro analisado foi a curva de proliferação desses isolados (Figura 7).

Os isolados das formas indeterminadas (Figura 7 – A), cardíacas (Figura 7 – B) e o isolado SAO

(Figura 7 – D – linha mais escura), apresentaram queda abrupta no número de parasitas no meio por

volta do dia 3 ou 4, não apresentando a fase estacionária comumente observada em cepas mantidas

em laboratório (Y e Tulahuen) (SILVA et al., 2011). Entretanto, os isolados da forma digestiva

(Figura 7 – C) e AP (Figura 7 – D – linha mais clara) apresentaram um período de fase estacionária

após o dia 4, perdurando até os últimos dias da contagem. Em um olhar geral a todas as curvas, temos

que o perfil de proliferação dos isolados apresenta similaridades de acordo com a forma clínica

manifestada. A genotipagem dos parasitas também foi realizada, onde todos os isolados, com exceção

de MJFL, pertencem à DTU TcII e MJFL à TcIII (Nakamura et al, em preparação).

1 “Now here, you see, it takes all the running you can do, to keep in the same place” (Lewis Carroll – Alice Trough the Looking Glass)

34

Figura 7: Curvas de proliferação dos isolados de Trypanosoma cruzi. Os isolados

foram cultivados conforme descrito em Material e Métodos, e, diariamente durante 7

dias, foi retirada uma alíquota e o número de células determinado a partir de contagem

em câmara de Neübauer. Isolados das formas A – Indeterminada; B – Cardíaca, C –

Digestiva e D – Cardiodigestiva.

35

Um outro fato interessante que observamos foram diferenças na mobilidade (velocidade

no batimento do flagelo), sendo o isolado MHBL com células mais ativas. Quanto à coloração do

precipitado após sedimentação, MJFL apresentou-se mais escuro que outros isolados (coloração

castanho claro) (dados não mostrados).

Na Tabelas II está representado o parâmetro obtido da análise das curvas de proliferação

(Figura 7), tais como o número de dias para os parasitas atingirem o início da fase estacionária,

importante para que todos eles sejam avaliados em um mesmo período. Assim, o isolado MFS em 3

dias atinge o início da fase estacionária, enquanto o isolado MSLS leva 5 dias para atingir a mesma

fase.

Tabela II: Número de dias para cada isolado atingir o início da fase estacionária

Epimastigotas (5,2 x 106céls/ml) foram incubados em meio de cultura e diariamente foram

removidas alíquotas para contagem do número de células em câmara de Neübauer. Dados obtidos

da Figura 7. A partir da Figura 7, o tempo de duplicação e o tempo de crescimento (proliferação)

foram calculados conforme descrito no material e métodos. Análise estatística: *teste-t, no qual

p<0,05 foi considerado significativo entre os isolados do mesmo grupo.

O tempo de duplicação entre os isolados de mesma forma clínica foi estatisticamente

diferente (Tabela II). Porém, para o tempo de proliferação, os isolados das formas indeterminada e

digestiva apresentam diferença significativa. Em contrapartida, não há diferença entre os isolados da

forma cardíaca e cardiodigestiva (Tabela II).

Isolado Forma Clínica Dias TD (hs) TC

MFS Indeterminado 3 22.48 ± 1.00* 9.30 ± 0.92*

MJFL Indeterminado 4 20.92±0.14* 10.90 ± 0.18*

MAMA Cardíaco 4 28.47 ± 0.36* 10.38 ± 0.30

MHBL Cardíaco 3 21.80 ± 1.02* 9.98 ± 1.06

MSLS Digestivo 5 27.28 ± 1.04* 11.56 ± 1.10*

MAB Digestivo 5 53.98 ± 1.96* 4.69 ± 0.26*

AP Cardiodigestivo 4 39.05 ± 1.89* 8.50 ± 0.88

SAO Cardiodigestivo 4 32.68 ± 1.33* 7.72 ± 0.65

36

Um questionamento que surgiu a partir da Tabela I foi se o tratamento prévio de pacientes

com BNZ influenciaria na sensibilidade dos parasitas ao medicamento in vitro. Assim, as EC50s dos

isolados para esse medicamento foram determinadas. De acordo com a Figura 8, pode-se observar

que apenas um isolado clínico, MJFL (proveniente de paciente na forma indeterminada) apresentou-

se resistente ao BNZ. Interessantemente, não há relatos em seu prontuário se houve, em algum

momento, tratamento com o fármaco. O paciente MSLS, que possui relato de tratamento, apresentou

maior sensibilidade ao fármaco. O restante dos isolados, independentemente ou não de tratamento

prévio, apresentou sensibilidade com valores semelhantes. Analisando os dados da MFS, MAMA,

MHBL, MAB, AP e SAO, a partir do teste ANOVA, a diferença entre eles é considerada não

significativa (p>0.05).

Figura 8: EC50 para determinação da resistência ao BZN. Apenas os

pacientes MFS, MHBL e MSLS relataram ter realizado tratamento como

fármaco de escolha. Análise estatística *t-teste no qual p<0,05 foi considerado

significante.

37

Parte III: “Um doce” questionamento: seria o metabolismo de carboidratos o protagonista?

A partir de experimentos previamente realizados no laboratório, notou-se que esses

isolados, diferentemente de outras cepas já adaptadas ao meio LIT, possuíam grande dependência de

glicose (Nakamura et al, em preparação). Nos experimentos de consumo de oxigênio, onde utilizou-

se um meio que mimetiza o meio intracelular e que não contém glicose, não foi possível observar

estimulação pelo ADP e pelo protonóforo CCCP. Assim, um novo experimento foi realizado,

utilizando o meio IB, que contém glicose. Conseguimos, assim, observar a estimulação por esses

compostos (Nakamura et al, em preparação).

Nesse sentido, decidimos concentrar nossas análises da proteômica no metabolismo de

carboidratos que aparentou ter relevância para os isolados clínicos. Além disso, enzimas do

metabolismo de carboidratos têm sido apontadas como alvos para uma terapia mais específica para

doença de Chagas. Por ser a primeira forma clínica nos hospedeiros humanos após o estabelecimento

da forma crônica da doença, e, uma vez que as outras manifestações clínicas derivam dessa, os

isolados da forma indeterminada foram utilizados como referência para nossas análises comparativas.

Os dados gerais dessas análises encontram-se sintetizados na Tabela IV. Seguindo o mesmo

raciocínio, os isolados das formas cardíaca e digestiva foram comparados com os da cardiodigestiva,

dado que esta última deriva de uma dessas formas.

38

Tabela IV: Relação das proteínas encontradas na análise proteômica dos isolados de

Trypanosoma cruzi

Forma clínica Isolados

Número de proteínas identificadas

Total Características

dos Isolados

Comuns

aos

Isolados

Indeterminada MFS 3.303 725

2.578 MJFL 3.263 685

Cardíaca MAMA 3.312 302

3.010 MHBL 3.230 220

Digestiva MSLS 3.131 328

2.860 MAB 3.162 359

Cardiodigestiva AP 3.127 267

2.803 SAO 3.163 303

Número de proteínas encontradas pelo DAVID. Características dos Isolados: proteínas

encontradas de maneira diferentemente expressa de maneira exclusiva em cada isolado, podendo

referenciar características selecionadas pelo ambiente do hospedeiro. Comuns aos Isolados:

proteínas encontradas na intersecção das análises, que podem referenciar características inerentes

àquela forma clínica.

4.1. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Cardíaca

Quando comparadas, nos isolados da forma indeterminada foram identificadas pelo

DAVID 206 proteínas, das quais 38 proteínas (18,5%) não estão anotadas e todas são de T. cruzi

marinkelli.

Convertendo 168 proteínas no software KEGG (KEGG ID), 67 (39,9%) foram

identificadas e 101 (60,1%) foram agrupadas em hipotéticas (3) e não caracterizadas (98). Quando a

lista de 168 proteínas foi analisada pelo KEGG Pathway, 17 proteínas foram vinculadas a uma via

metabólica e o restante foi dado como não encontrado. Das proteínas não encontradas, uma nova

busca foi realizada, utilizando outro software, o UNIPROT, a fim de identificar essas proteínas. O

39

quadro geral após as duas análises e distribuição nos diferentes processos metabólicos encontra-se

representado na Figura 9 (coluna preta).

O mesmo procedimento foi realizado para as proteínas abundantes dos isolados da forma

cardíaca, onde 539 foram encontradas pelo DAVID, das quais 99 não estão anotadas. Das proteínas

encontradas, 224 (41,6%) identificadas e 315 (58,4%) consideradas hipotéticas pelo KEGG ID. 78

proteínas foram correlacionadas em metabolismo pelo KEGG e aquelas não encontradas foram

analisadas pelo UNIPROT (Figura 9, coluna cinza). Observa-se que para os isolados da forma

indeterminada o metabolismo energético, proteínas estruturais e relacionadas à atividade nuclear

encontram-se em evidência. E para os da forma cardíaca, proteínas relacionadas à infecção, fator de

virulência e apoptose.

A partir desses dados, as proteínas dos metabolismos de carboidratos e energético foram

selecionadas e organizadas na Tabela V. Na Tabela V é possível observar que após análise

comparativa entre os isolados da forma indeterminada e cardíaca, encontram-se 8 proteínas

abundantes nos primeiros.

A citocromo c (tcr:508959.4) possui função de agente redutor entre a ubiquinona e o

complexo IV, na cadeia transportadora de elétrons (GINGER; SAM; ALLEN, 2012; GNIPOVÁ et

al., 2012). Estudos em T. brucei indicam que, associada a uma má função do complexo IV,

(ocasionada pelo knockout dos genes responsáveis pela estruturação do complexo) há uma

ineficiência no transporte de elétrons, levando a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs)

(GINGER; SAM; ALLEN, 2012; GNIPOVÁ et al., 2012). As EROs podem ter funções de sinalização

celular (entre a mitocôndria e a célula) e mediar processos de apoptose.

A glicosil transferase (tcr:504215.20) encontra-se envolvida com a produção de mucina.

A mucina é uma glicoproteína que contribui para proteção do parasita e estabelecimento da infecção

no hospedeiro (BUSCAGLIA et al., 2006). Há formação de uma superfície de membrana mosaica

cujas proteínas de membrana atuam na camuflagem do parasita (BUSCAGLIA et al., 2006). A

glicosil transferase, juntamente com a proteína hipotética (tcr:511279.60), cuja função é relacionada

à hidrolases de compostos O-glicosil, atuam na transferência dos resíduos de serina e treonina para

formação de âncoras GPI (glicosil fosfatidilinositol) associadas à proteção (BUSCAGLIA et al.,

2006).

40

A proteína de ligação ao GTP (tcr:508881.110), participa do sistema

de endomembranas Rab + ARF GTPases. As Rab funcionam como proteínas de direcionamento do

transporte endomembranas. Em amastigotas, atua juntamente com a ARF-6 para o transporte de

vesículas (VENKATESH et al., 2017).

A membrana do T.cruzi é recoberta com uma “capa” densa formada por moléculas da

família da trans-sialidase e de glicoproteínas contendo ácido siálico. Essa “capa” garante uma

interface com o ambiente do hospedeiro (OLIVEIRA et al., 2014). A trans-sialidase (tcr: 420293.20;

tcr: 510817.50) é responsável por transferir unidades de ácido siálico para moléculas contendo β-

galactopiranosil, sintetizando exclusivamente ligações α2-3 (OLIVEIRA et al., 2014; RUIZ DÍAZ et

al., 2015). A adição do ácido siálico juntamente com a mucina, confere resistência à lise pelo sistema

complemento do hospedeiro (OLIVEIRA et al., 2014; RUIZ DÍAZ et al., 2015).

41

Figura 9: Distribuição das proteínas diferentemente abundantes entre os isolados da

forma indeterminada (Indeterminated, Coluna Preta) quando comparados aos da forma

cardíaca (Cardiac, Coluna Cinza). Met – Metabolism; Signal – Signaling; CS&M – Cell

Structure and Motility; HP int – Host-parasite interaction; BP – Binding protein to e ND –

Not determinated.

42

Tabela IV: Comparação das proteínas do metabolismo de carboidratos diferentemente

abundantes entre os isolados da forma indeterminada quando comparados aos da forma

cardíaca e vice-versa.

*Nome da proteína e/ou função molecular determinada pelo UNIPROT. Met – metabolismo; C –

metabolismo de carboidrato e E – metabolismo energético. A cor branca refere-se a forma

assintomática da doença e cinza à sintomática (cardíaca).

A proteína não caracterizada (tcr:506977.60) tem função associada ao complexo MICOS

(mitochondrial contact site). Esse grupo de proteínas, descrito em humanos, bactérias e

proteobactérias, é responsável pela formação e manutenção das cristas mitocondriais (HUYNEN et

al., 2016). A manutenção das cristas está relacionada com a manutenção do espaço intermembranas

ID Protein Name MetUnique

peptides

Sequence

coverage

(%)

Molecular

weight

(kDa)

Indeterminate

tcr:504215.20 glycosyltransferase C 1 6.4 68,366

tcr:511279.60 hypothetical protein (hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds)* C 4 30.8 93,547

tcr:420293.20 C 8 25.5 79,632

tcr:510817.50 C 3 7.1 79,695

tcr:508959.4 cytochrome c E 1 40.4 12,239

tcr:504423.20 electon transport protein SCO1/SCO2 E 3 12.7 46,641

tcr:508881.110 GTP-binding protein E 2 6.3 72,175

tcr:506977.60 hypothetical protein (Uncharacterized protein - MICOS complex)* E 12 27 12,391

tcr:510265.10 quinone oxidoreductase E 3 51.5 36,021

Cardiac

tcr:408345.20 C 1 49.3 31,649

tcr:503793.10 C 2 43.3 38,021

tcr:508207.230 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase C 2 3.8 78.68

tcr:505183.120 aldo/keto reductase C 6 23 35,922

tcr:503815.10 alkyl-dihydroxyacetone phosphate synthase C 2 29 69,316

tcr:506937.10 cytosolic malate dehydrogenase C 4 47.6 35,589

tcr:511025.110 dihydrolipoyl dehydrogenase C 2 67.3 50,588

tcr:510667.120 galactokinase C 3 46.2 51,335

tcr:506953.49 C 3 60.7 31,412

tcr:436535.19 C 4 59.9 31,142

tcr:506529.508 glucose-6-phosphate isomerase, glycosomal C 3 47 68,365

tcr:506885.413 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase C 1 22.8 37,262

tcr:503493.10 hypothetical protein (uridylyltransferase activity)* C 4 39.4 55,862

tcr:508741.170 hypothetical protein (Uncharacterized Protein - glycerate kinase activity)* C 3 53.3 56,114

tcr:506177.20 lectin, mannose-binding vacuolar ptn sorting-associated C 3 12.1 66,019

tcr:508647.270 malic enzyme C 2 32.3 63,626

tcr:511911.130 phosphoglucomutase C 4 56.3 65,856

tcr:503955.40 C 3 11.9 78,216

tcr:506471.30 C 4 14.1 83,287

tcr:503767.10 C 2 16.1 78,458

tcr:508673.20 UDP-Gal or UDP-GlcNAc-dependent glycosyltransferase C 1 6.4 42,547

tcr:508183.10 5-demethoxyubiquinone hydroxylase, mitochondrial E 3 23.9 22,936

tcr:509011.70 adrenodoxin precursor E 2 22.7 17,808

tcr:511751.120 aldehyde dehydrogenase family E 1 5.7 56,857

tcr:509445.30 farnesyl synthetase E 2 16 39,373

tcr:506825.140 hypothetical protein (COX assembly mithocondrial protein)* E 1 11.4 22,096

tcr:507993.10 hypothetical protein (Uncharacterized Protein - proton-transporting ATP synthase complex assembly)* E 2 6.4 43,613

trans-sialidase

2-oxoglutarate dehydrogenase subunit

glucose-6-phosphate dehydrogenase

trans-sialidase

43

e, assim, ao potencial de membrana mitocondrial, necessário para os processos de fosforilação

oxidativa (CHATZI; MANGANAS; TOKATLIDIS, 2016).

Com relação a SCO1/SCO2 (tcr: 504423.20, electron transport protein SCO1/SCO2), em

humanos, participam da via de maturação da citocromo c oxidase (COX) atuando como

metalochaperonas, responsáveis pela formação do sítio de cobre dessa enzima (AICH ET AL E LIFE

2018). Mudanças nos níveis de ATP podem ser relevantes para a sinalização da proteína SCO1, que

regula a homeostase mitocondrial do cobre. Quando os níveis de ATP estão baixos, ocorre a ativação

da AMP quinase que fosforila a p53 (proteína supressora de tumor), que por sua vez, ativa a expressão

da SCO2 para modular o balanço entre a utilização de vias respiratórias e glicolíticas (BAKER;

COBINE; LEARY, 2017). Não foram encontradas referências na literatura relacionadas a essas

chaperonas em tripanossomatídeos.

Não encontramos trabalhos relacionados à função da quinona oxidoredutase (tcr:

510265.10) em tripanossomatídeos e parasitos em geral. Entretanto, em ratos, a NAD(P)H quinona

oxidorredutase 1 (NQO1) e 2 (NQO2) conferem proteção contra o estresse oxidativo e carcinogênese.

O knockout da NQO1 leva à diminuição da p53 reduzida e menor taxa de apoptose. Dados na literatura

sugerem que a NQO2 funciona similarmente à NQO1 (LEE et al., 2013).

Dentre as proteínas diferentemente abundantes da forma cardíaca (23), encontram-se a 2-

oxoglutarato (tcr:408345.20 e tcr:503793.10), pertencentes ao complexo da piruvato desidrogenase

que catalisa a conversão de piruvato a acetil-coA e CO2, na mitocôndria (BUSCAGLIA et al., 1996;

HAUSER et al., 1996; ZHUO et al., 2017). Também presente no mesmo complexo há a dihidrolipil-

dehidrogenase (tcr:511025.110) envolvida na clivagem de glicina e componente de alpha-keto ácido

desidrogenases, tal como a piruvato desidrogenase (GUTIÉRREZ-CORREA, 2010).

Foram encontradas também em abundância a 6-fosfofruto-2-quinase/frutose 2,6

bisfosfato (tcr:508207.230), moduladora alostérica positiva da piruvato quinase e da

fosfofrutoquinase 1, sendo importante para a regulação do metabolismo de

carboidratos(CHEVALIER et al., 2005); família de proteínas aldeído desidrogenase

(tcr:511751.120) possuem papel importante na oxidação de aldeídos, estando presentes na via

glicolítica e no metabolismo de álcool. Em Entamoeba histolytica, estima-se que as proteínas desse

grupo estão associadas à formação de acetil-CoA (PINEDA et al., 2010).

44

Associada à resistência natural ao BNZ, encontramos a enzima Aldo-ceto redutase

(tcr:505183.120), que juntamente com a álcool desidrogenase apresentam papel de redutase

específica à naptoquinonas, sendo dependentes de NADPH (GARCÍA-HUERTAS et al., 2017).

Alquildihydroxicetona (tcr:503815.10), em Leishmania sp. atua na formação de éter

lipídios que participam em associações com âncoras GPI e glicoproteínas de membrana associadas

ao glicossomo (LUX et al., 2000).

Associada à cadeia transportadora de elétrons, encontra-se a proteína de agrupamento

mitocondrial COX1 (proteína hipotética, tcr:506825.140), responsável pela manutenção das proteínas

do complexo IV (em humanos) (CLEMENTE et al., 2013). A 5-demethoxiubiquinona hidrolase

(mitocondrial), proteína homóloga a COQ7 – biossíntese de ubiquinona (tcr: 508183.10), é a proteína

que intermedia a formação da ubiquinona, cofator responsável pelo transporte de elétrons entre o

complexo II e o III (STENMARK et al., 2001).

A malato desidrogenase citosólica (tcr:506937.10) é responsável pela conversão de

malato a piruvato e formação de NADPH. Em T.cruzi participa do catabolismo de aminoácidos

aromáticos, no citosol, tendo relevância metabólica no equilíbrio redox (LEROUX et al., 2011;

RONDÓN-MERCADO et al., 2017). Foi encontrada também a enzima málica (tcr:508647.270) que

possui duas isoenzimas, a citosólica e a mitocondrial. É responsável pela catálise de piruvato a malato

e é modulada positivamente na presença de L-aspartato e NADPH (RANZANI et al., 2017).

A galactoquinase (tcr:510667.120) atua na síntese da UDP galactose e formação de

glicoconjugados que, em T.cruzi, são importantes para sobrevivência do parasita(LOBO-ROJAS et

al., 2016). A fosfoglicomutase (tcr:511911.130) catalisa a interconversão de Glicose-6-fosfato e

Glicose-1-fosfato, sendo também um intermediador na síntese de galactose. O que justitifca o parasita

não possui transportador para esse açúcar tendo que o produzir endogenamente, (PENHA et al.,

2009). A proteína hipotética (tcr: 503493.10) tem possível função de uridilatransferase. Pode

participar do metabolismo de galactose, sendo a enzima responsável pela formação da UDP-galactose

(YUZYUK et al., 2018). A UDP-galactose (tcr:508673.20) participa na ativação dessa molécula de

galactose, a fim de torná-la energeticamente viável em suas reações de interconversão (ROPER;

FERGUSON, 2003).

Presente na via das pentoses,a glicose-6-desidrogenase (tcr:506953.49 e tcr:436535.19),

que realiza a conversão da β-d-glicose-6-fosfato à 6-fosfoglico-δlactona e tem como resultado a

45

redução do NADP+ a NADPH + H+ (coenzima importante para a detoxificação de hidroperóxidos do

parasita) e ribose-5-fosfato, utilizada na síntese de nucleotídeos (LIMA et al., 2015; MERCALDI et

al., 2016). Essa enzima está relacionada à resistência ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2

(MIELNICZKI-PEREIRA et al., 2007).Em T.cruzi está presente tanto no glicossomo, quanto no

citosol.

A Glicose-6-fosfato isomerase (tcr:506529.508), localizada no glicossomo, realiza o

segundo passo da glicólise, na isomerização da glicose-6-fosfato a grutose-6-fosfato (BROUTIN et

al., 2006; IGOILLO-ESTEVE et al., 2007).

A Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (tcr:506885.413) realiza a conversão

de gliceraldeído-3-fosfato para D-glicerato-1,3-bisfosfato e produção de NADH + H+. Além da

participação na via glicolítica, também há indícios que se encontra envolvida na regulação da

transcrição de DNA, sendo um provável indicador de modificações celulares (LEANDRO DE JESUS

et al., 2017).

A lectina (tcr:506177.20) é uma proteína que se associa a glicoproteínas em um sistema

de receptores envolvidos nos processos de endocitose. Em formas epimastigotas e tripomastigotas

são encontradas em compartimentos intracelulares, sendo expostas na membrana quando o parasita

se encontra na forma amastigota (ARROYO-OLARTE et al., 2018; BROSSAS et al., 2017). Neste

caso foi encontrada uma proteína ligante de manose, associada ao endereçamento para o lisossomo

(OLSON; DAHMS, 2015).

A proteína não caracterizada (proteína hipotética, tcr:507993.10) parece estar envolvida

na formação do complexo da ATP sintase. Em E.coli estudos apontam que há formação de

subcomplexos para evitar que qualquer alteração na proteína cause danos à permeabilidade da

membrana mitocondrial (DECKERS-HEBESTREIT, 2013).

Com relação as proteínas, precursor de adrenoredoxina (tcr:509011.70), farnesilsintetase

(tcr:509445.30) e a proteína não caracterizada (atividade sugerida de glicerato quinase) (tcr:

508741.170) não foram encontrados trabalhos relacionados suas funções em tripanosomatídeos e

parasitos em geral. Entretanto, essas proteínas encontram-se anotadas na análise proteômica total de

El-Sayed e colaboradores (EL-SAYED et al., 2005).No caso das trans-sialidases tcr:503955.40;

tcr:506471.30 e tcr:503767.10, podemos afirmar serem isoformas das proteínas de mesmo nome

descritas para forma indeterminada.

46

4.2. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Digestiva

O mesmo procedimento foi realizado para as proteínas mais abundantes na análise dos

isolados da forma indeterminada vs. os da forma digestiva 266 foram encontradas pelo DAVID, das

quais 42 não estão anotadas. 26 proteínas predominantes da forma indeterminada foram identificadas

pelo KEGG.Contudo, 197 proteínas foram enquadradas por este software em não encontradas. Desse

modo, uma nova busca foi realizada utilizando outro software, o UNIPROT, a fim de identificar essas

proteínas. O quadro geral após as duas análises e distribuição nos diferentes processos metabólicos

encontra-se ilustrado na Figura 10 (coluna preta).

Para as proteínas mais abundantes nos isolados da forma digestiva, 453 foram

encontradas pelo DAVID, das quais 98 não estão anotadas.65 proteínas abundantes da forma

digestiva foram identificadas pelo KEGG.Porém, 385 proteínas foram enquadradas por este software

como não encontradas. Conforme mencionado anteriormente, uma nova busca foi realizada utilizando

o software UNIPROT. O quadro geral após as duas análises e distribuição nos diferentes processos

metabólicos encontra-se ilustrado na Figura 10 (coluna cinza).


selecionadas e organizadas conforme a Tabela VI. Os isolados da forma indeterminada, quando

comparada aos da digestiva, apresentaram 17 proteínas predominantes, das quais 6 foram comuns às

encontradas na análise desta forma com a forma cardíaca da doença: Proteína de transporte de elétrons

SCO1/SCO2 (tcr:504423.20); Proteina de ligação com GTP (tcr:508881.110); Trans-sialidase

(tcr:420293.20 e tcr:510817.50) e Proteína não caracterizada (proteínas hipotéticas, tcr:506977.60 e

tcr:511279.60).

47



digestiva (Coluna Cinza). Met – Metabolism; Signal – Signaling; CS&M – Cell Structure

and Motility; HP int – Host-parasite interaction; BP – Binding protein to e ND – Not

determinated.

48

Tabela V: Comparação das proteínas do metabolismo de carboidratos diferentemente

abundantes entre a forma indeterminada quando comparados aos da forma digestiva e vice-

versa.

*Nome da proteína e/ou função molecular determinada pelo UNIPROT. Met – metabolismo; C –

metabolismo de carboidrato e E – metabolismo energético. A cor branca refere-se a forma

assintomática da doença e cinza à sintomática (digestiva).


peptides

Sequence

coverage

(%)

Molecular

weight

(kDa)

Indeterminated

tcr:509875.50 beta galactofuranosyl glycosyltransferase C 2 17.3 50,751

tcr:506263.30 D-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase-protein C 2 41 39.15

tcr:511025.50 glucosamine-6-phosphate isomerase C 2 59.1 31,442

tcr:503823.40 glycosyl hydrolase-like protein C 1 7.4 118.62

tcr:505989.74 peroxisome biogenesis factor 1 C 5 10.6 100.68

tcr:511279.60 hypothetical protein (Uncharacterized - hydrolyzing O-glycosyl compounds)* C 4 30.8 93,547

tcr:420293.20 C 8 25.5 79,632

tcr:510817.50 C 3 7.1 79,695

tcr:508387.130 E 5 12.6 54,809

tcr:506297.110 E 3 3.6 138.97

tcr:509597.20 carbonic anhydrase-like protein E 3 13.3 71,129



tcr:510131.40 haloacid dehalogenase-like hydrolase E 3 39.9 34,722

tcr:506977.60 hypothetical protein (Uncharacterized - MICOS complex)* E 2 27 12,391

tcr:507807.10 hypothetical protein (Uncharacterized - ATPase activity)* E 2 1.2 160

tcr:509127.50 mitochondrial carrier protein E 2 20.4 36,462

tcr:509247.20 small GTPase E 3 18.9 30,597

tcr:509011.54 ubiquinol-cytochrome C reductase E 3 33.8 82,634

Digestive

tcr:503793.10 2-oxoglutarate dehydrogenase subunit C 2 43.3 38,021

tcr:503733.20 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase C 1 1.7 83,957





tcr:506953.49 C 3 60.7 31,412

tcr:436535.19 C 4 59.9 31,142



tcr:506177.20 lectin C 3 12.1 66,019

tcr:508647.270 malic enzyme C 2 32.3 63626

tcr:503641.19 peroxisome assembly protein C 1 16.8 30,927


tcr:503767.10 trans-sialidase C 2 16.1 78,458


tcr:509717.20 Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex E 5 45.2 49,659


tcr:507993.10hypothetical protein (Uncharacterized - proton-transporting ATP synthase

complex assembly)*E 2 6.4 43,613

tcr:506825.140 hypothetical ptn (COX assembly mithocondrial protein)* E 1 11.4 22,096

tcr:510647.60 small GTP-binding protein E 1 18.6 20,495

trans-sialidase

ATPase


49

Exclusivas para essa análise encontramos a ATPase (tcr:506297.110 e tcr:508387.130) e

a proteína hipotética com atividade ATPase (tcr:507807.10). Membros da família Na+-ATPases em

T.cruzi estão envolvidas na captação do mio-inositol que é importante para a proliferação do parasita

(SARAIVA et al., 2009).

-galactofuranosil glicosiltransferase (tcr:509875.50), descrita em Trypanosoma

rangelli, está envolvida na produção de gliconjugados para a síntese de proteinas de membrana. Em

T.cruzi a galactofuranose é encontrada na “capa” de lipopeptideosglicanos que estão envolvidos na

adesão à célula mamífera e na internalização do parasita (STOCO et al., 2012).

A glucosamina-6-fosfato isomerase (tcr:511025.50) é descrita como uma proteína de

membrana importante no encistamento em Giardi aintestinalis (ELIGIO-GARCÍA et al., 2011).

Hidrolase ácida dehalogenase-like – HAD-like - (tcr:510131.40) em Leishmania sp.

participa da homeostase de fatores oxidorredutores e detoxificação celular. Participa também da

resposta ao estresse podendo ser responsável pela supressão de genes e utilização de compostos de

reserva, indicando um papel na diferenciação celular (ALCOLEA, 2011).

Com relação ao Fator de biogênese de peroxissomo (tcr:505989.74), estudos realizados

em Leishmania sp. indicam que o peroxissomo e o glicossomo possuem estruturação a partir dos

mesmos genes (PAF1 e PEX2). Essa proteína é responsável pela formação de éteres de lipídios,

fatores relacionados à virulência. Por ser o centro da organização das enzimas responsáveis pela

glicólise e síntese de lipídios nos parasitas, o glicossomo torna-se um importante alvo para o

desenvolvimento de novos fármacos específicos (FLASPOHLER et al., 1997).

Small GTPase (tcr:509247.20) atua juntamente com o transporte por RAB11, associando-

se à âncora GPI com a trans-sialidase, formando o CVC (contractile vacuole complex - rico em

lipídios estruturais), que controla o tráfego de proteínas para a âncora GPI, sendo relacionado à fatores

de invasão (NIYOGI et al., 2015).

A glicosil hidrolase-like (tcr:503823.40) pertence à classe de proteínas responsáveis por

retirar a energia presente nas ligações de carboidratos complexos. São principalmente lisoenzimas, as

quais diminuem significativamente a energia de ativação das reações de hidrólise (DAVIES;

HENRISSAT, 1995).

50

Importante para comunicação entre o citosol e a mitocondria, encontra-se a proteína

carreadora mitocondrial (tcr:509127.50). Essa intercomunicação permite a troca de intermediários

metabólicos, bem como a manutenção do equilíbrio redox da célula. Há relatos dessa família de

carreadores nas funções de transportador de oxoglutarato, bem como na funcionalidade da lançadeira

oxalato/malato em T. brucei, (COLASANTE et al., 2018).

Atuando na cadeia transportadora de elétrons, no core do complexo III, a ubiquinol-

citocromo c redutase (tcr:509011.54) é repsonável pela transferência de elétrons entre a ubiquinona

(complexos I e II) e o complexo-FeS da terceira unidade proteíca da cadeia (LEE, 2014).

A anidrase carbônica proteína-like (tcr: 509597.20) atua na regulação das concentrações

de CO2 celulares e nas taxas de proliferação e virulência dos parasitos (NOCENTINI et al., 2018) e

D-isômero específico 2-hidroxiácido desidrogenase (tcr:506263.30) possui função semelhante a uma

lactato desidrogenase, atuando em processos de fermentação (DIAS et al., 2018).

A forma digestiva apresentou 20 proteínas diferentemente abundantes, sendo 17 comuns

às encontradas na análise da forma indeterminada com a forma cardíaca da doença. Sendo comuns à

forma cardíaca: 2-oxoglutarato desidrogenase (tcr:503793.10); 5-demetoxiubiquinona hidrolase

(tcr:508183.10); 6-fosfofructo-2-kinase/frutose-2,6-bifosfatase (tcr:503733.20); precursor de

adrenodoxina (tcr:509011.70); aldo-ceto redutase (tcr:505183.120); alquil dihidroxicetona fosfato

sintase (tcr:503815.10); proteína hipotética (tcr:506825.140 e tcr:507993.10); malato desidrogenase

citosólica (tcr:506937.10); galactoquinase (tcr:510667.120); glicose-6-fosfato desidrogenase

(tcr:506953.40 e tcr:436535.19); glicose-6-fosfato isomerase – glicossomal (tcr:506529.508);

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (tcr:506885.413); lectina (tcr:506177.20); enzima málica

(tcr:508647.270); fosfoglicomutase (tcr:511911.130), trans-sialidade – mesma isoforma –

(tcr:503767.10). Interessantemente, quanto à forma indeterminada da análise anterior, foram

encontradas diferentes isoformas da trans-sialidase.

A acetiltransferase – componente do complexo piruvato desidrogenase (tcr:509717.20)

catalisa a conversão de piruvato a acetil-CoA e CO2 na mitocôndria(WANG et al., 2014).

O peroxissomo encontra-se co-relacionado ao glicossomo, e o fator de formação do

peroxissomo (tcr:503641.19) atua na biogênese da matriz glicossomal, bem como à sua membrana

(FLASPOHLER et al., 1997).

51

Por fim, small GTP de ligação (tcr:510647.60), assim como as GTPs descritas

anteriormente, parecem estar correlacionadas ao sistema de vesículas associado à Rab11

(VENKATESH et al., 2017).

4.3. Isolados da forma indeterminada vs os da forma Cardiodigestiva

Comparando-se as proteínas abundantes nos isolados da forma indeterminada com os da

forma cardiodigestiva, 240 foram encontradas pelo DAVID, das quais 46 não estão anotadas pelo

software. 27 proteínas abundantes da forma indeterminada foram identificadas pelo KEGG.

Entretanto, 212 proteínas foram enquadradas por este software em não encontradas. Desse modo,

uma nova busca foi realizada utilizando o software UNIPROT. O quadro geral após as duas análises

e distribuição nos diferentes processos metabólicos encontra-se ilustrado na Figura 11 (coluna preta).

Para as proteínas abundantes nos isolados da forma cardiodigestiva, 417 foram

encontradas pelo DAVID, das quais 93 não estão anotadas. 56 proteínas abundantes da forma

indeterminada foram identificadas pelo KEGG e 361 proteínas foram enquadradas por este software

como não encontradas. Desse modo, uma nova busca foi realizada, utilizando o software UNIPROT.

O quadro geral após as duas análises e distribuição nos diferentes processos metabólicos encontra-se

ilustrado na Figura 11 (coluna preta).

52



cardiodigestiva (Coluna Cinza). Met – Metabolism; Signal – Signaling; CS&M – Cell


Not determinated.


selecionadas e organizadas conforme a Tabela VII.

53

Os isolados da forma indeterminada, quando comparados aos da cardiodigestiva,

apresentaram 12 proteínas mais abundantes, nas quais apenas três foram não foram anteriormente

descritas: ATP sintase, cadeia alfa – precursor mitocondrial (tcr:510395.10) e ATP sintase vacuolar

(tcr:511145.50), que participam de processos de produção de energia.

Tabela VI: Comparação das proteínas do metabolismo de carboidratos diferentemente

abundantes entre a forma indeterminada quando comparados aos da forma cardiodigestiva e

vice-versa.

Proteínas identificadas com*Nome da proteína e/ou função molecular determinada pelo UNIPROT.

Met – metabolismo; C – metabolismo de carboidrato e E – metabolismo energético. A cor branca

refere-se a forma assintomática da doença e cinza à sintomática cardiodigestiva).


peptides

Sequence

coverage

(%)

Molecular

weight

(kDa)

Indeterminated

tcr:511279.60 hypothetical protein (Uncharacterized - hydrolyzing O-glycosyl compounds)* C 4 30.8 93,547

tcr:505989.74 peroxisome biogenesis factor 1 C 5 10.6 100.68

tcr:420293.20 C 8 25.5 79,632

tcr:510817.50 C 3 7.1 79,695

tcr:510395.10 ATP synthase, alpha chain, mitochondrial precursor E 1 36.4 25,857




tcr:506977.60 hypothetical protein (Uncharacterized - MICOS complex)* E 3 8.3 108.6

tcr:510877.120 NADPH-dependent FMN/FAD containing oxidoreductase E 7 17.5 68,631

tcr:503809.20 E 2 14.1 45,092

tcr:508479.190 E 5 21 33,814

tcr:509247.20 small GTPase E 3 18.9 30,597

tcr:511145.50 vacuolar ATP synthase E 1 7.7 19,781

Cardiodigestive

tcr:408345.20 C 1 49.3 31,649

tcr:503793.10 C 2 43.3 38,021


tcr:506953.49 C 3 60.7 31,412

tcr:436535.19 C 4 59.9 31,142



tcr:503493.10 hypothetical protein (Uncharacterized - uridylyltransferase activity)* C 4 39.4 55,862

tcr:506177.20 lectin C 3 12.1 66,019

tcr:508647.270 malic enzyme C 2 32.3 63,626


tcr:503767.10 C 2 16.1 78,458

tcr:503955.40 C 3 11.9 78,216

tcr:509281.20 C 1 6.7 79,272



tcr:506825.140 hypothetical protein (COX assemble mithocondrial protein)* E 1 11.4 22,096

tcr:507993.10 hypothetical protein (Uncharacterized - proton-transporting ATP synthase complex assembly)* E 2 27 12,391

tcr:506401.50 malonyl-CoA decarboxylase, mitochondrial E 3 7 80,297

tcr:503999.70 ras-family member, GTP-binding protein E 4 15.6 42,984

tcr:510647.60 small GTP-binding protein E 1 18.6 20,495

2-oxoglutarate dehydrogenase subunit


peroxisome assembly protein

trans-sialidase

trans-sialidase

54

A proteína NADPH dependente FMN/FAD – com atividade de oxidorredutase

(tcr:510877.120) atua na redução de ERNs (espécies reativas de nitrogênio) e EROs, provenientes do

metabolismo do parasita (PORTAL et al., 2008).

Os isolados da forma cardiodigestiva apresentaram 16 proteínas mais abundantes, das

quais 16 foram comuns às análises anteriormente analisadas, destacando-se as isoformas da trans-

silidase, nas quais a tcr:503767.10 é comum aos isolados das formas cardíaca e digestiva e a

tcr:509281.20 apenas aos da forma cardíaca. A proteína hipotética (tcr:503493.10) exclusiva apenas

aos isolados da forma cardíaca e as outras 14 proteínas foram comuns aos isolados das duas formas

sintomáticas. A trans-sialidase (isoformas diferentes), foram comuns às análises dos isolados das

formas indeterminadas.

4.4. Isolados da forma Cardíaca vs os da forma Cardiodigestiva

Comparando-se as proteínas abundantes desses dois grupos de isolados, para os isolados

da forma cardíaca, 360 proteínas foram encontradas pelo software DAVID conforme ilustrado na

Figura 12 (coluna preta). Para os isolados da manifestação cardiodigestiva, foram identificadas 166

proteínas abundantes, classificadas na Figura 12 (coluna cinza).

Para esta análise, todas as proteínas relacionadas ao metabolismo energético e de

carboidratos, Tabela VIII, encontradas foram anteriormente descritas.

55




Structure and Motility; HP int – Host-parasite interaction; BP – Binding protein to e ND – Not

determinated.

56

Tabela VII: Comparação das proteínas do metabolismo de carboidratos diferentemente

abundantes entre a forma cardíaca quando comparados aos da forma cardiodigestiva e vice-

versa.



refere-se a forma cardiodigestiva da doença e cinza à cardíaca).

4.5. Isolados da forma Digestiva vs os da forma Cardiodigestiva

Quando comparadas as proteínas abundantes nos isolados da forma digestiva vs os da

forma cardiodigestiva 270 foram encontradas pelo DAVID para os isolados da forma digestiva,

conforme ilustrado na Figura 13 (coluna preta). Para os isolados da manifestação cardiodigestiva,

foram identificadas 217 proteínas abundantes (Figura 13, coluna cinza).

ID Gene Name MetUnique

peptides

Sequence

coverage (%)

Molecular

weight

Cardiodigestive

tcr:504867.90 glycerol-3-phosphate acyltransferase C 5 10.1 79,402

tcr:504215.20 glycosyltransferase C 1 6.4 68,366

tcr:504147.180 hypothetical protein E 2 7.4 41,256

tcr:506401.50 malonyl-CoA decarboxylase, mitochondrial precursor E 3 7 80,297


Cardiac

tcr:508207.230 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase C 2 3.8 78.68



tcr:511025.110 dihydrolipoyl dehydrogenase C 2 67.3 50,588


tcr:508741.170 hypothetical protein C 3 53.3 56,114

tcr:397937.5 N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase-like protein C 1 47.7 14,348

tcr:506471.30 trans-sialidase C 4 14.1 83,287

tcr:508673.20 UDP-Gal or UDP-GlcNAc-dependent glycosyltransferase C 1 6.4 42,547

tcr:511751.120 aldehyde dehydrogenase family E 1 5.7 56,857


tcr:509445.30 farnesyl synthetase E 2 16 39,373

tcr:503811.50 hypothetical protein E 1 9.9 46,783

tcr:506579.110 hypothetical protein E 3 8.3 108.6

tcr:509169.30 hypothetical protein E 1 28 45,439


tcr:503809.20 peroxisome assembly protein E 2 14.1 45,092


57





Not determinated.

58

Para esta análise, todas as proteínas relacionadas ao metabolismo energético e de

carboidratos encontradas, Tabela IX, foram descritas anteriormente.

Tabela VIII: Comparação das proteínas do metabolismo de carboidratos diferentemente

abundantes entre a forma digestiva quando comparados aos da forma cardiodigestiva e vice-

versa.



refere-se a forma cardiodigestiva da doença e cinza à digestiva).

ID Gene Name MetUnique

peptides

Sequence

coverage (%)

Molecular

weight

Cardiodigestive

tcr:408345.20 2-oxoglutarate dehydrogenase subunit C 1 49.3 31,649

tcr:509875.50 beta galactofuranosyl glycosyltransferase C 2 17.3 50,751

tcr:511025.50 glucosamine-6-phosphate isomerase C 2 59.1 31,442

tcr:503823.40 glycosyl hydrolase-like protein C 1 7.4 118.62

tcr:503955.40 C 3 11.9 78,216

tcr:509281.20 C 1 6.7 79,272

tcr:506297.110 E 3 3.6 138.97

tcr:508387.130 E 5 12.6 54,809

tcr:509597.20 carbonic anhydrase-like protein E 3 13.3 71,129

tcr:509649.59 hypothetical protein (GTP binding) E 1 10 46,901

tcr:509127.50 mitochondrial carrier protein E 2 20.4 36,462


tcr:509011.54 ubiquinol-cytochrome C reductase E 3 33.8 82,634

Digestive

tcr:503733.20 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase C 1 1.7 83,957







tcr:503641.19 E 1 16.8 30,927

tcr:503809.20 E 2 14.1 45,092

tcr:510265.10 quinone oxidoreductase E 3 51.5 36,021


ATPase

trans-sialidase

peroxisome assembly protein

59

5. DISCUSSÃO

Parte I: Uma história contada de trás para frente: o histórico dos pacientes

A história dos isolados de T. cruzi a partir do histórico dos pacientes

A maioria dos pacientes que chega ao GEDoCh reside ou passou parte da vida em área

endêmica para doença de Chagas. O mesmo padrão pode ser observado em sete dos oito históricos

dos pacientes dos quais se originaram os isolados clínicos utilizados no presente estudo. nica exceção

é o paciente MFS que será descrito adiante. Além disso, é registrado que, em sua maioria, os pacientes

possuem casos de doença de Chagas na família. É interessante observar a variedade de formas clínicas

de uma mesma região. Como observado na Tabela I, os pacientes MHBL e MAB relatam, em seus

prontuários, que há parentes com a doença de Chagas, porém com formas clínicas diferentes daquelas

que possuem.

Dentre os isolados há três casos que se destacam. MHBL é um paciente que teve

reativação, ou seja, a parasitemia foi detectável após tratamento de imunossupressão (LATTES;

LASALA, 2014; PINAZO et al., 2013). MFS, por sua vez, teve sua infecção a partir de transfusão

sanguínea ainda quando recém-nascida. Apesar do alto índice de cura relatado em crianças na fase

aguda tratadas com BNZ, a paciente não respondeu ao tratamento com o fármaco. Uma hipótese que

pode ser levantada é ter ocorrido uma seleção por pressão do BNZ no doador de sangue, selecionando

os parasitos resistentes ao fármaco. O terceiro caso é do paciente MSLS que possui diagnóstico

positivo para doença de Chagas, porém sorologia negativa. Tal fato, considerado um fator de risco

em áreas endêmicas, pode ser resultante de um déficit na resposta humoral do hospedeiro após a

infecção pelo parasito (FURUCHÓ et al., 2008; SALOMONE et al., 2003; ZINGALES, 2017).

60

Parte II: “Pois aqui, como vê, você tem que correr o mais que pode para continuar no mesmo

lugar”2: a estratégia do parasita para se adaptar ao ambiente de seu hospedeiro.

A Hipótese da Rainha Vermelha, proposta em 1973 por Leigh Van Halen (VALEN,

1973), serve como contexto interessante para analise dos parasitas estudados. De acordo com a

mesma, a co-evolução funciona como uma corrida armamentista entre parasitas e hospedeiros, já que

um encontra-se sob pressão do outro (DECAESTECKER et al., 2007; RABAJANTE et al., 2015;

STENSETH; SMITH, 1984; VALEN, 1973). Quaisquer vantagens ou desvantagens adquiridas pelos

parasitas em relação ao hospedeiro são passadas para as próximas gerações, bem como as adaptações

do hospedeiro para conter os avanços do parasita (RABAJANTE et al., 2015; STENSETH; SMITH,

1984). Desse modo, ambos evoluem para permanecer em um mesmo lugar, no qual o hospedeiro não

seja prejudicado pelo parasita, que por sua vez necessita sobreviver nesse hospedeiro hostil.

Com esse plano de fundo, podemos analisar o comportamento dos parasitas em seus

respectivos hospedeiros. O fator ambiental, ou seja, o hospedeiro, pode ser de grande ajuda para

compreendermos as diferenças entre isolados de mesma forma clínica e as diferenças entre as formas

clínicas. Como observado, isolados de mesma forma clínica possuem algumas características comuns,

porém há diferenças entre as quatro formas da doença de Chagas. Para tentarmos desvendar tal

questão é necessário um olhar no tecido no qual os parasitas se hospedam.

Os isolados clínicos podem ser um representativo daqueles que melhor se adaptaram ao

hospedeiro e prosseguem seu ciclo biológico escapando do controle do sistema imune do hospedeiro.

Após estabelecimento da fase crônica, há estudos em modelo animal que indicam que os parasitas

primeiramente criam ninhos nos tecidos intestinais e depois, sob influência do sistema imune do

hospedeiro, há migração para outros tecidos (FERREIRA et al., 2016; HENRIQUES et al., 2014;

LEWIS et al., 2014).

Uma hipótese, a partir dos resultados obtidos, para o tropismo do parasito pode ser a

alteração epigenética ocasionada por sinalizadores metabólicos. Tais sinalizadores podem resultar em

alterações na expressão de enzimas da glicólise tornando o parasito melhor adaptado para

determinado tecido, aumentando assim sua proliferação e dano celular, caracterizando as fibroses.

2 “Now here, you see, it takes all the running you can do, to keep in the same place” (Lewis Carroll – Alice Trough the Looking Glass)

61

A utilização de carboidratos pelo epitélio digestório como combustível energético precisa

ser secundária, já que é a partir daí que a glicose será absorvida e disponibilizada para tecidos

altamente dependentes de glicose (NEWSHOLME; CARRIE, 1994; ROEDIGER, 1982). Dessa

maneira, há maior disponibilidade de glicose para os tecidos musculares adjacentes. Tal fato pode

explicar a curva de proliferação das formas indeterminadas. De forma similar o tecido cardíaco utiliza

cerca de 35-40% de carboidratos como combustível principal (PINNELL; TURNER; HOWELL,

2007), favorecendo a via da β-oxidação para obtenção de energia (cerca de 60%) (PINNELL;

TURNER; HOWELL, 2007).

Em nossas condições experimentais, os isolados da forma indeterminada e cardíaca

apresentaram uma dependência significativa em relação a glicose (Figura 7). Para as formas

digestivas, é importante ser observado outro mecanismo: a presença da fase estacionária de

proliferação. Esses isolados, e o isolado AP, podem possuir um maquinário metabólico preparado

para utilização de aminoácidos, garantindo a presença da fase estacionária, mesmo com a depleção

de carboidratos no meio. Tal fato pode estar associado ao metabolismo de glutamina presente no

tecido intestinal. A glutamina será convertida a 2-oxoglutarato (NEWSHOLME; CARRIE, 1994;

ROEDIGER, 1982), que poderá ser utilizado para o ciclo de Krebs dos parasitos.

Curvas de Proliferação: como o histórico do paciente influencia o comportamento dos parasitas

A análise dos genótipos dos oito isolados clínicos foi realizada por nosso grupo. Fatores

como a distribuição geográfica dos diferentes genótipos de T. cruzi e casos clínicos relatados

contribuem para a teoria de que existe uma relação entre alguns dos genótipos e a forma clínica da

doença. Isso ocorre em três grupos: TcI - formas indeterminadas e cardíacas; TcII e TcV - forma

digestiva. Entretanto, diferentemente do esperado, sete isolados (independentemente da sua forma

clínica) pertencem à mesma DTU (TcII), enquanto apenas um isolado da forma indeterminada

pertence à TcIII (MJFL) (BUSCAGLIA; DI NOIA, 2003; CARRANZA et al., 2009; ZINGALES,

2011). No entanto, esse fato é explicado pela distribuição geográfica da DTU na América do Sul

(Figura 3) (ZINGALES, 2011).

Uma característica que nos chamou atenção nas culturas das formas epimastigotas foi a

coloração do precipitado celular que provavelmente reflete o conteúdo de heme (CAZZULO;

SUNDARAM; KORNBERG, 1969; HEALY et al., 1992). A hemina atua como fonte de heme para

62

os organismos (CUPELLO et al., 2011) e, no caso de T. cruzi, o parasito precisa captar essa molécula

a partir do meio, já que não a sintetiza (CUPELLO et al., 2011). O heme é importante fonte de ferro

para a célula, criando um ambiente redutor, principalmente na mitocôndria, compondo não apenas,

mas também, proteínas da cadeia respiratória (citocromo c, citocromo c oxidase e citocromo c

redutase (CUPELLO et al., 2011)).

Assim, o estudo dos isolados começou a dar relevância a um outro fator: a interferência

do meio ambiente (sistema fisiológico de cada paciente) no tropismo do parasita nos tecidos para a

manifestação clínica. Ao mudar o ambiente fisiológico dos parasitas para um comum a todos (meio

de cultura), foi possível observar que isolados provenientes das diferentes formas clínicas

apresentaram diferentes perfis de proliferação. No entanto, existem semelhanças quando comparadas

entre seus pares biológicos, ou seja, isolados da mesma forma clínica provenientes de pacientes

diferentes.

Conforme observado na Figura 7, os isolados de pacientes portadores da forma

indeterminada e cardíaca têm maior dependência da glicose. Pois, perto do terceiro ou quarto dia há

queda no número de parasitas encontrados na cultura. Os isolados da forma digestiva, no entanto,

parecem ter maior sobrevivência à falta de glicose no meio, apresentando na curva uma fase

estacionária duradoura. Curiosamente, nos isolados de formas cardiodigestivas, há uma diferença

entre o padrão das duas curvas. Essa diferença pode ser explicada a partir da análise do histórico da

doença nos pacientes. O isolado do paciente SAO, conforme descrito em seu registro médico,

permaneceu 40 anos na forma indeterminada da doença, quando houve mudança do diagnóstico para

a forma cardíaca e 13 anos depois, o paciente apresentou outra alteração, tornando-se cardiodigestivo.

A curva de proliferação da SAO quando comparada a curva do isolado da forma indeterminada,

MJFL, apresenta TC semelhante, mas não TD. O outro paciente cardiodigestivo, AP, entrou no

GEDoCh como um paciente digestivo. Da mesma forma, a curva AP se assemelha de forma

significativa quanto ao TC e não quanto ao TD, quando comparada ao isolado MSLS, também

digestivo.

Os achados da EC50 para o BNZ dos isolados clínicos (Figura 8) apresentam valores

próximos aos encontrados em outros estudos com cepas de mesma DTU (TcII e TcIII), sendo de

aproximadamente 2,4 μg/mL (BANDYOPADHYAY et al., 2018; MORENO et al., 2010; PÉREZ-

MOLINA et al., 2015; SABINO et al., 2013). Nos prontuários médicos apenas três pacientes

relataram o uso anterior do BNZ. O paciente MHBL interrompeu o uso devido a efeitos colaterais;

63

MFS não respondeu ao tratamento e MSLS concluiu o tratamento indicado. Apenas o isolado MJFL

apresentou alta resistência ao BNZ. Curiosamente, este é o único isolado caracterizado como TcIII,

o qual é predominante no ciclo silvestre da doença, parasitando principalmente tatus (HENRIQUE et

al., 2016; YEO et al., 2005). No Brasil e Paraguai tal DTU encontra-se principalmente em cachorros,

sendo rara em humanos (YEO et al., 2005). Vale a pena ressaltar que a ativação da droga pelo

hospedeiro mamífero e parasita (WILKINSON et al., 2012) é realizada por diferentes enzimas,

citocromo P450 e nitroredutase, respectivamente, que pode explicar a diferença encontrada.

Parte III: Um doce questionamento: seria o metabolismo de carboidratos o protagonista?

O metabolismo de carboidratos em T. cruzi apresenta diferenças significativas entre as

formas replicativas. A fase epimastigota encontra-se em um ambiente rico em carboidratos, o

intestino de seu inseto vetor (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011), já a forma amastigota

intracelular, encontra-se um ambiente com carboidratos escassos. Essa diferença ambiental faz com

que haja mudança nos metabolismos das duas formas: os amastigotas aparentemente não possuem

transportadores para glicose, favorecendo a síntese de proteínas envolvidas no metabolismo de

aminoácidos (CAZZULO, 1992; MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

A forma epimastigota e a forma tripomastigota possuem metabolismos semelhantes,

apresentando alto consumo de glicose, podendo, além disso, utilizar aminoácidos como fonte de

energia. O metabolismo dessas formas é também conhecido como “fermentação aeróbia da glicose”

(MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011), uma vez que compostos não completamente reduzidos

são produzidos e excretados, como o succinato e a alanina, ao invés da completa oxidação da glicose

a CO2 e H2O. O balanço entre a produção de succinato e alanina é alterado a depender da concentração

de CO2, i.e., altas concentrações favorecem a produção de succinato pela fosfoenolpiruvato

carboxiquinase. Uma possível razão para esse fato seria a deficiência no conteúdo de citocromos da

cadeia respiratória mitocondrial que a torna incapaz de oxidar altas concentrações de succinato,

resultando assim na sua excreção (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011). Outro fato

interessante é que ao contrário das leveduras, esses parasitos não estão sob o “efeito Pasteur”, ou seja,

a mudança de metabolismo anaeróbio para o aeróbio ser acompanhado de uma diminuição na

utilização da glicose. Pelo contrário, realizam o chamado “efeito Pasteur reverso”, onde o consumo

de glicose pode ser bem menor em condições anaeróbias. Esse comportamento ocorre devido à

ausência dos principais controles da via glicolítica (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

64

A glicolise, diferentemente do que ocorre nas células humanas, tem seus seis primeiros

passos dentro de uma organela, o glicossomo. O transporte de glicose para o interior do glicossomo

ainda não está elucidado, podendo ocorrer através de poros de difusão, tal como ocorre nos

peroxissomos, ou a partir de proteínas de membrana com características de transportador ou carreador

(MULLER; CERDAN; RADULESCU, 2016). As outras 3 enzimas da glicólise encontram-se no

citosol e a fase oxidativa da quebra completa da glicose ocorre na mitocôndria. Dentro do glicossomo

também encontram-se as enzimas da via das pentoses fosfato e da β-oxidação (MAUGERI;

CANNATA; CAZZULO, 2011). Dando suporte a esses dados, nos experimentos de consumo de

oxigênio realizados com os isolados estudados, observou-se maior dependência de glicose quando

comparado com a cepa Y, que já está adaptada ao meio de cultura (Nakamura et al, em preparação).

O “doce metabolismo” em questão torna-se interessante quando se observa o ciclo

biológico do parasito. O T.cruzi passa por ambientes diversos durante seu desenvolvimento o que

exige uma plasticidade metabólica (LEANDRO DE JESUS et al., 2017). Essa plasticidade é obtida a

partir da modificação de sua cromatina, permitindo que regiões tornem-se mais ou menos expressas

(JANKE; DODSON; RINE, 2015). Estudos sugerem que para essa ação epigenética é importante a

presença da enzima treonina desidrogenase mitocondrial, responsável pela metabolização da treonina

levando a produção de Acetil-CoA (BRINGAUD; RIVIÈRE; COUSTOU, 2006), além da alteração

morfológica do parasita durante seu ciclo de vida (PARIONA-LLANOS et al., 2015). Alterações

epigenéticas também podem ser a chave para entender como pacientes portadores da forma

assintomática (indeterminada) da doença de Chagas evoluem para formas sintomáticas.

Comparando as proteínas encontradas relacionadas ao metabolismo de carboidratos e

energético entre os isolados da forma indeterminada e cardíaca, observa-se maior abundância

daquelas relacionadas à degradação de carboidratos (como a aldeído desidrogenase e aldoceto-

redutase) e relacionadas à estruturas de superfície (bem como as enzimas envolvidas na síntese de

galactose) e via glicolítica e cadeia transportadora de elétrons nos isolados da forma sintomática da

doença, que utiliza mais carboidratos em seu metabolismo (Figura 14).

Os isolados da forma cardíaca estudados apresentam maior abundância da glicose-6-

fosfato desidrogenase, presente na via das pentoses fosfato que pode ocorrer tanto no glicossomo

quanto no citosol. A presença dessa proteína confere maior poder redutor na forma de NADPH + H+

tanto no glicossomo, que poderá ser utilizado na β-oxidação de lipídios, quando no citosol, que poderá

65

ser utilizado para detoxificação de hidroperóxidos. Em relação à via glicolítica, há maior prevalência

do complexo fosfofrutoquinase 2,6 bifosfato/Frutose 2,6 bifosfatase, fato que representa a produção

do modulador alostérico positivo da Piruvato Quinase (PK), a frutose-2,6-bifosfato. A PK, caso esteja

modulada negativamente, levará ao aumento da concentração de fosfoenolpiruvato (PEP), que será

encaminhado ao glicossomo, onde poderá levar a formação de succinato ou L-alanina. A produção

desses dois compostos é uma forma de re-oxidar o NADH+H+ produzido nas etapas iniciais da via

glicolítica (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011).

Outras enzimas da via glicolítica, GAPDH e a glicerato quinase contribuem para uma

maior eficiência dessa via. Como não há diferenças significativas no tempo de duplicação (Tabela

II) e na fase log de proliferação, onde há um intenso consumo desse carboidrato (Figura 7), os isolados

da forma indeterminada podem ter compensações, como fatores de estabilidade da crista mitocondrial

(MICOS), carreadores de elétrons como o citocromo c e a quinona oxidase. A maior abundância da

proteína de transporte de elétrons SCO1/SCO2, que é responsável pela estabilização da montagem da

citocromo c oxidase, pode tornar o complexo IV mais eficiente ao manter o centro redutor de cobre

mais estável. E assim, o consumo de glicose entre as formas clínicas aparenta ser semelhante de

acordo com o perfil de proliferação dessas células (Figura 7).

Um ponto a ser ressaltado é a maior abundância da GAPDH em todos os isolados

sintomáticos quando comparados aos indeterminados. Essa enzima da via glicolítica é apontada como

alvo para novos fármacos. Também relacionada com o remodelamento da cromatina dos parasitos

durante seu ciclo de vida, a GAPDH pode ser uma pista de como elucidar a mudança de forma clínica

nos pacientes. Mas, como correlacionar alterações de cromatina e a lise da glicose? Estudos sugerem

que a GAPDH pode estar associada ao telômero, sendo um sensor celular para as alterações

epigenéticas do organismo. Acredita-se que formas epimastigotas possuem associação entre a

GAPDH e o telômero a fim de proteger o material genético durante as divisões celulares (LEANDRO

DE JESUS et al., 2017; PARIONA-LLANOS et al., 2015). Além disso, a GAPDH está correlacionada

com o balanço entre NAD+/NADH+H+. Um aumento da concentração de NAD+, provoca a

dissociação da GAPDH dos telômeros, podendo ser o ponto inicial para diferenciação em

tripomastigotas, que não possuem tal interação (PARIONA-LLANOS et al., 2015; PINAZO et al.,

2014).

67

Figura 14 – Esquema representativo da via glicolítica, ciclo de Krebs e cadeia transportadora de elétrons

mitocondrial em T. cruzi evidenciando-se as proteínas abundantes nos isolados da forma indeterminada

(azul) e cardíaca (vermelha) – adaptado de (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011): Cardiac Isolates (red):

1.galactokinase; 2.hypothetical protein (uridylyltransferase activity); 3.phosphoglucomutase; 4.UDP-Gal or UDP-

GlcNAc-dependent glycosyltransferase; 5. glucose-6- phosphate isomerase, glycosomal 6. glucose-6- phosphate

dehydrogenase; 7. 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase; 8. glyceraldehyde-3- phosphate

dehydrogenase; 9. Hypotetical protein (unchariterized protein - glicerate kinase); 10. 2- oxoglutarate dehydrogenase

subunit; 11. dihydrolipoyl dehydrogenase; 12. cytosolic malate dehydrogenase; 13. malic enzyme; 14. hypothetical

protein (uncharacterized protein - proton-transporting ATP synthase complex assembly); 15.5-

demethoxyubiquinone hydrolase, mitochondrial; 16. hypothetical protein (COX assembly mitochondrial protein);

Indeterminated Isolates (blue): 17. hypothetical protein (uncharacterized protein - MICOS complex); 18.

citocrome c; 19. eletron transport protein SCO1/SCO2; 20. quinone oxirredutase; 21. Glycosyltransferase; 22.

hypotetical protein (hydrolase activity, hydrolizing O-glycosyl compounds).

Envolvidas no balanço de NADPH+H+ citosólico, encontram-se a malato desidrogenase

(MDH) e a enzima málica. Em condições onde a razão NAD+/NADH+H+ no glicossomo encontra-

se ideal, o malato vai para o citosol e através da MDH é convertido em piruvato e este por sua vez

em alanina, que é exportada da célula (Figura 14). Caso o balanço de NADP+/NADPH+H+, no citosol,

estiver baixa o piruvato será convertido em malato pela enzima málica, oxidando a coenzima. O

malato por sua vez, é transformado em fumarato que será encaminhado para o glicossomo, sendo

convertido em succinato e exportado da célula.

Comparando as proteínas com abundâncias diferentes relacionadas ao metabolismo de

carboidratos e energético entre os isolados da forma indeterminada e digestiva, observa-se várias

proteínas relacionadas à degradação de carboidratos, tal como na forma cardíaca explicada

anteriormente (como a aldeído desidrogenase e a aldoceto-redutase) e relacionadas à estruturas de

superfície (como as enzimas envolvidas na síntese de galactose, fator de organização glicossomo) e

proteínas envolvidas na via glicolítica e cadeia transportadora de elétrons nos isolados da forma

digestiva (Figura 15).

Com relação às enzimas descritas na via cardíaca da via glicolítica e via pentoses fosfato,

MDH e enzima málica, as mesmas foram encontradas na forma digestiva. Diferenças foram

encontradas em relação às proteínas da cadeia respiratória para qual, a forma digestiva possui mais

abundantes a 5-demetoxiubiquinone hidrolase (COQ7), COX assembly protein e ATP sintase.

Interessantemente, os isolados da forma assintomática quando comparados aos da forma

digestiva apresentaram prevalência da lactato desidrogenase e da anidrase carbônica, além das

proteínas de transporte de elétrons SCO1/SCO2 e ubiquinol da cadeia transportadora mitocondrial.

68

Há também a proteína do complexo MICOS que auxilia na estabilização das cristas mitocondriais. O

fator de destaque para anidrase carbônica é a regulação da concentração e de dióxido de carbono na

célula. A variação dessa concentração pode influenciar no destino do piruvato produzido na glicólise.

Anidrase carbônica em maior abundância leva à diminuição na produção de CO2 e assim à menor

conversão de piruvato a oxalacetato (OAA) pela piruvato carboxilase, na mitocôndria. Nesse sentido

o piruvato é convertido em alanina no citosol ou no glicossomo dependendo do estado redox dos

compartimentos celulares. A alanina formada é excretada pelo parasita (MAUGERI; CANNATA;

CAZZULO, 2011).

Ainda não há elucidação de como ocorre o transporte de glicose para o interior do

glicossomo. Uma possível hipótese é a presença de complexos proteicos intermembrana pertencentes

à família dos carreadores mitocondriais. A presença dos carreadores mitocondriais pode fundamentar

a hipótese para o maior consumo de glicose nos isolados indeterminados, quando comparados aos

digestivos (Figura 7).

Nessa análise, (isolados da forma indeterminada vs os da digestiva), há também a

presença da D-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase protein, cuja atuação é de lactato

desidrogenase, em T.cruzi, que é indicada como uma das responsáveis pelo controle redox dos

parasitos (DIAS et al., 2018).

A análise entre os isolados da forma cardiodigestiva e os da indeterminada não apresentou

muitas diferenças em relação à análise anterior. De maneira geral há predominância da via glicolítica

nos isolados da forma sintomática da doença e do metabolismo energético para os da forma

assintomática.

As outras duas análises, levando em consideração a evolução das formas cardíaca e

digestiva para a forma cardiodigestiva não apresentaram muitas proteínas diferentemente abundantes

nas vias analisadas. Interessantemente, os isolados da forma cardiodigestiva apresentaram uma

característica semelhante aos da indeterminada, na qual prevalece maior abundância de proteínas

relacionadas ao metabolismo energético do parasita. A análise entre os isolados da forma digestiva e

os da cardiodigestiva novamente destacou a anidrase carbônica e o carreador mitocondrial. Tal fato

torna-se interessante se observamos tanto a evolução da doença quanto as curvas de proliferação

(Figura 7). Para o isolado SAO, o tempo de duplicação apresenta-se semelhante aos isolados

cardíacos e indeterminados, que também possuem tais enzimas. Em relação ao isolado AP, a

69

característica semelhante é uma fase estacionária, conforme observado nas curvas de isolados das

formas digestivas.

71



(azul) e os da digestiva (laranja) – adaptado de (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011): Digestive Isolates

(orange): 1.galactokinase; 3.phosphoglucomutase; 5. glucose-6- phosphate isomerase, glycosomal 6. glucose-6-

phosphate dehydrogenase; 7. 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase; 8. glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase; 10. 2- oxoglutarate dehydrogenase subunit; 12. cytosolic malate dehydrogenase; 13.

malic enzyme; 14. hypothetical protein (uncharacterized protein - proton-transporting ATP synthase complex

assembly); 15.5-demethoxyubiquinone hydrolase, mitochondrial; 16. hypothetical protein (COX assembly

mitochondrial protein); 23. Acetyltransferase componente of pyruvate dehydrogenase complex; Indeterminated

Isolates (blue): 17. hypothetical protein (uncharacterized protein - MICOS complex); 19. eletron transport protein

SCO1/SCO2; 22. hypotetical protein (hydrolase activity, hydrolizing O-glycosyl compounds) 24. D-isomer specific

2-hydroxyacid dehydrogenase-protein (lactate dehydrogenase); 25. ATPase and hypothetical protein

(uncharacterized – ATPase activity); 26. carbonic anhydrase-like protein; 27. mitochondrial carrier protein; 28.

Ubiquinol-cytochrome c reductase.

73



(azul) e os da cardiodigestiva (verde) – adaptado de (MAUGERI; CANNATA; CAZZULO, 2011):

Cardiodigestive Isolates (green): 2.hypothetical protein (uridylyltransferase activity); 3.phosphoglucomutase; 5.

glucose-6- phosphate isomerase, glycosomal 6. glucose-6- phosphate dehydrogenase; 8. glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase; 10. 2-oxoglutarate dehydrogenase subunit; 12. cytosolic malate dehydrogenase; 13.

malic enzyme; 14. hypothetical protein (uncharacterized protein - proton-transporting ATP synthase complex

assembly); 15.5-demethoxyubiquinone hydrolase, mitochondrial; 16. hypothetical protein (COX assembly

mitochondrial protein); Indeterminated Isolates (blue): 17.hypothetical protein (uncharacterized protein - MICOS

complex); 18. cytochrome c; 19. electron transport protein SCO1/SCO2; 22. hypothetical protein (hydrolase

activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds) 29. ATP synthase, alpha chain, mitochondrial precursor; 30. NADPH-

dependent FMN/FAD containing oxorreductase; 31. vacuolar ATP synthase.

74

6. CONCLUSÃO

6.1. Características inerentes aos pacientes, que podem influenciar a evolução da doença,

aparentam refletir sobre a população de parasitos estudada em laboratório.

6.2. Há certo direcionamento das vias metabólicas de acordo com a plasticidade metabólica do

parasito. Os isolados das formas indeterminadas, quando comparadas aos das sintomáticas,

possuem metabolismo energético mais robusto, bem como maior abundância de proteínas

responsáveis pela estruturação da cadeia transportadora de elétrons. Tal característica também

é observada na análise das proteínas encontradas nos isolados das formas cardiodigestivas vs

os das formas cardíaca e digestiva. O parasito nesse caso encontra-se bem estabelecido em

mais de um tecido, podendo apresentar maior versatilidade quanto à obtenção de nutrientes,

bem como a adaptação ao estresse oxidativo proveniente do metabolismo da célula

hospedeira.

6.3. A GAPDH, apontada como responsável pela modulação nas características da cromatina

celular do parasito durante seu ciclo de vida, foi encontrada de forma abundante apenas nos

isolados das formas sintomáticas, quando comparadas aos das assintomáticas, fato que pode

sugerir uma possível participação dessa proteína na alteração do estabelecimento da forma

clínica do paciente.

6.4. A anidrase carbônica, carreadores mitocondriais e lactato desidrogenase tem abundância nos

isolados que apresentam maior consumo de glicose e não possuem a fase estacionária em seu

perfil proliferativo. A presença de uma fase estacionária garante maior tempo de infecção do

parasito.

7. IMPLICAÇÕES DOS ACHADOS NO PRESENTE TRABALHO

7.1. A partir das proteínas encontradas diferentemente entre os isolados das formas assintomáticas

e sintomáticas, principalmente a GAPDH, um possível rastreamento dos parasitas presentes

na circulação sanguínea possa indicar se um paciente assintomático passará a apresentar

sintomatologia e assim iniciar-se um pré-tratamento.

7.2. Servir de suporte para pesquisas de novos fármacos, cujos alvos enzimáticos, bem como o

metabolismo energético para os isolados assintomáticos e a glicólise para os sintomáticos

apresentaram maior destaque.

75

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ANEXO I

88

ANEXO II

89

ANEXO III

universidade estadual de campinas instituto de … · 2019. 10. 29. · científico para descobrir...

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